KR102040235B1 - RGMa 결합 단백질 및 그 사용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 신경학적 질환 또는 면역학적 질환의 예방, 치료 또는 재발 예방용의 의약으로서 사용할 수 있는, 결합 활성이 높고, 부작용이 적은 항Repulsive Guidance Molecule a(RGMa) 항체를 얻는 것을 과제로 하고, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, 또한 RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화하는, 단리된 RGMa 결합 단백질, 바람직하게는, 상보성 결정 영역의 아미노산 서열이 서열목록의 서열번호 30∼35 또는 서열목록의 서열번호 36∼40 및 SFG인, 항RGMa 항체를 제공하는 것에 의해 그 문제점을 해결한다.

Description

RGMa 결합 단백질 및 그 사용
본 발명은, RGMa 결합 단백질 및 그 사용에 관한 것이다.
RGM(repulsive guidance molecule)은, 분자량이 약 33kDa의 GPI 앵커형 막단백질이고, 당초, 시각계의 축색 유도 분자로서 동정(同定)된 막단백질이다(비특허문헌 1 참조). RGM 패밀리에는 RGMa, RGMb 및 RGMc라 불리는 3종류의 멤버가 포함되지만, 그 중에서도 RGMa가 발생 단계에 가하여, 성인 인간 및 래트의 중추 신경계 손상 후에 재발현되는 점, 래트에 있어서 RGMa 저해가 척수 손상 후의 신경 돌기 성장을 항진시키고, 기능 회복을 촉진시키는 점으로부터(비특허문헌 2 참조), RGMa는 중추 신경계 손상 후의 신경 돌기 저해 물질이라고 생각되고 있다.
RGMa에는 면역계에 있어서의 작용도 보고되고 있다. RGMa는 수상세포 상에 발현되고, T세포에 작용함으로써 T세포의 ICAM-1·피브로넥틴으로의 접착성을 높이거나, 사이토카인의 생산을 유도한다(특허문헌 4). 다발성 경화증 모델 마우스에 있어서, 항RGMa 항체를 투여하면, 뇌척수염에 의한 증상이 억제되고, 발증, 재발을 억제하는 효과도 나타낸다. 항RGMa 항체는, 수상세포에 발현되는 RGMa에 결합함으로써, T세포의 활성화를 억제하고, 다발성 경화증에 효과를 나타내는 것으로 생각되고 있다.
RGMa의 시그널 전달 기구도 해명되고 있고, RGMa의 수용체로서 Neogenin 단백질이 보고되고 있다(특허문헌 3). Neogenin은, 일회 막관통형 단백질로, 신경 세포나 T세포상에서 발현되고 있다.
RGMa는 세포막 상의 Neogenin에 결합하여, 세포 내의 RhoA의 활성화, Ras의 불활성화를 유도함으로써, 신경 돌기 성장 저해 효과를 초래한다. 한편으로, 발생 도상의 닭의 뇌에 있어서, RGMa가 결합하지 않은 경우, Neogenin은 아포토시스를 야기하는 것이 알려져 있다(Matsunaga 등, Dev. Growth Differ. 46, 481, 2004). 즉, RGMa/Neogenin 경로는, 신경 세포의 생존을 촉진하는, 신경 재생에 있어서 바람직한 작용, 및 신경 돌기 성장을 저해하는 마이너스의 작용의 두 가지 상반되는 작용을 가지고 있다고 생각된다.
RGM을 표적으로 한 의약으로서, 특허문헌 1에는 항RGM 중화 항체를 유효 성분으로서 함유하는 축색 재생 촉진제가 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 2 및 특허문헌 3에는, Neogenin 수용체로의 RGM의 결합을 조절하는 항RGM 항체의 뇌 및 척수로의 기계적 손상의 치료제가 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 4에는, 항RGM 항체의 다발성 경화증 등의 의약 용도가 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 5에는, 항RGM 항체의 다발성 경화증, 포유동물의 뇌 외상, 척수 손상, 졸중, 신경변성 질환 및 통합실조증을 포함하는 질환에 대한 치료 용도가 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 6에는, 항RGM 항체 등의 RGM 조절인자의 척수 손상이나 다발성 경화증에 대한 치료 용도가 개시되어 있고, 비특허문헌 3에는 진행형 다발성 경화증에 대한 치료 용도가 개시되어 있다.
국제공개 WO2005/087268호 팜플렛 일본공표특허 제2010-537655호 공보 일본공표특허 제2009-510002호 공보 국제공개 WO2011/071059호 팜플렛 일본공표특허 제2011-512806호 공보 일본공표특허 제2004-525875호 공보
Neuron 5, 735-743(1990) J. Cell Biol.173, 47-58(2006) Cell Reports 10, 1-12(2015)
상기한 바와 같이, 항RGMa 항체의 신경학적 질환이나 면역학적 질환에 대한 치료 용도는 개시되어 있지만, 종래의 항체는 활성이 불충분하거나, RGMa 본래의 기능도 손상될 우려가 있고, 부작용의 문제 등이 있었다. 특히, 종래의 항체는, RGMa와 Neogenin간의 결합을 저해함으로써, RGMa와 결합한 Neogenin이 가지는 아포토시스 억제 등의 바람직한 작용도 저해할 우려가 있었다. 이에, 본 발명은, RGMa/Neogenin의 상호 작용을 저해하지 않고, 또한 RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화하는 RGMa 결합 단백질을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 예의 검토를 행하였다. 그 결과, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, 또한 RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화하는 RGMa 결합 단백질을 얻는 데에 성공하고, 그것이 신경학적 질환이나 면역학적 질환에 대한 의약으로서 사용될 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
본 발명은 이하와 같다.
[1] RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, 또한 RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화하는, 단리된 RGMa 결합 단백질
[2] 인간 RGMa, 래트 RGMa 및/또는 마우스 RGMa와 결합하는, [1]에 기재된 RGMa 결합 단백질
[3] EEVVNAVEDWDSQG(서열목록의 서열번호 26), NQQIDFQAFHTNAE(서열목록의 서열번호 27), PTAPETFPYET(서열목록의 서열번호 28), 및/또는 KLPVEDLYYQA(서열목록의 서열번호 29)의 펩티드에 결합하는, [1] 또는 [2]에 기재된 RGMa 결합 단백질
[4] 서열목록의 서열번호 26 및 서열번호 27의 펩티드에 결합하는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 RGMa 결합 단백질
[5] 서열목록의 서열번호 26, 서열목록의 서열번호 27 및 서열목록의 서열번호 28의 펩티드에 결합하는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 RGMa 결합 단백질
[6] 서열목록의 서열번호 26, 서열목록의 서열번호 27 및 서열목록의 서열번호 29의 펩티드에 결합하는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 RGMa 결합 단백질
[7] RGMa 결합 단백질이 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편(斷片)인, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 RGMa 결합 단백질
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 RGMa 결합 단백질의 단백질 부분을 코딩하는 핵산 분자
[9] [8]에 기재된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터
[10] [9]에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포
[11] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 RGMa 결합 단백질의 제조 방법으로서, [10]에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는 방법
[12] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 RGMa 결합 단백질을 포함하는, 의약 조성물
[13] 신경학적 질환 또는 면역학적 질환의 예방, 치료 또는 재발 예방용의 [12]에 기재된 의약 조성물
[14] 신경학적 질환이 근위축성 측삭경화증, 상완신경총 손상, 뇌 손상(외상성 뇌 손상을 포함함), 뇌성마비, 길랑바레(Guillain-Barre) 증후군, 대뇌백질 위축증, 다발성 경화증(재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증을 포함함), 시신경척수염, 폴리오 후 증후군(post-polio syndrome), 이분척추, 척수 손상, 척수성 근위축증, 척추종양, 횡단성 척수염, 인지증(노년성 인지증, 경도 인지 기능 장해, 알츠하이머병, 알츠하이머 관련 인지증을 포함함), 헌팅턴 무도병, 지발성 디스키네시아, 조병(躁病), 파킨슨병, 스틸-리차드슨-올스제위스키 증후군, 다운증, 중증근무력증, 신경외상(시신경외상을 포함함), 혈관 아밀로이드증, 아밀로이드증을 수반하는 대뇌출혈, 뇌경색, 뇌염, 급성 혼란 장해, 녹내장, 통합실조증 및 망막 신경선유층 변성[당뇨병성 망막증, 허혈성 시신경증, X염색체 연쇄성 망막분리증, 약물 유발성 시신경증, 망막 디스트로피, 가령황반변성, 시신경 유두 드루젠에 의해 특징지어지는 안병, 광수용기 변성의 유전적 결정 인자에 의해 특징지어지는 안병, 상염색체 열성 추체-간체 디스트로피, 시신경증을 수반하는 미토콘드리아 장해를 포함함]를 포함하는 군으로부터 선택되는, [13]에 기재된 의약 조성물
[15] 면역학적 질환이 다발성 경화증(재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증을 포함함), 시신경척수염, 건선, 관절염(관절 류머티즘, 변형성 관절증, 건선성 관절염을 포함함), 길랑바레 증후군, 신경 베체트병(Behcet's disease), 악성 빈혈, I형 (인슐린 의존형)당뇨병, 전신 에리테마토데스(SLE), 염증성 장질환(IBD), 쇼그렌 증후군, 굿파스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 그레이브스병, 자기면역성 용혈성 빈혈, 자기면역성 혈소판 감소성 자반병, 천식, 화분증, 아토피성 피부염, 사구체신염, 중증근무력증, 하시모토병, 및 사르코이도시스(sarcoidosis)를 포함하는 군으로부터 선택되는, [13]에 기재된 의약 조성물
[16] 신경학적 질환 또는 면역학적 질환이 척수 손상, 신경외상(시신경외상을 포함함) 및 다발성 경화증(재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증을 포함함)을 포함하는 군으로부터 선택되는 [13]에 기재된 의약 조성물
[17] 경쇄의 상보성 결정 영역 1(LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2(LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3(LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1(HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2(HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3(HCDR3)의 각각의 아미노산 서열이,
LCDR1 : RASQDISSYLN(서열목록의 서열번호 30)
LCDR2 : YTSRLHS(서열목록의 서열번호 31)
LCDR3 : QQLNTLP(서열목록의 서열번호 32)
HCDR1 : DAWMD(서열목록의 서열번호 33)
HCDR2 : EIRSKANNHATYYAESVKG(서열목록의 서열번호 34) 및
HCDR3 : RDGAY(서열목록의 서열번호 35)
을 포함하거나,
또는,
LCDR1 : RSSQSLVHSNGNTYLH(서열목록의 서열번호 36)
LCDR2 : KVSNRFS(서열목록의 서열번호 37)
LCDR3 : SQSTHVP(서열목록의 서열번호 38)
HCDR1 : TSYYWN(서열목록의 서열번호 39)
HCDR2 : YISYDGTNNYNPSLKN(서열목록의 서열번호 40) 및
HCDR3 : SFG
를 포함하고,
각 CDR 서열에 있어서는, 1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가되어 있어도 되는, 단리된 항RGMa 항체, 또는 그 항원 결합 단편
[18] 중쇄 가변 영역(VH)이
VH: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHATYYAES
VKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS(서열목록의 서열번호 41) 또는 상기 아미노산 서열에 적어도 90%의 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하고,
경쇄 가변 영역(VL)이
VL: DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGS
GSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME(서열목록의 서열번호 42)또는 해당아미노산 서열에 적어도 90%의 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하는, [17]에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편
[19] 항RGMa 항체가 인간화 항체인, [17] 또는 [18]에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편
[20] 항RGMa 항체가 인간IgG의 정상 영역을 가지는, [17]로부터 [19] 중 어느 하나에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편
[21] RGMa와의 결합이 [17] 또는 [18]에 기재된 항RGMa 항체와 경합하는, RGMa 결합 단백질
[22] [17] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편의 단백질 부분을 코딩하는 핵산 분자
[23] VH 및 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이
VH: gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcagatccctgagactgtcc
tgtaccgcctccggcttcaccttctccgacgcctggatggattgggtgcgacaggctcctggcaagggc
ctggaatgggtggccgagatccggtccaaggccaacaaccacgccacctactacgccgagtctgtgaag
ggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgtgtacctgcagatgaactccctgcggacc
gaggacaccgccctgtactactgcaccagaagggacggcgcctactggggcaagggcaccacagtgaca
gtgtcctcc(서열목록의 서열번호 43), 및
VL: gacatccagatgacccagtccccctcctccgtgtctgcttccgtgggcgacagagtgaccatc
acctgtcgggcctcccaggacatctcctcctacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggccccc
aagctgctgatctactacacctcccggctgcactccggcgtgccctctagattttccggctctggctcc
ggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgcctcctacttctgtcagcag
ctgaacaccctgccctggacctttggcgga ggcaccaaggtggaaatggaa (서열목록의 서열번호 44)을 포함하는 핵산 서열인, [22]에 기재된 핵산 분자
[24] [22] 또는 [23]에 기재된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터
[25] [24]에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포
[26] [17] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편의 제조 방법으로서, [25]에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는 방법
[27] [17] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는, 의약 조성물.
[28] 신경학적 질환 또는 면역학적 질환의 예방, 치료 또는 재발 예방용의 [27]에 기재된 의약 조성물
[29] 신경학적 질환이, 근위축성 측삭경화증, 상완신경총 손상, 뇌손상(외상성 뇌손상을 포함함), 뇌성마비, 길랑바레 증후군, 대뇌백질 위축증, 다발성 경화증(재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증을 포함함), 시신경척수염, 폴리오 후 증후군, 이분척추, 척수 손상, 척수성 근위축증, 척추종양, 횡단성 척수염, 인지증(노년성 인지증, 경도 인지 기능 장해, 알츠하이머병, 알츠하이머 관련 인지증을 포함함), 헌팅턴 무도병, 지발성 디스키네시아, 조병, 파킨슨병, 스틸-리차드슨-올스제위스키 증후군, 다운증, 중증근무력증, 신경외상(시신경외상을 포함함), 혈관 아밀로이드증, 아밀로이드증을 수반하는 대뇌출혈, 뇌경색, 뇌염, 급성 혼란 장해, 녹내장, 통합실조증 및 망막 신경선유층 변성(당뇨병성 망막증, 허혈성 시신경증, X염색체 연쇄성 망막분리증, 약물 유발성 시신경증, 망막 디스트로피, 가령황반변성, 시신경 유두 드루젠에 의해 특징지어지는 안병, 광수용기 변성의 유전적 결정 인자에 의해 특징지어지는 안병, 상염색체 열성 추체-간체 디스트로피, 시신경증을 수반하는 미토콘드리아 장해를 포함함)를 포함하는 군으로부터 선택되는, [28]에 기재된 의약 조성물
[30] 면역학적 질환이 다발성 경화증(재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증을 포함함), 시신경척수염, 건선, 관절염(관절 류머티즘, 변형성 관절증, 건선성 관절염을 포함함), 길랑바레 증후군, 신경 베체트병, 악성 빈혈, I형(인슐린 의존형) 당뇨병, 전신 에리테마토데스(SLE), 염증성 장질환(IBD), 쇼그렌 증후군, 굿파스쳐 증후군, 그레이브스병, 자기면역성 용혈성 빈혈, 자기면역성 혈소판 감소성 자반병, 천식, 화분증, 아토피성 피부염, 사구체신염, 중증근무력증, 하시모토병 및 사르코이도시스를 포함하는 군으로부터 선택되는, [28]에 기재된 의약 조성물
[31] 신경학적 질환 또는 면역학적 질환이 척수 손상, 신경외상(시신경외상을 포함함) 및 다발성 경화증(재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증을 포함함)을 포함하는 군으로부터 선택되는 [28]에 기재된 의약 조성물
[32] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 RGMa 결합 단백질을, 그것을 필요로 하는 대상에, 유효량 투여하는 공정을 포함하는, 신경학적 질환 또는 면역학적 질환의 예방, 치료 또는 재발 예방 방법
[33] [17] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편을, 그것을 필요로 하는 대상에, 유효량 투여하는 공정을 포함하는, 신경학적 질환 또는 면역학적 질환의 예방, 치료 또는 재발 예방 방법
본 발명의 RGMa 결합 단백질은, RGMa와 Neogenin의 상호 작용을 저해하지 않는 것에 의해, RGMa와 결합한 Neogenin이 가지는 신경 세포 등에 대한 Apoptosis의 저해 등의 작용을 유지할 수 있으므로, 신경 세포의 보호 효과가 강하고, 신경 세포 감소에 수반되는 부작용의 우려가 적다. 또한, 본 발명의 인간화 항RGMa 항체는, 종래의 항체보다 인간 RGMa와의 결합성 및 열안정성 등의 특성이 우수하다. 따라서, 약효가 우수하고, 부작용이 적은 신경학적 질환이나 면역학적 질환에 대한 의약으로서 사용할 수 있다.
도 1은, RGMa 폴리클로널 항체(AF2459), 비교예 항체(r5F9) 및 본 발명의 항체(r70E4, 116A3)를 사용한, RGMa-Neogenin 결합 저해 시험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는, 대조 마우스 IgG 및 본 발명의 항체(B5.70E4, B5.116A3)를 사용한, RGMa-BMP2 결합 저해 시험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은, 비교예 항체(rH5F9), 본 발명의 키메라 항체(r116A3C) 및 본 발명의 인간화 항체(HE/KA, HA/KC)를 사용한, 항체의 열안정성 시험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는, 본 발명의 항체[B5.70E4(좌), B5.116A3(우)]를 사용한, 신경 돌기 성장 시험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는, 대조 마우스 IgG(mo-IgG2bk) 및 본 발명의 항체(r70E4, r116A3)를 사용한, 척수 손상 모델 래트를 이용한 효력 시험의 결과를 나타낸 도면이고, 도 5의 (A)는 척수 압좌(壓挫) 모델, 도 5의 (B)는 척수반측 절단 모델에서의 효력 시험의 결과를 나타낸다.
도 6은, PLP139-151 펩티드로 야기된 다발성 경화증 모델 마우스를 이용한 본 발명의 항체(B5.116A3)의 효력 시험의 결과를 나타낸 도면이고, 좌측이 EAE 스코어, 우측이 체중의 변화를 나타내고, 상단이 피험(被驗) 항체를 7일 및 10일 후에 투여한 경우, 하단이 피험 항체를 18일 및 21일 후에 투여한 경우의 결과를 나타낸다.
본 발명의 이해를 쉽게 하기 위해, 이하에 본 발명에 사용되는 용어를 설명한다.
[RGMa]
RGMa는 중추 신경계에 있어서의 신경 돌기 성장 저해 단백질이고, 인간 RGMa 단백질은 서열목록의 서열번호 1에 나타낸 바와 같이 450아미노산으로 이루어지는 전구 단백질로서 생합성된다. N말단에 존재하는 시그널 펩티드 Met1∼Pro47(N말단측으로부터 첫번째의 메티오닌 잔기로부터 47번 앞의 프롤린 잔기까지의 펩티드를 가르키고, 이후 동일하게 기재)이 제거되고, Asp168과 Pro169 사이의 펩티드 결합이 절단되고, C말단 펩티드 Arg423∼Cys450이 제거되고, 또한 C말단으로 된 Gly422의 C말단 카르복실기에 GPI 앵커가 부가된다. 인간 RGMa 단백질은, N말단측 도메인(Cys48∼Asp168)과 C말단측 도메인(Pro169∼Ala424)이 술피드 결합에 의해 연결된 성숙 단백질로서, GPI 앵커를 통하여 세포막 상에 발현된다. 마우스의 RGMa의 전구 단백질은 서열목록의 서열번호 2에 나타내는 아미노산 서열, 래트의 RGMa의 전구 단백질은 서열목록의 서열번호 3에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지나, C말단 펩티드가 제거되기 때문에, 성숙 단백질로서는 동일한 아미노산 서열로 된다. 본 발명에서는, RGMa는 후술하는 Neogenin에 결합하여 작용하는 것이면, 전구 단백질, 성숙 단백질 또는 그 활성형 단편 중 어느 하나를 가르켜도 되고, 이들의 유도체 또는 변이체여도 된다. 또한, 인간 RGMa여도 되고, 다른 생물 유래의 RGMa여도 되지만, 인간 RGMa가 바람직하다.
[Neogenin]
Neogenin은 중추 신경의 신경 세포 등에 발현되고, RGMa의 수용체에 하나로서 기능하고 있다. 인간 Neogenin 단백질은 서열목록의 서열번호 10에 나타낸 바와 같이, 1461아미노산으로 이루어지고, 시그널 펩티드 Met1∼Ala33이 제거되어 성숙한 막단백질로서 발현된다. 본 발명에서는, Neogenin은 RGMa에 결합하는 것이면, 전구 단백질, 성숙 단백질 또는 그 RGMa 결합 단편 중 어느 하나를 가르켜도 되고, 이들의 유도체 또는 변이체여도 된다. 또한, 인간 Neogenin이어도 되고, 다른 생물 유래의 Neogenin이어도 되지만, 인간 Neogenin이 바람직하다.
[중화]
본원에 있어서 「중화」란 목적하는 표적에 결합하고, 또한 그 표적의 어떠한 기능을 저해할 수 있는 작용을 말한다. 즉, 「RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화함」이란, RGMa 결합 단백질이 RGMa에 결합하는 것에 의해, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 저해하는 것을 말한다. 신경 돌기 성장 저해 활성은, 당분야에 있어서 알려진 몇 가지의 in vitro 또는 in vivo 분석의 하나 또는 그 이상에 의해 평가할 수 있지만, 예를 들면, 본원 명세서에 기재된 신경 돌기 성장 저해 시험에 의해 평가할 수 있다.
[단리]
단리된 RGMa 결합 단백질 등의 「단리되었음」이란, 동정되고, 또한 분리된, 및/또는, 자연 상태에서의 성분으로부터 회수되었다는 의미다. 자연 상태에서의 불순물은, 그 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬 및 그 외의 단백질성 용질 또는 비단백질성 용질을 들 수 있다. 일반적으로, RGMa 결합 단백질 등을 단리하기 위해서는, 적어도 하나의 정제 공정에 의해 정제하면 되고, 적어도 하나의 정제 공정에 의해 정제된 RGMa 결합 단백질을 「단리된 RGMa 결합 단백질」이라고 할 수 있다.
[RGMa 결합 단백질]
본원에 있어서 「RGMa 결합 단백질」이란 RGMa에 결합하는 단백질을 포함하는 분자를 말한다. RGMa 결합 단백질로서는, 항RGMa 항체 및 그 항원 결합 단편, 및 RGMa 결합 골격(scaffold) 단백질, 및 Neogenin의 세포외 도메인 등의 가용성 RGMa수용체 단백질, 및 이들의 융합 단백질을 예로 들 수 있다. RGMa 결합 골격 단백질이란, 세린 프로테아제 조해제의 Kunitz 도메인이나 인간의 파이브로넥틴의 세포외 도메인, 안키린, 리포칼린 등에 변이를 도입하는 것에 의해, RGMa와의 결합 기능을 실현하는 단백질을 말한다. 융합 단백질이란, RGMa 결합 단백질에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자(TGF-β, NGF, Neurotrophin 등), 알부민, 효소, 다른 항체 등의 본원의 RGMa 결합 단백질 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자공학적으로 결합한 RGMa 결합 단백질을 말한다.
[인간 항체]
인간 항체란 경쇄, 중쇄 모두 인간 면역 글로불린 유래의 항체를 말한다. 인간 항체는 중쇄의 정상 영역의 차이에 의해, γ쇄의 중쇄를 가지는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함함), μ쇄의 중쇄를 가지는 IgM, α쇄의 중쇄를 가지는 IgA(IgA1, IgA2를 포함함), δ쇄의 중쇄를 가지는 IgD 또는 ε쇄의 중쇄를 가지는 IgE를 포함한다. 또한, 원칙으로서 경쇄는, κ쇄와 λ쇄 중 어느 한쪽을 포함한다.
[인간화 항체]
인간화 항체란, 비인간 동물 유래 항체의 상보성 결정 영역과 인간 항체 유래의 프레임워크 영역으로 이루어지는 가변 영역, 및 인간 항체 유래의 정상 영역으로 이루어지는 항체를 말한다.
[키메라 항체]
키메라 항체란 경쇄, 중쇄 또는 그 양쪽이, 비인간 유래의 가변 영역과 인간 유래의 정상 영역으로 이루어지는 항체를 말한다.
[항RGMa 항체]
본원에 있어서 항RGMa 항체는, RGMa에 결합하는 면역 글로불린 분자 또는 그 개변 분자를 말한다. 개변 분자에는, 다중특이성(multispecific) 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 기능 개변 항체 및 컨쥬게이트(conjugate) 항체를 포함하는 것으로 한다.
[다중특이성 항체]
다중특이성 항체란, 2가지 이상의 다른 항원특이성을 가지는 2개 이상의 독립된 항원 인식 부위를 가진 비대칭의 항체이고, 2가지의 항원특이성을 가지는 이중특이성 항체, 3가지의 항원특이성을 가지는 삼중특이성 항체 등을 들 수 있다.
[기능 개변 항체]
본원에 있어서 기능 개변 항체란, 주로 항체의 Fc 영역의 아미노산이나 당쇄를 개변하는 것에 의해, 항체가 가지는 항원 결합 기능 이외의 기능, 예를 들면, 세포 살상 기능, 보체 활성화 기능이나 혈중 반감기 연장 기능을 개변한 항체를 말한다.
[컨쥬게이트 항체]
본원에 있어서 컨쥬게이트 항체란, 항체에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자(TGF-β, NGF, Neurotrophin 등), 알부민, 효소 등의 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자공학적으로 결합한 항체를 말한다.
[항원 결합 단편]
본원에 있어서 항원 결합 단편이란, 항체의 일부분을 포함하는 단백질이고, 항원에 결합할 수 있는 것을 말한다. 항원 결합 단편의 예로서는, F(ab')2, Fab', Fab, Fv(variable fragment of antibody), 디술피드 결합 Fv, 1본쇄 항체(scFv) 및 이들의 중합체 등을 들 수 있다. 또한, 항원 결합 단편은, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자(TGF-β, NGF, Neurotrophin 등), 알부민, 효소, 다른 항체 등의 본원의 항RGMa 항체 이외의 기능 분자가 화학적 또는 유전자공학적으로 결합되어 있는 컨쥬게이트 항원 결합 단편을 포함하는 것으로 한다.
[상보성 결정 영역]
상보성 결정 영역(CDR)이란 면역 글로불린 분자의 가변 영역 중, 항원 결합 부위를 형성하는 영역을 말하고, 초가변 영역이라고도 불리며, 면역 글로불린 분자마다 특히 아미노산 서열의 변화가 큰 부분을 말한다. CDR에는 경쇄 및 중쇄 각각에 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3, 및 HCDR1, HCDR2, HCDR3)이 있다. 본원에서는, 면역 글로불린 분자의 CDR은 카바트(Kabat)의 번호매김 시스템(Kabat 등, 1987, Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA)에 따라서 결정된다.
[아미노산 서열의 퍼센트(%) 동일성]
여기서 가변 영역 등의, 동정한 참조 폴리펩티드 서열에 관한 「퍼센트(%) 동일성」이란, 서열을 정렬시키고, 최대의 퍼센트 동일성을 얻기 위해 필요하면 간극을 도입하고, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로 고려하지 않는다고 한 후의, 특정한 참조 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 동일성을 측정하는 목적을 위한 얼라인먼트(alig㎚ent)는, 당업자의 기량 범위에 있는 여러가지 방법, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용함으로써 달성 가능하다. 당업자라면, 비교되는 서열의 완전한 길이에 대하여 최대의 얼라인먼트를 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열을 얼라인먼트하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 여기서의 목적을 위해서는, 퍼센트 동일성값은, 페어와이즈(pairwise) 얼라인먼트에 있어서, 서열 비교 컴퓨터 프로그램 BLAST를 사용함으로써 얻어진다.
아미노산 서열 비교에 BLAST가 사용되는 상황에서는, 주어진 아미노산 서열 A의, 주어진 아미노산 서열 B와의 퍼센트 동일성은 다음과 같이 계산된다 :
분률 X/Y의 100배
여기서, X는 서열 얼라인먼트 프로그램 BLAST의 A 및 B의 프로그램 얼라인먼트에 의해 동일하다고 일치된 스코어의 아미노산 잔기수이며, Y는 B의 전체 아미노산 잔기수다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 상이한 경우, A의 B에 대한 퍼센트 동일성은, B의 A에 대한 퍼센트 동일성과는 상이한 것은 이해될 것이다. 특별히 단서가 없는 한, 여기서의 모든 퍼센트 동일성값은, 바로 위의 단락에 나타낸 바와 같이 BLAST 컴퓨터 프로그램을 사용하여 얻어진다.
[경합]
본원에 있어서, 본 발명의 항RGMa 항체와 「경합함」이란, 본 명세서에 기재된 표면 플라스몬 공명(SPR)법에 의해 측정한 경우에, 상기 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편의 존재에 의해, 유의차를 가지고 본 발명의 항RGMa 항체와 RGMa의 결합이 저하되는 것을 말한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
<RGMa 결합 단백질>
본 발명의 RGMa 결합 단백질은, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, 또한 RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화하는, 단리된 RGMa 결합 단백질이다.
RGMa 단백질로서는 포유류 유래의 RGMa 단백질이 바람직하고, 예를 들면, 인간의 RGMa 단백질로서는 서열목록의 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 들 수 있고, 마우스의 RGMa 단백질로서는 서열목록의 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 들 수 있고, 래트의 RGMa 단백질로서는 서열목록의 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 들 수 있다. 또한, 이들 서열에 있어서, 1개 또는 수개(바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼5개)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 RGMa 단백질과 실질적으로 동일한 활성을 가지는, 폴리펩티드나 상기 아미노산 서열에 대하여 90% 이상(바람직하게는 95% 이상)의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드여도 된다.
여기서, 「RGMa 단백질과 실질적으로 동일한 활성을 가짐」이란, 그 폴리펩티드가 신경 돌기 성장 저해 작용을 가지는 것이면 어떠한 것도 포함된다.
상기 아미노산의 치환은 보존적 치환이 바람직하다. 여기서 「보존적 치환」이란, 펩티드의 활성을 실질적으로 개변하지 않도록, 아미노산 잔기를, 별도의 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 예를 들면, 어떤 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기에 의해 치환하는 경우, 어떤 극성 잔기를 동일한 전하를 가지는 별도의 극성 잔기에 의해 치환하는 경우 등을 들 수 있다. 이와 같은 치환을 행할 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산의 예로서, 비극성(소수성) 아미노산으로서는 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 메티오닌 등을 들 수 있다. 극성(중성) 아미노산으로서는, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴, 시스테인 등을 들 수 있다. 양전하를 가진 (염기성)아미노산으로서는 알기닌, 히스티딘, 리신 등을 들 수 있다. 또한, 부전하를 가진 (산성)아미노산으로서는 아스파라긴산, 글루타민산 등을 들 수 있다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질이 RGMa에 결합함이란, RGMa 특이적인 결합을 의미하지만, 인간 RGMa에 대한 해리정수(Kd)가 낮은 것이 더욱 바람직하고, 상한값으로서, 예를 들면 10-8M 이하, 보다 바람직하게는 10-9M 이하, 더욱 바람직하게는 10-10M 이하이며, 하한값으로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 10-14M 이상, 보다 바람직하게는 10-13M 이상인 RGMa 결합 단백질을 들 수 있다.
RGMa 단백질은 성숙 단백질로서, N말단측 도메인과 C말단측 도메인으로 이루어지나, C말단측 도메인 단독으로도 신경 돌기 성장 저해 활성을 갖는다. 본 발명의 RGMa 결합 단백질은, RGMa의 C말단측 도메인에만 결합하여 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화하는 것이 바람직하다. 인간 RGMa의 C말단측 도메인에 대한 해리정수(Kd)가 낮은 것이 더욱 바람직하고, 상한값으로서, 예를 들면 10-8M 이하, 보다 바람직하게는 10-9M 이하, 더욱 바람직하게는 10-10M 이하이며, 하한값으로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 10-14M 이상, 보다 바람직하게는 10-13M 이상인 RGMa 결합 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질은, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않는다. 여기서, 「RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않음」이란, 후술하는 실시예에 나타내는, RGMa와 Neogenin의 결합계에 있어서, RGMa 결합 단백질의 농도를 증가시켜도 RGMa와 Neogenin의 결합이 실질적으로 감소하지 않는 것을 의미한다. 예를 들면, RGMa와 Neogenin의 결합계에 RGMa 결합 단백질을 첨가하고, 그 농도를 증가시킨 경우에 있어서, IC50을 나타내는 RGMa 결합 단백질 농도가 10㎍/mL 이상, 보다 바람직하게는 50㎍/mL 이상, 가장 바람직하게는 100㎍/mL 이상이면, 상기 RGMa 결합 단백질은 RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않는다고 할 수 있다.
RGMa와의 결합 시험에 사용되는 Neogenin으로서는, RGMa와 동종의 Neogenin이 바람직하다. 즉, 마우스의 RGMa에 대해서는 마우스의 Neogenin을, 인간의 RGMa에 대해서는 인간의 Neogenin을 사용하는 것이 바람직하다. 인간 Neogenin의 일례로서는 서열목록의 서열번호 10의 아미노산 서열을 가지는 단백질이 예시되지만, RGMa와 결합할 수 있는 것이면, 서열목록의 서열번호 10과 90% 이상(바람직하게는 95% 이상)의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 것이면 된다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질은, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화한다. 신경 돌기 성장 저해 활성은, 후술하는 실시예에 나타내는, 신경 돌기 성장 시험에 의해 평가할 수 있다. RGMa를 첨가하면 신경 돌기의 성장이 억제되는 바, RGMa 결합 단백질을 첨가함으로써, RGMa에 의한 신경 돌기 성장 억제가 일어나지 않게 된다. 본 발명의 RGMa 결합 단백질은 RGMa 첨가에 의한 신경 돌기 성장의 억제가 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 중화할 수 있다.
RGMa 단백질의 아미노산 서열은 동물 종류에 의해 상이하므로, 서열목록의 서열번호 1로 나타내는 인간 RGMa와 서열목록의 서열번호 2로 나타내는 마우스 RGMa, 서열목록의 서열번호 3으로 나타내는 래트 RGMa에서도 아미노산 서열에 차이가 있다. 일반적으로, 항체 의약 등의 단백질 제제의 약리 시험이나 안전성 시험에서는, 마우스나 래트 등의 설치류가 실험 재료로서 이용되기 때문에, 본 발명의 RGMa 결합 단백질은 마우스나 래트의 RGMa에 결합하는 것이 바람직하고, 마우스나 래트의 RGMa에 대한 Kd가 낮은 것이 더욱 바람직하다. Kd의 상한값으로서, 예를 들면 5x10-7M 이하, 보다 바람직하게는 10-8M 이하, 더욱 바람직하게는 10-9M 이하이며, 하한값으로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 10-12M 이상, 보다 바람직하게는 10-11M 이상인 RGMa 결합 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질은 열안정성이 우수한 것이 바람직하다. 열안정성은 가열 처리에 의한 RGMa와의 결합의 저하에 의해 평가할 수 있지만, 60℃ 이상의 열처리에 의해서도 안정한 것이 바람직하고, 65℃ 이상의 열처리에 의해서도 안정한 것이 보다 바람직하고, 70℃ 이상의 열처리에 의해서도 안정한 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질이 RGMa에 결합할 때의 결합 부위는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 인간 RGMa로 말하면, EEVVNAVEDWDSQG(서열목록의 서열번호 26)(서열목록의 서열번호 1의 아미노산번호 298-311), NQQIDFQAFHTNAE(서열목록의 서열번호 27)(서열목록의 서열번호 1의 아미노산번호 322-335), PTAPETFPYET(서열목록의 서열번호 28)(서열목록의 서열번호 1의 아미노산번호 349-359), KLPVEDLYYQA(서열목록의 서열번호 29)(서열목록의 서열번호 1의 아미노산번호 367-377)의 하나 이상의 펩티드에 결합하는 것이 바람직하다. 서열목록의 서열번호 26과 27에 결합하는 것이 보다 바람직하고, 서열목록의 서열번호 26과 27, 또한 서열목록의 서열번호 28 또는 29에 결합하는 것이 더욱 바람직하다.
RGMa 결합 단백질로서는, 구체적으로는 항RGMa 항체, RGMa 결합 골격 단백질, 및 이들의 융합 단백질을 들 수 있다.
<항RGMa 항체>
본 발명의 항RGMa 항체는, RGMa 단백질 또는 그 부분 단편(예를 들면, 상기 서열목록의 서열번호 26∼29의 하나 이상을 포함하는 단편)을 항원으로서, 상기 항원을 마우스 등의 포유동물에게 면역시켜 얻어지는 폴리클로널 항체나 모노클로널 항체, 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조되는 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 인간 항체 생성 형질전환(transgenic) 동물 등을 이용하여 제조되는 인간 항체 등이 포함된다. 본 발명의 항체를 의약으로서 인간에게 투여하는 경우에는, 부작용의 관점에서, 인간화 항체 또는 인간 항체가 바람직하다.
항원은 그대로 면역에 사용해도 되고, 캐리어 단백질과의 복합체로서 사용해도 된다. 항원과 캐리어 단백질의 복합체 조제에는 글루타르알데히드, 카르보디이미드, 말레이미드 활성 에스테르 등의 축합제를 사용할 수 있다. 캐리어 단백질은 소혈청 알부민, 사이로글로블린, 헤모시아닌, KLH 등이 예시된다.
면역되는 포유동물로서는 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 염소, 말 또는 소를 들 수 있고, 접종 방법은 피하, 근육 또는 복강 내의 투여를 들 수 있다. 투여에 있어서는 완전 프로인트 어주번트(Freund's Adjuvant)나 불완전 프로인트 어주번트와 혼화하여 투여해도 되고, 투여는 통상 2∼5주마다 1회씩 행해진다. 면역된 동물의 비장 또는 림프절로부터 얻어진 항체 생성 세포는 골수종 세포와 세포 융합시키고, 하이브리도마로서 단리된다. 골수종 세포로서는 포유동물 유래, 예를 들면 마우스, 래트, 인간 등의 유래의 것이 사용된다.
<폴리클로널 항체>
폴리클로널 항체는, 기존의 일반적인 제조 방법에 의해 취득할 수 있다. 즉, 예를 들면 전술한 바와 같은 항원을, 필요에 따라 프로인트 어주번트와 함께, 상기와 같은 포유동물에게 면역시킴으로써 이 면역 감작 동물로부터 얻은 혈청으로부터 취득할 수 있다.
<모노클로널 항체>
모노클로널 항체는, 구체적으로는 하기와 같이 하여 취득할 수 있다. 즉, 전술한 바와 같은 항원을 면역원으로 하고, 상기 면역원을, 필요에 따라 프로인트 어주번트(Freund's Adjuvant)와 함께, 상기와 같은 포유동물의 피하, 근육 내, 정맥 내, 족적(footpad) 내 또는 복강 내에 1회∼수회 주사하거나 또는 이식하는 것에 의해 면역 감작을 실시한다. 통상, 첫회 면역으로부터 약 1∼14일마다 1∼4회 면역을 행하여, 최종 면역으로부터 약 1∼5일 후에 면역 감작된 해당 포유동물로부터 항체 생성 세포가 취득된다.
모노클로널 항체는, 당업자에게 주지 방법을 이용하여 얻을 수 있다[예를 들면, 『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)].
모노클로널 항체를 분비하는 「하이브리도마」의 조제는, 쾰러 및 밀슈타인 들의 방법[네이처(Nature), 256, 495, 1975] 및 그에 준하는 수식 방법에 따라서 행할 수 있다. 즉, 면역 감작된 포유동물로부터 취득되는 비장 등에 포함되는 항체 생성 세포와, 포유동물, 바람직하게는 마우스, 래트 또는 인간 유래의 자기 항체 생성능이 없는 미엘로마 세포를 세포 융합시킴으로써 조제된다.
세포 융합에 사용되는 미엘로마 세포로서는, 예를 들면 마우스 유래 미엘로마 P3/X63-AG8.653(653), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1), P3/X63-Ag8.U1(P3U1), SP2/0-Ag14(Sp2/O, Sp2), PAI, F0 또는 BW5147, 래트 유래 미엘로마 210RCY3-Ag.2.3., 인간 유래 미엘로마 U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 또는 CEM-T15 등을 사용할 수 있다.
융합 촉진제로서는 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있고, 통상에는, 20∼50% 정도 농도의 폴리에틸렌글리콜(평균 분자량 1000∼4000)을 사용하여 20∼40℃, 바람직하게는 30∼37℃의 온도 하, 항체 생성 세포수와 골수종 세포수의 비교는 통상 1:1∼10:1 정도, 약 1∼10분간 정도 반응시킴으로써 세포 융합을 실시할 수 있다.
모노클로널 항체를 생성하는 하이브리도마 클론의 스크리닝은, 하이브리도마를, 예를 들면 미량정량판(microtiter plate) 중에서 배양하고, 웰의 배양 상청의 면역 항원에 대한 반응성을 ELISA 등의 면역화학적 방법에 의해 측정하는 것에 의해 행할 수 있다.
항체 생성 하이브리도마의 스크리닝에 있어서는, RGMa 단백질과의 결합 어세이에 더하여, 해당 항체가 RGMa 단백질과 Neogenin의 결합을 저해하지 않는지의 평가와, 해당 항체가 RGMa 단백질의 기능(신경 돌기 성장 저해 활성)을 중화하는지의 평가도 행한다. 이들 스크리닝 방법에 의해, 본 발명의 항RGMa 항체를 선택할 수 있다.
목적으로 하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 포함하는 웰로부터, 한계 희석법에 의해 클로닝을 더 행하여, 클론을 얻을 수 있다. 하이브리도마의 선별, 육종은, 통상 HAT(히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)을 첨가하여, 10∼20% 소태아혈청을 포함하는 동물세포용 배지에서 행해진다.
하이브리도마로부터의 모노클로널 항체의 제조는, 하이브리도마를 인비트로로 배양할 것인가, 또는 마우스, 래트 등의 포유동물의 복수(復水) 중 등에서의 인비보로 증식시키고, 얻어진 배양 상청, 또는 포유동물의 복수로부터 단리하는 것에 의해 행할 수 있다.
인비트로로 배양하는 경우에는, 배양하는 세포 종류의 특성 및 배양 방법 등의 여러가지 조건에 맞추어, 하이브리도마를 증식, 유지 및 보존시키고, 배양 상청 중에 모노클로널 항체를 생성시키는 데에 적절한 영양 배지를 사용하는 것이 가능하다.
기본 배지로서는, 예를 들면 Ham'F12 배지, MCDB153 배지 또는 저칼슘 MEM 배지 등의 저칼슘 배지 및 MCDB104 배지, MEM 배지, D-MEM 배지, RPMI1640 배지, ASF104 배지 또는 RD 배지 등의 고칼슘 배지 등을 들 수 있고, 상기 기본 배지는, 목적에 따라, 예를 들면 혈청, 호르몬, 사이토카인 및/또는 각종 무기물질 또는 유기물질 등을 함유시킬 수 있다.
모노클로널 항체의 단리, 정제는, 전술한 배양 상청 또는 복수를, 포화 황산암모늄, 유글로불린 침전법, 카프로산법, 카프릴산법, 이온 교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항면역글로불린 컬럼 또는 프로테인A 컬럼 등의 친화(affinity) 컬럼 크로마토그래피에 제공하는 것 등에 의해 행할 수 있다. 구체적으로는, 모노클로널 항체의 정제는 면역 글로불린의 정제법으로서 기지의 방법을 이용하면 되고, 예를 들면, 유안 분획법, PEG 분획법, 에탄올 분획법, 음이온 교환체의 이용, 더 RGMa 단백질을 사용하는 친화 크로마토그래피 등의 수단에 의해 용이하게 달성할 수 있다.
모노클로널 항체는 파지디스플레이(phage display)법에 의해 취득할 수도 있다. 파지디스플레이법에서는, 임의의 파지 항체 라이브러리로부터 선별한 파지를, 목적하는 면역원을 사용하여 스크리닝을 행하고, 면역원에 대한 원하는 결합성을 가지는 파지를 선택한다. 다음에, 파지 내에 포함되는 항체 대응 서열을 단리 또는 서열 결정하고, 단리된 서열 또는 결정된 서열 정보에 기초하여, 항체 또는 항원 결합 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 구축한다. 그리고, 이러한 발현 벡터를 트랜스팩션한 세포주를 배양하는 것에 의해, 모노클로널 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리로서, 인간 항체 라이브러리를 이용하는 것에 의해, 원하는 결합성을 가지는 인간 항체를 생성할 수 있다.
골격 단백질로서는 인간의 세린 프로테아제 조해제의 Kunitz 도메인이나 인간의 파이브로넥틴의 세포외 도메인 등이 이용되고, 골격 상의 표적 결합 부위의 서열을 개변하면 RGMa에 결합하는 골격 단백질을 생성할 수 있다(Clifford Mintz et.al BioProcess International, 2013, Vol.11(2), pp40-48).
융합 단백질로서는, RGMa 결합 단백질에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자(TGF-β, NGF, Neurotrophin 등), 알부민, 효소, 다른 항체 등의 본원의 RGMa 결합 단백질 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자공학적으로 결합한 RGMa 결합 단백질을 들 수 있다.
기능 분자로서 PEG를 결합하는 경우, PEG는 비한정적으로 분자량 2000에서 100000Da, 보다 바람직하게는 10000에서 50000Da의 것을 사용할 수 있고, 직쇄형이어도 되고, 브랜치형인 것이어도 된다. PEG는, 예를 들면 NHS 활성기를 사용함으로써, RGMa 결합 단백질의 아미노산 N말단 아미노기 등에 결합할 수 있다.
기능 분자로서 방사성 물질을 사용할 경우, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu 또는 211At 등을 사용할 수 있다. 방사성 물질은, 클로라민T법 등에 의해 RGMa 결합 단백질에 직접 결합시킬 수 있다.
기능 분자로서 독소를 사용할 경우, 세균 독소(예를 들면, 디프테리아 독소), 식물 독소(예를 들면, 리신), 저분자 독소(예를 들면, 겔다나마이신), 메이탄시노이드 및 칼리키아미신 등을 사용할 수 있다.
기능 분자로서 저분자 화합물을 사용할 경우, 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 마이토마이신, 네오카르지노스타틴, 빈데신 및 FITC 등의 형광 색소 등을 들 수 있다.
기능 분자로서, 효소를 사용할 경우, 루시페라제(예를 들면, 반딧불 루시페라제 및 세균 루시페라제; 미국특허 제4737456호), 말산 디히드로게나아제, 우레아제, 퍼옥시다아제[예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRPO)], 알칼리포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드옥시다아제(예를 들면, 글루코오스옥시다아제, 갈락토오스옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 디히드로게나아제), 복소환식 옥시다아제(예를 들면, 우리카아제 및 크산틴 옥시다아제 등), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등을 사용할 수 있다.
독소, 저분자 화합물 또는 효소를 화학적으로 결합할 때 사용하는 링커로서는, 2가 라디칼(예를 들면, 알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌 ), -(CR2)nO(CR2)n-(R은 임의의 치환기, n은 양의 정수)로 표시되는 링커나 알콕시의 반복 단위(예를 들면, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시 등) 및 알킬아미노(예를 들면, 폴리에틸렌아미노, JeffamineTM), 및 이산에스테르 및 아미드(숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드 등을 들 수 있음)를 들 수 있다. 기능 분자를 결합시키는 화학적 수식 방법은 당분야에 있어서 이미 확립되어 있다(D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies. , 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152: 127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93: 8681).
본 발명의 RGMa 결합 단백질의 바람직한 태양으로서 키메라 항체를 들 수 있다. 「키메라 항체」로서는, 가변 영역이 비인간 동물(마우스, 래트, 햄스터, 닭 등)의 면역글로불린 유래의 가변 영역이고, 정상 영역이 인간 면역글로불린 유래의 정상 영역인, 키메라 항체가 예시된다. 예를 들면, 항원을 마우스에 면역시키고, 그 마우스 모노클로널 항체의 유전자로부터 항원과 결합하는 가변 영역을 잘라내고, 인간 골수 유래의 항체 정상 영역과 결합하여 제작할 수 있다. 인간 면역글로불린 유래의 정상 영역은 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA(IgA1, IgA2), IgD 및 IgE 등의 이소 타입에 의해 각각 고유의 아미노산 서열을 갖지만, 본 발명에 있어서의 재조합 키메라 항체의 정상 영역은 어떠한 이소 타입에 속하는 인간 면역글로불린의 정상 영역이라도 된다. 바람직하게는, 인간 IgG의 정상 영역이다. 이와 같이 제작한 키메라 항체의 유전자를 이용하여 발현 벡터를 제작할 수 있다. 상기 발현 벡터에서 숙주 세포를 형질전환하는 것에 의해 키메라 항체 생성 형질전환 세포를 얻고, 상기 형질전환 세포를 배양함으로써 배양 상청 중으로부터 목적하는 키메라화 항체를 얻는다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질의 다른 바람직한 태양으로서 인간화 항체를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 「인간화 항체」는, 마우스 등의 비인간 동물 항체의 항원 결합 부위(CDR; 상보성 결정 영역)의 DNA 서열만을 인간 항체 유전자에 이식(CDR 그라프팅)한 항체다. 예를 들면, 일본공표특허 평4-506458호 공보 및 일본특허 제2912618호 명세서 등에 기재된 방법을 참조하여 제작할 수 있다. 구체적으로는, 그 CDR의 일부 또는 전부가 비인간 포유동물(마우스, 래트, 햄스터 등)의 모노클로널 항체에 유래하는 CDR이고, 그 가변 영역의 프레임워크 영역이 인간 면역글로불린 유래의 가변 영역의 프레임워크 영역이며, 또한 그 정상 영역이 인간 면역글로불린 유래의 정상 영역인 것을 특징으로 하는 인간화 항체를 의미한다.
본 발명에서의 인간화 항체는, 예를 들면, 다음과 같이 하여 제조할 수 있다. 그러나, 그와 같은 제조 방법에 한정되는 것이 아닌 것은 말할 필요도 없다.
예를 들면, 마우스 모노클로널 항체에 유래하는 재조합 인간화 항체는, 일본공표특허 평4-506458호 공보 및 일본공개특허 소62-296890호 공보 등을 참조하여, 유전자공학적으로 제작할 수 있다. 즉, 마우스 모노클로널 항체를 생성하는 하이브리도마로부터, 마우스 중쇄 CDR 부분의 DNA와 마우스 경쇄 CDR 부분의 DNA를 단리하고, 인간 면역글로불린 유전자로부터 인간 중쇄 CDR 이외의 전영역의 인간 중쇄 유전자와, 인간 경쇄 CDR 이외의 전영역의 인간 경쇄 유전자를 단리한다.
단리한 마우스 중쇄 CDR 부분의 DNA를 이식한 인간 중쇄 유전자를 발현 가능하도록 적당한 발현 벡터에 도입하고, 동일하게 마우스 경쇄 CDR 부분의 DNA를 이식한 인간 경쇄 유전자를 발현 가능하도록 적당한 또 하나의 발현 벡터에 도입한다. 또는, 마우스의 CDR을 이식한 인간의 중쇄 및 경쇄 유전자를 동일한 발현 벡터에 발현 가능하도록 도입할 수도 있다. 이와 같이 하여 제작된 발현 벡터에서 숙주 세포를 형질전환하는 것에 의해 인간화 항체 생성 형질전환 세포를 얻고, 상기 형질전환 세포를 배양함으로써 배양 상청 중으로부터 목적하는 인간화 항체를 얻는다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질의 별도의 바람직한 태양으로서 인간 항체를 들 수 있다. 인간 항체란, 면역글로불린을 구성하는 중쇄의 가변 영역 및 중쇄의 정상 영역, 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄의 정상 영역을 포함하는 모든 영역이 인간 면역글로불린을 코딩하는 유전자에 유래하는 면역글로불린으로 되어 있는 항체로서, 인간 항체 유전자를 마우스에 도입하여 제작할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 적어도 인간 면역글로불린 유전자를 마우스 등의 인간 이외의 포유동물의 유전자좌 내에 삽입시키는 것에 의해 제작된 형질전환 동물을, 항원으로 면역 감작하는 것에 의해, 전술한 폴리클로널 항체 또는 모노클로널 항체의 제작법과 동일하게 하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 인간 항체를 생성하는 형질전환 마우스는, Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; 일본공표특허 평4-504365호 공보; 일본공표특허 평7-509137호 공보; 국제공개 WO94/25585호 팜플렛; Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 및 일본공표특허 평6-500233호 공보 등에 기재된 방법에 따라서 제작할 수 있다. 보다 구체적으로는, HuMab(등록상표) 마우스(Medarex, Princeton NJ), KMTM 마우스(Kirin Pharma Company, Japan), KM(FCγRIIb-KO) 마우스 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로널 항체로서 구체적으로는, 중쇄 가변 영역의 CDR에 서열목록의 서열번호 33(HCDR1), 34(HCDR2) 및 35(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역의 CDR에 서열목록의 서열번호 30(LCDR1), 31(LCDR2) 및 32(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
그리고, RGMa와의 결합능을 가지고, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화한다는 본 발명의 항체 특성이 유지되는 한, 이들 CDR의 하나 이상에 있어서, 1개∼수개의 아미노산이 치환되어도 된다. 여기서, 1개∼수개란, 예를 들면 1개 또는 2개다. 그리고, 상기 아미노산 치환은 본 발명의 특성을 유지하기 위해 보존적 치환인 것이 바람직하다. 항체의 특성이 유지됨이란, 이들 특성이 CDR의 아미노산 서열 개변 전과 비교하여 동일한 정도, 예를 들면 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상으로 유지되는 것을 말한다. 그리고, 유지는 향상도 포함한다.
CDR 이외의 영역은 항체로서의 구조를 유지하고, 기능을 발휘할 수 있는 서열이면 특별히 제한되지 않고, 마우스 유래의 서열, 인간 유래의 서열, 다른 포유동물 유래의 서열, 그들의 키메라 서열, 인공 서열 중 어느 것이어도 된다. 정상 영역을 포함하는 경우에 있어서는, 중쇄 및 경쇄의 정상 영역의 아미노산 서열은, Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 및 Cell vol.22, p197, 1980에 기재된 것이 예시된다.
이들 CDR을 가지는 마우스 항체로서는, 경쇄에 서열목록의 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 항체, 중쇄에 서열목록의 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 항체가 예시된다. 그리고, 이들 아미노산 서열에 있어서는, RGMa와의 결합능을 가지고, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 1개 또는 수개의 아미노산(1∼20개, 1∼10개 또는 1∼5개)의 치환, 결실, 부가 또는 삽입이 있어도 된다. 이와 같은 치환, 결실, 부가는 CDR에 도입되어도 되지만, CDR 이외의 영역에 도입되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산 치환은 본 발명의 특성을 유지하기 위해 보존적 치환인 것이 바람직하다. 또한, 상기 마우스 항체에 있어서, 정상 영역을 인간 유래로 한 마우스/인간 키메라 항체도 예시된다. 이와 같은 마우스/인간 키메라 항체로서는, 경쇄에 서열목록의 서열번호 8의 아미노산 서열(가변 영역은 1∼107)을 가지는 항체, 중쇄에 서열목록의 서열번호 9의 아미노산 서열(가변 영역은 1∼116)을 가지는 항체가 예시된다. 그리고, 이들 아미노산 서열에 있어서, RGMa와의 결합능을 가지고, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 1개 또는 수개의 아미노산(1∼20개, 1∼10개 또는 1∼5개)의 치환, 결실, 부가 또는 삽입이 있어도 된다. 이와 같은 치환, 결실, 부가는 CDR에 도입되어도 되지만, CDR 이외의 영역에 도입되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산 치환은 본 발명의 특성을 유지하기 위해 보존적 치환인 것이 바람직하다.
또한, CDR 이외를 인간 유래로 한 인간화 항체도 예시된다. 이와 같은 인간화 항체로서는, 중쇄에 서열목록의 서열번호 11∼18(가변 영역은 N말단측 116잔기까지) 중 어느 아미노산 서열을 가지고, 경쇄에 서열목록의 서열번호 19∼25(가변 영역은 N말단측 1∼107잔기까지) 중 어느 아미노산 서열을 가지는 항체가 예시된다.
그리고, 인간화 항체의 아미노산 서열(중쇄: 서열목록의 서열번호 11∼18, 경쇄: 서열목록의 서열번호 19∼25)에 있어서는, RGMa와의 결합능을 가지고, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 1개 또는 수개의 아미노산(1∼20개, 1∼10개 또는 1∼5개)의 치환, 결실, 부가 또는 삽입이 있어도 된다. 이와 같은 치환, 결실, 부가는 CDR에 도입되어도 되지만, CDR 이외의 영역에 도입되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산 치환은 본 발명의 특성을 유지하기 위해 보존적 치환인 것이 바람직하다.
중쇄 아미노산 서열과 경쇄 아미노산 서열은 이들의 임의의 조합이어도 되지만, 특히 바람직한 것은, 중쇄에 서열목록의 서열번호 15의 아미노산 서열, 경쇄에 서열목록의 서열번호 19의 아미노산 서열을 가지는 항체다. 서열목록의 서열번호 15의 아미노산 서열 중, 중쇄 가변 영역에 상당하는 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 41에 나타내고, 경쇄 가변 영역에 상당하는 아미노산 서열을 서열목록의 서열번호 42에 나타낸다. 즉, 본 발명의 특히 바람직한 항체는, 중쇄 가변 영역에 서열목록의 서열번호 41의 아미노산 서열을 가지고, 경쇄 가변 영역에 서열목록의 서열번호 42의 아미노산 서열을 가지는 항체다.
그리고, 이들 아미노산 서열에 있어서, RGMa와의 결합능을 가지고, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 1개 또는 수개의 아미노산(1∼20개, 1∼10개 또는 1∼5개)의 치환, 결실, 부가 또는 삽입이 있어도 된다. 이와 같은 치환, 결실, 부가는 CDR에 도입되어도 되지만, CDR 이외의 영역에 도입되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산 치환은 본 발명의 특성을 유지하기 위해 보존적 치환인 것이 바람직하다.
이와 같은 서열목록의 서열번호 41 및/또는 서열목록의 서열번호 42의 아미노산 서열에 있어서 치환, 결실 등이 포함된 본 발명의 항체 아미노산 서열은, 중쇄 가변 영역이 서열목록의 서열번호 41과 90% 이상(보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 가지는 아미노산 서열이고, 경쇄 가변 영역이 서열목록의 서열번호 42과 90% 이상(보다 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상)의 동일성을 가지는 아미노산 서열이다.
본 발명의 모노클로널 항체의 다른 구체예로서, 중쇄 가변 영역의 CDR에 서열목록의 서열번호 39(HCDR1), 40(HCDR2) 및 SFG(HCDR3)의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역의 CDR에 서열목록의 서열번호 36(LCDR1), 37(LCDR2) 및 38(LCDR3)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다. 그리고, RGMa와의 결합능을 가지고, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화한다는 본 발명의 항체 특성이 유지되는 한, 이들 CDR의 하나 이상에 있어서, 1개∼수개의 아미노산이 치환되어도 된다. 여기서, 1개∼수개란, 예를 들면 1개 또는 2개다. 그리고, 상기 아미노산 치환은 본 발명의 특성을 유지하기 위해 보존적 치환인 것이 바람직하다.
CDR 이외의 영역은 항체로서의 구조를 유지하고, 기능을 발휘할 수 있는 서열이면 특별히 제한되지 않고, 마우스 유래의 서열, 인간 유래의 서열, 다른 포유동물 유래의 서열, 그들의 키메라 서열, 인공 서열 중 어느 것이라도 된다. 정상 영역을 포함하는 경우에 있어서는, 중쇄 및 경쇄의 정상 영역의 아미노산 서열은, Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 및 Cell vol.22, p197, 1980에 기재된 것이 예시된다.
이들 CDR을 가지는 마우스 항체로서는, 경쇄에 서열목록의 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 항체, 중쇄에 서열목록의 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 항체가 예시된다. 그리고, 이들 아미노산 서열에 있어서, RGMa와의 결합능을 가지고, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화한다는 특성이 유지되는 한, 1개 또는 수개의 아미노산(1∼20개, 1∼10개 또는 1∼5개)의 치환, 결실, 부가 또는 삽입이 있어도 된다. 이와 같은 치환, 결실, 부가는 CDR에 도입되어도 되지만, CDR 이외의 영역에 도입되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산 치환은 본 발명의 특성을 유지하기 위해 보존적 치환인 것이 바람직하다.
또한, 상기 마우스 항체에 있어서, 정상 영역을 인간 유래로 한 키메라 항체도 예시된다. 또한, CDR 이외를 인간 유래로 한 인간화 항체도 예시된다.
본 발명의 항RGMa 항체에는, 특정한 아미노산 서열로 이루어지는 CDR(예를 들면, LCDR1로서 서열목록의 서열번호 30, LCDR2로서 서열목록의 서열번호 31, LCDR3으로서 서열목록의 서열번호 32, HCDR1로서 서열목록의 서열번호 33, HCDR2로서 서열목록의 서열번호 34, HCDR3으로서 서열목록의 서열번호 35의 아미노산 서열), 또는 특정한 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역(예를 들면, 중쇄 가변 영역으로서 서열목록의 서열번호 41, 경쇄 가변 영역으로서 42의 아미노산 서열)을 가지는 다중특이성 항체, 기능 개변 항체, 컨쥬게이트 항체가 포함된다.
본 발명의 항RGMa 항체는, 그 자체에 RGMa 이외의 다른 항원 결합 특이성을 가지는 항체를 유전자공학적인 방법에 의해 결합하는 것에 의해, 이중특이성 항체 등의 다중특이성 항체를 제작할 수 있다. 상기 유전자공학적인 방법은 당분야에 있어서 이미 확립되어 있다. 예를 들면, 가변 영역을 직렬로 연결한 DVD-Ig[Wu 등, Nature Biotechnology 25(11), 1290(2007)]나, 항체의 Fc 영역을 개변함으로써, 상이한 항원에 결합하는 2종류의 항체의 중쇄가 조합되는 ART-Ig의 기술[Kitazawa 등, Nature Medicine 18(10), 1570(2012)]을 이용하면 원하는 이중특이성 항체를 취득할 수 있다. RGMa 이외의 다른 항원으로서는, 비한정적으로 Nogo, MAG, Omgp, CSPG, Sema3A, Lingo-1 등의 신경 돌기 성장을 저해하는 인자나, TNF-α, IL-6 수용체, CD3, CD20, α4 인테그린, BLys, Thymic Stromal Lymphopoietin, IgE, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-17, IL-23, IL-25 등의 면역 관련 분자를 들 수 있다.
본 발명의 항RGMa 항체의 개변 분자로서 기능 개변 항체를 들 수 있다. 기능 개변 항체는, 주로 Fc 영역 등을 개변하는 것에 의해, 세포 살상 기능이나 보체 활성화 기능, 혈중 반감기 연장 기능 등의 기능을 개변한 항체를 의미한다(시타라 겐야, 약학 잡지, 2009, Vol.129 (1), p3; 이시이 아키코 등, 일본 약리학 잡지, 2010, Vol.136(5), p280; 하시구치 슈헤이 등, 생화학, 2010, Vol.82(8), p710).
항RGMa 항체의 기능 개변 항체는, 이하와 같은 방법으로 조제된다. 예를 들면, 본원 항RGMa 항체를, 숙주 세포로서 α1,6-푸코스 전이효소(FUT8) 유전자를 파괴한 CHO세포를 사용하여 제조하면, 당쇄의 푸코스 함량이 저하되어 세포 살상 기능이 높아진 항체가 얻어지고, FUT8 유전자를 도입한 CHO세포를 숙주 세포로서 제조하면, 세포 살상 기능이 낮은 항체가 얻어진다(국제공개 제2005/035586호, 국제공개 제2002/31140호, 국제공개 제00/61739호). 또한, Fc 영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 보체 활성화 기능을 조절할 수 있다(미국특허 제6737056호, 미국특허 제7297775호, 미국특허 제7317091호). 또한, Fc 수용체의 하나인 FcRn으로의 결합을 향상시킨 Fc 영역의 변이체를 사용하는 것에 의해, 혈중 반감기의 연장을 도모할 수 있다(하시구치 슈헤이 등, 생화학, 2010, Vol.82(8), p710). 이들 기능 개변 항체는, 유전자공학적으로 제조할 수 있다.
본 발명의 항RGMa 항체의 개변 분자로서 컨쥬게이트 항체를 들 수 있다. 컨쥬게이트 항체로서는, 항RGMa 항체로 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자(TGF-β, NGF, Neurotrophin 등), 알부민, 효소, 다른 항체 등의 본원의 항RGMa 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자공학적으로 결합한 컨쥬게이트 항체를 들 수 있다.
기능 분자로서 PEG를 결합할 경우, PEG는 비한정적으로 분자량 2000에서 100000Da, 보다 바람직하게는 10000에서 50000Da의 것이 사용할 수 있고, 직쇄형이어도 되고, 브랜치형인 것이어도 된다. PEG는, 예를 들면 NHS 활성기를 사용함으로써, 항체의 아미노산의 N말단 아미노기 등에 결합할 수 있다.
기능 분자로서 방사성 물질을 사용할 경우, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu 또는 211At 등을 사용할 수 있다. 방사성 물질은, 클로라민T법 등에 의해 항체에 직접 결합시킬 수 있다.
기능 분자로서 독소를 사용할 경우, 세균 독소(예를 들면, 디프테리아 독소), 식물 독소(예를 들면, 리신), 저분자 독소(예를 들면, 겔다나마이신), 메이탄시노이드, 및 칼리키아미신 등을 사용할 수 있다.
기능 분자로서 저분자 화합물을 사용할 경우, 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 마이토마이신, 네오카르지노스타틴, 빈데신 및 FITC 등의 형광 색소 등을 들 수 있다.
기능 분자로서 효소를 사용할 경우, 루시페라제(예를 들면, 반딧불 루시페라제 및 세균 루시페라제; 미국특허 제4737456호), 말산 디히드로게나아제, 우레아제, 퍼옥시다아제[예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRPO)], 알칼리포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드옥시다아제(예를 들면, 글루코오스옥시다아제, 갈락토오스옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 디히드로게나아제), 복소환식 옥시다아제(예를 들면, 우리카아제 및 크산틴옥시다아제 등), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등을 이용할 수 있다.
독소, 저분자 화합물 또는 효소를 화학적으로 결합할 때 사용하는 링커로서는, 2가 라디칼(예를 들면, 알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌 ), -(CR2)nO(CR2)n-(R은 임의의 치환기, n은 양의 정수)로 표시되는 링커나 알콕시의 반복 단위(예를 들면, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시 등) 및 알킬아미노(예를 들면, 폴리에틸렌아미노, JeffamineTM), 및 2산에스테르 및 아미드(숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드 등을 들 수 있음)를 들 수 있다. 기능 분자를 결합시키는 화학적 수식 방법은 당분야에 있어서 이미 확립되어 있다(D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152: 127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93: 8681).
본 발명에 있어서의 항체의 「항원 결합 단편」이란, 전술한 바와 같은 항체의, 항원 결합성을 가지는 일부분의 영역을 의미하고, 구체적으로는 F(ab')2, Fab', Fab, Fv(variable fragment of antibody), 디술피드 결합 Fv, 1본쇄 항체(scFv) 및 이들의 중합체 등을 들 수 있고, 또한, 항원 결합 단편에는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자(TGF-β, NGF, Neurotrophin 등), 알부민, 효소, 다른 항체 등의 본원의 항RGMa 항체 이외의 기능 분자가 화학적 또는 유전자공학적으로 결합되어 있는 컨쥬게이트 항원 결합 단편이 포함된다.
여기서, 「F(ab')2」 및 「Fab」란, 면역글로불린을, 단백 분해효소인 펩신 또는 파파인 등으로 처리함으로써 제조되고, 힌지 영역 중의 2개의 중쇄 사이에 존재하는 디술피드 결합의 전후에서 소화되어 생성되는 항체 프래그먼트를 의미한다. 예를 들면, IgG를 파파인으로 처리하면, 힌지 영역 중의 2개의 중쇄 사이에 존재하는 디술피드 결합의 상류에서 절단되어 VL(경쇄 가변 영역)과 CL(경쇄 정상 영역)으로 이루어지는 경쇄, 및 VH(중쇄 가변 영역)와 CHγ1(중쇄 정상 영역 중의 γ1 영역)로 이루어지는 중쇄 프래그먼트가 C말단 영역에서 디술피드 결합에 의해 결합한 상동의 2개의 항체 프래그먼트를 제조할 수 있다. 이들 2개의 상동의 항체 프래그먼트를 각각 Fab라고 한다. 또한, IgG를 펩신으로 처리하면, 힌지 영역 중의 2개의 중쇄 사이에 존재하는 디술피드 결합의 하류에서 절단되어 상기 2개의 Fab가 힌지 영역에서 연결된 것보다 약간 큰 항체 프래그먼트를 제조할 수 있다. 이 항체 프래그먼트를 F(ab')2라고 한다.
본 발명의 항RGMa 항체의 항원 결합 단편의 개변 분자로서 컨쥬게이트 항원 결합 단편을 들 수 있다. 컨쥬게이트 항원 결합 단편으로서는, 항RGMa 항체의 항원 결합성을 가지는 일부분의 영역에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비펩티드성 폴리머, 방사성 물질, 독소, 저분자 화합물, 사이토카인, 성장 인자(TGF-β, NGF, Neurotrophin 등), 알부민, 효소, 다른 항체 등의 본원의 항RGMa 항체 이외의 기능 분자를 화학적 또는 유전자공학적으로 결합한 컨쥬게이트 항원 결합 단편을 들 수 있다.
기능 분자로서 PEG를 결합할 경우, PEG는 비한정적으로 분자량 2000에서 100000Da, 보다 바람직하게는 10000에서 50000Da의 것이 사용할 수 있고, 직쇄형이어도 되고, 브랜치형인 것이어도 된다. PEG는, 예를 들면 NHS 활성기를 사용하는 것에 의해, 항RGMa 항체의 항원 결합성을 가지는 일부분의 영역의 N말단 아미노기 등에 결합할 수 있다.
기능 분자로서 방사성 물질을 사용할 경우, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu 또는 211At 등을 사용할 수 있다. 방사성 물질은, 클로라민T법 등에 의해 항RGMa 항체의 항원 결합성을 가지는 일부분의 영역에 직접 결합시킬 수 있다.
기능 분자로서 독소를 사용할 경우, 세균 독소(예를 들면, 디프테리아 독소), 식물 독소(예를 들면, 리신), 저분자 독소(예를 들면, 겔다나마이신), 메이탄시노이드 및 칼리키아미신 등을 사용할 수 있다.
기능 분자로서 저분자 화합물을 사용할 경우, 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 마이토마이신, 네오카르지노스타틴, 빈데신 및 FITC 등의 형광 색소 등을 들 수 있다.
기능 분자로서 효소를 사용할 경우, 루시페라제(예를 들면, 반딧불 루시페라제 및 세균 루시페라제; 미국특허 제4737456호), 말산 디히드로게나아제, 우레아제, 퍼옥시다아제[예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRPO)], 알칼리포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드옥시다아제(예를 들면, 글루코오스옥시다아제, 갈락토오스옥시다아제, 및 글루코오스-6-포스페이트 디히드로게나아제), 복소환식 옥시다아제(예를 들면, 우리카아제 및 크산틴옥시다아제 등), 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등을 이용할 수 있다.
독소, 저분자 화합물 또는 효소를 화학적으로 결합할 때 사용하는 링커로서는, 2가 라디칼(예를 들면, 알킬렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌 ), -(CR2)nO(CR2)n-(R은 임의의 치환기, n은 양의 정수)로 표시되는 링커나 알콕시의 반복 단위(예를 들면, 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시 등) 및 알킬아미노(예를 들면, 폴리에틸렌아미노, JeffamineTM), 및, 2산에스테르 및 아미드(숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트 및 카프로아미드 등을 들 수 있음)를 들 수 있다. 기능 분자를 결합시키는 화학적 수식 방법은 당분야에 있어서 이미 확립되어 있다(D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152: 127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93: 8681).
본 발명의, 특정한 아미노산 서열을 가지는 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항RGMa 항체는, 혈중 반감기를 길게 유지하고자 하는 것으로부터 해당 정상 영역이 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 정상 영역인 것이 바람직하다.
본 발명에는, 상기와 같은 특정한 CDR의 아미노산 서열을 가지는 항체와, RGMa 단백질과의 결합에 있어서 경합하는 항RGMa 항체, 및 그 항원 결합 단편도 포함된다.
상기와 같은 특정한 CDR의 아미노산 서열을 가지는 항체와 RGMa의 결합에 있어서 경합하는 항체로서는, 에피토프로서, Glu298∼Gly311, Asn322∼Glu335, Lys367∼Ala377 및 Pro349∼Thr359로부터 선택되는 영역에 에피토프를 가지는 항체가 예시된다.
상기 항체는, 상기와 같은 CDR 서열을 가지는 항체와 RGMa 단백질의 결합계에서, 공존시키는 것에 의해 취득(스크리닝)하거나, 평가할 수 있다. 예를 들면, 이하의 표면 플라스몬 공명(SPR)법에 의해 스크리닝함으로써 취득할 수 있다.
아비딘이 고정된 센서칩에 비오틴화한 인간 RGMa 단백질(4㎍/mL)을 리간드로서 로딩함으로써, 1300에서 1600RU 상당의 인간 RGMa 단백질을 고정한다. 다음에, 임의의 항RGMa 항체(15㎍/mL)를 아날라이트(analyte)로서 로딩하고, 센서칩 상에 고정된 인간 RGMa 단백질에 결합시킨다. 이를 복수회 반복함으로써, 센서칩 상의 인간 RGMa 단백질의 모든 분자에 임의의 항RGMa 항체가 결합되어 있는 상태(포화 상태)를 형성하고, 포화 상태에서의 결합량(포화 결합량 1)을 구한다.
동일한 실험을 본 발명의 특정한 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 항RGMa 항체에서도 실시하고, 포화 상태에서의 결합량(포화 결합량 2)을 구한다.
계속해서, 센서칩 상의 인간 RGMa 단백질을 본 발명의 특정한 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 항RGMa 항체로 포화시킨 후, 임의의 항RGMa 항체(15㎍/mL)를 아날라이트로서 로딩하고, 본 발명의 특정한 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 항RGMa 항체로 포화된 인간 RGMa 단백질에 추가되는 형태로 결합하는지 아닌지를 조사한다.
임의의 항RGMa 항체가, 본 발명의 특정한 CDR의 아미노산 서열을 포함하는, 항RGMa 항체로 포화된 인간 RGMa 단백질에 추가되는 형태로, 상기에서 산출한 임의의 항RGMa 항체의 포화 결합량 1을 나타내면서 결합할 수 있는 경우에는, 그 항체는 「경합하지 않는다」고 판단된다. 한편, 임의의 항RGMa 항체가, 본 발명의 특정한 CDR의 아미노산 서열을 포함하는, 항RGMa 항체로 포화된 인간 RGMa 단백질에 추가되는 형태로 결합할 수 없는 경우에는, 그 항체는 「경합한다」고 판단된다. 또한, 임의의 항RGMa 항체가, 본 발명의 특정한 CDR의 아미노산 서열을 포함하는, 항RGMa 항체로 포화된 인간 RGMa 단백질에 추가되는 형태로 결합할 수 있는 경우라도, 추가되는 결합량이 유의차를 가지고 포화 결합량 1에 도달하지 않는 경우에는, 그 항체는 「경합한다」고 판단된다. 유의차는 일반적인 검정 방법(예를 들면, 스튜던트의 t검정)으로 조사하고, 유의 수준은 5% 이하로 한다.
상기 특정한 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 항RGMa 항체에 대하여, RGMa와의 결합이 경합하는, 항RGMa 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 래트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 등, 임의의 동물 유래의 항체라도 되고, 이들 항체의 조합인 키메라 항체나 인간화 항체라도 되지만, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것이 바람직하다.
<본 발명의 핵산 분자>
본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 모노클로널 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드지만, 예로서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 33, 34, 및 35의 아미노산 서열(1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어도 됨)을 코딩하는 염기서열을 각각 포함하고, 또한 경쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 30, 31, 및 32의 아미노산 서열(1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어도 됨)을 코딩하는 염기서열을 각각 포함하는 폴리뉴클레오티드나, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 39, 40, 및 SFG의 아미노산 서열(1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어도 됨)을 코딩하는 염기서열을 각각 포함하고, 또한 경쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 36, 37, 및 38의 아미노산 서열(1개 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어도 됨)을 코딩하는 염기서열을 각각 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 분자의 다른 예로서, 중쇄를 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 또한 경쇄를 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드나, 중쇄를 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 또한 경쇄를 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 분자의 다른 예로서, 중쇄를 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 또한 경쇄를 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 핵산 분자의 다른 예로서, 중쇄를 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 11∼18 중 어느 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 경쇄를 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 19∼25 중 어느 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 예시된다.
본 발명의 핵산 분자의 특히 바람직한 예로서, 중쇄를 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 15의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 경쇄를 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 19의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 예시된다.
본 발명의 핵산 분자의 다른 예로서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 41의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 42의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 예시된다.
본 발명의 핵산 분자의 구체예로서, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 43의 염기서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역을 코딩하는 영역이 서열목록의 서열번호 44의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
그리고, 본 발명의 핵산 분자는 RGMa와의 결합능을 가지고, RGMa와 Neogenin의 결합을 저해하지 않고, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화한다고 하는 모노클로널 항체를 코딩하는 한, 서열목록의 서열번호 43의 염기서열의 상보쇄 DNA와 긴축한(stringent) 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드 및 서열목록의 서열번호 44의 염기서열 상보쇄 DNA와 긴축한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것이어도 된다. 여기서, 긴축한 조건으로서는, 예를 들면 서던 교잡(Southern hybridization) 후, 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도로 세정을 행하는 조건을 들 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 중쇄와 경쇄의 정상 영역과 가변 영역 모두를 코딩하는 것이어도 되지만, 중쇄와 경쇄의 가변 영역만을 코딩하는 것이어도 된다. 정상 영역과 가변 영역 모두를 코딩할 경우의 중쇄 및 경쇄의 정상 영역의 염기서열은, Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 및 Cell vol.22, p197, 1980에 기재된 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산 분자는, 예를 들면, 이하의 방법에 의해 얻을 수 있다. 먼저, 하이브리도마 등의 세포로부터, 시판되는 RNA 추출 키트를 사용하여 전체 RNA를 조제하고, 랜덤 프라이머 등을 사용하여, 역전사효소에 의해 cDNA를 합성한다. 다음에, 기지의 인간 항체 중쇄 유전자, 경쇄 유전자의 가변 영역에 있어서, 각각 보존되어 있는 서열의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR법에 의해, 항체를 코딩하는 cDNA를 증폭시킨다. 정상 영역을 코딩하는 서열에 대해서는, 기지의 서열을 PCR법으로 증폭시킴으로써 얻을 수 있다. DNA의 염기서열은, 서열 결정용 플라스미드에 삽입하는 등, 상법(常法)에 의해 결정할 수 있다.
또는, 가변 영역 또는 그 일부의 서열을 화학 합성하고, 정상 영역을 포함하는 서열에 결합하는 것에 의해서도 본 발명의 모노클로널 항체를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 형질전환체(숙주 세포)를 제공한다. 재조합 벡터로서는, 대장균(Echerichia coli)과 같은 원핵세포에서 발현 가능한 벡터(예를 들면, pBR322, pUC119 또는 이들의 파생물)라도 되지만, 진핵세포에서 발현 가능한 벡터가 바람직하고, 포유동물 유래의 세포에서 발현 가능한 벡터가 보다 바람직하다. 포유동물 유래의 세포에서 발현 가능한 벡터로서는, 예를 들면 pcDNA3.1(Invitrogen사 제조), pConPlus, pcDM8, pcDNA I/Amp, pcDNA3.1, pREP4와 같은 플라스미드 벡터, pDON-AI DNA[다카라바이오샤(TAKARA BIO INC.) 제조] 등의 바이러스 벡터를 들 수 있다. 중쇄 코드 서열과 경쇄 코드 서열을 포함하는 하나의 벡터라도 되고, 중쇄 코드 서열 포함하는 벡터와 경쇄 코드 서열을 포함하는 벡터의 2개의 벡터라도 된다.
본 발명의 재조합 벡터를 도입하는 형질전환체는 대장균, 고초균과 같은 원핵세포라도 되지만, 진핵세포가 바람직하고, 포유동물 유래의 세포가 보다 바람직하다. 포유동물 유래의 세포로서는, 예를 들면 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO세포), COS, 미엘로마, BHK, HeLa, Vero, 293, NS0, Namalwa, YB2/0 등을 들 수 있다.
얻어진 항RGMa 항체나 그 항원 결합 단편은, 균일해질 때까지 정제할 수 있다. 항체 등의 분리, 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 이용하면 된다. 예를 들면, 친화 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등을 적절하게 선택, 조합시키면, 항체를 분리, 정제할 수 있으나(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 이들에 한정되는 것은 아니다. 친화 크로마토그래피에 이용하는 컬럼으로서는, 프로테인A 컬럼, 프로테인G 컬럼, 항면역글로불린 항체 결합 컬럼, 항원 결합 컬럼 등을 들 수 있다. 예를 들면, 프로테인A 컬럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Amersham Biosciences) 등을 들 수 있다.
<면역학적 질환 및 신경학적 질환의 예방 또는 치료약>
본 발명의 RGMa 결합 단백질, 특히 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편은, RGMa의 신경 돌기 성장 저해 활성을 중화함으로써 신경 기능의 수복을 촉진시키므로, 신경학적 질환의 예방, 치료 또는 재발 예방약으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질, 특히 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편은 또한, RGMa에 의한 T세포 활성화를 중화하므로, 면역학적 질환의 예방, 치료 또는 재발 예방약으로서 사용할 수 있다.
신경학적 질환으로서는 근위축성 측삭경화증, 상완신경총 손상, 뇌손상(외상성 뇌손상을 포함함), 뇌성마비, 길랑바레 증후군, 대뇌백질 위축증, 다발성 경화증(재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증을 포함함), 시신경척수염, 폴리오 후 증후군, 이분척추, 척수 손상, 척수성 근위축증, 척추종양, 횡단성 척수염, 인지증(노년성 인지증, 경도 인지 기능 장해, 알츠하이머병, 알츠하이머 관련 인지증을 포함함), 헌팅턴 무도병, 지발성 디스키네시아, 조병, 파킨슨병, 스틸-리차드슨-올스제위스키 증후군, 다운증, 중증근무력증, 신경외상(시신경외상을 포함함), 혈관 아밀로이드증, 아밀로이드증을 수반하는 대뇌출혈, 뇌경색, 뇌염, 급성 혼란 장해, 녹내장, 통합실조증 및 망막 신경선유층 변성(당뇨병성 망막증, 허혈성 시신경증, X염색체 연쇄성 망막분리증, 약물 유발성 시신경증, 망막 디스트로피, 가령황반변성, 시신경 유두 드루젠에 의해 특징지어지는 안병, 광수용기 변성의 유전적 결정 인자에 의해 특징지어지는 안병, 상염색체 열성 추체-간체 디스트로피, 시신경증을 수반하는 미토콘드리아 장해를 포함함)가 예시된다. 바람직하게는 척수 손상, 신경외상(시신경외상을 포함함)이다.
면역학적 질환으로서는 다발성 경화증(재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증을 포함함), 시신경척수염, 건선, 관절염(관절 류머티즘, 변형성 관절증, 건선성 관절염을 포함함), 길랑바레 증후군, 신경 베체트병, 악성 빈혈, I형(인슐린 의존형) 당뇨병, 전신 에리테마토데스(SLE), 염증성 장질환(IBD), 쇼그렌 증후군, 굿파스쳐 증후군, 그레이브스병, 자기면역성 용혈성 빈혈, 자기면역성 혈소판 감소성 자반병, 천식, 화분증, 아토피성 피부염, 사구체신염, 중증근무력증, 하시모토병, 및 사르코이도시스가 예시된다. 바람직하게는, 다발성 경화증이다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질, 특히 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편은 신경학적 질환/면역학적 질환의 예방, 치료 또는 재발 예방약으로서 사용할 수 있지만, 바람직한 신경학적 질환/면역학적 질환으로서는 척수 손상, 신경외상(시신경외상을 포함함), 다발성 경화증(재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증을 포함함)을 들 수 있다.
여기서, 「치료」란, 포유동물, 특히 인간 질환의 임의의 치료를 포함하고, 질환 증상을 저해하는, 즉, 그 진행을 저지 또는 질병 또는 증상을 소멸시키는 것, 및 질환 증상을 경감하는 것, 즉, 질병 또는 증상의 후퇴, 또는 증상의 진행 지연을 일으키는 것을 포함한다.
또한, 「예방」이란, 포유동물, 특히 인간에게서 상기 질환의 발증을 방지하는 것을 포함한다.
또한, 「재발 예방」란, 포유동물, 특히 인간에게서 관해, 재발을 되풀이하는 상기 질환의 재발을 방지하는 것을 포함한다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질(항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편)은, 신경학적 질환 또는 면역학적 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물로 할 수 있다.
본 발명의 RGMa 결합 단백질(항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편)의 투여 형태는 특별히 제한되지 않고, 경구 투여, 비경구 투여(예를 들면, 정맥 주사, 근육 주사, 피하 투여, 직장 투여, 경피 투여, 뇌내 투여, 척수내 투여, 기타 국소 투여) 중 어느 투여 경로에 의해 인간을 포함하는 포유류에 투여할 수 있다.
경구 투여 및 비경구 투여를 위한 제형 및 그 조제 방법은 당업자에게 주지하며, 본 발명에 의한 항체를 약학적으로 허용되는 담체 등과 배합함으로써 의약 조성물을 제조할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형(劑型)은, 주사용 제제(예를 들면, 점적 주사제, 정맥 주사제, 근육 주사제, 피하 주사제, 경피 주사제, 뇌내 투여 제제, 척수내 투여 제제), 외용제(예를 들면, 연고제, 팝제, 로션제), 좌제 흡입제, 안제(眼劑), 안연고제, 점비제, 점이제, 리포솜제 등을 들 수 있다. 특히, 중추 신경 조직에 직접 작용시키고 싶은 경우에는 침투압 펌프의 의료용 마이크로 펌프를 사용하여 지속적으로 주입할 수도 있고, 피브린 풀 등과 혼합하여 서방(徐放) 제제로 한 뒤에 환부 조직에 유치할 수도 있다.
예를 들면, 주사용 제제는, 통상 항체를 주사용 증류수에 용해하여 조제하지만, 필요에 따라 용해 보조제, 완충제, pH조정제, 등장화제, 무통화제, 보존제, 안정 화제 등을 첨가할 수 있다. 또한, 용시(用時) 조제용의 동결 건조 제제로 할 수도 있다.
경구 투여를 위한 제형은, 고체 또는 액체의 제형, 구체적으로는 정제, 피복 정제, 환제, 미립제, 과립제, 산제, 캡슐제, 시럽제, 유제, 현탁제, 주사제, 트로키제 등을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 치료상 유효한 다른 약제를 더 함유하고 있어도 되고, 또한, 필요에 따라 살균제, 소염제, 비타민류, 아미노산 등의 성분을 배합할 수도 있다.
약리학적으로 허용되는 담체로서는, 예를 들면 고형 제제에 있어서의 부형제(賦形劑), 활택제, 결합제 및 붕괴제, 또는 액상 제제에 있어서의 용제, 용해보조제, 현탁화제, 등장화제, 완충제 및 무통화제 등을 들 수 있다. 더욱 필요에 따라, 통상의 방부제, 항산화제, 착색제, 감미제, 흡착제, 습윤제 등의 첨가물을 적절하게, 적량 사용할 수도 있다.
본 발명에 의한 항체의 투여량은, 예를 들면 투여 경로, 질환의 종류, 증상의 정도, 환자의 연령, 성별, 체중, 질환의 위중함, 약물 동태 및 독물학적 특징 등의 약리학적 지견, 약물 송달계의 이용 유무, 및 다른 약물의 조합의 일부로서 투여되는지 등 다양한 인자를 기초로, 의사에 의해 결정되지만, 통상, 성인(체중 60kg)당, 경구 투여에서는 1∼5000㎍/일, 바람직하게는 10∼2000㎍/일, 보다 바람직하게는 50∼2000㎍/일을, 주사 투여에서는 1∼5000㎍/일, 바람직하게는 5∼2000㎍/일, 보다 바람직하게는 50∼2000㎍/일을, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 전신으로의 비경구 투여에서는 체중당 10∼100000㎍/kg, 보다 바람직하게는 100∼50000㎍/kg, 더욱 바람직하게는 500∼20000㎍/kg를 1일, 1주간, 1개월간에 1회, 또는 1년간에 1∼7회의 간격으로 투여할 수 있다. 침투압 펌프 등을 이용한 국소 투여에서는, 통상, 성인(체중 60kg)당, 10∼100000㎍/일, 보다 바람직하게는 100∼10000㎍/일, 더욱 바람직하게는 500∼5000㎍/일의 속도로 지속 주입할 수 있다.
<실시예>
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예의 태양에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 RGMa 단백질(C말단측 도메인)의 조제
인간 RGMa 단백질(서열목록의 서열번호 1)의 Pro169∼Gly422(N말단측으로부터 169번째의 프롤린 잔기로부터 422번째의 글리신 잔기까지를 나타내고, 이후 동일하게 기재)의 C말단에 히스티딘 태그를 융합한 재조합 인간 RGMa 단백질 발현하는 CHO세포를 수립하였다.
CHO세포의 배양 상청 중에 포함되는 인간 RGMa 단백질 C말단측 도메인을, 니켈 컬럼(GE Healthcare사 제조, 17-5247-01)에 흡착시킨 후, 100mM 이미다졸 용액으로 용출하였다. 투석에 의해, 이미다졸 용출 획분으로부터 Phosphate bufferd saline(PBS)로 치환하고, 면역원으로서 사용하였다.
실시예 2: 마우스 항인간 RGMa 모노클로널 항체의 제작
실시예 1에서 조제한 재조합 인간 RGMa 단백질 10㎍를, 완전 프로인트 어주번트(시그마사 제조)와 혼합하여 에멀전을 제작하고, BALB/c 마우스[니폰 찰리스·리버 가부시키가이샤(Charles River Laboratories International, Inc.)의 배부(背部) 피하 몇군데에 면역시켰다. 그 후 1∼2주일 간격으로 불완전 프로인트 어주번트(시그마사 제조)로 에멀전을 제작한 재조합 인간 RGMa 단백질 10㎍를 동일하게 면역시키고, 수회 면역 후에 채혈하였다. 후술하는 인간 또는 마우스 RGMa 단백질을 고상화한 ELISA법에 의해 항체값을 측정하였다. 항체값의 상승이 인지된 개체에 대하여, 인간 RGMa 단백질 10㎍를 정맥내 투여하여 부스트하고, 2∼3일 후에 비(脾)세포를 회수하였다.
세포 융합은 상기 비세포와 그 반수의 마우스 미엘로마 세포[SP2/0, 다이닛폰스미토포 세이야쿠(Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.)]를 혼합하고, 원심하여 얻은 침전 획분에 폴리에틸렌글리콜[로슈·다이그노스틱사(Roche Diagnostics K.K) 제조]을 가하여 세포 융합시켰다. 다음에, 원심한 세포를 D-MEM(인비토로젠사 제조)으로 2회 세정하였다. 세포를 10% 소태아 혈청(인비토로젠사 제조), 1% BM condimed(로슈·다이그노스틱사 제조) 및 HAT[시그마 알드리치사(Sigma-Aldrich) 제조]를 포함하는 GIT 배지[닛폰 세이야쿠(NIHON PHARMACEUTICAL CO., LTD.) 제조]에 재현탁하고, 각 웰 5×104 미엘로마 세포/well에서 96구멍 플레이트에 파종하였다. 배양 상청을 회수하고, 실시예 3의 인간 RGMa 단백질 고상화 ELISA법에 의해, 항체 생성 세포의 스크리닝을 행하였다. 스크리닝에서 얻어진 항체 생성 세포를 한계 희석법에 의해 클로닝하고, 2종류의 모노클로널 항체(B5.116A3 및 B5.70E4)를 생성하는 하이브리도마 세포를 선정하였다.
이소타이핑 키트(Mouse MonoAB ID/SP KIT, ZYMED사 제조, 93-6550)를 사용하여 판정한 양쪽 모노클로널 항체의 이소 타입은, 모두 중쇄는 마우스 IgG2b, 경쇄는 κ였다.
모노클로널 항체의 정제는, 하이브리도마의 배양 상청으로부터, 항마우스 IgG 항체를 고정한 아가로오스(Sigma사 제조의 Anti-Mouse IgG -Agarose)를 사용한 친화 크로마토그래피에 의해 행하였다. 항체를 컬럼에 결합시킨 후, PBS로 컬럼을 세정하고, 이어서, 10mM 글리신 염산(pH2.7)으로 용출하고, 신속하게 중화하였다. 그 후, 용출 중화액을 한외여과막에 의해 PBS로 치환하였다.
실시예 3: 인간 또는 마우스 RGMa 단백질을 고상화한 ELISA
PBS에서 2㎍/mL로 조제한 인간 RGMa 단백질(R&D systems사 제조, 2459-RM) 또는 마우스 RGMa 단백질(R&D systems사 제조, 2458-RG)을 96구멍 플레이트에 50μL/well씩 나누어 주입하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 용액을 제거한 후, PBS에서 5배 희석한 ApplieBlock(생화학 바이오 비즈니스사 제조, 200150)을 200μL/well씩 나누어 주입하고 실온에서 1시간 정치하고, 비특이 결합을 블록킹하였다. PBST(0.05% Tween20을 포함하는 PBS)로 3회 세정한 후, PBS에서 단계 희석한 검체(마우스 혈청, 하이브리도마 배양 상청, 후술하는 재조합 항체 발현 배양 상청, 또는 정제 항체 등)를, 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후, PBST로 3회 세정하고, 이어서 PBS로 희석한 퍼옥시다아제 표식 양의 항마우스 IgG항체(GE Healthcare사 제조, NA9310V)를 50μL/well씩 나누어 주입하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 3회 세정한 후, 퍼옥시다아제 발색 키트[스미토모 베이크라이트샤(Sumitomo Bakelite Company Limited) 제조, ML-1130O]를 첨가하여 일정 시간 발색시키고, 플레이트 리더에 의해 492㎚의 흡광도를 측정하였다.
실시예 4: 항체의 에피토프 해석
항체가 결합하는 에피토프는, 펩티드 스캔법에 의해 결정하였다. 인간 RGMa 단백질(서열목록의 서열번호 1)의 Arg172∼Ala424에 포함되는, 3잔기씩 비켜 놓은 연속하는 11잔기로 이루어지는 아미노산 서열의 N말단측에, N말단을 비오틴화한 스페이서 서열(SGSG)(서열목록의 서열번호 46)을 융합한 총 83종류의 펩티드를 합성하였다. 펩티드를 아비딘 플레이트에 고정한 후, 피험 항체(B5.116A3, B5.70E4)를 반응시켰다. 그 다음에, 퍼옥시다아제 표식 토끼의 항마우스 Ig항체(Dako사, P026002)를 반응시켜, 기질 용액을 첨가하여 일정 시간 발색시킨 후, 플레이트 리더에 의해 흡광도를 측정하였다.
그 결과, B5.116A3은 Glu298∼Gly311(Glu298∼Asp308, Val301∼Gly311의 2종류의 펩티드), Asn322∼Glu335(Asn322∼Thr332, Ile325∼Glu335의 2종류의 펩티드) 및 Lys367∼Ala377의 인간 RGMa 유래의 펩티드에 결합하고, B5.70E4는 Glu298∼Gly311(Glu298∼Asp308, Val301∼Gly311의 2종류의 펩티드), Asn322∼Glu335(Asn322∼Thr332, Ile325∼Glu335의 2종류의 펩티드) 및 Pro349∼Thr359의 인간 RGMa 유래의 펩티드에 결합하였다.
실시예 5: 마우스 항체 유전자의 서열 해석과 클로닝
마우스 모노클로널 항체(B5.116A3, B5.70E4)를 생성하는 하이브리도마 세포로부터, total RNA를 추출하였다. Total RNA를 주형으로 하여, 역전사 반응에 의해 cDNA를 합성하였다. cDNA를 주형으로, 경쇄 가변 영역 및 정상 영역, 및 중쇄 가변 영역 및 정상 영역의 유전자를 PCR 증폭하고, DNA 서열을 결정하였다. 다음에, 결정된 가변 영역 서열 및 정상 영역 서열에 기초하여, 항체 전장 유전자를 PCR에 의해 증폭하고, 클로닝하였다. 이들 항체 유전자가 코딩하는 아미노산 서열은, 이하와 같았다.
(1) B5.116A3 경쇄 아미노산 서열(서열목록의 서열번호 4)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGT
DYSLTISNLEQEDIATYFCQQLNTLPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNN
FYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVK
SFNRNEC
(2) B5.116A3 중쇄 아미노산 서열(서열목록의 서열번호 5)
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGR
FTISRDDSKRSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRDGAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSS
VTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASST
TVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDP
DVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIK
GLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSK
LNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK
(3) B5.70E4 경쇄 아미노산 서열(서열목록의 서열번호 6)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSG
SGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVV
CFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTST
SPIVKSFNRNEC
(4)B5.70E4 중쇄 아미노산 서열(서열목록의 서열번호 7)
DVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITTSYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGTNNYNPSLKNRIS
ITRDTSKNQFFLRLNSVTTEDTATYYCAGSFGYSQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLG
CLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDK
KLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQI
SWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVR
APQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMK
TSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK
실시예 6: 재조합 마우스 항체 및 재조합 래트 마우스 키메라 항체의 조제
하이브리도마 유래의 2종류의 항RGMa 항체 B5.116A3 또는 B5.70E4의 재조합 마우스 항체를 조제하였다(각각 이후, 「r116A3」, 「r70E4」이라고 기재함).
또한, 비교예로서, 특허문헌 1(WO2009/106356)에 기초하여, 래트 항체 5F9의 가변 영역과 마우스 항체(IgG2bκ)의 정상 영역(경쇄 정상 영역은 서열목록의 서열번호 4의 Arg108∼Cys214, 중쇄 정상 영역은 서열목록의 서열번호 5의 Ala117∼Lys452)을 융합하여 재조합 래트 마우스 키메라 항체(이후, 「r5F9」이라고 기재함)를 조제하였다.
각각의 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를, pcDNA3.3(Life Technologies사 제조)에 삽입하고, 발현 벡터를 제작하였다. 발현 벡터를, HEK293F세포(Life Technologies사 제조)에 Neofection 293[아스텍(Astec)사 제조]을 사용하여 도입하였다. 세포를 37℃, 8% 탄산 가스 조건 하에서 6일간 배양한 후, 배양 상청을 회수하였다. 재조합 항체의 정제는, 배양 상청을, Protein A 또는 Protein G를 고정화한 친화 컬럼(GE healthcare사 제조)에 어플라이하고, 컬럼에 결합한 항체를 10mM 글리신염산(pH2.8)으로 용출하고, 신속하게 중화한 후, PBS로 치환하였다.
사용 목적에 따라, 정제 순도를 높일 필요가 있는 경우에는, Protein A 컬럼 정제 후의 항체를, Ceramic Hydroxyapatite Type1(CHT) 컬럼(BIORAD사 제조)에 의해 정제하였다. CHT 컬럼에 결합한 항체를 10mM KH2PO4(pH6.5)로 세정한 후, 20mM KH2PO4(pH6.5), 0.5M NaCl로 용출하였다. 용출 획분을 회수한 후, PBS로 치환하였다.
실시예 7: RGMa 단백질 발현 세포에 대한 결합 시험
전장 인간 RGMa 단백질(서열목록의 서열번호 1의 Met1∼Cys450), 인간 RGMa 단백질 C말단측 도메인(서열목록의 서열번호 1의 Pro169∼Cys450), 전장 마우스 RGMa 단백질(서열목록의 서열번호 2의 Met1∼Trp454), 또는 래트 RGMa 단백질 C말단측 도메인(서열목록의 서열번호 3의 Pro170∼Trp449)을 발현하는 벡터를, CHO세포 또는 HEK293세포에 도입하여, 항원 발현 세포를 제작하였다.
그리고, RGMa 단백질은, GPI 앵커 부가 반응 시에 C말단 펩티드가 프로세싱을 받는다. 마우스 RGMa 단백질 및 래트 RGMa 단백질은, 모두 Ala427에서 절단되고, C말단측의 펩티드는 제거된다. 따라서, GPI 앵커를 통하여 세포 상에 발현되는 전장 단백질 및 C말단측 도메인의 아미노산 서열은, 마우스와 래트에서는 동일하다.
최종 농도 10㎍/mL의 피험 항체(r116A3 및 r70E4) 및 r5F9(비교예)를, 상기의 항원 발현 세포와 반응시킨 후, 0.1% 소혈청 알부민, 0.05% NaN3을 포함하는 PBS에 의해 세포를 세정하였다. FITC 표식 항마우스 면역글로불린 항체(DAKO사 제조)를 반응시켜, 세포를 세정하였다. 유세포 분석기(flow cytometry)[벡톤·딕킨슨(Becton, Dickinson)사 제조, 팍스캘리버(FACScalibur)]로 형광을 측정하고, 피험 항체의 항원 발현 세포로의 결합성을 평가하였다(표 1).
그 결과, r116A3 및 r70E4는 r5F9와 상이하고, 인간 및 래트 RGMa 단백질의 C말단측 도메인에도 결합하는 것을 알았다. RGMa 단백질은 C말단측 도메인만으로도 신경 돌기 성장 저해 작용이 인지되고 있고, r116A3 및 r70E4는, 전장RGMa 단백질 및 C말단측 도메인의 양자를 저해한다.
[표 1]
표 1. 각종 재조합 항RGMa 항체의 항원 발현 세포에 대한 결합 평가*
Figure 112017118696609-pct00001
*; ++ 강하게 결합
+ 약하게 결합
- 결합하지 않음
실시예 8: RGMa 단백질에 대한 해리정수 측정
피험 항체(r116A3, r70E4) 및 r5F9(비교예)의 RGMa 단백질에 대한 친화성은, Proteon XPR36[바이오래드(Bio-Rad)사 제조]을 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR)법에 의해 측정하였다.
10mM 아세트산 버퍼(pH4.5)에서 10㎍/mL로 희석한 인간 RGMa 단백질(R&D Systems사 제조, 2459-RM), 인간 RGMa 단백질 C말단측 도메인(실시예 1에서 조제), 또는 마우스 RGMa 단백질(R&D Systems사 제조, 2458-RG)을, 아민 커플링법에 의해 GLC 센서칩에 고정하였다. 아날라이트로서 단계 희석한 피험 항체를 유속 100μL/min으로 60초간 어플라이하고, 해리정수(Kd값)를 측정하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이, r116A3 및 r70E4는 r5F9와 상이하고, 인간 RGMa 단백질의 C말단측 도메인에도 결합하였다. r116A3은 r5F9보다도, 인간 RGMa 단백질에 대하여 32배, 마우스 RGMa 단백질에 대해서는 44배 강하게 결합하였다.
[표 2]
표 2. 항RGMa 모노클로널 항체의 친화성
Figure 112017118696609-pct00002
실시예 9: RGMa - Neogenin 결합 저해 시험
재조합 인간 Neogenin 단백질(서열목록의 서열번호 10)의 세포외 도메인(Ala34∼Leu1105)을 정제하였다. 인간 Neogenin 단백질 세포외 도메인을 발현하는 CHO세포주를 수립하였다. C말단에 히스티딘 태그를 융합하였다. CHO세포의 배양 상청으로부터, 니켈 컬럼(GE Healthcare사 제조, 17-5247-01)에 흡착시킨 후, 100mM 이미다졸 용액으로 용출하였다. 투석에 의하여, 이미다졸 용출 획분으로부터 PBS로 치환하였다.
ChromaLink Biotin Labeling Kit(Solulink사 제조)를 사용하여, 인간 RGMa 단백질(R&D Systems사 제조, 2459-RM)을 비오틴 표식하였다. 2㎍/mL로 조제한 비오틴 표식 인간 RGMa 단백질을, 2배 단계 희석한 피험 항체(r116A3, r70E4)와 등량 혼화하고, 실온에서 2시간 반응시켜 혼합 용액을 조제하였다.
동시에, PBS에서 2㎍/mL로 조제한 인간 Neogenin 단백질 세포외 도메인을 96구멍 플레이트에 50μL/well씩 가하여 실온에서 1시간 정치하고, Neogenin 고상 플레이트를 제작하였다. 용액을 제거한 후, 2.5% 소혈청 알부민 용액을 첨가하고, 1시간 정치함으로써 비특이 결합을 블록킹하였다. 상기 Neogenin 고상 플레이트에, 상기의 혼합 용액을 50μL/well로 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후 세정 조작을 행하고, 퍼옥시다아제 표식 Avidin[VECTASTAIN ABC 시스템, 벡터 라보라토리즈(VECTOR Laboratories)사 제조]을 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후 세정 조작을 행하고, 기질 용액을 첨가하여 일정 시간 발색시키고, 플레이트 리더에 의해 흡광도를 측정하였다. 항체가 존재하지 않는 경우의 흡광도비를 1로서 플롯팅하고, 항체에 의한 농도 의존적인 RGMa-Neogenin의 결합 저해를 평가하였다(도 1). \
그 결과, 항인간 RGMa 폴리클로널 항체(R&D Systems사 제조, AF2459) 및 r5F9와는 상이하고, r116A3 및 r70E4는 RGMa-Neogenin의 결합을 저해하지 않았다.
실시예 10: RGMa - BMP2 결합 저해 시험
PBS에서 2㎍/mL로 조제한 인간 RGMa 단백질(R&D Systems사 제조, 2459-RM)을 96구멍 플레이트에 50μL/well씩 가하여 실온에서 1시간 정치하였다. 2.5% 소혈청 알부민 용액을 첨가하고, 1시간 정치함으로써 비특이 결합을 블록킹하고, RGMa 단백질 고상화 플레이트를 조제하였다. 상기 RGMa 단백질 고상 플레이트에 0.01∼0㎍/mL로 단계 희석한 피험 항체(B5.116A3, B5.70E4)를 가하여 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후 세정 조작을 행하고, 0.5㎍/mL로 희석한 인간 BMP2 단백질(R&D Systems사 제조, 355-BM)을 가하여 실온에서 1시간 정치하였다.
비오틴 표식 항BMP2 항체를 반응시키고, 퍼옥시다아제 표식 Avidin(VECTASTAIN ABC 시스템, 벡터 라보라토리즈사 제조), 기질 용액을 더 첨가하여 일정 시간 발색시키고, 플레이트 리더에 의해 흡광도를 측정하였다(도 2).
그 결과, 특히, 항RGMa 항체(B5.116A3)는, 농도 의존적으로 RGMa-BMP2의 결합을 약하게 저해하였다(0.01㎍/mL에서 흡광도 0.45, 0.1㎍/mL에서 흡광도 0.4, 1㎍/mL에서 흡광도 0.32, 10㎍/mL에서 흡광도 0.1).
실시예 11: 인간화 항체의 설계
마우스 모노클로널 항체 B5.116A3의 인간화는, 일본특허 제2912618호 공보에 기재된 Winter 등의 방법에 따라, 상보성 결정 영역(CDR) 이식법으로 행하였다.
먼저, 마우스 모노클로널 항체 B5.116A3의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 3D homology model을 작성하고, 프레임워크(FW) 영역에서, CDR 근방에 위치하는 아미노산 잔기를 특정하였다. 이들 아미노산이 가능한 한 유지되는 인간 항체 FW를 선택하여, 마우스 항체의 CDR을 이식하고, 인간화 항체 서열을 설계하였다. 설계한 인간화 항체 서열은, 중쇄는 HA(서열목록의 서열번호 11), 경쇄는 KA(서열목록의 서열번호 19)로 기재한다. 또한, 가변 영역의 구조 안정성에 관여하는 FW 내의 아미노산에 추가의 변이 도입을 행하여, 복수의 인간화 항체 서열을 설계하였다(중쇄는 HA를 포함하여 HB∼HH까지 총 8종, 경쇄는 KA를 포함하여 KB∼KGR까지 총 7종).
[표 3]
표 3. 설계한 인간화 항체 서열
Figure 112017118696609-pct00003
실시예 12: 재조합 마우스 인간 키메라 및 재조합 인간화 항체의 조제
(1) 실시예 6에 준하여, 이하의 아미노산 서열을 가지는 재조합 마우스 인간 키메라 항RGMa 항체 116A3(r116A3C)을 조제하였다.
경쇄(서열목록의 서열번호 8)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGT
DYSLTISNLEQEDIATYFCQQLNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNN
FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK
SFNRGEC
중쇄(서열목록의 서열번호 9)
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGR
FTISRDDSKRSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRDGAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT
AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN
TKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW
YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP
QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(2) 실시예 6에 준하여, 이하의 중쇄 및 경쇄의 조합으로 이루어지는 총 20종의 인간화 항RGMa 항체를 조제하였다.
중쇄/경쇄의 조합;
HA/KA, HA/KB, HA/KC, HA/KG, HB/KC, HC/KA, HC/KB, HD/KA, HD/KB, HD/KC, HD/KD, HE/KA, HF/KA, HF/KF, HF/KG, HG/KD, HG/KH, HH/KA, HH/KD, HH/KF
(3) 실시예 6에 준하여, 재조합 인간화 항RGMa 항체(이후, rH5F9라고 기재)를 조제하였다(비교예).
특허문헌 1(WO2009/106356)에 기재된 인간화 항RGMa 모노클로널 항체 h5F9의 가변 영역(경쇄는 특허문헌 1의 seq ID_53, 중쇄는 특허문헌 1의 seq ID_50)을, 인간 항체 정상 영역(경쇄는 서열목록의 서열번호 26의 Arg108∼Cys214, 중쇄는 서열목록의 서열번호 27의 Ala117∼Lys446)과 연결하였다.
실시예 13: 항체의 열안정성 시험
실시예 12에 기재된 재조합 항체를 발현하는 배양 상청을 20μL씩 분취(分取)하고, 서멀 사이클러(Takara bio사 제조, TP600)를 이용하여, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃의 8점의 온도에서 각각 10분간 열처리하였다.
항체 최종 농도가 125ng/mL로 되도록 배양 상청을 PBS로 희석하였다. 그 후, 실시예 3에 기재한 인간 RGMa 단백질을 고상화한 ELISA에 제공하고, 항체의 항원 결합성을 평가하였다(도 3).
그 결과, 중쇄 HE, 경쇄 KA의 조합으로 이루어지는 인간화 항체(이하, 「rH116A3」이라 함) 및 마우스 인간 키메라 항체(r116A3C)는, 인간화 항체(rH5F9)보다 우수한 열안정성을 나타내었다. 이후, 이 HE/KA의 조합으로 이루어지는 인간화 항체를 rH116A3이라고 기재한다.
그리고, 열처리를 하지 않았을 경우, 마우스 인간 키메라 항체(r116A3C)와 인간화 항체(rH116A3)는 동등한 항원 결합성을 나타내고, 인간화에 수반하는 항원 결합성의 저하는 없었다.
실시예 14: 인간화 항RGMa 항체( rH116A3 ) 생성 CHO 안정 발현주의 수립
인간화 항RGMa 항체(rH116A3)를 생산하는 CHO 안정 발현주는, Lonza GS Xceed 시스템(Lonza사)에 의해 수립하였다. 인간화 항RGMa 항체(rH116A3)의 경쇄 코드 서열(서열목록의 서열번호 44) 및 중쇄 코드 서열(서열목록의 서열번호 43)을 포함하는 pXC 이중유전자(double gene) 벡터를, CHOK1SV GS knock out 친세포주에 도입하고, methionine sulphoximine(MSX) 선택 하에서 형질전환 세포풀(cell pool)을 취득하였다. 유세포 분석기에 의해 단일세포로 분리한 후, 배양 상청 중으로의 항체 생성량, 세포 증식성 등을 평가하고, CHO 안정 발현주를 취득하였다.
실시예 15: 신경 돌기 성장 시험
래트 신생자(P7)로부터 소뇌를 적출하여, 트립신 용액(0.2% DNase를 포함하는 0.25% 트립신 PBS용액)에 현탁하고, 37℃에서 10∼15분간 소화하였다. 계속해서 10% 소태아 혈청 함유 DMEM 배지를 가하여 원심분리하였다. 동일 배지로 재현탁하여 원심분리하고, 동일하게 조작을 2회 반복하여 세포를 세정하였다. 또한, 상기 세포 현탁액을 70㎛ 셀 스트레이너로 여과한 후, 원심분리하여 침전 획분을 동일 배지에서 재현탁하였다. 세포 부유액에 B27 supplement(GIBCO사 제조)를 가하여 래트 신생자의 소뇌 과립세포를 조제하였다.
다음에, 세포 플레이트에 래트 신생자의 소뇌 과립세포를 파종하고, 37℃에 1일간 배양을 행하였다.
최종 농도 2㎍/mL의 재조합 RGMa 단백질(R&D Systems사 제조, 2459-RM)을 첨가하여 37℃, 2일간 배양하였다. 신경 돌기의 길이를 현미경 관찰에 의해 측정한 바, 도 4에 나타낸 바와 같이, RGMa의 첨가에 의해, 좌측 도면의 실험에서는 신경 돌기의 길이가 37㎛에서 26㎛로 되고, 우측 도면에서는 38㎛에서 27㎛로 되어, 신경 돌기 성장이 저해되었다. 피험 항체(B5.116A3, B5.70E4)만을 최종 농도 10㎍/mL로 첨가해도, 신경 돌기의 길이에 변화는 보이지 않았으나, 재조합 RGMa 단백질과 동시에 피험 항체를 첨가한 경우에는, 대조(RGMa 비첨가)와 동일한 정도로 신경 돌기가 성장하고, 항체에 의한 RGMa 단백질의 중화 작용이 인지되었다.
실시예 16: 척수 손상 모델 래트를 이용한 효력 시험
할로탄[다케다 야쿠힌 고교샤(Takeda Pharmaceutical Company Limited) 제조]에 의해 흡인 마취한 Wistar계 래트(암컷, 8주령, 체중 약 200g)에, 척추 레벨 T9를 중심으로 전후 1추골분(T8∼T10)의 추궁 절제술을 행하여, 척수를 노출시켰다. 척수 압좌 모델을 이용하여 평가하는 경우에는, IH impactor(Precision System사 제조)을 사용하여, 노출된 척수에 200kdyn의 압력을 가하였다.
상기와 같이 척수를 손상시킨 직후에, 400㎍/mL의 피험 항체(r116A3, r70E4) 또는 대조 마우스 항체(mo-IgG2bκ)를 채운 침투압 미니 펌프(200μL 액량, 0.5μL/시간, 14일간 송달)(Alzet사 제조, model 2002)를 래트의 등의 피하에 두었다. 침투압 미니 펌프의 출구에 접속된 실리콘제 튜브의 선단은, 척수 손상 부위의 경막 하에 두었다. 상기 튜브는, 추궁 절제술 부위의 바로 아래 다리측의 가시돌기에 꿰매어 고정하고, 근육 및 피부층을 봉합하여 사육하였다.
척수 손상 모델 래트의 운동 기능은, Basso-Beattie-Bresnahan(BBB) 스코어[Basso, D. M., Beattie, M. S., & Bresnahan, J. C., A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21(1995)]를 이용하여, 손상 후 0일째, 1일째, 3일째, 7일째, 이후 1주일마다 최장 8주에 걸쳐 평가하였다. 그 결과, 도 5의 (A)에 나타낸 바와 같이, r116A3 또는 r70E4는, 대조 항체(mo-IgG2bκ)와 비교하여 각각 투여 후 4주간 또는 3주간 이후에 유의하게 BBB 스코어가 개선되었다(p <0.05, Student's t-검정).
척수반측 절단 모델을 이용하여 평가하는 경우에는, 노출시킨 척수의 배측부를 1.8㎜∼2.0㎜의 깊이로 절단하였다. 상기와 동일하게 피험 항체(B5.116A3) 또는 대조 마우스 항체(mo-IgG2bκ)를 침투압 미니 펌프를 사용하여 투여하고, 손상 후 0일째, 1일째, 3일째, 7일째, 이후 1주일마다 최장 10주에 걸쳐, BBB 스코어를 이용하여 평가하였다. 도 5의 (B)에 나타낸 바와 같이, B5.116A3은 대조 항체(mo-IgG2bκ)와 비교하여 투여 후 4주간 이후에 유의하게 BBB 스코어가 개선되었다(p <0.01, Student's t-검정).
실시예 17: 다발성 경화증 모델 마우스를 사용한 효력 시험
PLP139 - 151펩티드(HSLGKWLGHPDKF: 서열목록의 서열번호 45, 펩티드 연구소 제조)를 생리식염액[오츠카 세이야쿠 고죠(Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) 제조]으로 용해하고, 결핵사균 H37 Ra(Difco Laboratories사 제조)를 가한 불완전 프로인트 어주번트(시그마사 제조)와 혼합하여, 에멀전을 제작하였다. PLP139 - 151펩티드로서 50㎍/head로 SJL/JorllcoCrj(SJL/J) 마우스(니폰 찰리스·리버 가부시키가이샤)의 배부(背部) 피하에 면역하고, EAE 스코어(H. Kataoka, K Sugahara, K. Shimano, K. Teshima, M. Koyama, A. Fukunari and K. Chiba. FTY720, sphingosine 1-phosphate receptor modulator, ameliorates experimental autoi㎜une encephalomyelitis by inhibition of T cell infiltration. Cellular & Molecular I㎜unology 6, 439-448, 2005.) 및 체중 변화를 평가하였다(도 6).
생리식염액에 희석한 피험 항체(B5.116A3)를, PLP139 - 151펩티드로 면역시킨 7일 및 10일 후 또는 18일 및 21일 후에 각각 20mg/kg로 복강 내에 투여하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 항RGMa마우스 모노클로널 항체(B5.116A3)는, 대조 항체(mo-IgG2bκ)와 비교하여, 발증 전의 투여로 EAE 스코어의 악화를 억제하고(도 6 상단), 발증 후의 투여로 재발 예방 효과를 제시하였다(도 6 하단).
실시예 18: 항체의 면역원성 시험
51명의 건강한 사람 도너 유래의 말초혈 중에 포함되는 미분화 수상세포를 과립구 단구 콜로니 자극인자(GM-CSF) 및 Interleukin-4 자극에 의해 성숙시켰다. 성숙 수상세포에 최종 농도 50㎍/mL의 피험 항체(rH116A3)를 첨가하고, 4, 5일간 배양함으로써, 항체를 수상세포에 취입시켰다. 여기에, 동일 도너 유래의 말초혈 CD4+T세포(헬퍼 T세포)를 혼합하고, 1주일 더 공배양한 후, T세포의 증식을 유세포 분석기에 의해 측정하였다. 피험 항체의 T세포 증식 활성을 지표로서, 인간에서의 면역원성 리스크를 평가하였다. 그 결과, 51명의 도너 중, 4명(7.8%)에 대하여 T세포의 증식이 인지되고, 면역원성 리스크는 낮았다.
SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Osaka University National University Corporation Chiba University <120> RGMa binding protein and its use <130> A16005-16140 <150> JP2015-091095 <151> 2015-04-28 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp 1 5 10 15 Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro 20 25 30 Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys 35 40 45 Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser 50 55 60 His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg 65 70 75 80 Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp 85 90 95 Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln 100 105 110 His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr 115 120 125 Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile 130 135 140 Cys His Tyr Glu 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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 17 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody heavy chain HG <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg 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Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 20 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody light chain KB <400> 20 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Glu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 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Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 22 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody light chain KD <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn 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Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Glu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 24 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody light chain KF <400> 24 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Glu Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 25 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody light chain KG <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 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Glu Val Val Asn Ala Val Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly 1 5 10 <210> 27 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Pro Thr Ala Pro Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala 1 5 10 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 31 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro 1 5 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Asp Ala Trp Met Asp 1 5 <210> 34 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Arg Asp Gly Ala Tyr 1 5 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 38 Ser Gln Ser Thr His Val Pro 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 39 Thr Ser Tyr Tyr Trp Asn 1 5 <210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 40 Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 41 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody heavy chain <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Arg Asp Gly Ala Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized antibody light chain <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Glu 100 105 <210> 43 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a gene encoding humanized antibody heavy chain <400> 43 gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcagatc cctgagactg 60 tcctgtaccg cctccggctt caccttctcc gacgcctgga tggattgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtggccgag atccggtcca aggccaacaa ccacgccacc 180 tactacgccg agtctgtgaa gggccggttc accatctccc gggacgactc caagtccatc 240 gtgtacctgc agatgaactc cctgcggacc gaggacaccg ccctgtacta ctgcaccaga 300 agggacggcg cctactgggg caagggcacc acagtgacag tgtcctcc 348 <210> 44 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a gene encoding humanized antibody light chain <400> 44 gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc gtgtctgctt ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggcctccca ggacatctcc tcctacctga actggtatca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctcccggc tgcactccgg cgtgccctct 180 agattttccg gctctggctc cggcaccgac tttaccctga ccatctccag cctgcagccc 240 gaggacttcg cctcctactt ctgtcagcag ctgaacaccc tgccctggac ctttggcgga 300 ggcaccaagg tggaaatgga a 321 <210> 45 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP139-151 <400> 45 His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe 1 5 10 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer <400> 46 Ser Gly Ser Gly 1

Claims (31)

  1. 경쇄의 상보성 결정 영역 1(LCDR1), 경쇄의 상보성 결정 영역 2(LCDR2), 경쇄의 상보성 결정 영역 3(LCDR3), 중쇄의 상보성 결정 영역 1(HCDR1), 중쇄의 상보성 결정 영역 2(HCDR2) 및 중쇄의 상보성 결정 영역 3(HCDR3)의 각각의 아미노산 서열이,
    LCDR1: RASQDISSYLN(서열목록의 서열번호 30)
    LCDR2: YTSRLHS(서열목록의 서열번호 31)
    LCDR3: QQLNTLP(서열목록의 서열번호 32)
    HCDR1: DAWMD(서열목록의 서열번호 33)
    HCDR2: EIRSKANNHATYYAESVKG(서열목록의 서열번호 34) 및
    HCDR3: RDGAY(서열목록의 서열번호 35)
    을 포함하거나,
    또는,
    LCDR1: RSSQSLVHSNGNTYLH(서열목록의 서열번호 36)
    LCDR2: KVSNRFS(서열목록의 서열번호 37)
    LCDR3: SQSTHVP(서열목록의 서열번호 38)
    HCDR1: TSYYWN(서열목록의 서열번호 39)
    HCDR2: YISYDGTNNYNPSLKN(서열목록의 서열번호 40) 및
    HCDR3: SFG
    를 포함하는,
    단리된 항RGMa 항체, 또는 그 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    중쇄 가변 영역(VH)이
    VH: EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVK
    GRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS(서열목록의 서열번호 41) 을 포함하고,
    경쇄 가변 영역(VL)이
    VL: DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGS
    GTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME(서열목록의 서열번호 42) 을 포함하는, 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    항RGMa 항체가 인간화 항체인, 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    항RGMa 항체가 인간IgG의 불변 영역을 가지는, 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편의 단백질 부분을 코딩하는 핵산 분자.
  6. 제5항에 있어서,
    VH 및 VL의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이
    VH:gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcagatccctgagactgtcctgtaccgcctccggcttcaccttctccgacgcctggatggattgggtgcgacaggctcctggcaagggcctggaatgggtggccgagatccggtccaaggccaacaaccacgccacctactacgccgagtctgtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgtgtacctgcagatgaactccctgcggaccgaggacaccgccctgtactactgcaccagaagggacggcgcctactggggcaagggcaccacagtgacagtgtcctcc(서열목록의 서열번호 43), 및
    VL:gacatccagatgacccagtccccctcctccgtgtctgcttccgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcgggcctcccaggacatctcctcctacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactacacctcccggctgcactccggcgtgccctctagattttccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgcctcctacttctgtcagcagctgaacaccctgccctggacctttggcggaggcaccaaggtggaaatggaa(서열목록의 서열번호 44)
    를 포함하는 핵산 서열인, 핵산 분자.
  7. 제5항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 제7항에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편의 제조 방법으로서, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편의 단백질 부분을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편의 제조 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 항RGMa 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는, 신경학적 질환 또는 자가면역질환의 예방, 치료 또는 재발 예방용인 의약 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    근위축성 측삭경화증, 상완신경총 손상, 뇌손상, 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 길랑바레 증후군, 대뇌백질 위축증, 다발성 경화증, 재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증, 시신경척수염, 폴리오 후 증후군, 이분척추, 척수 손상, 척수성 근위축증, 척추종양, 횡단성 척수염, 인지증, 노년성 인지증, 경도 인지 기능 장해, 알츠하이머병, 알츠하이머 관련 인지증, 헌팅턴 무도병, 지발성 디스키네시아, 조병, 파킨슨병, 스틸-리차드슨-올스제위스키 증후군, 다운증, 중증근무력증, 신경외상, 시신경외상, 혈관 아밀로이드증, 아밀로이드증을 수반하는 대뇌출혈, 뇌경색, 뇌염, 급성 혼란 장해, 녹내장, 통합실조증 및 망막 신경섬유층 변성, 당뇨병성 망막증, 허혈성 시신경증, X염색체 연쇄성 망막분리증, 약물 유발성 시신경증, 망막 디스트로피, 가령황반변성, 시신경 유두 드루젠에 의해 특징지어지는 안병, 광수용기 변성의 유전적 결정 인자에 의해 특징지어지는 안병, 상염색체 열성 추체-간체 디스트로피, 및 시신경증을 수반하는 미토콘드리아 장해를 포함하는 군으로부터 선택되는 신경학적 질환; 또는
    다발성 경화증, 재발 관해형 다발성 경화증, 1차성 진행형 다발성 경화증, 2차성 진행형 다발성 경화증, 시신경척수염, 건선, 관절염, 관절 류머티즘, 변형성 관절증, 건선성 관절염, 길랑바레 증후군, 신경 베체트병, 악성 빈혈, I형(인슐린 의존형) 당뇨병, 전신 에리테마토데스(SLE), 염증성 장질환(IBD), 쇼그렌 증후군, 굿파스쳐 증후군, 그레이브스병, 자기면역성 용혈성 빈혈, 자기면역성 혈소판 감소성 자반병, 천식, 화분증, 아토피성 피부염, 사구체신염, 중증근무력증, 하시모토병, 및 사르코이도시스를 포함하는 군으로부터 선택되는 자가면역질환
    의 예방, 치료 또는 재발 예방용인, 의약 조성물.
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