KR20160055275A - 시스 ｒｇｍａ/네오제닌 상호작용 또는 지질 래프트에 대해 지시되는 제제 및 치료 방법에서의 이의 용도 - Google Patents

시스 ｒｇｍａ/네오제닌 상호작용 또는 지질 래프트에 대해 지시되는 제제 및 치료 방법에서의 이의 용도 Download PDF

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필리프 피. 모니에르
나르도스 지. 타쏘우
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유니버시티 헬스 네트워크
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Abstract

본원에는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용 또는 지질 래프트를 조정하는 제제가 개시된다. 상기 제제에 의한 조정은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 차단하고/하거나 지질 래프트를 방해함을 포함할 수 있다. 결국, 이는 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킨다. 또한, 본원에서는 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서의 질환의 치료 방법도 개시된다. 상기 방법은 상기 대상체에게 상기 제제를 투여함을 포함할 수 있다. 추가로, 본원에는 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 동정하는 방법이 제공된다.

Description

시스 ＲＧＭＡ/네오제닌 상호작용 또는 지질 래프트에 대해 지시되는 제제 및 치료 방법에서의 이의 용도{AGENTS DIRECTED AGAINST A CIS RGMA/NEOGENIN INTERACTION OR LIPID RAFTS AND USE OF THE SAME IN THE METHODS OF TREATMENT}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 본원에 인용에 의해 포함되는 2013년 9월 17일에 출원된 U.S. 가특허 출원 제61/878,827호에 대한 우선권을 주장한다.
기술 분야
본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa: Repulsive Guidance Molecule A)와 네오제닌 사이의 시스(cis) 상호작용을 차단하거나 지질 래프트(lipid raft)를 방해하는 제제(agent), 세포 생존 및 축삭(axon) 성장 및/또는 재생을 촉진시키기 위해 이러한 시스 상호작용 또는 지질 래프트를 조정하는 방법, 및 시스 상호작용 또는 지질 래프트가 대상체에게 유해한 질환, 예를 들면, 색소성 망막염, 다발성 경화증, 허혈(예를 들면, 뇌졸중), 시신경 손상, 및 척수 손상의 치료 방법에 관한 것이다.
배경
중추 신경계(CNS)에의 손상은 성인 뉴런이 축삭을 재생시키는 능력이 좋지 못한 경우에 기능의 영구적 상실을 초래할 수 있다. 추가로, 성인 뉴런은 손상에 따른 아폽토시스(apoptosis)에 민감하다. 손상에 대한 반응으로, CNS에서 배척성 인도 분자 A(RGMa)의 수준이 증가한다. 이러한 증가된 수준의 RGMa는 축삭 성장 및/또는 재생을 억제하고 뉴런 세포 생존을 촉진시킨다. 이와 같이, RGMa는 손상된 CNS에 대해 긍정적 영향 및 부정적 영향을 발휘한다. 또한, 이들 영향은 CNS 발달 동안 발생한다.
RGMa는 네오제닌과의 트랜스(trans) 상호작용을 통해 이러한 축삭 성장의 억제 및/또는 세포 생존의 재생 및 촉진을 매개한다. 이러한 트랜스 상호작용은 세포외 RGMa와 뉴런 표면에 위치한 네오제닌 사이에 발생한다.
따라서, CNS에의 손상 또는 CNS의 질환의 존재시에 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생 둘 다를 촉진시키는 치료요법의 확인 및 개발에 대한 요구가 존재한다.
요약
본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 지질 래프트를 방해할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하고, 이에 의해 지질 래프트로의 네오제닌의 유입(recruitment)이 차단될 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, 상기 항체는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하고, 이에 의해 지질 래프트로의 네오제닌의 유입이 차단될 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 콜레스테롤-저하제일 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 콜레스테롤-저하제일 수 있고, 여기서, 상기 콜레스테롤-저하제는, 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD), 콜레스테롤 산화효소(CO), AY-9944, 스타틴, 서브틸리신/켁신 유형 9(PCK9) 억제제, 나이스타틴, 필리핀, 프로단백질 전환효소, BM15.766, 알킬인지질 유사체, 및 이들의 임의의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 콜레스테롤-저하제일 수 있고, 여기서, 상기 콜레스테롤-저하제는, 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD), 콜레스테롤 산화효소(CO), AY-9944, 스타틴, 서브틸리신/켁신 유형 9(PCK9) 억제제, 나이스타틴, 필리핀, 프로단백질 전환효소, BM15.766, 알킬인지질 유사체, 및 이들의 임의의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기서, 상기 콜레스테롤-저하제는 지질 래프트를 방해하고, 이에 의해 지질 래프트로의 네오제닌의 유입이 방해될 수 있다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이, 여기서, 상기 질환은, 색소성 망막염, 허혈, 다발성 경화증, 척수 손상, 및 시신경 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 질환은, 색소성 망막염, 허혈, 다발성 경화증, 척수 손상, 및 시신경 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기서, 상기 허혈은 뇌졸중일 수 있다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 콜레스테롤-저하제는, 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD), 콜레스테롤 산화효소(CO), AY-9944, 스타틴, 서브틸리신/켁신 유형 9(PCK9) 억제제, 나이스타틴, 필리핀, 프로단백질 전환효소, BM15.766, 알킬인지질 유사체, 및 이들의 임의의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 콜레스테롤-저하제는, 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD), 콜레스테롤 산화효소(CO), AY-9944, 스타틴, 서브틸리신/켁신 유형 9(PCK9) 억제제, 나이스타틴, 필리핀, 프로단백질 전환효소, BM15.766, 알킬인지질 유사체, 및 이들의 임의의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하고, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는 것을 추가로 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하고, 지질 래프트를 방해하는 것을 추가로 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 질환은, 색소성 망막염, 허혈, 다발성 경화증, 척수 손상, 및 시신경 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기서, 상기 질환은 척수 손상일 수 있고, 여기서, 상기 방법은, 상기 대상체에서의 운동 기능(locomoter function)을 회복시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 질환은, 색소성 망막염, 허혈, 다발성 경화증, 척수 손상, 및 시신경 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기서, 상기 질환은 색소성 망막염일 수 있고, 여기서, 상기 방법은, 상기 대상체에서의 광 수용기(photoreceptor) 세포의 생존을 촉진시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제를 투여함을 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 질환은, 색소성 망막염, 허혈, 다발성 경화증, 척수 손상, 및 시신경 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 여기서, 상기 허혈은 뇌졸중일 수 있고, 여기서, 상기 방법은, 상기 대상체에서 경색 체적, 뇌 부종, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 감소시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
또한, 본 발명은, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 RGM 펩타이드는 RGMa 펩타이드일 수 있고, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 RGM 펩타이드는 RGMa 펩타이드일 수 있고, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 RGM 펩타이드는 RGMa 펩타이드일 수 있고, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 RGM 펩타이드는 RGMa 펩타이드일 수 있고, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 RGM 펩타이드는 RGMa 펩타이드일 수 있고, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 RGM 펩타이드는 RGMa 펩타이드일 수 있고, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 네오제닌 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383일 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 조정은, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 조정은, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는 것을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준이 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준보다 더 낮으면, 상기 제제는 시스 상호작용을 방해한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해한다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제일 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은, (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제에 관한 것이고, 여기서, 상기 제제는 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있고, 여기서, 상기 제제는 항체일 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다); (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)를 포함하는, 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 네오제닌 펩타이드는 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417일 수 있다.
또한, 본 발명은, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 관한 것이고, 여기서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해한다.
도 1은, 네오제닌이 지질 래프트에 존재하였음을 보여준다. (A) 네오제닌에 대한 N-20 및 AF1079 항체를 생성하기 위해 사용된 서열의 도식적 표현. (B) N-20은 1개의 180kDa 밴드를 검출하였고, 반면에 AF1079는 상기 180kDa 밴드 및 약 150kDa에서 네오제닌의 N-말단 결실을 인식하였음을 보여주는 뇌 용해물의 웨스턴 블롯 분석. (C) F-액틴(알렉사 팔로이딘(Alexa Phalloidin)) 및 (D) 네오제닌의 망막 성장 원추(retinal growth cone)의 면역형광 화상. 바, 30㎛. (E) 네오제닌 염색, 래프트 마커 콜레라 독소 서브유닛 B(CTB), 및 네오제닌과 CTB의 공동국소화(colocalization)를 나타내는, 점선 외곽선으로 보여지는 표시 영역이 색(색 도시하지 않음)의 변경을 나타낸 합쳐진 화상의 복합 화상. 네오제닌과 CTB 사이의 공동국소화를 정량하기 위한 강도 상관관계 지수(ICQ: Intensity correlation quotient)는 12 성장 원추로 계산되었다. ICQ는, -0.5 내지 +0.5 범위를 유도하기 위해, 총 픽셀 수에 대한 양 또는 음의 (Ai-a)(Bi-b) 값의 수의 비에서 0.5를 뺄셈한 것을 반영하였다. 여기서, 평균 0.27의 ICQ가 계산되었고, 이는 네오제닌과 CTB 사이의 강한 공동국소화를 나타냈다. 바, 30㎛. (F) 네오제닌(AF1079), RGMa, 및 색(색 도시하지 않음)으로 보여지는 표시 영역이 네오제닌과 RGMa의 공동국소화를 나타내는 합쳐진 화상의 복합 화상. 평균 0.32의 ICQ가 계산되었고, 이는 네오제닌과 RGMa 사이의 강한 공동-국소화를 나타냈다. 바, 30㎛. (G) 네오제닌(화살촉)이 RGMa와 래프트 마커, 플로틸린과 국소화되었음을 보여주는 병아리 뇌 농도구배 분획화. 트랜스페린 수용체(TfR)를 중질 분획 마커(heavy fraction marker)로서 사용하였다.
도 2는, 네오제닌의 4Ig 도메인과 RGMa의 N-말단 부분 사이의 시스-상호작용이 네오제닌을 지질 래프트로 유입시켰음을 보여준다. (A) 4Ig- 또는 6FNIII-AP로 코팅된 플레이트 상에서 RGMa 단백질을 항온배양하였다. (결합: -, 기저선; ++ > 5 x 기저선; 본 실험에 관한 정량 분석은 도 9에 제시된다). 1개의 C-RGMa 도메인 및 1개의 N-RGMa 도메인(N-RGMa77 -113)은 6FNIII와 상호작용하였다. 1개의 N-RGMa 도메인(N-래프트)은 4Ig와 상호작용하였다. (B) His-6FNIII 또는 His-4Ig를 발현하는 세포로부터의 상청액(Sup)은, N-래프트, N-RGMa50 -99, 및 N-inh로 코팅된 비드를 이용하여 풀 다운되었다(pulled down)(IP). 이어서, 항-His 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하여, His-6FNIII 또는 His-4Ig가 상기 코팅된 비드와 상호작용하였는지의 여부를 밝혔다. 이는 His-6FNIII가 N-inh에 의해 풀 다운되었고, 반면에 His-4Ig는 N-래프트에 의해 풀 다운되었음을 보여주었다. 세포 상청액에 대한 웨스턴 블롯을 수행하여, 풀 다운을 수행하기 위해 동량의 His-FNIII 및 His-4Ig를 사용하였음을 입증하였다. 라미닌(lam.) 및 라미닌 + N-RGMa 또는 N-RGMa 단백질 도메인에 대한 망막-외식편(retinal-explant) 과성장의 (C) 화상 및 (D) 정량은, N-RGMa 및 N-in.만이 축삭 성장을 억제하였음을 보여주었다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3 독립적 실험), *p<0.0001이었다. 스케일 바, 100㎛. (E) 막 분획화(membrane fractionation)를 제조하기 1일 전에 병아리 뇌에 대조군 펩타이드(Ctrl; N-RGMa50 -99), 4Ig, N-래프트, 또는 노긴(Noggin)을 주사하였다. 대조군 실험에서, 네오제닌은 플로틸린/RGMa-함유 지질 래프트 분획(실선 박스로 나타냄)에 국소화되었다. 4Ig, N-래프트 또는 노긴은 네오제닌을 중질 분획으로 이동시켰다.
도 3은, RGMa 억제에 지질 래프트와의 네오제닌 회합이 요구되었음을 보여준다. (A) N-RGMa 상에서 배양되고 4Ig(1㎍/ml), N-래프트(1㎍/ml), RGMa ShRNA(shRNA 및 shRNA37), MβCD(10mM), CO(2U/ml), 및 노긴(100nM)으로 치료된 측두 외식편. (B 내지 F) 외식편은 라미닌(Ctrl) 상에서, 라미닌 + -N-RGMa, -C-RGMa, 또는 -RGMaΔ 상에서 성장되었고, (B) RGMa shRNA21 및 shRNA37, (C) 4Ig, (D) N-래프트, (E) MβCD 및 CO, 및 (F) 노긴(Nog.)으로 치료하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3 독립적 실험), *p<0.005이었다. (G) 병아리 시각 경로에서의 생체내 실험의 도식적 표현. 우측 눈은, E2에서 RGMa/네오제닌 작제물을 발현하는 플라스미드로 전기천공하였고, E17에서 눈으로부터 시개(optic tectum)까지 추적을 수행하였다. 삽도는, 패널 H 내지 K에 제시된 영역을 나타낸다. (H) N-RGMa50 -99를 이용한 대조군, 이는 네오제닌과 상호작용하지 않는다. 축삭 경로는 온전하였고, 모든 섬유들은 말단 영역(TZ: terminal zone)으로 말단 수지상(terminal arbor)을 확립하였다. (I) RGMa-shRNA, (J) N-래프트 또는 (K) 4Ig의 전기천공, 예측된 TZ(화살촉) 외부에 말단 수지상을 확립하는 다수의 섬유들로 축삭 경로가 섭동됨(perturbed). 스케일 바, 100㎛. (L) 상기 제시된 치료들의 실행의 도식적 표현. 네오제닌의 4Ig 도메인은 RGMa의 N-말단부(N-래프트)와 상호작용하여 지질 래프트로의 네오제닌의 BMP-의존적 유입을 가능하게 한다. 일단, 지질 래프트에서 네오제닌은 축삭 억제를 형질도입하였다. 지질 래프트와의 네오제닌 회합을 방지한 처리는 축삭 억제를 무효로 하였다. 이들 처리는 (1) 노긴으로의 BMP의 킬레이팅(chelating); (2) N-래프트 펩타이드의 첨가로의 네오제닌 상의 4Ig 부위의 차폐(masking); (3) 4Ig 펩타이드의 첨가로의 RGMa 상의 N-래프트 부위의 차폐; (4) shRNA(shRNA21 및 shRNA37)로의 RGMa의 사일런싱(silencing), 및 (5) 콜레스테롤 소모(MβCD 및 CO)를 이용한 지질 래프트의 방해.
도 4는, 네오제닌이 지질 래프트에 세포 사멸을 유도할 것을 요구되었음을 보여준다. (A) RGMa를 안정하게 발현하는 HEK293 세포(도 11)를 빈(empty) 플라스미드(대조군) 또는 네오제닌(Neo)으로 형질감염시켰다. 네오제닌은 대조군과 비교하여 세포 사멸을 유도하였다(화살표). (B) BSA(Neo+Ctrl), 4Ig(1㎍/ml), 노긴(100nM), 또는 MβCD(10mM)에서 항온배양된 네오제닌-형질감염된 세포에서의 세포 사멸의 정량. 지질 래프트와의 네오제닌 회합을 방지한 처리는, 네오제닌-유도된 세포 사멸을 유의하게 구제하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3 독립적 실험), *p<0.0001이었다. GFP- 및 네오제닌-발현 플라스미드로 전기천공하고, 이어서, N-RGMa50-99(Ctrl; 1㎍/ml), 4Ig(1㎍/ml), 또는 N-래프트(1㎍/ml)를 주사하고, TUNEL 검정을 수행한 병아리 E5 시개(tecta)에서의 세포 사멸의 (C) 대표적 화상 및 (D) 정량. 4Ig 또는 N-래프트는, 네오제닌에 의해 야기된 TUNEL 양성 세포의 수를 유의하게 감소시켰다. 3개의 상이한 시개/조건으로부터 데이터는 평균 ± SEM(*p<0.001)이었다. 바, 100㎛. 요오드화 프로피디움(PI)으로 염색한, 대조군 펩타이드(1㎍/ml), 4Ig(1㎍/ml), N-래프트(1㎍/ml), 또는 MβCD(10mM) 및 사멸 세포와 4일 동안 항온배양된 망막 홀 마운트(whole mount)의 (E) 대표적 화상 및 (F) 정량. 3개의 독립적 실험으로부터의 조건당 9개의 홀 마운트로부터의 화상을 동일한 강도에서 취하였고, ImageJ를 이용하여 형광도를 측정하였다. 4Ig, N-래프트, 또는 MβCD는 망막 홀 마운트에서 세포 사멸을 유의하게 감소시켰다. 바, 500㎛. (G) 축삭절단 후 14일째에 손상된 망막에서의 플루오로골드(Fluorogold)-표지된 망막 신경절 세포(RGC: retinal ganglion cell)를 묘사한 플랫-마운트 망막 형광 현미경 사진. 대조군 망막(Ctrl)은 생존 RGC가 거의 없었다. 4Ig, N-래프트 또는 MβCD는 세포 생존을 증가시켰다. 바, 200㎛. (H) 본 발명자들의 분석에서 선택된 망막 영역의 표시. (I) 4Ig 또는 N-래프트 및 (J) MβCD가 RGC 생존을 유의하게 증가시켰음을 보여주는 축삭절단 후 14일째의 생존 RGC 밀도의 정량. 데이터는 평균 ± SEM(n=6 눈), *p<0.01이었다.
도 5는, 지질 래프트 내의 네오제닌 존재를 변경하는 것이 척수 손상 후 기능 회복 및 뉴런 생존을 촉진시켰음을 보여준다. BBB(A, D), 운동 서브스코어(motor subscore)(B, E), 및 평균 발걸음 수(C, F)를 이용한 행동 평가는, 4Ig(IV) 또는 MβCD(IP)로의 전신 치료가 대조군에 비하여 척수 손상된 래트에서 현저한 기능적 향상을 초래하였음을 보여주었다. 데이터는 평균 ± SEM(대조군: n=7; 4Ig: n=8; MβCD: n=8)(*p<0.005)이었다. (G, H) BBB(G) 및 평균 발걸음 수(H)를 이용한 행동 평가는, 4Ig의 척수강내 적용이, 대조군에 비하여 척수 손상된 래트에서 현저한 기능적 향상을 초래하였음을 보여주었다. 데이터는 평균 ± SEM(대조군: n=10; 4Ig: n=10)(*p<0.005)이었다. (I 내지 M) 뉴런 마커, NeuN으로 염색된 손상된 척수의 종단면. 삽도는, (I) 비히클 대조군, (J) 4Ig, 및 (K) MβCD로의 전신 치료 후 래트로부터의 손상된 척수 내의 병변-주위 뉴런을 나타낸다. 화살표는 4Ig 및 MβCD 치료 후의 뉴런을 나타낸다. 점선은 백색질과 회색질 사이의 경계를 나타낸다. I 내지 K에 제시된 실험의 정량은, (L) 4Ig 및 (M) MβCD를 이용한 치료가, SCI 후 남은 뉴런의 수에 유의한 증가를 초래하였음을 보여준다. 각각의 동물에 대해, 뉴런의 무명수(absolute number)를, 등가의 회색질 조직을 포함하는 각각의 척수의 두께에 걸쳐 등가의 전방-후방 거리에서의 5개의 절편으로부터 정량하였다. (N 내지 O) 4Ig로의 척수강내 치료 후 손상된 척수의 횡단면의 Neu-N 염색. 삽도는, (N) 비히클, 및 (O) 4Ig로 처리된 래트로부터의 척수를 나타낸다. 화살촉은 뉴런을 나타낸다. (P) N 내지 O에 제시된 실험의 정량은, 4Ig로의 척수강내 치료가, SCI 후 뉴런의 수에 유의한 증가를 초래하였음을 보여준다. 병변 부위에 대해 상이한 거리에서의 정량은 도 12D에 제시된다. 바, 100㎛. 데이터는 평균 ± SEM(n=8 동물/조건), *p<0.001이었다. 스케일 바, 100㎛.
도 6은, 지질 래프트 내의 네오제닌 존재를 변경하는 것이 유수(myelinated) 척수에서 축삭 재생을 촉진시켰음을 보여준다. 피질-척수로(cortico-spinal tract)로부터의 축삭을 가시화하기 위해, SCI 후 6주째에 비오틴 덱스트란 아민(BDA)을 이용한 순행성 축삭 추적을 수행하였다. (A) 상부 패널은 손상 후 대조군 척수를 나타낸다. 삽도는 보다 높은 배율을 나타낸다. 병변 공동(lesion cavity)는 좌측에 제시된다. (B) 4Ig로 치료된 손상된 척수. BDA를 이용한 추적으로, 4Ig 실험에서는 상기 공동의 미측에 섬유가 나타났지만, 대조군에서는 나타나지 않았다. 최장 재생 축삭은 상기 공동의 미측 말단을 지나 몇 mm 연장되었다. 화살표는 섬유를 나타낸다. 삽도의 화살촉은 섬유로 변하고 있는 것을 나타낸다. 스케일 바, 100㎛. (C, D) SCI-후 평균 최대 길이는 (C) 4Ig 및 (D) MβCD 치료에 따라 증가하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n=4 독립적 래트/조건; 3 내지 4절편/래트), *p<0.001이었다. 평균 재생 축삭의 수/절편을 측정하였고, 이는 (E) 4Ig 및 (F) MβCD로 치료된 손상된 래트에서 보다 큰 재생 축삭의 수를 나타냈다. 데이터는 평균 ± SEM(n=4 독립적 래트/조건; 3 내지 4절편/래트), *p<0.005이었다. (G, H) 동물을 희생시키고 축삭 길이를 측정하기 전에 4 또는 6주(w) 동안 4Ig로 치료된 손상된 척수. (G) 평균 축삭 길이는 4주에 비하여 6주째에 유의하게 더 컸다. (H) 평균 재생 축삭의 수/절편을 측정하였고, 이는 4주에 비하여 척수가 6주 동안 치료된 경우에 유의하게 더 높은 3 내지 4mm의 축삭의 수를 나타냈다. 데이터는 평균 ± SEM(n=5 독립적 래트/조건; 3 내지 4절편/래트), *p<0.005이었다.
도 7은, 지질 래프트 내의 네오제닌 존재를 변경하는 것이 시신경 손상 후 축삭 재생을 촉진시켰음을 보여준다. (A 내지 D) 시신경 압박(optic nerve crush) 및 각종 치료 후 21일째의 시신경의 종단면의 GAP-43 면역 염색. 대조군(A)에 비교하여, (B) 4Ig 및 (C) N-래프트로 지질 래프트 내의 네오제닌의 존재를 변경하거나 (D) MβCD로 지질 래프트를 방해하는 것은 (가장 쉽게 (C)에서 점선으로 보여지는) 압박 부위 후에 그리고 원위 유수 시신경으로의 축삭 재생을 향상시켰다. 화살표는 각각의 신경 절편에서의 몇몇의 재생 축삭을 표시한다. 삽도 화상은, 상응하는 절편으로부터의 재생 축삭의 보다 높은 배율의 도면이다. (E) 시신경 손상 후 4Ig, N-래프트, 및 MβCD이 축삭 재생을 유의하게 향상시켰음을 보여주는 축삭 길이의 정량. 데이터는 평균 ± SEM(n=7 시신경/조건), *p<0.001이었다. 스케일 바, 200㎛.
도 8은, 공동-국소화 실험을 위한 대조군을 보여준다. (A) 망막 성장 원추의 CTB 및 F-액틴 염색. 래프트 마커 콜레라 독소 서브유닛 B(CTB), F-액틴 마커 알렉사-팔로이딘의 합쳐진 화상 및 복합 화상, 이는 도해의 줄기 및 원주에서의 CTB 및 F-액틴(색 도시하지 않음)의 공동국소화 중첩을 보여준다; 바, 30㎛. (B) CTB 및 F-액틴은 망막 성장 원추에서 무작위 염색을 보여주었다. CTB와 알렉사-팔로이딘 사이의 공동국소화를 정량하기 위한 강도 상관관계 지수(ICQ)는 10 성장 원추로 기술된 바와 같이 계산되었다. ICQ는, -0.5 내지 +0.5 범위를 유도하기 위해, 총 픽셀 수에 대한 양 또는 음의 (Ai-a)(Bi-b) 값의 수의 비에서 0.5를 뺄셈한 것을 반영하였다. 여기서, 평균 0.05의 ICQ가 계산되었고, 이는 CTB와 F-액틴 사이의 무작위 국소화를 나타낸다. (C) 병아리 뇌의 MβCD 치료는 네오제닌 공동국소화를 중질 분획으로 이동시킨다. 막 분획화(membrane fractionation)를 제조하기 1일 전에 병아리 뇌에 MβCD(10mM)를 주사하여 콜레스테롤을 고갈시켰다. 이들 실험에서, 네오제닌은 트랜스페린 수용체(TfR)와 공동국소화되었다. 따라서, MβCD로의 사전-치료는 네오제닌 국소화를 변경시켰고, 이는 지질 래프트 분획 내에 더 이상 존재하지 않았음을 나타낸다.
도 9는, 별도의 네오제닌 영역과 상호작용하는 상이한 RGMa 도메인의 확인을 보여준다. (A) 상이한 RGMa-AP 단백질을 4Ig 6FNIII 또는 BSA로 코팅된 웰 상에서 항온배양하였다. 비색 기질 p-니트로페닐 포스페이트를 첨가함으로써 결합이 드러났고, 이는 AP 태그(tag)의 존재를 밝혔으며, 플레이트 판독기를 이용하여 405nm에서의 흡광도를 측정하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3 독립적 실험), *p<0.005이었다. (B) 상이한 RGMa 영역 유래의 단백질로 코팅된 웰 상에서 4Ig-AP 및 6FNIII-AP 단백질이 검정된 결합 검정의 정량. 이러한 검정을 확증한 (a)에서 상호작용을 나타낸 단편. 따라서, 네오제닌 내의 4Ig 및 6FNIII 도메인에 각각 결합된 2개의 N-RGMa 단편이 확인되었다(N-래프트 및 N-RGMa77-113). C-RGMa 단백질 및 전장 RGMa만이 6FNIII에 결합하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3 독립적 실험), *p<0.005이었다. (C) DCC의 4Ig 도메인은 N-래프트(N-RGMa28-73)과 상호작용하지 않는다. 단백질 DCC-4Ig 및 네오제닌-4Ig로 코팅된 웰 상에서 N-RGMa-AP가 검정된 결합 검정의 정량. 이 실험에서 DCC-4Ig를 제외하고 네오제닌-4Ig는 N-래프트-AP와 상호작용하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n=4 독립적 실험), *p<0.005이었다. (D) 지질 래프트 내의 네오제닌의 국소화를 위해 네오제닌의 4Ig 도메인과 N-래프트 사이의 시스-상호작용이 요구된다. HEK-293 세포를 네오제닌 및 RGMa 작제물로 형질감염시켰다. 세포를 수집하기 1시간 전에 배지에 BMP2(100nM)를 첨가하였다. 지질 래프트 분획화에 이어서 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 플로틸린을 지질 래프트 분획을 위한 마커로서 사용하였고, 반면에 트랜스페린 수용체(TfR)를 중질 막-분획을 위한 마커로서 사용하였다. 모든 실험을 2회 반복하였다. 네오제닌에 대한 웨스턴 블롯은, 이소형(isoform) 둘 다를 인식하는 항체 AF 1079를 이용하여 수행하였다. 제1 세트의 실험에서, 세포는 네오제닌으로만 형질감염시켰다. 이 연구로부터의 세포 막에서, 네오제닌은 중질 막 TfR에 대한 마커와 공동-국소화되었고, 지질 래프트 마커 플로틸린과의 공동-국소화는 관찰되지 않았다. 제2 세트에서, 전장 네토제닌 및 RGMa를 형질감염시켰고, 플로틸린을 함유하는 지질 래프트 분획에 180kDa 네오제닌 밴드가 국소화되었다. 제3 및 제4 세트에서, 네오제닌의 4Ig 절단(Neo (4Ig del)) 또는 RGMa의 N-RGMa28-73(N-래프트) 절단(RGMa (28-73 del))을 형질감염시켰을 때, 플로틸린 함유 래트프 분획에 네오제닌은 더 이상 존재하지 않았다. 이는 지질 래프트 내의 네오제닌 존재를 위해 4Ig와 N-NRMa28-73(N-래프트) 사이의 상호작용이 요구됨을 시사한다.
도 10은, shRNA를 이용한 RGMa 사일런싱의 평가를 보여준다. (A) RGMa-shRNA(shRNA#21 및 shRNA#37)를 이용한 병아리 및 마우스 RGMa 사일런싱의 웨스턴 블롯 분석. HEK-293 세포를 병아리 또는 마우스 RGMa 및 shRNA로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 2일 후에, 막 제조를 수행하였고, 항 RGMa 항체를 이용한 웨스턴 블롯에서 RGMa 발현을 분석하였다. HEK-293 세포를 병아리 RGMa로 형질감염시킨 경우, 웨스턴 블롯 분석은 대조군 shRNA(shRNA-Crl)을 제외한 RGMa-shRNA(shRNA#21 및 shRNA#37)가 RGMa 발현을 사일런싱시켰음을 밝혔다. HEK-293 세포를 마우스 RGMa로 형질감염시킨 경우, 웨스턴 블롯 분석은 RGMa-shRNA #21이 이의 발현을 사일런싱시켰음을 밝혔다. 그러나, shRNA #37은 마우스 RGMa 발현을 사일런싱시키지 않았다. 따라서, 마우스 RGMa는 구제 실험에 사용할 수 있고, 여기서, 병아리 RGMa는 RGMa shRNA #37로 사일런싱되었다. 쿠마시(Coomassie) 염색은 등가량의 단백질 부하를 보여준다. (B) 해리된(dissociated) 망막 신경절 세포를 각종 작제물로 형질감염시켰고 N-RGMa 상에서 배양시켰다. 적색 형광성 단백질로의 공동-형질감염을 수행하여 형질감염된 세포를 확인하였다. βIII 튜불린에 대한 염색을 수행하여 뉴런 세포를 확인하였다. 대조군 shRNA로 형질감염된 RGC의 대표적 사진은, N-RGMa로 코팅된 커버슬립(coverslip) 상에서의 축삭 과성장의 억제를 보여준다. 병아리 RGMa를 사일런싱시킨 shRNA37의 존재시, 이러한 억제는 억압되었다. shRNA37이 마우스 RGMa로 공동-형질감염된 경우, 축삭 성장의 N-RGMa 억제가 회복되었다. (C) 망막 신경절 세포를 각종 플라스미드로 형질감염시켰고 라미닌 및 라미닌 + N-RGMa, C-RGMa 및 RGMaΔ 상에서 성장되었던 실험들의 정량. RGMa 단백질에 대해, 망막 축삭은 라미닌과 비교하는 경우에 더 짧았다. 이들 억제는 shRNA37 형질감염에 의해 억압되었고, 마우스 RGMa를 shRNA37로 공동-형질감염시킨 경우에 회복되었다. 따라서, shRNA37의 영향은 RGMa의 특이적 사일런싱으로부터 초래된다. 모든 데이터는 평균 축삭 길이 ± SEM(n = 6 독립적 실험)이었다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 6 독립적 실험), *p<0.01이었다. (D) 망막 외식편의 MβCD 치료는 네오제닌 공동국소화를 보다 중질의 분획으로 변화시킨다. 병아리 외식편을 MβCD(10mM)로 치료하여 막 분획화를 제조하기 전에 1시간 동안 콜레스테롤을 고갈시켰다. 이들 실험에서, 네오제닌은 트랜스페린 수용체(TfR)를 공동-국소화시켰다. 따라서, MβCD를 이용한 사전-치료는 네오제닌 국소화를 변경시켰고, 이는 지질 래프트 분획 내에 네오제닌이 더 이상 존재하지 않았음을 나타낸다.
도 11은 세포 사멸의 평가를 위한 대조군 실험을 보여준다. (A) 안정한 HEK-293에서의 RGMa 발현. RGMa를 안정하게 발현하는 세포주가 HEK-293 세포에서 생성되었다. 분석을 위해 대조군 및 RGMa-발현성 안정한 세포주로부터 막을 제조하였다. (디설파이드 가교를 보존하기 위해서) DTT의 부재 하에 부하된 샘플에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 항-RGMa 항체는 안정한 세포주에서 예측된 55kDa 밴드의 존재를 밝힌다. 이러한 밴드는 대조군에서는 부재한다. (B) 녹색 형광성 단백질(GFP) 전기 천공은 병아리 시개에서 아폽토시스를 야기하지 않는다. E5 시개를 GFP-발현성 플라스미드로 전기천공하였고, 1일 후에 시개를 제거하였고, 절편에 대한 TUNEL 분석을 이용하여 아폽토시스성 세포 사멸을 측정하였다. GFP 염색은 시개가 성공적으로 전기천공되었음을 나타냈다. TUNEL 염색은 GFP 전기천공이 아폽토시스를 유도하지 않았음을 밝혔다. 따라서, GFP의 전기천공은 아폽토시스성 사멸을 유도하지 않았다.
도 12는 GFAP 및 NeuN 염색시 MβCD 및 4Ig를 이용한 치료의 효과를 보여준다: (A) MβCD, 4Ig, 및 대조군 PBS로 치료된 래트로부터의 성상세포 마커, GFAP로 염색된 병변 부위의 미측의 척수 영역을 보여주는 대표적 화상. 삽도는 GFAP 양성 성상세포의 고배율 화상을 보여준다. (B, C) 각각의 동물에 대해, 3개의 절편(1.1 x 106um2 면적)의 총합 면역형광성 강도 값은, 각각의 척수의 두께에 걸쳐 등가의 전방-후방 거리를 갖는 3개의 절편에서 문측 및 미측 둘 다의 병변의 가장자리로부터 0.45mm 및 1.8mm에서 측정되었다. 동물당 각각의 영역으로부터의 평균 값은 손상되지 않은 대조군의 평균 강도 값에 대해 정규화하였고 평균계산하였다. 그룹들 사이의 유의한 차이는 존재하지 않는다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 5 동물/조건)이었다. (D) MBCD 또는 4Ig 치료는 병변 체적에 영향을 미치지 않았다. 시상 주위 절편을 LFB/H&E로 염색시켰고, 각각의 척수에서 병변의 체적을 계산하였고 평균계산하였다. 병변의 체적에 있어서 그룹들 사이의 유의한 차이는 존재하지 않았다. (E) 숙주 뉴런 수: 4Ig의 척수강내 적용을 6주의 기간에 걸쳐 수행하였고, 이어서, 척수의 손상 및 횡단면을 NeuN으로 염색하였다. 병변 qdnl를 포함하는 척수의 5mm 문측-미측 절편에 걸쳐 320um의 거리로 분리된 NeuN+ 세포를 계수하였고; 상부 그래프는, 그룹당 계수되고 평균계산된 모든 뉴런의 합계를 보여주고; 하부 그래프는 -3mm 문측 내지 0(중심) 내지 3mm 미측을 포함하는 문측-미측 간격에서 계수된 뉴런의 평균 #을 보여준다; 1원 ANOVA, 사후 본페로니(post-hoc Bonferonni).
도 13은, 4Ig 및 MβCD를 이용한 치료가 척수 손상 후 기능적 결과를 향상시켰음을 보여준다. 손상 및 치료 후 행동 평가. (A, B) 기록을 슬로우 모션으로 분석하였고; 뒷다리당 발걸음 수를 기록하였고 각각의 래트에 대해 주당 평균을 계산하였다. 뒷다리를 끄는 손상된 래트는 12의 최대 발걸음을 스코어링하였다. 손상되지 않은 래트는 교차당 0 또는 때때로 1의 발걸음을 가졌다. 시험에 대한 상대적 성공률을 계산하였고, 이는 여기서 제시된다. 4Ig 또는 MβCD를 이용한 치료는 대조군에 비하여 척수 손상된 래트에서 현저한 기능적 향상을 초래하였다. 데이터는 평균 ± SEM(대조군: n = 8; 4Ig: n = 8; MβCD: n = 8)(*p<0.005)이었다. (C) 척수의 H/E&LFB 염색은, 래트에서 클립 압박 척수 손상(T8 수준에서의 20g 손상) 후 진원(epicenter)에서 척수-피질로의 전형적 공동 및 완전한 삭마(ablation)를 보여주는 문측 내지 미측의 단면적에서 시작한다. 척수피질로(CST)는 온전하였던 제1 문측 절편에서 박스로 표시되었다. (D) 패널은 4wks에서 BDA가 주사된 4Ig 래트에서 병변으로부터 약 1000um 미측의 BDA 표지된 섬유를 보여준다. 박스는 BDA 표지된 섬유의 보다 높은 배율의 구불구불한 형태를 보여준다(화살표). 표지된 섬유는 4wks에서 BDA가 주사된 4Ig 래트에서 병변 부위로부터 미측의 더 먼 거리에서 나타나지 않았다. (E) 척수피질로 축삭을 보여주는, 4Ig 치료된 래트 및 손상되지 않은 대조군의 병변 부위(T8)의 2mm 문측 및 5mm 미측의 척수의 단면적의 BDA 염색. 단면적에서, BDA 축삭 프로필은 4Ig 및 손상되지 않은 대조군에서 병변 부위의 2mm 문측의 CST(원으로 표시됨)에서 나타난다. 또한, BDA 표지된 CST 축삭은, CST의 지속성을 보여주는 손상되지 않은 대조군 래트에서의 병변 부위의 5mm 미측에 존재한다. 대조적으로, BDA 표지되지 않은 축삭은, CST의 파괴 및 남은 축삭이 없음을 보여주는 병변 부위의 5mm 미측의 절편에서 4Ig 치료된 래트에서 나타난다. (F) MβCD로 치료된 노령의 래트의 행동 평가: 노령의 래트(7개월령 초과)는 손상되었고, MβCD로 4주의 기간 동안 치료하였다. BBB 평가는, MβCD가 대조군에 비하여 척수 손상된 래트에서 현저한 기능적 향상을 초래하였음을 보여주었다. 손상 7일 후에 즉시 효과를 관찰하였고, 이는 MβCD 치료가 생존도 촉진시킨다는 개념과 일치한다. 데이터는 평균 ± SEM(대조군: n=4; MβCD: n=4)(*p<0.05)이었다.
도 14는, 4Ig, 손상된 시신경에서 N-래프트 및 MβCD를 이용한 치료를 보여준다. 시신경을 압박 손상시켰고 손상 21일 후 희생까지 DMSO(대조군), 4Ig, N-래프트, 및 MβCD를 이용하여 치료하였다. 이어서, 시신경을 고정시켰고, 절편화하였고, 항-GFAP 항체를 이용하여 분석하여 성상세포를 표지화하였다. (A) DMSO(대조군), 4Ig, N-래프트, 및 MβCD를 이용하여 치료한 시신경의 대표적 사진. 패널은 GFAP, DAPI 및 합쳐진 염색을 도시한다. 상부 우측 패널은 GFAP 염색의 정량에 사용된 영역을 나타낸다. (B) 각각의 동물에 대해, (A)에 제시된 4개의 영역들에서 Image J 프로그램(NIH)을 이용하여 면역형광성 강도를 측정하였다. 각각의 영역에 대한 상대적 평균 강도가 제시된다. 그룹들 사이의 유의한 차이는 존재하지 않는다. 데이터는 평균 ± SEM(n=4 동물/조건)이었다. (C) 시신경 압박 21일 후에 플랫-마운트 망막에서의 콜레라 독소 B(FITC 접합됨) 순행성 표지화를 보여주는 형광 현미경 사진. 각각의 사진은 특정 치료 후 중간-주변부(mid-periphery)로부터의 것이다. RGC의 축삭을 따라서 CTB-FITC를 능동적으로 순행 수송하고 있는 RGC의 세포체(화살표) 및 축삭을 볼 수 있다. MBCD, 4Ig 또는 N-래프트 치료는 i) 대조군과 비교하여 시신경 압박 후 신경 섬유층에서 RGC 축삭 체세포(axonsoma)의 온전함(integrity)을 보존하였다. 이들 영향은 중간-주변부 내지 외측 망막의 망막의 전체 표면에 걸쳐 나타났다.
도 15는, 네오제닌에 대한 RGMa 작용에 관한 모델을 보여준다. RGMa 및 네오제닌은 뉴런 사멸 및 축삭 성장/재생을 제어하는 두 종류의 상호작용을 확립한다. A) RGMa의 N-말단부와 네오제닌 내의 4Ig 도메인 사이의 시스 상호작용은 네오제닌을 지질 래프트에 유입시킨다. 일단 지질 래프트에 유입되면, 네오제닌은 환경으로부터의 RGMa 분비 공급원의 부재시에 세포 사멸을 유도할 것이다. B) 트랜스 상호작용은 RGMa의 C- 및 N-말단부와 네오제닌 내의 FNII 도메인으로의 2개의 별도의 도메인 사이에서 발생하고, RGMa와 네오제닌 사이의 상호작용은 축삭 성장/재생 억제를 조절한다. 트랜스로 상호작용하는 RGMa 펩타이드는 뉴런의 직접적인 주위의 세포에 의해 분비된다. 축삭 성장/재생을 차단하기 위해 네오제닌이 지질 래프트 내에 존재할 필요가 있었다. C) 네오제닌은 세포 사멸을 야기하고 축삭 성장/재생을 차단하기 위해 지질 래프트 회합을 요구하므로, 이들 구획으로의 네오제닌 유입을 변경하는 것을 사용하여 이의 기능을 방지할 수 있다. 이는, 4Ig 펩타이드(여기서 제시됨), N-래프트 펩타이드와 같은 펩타이드 또는 지질 래프트 방해를 포함하는 제제를 이용하여 이루어질 수 있다. 지질 래프트와의 네오제닌 회합을 방지하는 것은 세포 생존 및 축삭 성장/재생을 촉진시킨다.
도 16은, 닭 RGMa의 아미노산 28 내지 73의 서열을 나타낸다. 닭 RGMa 서열은 수탁번호 제NP_989868.1(서열번호 6)이었다.
도 17은 (A) 웨스턴 블롯 및 이의 상응하는 쿠마시 염색된 겔; (B) RGMa 펩타이드의 도해; 및 (C) 450nm에서의 흡광도에 대해 플롯팅된 펩타이드를 보여준다. 본 연구에 사용된 모든 작제물들은 갈루스 갈루스(Gallus gallus) 종으로부터 생성되었다. 네오제닌의 4Ig 도메인에의 N-RGMa의 결합 부위를 동정하기 위해, N-RGMa(28-73aa)는 4개의 중첩 단편들로 나뉘었다: 1) N-RGMa(28-54aa); 2) N-RGMa(40-62aa); 3) N-RGMa(55-73aa) 및 4) N-RGMa(54-62aa). 서열을 Psectag2B-AP 플라스미드에 클로닝하였고, 이는 알칼리성 포스파타제 태그와 융합된 가용성 단백질로서의 펩타이드의 분비를 가능하게 하였다. 96-웰 미량정량 플레이트(microtiter plate)(Corning Incorporated)를 이용하여, 웰을 4℃에서 100μl의 폴리-L-리신(10㎍/mL)으로 밤새 코팅하였다. 이어서, 웰을 10μl의 PBST(+0.02% Tween)로 3회 세척하였다. 50μl(2.5㎍/mL)의 His-태그된: 전장 네오제닌; 4Ig 네오제닌; 및 FNIII 네오제닌을 37℃에서 각각의 웰 상에 1시간 동안 코팅하였다. 100μl PBST의 3회 세척 후, 이어서, 각각의 웰을 37℃에서 PBST 중의 3% BSA 300μl로 1시간 동안 차단하였다. 이어서, 1% BSA + PBST 중의 50μl(1.0㎍/mL)의 AP-태그된: N-RGMa(28-73); N-RGMa(28-54); N-RGMa(40-62); N-RGMa(54-73); N-RGMa(54-62)를 각각의 웰에 첨가하였고, 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 각각의 웰을 100μl PBST로 3회 완전하게 세척하였고, 이어서, 각각의 웰을 알칼리성 포스파타제(AP) 전개 완충액(100mM NAHCO3, 1mM MgCl2)으로 후속적으로 평형화시켰다. p-니트로페닐 포스페이트(pNPP)(Sigma-Aldrich)가 보충된 AP 전개 완충액을 이용하여 반응을 전개시켰고, 색 발현까지 전개되도록 하였다. 50μl(0.1M) NaOH의 첨가로 반응을 정지시켰다. 450나노미터(nm) 파장에서 미세 플레이트 자동 판독기(BIO-TEK Instruments Inc.)를 이용하여 각 반응의 흡광도를 측정하였다. 네오제닌의 4Ig-도메인에 대한 N-래프트 내의 결합 부위를 추가로 동정하기 위해, N-래프트는 4개의 중첩 단편들로 나뉘었다: N-RGMa(28-54aa); N-RGMa(40-62aa); N-RGMa(55-73aa); 및 N-RGMa(54-62aa). 이들 4개의 단편들을 정제하였고, 전장 네오제닌, 네오제닌의 4Ig-도메인, 및 네오제닌의 6FNIII-도메인에의 결합에 대해 시험하였다(도 17A 내지 도 17C). 이들 연구는 N-RGMa(40-62aa) 및 N-RGMa(54-73aa)가 네오제닌의 4Ig-도메인에 특이적으로 결합하였음을 입증하였다(도 17C).
도 18은, 네오제닌이 성체 뮤린 광 수용기에서 발현되는 것을 보여준다: 성체 망막을 항-네오제닌 항체로 염색하였고, 이는, 광 수용기를 함유하는 외핵층(ONL: Outer Nuclear Layer)에서 이러한 단백질이 발현된다는 것을 밝힌다.
도 19는, 네오제닌 4Ig 도메인이 rd1 마우스에서 광 수용기 사멸을 방지한다는 것을 보여준다: A) P9에서 Rd1 마우스에게 PBS(대조군)을 또는 네오제닌의 4Ig 단편을 주사하였다. P21에서 동물을 희생시켰고 DAPI 또는 H&E 염색을 수행하여 광 수용기를 가시화하였다. 4Ig 주사된 동물에서, 대조군과 비교하는 경우에 외핵층(ONL)은 더 두껍게 나타났다. B) (A)에 제시된 실험에 대한 정량. ONL의 평균 두께뿐만 아니라 세포의 수는 대조군에 비하여 4Ig 치료된 동물에서 유의하게 증가하였다.
도 20은, 콜레스테롤 고갈/억제가 광 수용기 생존을 촉진시킨다는 것을 보여준다: (A) P9에서 rd1 마우스에게 PBS(대조군)을 또는 MBCD 또는 AY-9944를 주사하였다. P21에서 동물을 희생시켰고 DAPI 염색을 수행하여 광 수용기를 가시화하였다. MBCD 및 AY-9944 주사된 동물에서, 대조군과 비교하는 경우에 외핵층은 더 두껍게 나타났다. B) (A)에서 제시된 실험에 대한 정량. ONL에서의 세포의 수는 대조군에 비하여 MBCD 및 AY-9944 치료된 동물에서 유의하게 증가하였다.
도 21은, 콜레스테롤 고갈/억제가 간상체 생존을 촉진시킨다는 것을 보여준다: P9에서 rd1 마우스에게 PBS(대조군)를 또는 MBCD 또는 AY-9944를 주사하였다. P21에서 동물을 희생시켰고 간상체를 항-로돕신 항체로 염색시켰다. MBCD 및 AY-9944 주사된 동물에서, 본 발명자들은 외핵층 내의 간상체 수의 현저한 증가를 관찰할 수 있었다.
도 22는, 뇌졸중 모델에서 RGMa가 네오제닌을 통해 세포 생존을 촉진시킨다는 것을 보여준다: (A) 망막 전량을 뇌졸중 모델로서 산소 글루코스 박탈(OGD: oxygen glucose deprivation)시켰고 요오드화 프로피디움 염색(적색, 색 도시하지 않음)을 수행하여 세포 사멸을 평가하였다. 대조군(OGD 부재)에서, 대부분의 새포가 생존한다. OGD 후 증가된 염색은 보다 높은 사멸 세포의 수를 나타낸다. 배지에의 RGMa의 첨가(OGD+RGMa)는 세포 사멸을 감소시킨다. 네오제닌 차단 항체의 존재는 RGMa의 프로-생존 효과(pro-survival effect)를 없애고, 이는 세포 생존에 대한 RGMa의 효과가 네오제닌-매개된 것임(OGD+RGMa+네오제닌 항체)을 나타낸다. (B) A에서의 4개의 독립적 실험의 정량이 제시된다.
도 23은 RGMa 주사가 생체내 뇌졸중 모델에서 세포 생존을 촉진시킨다는 것을 보여준다. (A, B, C) 눈에 대해 수행된 실험의 도식적 표현. A) 주요 동맥을 결찰시켜 15분 동안 혈류를 정지시켰다. B) 결찰 직후에 눈 유리체에 RGMa를 주사하였다. C) 결찰 2주 후에, 역행 표지화를 수행하여 세포 생존을 평가하였다. D) 정량에 사용된 망막 영역의 표현. E) 각각의 조건에 대해 8마리의 래트에서 세포 생존의 정량을 수행하였다. 이는 RGMa 주사가 이러한 생체내 뇌졸중 모델에서 생존을 2배 촉진시킨다는 것을 보여준다.
도 24는, 4Ig가 망막 전량에서 OGD(산소 글루코스 박탈) 후에 생존을 증가시킨다는 것을 보여준다: A) 망막 전량에서 세포 생존에 대한 4Ig의 효과를 평가하였다. 배양시 2일 후, 요오드화 프로피디움 염색을 수행하여 사멸 세포를 가시화하였다. 대조군 또는 4Ig의 존재 하에 OGD를 수행하였다(1h). OGD 1일 후에 PI 염색에 의해 세포 생존을 평가하였다. B) A에서 관찰된 행동의 정량. 4Ig 치료된 배양물에서의 세포 생존의 유의한 향상이 존재한다.
도 25는, 지질 래프트(4Ig)와의 네오제닌 회합을 변경하는 것이 뇌졸중 후 뇌 손상을 방지한다는 것을 보여준다: 혈병을 중간 대뇌 동맥에 주입하여 뇌졸중을 생성시켰고, 동물을 4Ig(매일) 및 동물 또는 대조군 펩타이드의 꼬리 정맥 주입으로 치료하였다. 동물을 1주 동안 유지하였고, 뇌를 염색하여(2% 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드 용액) 손상을 가시화하였다. 이어서, 손상을 나타내는 백색 영역의 유리체(화살표)에 콜레라 독소를 주사하였다. 4Ig 치료된 동물에서, 손상이 대조군과 비교하여 감소되었다.
도 26은, 지질 래프트(4Ig)와의 네오제닌 회합을 변경하는 것이 뇌졸중 후 뇌 손상을 방지한다는 것을 보여준다: 혈병을 중간 대뇌 동맥에 주입하여 뇌졸중을 생성시켰고, 동물을 4Ig(매일) 및 동물 또는 대조군 펩타이드의 꼬리 정맥 주입으로 치료하였다. 동물을 1주 동안 유지하였고, 뇌를 염색하여(2% 2,3,5-트리페닐테트라졸리움 클로라이드 용액) 손상을 가시화하였다. A) 4Ig 및 대조군 동물에서 경색 체적을 측정하였다. 이는 4Ig 치료된 동물에서의 경색 크기의 유의한 감소를 보여준다. B) 4Ig 및 대조군 동물에서 뇌 부종의 크기를 측정하였다. 이는 4Ig 치료된 동물에서의 부종 크기의 유의한 감소를 보여준다. (*p<0.05)
도 27은, 지질 래프트(4Ig)와의 네오제닌 회합을 변경하는 것이 뇌졸중 후 뇌 기능 회복을 보조한다는 것을 보여준다: 혈병을 중간 대뇌 동맥에 주입하여 뇌졸중을 생성시켰고, 동물을 4Ig(매일) 또는 대조군 펩타이드의 꼬리 정맥 주입으로 치료하였다. 동물을 1주 동안 유지하였고, 베더슨(Bederson) 시험을 이용하여 기능적 행동을 평가하였다. 4Ig 치료된 동물은 대조군과 비교하는 경우 뇌 기능의 유의한 향상(p<0.05)을 보여주었다.
도 28은 실험 설계의 표현을 나타낸다. 마우스에서 수행된 EAE 실험의 도식적 표현.
도 29는, 4Ig 펩타이드가 EAE에서의 마비를 완화시켰음을 보여준다: 치료 그룹당 5마리인 10마리의 마우스에서 EAE를 유도하였다. 화살표로 표시된 날에 마우스에게 4Ig 펩타이드(PBS 중의 3㎍) 또는 대조군으로서의 PBS를 제공하였다. 17일째에 대조군 마우스는 심하게 마비되었고, 반면에 4Ig는 마비의 중증도를 강력하게 감소시켰다.
도 30은, AY-9944 및 BM 15.766을 이용하여 콜레스테롤 생합성을 억제하는 것은 미엘린 상의 망막 신경절 세포 신경염의 성장을 촉진시켰다는 것을 보여준다. E7 병아리 배아로부터 망막 외식편을 제조하였고 라미닌 또는 미엘린으로 코팅된 커버슬립 상에서 배양하였고, 대조군(DMSO) 또는 AY-9944(1μM) 또는 BM15.766(4μM)으로 치료하였다. 배양시 18hr 후, 외식편을 4% PFA로 고정시켰고 Alexa4880팔로이딘으로 염색하였다. Cellsens 소프트웨어를 이용하여 신경돌기를 측정하였다. 라미닌(대조군) 또는 미엘린(CNS의 억제성 화합물) 상에서 망막 외식편을 배양하였다. 라미닌 상에서, 축삭 성장은 미엘린이 과성장을 억제하였기 때문에 미엘린과 비교하여 정상이었다. 콜레스테롤 억제제가 배지에 첨가된 경우, 이들은 라미닌 상의 과성장에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 이들은 미엘린 상의 과성장을 회복시켰고, 이는 이들이 미엘린의 억제 활성을 억압하였다는 것을 나타냈다.
본 발명은 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 방법, 및 지질 래프트 내의 네오제닌의 유입을 조정하는(즉, 네오제닌의 유입을 방해하고/방해하거나 네오제닌을 유지하는) 방법에 관한 것이다. 트랜스 상호작용은 세포외 RGMa와 뉴런 세포의 표면의 네오제닌 사이에 발생하고, 한편, 시스 상호작용은 예상외로 뉴런 세포의 동일한 원형질 막 내에 위치한 RGMa와 네오제닌 사이에서 발생한다.
시스 상호작용의 차단 및 지질 래프트의 방해 둘 다(이들의 발견은 본원에 기술되어 있다)는 CNS의 손상 또는 질환에 대한 반응으로 2개의 부정적 효과인 (a) 세포 사멸 및 (b) 축삭 억제에 대응하는 능력을 갖는다. 지질 래프트에의 유입시, 네오제닌은 RGMa와의 트랜스 상호작용의 부재 하에 신호를 전달하여 뉴런 세포 사멸(예를 들면, 아폽토시스)을 유도한다. 지질 래프트 자체의 방해에 의해 또는 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방지함으로써 지질 래프트에의 네오제닌의 유입을 억제하는 것은 뉴런 세포 생존의 증가 및 축삭 성장 및/또는 재생의 증가 둘 다를 초래한다.
이러한 시스 상호작용은 네오제닌의 4개의 면역글로불린-유사 도메인(4Ig 도메인) 및 RGMa의 N-말단부(즉, 본원에 N-래프트 또는 RGMa의 아미노산 28 내지 73으로서 기재되어 있음)에 의해 매개된다. 하기에 보다 상세하게 기술되고 도 2a, 도 9 및 도 17에 나타내는 N-래프트 내의 맵핑 실험은, RGMa의 아미노산 40 내지 73이, 네오제닌의 4Ig 도메인을 결합시키는데 필요한 아미노산 및/또는 2차 구조를 함유함을 나타냈다. 추가로, 전장 RGMa는 4Ig 도메인에 결합할 수 없었고, 이는 이들 요구되는 아미노산 및/또는 2차 구조가 RGMa에 (예를 들면, 입체배좌 변화(conformational change)에 따라) 노출되어 네오제닌과 시스 상호작용을 발생시킬 필요가 있었음을 나타낸다.
하기에 보다 상세하게 기술되는 바와 같이, 상기 조정 방법은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 차단하거나 방해하고/하거나 지질 래프트를 방해하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 지질 래프트에의 네오제닌의 유입을 변경하고, 이에 의해 네오제닌이 신호를 전달하여 세포 사멸을 유도하고 축삭 성장 및/또는 재생을 억제하는 것이 방지된다.
상기 조정 방법은 또한 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 차단하거나 방해하는 제제를 투여함을 포함한다. 이러한 제제는 펩타이드 제제, 콜레스테롤-저하제, 또는 하기에 보다 상세하게 기술되는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 상기 제제는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 RGMa와 네오제닌 사이에 시스 상호작용을 발생시키기 위해 필요한 아미노산 및/또는 2차 구조를 특이적으로 인식하여 선택적으로 결합할 수 있다. 이와 같이, 항체 또는 항체 단편은 시스 상호작용을 억제하고, 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 조정하고, 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
또한, 본 발명은, 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 치료 방법은, 대상체에서의 뉴런 세포 성장 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시키도록 조정하는 방법을 적용할 수 있다. 상기 질환은 색소성 망막염, 허혈, 다발성 경화증, 척수 손상, 및 시신경 손상일 수 있다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당해 분야 숙련가 중 하나에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 충돌하는 경우, 정의를 포함하는 본 문서가 제어할 것이다. 바람직한 방법 및 재료는 하기에 기술되지만, 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에 언급되는 모든 출판물, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌은 이들의 전문이 인용에 의해 포함된다. 본원에 개시되는 재료, 방법 및 예시는 단지 설명을 위한 것이고, 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는", "포함한다", "갖는", "갖다", "할 수 있다", "함유한다" 및 이들의 변형은, 추가의 작용 또는 구조의 가능성을 불가능하게 하지 않는 개방형(open-ended) 변천 어구, 용어, 또는 단어인 것으로 의도된다. 단수형 "한", "하나" 및 "상기"는 문맥에서 달리 명확하게 구술하지 않는 한 복수의 기준을 포함한다. 또한, 본 개시는 명확하게 제시되든지 제시되지 않든지, 본원에 제시되는 실시형태 또는 요소들을 "포함하는", "이들로 이루어진" 및 "필수적으로 이루어진" 다른 실시형태도 고려한다.
"억셉터(acceptor)" 및 "억셉터 항체"는, 본원에서 하나 이상의 프레임워크(framework) 영역의 아미노산 서열의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%를 제공하거나 암호화하는 항체 또는 핵산을 나타내는 것으로 사용된다. 용어 "억셉터"는, 불변 영역(들)을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 또한, 상기 용어는, 프레임워크 영역들 중 하나 이상 및 불변 영역(들)을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들면, 용어 "억셉터"는 프레임워크 영역들 중 하나 이상의 아미노산 서열의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%를 제공하거나 암호화하는 사람 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 나타낼 수 있다. 이러한 억셉터는 사람 항체의 하나 이상의 특정 위치에서 발생하지 않는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 10개의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 억셉터 프레임워크 영역 및/또는 억셉터 불변 영역(들)은 생식선 항체 유전자, 성숙 항체 유전자, 또는 기능성 항체(예를 들면, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 항체, 개발중인 항체 또는 상업적으로 입수가능한 항체)로부터 유도되거나 얻어질 수 있다.
"친화성 성숙 항체"는 본원에서 하나 이상의 CDR에 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 나타내는 것으로 사용되고, 이는, 변경(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 표적 항원에 대한 항체의 친화도(즉, KD, kd 또는 ka)의 향상을 초래한다. 예시의 친화성 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화성 성숙 항체를 생산하기 위한 각종 절차는 바이오-디스플레이(bio-display)를 이용하여 제조된 조합적 항체 라이브러리의 스크리닝을 포함하여 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙을 기술한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌[Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); 및 Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]에 의해 기술된다. 선택적 돌연변이유발 위치에서 그리고 활성-강화 아미노산 잔기와의 접촉 또는 초돌연변이 위치에서의 선택적 돌연변이는 문헌[U.S. Pat. No. 6,914,128 B1]에 기술된다.
본원에서 사용되는 "항체" 및 "항체들"은 모노클로날 항체, 다특이적 항체, 사람 항체, 사람화된 항체(완전 또는 부분 사람화된 항체), 동물 항체, 이들에 한정되지 않지만, 예를 들면, 조류(예를 들면, 오리 또는 거위), 상어, 고래 및 비-영장류(예를 들면, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니아 피그, 고양이, 개, 래트, 마우스 등) 또는 비-사람 영장류(예를 들면, 원숭이, 침팬지 등)를 포함하는 포유동물 항체, 재조합체 항체, 키메라 항체, 단일쇄 Fv("scFv"), 단일쇄 항체, 단일 도메인 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 디설파이드-링크된 Fv("sdFv"), 및 항-이디오타입("항-Id") 항체, 이원-도메인 항체, 이원 가변 도메인(DVD) 또는 삼원 가변 도메인(TVD) 항체(이원-가변 도메인 면역글로불린 및 이들의 제조 방법은 문헌[Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25(11):1290-1297 (2007) 및 PCT 국제 출원 WO 2001/058956]에 기술되어 있고, 상기 문헌의 각각의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다) 및 상기 중 어느 하나의 기능적 활성 에피토프-결합 단편을 말한다. 특히, 항체로는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉, 분석물-결합 부위를 함유하는 분자가 포함된다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스로 이루어질 수 있다. 단순화하기 위해, 분석물에 대한 항체는 본원에서 흔히 "항-분석물 항체" 또는 단지 "분석물 항체" 중 어느 하나로서 나타낸다.
본원에서 사용되는 "항체 단편"은, 항원-결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 말한다. 상기 부분은 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, 항체 이소타입에 따라 CH2, CH3 또는 CH4)을 포함하지 않는다. 항체 단편의 예로는 Fab 단편, Fab' 단편, Fab'-SH 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 디아바디, 단일쇄 Fv(scFv) 분자, 단지 1개의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드, 단지 1개의 중쇄 가변 영역을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드 및 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 함유하는 단일쇄 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
"이특이적 항체"는 본원에서 쿼드로마(quadroma) 기술(문헌[Milstein et al., Nature, 305(5934): 537-540 (1983)] 참조)에 의해, 2개의 상이한 모노클로날 항체의 화학적 접합(문헌[Staerz et al., Nature, 314(6012): 628-631 (1985)] 참조)에 의해, 또는 Fc 영역에 돌연변이를 도입시키는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 또는 유사한 접근법(문헌[Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993)] 참조)에 의해 생성되는 전장 항체를 나타내는 것으로 사용되고, 이는 단지 하나가 기능성 이특이적 항체인 다수의 상이한 면역글로불린 종을 초래한다. 이특이적 항체는 이의 2개의 결합 아암(arm)(한 쌍의 HC/LC) 중 하나 상의 1개의 항원(또는 에피토프)에 결합하고, 이의 제2 아암(다른 쌍의 HC/LC) 상의 상이한 항원(또는 에피토프)에 결합한다. 이러한 정의에 의해, 이특이적 항체는 (특이성 및 CDR 서열 둘 다에 있어서) 2개의 별개의 항원-결합 아암을 갖고, 상기 항체가 결합하는 각각의 항원에 대해 1가이다.
"CDR"은 본원에서 항체 가변 서열 내의 "상보성 결정 영역"을 나타내는 것으로 사용된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 각각에 3개의 CDR이 존재하고, 이들은 가변 영역의 각각에 대해 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"이라고 명명한다. 본원에서 사용되는 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합하는 단일 가변 영역에서 발생하는 3개의 CDR의 그룹을 말한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되어 왔다. 카바트(Kabat)에 의해 기술된 상기 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991))은 항체의 임의의 가변 영역에 적용할 수 있는 명백한 잔기 번호매김 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계도 제공한다. 이들 CDR은 "카바트 CDR"로서 나타낼 수 있다. 초티아(Chothia)와 동료들(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); 및 Chothia et al., Nature, 342: 877-883 (1989))은 카바트 CDR 내의 소정 하위-부분이 아미노산 서열의 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩타이드 골격 입체배좌를 채택함을 발견하였다. 이들 하위-부분은 "L1", "L2" 및 "L3" 또는 "H1", "H2" 및 "H3"으로서 명명하였고, 여기서, 상기 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지명한다. 이들 영역은 "초티아 CDR"로서 나타낼 수 있고, 이는 카바트 CDR과 중복되는 경계를 갖는다. 카바트 CDR과 중복되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 문헌[Padlan, FASEB J., 9: 133-139 (1995), 및 MacCallum, J. Mol. Biol., 262(5): 732-745 (1996)]에 의해 기술되었다. 또 다른 CDR 경계 정의는 본원 시스템 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 특정 잔기 또는 잔기들의 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의한 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 관점에서 이들은 짧아지거나 길어질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 카바트 CDR과 중복될 것이다. 소정 실시형태들은 카바트- 또는 초티아-정의된 CDR을 사용하지만, 본원에서 사용된 방법은 이들 시스템 중 어느 하나에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다.
"CDR-절편이식된 항체"는 본원에서 1종 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, 여기서, VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 이상의 서열이 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체, 예를 들면, 뮤린 CDR 중 하나 이상(예를 들면, CDR3)이 사람 CDR 서열로 대체된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 나타내는 것으로 사용된다.
"키메라 항체"는 본원에서 1종 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열, 및 다른 종 유래의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예를 들면, 사람, 개, 말 또는 고양이 불변 영역에 링크된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 나타내는 것으로 사용된다. 키메라 항체는, 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 유래의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 중쇄 및/또는 경쇄의 일부를 포함하고, 한편, 상기 쇄(들)의 나머지는, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 다른 종 유래의 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 및 이러한 항체들의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이다(예를 들면, U.S. Pat. 제4,816,567호 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)을 참조한다).
"디아바디"는 본원에서 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내는 것으로 사용되고, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)(VH-VL)을 포함한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 이루기(pairing)에 짧은 링커를 이용함으로써, 상기 도메인들은 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 한다.
"공여자" 및 "공여자 항체"는 본원에서 하나 이상의 CDR을 제공하는 항체를 나타내는 것으로 사용된다. 공여자 항체는, 프레임워크 영역이 수득되거나 유도되는 항체와 상이한 종 유래의 항체일 수 있다. 사람화된 항체와 관련하여, 용어 "공여자 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비-사람 항체를 말한다. 소화된(bovinized) 항체와 관련하여, 용어 "공여자 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비-소(non-bovine) 항체를 말한다. 돼지화된 항체와 관련하여, 용어 "공여자 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비-돼지 항체를 말한다. 개화된(caninized) 항체와 관련하여, 용어 "공여자 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비-개(non-canine) 항체를 말한다. 고양이화된 항체와 관련하여, 용어 "공여자 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비-고양이 항체를 말한다. 말화된 항체와 관련하여, 용어 "공여자 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비-말 항체를 말한다.
"이원-특이적 항체"는, 본원에서 2개의 결합 아암(한 쌍의 HC/LC)의 각각에서 2개의 상이한 항원(또는 에피토프)에 결합할 수 있는 전장 항체를 나타내는 것으로 사용된다(PCT 공보 WO 02/02773 참조). 따라서, 이원-특이적 결합 단백질은, 동일한 특이성 및 동일한 CDR 서열을 갖는 2개의 동일한 항원 결합 아암을 갖고, 이것이 결합하는 각각의 항원에 대해 2가이다.
"이원 가변 도메인"은 본원에서 2가(2개의 항원 결합 부위), 4가(4개의 항원 결합 부위) 또는 다가의 결합 단백질일 수 있는 결합 단백질 상의 2개 이상의 항원 결합 부위를 나타내는 것으로 사용된다. DVD는 단일특이적, 즉, 1개의 항원(또는 1개의 특정 에피토프)에 결합할 수 있거나, 다중특이적, 즉, 2개 이상의 항원(즉, 동일한 표적 항원 분자의 2개 이상의 에피토프 또는 상이한 표적 항원의 2개 이상의 에피토프)에 결합할 수 있다. 바람직한 DVD 결합 단백질은 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하고, "DVD 면역글로불린" 또는 "DVD-Ig"로서 나타낸다. 따라서, 이러한 DVD-Ig 결합 단백질은 4량체이고 IgG 분자를 상기시키지만, IgG 분자보다 더 많은 항원 결합 부위를 제공한다. 따라서, 4량체성 DVD-Ig 분자의 각각의 절반은 IgG 분자의 절반을 상기시키고 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하지만, 단일 항원 결합 도메인을 제공하는 IgG 분자의 중쇄 및 경쇄의 쌍과는 달리, DVD-Ig의 중쇄 및 경쇄의 쌍은 2개 이상의 항원 결합 부위를 제공한다.
DVD-Ig 결합 단백질의 각각의 항원 결합 부위는 공여자("모") 모노클로날 항체로부터 유도될 수 있고, 따라서, 항원 결합 부위당 항원 결합에 관여하는 총 6개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 따라서, 2개의 상이한 에피토프(2개의 상이한 항원 분자의 2개의 상이한 에피토프 또는 동일한 항원 분자의 2개의 상이한 에피토프)에 결합하는 DVD-Ig 결합 단백질은 제1 모 모노클로날 항체로부터 유도된 항원 결합 부위 및 제2 모 모노크로날 항체의 항원 결합 부위를 포함한다.
DVD-Ig 결합 분자의 고안, 발현, 및 특성확인의 상세한 설명은 문헌[PCT 공보 제WO 2007/024715호, U.S. Pat. 제7,612,181호 및 Wu et al., Nature Biotech., 25: 1290-1297 (2007)]에 제공된다. 이러한 DVD-Ig 분자의 바람직한 예로는, 구조식 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고, C는 중쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니며, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이지만, 바람직하게는 1이다]을 포함하는 중쇄; 및 구조식 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고, C는 경쇄 불변 도메인이고, X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니며, X2는 Fc 영역을 포함하지 않고, n은 0 또는 1이지만, 바람직하게는 1이다]을 포함하는 경쇄가 포함된다. 이러한 DVD-Ig는 2개의 상기 중쇄 및 2개의 상기 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서, 각각의 쇄는 가변 영역들 사이에 개재되는 불변 영역 없이 탠덤(tandem)으로 링크된 가변 도메인을 포함하고, 여기서, 중쇄 및 경쇄는 회합되어 탠덤 기능성 항원 결합 부위를 형성하고, 한 쌍의 중쇄 및 경쇄는 다른 쌍의 중쇄 및 경쇄와 회합하여 4개의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 4량체성 결합 단백질을 형성할 수 있다. 다른 예에서, DVD-Ig 분자는, 가변 도메인들 사이에 개재되는 불변 영역 없이 탠덤으로 링크된 3개의 가변 도메인(VD1, VD2, VD3)을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서, 한 쌍의 중쇄 및 경쇄는 회합하여 3개의 항원 결합 부위를 형성할 수 있고, 여기서, 한 쌍의 중쇄 및 경쇄는 다른 쌍의 중쇄 및 경쇄와 회합하여 6개의 항원 결합 부위를 갖는 4량체성 결합 단백질을 형성할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 DVD-Ig 결합 단백질은, 이의 모 모노클로날 항체에 의해 결합된 동일한 표적 분자에 결합할 뿐만 아니라, 이의 하나 이상의 모 모노클로날 항체 중 하나 이상의 원하는 특성도 갖는다. 바람직하게, 이러한 부가적 특성은 모 모노클로날 항체들 중 하나 이상의 항체 파라미터(parameter)이다. 이의 모 모노클로날 항체들 중 하나 이상으로부터의 DVD-Ig 결합 단백질에 기여할 수 있는 항체 파라미터로는 항원 특이성, 항원 친화도, 효력, 생물학적 기능, 에피토프 인식, 단백질 안정성, 단백질 용해도, 생산 효율, 면역원성, 약동학, 생체이용률, 조직 교차 반응성, 및 이종상동성 항원 결합이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
DVD-Ig 결합 단백질은 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드의 적어도 1개의 에피토프에 결합한다. DVD-Ig 결합 단백질의 비-제한적 예로는, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드의 1개 이상의 에피토프에 결합하는 DVD-Ig 결합 단백질, 사람 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드의 에피토프 및 다른 종(예를 들면, 마우스)의 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드의 에피토프에 결합하는 DVD-Ig 결합 단백질, 및 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드의 에피토프 및 다른 표적 분자의 에피토프에 결합하는 DVD-Ig 결합 단백질이 포함된다.
"에피토프" 또는 "에피토프들" 또는 "목적하는 에피토프"는 인식되어 특이적 결합 파트너 상의 상보성 부위(들)에 결합할 수 있는 임의의 분자 상의 부위(들)를 말한다. 상기 분자 및 특이적 결합 파트너는 특이적 결합 쌍의 부분이다. 예를 들면, 에피토프는 폴리펩타이드, 단백질, 합텐, 탄수화물 항원(이들에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 당지질, 당단백질, 또는 지질다당류), 또는 다당류 상에 존재할 수 있다. 이의 특이적 결합 파트너는 항체일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
"Fab"는 본원에서 항체 단편을 나타내는 것으로 사용된다. 항체의 파파인 소화는 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab" 단편이라고 칭하는 2개의 동일한 항원-결합 단편, 및 이의 명칭이 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 잔여 "Fc" 단편을 생성시킨다. 펩신 처리는 결합성 가교 항원을 수득한다. 또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은, 항체 힌지(hinge) 영역 유래의 1개 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에의 몇몇의 잔기 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인(들)은 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편들의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
본원에 사용되는 F(ab')2 단편은, 대부분의 Fc 영역을 제거하는 한편 온전한 일부의 힌지 영역을 남기는 전체 IgG 항체의 펩신 소화에 의해 생성된 항체를 말한다. F(ab')2 단편은 디설파이드 결합에 의해 함께 링크된 2개의 항원-결합 F(ab) 부분을 갖고, 따라서, 약 100kDa의 분자량을 갖는 2가이다. 2가의 항체 단편(F(ab')2 단편)은 전체 IgG 분자보다 더 작고, 면역조직화학에서 조직에의 보다 양호한 침투를 가능하게 함으로써 보다 양호한 항원 인식을 가능하게 한다. 또한, F(ab')2 단편의 사용은 생세포 상의 Fc 수용체에 대한 또는 단백질 A/G에 대한 비특이적 결합을 회피한다. F(ab')2 단편은 항원에 결합하여 항원을 침전시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 "프레임워크"(FR) 또는 "프레임워크 서열"은 가변 영역에서 CDR을 제외한 나머지 서열을 의미할 수 있다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템(예를 들면, 상기 참조)에 의해 결정될 수 있으므로, 프레임워크 서열의 의미는 상응하게 상이한 해석으로 이어진다. 또한, 6개의 CDR(경쇄의 CDR-L1, -L2 및 -L3, 및 중쇄의 CDR-H1, -H2 및 -H3)은 경쇄 및 중쇄 상의 프레임워크 영역을 각 쇄 상의 4개의 하위-영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 분할하고, 여기서, CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치하고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치하고, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. 특정 하위-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 구체화하지 않고, 다른 사람들이 언급하는 바와 같이 프레임워크 영역은 단일 천연 발생 면역글로불린 쇄의 가변 영역 내의 합한 FR을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, FR은 4개의 하위-영역들 중 하나를 나타내고, FR들은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 하위-영역들 중 2개 이상을 나타낸다.
당해 분야에 공지되어 있는 기술을 이용하여 비-사람 항체를 사람화시키기 위한 중쇄 및 경쇄 "억셉터" 프레임워크 서열(또는 간단하게 "억셉터" 서열)로서 사용할 수 있는 사람 중쇄 및 경쇄 FR 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 한 실시형태에서, 사람 중쇄 및 경쇄 억셉터 서열은 V-베이스(hypertext transfer protocol://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)와 같은 공공의 입수가능한 데이터베이스에 또는 국제 ImMunoGeneTics®(IMGT®) 정보 시스템(hypertext transfer protocol://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)에 열거되어 있는 프레임워크 서열들로부터 선택된다.
"Fv"는 본원에서 완전 항원-인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편을 나타내는 것으로 사용된다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 2량체로 이루어진다.
"사람 항체"는 본원에서 사람 생식선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 나타내는 것으로 사용된다. 본 개시의 사람 항체는 예를 들면, CDR 내에서, 사람 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들면, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 용어 "사람 항체"는 다른 포유동물 종, 예를 들면, 마우스의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열 상에 절편이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
"사람화된 항체"는 본원에서 비-사람 종(예를 들면, 마우스) 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, 여기서, 상기 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 더 "사람-유사"하게 변경된, 즉, 사람 생식선 가변 서열과 더 유사한 항체를 기술하는 것으로 사용된다. "사람화된 항체"는, 목적하는 항원에 면역특이적으로 결합하고 사람 항체의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 프레임워크(FR) 영역 및 비-사람 항체의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 변이체, 유도체, 유사체 또는 이들의 단편이다. CDR과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 말한다. 사람화된 항체는, 실질적으로 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) 모두를 포함하고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역들은 비-사람 면역글로불린(즉, 공여자 항체)의 CDR 영역들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역들은 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 프레임워크 영역들이다. 한 실시형태에서, 사람화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 사람 면역글로불린의 적어도 일부를 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄 및 적어도 중쇄의 가변 도메인을 함유한다. 또한, 항체는 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 사람화된 경쇄만을 함유한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 사람화된 중쇄만을 함유한다. 특정 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄의 사람화된 가변 도메인 및/또는 사람화된 중쇄만을 함유한다.
사람화된 항체는, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 제한 없이 포함하는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE 및 임의의 이소타입을 포함하는 임의의 부류의 면역글로불린들로부터 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 1개 초과의 부류 또는 이소타입 유래의 서열을 포함할 수 있고, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 기술을 이용하여 원하는 이펙터 기능을 최적화하기 위해 특정 불변 도메인을 선택할 수 있다.
사람화된 항체의 프레임워크 영역 및 CDR은 모 서열에 정확하게 상응할 필요가 없고, 예를 들면, 공여자 항체 CDR 또는 컨센서스 프레임워크는 1개 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이유발되어 해당 부위에서의 CDR 또는 프레임워크 잔기는 공여자 항체 또는 컨센서스 프레임워크 중 어느 하나에 상응하지 않을 수 있다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 일반적으로, 사람화된 항체 잔기의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95%는 모 FR 및 CDR 서열의 잔기에 상응할 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열 내의 프레임워크 영역을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련 면역글로불린 서열의 패밀리에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로 이루어진 서열을 말한다(예를 들면, 문헌[Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)]을 참조한다). 따라서, "컨센서스 면역글로불린 서열"은 "컨센서스 프레임워크 영역(들)" 및/또는 "컨센서스 CDR(들)"을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 패밀리에서, 컨센서스 서열 내의 각각의 위치는 상기 패밀리 내의 해당 위치에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산에 의해 점령된다. 2개의 아미노산이 동등하게 빈번하게 발생하는 경우, 둘 중 어느 하나는 컨센서스 서열 내에 포함될 수 있다.
"초가변성 영역"은 본원에서 항원-결합에 관여하는 항체의 아미노산 잔기를 나타내는 것으로 사용된다. 초가변성 영역은 문헌[Kabat et al., 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에 의해 정의되고/되거나 문헌[Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 의해 정의되고/되거나 문헌["AbM loops" by Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989)]에 의해 정의되고/되거나 문헌[Lefranc et al., Nucleic Acids Res., 27:209-212 (1999) in the international ImMunoGeneTics information systems database]에 의해 정의된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 내의 그리고 중쇄 가변 도메인 내의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 유래의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 초가변성 영역 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기이다.
2개 이상의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 관련하여 본원에서 사용되는 "동일한" 또는 "동일성은, 상기 서열이, 명시된 영역에 걸쳐 명시된 백분율의 동일한 잔기를 갖는다는 것을 의미할 수 있다. 상기 백분율은, 2개의 서열을 정렬하고, 명시된 영역에 걸쳐 상기 2개의 서열을 비교하고, 매칭된 위치의 수를 얻기 위해서 상기 서열 둘 다에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 측정하고, 상기 매칭된 위치의 수를 상기 명시된 영역에서의 위치의 총수로 나누고, 상기 얻어진 값에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써 계산할 수 있다. 2개의 서열이 상이한 길이로 이루어지거나 상기 정렬이 1개 이상의 엇갈린 말단(staggered end)을 생성시키고 명시된 영역의 비교가 단일 서열만을 포함하는 경우, 상기 단일 서열의 잔기들은 상기 계산의 분모에 포함되지만, 분자에는 포함되지 않된다.
"카바트 번호매김", "카바트 정의" 및 "카바트 표지(labeling)"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당해 분야에 인지되어 있는 이들 용어는 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내에서 다른 아미노산 잔기들보다 더 가변성(즉, 초가변성)인 아미노산 잔기의 번호매김 시스템을 말한다(Kabat et al., Ann. NY Acad. Sci., 190:382-391 (1971) 및 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)). 중쇄 가변 영역의 경우, 초가변성 영역은 CDR1에 대해 아미노산 위치 31 내지 35, CDR2에 대해 아미노산 위치 50 내지 65, CDR3에 대해 아미노산 위치 95 내지 102의 범위이다. 경쇄 가변 영역의 경우, 초가변성 영역은 CDR1에 대해 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2에 대해 아미노산 위치 50 내지 56, CDR3에 대해 아미노산 위치 89 내지 97의 범위이다.
본원에서 사용되는 "지질 래프트"는 (예를 들변, 막의 다른 영역에 비하여) 농축된 양의 콜레스테롤을 함유하는 세포의 막의 미세도메인(microdomain)을 말한다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 농축은 2배 초과이다. 다른 실시형태에서, 상기 농축은 3배 초과이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 농축은 4배 초과이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 농축은 막의 다른 영역과 비교하여 5배 초과의 콜레스테롤이다.
본원에서 사용되는 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 말하고, 즉, 상기 집단을 포함하는 각각의 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서 단일 항원에 대해 지시된다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정인자들(에피토프들)에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 구체적으로 본원의 모노클로날 항체로는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가, 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이 서열과 상동성이고, 한편, 나머지 쇄(들)는 다른 종으로부터 유도되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이 서열과 상동성인, "키메라" 항체 및 이러한 항체의 단편이 원하는 생물학적 특성을 나타내는 한 이들 "키메라" 항체 및 이러한 항체의 단편이 포함된다.
본원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"로는 생리학적으로 화합성인(physiologically compatible) 임의의 모든 용매, 분산 매체, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 및 에탄올 등 중 하나 이상 및 이들의 조합이 포함된다. 다수의 경우, 조성물에 등장성 제제, 예를 들면, 당, 폴리알콜, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 항체 또는 항체부의 유통 기한 또는 유효성을 향상시키는 미량의 보조 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 어느 하나 또는 둘 중 어느 한 유형의 뉴클레오타이드의 변형된 형태의 2개 이상의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 말한다. 상기 용어는 단일 또는 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다. 용어 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는, 이의 기원의 관점에서, "단리된 폴리뉴클레오타이드"가 천연에서 발견되거나; 천연에서 링크되어 있지 않은 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 링크되어 있거나; 보다 큰 서열의 부분으로서 천연에서 발생하지 않는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 상기 "단리된 폴리뉴클레오타이드"가 관련되어 있지 않은 (게놈, cDNA 또는 합성 기원, 또는 이들의 몇몇의 조합의) 폴리뉴클레오타이드를 의미할 것이다.
본원에서 사용되는 "폴리펩타이드"는 아미노산들의 임의의 중합체성 쇄를 말한다. 용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 용어 폴리펩타이드와 상호교환적으로 사용되고, 또한, 아미노산들의 중합체성 쇄를 나타낸다. 용어 "폴리펩타이드"는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편, 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체성 또는 중합체성일 수 있다.
"재조합 항체" 및 "재조합 항체들"은, 1개 이상의 모노클로날 항체의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 아미노산 서열을 재조합 기술에 의해 적절한 발현 벡터에 클로닝하고, 후속적으로 상기 항체를 적절한 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함하는 1개 이상의 단계들에 의해 제조된 항체를 말한다. 상기 용어로는 재조합적으로 생성된 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체(완전 또는 부분 사람화됨), 항체 단편들로 이루어진 다중-특이적 또는 다가의 구조, 이기능성 항체, 이종접합체 Ab, DVD-Ig®, 및 본원의 (i)에 기술된 기타 항체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. (이원-가변 도메인 면역글로불린 및 이들의 제조 방법은 문헌[Wu, C., et al., Nature Biotechnology, 25:1290-1297 (2007)]에 기술되어 있다). 본원에서 사용되는 용어 "이기능성 항체"는 1개의 항원성 부위에 대한 특이성을 갖는 제1 아암 및 상이한 항원성 부위에 대한 특이성을 갖는 제2 아암을 포함하는 항체, 이원 특이성을 갖는 이기능성 항체를 말한다.
본원에서 사용되는 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 말하고, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는, VH와 VL 도메인 사이에, scFv가 항원 결합에 바람직한 구조를 형성하도록 하는 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌[Pluckthun in the The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "대상체" 및 "환자는, 포유동물(예를 들면, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니아 피그, 고양이, 개, 래트 및 마우스, 비-사람 영장류(예를 들면, 원숭이, 예를 들면, 사이노몰거스 또는 레서스 원숭이, 침팬지 등) 및 사람)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 척추동물을 말한다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 대상체는 사람 또는 비-사람일 수 있다. 대상체 또는 환자는 다른 형태의 치료를 경험하고 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 "치료학적 유효량"은 원하는 치료학적 결과를 달성하는데 필요한 용량으로 그리고 필요한 시간 동안 유효한 양을 말한다. 치료학적 유효량은, 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 지속기간을 감소시키거나 완화시키거나, 장애의 진행을 예방하거나, 장애의 퇴행을 야기하거나, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 재발, 진전, 개시, 또는 진행을 예방하거나, 장애를 검출하거나, 다른 치료요법(예를 들면, 예방학적 또는 치료학적 제제)의 예방학적 또는 치료학적 효과(들)을 향상시키거나 개선시키기에 충분한 치료요법의 양 및/또는 지속기간일 수 있다. 항체 또는 항체부의 치료학적 유효량은 당해 분야 숙련가에 의해 결정될 수 있고, 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중과 같은 인자들 및 개체에서 원하는 반응을 유발하는 상기 항체 또는 항체부의 능력에 따라 다를 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 항체 또는 항체부의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료학적으로 이로운 효과보다 더 큰 양이다.
"치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 각각 본원에서 질환의 개시 또는 진행을 역전시키거나, 완화시키거나, 억제시키는 것, 또는 이러한 용어가 적용되는 이러한 질환의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완환시키거나, 억제시키는 것을 기술하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 대상체의 병태에 따라, 상기 용어는 또한 질환을 예방하는 것을 말하고, 질환의 개시를 예방하거나 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 예방하는 것을 포함한다. 치료는 급성 또는 만성 방식 중 어느 하나로 수행할 수 있다. 또한, 상기 용어는 질환 또는 이의 증상에 걸리기 전에 질환 또는 이러한 질환과 관련된 증상의 중증도를 감소시키는 것을 말한다. 질환 또는 이의 증상에 걸리기 전의 이러한 질환 또는 이의 증상의 중증도의 예방 또는 감소는, 질환 또는 이의 증상에 걸린 투여의 시점이 아닌 대상체에게의 본 발명의 제제 또는 약제학적 조성물의 투여를 나타낸다. "예방"은 또한 질환 또는 이러한 질환과 관련된 하나 이상의 증상의 재발의 예방을 말한다. "치료" 및 "치료학적으로"는 "치료하는"이 상기 정의된 바와 같이 치료의 작용을 말한다.
"변이체"는 본원에서 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 기술하는 것으로 사용된다. "생물학적 활성"의 대표예로는 특정 항체에 의해 결합되거나 면역 반응을 촉진시키는 능력이 포함된다. 변이체는 또한 본원에서 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 참조 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 기술하는 것으로 사용된다. 아미노산의 보존적 치환, 즉, 아미노산을 유사한 특성(예를 들면, 친수성, 하전 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 당해 분야에서 전형적으로 작은 변화와 관련된 것으로 인식된다. 이들 작은 변화는 당해 분야에 이해되어 있는 바와 같이 아미노산의 수치료 지수(hydropathic index)를 고려함으로써 부분적으로 확인할 수 있다. 문헌[Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)]. 아미노산의 수치료 지수는 이의 소수성 및 전하의 고려에 기초한다. 유사한 수치료 지수의 아미노산들은 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유한다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 한 양상에서, ±2의 수치료 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 또한, 아미노산들의 친수성은 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 초래할 수 있는 치환을 밝히는데 사용될 수 있다. 펩타이드와 관련하여 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 밀접하게 상호관련되어 있는 것으로 복된 유용한 측정값인 당해 펩타이드의 최대 국소 평균 친수성의 산출을 가능하게 한다. 문헌[U.S. 특허 제4,554,101호]은 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 당해 분야에서 이해되는 바와 같이 생물학적 활성, 예를 들면, 면역원성을 보유하는 펩타이드를 초래할 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행할 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 둘 다는 당해 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 화합성인 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 밝혀지는 바와 같이, 아미노산의 관련 유사성, 및 특히 이들 아미노산의 측쇄에 의존하는 것으로 이해된다. 또한, "변이체"는 예를 들면, 단백질 용해, 인산화 또는 기타 번역-후 변형에 의해 별도로 프로세싱되었지만 여전히 이의 항원 반응성을 보유하는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 기술하는 것으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "버니어 구역(Vernier zone)"은 문헌[Foote and Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, 이는 본원에 인용에 의해 포함됨)]에 기술된 바와 같이 CDR 구조를 조정하고 항원에 대한 핏(fit)을 미세-조절할 수 있는 프레임워크 잔기들의 서브세트를 말한다. 버니어 구역 잔기는 CDR 아래에 층을 형성하고, CDR의 구조 및 항체의 친화도에 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 수적 범위의 인용을 위해, 동일한 정밀도를 갖는 각각의 사이에 개재되는 수는 명백하게 고려된다. 예를 들면, 6 내지 9의 범위에 대해, 6 및 9에 추가하여 수 7 및 8이 고려되고, 범위 6.0 내지 7.0에 대해, 수 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명백하게 고려된다.
2. 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생의 조정 방법
본원에서 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생의 조정 방법이 제공된다. 조정은 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 변경(예를 들면, 차단 또는 방해)하고/하거나 지질 래프트의 온전성을 방해하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 조정되는 것은 이를 필요로 하는 대상체에서의 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용이다. RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용은 하기에 보다 상세하게 기술된다. 조정 방법은 이러한 시스 상호작용을 방해할 수 있다. 조정 방법은 이러한 시스 상호작용을 차단할 수 있다.
시스 상호작용을 방해하거나 차단하는 것은 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 시스 상호작용을 방해하거나 차단하는 것은 네오제닌 수용체 유입의 조정을 통해 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 뉴런 세포는 망막 신경절 세포(RGC), 운동 뉴런, 해마 세포, 피질 세포, 광수용체 세포, 및 척추 뉴런일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
조정 방법은 대상체에게 제제를 투여함을 포함할 수 있다. 이러한 제제는 시스 상호작용을 방해할 수 있다. 이러한 제제는 시스 상호작용을 차단할 수 있다. 따라서, 시스 상호작용을 방해하거나 차단함으로써, 당해 제제는 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 조정되는 것은 지질 래프트의 온전성이다. 조정 방법은 지질 래프트를 방해할 수 있다. 조정 방법은 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있고, 이는 지질 래프트를 방해할 수 있다. 지질 래프트를 방해하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것은 유입에 영향을 미칠 수 있고, 이는 결국 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
지질 래프트의 온전성을 조정하는 방법은 대상체에게 제제를 투여함을 포함할 수 있다. 이러한 제제는 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다. 따라서, 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 추가로, 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것은 또한 RGMa와 네오제닌 사이의 트랜스 상호작용의 능력에 영향을 미치고/미치거나 RGMa와 네오제닌 사이의 트랜스 상호작용의 능력에 영향을 미쳐 축삭 성장을 억제할 수 있다. 이러한 제제에 의해 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것은 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
이들 조정 방법은 하기에 보다 상세하게 기술되는 바와 같이 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다.
a. RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용 및 지질 래프트 방해
당해 방법은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용, 및/또는 지질 래프트를 조정할 수 있다.
RGMa는 33kDa의 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-링크된 막 당단백질이다. 전장 RGMa 단백질은 N-말단 신호 펩타이드, RGD 모티프(motif), 부분 폰 빌레브란트 인자(vWF: von Willebrant factor) D형 도메인, 소수성 영역, 및 C-말단 GPI-앵커(anchor)를 함유한다. RGMa는 개열되어 각종 RGMa 펩타이드들이 생성되고, 이들 중 일부는 막 회합되고, 이들 중 일부는 가용성이고, 이들 중 일부는 디설파이드 결합에 의해 링크된다. 예를 들면, 개열은 자가 단백질용해(autoproteolysis)를 포함할 수 있고, 여기서, 얻어진 N-말단(N-RGMa) 및 C-말단(C-RGMa) 도메인은 디설파이드 가교에 의해 링크될 수 있다. 또한, 개열은, RGMa 유래의 가용성 N-말단 펩타이드를 방출시키는 효소 푸린-1, 및 나머지 개열 부위를 포함할 수 있다.
RGMa는 처음에 네오제닌에 결합된 망막 축삭에 대한 화학배척성(chemorepulsive) 분자로서 동정되었다. 네오제닌은 막관통 수용체(transmembrane receptor)의 면역글로불린 상과(superfamily)의 구성원이고, 4개의 N-말단 면역글로불린-유사 도메인들, 6개의 피브로넥틴 결합(fibronection) 도메인, 막관통 도메인, 및 C-말단 도메인을 포함한다.
종합하면, RGMa 및 네오제닌은 발달중인 시각계에서의 축삭 인도 및 발달중인 뇌에서의 축삭관(axon tract) 인도를 매개한다. 특히, RGMa와 네오제닌 사이의 트랜스 상호작용은 발달중인 중추 신경계(CNS) 및 손상된 CNS에서의 축삭 성장 및/또는 재생을 억제한다. 이러한 트랜스 상호작용에서, RGMa 펩타이드는 뉴런 주위의 세포에 의해 분비되고, 분비된 RGMa 펩타이드는 표면 뉴런에 위치한 네오제닌과 상호작용한다. 이러한 RGMa와 네오제닌 사이의 트랜스 상호작용은 또한 세포 생존을 촉진시킨다. 이러한 트랜스 상호작용의 부재시, 네오제닌은 세포 사멸, 즉, 아폽토시스를 유도한다. 따라서, 네오제닌은, 트랜스 상호작용의 존재 하에 세포 생존을 촉진시키도록 신호를 전달하지만 트랜스 상호작용의 부재시에 세포 사멸을 유도하도록 신호를 전달하는 의존성-수용체이다.
본원에서 입증되는 바와 같이, 세포 사멸을 유도하도록 신호를 전달하는 네오제닌은 RGMa와 네오제닌 사이에 발생하는 시스 상호작용에 의해 매개된다. 이러한 시스 상호작용은 뉴런 세포의 동일한 원형질 막과 관련된 RGMa와 네오제닌 사이에서 발생한다. 특히, 이러한 시스 상호작용은 뉴런 세포의 막 내의 지질 래프트에의 네오제닌의 유입을 가능하게 한다. 지질 래프트는 콜레스테롤이 농축되는 막 내의 미세도메인이다. 지질 래프트를 방해하고/하거나 시스 상호작용을 차단하거나 방해하는 것은 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 조정함으로써 네오제닌 신호전달에 기여할 수 있는 세포 사멸을 예방하거나 감소시킨다.
또한, 본원에서 입증되는 바와 같이, 축삭 성장 및/또는 재생을 억제하기 위해서 RGMa와 네오제닌 사이의 트랜스 상호작용에 추가하여 RGMa와 네오제닌 사이의 이러한 시스 상호작용도 요구된다. 따라서, 시스 상호작용을 차단하거나 방해하는 것은, 트랜스 상호작용이 발생하는 경우라도, 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 방지하고/하거나 지질 래프트로부터 네오제닌을 제거함으로써 네오제닌 신호전달에 기여할 수 있는 축삭 성장 및/또는 재생의 억제를 방지하거나 감소시킨다.
본원에서 추가로 입증되는 바와 같이, 하기에 보다 상세하게 기술되는 콜레스테롤 저하제로 콜레스테롤을 고갈시킴에 의한 지질 래프트의 방해는 (1) 세포 사멸 및 (2) 네오제닌 신호전달에 기여할 수 있는 축삭 성장 및/또는 재생의 억제를 방지하거나 감소시킨다. 신호를 전달하기 위해 지질 래프트 내에 네오제닌이 존재할 필요가 있으므로 이러한 방지 또는 감소가 발생한다고 가정된다.
이와 같이, 본원에서 네오제닌 신호전달은 (1) 콜레스테롤 저하제로의 지질 래프트의 방해 및/또는 (2) RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 차단하거나 방해함에 의해 억제되거나 차단될 수 있음이 입증된다.
또한, 본원에서 입증되는 바와 같이, 트랜스 및 시스 상호작용은 RGMa와 네오제닌의 상이한 부분에 의해 매개된다. RGMa와 네오제닌 사이의 트랜스 상호작용은 네오제닌의 6개의 피브로넥틴 결합 도메인(본원에서 "네오제닌의 6FNIII 도메인" 또는 "6FNIII 도메인"으로서도 공지됨)을 통해 매개된다. RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용은 RGMa의 아미노산 28 내지 73(본원에서 "N-래프트"로서도 공지됨) 및 네오제닌의 4개의 면역글로불린-유사 도메인(본원에서 "네오제닌의 4Ig 도메인" 또는 "4Ig"로서도 공지됨)에 의해 매개된다. 또한, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용은 골 혈성 단백질(BMP: Bone Morphogenetic Protein)에 의해 가능해지고, 따라서, BMP는 지질 래프트에의 네오제닌 유입에도 요구된다.
또한, 본원에서 입증되는 바와 같이, N-래프트의 부분은 시스 상호작용에 충분하다. 이들 부분은 RGMa의 아미노산 54 내지 73 및 40 내지 62이지만, RGMa의 아미노산 28 내지 54 또는 54 내지 62는 아니다. 이러한 맵핑은 RGMa의 아미노산 40 내지 73은 시스 상호작용에 충분할 수 있음을 나타냈다. 대조적으로, 전장 RGMa는 네오제닌의 6FNIII 도메인과 상호작용할 수 없다. 종합하면, 이는 시스 상호작용이 RGMa의 구조 또는 폴딩에 의존적일 수 있음을 나타냈다. 전장 RGMa는, RGMa와 네오제닌 사이에 발생하는 시스 상호작용을 위해 RGMa 상의 4Ig 결합 부위(즉, RGMa의 아미노산 28 내지 73, 54 내지 73, 40 내지 62, 및 40 내지 73에 의해 포함됨)를 노출시키기 위한 추가의 인자, 예를 들면, BMP를 요구할 수 있다.
b. 제제
상기 기술된 바와 같이, 당해 방법은, 대상체에게 제제를 투여함으로써, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하고/하거나 지질 래프트를 방해할 수 있다. 당해 제제는 시스 상호작용을 방해하거나 차단할 수 있고, 따라서, 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 당해 제제는 또한, 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것을 포함하여 지질 래프트를 방해할 수 있고, 이는 결국 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킨다. 당해 제제는 항체, 펩타이드 제제, 콜레스테롤 저하제, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있다. 항체, 펩타이드 제제 및 콜레스테롤 저하제는 하기에 보다 상세하게 기술된다.
(1) 펩타이드 제제
당해 방법은 대상체에게 펩타이드 제제를 투여함으로써 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정할 수 있다. 펩타이드 제제는 상기 시스 상호작용을 방해하거나 차단할 수 있고, 따라서, 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 펩타이드 제제는 RGMa 펩타이드, 네오제닌 펩타이드, 노긴 펩타이드, 이들의 단편, 이들의 변이체, 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있다. RGMa 펩타이드, 네오제닌 펩타이드 및 노긴 펩타이드는 하기에 보다 상세하게 기술된다.
(a) 네오제닌 펩타이드
당해 방법은 대상체에게 네오제닌 펩타이드를 투여함으로써 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정할 수 있다. 네오제닌 펩타이드는 시스 상호작용을 방해하거나 차단할 수 있고, 따라서, 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
네오제닌 펩타이드는 네오제닌의 단편, 네오제닌의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 네오제닌 펩타이드는 네오제닌, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합의 2개의 면역글로불린-유사 도메인을 포함할 수 있다. 네오제닌 펩타이드는 네오제닌, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합의 3개의 면역글로불린-유사 도메인을 포함할 수 있다. 네오제닌 펩타이드는 네오제닌, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합의 4개의 면역글로불린-유사 도메인을 포함할 수 있다. 네오제닌의 4개의 면역글로불린-유사 도메인은 또한 본원에서 네오제닌의 4Ig 도메인으로서도 나타낼 수 있다. 따라서, 네오제닌 펩타이드는 4Ig 도메인, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
네오제닌 펩타이드는, 수탁번호 제AAC59662의 아미노산 1 내지 383(서열번호 1)을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 네오제닌 펩타이드는, 수탁번호 제AAC59662의 아미노산 1 내지 383(서열번호 1)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 네오제닌 펩타이드는 수탁번호 제AAC59662의 아미노산 1 내지 383(서열번호 1), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
네오제닌 펩타이드는 수탁번호 제AAI43272의 아미노산 1 내지 417(서열번호 11)을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 네오제닌 펩타이드는, 수탁번호 제AAI43272호의 아미노산 1 내지 417(서열번호 11)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 네오제닌 펩타이드는 수탁번호 제AAI43272의 아미노산 1 내지 417(서열번호 11), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
네오제닌 펩타이드는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열과 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 네오제닌 펩타이드는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
(b) RGMa 펩타이드
당해 방법은 대상체에게 RGMa 펩타이드를 투여함으로써 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정할 수 있다. RGMa 펩타이드는 시스 상호작용을 방해하거나 차단할 수 있고, 따라서, 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
RGMa 펩타이드는 RGMa의 단편, RGMa의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는, 네오제닌의 4Ig 도메인과 상호작용하는 RGMa의 임의의 단편일 수 있다. RGMa 펩타이드는, RGMa와 네오제닌 사이에 발생하는 시스 상호작용에 요구될 수 있는 임의의 2차 구조를 함유할 수 있다.
RGMa 펩타이드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열일 수 있다. 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열은 또한 본원에서 "N-래프트"로서도 나타낼 수 있다. 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열은 도 16에 나타내고, RGMa의 아미노산 28 내지 73이다.
RGMa 펩타이드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열일 수 있다. 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열은 RGMa의 아미노산 54 내지 73일 수 있다.
RGMa 펩타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열일 수 있다. 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열은 RGMa의 아미노산 40 내지 62일 수 있다.
RGMa 펩타이드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열일 수 있다. 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열은 RGMa의 아미노산 40 내지 73일 수 있다.
RGMa 펩타이드는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. RGMa 펩타이드는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
RGMa 펩타이드와 유사하게 작용하는, 즉, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 차단하거나 방해하는 펩타이드는 RGMc 유래의 펩타이드를 포함할 수 있다. 이러한 RGMc 펩타이드는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. RGMc 펩타이드는, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. RGMc 펩타이드는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열일 수 있다.
(c) 노긴
당해 방법은 대상체에게 노긴 펩타이드를 투여함으로써 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정할 수 있다. 노긴 펩타이드는 시스 상호작용을 방해하거나 차단할 수 있고, 따라서, 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
노긴 펩타이드는 노긴의 단편, 노긴의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 노긴 펩타이드는 수탁번호 제AAA83259의 아미노산 서열(서열번호 5)을 포함할 수 있다. 노긴 펩타이드는 수탁번호 제AAA83259의 아미노산 서열(서열번호 5)과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 노긴 펩타이드는 수탁번호 제AAA83259의 아미노산 서열(서열번호 5)일 수 있다.
(2) 콜레스테롤- 저하제
당해 방법은 대상체에게 콜레스테롤-저하제를 투여함으로써 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정할 수 있다. 콜레스테롤-저하제는 지질 래프트를 방해하고/하거나 시스 상호작용을 방지하거나 차단할 수 있고, 따라서, 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
콜레스테롤-저하제는 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD), 콜레스테롤 산화효소(CO), AY-9944, 스타틴, 서브틸리신/켁신 유형 9(PCK9) 억제제, 나이스타틴, 필리핀, 프로단백질 전환효소, BM15.766, 알킬인지질 유사체(예를 들면, 밀테포신, 에델포신 및 페리포신), 또는 이들의 임의의 배합물일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
(3) 항체
당해 방법은 대상체에게 항체를 투여함으로써 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정할 수 있다. 항체는 시스 상호작용을 방해하거나 차단할 수 있고, 따라서, 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
항체는 상기 기술된 RGMa 펩타이드에 대해 지시될 수 있다. 이러한 RGMa 펩타이드는, RGMa와 네오제닌 사이에 발생하는 시스 상호작용에 요구될 수 있는 임의의 2차 구조를 함유한다. 따라서, RGMa 펩타이드에 대해 지시된 항체는 이러한 2차 구조를 특이적으로 인식하고 이에 선택적으로 결합할 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 당해 항체는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및/또는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 특이적으로 인식하고 이에 선택적으로 결합할 수 있다. 항체는 RGMa의 아미노산 28 내지 73, 40 내지 62, 54 내지 73 및/또는 40 내지 73을 특이적으로 인식하고 이에 선택적으로 결합할 수 있다.
다른 실시형태에서, 당해 항체는 상기 기술된 네오제닌 펩타이드, 예를 들면, 네오제닌의 4Ig 도메인 또는 네오제닌의 세포외 부분에 대해 지시될 수 있다. 당해 항체는 네오제닌의 4Ig 도메인을 특이적으로 인식하고 이에 선택적으로 결합할 수 있다. 당해 항체는 수탁번호 제AAC59662의 아미노산 1 내지 383(서열번호 1), 수탁번호 제AAI43272의 아미노산 1 내지 417(서열번호 11) 및/또는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 특이적으로 인식하고 이에 선택적으로 결합할 수 있다.
(a) 항체 제조/생산
항체는 각종 기술들 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 항체는, 종래 기술을 통한 또는 항체의 생산을 가능하게 하기 위해 적합한 박테리아 또는 포유동물 세포 숙주에의 항체 유전자, 중쇄 및/또는 경쇄의 형질감염을 통한 모노클로날 항체의 생성을 포함하는 세포 배양 기술에 의해 생산될 수 있고, 여기서, 상기 항체는 재조합체일 수 있다. 용어 "형질감염"의 각종 형태는, 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에의 외인성 DNA의 도입을 위해 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들면, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전 및 DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하도록 의도된다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 중 어느 하나에서 본 발명의 항체를 발현시킬 수 있지만, 진핵생물 세포(및 특히 포유동물 세포)는 원핵생물 세포보다 더욱 적절하게 폴딩된 면역학적 활성 항체를 어셈블링하고 분비하는 경향이 있으므로, 진핵생물 세포에서의 항체의 발현이 바람직하고, 포유동물 숙주 세포에서의 항체 발현이 가장 바람직하다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 예시의 포유동물 숙주 세포로는 예를 들면, 문헌[Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)]에 기술되어 있는 DHFR 선택가능한 마커와 사용되는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(문헌[Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)]에 기술된 dhfr-CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합체 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되는 경우, 당해 항체는, 숙주 세포에서의 항체의 발현, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장된 배양 배지에의 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또한, 숙주 세포는 기능성 항체 단편, 예를 들면, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 상기 절차에 대한 변형은 본 발명의 범위 내임이 이해될 것이다. 예를 들면, 숙주 세포를 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 중 어느 하나의 기능성 단편을 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술은, 목적하는 항원에의 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하는데 사용될 수 있다. 또한, 이러한 절삭된 DNA 분자로부터 발현된 분자는 본 발명의 항체에 포함된다. 추가로, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고(즉, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 결합하고) 다른 중쇄 및 경쇄는 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드 이외의 항원에 대해 특이적인 이기능성 항체는 본 발명의 항체를 표준 화학 가교결합 방법에 의해 제2 항체에 가교결합시킴으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부의 재조합 발현에 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포에 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동적으로 링크되어 유전자의 높은 수준의 전사가 유도된다. 또한, 재조합 발현 벡터는 DHFR 유전자를 지니고, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 한다. 선택된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하고, 온전한 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 또한 추가로, 본 발명은, 적합한 배양 배지에서 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 본 발명의 숙주 세포를 배양함에 의한 본 발명의 재조합 항체의 합성 방법을 제공한다. 당해 방법은 배양 배지로부터 재조합 항체를 단리함을 추가로 포함할 수 있다.
모노클로날 항체의 제조 방법은, 원하는 특이성을 갖는 항체를 생산할 수 있는 불멸 세포주의 제조를 포함한다. 이러한 세포주는, 면역화된 동물로부터 얻어진 비장 세포로부터 생산될 수 있다. 동물은 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드 또는 이들의 단편 및/또는 변이체로 면역화할 수 있다. 동물을 면역화하는데 사용된 펩타이드는 사람 Fc를 암호화하는 아미노산, 예를 들면, 사람 항체의 단편 결정화가능한 영역 또는 테일(tail) 영역을 포함할 수 있다. 이어서, 비장 세포는, 예를 들면, 골수종 세포 융합 파트너와의 융합에 의해 불멸화시킬 수 있다. 각종 융합 기술을 사용할 수 있다. 예를 들면, 비장 세포 및 골수종 세포를 비이온성 세제와 몇 분 동안 배합하고, 이어서, 골수종 세포를 제외한 하이브리드 세포의 성장을 지지하는 선택 배지 상에 저밀도로 플레이팅할 수 있다. 하나의 이러한 기술은 하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘(HAT) 선택을 사용한다. 다른 기술로는 전기융합(eletrofusion)이 포함된다. 충분한 시간, 일반적으로 약 1 내지 2주 후에, 하이브리드의 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선택하고, 이들의 배양 상청액을 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대해 시험하였다. 높은 반응성 및 특이성을 갖는 하이브리도마를 사용할 수 있다.
모노클로날 항체는 성장하는 하이브리도마 콜로니의 상청액으로부터 단리될 수 있다. 추가로, 각종 기술, 예를 들면, 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복막강에의 하이브리도마 세포주의 주입을 사용하여 수율을 향상시킬 수 있다. 이어서, 모노클로날 항체는 복수액 또는 혈액으로부터 수거할 수 있다. 오염물질은 종래 기술, 예를 들면, 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출에 의해 항체로부터 제거될 수 있다. 친화성 크로마토그래피는 항체를 정제하기 위한 프로세스에서 사용될 수 있는 방법의 한 예이다.
단백질용해 효소 파파인은 IgG 분자를 우선적으로 개열시켜 몇몇의 단편을 수득하고, 이들 중 2개(F(ab) 단편)는 각각 온전한 항원-결합 부위를 포함하는 공유결합적 이종이량체를 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 개열시켜 F(ab')2 단편을 포함하는 몇몇의 단편을 제공할 수 있고, 이는 항원-결합 부위 둘 다를 포함한다.
Fv 단편은 IgM, 그리고 드물게는 IgG 또는 IgA 면역글로불린 분자의 우선적 단백질용해성 개열에 의해 생산될 수 있다. Fv 단편은 재조합 기술을 이용하여 유도될 수 있다. Fv 단편으로는, 천연 항체 분자의 큰 항원 인식 및 결합 능력을 보유하는 항원-결합 부위를 포함하는 비-공유결합적 VH::VL 이종이량체가 포함된다.
항체, 항체 단편 또는 유도체는, CDR들에 지지체를 제공하고 서로에 대한 CDR들의 공간 관계를 정의하는 중쇄 및 경쇄 프레임워크("FR") 세트 사이에 각각 개재된(interposed) 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있다. DR 세트는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3개의 초가변성 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터 진행하여, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로서 나타낸다. 따라서, 항원-결합 부위는, 중쇄 및 경쇄 V 영역의 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함할 수 있다. 단일 CDR(예를 들면, CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 포함하는 폴리펩타이드는 "분자 인식 단위"로서 나타낼 수 있다. 항원-항체 복합체의 결정학적 분석은, CDR의 아미노산 잔기가 결합된 항원과 광범위한 접촉을 형성함을 입증하였고, 여기서, 가장 광범위한 항원 접촉은 중쇄 CDR3과의 접촉이다. 따라서, 분자 인식 단위는 주로 항원-결합 부위의 특이성에 관여할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는 것에 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 관여한다.
당해 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여, 예를 들면, Cambridge Antibody Technologies(Cambridgeshire, UK), MorphoSys(Martinsreid/Planegg, Del.), Biovation(Aberdeen, Scotland, UK) BioInvent(Lund, Sweden)와 같은 각종 상업적 판매업체로부터 입수가능한 펩타이드 또는 단백질 라이브러리(예를 들면, 이들에 한정되지 않지만 박테리오파지, 리보솜, 올리고뉴클레오타이드, RNA, cDNA, 또는 효모 등, 디스플레이 라이브러리)로부터 재조합 항체를 선택하는 방법을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 필수 특이성의 항체를 생산하거나 단리하는 다른 적합한 방법을 사용할 수 있다. 문헌[U.S. Pat. 제4,704,692호; 제5,723,323호; 제5,763,192호; 제5,814,476호; 제5,817,483호; 제5,824,514호; 제5,976,862호]을 참조한다. 대안의 방법은, 당해 분야에 공지되어 있고/있거나 본원에 기술되어 있는, 사람 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자전이 동물(예를 들면, SCID 마우스, Nguyen et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41:901-907; Sandhu et al. (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren et al. (1998) Immunol. 93:154-161)의 면역화에 의존한다. 이러한 기술로는 리보솜 디스플레이(Hanes et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942; Hanes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130-14135); 단일 세포 항체 생산 기술(예를 들면, 선택된 림프구 항체 방법("SLAM")(U.S. Pat. 제5,627,052호, Wen et al. (1987) J. Immunol. 17:887-892; Babcook et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848); 겔 미세액적 및 유동 세포측정(Powell et al. (1990) Biotechnol. 8:333-337; One Cell Systems, (Cambridge, Mass).; Gray et al. (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; Kenny et al. (1995) Bio/Technol. 13:787-790); B-세포 선택(Steenbakkers et al. (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994))이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
친화성 성숙된 항체는 당해 분야에 공지되어 있는 다수의 절차들 중 임의의 하나에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화성 성숙을 기술하는 문헌[Marks et al., BioTechnology, 10: 779-783 (1992)]을 참조한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌[Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7): 3310-3319 (1995); Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]에 의해 기술된다. 선택적 돌연변이유발 위치에서의 그리고 접촉 또는 초돌연변이 위치에서의 활성 향상 아미노산 잔기를 갖는 선택적 돌연변이는 문헌[U.S. Pat. 제6,914,128 B1호]에 기술된다.
또한, 본 발명의 항체 변이체는, 유액 중에 항체를 생산시키는 유전자전이 동물 또는 포유동물, 예를 들면, 염소, 소, 말, 및 양 등을 제공하도록 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 숙주 세포에 전달함을 이용하여 제조할 수 있다. 이들 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제5,827,690호; 제5,849,992호; 제4,873,316호; 제5,849,992호; 제5,994,616호; 제5,565,362호; 및 제5,304,489호]에 기술된다.
또한, 항체 변이체는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 전달하여 식물 부분에 또는 이로부터 배양된 세포에 항체, 특정 부분 또는 변이체를 생산하는 유전자전이 식물 및 배양된 식물 세포(예를 들면, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 담배, 옥수수 및 좀개구리밥(duckweed))를 제공함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Cramer et al. (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 및 이에 인용된 참조문헌]은, 예를 들면, 유도가능한 프로모터를 이용하여 대량의 재조합 단백질을 발현하는 유전자전이 담배 잎의 생산을 기술한다. 유전자전이 옥수수를 사용하여, 다른 재조합 시스템에서 생산되거나 천연 공급원으로부터 정제된 것과 동등한 생물학적 활성을 갖는 포유동물 단백질을 상업적 생산 수준으로 발현시켰다. 예를 들면, 문헌[Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. (1999) 464:127-147 및 이에 인용된 참조문헌]을 참조한다. 또한, 항체 변이체는 항체 단편, 예를 들면, 단일 쇄 항체(scFv)를 포함하는 유전자전이 식물 종자(담배 종자 및 감자 줄기 포함)로부터 대량으로 생산되었다. 예를 들면, 문헌[Conrad et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109 및 이에 인용된 참조문헌]을 참조한다. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 공지의 방법에 따라 유전자전이 식물을 이용하여 생산될 수 있다.
항체 유도체는, 예를 들면, 외인성 서열을 부가하여 면역원성을 변형시키거나 결합, 친화성, 온-레이트(on-rate), 오프-레이트(off-rate), 산가, 특이성, 반감기, 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소시키거나, 향상시키거나, 변형시킴으로써 생산될 수 있다. 일반적으로, 비-사람 또는 사람 CDR 서열의 일부 또는 전부가 유지되고, 한편, 가변 및 불변 영역의 비-사람 서열은 사람 또는 다른 아미노산으로 대체된다.
작은 항체 단편은 2개의 항원-결합 부위를 갖는 디아바디일 수 있고, 여기서, 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄 내의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)(VH VL)을 포함한다. 예를 들면, 문헌[EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]을 참조한다. 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 이루기에 짧은 링커를 이용함으로써, 상기 도메인들은 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 한다. 또한, 본원에 전문이 인용에 의해 포함되고, 모 항체의 초가변성 영역에 삽입된 하나 이상의 아미노산 및 항원에 대한 모 항체의 결합 친화도보다 적어도 약 2배 더 강한 표적 항원에 대한 결합 친화도를 갖는 항체 변이체를 개시하는 문헌[U.S. Pat. 제6,632,926호 to Chen et al.]을 참조한다.
항체는 선형 항체일 수 있다. 선형 항체를 제조하기 위한 절차는 당해 분야에 공지되어 있고, 문헌[Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062]에 기술되어 있다. 간략하게, 이들 항체는, 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이특이적이거나 단일특이적일 수 있다.
항체는, 단백질 A 정제, 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 공지의 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 또한, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")를 정제에 사용할 수 있다.
항체를 검출가능하게 또는 치료학적으로 표지하는 것이 유용할 수 있다. 이들 제제에 항체를 접합시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 단지 설명의 목적을 위해, 항체는 검출가능한 모이어티, 예를 들면, 방사성 원자, 발색단, 또는 형광단 등으로 표지될 수 있다. 이러한 표지된 항체는 생체내 또는 단리된 시험 샘플에서의 진단학적 기술에 사용할 수 있다. 또한, 항체는, 예를 들면, 약제학적 제제, 예를 들면, 화학치료학적 약물 또는 독소에 접합될 수 있다. 이들은 사이토카인에, 리간드에, 다른 항체에 링크될 수 있다. 항-종양 효과를 달성하기 위한 항체에의 커플링에 적합한 제제로는 사이토카인, 예를 들면, 인터류킨 2(IL-2) 및 종양 괴사 인자(TNF); 알루미늄(III) 프탈로시아닌 테트라설포네이트, 헤마토포르피린 및 프탈로시아닌을 포함하는 광역학적 치료요법에 사용하기 위한 감광제; 방사성 핵종, 예를 들면, 요오드-131(131I), 이트리움-90(90Y), 비스무스-212(212Bi), 비스무스-213(213Bi), 테크네티움-99m(99mTc), 레니움-186(186Re), 및 레니움-188(188Re); 항생제, 예를 들면, 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 다우노마이신, 네오카르지노스타틴, 및 카르보플라틴; 박테리아, 식물, 및 기타 독소, 예를 들면, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 A, 스태필로코커스 장독소 A, 아브린-A 독소, 리신 A(탈글리코실화된 리신 A 및 천연 리신 A), TGF-알파 독소, 차이니즈 코브라(naja naja atra) 유래의 세포독소 및 겔로닌(식물 독소); 식물 유래의 리보솜 불활성화 단백질, 세균 및 진균, 예를 들면, 레스트릭토신(아스퍼질러스 레스트릭투스에 의한 리보솜 불활성화 단백질), 사포린(사포나리아 오피시날리스 유래의 리보솜 불활성화 단백질), 및 RNase; 티로신 키나제 억제제; ly207702(디플루오로화된 퓨린 뉴클레오시드); 항 담낭제(anti cystic agent)를 함유하는 리포솜(예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 독소를 암호화하는 플라스미드, 메토트렉세이트 등); 및 다른 항체 또는 항체 단편, 예를 들면, F(ab)가 포함된다.
항체는 재조합 또는 합성 수단에 의해 서열분석되고 복제될 수 있다. 또한, 이들은 이들을 암호화하는 뉴클레오타이드의 선형 서열로 추가로 서열분석될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체의 서열을 암호화하는 이들 폴리뉴클레오타이드를 상기 기술된 바와 같이 단독으로 또는 담체, 벡터 또는 숙주 세포와의 조합으로 제공한다.
하이브리도마 기술, 선택된 림프구 항체 방법(SLAM), 유전자전이 동물, 및 재조합 항체 라이브러리의 사용을 통한 항체 생산은 하기에 보다 상세하게 기술된다.
(a) 하이브리도마 기술을 이용한 항-RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드 항체
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합체 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 조합의 사용을 포함하는 당해 분야에 공지되어 있는 광범위한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 당해 분야, 예를 들면, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, second edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1988); Hammerling, et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, (Elsevier, N.Y., 1981)]에 공지되어 있고 교시되어 있는 기술을 포함하는 하이브리도마 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 한정되지 않음에 주의한다. 용어 "모노클로날 항체"는, 이것이 생산되는 방법이 아니라 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론으로부터 유도되는 항체를 말한다.
한 실시형태에서, 본 발명은 모노클로날 항체를 생성시키는 방법 및 당해 방법에 의해 생산된 항체를 제공한다. 당해 방법은 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양함을 포함할 수 있고, 여기서, 바람직하게는 상기 하이브리도마는, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드로 면역화된 동물, 예를 들면, 래트 또는 마우스로부터 단리된 비장 세포를 골수종 세포와 융합하고, 이어서, 상기 융합으로부터 얻어진 하이브리도마를 본 발명의 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대해 스크리닝함으로써 생성된다. 간략하게, 래트를 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드로 면역화시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드를 보조제와 함께 투여하여 면역 반응을 자극한다. 이러한 보조제로는 완전 또는 불완전 프로인트(Freund) 보조제, RIBI(뮤라밀 디펩타이드) 또는 ISCOM(면역자극 복합체)이 포함된다. 이러한 보조제는, 이를 국소적 저장소(deposit)에 봉쇄함으로써 신속하게 분산되는 것으로부터 폴리펩타이드를 보호할 수 있거나, 이들은, 대식세포 및 면역 시스템의 다른 구성성분에 주화성인 인자를 분비하도록 숙주를 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 바람직하게, 폴리펩타이드가 투여되는 경우, 면역화 스케쥴은 몇 주에 걸쳐 지속되는 2회 이상의 폴리펩타이드의 투여를 포함할 것이지만; 폴리펩타이드의 단일 투여도 사용할 수 있다.
RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드로의 동물의 면역화 후, 동물로부터 항체 및/또는 항체-생산 세포가 수득될 수 있다. 항-RGMa 펩타이드 또는 항-네오제닌 펩타이드 항체-함유 혈청은 동물을 출혈시키거나 희생시킴으로써 동물로부터 얻어진다. 혈청은 동물로부터 얻어짐에 따라 사용될 수 있거나, 면역글로불린 분획은 혈청으로부터 수득될 수 있거나, 항-RGMa 펩타이드 또는 항-네오제닌 펩타이드 항체는 혈청으로부터 정제될 수 있다. 이러한 방식으로 얻어진 혈청 또는 면역글로불린은 폴리클로날이고, 따라서, 이종성 어레이의 특성을 갖는다.
일단 면역 반응이 검출되면, 예를 들면, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 대해 특이적인 항체는 래트 혈청에서 검출되고, 래트 비장을 수거하고, 비장 세포를 단리한다. 이어서, 비장 세포를 익히 공지되어 있는 기술에 의해 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들면, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassas, Va., US)으로부터 입수가능한 세포주 SP20 유래의 세포에 융합시킨다. 하이브리도마를 선택하고 제한 희석에 의해 클로닝한다. 이어서, 하이브리도마 클론은 당해 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 검정한다. 일반적으로 높은 수준의 항체를 함유하는 복수액은 래트를 양성 하이브리도마 클론으로 면역화시킴으로써 생성될 수 있다.
다른 실시형태에서, 항체-생산 불멸화된 하이브리도마는 면역화된 동물로부터 제조될 수 있다. 면역화 후, 동물을 희생시키고, 비장 B 세포를 당해 분야에 익히 공지되어 있는 바와 같이 불멸화된 골수종 세포에 융합시킨다. 예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, supra]을 참조한다. 바람직한 실시형태에서, 골수종 세포는 면역글로불린 폴리펩타이드(비-분비성 세포주)를 분비하지 않는다. 융합 및 항생제 선택 후, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드, 또는 이들의 일부, 또는 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드를 발현하는 세포를 이용하여 하이브리도마를 스크리닝한다. 바람직한 실시형태에서, 초기 스크리닝은 효소-링크된 면역흡착 검정(ELISA) 또는 방사선 면역 검정(RIA), 바람직하게는 ELISA를 이용하여 수행한다. ELISA 스크리닝의 한 예는 PCT 공보 제WO 00/37504호에 제공된다.
항-RGMa 펩타이드 또는 항-네오제닌 펩타이드 항체-생산성 하이브리도마를 선택하고, 클로닝하고, 추가로 강력한 하이브리도마 성장, 높은 항체 생산, 및 원하는 항체 특성을 포함하는 원하는 특성에 대해 스크리닝한다. 하이브리도마는 동계 동물에서, 면역 시스템이 결여되어 있는 동물, 예를 들면, 누드 마우스에서 생체내에서 또는 시험관내 세포 배양물에서 배양하고 확장시킬 수 있다. 하이브리도마를 선택하고, 클로닝하고, 확장시키는 방법은 당해 분야 숙련가들에게 익히 공지되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 하이브리도마는 래트 하이브리도마이다. 다른 실시형태에서, 하이브리도마는 비-사람, 비-래트 종, 예를 들면, 마우스, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말에서 생산된다. 또 다른 바람직한 실시형태에서, 하이브리도마는 사람 하이브리도마이고, 여기서, 사람 비-분비성 골수종은 항-RGMa 펩타이드 또는 항-네오제닌 펩타이드 항체를 발현하는 사람 세포와 융합된다.
특정 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 (2개의 동일한 Fab 단편을 생산하기 위한) 파파인 또는 (F(ab')2 단편을 생산하기 위한) 펩신과 같은 효소를 이용한 면역글로불린 분자들의 단백질용해성 개열에 의해 생산될 수 있다. IgG 분자의 F(ab')2 단편은, 경쇄(가변 경쇄 및 불변 경쇄 영역을 함유함) 둘 다를 포함하는 보다 큰("모") IgG 분자의 2개의 항원-결합 부위, 중쇄의 CH1 도메인, 및 모 IgG 분자의 디설파이드-형성 힌지 영역을 보유한다. 따라서, F(ab')2 단편은 여전히 모 IgG 분자와 유사한 항원 분자에 가교결합할 수 있다.
(b) SLAM을 이용한 항- RGMa 펩타이드 또는 항- 네오제닌 펩타이드 모노클로날 항체
본 발명의 다른 양상에서, 재조합 항체는, 문헌[U.S. Pat. 제5,627,052호; PCT Publication 제WO 92/02551호; 및 Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 7843-7848 (1996)]에 기술된 바와 같이 당해 분야에 선택된 림프구 항체 방법(SLAM)으로서 언급된 절차를 이용하여 단일 단리된 림프구로부터 생성된다. 이러한 방법에서, 목적하는 항체를 분비하는 단일 세포, 예를 들면, 면역화된 동물들 중 임의의 하나로부터 유도된 림프구는 항원-특이적 용혈성 플라크 검정을 이용하여 스크리닝하고, 여기서, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드 또는 이들의 단편은 비오틴과 같은 링커를 이용하여 양 적혈구 세포에 커플링되고, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 대한 특이성을 갖는 항체를 분비하는 단일 세포를 동정하는데 사용된다. 목적하는 항체-분비 세포의 동정 후, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA는 역 전사효소-PCR(RT-PCR)에 의해 세포로부터 구제되고, 이어서, 이들 가변 영역은 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 적절한 면역글로불린 불변 영역(예를 들면, 사람, 소, 개, 말, 고양이 또는 돼지 불변 영역)과 관련하여 발현될 수 있다. 이어서, 생체내 선택된 림프구로부터 유도된, 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포는, 예를 들면, 형질감염된 세포를 패닝(panning)하여 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 대한 항체를 발현하는 세포를 단리함으로써 추가의 분석 및 시험관내 선택을 행할 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 추가로 시험관내에서, 예를 들면, 시험관내 친화성 성숙 방법에 의해 조작될 수 있다. 예를 들면, 문헌[PCT 공보 제WO 97/29131호 및 PCT 공보 제WO 00/56772호]을 참조한다.
(c) 유전자전이 동물을 이용한 항- RGMa 펩타이드 또는 항- 네오제닌 펩타이드 모노클로날 항체
본 발명의 다른 실시형태에서, 항체는, 사람 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 포함하는 비-사람 동물을 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드로 면역화시킴으로써 생산된다. 한 실시형태에서, 비-사람 동물은, 사람 면역글로불린 유전자좌의 큰 단편을 포함하고 마우스 항체 생산이 결핍된 유전자조작된 마우스 스트레인인 XENOMOUSE® 유전자전이 마우스이다. 예를 들면, 문헌[Green et al., Nature Genetics, 7: 13-21 (1994) 및 U.S. Pat. 제5,916,771호; 제5,939,598호; 제5,985,615호; 제5,998,209호; 제6,075,181호; 제6,091,001호; 제6,114,598호; 및 제6,130,364호]을 참조한다. 또한, 문헌[PCT 공보 제WO 91/10741호; 제WO 94/02602호; 제WO 96/34096호; 제WO 96/33735호; 제WO 98/16654호; 제WO 98/24893호; 제WO 98/50433호; 제WO 99/45031호; 제WO 99/53049호; 제WO 00/09560호; 및 제WO 00/37504호]을 참조한다. XENOMOUSE® 유전자전이 마우스는 완전 사람 항체의 성인-유사 사람 레퍼토리를 생산하고, 항원-특이적 사람 모노클로날 항체를 생성시킨다. XENOMOUSE® 유전자전이 마우스는, 사람 중쇄 유전자좌 및 경쇄 유전자좌의 메가베이스 크기의 생식선 입체배치 YAC 단편의 도입을 통해 사람 항체 레퍼토리의 대략 80%를 함유한다. 문헌[Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med., 188: 483-495 (1998)]을 참조하고, 이의 개시는 본원에 인용에 의해 포함된다.
(d) 재조합 항체 라이브러리를 이용한 항- RGMa 펩타이드 또는 항- 네오제닌 펩타이드 모노클로날 항체
또한, 시험관내 방법을 사용하여 본 발명의 항체를 제조할 수 있고, 여기서, 항체 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드-결합 특이성을 갖는 항체를 동정한다. 이러한 재조합 항체 라이브러리의 스크리닝 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제5,223,409호(Ladner et al.); PCT 공보 제WO 92/18619호(Kang et al.); PCT 공보 제WO 91/17271호(Dower et al.); PCT 공보 제WO 92/20791호(Winter et al.); PCT 공보 제WO 92/15679호(Markland et al.); PCT 공보 제WO 93/01288호(Breitling et al.); PCT 공보 제WO 92/01047호(McCafferty et al.); PCT 공보 제WO 92/09690호(Garrard et al.); Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3: 81-85 (1992); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J., 12: 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992); Garrard et al., Bio/Technology, 9: 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991); US 특허 출원 공보 제2003/0186374호; 및 PCT 공보 제WO 97/29131호, 이들 문헌의 각각의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다]에 기술되어 있는 방법이 포함된다.
재조합 항체 라이브러리는 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드, 또는 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드의 일부로 면역화된 대상체 유래일 수 있다. 대안으로, 재조합 항체 라이브러리는 나이브(naive) 대상체, 즉, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드, 예를 들면, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드로 면역화되지 않은 사람 대상체 유래의 사람 항체 라이브러리로 면역화되지 않은 대상체 유래일 수 있다. 본 발명의 항체는, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드를 포함하는 펩타이드로 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝하여 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드를 인식하는 이들 항체를 선택함으로써 선택된다. 이러한 스크리닝 및 선택을 수행하는 방법은 선행 단락의 참조문헌에 기술되어 있는 바와 같이 당해 분야에 익히 공지되어 있다. RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 대한 특정 결합 친화도를 갖는 본 발명의 항체, 예를 들면, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드로부터 특정 Koff 속도 상수로 해리되는 항체를 선택하기 위해, 당해 분야에 공지되어 있는 표면 플라스몬 공명 방법을 이용하여 원하는 Koff 속도 상수를 갖는 항체를 선택할 수 있다. RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 대한 특정 중화 활성을 갖는 본 발명의 항체, 예를 들면, 특정 IC50을 갖는 항체를 선택하기 위해, RGMa 또는 네오제닌 활성의 억제를 평가하기 위한 당해 분야에 공지되어 있는 표준 방법을 사용할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합부에 관한 것이다. 바람직하게, 항체는 중화 항체이다. 각종 실시형태에서, 항체는 재조합 항체 또는 모노클로날 항체이다.
예를 들면, 본 발명의 항체는 또한 당해 분야에 공지되어 있는 각종 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 이들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지닌 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 이러한 파지를 이용하여, 레퍼토리 또는 조합적 항체 라이브러리(예를 들면, 사람 또는 뮤린 또는 소, 개, 말, 고양이 또는 돼지)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이할 수 있다. 목적하는 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는, 예를 들면, 표지된 항원 또는 고체 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 이용하여 항원으로 선택되거나 동정될 수 있다. 이들 방법에 사용된 파지는 전형적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 중 어느 하나에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 파지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 사상 파지이다. 본 발명의 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예로는 문헌[Brinkmann et al., J. Immunol. Methods, 182: 41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods, 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene, 187: 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology, 57: 191-280 (1994); PCT 공보 제WO 92/01047호; PCT 공보 제WO 90/02809호; 제WO 91/10737호; 제WO 92/01047호; 제WO 92/18619호; 제WO 93/11236호; 제WO 95/15982호; 제WO 95/20401호; 및 U.S. Pat. 제5,698,426호; 제5,223,409호; 제5,403,484호; 제5,580,717호; 제5,427,908호; 제5,750,753호; 제5,821,047호; 제5,571,698호; 제5,427,908호; 제5,516,637호; 제5,780,225호; 제5,658,727호; 제5,733,743호; 및 제5,969,108호]에 개시되어 있는 방법들이 포함된다.
상기 참조문헌에 기술되는 바와 같이, 파지 선택 후, 파지 유래의 영역을 암호화하는 항체를 단리하고, 이를 이용하여 사람 항체 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생성시키고, 예를 들면, 하기에 상세하게 기술되는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생산하는 기술은 문헌[PCT 공보 제WO 92/22324호; Mullinax et al., BioTechniques, 12(6): 864-869 (1992); Sawai et al., Am. J. Reprod. Immunol., 34: 26-34 (1995); 및 Better et al., Science, 240: 1041-1043 (1988)]에 개시되어 있는 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 사용할 수 있다. 단일쇄 Fv 및 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 기술의 예로는 문헌[U.S. Pat. 제4,946,778호 및 제5,258,498호; Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999 (1993); 및 Skerra et al., Science, 240: 1038-1041 (1988)]에 기술되어 있는 것들이 포함된다.
파지 디스플레이에 의한 재조합 항체 라이브러리의 스크리닝의 대안으로, 대형 조합적 라이브러리를 스크리닝하기 위한 당해 분야에 공지되어 있는 다른 방법론을 본 발명의 항체의 동정에 적용할 수 있다. 대안의 발현 시스템의 한 유형은 문헌[PCT 공보 제WO 98/31700호(Szostak and Roberts)]에 그리고 문헌[Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12302 (1997)]에 기술되어 있는 바와 같은 재조합 항체 라이브러리가 RNA-단백질 융합으로서 발현되는 시스템이다. 이러한 시스템에서 공유결합적 융합은, 3' 말단에 펩티딜 억셉터 항생제인 퓨로마이신을 지닌 합성 mRNA의 시험관내 번역에 의해 암호화되는 펩타이드 또는 단백질과 mRNA 사이에 생성된다. 따라서, 특정 mRNA는, 암호화된 펩타이드 또는 단백질, 예를 들면, 항체 또는 이의 부분의 특성, 예를 들면, 이원 특이성 항원에의 항체 또는 이의 부분의 결합에 기초하여 mRNA(예를 들면, 조합적 라이브러리)의 복합 혼합물로부터 농축될 수 있다. 이러한 라이브러리의 스크리닝으로부터 회수되는 항체 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산 서열은 (예를 들면, 포유동물 숙주 세포에서) 상기 기술된 바와 같은 재조합 수단에 의해 발현될 수 있고, 또한, 상기 기술된 바와 같이, 돌연변이가 본래 선택된 서열(들)에 도입된 mRNA-펩타이드 융합의 추가 라운드의 스크리닝에 의해 또는 재조합 항체의 시험관내 친화성 성숙을 위한 다른 방법에 의해 추가로 친화성 성숙시킬 수 있다. 이러한 방법의 바람직한 예는 PROfusion 디스플레이 기술이다.
다른 접근법에서, 본 발명의 항체는 또한 당해 분야에 공지되어 있는 효모 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 효모 디스플레이 방법에서, 유전적 방법을 이용하여 효모 세포 벽에 항체 도메인을 테더링하여(tether) 이들을 효모의 표면 상에 디스플레이한다. 특히, 이러한 효모는, 레퍼토리 또는 조합적 항체 라이브러리(예를 들면, 사람 또는 뮤린 또는 소, 개, 말, 고양이 또는 돼지)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 디스플레이하는데 이용할 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 효모 디스플레이 방법의 예로는 본원에 인용에 의해 포함된 문헌[U.S. Pat. 제6,699,658호(Wittrup et al.)]에 개시되어 있는 방법이 포함된다.
(b) 재조합 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드 항체의 생산
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지되어 있는 다수의 기술들 중 어느 하나에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포로부터의 발현이 있고, 여기서, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포에 형질감염된다. 용어 "형질감염의 각종 형태는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에의 외인성 DNA의 도입에 통상적으로 사용되는 광범위한 기술, 예를 들면, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, 및 DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하도록 의도된다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현시킬 수 있지만, 진핵생물 세포(및 특히 포유동물 세포)는 원핵생물 세포보다 더욱 적절하게 폴딩된 면역학적 활성 항체를 어셈블링하고 분비하는 경향이 있으므로, 진핵생물 세포에서의 항체의 발현이 바람직하고, 포유동물 숙주 세포에서의 항체 발현이 가장 바람직하다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위한 예시의 포유동물 숙주 세포로는 예를 들면, 문헌[Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159: 601-621 (1982)]에 기술되어 있는 DHFR 선택가능한 마커와 사용되는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(문헌[Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)]에 기술된 dhfr-CHO 세포 포함), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 포함된다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합체 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되는 경우, 당해 항체는, 숙주 세포에서의 항체의 발현, 또는 보다 바람직하게는 숙주 세포가 성장된 배양 배지에의 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또한, 숙주 세포는 기능성 항체 단편, 예를 들면, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 상기 절차에 대한 변형은 본 발명의 범위 내임이 이해될 것이다. 예를 들면, 숙주 세포를 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 중 어느 하나의 기능성 단편을 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술은, 목적하는 항원에의 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하는데 사용될 수 있다. 또한, 이러한 절삭된 DNA 분자로부터 발현된 분자는 본 발명의 항체에 포함된다. 추가로, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고(즉, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 결합하고) 다른 중쇄 및 경쇄는 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드 이외의 항원에 대해 특이적인 이기능성 항체는 본 발명의 항체를 표준 화학 가교결합 방법에 의해 제2 항체에 가교결합시킴으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부의 재조합 발현에 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포에 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동적으로 링크되어 유전자의 높은 수준의 전사가 유도된다. 또한, 재조합 발현 벡터는 DHFR 유전자를 지니고, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 한다. 선택된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하고, 온전한 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수한다. 또한 추가로, 본 발명은, 적합한 배양 배지에서 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 본 발명의 숙주 세포를 배양함에 의한 본 발명의 재조합 항체의 합성 방법을 제공한다. 당해 방법은 배양 배지로부터 재조합 항체를 단리함을 추가로 포함할 수 있다.
(a) 사람화된 항체
사람화된 항체는, 목적하는 항원에 면역특이적으로 결합하고, 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크(FR) 영역 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는, 항체 또는 변이체, 유도체, 유사체 또는 이의 부분일 수 있다. 사람화된 항체는, 비-사람 종 유래의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 사람 면역글로불린 분자 유래의 프레임워크 영역을 갖는 원하는 항원에 결합하는 비-사람 종 항체 유래일 수 있다.
CDR과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 말한다.
사람화된 항체는, 실질적으로 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) 모두를 포함하고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역들은 비-사람 면역글로불린(즉, 공여자 항체)의 CDR 영역들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역들은 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 프레임워크 영역들이다. 한 양상에 따르면, 사람화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 사람 면역글로불린의 적어도 일부를 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄 및 적어도 중쇄의 가변 도메인 둘 다를 함유한다. 또한, 항체는 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 사람화된 경쇄만을 함유한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 사람화된 중쇄만을 함유한다. 특정 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄의 및/또는 중쇄의 사람화된 가변 도메인만을 함유한다.
사람화된 항체는, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 제한 없이 포함하는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE 및 임의의 이소타입을 포함하는 임의의 부류의 면역글로불린들로부터 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 1개 초과의 부류 또는 이소타입 유래의 서열을 포함할 수 있고, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 기술을 이용하여 원하는 이펙터 기능을 최적화하기 위해 특정 불변 도메인을 선택할 수 있다.
사람화된 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 모 서열에 정확하게 상응할 필요가 없고, 예를 들면, 공여자 항체 CDR 또는 컨센서스 프레임워크는 1개 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이유발되어 해당 부위에서의 CDR 또는 프레임워크 잔기는 공여자 항체 또는 컨센서스 프레임워크 중 어느 하나에 상응하지 않을 수 있다. 그러나, 한 실시형태에서, 이러한 돌연변이는 광범위하지 않을 것이다. 일반적으로, 사람화된 항체 잔기의 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%는 모 FR 및 CDR 서열의 잔기에 상응할 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열 내의 프레임워크 영역을 말한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련 면역글로불린 서열의 패밀리에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로 이루어진 서열을 말한다(예를 들면, 문헌[Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, 1987)]을 참조한다). 면역글로불린의 패밀리에서, 컨센서스 서열 내의 각각의 위치는 상기 패밀리 내의 해당 위치에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산에 의해 점령된다. 2개의 아미노산이 동등하게 빈번하게 발생하는 경우, 둘 중 어느 하나는 컨센서스 서열 내에 포함될 수 있다.
사람화된 항체는, 설치류 항-사람 항체에 대한 원하지 않는 면역학적 반응을 최소화하도록 고안될 수 있고, 이는 사람 수용자에서의 이들 모이어티의 치료학적 적용의 지속기간 및 유효성을 한정한다. 사람화된 항체는 비-사람인 공급원 유래의 것에 도입되는 1개 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-사람 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로서도 나타내고, 이는 전형적으로 가변 도메인으로부터 취한다. 사람화는 초가변성 영역 서열을 사람 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "사람화된" 항체는, 비-사람 종 유래의 상응하는 서열이 온전한 사람 가변 도메인보다 실질적으로 더 적게 치환된 키메라 항체이다. 예를 들면, 문헌[U.S. 특허 제4,816,567호]을 참조하고, 이의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다. 사람화된 항체는, 일부 초가변성 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서의 유사 부위 유래의 잔기로 치환된 사람 항체일 수 있다. 본 발명의 항체의 사람화 또는 유전자조작은 임의의 공지의 방법, 이들에 한정되는 것은 아니지만 예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제5,723,323호; 제5,976,862호; 제5,824,514호; 제5,817,483호; 제5,814,476호; 제5,763,192호; 제5,723,323; 제5,766,886호; 제5,714,352호; 제6,204,023호; 제6,180,370호; 제5,693,762; 제5,530,101; 제5,585,089호; 제5,225,539호; 및 제4,816,567호]에 기술된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
사람화된 항체는 RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유할 수 있다. 사람화된 항체는 모 및 사람화된 서열의 3차원 모델을 이용한 모 서열 및 각종 개념적 사람화된 생성물의 분석 프로세스에 의해 제조할 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하다. 선택된 후보물 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체배좌 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이의 조사는, 후보물 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 잔기들의 가능한 역할 분석, 즉, 후보물 면역글로불린이 이의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식에서, 수용자 및 임포트 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 조합하여 원하는 항체 특성, 예를 들면, RGMa 펩타이드 또는 네오제닌 펩타이드에 대한 증가된 친화도를 달성할 수 있다. 일반적으로, 초가변성 영역 잔기는 직접적으로 그리고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는 것에 관여할 수 있다.
사람화에 대한 대안으로서, 사람 항체(본원에서 "완전 사람 항체"로서도 나타냄)가 생성될 수 있다. 예를 들면, PROfusion 및/또는 효모 관련 기술을 통해 라이브러리로부터 사람 항체를 단리할 수 있다. 또한, 유전자전이 동물(예를 들면, 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하 면역화시에 사람 항체의 완전 레퍼토리를 생산할 수 있는 마우스)을 생산할 수 있다. 예를 들면, 키메라 및 생식선 돌연변이체 마우스에서의 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동형 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 초래한다. 이러한 생식선 돌연변이체 마우스에서의 사람 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 챌린지에 따라 사람 항체의 생산을 초래할 것이다. 사람화된 또는 완전 사람 항체는 문헌[U.S. 특허 제5,770,429호; 제5,833,985호; 제5,837,243호; 제5,922,845호; 제6,017,517호; 제6,096,311호; 제6,111,166호; 제6,270,765호; 제6,303,755호; 제6,365,116호; 제6,410,690호; 제6,682,928호; 및 제6,984,720호, 상기 문헌 각각의 내용은 본원에 인용에 의해 포함된다]에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다.
c. 뉴런 세포 생존
상기 기술된 바와 같이, 당해 조정 방법은 대상체에서의 뉴런 세포 생존을 촉진시킬 수 있다. 뉴런 세포 생존은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킴으로써 촉진될 수 있다. 상기 기술된 제제는 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다.
당해 조정 방법은 시신경 손상, 척수 손상, 또는 이들의 조합 후 뉴런 세포 생존을 촉진시킬 수 있다. 당해 조정 방법은 색소성 망막염, 허혈(예를 들면, 뇌졸중) 또는 다발성 경화증을 앓고 있는 대상체에서의 뉴런 세포 생존을 촉진시킬 수 있다. 시신경 손상, 척수 손상, 색소성 망막염, 허혈(예를 들면, 뇌졸중) 또는 다발성 경화증의 치료 방법은 하기에 보다 상세하게 기술된다.
당해 조정 방법은 대상체에서의 뉴런 세포 생존을 적어도 약 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 또는 약 10.0배 촉진시킴을 포함할 수 있다. 당해 조정 방법은 대상체에서의 뉴런 세포 생존을 적어도 약 2.0배 또는 3.0배 촉진시킴을 포함할 수 있다.
당해 조정 방법은 제제가 투여되지 않은 대상체에서의 뉴런 세포 생존에 비하여 대상체에서의 뉴런 세포 생존을 증가시킴을 포함할 수 있다. 당해 조정 방법은 제제가 투여되지 않은 대상체에서의 뉴런 세포 생존에 비하여 대상체에서의 뉴런 세포 생존을 적어도 약 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 6.0배, 6.5배, 7.0배, 7.5배, 8.0배, 8.5배, 9.0배, 또는 약 10.0배 증가시킴을 포함할 수 있다. 당해 조정 방법은 제제가 투여되지 않은 대상체에서의 뉴런 세포 생존에 비하여 대상체에서의 뉴런 세포 생존을 적어도 약 2.0배 또는 3.0배 증가시킴을 포함할 수 있다.
d. 축삭 성장 및/또는 재생의 촉진
당해 조정 방법은 대상체에서의 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 축삭 성장 및/또는 재생은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킴으로써 촉진될 수 있다. 상기 기술된 제제는 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다.
당해 조정 방법은 시신경 손상, 척수 손상 또는 이들의 조합 후 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 당해 조정 방법은 색소성 망막염, 허혈(예를 들면, 뇌졸중) 또는 다발성 경화증을 앓고 있는 대상체에서의 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 시신경 손상, 척수 손상, 색소성 망막염, 허혈(예를 들면, 뇌졸중) 또는 다발성 경화증의 치료 방법은 하기에 보다 상세하게 기술된다.
3. 치료 방법
또한, 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 당해 치료 방법은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조절하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 상기 기술된 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법을 적용할 수 있다. 당해 치료 방법은 대상체에게 상기 기술된 제제를 투여함을 포함할 수 있다.
RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것은 질환에 이로울 수 있다. 상기 질환으로는 색소성 망막염, 허혈(예를 들면, 뇌졸중), 다발성 경화증, 척수 손상 및 시신경 손상이 포함될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니고, 이들의 각각은 하기에 보다 상세하게 기술된다.
a. 색소성 망막염
당해 치료 방법은 대상체에서의 색소성 망막염을 치료하는 것을 포함할 수 있다. 제제는 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다. 조정은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나, 지질 래프트를 방해하고/하거나, 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킴을 포함할 수 있다. 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것은 대상체에서의 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 당해 치료 방법은 색소성 망막염을 앓고 있는 대상체에서 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
뉴런 세포는 광수용체 세포일 수 있다. 따라서, 색소성 망막염의 치료 방법은 제제가 투여된 대상체에서의 광수용체 세포의 생존을 촉진시킬 수 있다.
당해 치료 방법은 제제가 투여되지 않은 대상체에서의 외핵층에 비하여 대상체에서의 외핵층을 적어도 약 1.5배, 2.0배, 2.5배, 3.0배, 3.5배, 4.0배, 4.5배, 5.0배, 5.5배, 또는 6.0배 증가시킬 수 있다.
b. 허혈
치료 방법은 대상체에서의 허혈을 치료함을 포함할 수 있다. 허혈의 치료 방법은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다. 조정은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나, 지질 래프트를 방해하고/하거나, 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킴을 포함할 수 있다. 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것은 대상체에서의 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 당해 치료 방법은 대상체에서 허혈 손상 후 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
허혈은 뇌졸중을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 허혈은 뇌졸중일 수 있다. 따라서, 당해 방법은 대상체에게 제제를 투여함으로써 뇌졸중을 치료함을 포함할 수 있다.
뇌졸중의 치료 방법은, 뇌졸중을 앓고 있고 제제가 투여되지 않은 대상체의 뇌 부종에 비하여 대상체에서의 뇌 부종을 감소시킬 수 있다. 뇌졸중의 치료 방법은, 뇌졸중을 앓고 있고 제제가 투여되지 않은 대상체의 경색 체적에 비하여 대상체에서의 경색 체적을 감소시킬 수 있다. 뇌졸중의 치료 방법은, 뇌졸중을 앓고 있고 제제가 투여되지 않은 대상체의 행동 결손에 비하여 대상체에서의 뇌졸중으로부터 초래되는 행동 결손을 감소시킬 수 있다.
c. 다발성 경화증
당해 치료 방법은 대상체에서의 다발성 경화증을 치료함을 포함할 수 있다. 다발성 경화증의 치료 방법은 대상체에게 제제를 투여함을 포함할 수 있다. 당해 제제는 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다. 조정은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나, 지질 래프트를 방해하고/하거나, 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킴을 포함할 수 있다. 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것은 대상체에서의 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 당해 치료 방법은 다발성 경화증을 앓고 있는 대상체에서의 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
당해 치료 방법은, 다발성 경화증을 앓고 있고 제제가 투여되지 않은 대상체에서의 신경퇴화에 비하여 대상체에서의 신경퇴화를 감소시킬 수 있다.
d. 척수 손상
치료 방법은 대상체에서의 척수 손상을 치료함을 포함할 수 있다. 척수 손상의 치료 방법은 대상체에게 제제를 투여함을 포함할 수 있다. 당해 제제는 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다. 조정은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나, 지질 래프트를 방해하고/하거나, 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킴을 포함할 수 있다. 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것은 대상체에서의 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 당해 치료 방법은 대상체에서의 척수 손상 후 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 대상체에서의 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킴으로써, 치료 방법은 대상체에서의 운동 활성을 회복시킬 수 있다. 당해 치료 방법은 척수 손상 후 대상체에서의 운동 활성을 부분적으로 또는 완전하게 회복시킬 수 있다.
e. 시신경 손상
당해 치료 방법은 대상체에서의 시신경 손상을 치료함을 포함할 수 있다. 시신경 손상의 치료 방법은 대상체에게 제제를 투여함을 포함할 수 있다. 당해 제제는 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킬 수 있다. 조정은 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나, 지질 래프트를 방해하고/하거나, 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시킴을 포함할 수 있다. 시스 상호작용을 방해하거나 차단하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것은 대상체에서의 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다. 따라서, 당해 치료 방법은 대상체에서의 시신경 손상 후 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 수 있다.
본 발명은 하기 비-제한적 실시예에 의해 설명되는 다수의 양상들을 갖는다.
4. 약제학적 조성물
상기 기술된 제제는 약제학적 조성물 중의 구성성분일 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명의 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 이들에 포함되는 것은 아니지만 장애의 진단, 검출, 또는 모니터링에, 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리 또는 완화에 그리고/또는 연구에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시형태에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 제제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하고/하거나 지질 래프트를 방해하고/하거나 지질 래프트 내의 콜레스테롤 수준을 감소시키는 것이 이로울 수 있는 장애를 치료하기 위해 본 발명의 하나 이상의 제제 및 본 발명의 제제 이외의 하나 이상의 예방학적 또는 치료학적 제제를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 당해 예방학적 또는 치료학적 제제는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리 또는 완화에 유용한 것으로 공지되어 있거나, 이에 사용되어 왔거나, 현재 사용되고 있다. 이들 실시형태에 관련하여, 당해 조성물은 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 제제는 대상체에게의 투여에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"로는 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 및 에탄올 등, 및 이들의 조합 중 하나 이상이 포함된다. 다수의 경우, 당해 조성물에 등장성 제제, 예를 들면, 당, 다가 알콜, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약제학적으로 허용되는 담체는 미량의 보조제 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 제제의 유통 기한 또는 유효성을 향상시킨다.
각종 전달 시스템이 공지되어 있고, 본 발명의 하나 이상의 제제 또는 본 발명의 하나 이상의 제제와 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방하거나 관리하거나 치료하거나 완화시키는데 유용한 예방학적 제제 또는 치료학적 제제의 조합을 투여하는데 사용할 수 있고, 예를 들면, 리포솜 내의 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 제제를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 세포내이입(endocytosis)(예를 들면, 문헌[Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)]을 참조한다), 레트로 바이러스 또는 다른 벡터의 부분으로서의 핵산의 작제 등이 있다. 본 발명의 예방학적 제제 또는 치료학적 제제의 투여 방법으로는 비경구 투여(예를 들면, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외 투여, 종양내 투여 및 점막 투여(예를 들면, 비내 및 경구 경로)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 폐 투여는 흡입기 또는 네뷸라이저(neulizer) 및 에어로졸화 제제(aerosolizing agent)를 갖는 제형의 사용에 의해 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제6,019,968호; 제5,985,320호; 제5,985,309호; 제5,934,272호; 제5,874,064호; 제5,855,913호; 제5,290,540호; 및 제4,880,078호; 및 PCT 공보 제WO 92/19244호; 제WO97/32572호; 제WO97/44013호; 제WO98/31346호; 및 제WO99/66903호]을 참조하고, 상기 문헌의 각각은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 제제 또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 이용하여 투여한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 예방학적 또는 치료학적 제제는 근육내, 정맥내, 종양내, 경구, 비강내, 폐 또는 피하 투여한다. 예방학적 또는 치료학적 제제는 임의의 종래 경로에 의해, 예를 들면, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 라이닝(예를 들면, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여할 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다.
특정 실시형태에서, 치료가 필요한 부위에 국소적으로 본 발명의 제제를 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이는, 한정 없이, 예를 들면, 국소 주입에 의해, 주사에 의해, 또는 이식물의 수단에 의해 달성될 수 있고, 상기 이식물은 시알라스틱 막, 중합체, 섬유성 매트릭스(예를 들면, Tissuel), 또는 콜라겐 매트릭스와 같은 막 및 매트릭스를 포함하는 다공성 또는 비-다공성 물질이다. 한 실시형태에서, 본 발명의 하나 이상의 제제의 유효량을 대상체에게 환부에 국소적으로 투여하여 장애 또는 이의 증상을 예방하고/하거나, 치료하고/하거나, 관리하고/하거나, 완화한다.
다른 실시형태에서, 제제는 제어 방출 또는 지연 방출 시스템으로 전달할 수 있다. 한 실시형태에서, 펌프를 이용하여 제어 또는 지연 방출을 달성할 수 있다(문헌[Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574]을 참조한다). 다른 실시형태에서, 중합체 물질을 사용하여 본 발명의 치료요법의 제어 또는 지연 방출을 달성할 수 있다(예를 들면, 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61]을 참조하고; 또한, 문헌[Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); U.S. Pat. 제5,679,377호; U.S. Pat. 제5,916,597호; U. S. Pat. 제5,912,015호; U.S. Pat. 제5,989,463호; U.S. Pat. 제5,128,326호; PCT 공보 제WO99/15154호; 및 PCT 공보 제WO99/20253호]을 참조한다). 지연 방출 제형에 사용된 중합체의 예로는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜라이드(PLG), 다가 무수물, 폴리(N-비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락타이드(PLA), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA), 및 폴리오르토에스테르가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시형태에서, 지연 방출 제형에 사용된 중합체는 불활성이고, 침출가능한 불순물을 포함하지 않고, 보관시 안정하고, 멸균성이고, 생체분해성이다. 또 다른 실시형태에서, 제어 또는 지연 방출 시스템을 예방학적 또는 치료학적 표적의 부근에 위치시킬 수 있고, 따라서, 전신 용량의 분획만이 요구된다(예를 들면, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]을 참조한다).
제어 방출 시스템은 Langer(1990, Science 249:1527-1533)에 의한 검토에서 논의된다. 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 기술을 이용하여 본 발명의 하나 이상의 제제를 포함하는 지연 방출 제형을 생산할 수 있다. 예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제4,526,938호, PCT 공보 WO91/05548, PCT 공보 WO96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy &Oncology 39:179-189; Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; and Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759- 760]을 참조하고, 문헌의 각각은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 상기 기술된 제제를 암호화하는 핵산이고, 핵산을 적절한 핵산 발현 벡터의 부분으로서 작제하고, 예를 들면, 레트로 바이러스 벡터의 사용에 의해(U.S. Pat. 제4,980,286호), 또는 직접적 주사에 의해, 또는 미세입자 봄바르드먼트(예를 들면, 유전자 총; Biolistic, Dupont) 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제로의 코팅에 의해, 또는 핵에 유입되는 것으로 공지되어 있는 호메오박스-유사 펩타이드에의 링크에 투여함에 의해 이를 세포내에 존재하도록 투여함으로써, 핵산을 생체내 투여하여 이의 암호화된 항체의 발현을 촉진시킬 수 있다(예를 들면, 문헌[Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868]을 참조한다). 대안으로, 핵산을 세포내 도입할 수 있고, 동종 재조합에 의한 발현을 위해 숙주 세포 DNA 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화한다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예를 들면, 정맥내, 피부내, 피하, 경구, 비내(예를 들면, 흡입), 경피(예를 들면, 국부), 경점막, 및 직장 투여가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 몇몇의 실시형태에서, 흡입은 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하기 위해 기화장치의 사용을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 사람에게의 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비내, 또는 국소 투여에 적당한 약제학적 조성물로서 일상적 절차에 따라 제형화한다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 당해 조성물은 또한 가용화제 및 국소 마취제, 예를 들면, 리그노카인을 포함하여 주사 부위에서의 통증을 진정시킬 수 있다.
본 발명의 조성물이 국소적으로 투여되는 경우, 당해 조성물은 당해 분야에 공지되어 있는 연고, 크림, 경피 패치, 로션, 겔, 샴푸, 스프레이, 에어로졸, 용액, 유제, 또는 다른 형태의 형태로 제형화할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)]을 참조한다. 분무불가능한 국소 용량형의 경우, 국소 적용에 적합한 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하고 물보다 큰 역학적 점성을 갖는 점성 내지 반-고체 또는 고체 형태를 전형적으로 사용한다. 적합한 제형으로는 한정 없이 용액, 현탁액, 유액, 크림, 연고, 분말, 도찰제, 및 살브제 등이 포함되고, 이는 원하는 경우 멸균하거나, 각종 특성, 예를 들면, 삼투압에 영향을 미치기 위한 보조제(예를 들면, 보존제, 안정화제, 습윤제, 완충제 또는 염)와 혼합한다. 다른 적합한 국소적 용량형으로는 분무가능한 에어로졸 제제가 포함되고, 여기서, 예를 들면, 고체 또는 액체 불활성 담체와의 조합으로의 활성 성분을 가압된 휘발물질(예를 들면, 기체 추진제, 예를 들면, 프레온)과의 혼합물에 또는 스퀴즈 보틀(squeeze bottle)에 패키징한다. 보습제 또는 습윤제도 원하는 경우에 약제학적 조성물 및 용량형에 첨가할 수 있다. 이러한 추가의 성분의 예는 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
본 발명의 방법이 조성물의 비내 투여를 포함하는 경우, 상기 조성물은 에어로졸 형태, 스프레이, 미스트로 또는 드롭제의 형태로 제형화할 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 사용하기 위한 예방학적 또는 치료학적 제제는 적합한 추진제(예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로-플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소, 또는 다른 적합한 기체)의 사용과 함께 가압 팩 또는 네뷸라이저로부터 에어로졸 스프레이 상품의 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 용량 단위는 측정된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캡슐 및 카트리지(예를 들면, 젤라틴으로 이루어짐)는 화합물의 분말 혼합물 및 적합한 분말 기재, 예를 들면, 락토스 또는 전분을 함유하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 방법이 경구 투여를 포함하는 경우, 조성물은 정제, 캡슐, 샤세, 겔캡, 용액, 및 현탁액 등의 형태로 경구 제형화될 수 있다. 정제 또는 캡슐은 약제학적으로 허용되는 부형제, 예를 들면, 결합제(예를 들면, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예를 들면, 락토스, 미세결정 셀룰로스, 또는 칼슘 수소 포스페이트); 윤활제(예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 또는 실리카); 붕해제(예를 들면, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트)와 함께 종래 수단에 의해 제조할 수 있다. 정제는 당해 분야에 익히 공지되어 있는 방법에 의해 코팅할 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제제는 이들에 한정되지 않지만 용액, 시럽, 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 이들은 사용하기 전에 물 또는 다른 적합한 비히클과의 구성(constitution)을 위한 건조 생성물로서 제시될 수 있다. 이러한 액체 제제는 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들면, 현탁제(예를 들면, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체, 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예를 들면, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예를 들면, 아몬드 오일, 오일 에스테르, 에탄올 알콜, 또는 분획화된 식물성 오일); 및 보존제(예를 들면, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 함께 종래 수단에 의해 제조할 수 있다. 또한, 당해 제제는 완충염, 향미제, 착색제 및 감미제를 적절하게 함유할 수 있다. 경구 투여를 위한 제제는 예방학적 또는 치료학적 제제(들)의 느린 방출, 제어된 방출, 또는 지연된 방출을 위해 적합하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은, 예를 들면, 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용에 의해 에어로졸화 제제로 제형화된 조성물의 폐 투여를 포함할 수 있다. 예를 들면, 문헌[U.S. Pat. 제6,019,968호; 제5,985,320호; 제5,985,309호; 제5,934,272호; 제5,874,064호; 제5,855,913호; 제5,290,540호; 및 제4,880,078호; 및 PCT 공보 제WO 92/19244호; 제WO 97/32572호; 제WO 97/44013호; 제WO 98/31346호; 및 제WO 99/66903호]을 참조하고, 상기 문헌의 각각은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체 및/또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 이용하여 투여한다.
본 발명의 방법은 주사에 의한(예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한) 비경구 투여를 위해 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 주사용 제형은, 첨가된 보조제와 함께 단위 용량형으로(예를 들면, 앰플로 또는 다중 용량 컨테이너로) 제시될 수 있다. 당해 조성물은 오일 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유액과 같은 이러한 형태를 취할 수 있고, 제형화 제제, 예를 들면, 현탁화, 안정화 및/또는 분산화 제제를 함유할 수 있다. 대안으로, 활성 성분은 사용하기 전에 적합한 비히클(예를 들면, 멸균 발열원-불포함 물)과의 구성을 위한 분말 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 방법은 데포(depot) 제제로서 제형화된 조성물의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 장기 작용성 제형은 (예를 들면, 피하 또는 근육내) 이식에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 당해 조성물은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용가능한 오일 중의 유액으로서) 또는 이온 교환 수지로 또는 난용성 유도체로서(예를 들면, 난용성 염으로서) 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 중성 또는 염 형태로서 제형화된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염으로는 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 음이온과 같은 음이온으로 형성된 염, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화 철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 양이온과 같은 양이온으로 형성된 염이 포함된다.
일반적으로, 조성물의 성분은 개별적으로 공급되거나 또는 단위 용량형, 예를 들면, 활성제의 양이 표시된 앰플 또는 샤세와 같은 용봉된 컨테이너 내의 동결건조된 건조 분말 또는 무수 농축물로서 함께 혼합된다. 투여 방식이 주입인 경우, 조성물은 멸균 약제학적 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 조제될 수 있다. 투여 방식이 주사에 의한 것인 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플은 투여하기 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 제공할 수 있다.
특히, 본 발명은 또한 본 발명의 제제들 또는 약제학적 조성물들 중 하나 이상이 용봉된 컨테이너 내에 패키징된 것, 예를 들면, 항체의 양이 표시된 앰플 또는 샤세를 제공한다. 한 실시형태에서, 본 발명의 제제들 또는 약제학적 조성물들 중 하나 이상은 용봉된 컨테이너 내의 멸균 동결건조된 건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급되고, 대상체에게의 투여를 위해 (예를 들면, 물 또는 염수를 이용하여) 적절한 농도로 재구성될 수 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 제제들 또는 약제학적 조성물들 중 하나 이상은 용봉된 컨테이너 내에 멸균 동결건조된 건조 분말로서 적어도 5mg, 예를 들면, 적어도 10mg, 적어도 15mg, 적어도 25mg, 적어도 35mg, 적어도 45mg, 적어도 50mg, 적어도 75mg, 또는 적어도 100mg의 단위 용량으로 공급된다. 상기 동결건조된 제제 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 이의 본래 컨테이너에서 2℃ 내지 8℃에서 보관되어야만 하고, 본 발명의 제제들 또는 약제학적 조성물들은 재구성된 후에 1주 내에, 예를 들면, 5일 내에, 72시간 내에, 48시간 내에, 24시간 내에, 12시간 내에, 6시간 내에, 5시간 내에, 3시간 내에, 또는 1시간 내에 투여되어야만 한다. 대안의 실시형태에서, 본 발명의 제제들 또는 약제학적 조성물들 중 하나 이상은 항체의 양 및 농도가 표시된 용봉된 컨테이너 내의 액체 형태로 공급된다. 추가의 실시형태에서, 액체 형태의 투여된 조성물은 용봉된 컨테이너 내에 적어도 0.25mg/ml, 예를 들면, 적어도 0.5mg/ml, 적어도 1mg/ml, 적어도 2.5mg/ml, 적어도 5mg/ml, 적어도 8mg/ml, 적어도 10mg/ml, 적어도 15mg/ml, 적어도 25mg/ml, 적어도 50mg/ml, 적어도 75mg/ml 또는 적어도 100mg/ml로 공급된다. 상기 액체 형태는 이의 본래 컨테이너 내에서 2℃ 내지 8℃에서 보관되어야만 한다.
본 발명의 제제는 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물 내에 포함될 수 있다. 한 양상에서, 제제는, 0.1 내지 250mg/ml의 항체를 함유하는 주사가능한 용액으로서 제조될 것이다. 주사가능한 용액은 플린트(flint) 또는 갈색 바이알, 앰플 또는 사전-충전된 시린지 내의 액체 또는 동결건조된 용량형으로 이루어질 수 있다. 완충액은 pH 5.0 내지 7.0(임의로 pH 6.0)의 L-히스티딘(1 내지 50mM), 임의로 5 내지 10mM일 수 있다. 다른 적합한 완충액으로는 나트륨 석시네이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 포스페이트 또는 칼륨 포스페이트가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 염화 나트륨을 이용하여 용액의 등장성(tonicity)을 0 내지 300mM(액체 용량형의 경우 임의로 150mM)의 농도로 변경시킬 수 있다. 동결건조된 용량형에 동결보호제, 원칙적으로 0 내지 10% 슈크로스(임의로 0.5 내지 1.0%)가 포함될 수 있다. 다른 적합한 동결보호제로는 트레할로스 및 락토스가 포함된다. 동결건조된 용량형에 벌킹제(bulking agent), 원칙적으로 1 내지 10%의 만니톨(임의로 2 내지 4%)가 포함될 수 있다. 안정화제는 액체 및 동결건조된 용량형 둘 다에 대해 원칙적으로 1 내지 50mM의 L-메티오닌(임의로 5 내지 10mM)을 사용할 수 있다. 다른 적합한 벌킹제로는 글리신, 아르기닌이 포함되고, 0 내지 0.05%의 폴리소르베이트-80(임의로 0.005 내지 0.01%)로서 포함될 수 있다. 추가의 계면활성제로는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 주사가능한 용액으로서 제조된 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 보조제로서 유용한 제제, 예를 들면, 항체의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 사용되는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 특히 유용한 보조제는 히알루로니다제, 예를 들면, Hylenex®(재조합 사람 히알루로니다제)이다. 주사가능한 용액 중의 히알루로니다제의 첨가는 비경구 투여, 특히, 피하 투여에 따른 사람 생체이용률을 향상시킨다. 또한, 이는 보다 적은 통증 및 불편감으로 보다 큰 주사 부위 체적(즉, 1ml 초과), 및 주사 부위 반응의 최소 발생을 가능하게 한다. (본원에 인용에 의해 포함된 문헌[국제 출원 공개 제WO 04/078140호 및 U.S. 특허 출원 공보 제2006104968호]을 참조한다.)
본 발명의 조성물은 각종 형태로 존재할 수 있다. 이들로는, 예를 들면, 액체, 반-고체 및 고체 용량형, 예를 들면, 액체 용액(예를 들면, 주사가능한 용액 및 주입가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 분말, 리포솜, 및 좌제가 포함된다. 바람직한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료학적 적용에 의존한다. 조성물은 주사가능한 또는 주입가능한 용액의 형태, 예를 들면, 다른 항체를 이용한 사람 또는 포유동물(예를 들면, 소, 개, 말, 고양이 및 돼지)의 수동적 면역화 사용된 것과 유사한 조성물로 존재할 수 있다. 한 실시형태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여한다. 다른 실시형태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여한다.
치료학적 조성물은 전형적으로 멸균되어야만 하고, 제조 및 보관 조건 하에 안정해야만 한다. 상기 조성물은 용액, 미세유액, 분산액, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정돈된 구조로서 제형화될 수 있다. 멸균의 주사가능한 용액은, 필요에 따라 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합을 갖는 적절한 용매 중에 활성 화합물(즉, 결합 단백질, 예를 들면, 본 발명의 제제)을 필요량으로 포함시키고, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은, 염기성 분산액 매질 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 동결건조된 분말의 경우, 제조 방법은, 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 분무-건조를 포함한다. 용액의 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 지연된 흡수는 조성물 중에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
본 발명의 제제는 당해 분야에 공지되어 있는 각종 방법에 의해 투여될 수 있다. 다수의 치료학적 적용을 위해, 투여의 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사, 흡입, 또는 주입일 수 있다. 당해 분야 숙련가에 의해 이해될 것인 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 다를 것이다. 소정 실시형태에서, 활성 화합물은 화합물이 신속하게 방출되는 것에 대해 보호할 것인 담체와 함께 제조될 수 있고, 예를 들면, 이식물, 경피 패치 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형이다. 생체분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 제형의 다수의 제조 방법은 특허되어 있거나 당해 분야 숙련가들에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 제제는, 예를 들면, 불활성 희석제 또는 소화가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 제제(및 바람직한 경우 다른 성분)는 또한 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐 내에 밀봉되거나, 정제로 압축되거나, 대상체의 식이에 직접적으로 포함될 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위해, 당해 제제는 부형제와 포함될 수 있고, 소화가능한 정제, 협측 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽제 및 웨이퍼제 등의 형태로 사용된다. 비경구 투여 이외의 다른 투여에 의해 본 발명의 제제를 투여하기 위해, 당해 제제를 이의 불활성화를 방지하기 위한 물질로 코팅하거나 당해 제제를 이의 불활성화를 방지하기 위한 물질과 공동-투여할 필요가 있을 수 있다.
소정 실시형태에서, 본 발명의 제제는 당해 분야에 공지되어 있는 반감기 연장 비히클에 링크된다. 이러한 비히클로는 Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 비히클은, 예를 들면, 문헌[U.S. 출원 일련번호 제09/428,082호 및 공개된 PCT 출원 제WO 99/25044호]에 기술되어 있고, 상기 문헌은 임의의 목적을 위해 본원에 인용에 의해 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 제제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열을 투여하여 유전자 치료요법의 방식에 의해 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하거나 관리하거나 완화시킨다. 유전자 치료요법은 대상체에게의 발현되거나 발현가능한 핵산의 투여에 의해 수행되는 치료요법을 말한다. 본 발명의 이러한 실시형태에서, 핵산은, 예방학적 또는 치료학적 효과를 매개하는 본 발명의 이들의 암호화된 제제를 생산한다.
당해 분야에서 이용가능한 유전자 치료요법을 위한 방법들 중 임의의 방법은 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 유전자 치료요법의 방법의 일반적 검토를 위해, 문헌[Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); 및 Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술의 당해 분야에 통상적으로 공지되어 있는 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기술되어 있다. 유전자 치료요법의 각종 방법의 상세한 설명은 본원에 인용에 의해 포함되어 있는 문헌[US20050042664 A1]에 개시되어 있다.
본 발명의 제제는, 통증과 관련된 질환 또는 병태, 또는 RGMa 또는 네오제닌과 관련된 임의의 기타 질환 또는 병태를 치료하기 위해 단독으로 또는 조합으로 사용할 수 있다. 상기 조합이 이들의 의도된 목적에 유용한 조합임이 추가로 이해되어야만 한다.
약제학적 조성물은 본 발명의 제제의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료학적 결과를 달성하는데 필요한 용량으로 그리고 필요한 시간 동안에 유효한 양을 말한다. 당해 제제의 치료학적 유효량은 당해 분야 숙련가에 의해 결정될 수 있고, 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자들 및 개체에서의 원하는 반응을 유발시키는 항체의 능력에 따라 다를 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 당해 제제의 독성 또는 유해 효과가 존재하는 경우 치료학적으로 이로운 효과가 보다 더 큰 것이다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 결과를 달성하는데 필요한 용량으로 그리고 필요한 시간 동안에 유효한 양을 말한다. 전형적으로, 예방학적 용량은 질환의 초기 단계 전의 또는 질환의 초기 단계의 대상체에서 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 더 적을 것이다.
투약 용법은 최적의 원하는 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 몇몇의 분할 용량을 시간에 걸쳐 투여할 수 있거나, 용량은 치료학적 상황의 긴급함에 의해 나타나는 바에 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이함 및 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 용량 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용량 단위 형태는 치료되는 포유동물 대상체를 위한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 말하고; 각각의 단위는 요구되는 약제학적 담체와 함께 원하는 치료학적 효과를 생산하는 것으로 계산된 소정 양의 활성 화합물을 함유한다. 용량 단위 형태에 관한 명세서는 (a) 활성 화합물의 고유한 특성 및 달성되는 특정 치료학적 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체에서의 민감성 치료를 위한 이러한 활성 화합물의 합성 분야에 내재하는 제한에 의해 구술되고 이들에 직접적으로 의존한다.
당해 제제의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 예시의 비-제한적 범위는 0.1 내지 200mg/kg, 예를 들면, 0.1 내지 10mg/kg의 용량이다. 당해 제제의 치료학적 또는 예방학적 유효량은 1 내지 200mg/kg, 10 내지 200mg/kg, 20 내지 200mg/kg, 50 내지 200mg/kg, 75 내지 200mg/kg, 100 내지 200mg/kg, 150 내지 200mg/kg, 50 내지 100mg/kg, 5 내지 10mg/kg, 또는 1 내지 10mg/kg일 수 있다. 용량 값은 완화되는 병태의 유형 및 중증도에 따라 다를 수 있음에 주의해야 한다. 추가로, 제제 용량은 당해 분야 숙련가에 의해 결정될 수 있고, 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자들 및 개체에서 원하는 반응을 유발시키는 제제의 능력에 따라 다를 수 있다. 용량은 또한 당해 제제의 독성 또는 유해 효과가 존재하는 경우 치료학적으로 이로운 효과가 보다 더 큰 것이다. 임의의 특정 대상체의 경우 특정 투약 용법이 개체의 요구 및 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 지도하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간에 걸쳐 조정되어야만 한다는 것, 그리고, 본원에 제시되는 용량 범위는 단지 예시적인 것이고 특허청구된 조성물의 범위 또는 실행을 한정하도록 의도되는 것은 아님이 추가로 이해되어야 한다.
5. 실시예
실시예 1
실시예 2 내지 실시예 11에 관한 재료 및 방법
하기 실시예 2 내지 실시예 11에 기술되는 실험에서 사용되었던 재료 및 방법이 여기 실시예 1에 제공된다.
망막 외식편 과성장 검정 및 면역 공동국소화. 폴리-L-리신(SIGMA; 10㎍/ml) 코팅된 유리 커버슬립을 라미닌(Invitrogen; 10㎍/ml) 및 RGMa 단백질(5㎍/ml)로 처리하였고, 실온에서 3시간 동안 항온배양하였다. 측두 망막 외식편을 단백질-코팅된 표면 상에서 18시간 동안 배양하였다. 지질 래프트를 방해하기 위해서, 외식편을 10mM 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD)로 12분 동안 또는 2U/ml 콜레스테롤 옥시다제(CO)로 1시간 동안 37℃에서 전처리하였다. 이어서, 이식편을 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시켰고, 알렉사488-팔로이딘으로 염색하였다. 섬유 길이는 Image Pro 5.0을 이용하여 정량하였다. 면역 국소화를 위해, 이식편을 콜레라 독소 B-FITC(C1655; Sigma; 10mg/mL)로 처리하였고, 패칭하였고, 고정시켰고, 네오제닌 항체로 염색하였다. 망막 신경절 세포(RGC)를 RGMa-His로 전기천공하고, 18시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 고정시켰고 네오제닌 및 His-태그 항체로 염색하였다.
세포 및 시개의 지질 래프트 분획화 . 주사된 병아리 E8 시개(4Ig, 2mg/mL; N-래프트, 1mg/mL; 메틸-β-사이클로덱스트린(10mM)) 또는 형질감염된 세포(네오제닌 및 RGMa)를 24시간 후에 수집하였고, 용해시켰고, 슈크로스 밀도 농도구배의 바닥에 위치시켰고(0.9-0.8-0.75-0.7-0.6-0.5-0.4-0.2M), SW 60 회전기(Beckman Instruments Inc.)에서 38,000rpm으로 16시간 동안 원심분리하였다.
척수 손상(SCI). 척수는 20g의 힘으로 척수 수준 T8에서 클립 압박에 의해 손상되었다. SCI 직후에 4Ig 또는 비히클을 척추내 주사하였다. 2회의 주사(250ng/μL, 각각 3μL)가 병변 부위에 대해 1mm 문측 및 1mm 미측이고 정중선 정맥(midline vein)에 인접하게 이루어졌다. SCI 직후, 4Ig 치료된 래트는 또한 1mg/kg 용량의 4Ig를 내경정맥을 통해 정맥내(i.v.) 투여받았고, 후속적으로 2주 이상 동안 매주 i.v. 주사를 투여받았다. MβCD 그룹의 래트는 SCI 직후에 MβCD의 복강내(i.p.) 주사를 1000mg/kg/주로 투여받았고, 이어서, 희생되기까지 매일 i.p. 주사를 투여받았다. 대조군 래트는 상기 기술된 등가의 비히클 체적을 투여받았다.
척수강내 주입. 4Ig의 국소 전달을 평가하기 위해, 19마리의 성체 암컷 위스타(Wistar) 래트를 손상시켰고, 병변 부위 문측 및 미측에 4Ig 또는 PBS를 주사하였다. 척추내 주사 직후, 4Ig 또는 PBS를 척수강내 전달하였고, 이어서, 연속적으로 카테터 및 펌프 시스템을 통해 (0.5μL/시간) 14일 동안 전달하였다.
기능적 분석. 기능 시험은 손상 전, SCI-후 1일, 및 이어서, 6주 동안 매주 수행하였다. 운동 기능은 BBB 운동 평정 척도(locomotor rating scale)를 이용하여 평가하였다. 0의 스코어는 뒷다리 움직임이 없음을 나타내고, 21의 스코어는 대조군에서 관찰되는 바와 같은 손상되지 않은 운동성을 나타낸다. 운동 서브스코어는 측정하여 발가락 제거, 우세한 발바닥 위치 및 불안정성의 부재를 평가하였다. 7의 최대 운동 서브스코어는 정상 운동성을 의미한다.
사다리-걷기(Ladder-walk) 분석을 수행하여 미세 운동 기능을 평가하였다. SCI-후 1주째에 그리고 그 후로 매주, 10 초과의 BBB 스코어를 갖는 래트를 수평 사다리-걷기 장치에 두고 3회의 시험을 기록하였다. 기록값을 슬로우 모션(slow motion)으로 분석하였고; 뒷다리당 발걸음 수를 기록하였고, 각각의 래트에 대해 주당 평균을 계산하였다.
단백질의 클로닝 및 정제. 네오제닌의 Ig 도메인(4Ig) 및 DCC의 Ig 도메인(4Ig)를 N-말단에 6-His 태그를 갖는 pSectag 2B 벡터(Invitrogen)에 그리고 C-말단에 벡터의 myc 및 6-His 태그를 갖는 프레임에 클로닝하였다. N-RGMa 작제물, N-RGMa28-73(N-래프트), N-RGMa50 -99, 및 N-RGMa77 -113(N-inh.)는, C-말단에 myc 태그 및 6-His 태그도 함유한 N-RGMa77 -113을 제외하고는 N-말단에서 6-His 태그로 모두 클로닝하였다. 세포를 형질감염시켰고, 48hr 후에 배지를 수집하였고, Ni-NTA 비드 상에서 제조업자의 프로토콜(Qiagen)에 따라 정제하였다. 모든 검정에 사용하기 전에 PBS 중에서 단백질을 투석시켰다.
망막 외식편 과성장 검정. 폴리-L-리신(PLL; SIGMA; 10㎍/ml) 코팅된 유리 커버슬립을 라미닌(10㎍/ml; Invitrogen) 및 RGMa 단백질(5㎍)로 처리하였고, 실온에서 3시간 동안 항온배양하였다. PLL 처리된 커버슬립을 미엘린으로 밤새 코팅하였고(6㎍/㎠), 이어서, 라미닌으로 코팅하였다. 측두 망막 외식편을 DMEM F-12 배지(2% 병아리 혈청, 10% FBS) 중의 미엘린 또는 단백질-코팅된 표면 상에서 18시간 동안 배양하였다. 래프트를 방해하기 위해서, 외식편을 10mM의 MβCD로 12분 동안 또는 2U/ml의 CO로 1시간 동안 37℃에서 전처리하였고, 세척하였고, 단백질 코팅된 커버슬립 상에서 배양하였다. 이어서, 이식편을 4% PFA로 고정시켰고, 알렉사488-플루오르-팔로이딘(1:50; Molecular Probes)으로 염색하였다. 섬유 길이는 Image Pro 5.0을 이용하여 정량하였다.
풀-다운(Pull-down) 검정. 단백질을 활성화된 CNBr 세파로스 비드(Pharmacia)에 공급자의 지침에 따라 커플링시켰다. 형질감염된 세포 유래의 상청액을 실온(RT)에서 2h 동안 커플링된 비드에 첨가하였다. 이어서, 비드를 PBS + 0.02% Tween 20으로 6x 세척하였고, SDS 부하 완충액을 첨가하였다. 샘플을 끓이고, 웨스턴 블롯팅을 행하였다.
HEK 세포 및 시개의 지질 래프트 분획화. 단백질(4Ig, 2mg/ml; N-래프트, 1mg/mL; RGMaΔ, 5mg/ml; 메틸-β-사이클로덱스트린(10mM))을 병아리 E8 시개에 주사하였고, 24시간 후에 수집하였다. HEK 세포를 네오제닌 및 상이한 RGMa 작제물로 형질감염시켰고, 48hr 후에 수집하였다. RGMaΔ로의 치료를 위해, 네오제닌 형질감염된 세포를 RGMaΔ(2mg/ml) 및 BMP-2(100nM)로 치료하였고, 37℃에서 1hr 동안 추가로 항온배양하였다. 시개(각 세트의 실험에 대해 3개의 시개) 및/또는 세포를 냉경된 완충액(25mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM EDTA 및 프로테아제 억제제 칵테일)에 용해시켰고, 각각 G25 및 G30 니들을 통과시켰고, 4℃에서 10min 동안 800g에서 원심분리하였다. 냉 Triton X-100을 후 핵 상청액(post nuclear supernatant)에 첨가하여 1%의 최종 농도로 하였고, 1시간 동안 빙상에서 항온배양하였다. 2X 체적의 2M 슈크로스를 첨가하였고, 샘플을 슈크로스 밀도 농도구배의 바닥에 위치시켰고(0.9-0.8-0.75-0.7-0.6-0.5-0.4-0.2M), SW 60 회전기(Beckman Instruments Inc.)에서 38,000rpm으로 16시간 동안 원심분리하였다. 400μl의 분획을 상부(상부를 1로 번호매기고, 다음 8개의 분획을 연속적으로 번호매김)로부터 수집하였고, -80℃에서 보관하였다.
난내(in ovo ) 전기천공 및 DiI 추적. 난(백색 레그혼)을 고습도의 챔버 내의 38℃에서 항온배양하였다. 소량의 바이러스 용액(1 x 108IU/ml의 바이러스 역가)을 1/10 체적의 0.25% 패스트 그린 용액(fast green solution)(Molecular Probes)과 혼합하였고, E1.5에서 시개에 주사하였다. 작은 DiI 결정(Molecular Probes)가 우안의 측두-배면(temporo-dorsal) 부분에 위치한 경우에 난을 E15까지 추가로 항온배양하였다. E17에서, 배아를 희생시켰고, 시개를 4% PFA에 고정시켰다. 상기 시개를 반으로 자른 후 현미경(Olympus BX61) 하에 DiI 추적을 보았다. 시개의 디지털 화상을 촬영하였고, 포토샵(Adobe)을 이용하여 프로세싱하였다. 대안으로, 플라스미드 작제물을 안포로 전기천공하여 눈에의 발현을 제한하였고, 상기와 같이 추적을 수행하였다.
통계학적 분석. 망막 과성장 검정의 통계학적 분석은 엑셀(Microsoft)을 이용한 스튜던츠 양측 t-시험(Student's two-tail t-test)을 이용하여 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM(n=적어도 3회의 독립적 실험; 독립적 실험당 2개의 복제물, 복제물당 10개 초과의 외식편)으로서 나타내어졌다.
면역공동국소화 프로토콜. 망막 외식편을 37℃에서 18시간 동안 라미닌 상에서 배양하였고, 콜레라 독소 B-FITC(C1655; Sigma; 10mg/mL)로 처리하였고, 이어서, 항-콜레라 독소 B 항체(ab5988; abcam; 1:1000)로 패칭하였고, 4% PFA 중에 고정시켰다. 공동-국소화를 위해 네오제닌으로 염색하고, 외식편을 5% FBS/PBS로 차단하였고, 네오제닌 항체(H-175; Santa Cruz; 1:200)와 항온배양하였고, 이어서, 항-토끼 알렉사 555 2차 항체(분자 프로브; 1:250)와 항온배양하였다. 콜레라 독소 및 F-액틴의 공동-국소화를 위해, 이식편을 콜레라 독소로 처리하였고, 상기와 같이 패칭하였고, 알렉사555-플루오르-팔로이딘으로 염색하였다. 네오제닌 및 RGMa-His의 공동-국소화를 위해, DRG 뉴런을 병아리 E8 배아로부터 제조하였고, Amaxa Nucleofector Kit(Lonza)를 이용하여 RGMa-His로 전기천공하였고, 라미닌 코팅된 커버슬립 상에 플레이팅하였고, 18hr 동안 배양하였다. 세포를 고정시켰고, 세척하였고, 5% FBS 중에 차단하였고, 네오제닌(H-175; Santa Cruz; 1:200) 및 His 항체(abm; 1:1000)로 공동-염색하였다. DRG를 항-토끼 알렉사 555 및 항-마우스 알렉사 488 항체(분자 프로브; 1:250)와 함께 항온배양하였다.
화상 분석. 망막 신경절 세포 및 DRG 뉴런의 성장 원추를 Olympus BX61 현미경으로 화상 촬영하였다. 적색(네오제닌) 및 녹색(콜레라 독소 B 또는 RGMa) 채널 둘 다에서 Z 스택 화상을 촬영하였고, 프로그램의 "maximum projection over z(z에 대해 최대 투사)" 특성을 사용함으로써 단일층으로 합하였다. 2개의 색의 공동국소화의 정도는 "강도 상관관계 분석 플러그인을 이용한 Image J(Image J with intensity correlation analysis plugin)"를 이용하여 정량하였다. 강도 상관관계 분석(ICA)은 2개의 채널의 강도들이 동시성(의존적 염색) 또는 비동시성(분리된 염색)에서 변하였는지를 측정하였다.
정량적 공동- 국소화 분석. 강도 상관관계 분석(ICA) 플러그인(WCIF ImageJ)을 이용한 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 정량적 공동국소화 분석을 수행하였다. ICQ 값은 -0.5 내지 +0.5의 범위이다. 무작위 염색: ICQ 약 0; 분리된 염색: 0> ICQ > -0.5; 의존적 염색: 0< ICQ <+0.5. 부호 검정의 정상 근사법(normal approximation)(P 부호 검정)의 수단에 의해 유의성에 대한 시험을 수행하였다.
세포 사멸 검정. RGMa를 안정하게 발현시킨 HEK293 세포를 이 검정에 사용하였다. 네오제닌 발현 플라스미드(1㎍/μl)의 일시적 형질감염을 리포펙타민 2000을 이용하여 수행하였다. 형질감염 후, 세포를 5% CO2 중에서 24h 동안 항온배양하였고, 트립판 블루(SIGMA) 염색을 수행하여 세포 사멸을 평가하였다.
해리된 망막 신경절 세포 구제 검정. 해리된 망막 신경절 세포를 E7 병아리 배아로부터 제조하였다. 망막을 HBSS에서 절개하였고, 트립신처리하였고, 10% 소 혈청 및 N2 보충물을 갖는 DMEM/F12 배지 중에서 배양하였다. nuclefector 키트(Amaxa Chicken Neuron Nucleofector kit, Lonza)를 이용하여 세포를 pFRP 대조군 shRNA, 병아리 RGMa에 대한 shRNA 37, 및 shRNA 37 및 마우스 RGMa 둘 다로 뉴클레오펙션시켰다. 세포를 라미닌(10㎍) 또는 N-RGMa(10㎍), C-RGMa(10㎍) 또는 RGMaΔ(20㎍) 단백질을 갖는 라미닌으로 코팅된 커버슬립 상에 플레이팅하였고, 18hr 동안 성장시켰다. 세포를 4% 파라포름알데하이드 중에 고정시켰고, β-튜불린 항체(Covance; 1:1000)로 RT에서 1시간 동안 염색시켰고, 이어서, 알렉사 플루오르488 염소 항 마우스 2차 항체를 RT에서 1시간 동안 사용하였다. 형질감염된 세포의 화상은 Olympus 형광 현미경(BX61)을 이용하여 촬영하였다. 형질감염된 세포의 축삭의 길이는 cellSens(Olympus)을 이용하여 각각의 조건(적어도 40개의 세포/조건/실험)으로부터 측정하였다.
해리된 망막 신경절 세포의 성장 원추에서의 RGMa 의 염색. 성장 원추에서의 RGMa 사일런싱을 나타내기 위해서, 해리된 망막 신경절 세포를 상기와 같이 제조하였고, 전부 RFP를 발현하는 shRNA 37 및 21 및 대조군 shRNA로 뉴클레오펙션시켰다. 뉴클레오펙션된 세포를 라미닌(10㎍/ml)이 코팅된 커버슬립 상에 플레이팅하였고, 배양하였고, 4% 파라포름알데하이드로 18hr 동안 고정시켰고, RGMa 항체(7A2: RGMa의 C 말단부를 표적으로 하는 하이브리도마 세포로부터의 상청액)를 이용하여 4℃에서 밤새 염색하였다. 세포를 RT에서 1hr 동안 알렉사-플루오르 488 항-마우스 2차 항체와 추가로 항온배양하였다. 뉴클레오펙션된 망막 신경절 세포로부터의 성장 원추는 Olympus 형광 현미경(BX61)을 이용하여 화상 촬영하였다.
RGMa 하향조절의 웨스턴 블롯 분석. HEK 세포를 PEI(Polysciences Inc.)를 이용하여 HIS 항체 및 대조군 shRNA, shRNA 37, shRNA 21로 태그된 병아리 RGMa 또는 마우스 RGMa로 공동-형질감염시켰다. 세포를 72시간 동안 항온배양하였고, RIPA 완충액 및 프로테아제 억제제 칵테일을 이용하여 용해시켰다. 세포 용해물은 웨스턴 블롯을 실행시켰고, HIS 항체(abm 1:1000)로 RT에서 1hr 동안 프로빙하였다. 오디세이 염소 항 마우스 2차 항체(1:4000; LI-COR)를 RT에서 1hr 동안 사용하였다. 쿠마시 염색을 수행하여 각각의 조건에 대해 동등한 총 단백질 부하를 확실히 하였다.
시신경 압박. 모든 동물은 병원체 불포함 환경에서 유지된 체중 250 내지 300g의 암컷 스프라그-돌리 래트였다. 간략하게, 신경 압박 7일 전에, 동물들은 RGC의 상구(superior colliculus) 표적에 2% 플루오로골드(Fluorogold)의 정위 주사(stereotaxic injection)를 투여받았다. 정위 아암에 부착된 Foredoom Micro Motor 드릴을 이용하여 상구 위 두개골에 양쪽으로 구멍을 뚫었다. 컴퓨터 제어된 Picopump(World Precision Instruments)에 의해 작동되는 10μl 해밀턴 시린지를 이용하여 주사를 행하였다. 각각 3μl의 플루오로골드 용액으로 이루어진 2회의 주사를 500nl/분의 주사 속도로 상구 내에 상이한 깊이로 전달하였다. 각각의 주사 후 10분 동안 니들은 당해 위치에 남겨두고 서서히 철수시켜 주사된 용액이 니들 통로까지 역류하는 것을 방지하였다.
추가로, 압박 신경 수술 절차를 위해, 동물을 정위 프레임 내에 두었고, 가스 마취 마스크를 통해 이소플루란(2%; 0.8L/min O2)을 환기시켰다. 상안연(superior rim of the orbit)에서의 절개를 통해 신경을 평가하였고, 이어서, 위에 놓인 직근의 수축을 평가하였다. 미세 자동-폐쇄 포셉을 이용하여 6초 동안 시신경을 압박하였다. 궁극적으로, 안와 내용물은 이들의 본래 위치로 완만하게 되돌아갔고, 초기 절개를 폐쇄하였다. 수술 후, 가열 램프 하에 동물을 정상체온 조건의 37℃에서 유지하였고, 이들에게 케토프로펜(5mg/mL, 래트에 대한 용량: 0.1mL/100g 체중) 및 멸균 염수를 제공하여 수술 후 회복을 용이하게 하였다.
주사 프로토콜 및 투약. 시신경 압박 후 RGC 생존 및 재생에 대한 4Ig, N-래프트 및 MβCD의 효과를 평가하기 위해, 4μl의 4Ig(250ng/μl) 및 N-래프트(150ng/μl) 용액의 안내 주사를 손상 후 3일 및 10일째에 전달하였다. 추가로, 이들 2개의 그룹은 손상 후 3일 및 10일째에 4Ig 및 N-래프트를 1mg/kg의 용량으로 경정맥을 통해 투여받았다. 별도로, MβCD 그룹의 동물들은 신경 압박 후 3주 동안 1일 1회 스케쥴로 MβCD의 복강내 주사를 1000mg/kg/주로 투여받았다.
안내 주사. 간략하게, 래트를 O2의 혼합물 중의 2% 이소플루란으로 처음으로 마취시켰고, 이어서, 안내 주사 전에 Alcaine 점안액(Alcon)을 이용하여 각막을 마취시켰다. PEEK 튜빙을 통한 수력 커플링(hydraulic coupling)을 통한 10μl 해밀턴 시린지에 부착된 풀링된 유리 마이크로피펫을 사용하여 4Ig, 및 N-래프트 용액을 연곽 후방인 눈의 초자체 방에 전달하였다. 주사 후 5s 동안 피펫을 고정시켰고, 서서히 눈으로부터 철수시켜 역류를 방지하였다. 주사 후, 각막을 안 연고로 덮어 건조함을 방지하였고, 동물을 이들의 정상 하우징에 되돌려 보냈다.
손상 후 RGC 생존의 정량. 동물을 신경 압박 후 21일째에 안락사시켰고, 눈을 적출하였고, 각막 및 수정체를 제거하였고, 망막을 함유하는 나머지 안배를 4% 파라포름알데하이드 중에 1시간 동안 고정시켰다. 이어서, 망막을 제거하였고, 플랫-마운팅하였고(flat-mounted), 50:50 글리세롤/PBS를 이용하여 커버슬립하였다. RGC 중의 플루오로골드 염색은 Leica DM LFSA 현미경에 부착된 Andor iXon 885+ 전자-증배 전하-커플링된 장치 카메라를 이용하여 가시화되었다. 또한, 액체 광 가이드를 갖는 Sutter Lambda XL(Quorum Technologies, Guelph, Canada)을 조명의 공급원으로서 사용하였다. RGC의 밀도는 플랫-마운트의 각각의 사분면의 내부(1/6 망막 이심률), 중간주변부(1/2 망막 이심률), 또는 외부 망막(5/6 망막 이심률)에서(망막의 중심으로부터의 거리로 정의됨) 측정하였다. 이러한 세포 수를 0.08의 인자로 나누어 외삽된 RGC 밀도/세포의 단위 면적/㎟을 수득하였다.
RGC 재생, 망막내 온전성 및 GAP-43 면역조직화학의 정량. 우선, RGC 축삭 재생 및 망막내 온전성을 시신경 압박 후 21일째에 조사하였다. RGC의 전방 표지화는 신경 제거 및 고정화 2일 전에 발생하였고, 전방 추적자 FITC-접합된 콜레라 독소 B형(CTB-FITC)을 눈의 초자체 방에 주사하여 축삭을 능동적으로 추적하였다. CTB-FITC를 축삭 내에서 전방으로 수송하여 시냅스 막에 도달시켰다.
시신경 압박 후 21일째에 RGC 축삭 재생을 조사하였다. 동물을 상행 대동맥을 통해 4% 파라포름알데하이드로 관류시켰고, 한편, 하행 대동맥을 압입(clamped off)하였고, 시신경을 제거하였다. 동일한 고정 용액 중에서 신경을 밤새 후-고정되었고, 또한, 40℃에서 7일 동안 PBS 중의 30% 슈크로스에서 고정되었다. 고정된 신경은 Leica CM1950 크라이오스태트 마이크로톰으로 두께 14㎛로 연속적으로 절편화되었다. 슬라이드는 우선 신생아 및 성인 RGC 둘 다에서 망막 신경절 세포 축삭을 재생시키는 마커인 성장 관련 단백질-43(GAP-43)에 대해 지시된 1차 항혈청 중에서 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 1차 항혈청(토끼 폴리클로날, 1:250, Cell Signaling Technology/NEB)을 0.3% Triton X-100 및 3% 정상 염소 혈청을 함유하는 PBS 중에 희석시켰다. 1차 항체 항온배양 후, 절편을 PBS 중에서 15분 동안 3회 세정하였고, 이어서, 실온에서 FITC 표지된 2차 항체와 함께 3시간 항온배양하였다.
이어서, 50:50 글리세롤/PBS로 커버 슬립핑하기 전에 상기 슬라이드를 PBS 중에서 15분 동안 3회 세정하였다. 압박 부위의 전방에서 시작하여 원위부로 진행되는 시신경의 빈(bin) 내의 재생 축삭 성장 원추의 총 수를 정량하였다. 빈은 하기와 같았다: 0 내지 250, 250 내지 500, 및 500㎛ 초과. 각각의 시신경의 폭에 걸쳐 총 4개의 등간격의 절편을 조사하였고, Emgain 적용된 Andor iXon 885+ 카메라와 Leica DM LFSA 현미경(20×대물렌즈)을 이용하여 정량하였다.
통계학적 분석. RGC의 밀도 및 재생 축삭의 수는 평균 ± SEM으로서 제시되었고, 분산의 일원 분석, 이어서, Tukey 시험으로 분석하였다. RGC의 밀도를 망막 이심률(내부, 중간, 외부)에 의해 그룹핑하였다. p < 0.05인 경우에 차이가 유의한 것으로 고려되었다.
척수 손상. 수술 전에, 32마리의 성체 암컷 위스타 래트(Charles River, St. Constant, QC, 200 내지 300g)를 기저선 행동 평가를 위해 적응시키고 트레이닝시켰다. 래트를 4개의 그룹(n=8/그룹): 1) MBCD(i.p.); 2) 비히클 대조군(i.p.); 3) 4Ig(i.v. 및 척추내); 4) 비히클 대조군(i.v. 및 척추내)으로 나누었다. 산화 질소 및 산소(1:2, v/v)의 혼합물과 2% 이소플루오란의 흡입에 의해 래트를 마취시켰다. 후궁절제술에 의해 척수를 노출시켰고, 20g의 힘으로 척수 수준 T8에서 클립 압박 손상을 제조하였다. 이는 사람 병리를 반영하는 SCI의 임상학적 관련 모델이었다. 4Ig 및 등가의 대조군 그룹에서, SCI 직후에 4Ig 또는 비히클을 척추내 주사하였다. 총 2회의 주사(250ng/μL, 각각 3μL)가 병변 부위에 대해 1mm 문측 및 1mm 미측이고 정중선 정맥(midline vein)에 인접하게 이루어졌다. 주사는, 10μl 해밀턴 시린지 및 커스텀화된 32G 니들을 갖는 전동 마이크로인젝터를 이용한 수술 현미경의 도움으로 1.5μl/분의 속도로 정위적으로 이루어졌다. 주사 후 추가의 2분 동안 니들을 당해 위치에 남겨두어 누출을 방지하였다. 위에 놓인 근육 및 피부를 3-0 바이크릴 봉합사(Johnson and Johnson, Peterborough ON, Canada)로 봉합하였다.
SCI 직후, 4Ig 치료된 래트는 또한 1mg/kg 용량의 4Ig를 내경정맥을 통해 i.v. 투여받았고, 후속적으로 2주 이상 동안 매주 i.v. 주사를 투여받았다. MβCD 그룹의 래트는 SCI 직후에 MβCD의 i.p. 주사를 1000mg/kg/주로 투여받았고, 이어서, 희생되기까지 매일 i.p. 주사를 투여받았다. 대조군 래트는 상기 기술된 등가의 체적을 투여받았다. 자발적 배뇨가 확립될 때까지 매일 3회 수동으로 방광을 평가하였고, 혈뇨 또는 뇨관 감염을 Clavomax(7일 동안 62.5mg PO BID)로 치료하였다. 래트를 12시간 명/암 사이클의 26℃로 온도-제어된 방에 단독으로 하우징하였다. 물 및 음식은 임의 공급하였다.
척수강내 주입. 4Ig의 국소 전달을 평가하기 위한 별도의 실험에서, 19마리의 성체 암컷 위스타 래트를 손상시켰고, 상기 기술된 바와 같이 병변 부위 문측 및 미측에 4Ig 또는 포스페이트-완충된 염수(PBS)를 주사하였다. 척추내 주사 직후, 미니-삼투압 펌프(Alzet 모델 제2002호)에 부착된 폴리우레탄 카테터(Alzet 모델 제0007741호; Alzet Osmotic Pumps, Cupertino, CA)를 통해 4Ig를 척수강내 전달하였다. 233uL의 4Ig(1ug/uL)를 미니-삼투압 펌프에 주사하였다. 동일한 체적의 PBS를 4Ig를 투여받지 않은 동물에서 대조군으로서 사용하였다. 펌프는 37℃에서 밤새 멸균 염수 중에서 프라이밍하였다. 척수강내 공간에 삽입된 카테터를 통해 T9에서 소 정중선 경막절개술이 이루어졌다. 카테터의 끝을 T7 수준에 대해 문측에 지시하였고, 이는 4Ig의 문측 주사 부위에 대해 대략 1mm 문측이었다. 카테터 및 펌프를 피하 조직에 광범위하게 봉합하였다. 이어서, 4Ig 또는 PBS를 카테터 및 펌프 시스템을 통해 14일 동안(0.5uL/hr) 연속적으로 척수강내 전달하였다.
기능적 분석. 기능 시험은 손상 전, SCI-후 1일, 및 이어서, 6주 동안 매주 수행하였다. 운동 기능은 BBB 운동 평정 척도를 이용하여 평가하였다. 래트를 개별적으로 미끄럽지 않은 표면의 노지에 두었고, 치료에 대해 맹검인 2명의 독립적 실험자가 관찰하였고, 4분 동안 뒷다리 운동을 비디오-기록하였고, 관절 운동, 걷는 능력, 조정력(coordination), 발걸음 위치, 및 발가락 제거를 포함하는 동물의 기능을 평가하였다. 0의 스코어는 뒷다리 움직임이 없음을 나타내고, 21의 스코어는 대조군에서 관찰되는 바와 같은 손상되지 않은 운동성을 나타낸다. 운동 서브스코어는 측정하여 발가락 제거, 우세한 발바닥 위치 및 불안정성의 부재를 평가하였다. 7의 최대 운동 서브스코어는 정상 운동성을 의미한다.
장치를 이용하여 사다리-걷기 분석을 수행하여 미세 운동 기능을 평가하였다. SCI-전에 수평 사다리를 건너도록 래트를 1주 동안 트레이닝하였다. SCI-후 1주째에 그리고 그 후로 매주, 10 초과의 BBB 스코어를 갖는 래트를 수평 사다리-걷기 장치에 두고 3회의 시험을 기록하였다. 기록값을 슬로우 모션으로 분석하였고; 뒷다리당 발걸음 수를 기록하였고, 각각의 래트에 대해 주당 평균을 계산하였다. 뒷다리를 끄는 손상된 래트를 12의 최대 발걸음으로 스코어링되었다. 손상되지 않은 래트는 교차(crossing)당 0 또는 때때로 1의 발걸음을 가졌다. 시험에 대한 상대적 성공률을 계산하였다.
조직 제조, 면역염색 및 정량적 분석. SCI 후 매주 행동 평가를 한 후 6주째에 래트를 희생시켰다. 래트를 복강내 나트륨 펜토바르비톨로 깊게 마취시켰고, 0.1M 포스페이트 완충된 염수(PBS), pH 7.4 중의 4% 파라포름알데하이드로 경심 관류하였다. T8에서의 병변 부위를 포함하는 조직의 1.5cm 절편을 절개하였고, 0.1M PBS 중의 30% 슈크로스에서 적어도 24시간 동안 동결보호하였다. 조직을 Shandon Cryomatrix(VWR Laboratories, Mississauga, ON, Canada)에 포매시켰고, 20㎛ 일련의 절편으로 시상주변 저온절단하였다.
나머지 숙주 뉴런을 정량하기 위해, 절편을 NeuN과 면역반응시켰다. 절편을 0.1M PBS 중의 10%(v/v)의 정상 염소 혈청과 함께 1시간 동안 차단하였고, 뉴런을 위해 마우스 항-NeuN(1:500; Chemicon)과 함께 밤새 항온배양하였고, PBS 중에서 세척하였고, 비오티닐화된 항-마우스 2차 항체(Vector Laboratories)로 1hr 동안 항온배양하였고, 세척하였고, 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체(Vectastain Elite ABC Kit Standard, Vector Laboratories)와 함께 1시간 동안 항온배양하였다. 디아미노벤지딘(DAB)(Vectastain Elite ABC Kit Standard, Vector Laboratories)는 크로마겐으로서 적용되었다. 각각의 척수에 대해, 척수의 두께에 걸쳐 동등한 전방-후방 거리에서 280 내지 420um 떨어진 5개의 절편을 등가의 회색질 영역이 포함되도록 그리고 세포가 이중-계수되지 않도록 샘플링하였다. 모든 NeuN 양성 뉴런은 Nikon NIS Elements BR v.3.1 소프트웨어를 사용하여 병변 진원지로부터 2.7mm 문측 및 미측에서 계수하였다. 데이터는, 전체 척수 두께에 대해 정규화되지 않은 총 수의 그룹 평균으로서 제시되었다.
숙주 성상세포 및 희소돌기아교세포를 정량하기 위해, 절편을 상기와 같이 차단하였고, 하기 1차 항체와 함께 밤새 항온배양하였다: 성상세포의 경우 마우스 항-GFAP(1:200; Chemicon, Temecula, CA) 및 희소돌기아교세포의 경우 마우스 항-CC1/APC(1:1000, Calbiochem, San Diego, CA). 조직 절편은 0.1M PBS로 세척하였고, 실온에서 1hr 동안 형광성-접합된 2차 항체와 함께 항온배양하였고, PBS로 세척하였고, 이어서, 4',6-디아미딘-2-페닐-인돌(DAPI) 핵 카운터 염색을 함유하는 Vectashield 장착 배지(Vector Laboratories, Burlington, ON, Canada)로 커버슬립핑하였다. 종-특이적 비-면역 IgG 및 1차 항체의 생략은 음성 대조군으로 사용하였다. 손상 부위에 인접한 숙주 희소돌기아교세포의 생존을 정량하기 위해, CC1로 면역염색한 절편을 Nikon Eclipse TE 300 현미경 및 NIS Elements BR v.3.1 소프트웨어를 사용하여 동일한 설정과 노출 시간으로 화상 촬영하였다. 동물당 최대 공동(cavitation) 및 유사한 등-배 거리를 갖는 3개의 절편을 조사하였다. 필드(2.9 × 105 um2 면적)에서 CC1+ 세포의 수를 각각의 절편에서 병변의 가장자리로부터 600um 내의 문측 및 미측 둘 다에서 계수하였다. GFAP 면역반응성을 정량하기 위해, 면역염색한 절편을 Nikon Eclipse TE 300 현미경 및 NIS Elements BR v.3.1 소프트웨어를 사용하여 동일한 설정과 노출 시간으로 화상 촬영하였다. 동물당 최대 공동 및 유사한 등-배 거리를 갖는 3개의 절편을 조사하였다. 각각의 절편에 대해, 3개의 영역(1.1 × 106 um2 면적)의 총 강도 값을 병변의 가장자리로부터 문측 및 미측 둘 다로 0.45mm 및 1.8mm에서 측정하였다. 각각의 영역에 대해, 그룹당 평균 강도 값을 평균하였다.
병변의 체적을 정량하기 위해, 조직 형태를 위해 모든 8번째 시상주변 절편을 룩솔 패스트 블루 및 헤모톡실린 & 에오신(LFB/H&E)에 대해 프로세싱하였다. 상기 절편을 Nikon Eclipse TE 300 현미경으로 화상 촬영하였고, 각각의 절편의 공동의 면적은 NIS Elements BR v.3.1 소프트웨어를 사용하여 추적하였다. 공동(cavity) 내의 임의의 괴사 조직은 병변의 일부로서 계수되었다. 총 공동 체적은 측정된 면적의 총합에 교차 거리를 곱함으로써 계산하였다.
비오틴 덱스트란 아민(BDA)를 이용한 피질척수로(CST)의 전방 축삭 추적. CST로부터 축삭을 가시화하기 위해, SCI 후 기능적 평가의 종료 후 6주째에 BDA를 이용한 전방 축삭 추적을 수행하였다. 각 그룹으로부터 동물(n=3 내지 4)을 BDA 주사를 위해 무작위 선택하였다. 1:2 NO:O2의 2% 이소플루오란을 이용한 깊은 마취 하에, 래트를 정위 프레임 내에 배치하였고, 개두술을 양쪽으로 수행하여 감각운동 피질을 노출시켰다. BDA(10%, 10,000 MW; Invitrogen(Life Technologies))를 0.01M PBS에 용해시켰고, 브레그마와 관련하여 하기 좌표들을 이용하여 각각의 감각운동 피질 내의 6개의 부위에 주사하였다: 1) 0.5mm 후방 및 1mm 측면, 2) 0.5mm 후방 및 2mm 측면, 3) 1mm 후방 및 1 mm 측면, 4) 1mm 후방 및 2mm 측면, 5) 1.5mm 후방 및 1mm 측면, 6) 1.5mm 후방 및 2mm 측면. 각각의 부위에서, 피질의 표면으로부터 1.2mm에 1μl의 BDA를 주사하였다. 주사는, 10μl 해밀턴 시린지 및 32 게이지 니들을 갖는 전동 마이크로인젝터를 이용한 수술 현미경의 도움으로 0.5μl/분의 속도로 정위적으로 이루어졌다. 주사 후 추가의 2분 동안 니들을 당해 위치에 남겨두어 누출을 방지하였고, 피부를 6-0 바이크릴로 봉합하였다. 동물들을 3주 이상 동안 생존하도록 하였고, 이어서, 0.1M PBS 중의 4% 파라포름알데하이드로 경심 관류하였다. 병변 부위를 포함하는 조직의 1.5cm 절편을 포함하는 BDA 조직을 절개하였고, 슬라이드 상의 20㎛ 동결절편 또는 자유-부유하는(free-floating) 30㎛ 절편으로서 프로세싱하였다. 자유-부유 절편을 PBS를 함유하는 24-웰 플레이트에 수집하였다. 상기 절편은 RT에서 10분 동안 메탄올 중의 1% H2O2로 전-처리하였고, 30분 동안 0.5% Triton X를 함유하는 PBS로 세정하였고, RT에서 1h 동안 아비딘-비오틴 퍼옥시다제 복합체(Vectostain Elite ABC Kit Standard, Vector Laboratories, Burlington, ON, Canada)에서 항온배양하였다. 슬라이드를 PBS로 세척하였고, 이어서, 형광성 알렉사-488 염소 항-마우스 2차 항체(1:500; Invitrogen(Life Technologies)와 함께 항온배양하였고, DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐-인돌) 핵 카운터 염색을 함유하는 Vectashield 장착 배지(Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada)로 커버슬립핑하였다.
통계학적 분석. 기능적 시험은 시점에 대해 그룹들을 비교하는 양측 반복-측정 ANOVA에 의해, 이어서, 본페로니(Bonferroni) 방법을 이용한 사후(post-hoc) 쌍별(pairwise) 다중 비교에 의해 분석하였다. 세포 수의 차이는 일원 ANOVA를 이용하여, 이어서, 본페로니 시험을 이용한 쌍별 다중 비교에 의해 분석하였다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로서 제시되었다. p < 0.05인 경우에 차이가 유의한 것으로 고려되었다.
카스파제-3 및 척수 절편의 NeuN 염색. T8에서의 병변 부위를 포함하는 대조군(n=4) 및 4Ig(n=4) 치료된 래트로부터의 조직의 1.5cm 절편을 절개하였고, 30% 슈크로스에서 동결보호하였다. 조직을 20㎛ 일련의 절편으로 시상주변 절편화하였다. 나머지 뉴런을 카스파제-3으로 공동-표지화하기 위해, 절편을 차단하였고, 4℃에서 토끼 항 카스파제-3(1:750; Cell Signaling)과 함께 밤새 항온배양하였다. 다음날, 절편을 세척하였고, RT에서 마우스 항-NeuN(1:500; Chemicon)과 함께 4hr 동안 항온배양하였고, 이어서, RT에서 알렉사 488 항-마우스 및 알렉사 555 항-토끼 2차 항체(1:500; Molecular Probes)와 함께 1hr 동안 DAPI/PBS와 함께 항온배양하였다. 각각의 척수에 대해, 척수의 두께에 걸쳐 160um 떨어진 5개의 절편을 세포가 이중-계수되지 않도록 샘플링하였다. 모든 NeuN 양성 뉴런 및 NeuN/카스파제-3 이중 표지된 세포, 및 카스파제-3 표지된 세포 및 DAPI 염색된 세포의 총 수는 cellSens 소프트웨어(Olympus)를 사용하여 병변 진원지로부터 1.5mm 문측 및 미측에서 계수하였다.
실시예 2
성장 원추의 지질 래프트 내의 네오제닌의 존재
중추 신경계(CNS)의 발달에 있어서 네오제닌의 역할을 연구하기 위해, 뇌 막(E8)에서의 네오제닌의 발현을 웨스턴 블롯팅에 의해 조사하였다. 하기 항체들을 본 연구에 사용하였다: 네오제닌의 전체 세포외 도메인에 대해 지시되는 항체인 AF1079, 및 네오제닌의 N-말단에 대해 지시되는 항체인 N-20. AF1079는 180-kDA 및 150-kDa에서 2개의 밴드로 검출되었고, 한편, N-20은 180-kDa에서 1개의 밴드로 검출되었다(도 1A 및 도 1B). 이러한 결과는, 뇌 막이 전장 네오제닌(즉, 180-kDa) 및 네오제닌의 N-말단 절삭(즉, 150-kDa)을 함유하였고, 이는 4Ig 반복의 일부가 결여되어 있었음을 나타냈다.
네오제닌의 발현을 추가로 연구하기 위해, 네오제닌의 막 국소화를 공초점 영상화에 의해 조사하였다. 구체적으로, 네오제닌의 N-말단부에 대한 항체로 염색을 수행하였다. 이러한 염색은 망막 신경절 세포(RGC, E8, 도 1A 내지 도 1D)의 성장 원추에서의 반점의 염색 패턴을 나타냈다. 이들 반점 구조는 래프트 마커, 각각 0.27 및 0.32의 강도 상관관계 지수가 계산된 콜레라 독소(CTB) 및 RGMa(도 1E 및 도 1F)와 공동-국소화되었다. 이러한 결과는 네오제닌이 RGMa(P 부호 = 0.005) 및 지질 래프트(P 부호 =0.0002)와 유의하게 관련되어 있음을 나타냈다. 대조군으로서, 축삭을 CTB 및 F-액틴에 대해 염색하였다. 이러한 대조군 실험에서, 계산된 상관관계 지수는 0.05였고, 이는 CTB 및 F-액틴에 대한 염색의 분리를 나타냈다(도 8).
지질 래프트 내의 네오제닌의 국소화를 추가로 조사하기 위해, 병아리 뇌 막으로부터 단리된 지질 래프트 내의 네오제닌의 존재비(abundance)를 조사하였다. 네오제닌을 분획 2 내지 4에서 회수하였고, 이를 지질 래프트 마커 플로틸린 및 RGMa에 있어서 농축된다(도 1G). 네오제닌은 비-지질 래프트 분획에서 회수되지 않았고, 이는 중쇄 분획 마커 트랜스페린 수용체를 함유하였다(도 1G).
추가로, 배아를 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD)으로 처리하여 막 콜레스테롤을 고갈시켰고, 이는 지질 래프트를 방해하였고, 뇌 샘플이 분획화되었다. MβCD의 존재시, 네오제닌은 트랜스페린 수용체와 함께 비-지질 래프트 분획에 회수되었다(도 8C).
요약하면, 상기 결과는, 발달중인 CNS에서 뇌 막에 네오제닌이 국소화되었고, 보다 구체적으로는 이들 뇌 막 내의 지질 래프트에 네오제닌이 국소화되었음을 입증하였다.
실시예 3
지질 래프트 내의 네오제닌의 존재는 N-래프트와 네오제닌-4Ig 사이의 상호작용에 의해 조절되었다
상기 기술된 바와 같이, 네오제닌은 지질 래프트 및 RGMa와 관련되어 있었다. 네오제닌과 RGMa 사이의 상호작용이 지질 래프트에의 네오제닌의 유입에 관여하였는지를 결정하기 위해, 네오제닌 및 RGMa의 상이한 영역들 사이의 상호작용을 조사하기 위한 결합 연구를 수행하였다.
구체적으로, 네오제닌의 4Ig-도메인 및 6FNIII-도메인은 각각 알칼리성 포르파타제(AP)에 융합되었다. 네오제닌의 4Ig-도메인 및 6FNIII-도메인은 네오제닌의 세포외 부분에서 발견되었다. 수탁 번호 제AAC59662호(서열번호 1)는 네오제닌의 아미노산 서열이었다. 4Ig-도메인은 수탁번호 제AAC59662호(서열번호 1)의 아미노산 1 내지 383이었다. 6FNIII-도메인은 수탁번호 제AAC599662호(서열번호 1)의 아미노산 429 내지 1036이었다.
각종 RGMa 펩타이드에의 이들 융합의 결합을 ELISA 검정으로 분석하였다(도 2A).
네오제닌의 6FNIII-도메인은 전장 RGMa와 상호작용하였지만, 네오제닌의 4Ig-도메인은 전장 RGMa와 상호작용하지 않았다(도 2A). 이러한 데이터는 RGMa와 네오제닌의 생체내 결합이 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 가능하게 하기 위한 추가의 인자(들)를 요구할 수 있음을 시사하였고, 이는 하기에 보다 상세하게 기술된다.
추가로, 네오제닌의 4Ig-도메인은 RGMa의 N-말단부와 상호작용하였다(도 2A). 네오제닌의 6FNIII-도메인(본원에서 "피브로넥틴 도메인"으로서도 나타냄)도 RGMa의 N-말단부와 상호작용하였다.
RGMa의 별개의 N-말단 영역이 네오제닌의 4Ig- 및 6FNIII-도메인에 결합하였는지를 측정하기 위해, RGMa의 N-말단 영역에 걸친 펩타이드를 생성시켰다. RGMa의 아미노산 서열은 수탁번호 제NP_989868.1(서열번호 6)이었다. 이들 펩타이드는 RGMa의 아미노산 28 내지 73에 걸친 펩타이드(본원에서 "N-래프트"로서도 나타냄) 및 RGMa의 아미노산 77 내지 113에 걸친 펩타이드(본원에서 "N-inh"로서도 나타냄)였다. N-래프트 펩타이드는 네오제닌의 4Ig-도메인과 상호작용하였지만, 네오제인의 6FNIII-도메인과는 상호작용하지 않았다. N-inh 펩타이드는 네오제닌의 6FNIII-도메인과 상호작용하였지만, 네오제인의 4Ig-도메인과는 상호작용하지 않았다. RGMa의 N-래프트 및 N-inh 펩타이드가 네오제닌의 4Ig- 및 6FNIII-도메인 대신에 AP와 융합된 상보적 실험에서, N-래프트는 4Ig-도메인에 결합하였고 6FNIII-도메인에는 결합하지 않았으며, 한편, N-inh는 6FNIII-도메인에 결합하였고 4Ig-도메인에는 결합하지 않았다(도 9). 추가로, N-inh 및 N-래프트 코팅된 비드는 6FNIII-도메인 및 4Ig-도메인을 각각 풀링 다운하였고, 이는 상기 기술된 ELISA 결과와 일치하였다(도 2B).
네오제닌의 4Ig-도메인과 N-래프트 사이의 상호작용을 특이성을 평가하기 위해서, 가장 가까운 네오제닌 상동체 DCC를 조사하여 DCC가 N-래프트와 상호작용하였는지를 측정하였다. DCC의 4Ig-도메인과 N-래프트 사이에 유의한 상호작용은 관찰되지 않았다(도 9C).
상기 기술된 네오제닌-RGMa 상호작용이 생물학적으로 관련되었는지를 측정하기 위해, RGMa 펩타이드를 기질로서 이용한 과성장 실험을 수행하였다(도 2C). 전장 N-RGMa 및 N-inh 단편은 대조군과 비교하여 축삭 성장에 있어 3 내지 4배의 감소를 야기하였다(51.5.5±3.0㎛ 및 88.1±13.3㎛ vs. 238.1±9.3㎛; 도 2C 및 도 2D). 이들 데이터는 네오제닌의 6FNIII-도메인과의 N-RGMa 및 N-inh의 상호작용이 망막 축삭 성장을 억제하였음을 나타냈다. N-래프트 펩타이드를 기질로서 사용한 경우, 축삭 과성장의 효과를 관찰되지 않았다(도 2C 내지 도 2D). 이들 데이터는 RGMa의 N-래프트와 네오제닌의 4Ig-도메인 사이의 상호작용이 축삭 성장을 트랜스로 축삭 성장을 억제하지 않았음을 나타냈다. 따라서, 트랜스로 축삭 성장을 억제하기 위해서, RGMa는 네오제닌의 6FNIII-도메인과 상호작용하였고 네오제닌의 4Ig-도메인과는 상호작용하지 않았다.
N-래프트 및 4Ig 상호작용이 지질 래프트에 네오제닌을 유입하였는지를 평가하기 위해서, N-래프트 및 4Ig 도메인을 RGMa 및 네오제닌으로부터 각각 결실시켰고, 이어서, 지질 래프트와의 네오제닌 회합을 조사하였다(도 9). 구체적으로, HEK293 세포를 네오제닌 및 RGMa로 공동-형질감염시켰고 BMP2로 처리하였다. BMP2는 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 촉진시켰다. 이들 HEK293 세포에서, 지질 래프트 분획에서 네오제닌이 발견되었다.
대조적으로, 네오제닌의 결실 돌연변이체(즉, 4Ig-도메인의 결실 그리고 본원에서 "4Ig-del"로서도 나타냄) 및 RGMa의 결실 돌연변이체(즉, N-래프트 도메인의 결실 그리고 본원에서 "N-래프트-del"로서도 나타냄)는 보통 세포 표면에 대해 표적화되었지만(데이터 도시하지 않음), 결실 돌연변이체 둘 중 어느 하나도 지질 래프트 분획에 유입되지 않았다(도 9). 이들 데이터는 지질 래프트 내에 존재하는 네오제닌에 N-래프트와 4Ig 사이의 상호작용이 필요하였음을 나타냈다.
이와 같이, 과발현 재조합체 4Ig 및 N-래프트가, 지질 래프트 분획으로부터 비-지질 래프트 분획으로 네오제닌을 대체하기 위해 내인성 4Ig 및 N-래프트 도메인과 경쟁하였는지를 조사하였다. 구체적으로, RGMa의 아미노산 잔기 50 내지 99인 래프트, 4Ig-도메인, 또는 대조군 펩타이드(본원에서"N-GRMa50 -99"로서도 나타냄)를 E8에서 시개에 주사하였다. 분획화-분석을 위해 하루 뒤에 시개를 수집하였다.
전장 네오제닌은 대조군의 래프트 분획(N-RGMa50 -99)에 광범위하게 국소화되었다. N-래프트 또는 4Ig의 조재시, 네오제닌은, 지질 래프트 분획으로부터 지질 래프트 단백질을 함유하지 않았던 중쇄 분획으로 재국소화되었다(도 2E).
지질 래프트 중의 네오제닌의 존재는 또한 BMP에 의존한다. 따라서, BMP-킬레이터 노긴의 존재시 네오제닌이 지질 래프트 분획으로부터 중쇄 분획으로 재국소화되었는지를 조사하였다. 구체적으로, 이러한 연구를 위해, 병아리 뇌에 노긴을 주사하였고, 노긴의 존재시 네오제닌이 지질 래프트 내에 존재하지 않았음을 관찰하였다(도 2E). 따라서, 상기 데이터는 노긴, N-래프트 및 4Ig가 각각 네오제닌이 지질 래프트와 회합되는 것을 방지하였음을 나타냈다.
요약하면, 상기 시험관내 및 생체내 결과는, 지질 래프트에 네오제닌을 유입하기 위해 네오제닌 내의 4Ig-도메인과 RGMa 내의 N-래프트-도메인 사이의 상호작용이 필요하였음을 나타냈다.
실시예 4
녹 다운(Knock Down) 분석은 RGMa 와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 밝혔다
CNS는 3개의 RGMa 이소형, 즉, N-RGMa, C-RGMa, 및 RGMaΔ를 함유한다. N-RGMa 및 C-RGMa는 도 2A에 나타낸 바와 같았다. RGMaΔ는 전장 RGMa였다.
N-RGMa, C-RGMa, 및 RGMaΔ는 각각 축삭 과성장을 트랜스로 억제하였고, 따라서, 성장 기질로서 제공된 경우, N-RGMa, C-RGMa 및 RGMaΔ의 각각은 축삭 성장을 차단하였다. 추가로, N-RGMa, C-RGMa 및 RGMaΔ는 네오제닌의 피브로넥트린 도메인과의 상호작용에 의해 축삭 성장을 트랜스로 차단하였다(도 2A 내지 도 2D).
상기 기술되어 있고 도 2E 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 네오제닌의 4Ig-도메인과 N-RGMa23 -73 사이의 상호작용은 네오제닌을 지질 래프트에 유입시켰다. RGMa 이의 GPI 앵커를 통해 지질 래프트에 국소화되었다. 추가로, 또한, 상기 기술된 바와 같이, 네오제닌 및 RGMa는 성장 원추에 공동-국소화되었고(도 1F), N-래프트가 성장 기질로서(즉, 트랜스로) 제공된 경우, N-래프트는 축삭 과성장을 차단하지 않았다(도 2D). 종합하면, 이들 결과는 네오제닌이 RGMa와의 시스 상호작용을 통해 지질 래프트에 유입되었음을 나타냈다.
RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용이 네오제닌을 지질 래프트에 유입시켰음을 추가로 측정하기 위해, 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 사용하여 성장 원추에서의 RGMa를 사일런싱시켰다. 구체적으로, shRNA를 E2 병아리 눈에 전달시켰고, 형질감염된 E7 망막으로부터의 외식편을 이용하여 각각의 RGMa 단백질(즉, N-RGMa, C-RGMa 및 RGMaΔ)의 과성장을 측정하였다. 눈에서의 shRNA의 형질도입은 단지 망막 신경절 세포(RGC)에서의 네오제닌과의 시스 RGMa 상호작용만을 방해하였고, 성장 기질로서 외인적으로 제공된 RGMa와 성장 원추 사이의 트랜스 상호작용에는 영향을 미치지 않았다.
내인성 RGMa를 억압한 2개의 상이한 shRNA(shRNA-21 및 shRNA-37; 도 12)는 N-RGMa 기질 상의 망막 외식편 과성장을 대조군 shRNA(도 3A 및 도 3B)에 비하여 각각 3.1 및 2.8배 향상시켰다. 추가로, RGMa의 사일런싱은 C-RGMa 및 RGMaΔ에 대한 축삭 성장에 있어서 2.8 내지 3.4배 증가를 제공하였다(도 3A 및 도 3B).
구제 실험에 있어서, shRNA37에 내성이었던 마우스 RGMa로의 공동-형질감염은, shRNA37로 치료된 해리된 RGC에서의 RGMa 단백질의 억제 활성을 회복시켰다(도 10). 따라서, RGMa shRNA로 얻어진 결과는 표적을 벗어난(off-target) 효과가 아니었다. 종합하면, 상기 데이터는, 축삭 과성장을 억제하기 위해서는 트랜스 상호작용 이외에도 지질 래프트에 네오제닌을 유입한 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용이 요구되었음을 나타냈다.
RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용이 4Ig와 N-래프트 사이에 발생하였음을 추가로 측정하기 위해, 4Ig 및/또는 N-래프트가 차단 펩타이드로서 작용하였고 RGMa 단백질 상에 성장된 망막 외식편에서의 축삭 성장을 회복시켰음을 조사하기 위한 연구를 수행하였다. 이들 연구에서, 배지에의 5㎍/ml의 4Ig(도 3A 및 도 3C) 또는 N-래프트(도 3A 및 도 3D)의 첨가는 RGMa 단백질의 억제 효과를 차단하였고, 과성장을 회복시켰다. 종합하면, 이들 데이터는, 축삭 성장을 억제하기 위해 네오제닌의 4Ig-도메인과 N-래프트 사이의 시스 상호작용을 필요로 하였음을 나타냈다.
실시예 5
RGMa 억제는 지질 래프트 및 BMP와의 네오제닌 회합을 요구하였다
상기 기술된 바와 같이, 4Ig와 N-래프트 사이의 상호작용은 지질 래프트와의 네오제닌 회합을 조절하였고(도 2E), 축삭 성장을 억제하기 위해 지질 래프트 내에 네오제닌이 존재해야만 함을 나타냈다. 축삭 성장을 억제하기 위해 지질 래프트 내에 네오제닌이 존재해야만 하는지를 추가로 연구하기 위해, 축삭을 RGMa 단백질 상에서 배양한 경우에 제제들 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD) 및 콜레스테롤 옥시다제(CO)를 사용하여 지질 래프트를 방해하였다. 구체적으로, 10mM MβCD 또는 2U/ml의 CO의 존재 하에 축삭을 RGMa 단백질 상에서 배양한 경우, 축삭 과성장이 대조군 값으로 회복되었다(도 3A, 도 3E, 도 S3D). 이들 데이터는 트랜스로 제공된 RGMa에 대한 축삭 반응이 지질 래프트에의 네오제닌 수송에 의해 유발되었음을 나타냈다. 이러한 지질 래프트에의 네오제닌 수송은 네오제닌과 RGMa(즉, 네오제닌의 4Ig-도메인과 RGMa의 N-래프트) 사이의 시스 상호작용에 의해 매개되었다.
도 2E의 데이터는, 발달중인 CNS에서 지질 래프트에의 네오제닌 유입이 BMP에 의존적이었음을 나타냈다. BMP와 상호작용하는 단백질인 노긴이 RGMa 단백질에 대한 축삭 반응에 영향을 미치는지를 측정하기 위해, 노긴의 존재 및 부재 하에 축삭 과성장을 측정하였다. 이들 연구에서, 축삭 과성장은 노긴 단독에 의해서 영향을 받지 않았지만, N-RGMa, C-RGMa 또는 RGMaΔ에 의해서는 현저하게 감소되었다(도 3A 및 도 3F). 노긴은, 대조군 값에 비하여 각각의 개별 RGMa에 노출된 망막 외식편(E8)에서 과성장을 회복시켰다(도 3A 및 도 3F). 이들 데이터는, BMP에 의존적이었던 유사한 메커니즘이 3개의 RGMa 단백질 모두, 즉, N-RGMa, C-RGMa 또는 RGMaΔ에 대한 네오제닌-매개된 반응을 강조하였음을 나타냈다.
요약하면, 상기 결과들은, RGMa는 BMP(들)와 함께 지질 래프트에의 네오제닌 수송을 조절하였고, 이러한 수송은 RGMa에 의한 축삭 성장 억제를 매개하는데 필요하였음을 나타냈다.
실시예 6
네오제닌은 정확한 축삭 경로 탐색( pathfinding )에 지질 래프트를 필요로 하였다
생체내 축삭 경로에 대한 4Ig와 N-래프트 사이의 상호작용의 효과를 연구하기 위해, 4Ig, N-래프트 및 대조군 NRGMa50 -99를 이소성 발현시켰고, 축삭 경로 탐색을 조사하였다. 치료가 성장하는 축삭에 영향을 미치고 이들의 환경에 영향을 미치지 않았음을 확실히 하기 위해, 전기 천공을 수행한 경우에 전계의 적용을 E2에서의 시신경으로 좁혔고, 이에 의해 눈 및 망막 축삭에 대한 발현이 제한되었다(도 3G).
대조군 실험에서, 모든 망막 축삭은 잘 정의된 말단 구역 내의 수지상(arborization)을 확립하여다(도 3H). 양성 대조군으로서, RGMa를 사일런싱시켜 축삭 경로를 교란시키는 shRNA를 전기천공하였다(도 3I). 4Ig 전기천공의 100%(8 중 8) 및 N-래프트 전기천공의 85.7%(7 중 6)는 이상 경로를 야기하였다(도 3J 및 도 3K).
따라서, 이들 데이터는, 지질 래프트에의 네오제닌 국소화에 요구되었던 4Ig와 N-래프트 사이의 상호작용이 생체내 축삭 경로 탐색에도 요구되었음을 나타냈다. 종합하면, 과성장 실험(도 3A 내지 도 3F)으로, 이들 데이터는, 네오제닌에의 시스로의 RGMa 결합은 BMP에 의해 보조되었고, 지질 래프트에 네오제닌을 전좌시켰고, 이러한 전좌(translocation)는 축삭 성장을 억제하였던 후속적 트랜스 RGMa-네오제닌 상호작용에 요구되었음을 나타냈다(도 3L). 상기의 관점에서, 성장 원추에서의 노긴, N-래프트, 4Ig 또는 RGMa-녹다운을 이용하여 지질 래프트에의 네오제닌의 전좌 또는 콜레스테롤 고갈을 차단하는 것은 축삭 성장을 자극하기 위한 5개의 전략을 제공하였다(도 3L).
실시예 7
네오제닌은 지질 래프트가 세포 사멸을 유도하도록 요구하였다
RGMa를 중화시켜 트랜스 상호작용을 억제하는 것은 축삭 성장을 증가시키지만, 결국 네오제닌의 사멸-촉진(pro-death) 기능을 활성화시킨다. 네오제닌이 지질 래프트가 아폽토시스를 유도하도록 요구하였는지를 측정하기 위해, HEK293 세포를 네오제닌으로 형질감염시켰고, 트립판 블루 배제 검정에 의해 세포 사멸을 측정하였다. 이러한 검정에서, HEK293 세포는 RGMa를 안정하게 발현시켰다(도 11).
네오제닌은 모의(Mock)-세포에서 보여진 것의 2배 초과로 세포 사멸을 상승시켰다(도 4A). 노긴, 4Ig, N-래프트 또는 MβCD가 네오제닌-형질감염된 세포의 배지에 첨가된 경우, 세포 생존력은 약 2 내지 3배 향상되었고, 이는 네오제닌 유도된 사멸에 지질 래프트가 요구되었음을 나타낸다(도 4B).
따라서, 이들 데이터는, 상기 데이터와 함께, 네오제닌이 RGMa와 함께 기능하여 축삭 성장을 억제하는 경우 및 RGMa 없이 기능하여 아폽토시스를 유도하는 경우에 지질 래프트를 요구하였음을 나타냈다. 이와 같이, 지질 래프트에의 네오제닌 수송을 방지하는 것은 축삭 성장 및 세포 생존을 동시에 촉진시켰다.
RGMa는 발달중인 병아리 신경관에서 발현되었고, 따라서, 네오제닌이 이의 생체내 사멸-촉진 기능에 지질 래프트를 요구하였는지를 측정하기 위해, 병아리 배아(E2)의 신경관에서 아폽토시스를 조사하였다. 구체적으로, 모의 또는 네오제닌 중 어느 하나를 발현한 플라스미드로 GFP-작제물을 전기천공하였고, TUNEL 염색에의해 아폽토시스를 검정하였다.
아폽토시스를 유도하지 않았던 모의 발현(도 11)과 대조적으로, GFP-네오제닌 형질감염된 세포에서는 다수의 TUNEL+ 세포가 관찰되었다(도 4C 및 도 4D). 이러한 네오제닌의 아폽토시스-촉진 효과는, 네오제닌-전기천공에 따라 4Ig 또는 N-래프트가 시개에 주사된 경우에 폐지되었다. 4Ig 및 N-래프트는 TUNEL+ 세포의 수를 각각 약 18배(432±23로부터 23±4로) 그리고 약 4배(432±23으로부터 103±8로) 감소시켰다(도 4D). 이들 데이터는, 아폽토시스가 발달중인 뇌에서 발생하기 위해서 지질 래프트에 네오제닌이 존재할 것이 요구되었음을 나타냈다. 또한, 상기 데이터는, 네오제닌이 지질 래프트가 아폽토시스를 유도할 것을 요구하였고, 따라서, 4Ig 또는 N-래프트를 통한 지질 래프트에의 네오제닌 유입 또는 국소화를 방지하였거나 MβCD로의 콜레스테롤 고갈이 아폽토시스의 유도를 차단하였음을 입증하였다.
실시예 8
네오제닌은 손상된 망막 뉴런에서 지질 래프트가 아폽토시스를 유도하는 것을 요구하였다
상기 데이터는 뇌 발달 동안 기능하는 RGMa/네오제닌 경로에 지질 래프트가 요구되었음을 나타냈다. RGMa/네오제닌 경로는 손상된 중추 신경계(CNS)에서 뉴런 사멸을 매개하였다. 따라서, 네오제닌의 병리생리학적 역학에 지질 래프트 내의 네오제닌의 국소화가 필요한지를 조사하였다.
이러한 연구를 위해, 망막 기관형(organotypic) 배양물을 사용하였고, 여기서, 망막 신경절 세포(RGC)의 축삭절단술은 회귀 인자(tropic factor)의 세포를 제거하였고, 아폽토시스를 유도하였다. 세포 사멸은 요오드화 프로피디움(PI)을 이용하여 검출하였고, 모든 화상은 포커스 내에 RGC-층으로 동일한 강도에서 촬영하였다. 세포 사멸은 전체 양의 상대적 PI 강도를 측정함으로써 평가하였다. 배지 중의 4Ig 또는 N-래프트의 존재는 세포 사멸을 유의하게 (약 40%) 감소시켰다(도 4E 및 도 4F). MβCD 또는 CO로 지질 래프트를 교란시키는 것은 대조군에 비하여 세포 생존을 유사하게 약 50% 향상시켰다(도 4E 및 도 4F).
따라서, 이들 데이터는, 손상된 뉴런에서 아폽토시스를 유도하기 위해서는 네오제닌에 대해 지질 래프트 내의 네오제닌의 국소화가 요구되었음을 나타냈다. 손상된 뉴런에서의 이러한 아폽토시스는, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 차단함으로써 지질 래프트에의 네오제닌의 유입을 방지한 4Ig 또는 N-래프트, 또는 콜레스테롤을 고갈시키고 지질 래프트를 방해한 MβCD 또는 CO의 존재 하에 유의하게 감소되었다. 이와 같이, 4Ig, N-래프트 또는 MβCD 또는 CO로의 콜레스테롤 고갈은 네오제닌에 의한 아폽토시스의 유도를 차단함으로써 세포 생존을 촉진시켰다.
손상 후, 높은 수준의 네오제닌 및 RGMa 둘 다가 망막에서 관찰되었다. 추가로, RGMa 및 네오제닌은 축삭절개술 후 생체내에서 망막 신경절 세포(RGC)의 아폽토시스성 사멸을 야기하였다. 네오제닌이 손상 후 아폽토시스를 유도하기 위해서 생체내에서 지질 래프트를 요구하였음을 측정하기 위해, 4Ig 또는 N-래프트를 안내 주사하였고, 축삭절개술 후 14일째에 세포 생존을 측정하였다. 4Ig(682±21세포/㎟) 및 N-래프트(652±24세포/㎟) 둘 다는 대조군(361±19세포/㎟)에 비하여 RGC 생존을 약 2배 증가시켰다(도 4G 및 도 4I). MβCD의 전신 투여(복강내, IP)는 또한 RGC 생존을 약 2배 증가시켰다(도 4G 및 도 4J). CO는 생체내에서 안정하지 않았고, 따라서, 시험되지 않았다. 이들 데이터는 추가로 손상된 CNS에서의 네오제닌-유도된 아폽토시스가 지질 래프트와의 네오제닌 회합을 요구하였음을 나타냈다. 이러한 회합은 네오제닌의 4Ig-도메인과 RGMa의 N-래프트 사이의 시스 상호작용에 의존하였다.
실시예 9
네오제닌은 지질 래프트가 척수 손상 후 축삭 재생을 억제할 것을 요구하였다
상기 기술되고 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 지질 래프트로부터 네오제닌을 분리하는 것은 발달중인 CNS에서 축삭 과성장을 지지하였고 뉴런 사멸을 중단시켰다. 추가로, 생체내에서 축삭절개술 후 RCG의 향상된 생존률이 도 4G 내지 도 4J에 나타낸 바와 같이 관찰되었다. RGMa는 발달 동안에 방사상 신경교세포에 의해 발현되었고, 인도 분자로서 작용하였다. RGMa는 손상된 CNS에서 반응성 성상세포 및 희소돌기아교세포에 의해 발현되었다. CNS를 발달시키고 재생시키는 것 둘 다에 있어서, RGMa는 축삭 성장의 억제제로서 기능하였다.
상기 데이터는 지질 래프트와의 네오제닌 회합이 발달중인 RGC에서 RGMa/네오제닌 경로의 억제 기능을 억압하였음을 입증하였으므로, 손상된 CNS의 재생을 ㅈ지연시키기 위해서 RGMa/네오제닌 경로에 의한 지질 래프트와의 네오제닌 회합이 요구되었는지를 측정하기 위해, RGMa/네오제닌 경로가 재생을 지연시킨 손상 모델에서 연구를 수행하였다.
래트 척수 압박 모델에서의 척수 손상(SCI) 후 재생은 사람 SCI를 밀접하게 모방하였다. 구체적으로, BBB 운동 평정 척도, 운동 서브스코어 및 사다리 걷기 시험을 이용하여 기능적 회복을 매주 모니터링하였다.
4Ig(정맥내, IV) 또는 MβCD(IP)로의 치료는, 대조군에 비하여 보다 높은 BBB 스코어 및 운동 서브스코어에 의해 입증되는 바와 같이 SCI 후 2 내지 3주 정도로 빠르게 유의한 기능적 회복을 보여주었다(도 5A, 도 5B, 도 5D, 및 도 5E).
사다리-걷기 시험을 이용하여 뒷다리 조정력을 평가하였고, 여기서, 발걸음은 오류로서 여겨졌으며, 따라서, 보다 높은 스코어는 더 좋지 않은 조정력을 반영하였다. 대조군에 비하여, 4Ig가 주사된 래트는 더 적은 발걸음을 가졌다(도 5C). 또한, MβCD가 주사된 래트에서도 유사한 패턴의 기능적 향상이 관찰되었다(도 5D 내지 도 5F).
추가로, 성상세포에 대한 염색은 4Ig 및 MβCD로의 치료가 이들 세포 집단에 영향을 미치지 않았음을 나타냈다. 따라서, 운동 기능에서 관찰된 향상은 향상된 뉴런 생존 또는 축삭 재생으로부터 초래되었다(도 12).
4Ig로 관찰된 효과가 손상 부위에서 단독으로의 이러한 펩타이드의 작용으로부터 초래되었음을 측정하기 위해, Alzet 미니-삼투압 펌프를 이용한 국소적 척수강내 적용을 수행하였다. 자발적 회복을 저하시키기 위해, 보다 강한 클립을 이용하여 압박을 수행하였다(26 대 20). 상기 기술된 전신적 적용과 유사하게, 4Ig의 국소적 적용은, 보다 높은 BBB 스코어에 의해 입증되는 바와 같이 SCI 후 2 내지 3주 정도로 빠르게 유의한 기능적 회복을 보여주었다(도 5G). 또한, 여기서, 뒷다리 조정력은 유의하게 향상되었고, 4Ig가 국소적으로 주사된 래트는 보다 적은 발걸음수를 가졌다(도 6H).
운동 회복에 대한 MβCD의 효과는 SCI-후의 보다 나이 든 동물(7개월령 초과, n=4)에서 시험하였다. 어린 동물을 이용한 결과와 유사하게, MβCD-치료는 현저한 향상을 제공하였다(+6.8 BBB 점수 대 대조군; 도 13C).
따라서, 상기 결과는 4Ig 또는 MβCD를 통해 지질 래프트와의 네오제닌의 회합을 저해하는 것은 SCI 후 기능적 운동 회복을 자극하였다.
실시예 10
뉴런 절약(Neuronal Sparing) 및 운동 축삭 재생
SCI 후 뉴런 손상은 근육 제어의 손실 및 궁극적 마비를 초래하였다. RGMa/네오제닌 경로는 손상된 CNS에서 뉴런 세포 사멸을 유발하였다. 따라서, 지질 래프트와의 네오제닌 회합을 차단하는 것이 SCI 후 뉴런 손실을 중단시키고 축삭 재생을 가속화시키고, 후속적으로 기능적 회복을 초래하였는지를 조사하기 위한 연구를 수행하였다.
본 연구에서, 손상된 래트는 4Ig 또는 MβCD의 전신 적용을 6주 동안 투여받았고, 병변 주위 뉴런을 뉴런 마커인 NeuN으로 정량하였다. 4Ig 또는 MβCD 치료는 대조군과 비교하여 병변 주위 뉴런의 수를 약 2배 증가시켰다(도 5I 내지 도 5M). 6주의 기간에 걸친 4Ig의 척수강내 적용은 척수의 단면에 있어서 NeuN 양성 세포의 유사한 증가(약 2배)를 초래하였다(도 5N 내지 도 5P 및 도 12E). 측정값은, 4Ig 및 MβCD 치료된 동물에 대한 병변 체적이 대조군과 비교한 경우에 유의하게 다르지 않았음을 밝혔다(도 12D). 따라서, 이들 데이터는 추가로 지질 래프트와의 네오제닌 회합을 차단하는 것이 SCI 후 뉴런 손실을 약화시켰음을 나타냈다.
CNS 축삭의 재생 불능은, 대부분 재생에 도움이 되지 않는 미엘린에 존재하는 억제제로 인한 것이었다. 향상된 행동 결과가 축삭 재생으로부터 초래되었음을 측정하기 위해, 운동 피질에 비오틴 덱스트란 아민(BDA)을 주사함으로써 피질척수로의 전방 추적을 수행하였다(도 6).
단지 1마리의 대조군 동물이 손상 부위(공동) 이상으로 연장된 단일 재생 섬유를 보여주었다. 대조적으로, 4Ig 및 MβCD 치료된 동물 모두는 공동 이상으로 돌출되는 섬유를 가졌고, 몇몇은 이 부위 이상으로 몇 밀리미터 연장되었다(도 6A 및 도 6B). 가장 긴 축삭의 평균 길이는 각각의 대조군(18±7μm 및 128±118μm)과 비교하여 4Ig(2875±228μm) 또는 MβCD(2195±335μm)로 치료된 동물에서 증가되었다(도 6C, 도 6D). 축삭은 대조군에서 병변 부위 이상으로 거의 보여지지 않았지만, 4Ig- 또는 MβCD-그룹에서는 다수의 섬유가 병변 부위의 3000μm 이상 걸쳐 있었다(도 6E 및 도 6F).
척수의 등면 및 배면 둘 다가 동시에 압박된 충격/압박 손상의 SCI 모델을 추가의 연구에 사용하였다. 사용된 SCI의 중증도는 회백질 및 인접한 백질의 중앙 공동을 초래하였고, 이는 연막하 백질의 해를 입지 않은 가장자리를 남기고 모든 CST 축삭을 절단하였다(도 13C). 4Ig 및 MβCD 동물에서, 이상 경로를 나타낸 섬유들을 관찰하였고(도 S6D), 이는 축삭 재생의 지표였다.
BDA-섬유가 재생 축삭이었는지를 측정하기 위해서, 4Ig(IV-주사) 치료된 동물 유래의 척수를 상이한 시점들(각각에 대해 n=5)에 조사하였고, 섬유는 손상 후 4주째와 비교한 경우 6주째에 유의하게 더 길었음이 관찰되었다(도 6G). 특히, 4주 동물에 비하여 6주 동물에서 병변으로부터 2 내지 3mm 미측의 섬유의 유의하게 높은 수가 관찰되었다(도 6H).
또한, 병변의 문측 3mm 및 미측 5mm에서 척수의 단면을 조사하였다. 샴(sham) 동물에서, 해를 입지 않은 섬유는 양쪽 위치 둘 다에서 명백하였고, 이는 손상되지 않은 척수에서의 CST의 연속성을 보여준다. 대조적으로, 4Ig(IV) 치료된 동물에서, 병변의 문측에서 섬유가 관찰되었지만, 병변의 미측 5mm에서는 관찰되지 않았고, 이는 해를 입지 않은 섬유의 결여를 나타낸다. 4IG(IV) 또는 MBCD(IP) 치료된 래트에서, 표지된 섬유는 병변 부위의 미측 약 4mm의 최대 거리에서 검출되었고, 이는 이들 섬유가 재생되지 않았고 해를 입었음을 나타낸다.
요약하면, 상기 결과는, 4Ig 또는 MβCD를 통해 지질 래프트로부터 네오제닌을 배제시키는 것은 SCI 후 축삭 재생 및 동반되는 기능적 회복을 촉진시켰음을 나타냈다.
실시예 11
네오제닌은 지질 래프트가 시신경 압박 후 축삭 재생을 방해할 것을 요구하였다
섬유 재생시키는 것을 추가로 조사하기 위해, 재생 섬유만을 염색시키는 GAP-43과 함께 시신경 압박 모델을 사용하였다. 이러한 연구는, 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 차단함에 의한 4Ig 또는 N-래프트로의 치료가 시신경 손상 후 축삭 재생을 상기 기술된 바와 같은 척수 손상 후에도 관찰된 바와 같이 촉진시켰음을 나타냈다.
손상 후, 4Ig 또는 N-래프트의 IV 주사를 투여받은 동물 및 축삭 재생을 21일 후에 조사하였다(도 7). GAP-43 면역염색에 의해 재생을 가시화하였고, 이는 근위 및 원위 신경 스텀프(stump)의 재생 성체 RGC-축삭에 국소화되었다.
대조군에서, 시신경 내의 병변 부위를 교차한 축삭은 거의 없었고, 성장 원추는 압박 부위에서 갑자기 정지되었다(도 7A). 대조군에서의 재생 축삭은 그 길이가 250㎛ 미만으로 제한되었고, 평균 시신경당 약 408 재생 축삭이 병변 부위 이상으로 관찰되었다(도 7A 및 7E; 250μm 미만: 224±36; 250 내지 500μm: 108±12; 및 500μm 초과: 76±24).
대조적으로, 4Ig로 치료된 동물은 병변 부위 이상으로 증가된 재생 축삭 및 신경의 근위 절편에서의 보다 현저한 스프라우팅(sprouting)을 보여주었다(도 7B 및 도 7E). 길이에 의한 축삭 수의 정량은, 4Ig가 재생 축삭의 수를 대조군에 비하여 유의하게 5.7배 증가시켰음을 보여주었다(도 7B, 도 7E; 250μm 미만: 1134±68; 250 내지 500μm: 640±128 및 500μm 초과: 410±64). 또한, N-래프트를 투여받은 동물은 병변 부위 이상의 재생을 4Ig와 비슷한 정도로 보여주었다(도 7C 및 도 7E). 따라서, 이들 데이터는, 4Ig 및 N-래프트 둘 다가 미엘린화된 성체 CNS에서 축삭-재생을 향상시켰음을 나타냈다.
콜레스테롤 고갈이 시신경 압박 후 축삭 재생을 촉진시켰는지의 여부도 이들 연구에서 조사하였다. 28일 기간에 걸쳐 MβCD로 치료된 래트에서 축삭 길이를 측정하였다(도 7D 및 도 7E). 측정된 모든 거리에 대하여, MβCD로 치료된(IP 주사) 동물에서의 절편당 축삭의 평균 수는 대조군보다 유의하게 7.1배 더 높았다(도 7D 및 도 7E; 250μm 미만: 23.7±1.2; 250 내지 500μm: 10.7±0.9; 및 500μm 초과: 8.4±1.4).
손상 후 4주째에 4Ig, N-래프트 및 MβCD 치료에 의한 증가된 축삭/세포체(soma) 보존에 대해, 시신경 압박 후 RGC 축삭의 망막내 온전성을 조사하였다. 온전한 축삭을 갖는 생존 RGC의 세포체(cell body)는 CTB-FITC로 분명하게 표지되었다(도 14C). 4Ig, N-래프트 및 MβCD로의 치료는 (1) 망막에 걸쳐 보다 두꺼운 축삭 번들(bundle) 및 (2) RGC 세포체들의 증가된 표지화를 초래하였고, 이는 세포 생존 및 축삭 재생 둘 다에 있어서의 이들 치료의 역할과 일치하였다.
요약하면, 이들 데이터는, 네오제닌이 시신경 손상 후 축삭 재생 실패를 매개하였음, 그리고, 4Ig, N-래프트 또는 MβCD를 통한 지질 래프트와의 네오제닌 회합의 방지가 축삭 재생을 초래하였음을 보여주었다.
성상교세포가 4Ig, N-래프트 또는 MβCD 치료에 영향을 받지 않았으므로, 이들 치료의 재생-촉진 효과는 재생 축삭에 대한 효과로부터 초래되었다(도 14). 따라서, 이들 데이터는, 지질 래프트 내의 네오제닌 존재를 변경하는 것은 CNS-손상 후 축삭 재생을 촉진시켰음을 입증하였다.
실시예 12
실시예 13을 위한 재료 및 방법
하기 실시예 13에 기술된 실험에서 사용된 재료 및 방법은 여기 실시예 12에 제공된다.
작제물. 본 연구에 사용된 모든 작제물들은 달리 언급되지 않는 한 갈루스 갈루스(Gallus gallus) 종으로부터 생성되었다. 구체적으로, N-RGMa(즉, 아미노산 28 내지 73; 본원에서 "N-래프트"로서도 나타냄)를 4개의 오버랩핑(overlapping) 단편들로 나누었다: (1) 아미노산 28 내지 54, 본원에서 "N-RGMa(28-54aa)"로서도 나타냄; (2) 아미노산 40 내지 62, 본원에서 "N-RGMa(40-62aa)"로서도 나타냄; (3) 아미노산 55 내지 73, 본원에서 "N-RGMa(55-73aa)"로서도 나타냄; 및 (4) 아미노산 64 내지 62, 본원에서 "N-RGMa(54-62aa)"로서도 나타냄. 이들 서열을 Psectag2B-AP 플라스미드에 클로닝하였고, 이는 알칼리성 포스파타제 태그와 융합된 가용성 단백질로서의 펩타이드 분비를 가능하게 하였다.
결합 검정. 96웰 미세역가 플레이트(Corning Incorporated)에서 검정을 수행하였다. 상기 웰을 4℃에서 밤새 100μl의 폴리-L-리신(10μg/mL)으로 코팅하였다. 이어서, 웰을 100μl의 PBST(+0.02% Tween)로 3회 세척하였다.
50μl(2.5μg/mL)의 His-태그된: 전장 네오제닌; 네오제닌의 4Ig-도메인; 및 네오제닌의 6FNIII-도메인을 37℃에서 1시간 동안 각각의 웰 상에 코팅하였다. 100μl의 PBST의 3회 세척 후, 이어서, 각각의 웰을 37℃에서 1시간 동안 300μl의 PBST 중의 3% BSA로 차단하였다.
이어서, 1% BSA + PBST 중의 50μl(1.0μg/mL)의 AP-태그된: N-RGMa(28-73); N-RGMa(28-54); N-RGMa(40-62); N-RGMa(54-73); N-RGMa(54-62)를 각각의 웰에 첨가하였고 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 각각의 웰을 100μl의 PBST로 3회 완전하게 세척하였고, 이어서, 각각의 웰을 알칼리성 포스파타제(AP) 전개 완충액(100mM NaHCO3, 1mM MgCl2)로 후속적 평형화시켰다. p-니트로페닐 포스페이트(pNPP)가 보충된 AP 전개 완충액을 이용하여 반응을 전개시켰고, 색 발현까지 전개되도록 하였다. 50μl(0.1M) NaOH의 첨가로 반응을 정지시켰다. 미세플레이트 자동 판독기(BIO TEK Instruments Inc.)를 이용하여 각각의 반응의 흡광도를 405나노미터(nm) 파장에서 측정하였다.
실시예 13
상기 기술한 바와 같이, RGMa의 N-래프트는 네오제닌의 4Ig-도메인에 결합하여, 지질 래프트에의 네오제닌 국소화에 요구되었던 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 매개하였다. N-래프트는 RGMa의 잔기 28 내지 73이었다. 네오제닌의 4Ig-도메인에 대한 N-래프트 내의 결합 부위를 추가로 동정하기 위해, N-래프트를 4개의 오버랩핑 단편들로 나누었다: N-RGMa(28-54aa); N-RGMa(40-62aa); N-RGMa(55-73aa); 및 N-RGMa(54-62aa). 이들 4개의 단편들을 정제하였고, 전장 네오제닌, 네오제닌의 4Ig-도메인, 및 네오제닌의 6FNIII-도메인에 대한 결합에 관해 시험하였다(도 17A 내지 도 17C).
이들 연구는, N-RGMa(40-62aa) 및 N-RGMa(54-73aa)가 네오제닌의 4Ig-도메인에 특이적으로 결합하였음을 입증하였다(도 17C). 또한, 상기 기술한 바와 같은 전장 RGMa는 네오제닌의 4Ig-도메인에 결합하지 않았다. 추가로, N-RGMa(28-54aa)는 네오제닌의 4Ig-도메인에 결합하지 않았다.
4Ig에 결합한 단편, 즉, N-RGMa(40-62aa) 및 N-RGMa(55-73aa)와 오버랩핑된 N-RGMa(54-62aa)는 네오제닌의 4Ig-도메인에 결합하지 않았다. 이러한 결과는, 네오제닌의 4Ig-도메인에 대한 결합에 필요한 아미노산 및/또는 구조가 RGMa의 잔기 40 내지 73에 위치하였음을 나타냈다.
결합 연구는, 2개의 오버랩핑 단편들: N-RGMa(40-62aa) 및 N-RGMa(55-73aa)가 네오제닌의 4Ig 도메인에 특이적으로 결합하였고, 반면, 전장 RGMa 단백질 및 N-RGMa(28-54aa) 단편은 결합하지 않았음을 밝혔다. 또한, 마우스 유래의 N-RGMa(서열번호 10) 및 N-RGMc(서열번호 9)를 시험하였고, 사람 네오제닌 유래의 N-RGMa 부분이 결합한 바와 같은(데이터 도시하지 않음) 네오제닌의 4Ig 도메인에 대한 결합을 입증하였다. N-RGMa의 결합 도메인을 추가로 단리하기 위한 노력에 있어서, 상기 언급된 결합 연구에서 동정된 목적하는 특정 영역을 오버랩핑하는 4번째 오버랩핑 단편 N-RGMa(54-62aa)를 네오제닌에 대한 결합 특성에 대해 연구하였다. N-RGMa(54-62aa) 단편은 네오제닌의 4Ig 도메인에 결합하지 않았다. 이는, 40-73aa의 영역에서 네오제닌의 4Ig에 대한 N-RGMa의 결합에 중대한 폴딩 조성물이 요구되었음을 밝혔다.
실시예 14
망막 퇴화
간상체(rods)의 비가역적 손실은, 색소성 망막염(RP) 환자에서의 진행성이고 영구적인 기능 결손의 주요 결정인자였다. 간상체는 아폽토시스로 인하여 손실되었고, 이는 유전적 돌연변이로부터 초래되었다. 그러나, RP에서는 원추의 진행성 손실도 존재하였다. 지질 래프트에의 네오제닌 유입의 차단은 산화적 스트레스가 존재한 경우에 생체내 및 시험관내 뉴런 생존을 촉진시켰다. 산화적 스트레스는 RP에서 원추 사멸에 기여하였다. 따라서, 지질 래프트에의 네오제닌 유입의 차단이 망막 퇴하에 있어서 광수용체 세포 사멸을 억제하고 원추 및 간상체 생존을 촉진시켰음을 측정하기 위한 연구를 수행하였다.
구체적으로, 이들 연구는, 성체 간상체 및 원추에서 네오제닌이 발현되었음을 입증하였다(도 18). rd1 마우스를 사용하여 네오제닌이 간상체 사멸에 관여하였는지를 측정하였다. rd1 마우스 모델은 사람 RP에 대한 모델이고, 간상체 광수용체 cGMP 포스포디에스테라제-6.2의 β-서브유닛을 암호화하는 유전자에서의 기능 손실 돌연변이를 지녔다. 이러한 기능 손실 돌연변이는 cGMP의 축적을 유도하였고, 이는 광수용체 세포 사멸을 야기하였다. 구체적으로, rd1 마우스는 출생 후 9일째(P9) 및 P21에 아폽토시스를 보여주었고, 광수용체 세포의 90% 초과가 사멸되었다.
이들 연구에서, P9 및 P15에서 4Ig(2μg/μl) 펩타이드의 안내 주사를 수행하였고, P21에서 동물을 희생시켜 세포 생존을 조사하였다. 4Ig 펩타이드로의 치료는, 4Ig 펩타이드로의 치료를 투여받지 않았던 대조군 동물과 비교하여 망막 내의 광수용체의 수를 유의하게 향상시켰다. 추가로, 4Ig 펩타이드 대신에 PBS가 주사된 대조군 동물에서, 광수용체 층은 평균 약 2개의 세포 두께를 가졌다. 4Ig의 주사는 외핵층(ONL) 두께를 약 6개의 세포로 증가시켰다(도 19). 이러한 측정값은 ONL의 평균 두께였다. 따라서, 이들 데이터는, 상기 기술된 바와 같이 지질 래프트에의 네오제닌 국소화를 차단한 4Ig 펩타이드로의 치료가 대조군 마우스와 비교하여 ONL의 두께를 3배 초과로 증가시켰음을 나타냈다.
지질 래프트를 방해하는 것이 rd1 마우스에서의 세포 생존을 촉진시켰는지를 측정하기 위해, 광수용체 세포 생존에 대한 콜레스테롤 고갈의 효과를 조사하였다. 상기 기술된 바와 같이, 콜레스테롤 고갈은 지질 래프트를 제거한다. 구체적으로, 마우스를 P9 내지 P21에 매일 MβCD의 피하(IP) 주사로 치료하였다. 이들 치료된 마우스에서, 광수용체 생존은 향상되었다(도 21 및 도 22). MβCD는 세포 생존을 4Ig 치료로 관찰된 바와 유사한 정도로 촉진, 즉, ONL의 평균 두께의 3배 및 약 6개 세포의 평균 깊이로 증가시켰다. 따라서, 이들 데이터는 콜레스테롤을 고갈시키는 것이 광수용체 세포의 생존을 촉진시켰음을 나타냈다.
세포 생존에 대한 콜레스테롤 합성 감소의 효과를 조사하기 위해, rd1 마우스에서 AY-9944를 조사하였다(도 20 및 도21). 2회의 AY-9944의 복강내 주사를 이용하여 P9 및 P15에 Rd1 마우스를 치료하였고, P21에 희생시켰다. MβCD와 유사하게, AY-9944는 rd1 마우스에서의 광수용체 생존을 촉진시켰다. 따라서, 이들 데이터는, 콜레스테롤 합성을 감소시키는 것이 rd1 마우스에서의 광수용체 생존을 촉진시켰음을 나타냈다.
요약하면, 상기 데이터는, 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 차단하는 것이 사람 색소성 망막염에 대한 모델인 rd1 마우스에서 광수용체 세포 사멸을 감소시켰고, 광수용체 세포 생존을 촉진시켰음을 나타냈다.
실시예 15
AY-9944 및 BM 15.766을 이용한 콜레스테롤 생합성의 억제는 미엘린 상의 망막 신경절 세포 신경돌기의 성장을 촉진시켰다
상기 입증된 바와 같이, 콜레스테롤 합성을 감소시켰던 AY-9944는 뉴런 세포 생존을 촉진시켰다. 콜레스테롤 합성을 감소시키는 역할을 추가로 조사하기 위해, 콜레스테롤 합성을 감소시키는 것이 미엘린 상의 망막 신경절 세포 신경돌기의 성장을 촉진시켰는지를 조사하기 위한 연구를 수행하였다.
구체적으로, E7 병아리 배아로부터 망막 외식편을 제조하였고, 라미닌 또는 미엘린으로 코팅된 커버슬립 상에서 배양하였고, 대조군(DMSO) 또는 2개의 콜레스테롤 생합성의 억제제인 AY-9944(1μM) 또는 BM15.766(4μM)으로 치료하였다. 배양에 있어서 18hr 후, 외식편을 4% PFA로 고정시켰고, 알렉사488-팔로이딘으로 염색하였다. Cellsens 소프트웨어를 이용하여 신경돌기를 측정하였다. 망막 외식편을 라미닌(대조군) 또는 미엘린(CNS의 억제 화합물) 상에서 배양하였다. 라미닌 상에서, 축삭 성장은, 미엘린이 과성장을 억제하였으므로 미엘린과 비교하여 정상이었다. 콜레스테롤 억제제가 배지에 첨가된 경우, 이들은 라미닌 상의 과성장에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 이들은 미엘린 상의 과성장을 회복시켰고, 이는, 이들이 미엘린의 억제 활성을 억압하였음을 나타냈다.
실시예 16
실시예 17의 재료 및 방법
하기 실시예 16에 기술된 실험에서 사용된 재료 및 방법은 여기 실시예 15에 제공된다.
대뇌 국소 허혈 모델. 모든 실험에서, 체중 200 내지 250g의 암컷 스프라그-돌리 래트를 사용하였다. 간략하게, MCA에 사전 형성된 혈병을 주사함에 의해 국소 대뇌 허혈을 유도하였다. 래트를 3.0% 이소플루란으로 처음으로 마취시켰고, 이어서, 수술 동안에 페이스 마스크로 30:70 O2 및 NO2의 혼합물 중의 1.5% 이소플루란으로 유지하였다. 정상체온 래트에서 수술 지속시간 동안 그리고 수술 직후 기간에 동물이 마취로부터 완전히 회복될 때까지 가열 패드를 이용하여 체온을 37℃로 유지하였다.
배면 경부 피부의 정중선에 1.5cm를 종단으로 절개하였다. 우측 총 경정맥(CCA), 우측 내경정맥(ICA) 및 우측 외경정맥(ECA)를 노출시켰다. ECA의 원위부를 결찰시켜 절단하였다. 소 트롬빈(Thrombostat, TM Warner-Lambert Co.)이 충전된 변형된 폴리에틸렌-10 카테터를 작은 구멍을 통해 우측 ECA의 내강에 도입하였다. 10마이크로리터의 혈액을 카테터로 채혈하였고, 15분 동안 유지하여 혈병이 형성되도록 하였다. 일단 혈병이 형성되면, 카테터의 끝이 MCA의 기원으로부터 1 내지 1mm 떨어질 때까지 카테터를 내경정맥으로 17mm 전진시켰다. 이어서, 카테터 내에 사전형성된 혈병을 주사하였고, 카테터를 제거하였다. 수술은 일반적으로 15분 내에 종료되었고, 상처를 닫았다. 이어서, 동물을 케이지로 되돌려 보냈다. 이들의 케이지에 되돌려 보낸 후, 동물을 정상 회복에 대해 모니터링하였다.
뇌 경색 체적 및 부종의 정량. 경색 체적은 동측 반구체(ipsilateral hemisphere)로부터의 총 체적 중의 백분율로서 표시되었다. 2개의 반구체 사이의 체적 차이를 계산하고 좌측 반구체의 체적으로 나눔으로써 뇌 부종을 측정하였다.
간략하게, MCA 폐색 7일 후 마취된 래트를 사멸시켰다. 두개골로부터 뇌를 제거하였고, 빙냉 염수에서 약 5분 동안 냉각시켰다. 형태 측정 조사를 위해, 2mm 두께의 각막 절편을 래트 뇌 매트릭스(rat brain matrix)를 이용하여 절단하였다. 총 8개의 각막 절편을 수집하였고, 절편을 2%의 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 용액을 이용하여 염색하였다. 경색은 적색 정상 뇌의 배경 상에 옅은 백색으로 나타났다. 염색된 뇌 절펴을 Scan Jet(Hewlett Packard) 플랫베드 스캐너(flatbed scanner)로 스캐닝하였다. 화상을 분석하였고, 경색 체적 및 부종의 측정은 맹검되었다. 경색 체적은 하기 식을 이용하여 계산하였다:
경색 체적 = [좌측 반구체 체적 - (우측 반구체 체적 - 측정된 경색 체적)]/좌측 반구체 체적.
하기 식을 이용하여 뇌 팽윤(swelling)을 측정하였다:
팽윤 (부종) = (우측 반구체 체적 - 좌측 반구체 체적)/좌측 반구체 체적.
경색 체적 및 뇌 팽윤을 백분율로 표시하였다.
신경학적 결손 및 발작 활성. 각각의 래트의 신경학적 결손 및 발작 활성을 허혈 손상 후 2, 8, 24, 48, 72시간 및 1주째에(각각의 래트에 대해 6회) 어떠한 절차가 수행되었는지에 대한 지식이 없는 관찰자에 의해 주의 깊게 평가하였다.
간략하게, 변형된 베더슨 스코어링 시스템을 이용하여 신경학적 결손을 측정하였다. 변형된 시스템에서는 표준 채점(등급 0 내지 3) 시스템 대신에 0 내지 4의 채점 등급을 이용하여 행동을 평가하였다. 변형된 스코어링 시스템은 임상학적으로 적절하였고, 변형되지 않은 스코어링 시스템과 비교하여 행동을 평가하는 능력이 더 좋았다. 발작 활성은 라신(Racine) 스케일로 분류되었다. 사망률도 기록되었다.
실시예 17
뇌졸중
RGMa는 사람 성인 신경계에서(미엘린에서) 그리고 뇌졸중 후 반암부(penumbra)에서 높게 발현되었다. 사람 뇌에서의 국소 뇌 허혈 후, RGMa는 병변 부위에서 글고 경색 주위 영역에서 상향조절되었다. 병변 부위 및 경색 주위 영역은 제한된 재생을 가졌다. 상기 기술된 바와 같이, RGMa는 축삭 성장을 억제하고, 따라서, 손상 영역에서의 재생을 억제한다. 따라서, 추가의 연구를 수행하여 뇌졸중과 같은 허혈 발작(ischemic insult) 후 RGMa/네오제닌 경로를 조사하였다.
RGMa 는 허혈 발작 후 뉴런 생존을 촉진시켰다. 뇌졸중에서의 RGMa/네오제닌 경로의 역할을 평가하기 위해, 시험관내 뇌졸중 모델(산소 글루코스 박탈; OGD)을 이용하여 뇌졸중-유도된 세포 사멸을 연구하였다.
구체적으로, 망막 전량을 1시간 동안 OGD시켰다. 허혈 후, 전량을 24시간 동안 항온배양하였고, 요오드화 프로피디움(PI) 염색을 이용하여 사멸 세포를 동정하였다. 이러한 접근법을 이용하여, 배지에의 RGMa의 첨가는 세포 생존을 촉진시켰다(도 22). 또한, 이러한 접근법은, 항-네오제닌 항체가 세포 사멸을 회복시켰으므로 네오제닌이 세포 생존에서의 이러한 촉진을 매개하였음을 보여주었다.
이러한 연구를 확장하기 위해, 눈에의 RGMa 주사가 주요 눈 동맥의 결찰 후 세포 생존에 영향을 미쳐 눈 허혈을 유도하였는지를 시험하였다. 이러한 주사 치료는 대조군과 비교한 경우에 생존을 2배까지 향상시켰고(도 23), 이는 추가로 네오제닌/RGMa 경로가 허혈 발작 후 세포 사멸에 관여하였음을 나타낸다.
지질 래프트와의 네오제닌 회합을 방해하는 것은 OGD 후의 세포 생존을 촉진시켰다. 네오제닌이 지질 래프트 회합에 세포 사멸을 유도할 것을 요구하였는지를 측정하기 위해, 4Ig의 존재 하에 망막 전량에 대해 OGD를 수행하였고, 이는 상기 기술한 바와 같이 지질 래프트에의 네오제닌 국소화를 방지하였다. 이들 연구는 4Ig 펩타이드가 대조군과 비교하여 세포 생존을 향상시켰고 사멸 뉴런의 수를 2배 감소시켰음을 입증하였다(도 24).
지질 래프트와의 네오제닌 회합을 방해하는 것은 생체내 뇌 손상을 감소시켰다. 네오제닌이 세포 사멸을 유도하기 위한 지질 래프트 회합을 요구하였는지를 측정하기 위해, 혈병을 이용하여 중간 대뇌 동맥 폐색을 수행하였다. 동물을 펩타이드 대조군 또는 4Ig의 주사에 의해 매일 치료하였다. 이들 연구에서, 동물의 기능적 평가를 수행하였고, 뇌 손상을 조사하였다. 이들 연구는, 대조군과 비교하는 경우 4Ig의 존재 하에 뇌 부종 및 경색 체적이 유의하게 감소되었음을 입증하였다(도 25 및 도 26). 추가로, 대조군과 비교하는 경우에 4Ig 치료된 동물에서 행동 결손도 유의하게 감소되었다(도 27).
요약하면, 이들 데이터는, 뇌졸중과 같은 허혈 발병 후 지질 래프트와의 네오제닌 회합을 차단하는 것은 세포 생존을 촉진시켰고, 뇌 부종, 경색 체적, 및 행동 결손을 감소시켰음을 나타냈다.
실시예 18
다발성 경화증
상기 데이터는, 다발성 경화증과 관련된 모델인 척수 손상 및 시신경 손상 모델에서 4Ig 펩타이드가 뉴런 세포 생존 및 축삭 재생을 촉진시켰음을 나타냈다. RGMa/네오제닌 경로를 조정하는 것이 다발성 경화증을 약화시켰는지를 측정하기 위해, EAE 마우스 모델을 4Ig 펩타이드로 치료하였고, 이는 상기 기술한 바와 같이 지질 래프트에의 네오제닌 국소화를 차단하였다.
구체적으로, 4Ig가 EAE 모델에서 마비를 감소시켰는지를 시험하였다. EAE를 유도하기 위해, C57BL6/J 마우스에게 완전 프로인트 보조제(CFA)와 혼합된 MOGp35-55 펩타이드 유액을 주사하였다(50μg, 0일째). 또한, 2일째에, 중증의 믿을 만한 EAE를 생성시키기 위해서 동물에게 400ng의 백일해 독소(PTX)를 복강내 투여하였고, 이어서, 17일의 기간에 걸쳐 임상학적 징후를 조사하였다(도 28).
EAE 유도 후 3, 6 및 9일째에, 동물을 PBS 중의 3μg의 4Ig(IV 주사)로 또는 PBS(대조군)로 치료하였다. 17일 후, 대조군 마우스는, 이들이 심각하게 마비되었음을 나타내는 5에 가까운 임상학적 스코어를 나타냈다(도 29). 대조적으로, 4Ig 주사된 마우스는, 상기 기술된 바와 같이 4Ig가 지질 래프트 내의 네오제닌의 존재를 차단하였으므로 이들 마우스에서의 면역-매개된 마비에 지질 래프트 내의 네오제닌 존재가 요구되었음을 나타내는 1.4의 유의하게 낮은 스코어를 가졌다.
요약하면, 이들 데이터는, 4Ig 펩타이드를 통한 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 차단하는 것은 EAE 모델에서의 마비를 감소시켰음을 나타냈다.
실시예 19
RGMa 와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 차단하는 항체의 제조
상기 기술한 바와 같이, RGMa의 하기 부분은 네오제닌의 4Ig 도메인에 결합하였다: 아미노산 28 내지 73(즉, N-래프트 및 서열번호 2), 아미노산 40 내지 62(즉, 서열번호 4), 및 아미노산 54 내지 73 (즉, 서열번호 3). 상기 기술된 바와 같이, 네오제닌의 4Ig 도메인은 수탁번호 제AAC59662호의 아미노산 1 내지 383(서열번호 1)이었다. 다른 단편은 마우스 네오제닌의 4Ig 도메인(서열번호 8), 마우스 N-RGMc(서열번호 9), 마우스 N-RGMa(서열번호 10) 또는 수탁번호 제AAI43272의 아미노산 1 내지 417(사람 네오제닌; 서열번호 11)을 포함할 수 있다.
이들 RGma 펩타이드와 달리, 전장 RGMa는 도 2A에 나타낸 바와 같이 네오제닌의 4Ig 도메인에 결합할 수 없었다. 추가로, 도 17C의 데이터는, RGMa의 아미노산 40 내지 73도 네오제닌의 4Ig 도메인에 결합할 수 있음을 나타냈다. RGMa의 아미노산 40 내지 73은 서열번호 7에 제시된다. 종합하면, 이들 데이터는, RGMa의 아미노산 40 내지 73 내에 함유된 RGMa의 특정 구조가 4Ig에 결합하는데 요구될 수 있고, 따라서, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 매개하고 지질 래프트에 네오제닌을 유입시킨다는 것을 시사하였다. 이러한 구조는 전장 RGMa에 내포될 수 있고, 따라서, 전장 RGMa가 네오제닌의 4Ig-도메인에 결합하는 것을 방지할 수 있다. 이러한 내포(occlusion)는 다른 인자(들), 예를 들면, 상기 기술된 바와 같이 지질 래프트에의 네오제닌 유입에 요구되었던 BMP에 의해 제거될 수 있다. 내포의 제거는 RGMa에서의 입체구조 변화를 포함할 수 있다.
따라서, 4Ig 도메인에 결합하는 항체 또는 RGMa의 아미노산 40 내지 73 내에 함유된 이러한 구조는 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 차단할 수 있고, 따라서, 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 차단하고, 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킨다.
이들 RGMa 펩타이드 및 4Ig 펩타이드는 RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 차단하고, 따라서, 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 차단하는 항체를 생성시키고 동정하는데 사용될 것이다. 이들 항체는 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 차단함으로써 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 것으로 예측된다.
구체적으로, 이들 항체는 동물을 RGMa 펩타이드 또는 4Ig 펩타이드 중 하나 이상으로 면역화함으로써 생성될 것이다. 상기 동물로부터 그리고 도 2A, 도 9 및 도 17과 관련하여 기술되어 있는 결합 검정을 이용하여 혈청을 수집할 것이고, 혈청은 N-래프트와 4Ig 사이의 상호작용을 방해하는 혈청, 즉, 혈청의 존재 하에 N-래프트와 4Ig 사이의 결합이 감소되거나 측정불가능한 혈청들에 대해 스크리닝될 것이다. 이어서, 항체는, N-래프트와 4Ig 사이의 상호작용을 방해하는 이들 혈청으로부터 정제될 것이다. 이들 정제된 항체는 지질 래프트에의 네오제닌 유입을 차단하고, 따라서, 뉴런 세포 생존 및 축삭 성장 및/또는 재생을 촉진시킬 것임이 예측된다.
상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 수반되는 실시예는 단지 설명을 위한 것이고 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 여겨지지 않아야 하고, 이는 첨부된 청구범위 및 이들의 등가범위에 의해서만 한정됨을 이해한다.
개시된 실시형태에 대한 각종 변화 및 변형은 당해 분야 숙련가들에게 명백해질 것이다. 본 발명의 화학적 구조, 치환체, 유도체, 중간물, 합성물, 조성물, 제형, 또는 사용 방법에 관한 변화 및 변형을 제한 없이 포함하는 이러한 변화 및 변형은 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY HEALTH NETWORK <120> AGENTS DIRECTED AGAINST A CIS RGMA/NEOGENIN INTERACTION OR LIPID RAFTS AND USE OF THE SAME IN METHODS OF TREATMENT <130> 031777-9001-WOO1 <150> US 61/878,827 <151> 2013-09-17 <160> 11 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1443 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <221> MISC_FEATURE <223> Neogenin - Accession No. AAC59662 <400> 1 Arg Ser Gly Pro Arg Ser Pro Leu Thr Gly Ser Val Val Arg Thr Phe 1 5 10 15 Thr Pro Phe Tyr Phe Leu Val Glu Pro Met Asp Ile Leu Ser Val Arg 20 25 30 Gly Ala Ser Val Ile Met Asn Cys Ser Ser Tyr Cys Glu Thr Pro Pro 35 40 45 Lys Ile Glu Trp Lys Lys Asp Gly Thr Leu Leu Asn Leu Val Ser Asp 50 55 60 Asp Arg Arg Gln Leu Leu Pro Asp Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ser Val 65 70 75 80 Val His Ser Lys His Asn Lys Pro Asp Glu Gly Tyr Tyr Gln Cys Val 85 90 95 Ala Thr Val Glu Ser Leu Gly Ser Ile Val Ser Arg Thr Ala Lys Leu 100 105 110 Thr Val Ala Gly Leu Pro Arg Phe Thr Ser Gln Pro Glu Leu Ser Ser 115 120 125 Val Tyr Lys Gly Asn Ser 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Ser Asp Leu Val Phe Leu Lys Gln Pro Ser 245 250 255 Pro Leu Val Arg Val Ile Gly Gln Asp Val Val Leu Pro Cys Val Ala 260 265 270 Ser Gly Leu Pro Thr Pro Thr Ile Lys Trp Met Lys Asn Glu Glu Ala 275 280 285 Leu Asp Thr Glu Ser Ser Glu Arg Leu Val Leu Leu Ala Gly Gly Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Asp Val Thr Glu Asp Asp Ala Gly Thr Tyr Phe Cys 305 310 315 320 Ile Ala Asp Asn Gly Asn Glu Thr Ile Glu Ala Gln Ala Glu Leu Thr 325 330 335 Val Gln Ala Gln Pro Glu Phe Leu Lys Gln Pro Thr Asn Ile Tyr Ala 340 345 350 His Glu Ser Met Asp Ile Val Phe Glu Cys Glu Val Thr Gly Lys Pro 355 360 365 Thr Pro Thr Val Lys Trp Val Lys Asn Gly Asp Met Val Ile Pro Ser 370 375 380 Asp Tyr Phe Lys Ile Val Lys Glu His Asn Leu Gln Val Leu Gly Leu 385 390 395 400 Val Lys Ser Asp Glu Gly Phe Tyr Gln Cys Ile Ala Glu Asn Asp Val 405 410 415 Gly <210> 9 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse N-RGMc <400> 9 Met Gly Gln Ser Pro Ser Pro Arg Ser Pro His Gly Ser Pro Pro Thr 1 5 10 15 Leu Ser Thr Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Cys Gly Gln Ala His Ser 20 25 30 Gln Cys Lys Ile Leu Arg Cys Asn Ala Glu Tyr Val Ser Ser Thr Leu 35 40 45 Ser Leu Arg Gly Gly Gly Ser Pro Asp Thr Pro Arg Gly Gly Gly Arg 50 55 60 Gly Gly Leu Ala Ser Gly Gly Leu Cys Arg Ala Leu Arg Ser Tyr Ala 65 70 75 80 Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu Ala Phe 85 90 95 His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ile Gln His Asn Cys 100 105 110 Ser Arg Gln Gly Pro Thr Ala Pro Pro Pro Ala Arg Gly Pro Ala Leu 115 120 125 Pro Gly Ala Gly Pro Ala Pro Leu Thr Pro Asp Pro Cys Asp Tyr Glu 130 135 140 Ala Arg Phe Ser Arg Leu His Gly Arg Ala Pro Gly Phe Leu His Cys 145 150 155 160 Ala Ser Phe Gly Asp 165 <210> 10 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse N-RGMa <400> 10 Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp 1 5 10 15 Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Leu Trp Pro 20 25 30 Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Ile Ser Pro Cys 35 40 45 Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly 50 55 60 Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu 65 70 75 80 Arg Thr Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly 85 90 95 Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser 100 105 110 Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg 115 120 125 Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu 130 135 140 Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn 145 150 155 160 Tyr Thr <210> 11 <211> 1450 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Neogenin - Accession No. AAI43272 <400> 11 Met Ala Ala Glu Arg Gly Ala Arg Arg Leu Leu Ser Thr Pro Ser Phe 1 5 10 15 Trp Leu Tyr Cys Leu Leu Leu Leu Gly Arg Arg Ala Pro Gly Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Arg Ser Gly Ser Ala Pro Gln Ser Pro Gly Ala Ser Ile Arg 35 40 45 Thr Phe Thr Pro Phe Tyr Phe Leu Val Glu Pro Val Asp Thr Leu Ser 50 55 60 Val Arg Gly Ser Ser Val Ile Leu Asn Cys Ser Ala Tyr Ser Glu Pro 65 70 75 80 Ser Pro Lys Ile Glu Trp Lys Lys Asp Gly Thr Phe Leu Asn Leu Val 85 90 95 Ser Asp Asp Arg Arg Gln Leu Leu Pro Asp Gly Ser Leu Phe Ile Ser 100 105 110 Asn Val Val His Ser Lys His Asn Lys Pro Asp Glu Gly Tyr Tyr Gln 115 120 125 Cys Val Ala Thr Val Glu Ser Leu Gly Thr Ile Ile Ser Arg Thr Ala 130 135 140 Lys Leu Ile Val Ala Gly Leu Pro Arg Phe Thr Ser Gln Pro Glu Pro 145 150 155 160 Ser Ser Val Tyr Ala Gly Asn Asn Ala Ile Leu Asn Cys Glu Val Asn 165 170 175 Ala Asp Leu Val Pro Phe Val Arg Trp Glu Gln Asn Arg Gln Pro Leu 180 185 190 Leu Leu Asp Asp Arg Val Ile Lys Leu Pro Ser Gly Met Leu Val Ile 195 200 205 Ser Asn Ala Thr Glu Gly Asp Gly Gly Leu Tyr Arg Cys Val Val Glu 210 215 220 Ser Gly Gly Pro Pro Lys Tyr Ser Asp Glu Val Glu Leu Lys Val Leu 225 230 235 240 Pro Asp Pro Glu Val Ile Ser Asp Leu Val Phe Leu Lys Gln Pro Ser 245 250 255 Pro Leu Val Arg Val Ile Gly Gln Asp Val Val Leu Pro Cys Val Ala 260 265 270 Ser Gly Leu Pro Thr Pro Thr Ile Lys Trp Met Lys Asn Glu Glu Ala 275 280 285 Leu Asp Thr Glu Ser Ser Glu Arg Leu Val Leu Leu Ala Gly Gly Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Asp Val Thr Glu Asp Asp Ala Gly Thr Tyr Phe Cys 305 310 315 320 Ile Ala Asp Asn Gly Asn Glu Thr Ile Glu Ala Gln Ala Glu Leu Thr 325 330 335 Val Gln Ala Gln Pro Glu Phe Leu Lys Gln Pro Thr Asn Ile Tyr Ala 340 345 350 His Glu Ser Met Asp Ile Val Phe Glu Cys Glu Val Thr Gly Lys Pro 355 360 365 Thr Pro Thr Val Lys Trp Val Lys Asn Gly Asp Met Val Ile Pro Ser 370 375 380 Asp Tyr Phe Lys Ile Val Lys Glu His Asn Leu Gln Val Leu Gly Leu 385 390 395 400 Val Lys Ser Asp Glu Gly Phe Tyr Gln Cys Ile Ala Glu Asn Asp Val 405 410 415 Gly Asn Ala Gln Ala Gly Ala Gln Leu Ile Ile Leu Glu His Ala Pro 420 425 430 Ala Thr Thr Gly Pro Leu Pro Ser Ala Pro Arg Asp Val Val Ala Ser 435 440 445 Leu Val Ser Thr Arg Phe Ile Lys Leu Thr Trp Arg Thr Pro Ala Ser 450 455 460 Asp Pro His Gly Asp Asn Leu Thr Tyr Ser Val Phe Tyr Thr Lys Glu 465 470 475 480 Gly Ile Ala Arg Glu Arg Val Glu Asn Thr Ser His Pro Gly Glu Met 485 490 495 Gln Val Thr Ile Gln Asn Leu Met Pro Ala Thr Val Tyr Ile Phe Arg 500 505 510 Val Met Ala Gln Asn Lys His Gly Ser Gly Glu Ser Ser Ala Pro Leu 515 520 525 Arg Val Glu Thr Gln Pro Glu Val Gln Leu Pro Gly Pro Ala Pro Asn 530 535 540 Leu Arg Ala Tyr Ala Ala Ser Pro Thr Ser Ile Thr Val Thr Trp Glu 545 550 555 560 Thr Pro Val Ser Gly Asn Gly Glu Ile Gln Asn Tyr Lys Leu Tyr Tyr 565 570 575 Met Glu Lys Gly Thr Asp Lys Glu Gln Asp Val Asp Val Ser Ser His 580 585 590 Ser Tyr Thr Ile Asn Gly Leu Lys Lys Tyr Thr Glu Tyr Ser Phe Arg 595 600 605 Val Val Ala Tyr Asn Lys His Gly Pro Gly Val Ser Thr Pro Asp Val 610 615 620 Ala Val Arg Thr Leu Ser Asp Val Pro Ser Ala Ala Pro Gln Asn Leu 625 630 635 640 Ser Leu Glu Val Arg Asn Ser Lys Ser Ile Met Ile His Trp Gln Pro 645 650 655 Pro Ala Pro Ala Thr Gln Asn Gly Gln Ile Thr Gly Tyr Lys Ile Arg 660 665 670 Tyr Arg Lys Ala Ser Arg Lys Ser Asp Val Thr Glu Thr Leu Val Ser 675 680 685 Gly Thr Gln Leu Ser Gln Leu Ile Glu Gly Leu Asp Arg Gly Thr Glu 690 695 700 Tyr Asn Phe Arg Val Ala Ala Leu Thr Ile Asn Gly Thr Gly Pro Ala 705 710 715 720 Thr Asp Trp Leu Ser Ala Glu Thr Phe Glu Ser Asp Leu Asp Glu Thr 725 730 735 Arg Val Pro Glu Val Pro Ser Ser Leu His Val Arg Pro Leu Val Thr 740 745 750 Ser Ile Val Val Ser Trp Thr Pro Pro Glu Asn Gln Asn Ile Val Val 755 760 765 Arg Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Gly Ile Gly Ser Pro His Ala Gln Thr 770 775 780 Ile Lys Val Asp Tyr Lys Gln Arg Tyr Tyr Thr Ile Glu Asn Leu Asp 785 790 795 800 Pro Ser Ser His Tyr Val Ile Thr Leu Lys Ala Phe Asn Asn Val Gly 805 810 815 Glu Gly Ile Pro Leu Tyr Glu Ser Ala Val Thr Arg Pro His Thr Asp 820 825 830 Thr Ser Glu Val Asp Leu Phe Val Ile Asn Ala Pro Tyr Thr Pro Val 835 840 845 Pro Asp Pro Thr Pro Met Met Pro Pro Val Gly Val Gln Ala Ser Ile 850 855 860 Leu Ser His Asp Thr Ile Arg Ile Thr Trp Ala Asp Asn Ser Leu Pro 865 870 875 880 Lys His Gln Lys Ile Thr Asp Ser Arg Tyr Tyr Thr Val Arg Trp Lys 885 890 895 Thr Asn Ile Pro Ala Asn Thr Lys Tyr Lys Asn Ala Asn Ala Thr Thr 900 905 910 Leu Ser Tyr Leu Val Thr Gly Leu Lys Pro Asn Thr Leu Tyr Glu Phe 915 920 925 Ser Val Met Val Thr Lys Gly Arg Arg Ser Ser Thr Trp Ser Met Thr 930 935 940 Ala His Gly Thr Thr Phe Glu Leu Val Pro Thr Ser Pro Pro Lys Asp 945 950 955 960 Val Thr Val Val Ser Lys Glu Gly Lys Pro Lys Thr Ile Ile Val Asn 965 970 975 Trp Gln Pro Pro Ser Glu Ala Asn Gly Lys Ile Thr Gly Tyr Ile Ile 980 985 990 Tyr Tyr Ser Thr Asp Val Asn Ala Glu Ile His Asp Trp Val Ile Glu 995 1000 1005 Pro Val Val Gly Asn Arg Leu Thr His Gln Ile Gln Glu Leu Thr 1010 1015 1020 Leu Asp Thr Pro Tyr Tyr Phe Lys Ile Gln Ala Arg Asn Ser Lys 1025 1030 1035 Gly Met Gly Pro Met Ser Glu Ala Val Gln Phe Arg Thr Pro Lys 1040 1045 1050 Ala Ser Gly Ser Gly Gly Lys Gly Ser Arg Leu Pro Asp Leu Gly 1055 1060 1065 Ser Asp Tyr Lys Pro Pro Met Ser Gly Ser Asn Ser Pro His Gly 1070 1075 1080 Ser Pro Thr Ser Pro Leu Asp Ser Asn Met Leu Leu Val Ile Ile 1085 1090 1095 Val Ser Val Gly Val Ile Thr Ile Val Val Val Val Ile Ile Ala 1100 1105 1110 Val Phe Cys Thr Arg Arg Thr Thr Ser His Gln Lys Lys Lys Arg 1115 1120 1125 Ala Ala Cys Lys Ser Val Asn Gly Ser His Lys Tyr Lys Gly Asn 1130 1135 1140 Ser Lys Asp Val Lys Pro Pro Asp Leu Trp Ile His His Glu Arg 1145 1150 1155 Leu Glu Leu Lys Pro Ile Asp Lys Ser Pro Asp Pro Asn Pro Ile 1160 1165 1170 Met Thr Asp Thr Pro Ile Pro Arg Asn Ser Gln Asp Ile Thr Pro 1175 1180 1185 Val Asp Asn Ser Met Asp Ser Asn Ile His Gln Arg Arg Asn Ser 1190 1195 1200 Tyr Arg Gly His Glu Ser Glu Asp Ser Met Ser Thr Leu Ala Gly 1205 1210 1215 Arg Arg Gly Met Arg Pro Lys Met Met Met Pro Phe Asp Ser Gln 1220 1225 1230 Pro Pro Gln Pro Val Ile Ser Ala His Pro Ile His Ser Leu Asp 1235 1240 1245 Asn Pro His His His Phe His Ser Ser Ser Leu Ala Ser Pro Ala 1250 1255 1260 Arg Ser His Leu Tyr His Pro Gly Ser Pro Trp Pro Ile Gly Thr 1265 1270 1275 Ser Met Ser Leu Ser Asp Arg Ala Asn Ser Thr Glu Ser Val Arg 1280 1285 1290 Asn Thr Pro Ser Thr Asp Thr Met Pro Ala Ser Ser Ser Gln Thr 1295 1300 1305 Cys Cys Thr Asp His Gln Asp Pro Glu Gly Ala Thr Ser Ser Ser 1310 1315 1320 Tyr Leu Ala Ser Ser Gln Glu Glu Asp Ser Gly Gln Ser Leu Pro 1325 1330 1335 Thr Ala His Val Arg Pro Ser His Pro Leu Lys Ser Phe Ala Val 1340 1345 1350 Pro Ala Ile Pro Pro Pro Gly Pro Pro Thr Tyr Asp Pro Ala Leu 1355 1360 1365 Pro Ser Thr Pro Leu Leu Ser Gln Gln Ala Leu Asn His His Ile 1370 1375 1380 His Ser Val Lys Thr Ala Ser Ile Gly Thr Leu Gly Arg Ser Arg 1385 1390 1395 Pro Pro Met Pro Val Val Val Pro Ser Ala Pro Glu Val Gln Glu 1400 1405 1410 Thr Thr Arg Met Leu Glu Asp Ser Glu Ser Ser Tyr Glu Pro Asp 1415 1420 1425 Glu Leu Thr Lys Glu Met Ala His Leu Glu Gly Leu Met Lys Asp 1430 1435 1440 Leu Asn Ala Ile Thr Thr Ala 1445 1450

Claims (65)

  1. (i) 뉴런 세포 생존 및 (ii) 축삭 성장 및/또는 축삭 재생 둘 다를 촉진시키는 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제제가 지질 래프트(lipid raft)를 방해하는, 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제제가 배척성 인도 분자 A(RGMa: Repulsive Guidance Molecule A)와 네오제닌 사이의 시스(cis) 상호작용을 방해하는, 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제제가 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물인, 제제.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제제가 펩타이드 제제인, 제제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  8. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  9. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  10. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  11. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  12. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  13. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  14. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  15. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하고, 이에 의해 지질 래프트로의 네오제닌의 유입(recruitment)이 차단되는, 제제.
  16. 제4항에 있어서, 상기 제제가 항체인, 제제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 제제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 제제.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 제제.
  20. 제17항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 제제.
  21. 제17항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 제제.
  22. 제17항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 제제.
  23. 제17항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 제제.
  24. 제17항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 제제.
  25. 제17항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 제제.
  26. 제17항에 있어서, 상기 항체가, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하고, 이에 의해 지질 래프트로의 네오제닌의 유입(recruitment)이 차단되는, 제제.
  27. 제4항에 있어서, 상기 제제가 콜레스테롤-저하제인, 제제.
  28. 제27항에 있어서, 상기 콜레스테롤-저하제가, 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD), 콜레스테롤 산화효소(CO), AY-9944, 스타틴, 서브틸리신/켁신 유형 9(PCK9) 억제제, 나이스타틴, 필리핀, 프로단백질 전환효소, BM15.766, 알킬인지질 유사체, 및 이들의 임의의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제제.
  29. 제28항에 있어서, 상기 콜레스테롤-저하제가 지질 래프트를 방해하고, 이에 의해 지질 래프트로의 네오제닌의 유입이 차단되는, 제제.
  30. 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법은, 상기 대상체에게 제1항의 제제를 투여함을 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 질환이, 색소성 망막염, 허혈, 다발성 경화증, 척수 손상, 및 시신경 손상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 허혈이 뇌졸중인, 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 제제가 펩타이드 제제, 항체, 콜레스테롤-저하제, 또는 이들의 임의의 배합물인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 제제가 펩타이드 제제이고, 여기서, 상기 펩타이드 제제는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 제제가 콜레스테롤-저하제이고, 여기서, 상기 콜레스테롤-저하제는, 메틸-β-사이클로덱스트린(MβCD), 콜레스테롤 산화효소(CO), AY-9944, 스타틴, 서브틸리신/켁신 유형 9(PCK9) 억제제, 나이스타틴, 필리핀, 프로단백질 전환효소, BM15.766, 알킬인지질 유사체, 및 이들의 임의의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 제제가 항체이고, 여기서, 상기 항체는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 방법.
  37. 제30항에 있어서, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제30항에 있어서, 지질 래프트를 방해하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  39. 제31항에 있어서, 상기 질환이 척수 손상이고, 여기서, 상기 방법이, 상기 대상체에서의 운동 기능(locomoter function)을 회복시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  40. 제31항에 있어서, 상기 질환이 색소성 망막염이고, 여기서, 상기 방법이, 상기 대상체에서의 광수용기(photoreceptor) 세포의 생존을 촉진시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제32항에 있어서, 상기 방법이, 상기 대상체에서 경색 체적, 뇌 부종, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 감소시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  42. 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) RGM 펩타이드 및 네오제닌 펩타이드를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(여기서, 상기 RGM 펩타이드는, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 네오제닌 펩타이드는, 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열, 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다);
    (b) 상기 제제의 존재 하에 상기 혼합물을 항온처리하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 항온처리된 혼합물에서 RGM 펩타이드와 네오제닌 펩타이드 사이의 특이적 결합의 수준을 검출하는 단계(여기서, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준에 대한 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준의 차이는, 상기 제제가 시스 상호작용을 조정한다는 것을 나타낸다)
    를 포함하는, 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 조정하는 제제를 확인하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 제제가 항체 또는 항체 단편인, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 RGM 펩타이드가 RGMa 펩타이드이고, 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열인, 방법.
  45. 제42항에 있어서, 상기 RGM 펩타이드가 RGMa 펩타이드이고, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열인, 방법.
  46. 제42항에 있어서, 상기 RGM 펩타이드가 RGMa 펩타이드이고, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열인, 방법.
  47. 제42항에 있어서, 상기 RGM 펩타이드가 RGMa 펩타이드이고, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열인, 방법.
  48. 제42항에 있어서, 상기 RGM 펩타이드가 RGMc 펩타이드이고, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열인, 방법.
  49. 제42항에 있어서, 상기 RGM 펩타이드가 RGMa 펩타이드이고, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열인, 방법.
  50. 제42항에 있어서, 상기 네오제닌 펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383인, 방법.
  51. 제42항에 있어서, 상기 네오제닌 펩타이드가, 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열인, 방법.
  52. 제42항에 있어서, 상기 조정이, RGMa와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는 것을 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 제제의 존재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 검출된 수준이, 상기 제제의 부재 하의 네오제닌 펩타이드에 대한 RGM 펩타이드의 특이적 결합의 수준보다 더 낮은 경우, 상기 제제가 시스 상호작용을 방해하는 것인, 방법.
  54. 서열번호 1의 아미노산 1 내지 383을 포함하는 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는, 펩타이드.
  55. 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는, 펩타이드.
  56. 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는, 펩타이드.
  57. 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는, 펩타이드.
  58. 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는, 펩타이드.
  59. 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는, 펩타이드.
  60. 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는, 펩타이드.
  61. 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는, 펩타이드.
  62. 제6항에 있어서, 상기 펩타이드 제제가, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는, 제제.
  63. 제17항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는, 제제.
  64. 제42항에 있어서, 상기 네오제닌 펩타이드가 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417인, 방법.
  65. 서열번호 11의 아미노산 1 내지 417을 포함하는 아미노산 서열과 약 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 배척성 인도 분자 A(RGMa)와 네오제닌 사이의 시스 상호작용을 방해하는, 펩타이드.
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