JPWO2005087268A1 - 軸索再生促進剤 - Google Patents
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Abstract
RGM様タンパク質阻害剤を有効成分として含有する軸索再生促進剤が開示される。RGM様タンパク質阻害剤には、抗RGM様タンパク質抗体、Y27632等のRGM様タンパク質阻害剤、およびRGM様タンパク質の転写または翻訳を阻害しうるアンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ等が含まれる。本発明の軸索再生促進剤は，中枢神経の軸索の再生に有効であり，交通事故や脳血管障害等により脊髄等の中枢神経系に損傷を受けた患者の治療等に寄与する。
Description
本発明は，神経細胞，特に，中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進することができる軸索再生促進剤に関する。
脊髄等の中枢神経が交通事故等に起因する傷害あるいは脳血管障害等で損傷を受けると，神経機能は失われたまま再生することはできない。末梢神経が再生するのとは対照的である。中枢神経は，損傷すると再生できないので，中枢神経を損傷するとしばしば部分的又は完全な麻痺が起きる。したがって，損傷した中枢神経を再生させることは医療分野における重要な課題である。
もっとも，成人の中枢神経の軸索が，末梢神経のグラフトを介して再生し得る（非特許文献１）ことから，成人の中枢神経が再生しない主な原因は，神経細胞を取り巻く局所的な環境にあることが示唆される。これまでに，中枢神経の再生を阻害する３つの主な阻害物質として，Nogo，ミエリン結合糖タンパク質(MAG)及び乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質(OMgp)が同定されている。Nogoは，モノクローナル抗体IN-1の対応抗原として同定された（非特許文献２〜４）。ミエリン鞘の形成及び維持に重要な役割を果たすことが知られているMAG(非特許文献５〜８）は，ある種のニューロンからの軸索の成長を阻害することが見出された（非特許文献９，１０）。成人中枢神経の白質中の主たるピーナツアグルチニン−結合ポリペプチドであるOMgp（非特許文献１１）は，軸索成長の第３の阻害物質として同定された（非特許文献１２，１３）。Nogo，MAG及びOMgpは，p75をコレセプターとしてNgRに結合することが知られており，このことは，これらが共通の信号伝達経路を共有していることを示唆している（非特許文献１４〜１７）。
これらの阻害物質を排除ないし阻害することにより，軸索を再生することが研究された。しかしながら，これらの阻害物質のそれぞれをノックアウトしたマウスを用いた研究により，これらの阻害物質を排除しただけでは中枢神経の軸索が再生されないことがわかった（非特許文献１８〜２２）。さらに，機能的なp75NTRを枯渇させたり，可溶性p75N-Fcを投与しても，損傷した脊髄の再生が促進されなかったことが報告されている（非特許文献２３）。
［非特許文献１］ S. David, A. J. Aguayo, Science 214, 931-3 (Nov 20, 1981).
［非特許文献２］ M. S. Chen et al., Nature 403, 434-9 (Jan 27, 2000).
［非特許文献３］ T. GrandPre, F. Nakamura, T. Vartanian, S. M. Strittmatter, Nature 403, 439-44 (Jan 27, 2000).
［非特許文献４］ P. Caroni, M. E. Schwab, Neuron 1, 85-96 (Mar, 1988).
［非特許文献５］ S. Carenini, D. Montag, H. Cremer, M. Schachner, R. Martini, Cell Tissue Res 287, 3-9 (Jan, 1997).
［非特許文献６］ M. Fruttiger, D. Montag, M. Schachner, R. Martini, Eur J Neurosci 7, 511-5 (Mar 1, 1995).
［非特許文献７］ N. Fujita et al., J Neurosci 18, 1970-8 (Mar 15, 1998).
［非特許文献８］ J. Marcus, J. L. Dupree, B. Popko, J Cell Biol 156, 567-77 (Feb 4, 2002).
［非特許文献９］ G. Mukhopadhyay, P. Doherty, F. S. Walsh, P. R. Crocker, M. T. Filbin, Neuron 13, 757-67 (Sep, 1994).
［非特許文献１０］ L. McKerracher et al., Neuron 13, 805-11 (Oct, 1994).
［非特許文献１１］ D. D. Mikol, K. Stefansson, J Cell Biol 106, 1273-9 (Apr, 1988).
［非特許文献１２］ V. Kottis et al., J Neurochem 82, 1566-9 (Sep, 2002).
［非特許文献１３］ K. C. Wang et al., Nature 417, 941-4 (Jun 27, 2002).
［非特許文献１４］ K. C. Wang, J. A. Kim, R. Sivasankaran, R. Segal, Z. He, Nature 420, 74-8 (Nov 7, 2002).
［非特許文献１５］ M. Domeniconi et al., Neuron 35, 283-90 (Jul 18, 2002).
［非特許文献１６］ A. E. Fournier, T. GrandPre, S. M. Strittmatter, Nature 409, 341-6 (Jan 18, 2001).
［非特許文献１７］ T. Yamashita, H. Higuchi, M. Tohyama, J Cell Biol 157, 565-70 (May 13, 2002).
［非特許文献１８］ U. Bartsch et al., Neuron 15, 1375-81 (Dec, 1995).
［非特許文献１９］ C. J. Woolf, Neuron 38, 153-6 (Apr 24, 2003).
［非特許文献２０］ J. E. Kim, S. Li, T. GrandPre, D. Qiu, S. M. Strittmatter, Neuron 38, 187-99 (Apr 24, 2003).
［非特許文献２１］ B. Zheng et al., Neuron 38, 213-24 (Apr 24, 2003).
［非特許文献２２］ M. Simonen et al., Neuron 38, 201-11 (Apr 24, 2003).
［非特許文献２３］ X. Song et al., J Neurosci 24, 542-6 (Jan 14, 2004).
［非特許文献２４］ P. P. Monnier et al., Nature 419, 392-5 (Sep 26, 2002).
［非特許文献２５］ B. K. Muller, D. G. Jay, F. Bonhoeffer, Curr Biol 6, 1497-502 (Nov 1, 1996).
［非特許文献２６］ C. J. Woolf, S. Bloechlinger, Science 297, 1132-4 (Aug 16, 2002).
［非特許文献２７］ B. Niederost, T. Oertle, J. Fritsche, R. A. McKinney, C. E. Bandtlow, J Neurosci 22, 10368-76 (Dec 1, 2002).
［非特許文献２８］ M. Lehmann et al., J Neurosci 19, 7537-47 (Sep 1, 1999).
［非特許文献２９］ P. Dergham et al., J Neurosci 22, 6570-7 (Aug 1, 2002).
［非特許文献３０］ P. P. Monnier, A. Sierra, J. M. Schwab, S. Henke-Fahle, B. K. Mueller, Mol Cell Neurosci 22, 319-30 (Mar, 2003).
［非特許文献３１］ M. Uehata et al., Nature 389, 990-4 (Oct 30, 1997).
［非特許文献３２］ A. A. Habib et al., J Neurochem 70, 1704-11 (Apr, 1998).
［非特許文献３３］ H. Liu, C. E. Ng, B. L. Tang, Neurosci Lett 328, 257-60 (Aug 16, 2002).
［非特許文献３４］ A. B. Huber, O. Weinmann, C. Brosamle, T. Oertle, M. E. Schwab, J Neurosci 22, 3553-67 (May 1, 2002).
［非特許文献３５］ D. Hunt, R. S. Coffin, P. N. Anderson, J Neurocytol 31, 93-120 (Feb, 2002).
［非特許文献３６］ L. L. Jones, Y. Yamaguchi, W. B. Stallcup, M. H. Tuszynski, J Neurosci 22, 2792-803 (Apr 1, 2002).
［非特許文献３７］ J. W. Fawcett, R. A. Asher, Brain Res Bull 49, 377-91 (Aug, 1999).
［非特許文献２］ M. S. Chen et al., Nature 403, 434-9 (Jan 27, 2000).
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［非特許文献４］ P. Caroni, M. E. Schwab, Neuron 1, 85-96 (Mar, 1988).
［非特許文献５］ S. Carenini, D. Montag, H. Cremer, M. Schachner, R. Martini, Cell Tissue Res 287, 3-9 (Jan, 1997).
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［非特許文献８］ J. Marcus, J. L. Dupree, B. Popko, J Cell Biol 156, 567-77 (Feb 4, 2002).
［非特許文献９］ G. Mukhopadhyay, P. Doherty, F. S. Walsh, P. R. Crocker, M. T. Filbin, Neuron 13, 757-67 (Sep, 1994).
［非特許文献１０］ L. McKerracher et al., Neuron 13, 805-11 (Oct, 1994).
［非特許文献１１］ D. D. Mikol, K. Stefansson, J Cell Biol 106, 1273-9 (Apr, 1988).
［非特許文献１２］ V. Kottis et al., J Neurochem 82, 1566-9 (Sep, 2002).
［非特許文献１３］ K. C. Wang et al., Nature 417, 941-4 (Jun 27, 2002).
［非特許文献１４］ K. C. Wang, J. A. Kim, R. Sivasankaran, R. Segal, Z. He, Nature 420, 74-8 (Nov 7, 2002).
［非特許文献１５］ M. Domeniconi et al., Neuron 35, 283-90 (Jul 18, 2002).
［非特許文献１６］ A. E. Fournier, T. GrandPre, S. M. Strittmatter, Nature 409, 341-6 (Jan 18, 2001).
［非特許文献１７］ T. Yamashita, H. Higuchi, M. Tohyama, J Cell Biol 157, 565-70 (May 13, 2002).
［非特許文献１８］ U. Bartsch et al., Neuron 15, 1375-81 (Dec, 1995).
［非特許文献１９］ C. J. Woolf, Neuron 38, 153-6 (Apr 24, 2003).
［非特許文献２０］ J. E. Kim, S. Li, T. GrandPre, D. Qiu, S. M. Strittmatter, Neuron 38, 187-99 (Apr 24, 2003).
［非特許文献２１］ B. Zheng et al., Neuron 38, 213-24 (Apr 24, 2003).
［非特許文献２２］ M. Simonen et al., Neuron 38, 201-11 (Apr 24, 2003).
［非特許文献２３］ X. Song et al., J Neurosci 24, 542-6 (Jan 14, 2004).
［非特許文献２４］ P. P. Monnier et al., Nature 419, 392-5 (Sep 26, 2002).
［非特許文献２５］ B. K. Muller, D. G. Jay, F. Bonhoeffer, Curr Biol 6, 1497-502 (Nov 1, 1996).
［非特許文献２６］ C. J. Woolf, S. Bloechlinger, Science 297, 1132-4 (Aug 16, 2002).
［非特許文献２７］ B. Niederost, T. Oertle, J. Fritsche, R. A. McKinney, C. E. Bandtlow, J Neurosci 22, 10368-76 (Dec 1, 2002).
［非特許文献２８］ M. Lehmann et al., J Neurosci 19, 7537-47 (Sep 1, 1999).
［非特許文献２９］ P. Dergham et al., J Neurosci 22, 6570-7 (Aug 1, 2002).
［非特許文献３０］ P. P. Monnier, A. Sierra, J. M. Schwab, S. Henke-Fahle, B. K. Mueller, Mol Cell Neurosci 22, 319-30 (Mar, 2003).
［非特許文献３１］ M. Uehata et al., Nature 389, 990-4 (Oct 30, 1997).
［非特許文献３２］ A. A. Habib et al., J Neurochem 70, 1704-11 (Apr, 1998).
［非特許文献３３］ H. Liu, C. E. Ng, B. L. Tang, Neurosci Lett 328, 257-60 (Aug 16, 2002).
［非特許文献３４］ A. B. Huber, O. Weinmann, C. Brosamle, T. Oertle, M. E. Schwab, J Neurosci 22, 3553-67 (May 1, 2002).
［非特許文献３５］ D. Hunt, R. S. Coffin, P. N. Anderson, J Neurocytol 31, 93-120 (Feb, 2002).
［非特許文献３６］ L. L. Jones, Y. Yamaguchi, W. B. Stallcup, M. H. Tuszynski, J Neurosci 22, 2792-803 (Apr 1, 2002).
［非特許文献３７］ J. W. Fawcett, R. A. Asher, Brain Res Bull 49, 377-91 (Aug, 1999).
本発明の目的は，中枢神経の軸索の再生を促進することができる，新規な軸索再生促進剤を提供することである。
本願発明者らは，鋭意研究の結果，脊髄の白質及び灰白質中に，ニワトリ胎児において，網膜蓋体の突起の形成に関与するRGM(repulsive guidance molecule)（非特許文献２４及び２５）と相同性を有するタンパク質（本明細書及び特許請求の範囲において「RGM様タンパク質」と呼ぶ）が発現しており，脊髄を損傷すると，該タンパク質の発現が増大することを見出した。さらに，該タンパク質が中枢神経の軸索の成長を阻害する活性を有することを見出した。そして，抗RGM様タンパク質抗体やY27632のような，RGM様タンパク質阻害剤でRGM様タンパク質を処理することにより，RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性が消失することを見出し，RGM様タンパク質阻害剤を軸索成長促進剤として利用できることに想到し，本発明を完成した。
すなわち，本発明は，RGM様タンパク質阻害剤を有効成分として含有する軸索再生促進剤を提供する。好ましくは，前記RGM様タンパク質阻害剤は，抗RGM様タンパク質抗体である。また好ましくは，前記RGM様タンパク質阻害剤は，Y27632である。
好ましくは，前記軸索は，中枢神経系の軸索である。
本発明の別の観点においては，本発明は，軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質をRGM様タンパク質と接触させ，前記試験物質がRGM様タンパク質の機能を阻害するか否かを判定することを含む方法を提供する。
本発明によれば，中枢神経の軸索の再生を促進することができる，新規な軸索再生促進剤が提供された。本発明の軸索再生促進剤は，中枢神経の軸索の再生に有効であり，脊髄等の中枢神経系に損傷を受けた患者の治療等に大いに寄与すると期待される。
上記の通り，本願発明者らは先に，ニワトリ胎児においてRGM様タンパク質が脊髄の白質及び灰白質中に発現していることを見出した。ヒトにおいては、ニワトリ胎児RGM様タンパク質と相同性を有する遺伝子が脳で発現されていることが確認された。ヒトのRGM様タンパク質の遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す。また、ラットのRGM様タンパク質の遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列番号３及び４に示す。
下記実施例において具体的に記載するように，RGM様タンパク質は軸索の成長を阻害する活性を有し，また，脊髄が損傷すると，その発現が増大する。さらに，下記実施例において，抗RGM様タンパク質抗体をニューロンに作用させることにより，RGM様タンパク質による軸索成長阻害が見られなくなることが確認された。従って，抗RGM様タンパク質抗体のような，RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性を中和する物質は，軸索再生促進剤として用いることができる。
従って，本発明の軸索再生促進剤は，RGM様タンパク質阻害剤を有効成分として含有する。ここで，「RGM様タンパク質阻害剤」とは，RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性を消失又は少なくとも有意に減少させる物質を意味する。RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性は，後述する実施例に記載の通りに調べることができる。
本発明のRGM様タンパク質阻害剤として特に好ましいものは抗RGM様タンパク質抗体である。本明細書において，「抗RGM様タンパク質抗体」とは，RGM様タンパク質と抗原抗体反応により結合しうる抗体を意味する。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
RGM様タンパク質に結合するポリクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，RGM様タンパク質を感作抗原として用いて動物を免疫し，その血清から得ることができる。RGM様タンパク質に結合するモノクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，RGM様タンパク質を感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし，このハイブリドーマを培養することにより得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体には，ハイブリドーマにより産生される抗体に加えて，抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体，キメラ抗体，ＣＤＲ移植抗体，およびこれらの抗体の断片等が含まれる。
遺伝子組み換え抗体は，抗RGM様タンパク質抗体を生産するハイブリドーマから抗体をコードするｃＤＮＡをクローニングし，これを発現ベクター中に挿入して，動物細胞，植物細胞などを形質転換し，この形質転換体を培養することにより製造することができる。キメラ抗体とは，ある動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体である。RGM様タンパク質に結合しうる抗体断片としては，Fab，F(ab')2，Fab'，scFv，ディアボディー等があげられる。
抗体産生細胞の作製
RGM様タンパク質に結合する抗体を産生する細胞は，当該技術分野においてよく知られる方法により取得することができる。RGM様タンパク質を感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。より詳細には，まず、抗原となるRGM様タンパク質を製造する。市販の脳cDNAライブラリーにRGM様タンパク質のcDNAが含まれているので，市販の脳cDNAライブラリーを鋳型としたＰＣＲにより、容易にこの遺伝子の増幅産物を得ることができ、この遺伝子を適当なベクターに挿入して、組換え的にRGM様タンパク質を生成することができる。次に、このようにして製造したRGM様タンパク質を抗原として，動物の皮下，静脈内または腹腔内に投与する。免疫動物としては，マウス，ラット，ハムスター，ウサギ，ヤギ等の哺乳動物を用いることができる。好ましくは，抗原をキャリアタンパク質に結合させるか，フロインド完全アジュバント等の適当なアジュバントとともに抗原を投与する。あるいは、抗原としてRGM様タンパク質の部分ペプチドを用いてもよい。
RGM様タンパク質に結合する抗体を産生する細胞は，当該技術分野においてよく知られる方法により取得することができる。RGM様タンパク質を感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。より詳細には，まず、抗原となるRGM様タンパク質を製造する。市販の脳cDNAライブラリーにRGM様タンパク質のcDNAが含まれているので，市販の脳cDNAライブラリーを鋳型としたＰＣＲにより、容易にこの遺伝子の増幅産物を得ることができ、この遺伝子を適当なベクターに挿入して、組換え的にRGM様タンパク質を生成することができる。次に、このようにして製造したRGM様タンパク質を抗原として，動物の皮下，静脈内または腹腔内に投与する。免疫動物としては，マウス，ラット，ハムスター，ウサギ，ヤギ等の哺乳動物を用いることができる。好ましくは，抗原をキャリアタンパク質に結合させるか，フロインド完全アジュバント等の適当なアジュバントとともに抗原を投与する。あるいは、抗原としてRGM様タンパク質の部分ペプチドを用いてもよい。
下記実施例では，配列番号４に示すアミノ酸配列を有するラットRGM様タンパク質の第３０９番目のアミノ酸残基（以下，「309aa」のように記載）から322aaまでの部分ペプチドを化学合成して免疫原として用いたところ、この部分ペプチドに対するポリクローナル抗体が，RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性の中和活性を有することが見出された。したがって、ヒト遺伝子の対応する領域を含むポリペプチドを免疫原として用いて、ヒトRGM様タンパク質に対する中和抗体を得ることができる。
抗原の投与は，１−３週間毎に数回行う。血清中の免疫グロブリンの量をＥＬＩＳＡ法などにより測定することにより，抗体価をモニターする。十分に抗体価が上昇した後，この動物から免疫細胞を取り出す。免疫細胞としては好ましくは脾臓細胞を用いる。抗体産生免疫細胞と，同種の哺乳動物に由来する骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマを作製するのに適した各種の骨髄腫細胞株が市販されている。融合は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，例えばＰＥＧの存在下で行い，ＨＡＴ培地で融合細胞を選択する。培養上清をＥＬＩＳＡ法などによりアッセイして，抗原と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。次に，限界希釈法により目的とする抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることができる。さらに、得られたハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体について，下記実施例に記載する軸索成長アッセイを行い，RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性を中和する活性を有するハイブリドーマを選択することができる。
モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は，モノクローナル抗体産生細胞を培養して得られる培養液の上清から，またはあらかじめ２，４，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで前処理したマウスにモノクローナル抗体産生細胞を腹腔内投与し，接種後７日から１０日目にマウスの腹水を採取し，遠心分離し，上清を分取することにより製造することができる。モノクローナル抗体の精製は，通常のタンパク質精製方法，例えば，塩析，限外濾過，ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ＨＰＬＣ等の方法を用いて行うことができる。好ましくは，プロテインＡカラムによるアフィニティークロマトグラフィーを行う。精製したモノクローナル抗体のサブクラスは，市販のマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いてタイピングすることにより決定することができる。
モノクローナル抗体は，モノクローナル抗体産生細胞を培養して得られる培養液の上清から，またはあらかじめ２，４，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで前処理したマウスにモノクローナル抗体産生細胞を腹腔内投与し，接種後７日から１０日目にマウスの腹水を採取し，遠心分離し，上清を分取することにより製造することができる。モノクローナル抗体の精製は，通常のタンパク質精製方法，例えば，塩析，限外濾過，ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ＨＰＬＣ等の方法を用いて行うことができる。好ましくは，プロテインＡカラムによるアフィニティークロマトグラフィーを行う。精製したモノクローナル抗体のサブクラスは，市販のマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いてタイピングすることにより決定することができる。
抗体遺伝子の塩基配列の解析
本発明のモノクローナル抗体をコードする抗体遺伝子の塩基配列は，得られたモノクローナル抗体産生細胞の遺伝子を解析することにより得ることができる。モノクローナル抗体産生細胞から全ＲＮＡを抽出し，これを鋳型としてリバーストランスクリプターゼを用いてｃＤＮＡ断片を調整する。次に，適切に設計されたプライマーを用いてＰＣＲにより抗体遺伝子のＶ領域を増幅し，この領域のｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
本発明のモノクローナル抗体をコードする抗体遺伝子の塩基配列は，得られたモノクローナル抗体産生細胞の遺伝子を解析することにより得ることができる。モノクローナル抗体産生細胞から全ＲＮＡを抽出し，これを鋳型としてリバーストランスクリプターゼを用いてｃＤＮＡ断片を調整する。次に，適切に設計されたプライマーを用いてＰＣＲにより抗体遺伝子のＶ領域を増幅し，この領域のｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
抗体の特異性の確認
本発明のモノクローナル抗体の結合の特異性は，ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，免疫薄層クロマトグラフィー，BIAcore，蛍光抗体法等の当該技術分野において知られる方法を用いて確認することができる。例えば，RGM様タンパク質を固定化したマイクロプレートに，２倍希釈系列の本発明のモノクローナル抗体を加えてインキュベートした後，酵素標識二次抗体を加え，基質を加えて発色させ，マイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。
本発明のモノクローナル抗体の結合の特異性は，ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，免疫薄層クロマトグラフィー，BIAcore，蛍光抗体法等の当該技術分野において知られる方法を用いて確認することができる。例えば，RGM様タンパク質を固定化したマイクロプレートに，２倍希釈系列の本発明のモノクローナル抗体を加えてインキュベートした後，酵素標識二次抗体を加え，基質を加えて発色させ，マイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。
組換え型抗体
本発明の抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用して，遺伝子組換え技術を用いて組換え型の抗体を製造することができる。組換え型の抗RGM様タンパク質モノクローナル抗体を製造するためには，本発明の抗体をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み，宿主細胞に導入する。宿主細胞としては，大腸菌，酵母，哺乳動物細胞，昆虫細胞，植物細胞などを用いることができ，特に哺乳類細胞，例えば，CHO，COS，BHKを用いることが好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は，例えば塩化カルシウム法，リン酸カルシウム法，DEAEデキストラン法，カチオン性リポソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法，エレクトロポーレーション法，リポフェクションなどの方法により行うことができる。得られた形質転換宿主細胞を培養し，抗体を発現させることにより，組換え型の抗体を製造することができる。
本発明の抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用して，遺伝子組換え技術を用いて組換え型の抗体を製造することができる。組換え型の抗RGM様タンパク質モノクローナル抗体を製造するためには，本発明の抗体をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み，宿主細胞に導入する。宿主細胞としては，大腸菌，酵母，哺乳動物細胞，昆虫細胞，植物細胞などを用いることができ，特に哺乳類細胞，例えば，CHO，COS，BHKを用いることが好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は，例えば塩化カルシウム法，リン酸カルシウム法，DEAEデキストラン法，カチオン性リポソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法，エレクトロポーレーション法，リポフェクションなどの方法により行うことができる。得られた形質転換宿主細胞を培養し，抗体を発現させることにより，組換え型の抗体を製造することができる。
キメラ抗体
キメラ抗体とは，ある動物（例えばマウス）に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他の動物（例えばヒト）に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体である。キメラ抗体は，RGM様タンパク質に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから，抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，一方，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，これらを組み合わせて適当な発現ベクター中に挿入して，宿主細胞中で発現させることにより，組換え的に製造することができる。
キメラ抗体とは，ある動物（例えばマウス）に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他の動物（例えばヒト）に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体である。キメラ抗体は，RGM様タンパク質に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから，抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，一方，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，これらを組み合わせて適当な発現ベクター中に挿入して，宿主細胞中で発現させることにより，組換え的に製造することができる。
ＣＤＲ移植抗体
ＣＤＲ移植抗体は，ある動物（例えばマウス）の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の動物（例えばヒト）の抗体の相補性決定領域に移植した抗体である。ＣＤＲ移植抗体をコードする遺伝子は，RGM様タンパク質に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマからクローニングされた抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列に基づいて，それぞれＣＤＲ１，２，３をコードする遺伝子配列を設計し，他の動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベクター中の対応するＣＤＲ１，２，３の配列と置き換えることにより得ることができる。例えば，マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するように設計した数個のプライマーを用いて，ＰＣＲ法により合成することができる。あるいは，合成ＤＮＡを用いて全配列を構築してもよい。この発現ベクターを適当な宿主細胞中で発現させることにより，ＣＤＲ移植抗体を組換え的に製造することができる。
ＣＤＲ移植抗体は，ある動物（例えばマウス）の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の動物（例えばヒト）の抗体の相補性決定領域に移植した抗体である。ＣＤＲ移植抗体をコードする遺伝子は，RGM様タンパク質に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマからクローニングされた抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列に基づいて，それぞれＣＤＲ１，２，３をコードする遺伝子配列を設計し，他の動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベクター中の対応するＣＤＲ１，２，３の配列と置き換えることにより得ることができる。例えば，マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するように設計した数個のプライマーを用いて，ＰＣＲ法により合成することができる。あるいは，合成ＤＮＡを用いて全配列を構築してもよい。この発現ベクターを適当な宿主細胞中で発現させることにより，ＣＤＲ移植抗体を組換え的に製造することができる。
抗体断片
RGM様タンパク質に結合しうるFab，F(ab')2，Fab'，scFv，ディアボディー等の抗体断片は，上述の本発明の抗RGM様タンパク質モノクローナル抗体をパパイン，トリプシン等の酵素で処理するか，またはこれらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることにより，製造することができる。
RGM様タンパク質に結合しうるFab，F(ab')2，Fab'，scFv，ディアボディー等の抗体断片は，上述の本発明の抗RGM様タンパク質モノクローナル抗体をパパイン，トリプシン等の酵素で処理するか，またはこれらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることにより，製造することができる。
RGM様タンパク質阻害剤の他の例としては，セリン/スレオニンキナーゼRhoキナーゼ阻害剤として知られているY27632（非特許文献３１）を挙げることができる。下記実施例において，Y27632は，RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性を中和する活性を有することが確認された。なお，Y27632は次の化学構造を有する。
さらに，本発明の軸索再生促進剤は，RGM様タンパク質阻害剤として，アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす分子（例えば，ｄｓＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）等を含むものであってもよい。これらの核酸は，RGM様タンパク質遺伝子またはRGM様タンパク質をコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻害することができる。アンチセンス，リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは，RGM様タンパク質をコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ｍＲＮＡと特異的に結合し，転写および／または翻訳を阻害することによりタンパク質の発現を阻害する。結合はワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく，トリプレックス形成によるものでもよい。
リボザイムとは，触媒的特性を有する１またはそれ以上のＲＮＡのＲＮＡ構造を表す。リボザイムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々の二次構造のリボザイム，例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは，二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。
RGM様タンパク質阻害剤は，そのまま投与することも可能であるが，通常，医薬で用いられる担体を用いて製剤される。製剤に用いる担体としては，製剤分野で常用されるいずれのものをも用いることができ，例えば，注射剤の調製には生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水等が好ましく用いられる。さらに，乳化剤や浸透圧調節剤等の常用される添加剤を含めてもよい。
本発明の軸索再生促進剤の投与経路は，非経口投与が好ましく，特に，神経の損傷部に直接注射することが好ましい。
投与量は，RGM様タンパク質阻害剤の種類や投与経路，神経損傷の程度等に応じて適宜選択されるが，損傷部位に直接投与する場合，成人１日，１損傷部位当たりのRGM様タンパク質阻害剤の投与量は抗RGM様タンパク質抗体の場合，通常，1mg〜20mg，好ましくは，5mg〜10mgであり，Y27632の場合，通常，20mg〜100mg，好ましくは，30mg〜50mgである。直接投与以外の非経口投与，例えば静脈注射等では，通常，上記投与量の１０倍程度である。
別の観点においては，本発明は，軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法を提供する。この方法は，試験物質をRGM様タンパク質と接触させ，この試験物質がRGM様タンパク質の機能を阻害するか否かを判定することを含む。RGM様タンパク質の機能の阻害には、RGM様タンパク質に結合してRGM様タンパク質の正常な機能の発揮を阻害すること、特に軸索の再生を促進する能力を阻害すること、ならびにRGM様タンパク質とそのレセプターとの結合を阻害することが含まれる。試験物質がRGM様タンパク質と結合する能力、あるいはRGM様タンパク質とそのレセプターであるネオジェニンとの結合を阻害する能力は，当業者によく知られる結合アッセイ，例えば，限定されないが，ゲルシフトアッセイ，放射性標識競合アッセイ，クロマトグラフィーによる分画などにより判定することができる。また、RGM様タンパク質のレセプターであるネオジェニンの存在下で試験物質をRGM様タンパク質と接触させ、Rho活性を測定してもよい。RGM様タンパク質がネオジェニンと結合するとRho活性が上昇するため、試験物質の存在下でRho活性の上昇が見られない場合には、その試験物質はRGM様タンパク質の機能を阻害していると考えらる。
これらのアッセイにより，RGM様タンパク質の機能を阻害するものとして同定された物質は，軸索再生促進剤の候補物質であると考えられる。次に，当該技術分野において知られる軸索成長アッセイ法を用いて，この候補物質の存在下および非存在下において，ニューロンの軸索の成長を測定して比較することにより，この候補物質が軸索再生促進効果を有するか否かを判定することができる。このようなアッセイ方法の具体例は下記の実施例に記載されている。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００４−６８８４９号および２００４−２７３０４１号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
RGM様タンパク質のクローニング
ニワトリRGM（非特許文献２４）のアミノ酸配列をクエリーとして用いて，GenBankデータベースのBLAST検索を行なった。その結果，accession No. がXM_218791 (Rattus norvegicus)であるラットcDNAが同定された。推定アミノ酸配列がニワトリRGMタンパク質と79%の相同性を示したので，XM_218791をラットRGM様タンパク質と命名した。完全長ラットRGM様タンパク質cDNAは，成熟ラット脳cDNAライブラリーからＰＣＲにより単離した。用いたフォワードプライマーの塩基配列はagtggtaacaggccgagctggatgg（配列番号５）リバースプライマーの塩基配列はccacaaccttgtcgcgtgcactaat（配列番号６）であり，95℃30秒の変性工程，55℃30秒のアニーリング工程，及び７２℃，3分30秒の伸長工程から成るサイクルを25回繰り返した。コードされるタンパク質は４３１個のアミノ酸残基から成る。非特許文献２４に基づき，ネイティブのラットRGMが152aaから始まることが予測されたので，pSecTag2(Invitrogen社製）のシグナルペプチドにHA(ヘマグルチニン)及びラットRGM様タンパク質の152〜431aaを用いて，pSecTag2-Hygro(Invitrogen社製）中にHA-RGMベクターを作製した。この操作は具体的に次のようにして行なった。まず，完全長ラットRGM様タンパク質cDNAを鋳型として，BamHI-HAtag-（RGM様タンパク質の152〜431aaにあたるcDNA）-XhoIの断片をＰＣＲにより作成した。次に，作成した断片とpSecTag2-Hygro（Invitrogen社製）を２種類の制限酵素（BamHI及びXhoI）で切断し，両者のライゲーションをおこなった後，大腸菌に形質転換した。全てのＰＣＲ増幅断片は，ＤＮＡシーケンシングにより確認した。
ニワトリRGM（非特許文献２４）のアミノ酸配列をクエリーとして用いて，GenBankデータベースのBLAST検索を行なった。その結果，accession No. がXM_218791 (Rattus norvegicus)であるラットcDNAが同定された。推定アミノ酸配列がニワトリRGMタンパク質と79%の相同性を示したので，XM_218791をラットRGM様タンパク質と命名した。完全長ラットRGM様タンパク質cDNAは，成熟ラット脳cDNAライブラリーからＰＣＲにより単離した。用いたフォワードプライマーの塩基配列はagtggtaacaggccgagctggatgg（配列番号５）リバースプライマーの塩基配列はccacaaccttgtcgcgtgcactaat（配列番号６）であり，95℃30秒の変性工程，55℃30秒のアニーリング工程，及び７２℃，3分30秒の伸長工程から成るサイクルを25回繰り返した。コードされるタンパク質は４３１個のアミノ酸残基から成る。非特許文献２４に基づき，ネイティブのラットRGMが152aaから始まることが予測されたので，pSecTag2(Invitrogen社製）のシグナルペプチドにHA(ヘマグルチニン)及びラットRGM様タンパク質の152〜431aaを用いて，pSecTag2-Hygro(Invitrogen社製）中にHA-RGMベクターを作製した。この操作は具体的に次のようにして行なった。まず，完全長ラットRGM様タンパク質cDNAを鋳型として，BamHI-HAtag-（RGM様タンパク質の152〜431aaにあたるcDNA）-XhoIの断片をＰＣＲにより作成した。次に，作成した断片とpSecTag2-Hygro（Invitrogen社製）を２種類の制限酵素（BamHI及びXhoI）で切断し，両者のライゲーションをおこなった後，大腸菌に形質転換した。全てのＰＣＲ増幅断片は，ＤＮＡシーケンシングにより確認した。
RGM様タンパク質-CHO細胞の生成
Flp-In System（商品名，Invitrogen社製)を用い，製造者の指示通りにRGM様タンパク質発現細胞を生成した。２種類の制限酵素（NheI及びXhoI）を用いて，pSecTag2ベクターから，シグナルペプチドを含むHA-RGM断片を生成し，これをpcDNA5FRT(Invitrogen社製)に連結した。この構築物(pcDNA5FRT/Igκleader/HA/RGM)及びpOG44をFlp-in CHO細胞に共トランスフェクトし，ハイグロマイシンＢ(500μg/ml, Invitrogen社製）を含む培地中で２週間増殖させることにより安定にHA-RGMを発現する細胞が生成された。HA-RGMの発現は，ウェスタンブロット及び免疫細胞化学（図２）により確認した。
Flp-In System（商品名，Invitrogen社製)を用い，製造者の指示通りにRGM様タンパク質発現細胞を生成した。２種類の制限酵素（NheI及びXhoI）を用いて，pSecTag2ベクターから，シグナルペプチドを含むHA-RGM断片を生成し，これをpcDNA5FRT(Invitrogen社製)に連結した。この構築物(pcDNA5FRT/Igκleader/HA/RGM)及びpOG44をFlp-in CHO細胞に共トランスフェクトし，ハイグロマイシンＢ(500μg/ml, Invitrogen社製）を含む培地中で２週間増殖させることにより安定にHA-RGMを発現する細胞が生成された。HA-RGMの発現は，ウェスタンブロット及び免疫細胞化学（図２）により確認した。
軸索成長アッセイ
生後８日(P8)の仔ラットからの小脳顆粒細胞を，トリプシン処理(PBS中0.25%トリプシン，３７℃，１５分間）により分離し，血清含有培地に再懸濁し，粉砕し，PBSで３回洗浄した。共存培養アッセイのために，チャンバースライド中のRGM-CHO細胞又は対照CHO細胞のコンフルーエント単細胞層上にニューロンをプレートした。ROCK(Rhoキナーゼ）を阻害するために，10μMのY27632（大阪のウェルファイド社製）を培養物に添加した。培養物を，血清フリーのDMEM/F12培地中で２４時間増殖させた。
生後８日(P8)の仔ラットからの小脳顆粒細胞を，トリプシン処理(PBS中0.25%トリプシン，３７℃，１５分間）により分離し，血清含有培地に再懸濁し，粉砕し，PBSで３回洗浄した。共存培養アッセイのために，チャンバースライド中のRGM-CHO細胞又は対照CHO細胞のコンフルーエント単細胞層上にニューロンをプレートした。ROCK(Rhoキナーゼ）を阻害するために，10μMのY27632（大阪のウェルファイド社製）を培養物に添加した。培養物を，血清フリーのDMEM/F12培地中で２４時間増殖させた。
可溶性RGMアッセイのために，2.5 U/mlのPI-PLC(フォスファチジルイノシトール特異的ホスフォリパーゼＣ，Sigma社製）を含む又は含まない血清フリーDMEM/F12中でRGM-CHO細胞又は対照CHO細胞のコンフルーエント単細胞層をインキュベートした。培養物を13000gで１０分間遠心後，上清を回収することにより浮遊細胞を除去した。上清の一部をウェスタンブロット分析に供した。ポリL-リジンをコートしたチャンバースライド上のコンディションド培地上にニューロンをプレートし，１２時間又は２４時間インキュベートした。軸索アッセイのために，細胞を4%(w/v)パラホルムアルデヒドで固定し，ニューロンに特異的なβチューブリンIIIタンパク質を認識するモノクローナル抗体(TuJ1，1:1000, Covance Research Products, Inc., アメリカのDenver)をで免疫染色した。次いで，βチューブリンIII陽性ニューロンのそれぞれについて最長の突起（軸索）の長さを測定した。
脊髄損傷
麻酔した(ペントバルビタールナトリウム，40 mg/kg)雌Wistarラット(200〜250g)に，脊椎レベルT10の椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。No.11ブレードを用いて脊髄を切断することにより後索，皮質脊髄路及び後角の一部の損傷部位を作出した。次に，筋肉及び皮膚層を縫合した。膀胱の機能が回復するまで，１日に少なくとも２回，腹腔に圧力を加えて膀胱を圧迫した。
麻酔した(ペントバルビタールナトリウム，40 mg/kg)雌Wistarラット(200〜250g)に，脊椎レベルT10の椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。No.11ブレードを用いて脊髄を切断することにより後索，皮質脊髄路及び後角の一部の損傷部位を作出した。次に，筋肉及び皮膚層を縫合した。膀胱の機能が回復するまで，１日に少なくとも２回，腹腔に圧力を加えて膀胱を圧迫した。
抗ラットRGM様タンパク質抗体の産生
RGM様タンパク質の部分ペプチド(309-322aa)を化学合成し，これを免疫原として用いて抗ラットRGM様タンパク質ウサギ抗血清を得た。これをアフィニティ精製し，免疫組織化学及び免疫ブロットのためには1μg/mlの濃度で，中和抗体アッセイのためには10μg/mlの濃度で用いた。
RGM様タンパク質の部分ペプチド(309-322aa)を化学合成し，これを免疫原として用いて抗ラットRGM様タンパク質ウサギ抗血清を得た。これをアフィニティ精製し，免疫組織化学及び免疫ブロットのためには1μg/mlの濃度で，中和抗体アッセイのためには10μg/mlの濃度で用いた。
組織調製及び免疫組織化学
免疫組織化学のために，未損傷脊髄又は損傷後６時間，１日，３日若しくは７日の脊髄から新鮮な凍結組織を得た。ジエチルエーテルで深く麻酔した後，頭部切除し，脊髄を取り出し，Tissue Tek OCT（商品名）中に包埋し，直ちにドライアイス上で-80℃で凍結した。一連の傍矢状切片をクライオスタット上で18μmの位置で切断し，APS coating Superfrost-Plus slide(商品名，大阪の松浪硝子工業社製）上にマウントした。切片を4%(w/v)パラホルムアルデヒドで室温，１時間固定し，PBSで３回洗浄し，5%ヤギ血清(GS)及び0.1% Triton X-100(商品名）を含むPBS中で，室温，１時間ブロックした。切片を一次抗体と共に４℃で一夜インキュベートし，PBSで３回洗浄し，フルオレッセイン結合二次抗体(1:1000; Molecular Probes社製）と共に室温，１時間インキュベートした。抗ラットRGM様タンパク質ポリクローナル抗体(1μg/ml)，抗神経膠線維酸性タンパク質(GFAP)モノクローナル抗体(1:1000, Sigma社製），抗ミエリン／乏突起神経膠細胞特異的特異的蛋白(MOSP)モノクローナル抗体(1:500; Chemicon社製)又はβチューブリンIIIタンパク質を認識するモノクローナル抗体(TuJ1, 1:1000, Covance社製）を一次抗体として用いた。試料を共焦点走査電子顕微鏡（ドイツ国JenaのCarl Zeiss社製）で調べた。抗ラットRGM様タンパク質抗体の特異性を調べるために，対照及び脊髄損傷(SCI)切片を，ラットRGM様タンパク質特異的ペプチド(309-322aa)の存在下で染色した。組織は，10μg/mlの該ペプチドを添加することにより全く染色されなくなった（データ示さず）。
免疫組織化学のために，未損傷脊髄又は損傷後６時間，１日，３日若しくは７日の脊髄から新鮮な凍結組織を得た。ジエチルエーテルで深く麻酔した後，頭部切除し，脊髄を取り出し，Tissue Tek OCT（商品名）中に包埋し，直ちにドライアイス上で-80℃で凍結した。一連の傍矢状切片をクライオスタット上で18μmの位置で切断し，APS coating Superfrost-Plus slide(商品名，大阪の松浪硝子工業社製）上にマウントした。切片を4%(w/v)パラホルムアルデヒドで室温，１時間固定し，PBSで３回洗浄し，5%ヤギ血清(GS)及び0.1% Triton X-100(商品名）を含むPBS中で，室温，１時間ブロックした。切片を一次抗体と共に４℃で一夜インキュベートし，PBSで３回洗浄し，フルオレッセイン結合二次抗体(1:1000; Molecular Probes社製）と共に室温，１時間インキュベートした。抗ラットRGM様タンパク質ポリクローナル抗体(1μg/ml)，抗神経膠線維酸性タンパク質(GFAP)モノクローナル抗体(1:1000, Sigma社製），抗ミエリン／乏突起神経膠細胞特異的特異的蛋白(MOSP)モノクローナル抗体(1:500; Chemicon社製)又はβチューブリンIIIタンパク質を認識するモノクローナル抗体(TuJ1, 1:1000, Covance社製）を一次抗体として用いた。試料を共焦点走査電子顕微鏡（ドイツ国JenaのCarl Zeiss社製）で調べた。抗ラットRGM様タンパク質抗体の特異性を調べるために，対照及び脊髄損傷(SCI)切片を，ラットRGM様タンパク質特異的ペプチド(309-322aa)の存在下で染色した。組織は，10μg/mlの該ペプチドを添加することにより全く染色されなくなった（データ示さず）。
中和抗体アッセイ
対照CHO細胞又はRGM-CHO細胞のPI-PLC処理により誘導されたコンディションド培地中のポリL-リジンコートチャンバースライド上に小脳顆粒ニューロンをプレートした。RGM-CHO細胞のPI-PLC処理により誘導されたコンディションド培地に抗ラットRGM様タンパク質抗体(10μg/ml)を添加した。２４時間インキュベート後，成長アッセイを上記と同様に行なった。
対照CHO細胞又はRGM-CHO細胞のPI-PLC処理により誘導されたコンディションド培地中のポリL-リジンコートチャンバースライド上に小脳顆粒ニューロンをプレートした。RGM-CHO細胞のPI-PLC処理により誘導されたコンディションド培地に抗ラットRGM様タンパク質抗体(10μg/ml)を添加した。２４時間インキュベート後，成長アッセイを上記と同様に行なった。
ウェスタンブロットアッセイ
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤 (ドイツ国ManheimのRoche Diagnostics社製)を含む， 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl，10%グリセロール，0.5% Brij-58 (Sigma社製)で対照CHO細胞又はRGM-CHO細胞を溶解した。細胞溶解物を13000g，４℃，１０分間の遠心で清澄化し，上清を回収し，Bio-Rad DC protein assay kit(商品名）を用いてタンパク濃度を正規化した。12%β-メルカプトエタノールを含む試料バッファー中で，等量のタンパク質を５分間煮沸し，SDS-PAGEにかけた。溶解バッファー処理を除き，コンディションド培地も同様に処理した。タンパク質をPVDF膜に転写し，5%スキムミルク及び0.05% Tween 20(商品名）を含むPBS中で，室温，１時間ブロックした。抗ラットRGM様タンパク質ポリクローナル抗体(1μg/ml)又は抗HAモノクローナル抗体(1:1000, Sigma社製）で膜を一夜ブロットした。検出のために，ECL chemiluminescence system (商品名，Amersham Biosciences社製）及びHRP(セイヨウワサビペルオキシダーゼ)-結合二次抗体(1:1000; Cell Signaling Technology社製）を用いた。
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤 (ドイツ国ManheimのRoche Diagnostics社製)を含む， 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl，10%グリセロール，0.5% Brij-58 (Sigma社製)で対照CHO細胞又はRGM-CHO細胞を溶解した。細胞溶解物を13000g，４℃，１０分間の遠心で清澄化し，上清を回収し，Bio-Rad DC protein assay kit(商品名）を用いてタンパク濃度を正規化した。12%β-メルカプトエタノールを含む試料バッファー中で，等量のタンパク質を５分間煮沸し，SDS-PAGEにかけた。溶解バッファー処理を除き，コンディションド培地も同様に処理した。タンパク質をPVDF膜に転写し，5%スキムミルク及び0.05% Tween 20(商品名）を含むPBS中で，室温，１時間ブロックした。抗ラットRGM様タンパク質ポリクローナル抗体(1μg/ml)又は抗HAモノクローナル抗体(1:1000, Sigma社製）で膜を一夜ブロットした。検出のために，ECL chemiluminescence system (商品名，Amersham Biosciences社製）及びHRP(セイヨウワサビペルオキシダーゼ)-結合二次抗体(1:1000; Cell Signaling Technology社製）を用いた。
結果
軸索成長アッセイ
小脳顆粒ニューロンを，ラットRGM様タンパク質発現CHO細胞又は対照CHO細胞のコンフルーエント単細胞層上にプレートして行なった軸索成長アッセイの結果を図１に示す。図１に示すように，RGM様タンパク質発現CHO細胞上で小脳顆粒ニューロンを培養した場合には，軸索長さが対照に比べて有意に短かった。一方，本発明の軸索成長促進剤であるY27632を培地に添加した場合には，対照と同程度に軸索が成長し，RGM様タンパク質発現CHO細胞上で培養した場合に比べ，有意に軸索が成長された。
軸索成長アッセイ
小脳顆粒ニューロンを，ラットRGM様タンパク質発現CHO細胞又は対照CHO細胞のコンフルーエント単細胞層上にプレートして行なった軸索成長アッセイの結果を図１に示す。図１に示すように，RGM様タンパク質発現CHO細胞上で小脳顆粒ニューロンを培養した場合には，軸索長さが対照に比べて有意に短かった。一方，本発明の軸索成長促進剤であるY27632を培地に添加した場合には，対照と同程度に軸索が成長し，RGM様タンパク質発現CHO細胞上で培養した場合に比べ，有意に軸索が成長された。
溶液の形態にあるRGM様タンパク質が軸索成長を阻害するか否かを調べた。試験に先立ち，培地をPI-PLCで処理することにより，HA-RGM様タンパク質が培地に遊離されることを抗HA抗体を用いた免疫染色により確認した。なお，PI-PLCにより，GPI(グリコシルホスファチジルイノシトール)-結合タンパク質が膜から遊離される。RGM様タンパク質は，上記の通りニワトリRGMと相同性が高く，GPI-結合タンパク質であると予測されたため，PI-PLC処理を行なった。その結果，PI-PLC処理を行なったRGM様タンパク質発現CHO細胞の培地においてのみ，免疫染色によりHA-RGM様タンパク質が検出され，対照CHO細胞の培地及びPI-PLC処理を行なわなかったRGM様タンパク質発現CHO細胞の培地中には，HA-RGM様タンパク質は全く検出されなかった。このことから，RGM様タンパク質は，GPI-結合タンパク質であり，PI-PLC処理により溶液中に遊離されることが確認された。
各コンディションド培地で処理したニューロンの軸索長さを図２に示す。図２に示すように，RGM様タンパク質発現CHO細胞をPI-PLC処理した培地で処理したニューロンのみ，軸索の成長が有意に阻害された。これは，RGM様タンパク質が，軸索の成長を阻害する作用を有していることを示している。また，対照のCHO細胞の培地では，PI-PLC処理の有無により軸索長さは変わらなかった。このことは，PI-PLC処理自体が，軸索成長に影響を与えないことを示している。
RGM様タンパク質の脊髄中での分布
試験に先立ち，作製した抗RGM様タンパク質抗体がRGM様タンパク質に対して特異性を有するか否かの確認試験を行なった。抗HA抗体又は作製した抗RGM様タンパク質抗体を用い，PI-PLC処理を行なったRGM様タンパク質発現CHO細胞の培地についてウェスタンブロットを行なった。その結果，抗HA抗体を用いた場合も，作製した抗RGM様タンパク質抗体を用いた場合も，全く同じ位置（約35Kダルトン）にバンドが検出され，対照では検出されなかった。さらに，抗RGM様タンパク質抗体を作製する際に，免疫原として用いた上記ペプチドを10μg/mlの濃度で抗RGM様タンパク質抗体に添加し，それを用いて成熟ラットの損傷脊髄又は正常脊髄の新鮮な凍結切片の免疫組織染色を行なうと，全く染色されなくなった。これらのことから，作製した抗RGM様タンパク質抗体が，RGM様タンパク質に対して特異性を有する（抗原抗体反応する）ことが確認された。
試験に先立ち，作製した抗RGM様タンパク質抗体がRGM様タンパク質に対して特異性を有するか否かの確認試験を行なった。抗HA抗体又は作製した抗RGM様タンパク質抗体を用い，PI-PLC処理を行なったRGM様タンパク質発現CHO細胞の培地についてウェスタンブロットを行なった。その結果，抗HA抗体を用いた場合も，作製した抗RGM様タンパク質抗体を用いた場合も，全く同じ位置（約35Kダルトン）にバンドが検出され，対照では検出されなかった。さらに，抗RGM様タンパク質抗体を作製する際に，免疫原として用いた上記ペプチドを10μg/mlの濃度で抗RGM様タンパク質抗体に添加し，それを用いて成熟ラットの損傷脊髄又は正常脊髄の新鮮な凍結切片の免疫組織染色を行なうと，全く染色されなくなった。これらのことから，作製した抗RGM様タンパク質抗体が，RGM様タンパク質に対して特異性を有する（抗原抗体反応する）ことが確認された。
RGM様タンパク質の分布を調べるために，成熟ラットから新鮮な凍結切片を調製し，免疫組織染色を行なった。この免疫組織染色は具体的に次のようにして行なった。まず，新鮮凍結切片を室温にて十分に乾燥させた。リン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド溶液で１時間固定し，ブロッキング操作を１時間，次に一次抗体処理を４℃にて一晩行い，二次抗体処理を室温にて１時間行った。ブロッキング溶液として0.1Mリン酸緩衝食塩水の中にヤギ血清10%，tritonX 0.1%を添加したものを用いた。一次抗体液として上記のブロッキング溶液に抗RGM様タンパク質を１μg/mlを添加したものを用いた。二次抗体液として0.1Mリン酸緩衝食塩水の中にヤギ血清10%とフルオレッセイン結合二次抗体（1:1000; Molecular Probes社製）を用いた。その結果，白質及び灰白質の両方において，RGM様タンパク質が恒常的に発現していることがわかった。
抗RGM様タンパク質−抗-MOSP(ミエリン／乏突起神経膠細胞特異的タンパク質）で二重染色することにより，RGM様タンパク質は乏突起神経膠細胞及び白質中のその突起中で発現していることが示された。さらに，RGM様タンパク質は，Tuj1(ニューロン特異的βチューブリンIIIタンパク質)-陽性ニューロンの細胞体に局在化しており，白質中のこれらの細胞の軸索には局在化していなかった。抗ラットRGM様タンパク質抗体及び抗星状細胞マーカーGFAP(神経膠線維酸性タンパク質）で二重免疫組織化学染色を行なったところ，これらが共に局在化している部位は全くなかった。このことは，RGM様タンパク質が星状細胞中に存在しないことを示している。総合すると，RGM様タンパク質は，ニューロン及び星状細胞により発現され，脊髄中におけるその発現パターンはNogo又はOMgpに類似している。
脊髄損傷後のRGM様タンパク質発現
RGM様タンパク質の発現は，損傷部位の中心並びに損傷部位の頭側及び尾側の白質中において検出された。中心領域では，損傷６時間後には，組織構造は正常に見えた。退行変化が観察され始める損傷１日〜３日後には，RGM様タンパク質に対する免疫反応は，損傷部位上及び異所性細胞外マトリックス中にも観察された。この細胞外免疫反応性は，RGM様タンパク質発現細胞の退行に起因するものかもしれない。中心領域におけるRGM様タンパク質発現細胞を特徴付けるために，抗GFAP-抗RGM様タンパク質，抗MOSP-抗RGM様タンパク質，及び抗Tuj1-抗RGM様タンパク質を用い，損傷７日後の組織について二重標識実験を行なったところ，二重標識細胞（すなわち，GFAP陽性及びRGM様タンパク質陽性，MOSP陽性及びRGM様タンパク質陽性，又はTuj1陽性及びRGM様タンパク質陽性）は観察されなかった。中枢神経系への損傷が，グリア細胞性瘢痕をもたらすことを考慮すると，これらの細胞は，例えば小グリア細胞，マクロファージ，乏突起神経膠前駆細胞，線維芽細胞，軟膜細胞及び／又はシュワン細胞などの，グリア細胞性瘢痕を構成する他の種類の細胞であるかもしれない。
RGM様タンパク質の発現は，損傷部位の中心並びに損傷部位の頭側及び尾側の白質中において検出された。中心領域では，損傷６時間後には，組織構造は正常に見えた。退行変化が観察され始める損傷１日〜３日後には，RGM様タンパク質に対する免疫反応は，損傷部位上及び異所性細胞外マトリックス中にも観察された。この細胞外免疫反応性は，RGM様タンパク質発現細胞の退行に起因するものかもしれない。中心領域におけるRGM様タンパク質発現細胞を特徴付けるために，抗GFAP-抗RGM様タンパク質，抗MOSP-抗RGM様タンパク質，及び抗Tuj1-抗RGM様タンパク質を用い，損傷７日後の組織について二重標識実験を行なったところ，二重標識細胞（すなわち，GFAP陽性及びRGM様タンパク質陽性，MOSP陽性及びRGM様タンパク質陽性，又はTuj1陽性及びRGM様タンパク質陽性）は観察されなかった。中枢神経系への損傷が，グリア細胞性瘢痕をもたらすことを考慮すると，これらの細胞は，例えば小グリア細胞，マクロファージ，乏突起神経膠前駆細胞，線維芽細胞，軟膜細胞及び／又はシュワン細胞などの，グリア細胞性瘢痕を構成する他の種類の細胞であるかもしれない。
中心領域に隣接する白質中では，RGM様タンパク質−免疫陽性細胞及び免疫反応性の強度は，６時間後までほとんど変化しなかった。しかしながら，術後１日ないし３日において，それらは連続的に増大した。７日後には，無傷の脊髄に比べて有意にその密度が高くなった。白質中のRGM様タンパク質発現細胞を特徴付けるために，損傷７日後の組織について二重標識実験を行なった。抗RGM様タンパク質−抗GFAP及び抗RGM様タンパク質−抗Tuj1を用いて二重染色を行なったところ，二重標識細胞は観察されなかった。これにより，これらの細胞は星状細胞でもニューロンでもないことが確認された。RGM様タンパク質及びMOSPで二重染色を行なったところ，二重染色された細胞が検出された。このことは，脊髄損傷後，RGM様タンパク質が乏突起神経膠細胞中で強く発現されることを示している。最終的に，全てのMOSP発現細胞がRGM様タンパク質を発現することが確認され，RGM様タンパク質陽性でMOSP陰性細胞は観察されなかった。白質中のこれらの細胞は，損傷部位の中心で観察された細胞と同じであると考えられる。従って，RGM様タンパク質は，損傷部位の中心及びそれに隣接する白質において，脊髄の損傷に応答して発現が増大する。
抗RGM様タンパク質抗体による，RGM様タンパク質の軸索成長阻害活性の中和
結果を図３に示す。図３中，「＊」は，RGMが対照に対して有意に短いことを示しており，「**」は，RGM+抗RGMが，RGMに対して有意に長くなっていることを示している。図３に示すように，抗RGM様タンパク質抗体を添加すると，RGM様タンパク質による軸索成長阻害活性は有意に中和された。これにより，抗RGM様タンパク質ポリクローナル抗体が，軸索成長促進剤として利用可能であることが確認された。
結果を図３に示す。図３中，「＊」は，RGMが対照に対して有意に短いことを示しており，「**」は，RGM+抗RGMが，RGMに対して有意に長くなっていることを示している。図３に示すように，抗RGM様タンパク質抗体を添加すると，RGM様タンパク質による軸索成長阻害活性は有意に中和された。これにより，抗RGM様タンパク質ポリクローナル抗体が，軸索成長促進剤として利用可能であることが確認された。
１．方法
(1) 外科的施術
麻酔した（ペントバルビタールナトリウム，40mg/kg）雄Wistarラット（200〜250g）に，脊椎レベルT9/10の椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。No.11ブレードを用いて脊髄の背側の部分を1.8mmの深さに切った。組織学的検査により，全ての動物において，これらの損傷は，後柱中の全ての背側の皮質脊髄路（CST）線維及び外側皮質脊髄路を切断し，中心管を超えて延びていた。この脊髄半側切断の直後，対照抗体（8匹，22.3μg/kg・日，２週間）又は実施例１で作製した抗RGM様タンパク質抗体（8匹，22.3μg/kg・日，２週間）を満たした浸透圧ミニポンプ（200μL溶液，0.5μL／時間，14日間送達）（米国カリフォルニア州CupertinoのDurect Corp.）を装着した。該ミニポンプは，動物の背中の皮下に置き，ミニポンプの出口に接続されたシリコーン製チューブは，脊髄半側切断部位の硬膜下に，ティップが損傷部位の頭側の直近傍に来るように置いた。該チューブは，椎弓切除術部位の直下肢側の棘突起に縫いつけて固定した。次に，筋肉及び皮膚層を縫合した。膀胱の機能が回復するまで，少なくとも１日２回，手で腹圧を加えて膀胱を圧迫した。
(1) 外科的施術
麻酔した（ペントバルビタールナトリウム，40mg/kg）雄Wistarラット（200〜250g）に，脊椎レベルT9/10の椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。No.11ブレードを用いて脊髄の背側の部分を1.8mmの深さに切った。組織学的検査により，全ての動物において，これらの損傷は，後柱中の全ての背側の皮質脊髄路（CST）線維及び外側皮質脊髄路を切断し，中心管を超えて延びていた。この脊髄半側切断の直後，対照抗体（8匹，22.3μg/kg・日，２週間）又は実施例１で作製した抗RGM様タンパク質抗体（8匹，22.3μg/kg・日，２週間）を満たした浸透圧ミニポンプ（200μL溶液，0.5μL／時間，14日間送達）（米国カリフォルニア州CupertinoのDurect Corp.）を装着した。該ミニポンプは，動物の背中の皮下に置き，ミニポンプの出口に接続されたシリコーン製チューブは，脊髄半側切断部位の硬膜下に，ティップが損傷部位の頭側の直近傍に来るように置いた。該チューブは，椎弓切除術部位の直下肢側の棘突起に縫いつけて固定した。次に，筋肉及び皮膚層を縫合した。膀胱の機能が回復するまで，少なくとも１日２回，手で腹圧を加えて膀胱を圧迫した。
(2) 組織調製及び免疫組織化学
組織調製及び免疫組織化学は，実施例１と同様に行った。
組織調製及び免疫組織化学は，実施例１と同様に行った。
(3) CSTの順行性標識
損傷８週間後，下行CST線維を，ビオチンデキストランアミン（BDA，生理食塩液中10%，皮質当り3.5μL，分子量10000，米国オレゴン州EugeneのMolecular Probes社）を，麻酔下，左右の運動皮質に注射した（座標：ブレグマの2mm後方，ブレグマの2mm側方，深さ1.5mm）。各注射において，マイクロリッターシリンジに装着した内径15〜20μmのガラス毛管を介して，0.25μLのBDAを30秒間に亘って注入した。合計で，６匹の対照，及び８匹のSCI後抗RGM様タンパク質抗体投与ラットについて検査し比較した。BDA注射１４日後，PBS及び次いでパラホルムアルデヒドを潅流して動物を殺した。損傷部位を通る脊髄のクリオスタット切片を傍矢状に切った（50μm）。損傷部位の頭側及び下肢側の横断切片を採取した。切片は，0.5%ウシ血清アルブミン（BSA）含有PBSで１時間ブロッキングし，次いで，0.15% BSA含有PBS中Alxa Fluor 488-（商品名）結合ストレプトアビジン（1:400，Molecular Probes社）と共に１日間インキュベートした。損傷部位の中心から，最も下肢側に延びた，BDA検出CST線維までの距離を測定した。
損傷８週間後，下行CST線維を，ビオチンデキストランアミン（BDA，生理食塩液中10%，皮質当り3.5μL，分子量10000，米国オレゴン州EugeneのMolecular Probes社）を，麻酔下，左右の運動皮質に注射した（座標：ブレグマの2mm後方，ブレグマの2mm側方，深さ1.5mm）。各注射において，マイクロリッターシリンジに装着した内径15〜20μmのガラス毛管を介して，0.25μLのBDAを30秒間に亘って注入した。合計で，６匹の対照，及び８匹のSCI後抗RGM様タンパク質抗体投与ラットについて検査し比較した。BDA注射１４日後，PBS及び次いでパラホルムアルデヒドを潅流して動物を殺した。損傷部位を通る脊髄のクリオスタット切片を傍矢状に切った（50μm）。損傷部位の頭側及び下肢側の横断切片を採取した。切片は，0.5%ウシ血清アルブミン（BSA）含有PBSで１時間ブロッキングし，次いで，0.15% BSA含有PBS中Alxa Fluor 488-（商品名）結合ストレプトアビジン（1:400，Molecular Probes社）と共に１日間インキュベートした。損傷部位の中心から，最も下肢側に延びた，BDA検出CST線維までの距離を測定した。
(4) 行動試験
Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動評価基準(Basso, D.M., Beattie, M.S., & Bresnahan, J.C., A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995))により，損傷後７週間に亘り，開放フィールド環境下で行動回復を評価した。盲検的に定量を行った。
Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動評価基準(Basso, D.M., Beattie, M.S., & Bresnahan, J.C., A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995))により，損傷後７週間に亘り，開放フィールド環境下で行動回復を評価した。盲検的に定量を行った。
２．結果
(1) RGM様タンパク質の中和による機能的改善
上記の通り，内発性のRGM様タンパク質が，損傷された中枢神経系の軸索の再生の阻害剤として働くのか否かを評価した。ラットの脊髄の背側2/3を，脊椎レベルTh9/10において切除することにより，主皮質脊髄路及び外側皮質脊髄路を切除した。抗RGM様タンパク質中和抗体又は対照としてのIgGを浸透圧ミニポンプにより，胸部の損傷部の近傍の硬膜下に設置したカテーテルを介して送達した。対照群と処置群では，損傷の深さに有意差はなかった。運動動作を監視した。脊髄を損傷しない擬似手術を施したラットでは，Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動スコアが満点であった。全てのラットは，損傷１日後には，ほぼ完全に対麻痺状態であった（図４）。その後，BBBスコアにより評価される運動行動を部分的に徐々に回復した。脊髄損傷後４週間までは，抗RGM様タンパク質抗体投与動物と対照動物の間にBBBスコアの差はなかった。注目すべきことに，手術の６週間後から７週間後の間の運動動作は，抗RGM様タンパク質抗体を投与されたラットの方が，対照ラットよりも有意に優れていた。従って，抗RGM様タンパク質抗体は，脊髄損傷ラットの治療に有効である。
(1) RGM様タンパク質の中和による機能的改善
上記の通り，内発性のRGM様タンパク質が，損傷された中枢神経系の軸索の再生の阻害剤として働くのか否かを評価した。ラットの脊髄の背側2/3を，脊椎レベルTh9/10において切除することにより，主皮質脊髄路及び外側皮質脊髄路を切除した。抗RGM様タンパク質中和抗体又は対照としてのIgGを浸透圧ミニポンプにより，胸部の損傷部の近傍の硬膜下に設置したカテーテルを介して送達した。対照群と処置群では，損傷の深さに有意差はなかった。運動動作を監視した。脊髄を損傷しない擬似手術を施したラットでは，Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動スコアが満点であった。全てのラットは，損傷１日後には，ほぼ完全に対麻痺状態であった（図４）。その後，BBBスコアにより評価される運動行動を部分的に徐々に回復した。脊髄損傷後４週間までは，抗RGM様タンパク質抗体投与動物と対照動物の間にBBBスコアの差はなかった。注目すべきことに，手術の６週間後から７週間後の間の運動動作は，抗RGM様タンパク質抗体を投与されたラットの方が，対照ラットよりも有意に優れていた。従って，抗RGM様タンパク質抗体は，脊髄損傷ラットの治療に有効である。
なお，図４は，抗RGM様タンパク質抗体又は対照抗体を投与したラットの，中央胸部背側の半側切除術後，図示の時間が経過した後のBBBスコアを示すものである。各群６匹又は８匹のラットの平均±標準偏差を示す。＊は，抗RGM様タンパク質抗体を投与した群が，その週において，対照群とは有意に異なることを示している。*:対照に対してp<0.05。
(2) RGM様タンパク質阻害による軸索再生促進
上記の通り，先に試験したラットの一部について，BDAを知覚−運動皮質に注入することにより，背側CST（皮質脊髄路）の完全性を調べた。抗RGM様タンパク質抗体を投与した損傷ラットからの試料（図5b）は，対照ラットからの試料（図5a）と比較して全く異なったパターンの標識化を示した。抗RGM様タンパク質抗体を投与しなかったラットにおいては，損傷部位の基端部では，主CSTは損傷より頭側において途絶している（図5a,c）。この基本的なパターンは，中枢神経系では，軸索の再生が通常起こらないことを反映している。対照的に，抗RGM様タンパク質抗体を投与したラットでは，標識したCSTから出芽した多数の線維が観察された（図5b,d）。出芽した軸索は，白質よりも灰白質中によりよく延びていた。このタイプの多数の線維は，該抗体を投与した全ての損傷動物において観察された。これは，BDAの取り込みの程度が異なることに起因するものではあり得ない。なぜなら，損傷部位よりも頭側の背側CST中の線維の総数は，抗体投与動物と対照動物の間で差が見られなかったからである。両群のラットについて，損傷部位を通る縦断面を観察すると，中和抗体を投与されたラットでは，CST線維の退縮がより少なく，多数の側枝CSTが出芽していた（図5a,b,i）。抗RGM様タンパク質投与ラットにおいて，典型的な不規則的曲折成長を示す再生線維は，損傷部位のレベルにおける組織橋（tissue bridge）において高頻度に見られた（図5d,f）。これらの再生線維は，背側の白質および損傷瘢痕内に向かって，かつ，嚢胞に沿って成長した（図5f,h）。注目すべきことに，多くの軸索が損傷組織を横切り，穴の周囲に成長するか又は損傷の中心部内に成長していた。中和抗体を投与されたラットの損傷部位におけるCST線維を高倍率で顕微鏡観察すると，シナプス様腫脹に類似した形態を示していた。一方，対照ラットでは，BDAが検出されなかった（図5e）。抗体投与ラットでは，軸索の束は，損傷組織を通って3.5mmまで成長し，損傷部位から下肢側に5mmも延びているものもあり，多数の標識化線維が観察された（図5g,h,j）。一方，対照ラットでは，線維は観察されなかった。これらの線維の多くは，直線的な弾道ではなく，分枝及び蛇行を伴っていた。再生線維の最も下肢側において，主管から出芽する多くの分枝が観察された。従って，抗RGM様タンパク質抗体投与は，CST軸索の再生を促進する。
上記の通り，先に試験したラットの一部について，BDAを知覚−運動皮質に注入することにより，背側CST（皮質脊髄路）の完全性を調べた。抗RGM様タンパク質抗体を投与した損傷ラットからの試料（図5b）は，対照ラットからの試料（図5a）と比較して全く異なったパターンの標識化を示した。抗RGM様タンパク質抗体を投与しなかったラットにおいては，損傷部位の基端部では，主CSTは損傷より頭側において途絶している（図5a,c）。この基本的なパターンは，中枢神経系では，軸索の再生が通常起こらないことを反映している。対照的に，抗RGM様タンパク質抗体を投与したラットでは，標識したCSTから出芽した多数の線維が観察された（図5b,d）。出芽した軸索は，白質よりも灰白質中によりよく延びていた。このタイプの多数の線維は，該抗体を投与した全ての損傷動物において観察された。これは，BDAの取り込みの程度が異なることに起因するものではあり得ない。なぜなら，損傷部位よりも頭側の背側CST中の線維の総数は，抗体投与動物と対照動物の間で差が見られなかったからである。両群のラットについて，損傷部位を通る縦断面を観察すると，中和抗体を投与されたラットでは，CST線維の退縮がより少なく，多数の側枝CSTが出芽していた（図5a,b,i）。抗RGM様タンパク質投与ラットにおいて，典型的な不規則的曲折成長を示す再生線維は，損傷部位のレベルにおける組織橋（tissue bridge）において高頻度に見られた（図5d,f）。これらの再生線維は，背側の白質および損傷瘢痕内に向かって，かつ，嚢胞に沿って成長した（図5f,h）。注目すべきことに，多くの軸索が損傷組織を横切り，穴の周囲に成長するか又は損傷の中心部内に成長していた。中和抗体を投与されたラットの損傷部位におけるCST線維を高倍率で顕微鏡観察すると，シナプス様腫脹に類似した形態を示していた。一方，対照ラットでは，BDAが検出されなかった（図5e）。抗体投与ラットでは，軸索の束は，損傷組織を通って3.5mmまで成長し，損傷部位から下肢側に5mmも延びているものもあり，多数の標識化線維が観察された（図5g,h,j）。一方，対照ラットでは，線維は観察されなかった。これらの線維の多くは，直線的な弾道ではなく，分枝及び蛇行を伴っていた。再生線維の最も下肢側において，主管から出芽する多くの分枝が観察された。従って，抗RGM様タンパク質抗体投与は，CST軸索の再生を促進する。
なお，図５中，a,bは，BDA標識したCST線維の代表的な写真であり，頭側を左側に示す。対照IgG(a)又は抗RGM様タンパク質抗体(b)を投与した脊髄の，順行的に標識した，損傷１０週間後のCST線維を示す（図５及び６においてRGM様タンパク質を「RGMa」と記載）。損傷部位の中心を星印で示す。図５中，c〜gは，図５のa及びbの，四角で囲んだ領域を，より高倍率で観察した写真である。抗RGM様タンパク質抗体を投与したラットでは，増加した側枝CST線維が，頭側に出芽し(d)，損傷部位において再生線維が見られる（f，矢印）が，対照IgGを投与したラットでは対応する領域においてこれらは観察されなかった（c，e）。hはbと同一の動物の別の切片であり，損傷部位の中心（矢印）から2.6mm下肢側における再生線維を示す。スケールバーは，aとbが５００μm，c〜fが１００μm，gとhが２００μmである。iは，抗RGM様タンパク質抗体又はIgG（n=6〜8／群）を投与したラットにおける，脊髄損傷１０週間後の，BDA検出主CST線維の損傷部位中心からの距離を示す。＊：対照に対し，p<0.01。抗RGM様タンパク質抗体は，損傷した主CSTの退縮を抑制することを示す。jは，抗RGM様タンパク質抗体又はIgG（n=6〜8／群）を投与したラットにおける，脊髄損傷１０週間後の，最も下肢側のBDA検出CST線維の損傷部位中心からの距離を示す。＊：対照に対し，p<0.01。
１． 方法
(1) GTP-RhoAの親和性沈殿
1% Triton X-100（商品名），0.5%デオキシコール酸ナトリウム，0.1% SDS，500mM NaCl 及び10 mM MgCl2，10μg/mlのロイペプチン及び10μg/mlのアプロチニンを含む50mM Tris (pH7.5)で細胞を溶解した。細胞溶解物を，13000g，４℃，１０分間遠心して清澄化し，上清を，Rhotekin beads(商品名，Upstate Biotech社製)の20μgのGST-Rho結合領域と共に４℃で４５分間インキュベートした。洗浄バッファー(1% Triton X-100（商品名），150mM NaCl，10 mM MgCl2，各10μg/mlのロイペプチン及びアプロチニンを含む50mM Tris (pH7.5))でビーズを４回洗浄した。RhoAに対するモノクローナル抗体(米国カリフォルニア州Santa Cruz のSanta Cruz Biotech社製)を用いたウェスタンブロットにより，結合されたRhoを検出した。
(1) GTP-RhoAの親和性沈殿
1% Triton X-100（商品名），0.5%デオキシコール酸ナトリウム，0.1% SDS，500mM NaCl 及び10 mM MgCl2，10μg/mlのロイペプチン及び10μg/mlのアプロチニンを含む50mM Tris (pH7.5)で細胞を溶解した。細胞溶解物を，13000g，４℃，１０分間遠心して清澄化し，上清を，Rhotekin beads(商品名，Upstate Biotech社製)の20μgのGST-Rho結合領域と共に４℃で４５分間インキュベートした。洗浄バッファー(1% Triton X-100（商品名），150mM NaCl，10 mM MgCl2，各10μg/mlのロイペプチン及びアプロチニンを含む50mM Tris (pH7.5))でビーズを４回洗浄した。RhoAに対するモノクローナル抗体(米国カリフォルニア州Santa Cruz のSanta Cruz Biotech社製)を用いたウェスタンブロットにより，結合されたRhoを検出した。
２．結果
(2) GTP-RhoAの親和性沈降
ニューロン中のRhoA活性を測定した。生後７日のラットの小脳ニューロンに各コンディションド培地を添加し３０分経過した時点で，RhoAの活性を測定した（図６）。図６に示すように，RGM様タンパク質発現CHO細胞をPI-PLC処理した培地で培養したニューロンでは，対照のCHO細胞の培地で培養したニューロンに比較し，Rhoの活性化が認められた。この結果は，RGM様タンパク質がRhoを活性化することを示している。
(2) GTP-RhoAの親和性沈降
ニューロン中のRhoA活性を測定した。生後７日のラットの小脳ニューロンに各コンディションド培地を添加し３０分経過した時点で，RhoAの活性を測定した（図６）。図６に示すように，RGM様タンパク質発現CHO細胞をPI-PLC処理した培地で培養したニューロンでは，対照のCHO細胞の培地で培養したニューロンに比較し，Rhoの活性化が認められた。この結果は，RGM様タンパク質がRhoを活性化することを示している。
本発明の軸索再生促進剤は，損傷した中枢神経の再生に有効であり，中枢神経系を損傷した患者のための治療剤として有用である。
本発明は，神経細胞，特に，中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進することができる軸索再生促進剤に関する。
脊髄等の中枢神経が交通事故等に起因する傷害あるいは脳血管障害等で損傷を受けると，神経機能は失われたまま再生することはできない。末梢神経が再生するのとは対照的である。中枢神経は，損傷すると再生できないので，中枢神経を損傷するとしばしば部分的又は完全な麻痺が起きる。したがって，損傷した中枢神経を再生させることは医療分野における重要な課題である。
もっとも，成人の中枢神経の軸索が，末梢神経のグラフトを介して再生し得る（非特許文献１）ことから，成人の中枢神経が再生しない主な原因は，神経細胞を取り巻く局所的な環境にあることが示唆される。これまでに，中枢神経の再生を阻害する３つの主な阻害物質として，Nogo，ミエリン結合糖タンパク質(MAG)及び乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質(OMgp)が同定されている。Nogoは，モノクローナル抗体IN-1の対応抗原として同定された（非特許文献２〜４）。ミエリン鞘の形成及び維持に重要な役割を果たすことが知られているMAG(非特許文献５〜８）は，ある種のニューロンからの軸索の成長を阻害することが見出された（非特許文献９，１０）。成人中枢神経の白質中の主たるピーナツアグルチニン−結合ポリペプチドであるOMgp（非特許文献１１）は，軸索成長の第３の阻害物質として同定された（非特許文献１２，１３）。Nogo，MAG及びOMgpは，p75をコレセプターとしてNgRに結合することが知られており，このことは，これらが共通の信号伝達経路を共有していることを示唆している（非特許文献１４〜１７）。
これらの阻害物質を排除ないし阻害することにより，軸索を再生することが研究された。しかしながら，これらの阻害物質のそれぞれをノックアウトしたマウスを用いた研究により，これらの阻害物質を排除しただけでは中枢神経の軸索が再生されないことがわかった（非特許文献１８〜２２）。さらに，機能的なp75NTRを枯渇させたり，可溶性p75N-Fcを投与しても，損傷した脊髄の再生が促進されなかったことが報告されている（非特許文献２３）。
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［非特許文献３７］ J. W. Fawcett, R. A. Asher, Brain Res Bull 49, 377-91 (Aug, 1999).
本発明の目的は，中枢神経の軸索の再生を促進することができる，新規な軸索再生促進剤を提供することである。
本願発明者らは，鋭意研究の結果，脊髄の白質及び灰白質中に，ニワトリ胎児において，網膜蓋体の突起の形成に関与するRGM(repulsive guidance molecule)（非特許文献２４及び２５）と相同性を有するタンパク質（本明細書及び特許請求の範囲において「RGMタンパク質」と呼ぶ）が発現しており，脊髄を損傷すると，該タンパク質の発現が増大することを見出した。さらに，該タンパク質が中枢神経の軸索の成長を阻害する活性を有することを見出した。そして，抗RGMタンパク質抗体やY27632のような，RGMタンパク質阻害剤でRGMタンパク質を処理することにより，RGMタンパク質の軸索成長阻害活性が消失することを見出し，RGMタンパク質阻害剤を軸索成長促進剤として利用できることに想到し，本発明を完成した。
すなわち，本発明は，RGMタンパク質阻害剤を有効成分として含有する軸索再生促進剤を提供する。好ましくは，前記RGMタンパク質阻害剤は，抗RGMタンパク質抗体である。また好ましくは，前記RGMタンパク質阻害剤は，Y27632である。
好ましくは，前記軸索は，中枢神経系の軸索である。
本発明の別の観点においては，本発明は，軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質をRGMタンパク質と接触させ，前記試験物質がRGMタンパク質の機能を阻害するか否かを判定することを含む方法を提供する。
本発明によれば，中枢神経の軸索の再生を促進することができる，新規な軸索再生促進剤が提供された。本発明の軸索再生促進剤は，中枢神経の軸索の再生に有効であり，脊髄等の中枢神経系に損傷を受けた患者の治療等に大いに寄与すると期待される。
上記の通り，本願発明者らは先に，ニワトリ胎児においてRGMタンパク質が脊髄の白質及び灰白質中に発現していることを見出した。ヒトにおいては、ニワトリ胎児RGMタンパク質と相同性を有する遺伝子が脳で発現されていることが確認された。ヒトのRGMタンパク質の遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す。また、ラットのRGMタンパク質の遺伝子の塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列番号３及び４に示す。
下記実施例において具体的に記載するように，RGMタンパク質は軸索の成長を阻害する活性を有し，また，脊髄が損傷すると，その発現が増大する。さらに，下記実施例において，抗RGMタンパク質抗体をニューロンに作用させることにより，RGMタンパク質による軸索成長阻害が見られなくなることが確認された。従って，抗RGMタンパク質抗体のような，RGMタンパク質の軸索成長阻害活性を中和する物質は，軸索再生促進剤として用いることができる。
従って，本発明の軸索再生促進剤は，RGMタンパク質阻害剤を有効成分として含有する。ここで，「RGMタンパク質阻害剤」とは，RGMタンパク質の軸索成長阻害活性を消失又は少なくとも有意に減少させる物質を意味する。RGMタンパク質の軸索成長阻害活性は，後述する実施例に記載の通りに調べることができる。
本発明のRGMタンパク質阻害剤として特に好ましいものは抗RGMタンパク質抗体である。本明細書において，「抗RGMタンパク質抗体」とは，RGMタンパク質と抗原抗体反応により結合しうる抗体を意味する。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
RGMタンパク質に結合するポリクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，RGMタンパク質を感作抗原として用いて動物を免疫し，その血清から得ることができる。RGMタンパク質に結合するモノクローナル抗体は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，RGMタンパク質を感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし，このハイブリドーマを培養することにより得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体には，ハイブリドーマにより産生される抗体に加えて，抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体，キメラ抗体，ＣＤＲ移植抗体，およびこれらの抗体の断片等が含まれる。
遺伝子組み換え抗体は，抗RGMタンパク質抗体を生産するハイブリドーマから抗体をコードするｃＤＮＡをクローニングし，これを発現ベクター中に挿入して，動物細胞，植物細胞などを形質転換し，この形質転換体を培養することにより製造することができる。キメラ抗体とは，ある動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体である。RGMタンパク質に結合しうる抗体断片としては，Fab，F(ab')2，Fab'，scFv，ディアボディー等があげられる。
抗体産生細胞の作製
RGMタンパク質に結合する抗体を産生する細胞は，当該技術分野においてよく知られる方法により取得することができる。RGMタンパク質を感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。より詳細には，まず、抗原となるRGMタンパク質を製造する。市販の脳cDNAライブラリーにRGMタンパク質のcDNAが含まれているので，市販の脳cDNAライブラリーを鋳型としたＰＣＲにより、容易にこの遺伝子の増幅産物を得ることができ、この遺伝子を適当なベクターに挿入して、組換え的にRGMタンパク質を生成することができる。次に、このようにして製造したRGMタンパク質を抗原として，動物の皮下，静脈内または腹腔内に投与する。免疫動物としては，マウス，ラット，ハムスター，ウサギ，ヤギ等の哺乳動物を用いることができる。好ましくは，抗原をキャリアタンパク質に結合させるか，フロインド完全アジュバント等の適当なアジュバントとともに抗原を投与する。あるいは、抗原としてRGMタンパク質の部分ペプチドを用いてもよい。
RGMタンパク質に結合する抗体を産生する細胞は，当該技術分野においてよく知られる方法により取得することができる。RGMタンパク質を感作抗原として用いて動物を免疫し，得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ，抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする。より詳細には，まず、抗原となるRGMタンパク質を製造する。市販の脳cDNAライブラリーにRGMタンパク質のcDNAが含まれているので，市販の脳cDNAライブラリーを鋳型としたＰＣＲにより、容易にこの遺伝子の増幅産物を得ることができ、この遺伝子を適当なベクターに挿入して、組換え的にRGMタンパク質を生成することができる。次に、このようにして製造したRGMタンパク質を抗原として，動物の皮下，静脈内または腹腔内に投与する。免疫動物としては，マウス，ラット，ハムスター，ウサギ，ヤギ等の哺乳動物を用いることができる。好ましくは，抗原をキャリアタンパク質に結合させるか，フロインド完全アジュバント等の適当なアジュバントとともに抗原を投与する。あるいは、抗原としてRGMタンパク質の部分ペプチドを用いてもよい。
下記実施例では，配列番号４に示すアミノ酸配列を有するラットRGMタンパク質の第３０９番目のアミノ酸残基（以下，「309aa」のように記載）から322aaまでの部分ペプチドを化学合成して免疫原として用いたところ、この部分ペプチドに対するポリクローナル抗体が，RGMタンパク質の軸索成長阻害活性の中和活性を有することが見出された。したがって、ヒト遺伝子の対応する領域を含むポリペプチドを免疫原として用いて、ヒトRGMタンパク質に対する中和抗体を得ることができる。
抗原の投与は，１−３週間毎に数回行う。血清中の免疫グロブリンの量をＥＬＩＳＡ法などにより測定することにより，抗体価をモニターする。十分に抗体価が上昇した後，この動物から免疫細胞を取り出す。免疫細胞としては好ましくは脾臓細胞を用いる。抗体産生免疫細胞と，同種の哺乳動物に由来する骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマを作製するのに適した各種の骨髄腫細胞株が市販されている。融合は，当該技術分野においてよく知られる方法にしたがって，例えばＰＥＧの存在下で行い，ＨＡＴ培地で融合細胞を選択する。培養上清をＥＬＩＳＡ法などによりアッセイして，抗原と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。次に，限界希釈法により目的とする抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることができる。さらに、得られたハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体について，下記実施例に記載する軸索成長アッセイを行い，RGMタンパク質の軸索成長阻害活性を中和する活性を有するハイブリドーマを選択することができる。
モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は，モノクローナル抗体産生細胞を培養して得られる培養液の上清から，またはあらかじめ２，４，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで前処理したマウスにモノクローナル抗体産生細胞を腹腔内投与し，接種後７日から１０日目にマウスの腹水を採取し，遠心分離し，上清を分取することにより製造することができる。モノクローナル抗体の精製は，通常のタンパク質精製方法，例えば，塩析，限外濾過，ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ＨＰＬＣ等の方法を用いて行うことができる。好ましくは，プロテインＡカラムによるアフィニティークロマトグラフィーを行う。精製したモノクローナル抗体のサブクラスは，市販のマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いてタイピングすることにより決定することができる。
モノクローナル抗体は，モノクローナル抗体産生細胞を培養して得られる培養液の上清から，またはあらかじめ２，４，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで前処理したマウスにモノクローナル抗体産生細胞を腹腔内投与し，接種後７日から１０日目にマウスの腹水を採取し，遠心分離し，上清を分取することにより製造することができる。モノクローナル抗体の精製は，通常のタンパク質精製方法，例えば，塩析，限外濾過，ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ＨＰＬＣ等の方法を用いて行うことができる。好ましくは，プロテインＡカラムによるアフィニティークロマトグラフィーを行う。精製したモノクローナル抗体のサブクラスは，市販のマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを用いてタイピングすることにより決定することができる。
抗体遺伝子の塩基配列の解析
本発明のモノクローナル抗体をコードする抗体遺伝子の塩基配列は，得られたモノクローナル抗体産生細胞の遺伝子を解析することにより得ることができる。モノクローナル抗体産生細胞から全ＲＮＡを抽出し，これを鋳型としてリバーストランスクリプターゼを用いてｃＤＮＡ断片を調整する。次に，適切に設計されたプライマーを用いてＰＣＲにより抗体遺伝子のＶ領域を増幅し，この領域のｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
本発明のモノクローナル抗体をコードする抗体遺伝子の塩基配列は，得られたモノクローナル抗体産生細胞の遺伝子を解析することにより得ることができる。モノクローナル抗体産生細胞から全ＲＮＡを抽出し，これを鋳型としてリバーストランスクリプターゼを用いてｃＤＮＡ断片を調整する。次に，適切に設計されたプライマーを用いてＰＣＲにより抗体遺伝子のＶ領域を増幅し，この領域のｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
抗体の特異性の確認
本発明のモノクローナル抗体の結合の特異性は，ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，免疫薄層クロマトグラフィー，BIAcore，蛍光抗体法等の当該技術分野において知られる方法を用いて確認することができる。例えば，RGMタンパク質を固定化したマイクロプレートに，２倍希釈系列の本発明のモノクローナル抗体を加えてインキュベートした後，酵素標識二次抗体を加え，基質を加えて発色させ，マイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。
本発明のモノクローナル抗体の結合の特異性は，ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，免疫薄層クロマトグラフィー，BIAcore，蛍光抗体法等の当該技術分野において知られる方法を用いて確認することができる。例えば，RGMタンパク質を固定化したマイクロプレートに，２倍希釈系列の本発明のモノクローナル抗体を加えてインキュベートした後，酵素標識二次抗体を加え，基質を加えて発色させ，マイクロプレートリーダーで吸光度を測定する。
組換え型抗体
本発明の抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用して，遺伝子組換え技術を用いて組換え型の抗体を製造することができる。組換え型の抗RGMタンパク質モノクローナル抗体を製造するためには，本発明の抗体をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み，宿主細胞に導入する。宿主細胞としては，大腸菌，酵母，哺乳動物細胞，昆虫細胞，植物細胞などを用いることができ，特に哺乳類細胞，例えば，CHO，COS，BHKを用いることが好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は，例えば塩化カルシウム法，リン酸カルシウム法，DEAEデキストラン法，カチオン性リポソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法，エレクトロポーレーション法，リポフェクションなどの方法により行うことができる。得られた形質転換宿主細胞を培養し，抗体を発現させることにより，組換え型の抗体を製造することができる。
本発明の抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を利用して，遺伝子組換え技術を用いて組換え型の抗体を製造することができる。組換え型の抗RGMタンパク質モノクローナル抗体を製造するためには，本発明の抗体をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み，宿主細胞に導入する。宿主細胞としては，大腸菌，酵母，哺乳動物細胞，昆虫細胞，植物細胞などを用いることができ，特に哺乳類細胞，例えば，CHO，COS，BHKを用いることが好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は，例えば塩化カルシウム法，リン酸カルシウム法，DEAEデキストラン法，カチオン性リポソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法，エレクトロポーレーション法，リポフェクションなどの方法により行うことができる。得られた形質転換宿主細胞を培養し，抗体を発現させることにより，組換え型の抗体を製造することができる。
キメラ抗体
キメラ抗体とは，ある動物（例えばマウス）に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他の動物（例えばヒト）に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体である。キメラ抗体は，RGMタンパク質に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから，抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，一方，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，これらを組み合わせて適当な発現ベクター中に挿入して，宿主細胞中で発現させることにより，組換え的に製造することができる。
キメラ抗体とは，ある動物（例えばマウス）に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域と，他の動物（例えばヒト）に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域から構成される抗体である。キメラ抗体は，RGMタンパク質に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマから，抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，一方，他の動物に由来する抗体の重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードするｃＤＮＡをクローニングし，これらを組み合わせて適当な発現ベクター中に挿入して，宿主細胞中で発現させることにより，組換え的に製造することができる。
ＣＤＲ移植抗体
ＣＤＲ移植抗体は，ある動物（例えばマウス）の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の動物（例えばヒト）の抗体の相補性決定領域に移植した抗体である。ＣＤＲ移植抗体をコードする遺伝子は，RGMタンパク質に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマからクローニングされた抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列に基づいて，それぞれＣＤＲ１，２，３をコードする遺伝子配列を設計し，他の動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベクター中の対応するＣＤＲ１，２，３の配列と置き換えることにより得ることができる。例えば，マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するように設計した数個のプライマーを用いて，ＰＣＲ法により合成することができる。あるいは，合成ＤＮＡを用いて全配列を構築してもよい。この発現ベクターを適当な宿主細胞中で発現させることにより，ＣＤＲ移植抗体を組換え的に製造することができる。
ＣＤＲ移植抗体は，ある動物（例えばマウス）の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の動物（例えばヒト）の抗体の相補性決定領域に移植した抗体である。ＣＤＲ移植抗体をコードする遺伝子は，RGMタンパク質に結合するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマからクローニングされた抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列に基づいて，それぞれＣＤＲ１，２，３をコードする遺伝子配列を設計し，他の動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベクター中の対応するＣＤＲ１，２，３の配列と置き換えることにより得ることができる。例えば，マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するように設計した数個のプライマーを用いて，ＰＣＲ法により合成することができる。あるいは，合成ＤＮＡを用いて全配列を構築してもよい。この発現ベクターを適当な宿主細胞中で発現させることにより，ＣＤＲ移植抗体を組換え的に製造することができる。
抗体断片
RGMタンパク質に結合しうるFab，F(ab')2，Fab'，scFv，ディアボディー等の抗体断片は，上述の本発明の抗RGMタンパク質モノクローナル抗体をパパイン，トリプシン等の酵素で処理するか，またはこれらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることにより，製造することができる。
RGMタンパク質に結合しうるFab，F(ab')2，Fab'，scFv，ディアボディー等の抗体断片は，上述の本発明の抗RGMタンパク質モノクローナル抗体をパパイン，トリプシン等の酵素で処理するか，またはこれらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることにより，製造することができる。
RGMタンパク質阻害剤の他の例としては，セリン/スレオニンキナーゼRhoキナーゼ阻害剤として知られているY27632（非特許文献３１）を挙げることができる。下記実施例において，Y27632は，RGMタンパク質の軸索成長阻害活性を中和する活性を有することが確認された。なお，Y27632は次の化学構造を有する。
さらに，本発明の軸索再生促進剤は，RGMタンパク質阻害剤として，アンチセンスオリゴヌクレオチド，リボザイム，ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こす分子（例えば，ｄｓＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，ｓｈＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）等を含むものであってもよい。これらの核酸は，RGMタンパク質遺伝子またはRGMタンパク質をコードするｍＲＮＡに結合しその発現を阻害することができる。アンチセンス，リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いて遺伝子発現を制御する一般的方法，またはこのようにして外因性遺伝子を発現させる遺伝子治療方法は当該技術分野においてよく知られている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとは，RGMタンパク質をコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは，ｍＲＮＡと特異的に結合し，転写および／または翻訳を阻害することによりタンパク質の発現を阻害する。結合はワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく，トリプレックス形成によるものでもよい。
リボザイムとは，触媒的特性を有する１またはそれ以上のＲＮＡのＲＮＡ構造を表す。リボザイムは，一般に，エンドヌクレアーゼ，リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々の二次構造のリボザイム，例えばハンマーヘッドタイプおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは，二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。
RGMタンパク質阻害剤は，そのまま投与することも可能であるが，通常，医薬で用いられる担体を用いて製剤される。製剤に用いる担体としては，製剤分野で常用されるいずれのものをも用いることができ，例えば，注射剤の調製には生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水等が好ましく用いられる。さらに，乳化剤や浸透圧調節剤等の常用される添加剤を含めてもよい。
本発明の軸索再生促進剤の投与経路は，非経口投与が好ましく，特に，神経の損傷部に直接注射することが好ましい。
投与量は，RGMタンパク質阻害剤の種類や投与経路，神経損傷の程度等に応じて適宜選択されるが，損傷部位に直接投与する場合，成人１日，１損傷部位当たりのRGMタンパク質阻害剤の投与量は抗RGMタンパク質抗体の場合，通常，1mg〜20mg，好ましくは，5mg〜10mgであり，Y27632の場合，通常，20mg〜100mg，好ましくは，30mg〜50mgである。直接投与以外の非経口投与，例えば静脈注射等では，通常，上記投与量の１０倍程度である。
別の観点においては，本発明は，軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法を提供する。この方法は，試験物質をRGMタンパク質と接触させ，この試験物質がRGMタンパク質の機能を阻害するか否かを判定することを含む。RGMタンパク質の機能の阻害には、RGMタンパク質に結合してRGMタンパク質の正常な機能の発揮を阻害すること、特に軸索の再生を促進する能力を阻害すること、ならびにRGMタンパク質とそのレセプターとの結合を阻害することが含まれる。試験物質がRGMタンパク質と結合する能力、あるいはRGMタンパク質とそのレセプターであるネオジェニンとの結合を阻害する能力は，当業者によく知られる結合アッセイ，例えば，限定されないが，ゲルシフトアッセイ，放射性標識競合アッセイ，クロマトグラフィーによる分画などにより判定することができる。また、RGMタンパク質のレセプターであるネオジェニンの存在下で試験物質をRGMタンパク質と接触させ、Rho活性を測定してもよい。RGMタンパク質がネオジェニンと結合するとRho活性が上昇するため、試験物質の存在下でRho活性の上昇が見られない場合には、その試験物質はRGMタンパク質の機能を阻害していると考えらる。
これらのアッセイにより，RGMタンパク質の機能を阻害するものとして同定された物質は，軸索再生促進剤の候補物質であると考えられる。次に，当該技術分野において知られる軸索成長アッセイ法を用いて，この候補物質の存在下および非存在下において，ニューロンの軸索の成長を測定して比較することにより，この候補物質が軸索再生促進効果を有するか否かを判定することができる。このようなアッセイ方法の具体例は下記の実施例に記載されている。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００４−６８８４９号および２００４−２７３０４１号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
RGMタンパク質のクローニング
ニワトリRGM（非特許文献２４）のアミノ酸配列をクエリーとして用いて，GenBankデータベースのBLAST検索を行なった。その結果，accession No. がXM_218791 (Rattus norvegicus)であるラットcDNAが同定された。推定アミノ酸配列がニワトリRGMタンパク質と79%の相同性を示したので，XM_218791をラットRGMタンパク質と命名した。完全長ラットRGMタンパク質cDNAは，成熟ラット脳cDNAライブラリーからＰＣＲにより単離した。用いたフォワードプライマーの塩基配列はagtggtaacaggccgagctggatgg（配列番号５）リバースプライマーの塩基配列はccacaaccttgtcgcgtgcactaat（配列番号６）であり，95℃30秒の変性工程，55℃30秒のアニーリング工程，及び７２℃，3分30秒の伸長工程から成るサイクルを25回繰り返した。コードされるタンパク質は４３１個のアミノ酸残基から成る。非特許文献２４に基づき，ネイティブのラットRGMが152aaから始まることが予測されたので，pSecTag2(Invitrogen社製）のシグナルペプチドにHA(ヘマグルチニン)及びラットRGMタンパク質の152〜431aaを用いて，pSecTag2-Hygro(Invitrogen社製）中にHA-RGMベクターを作製した。この操作は具体的に次のようにして行なった。まず，完全長ラットRGMタンパク質cDNAを鋳型として，BamHI-HAtag-（RGMタンパク質の152〜431aaにあたるcDNA）-XhoIの断片をＰＣＲにより作成した。次に，作成した断片とpSecTag2-Hygro（Invitrogen社製）を２種類の制限酵素（BamHI及びXhoI）で切断し，両者のライゲーションをおこなった後，大腸菌に形質転換した。全てのＰＣＲ増幅断片は，ＤＮＡシーケンシングにより確認した。
ニワトリRGM（非特許文献２４）のアミノ酸配列をクエリーとして用いて，GenBankデータベースのBLAST検索を行なった。その結果，accession No. がXM_218791 (Rattus norvegicus)であるラットcDNAが同定された。推定アミノ酸配列がニワトリRGMタンパク質と79%の相同性を示したので，XM_218791をラットRGMタンパク質と命名した。完全長ラットRGMタンパク質cDNAは，成熟ラット脳cDNAライブラリーからＰＣＲにより単離した。用いたフォワードプライマーの塩基配列はagtggtaacaggccgagctggatgg（配列番号５）リバースプライマーの塩基配列はccacaaccttgtcgcgtgcactaat（配列番号６）であり，95℃30秒の変性工程，55℃30秒のアニーリング工程，及び７２℃，3分30秒の伸長工程から成るサイクルを25回繰り返した。コードされるタンパク質は４３１個のアミノ酸残基から成る。非特許文献２４に基づき，ネイティブのラットRGMが152aaから始まることが予測されたので，pSecTag2(Invitrogen社製）のシグナルペプチドにHA(ヘマグルチニン)及びラットRGMタンパク質の152〜431aaを用いて，pSecTag2-Hygro(Invitrogen社製）中にHA-RGMベクターを作製した。この操作は具体的に次のようにして行なった。まず，完全長ラットRGMタンパク質cDNAを鋳型として，BamHI-HAtag-（RGMタンパク質の152〜431aaにあたるcDNA）-XhoIの断片をＰＣＲにより作成した。次に，作成した断片とpSecTag2-Hygro（Invitrogen社製）を２種類の制限酵素（BamHI及びXhoI）で切断し，両者のライゲーションをおこなった後，大腸菌に形質転換した。全てのＰＣＲ増幅断片は，ＤＮＡシーケンシングにより確認した。
RGMタンパク質-CHO細胞の生成
Flp-In System（商品名，Invitrogen社製)を用い，製造者の指示通りにRGMタンパク質発現細胞を生成した。２種類の制限酵素（NheI及びXhoI）を用いて，pSecTag2ベクターから，シグナルペプチドを含むHA-RGM断片を生成し，これをpcDNA5FRT(Invitrogen社製)に連結した。この構築物(pcDNA5FRT/Igκleader/HA/RGM)及びpOG44をFlp-in CHO細胞に共トランスフェクトし，ハイグロマイシンＢ(500μg/ml, Invitrogen社製）を含む培地中で２週間増殖させることにより安定にHA-RGMを発現する細胞が生成された。HA-RGMの発現は，ウェスタンブロット及び免疫細胞化学（図２）により確認した。
Flp-In System（商品名，Invitrogen社製)を用い，製造者の指示通りにRGMタンパク質発現細胞を生成した。２種類の制限酵素（NheI及びXhoI）を用いて，pSecTag2ベクターから，シグナルペプチドを含むHA-RGM断片を生成し，これをpcDNA5FRT(Invitrogen社製)に連結した。この構築物(pcDNA5FRT/Igκleader/HA/RGM)及びpOG44をFlp-in CHO細胞に共トランスフェクトし，ハイグロマイシンＢ(500μg/ml, Invitrogen社製）を含む培地中で２週間増殖させることにより安定にHA-RGMを発現する細胞が生成された。HA-RGMの発現は，ウェスタンブロット及び免疫細胞化学（図２）により確認した。
軸索成長アッセイ
生後８日(P8)の仔ラットからの小脳顆粒細胞を，トリプシン処理(PBS中0.25%トリプシン，３７℃，１５分間）により分離し，血清含有培地に再懸濁し，粉砕し，PBSで３回洗浄した。共存培養アッセイのために，チャンバースライド中のRGM-CHO細胞又は対照CHO細胞のコンフルーエント単細胞層上にニューロンをプレートした。ROCK(Rhoキナーゼ）を阻害するために，10μMのY27632（大阪のウェルファイド社製）を培養物に添加した。培養物を，血清フリーのDMEM/F12培地中で２４時間増殖させた。
生後８日(P8)の仔ラットからの小脳顆粒細胞を，トリプシン処理(PBS中0.25%トリプシン，３７℃，１５分間）により分離し，血清含有培地に再懸濁し，粉砕し，PBSで３回洗浄した。共存培養アッセイのために，チャンバースライド中のRGM-CHO細胞又は対照CHO細胞のコンフルーエント単細胞層上にニューロンをプレートした。ROCK(Rhoキナーゼ）を阻害するために，10μMのY27632（大阪のウェルファイド社製）を培養物に添加した。培養物を，血清フリーのDMEM/F12培地中で２４時間増殖させた。
可溶性RGMアッセイのために，2.5 U/mlのPI-PLC(フォスファチジルイノシトール特異的ホスフォリパーゼＣ，Sigma社製）を含む又は含まない血清フリーDMEM/F12中でRGM-CHO細胞又は対照CHO細胞のコンフルーエント単細胞層をインキュベートした。培養物を13000gで１０分間遠心後，上清を回収することにより浮遊細胞を除去した。上清の一部をウェスタンブロット分析に供した。ポリL-リジンをコートしたチャンバースライド上のコンディションド培地上にニューロンをプレートし，１２時間又は２４時間インキュベートした。軸索アッセイのために，細胞を4%(w/v)パラホルムアルデヒドで固定し，ニューロンに特異的なβチューブリンIIIタンパク質を認識するモノクローナル抗体(TuJ1，1:1000, CovanceResearch Products, Inc., アメリカのDenver)をで免疫染色した。次いで，βチューブリンIII陽性ニューロンのそれぞれについて最長の突起（軸索）の長さを測定した。
脊髄損傷
麻酔した(ペントバルビタールナトリウム，40 mg/kg)雌Wistarラット(200〜250g)に，脊椎レベルT10の椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。No.11ブレードを用いて脊髄を切断することにより後索，皮質脊髄路及び後角の一部の損傷部位を作出した。次に，筋肉及び皮膚層を縫合した。膀胱の機能が回復するまで，１日に少なくとも２回，腹腔に圧力を加えて膀胱を圧迫した。
麻酔した(ペントバルビタールナトリウム，40 mg/kg)雌Wistarラット(200〜250g)に，脊椎レベルT10の椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。No.11ブレードを用いて脊髄を切断することにより後索，皮質脊髄路及び後角の一部の損傷部位を作出した。次に，筋肉及び皮膚層を縫合した。膀胱の機能が回復するまで，１日に少なくとも２回，腹腔に圧力を加えて膀胱を圧迫した。
抗ラットRGMタンパク質抗体の産生
RGMタンパク質の部分ペプチド(309-322aa)を化学合成し，これを免疫原として用いて抗ラットRGMタンパク質ウサギ抗血清を得た。これをアフィニティ精製し，免疫組織化学及び免疫ブロットのためには1μg/mlの濃度で，中和抗体アッセイのためには10μg/mlの濃度で用いた。
RGMタンパク質の部分ペプチド(309-322aa)を化学合成し，これを免疫原として用いて抗ラットRGMタンパク質ウサギ抗血清を得た。これをアフィニティ精製し，免疫組織化学及び免疫ブロットのためには1μg/mlの濃度で，中和抗体アッセイのためには10μg/mlの濃度で用いた。
組織調製及び免疫組織化学
免疫組織化学のために，未損傷脊髄又は損傷後６時間，１日，３日若しくは７日の脊髄から新鮮な凍結組織を得た。ジエチルエーテルで深く麻酔した後，頭部切除し，脊髄を取り出し，Tissue Tek OCT（商品名）中に包埋し，直ちにドライアイス上で-80℃で凍結した。一連の傍矢状切片をクライオスタット上で18μmの位置で切断し，APS coating Superfrost-Plus slide(商品名，大阪の松浪硝子工業社製）上にマウントした。切片を4%(w/v)パラホルムアルデヒドで室温，１時間固定し，PBSで３回洗浄し，5%ヤギ血清(GS)及び0.1% Triton X-100(商品名）を含むPBS中で，室温，１時間ブロックした。切片を一次抗体と共に４℃で一夜インキュベートし，PBSで３回洗浄し，フルオレッセイン結合二次抗体(1:1000; Molecular Probes社製）と共に室温，１時間インキュベートした。抗ラットRGMタンパク質ポリクローナル抗体(1μg/ml)，抗神経膠線維酸性タンパク質(GFAP)モノクローナル抗体(1:1000, Sigma社製），抗ミエリン／乏突起神経膠細胞特異的特異的蛋白(MOSP)モノクローナル抗体(1:500; Chemicon社製)又はβチューブリンIIIタンパク質を認識するモノクローナル抗体(TuJ1, 1:1000, Covance社製）を一次抗体として用いた。試料を共焦点走査電子顕微鏡（ドイツ国JenaのCarl Zeiss社製）で調べた。抗ラットRGMタンパク質抗体の特異性を調べるために，対照及び脊髄損傷(SCI)切片を，ラットRGMタンパク質特異的ペプチド(309-322aa)の存在下で染色した。組織は，10μg/mlの該ペプチドを添加することにより全く染色されなくなった（データ示さず）。
免疫組織化学のために，未損傷脊髄又は損傷後６時間，１日，３日若しくは７日の脊髄から新鮮な凍結組織を得た。ジエチルエーテルで深く麻酔した後，頭部切除し，脊髄を取り出し，Tissue Tek OCT（商品名）中に包埋し，直ちにドライアイス上で-80℃で凍結した。一連の傍矢状切片をクライオスタット上で18μmの位置で切断し，APS coating Superfrost-Plus slide(商品名，大阪の松浪硝子工業社製）上にマウントした。切片を4%(w/v)パラホルムアルデヒドで室温，１時間固定し，PBSで３回洗浄し，5%ヤギ血清(GS)及び0.1% Triton X-100(商品名）を含むPBS中で，室温，１時間ブロックした。切片を一次抗体と共に４℃で一夜インキュベートし，PBSで３回洗浄し，フルオレッセイン結合二次抗体(1:1000; Molecular Probes社製）と共に室温，１時間インキュベートした。抗ラットRGMタンパク質ポリクローナル抗体(1μg/ml)，抗神経膠線維酸性タンパク質(GFAP)モノクローナル抗体(1:1000, Sigma社製），抗ミエリン／乏突起神経膠細胞特異的特異的蛋白(MOSP)モノクローナル抗体(1:500; Chemicon社製)又はβチューブリンIIIタンパク質を認識するモノクローナル抗体(TuJ1, 1:1000, Covance社製）を一次抗体として用いた。試料を共焦点走査電子顕微鏡（ドイツ国JenaのCarl Zeiss社製）で調べた。抗ラットRGMタンパク質抗体の特異性を調べるために，対照及び脊髄損傷(SCI)切片を，ラットRGMタンパク質特異的ペプチド(309-322aa)の存在下で染色した。組織は，10μg/mlの該ペプチドを添加することにより全く染色されなくなった（データ示さず）。
中和抗体アッセイ
対照CHO細胞又はRGM-CHO細胞のPI-PLC処理により誘導されたコンディションド培地中のポリL-リジンコートチャンバースライド上に小脳顆粒ニューロンをプレートした。RGM-CHO細胞のPI-PLC処理により誘導されたコンディションド培地に抗ラットRGMタンパク質抗体(10μg/ml)を添加した。２４時間インキュベート後，成長アッセイを上記と同様に行なった。
対照CHO細胞又はRGM-CHO細胞のPI-PLC処理により誘導されたコンディションド培地中のポリL-リジンコートチャンバースライド上に小脳顆粒ニューロンをプレートした。RGM-CHO細胞のPI-PLC処理により誘導されたコンディションド培地に抗ラットRGMタンパク質抗体(10μg/ml)を添加した。２４時間インキュベート後，成長アッセイを上記と同様に行なった。
ウェスタンブロットアッセイ
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤 (ドイツ国ManheimのRoche Diagnostics社製)を含む， 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl，10%グリセロール，0.5% Brij-58 (Sigma社製)で対照CHO細胞又はRGM-CHO細胞を溶解した。細胞溶解物を13000g，４℃，１０分間の遠心で清澄化し，上清を回収し，Bio-Rad DC protein assay kit(商品名）を用いてタンパク濃度を正規化した。12%β-メルカプトエタノールを含む試料バッファー中で，等量のタンパク質を５分間煮沸し，SDS-PAGEにかけた。溶解バッファー処理を除き，コンディションド培地も同様に処理した。タンパク質をPVDF膜に転写し，5%スキムミルク及び0.05% Tween 20(商品名）を含むPBS中で，室温，１時間ブロックした。抗ラットRGMタンパク質ポリクローナル抗体(1μg/ml)又は抗HAモノクローナル抗体(1:1000, Sigma社製）で膜を一夜ブロットした。検出のために，ECL chemiluminescence system (商品名，Amersham Biosciences社製）及びHRP(セイヨウワサビペルオキシダーゼ)-結合二次抗体(1:1000; Cell Signaling Technology社製）を用いた。
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤 (ドイツ国ManheimのRoche Diagnostics社製)を含む， 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl，10%グリセロール，0.5% Brij-58 (Sigma社製)で対照CHO細胞又はRGM-CHO細胞を溶解した。細胞溶解物を13000g，４℃，１０分間の遠心で清澄化し，上清を回収し，Bio-Rad DC protein assay kit(商品名）を用いてタンパク濃度を正規化した。12%β-メルカプトエタノールを含む試料バッファー中で，等量のタンパク質を５分間煮沸し，SDS-PAGEにかけた。溶解バッファー処理を除き，コンディションド培地も同様に処理した。タンパク質をPVDF膜に転写し，5%スキムミルク及び0.05% Tween 20(商品名）を含むPBS中で，室温，１時間ブロックした。抗ラットRGMタンパク質ポリクローナル抗体(1μg/ml)又は抗HAモノクローナル抗体(1:1000, Sigma社製）で膜を一夜ブロットした。検出のために，ECL chemiluminescence system (商品名，Amersham Biosciences社製）及びHRP(セイヨウワサビペルオキシダーゼ)-結合二次抗体(1:1000; Cell Signaling Technology社製）を用いた。
結果
軸索成長アッセイ
小脳顆粒ニューロンを，ラットRGMタンパク質発現CHO細胞又は対照CHO細胞のコンフルーエント単細胞層上にプレートして行なった軸索成長アッセイの結果を図１に示す。図１に示すように，RGMタンパク質発現CHO細胞上で小脳顆粒ニューロンを培養した場合には，軸索長さが対照に比べて有意に短かった。一方，本発明の軸索成長促進剤であるY27632を培地に添加した場合には，対照と同程度に軸索が成長し，RGMタンパク質発現CHO細胞上で培養した場合に比べ，有意に軸索が成長された。
軸索成長アッセイ
小脳顆粒ニューロンを，ラットRGMタンパク質発現CHO細胞又は対照CHO細胞のコンフルーエント単細胞層上にプレートして行なった軸索成長アッセイの結果を図１に示す。図１に示すように，RGMタンパク質発現CHO細胞上で小脳顆粒ニューロンを培養した場合には，軸索長さが対照に比べて有意に短かった。一方，本発明の軸索成長促進剤であるY27632を培地に添加した場合には，対照と同程度に軸索が成長し，RGMタンパク質発現CHO細胞上で培養した場合に比べ，有意に軸索が成長された。
溶液の形態にあるRGMタンパク質が軸索成長を阻害するか否かを調べた。試験に先立ち，培地をPI-PLCで処理することにより，HA-RGMタンパク質が培地に遊離されることを抗HA抗体を用いた免疫染色により確認した。なお，PI-PLCにより，GPI(グリコシルホスファチジルイノシトール)-結合タンパク質が膜から遊離される。RGMタンパク質は，上記の通りニワトリRGMと相同性が高く，GPI-結合タンパク質であると予測されたため，PI-PLC処理を行なった。その結果，PI-PLC処理を行なったRGMタンパク質発現CHO細胞の培地においてのみ，免疫染色によりHA-RGMタンパク質が検出され，対照CHO細胞の培地及びPI-PLC処理を行なわなかったRGMタンパク質発現CHO細胞の培地中には，HA-RGMタンパク質は全く検出されなかった。このことから，RGMタンパク質は，GPI-結合タンパク質であり，PI-PLC処理により溶液中に遊離されることが確認された。
各コンディションド培地で処理したニューロンの軸索長さを図２に示す。図２に示すように，RGMタンパク質発現CHO細胞をPI-PLC処理した培地で処理したニューロンのみ，軸索の成長が有意に阻害された。これは，RGMタンパク質が，軸索の成長を阻害する作用を有していることを示している。また，対照のCHO細胞の培地では，PI-PLC処理の有無により軸索長さは変わらなかった。このことは，PI-PLC処理自体が，軸索成長に影響を与えないことを示している。
RGMタンパク質の脊髄中での分布
試験に先立ち，作製した抗RGMタンパク質抗体がRGMタンパク質に対して特異性を有するか否かの確認試験を行なった。抗HA抗体又は作製した抗RGMタンパク質抗体を用い，PI-PLC処理を行なったRGMタンパク質発現CHO細胞の培地についてウェスタンブロットを行なった。その結果，抗HA抗体を用いた場合も，作製した抗RGMタンパク質抗体を用いた場合も，全く同じ位置（約35Kダルトン）にバンドが検出され，対照では検出されなかった。さらに，抗RGMタンパク質抗体を作製する際に，免疫原として用いた上記ペプチドを10μg/mlの濃度で抗RGMタンパク質抗体に添加し，それを用いて成熟ラットの損傷脊髄又は正常脊髄の新鮮な凍結切片の免疫組織染色を行なうと，全く染色されなくなった。これらのことから，作製した抗RGMタンパク質抗体が，RGMタンパク質に対して特異性を有する（抗原抗体反応する）ことが確認された。
試験に先立ち，作製した抗RGMタンパク質抗体がRGMタンパク質に対して特異性を有するか否かの確認試験を行なった。抗HA抗体又は作製した抗RGMタンパク質抗体を用い，PI-PLC処理を行なったRGMタンパク質発現CHO細胞の培地についてウェスタンブロットを行なった。その結果，抗HA抗体を用いた場合も，作製した抗RGMタンパク質抗体を用いた場合も，全く同じ位置（約35Kダルトン）にバンドが検出され，対照では検出されなかった。さらに，抗RGMタンパク質抗体を作製する際に，免疫原として用いた上記ペプチドを10μg/mlの濃度で抗RGMタンパク質抗体に添加し，それを用いて成熟ラットの損傷脊髄又は正常脊髄の新鮮な凍結切片の免疫組織染色を行なうと，全く染色されなくなった。これらのことから，作製した抗RGMタンパク質抗体が，RGMタンパク質に対して特異性を有する（抗原抗体反応する）ことが確認された。
RGMタンパク質の分布を調べるために，成熟ラットから新鮮な凍結切片を調製し，免疫組織染色を行なった。この免疫組織染色は具体的に次のようにして行なった。まず，新鮮凍結切片を室温にて十分に乾燥させた。リン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド溶液で１時間固定し，ブロッキング操作を１時間，次に一次抗体処理を４℃にて一晩行い，二次抗体処理を室温にて１時間行った。ブロッキング溶液として0.1Mリン酸緩衝食塩水の中にヤギ血清10%，tritonX 0.1%を添加したものを用いた。一次抗体液として上記のブロッキング溶液に抗RGMタンパク質を１μg/mlを添加したものを用いた。二次抗体液として0.1Mリン酸緩衝食塩水の中にヤギ血清10%とフルオレッセイン結合二次抗体（1:1000; Molecular Probes社製）を用いた。その結果，白質及び灰白質の両方において，RGMタンパク質が恒常的に発現していることがわかった。
抗RGMタンパク質−抗-MOSP(ミエリン／乏突起神経膠細胞特異的タンパク質）で二重染色することにより，RGMタンパク質は乏突起神経膠細胞及び白質中のその突起中で発現していることが示された。さらに，RGMタンパク質は，Tuj1(ニューロン特異的βチューブリンIIIタンパク質)-陽性ニューロンの細胞体に局在化しており，白質中のこれらの細胞の軸索には局在化していなかった。抗ラットRGMタンパク質抗体及び抗星状細胞マーカーGFAP(神経膠線維酸性タンパク質）で二重免疫組織化学染色を行なったところ，これらが共に局在化している部位は全くなかった。このことは，RGMタンパク質が星状細胞中に存在しないことを示している。総合すると，RGMタンパク質は，ニューロン及び星状細胞により発現され，脊髄中におけるその発現パターンはNogo又はOMgpに類似している。
脊髄損傷後のRGMタンパク質発現
RGMタンパク質の発現は，損傷部位の中心並びに損傷部位の頭側及び尾側の白質中において検出された。中心領域では，損傷６時間後には，組織構造は正常に見えた。退行変化が観察され始める損傷１日〜３日後には，RGMタンパク質に対する免疫反応は，損傷部位上及び異所性細胞外マトリックス中にも観察された。この細胞外免疫反応性は，RGMタンパク質発現細胞の退行に起因するものかもしれない。中心領域におけるRGMタンパク質発現細胞を特徴付けるために，抗GFAP-抗RGMタンパク質，抗MOSP-抗RGMタンパク質，及び抗Tuj1-抗RGMタンパク質を用い，損傷７日後の組織について二重標識実験を行なったところ，二重標識細胞（すなわち，GFAP陽性及びRGMタンパク質陽性，MOSP陽性及びRGMタンパク質陽性，又はTuj1陽性及びRGMタンパク質陽性）は観察されなかった。中枢神経系への損傷が，グリア細胞性瘢痕をもたらすことを考慮すると，これらの細胞は，例えば小グリア細胞，マクロファージ，乏突起神経膠前駆細胞，線維芽細胞，軟膜細胞及び／又はシュワン細胞などの，グリア細胞性瘢痕を構成する他の種類の細胞であるかもしれない。
RGMタンパク質の発現は，損傷部位の中心並びに損傷部位の頭側及び尾側の白質中において検出された。中心領域では，損傷６時間後には，組織構造は正常に見えた。退行変化が観察され始める損傷１日〜３日後には，RGMタンパク質に対する免疫反応は，損傷部位上及び異所性細胞外マトリックス中にも観察された。この細胞外免疫反応性は，RGMタンパク質発現細胞の退行に起因するものかもしれない。中心領域におけるRGMタンパク質発現細胞を特徴付けるために，抗GFAP-抗RGMタンパク質，抗MOSP-抗RGMタンパク質，及び抗Tuj1-抗RGMタンパク質を用い，損傷７日後の組織について二重標識実験を行なったところ，二重標識細胞（すなわち，GFAP陽性及びRGMタンパク質陽性，MOSP陽性及びRGMタンパク質陽性，又はTuj1陽性及びRGMタンパク質陽性）は観察されなかった。中枢神経系への損傷が，グリア細胞性瘢痕をもたらすことを考慮すると，これらの細胞は，例えば小グリア細胞，マクロファージ，乏突起神経膠前駆細胞，線維芽細胞，軟膜細胞及び／又はシュワン細胞などの，グリア細胞性瘢痕を構成する他の種類の細胞であるかもしれない。
中心領域に隣接する白質中では，RGMタンパク質−免疫陽性細胞及び免疫反応性の強度は，６時間後までほとんど変化しなかった。しかしながら，術後１日ないし３日において，それらは連続的に増大した。７日後には，無傷の脊髄に比べて有意にその密度が高くなった。白質中のRGMタンパク質発現細胞を特徴付けるために，損傷７日後の組織について二重標識実験を行なった。抗RGMタンパク質−抗GFAP及び抗RGMタンパク質−抗Tuj1を用いて二重染色を行なったところ，二重標識細胞は観察されなかった。これにより，これらの細胞は星状細胞でもニューロンでもないことが確認された。RGMタンパク質及びMOSPで二重染色を行なったところ，二重染色された細胞が検出された。このことは，脊髄損傷後，RGMタンパク質が乏突起神経膠細胞中で強く発現されることを示している。最終的に，全てのMOSP発現細胞がRGMタンパク質を発現することが確認され，RGMタンパク質陽性でMOSP陰性細胞は観察されなかった。白質中のこれらの細胞は，損傷部位の中心で観察された細胞と同じであると考えられる。従って，RGMタンパク質は，損傷部位の中心及びそれに隣接する白質において，脊髄の損傷に応答して発現が増大する。
抗RGMタンパク質抗体による，RGMタンパク質の軸索成長阻害活性の中和
結果を図３に示す。図３中，「＊」は，RGMが対照に対して有意に短いことを示しており，「**」は，RGM+抗RGMが，RGMに対して有意に長くなっていることを示している。図３に示すように，抗RGMタンパク質抗体を添加すると，RGMタンパク質による軸索成長阻害活性は有意に中和された。これにより，抗RGMタンパク質ポリクローナル抗体が，軸索成長促進剤として利用可能であることが確認された。
結果を図３に示す。図３中，「＊」は，RGMが対照に対して有意に短いことを示しており，「**」は，RGM+抗RGMが，RGMに対して有意に長くなっていることを示している。図３に示すように，抗RGMタンパク質抗体を添加すると，RGMタンパク質による軸索成長阻害活性は有意に中和された。これにより，抗RGMタンパク質ポリクローナル抗体が，軸索成長促進剤として利用可能であることが確認された。
１．方法
(1) 外科的施術
麻酔した（ペントバルビタールナトリウム，40mg/kg）雄Wistarラット（200〜250g）に，脊椎レベルT9/10の椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。No.11ブレードを用いて脊髄の背側の部分を1.8mmの深さに切った。組織学的検査により，全ての動物において，これらの損傷は，後柱中の全ての背側の皮質脊髄路（CST）線維及び外側皮質脊髄路を切断し，中心管を超えて延びていた。この脊髄半側切断の直後，対照抗体（8匹，22.3μg/kg・日，２週間）又は実施例１で作製した抗RGMタンパク質抗体（8匹，22.3μg/kg・日，２週間）を満たした浸透圧ミニポンプ（200μL溶液，0.5μL／時間，14日間送達）（米国カリフォルニア州CupertinoのDurect Corp.）を装着した。該ミニポンプは，動物の背中の皮下に置き，ミニポンプの出口に接続されたシリコーン製チューブは，脊髄半側切断部位の硬膜下に，ティップが損傷部位の頭側の直近傍に来るように置いた。該チューブは，椎弓切除術部位の直下肢側の棘突起に縫いつけて固定した。次に，筋肉及び皮膚層を縫合した。膀胱の機能が回復するまで，少なくとも１日２回，手で腹圧を加えて膀胱を圧迫した。
(1) 外科的施術
麻酔した（ペントバルビタールナトリウム，40mg/kg）雄Wistarラット（200〜250g）に，脊椎レベルT9/10の椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。No.11ブレードを用いて脊髄の背側の部分を1.8mmの深さに切った。組織学的検査により，全ての動物において，これらの損傷は，後柱中の全ての背側の皮質脊髄路（CST）線維及び外側皮質脊髄路を切断し，中心管を超えて延びていた。この脊髄半側切断の直後，対照抗体（8匹，22.3μg/kg・日，２週間）又は実施例１で作製した抗RGMタンパク質抗体（8匹，22.3μg/kg・日，２週間）を満たした浸透圧ミニポンプ（200μL溶液，0.5μL／時間，14日間送達）（米国カリフォルニア州CupertinoのDurect Corp.）を装着した。該ミニポンプは，動物の背中の皮下に置き，ミニポンプの出口に接続されたシリコーン製チューブは，脊髄半側切断部位の硬膜下に，ティップが損傷部位の頭側の直近傍に来るように置いた。該チューブは，椎弓切除術部位の直下肢側の棘突起に縫いつけて固定した。次に，筋肉及び皮膚層を縫合した。膀胱の機能が回復するまで，少なくとも１日２回，手で腹圧を加えて膀胱を圧迫した。
(2) 組織調製及び免疫組織化学
組織調製及び免疫組織化学は，実施例１と同様に行った。
組織調製及び免疫組織化学は，実施例１と同様に行った。
(3) CSTの順行性標識
損傷８週間後，下行CST線維を，ビオチンデキストランアミン（BDA，生理食塩液中10%，皮質当り3.5μL，分子量10000，米国オレゴン州EugeneのMolecular Probes社）を，麻酔下，左右の運動皮質に注射した（座標：ブレグマの2mm後方，ブレグマの2mm側方，深さ1.5mm）。各注射において，マイクロリッターシリンジに装着した内径15〜20μmのガラス毛管を介して，0.25μLのBDAを30秒間に亘って注入した。合計で，６匹の対照，及び８匹のSCI後抗RGMタンパク質抗体投与ラットについて検査し比較した。BDA注射１４日後，PBS及び次いでパラホルムアルデヒドを潅流して動物を殺した。損傷部位を通る脊髄のクリオスタット切片を傍矢状に切った（50μm）。損傷部位の頭側及び下肢側の横断切片を採取した。切片は，0.5%ウシ血清アルブミン（BSA）含有PBSで１時間ブロッキングし，次いで，0.15% BSA含有PBS中Alxa Fluor488-（商品名）結合ストレプトアビジン（1:400，Molecular Probes社）と共に１日間インキュベートした。損傷部位の中心から，最も下肢側に延びた，BDA検出CST線維までの距離を測定した。
損傷８週間後，下行CST線維を，ビオチンデキストランアミン（BDA，生理食塩液中10%，皮質当り3.5μL，分子量10000，米国オレゴン州EugeneのMolecular Probes社）を，麻酔下，左右の運動皮質に注射した（座標：ブレグマの2mm後方，ブレグマの2mm側方，深さ1.5mm）。各注射において，マイクロリッターシリンジに装着した内径15〜20μmのガラス毛管を介して，0.25μLのBDAを30秒間に亘って注入した。合計で，６匹の対照，及び８匹のSCI後抗RGMタンパク質抗体投与ラットについて検査し比較した。BDA注射１４日後，PBS及び次いでパラホルムアルデヒドを潅流して動物を殺した。損傷部位を通る脊髄のクリオスタット切片を傍矢状に切った（50μm）。損傷部位の頭側及び下肢側の横断切片を採取した。切片は，0.5%ウシ血清アルブミン（BSA）含有PBSで１時間ブロッキングし，次いで，0.15% BSA含有PBS中Alxa Fluor488-（商品名）結合ストレプトアビジン（1:400，Molecular Probes社）と共に１日間インキュベートした。損傷部位の中心から，最も下肢側に延びた，BDA検出CST線維までの距離を測定した。
(4) 行動試験
Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動評価基準(Basso, D.M., Beattie, M.S., & Bresnahan, J.C., A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995))により，損傷後７週間に亘り，開放フィールド環境下で行動回復を評価した。盲検的に定量を行った。
Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動評価基準(Basso, D.M., Beattie, M.S., & Bresnahan, J.C., A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995))により，損傷後７週間に亘り，開放フィールド環境下で行動回復を評価した。盲検的に定量を行った。
２．結果
(1) RGMタンパク質の中和による機能的改善
上記の通り，内発性のRGMタンパク質が，損傷された中枢神経系の軸索の再生の阻害剤として働くのか否かを評価した。ラットの脊髄の背側2/3を，脊椎レベルTh9/10において切除することにより，主皮質脊髄路及び外側皮質脊髄路を切除した。抗RGMタンパク質中和抗体又は対照としてのIgGを浸透圧ミニポンプにより，胸部の損傷部の近傍の硬膜下に設置したカテーテルを介して送達した。対照群と処置群では，損傷の深さに有意差はなかった。運動動作を監視した。脊髄を損傷しない擬似手術を施したラットでは，Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動スコアが満点であった。全てのラットは，損傷１日後には，ほぼ完全に対麻痺状態であった（図４）。その後，BBBスコアにより評価される運動行動を部分的に徐々に回復した。脊髄損傷後４週間までは，抗RGMタンパク質抗体投与動物と対照動物の間にBBBスコアの差はなかった。注目すべきことに，手術の６週間後から７週間後の間の運動動作は，抗RGMタンパク質抗体を投与されたラットの方が，対照ラットよりも有意に優れていた。従って，抗RGMタンパク質抗体は，脊髄損傷ラットの治療に有効である。
(1) RGMタンパク質の中和による機能的改善
上記の通り，内発性のRGMタンパク質が，損傷された中枢神経系の軸索の再生の阻害剤として働くのか否かを評価した。ラットの脊髄の背側2/3を，脊椎レベルTh9/10において切除することにより，主皮質脊髄路及び外側皮質脊髄路を切除した。抗RGMタンパク質中和抗体又は対照としてのIgGを浸透圧ミニポンプにより，胸部の損傷部の近傍の硬膜下に設置したカテーテルを介して送達した。対照群と処置群では，損傷の深さに有意差はなかった。運動動作を監視した。脊髄を損傷しない擬似手術を施したラットでは，Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)運動スコアが満点であった。全てのラットは，損傷１日後には，ほぼ完全に対麻痺状態であった（図４）。その後，BBBスコアにより評価される運動行動を部分的に徐々に回復した。脊髄損傷後４週間までは，抗RGMタンパク質抗体投与動物と対照動物の間にBBBスコアの差はなかった。注目すべきことに，手術の６週間後から７週間後の間の運動動作は，抗RGMタンパク質抗体を投与されたラットの方が，対照ラットよりも有意に優れていた。従って，抗RGMタンパク質抗体は，脊髄損傷ラットの治療に有効である。
なお，図４は，抗RGMタンパク質抗体又は対照抗体を投与したラットの，中央胸部背側の半側切除術後，図示の時間が経過した後のBBBスコアを示すものである。各群６匹又は８匹のラットの平均±標準偏差を示す。＊は，抗RGMタンパク質抗体を投与した群が，その週において，対照群とは有意に異なることを示している。*:対照に対してp<0.05。
(2) RGMタンパク質阻害による軸索再生促進
上記の通り，先に試験したラットの一部について，BDAを知覚−運動皮質に注入することにより，背側CST（皮質脊髄路）の完全性を調べた。抗RGMタンパク質抗体を投与した損傷ラットからの試料（図5b）は，対照ラットからの試料（図5a）と比較して全く異なったパターンの標識化を示した。抗RGMタンパク質抗体を投与しなかったラットにおいては，損傷部位の基端部では，主CSTは損傷より頭側において途絶している（図5a,c）。この基本的なパターンは，中枢神経系では，軸索の再生が通常起こらないことを反映している。対照的に，抗RGMタンパク質抗体を投与したラットでは，標識したCSTから出芽した多数の線維が観察された（図5b,d）。出芽した軸索は，白質よりも灰白質中によりよく延びていた。このタイプの多数の線維は，該抗体を投与した全ての損傷動物において観察された。これは，BDAの取り込みの程度が異なることに起因するものではあり得ない。なぜなら，損傷部位よりも頭側の背側CST中の線維の総数は，抗体投与動物と対照動物の間で差が見られなかったからである。両群のラットについて，損傷部位を通る縦断面を観察すると，中和抗体を投与されたラットでは，CST線維の退縮がより少なく，多数の側枝CSTが出芽していた（図5a,b,i）。抗RGMタンパク質投与ラットにおいて，典型的な不規則的曲折成長を示す再生線維は，損傷部位のレベルにおける組織橋（tissue bridge）において高頻度に見られた（図5d,f）。これらの再生線維は，背側の白質および損傷瘢痕内に向かって，かつ，嚢胞に沿って成長した（図5f,h）。注目すべきことに，多くの軸索が損傷組織を横切り，穴の周囲に成長するか又は損傷の中心部内に成長していた。中和抗体を投与されたラットの損傷部位におけるCST線維を高倍率で顕微鏡観察すると，シナプス様腫脹に類似した形態を示していた。一方，対照ラットでは，BDAが検出されなかった（図5e）。抗体投与ラットでは，軸索の束は，損傷組織を通って3.5mmまで成長し，損傷部位から下肢側に5mmも延びているものもあり，多数の標識化線維が観察された（図5g,h,j）。一方，対照ラットでは，線維は観察されなかった。これらの線維の多くは，直線的な弾道ではなく，分枝及び蛇行を伴っていた。再生線維の最も下肢側において，主管から出芽する多くの分枝が観察された。従って，抗RGMタンパク質抗体投与は，CST軸索の再生を促進する。
上記の通り，先に試験したラットの一部について，BDAを知覚−運動皮質に注入することにより，背側CST（皮質脊髄路）の完全性を調べた。抗RGMタンパク質抗体を投与した損傷ラットからの試料（図5b）は，対照ラットからの試料（図5a）と比較して全く異なったパターンの標識化を示した。抗RGMタンパク質抗体を投与しなかったラットにおいては，損傷部位の基端部では，主CSTは損傷より頭側において途絶している（図5a,c）。この基本的なパターンは，中枢神経系では，軸索の再生が通常起こらないことを反映している。対照的に，抗RGMタンパク質抗体を投与したラットでは，標識したCSTから出芽した多数の線維が観察された（図5b,d）。出芽した軸索は，白質よりも灰白質中によりよく延びていた。このタイプの多数の線維は，該抗体を投与した全ての損傷動物において観察された。これは，BDAの取り込みの程度が異なることに起因するものではあり得ない。なぜなら，損傷部位よりも頭側の背側CST中の線維の総数は，抗体投与動物と対照動物の間で差が見られなかったからである。両群のラットについて，損傷部位を通る縦断面を観察すると，中和抗体を投与されたラットでは，CST線維の退縮がより少なく，多数の側枝CSTが出芽していた（図5a,b,i）。抗RGMタンパク質投与ラットにおいて，典型的な不規則的曲折成長を示す再生線維は，損傷部位のレベルにおける組織橋（tissue bridge）において高頻度に見られた（図5d,f）。これらの再生線維は，背側の白質および損傷瘢痕内に向かって，かつ，嚢胞に沿って成長した（図5f,h）。注目すべきことに，多くの軸索が損傷組織を横切り，穴の周囲に成長するか又は損傷の中心部内に成長していた。中和抗体を投与されたラットの損傷部位におけるCST線維を高倍率で顕微鏡観察すると，シナプス様腫脹に類似した形態を示していた。一方，対照ラットでは，BDAが検出されなかった（図5e）。抗体投与ラットでは，軸索の束は，損傷組織を通って3.5mmまで成長し，損傷部位から下肢側に5mmも延びているものもあり，多数の標識化線維が観察された（図5g,h,j）。一方，対照ラットでは，線維は観察されなかった。これらの線維の多くは，直線的な弾道ではなく，分枝及び蛇行を伴っていた。再生線維の最も下肢側において，主管から出芽する多くの分枝が観察された。従って，抗RGMタンパク質抗体投与は，CST軸索の再生を促進する。
なお，図５中，a,bは，BDA標識したCST線維の代表的な写真であり，頭側を左側に示す。対照IgG(a)又は抗RGMタンパク質抗体(b)を投与した脊髄の，順行的に標識した，損傷１０週間後のCST線維を示す（図５及び６においてRGMタンパク質を「RGMa」と記載）。損傷部位の中心を星印で示す。図５中，c〜gは，図５のa及びbの，四角で囲んだ領域を，より高倍率で観察した写真である。抗RGMタンパク質抗体を投与したラットでは，増加した側枝CST線維が，頭側に出芽し(d)，損傷部位において再生線維が見られる（f，矢印）が，対照IgGを投与したラットでは対応する領域においてこれらは観察されなかった（c，e）。hはbと同一の動物の別の切片であり，損傷部位の中心（矢印）から2.6mm下肢側における再生線維を示す。スケールバーは，aとbが５００μm，c〜fが１００μm，gとhが２００μmである。iは，抗RGMタンパク質抗体又はIgG（n=6〜8／群）を投与したラットにおける，脊髄損傷１０週間後の，BDA検出主CST線維の損傷部位中心からの距離を示す。＊：対照に対し，p<0.01。抗RGMタンパク質抗体は，損傷した主CSTの退縮を抑制することを示す。jは，抗RGMタンパク質抗体又はIgG（n=6〜8／群）を投与したラットにおける，脊髄損傷１０週間後の，最も下肢側のBDA検出CST線維の損傷部位中心からの距離を示す。＊：対照に対し，p<0.01。
１．方法
(1) GTP-RhoAの親和性沈殿
1% Triton X-100（商品名），0.5%デオキシコール酸ナトリウム，0.1% SDS，500mM NaCl 及び10 mM MgCl2，10μg/mlのロイペプチン及び10μg/mlのアプロチニンを含む50mM Tris (pH7.5)で細胞を溶解した。細胞溶解物を，13000g，４℃，１０分間遠心して清澄化し，上清を，Rhotekin beads(商品名，Upstate Biotech社製)の20μgのGST-Rho結合領域と共に４℃で４５分間インキュベートした。洗浄バッファー(1% Triton X-100（商品名），150mM NaCl，10 mM MgCl2，各10μg/mlのロイペプチン及びアプロチニンを含む50mM Tris (pH7.5))でビーズを４回洗浄した。RhoAに対するモノクローナル抗体(米国カリフォルニア州Santa Cruz のSanta Cruz Biotech社製)を用いたウェスタンブロットにより，結合されたRhoを検出した。
(1) GTP-RhoAの親和性沈殿
1% Triton X-100（商品名），0.5%デオキシコール酸ナトリウム，0.1% SDS，500mM NaCl 及び10 mM MgCl2，10μg/mlのロイペプチン及び10μg/mlのアプロチニンを含む50mM Tris (pH7.5)で細胞を溶解した。細胞溶解物を，13000g，４℃，１０分間遠心して清澄化し，上清を，Rhotekin beads(商品名，Upstate Biotech社製)の20μgのGST-Rho結合領域と共に４℃で４５分間インキュベートした。洗浄バッファー(1% Triton X-100（商品名），150mM NaCl，10 mM MgCl2，各10μg/mlのロイペプチン及びアプロチニンを含む50mM Tris (pH7.5))でビーズを４回洗浄した。RhoAに対するモノクローナル抗体(米国カリフォルニア州Santa Cruz のSanta Cruz Biotech社製)を用いたウェスタンブロットにより，結合されたRhoを検出した。
２．結果
(2) GTP-RhoAの親和性沈降
ニューロン中のRhoA活性を測定した。生後７日のラットの小脳ニューロンに各コンディションド培地を添加し３０分経過した時点で，RhoAの活性を測定した（図６）。図６に示すように，RGMタンパク質発現CHO細胞をPI-PLC処理した培地で培養したニューロンでは，対照のCHO細胞の培地で培養したニューロンに比較し，Rhoの活性化が認められた。この結果は，RGMタンパク質がRhoを活性化することを示している。
(2) GTP-RhoAの親和性沈降
ニューロン中のRhoA活性を測定した。生後７日のラットの小脳ニューロンに各コンディションド培地を添加し３０分経過した時点で，RhoAの活性を測定した（図６）。図６に示すように，RGMタンパク質発現CHO細胞をPI-PLC処理した培地で培養したニューロンでは，対照のCHO細胞の培地で培養したニューロンに比較し，Rhoの活性化が認められた。この結果は，RGMタンパク質がRhoを活性化することを示している。
本発明の軸索再生促進剤は，損傷した中枢神経の再生に有効であり，中枢神経系を損傷した患者のための治療剤として有用である。
Claims (5)
- RGM様タンパク質阻害剤を有効成分として含有する軸索再生促進剤。
- 前記RGM様タンパク質阻害剤が，抗RGM様タンパク質抗体である請求項１記載の軸索再生促進剤。
- 前記RGM様タンパク質阻害剤が，Y27632である請求項１記載の軸索再生促進剤。
- 前記軸索が，中枢神経系の軸索である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の軸索再生促進剤。
- 軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法であって，試験物質をRGM様タンパク質と接触させ，前記試験物質がRGM様タンパク質の機能を阻害するか否かを判定することを含む方法。
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