KR20070015398A - 축색 재생 촉진제 - Google Patents

Abstract

활성 성분으로서 RGM-유사 단백질 저해제를 함유하는 축색 재생 촉진제. RGM-유사 단백질 저해제의 예에는 항 RGM-유사 단백질 항체, Y27632 와 RGM-유사 단백질 저해제 및 RGM-유사 단백질의 전사 또는 번역을 방해할 수 있는 안티센스 핵산 및 이중 가닥 DNA 가 포함된다. 상기 축색 재생 촉진제는 중추신경 축색의 재생에 효과적이므로, 예컨대 교통 사고에 의한 척수 등의 중추 신경계 손상, 뇌혈관계 질환 등으로 고통받는 환자의 치료에 기여한다.

Description

축색 재생 촉진제 {AXON REGENERATION PROMOTER}

본 발명은 신경 세포의 축색, 특히 중추 신경계 신경 세포의 축색의 재생을 촉진할 수 있는 축색 재생 촉진제에 관한 것이다.

척수 등의 중추신경이 교통사고로 인한 상해 또는 뇌혈관장애로 손상을 받으면, 신경 기능이 상실되어 재생 불가능하다. 이는 말초 신경이 재생되는 것과는 대조적이다. 중추신경은 일단 손상되면 재생될 수 없기 때문에, 중추신경이 손상될 경우 종종 부분적 또는 완전한 마비가 일어난다. 따라서, 손상된 중추신경을 재생시키는 것은 의료 분야에서 중요한 과제이다.

성인의 중추신경의 축색은 말초 신경 이식을 통해 재생될 수 있다 (S. David, A. J. Aguayo, Science 214, 931-3 (Nov 20, 1981)). 이 사실은 성인의 중추신경이 재생되지 않는 주된 원인이 신경 세포를 둘러 싸는 국소적인 환경에 있음을 시사한다. 지금까지, 중추신경의 재생을 저해하는 3 가지 주요 저해 물질로서, Nogo, 마이엘린-결합 당단백질 (MAG), 및 희소돌기아교세포-마이엘린-당단백질(OMgp) 이 확인되었다. Nogo 는 단일클론 항체 IN-1 의 대응 항원으로서 동정되었다 (M. S. Chen et al., Nature 403, 434-9 (Jan 27, 2000); T. GrandPre, F. Nakamura, T. Vartanian, S. M. Strittmatter, Nature 403, 439-44 (Jan 27, 2000); P. Caroni, M. E. Schwab, Neuron 1, 85-96 (Mar, 1988)). MAG 는 마이엘린 수초의 형성 및 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있고 (S. Carenini, D. Montag, H. Cremer, M. Schachner, R. Martini, Cell Tissue Res 287, 3-9 (Jan, 1997); M. Fruttiger, D. Montag, M. Schachner, R. Martini, Eur J Neurosci 7, 511-5 (Mar 1, 1995); N. Fujita et al., J Neurosci 18, 1970-8 (Mar 15, 1998); J. Marcus, J. L. Dupree, B. Popko, J Cell Biol 156, 567-77 (Feb 4, 2002)), 특정 신경 세포로부터의 축색의 생장을 저해하는 것으로 나타났다 (G. Mukhopadhyay, P. Doherty, F. S. Walsh, P. R. Crocker, M. T. Filbin, Neuron 13, 757-67 (Sep, 1994); L. McKerracher et al., Neuron 13, 805-11 (Oct, 1994)). 성인 중추신경의 백질 내 주요 피넛 어글루티닌-결합 폴리펩티드인 OMgp (D. D. Mikol, K. Stefansson, J Cell Biol 106, 1273-9 (Apr, 1988)) 는, 축색 생장의 세 번째 저해 물질로 동정되었다 (V. Kottis et al., J Neurochem 82, 1566-9 (Sep, 2002); K. C. Wang et al., Nature 417, 941-4 (Jun 27, 2002)). Nogo, MAG, 및 OMgp 는 p75 를 공동수용체로 하여 NgR 에 결합하는 것으로 알려져 있는데, 이는 이들이 공통된 신호 전달 경로를 공유함을 시사한다 (K. C. Wang, J. A. Kim, R. Sivasankaran, R. Segal, Z. He, Nature 420, 74-8 (Nov 7, 2002); M. Domeniconi et al., Neuron 35, 283-90 (Jul 18, 2002); A. E. Fournier, T. GrandPre, S. M. Strittmatter, Nature 409, 341-6 (Jan 18, 2001); T. Yamashita, H. Higuchi, M. Tohyama, J Cell Biol 157, 565-70 (May 13, 2002)).

이들 저해 물질의 제거 또는 억제에 의한 축색 재생이 연구되었다. 그러 나, 녹아웃 마우스를 이용한 상기 각 저해 물질에 대한 연구에 의하면, 저해 물질의 제거만으로는 중추신경의 축색이 재생되지 않는 것으로 나타났다 (U. Bartsch et al., Neuron 15, 1375-81 (Dec, 1995); C. J. Woolf, Neuron 38, 153-6 (Apr 24, 2003); J. E. Kim, S. Li, T. GrandPre, D. Qiu, S. M. Strittmatter, Neuron 38, 187-99 (Apr 24, 2003); B. Zheng et al., Neuron 38, 213-24 (Apr 24, 2003); M. Simonen et al., Neuron 38, 201-11 (Apr 24, 2003)). 더욱이, 기능성 p 75 NTR 을 고갈시키거나 가용성 p75N-Fc 를 투여하더라도 손상된 척수의 재생이 촉진되지 않는 것으로 보고되었다 (X. Song et al., J Neurosci 24, 542-6 (Jan 14, 2004)).

참조문헌

[비특허문헌 1] S. David, A. J. Aguayo, Science 214, 931-3 (Nov 20, 1981).

[비특허문헌 2] M. S. Chen et al., Nature 403, 434-9 (Jan 27, 2000).

[비특허문헌 3] T. GrandPre, F. Nakamura, T. Vartanian, S. M. Strittmatter, Nature 403, 439-44 (Jan 27, 2000).

[비특허문헌 4] P. Caroni, M. E. Schwab, Neuron 1, 85-96 (Mar, 1988).

[비특허문헌 5] S. Carenini, D. Montag, H. Cremer, M. Schachner, R. Martini, Cell Tissue Res 287, 3-9 (Jan, 1997).

[비특허문헌 6] M. Fruttiger, D. Montag, M. Schachner, R. Martini, Eur J Neurosci 7, 511-5 (Mar 1, 1995).

[비특허문헌 7] N. Fujita et al., J Neurosci 18, 1970-8 (Mar 15, 1998).

[비특허문헌 8] J. Marcus, J. L. Dupree, B. Popko, J Cell Biol 156, 567-77 (Feb 4, 2002).

[비특허문헌 9] G. Mukhopadhyay, P. Doherty, F. S. Walsh, P. R. Crocker, M. T. Filbin, Neuron 13, 757-67 (Sep, 1994).

[비특허문헌 10] L. McKerracher et al., Neuron 13, 805-11 (Oct, 1994).

[비특허문헌 11] D. D. Mikol, K. Stefansson, J Cell Biol 106, 1273-9 (Apr, 1988).

[비특허문헌 12] V. Kottis et al., J Neurochem 82, 1566-9 (Sep, 2002).

[비특허문헌 13] K. C. Wang et al., Nature 417, 941-4 (Jun 27, 2002).

[비특허문헌 14] K. C. Wang, J. A. Kim, R. Sivasankaran, R. Segal, Z. He, Nature 420, 74-8 (Nov 7, 2002).

[비특허문헌 15] M. Domeniconi et al., Neuron 35, 283-90 (Jul 18, 2002).

[비특허문헌 16] A. E. Fournier, T. GrandPre, S. M. Strittmatter, Nature 409, 341-6 (Jan 18, 2001).

[비특허문헌 17] T. Yamashita, H. Higuchi, M. Tohyama, J Cell Biol 157, 565-70 (May 13, 2002).

[비특허문헌 18] U. Bartsch et al., Neuron 15, 1375-81 (Dec, 1995).

[비특허문헌 19] C. J. Woolf, Neuron 38, 153-6 (Apr 24, 2003).

[비특허문헌 20] J. E. Kim, S. Li, T. GrandPre, D. Qiu, S. M. Strittmatter, Neuron 38, 187-99 (Apr 24, 2003).

[비특허문헌 21] B. Zheng et al., Neuron 38, 213-24 (Apr 24, 2003).

[비특허문헌 22] M. Simonen et al., Neuron 38, 201-11 (Apr 24, 2003).

[비특허문헌 23] X. Song et al., J Neurosci 24, 542-6 (Jan 14, 2004).

[비특허문헌 24] P. P. Monnier et al., Nature 419, 392-5 (Sep 26, 2002).

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[비특허문헌 26] C. J. Woolf, S. Bloechlinger, Science 297, 1132-4 (Aug 16, 2002).

[비특허문헌 27] B. Niederost, T. Oertle, J. Fritsche, R. A. McKinney, C. E. Bandtlow, J Neurosci 22, 10368-76 (Dec 1, 2002).

[비특허문헌 28] M. Lehmann et al., J Neurosci 19, 7537-47 (Sep 1, 1999).

[비특허문헌 29] P. Dergham et al., J Neurosci 22, 6570-7 (Aug 1, 2002).

[비특허문헌 30] P. P. Monnier, A. Sierra, J. M. Schwab, S. Henke-Fahle, B. K. Mueller, Mol Cell Neurosci 22, 319-30 (Mar, 2003).

[비특허문헌 32] A. A. Habib et al., J Neurochem 70, 1704-11 (Apr, 1998).

[비특허문헌 33] H. Liu, C. E. Ng, B. L. Tang, Neurosci Lett 328, 257-60 (Aug 16, 2002).

[비특허문헌 34] A. B. Huber, O. Weinmann, C. Brosamle, T. Oertle, M. E. Schwab, J Neurosci 22, 3553-67 (May 1, 2002).

[비특허문헌 35] D. Hunt, R. S. Coffin, P. N. Anderson, J Neurocytol 31, 93-120 (Feb, 2002).

[비특허문헌 36] L. L. Jones, Y. Yamaguchi, W. B. Stallcup, M. H. Tuszynski, J Neurosci 22, 2792-803 (Apr 1, 2002).

[비특허문헌 37] J. W. Fawcett, R. A. Asher, Brain Res Bull 49, 377-91 (Aug, 1999).

본 발명의 목적은 중추신경 축색의 재생을 촉진할 수 있는 신규한 축색 재생 촉진제를 제공하는 것이다.

집중적인 연구 결과, 본 발명자들은 망막덮개 돌기 (retinotectal projection) 의 형성에 관여하는 RGM (repulsive guidance molecule) 과 상동성을 나타내는 단백질이 (P. P. Monnier et al., Nature 419, 392-5 (Sep 26, 2002); B. K. Muller, D. G. Jay, F. Bonhoeffer, Curr Biol 6, 1497-502 (Nov 1, 1996)), 닭 태아 척수의 백질 및 회백질에서 발현되고 (위 단백질을 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 "RGM-유사 단백질" 이라 함) 척수가 손상된 때에 상기 단백질의 발현이 증가된다는 것을 발견하였다. 또한, 상기 단백질이 중추신경 축색의 생장에 저해 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명자들은 RGM-유사 단백질을 항-RGM-유사 단백질 항체 또는 Y27632 와 같은 RGM-유사 단백질 저해제로 처리함으로써 RGM-유사 단백질의 축색 생장-저해 활성이 소실되는 것을 발견하였고, RGM-유사 단백질의 저해제를 축색 재생 촉진제로 사용하는 것을 착상해내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 RGM-유사 단백질의 저해제를 유효 성분으로 함유한 축색 재생 촉진제를 제공한다. 상기 RGM-유사 단백질 저해제는 바람직하게는 항-RGM-유사 단백질 항체이다. 또한 바람직하게, RGM-유사 단백질 저해제는 Y27632 이다.

상기 축색은 바람직하게는 중추 신경계 축색이다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 시험 물질을 RGM-유사 단백질과 접촉시키고 그 시험 물질이 RGM-유사 단백질의 기능을 저해하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 축색 재생 촉진제의 후보 물질의 동정 방법을 제공한다.

본 발명은 중추신경 축색의 재생을 촉진할 수 있는 신규한 축색 재생 촉진제를 제공한다. 본 발명에 따른 축색 재생 촉진제는 중추신경 축색의 재생에 유효하고, 따라서 예컨대 척수와 같은 중추 신경계의 손상으로 고통받는 환자의 치료에 실질적인 기여를 할 것으로 기대된다.

[도면의 간단한 설명]

도 1 은, 소뇌 과립 뉴런을 래트 RGM-유사 단백질-발현 CHO 세포 또는 대조군 CHO 세포의 융합성 단층 (confluent monolayer) 상에 플레이팅함으로써 수행된 축색 생장 어세이 (assay) 결과를 나타낸다. y-축은 각 뉴런의 가장 긴 축색의 평균 길이를 나타낸다. 데이터는 세 실험의 평균 ± 표준 편차이다. (*) 는 대조군에 대하여 p < 0.01 을 나타내고, (**) 는 RGM 에 대하여 p < 0.01 (Student 검정) 을 나타낸다.

도 2 는 각종 조건화된 배지로 처리된 뉴런의 축색 생장을 나타낸다. y-축은 각 뉴런의 가장 긴 축색의 평균 길이를 나타낸다. 데이터는 세 실험의 평균 ± 표준 편차이다. (*) 는 PI-PLC 로 처리된 대조군 CHO 세포의 조건화 배지에서 배양된 뉴런의 축색 길이에 대하여 p < 0.01 을 나타낸다.

도 3 은 항-RGM-유사 단백질 다클론 항체를 첨가 및 첨가하지 않은 RGM-유사 단백질 함유 배지에서 배양된 소뇌 과립 뉴런에 대한 축색 생장 어세이의 결과를 나타낸다. y-축은 각 뉴런의 가장 긴 축색의 평균 길이를 나타낸다. 데이터는 세 실험의 평균 ± 표준 편차이다. (*) 는 대조군에 대하여 p < 0.01 을 나타내고; (**) 는 RGM 에 대하여 p < 0.01 (Student 검정) 을 나타낸다. 대조군과 RGM + 항-RGM 사이에 유의미한 차이는 없었다.

도 4 는 항-RGM-유사 단백질 항체를 투여받은 래트 및 대조군 항체를 투여받은 래트의, 중앙흉부등쪽의 반측절제술 (midthoracic dorsal hemisection) 후 도면에 표시된 시간 경과 후의 BBB 점수를 나타낸다.

도 5 는 중앙흉부등쪽의 반측절제술을 받고 항-RGM-유사 단백질 항체 또는 대조군 항체로 처리된 래트의 척수 현미경 사진 및 재생 피질척수 (CST) 섬유의 병변 중심로부터의 거리를 나타낸다.

도 6 은 RGM-유사 단백질로 처리된 래트 소뇌 뉴런 내 활성 Rho 를 측정한 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.

상술한 바와 같이, 본 발명자들은 닭 태아에 있어서 RGM-유사 단백질이 척수의 백질 및 회백질에서 발현됨을 이미 발견하였다. 닭 태아 RGM-유사 단백질과 상동성을 갖는 유전자가 인간의 뇌에서 발현됨이 관찰되었다. 인간 RGM-유사 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 그 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 1 및 2 에 나타내었다. 래트 RGM-유사 단백질 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 그 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 3 및 4 에 나타내었다.

하기 실시예에 구체적으로 기재한 바와 같이, RGM-유사 단백질은 축색 생장에 대하여 저해 활성을 가지며, 척수가 손상된 때에는 그 발현이 증가된다. 나아가, 하기 실시예에 있어서, RGM-유사 단백질로 인한 축색 생장의 저해는 뉴런에 대한 항-RGM-유사 단백질 항체의 작용에 의해 제거되는 것으로 나타났다. 따라서, 축색 생장에 대한 RGM-유사 단백질의 저해 활성을 중화시키는 항-RGM-유사 단백질 항체와 같은 물질을 축색 재생 촉진제로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 축색 재생 촉진제는 유효 성분으로서 RGM-유사 단백질 저해제를 함유한다. 본원에서, "RGM-유사 단백질 저해제" 란 용어는 축색 재생에 대한 RGM-유사 단백질의 저해 활성을 없애거나 최소한 상당히 감소시키는 물질을 의미한다. RGM-유사 단백질의 축색 재생 저해 활성은 하기 실시예에 기재한 바와 같이 조사할 수 있다.

항-RGM-유사 단백질 항체는 본 발명에 따른 특히 바람직한 RGM-유사 단백질 저해제이다. 본원에서, "항-RGM-유사 단백질 항체" 는 항원-항체 반응에 의해 RGM-유사 단백질과 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 그 항체는 단일클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.

RGM-유사 단백질과 결합하는 다클론 항체는, 당업계에 공지된 방법에 따라, 감작 항원 (sensitizing antigen) 으로서 RGM-유사 단백질로 면역화된 동물 혈청으로부터 수득할 수 있다. RGM-유사 단백질과 결합하는 단일클론 항체는, 당업계에 공지된 방법에 따라, 감작 항원으로 RGM-유사 단백질을 이용하여 동물을 면역화하고; 생성된 면역세포를 수합하여 골수종 세포와 융합하고; 항체-생성 하이브리도마를 클로닝하고; 이 하이브리도마를 배양함으로써 수득할 수 있다.

하이브리도마에 의해 생성된 항체에 더하여, 본 발명에 따른 단일클론 항체는 또한 항체 유전자, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 및 이들 항체의 절편을 함유한 발현 벡터에 의해 형질전환된 형질전환주에 의해 생성된 유전적 재조합 항체도 포함할 수 있다.

유전적 재조합 항체를 다음과 같은 방법으로 제조할 수 있다: 항-RGM-유사 단백질 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 항체-암호화 cDNA 를 클로닝함; 상기 cDNA 를 발현 벡터에 삽입함; 동물 또는 식물 세포를 상기 벡터로 형질전환시킴; 및 생성된 형질전환주를 배양함. 키메라 항체는 특정 동물로부터 유래된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 다른 동물로부터 유래된 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진 항체이다. Fab, F(ab')2, Fab', scFv, 및 디아보디(diabody) 가 RGM-유사 단백질과 결합할 수 있는 항체 절편의 예이다.

항체-생성 세포의 제조

RGM-유사 단백질에 결합하는 항체를 생성하는 세포는 당업계에 공지된 방법에 의해 수득가능하다. RGM-유사 단백질을 감작 항원으로 하여 동물을 면역화하고; 생성된 면역세포를 수합하여 골수종 세포와 융합하고; 항체-생성 하이브리도마를 클로닝한다. 더 구체적으로, RGM-유사 단백질, 즉 항원을 우선 생성한다. RGM-유사 단백질의 cDNA 가 상업적으로 이용가능한 뇌 cDNA 라이브러리에 존재하므로, 상업적으로 이용가능한 뇌 cDNA 라이브러리를 주형으로 한 PCR 에 의해 상기 유전자의 증폭 산물을 쉽게 수득할 수 있으며: 이어서 유전자를 적절한 벡터에 삽입하고, RGM-유사 단백질을 재조합적으로 생성할 수 있다. 그 후, 이런 방식으로 제조된 RGM-유사 단백질을 항원으로 하여 동물에 피하, 정맥내, 또는 복강내 주사한다. 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 래빗, 또는 염소 등의 포유류를 면역화 동물로 이용할 수 있다. 항원을 바람직하게는 담체 단백질에 결합된 상태로 또는 Freund 완전 항원보강제와 같은 적절한 항원보강제와 병용하여 투여한다. RGM-유사 단백질의 부분적 펩티드 또한 항원으로 이용가능하다.

하기 실시예에 나타낸 바와 같이, SEQ ID NO: 4 에 표시된 아미노산 서열을 갖는 래트 RGM-유사 단백질의 아미노산 잔기 309 (본원에서 "309aa" 명명법을 사용함) 내지 322aa 의 화학적으로 합성된 부분적 펩티드를 면역원으로 사용할 경우, 상기 부분적 펩티드에 대해 생성된 다클론 항체는 RGM-유사 단백질의 축색 생장 저해 활성에 대하여 중화 활성을 나타낸다. 따라서, 인간 RGM-유사 단백질에 대한 중화 항체는, 해당 영역을 포함한 인간 유전자를 바탕으로 한 폴리펩티드를 면역원으로 사용함으로써 수득할 수 있다.

상기 항원을 여러 번에 걸쳐 매 1 ~ 3 주마다 투여한다. 예를 들어 ELISA 를 이용하여 혈청 내 면역글로불린의 양을 측정함으로써 항체 역가를 모니터한다. 일단 항체 역가가 허용 수준까지 상승하면, 동물로부터 면역세포를 수합한다. 지라 세포를 면역세포로 사용하는 것이 바람직하다. 항체-생성 면역세포를 동일한 포유류 종에서 유래된 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성한다. 하이브리도마 제작용으로 사용되는 각종 골수종 세포주는 시중에서 구할 수 있다. 융합은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 PEG 의 존재 하에 수행가능하며, 융합 세포는 HAT 배지 상에서 선별한다. 항원-결합 항체를 생성하는 하이브리도마는, 배양 상청액을, 예컨대 ELISA 로 어세이함으로써 선별한다. 목적하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 한계 희석법으로 클로닝할 수 있다. 수득된 하이브리도마에 의해 생성된 단일클론 항체에 대하여 하기 실시예에 기재된 축색 생장 어세이를 수행함으로써, RGM-유사 단백질의 축색 생장 저해 활성에 대하여 중화 활성을 나타내는 하이브리도마를 선별할 수 있다.

단일클론 항체의 제조

단일클론 항체를 생성하는 세포를 배양하여 얻은 배양액의 상청액으로부터 단일클론 항체를 제조할 수 있다. 또한, 2,4,10,14-테트라메틸펜타데칸으로 미리 처리된 마우스에 단일클론 항체-생성 세포를 복강내 투여하고; 이어서 접종 후 7일 내지 10일째에 마우스의 복수액을 수합하여 원심분리하고 그 상청액을 수합함으로써 단일클론 항체를 제조할 수도 있다. 단일클론 항체의 정제는 통상적인 단백질 정제 방법, 예컨대 염석, 한외여과, 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, HPLC 등의 방법으로 수행가능하다. 단백질 A 칼럼 상의 어피니티 크로마토그래피를 수행하는 것이 바람직하다. 시판되는 마우스 단일클론 항체 아이소타이핑 키트 (isotyping kit) 를 이용하여 형결정(typing)함으로써 정제된 단일클론 항체의 서브클래스를 확인할 수 있다.

항체 유전자 뉴클레오티드 서열의 분석

본 발명에 따른 단일클론 항체를 암호화하는 항체 유전자의 뉴클레오티드 서열을, 수득된 단일클론 항체-생성 세포의 유전자를 분석함으로써 수득할 수 있다. 총 RNA 를 단일클론 항체-생성 세포로부터 추출하고 RNA 를 주형으로 하여 역전사효소에 의해 cDNA 절편을 만든다. 적당하게 설계된 프라이머를 이용한 PCR 에 의해 항체 유전자의 V-영역을 증폭하고, 상기 영역의 cDNA 뉴클레오티드 서열을 확인한다.

항체 특이성의 결정

본 발명에 따른 단일클론 항체의 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 ELISA, RIA, 면역 박층 (immunothin-layer) 크로마토그래피, BIAcore, 또는 형광 항체 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 단일클론 항체를 RGM-유사 단백질이 고정된 마이크로플레이트에 일련의 2 배 희석물로 가하고; 인큐베이션 후, 효소-표지된 2차 항체를 가하고 기질을 첨가하여 발색시켜서; 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 흡광도를 측정한다.

재조합 항체

본 발명에 따른 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 이용하여 재조합 유전자 기술에 의해 재조합형 항체를 제작할 수 있다. 재조합형 항-RGM-유사 단백질 단일클론 항체를 제작하기 위해, 본 발명에 따른 항체를 암호화하는 유전자를 적절한 발현 벡터에 삽입한 후 숙주 세포에 도입한다. 대장균, 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포를 숙주 세포로 이용할 수 있으며, 포유류 세포, 예컨대 CHO, COS, 및 BHK 가 특히 바람직하다. 예를 들어, 염화칼슘법, 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, DOTAP 양이온성 리포좀을 이용한 방법 (Boehringer Mannheim Corporation), 전기천공법, 및 리포펙션(lipofection) 등에 의해 벡터를 숙주 세포로 도입할 수 있다. 수득된 형질전환 숙주 세포를 배양하고 그 항체를 발현시킴으로써 재조합형 항체를 생성한다.

키메라 항체

키메라 항체는 특정 동물 (예, 마우스) 에서 유래된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 다른 동물 (예, 인간) 에서 유래된 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진 항체이다. 키메라 항체는, RGM-유사 단백질에 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 cDNA 를 클로닝하고; 다른 동물에서 유래된 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 암호화하는 cDNA 를 클로닝하고; 이들 cDNA 를 조합하여 적절한 발현 벡터에 삽입한 다음; 숙주 세포에서 발현을 유도함으로써 재조합적으로 제작할 수 있다.

CDR-이식 항체

CDR-이식 항체는 특정 동물 (예, 마우스) 에서 유래된 항체의 상보성-결정 부위 (CDR) 가 상이한 동물 (예, 인간) 에서 유래된 항체의 상보성-결정 부위로 이식된 항체이다. CDR-이식 항체를 암호화하는 유전자는 다음과 같이 얻을 수 있다. CDR1, 2, 및 3 을 각각 암호화하는 유전자의 뉴클레오티드 서열은, RGM-유사 단백질에 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 클로닝된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 유전자 서열을 토대로 하여 설계되고, 상기 서열은 다른 동물에서 유래된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 유전자를 함유한 백터 중 대응하는 CDR1, 2, 및 3 의 서열을 대체한다. 예를 들어, 쥐과 동물의 항체 CDR 이 인간 항체 골격 영역 (framework region) 에 연결되도록 설계된 다수의 프라이머를 이용한 PCR 에 의해 합성을 수행할 수 있다. 다르게는, 합성 DNA 를 이용하여 완전한 서열을 구축할 수 있다. 적절한 숙주 세포에서 이러한 발현 벡터의 발현을 유도함으로써 CDR-이식 항체를 재조합적으로 제작할 수 있다.

항체 절편

RGM-유사 단백질과 결합할 수 있는 항체 절편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, 및 디아보디는, 본 발명에 따른 항-RGM-유사 단백질 단일클론 항체를 파파인 또는 트립신과 같은 효소로 처리함으로써 제작할 수 있다. 또한, 숙주 세포에 그러한 항체 절편을 암호화하는 유전자가 삽입된 발현 벡터를 도입하여, 항체 절편을 생성하는 형질전환주를 수득함으로써 제작할 수도 있다.

RGM-유사 단백질 저해제의 다른 예는 Y27632 (M. Uehata et al., Nature 389, 990-4 (Oct 30, 1997)) 로서, 이는 세린/트레오닌 키나아제인 Rho 키나아제의 저해제로 알려져 있다. 하기 실시예에 나타난 바와 같이, Y27632 는 RGM-유사 단백질의 축색 생장 저해 활성을 중화하는 활성을 나타낸다. Y27632 는 다음과 같은 화학적 구조를 가진다.

본 발명에 따른 축색 재생 촉진제에는 또한, RGM-유사 단백질의 저해제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 및 RNA 간섭 (RNAi) 을 일으키는 분자 (예, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA) 가 포함된다. 이들 핵산은 RGM-유사 단백질을 암호화하는 mRNA 또는 유전자에 결합함으로써 이의 발현을 방해할 수 있다. 안티센스 기술, 리보자임 기술 및 RNAi 기술을 이용하여 유전자 발현을 저해하는 일반적 방법 및 이러한 기술에 의해 외인성 유전자 발현을 유도하는 유전자 치료법이 당업계에 공지되어 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 RGM-유사 단백질을 암호화하는 mRNA 에 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자 또는 이의 유도체이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA 에 특이적으로 결합하고, 전사 및/또는 번역을 방해함으로써 단백질 발현을 저해한다. 결합은 왓슨-크릭 또는 후그스틴(Hoogsteen) 형 염기쌍 상보성에 의한 것이거나 삼중 나선 형성에 의한 것일 수 있다.

리보자임은 하나 이상의 RNA 의 촉매적 RNA 구조이다. 리보자임은 일반적으로 엔도뉴클리아제, 리가아제, 또는 중합효소 활성을 나타낸다. 각종 2차 구조를 갖는 리보자임이 알려져 있는데, 예컨대 해머헤드형 (hammerhead type) 리보자임 및 헤어핀형 (hairpin type) 리보자임이 있다. RNA 간섭 (RNAi) 이란, 이중 가닥 RNA 분자를 이용하여 표적 유전자를 침묵시키는 기술을 일컫는다.

RGM-유사 단백질 저해제는 그와 같이 투여될 수 있지만, 일반적으로 약물에 사용되는 담체를 이용하여 제형화된다. 제형화 기술에 통상 사용되는 임의의 담체를 본 제형물을 위한 담체로도 사용할 수 있다; 예를 들어, 생리 식염수 또는 인산염-완충 생리 식염수가 주사제의 제조에 바람직하게 사용된다. 유화제 및 삼투압 조절제 등의 통상의 첨가제 또한 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 축색 재생 촉진제의 투여 경로는 바람직하게는 비-경구 경로이고, 신경 손상 부위에 직접 주사하는 것이 특히 바람직하다.

투여량은 RGM-유사 단백질 저해제의 종류, 투여 경로, 신경 손상 정도 등에 따라 적절하게 선택된다. 그러나, 손상 부위에 직접 투여하는 경우, RGM-유사 단백질 저해제의 손상 부위별 1일 성인 투여량은, 항-RGM-유사 단백질 항체의 경우 일반적으로 1 내지 20 mg, 바람직하게는 5 내지 10 mg 이고, Y27632 의 경우 일반적으로 20 내지 100 mg, 바람직하게는 30 내지 50 mg 이다. 직접 투여 외의 비-경구 투여, 예컨대 정맥내 주사의 경우, 투여량은 일반적으로 상기 투여량의 약 10 배 이다.

다른 측면에서, 본 발명은 축색 재생 촉진제 후보 물질의 동정 방법을 제공한다. 상기 방법은, 시험 물질을 RGM-유사 단백질과 접촉시키고, 시험 물질이 RGM-유사 단백질의 기능을 저해하는지 여부를 확인하는 것을 포함한다. RGM-유사 단백질의 기능 저해에는, RGM-유사 단백질에 결합함으로써 RGM-유사 단백질의 정상적 기능의 발현을 저해하는 것, 특히 축색 재생 촉진 능력을 저해하는 것 뿐만 아니라 RGM-유사 단백질이 그 수용체에 결합하는 것을 저해하는 것을 포함한다. 시험 물질의 RGM-유사 단백질에 대한 결합 능력, 또는 시험 물질의, RGM-유사 단백질의 그 수용체, 네오제닌 (neogenin) 에 대한 결합 저해 능력은 당업계에 공지된 결합 어세이에 의해 측정가능하다. 비제한적 예로는 겔 시프트 어세이, 방사성표지 경쟁 어세이 (competitive assay), 및 크로마토그래피 분별법을 들 수 있다. 또한, RGM-유사 단백질의 수용체인 네오제닌의 존재 하에 시험 물질을 RGM-유사 단백질과 접촉시킨 후, Rho 활성을 측정할 수 있다. Rho 활성은 RGM-유사 단백질이 네오제닌과 결합한 경우에 증가하므로, 시험 물질의 존재시 Rho 활성의 증가가 나타나지 않는다는 것은 시험 물질이 RGM-유사 단백질의 기능을 저해함을 암시하는 것일 수 있다.

상기 어세이에 의해 RGM-유사 단백질의 기능을 저해하는 것으로 동정된 물질은 축색 재생 촉진제 후보 물질로 간주된다. 이어서, 당업계에 공지된 축색 생장 어세이법을 이용하여, 상기 후보 물질이 축색 재생-촉진 효과를 갖는지 여부를, 후보 물질의 존재 및 부재 하에 신경 세포의 축색 생장을 측정 및 비교함으로써 결정할 수 있다. 그러한 어세이 절차의 구체적 예를 하기 실시예에 기재하였다.

본원에 명백히 인용된 모든 특허 및 참조 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조 병합된다. 나아가, 본원이 우선권을 주장하는 일본 특허 출원 제2004-68849호 및 제2004-273041호의 청구 범위, 명세서 및 도면의 내용 또한 그 전체가 본원에 참조 병합된다.

하기 실시예에서 본 발명을 더 상세히 기술하나, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

RGM -유사 단백질의 클로닝

닭 RGM 의 아미노산 서열 (P. P. Monnier et al., Nature 419, 392-5 (Sep 26, 2002)) 을 질의 서열로 하여 GenBank 데이타베이스의 BLAST 서치를 수행하였다. 그 결과 등록 번호 XM_218791 (Rattus norvegicus) 의 래트 cDNA 가 확인되었다. 추정 아미노산 서열은 닭 RGM 단백질과 79% 상동성을 보였고, 따라서 XM_218791 은 래트 RGM-유사 단백질로 선정되었다. 전장의 래트 RGM-유사 단백질 cDNA 를 PCR 에 의해 성체 래트 뇌 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 사용된 정방향(forward) 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 agtggtaacaggccgagctggatgg (SEQ ID NO: 5); 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 ccacaaccttgtcgcgtgcactaat (SEQ ID NO: 6) 였고; PCR 은 95℃ 에서 30 초간의 변성, 55℃ 에서 30 초간의 어닐링(annealing), 및 72℃ 에서 3 분 30 초간의 신장의 25 사이클로 이루어졌다. 암호화된 단백질은 431 개 아미노산 잔기로 이루어졌다. 상기 인용된 Monnier 등의 종래 보고에 의하면 원래의 래트 RGM 은 152aa 에서 시작되는 것으로 추정되었다. pSecTag2 (Invitrogen Corporation) 의 시그널 펩티드와 함께 HA (헤마글루티닌) 및 152-431aa 의 래트 RGM-유사 단백질을 이용하여 pSecTag2-Hygro (Invitrogen Corporation) 에 HA-RGM 벡터를 구축하였다. 위 절차를 구체적으로 다음과 같이 수행하였다. 전장 래트 RGM-유사 단백질 cDNA 를 주형으로 하여, 우선 BamHI-HAtag-(RGM-유사 단백질의 152-431aa 에 대응하는 cDNA)-XhoI 절편을 PCR 에 의해 구축하였다. 구축된 절편 및 pSecTag2-Hygro (Invitrogen Corporation) 를 두 제한 효소 (BamHI 및 XhoI) 로 절단한 후, 양자를 연결하고 대장균에 형질전환시켰다. 전체 PCR-증폭 절편의 서열을 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.

RGM -유사 단백질- CHO 세포의 생성

Flp-In System (TM, Invitrogen Corporation) 을 이용하여, 제조자의 지시대로 RGM-유사 단백질-발현 세포를 생성하였다. 두 제한 효소 (NheI 및 XhoI) 를 이용하여 pSecTag2 벡터로부터 시그널 펩티드를 함유한 HA-RGM 절편을 생성하고, 상기 절편을 pcDNA5FRT (Invitrogen Corporation) 에 연결하였다. 상기 구축물 (pcDNA5FRT/Igκleader/HA/RGM) 및 pOG44 를 Flp-In CHO 세포에 공동-핵산전달감염 (co-transfect) 시켰다. 세포를 하이그로마이신 B (500 ㎍/mL, Invitrogen Corporation) 를 함유한 배지에서 2 주간 생장시켜서 HA-RGM 을 안정적으로 발현하는 세포를 수득하였다. HA-RGM 발현을 웨스턴 블롯 및 면역세포화학법으로 확인하였다.

축색 생장 어세이

생후 8일 (P8) 인 새끼 래트로부터 소뇌 과립 세포를 트립신처리 (PBS 중 0.25% 트립신, 37℃, 15 분) 에 의해 분리하고; 혈청-함유 배지에 재현탁하고; 분쇄하고; PBS 로 3회 세정하였다. 합동배양(coculture) 어세이를 위하여, 뉴런을 챔버 슬라이드 (chamber slide) 내 RGM-CHO 세포 또는 대조군 CHO 세포의 융합 성 단층 상에 플레이팅하였다. 10 μM Y27632 (Welfide Corporation, Osaka) 를 배양물에 가하여 ROCK (Rho 키나아제) 을 저해하였다. 상기 배양물을 무(無)혈청 DMEM/F12 배지에서 24 시간 증식시켰다.

가용성 RGM 어세이를 위하여, RGM-CHO 세포 또는 대조군 CHO 세포의 융합성 단층을, 2.5 U/mL PI-PLC (포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파아제 C, Sigma) 를 포함 또는 포함하지 않는 무혈청 DMEM/F12 에서 배양하였다. 배양물을 13000 g 에서 10 분간 원심분리한 후, 상청액을 수합하여 부유 세포를 제거하였다. 상청액의 일부를 웨스턴 블롯 분석하였다. 폴리-L-라이신-코팅된 챔버 슬라이드 상의 조건화 배지에 뉴런을 플레이팅하고 12 또는 24 시간 동안 배양하였다. 축색 어세이를 위해, 세포를 4% (w/v) 파라포름알데히드로 고정하고, 뉴런에 특이적으로 존재하는 β-튜불린 III 단백질을 인지하는 단일클론 항체로 면역염색하였다 (TuJ1, 1:1000, Covance Research Products, Inc., Denver, USA). 그 후, 각 β-튜불린 III-양성 뉴런의 가장 긴 신경돌기의 길이를 측정하였다.

척수 손상

마취한 (소듐 펜토바르비탈, 40 mg/kg) 암컷 Wistar 래트 (200-250 g) 에 척추 수준 (vertebral level) T10 의 절제술을 행하고 척수를 노출시켰다. 11번 블레이드를 이용해 척수를 절단함으로써 후주(dorsal column), 피질척수로, 및 후각(dorsal horn) 의 일부에 손상 부위를 만들어냈다. 이어서 근육 및 피부층을 봉합하였다. 방광 기능이 회복될 때까지, 복부에 압력을 가함으로써 1일 2회 이상 방광을 압박하였다.

항- 래트 RGM -유사 단백질 항체의 제작

RGM-유사 단백질의 부분적 펩티드 (309-322aa) 를 화학적으로 합성하고, 이를 면역원으로 이용하여 항-래트 RGM-유사 단백질 래빗 항혈청을 수득하였다. 항혈청을 어피니티 정제하여, 면역블롯팅 및 면역조직화학법의 경우 1 ㎍/mL 농도로 사용하고, 중화 항체 어세이에는 10 ㎍/mL 농도로 사용하였다.

조직 제작 및 면역조직화학법

면역조직화학법에 있어서, 비손상 척수 및 손상 후 6 시간, 1 일, 3 일, 및 7 일된 척수로부터 신선한 동결 시료를 수득하였다. 디에틸 에테르로 깊게 마취한 다음 두부를 절제하고, 척수를 제거한 후, Tissue Tek OCT (TM) 에 깊이 묻고 즉시 드라이아이스에서 -80℃ 로 동결하였다. 일련의 시상옆 단편 (parasagittal section) 을 냉동미세절단기 (cryostat) 상에서 18 ㎛ 위치에서 절단하고 APS 코팅 Superfrost-Plus 슬라이드 (TM, Matsunami Glass Ind., Ltd., Osaka) 에 놓았다. 상기 단편을 실온에서 4% (w/v) 파라포름알데히드로 1 시간 동안 고정하고, PBS 로 3회 세정하고, 실온에서 1 시간 동안 5% 염소 혈청 (GS) 및 0.1% Triton X-100 (TM) 을 함유한 PBS 에서 블로킹하였다. 단편을 1차 항체와 함께 4℃ 에서 밤새 인큐베이션하고, PBS 로 3회 세정한 다음, 실온에서 1 시간 동안 플루오레세인-결합 2차 항체 (1:1000, Molecular Probes) 와 인큐베이션하였다. 1차 항체로 하기를 사용하였다: 항-래트 RGM-유사 단백질 다클론 항체 (1 ㎍/mL), 항-신경아교원섬유산단백질 (GFAP) 단일클론 항체 (1:1000, Sigma), 항-마이엘린/희소돌기아교세포-특이적 단백질 (MOSP) 단일클론 항체 (1:500, Chemicon International, Inc.), 및 β-튜불린 III 단백질로 표식된 단일클론 항체 (TuJ1, 1:1000, Covance Research Products, Inc.). 공초점 주사 전자 현미경 (Carl Zeiss, Jena, Germany) 을 이용하여 시료를 검사하였다. 항-래트 RGM-유사 단백질 항체의 특이성을 확인하기 위하여, 대조군 및 척수 손상 (SCI) 단편을 래트 RGM-유사 단백질-특이적 펩티드 (309-322aa) 의 존재 하에 염색하였다. 상기 펩티드 10 ㎍/mL 첨가 결과, 조직 염색은 전혀 일어나지 않았다 (자료는 제시하지 않음).

중화 항체 어세이

대조군 CHO 세포 또는 RGM-CHO 세포의 PI-PLC 처리에 의해 유도된 조건화 배지 중의 폴리-L-라이신-코팅된 챔버 슬라이드 상에 소뇌 과립 뉴런을 플레이팅하였다. 항-래트 RGM-유사 단백질 항체를 (10 ㎍/mL), RGM-CHO 세포의 PI-PLC 처리에 의해 유도된 조건화 배지에 가하였다. 24 시간 인큐베이션 후, 생장 어세이를 상술한 바와 같이 수행하였다.

웨스턴 블롯 어세이

대조군 CHO 세포 또는 RGM-CHO 세포를, 프로테아제 저해제 칵테일 정제 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 를 포함한 0.5% Brij-58 (Sigma), 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤로 용해하였다. 세포 용해물을 4℃/13000 g 에서 10 분간 원심분리함으로써 맑게 하고; 그 상청액을 수합하고; Bio-Rad DC 단백질 어세이 키트 (TM) 를 이용하여 단백질 농도를 정상화하였다. 동량의 단백질을 12% β-머캅토에탄올을 함유한 시료 완충액에서 5 분간 끓이고 SDS-PAGE 하였다. 용해 완충액 처리를 제외하고는 조건화 배지를 동일하게 처리하였다. 단백질을 PVDF 막으로 옮기고, 실온의 5% 탈지 우유 및 0.05% Tween 20 (TM) 함유 PBS 에서 1 시간 동안 블롯팅하였다. 상기 막을 항-래트 RGM-유사 단백질 다클론 항체 (1 ㎍/mL) 또는 항-HA 단일클론 항체 (1:1000, Sigma) 로 밤새 블롯팅하였다. ECL 화학발광 시스템 (TM, Amersham Biosciences) 및 HRP (호스래디쉬 퍼옥시다제)-결합 2차 항체 (1:1000, Cell Signaling Technology, Inc.) 를 검출에 사용하였다.

결과

축색 생장 어세이

래트 RGM-유사 단백질-발현 CHO 세포 또는 대조군 CHO 세포의 융합성 단층 상에 소뇌 과립 뉴런을 플레이팅함으로써 실시한 축색 생장 어세이 결과를 도 1 에 나타내었다. 도 1 에 나타나 있듯이, RGM-유사 단백질-발현 CHO 세포에서 배양된 소뇌 과립 뉴런의 축색 길이가 대조군에 비하여 상당히 짧았다. 반면에, 본 발명에 따른 축색 생장 촉진제인 Y27632 를 배지에 첨가한 경우, 축색 생장은 대략 대조군의 경우와 동일하였고 RGM-유사 단백질-발현 CHO 세포상에서 배양한 경우에 비하여 상당하였다.

다음으로, 용액 형태의 RGM-유사 단백질이 축색의 생장을 저해하는지 여부를 조사하였다. 상기 시험에 앞서, 배지를 PI-PLC 로 처리함으로써 HA-RGM-유사 단백질이 배지로 유리됨을 항-HA 항체를 사용한 면역염색법에 의해 확인하였다. PI-PLC 로 처리함으로써 GPI (글리코실포스파티딜이노시톨)-결합 단백질이 막으로 부터 유리된다. 상기한 바와 같이 닭 RGM 과 상당히 유사한 RGM-유사 단백질이 GPI-결합 단백질일 수 있다고 추정되었으므로 상기 실험을 수행하였다. 그 결과, HA-RGM-유사 단백질은 PI-PLC-처리된 RGM-유사 단백질-발현 CHO 세포의 배지에서만 검출된 반면, 대조군 CHO 세포의 배지 및 PI-PLC-미처리된 RGM-유사 단백질-발현 CHO 세포의 배지에서는 HA-RGM-유사 단백질이 전혀 검출되지 않았다. 위 관찰 결과로부터, RGM-유사 단백질은 GPI-결합 단백질이고 PI-PLC 처리에 의해 용액으로 유리됨이 확인되었다.

각 조건화 배지에 대한 조건화 배지-처리된 뉴런의 축색 길이를 도 2 에 나타내었다. 도 2 에 나타나듯이, RGM-유사 단백질-발현 CHO 세포의 PI-PLC 처리에 의해 수득된 배지로 처리된 뉴런의 경우에만 축색 길이가 현저히 저해되었다. 위 결과는 RGM-유사 단백질이 축색 생장에 대하여 저해 활성을 가짐을 보여준다. 대조군 CHO 세포의 배지의 경우, 뉴런 생장은 PI-PLC 처리 존부에 의해 변화되지 않았는데, 이는 PI-PLC 처리 자체가 축색 생장에 영향을 주지는 않음을 나타낸다.

척수 내 RGM -유사 단백질의 분포

시험에 앞서, 생성된 항-RGM-유사 단백질 항체가 RGM-유사 단백질에 대하여 특이성을 나타내는지 여부에 대한 확인 실험을 수행하였다. 항-HA 항체 및 생성된 항-RGM-유사 단백질 항체를 이용하여, PI-PLC-처리된 RGM-유사 단백질-발현 CHO 세포의 배지 상에서 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 항-HA 항체 및 생성된 항-RGM-유사 단백질 항체를 사용한 경우 모두 정확히 동일한 위치 (약 35 kD) 에서밴드가 검출된 반면, 대조군의 경우 상기 밴드가 검출되지 않았다. 항-RGM-유 사 단백질 항체를 생성함에 있어 면역원으로 사용된 상기 펩티드를, 10 ㎍/mL 농도로 항-RGM-유사 단백질 항체에 첨가하고 성체 래트의 정상 척수 및 손상 척수의 신선한 동결 단편의 면역조직염색에 사용한 경우, 전혀 염색이 일어나지 않았다. 위 관찰 결과로써, 생성된 항-RGM-유사 단백질 항체가 RGM-유사 단백질에 대하여 특이성을 나타냄 (즉, 항원-항체 반응을 일으킴) 을 확인하였다.

RGM-유사 단백질의 분포를 조사하기 위하여, 성체 래트로부터 신선한 동결 단편을 제작하고 면역조직염색을 실시하였다. 상기 면역조직염색은 구체적으로 다음과 같이 실시하였다. 우선 신선한 동결 단편을 실온에서 완전히 건조하고; 인산염-완충 4% 파라포름알데히드 용액으로 1 시간 동안 고정하고 1 시간 동안 블로킹하고; 4℃ 에서 밤새 1차 항체로 처리한 다음; 실온에서 1 시간 동안 2차 항체로 처리함. 10% 염소 혈청 및 0.1% Triton X 를 함유한 0.1 M 인산염-완충 수성 염화나트륨을 블로킹 용액으로 사용하였다. 1 ㎍/mL 항-RGM-유사 단백질을 상기 블로킹 용액에 첨가함으로써 1차 항체 용액을 제조하였다. 2차 항체 용액은 0.1 M 인산염-완충 수성 염화나트륨 중의 플루오레세인-결합 2차 항체 (1:1000, Molecular Probes) 및 10% 염소 혈청이었다. RGM-유사 단백질이 백질 및 회백질 모두에서 항시적으로 발현됨을 발견하였다.

항-RGM-유사 단백질 및 항-MOSP (마이엘린/희소돌기아교세포-특이적 단백질) 를 이용한 이중 염색에 의해, RGM-유사 단백질이 희소돌기아교세포 및 백질 내 그 돌기에서 발현됨이 밝혀졌다. 또한, RGM-유사 단백질은 Tuj1 (뉴런-특이적 β-튜불린 III 단백질)-양성 뉴런의 세포체에 국지적으로 존재하나, 백질 내 이들 세 포의 축색에는 그렇지 않았다. 항 래트-RGM-유사 단백질 및 별아교세포 마커인 GFAP (신경아교원섬유산단백질) 에 대한 항체를 이용하여 이중 면역조직염색을 실시하였을 때, 이들 단백질이 함께 국지화된 영역을 검출할 수 없었는 바, 이는 RGM-유사 단백질이 별아교세포에 존재하지 않음을 증명한다. 종합적으로, RGM-유사 단백질은 뉴런 및 희소돌기아교세포에서 발현되고, 척수에서의 그 발현 패턴은 Nogo 및 OMgp 의 경우와 유사하다.

척수 손상 후 RGM -유사 단백질의 발현

RGM-유사 단백질 발현을, 손상 부위의 중심 및 손상 부위에 두부측(rostral) 및 하지측(caudal) 인 백질에서 검측하였다. 중심 영역에서, 손상 후 6 시간째에 정상 조직 구조가 보였다. 퇴행 변화가 손상 후 1~3 일째 관찰되기 시작했을 때, RGM-유사 단백질에 대한 면역반응 또한 손상 부위 및 이소성 세포외 매트릭스에서 관찰되었다. 상기 세포외 면역반응성은 RGM-유사 단백질-발현 세포의 퇴행에 기인한 것일 수 있다. 중심 영역에서 RGM-유사 단백질-발현 세포를 특징화하기 위하여, 항-GFAP/항-RGM-유사 단백질, 항-MOSP/항-RGM-유사 단백질, 및 항-Tuj1/항-RGM-유사 단백질을 이용하여, 손상 후 7 일째의 조직에 대하여 이중-표식 실험을 실시하였다. 이중-표식 세포 (즉, GFAP 양성 및 RGM-유사 단백질 양성; MOSP 양성 및 RGM-유사 단백질 양성; 또는 Tuj1 양성 및 RGM-유사 단백질 양성) 가 관찰되지 않았다. 중추 신경계에 대한 손상이 신경아교 상흔 (glial scar) 을 일으킴을 고려할 때, 상기 세포는 아마도 신경아교 상흔을 만드는 다른 종류의 세포, 예컨대, 미세아교 세포, 대식세포, 희소돌기아교세포 전구체, 섬유모 세포, 연질막 세포, 및/또는 Schwann 세포일 것이다.

중심 영역에 인접한 백질에서, RGM-유사 단백질-면역양성 세포 및 면역반응의 강도는 6 시간까지 거의 변화하지 않았다. 그러나, 그 강도는 수술 후 1 내지 3 일째에 계속하여 증가되었다. 7일 후, 신호 밀도가 비손상 척수에 비하여 현저히 높았다. 백질에서의 RGM-유사 단백질-발현 세포를 특징화하기 위하여, 손상 후 7 일째의 조직 상에서 이중 표식 실험을 수행하였다. 항-RGM-유사 단백질/항-GFAP 및 항-RGM-유사 단백질/항-Tuj1 을 이용하여 이중 염색을 수행하였을 때 이중-표식 세포가 관찰되지 않았다. 위 결과는 이들 세포가 별아교세포나 뉴런이 아님을 가리킨다. RGM-유사 단백질 및 MOSP 에 대한 이중 염색을 수행하였을 때 이중-염색 세포가 검출되었는데, 이는 척수 손상 후 RGM-유사 단백질이 희소돌기아교세포에서 강하게 발현됨을 나타낸다. 마지막으로, 모든 MOSP-발현 세포가 RGM-유사 단백질을 발현하는 반면, RGM-유사 단백질-양성, MOSP-음성 세포는 관측되지 않음을 확인하였다. 백질 내 이들 세포는 손상 부위의 중심에서 관측된 세포와 동일한 것으로 생각된다. 따라서, 척수 손상에 대한 반응으로서, RGM-유사 단백질의 발현이 손상 부위의 중심 및 그에 인접한 백질에서 증가된다.

축색 생장에 대한 RGM -유사 단백질의 저해 활성을 항- RGM -유사 단백질 항체에 의해 중화함

그 결과는 도 3 에 나타나있다. 도 3 의 (*) 는 RGM 이 대조군에 비해 상당히 짧음을 나타낸다. (**) 는 RGM + 항-RGM 이 RGM 의 경우보다 상당히 길 다는 것을 나타낸다. 도 3 에 나타난 바와 같이, 축색 생장에 대한 RGM-유사 단백질의 저해 활성은 항-RGM-유사 단백질 항체의 첨가로 인해 현저히 중화되었는데, 이는 항-RGM-유사 단백질 다클론 항체가 축색 생장 촉진제로 사용될 수 있음을 제시한다.

실시예 2

1. 방법

(1) 외과적 시술

마취된 (소듐 펜토바르비탈, 40 mg/kg) 암컷 Wistar 래트 (200-250 g) 를 척추 수준 T9/10 에서 절제하고, 척수를 노출시켰다. 11번 블레이드를 사용하여 척수의 등쪽 부분을 1.8 mm 깊이로 절단하였다. 조직학적 검사에 따르면, 모든 동물에 있어서 상기 손상은 후방 기둥 (posterior column) 의 등쪽 피질척수로 (CST) 섬유 및 외측 피질척수로 모두를 절단하고 중심관을 지나 연장되어 있었다. 상기 척수 반측절제술 직후, 대조군 항체 (8 동물, 22.3 ㎍/kgㆍ일, 2 주간) 또는 실시예 1 에서 생성된 항-RGM-유사 단백질 항체 (8 동물, 22.3 ㎍/kgㆍ일, 2 주간) 로 채워진 삼투압 미니펌프 (200 ㎕ 용액, 0.5 ㎕/시간, 14-일간 전달, Durect Corp., Cupertino, California, USA 제작) 를 설치하였다. 미니펌프를 동물 등의 피하에 놓고, 미니펌프의 배출구에 연결된 실리콘 관을 척수 반측절제술 부위의 경질막 밑에 오게하여, 팁(tip)이 두부측의 손상 부위에 바로 인접하게 하였다. 상기 관을 절제 부위의 바로 하지측의 가시돌기에 봉합하여 고정하였다. 이어서 근육 및 피부층을 봉합하였다. 방광 기능이 회복될 때까지, 복부에 수동으 로 가압하여 방광을 1일 2회 이상 압박하였다.

(2) 조직 제작 및 면역조직화학법

조직 제작 및 면역조직화학법을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행하였다.

(3) CST 의 선행성 표식

손상 8 주 후, 하행 CST 섬유의 좌우 운동 피질에 비오틴-덱스트란 아민 (BDA, 생리 식염수 중 10%, 피질 당 3.5 ㎕, 분자량 = 10,000, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) 을 마취하에 주사하였다 (좌표: 브레그마의 뒤쪽 2 mm, 브레그마의 옆쪽 2 mm, 깊이 1.5 mm). 각 주사시에, 마이크로리터 시린지(syringe)에 연결된 내부 지름 15-20 ㎛ 의 유리 모세관을 통해 0.25 ㎕ BDA 를 30초에 걸쳐 주사하였다. 모두 합해 6 마리의 대조군 래트 및 SCI 후 항-RGM-유사 단백질 항체를 투여한 8 마리의 래트를 검사 및 비교하였다. BDA 주사 후 14 일째, PBS 에 이어 파라포름알데히드를 관류하여 동물들을 죽였다. 손상 부위를 가로지르는 척수의 냉동 단편을 시상으로 채취하였다 (50 ㎛). 손상 부위의 두부측 및 하지측의 횡단면을 채취하였다. 상기 단편을 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) 함유 PBS 로 1 시간 동안 블로킹한 다음, 0.15% BSA 함유 PBS 중의 Alexa Fluor 488 (TM)-결합 스트렙타비딘 (1:400, Molecular Probes) 과 함께 1 일간 인큐베이션하였다. 손상 부위의 중심에서부터 가장 하지측으로 뻗은 BDA-검출 CST 섬유까지의 길이를 측정하였다.

(4) 행동 시험

Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) 운동 평가 기준 (Basso, D.M., Beattie, M.S., & Bresnahan, J.C., A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995)) 을 이용하여 손상 후 7 주간 개방된 야외 환경에서 행동 회복을 평가하였다. 맹검법으로 정량하였다.

2. 결과

(1) RGM-유사 단백질의 중화로 인한 기능 개선

내재적 RGM-유사 단백질이, 손상된 중추 신경계에 있어서 축색 재생의 저해제로 작용하는지 여부를 상술한 바와 같이 평가하였다. 래트 척수의 등쪽 2/3 를 척추 수준 Th9/10 에서 적출하여, 주피질척수로 및 외측 피질척수로를 적출하였다. 항-RGM-유사 단백질 중화 항체 또는 대조군으로서의 IgG 를, 흉부의 손상 부위 근처의 경막하에 설치한 카테터를 통하여 삼투압 미니펌프에 의해 전달하였다. 대조군과 처치군 사이에 손상 깊이는 유의미한 차이가 없었다. 운동 기능을 모니터하였다. 척수 손상이 없는 유사수술을 받은 래트는 Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) 운동 점수가 만점이었다. 모든 래트는 수술 후 1 일째에 거의 완전히 쌍마비 상태였다 (도 4). 그 후, BBB 점수로 평가되는 운동 행동을 점진적 및 부분적으로 회복한 것이 관측되었다. 척수 손상 후 4 주까지, 대조군 동물과 항-RGM-유사 단백질 항체 투여 동물 간에 BBB 점수에는 차이가 없었다. 수술 후 6 내지 7주 사이에, 항-RGM-유사 단백질 항체를 투여받은 래트의 운동 기능이 대조군 래트에 비해 현저히 향상된 것을 주목할만하다. 따라서, 항-RGM-유사 단백질 항체는 척수 손상을 받은 래트의 치료에 유효하다.

도 4 는, 항-RGM-유사 단백질 항체를 투여받은 래트 및 대조군 항체를 투여받은 래트에 있어서, 중앙흉부등쪽의 반측절제술 이후 도시된 시간 경과 후의 BBB 점수를 나타낸다. 각 군 (6 또는 8 마리 래트) 에 대하여 평균 ± 표준편차를 나타내었다. (*) 는 항-RGM-유사 단백질 항체를 투여받은 군이 그 주에 있어서 대조군과 유의하게 다름을 보여준다. *: 대조군에 대하여 p < 0.05.

(2) RGM-유사 단백질 저해에 의한 축색 재생의 촉진

앞서 시험한 래트 일부에 있어서 감각-운동 피질에 BDA 를 주사함으로써, 상기한 바와 같이 등쪽 CST (피질척수로) 의 완전성을 조사하였다. 항-RGM-유사 단백질 항체로 처리된 손상 래트의 시료 (도 5b) 는 대조군 래트의 시료 (도 5a) 와 완전히 다른 표식 패턴을 보였다. 항-RGM-유사 단백질 항체로 처리되지 않은 래트에 있어서, 손상 부위의 말단에 근접하여, 주 CST 는 손상부에 대해 두부측에서 끊겼다 (도 5a, c). 위 기본 패턴은 축색 재생이 중추 신경계에서는 통상 일어나지 않는다는 사실을 반영한다. 반대로, 항-RGM-유사 단백질 항체로 처리된 래트에 있어서는 표식 CST 로부터 다수의 섬유가 돋아나는 것이 관측되었다 (도 5b, d). 돋아난 축색은 백질에서보다 회백질에서 훨씬 더 뻗어나왔다. 상기 다수 섬유의 사진은 항체를 투여받은 손상된 동물 모두에서 관찰되었다. 손상 부위에 대해 두부측의 등쪽 CST 에서 총 섬유 갯수는 항체-처리 동물 및 대조군 동물 간에 차이가 보이지 않았으므로, 위 결과는 BDA 흡수 정도의 차이에 의한 것일 수 없다. 두 군의 래트에 있어서 손상 부위의 종단면을 관찰하면, 중화 항체로 처리된 래트의 경우 CST 섬유 퇴축이 덜하고, 다수의 측가지 CST 가 돋아나있 다 (도 5a, b, i). 항-RGM-유사 단백질로 처리된 래트의 경우, 전형적인 불규칙한 굴곡 생장을 나타내는 재생 섬유가 손상 부위 수준에서 조직교 내에 빈번하게 보였다 (도 5d, f). 이러한 재생 섬유는 등쪽 백질 및 손상 반흔 및 포낭을 따라 성장하였다 (도 5f, h). 많은 축색이 손상 조직을 가로질러서 구멍 주위에 성장하거나 또는 손상부의 중심에서 성장했다는 것은 주목할만하다. 중화 항체-처리된 래트의 손상 부위의 CST 섬유를 고배율 현미경으로 관찰한 결과 시냅스와 유사한 융기부를 닮은 형태를 나타냈다. 반면, 대조군 래트에서 BDA 가 검출되지 않았다 (도 5e). 항체-처리된 래트에서, 축색 다발이 손상 조직을 통해 3.5 mm 까지 생장하였고, 손상 부위로부터 하지측으로 5 mm 까지 뻗어나간 축색 다발도 있었으며; 다수의 표식 섬유가 관측되었다 (도 5g, h, j). 반면, 대조군 래트에서는 섬유가 관찰되지 않았다. 이들 섬유 다수는 선형 탄도가 아니라 분지형으로 구불구불하게 진행되었다. 주관 (main tract) 으로부터 뻗어나간 다수의 분지는 재생 섬유의 가장 하지측 부분에서 관측되었다. 따라서, 항-RGM-유사 단백질 항체의 투여는 CST 축색의 재생을 촉진한다.

도 5 에서, a 및 b 는 BDA-표식 CST 섬유의 대표적 사진으로서, 왼쪽이 두부측이다. 대조군 IgG (a) 또는 항-RGM-유사 단백질 항체 (b) 로 처리된 척수의 손상 10 주 후의 선행성-표식 CST 섬유를 나타낸다 (RGM-유사 단백질은 도 5 및 6 에서 RGMa 로 언급됨). 손상 부위의 중심은 별표로 표시되었다. 도 5 의 사진 c-g 는 도 5 a 및 b 의 사각 영역으로 표시된 영역의 고배율 사진이다. 항-RGM-유사 단백질 항체로 처리된 래트에서, 두부측으로 뻗어나간 증가된 측가지 CST 섬유 (d) 및 손상 부위의 재생 섬유 (f, 화살표) 가 관찰되었지만, 대조군 IgG-처리된 래트의 대응하는 영역에서는 이들 섬유가 관찰되지 않았다 (c, e). 사진 h 는 b 에서와 동일한 동물의 상이한 단편을 담고 있으며 손상 부위의 중심으로부터 2.6 mm 하지측의 재생 섬유를 보여준다 (화살표). 스케일바 (scale bar) 는 a 및 b 가 500 ㎛, c-f 가 100 ㎛, 및 g 및 h 가 200 ㎛ 이다. 도 5i 는, 항-RGM-유사 단백질 항체 또는 IgG 로 처리된 래트 (n = 6-8/군) 의 척수 손상 10 주 후에, 손상 중심으로부터 BDA-검출 주(main) CST 섬유의 거리를 나타낸다. *: 대조군에 대하여 p < 0.01. 항-RGM-유사 단백질 항체는 손상된 주 CST 에 의한 퇴축을 억제하는 것으로 나타났다. 도 5j 는, 항-RGM-유사 단백질 항체 또는 IgG 로 처리된 래트 (n = 6-8/군) 의 척수 손상 10 주 후에, 손상 중심에서부터 가장 하지측의 BDA-검출 CST 섬유의 거리를 나타낸다. *: 대조군에 대하여 p < 0.01.

실시예 3

1. 방법

(1) GTP-RhoA 의 어피니티 침전

세포를 1% Triton X-100 (TM), 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 ㎍/mL 류펩틴, 및 10 ㎍/mL 아프로티닌을 함유한 50 mM Tris (pH 7.5) 에 용해하였다. 세포 용해물을 4℃ 에서 10 분×13000 g 로 원심분리하여 맑게 하고, 그 상청액을 4℃ 에서 45 분간 Rhotekin 비드 (TM, Upstate Biotech) 의 20 ㎍ GST-Rho 결합 도메인과 함께 인큐베이션하였다. 비드를 세척 완충액 (1% Triton X-100 (TM), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 및 각각 10 ㎍/mL 의류펩틴 및 아프로티닌을 함유한 50 mM Tris (pH 7.5)) 으로 4회 세정하였다. RhoA 에 대한 단일클론 항체 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, California, USA) 를 이용하는 웨스턴 블롯에 의해 결합 Rho 를 검출하였다.

2. 결과

(2) GTP-RhoA 의 어피니티 침전

뉴런의 RhoA 활성을 측정하였다. 생후 7 일된 래트의 소뇌 뉴런에 조건화 배지를 가하고 30 분 경과 후 RhoA 활성을 측정하였다 (도 6). 도 6 에 나타난 바와 같이, 대조군 CHO 세포의 배지에서 배양된 뉴런과 비교하여, RGM-유사 단백질-발현 CHO 세포의 PI-PLC 처리에 의해 유도된 배지에서 배양된 뉴런에서 Rho 활성화가 확인되었다. 상기 결과는 RGM-유사 단백질이 Rho 를 활성화함을 보여준다.

본 발명에 따른 축색 재생 촉진제는 손상된 중추신경의 재생에 효과적이고 중추 신경계가 손상된 환자를 위한 치료제로서 유용하다.

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Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro 305 310 315 320 Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe 325 330 335 Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu 340 345 350 Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp 355 360 365 Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met 370 375 380 Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu 385 390 395 400 Leu Pro Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro Glu Met 405 410 415 Leu Pro Gly Thr Val Thr Leu Leu Val Leu Leu Pro Leu Phe Trp 420 425 430 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 5 agtggtaaca ggccgagctg gatgg 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 6 ccacaacctt gtcgcgtgca ctaat 25

Claims (5)

1. RGM-유사 단백질 저해제를 유효 성분으로 포함한 축색 재생 촉진제.
2. 제 1 항에 있어서, RGM-유사 단백질 저해제가 항-RGM-유사 단백질 항체인 축색 재생 촉진제.
3. 제 1 항에 있어서, RGM-유사 단백질 저해제가 Y27632 인 축색 재생 촉진제.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 축색이 중추 신경계 축색인 축색 재생 촉진제.
5. 시험 물질을 RGM-유사 단백질과 접촉시키고, 시험 물질이 RGM-유사 단백질의 기능을 저해하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 축색 재생 촉진제 후보 물질의 동정 방법.

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