KR20080034995A - 혈관 투과성을 저해하는 방법 및 조성물 - Google Patents

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마틴 에이. 슈워츠
레베카 에이. 스탁튼
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유니버시티 오브 버지니아 페이턴트 파운데이션
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Abstract

본 발명은 혈관 투과성을 조절하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 혈관 투과성 증가에 관여하는 단백질 및 신호 전달 경로를 차단하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

혈관 투과성을 저해하는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITION OF VASCULAR PERMEABLILITY}
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)를 근거로 2005년 8월 9일자 미국 가출원 60/706,597호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 국립보건원으로부터 부여받은 교부 번호 RO1 GM47214 및 T32 HL07284로 미국 정부의 지원하에 수행되었다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 가진다.
혈관 외부로의 유체 및 세포 통과는 염증, 조직 손상 및 다양한 경우에서 죽음의 원인이 되는 중요한 요인이다. 이들로는 허혈성 손상, 독성 쇼크, 알레르기 및 면역 반응이 있다. 혈관 투과성은 내피세포 사이의 세포-세포 유착에 의해 부분적으로 조절된다.
혈관 구조 내부의 내피세포 단일층은 혈액 유체 구획의 완전성을 유지하며 조절된 방식으로 가용성 인자와 백혈구의 통과를 허용하는, 장벽을 형성한다. 이러한 프로세스의 잘못된 조절은 혈관을 하부 조직으로 누출시켜, 부종을 포함한 병리학적 상태가 조합된 염증을 발생시킨다. 또한, 혈관 투과성 관련 부종은 동물의 발작 및 심근 경색 모델에서 조직 손상을 증가시키는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 저산소증 조직에서의 분비로 인한 허혈성 손상을 일으킨다. 혈관 투과성은 세포-세포 접촉 변형 및 인접 세포간의 세포간 구멍 발생을 특징으로 한다. 내피세포 장벽의 완전성은, 피질의 F-엑틴이 세포-세포 접촉을 안정화시키는 방식으로 액틴 세포골격의 반작용(opposing role)에 의해 부분적으로 조절되지만, 세포내 스트레스 섬유는 투과성을 유도하기 위해 장력을 발휘한다.
혈관 투과성은 면역 반응 및 상처 치유에 긍정적으로 기여할 수 있는 정확하게 조절된 기능이지만, 유체 및 면역 세포가 조직으로 누출되는 다양한 질병들에서 심각하고 생명을 위협하는 결과를 초래할 수 있다. 호흡 기능 부전을 유발하는 폐 혈관의 투과성 증가로 인한 폐내 유체 축적은 급성 호흡 곤란 증후군의 주된 요인이다. 발작 또는 심근 경색 이후의 저산소증 조직에 의한 VEGF 방출로 인한 혈관 누출은, 실질적으로 상기한 현상 이후에 조직 손상을 증가시킨다. 혈관 누출과 조직 부종은 패혈증에서 장기 부전을 일으킨다.
폐 손상은 심각하며, 때로는 치명적인 의학적 문제이다(Orfanos et al., 2004; Lionetti et al., 2005). 이는 통상적으로 감염에 의해 야기되며, 유체를 폐로 누출시키는 기계적 환기에 의해 악화되어 호흡 기능 부전이 될 수 있다. 급성 폐 손상의 사망율은 30-40%에 이르며, 현재 이용가능한 특수 치료법은 없는 실정이다.
작은 GTPase Rac은 많은 시스템에서 세포-세포 유착 형성 및 기능을 조절한다. 상피 및 내피 세포 타입에서, Rac는 접착 어셈블리 및 강한 정션(junction) 모두에 중요하며, 세포의 분산(cell scattering) 동안의 또는 투과성을 촉발시키는 작용제에 대한 반응으로 인한, 분열(disruption)에 중요하다. 이러한 복잡한 작용은, 상이한 Rac 작동제 경로가 차별적으로 세포-세포 정션을 조절할 수 있음을, 제시한다. Rac 및 이의 작동제 경로의 정확한 시간적 및 공간적 조절이 세포-세포 유착의 강화 및 분열 사이의 균형을 결정하는데 중요한 것으로 보인다. 그로나, 이러한 작용을 관리하는 하류 경로는 완전히 파악되지 않았다.
p21에 의해 활성화되는 키나제(PAKs)는 운동성, 형태형성 및 혈관신생 등의 복수의 세포 기능에 참여하는 Rac 및 Cdc42의 하류를 활성화시키는, 세린/트레오닌 키나제이다. GTP가 결합된 Rac 및 Cdc42는 비활성형의 PCK에 결합하면, PAK 자가저해 도메인에 부여된 의해 입체 제한(steric constraint)으로부터 벗어나, PAK는 자가-인산화 및 활성화된다. 활성화된 PAK에 대한 마커로서 제공되는 수많은 자가인산화 부위가 동정되었다. 주목을 끄는 PAK 하류 타겟은, 코필린(cofilin)에 대한 작용을 통해 액틴 중합을 조절하는 LIM 키나제와, 미오신 경쇄이다. PAK2는 MLC의 Ser19에 1회 인산화를 촉매하여, 수축성을 증가시키고 세포 수축을 촉발시킨다. 그러나, PAK는 MLC 키나제를 저해할 수 있어, 그로인해 MLC 인산화 및 수축을 제한할 수 있다. PAK2의 세린 141은 키나제의 활성화 동안에 인산화되는 AID 서열내에 위치된 부위이다. 이 부위의 인산화는 키나제 도메인과 AID의 상호작용 차단에 의한 활성화에 기여하여, 자가저해를 완화시킨다. 내피 세포에서, 촉매적으로 활성형인 PAK1의 발현은 MLC 인산화 및 세포 수축성을 증가시키지만, PAK 저해는 세포 수축성을 감소시킨다. 따라서, 이들 세포에서 PAK의 우세적인 작용은 수축력 조성인 것으로 보인다.
내피 세포-세포 정션에서의 PAK의 활성화는 사이토카인에 반응하여 혈관 투과성을 조절하는 것으로, 이미 입증되었다(Stockton, J. Biol. Chem. 279:46621-46630). 이는, 세포 수축을 촉진하는 미오신 경쇄의 인산화 조절에 의해 입증되었다. PAK는 ERK1/2 활성화를 조절하는 것으로 알려져 있다(Frost, 1997, EMBO J. 16:6426-6438). 또한, Erk는 혈관 투과성을 조절하는 것으로 알려져 있다(Verin, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 279:L360-70; Borbiev Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2003 285:L43-54).
PAK는 PIX(α 또는 β 이소형)라고 하는 단백질에 결합할 수 있으며, 이는 이후에 GIT(이소형 1 또는 2)라고 하는 다른 단백질에 결합한다(Turner, Curr Opin Cell Biol., 2001, 13:593-599). GIT는 Erk MAP 키나제의 활성화를 강화하는 스캐폴드 단백질인 것으로 제안되었다(Yin 2004, Mol. Cell Biol. 24:875-885). PAK 경로는 혈관 누출을 자극하는 많은 경우에 관여되는 것으로 보인다. GIT 단백질은 ADP-리보스화(ribosylation) 인자(ARF) 소형 GTP-결합 단백질에 대한 GTPase-활성화 단백질이다.
PAK에서 PIXα 및 PIXβ에 결합하는 서열은 PPPVIAPRPEHTKSVYTR(서열번호 1)(Manser et al., Mol. Cell. 1998 1:2:183-92)이다. GIT1/2에 결합하는 PIX의 코어 서열은 AALEEDAQILKVI(서열번호 2)이며, 이는 PIXα의 경우에는 아미노산 잔기 685-698에 해당되며, PIXβ의 경우에는 아미노산 잔기 527-542에 해당된다(Feng et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:5644-5650). PIX 단백질에 결합하는 GIT1 및 GIT2의 코어 서열은 Spa2 상동 도메인(255-375, GIT1) 및 코일드 코일 영역(coiled coil region)(428-485, GIT1)(Premont et al., 2004, Cell Signal 16:1001-1011)이다. 또한, MEK에 결합하는 GIT1의 영역은 Spa 상동 도메인(아미노산 잔기 255-375)내에 있다(Haendeler et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:50:49936-44).
PAK 키나제는 작은 GTPases Rac 및 Cdc42에 의해 활성화된다. 이는 때때로PIX (α 또는 β) 및 GIT(1 또는 2)라고 하는 다른 2개의 단백질과의 복합체로 발견된다. Pak는 PAK에서 자유로운 프롤린이 다수 존재하는 서열을 통해 PIX SH3 도메인에 직접 결합한다. 그러면, PIX는 PIX의 C-최말단과 GIT의 2 영역: Spa2 상동 도메인(아미노산 잔기 270-363) 및 코일드 코일(아미노산 잔기 428-485)을 통해, GIT 단백질에 조합한다. 또한, GIT1은 Erk 활성화를 위한 스캐폴드 단백질인 것으로 확인되었다. GIT1는 Erk 활성화를 위한 상류 키나제인 MEK1/2에 결합한다.
본 출원인이 이전에, PAK 키나제가 성장 인자, 염증 사이토카인 및 트롬빈에 의한 혈관 투과성을 유도하는데 중요함을 밝혔었다. PAK는, 투과성 장벽으로 제공되는 세포-세포 정션을 파괴하는, 미오신 경쇄 키나제의 인산화 및 세포 수축 증가에 의해, 투과성을 조절한다.
당업계에서는 오랫동안 혈관 투과성을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 대한 요구가 있었다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시킨다.
발명의 개요
PAK, PIX, GIT1 및 GIT2를 포함한 단백질 복합체 및 MEK는, 수많은 사이토카인, 성장 인자 또는 기계적 자극에 대한 반응으로 내피세포의 단일층의 투과성을 촉발시키는데 필수적이다. 혈관 투과성은 갑작스러운 폐 손상, 발작, 심근 경색 및 감염 등의 조직 손상 및 감염을 포함한, 수많은 병리학적 상태를 유발하는 주된 원인 인자이다. PAK는 여러가지 메카니즘을 통해 MLCK 인산화를 활성화시킬 수 있을 것으로 생각되었다. 가능성 있는 경로는, 미오신(Chew et al., 1998) 또는 칼데스몬(Foster et al., 2000)의 직접적인 인산화이다. 대안적으로, 이러한 작용은, Erk를 활성화시키기 위한 Raf 또는 MEK1/2의 활성화를 포함할 수 있으며(Frost et al., 1997; King et al., 1998), 이로써 MLCK를 활성화시킬 수 있다(Klemke et al., 1997). 본 발명은, PAK가 MLCK 인산화를 활성화시켜 혈관 누출을 유도하는 메카니즘, 이러한 경로를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
본 발명은 혈관 투과성을 조절하기 위한, 특히 혈관 투과성을 저해하기 위한, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 혈관 투과성을 촉발시키는데 중요한 단백질의 상호작용을 차단함으로써, 혈관 투과성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 PAK-PIX-GIT-MEK 복합체를 파괴하거나 또는 세포-세포 정션으로부터 상기 복합체를 대체하기 위하여, 상호작용 부위와 경쟁적인, 펩티드 및 이의 변형체, 단편, 유도체, 상동체 및 유사체를 제공한다. 상기 펩티드는 본원에서 경쟁적인 펩티드 또는 서열이라고 한다. 본 발명의 펩티드는 PAK, PIX, GIT 및 MEK 중 적어도 하나와 경쟁하거나 조절한다. 따라서, 본 발명은 관련 신호 전달 경로를 통한 혈관 투과성을 조절하는 것에 관한 것으로, PAK, PIX, GIT, MEK, Erk 및 MLCK로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 단백질 조절 경로의 조절자의 용도를 포함하며, 그로인해 혈관 투과성이 조절된다.
일 측면에서, 본 발명의 펩티드는 PAK의 PIXα 결합을 차단한다. 다른 측면으로, 본 발명의 펩티드는 PAK의 PIXβ 결합을 차단한다. 일 측면으로, 본 발명의 펩티드는 PAK의 GIT1 결합을 차단한다. 다른 측면으로, 본 발명의 펩티드는 PAK의 GIT2 결합을 차단한다. 일 측면으로, 본 발명의 펩티드는 MEK의 GIT1 결합을 차단한다. 일 측면으로, MEK는 MEK1 또는 MEK2이다. 일 측면으로, 본 발명의 펩티드는 Erk 활성화를 차단한다. 다른 측면으로, 본 발명의 펩티드는 Erk MAP 키나제를 차단한다. 일 측면으로, 본 발명의 펩티드는 PAK에서 Erk로의 시그널링, 그리고 MLCK로의 시그널링을 차단한다. 본 발명은 PAK로부터 하류 Erk 및 MLCK을 조절하기 위한 방법 및 조성물을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일예에서, 본 발명의 펩티드는 단백질 복합체 형성 또는 상호작용을 차단한다. 일 측면으로, 본 발명의 펩티드는 세포-세포 정션에 단백질 복합체의 국지화를 차단한다.
일 측면으로, 혈관 투과성은 필요한 개체에서 본 발명의 펩티드에 의해 차단된다.
하기 펩티드가 사용된다:
서열번호 1- PPPVIAPRPEHTKSVYTR
서열번호 2- AALEEDAQILKVI
서열번호 3- YGRKKRRQRRRG
서열번호 4- YGRKKRRQRRRGPPPVIAPRPEHTKSVYTR
서열번호 5- YGRKKRRQRRRGPPPVIAPAAEHAKSVVYTR
서열번호 6- YGRKKRRQRRRGKPPAPPMRNTSTM
서열번호 7- KPPAPPMRNTSTM
하기 핵산이 사용된다:
서열번호 8- GGCCAAAGCUGCUAAGAAGUU
서열번호 9- GGACGACGCCAUCUAUUCAUU
서열번호 10-GCACACCCAUUGACUAUGCUU
서열번호 11- GGACGCCACAUCUCCAUUGUU
간략하게, 본원에 사용되는 서열의 기능 및/또는 기원은 다음과 같다:
서열번호 1은 PIX에 결합하는 PAK의 서열이다.
서열번호 2는 GIT1 및 GIT2에 결합하는 PAK의 서열이다.
서열번호 3은 세포막 투과성을 부여하는 TAT 서열이다.
서열번호 4는 서열번호 1 및 3의 조합이다.
서열번호 5는 2개의 아미노산 돌연변이/치환을 포함하는 서열번호 4의 대조군 펩티드이다.
서열번호 6은 서열번호 3 및 7의 조합으로, 세포막 투과성을 부여하는 TAT 서열을 포함하는 PAK/Nck 차단 펩티드가 된다.
서열번호 7은 PAK의 첫번째 프롤린 다수 포함된 도메인의 서열이다.
서열번호 8-11은 본원에 사용된 siRNA Smartpool의 4가지 센스 서열이다.
일 예로, 단백질 저해자인 펩티드는 서열 PPPVIAPRPEHTKSVYTR(서열번호 1)(Manser et al., Mol. Cell. 1998 1:2:183-92), 이의 상동체, 변형체, 유도체, 유사체 및 단편을 포함한다. 서열번호 1은 PIX 결합 서열이라고 한다.
다른 예로, 단백질 복합체 형성 또는 상호작용을 저해하기 위해 사용되는 경쟁적인 서열은 AALEEDAQILKVI(서열번호 2)를 포함하며, 이는 GIT1/2에 결합하는 PIX내 코어 서열이다(PIXα의 경우 아미노산 잔기 685-698에 해당되며, PIXβ의 경우 아미노산 잔기 527-542에 해당됨; Feng et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:5644-5650). 사용되는 경쟁적인 펩티드는 PIX 단백질에 결합하는 GIT1 및 GIT2내 하나 이상의 코어 서열: Spa2 상동성 도메인(255-375, GIT1) 및 코일드 코일 영역(428-485, GIT1)(Premont et al., 2004, Cell Signal 16:1001-1011)을 포함한다. MEK에 결합하는 GIT1을 가진 영역은 또한 Spa 상동성 도메인내이며, 본 발명에 포함된다(아미노산 잔기 255-375)(Haendeler et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:50:49936-44). TAT 서열, YGRKKRRQRRRG(서열번호 3) 또는 펩티드에 세포막 투과성을 부여하는 관련 폴리베이직 서열은 이들 서열에 연결되어 있다(Stockton et al., J. Biol. Chem., 2004, 279:45:46621-46630). 복합체 형성 또는 세포-세포 정션내 국지화를 차단하고 PAK에서 Erk로, 그리고 다시 MLCK로의 시그널링을 차단하는 이들 단백질내 상호작용 부위도 본 발명에 포함된다. 일 측면으로, 하나 이상의 펩티드, 이의 상동체, 변형체, 유도체, 유사체 및 단편을 사용하여, 복합체 형성 또는 세포-세포 정션에 국지화를 차단하고, PAK에서 Erk로, 그리고 다시 MLCK의 시그널링을 차단한다. 본 발명의 일 측면으로, 하나 이상의 펩티드는 혈관 투과성을 조절하는 하나 이상의 다른 화합물과 함께 투여된다.
본 발명의 일 예에서, 본 발명의 펩티드에 폴리베이직 TAT 서열이나 다른 투과성 서열에 부착하면, 이 구조체가 세포에 도입되게 한다. 일 측면으로, 투과화 서열은 TAT 서열 YGRKKRRQRRRG(서열번호 3)이다. 이들 접합된 화합물은 손상되었거나 또는 자극된 피부에 혈관 투과성을 저해하여, 부종 및 조직 손상을 방지한다.
일 예로, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 1를 조합한, 결과 펩티드를 제공하다. 서열번호 3 및 서열번호 1의 조합은 서열번호 4이며, 이는 본원에서 "PIX-결합 펩티드"라고 한다. PIX 결합 펩티드는 또한 "PIX -차단 펩티드"라고도 한다. 따라서, 서열번호 4는 서열 YGRKKRRQRRRGPPPVIAPRPEHTKSVYTR을 가지며, 본원에서는 사용되는 C 말단에 변형된 형태는 YGRKKRRQRRRGPPPVIAPRPEHTKSVYTR-K+바이오틴이다.
본원에 언급된 대조군 펩티드는 YGRKKRRQRRRGPPPVIAPAAEHAKSVVYTR(서열번호 5)이며, 또한, (도 6) YGRKKRRQRRRGPPPVIAPAAEHAKSVVYTR-K+바이오틴으로도 사용된다.
다른 예로, 단백백질 복합체 형성 또는 상호작용을 저해하기 위해 사용되는 경쟁적인 서열은 AALEEDAQILKVI(서열번호 2)이며, 이는 GIT1/2(PIXα의 경우 아미노산 잔기 685-698에 해당되며, PIXβ의 경우 아미노산 잔기 527-542에 해당됨; Feng et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:5644-5650)가 결합하는 PIX내 코어 서열이다. 일 예로, 사용되는 경쟁적인 펩티드는 PIX 단백질에 결합하는 GIT1 및 GIT2내 하나 이상이 코어 서열을 포함하며, 이는 Spa2 상동성 도메인(255-375 in GIT1)과 코일드 코일 영역(428-485 in GIT1)이다(Premont et al., 2004, Cell Signal 16:1001-1011). MEK에 결합하는 GIT1은 또한 Spa 상동 도메인내에 있고, 본 발명에 포함된다(아미노산 잔기 255-375)(Haendeler et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:50:49936-44). 따라서, 본 발명은 이들 도메인의 펩티드, 이의 상동체, 유도체, 단편 및 변형체를 포함하는 펩티드를 더 포함한다. 복합체 형성 또는 세포-세포 정션에 국지화를 차단하고 PAK에서 Erk로, 그리고 다시 MLCK로의 시그널링을 차단하는, 이들 단백질내 다른 상호 부위도 본 발명에 포함된다. 일 측면으로, 하나 이상의 펩티드, 이의 상동체, 변형체, 유도체, 유사체 및 단편을 이용하여, 복합체 형성 또는 세포-세포 정션에 국지화를 차단하고 PAK에서 Erk로, 그리고 다시 MLCK로의 시그널링을 차단한다. 본 발명의 일 측면에서, 하나 이상의 본 발명의 펩티드는 혈관 투과성을 조절하는 하나 이상의 다른 화합물과 함께 투여된다.
본 발명의 일 예에서, 본 발명의 펩티드에 폴리베이직 TAT 서열 또는 다른 투과성 서열을 부착하면, 이 구조체가 세포에 도입되게 할 것이다. 일 측면으로, 상기 투과성 서열은 TAT 서열 YGRKKRRQRRRG(서열번호 3)이다. 이들 접합된 화합물은 손상되었거나 자극받은 조직에서의 혈관 투과성을 저해하여, 부종 및 조직 손상을 방지한다.
일 측면으로, TAT-펩티드 구조체는 세포와 접촉하였을 때 혈관 투과성을 저해한다. 일 측면으로, 상기 세포는 내피 세포이다. 일 측면으로, 상기 내피 세포는 배양 상태이다. 다른 측면으로, 상기 내피 세포는 생체내이다.
일 측면으로, 본 발명은 혈관 투과성을 감소시키거나 혈관 투과성 증가를 저해하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일 측면으로, 본 발명은, 혈관 누출로 인한 또는 조직 손상, 염증, 부종, 붓기, 쇼크, 질환, 비정상적인 혈관 투과성으로 인한 그외 상태 또는 장애에 의해 유발되는, 질병, 장애 또는 상태를 치료하기 위해, 개체에게 투여할 수 있는, 단백질 복합체의 기능 또는 활성의 저해자를 포함한다. 이러한 질환 및 손상으로는, 기계적 또는 그외 폐 손상, 발작 및 심근 경색이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 일 측면으로, 본 발명은 갑작스러운 폐 손상에서 유체 이동을 저해하는 조성물 및 방법을 제공한다. 다른 측면으로, 본 발명은 생체내에서 염증제에 의해 유도된 조직내 혈관 투과성을 감소시키거나, 또는 투과성 증가를 저해하는 조성물 및 방법을 제공한다. 일 측면으로, 상기 조직은 폐 조직이다. 또한, 본 발명의 화합물은 필요로하는 개체에 다른 약물 또는 약제와 함께 투여할 수 있다.
일 예로, 본 발명은 필요한 개체에서의 PAK-PIX-GIT-MEK 복합체 및 상호작용을 염증 및 손상으로 인한 혈관 투과성을 저해하기 위한, 본 발명의 펩티드의 투여를 제공한다. 상호작용 부위와 경쟁하여 PAK-PIX-GIT-MEK 복합체를 파괴하거나 또는 세포-세포 정션으로부터 복합체를 대체하기 위한 단백질 절편 및 펩티드는, 혈관 투과성을 감소시킨다. 이들 서열은 TAT 서열이나, 또는 단백질의 세포내로의 수송을 촉진하는 다른 서열과 융합될 수 있다. 이러한 반응제를 사용하여, 혈관 누출이 원인 인자인 질병에서 혈관 투과성을 저해할 수 있다. 내인성 상호작용 부위와 경쟁하여 PAK의 PIXα 또는 PIXβ 결합, PIX의 GIT1 또는 GIT2 결합, 및 MEK의 GIT1 결합을 차단하는 단백질 단편은, PAK을 Erk 활성화로 연결하는 시그널링 경로를 간섭하며, 세포-세포 정션 뿐만 아니라 MLCK까지 파괴한다.
일 예로, PAK 저해자는 우성적 네거티브 활성을 보이는 PAK 유래 서열을 포함하는 짧은 펩티드이다(Kiosses et al, 2002, Circ. Res. 90:697). 이 펩티드(YGRKKRRQRRRGKPPAPPMRNTSTM; 서열번호 6)는, PAK의 첫번째 프롤린 다수 함유 도메인에서의 서열 KPPAPPMRNTSTM(서열번호 7)이, 세포내 도입을 촉진시키는 HIV TAT 단백질(Schwarze et al, 1999, Science 285:1569)에서의 폴리베이직 서열 YGRKKRRQRRRG(서열번호 3)과 융합된 것이다. 펩티드(서열번호 6)는 전장의 우성적 네거티브 구조체와 유사한 PAK 기능을 저해한다. 펩티드는 스스로 PAK 키나제 활성을 차단하진 않지만, 대신 세포-세포 정션을 포함한 작용 부위로부터 PAK을 대체하며, 이는 세포 수축, 이동 및 투과성에 있어 그것의 작용을 방지하는데 충분하다. 이 펩티드는 "PAK-차단 펩티드" 및 "Nck-차단 펩티드"라고 한다.
다른 예로, PAK 저해자는 PAK의 자가저해 도메인을 포함하며, 이는 PAK 키나제 활성을 차단한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 사용하기 위한 그외 PAK 조절자들을 포함한다. 추가적인 PAK 조절자들을 동정하는데 유용한 방법은 본원과 미국 특허 6,248,549 및 2004년 7월 15일에 공개된 미국 공개공보 20040138133에 개시되어 있으며, 이들은 그 전체가 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
다른 예로, PAK 활성 또는 기능의 조절자는 PAK과의 결합으로부터 다른 단백질 또는 분자를 차단할 수 있다. 일 측면으로, 조절자는 다른 단백질 또는 분자와 결합하여, PAK과의 상호작용으로부터 이들을 저해한다. 다른 측면으로, 조절자는 PAK에 결함하여 다른 단백질 또는 분자를 PAK과의 결합으로부터 저해한다.
일 예로, 본 발명은 성장인자, 사이토카인 및 박테리아 독소로 인한 증가된 혈관 투과성을 저해하는 방법을 제공한다.
당업자라면, 본 발명의 저해자가 원하는 타겟 부위와의 상호작용이나 결합에 의한 경쟁적인 저해에 의해 작용하거나, 또는 분자의 작용 저해나 또는 3차 구조에 변화를 유도하는 것과 같이 복합체 형성 또는 상호작용을 어떻게든 차단함에 의해 간접적으로 작용할 수 있음을 알 것이다.
본 발명은, 이들 상호작용 및 신호 전달 경로를 파괴하기 위한 다른 타입의 분자를 추가적으로 제공한다. 일 에로, 본 발명은 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 분리된 핵산을 제공한다. 다른 예로, 본 발명은 본원에 기재된 신호 전달 경로의 단백질에 대한 siRNA를 제공한다. 일 측면에서, siRNA는 GIT에 대한 것이다. 일 측면으로, siRNA는 서열번호 8-11로 이루어진 군으로부터 선택된 서열이다. 다른 측면으로, 저해자는 MEK의 저해자이다. 일 측면으로, MEK의 저해자는 UO126이다.
일 예로, 본 발명은 본 발명의 펩티드 하나 이상을 개체에 투여하기 위한 키트를 제공한다.
일 예로, 본 발명은 본원에 기재된 단백질 조절 경로의 저해자를 동정하기 위한 분석 방법 및 방법을 제공한다.
본 발명의 다양한 측면 및 예는 하기에서 보다 상세하게 설명된다.
약어
AID- 자가저해 도메인
ARF- ADP-리보스화 인자(ribosylation factor)
BAEC- 소 대동맥 내피 세포
dn- 우성적 네거티브(dominant negative)
ECL- 증강된 화학발광
ERK- 세포외 신호 조절된 키나제
bFGF- 염기성 섬유아세포 성장 인자
FAK- 병소 유착 키나제(focal adhesion kinase)
FN- 파이브로넥틴
GAP- GTPase-활성화 단백질
GIT- GRK-상호작용성 ARF GAP
GRK- G 단백질이 커플링된 수용체 키나제
HRP- 호르세라디시 페록시다제
HUVEC- 인간 제대혈 내피 세포
ip- 복막내
IP- 면역침강
MEK- MAP/ERK 키나제
MLC- 미오신 경쇄
MLCK- 미오신 경쇄 키나제
PAK- p21-활성화된 단백질 키나제
PIX- PAK-상호작용성 교환 인자
PKL- 팔실린-키나제 링커 단백질(paxillin-kinase linker protein)
PBS- 포스페이트 완충화된 염수
SHD- Spa2 상동 도메인
TBS- 트리스-완충화된 염수
TNF- 종양 괴사 인자
VEGF- 혈관 내피 성장 인자
WCL- 전세포 용혈물
wt- 야생형
정의
본 발명의 상세한 설명 및 청구항에서, 후술한 정의에 따라 하기 용어가 사용된다.
본원에서, "하나(a)" 및 "하나(an)"는 하나 이상을 의미하며, 즉 항목의 문법적인 대상의 하나 이상을 의미한다. 예로, "하나의 요소"는 요소 하나 또는 하나 이상의 효소를 의미한다.
용어 "유착"은 본원에서 넓게는 다른 세포, 분자 또는 다른 물질에 부착하는 세포에 사용된다.
본원에서, 용어 "침범된 세포(affected)"는 질환 소상 또는 장애를 겪고 있는 개체의 세포이며, 침범된 세포는 질병 또는 장애가 없는 개체에 비해 변형된 표현형을 가진다.
만인 세포 또는 조직이 질환 또는 장애가 없는 개체의 동일 세포 또는 조직에 비해 변형된 표현형을 가진다며, 세포 또는 조직은 질환, 손상 또는 장애에 의해 "침범된" 것이다.
질환 또는 장애의 증상 심각도, 환자가 경험하는 그러한 증상의 횟수, 또는 이들 모두가 감소된다면, 질환, 상태 또는 장애는 "완화된" 것이다.
본원에서, "아미노산"은 하기와 같이 완전한 이름으로 나타내거나 각각에 해당되는 3개의 문자로 또는 하나의 문자로 표시된다:
완전한 명칭 3 문자 단문자
아스파르트산 Asp D
글루탐산 Glu E
라이신 Lys K
아르기닌 Arg R
히스티딘 His H
타이로신 Tyr Y
시스테인 Cys C
아스파라긴 Asn N
글루타민 Gln Q
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
글리신 Gly G
알라닌 Ala A
발린 Val V
루신 Leu L
이소루신 Ile I
메티오닌 Met M
프롤린 Pro P
페닐알라닌 Phe F
트립토판 Trp W
표현 "아미노산"은 본원에서, 천연 및 합성 아미노산 모두, 그리고 D 및 L 아미노산 모두를 의미한다. "표준 아미노산"은 천연 펩티드에서 일반적으로 발견되는 20개의 표준 L-아미노산을 의미한다. "비표준 아미노산 잔기"는 임의의 그것이 천연 기원으로부터 유래되었는지 또는 합성으로 제조되었는지와 관계없이, 표준 아미노산 이외의 다른 모든 아미노산을 의미한다. 본원에서, "합성 아미노산:은 염, 아미노산 유도체(예, 아미드) 및 치환을 비제한적으로 포함하는, 화학적으로 변형된 아미노산을 포함한다. 본 발명의 펩티드에 포함된 아미노산, 특히 카르복시 말단이나 아니로 말단에 아미노산은 메틸화, 아미드와, 아세틸화 또는 그것의 활성에 나쁘게 작용하지 않으면서 펩티드의 순환 반감기를 바꿀 수 있는 다른 화학 그룹으로의 치환에 의해 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드에 인황화 결합이 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.
용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 상호 호환적으로 사용되며, 유리 아미노산과 펩티드의 아미노산 잔기를 의미할 수 있다. 그것이 유리 아미노산 또는 펩티드의 잔기를 의미하는지는 용어가 사용된 문맥으로부터 명확해질 것이다.
아미노산은 하기 일반식으로 표시된다:
Figure 112008017008019-PCT00001
아미노산은 측쇄 R에 따라 7가지 그룹으로 분류할 수 있다: (1) 지방족 측쇄; (2) 하이드록시(OH) 기를 함유하는 측쇄; (3) 황 원자를 포함하는 측쇄; (4) 산성기나 아미드기를 포함하는 측쇄; (5) 염기성 기를 포함하는 측쇄; (6) 방향족 기를 포함하는 측쇄; 및 (7) 측쇄가 아미노기와 융합된 이미노산, 프롤린.
본원에서, 용어 "보존적인 아미노산 치환"은 하기 5개의 그룹들 중 하나에서의 교체로 정의된다:
I. 소형 지방족, 무극성 또는 일부 극성 잔기:
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이들의 아미드:
Asp, Asn, Glu, Gln;
III. 극성, 양으로 하전된 잔기:
His, Arg, Lys;
IV. 크며, 지방족의 비극성 잔기:
Met Leu, Ile, Val, Cys
V. 큰 방향족 잔기:
Phe, Tyr, Trp
본 발명의 펩티드 화합물을 설명하기 위해 사용된 명명법은, 아미노기가 각 아미노산 잔기의 좌측에 있고 카르복시기가 우측에 있는, 통상적인 실무에 따른다. 본 발명의 선택된 구체적인 예를 나타내는 식에서, 아미노- 및 카르복시-말단기는 구체적으로 나타내진 않았지만, 별도로 언급되어 있지 않은 한 생리적 pH 값에서 추측되는 형태인 것으로 이해될 것이다.
용어 "염기성" 또는 "양으로 하전된" 아미노산은, 본원에서, pH 7.0에서 R기가 총 양 전하를 갖는 아미노산을 의미하며, 표준 아미노산 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 비제한적으로 포함한다.
본원에서, 화합물의 "유사체"는 예컨대 다른 것과 구조적으로는 비슷하지만 근본적으로는 이성체인 화합물(예, 5-플루오로우라실은 티민의 유사체임)이다.
본원에서, 용어 "항체"는 항원의 특정 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자를 의미한다. 항체는 천연 소스 또는 재조합 소스로부터 유래된 무손상 면역글로분리일 수 있으며, 무손상 면역글로분린의 면역반응성이 있는 부분일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글루불린 분자들로 구성된 사량체이다. 본 발명에서 항체는 예컨대 다클론 항체, 단일클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐만 아니라 단쇄 항체 및 인간화 항체 등의, 다양한 형태로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
용어 "합성 항체"는 본원에서, 예컨대 본원에 언급된 바와 같이 박테리오파지에 의해 발현시킨 항체와 같은 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조한 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 항체를 코딩하는 DNA 분자, 및 항체 단백질이나 상기 항체에 특성을 부여하는 아미노산 서열을 발현하는 DNA 분자의 합성에 의해 제조된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 상기 DNA 또는 아미노산 서열은 이용가능하며 당업계에 잘 알려진 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기법을 이용하여 수득된다.
본원에서, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 적어도 일부분 이상이 정상 세포 또는 침범된 세포에 존재하는 핵산에 상보적인 핵산 폴리머를 의미한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 및 다른 올리고뉴클레오티드 변형을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 변형된 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(U.S. Patent No: 5,034,506; Nielsen et al., 1991, Science 254: 1497). "안티센스"는 단백질을 코딩하는 이중 가닥의 DNA 분자의 비-코딩 가닥의 핵산 서열, 또는 상기 비-코딩 가닥과 실질적으로 상동한 서열을 특히 나타낸다. "본원에서, 안티센스 서열은 단백질을 코딩하는 이중가닥 DNA의 서열에 상보적이다. 안티센스 서열은 DNA 분자의 코딩 가닥의 코딩 부분에만 반드시 상보적일 필요는 없다. 안티센스 서열은 단백질을 코딩하는 DNA 분자의 코딩 가닥에서 명기된 조절 서열에 상보적일 수 있으며, 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 통제한다.
본원에서, 용어 폴리펩티드의 "생물학적으로 활성인 단편" 또는 "생활성 단편"은 이들의 천연 리간드에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 단백질의 기능을 수행할 수 있는, 저장 단백질의 천연 또는 합성 부분을 포함한다.
"대조군" 세포는 테스트 세포와 동일한 세포 타입을 가진 세포이다. 대조군 세포는, 예컨대 테스트 세포를 시험하는 시관과 동일한 시간에 또는 거의 동일한 시간에 시험할 수 있다. 또한, 대조군 세포는, 예컨대 테스트 세포를 시험하는 시간과 따라 분리된 시간에 시험할 수 있으며, 대조군 세포의 시험 결과를 기록하여, 기록된 결과는 테스트 세포의 시험으로 수득한 결과와 비교할 수 있다.
"테스트" 세포는 연구중인 세포이다.
"질병표시(pathoindicative)" 세포는 조직에 있는 경우에 조직이 위치된 동물(또는 조직을 수득한 동물)이 질병 또는 장애를 앓고 있음을 표시하는 세포이다.
"병적" 세포는 조직에 있는 경우에 조직이 위치된 동물(또는 조직을 수득한 동물)에 질병 또는 장애를 유발 또는 기여하는 세포이다.
하나 이상의 세포가 질병 또는 장애를 앓지 않는 동물의 조직에 존재한다면, 조직은 세포를 "정상적으로 포함한다:.
용어 "경쟁적인 서열"은 이의 동계 결합 부위에 대해 다른 펩티드와 경쟁하는 펩티드, 이의 변형체, 단편, 유도체 또는 유사체를 의미한다.
"상보적"은 광의적으로는, 2개의 핵산 가닥 간에, 또는 동일한 핵산 가닥의 2 영역간의 서열 상보성을 의미하다. 제1 핵산 영역의 아데닌 잔기는 티민 또는 우라실인 제1 영역의 반대 제2 핵산 영역의 잔기와 특이적인 수소 결합("염기쌍")을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 본원에서, 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 염기쌍 규칙에 따라 관련된 폴리뉴클레오티드(즉, 뉴클레오티드의 서열)을 참조하는데 사용된다. 예컨대, 서열 "A-G-T"는 서열 "T-C-A"과 상보적이다.
유사하게, 제1 핵산 가닥의 시토신 잔기는 제1 가닥의 반대쪽 제2 핵산 가닥의 잔기가 구아닌이라면 이 잔기와 염기 쌍을 이룰 수 있는 것으로 알려져 있다. 2 영역을 역방향 양상으로 정렬하였을 때, 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기가 제2 영역의 잔기와 염기 쌍을 이룰 수 있다면, 핵산의 제1 영역은 동일한 또는 다른 핵산의 제2 영역과 상보적이다. 바람직하게는, 제1 영역은 제1 부분을 포함하며, 제2 영역은 제2 부분을 포함하며, 그로 인해, 제1 및 제2 부분이 역방향으로 정렬하였을 때, 제1 부분의 뉴클레오티드 잔기의 적어도 약 50%, 바람직하기로는 적어도 약 75%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%는 제2 부분에 있는 뉴클레오티드 잔기와 염기 쌍을 이룰 수 있다. 더 바람직하기로는 제1 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기는 제2 부분의 뉴클레오티드 잔기들과 염기 쌍을 이룰 수 있다.
용어 "복합체"는 본원에서 단백질에 대해 사용되며, 2 이상의 단백질의 결합 또는 상호작용을 나타낸다. 복합체 형성 또는 상호작용은 결합, 3차 구조 변화 및 단백질의 예컨대 인산화에 의한 변형과 같은 것을 포함할 수 있다.
본원에서, "화합물"은 약물로 통상적으로 간주되는 임의 타임의 기질 또는 물질, 또는 약물, 폴리펩티드, 분리된 핵산 및 항체로서 사용하기 위한 후보물질, 또는 본 발명의 방법에 사용되는 그외 물질, 뿐만 아니라 이들의 임의 조합을 의미한다.
본원에서, "검출가능한 마커" 또는 "리포터 분자"는 마커 없이도 유사한 화합물의 존재하에 마커를 포함하는 화합물의 특이적인 검출이 가능한, 원자 또는 분자이다. 검출가능한 마커 또는 리포터 분자는, 예컨대 방사능 동위원소, 항원 결기, 효소, 혼성화에 이용가능한 핵산, 발색단, 형광발색단, 화학발광 분자, 전기화학적으로 검출가능한 분자 및 변형된 형광-분극화 또는 변형된 광-산란을 위한 분자를 포함한다.
"질병"은 동물이 항상성을 유지할 수 없으며, 만일 질병이 완화되지 않으면 동물의 건강이 계속 악화될 수 있는, 동물의 건강 상태이다.
반대로, "장애"는 동물에서 동물이 항상성을 유지할 수는 있지만 동물의 건강 상태가 장애가 없는 경우보다는 좋지 않은, 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치하면, 장애가 반드시 동물의 건강 상태를 약화시키는 것은 아니다.
"코딩하는"은 규정된 뉴클레오티드 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 규정된 아미노산 서열 중 어느 하나와, 그로부터 형성되는 생물학적 특성을 가진, 생물학적 프로세스에서 다른 폴리머 및 마크로분자의 합성에 주형으로 제공하기 위한, 유전자, NA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드에서의 구체적인 뉴클레오티드 서열의 유전 특성을 나타낸다. 따라서, 유전자에 해당되는 mRNA의 전사 및 번역으로 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질이 생산된다면, 상기 유전자는 단백질을 코딩하는 것이다. mRNA 서열과 동일하며 통상적으로 서열목록으로 제공되는 뉴클레오티드 서열인 코딩 가닥과, 유전자 또는 cDNA의 전사하기 위한 주형으로서 사용되는 비-코딩 가닥, 둘 다 상기 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 그외 산물을 코딩하는 것으로 언급할 수 있다.
별도로 언급되어 있지 않으면, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로 겹침 버전(degenerate version)이 있지만 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"인핸서"는 전사 개시부에서의 인핸서의 거리 또는 위치와 상관없이, 전사 효율을 증가시킬 수 있는 DNA 조절 요소이다.
본원에서, 특정 단백질 또는 펩티드의 "본질적으로 순수한" 조제물은 조제물내 단백질 또는 펩티드의 적어도 약 95 중량%, 바람직하기로는 적어도 약 99 중량%가 특정 단백질 또는 펩티드인, 조제물이다.
"단편" 또는 "절편"은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 일부분, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열의 일부분이다. 용어 "단편" 및 "절편"은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
본원에서, "기능적인" 생물 분자는 이것을 특정화하는 특성 또는 활성을 보이는 형태의 생물 분자이다. 기능적 효소는, 예컨대 효소를 특정화하는 특징적인 촉매 활성을 보이는 효소이다.
본원에서, "상동적인"은 2개의 폴리머 분자간의, 예컨대 2개의 핵산 분자들 간의, 예컨대 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자들간의 또는 2개의 폴리펩티드 분자 간의 서브유닛 서열 동일성(similarity)이다. 2개의 분자 둘다에서의 서브유닛 위치에 동일한 단량성 서브유닛이 있는 경우, 예컨대 2개의 DNA 분자 각각의 위치에 아데닌이 있다면, 이들은 그 위치에서 상동적이다. 2개의 서열사이의 상동성은 매칭 또는 상동성 위치 갯수에 대한 직접적인 함수이며, 예컨대 2개의 화합물 서열에서 위치의 절반(예, 10개의 서브유닛의 폴리머에서 5곳)이 상동성이라면, 2개의 서열은 50% 상동적이며, 위치의 90%, 예컨대 10개 중 9개가 매치되거나 상동적이면, 2개의 서열은 90% 상동성을 공유한다. 예컨대, DNA 서열들 3'ATTGCC5'와 3'TATGGC는 50% 상동성을 공유한다.
본원에서, "상동성"은 "동일성"과 상호 호환적으로 사용된다.
2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간의 동일성 % 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다. 예로, 2개의 서열 비교에 사용가능한 수학적 알고리즘은, Karlin 및 Altschul(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)에서와 같이 변형된 Karlin 및 Altschul(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)의 알고리즘이 있다. 이 알고리즘은 Altschul, et al. (1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 통합되었으며, 예컨대 국립 생물공학 정보 센터(NCBI)의 월드 와이드 웹 사이트에서 조사할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은, 본원에 언급된 핵산과 상동적인 뉴클레오디스 서열을 억하기 위해, 다음과 같은 매개변수를 이용하여 NBLAST 프로그램(NCBI 웹 사이트에 "blastn"로 명기되어 있음)으로 수행할 수 있다: 갭 패널티= 5; 갭 확장 패널티 = 2; 미스매치 패널티 = 3; 매치 보상 = 1; 기대값 10.0; 및 글자 크기 = 11. BLAST 단백질 검색은, 본원에 언급된 단백질 분자와 상동적인 아미노산 서열을 얻기 위해, 하기 매개변수를 이용하여 XBLAST 프로그램(NCBI 웹 사이트에 "blastn"로 명기되어 있음) 또는 NCBI "blastp" 프로그램으로 수행할 수 있다: 기대값 10.0, BLOSUM62 스코링 매트릭스. 비교 목적으로 갭이 들어간 정렬을 수행하기 위해, Gapped BLAST를 Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 언급된 바와 같이 이용할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast 또는 PHI-Blast를 이용하여, 분자간 거리 관계(Id.) 및 공통된 양상을 공유하고 있는 분자들간의 관계를 검출하는, 반복 검색(iterated search)을 수행할 수 있다. BLAST, Gapped BLAST, PSI-Blast, 및 PHI-Blast 프로그램을 이용할 때, 해당 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수를 사용할 수 있다.
2가지 서열간의 동일성%는 전술한 기법과 유사한 기법으로 갭이 존재 또는 존재하지 않은 형태로 결정할 수 있다. 동일성 % 계산에서, 전형적으로 정확한 매치만 계수한다.
용어 "저해한다"는 본원에서 기재된 기능을 감소 또는 방해하는 화합물 또는 임의 물질의 능력을 의미한다. 바람직하기로는, 저해는 적어도 10% 이상, 더 바람직하기로는 25% 이상, 보다 더 바람직하기로는 50% 이상이며, 가장 바람직하기로는 기능이 75% 이상 저해된다.
용어 "복합체를 저해한다"는 본원에서 2개 이상의 단백질들의 복합체 형성 및 상호작용의 저해 뿐만 아니라 상기 복합체의 기능 또는 활성 저해를 의미한다. 또한, 상기 용어는 형성된 복합체의 파괴를 포함한다. 그러나, 이 용어는 동시에 이들 기능 모두가 저해되어야 하는 것을 내포하진 않는다.
용어 "단백질을 저해한다"는 본원에서 단백질의 합성, 수준, 활성 또는 기능을 저해하는 임의 방법 또는 기법 뿐만 아니라 대상 단백질의 합성, 수준, 활성 또는 기능의 유도 또는 자극을 저해하는 방법을 의미한다. 또한, 상기 용어는 대상 단백질의 합성, 수준, 활성 또는 기능을 조절할 수 있는 모든 대사 경로 또는 조절 경로를 의미한다. 이 용어는 다른 분자와의 결합 및 복합체 형성을 포함한다. 따라서, 용어 "단백질 저해자"는 적용시 단백질 기능 또는 단백질 경로 기능의 저해를 초래하는, 모든 물질, 화합물을 의미한다. 그러나, 상기 용어는 이들 기능 각각이 모두 동시에 저해되어야 함을 내포하지는 않는다.
"분리된 핵산"은 자연적으로 형성되는 상태에서 측면에 있는 서열로부터 분리된 핵산 절편 또는 단편, 예컨대 정상적으로 상기 단편에 인접한 서열, 예컨대 자연적으로 형성되는 게놈내에서 상기 단편에 인전합 서열로부터 분리된 DNA 절편을 의미한다. 또한, 상기 용어는 자연적으로 핵산을 수반하는 다른 성분, 예컨대 세포내에서 본래 이를 수반하는 RNA, DNA 또는 단백질로부터 실질적으로 정제된 핵산에 해당된다. 따라서, 상기 용어는, 예컨대 벡터에 통합된 재조합 DNA, 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스에 통합된 재조합 DNA, 또는 진핵 또는 원색 생물의 게놈 DNA에 통합된 재조합 DNA, 또는 다른 서열과 독립적인 별개의 분자(예, cDNA, 또는 PCR나 제한 효소 절단에 의해 생산된 게놈 단편 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한, 이는 추가적인 폴리펩티드 서열을 코딩하는 잡종 유전자의 일부분인 재조합 DNA를 포함한다.
별도로 언급되어 있지 않다면, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로 겹침 버전이며 동일한 아미노산 셔얼을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
본원에서, "학습 자료"는 본원에 언급된 다양한 질병 또는 장애의 완화를 수행하기 위한 키트에서, 본 발명의 화합물의 유용성을 전달하기 위하여 사용할 수 있는 공개문헌, 기록, 다이아그램 또는 그외 다른 발현 매질을 포함한다. 선택적으로 또는 대안적으로, 학습 자료는 포유류의 세포 또는 조직에서 질환 또는 장애를 완화시키는 한가지 이상의 방법을 설명할 수 있다. 본 발명에 따른 키트의 학습 자료는 예컨대 본 발명의 동정된 화합물을 포함하고 있는 용기에 부착될 수 있으며, 또는 동정된 화합물을 포함하고 있는 용기와 함께 이동될 수 있다. 대안적으로, 학습 자료는 학습 자료 및 화합물을 함께 수여자가 이용하게 하는 의도로, 용기와는 별도로 이송될 수도 있다.
본원에서, "리간드"는 타겟 화합물이나 분자에 특이적으로 결합하는 화합물이다. 리간드가 작용할 때 화합물에 "특이적으로 결합하는" 리단드 또는 화합물과 "특이적으로 반응하는" 리간드는 혼성 화합물의 샘플내 화합물의 존재를 결정한다.
본원에서, 용어 "연결(linkage)"은 2개의 그룹 사이의 연결을 의미한다. 연결은 공유 또는 비공유적일 수 있으며, 비제한적으로, 이온 결합, 수소 결합 및 소수성/친수성 상호작용이 있다.
본원에서, 용어 "링커"는 이온 결합, 수소 결합 또는 반 데르 발스 상호작용을 통해, 공유적으로 또는 비공유적으로 2개의 서로 다른 분자를 연결하는 분자를 의미한다.
본원에서, 용어 "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및 이중 가닥의 DNA 및 cDNA를 포함한다. 나아가, 용어 "핵산", "DNA," "RNA" 및 유사어는 또한, 핵산 유사체, 즉 포스포다이에스테르 벡본 이외의 다른 것을 가진 유사체를 포함한다. 예로, 소위 "펩티드 핵산"은 당업계에 공지된 것으로, 벡본에 포스포다이에스테르 결합 대신 펩티드 본드가 있으며, 이는 본 발명의 범위에 포함된다. "핵산"은, 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드로 구성되었던 간에, 그리고 포스포다이에스테르 연결 또는 변형된 연결, 예컨대 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 실록산, 카보네이트, 카복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카바메이트, 티오에테르, 브릿지 형성된 포스포르아미데이트, 브릿지 형성된 메틸렌포스포네이트, 브릿지 형성된 포스포르아미데이트, 브릿지 형성된 포스포르아미데이트, 브릿지 형성된 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 브릿지 형성된 포스포로티오에이트 또는 설폰 연결, 및 이들 연결의 조합으로 구성되었던지 간에, 모든 핵산을 의미한다. 또한, 용어 핵산은 구체적으로 5개의 생물에서 형성되는 염기(아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 유라실) 이외의 다른 염기로 구성된 핵산도 포함한다. 본원에서는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타내기 위해 통상적인 표시법을 이용한다: 단일가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5'-끝이고, 이중가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향은 5'-방향이라고 한다. 신생 RNA 전사체에 5'에서 3' 방향으로의 뉴클레오티드 첨가를 전사 방향이라고 한다. mRNA와 동일한 서열을 가진 DNA 가닥을 "코딩 가닥"이라고 하며, DNA에서 기준점으로부터 5'에 위치한 DNA 가닥의 서열을 "상류 서열"이라고 하며, DNA에서 기준점으로부터 3'에 위치한 DNA 가닥의 서열은 "하류 서열"이라고 한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 전형적으로 짧은 폴리뉴클레오티드, 통상 50개 이하의 뉴클레오티드를 의미한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C)로 표시되는 경우, 이는 "T" 대신 "U"가 치환된 RNA 서열(즉, A, U, G, C)을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
"작동가능하게 연결된"은 성분들이 그것의 통상적인 기능을 수행하도록 구성된 병렬을 의미한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열 또는 프로모터는 상기 코딩 서열의 발현을 실시할 수 있다. 2개의 폴리뉴클레오티드를 "작동가능하게 연결된"것으로서 언급하는 것은, 단일가닥 또는 이중가닥 핵산 모이어티가, 상기 2개의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나가 다른 것과 특징적인생리 작용을 발휘할 수 있는 방식으로 핵산 모이어티내에 정렬된 2개의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 의미한다. 예컨대, 유전자의 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 프로모터는 상기 코딩 영역의 전사를 촉진시킬 수 있다.
용어 "PAK 기능"은 본원에서 p21-활성화된 키나제의 모든 활성 또는 기능을 의미하며, 비제한적으로 다른 분자와의 PAK 결합, 키나제 활성, 자가인산화, 전좌, 다른 분자에 의한 활성화 등을 포함한다. "PAK 기능"은 본원에서 "PAK 활성"과 상호 호환적으로 사용된다. 본원에서, "PAK의 저해"는 PAK 합성 저해를 포함한, PAK의 모든 활성 또는 기능 저해를 의미한다.
용어 "PAK-차단 펩티드" "TAT-PAK-N-말단 펩티드" 및 "Nck-차단 펩티드는 서열번호 6의 펩티드이며, 이 용어들은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다. 서열번호 7은 서열번호 6의 구성 요소이다.
용어 "PAK-차단 펩티드", "PAK-결합 펩티드" 등은 본원에서 PAK의 PIX과의 상호작용을 차단하는 펩티드, 예컨대 서열번호 4의 펩티드를 의미하며, 이러한 용어들은 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "펩티드"는 전형적으로 짧은 폴리펩티드를 의미한다.
"폴리펩티드"는 아미노산 잔기로 구성된 폴리머, 자연적으로 형성되는 관련 구조 변이체, 및 펩티드 결합을 통해 연결된 이의 자연적으로 형성되지 않는 합성 유사체, 자연적으로 형성되는 관련 구조 변이체 및 이의 자연적으로 형성되지 않는 합성 유사체를 의미한다. 합성 폴리펩티드는 예컨대 자동 폴리펩티드 합성기를 이용하여 합성할 수 있다.
용어 "단백질"은 전형적으로 큰 폴리펩티드를 의미한다.
"재조합 폴리펩티드"는 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현으로 생산된 것이다.
펩티드는 2개 이상의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 아미노산은 자연적으로 형성되거나 또는 합성된(자연적으로 형성되지 않는) 아미노산이다. 펩티드 모방체는 하기와 같은 하나 이상의 변형을 가진 펩티드이다:
1. 하나 이상의 펩티딜 --C(O)NR-- 연결(결합)이, R이 C1-C4 알킬인, --CH2-카바메이트 연결(--CH2OC(O)NR--), 포스포네이트 연결, -CH2-설폰아미드(-CH2--S(O)2NR--) 연결, 유레아(--NHC(O)NH--) 연결, --CH2-2급 아민 연결 또는 알킬화된 펩티딜 연결(--C(O)NR--) 등의 비-펩티딜 연결로 치환된 펩티드;
2. N-말단이, R 및 R1이 수소 또는 C1-C4 알킬이고 단 R과 R1 둘다가 수소는 아닌, --NRR1 기, -- NRC(O)R 기, --NRC(O)OR 기, --NRS(O)2R 기, --NHC(O)NHR 기로 유도체화된, 펩티드;
3. C-말단이, R2가 C1-C4 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택된 --C(O)R2, 및 R3 및 R4가 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 --NR3R4로 유도체화된, 펩티드.
용어 "투과성"은 본원에서 세포 및 조직 사이에 또는 이들을 통한 유체, 세포 또는 파편 이동을 의미한다.
본원에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 포스페이트 완충화된 염수액, 물, 오일/물 또는 물/오일 에멀젼과 같은 에멀젼 및 다양한 타입의 습윤제 등의 모든 표준 약제 담체를 포함한다. 도한, 상기 용어는 인간을 포함한 동물에서의 사용을 위해 US 연방 정부의 관리 기관에 의해 승인되었거나 또는 US 약전에 기재된 모든 물질을 포함한다.
본원에서, 말단 아미노기에 대한 "보호기"는 펩티드의 말단 아미노기가 펩티드 합성에서 전통적으로 사용되는 다양한 임의 아미노-말단 보호기로 커플링된, 펩티드의 말단 아미노기를 의미한다. 이러한 보호기는, 예컨대 포르밀, 아세틸, 벤조일, 트리플루오로아세틸, 숙시닐 및 메톡시숙시닐과 같은 아실 보호기; 벤질옥시카릅보닐과 같은 방향족 우레탄 보호기; 지방족 우레탄 보호기, 예, tert-부톡시카릅보닐 또는 아다만틸옥시카르보닐을 포함한다. 적합한 보호기로 Gross and Mienhofer, eds., The Peptides, vol. 3, pp. 3-88 (Academic Press, New York, 1981)를 참조한다.
본원에서, 말단 카르복시기와 관련하여 "보호기"는 말단 카르복시기가 다양한 임의 카르복시-말단 보호기가 커플링된, 펩티드의 말단 카르복시기를 의미한다. 이러한 보호기로는 예컨대 tert-부틸, 벤질 또는 그외 에스테르나 에테르 결합을 통해 말단 카르복시기에 연결된 수용가능한 기를 포함한다.
본원에서, 용어 "정제된" 및 유사 용어는 천연 조건에서 분자나 화합물과 정상적으로 조합되는 다른 성분에 비해 분자 또는 화합물이 농화된 것을 의미한다. 용어 "정제된"은, 처리 과정 동안에 특정 분자가 완전히 순수해지는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. "고 정제된" 화합물은 본원에서 화합물의 순도가 90% 이상인 것을 의미한다.
용어 "단백질 조절 경로"는 본원에서, 단백질을 조절하는 상류 조절 경로 뿐만 아니라 단백질이 조절하는 하류 현상 모두를 의미한다. 이러한 조절은, 비제한적으로, 대상 단백질의 전사, 번역, 수준, 활성, 번역후 수정 및 기능 분만 아니라 단백질이 조절하는 하류 현상도 포함한다.
용어 "단백질 경로" 및 "단백질 조절 경로"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "조절한다"는 대상 기능이나 활성을 자극 또는 저해하는 것을 의미한다.
용어 "특이적으로 결합한다"는 본원에서, 특정 단백질을 인지 및 결합하지만 샘플내 다른 분자는 실질적으로 인지하거나 결합하지 않는 화합물을 의미하거나, 또는 세포 조절 과정의 한 파트로서 2개 이상의 단백질들 간의 결합을 의미하는데, 상기 단백질은 샘플내에서 다른 단백질을 실질적으로 인지하거나 결합하지 않는다.
용어 "표준"은 본원에서 비교용으로 사용되는 무엇을 의미한다. 예컨대, 표준은 테스트 샘플내 화합물을 측정할 경우에 비교 결과로 사용되며 대조군 샘플에 투입 또는 첨가되는, 공지된 표준 물질 또는 화합물이다. 또한, 표준은, 대상 마커를 측정하기 전에 샘플을 정제 또는 추출 과정으로 처리 또는 수행할 때, 샘플에 인지된 함량으로 첨가되며, 그러한 것을 정제 또는 회수율로서 결정하는데 유용한 물질 또는 화합물과 같은 "내부 표준"이라고도 할 수 있다.
진단 또는 치료의 "개체"는 인간을 포함한 포유류이다.
본원에서, 용어 "치료하는"은 구체적인 질환, 장애 또는 상태의 예방, 또는 특정 질환, 장애 또는 상태와 관련된 증상의 완화 및/또는 상기 증상의 방지 또는 제거를 포함한다. "예방" 치료제는 질병과 관련된 병리가 발생할 위험성을 줄이기 위해, 질병 사인을 보이지 않거나 또는 질병의 초기 사인만 나타내는 개체에게 투여되는 치료제이다.
"치료적" 치료제는 병적 사인을 약화하거나 또는 제거하기 위한 목적으로 병적 사인을 나타내는 개체에게 투여되는 치료제이다.
화합물의 "치료적 유효량"은 화합물을 투여하였을 때 개체에 유익한 효과를 제공하기에 충분한 화합물의 함량이다.
표현 "혈관 누출 관련 질환 또는 장애" 등은 본원에서 혈관 누출과 관련있거나 혈관 누출을 발생시키는 질환, 장애, 손상 또는 병리학적 상태를 의미한다. 따라서, 이 표현은 혈관 누출이 이루어진 모든 상태를 의미한다. 혈관 누출 또는 혈관 투과성 변화는 수많은 질환, 장애, 손상 및 병리학적 상태에서 발생한다. 예컨대, 이러한 병리학적 상태 또는 자극은, 비제한적으로, 조직 손상, 허혈증, 염증, 발작, 상처 치유, 급성 호흡 곤란 증후군, 고혈압, 심근경색, 패혈증, 저산소증, 감염, 알레르기 반응, 열손상, X-조사 및 자외선 조사를 포함한다. 또한, 혈관 누출운 수많은 질환들에서 국소 조직 염증과 관련있다. 용어 "혈관 누출 관련 질환 또는 장애"는 "혈관 투과성 관련 질환 또는 장애"와 상호 호환적으로 사용된다.
본 발명의 구현예
본 발명은 혈관 투과성을 조절하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 부분적으로는 PAK 기능 차단이 혈액 누출을 저해한다는 발견을 토대로 한다. 일 측면으로, 손상에 대한 반응으로 인한 혈액 누출이 저해된다. 또한, 본 발명은 미오신 경쇄 인산화의 유도와 같은 PAK의 활성이 MEK 및 Erk에 의해 매개된다는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Erk가 PAK을 통해 활성화됨을 개시한다. 또한, 본 발명은 Erk의 활성화에는 PAK, PIX 및 GIT1간의 완전한 복합체가 필요하며, 이후 MEK을 통해 작용한다는 것을 개시한다. 따라서, 본 발명은 혈관 투과성의 자극을 저해하고 MEK 및 Erk 경로를 통해 작용하기에 때문에 복합체를 파괴하기 위한, PAK/PIX/GIT1 복합체를 파괴하는 수단에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 증가된 혈관 투과성을 저해하기 위한 수단으로서 Erk 활성화 또는 그 경로를 저해하는 것을 포함한다.
일 예로, 본 발명은 PAK의 PIX 결합을 차단함으로써 혈관 투과성을 저해하는 방법을 제공한다. 일 측면으로, 본 발명은 PAK의 PIX 결합을 차단하는 펩티드를 제공한다. 일 측면으로, 펩티드는 서열번호 1-4로 이루어진 군으로부터 선택된 서열, 및 이의 상동체, 유도체 및 변형체를 갖는다.
일 예로, 본 발명은 GIT와 MEK의 상호작용을 저해함으로써 혈관 투과성을 저해하는 방법을 제공한다. 본 발명은 비제하적으로, 펩티드, 항체 및 siRNA 등의 저해자를 제공한다.
일 예로, 본 발명은 PIX의 GIT 결합을 차단함으로써 혈관 투과성을 저해하는 방법을 제공한다. 일 특면으로, GIT는 GIT1이다. 다른 측면으로, GIT는 GIT2이다. 일 측면으로, 본 발명은 PIX의 GIT 결합을 차단하는 펩티드를 제공한다. 일 측면으로, 상기 펩티드는 서열번호 2의 서열을 포함한다. 일 측면으로, PIX은 PIXα이다. 다른 측면으로, PIX은 PIXβ이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 사용하기 위한 다른 PAK 조절자를 포함한다. 추가적인 PAK 조절자를 동정하기 위해 사용가능한 분석방법은 본원 및 미국 특허 6,248,549와 미국 공개공보 20040138133에 기재되어 있으며, 이들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 예로, PAK 활성 또는 기능의 조절자는 다른 단백질 또는 분자가 PAK과 결합하는 것을 차단할 수 있다. 일 측면으로, 상기 조절자는 다른 단백질 또는 분자와 결합하여 이들이 PAK과 상호작용하는 것을 저해한다. 다른 측면으로, 조절자는 PAK에 결합하여, 다른 단백질이나 분자가 PAK에 결합하는 것을 저해한다. 일 측면으로, 본 발명의 저해자는 PAK의 PIX과의 상호작용을 저해한다. 일 측면으로, 저해자는 펩티드이다. 일 측면으로, 펩티드는 서열번호 4를 포함하는 서열, 또는 생물학적 활성 단편, 상동체, 변형체 또는 유도체를 가진다. 다른 측면으로, 상기 펩티드는 서열번호 4이거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 상동체, 변형체 또는 유도체이다.
일 예로, 본 발명의 저해자는 PIX-GIT 복합체 형성을 저해한다. 다른 측면으로, PIX-GIT 복합체의 기능이 저해된다. 일 측면으로, 본 발명의 저해자는 PIX-GIT 복합체를 PAK의 Erk 활성화 하류 촉진으로부터 저해한다. 다른 측면으로, 본 발명의 저해자는 팩-지 복합체를 PAK의 MLCK 활성화 하류 촉진으로부터 저해시킨다. 일 측면으로, 상기 저해자는 펩티드이다. 일 측면으로, 상기 펩티드는 서열번호 4이거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편, 상동체, 변형체 또는 유도체이다.
일 예로, 본 발명의 저해자는 PAK/PIX/GIT 복합체의 형성을 저해한다. 다른 예로, 본 발명의 저해자는 PAK/PIX/GIT/MEK 복합체 형성 또는 기능을 저해한다.
본 발명은 본원에서 동정된 경로를 차단하기 위한 siRINA의 용도에 관한 것이다. 일 측면으로, siRNA는 GIT1에 대한 것이다. 다른 측면으로 제1 siRNA는 제1 siRNA과 서열이 일부 상이한 제2 siRNA와 함께 사용할 수 있으며, 또는 제2 siRNA는 완전히 다른 서열에 대한 것일 수 있다. 일 측면으로, GIT1에 대한 siRNA는 서열ㄹ번호 8-11로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 본 발명의 siRNA는 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 본원의 펩티드를 코딩하는 핵산, 아프타머(aptamer), 항체, 키나제 저해자 및 약물/제제/화합물과 같은, 본원에 기재되거나 당업계에 공지된, 다른 조절자와 함께 사용될 수 있다.
수많은 분석 방법 및 방법은 본 발명에 개시되어 있으며, 당업자들이 화합물이 PAK, PIX, GIT, MEK, Erk, 및 MLCK의 신호 전달 및 조절 경로의 구성 요소를 조절하는지를 모니터할 수 있는 당업계에 공지되어 있으며, 이들 분석 방법 및 방법은 본 발명의 방법에 포함된다. 또한, 이들 방법은 단백질과 펩티드의 조절자를 동정하는데 이용가능하다.
예로, PAK의 활성 및 기능은 PAK 인산화 및 세포-세포 정션으로의 전좌를 분석함으로써, 모니터링할 수 있다. 이러한 분석 방법은 Schwartz et al. (U.S. Pat. Pub. No. 2005/0233965, Published 10/20/05; 이는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 개시되어 있다. PAK-1, -2, 및 -3은 AID라고 하는 조절성 N 말단의 서열과 키나제 도메인과의 상호작용을 통해 무활성의 구조를 유지하고 있다(Bokoch et al., Annu. Rev. Biochem., 2003, 72:743). PAK에 활성화된 락 또는 씨42가 결합하면, PAK 키나제 활성의 지속적인 증가를 부여하는 몇가지 부위의 자가 인산화가 유도된다(Gatti et al., J. Biol. Chem., 1999, 274:32565; Chong et al., J. Biol. Chem., 2001, 276:17347). 이러한 부위들 중, PAK 2의 Ser141(PAK1의 Ser144에 해당됨)은 AID내에 있으며, 이의 인산화는 AID와 키나제 도메인간의 상호작용을 차단함으로써 활성화에 기여한다. 내피 세포에서의 활성화된 PAK을 위치시키기 위해, 인산화된 Ser141 부위를 특이적으로 인지하는 항체를 사용할 수 있다.
테스트 화합물/저해제에 대한 반응으로 인한 내피 세포에서의 PAK 인산화를 조사하기 위해, 18시간 동안 혈청-결핍(0.5% 혈청)한 후 10% 혈청으로 자극시킨, 컨플루언트 소 대동맥 및 인가 제대혈 내피 세포(각각 BAEC 및 HUVEC)를 이용하여 상기 화합물은 혈청 효과에 대해 비교할 수 있다. 항-포스포-PAK Ser141 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 이용하여 PAK 인산화의 변화를 분석할 수 있다. 유가하게 처리한 세포를 항-포스포-PAK Ser141 (pPAK)으로 형광 염색한 것을 사용하고, 단백질의 활성화된 분획이 주로 세포-세포 정션에 위치되었는지를 분석함으로써, 혈청, 무처리 및 테스트 화합물에 대한 반응에 따른 PAK 인산화 변화를 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 단백질의 조절자 및 경로를 동정하기 위한, 효모 2-혼성 시스템(yeast two-hybrid system)의 이용을 포함한다. 상기한 조절자는 약물, 화합물, 펩티드, 핵산 등일 수 있다. 상기한 조절자는 내인성 조절자를 포함할 수 있다.
일반적으로, 효소 2-혼성 분석은 새로운 단백질-단백질 상호작용 및 상기 상호작용을 변이시키는 화합물을 동정할 수 있다. 여러가지 다수의 단백질을 잠재적인 결합 파트너로 이용함으로써, 이전에 특정화되지 않았던 상호작용을 검출할 수 있다. 두번째로, 효소 2-혼성 분석은 이루어지는 것으로 이미 공지된 상호작용을 특정화하는데 사용할 수 있다. 특정화는, 절단형 단백질을 이용하여 단백질의 어느 도메인이 상호작용에 작용하는지, 또는 세포내 환경을 변형시켜 어떤 조건에서 상호작용이 이루어지는지를, 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 분석은 상호작용의 모듈레이터를 스크리닝하는데도 사용할 수 있다.
본 발명은 화합물을 스크리닝하여, 본원의 단백질 상호작용 및 경로의 작용제(자극) 또는 길항제(저해)로 작용하는 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 길항제 후보 화합물에 대한 스크리닝 분석은 본원에 기재된 펩티드에 결합하거나 복합체를 이루거나, 또는 펩티드와 다른 세포 단백질과의 상호작용을 방해하는 화합물을 동정하기 위한 것이다. 이러한 스크리닝 분석은, 특히 소형 분자 약물 후보물을 동정하는데 적합하게 하는 화학 라이브러리의 고성능 스크리닝으로 수정가능한 분석을 포함한다.
분석은 단백질-단백질 결합 분석, 생화학적 스크리닝 분석, 면역분석 및 세포성 분석 등과 같은 다양한 포맷으로 수행할 수 있으며, 이는 당업계에서 잘 특정화되어 있다.
길항제에 대한 모든 분석은 2개의 구성 요소들간에 상호작용을 가능하게 하는 충분한 조건 및 시간 동안, 본원에서 동정된 펩티드를 후보 화합물이나 약물과 접촉시키는 것이 일반적이다.
결합 분석에서, 상호작용은 결합이며, 형성된 복합체는 반응 혼합물에서 분리 또는 검출할 수 있다. 특정 예에서, 본원에 기재된 복합체들의 펩티드들 중 하나 또는 테스트 화합물 또는 약물 후보물질은 고형상, 예컨대 마이크로타이터 플레이트에, 공유 또는 비공유 부착에 의해 고정된다. 일반적으로, 비공유 부착은 펩티드 및 약물 용액을 고성 표면에 코팅함으로써 달성된다. 대안적으로, 고정될 펩티드에 특이적인 고정된 항체, 예컨대 단일클론 항체를 사용하여, 이를 고형 표면에 고정할 수 있다. 분석은 검출가능한 표지물로 표지할 수 있는 비-고정화된 구성 요소를 고정된 구성 요소, 예컨대 고정된 구성 성분을 포함하고 있는 코팅된 표면에 가함으로써, 수행된다. 반응이 완료되면, 미-반응 구성 요소는, 예컨데 헹굼에 의해 제거하고, 고형 표면에 고정된 복합체만 검출한다. 비-고정화된 구성 성분이 본래 검출가능한 표지를 가지고 있는 경우에, 표면에 고정화된 표지물이 검출되면 이는 복합체화가 이루어졌음을 의미한다. 비-고정화된 구성 성분이 본래 표지물을 가지고 있지 않는 경우에는, 복합체화는 예컨대 상기 고정화된 복합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 이용하여 검출할 수 있다.
만일 대상 후보 화합물이 본원에 기재된 특정 펩티드와 상호작용하지만 결합하지는 않는다면, 상기 펩티드와의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 것으로 잘 알려진 방법에 의해 분석할 수 있다. 이러한 분석은, 예컨대 가교, 공동-면역침강 및 농도 구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 공동-정제와 같은 전통적인 접근 방법을 포함한다. 또한, 단백질-단백질 상호작용을 Fields 및 동료(Fields and Song, Nature (London), 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991))의 효소를 이용한 유전자 시스템을 이용하여, Chevray 및 Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)에 개시된 바와 같이, 모니터링할 수 있다. 2-혼성 기법을 이용하여 2개의 특이적인 단백질간의 단백질-단백질 상호작용을 동정하기 위한 완전한 키트를 이용할 수 있다. 또한, 이러한 시스템은 특이적인 단백질 상호작용에 참여되는 단백질 도메인의 맵을 작성하고, 뿐만 아니라 이들 상호작용에 중요한 아미노산 잔기의 위치를 특정화하는데 까지 확장될 수 있다.
본원에서 동정된 펩티드의 상호작용을 간섭하는 화합물 및 그외 세포내 또는 세포외 구성 요소를 하기와 같이 시험할 수 있다: 통상적으로, 유전자 산물 및 세포내 또는 세포외 구성 요소를 포함하는 반응 혼합물을 2종의 산물들의 상호작용 및 결합을 허용하는 조건 및 시간동안에 준비한다. 후보 화합물이 결합을 저해하는 능력을 테스트하기 위해, 반응은 테스트 화합물이 존재하거나 없는 상태에서 진행한다. 또한, 위약을 세번째 반응 혼합물에 첨가하여, 양성 대조군으로 사용한다. 상기 혼합물에 존재하는 테스트 화합물과 세포내 또는 세포외 구성 요소간의 결합(복합체 형성)은 전술한 바와 같이 모니터링한다. 테스트 화합물을 포함하는 반응 혼합물이 아닌 대조군 반응물(들)에서의 복합체 형성은, 테스트 화합물이 테스트 화합물과 이의 반응 파트너와의 상호작용을 간섭함을 의미한다.
길항제를 분석하기 위해, 펩티드를 특정 활성에 대해 스크리닝할 화합물과 함께 세포에 첨가할 수 있으며, 펩티드의 존재하에 대상 활성을 저해하는 화합물의 능력은 펩티드에 대한 길항성이다. 펩티드는 방사능 등으로 표지할 수 있다.
본 발명은 phylomers® 이용 및 역 효소 2-혼성 분석(Watt, 2006, Nature Biotechnology, 24:177; Watt, U.S. Pat. No. 6,994,982; Watt, U.S. Pat. Pub. No. 2005/0287580; Watt, U.S. Pat. No. 6,510,495; Barr et al., 2004, J. Biol. Chem., 279:41:43178-43189; 이들 공개문헌 각각의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨) 등의 그외 분석 및 라이브러리를 포함하다. phylomers®는 천뎐 단백질의 sub 도메인으로부터 유래된 것으로, 기존의 짧은 랜덤 펩티드보다 잠재적으로 더욱 안정하게 만든다. phylomers®는 그 기원이 인간이 아닌 생물 게놈으로부터 공급된다. 이러한 특징은 인간 단백질 타겟에 대한 phylomers®의 조합 능력을 현저하게 증대시킨다. 필로지카사의 현재 phylomers® 라이브러리에는 5000만개의 클론의 복잡도(complexity)가 있으며, 이는 랜덤 펩티드 또는 항체 Fab 단편 라이브러리의 복잡도 수와 맞먹는다. 상호작용 펩티드 라이브러리는 B42 활성화 도메인에 융합된 6300만개의 펩티드로 구성되어 있으며, 이를 이용하여 정방향 효모 2-혼성 스크린에서 타겟 단백질에 결합할 수 있는 펩티드를 분리할 수 있다. 두번째는, 200만개 이상의 펩티드로 구성된 차단 펩티드 라이브러리로, 이를 이용하여 역방향 2-혼성 시스템을 이용하여 특이적인 단백질 상호작용을 파괴시킬 수 있는 펩티드를 스크리닝할 수 있다.
phylomers® 라이브러리는 단백질 단편으로 이루어져 있으며, 이는 다양한 박테리아 게놈으로부터 제공된 것이다. 이 라이브러리에는 안정적인 서브도메인(15-50개의 아미노산 길이)이 매우 농화되어 있다. 이 기법은 파지 디스플레이 및 역방향 효모 2-혼성 트랩과 같은 고성능 스크리닝 기법과 병합할 수 있다.
뽄 발명의 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 단편에 대한 항체는, 당업계에 잘 알려진 방법을 이용하여 만들 수 있다. 예로, 미국 특허 출원번호 07/481,491는, 펩티드에 대한 항체를 만드는 방법이 기재되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 항체를 생산하기 위해, 토끼, 마우스 및 랫을 비제한적으로 포함하는 다양한 숙주 동물에, 폴리펩티드 또는 펩티드 단편을 주사하여 면역화시킬 수 있다. 면역 반응을 증가시키기 위해, 다양한 보강제를 숙주 종에 따라 사용할 수 있으며, 그 예로는 프로인트(완전 및 불완전), 알루미늄 하이드록사이드와 같은 미네랄 겔, 라이소렉시틴과 같은 계면활성제, 플루로닉 폴리올(pluronic polyol), 다가음이온(polyanion), 펩티드, 오일 에멀젼, KLH(keyhole limpet hemocyanin), 디니트로페놀 및 BCG(bacille Calmette-Guerin)과 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 보강체가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
단일클론 항체 제조에 있어, 배양한 연속 세포주(continuous cell line)에 의해 항체 분자를 생산하는 모든 기법을 이용할 수 있다. 예컨대, Kohler 및 Milstein (1975, Nature 256:495-497)에 의해 최초 개발된 하이브리도마 기법, 트리오마(trioma) 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 채택하여, 인간 단일클론 항체를 생산할 수 있다. 다른 예로, 단일클론 항체는 국제 특허 PCT/US90/02545에 개시된 기법을 이용하여 무균 동물에서 생산하며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명에 있어서, 인간 항체를 사용할 수 있으며, 이는 인간 하이브리도마를 이용하여(Cote et al ., 1983, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 80:2026-2030), 또는 시험관내에서 인간 B 세포에 EBV 바이러스를 형질감염시켜(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96), 수득할 수 있다. 또한, SLLP 폴리펩티드의 에피토프에 특이적인 마우스 항체 분자 유래의 유전자를 적절한 생물 활성을 가진 인간 항체 분자로부터 유래된 유전자와 함께 스플라이싱함에 의해, "키메라 항체"를 생산하기 위해 개발된 기법(Morrison et al ., 1984, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 81:6851-6855; Neuberger et al ., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al ., 1985, Nature 314:452-454) 을 이용할 수 있으며, 이러한 항체는 본 발명의 범위에 포함된다. 특이적인 단일클론 항체가 개발되면, 통상적인 기법에 의해 이의 돌연변이 및 변형체를 제조할 수 있다.
일 예로, 단쇄 항체 제조에 대한 기법(U.S. Patent No. 4,946,778, 이는 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨)은 단백질-특이적인 단쇄 항체를 제조하도록 개작된다. 다른 예로, Fab 발현 라이브러리 제조에 대한 기법(Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281)을 이용하여 본 발명의 특이적인 항체, 단백질, 유도체 또는 유사체에 대해 원하는 특이성을 가지고 있는 단일클론 Fab 단편을 쉽고 빠르게 동정가능하다.
항체 분자의 이디오타입(idiotype)을 포함하는 항체 단편을 공지된 기법에 의해 제조할 수 있다. 예컨대, 이러한 단편은 비제한적으로, 항체 분자의 펩신 분해에 의해 만들 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 이황화 결합을 환원시켜 제조할 수 있는 Fab' 단편; 파파인과 환원제를 항체 분자에 처리하여 제조할 수 있는 Fab 단펴; 및 Fv 단편을 포함한다.
다클론 항체의 제조는 바람직한 동물에 항원을 접종하고, 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 분리함으로써, 달성한다.
단백질 또는 펩티드의 전장 또는 펩티드 단편에 대한 단일클론 항체를, 예컨대 Harlow et al. (1988, In: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) 및 Tuszynski et al. (1988, Blood, 72:109-115)에 개시된 바와 같은 잘 알려져 있는 단일클론 항체 제조 공정을 이용하여 제조할 수 있다. 원하는 다량의 펩티드를 화학적 합성 기법으로 합성할 수 있다. 대안적으로, 원하는 펩티드를 코딩하는 DNA를 클로닝하고 다량의 펩티드 생산에 적합한 세포에서 적절한 프로모터 서열로부터 발현시킬 수 있다. 펩티드에 대한 단일클론 항체는 본원에 인용된 바와 같은 표준 공정을 이용하여 펩티드로 면역화된 마우스로부터 제조한다.
본원에 기재된 공정을 이용하여 수득되는 단일클론 항체를 코딩하는 핵산을 클로닝하고, 당업계에서 이용가능한 기법을 이용하여 서열분석할 수 있으며, 이는, 예컨대 Wright et al. (1992, Critical Rev. in Immunol. 12(3,4):125-168) 및 상기 문헌에 인용된 참조문헌에 개시되어 있다. 또한, 본 발명의 항체는 Wright et al., (supra) 및 상기 문헌에 인용된 참조문헌, 및 Gu et al. (1997, Thrombosis and Hematocyst 77(4):755-759)에 개시된 기법을 이용하여 "인간화"할 수 있다.
파지 항체 라이브러리를 제조하기 위해, 파지 표면에 원하는 단백질, 예컨대 원하는 항체가 발현되도록 발현하는, 세포, 예컨대 하이브리도마로부터 분리된 mRNA로부터 일차로 cDNA 라이브러리를 수득한다. mRNA의 cDNA 카피는 역전사효소를 이용하여 만든다. 면역글로불린 단편을 명시하는 cDNA를 PCR로 수득하고, 제조된 DNA는 적합한 박테리오파지 벡터에 클로닝하여 면역글로불린 유전자를 명시하는 DNA를 포함하는 박테리오파지 DNA 라이브러리를 제조한다. 이종 DNA를 포함하는 박테리오파지 라이브러리의 제조 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY)에 개시되어 있다.
원하는 항체를 코딩하는 박테리오파지는, 이의 해당 결합 단백질, 예컨대 항체에 대한 항원 결합에 이용가능한 방식으로, 그 표면에 단백질을 표시하도록 조작될 수 있다. 따라서, 특이적인 항체를 발현하는 박테리오파지를 해당 항원을 발현하는 세포의 존재하에 배양하면, 상기 박테리오파지는 세포에 결합할 것이다. 항원을 발현하지 않는 박테리오파지는 세포에 결합하지 않는다. 이러한 패닝 기법은 당업계에서 잘 알려져 있다.
전술한 절차와 같은 절차가 M13 박테리오파지 디스플레이를 이용하여 인간 항체를 생산하기 위해 개발되었다(Burton et al., 1994, Adv. Immunol. 57:191-280). 근본적으로, 항체-생산 세포 집단으로부터 수득되는 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 제조한다. mRNA는 재정렬된 면역글루불린 유전자를 코딩하며, 따라서 cDNA는 동일한 것을 코딩하다. 증폭된 cDNA를 M13 발현 벡터에 클로닝하여, 그 표면에 인간 Fab 단편을 발현하는 파지 라이브러리를 만든다. 대상 항체를 표시하는 파지는 항원 결합성에 의해 선별하고, 박테리아에서 증식시켜, 가용성 인산 Fab 면역글루불린을 생산하다. 따라서, 기존의 단일클론 항체 합성과는 반대로, 이러한 절차는 인간 면역글로불린을 발현하는 세포가 아닌 인간 면역글로불린을 코딩하는 DNA를 영속시킨다.
바로 위에 제시된 절파는 항체 분자의 Fab 부분을 코딩하는 파지의 제조를 설명한다. 그러나, 본 발명은 Fab 항체를 코딩하는 파지 제조로만 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다. 오히려, 단쇄 항체(scFv/파지 항체 라이브러리)를 코딩하는 파지도 본 발명에 포함된다. Fab 분자는 전체 Ig 경쇄를 포함하며, 즉, 이는 경쇄의 가변부 및 불변부 둘다를 포함하지만, 중쇄의 가변부와 제1 불변부 도메인(CH1)만 포함한다. 단쇄 항체 분자는 Ig Fv 단편을 포함하는 단백질의 단쇄를 포함한다. Ig Fv 단편은 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변부만 포함하며, 여기에는 불변부는 포함되어 있지 않다. scFv DNA를 포함하는 파지 라이브러리는 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-597에 언급된 방법을 따라 제조할 수 있다. 원하는 항체를 분리하기 위해 그렇게 제조된 파지 선별(panning)은 Fab DNA를 포함하는 파지 라이브러리에 대해 설명하고 있는 방법과 유사한 방식으로 수행한다.
본 발명은 또한 중쇄 및 경쇄 가변부가 거의 모든 가능한 특이성을 포함하도록 합성할 수 있는 합성 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 것으로 이해되어야 한다(Barbas, 1995, Nature Medicine 1:837-839; de Kruif et al. 1995, J. Mol. Biol.248:97-105).
항체 제조에서, 원하는 항체 스크리닝은 당업계에 공지된 기법, 예컨대 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 항체는, 다클론 항체, 단일클론 항체, 키메라(즉, "인간화") 항체 및 단쇄(재조합) 항체, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 제조된 단편을 포함할 수 있지만, 이로 한정되지 않는다.
본 발명의 펩티드는 Stewart et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; 및 Bodanszky and Bodanszky in The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York에 언급된 바와 같이, 고상 펩티드 합성(SPPS) 등의 표준적인 잘 확립된 기법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 처음에, 적절하게 보호된 아미노산 잔기를 그것의 카복시기를 통해 , 가교된 폴리스티렌 또는 폴리아미드 수지와 같은 유도체화된 불용성 폴리머 지지체에 부착한다. "적절하게 보호된"은 아미노산의 α-아미노기와 임의 측쇄 작용기 둘다에 보호기가 존재하는 것을 의미한다. 측쇄 보호기는 일반적으로 합성 전반에서 사용되는 용매, 시약 및 반응 조건에 안정적이며, 최종 펩티드 산물에 영향을 미치지 않는 조건하에서 제거가능하다. 올리고펩티드의 단계별 합성은 최초 아미노산으로부터 N-보호기를 제거하고, 이를 원하는 펩티드 서열에서 다음 아미노산의 카르복시 말단과 커플링시켜, 진행된다. 이 아미노산도 또한 적절하게 보호된다. 도입되는 아미노산의 카르복시를 활성화시켜, 카르보디이미드, 대칭적인 산 무수화물 또는 하이드록시벤조트리아졸 또는 펜타플루오로페닐 에스테르 등의 "활성형 에스테르"로의 형성과 같이 반응성 기로의 형성에 의해, 지지체에 결합된 아미노산의 N-말단과 반응시킬 수 있다. 고상 펩티드 합성 방법의 예는, α-아미노 보호기와 같은 tert-부틸옥스카보닐을 이용하는 BOC 방법, 및 아미노산 잔기의 α-아미노를 보호하기 위해 9-플루오레닐메틸옥스카보닐을 이용하는 FMOC 방법이 있으며, 이 두가지 방법 모두 당업자들에게 잘 알려져 있다.
또한, N- 및/또는 C-차단기의 병합은, 고상 펩티드 합성 방법에 기존의 프로토콜을 이용하여 수행할 수 있다. C-말단 차단기의 병합을 위해, 예컨대, 원하는 펩티드의 합성은, 전형적으로, 고상으로서 화학적으로 변형되어 수지로부터 절단되어 원하는 C-말단 차단기를 가진 펩티드를 만드는, 지지성 수지를 이용하여 수행된다. C-말단에 일차 아미노 차단기가 있는 펩티드를 제공하기 위해, 예컨대 p-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지를 이용하여 수행할 수 있으며, 따라서, 펩티드 합성이 완료되었을 때 하이드로플루오르산을 처리하면 C-말단이 아미드화된 원하는 펩티드가 분리된다. 이와 유사하게, C-말단에 N-메틸아민 차단기의 병합은, HF 처리시 N-메틸아미드화된 C-말단을 가진 펩티드가 분리되는, N-메틸아미노에틸-유도체화된 DVB 수지를 이용하여 달성된다. 에스테르화에 의한 C-말단의 차단 역시 통상적인 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 이는, 다음번 원하는 알코올과의 반응에서 에스테르 작용기가 형성될 수 있도록, 수지로부터 측쇄 펩티드의 분리를 허용하는 수지/차단기 병용 사용이 요구된다. FMOC 보호기를, 메톡시알콕시벤질 알코올 또는 등가 링커로 유도체화된 DVB 수지와 병용하여, 이러한 목적으로 사용할 수 있으며, 디클로로메탄 중의 TFA에 의해 지지체로부터 절단된다. 적절하게 활성화된 카복시 작용기의 예컨대 DCC와의 에스테르화는, 이후 바람직한 알코올 첨가에 의해 진행되며, 에스테르화된 펩티드 산물의 탈보호 및 분리가 뒷따른다.
N-말단 차단기의 병합은, 합성된 펩티드가 여전히 수지에 부착된 상태에서, 예컨대 적합한 무수 화합물과 니트릴의 처리에 의해 수행할 수 있다. N-말단에 아세틸-차단기를 병합하기 위해, 예컨대, 수지가 커플링된 펩티드를 아세토니트릴 중의 20% 아세트 무수화물로 처리할 수 있다. 이후, N-차단된 펩티드 산물은 수지로부터 절단하고, 탈보호 및 분리할 수 있다.
화학적 또는 생물학적 합성 기법으로 수득되는 펩티드가 원하는 펩티드인지를 확인하기 위해, 펩티드 조성 분석이 수행되어야 한다. 이러한 아미노산 조성 분석은 고해상도 질량 분광분석법을 이용하여 수행하여, 펩티드의 분자량을 결정할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 펩티드의 아미노산 내용은 수성 산 중에 펩티드를 가수 분해하고, HPLC 또는 아미노산 분석기를 이용한 혼합물의 구성 요소를 분리, 동정 및 정량화함으로써, 검증할 수 있다. 단백질 서열분석기는 순차적으로 단백질을 분해하여 순서대로 아미노산을 동정하는 것으로, 이를 이용하여 펩티드의 서열을 명확하게 결정할 수 있다. 이를 사용하기 전에, 펩티드를 정제하여 오염원을 제거한다. 여기서, 펩티드는 적절한 관리 기관이 설정한 표준을 충족시키도록 정제되는 것으로 이해된다. 다수의 통상적인 정제 방법들 중 임의의 한가지 방법, 예컨대 C4 -, C8- 또는 C18- 실리카와 같은 알킬화된 실리카 컬럼을 이용한 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)을 이용하여, 필수 순도에 도달할 수 있다. 유기 용매, 예컨대 일반적으로 트리플루오로아세트산이 소량 함유된 수성 완충액 중의 아세토니트릴의 함량을 증가시키는 농도 구배 이동상을 일반적으로 사용하여 정제를 수행한다. 또한, 이온-교환 크로마토그래피를 이용하여 펩티드의 전하를 기초로 펩티드를 분리할 수 있다.
물론, 펩티드 또는 항체, 이의 유도체 또는 이의 단편은 활성에 영향을 미치지 않는 변형된 아미노산 잔기를 병합할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예로, 말단은 차단기를 포함하도록, 즉 "원하지 않는 분해"로부터 N- 및 C-말단을 보호하거나/보호하고 안정화시키는데 적합한 화학적 치환체를 포함하도록 유도체화될 수 있으며, "원하지 않는 분해"는 화합물의 기능에 영향을 줄 것으로 보이는 화합물의 말단에 임의 타입의 효액적, 화학적 또는 생화학적 분해, 즉, 화합물의 말단에서의 순차적인 분해를 포함하는 것을 의미한다.
차단기는 펩티드의 생체내 활성에 나쁘게 작용하지 않는, 펩티드 화학 분야에서 통상적으로 이용되는 보호기를 포함한다. 예로, 적합한 N-말단 차단기는 N-말단의 알킬화 또는 아실화에 의해 도입될 수 있다. 적합한 N-말단 차단기의 예로는, C1-C5 분지형 또는 비-분지형의 알킬기, 아실기, 예컨대 포르밀 및 아세틸기 뿐만 아니라 아세트아미드메틸(Acm)기와 같은 이의 치환된 형태가 있다. 또한, 아미노산의 데스아미노 유사체도 N-말단 차단기로 이용가능하며, 펩티드의 N-말단에 커플링하거나 또는 N-말단 잔기 위치에 사용할 수 있다. C-말단의 카복시기에 병합 또는 병합되지 않은, 적합한 C-말단 차단기로는, 에스테르, 케톤 또는 아미드를 포함한다. 에스테르 또는 케톤-형성 알킬 기, 특히 저급 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸 및 프로필, 및 1급 아민(-NH2)과 같은 아미드 형성 아미노기, 및 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 메틸에틸아미노 등과 같은 모노- 및 다이-알킬아미노기는, C-말단 차단기의 예이다. 아그마틴(agmatine)과 같은 데스카복실화된 아미노산 유사체도 C-말단 차단기로 이용가능하며, 이는 펩티드의 C-말단 잔기와 커플링하거나 또는 그 위치에 사용할 수 있다. 또한, 펩티드로부터 말단의 유리 아미노기 및 카복기시를 모두 제거하여, 펩티드의 활성에는 영향을 미치지 않으면서 그것의 데스아미노 및 데스카복시화된 형태를 만들 수 있는 것으로 이해될 것이다.
또한, 활성에 영향을 미치지 않으면서 다른 변형체를 병합시킬 수 있으며, 그 예로는 천연 L-이소형의 하나 이상의 아미노산의 D-이소형의 아미노산으로의 치환을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다라서, 펩티드는 하나 이상의 D-아미노산을 포함할 수도 있으며, 또는 모두 D-형인 아미노산을 포함할 수도 있다. 본 발명에 있어서, 펩티드의 레트로-인버스 형태(Retro-inverso form), 예컨대 아미노산 모두가 D-아미노산 형태로 치환된 인버티드 펩티드도 고려된다.
또한, 본 발명의 산 부가 염도 기능적 등가체로 고려된다. 따하서, 본 발명에 따른 펩티드는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산이나, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등과 같은 유기산으로 처리하여, 본 발명에 사용하기 적합한 펩티드의 수용성 염을 제공한다.
또한, 본 발명은 단백질 및 펩티드의 상동체를 제공한다. 상동체는 보존적인 아미노산 서열 사이 또는 서열에는 작용하지 않는 변형, 또는 이들 둘다에 의해, 자연적으로 형성되는 단백질 또는 펩티드와는 다를 수 있다.
예컨대, 단백질 또는 펩티드의 일차 서열을 변형시키지만 정상적으로는 그 기능은 변형시키지 않는 보존적인 아미노산 변화를 줄 수 있다. 이를 위해, 전형적으로 10개 이상의 보존적인 아미노산 변화는 펩티드 기능에 영향을 주지 않는다.
(정상적으로 일차 서열을 변형시키지 않는) 변형은 폴리펩티드의 생체내 또는 시험관내 화학적 유도체화, 예컨대, 아세틸화 또는 카르볼실화를 포함한다. 또한, 당화 수정, 예컨대 이의 합성 및 처리 또는 이후의 처리 단계 동안에 폴리펩티드의 당화 패턴 수정에 의한; 예컨대 당화에 작용하는 효소, 예컨대 포유류의 당화 효소 또는 탈당화 효소에 폴리펩티드의 노출에 의해 형성된 당화 수정도 포함된다. 또한, 인산화된 아미노산 잔기, 예컨대 포스포타리오신, 포스포세린 또는 포스포트레오닌이 있는 서열도 포함한다.
또한, 단백질 분해에 대한 내성을 개선시키거나 또는 수용성 특징을 최적화하기 위해, 또는 치료제로 더욱 적합하게 하기 위해, 통상적인 분자 생물학적 기법을 이용하여 변형된, 폴리펩티드 또는 항체 단편도 포함된다. 이러한 폴리펩티드의 상동체는 자연적으로 형성되는 L-아미노산 이외의 잔기, 예컨대 D-아미노산 또는 비-자연적으로 형성되는 합성 아미노산이 포함되어 있는 것을 포함한다. 본 발명의 펩티드는 본원에 언급된 구체적인 예시된 임의 방법에 의한 결과물로 한정되진 않는다.
본원에 언급된 바와 같이 수득된 실질적으로 순수한 단백질은, 면역학적, 효액적 또는 그외 분석을 이용하여, 상기 과정의 각 단계에서 정제를 모니터링하는, 하기 공지된 단백질 정제 과정에 따라 정제할 수 있다. 단백질 정제 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 Deutscher et al. (ed., 1990, Guide to Protein Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego)에 언급되어 있다.
또한, 본 발명은 발명의 펩티드, 단백질 및 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. "핵산"은 데옥시리보뉴클레오사이드 또는 리보뉴클레오사이드로 구성되었던 간에, 그리고 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 실록산, 카보네이트, 카복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카바메이트, 티오에테르, 브릿지 형성된 포스포르아미데이트, 브릿지 형성된 메틸렌 포스포네이트, 브릿지 형성된 포스포르아미데이트, 브릿지 형성된 포스포르아미데이트, 브릿지 형성된 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 브릿지 형성된 포스포로티오에이트 또는 설폰 연결 및 이들 연결의 조합과 같은, 포스포다이에스테르 연결이나 변형된 연결로 구성되었던 간에, 모든 핵산을 의미한다. 또한, 용어 핵산은 구체적으로 5개의 생물에서 형성되는 염기(아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 유라실) 이외의 다른 염기로 구성된 핵산도 포함한다.
본 발명은 사용되는 핵산의 특성으로 한정하고자 하는 의도는 아니다. 타겟 핵산은 천연 또는 합성된 핵산일 수 있다. 핵산은 바이러스, 박테리아, 동물 또는 식물 소스로부터 유래된 것일 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 이중가닥, 단일가닥 또는 일부 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 또한, 핵산은 바이러스 또는 다른 거대 분자의 일부분으로서 발견될 수 있다. 예로, Fasbender et al., 1996, J. Biol. Chem. 272:6479-89 (polylysine condensation of DNA in the form of adenovirus)를 참조한다.
본 발명에 이용가능한 핵산은 예로, 안티센스 DNA 및/또는 RNA와 같은 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드; 유전자 요법용 DNA; 바이러스 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 바이러스 단편; DNA 및/또는 RNA 키메라; mRNA; 플라스미드; 코스미드; 게놈 DNA; cDNA; 유전자 단편; 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA, 슈퍼코일형의 DNA 및/또는 삼중 나선 DNA를 포함하는 다양한 구조의 DNA; Z-DNA 등이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 핵산은 다량의 핵산을 제조하기 위해 전형적으로 사용되는 임의의 통상적인 수단에 의해 제조할 수 있다. 예로, DNA 및 RNA를 상업적으로 이용가능한 시약 및 합성기를 이용하여 당업계에 잘 알려져 있는 방법(예, Gait, 1985, OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: A PRACTICAL APPROACH (IRL Press, Oxford, England))에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. RNA는 SP65(Promega Corporation, Madison, WI)와 같은 플라스미드를 이용한 시험관내 전사를 통해 고수율로 제조할 수 있다.
뉴클레이즈 안정성 증가가 바람직한 일부 예에서, 변형된 뉴클레오시드간(internucleoside linkage) 연결을 가진 핵산이 바람직할 수 있다. 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함하는 핵산은 당업계에 잘 알려진 시약 및 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 예컨대, 포스포네이트 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 메톡시에틸 포스포르아미데이트, 포름아세탈, 티오프름아세탈, 디이소프로필실릴, 아세트아미데이트, 카바메이트, 디메틸렌-설파이드(-CH2-S-CH2), 디인에틸렌-설폭사이드(-CH2-SO-CH2), 디메틸렌-설폰(-CH2-SO2-CH2), 2'-O-알킬, 및 2'-데옥시2'-플루오로 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한 핵산의 합성 방법은, 당업계에 잘 알려져 있다(Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31:335 및 이의 참조문헌).
핵산은 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 모든 적합한 수단에 의해 정제할 수 있다. 예컨대, 핵산을 역상 또는 이온 교환 HPLC, 크기 배제 크로마토그래피 또는 겔 전기영동에 의해 정제할 수 있다. 물론, 당업자는, 정제 방법이 정제되는 DNA의 크기에 부분적으로 의존됨을 알 것이다.
또한, 용어 핵산은 특히 5개의 생물에서 형성되는 염기(아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실) 이외의 염기로 구성된 핵산을 포함한다.
본 발명은 사용가능한 아프타머에 관한 것이다. 일 예로, 아프타머는 (동정된 단백질의 경우에서) 다른 화합물에 선호적으로 결합하도록 시험관내에서 선택된 화합물이다. 일 측면으로, 랜덤 서열을 이들로 한정될 필요는 없지만 다수의 (천연 또는 합성 둘다의)뉴클레오티드 또는 아미노산으로부터 쉽게 제조할 수 있기 때문에, 아프타머는 핵산 또는 펩티드이다. 다른 측면으로, 핵산 아프타머는 단백질 타겟에 결합하는 짧은 DNA 가닥이다. 일 측면으로 아파타머는 올리고뉴클레오티드 아프타머이다. 올리고뉴클레오티드 아파트머는 특이적인 대상 단백질 서열에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 아프타머를 동정하는 일반적인 방법은 일부 겹침(degenerate) 올리고뉴클레오티드로 시작하여 원하는 단백질에 결합하는 능력에 대하 수천개의 올리고뉴클레오티드를 동시에 스크리닝하는 것이다. 결합된 올리고뉴클레오티드는 단백질에서 용출시켜 서열분석함으로써, 특이적인 인지 서열을 동정할 수 있다. 화학적으로 안정화된 대량의 아프타머를 포에 이동시키면 대산 폴리펩티드에 특이적으로 결합하여, 그 기능을 차단한다. [예로, 아프타머의 시험관내 선별을 언급하고 있는 하기 공개문헌들을 참조한다: Klug et al., Mol. Biol. Reports 20:97-107 (1994); Wallis et al., Chem. Biol. 2:543-552 (1995); Ellington, Curr. Biol. 4:427-429 (1994); Lato et al., Chem. Biol. 2:291-303 (1995); Conrad et al., Mol. Div. 1:69-78 (1995); and Uphoff et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6:281-287 (1996)].
본원에서, 길항제 또는 차단제는 무제한적으로, 항체, 이의 항원 결합 부위 또는 특정 타겟 단백질에 결합하는 생합성 항체 결합부; 타겟 단백질 또는 이에 조합된 조절 인자를 코딩하는 핵산에 생체내에서 결합하는 안티센스 분자, 타겟 단백질에 결합하고/하거나 저해하는 라이보자임, 아프타머 또는 소형 분자, 또는 타겟 단백질을 코딩하는 핵산에 결합하고/하거나 발현을 저해, 감소 또는 조절하는 라이보자임, 아프타머 또는 소형 분자를 포함한다.
아프타머는 이들의 유전자의 단백질 산물에 고친화성으로 특이적으로 결합하는 능력으로 인해, 타겟 유전자 지능을 인공적으로 간섭하는 다른 올리고뉴클레오티드-근간의 방업 이상의 이점이 있다. 그러나, RNA 아프타머는 세포내 구획으로 효율적으로 들어가지 못하기 때문에 세포내 타겟 단백질에 결합하는 능력에 한계가 있을 수 있다. 더욱이, 벡터를 이용하 방법을 통해 포유류 세포내에서 RNA 아프타머를 발현시키고자 하는 시도는, 발현된 RNA 아프타머에서, 이의 기능적 구조를 변형시킬 수 있는 첨가된 측면 서열의 존재로 어렵게 되었다.
타겟 단백질 분자에 대해 단일가닥 핵산(DNA 및 RNA 아프타머)을 이용하고자하는 생각은 짧은 서열(20 mer - 80 mer)이 고친화성 및 특이성으로 타겟 단백질에 이들을 결합하게 하는 고유한 3D 구조로 접히게 하는 능력을 기초한 것이다. RNA 아프타머는 효모 및 다세포성 유기체와 같은 진핵 세포 내부에서 성공적으로 발현되었으며, 세포 환경에서 이의 타겟 단백질에 대해 저해 효과를 가지는 것으로 입증되었다.
본 발명은 본원에 언급된 단백질을 저해하는 조성물 및 방법에 관한 것이며, 당업계에 공지되었으나 언급되어있지 않은 것도 본 발명에 포함된다. 예로, 다양한 조절자/작용자, 예컨대 항체 및 안티센스 분자, RNAi 분자 또는 라이보자임과 같은 생물학적으로 활성인 핵산, 아프타머, 펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 인식하는 저분자량의 유기 화합물이 공지되어 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 혈관 투과성 조절 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 이러한 화합물은 표준적인 약제학적으로 허용가능한 당업계에 공지된 담체, 충진제, 가용화제 및 안정화제를 이용하여, 약제학적 조성물로 제형화할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물을 개체에게 투여하는 방법에 관한 것이다. 일 예로, 본 발명은 본 발명의 방법으로 이용하여 동정한 화합물을 투여함으로써, 혈관-누출 또는 투과성 관련 질환, 장애 또는 상태에 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 혈관 누출을 저해하기 위해 사용되고 있진 않은 화합물이, 대조군에 비해 적어도 10%로 혈관을 저해하는 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물은 무처리 대조군에 비해 적어도 25%로 혈관-누출을 저해하는 것이 더욱 바람직하다. 더 바람직하기로는, 본 발명의 화합물은 무처리 대조군에 비해 적어도 50%로 혈관-누출을 저해한다. 어욱 더 바람직하기로는, 본 발명의 화합물은 무처리 대조군에 비해 적어도 75%로 혈관-누출을 저해한다. 또한, 바람직하기로는, 본 발명의 화합물은 무처리 대조군에 비해 적어도 90%로 혈관-누출을 저해한다. 다른 측면으로, 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 무처리 대조군에 비해 적어도 95%로 혈관-누출을 저해한다. 본 발명의 일 측면에서, 혈관 누출은 PAK의 기능 또는 활성 저해로 인해 저해된다. 용어 "저해" 및 "차단"은 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 비제한적으로 국소, 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척수강내(intrathecal), 실내(intraventricular), 경피, 피하, 복막내, 비강내, 장내(enteral), 극소, 설하 또는 직장 등의 다양한 경로에 의해 필요한 개채에게 투여된다.
본 발명에서, 혈관 투과성 관련 질환, 장애 또는 상태를 치료가 필요한 개체에서 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 하나 이상의 혈관 투과성 조절 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 혈관 투과성을 조절하는 본 발명에 의해 동정된 화합물을 공지된 혈관 투과성 화합물이나 다른 약제와 함께 투여할 수 있다. 바람직하기로는, 상기 화합물은 인간에게 투여된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한, 적절한 화합물, 상동체, 단편, 유사체 또는 그 유도체의 약제학적 조성물의 용도를 제공하며, 상기 조성물은 하나 이상의 적절한 화합물, 이의 상동체, 단편, 유사체 또는 유도체, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본 발명을 실시하는데 이용가능한 약제학적 조성물은 1 ng/kg/day 내지 100 mg/kg/day의 투여량으로 전달되도록 투여될 수 있다. 본 발명의 방법 이용가능한 약제학적 조성물은 경구 고형 제형, 안 제형, 좌제, 에어로졸, 국소 또는 그외 유사한 제형으로 전신 투여될 수 있다. 적절한 화합물 뿐만 아니라, 그러한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체와 약물 투여를 증가시키고 용이하게 하는 것으로 공지된 다른 성분을 포함할 수도 있다. 그외 나노입자, 리포좀, 재밀봉된 적혈구(resealed erythrocyte), 및 면역학을 기본으로한 시스템(immunologically based system)과 같은 가능하 제형을 사용하여, 본 발명의 방법에 따른 적절한 화합물을 투여할 수 있다.
본원에 개시된 임의 방법을 이용하여 동정된 화합물은 본원에 개시된 질병을 치료하기 위해, 제형화하여 포유류에 투여할 수 있다.
본 발명은 활성 성분으로서 본원에 언급된 상태, 장애 및 질환 치료에 이용가능한 화합물을 포함하는 약제학적 조성물의 제조 및 사용에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 개체에게 투여하기 적합한 형태로 활성 성분을 단독으로 포함할 수 있으며, 또는 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능하 담체, 하나 이상의 부가 부형제 또는 이들의 일부 조합과, 활성 성분을 포함할 수 있다. 활성 성분은 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 생리학적으로 허용가능한 양이온 또는 음이온과 조합하는 형태와 같이, 생리학적으로 허용가능한 에스테르 또는 염의 형태로 약제학적 조성물에 존재할 수 있다.
본원에서, 용어 "생리학적으로 허용가능한" 에스테르 또는 염은 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분과 혼화가능한 활성성분의 에스테르 또는 염 형태를 의미하며, 이는 조성물이 투여되는 개체에 유해하지 않다.
본원에 언급된 약제학적 조성물의 제형은 약물학 분야에서 공지된 또는 이후 개발될 임의 방법에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 담체나 또는 하나 이상의 보조 성분과 조합되게 하는 단계를 포함하며, 이후, 필요하거나 바람직하다면, 산물을 바람직한 단일 또는 다중 투약 단위로 모양을 만들거나 패키징할 수 있다.
본원에 제공된 약제학적 조성물에 대한 설명은 원칙적으로 인간에게 윤리적 투여(ethical administration)하기에 적합한 약제학적 조성물에 관한 것이지만, 당업자라면 이러한 조성물이 모든 종류의 동물에 투여하기에 일반적으로 적합하다. 다양한 동물에게 투여하기에 적합한 조성물을 제공하기 위하여, 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물을 변형시키는 것은 잘 숙지되어 있으며, 전문적인 동물 약물학자는 주로 통상적인, 가능하다면 실험이 가미된 이러한 변형을 설계 및 수행할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 투여되는 개체는, 인간 및 그외 영장류, 소, 돼지, 말, 양, 고양이 및 개 등의 상업적으로 중요한 포유류, 닭, 오리, 거위 및 칠면조 등의 상업적으로 중요한 조류를 포함한 포유류가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 이용가능한 약제학적 조성물은 경구 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강내, 볼, 안, 척수강내 또는 그외 투여 경로에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매할 수 있다. 그외 고려가능한 조성물은, 활성 성분을 포함하고 있는 고안된 나노입자, 리포좀 조제물, 재밀봉된 적혈구, 및 면역-기재의 제형을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단일 단위 투약으로서 또는 복수개의 단일 단위 투약으로서 벌크(bulk)로 제조, 포장 또는 판매할 수 있다. 본원에서, "단위 투약"은 활성 성분의 미리 결정된 함량을 포함하는, 약제학적 조성물의 개별 함량이다. 활성 성분의 양은 개체에게 투여하게 될 활성 성분의 투여량과 동일하거나, 또는 투여량의 예컨대 1/2 또는 1/3과 같은 투여량의 편의 분획이다.
본 발명의 약제학적 조성물내 활성 성분, 약제학적으로 허용가능한 담체 및 임의의 부가적인 성분의 상대적인 함량은 치료되는 개체의 신원, 체격 및 상태에 따라, 그리고 또한 투여되는 조성물의 경로에 따라 변경할 수 있다. 예컨대, 상기 조성물은 활성 성분을 0.1% 내지 100% (w/w)로 포함할 수 있다.
활성 성분 이외에도, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 부가적인 약제학적으로 활성인 물질을 더 포함할 수 있다. 특히, 부가적인 물질은 구토억제제 및 시아나이드 및 시아네이트 스캐빈저와 같은 스캐빈저를 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 조절 방출 제형 또는 서방형 제형은 통상적인 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 경구 투여하기에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 비제한적으로 미리 결정된 함량의 활성 성분을 각각 포함하는 정제, 경질 캡슐, 연질 캡슐, 사케트, 트로키 또는 로젠 등의 개별 고형 투약 단위 형태로 제조, 포장 또는 판매할 수 있다. 경구 투여에 적합한 다른 제형은 분말 제형, 과립 제형, 수성 현탁제, 오일성 현탁제, 수용액, 오일성 용액 또는 에멀젼이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에서, "오일성" 액체는 탄소-함유성 액체 분자를 포함하며 물 보다 극성이 낮은 것이다.
활성 성분을 포함하는 정제는, 활성 성분을 선택적으로 하나 이상의 부가적인 성분과 함께 압축하거나 성형하여 제조할 수 있다. 압축된 정제는 적합한 장치에서, 선택적으로 하나 이상의 결합제, 윤활제, 부형제, 계면활성제 및 분산제과 혼합하여 활성 성분을 분말 또는 과립 조제물과 같은 자유 유동 형태로 압축시켜 제조할 수 있다. 성형된 정제는 적합한 장치에서, 활성 성분, 약제학적으로 허용가능한 담체 및 혼합물을 촉촉하게 하는데 적어도 충분한 액체의 혼합물을 성형하여, 제조할 수 있다. 정제 제조에 사용되는 약제학적으로 허용가능한 부형제는, 무활성 희석제, 과립화제, 붕괴제, 결합제 및 윤활제가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 공지된 분산제로는, 감자 전분 및 소듐 전분 글리콜레이트가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 공지된 계면 활성제로는 소듐 라우릴 설페이트가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 공지된 희석제로는 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 락토스, 미세결정형 셀룰로스, 칼슘 포스페이트, 칼슘 하이드로겐 포스페이트 및 소듐 포스페이트가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 공지된 과립화제 및 붕괴제로는 옥수수 전분(corn starch) 및 알긴산이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 공지된 결합제로는 젤라틴, 아카시아, 사전-젤라틴 처리한 옥수수 전분(pre-gelatinized maize starch), 폴리비닐피롤리돈 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로스가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 공지된 윤활제로는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리카 및 탈크가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
정제는, 개체의 위장관에서 느린 분해를 달성하여 활성 성분의 지속적인 방출 및 흡수를 제공하기 위해, 공지된 방법을 이용하여 코팅하거나 또는 코팅하지 않을 수 있다. 예로, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질을 이용하여 정제를 코딩할 수 있다. 다른 예로, 정제는 삼투성으로 조절되어 방출되는 정제로 만들기 위해, 미국 특허 4,256,108; 4,160,452; 및 4,265,874에 언급된 방법으로, 정제를 코딩할 수 있다. 정제는 또한, 약제학적으로 세련되고 입맛에 맞는 조제물로 제공하기 위해, 감미제, 향료, 착색제, 보존제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
활성 성분을 포함하는 경질 캡슐은, 젤라틴과 같은, 생리적으로 분해가능한 조성물을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 경질 캡슐은 활성 성분을 포함하며, 예컨대 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린과 같은 무활성의 고형 희석제 등의 추가적인 성분을 더 포함할 수 있다.
활성 성분을 포함하는 연질 젤라틴 갭슐은 젤라틴과 같은, 생리적으로 분해가능한 조성물을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 연질 캡슐은 활성 성분을 포함하며, 이는 물이나 피넛 오일, 액상 파라핀 또는 올리브 오일과 같은 오일 매질과 혼합될 수 있다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물의 액체 제형은 사용하기 전에 물이나 다른 적정 비히클로 재구성하도록 의도된 건조 산물의 형태로, 또는 액체 형태로, 제조, 포장 및 판매될 수 있다.
액체 현탁액은 통상적인 방법으로 제조하여, 수성 또는 오일성 비히클 중의 활성 성분의 현탁을 수득할 수 있다. 수성 비히클의 예로는 물과 등장성 염수가 있다. 오일성 비히클의 예로는 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올, 아라키스(arachis) 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일, 식물성 분별 오일 및 액상 파라핀과 같은 미네랄 오일이 있다. 액체 현탁액은 현탁제, 분산제 또는 습윤제, 유화제, 완화제, 보존제, 완충제, 염, 향료, 착색제 및 감미제 등의 한가지 이상의 부가적인 성분을 더 포함할 수 있다. 오일성 현탁액은 점증제를 더 포함할 수 있다. 공지된 현탁제는 소르비톨 시럽, 수소화된 식용 지방, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸트, 검 아카시아 및 소듐 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
공지된 분산제 또는 습윤제로는 렉시틴과 같은 천연 포스파티드, 알킬렌 옥시드와 지방산, 장쇄 지방족 알코올, 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르 또는 지방산 및 헥시톨 무수화물로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 산물(예, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 각각)이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 공지된 유화제로는 렉시틴 및 아카시아가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 공지된 보존제로는 메틸, 에틸, 또는 n-프로필 파라 하이드록시벤조에이트, 아스코르브산 및 소르브산이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 공지된 감미제로는 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 슈크로스 및 사카린이 있다. 오일성 현탁제에 대한 공지된 점증제로는 예컨대 밀랍, 경질 파라핀 및 세틸 알코올이 있다.
수성 또는 오일성 용매중의 활성 성분의 액체 용액은 액체 현탁제와 실질적으로 동일한 방식으로 제조할 수 있으며, 가장 큰 차이는 활성 성분이 용매에 현탁되는 것이 아니라 용해된다는 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물의 액체 용액은 액체 현탁제에 대해서 언급된 각 성분을 포함할 수 있으며, 현탁제는 용매중의 활성 성분의 용해를 돕는데 필수적인 것은 아닌 것으로 이해된다. 수성 용매의 예로는 물 및 등장성 염수가 있다. 오일성 용매의 예로는 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올, 아라키스 오일, 올리브 오일, 참기름 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일, 식물성 분별 오일, 액상 파라피과 같은 미네랄 오일이 있다.
본 발명의 약제학적 조제물의 분말 및 과립 제형은 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 제형은 사용하는 개체에게 직접 투여할 수 있으며, 예컨대 정제로 만들거나, 캡슐에 충진하거나 또는 수성 또는 오일성 비히클 첨가에 의한 수성 또는 오일성 현탁액 또는 용액을 제조할 수 있다. 이들 제형 각각은 한가지 이상의 분산제, 습윤제, 현탁제 및 보존제를 더 포함할 수 있다. 충진제, 감미제, 향료 또는 착색제와 같은 추가적인 부형제도 이들 제형에 함유될 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼 형태로 제조, 포장 또는 판매할 수 있다. 오일상은 올리브 오일 또는 아라키스 오일과 같은 식물성 오일, 액상 파라핀과 같은 미네랄 오일 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 조성물은 검 아카시아 또는 검 크라가칸트와 같은 천연 검, 소이빈 또는 렉시틴 포스파티드와 같은 천연 포스파티드, 소르비탄 모노올레이트와 같은 지방산과 헥시톨 무수화물의 조합으로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트와 같은 에틸렌 옥사이드를 갖는 부분 에스테르와 같은 중합 산물 등의, 하나 이상의 유화제를 더 포함할 수 있다. 또한, 이들 에멀죤은 예컨대 감미제 또는 향료 등의 추가적인 성분을 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 직장 투여, 질 투여 및 비경구 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매할 수 있다.
약제학적 조성물은 주사가능한 멸균 수성 또는 오일성 현탁액 또는 용액의 형태로 제조, 포장 또는 판매할 수 있다. 이들 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있으며, 활성 성분 이외에도, 본원에 언급된 분산제, 습윤제, 또는 현탁제와 같은 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 이러한 주사가능한 멸균 제형은 예로 물 또는 1,3 부탄 디올과 같은, 무독성의 비경구로 허용가능한 의석제 또는 용매를 이용하여 제조할 수 있다. 그외 허용가능한 희석제 및 용매로는 링거액, 등장성 소듐 클로라이드 용액 및 합성 모노 또는 다이-글리세라이드와 같은 고정화된 오일이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이용가능한 그외 비경구 투여가능한 제형은, 미세결정 형태내에, 리포좀 조제물내에 또는 생분해가능한 폴리머 시스템의 성분으로서 활성 성분을 포함하는 것을 포함한다. 지속적인 방출 또는 이식용 조성물은 에멀젼, 이온 교환 수지, 난용성 폴리머 또는 난용성 염 등의 약제학적으로 허용가능한 폴리머성 또는 소수성 물질을 포함할 수도 있다.
국소 투여용으로 적합한 제형은 도포제와 같은 액체 또는 반유동체 조제물, 로션, 트림, 연고 또는 페이스트와 같은 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼, 및 용액제 또는 현탁제가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 국소 투여가능한 제형에서, 활성 성분의 농도는 용매에서의 활성 성분의 가용성 한계 수준으로 높을 수 있지만, 활성 성분을 예컨대, 약 1% 내지 약 10%(w/w)으로 포함할 수 있다. 국소 투여 제형은 본원에 기재된 하나 이상의 부가적인 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 구강(buccal cavity)을 통한 폐 투여용으로 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매할 수 있다. 이러한 제형은 활성 성분을 포함하며 직경이 약 0.5 내지 약 7 nm, 바람직하기로는 약 1 내지 약 6 nm인, 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은, 분말을 분산시키도록 추진제의 기류를 인가할 수 있는 건조 분말 저장소를 포함하는 장치를 이용하여, 또는 밀폐된 용기에 저비점 추진제에 용해 또는 현탁된 활성 성분을 포함하고 있는 장치와 같은 자가 추진 용매/분말 분산성 용기를 이용하여, 투여하기 위한 건조 분말 형태가 편리하다. 바람직하기로는, 이러한 분말은 입자의 98% 이상의 직경이 0.5 nm 이상이고, 입자의 95% 이상이 직경 7 nm 이하인, 입자를 포함한다. 더 바람직하기로는, 입자의 95% 이상은 1 nm 이상의 직경을 가지고 입자의 90% 이상은 6 nm 이하의 직경을 가진다. 건조 분말 조성물은 바람직하기로는, 당과 같은 미세 고형 분말 희석제를 포함하며, 단위 투약 형태로 편리하게 제공된다.
저비점 추진제는 일반적으로 대기압에서의 비점이 65℉ 미만인 액체 추진제를 포함한다. 통상, 상기 추진제는 조성물의 50 - 99.9% (w/w)를 이룰 수 있으며, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20% (w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 액상 비이온성 또는 고상 음이온성 계면제 또는 고상 희석제(바람직하기로는 활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 차수의 입자 크기를 가짐)와 같은 추가적인 성분을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 폐 전달용으로 제형화된 약제학적 조성물은 용액 또는 현탁제의 액적(droplet)의 형태로 활성 성분을 제공할 수 있다. 이들 제형은 활성 성분을 포함하는, 수성 또는 희석 알코올 용액 또는 현탁액, 선택적으로 멸균된 형태로 제조, 포장 또는 판매할 수 있으며, 임의의 연무기 또는 미립화 장치를 이용하여 편리하게 투여할 수 있다. 이러한 제형은 비제한적으로 사카린 소듐과 같은 향료, 휘발성 오일, 완충제, 계면활성제 또는 메틸하이드록시벤조에이트와 같은 보존제를 포함하여, 한가지 이상의 추가적인 성분을 더 포함할 수 있다. 이러한 투여 경로로 제공되는 액적은 평균 직경이 약 0.1 내지 약 200 nm이다.
폐 전달에 유용한 것으로 본원에 언급된 제형은 본 발명의 약제학적 조성물의 비강내 전달에도 사용가능하다. 비강 투여에 적합한 다른 제형은 활성 성분을 포함하며 평균 입자 크기가 약 0.2 내지 500 ㎛인, 조대 분말(coarse powder)이다. 이러한 제형은 코로 들이쉬는 방식으로, 즉 분말이 있는 용기를 비공에 가까이하여 코 경로를 통해 순간 흡입에 의한 방식으로 투여된다.
코 투여에 적합한 제형은, 예컨대 활성 성분을 적게는 약 0.1% (w/w)에서 많게는 100% (w/w)로 포함할 수 있으며, 본원에 언급된 추가적인 성분을 한가지 이상 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 볼 투여(buccal administration)에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매할 수 있다. 이러한 제형은 예컨대, 통상적인 방법을 이용하여 제조된 정제 또는 로젠제의 형태일 수 있으며, 예컨대 활성 성분 0.1 내지 20% (w/w), 잔량의 경구 용해가능한 또는 분해가능한 조성물과, 선택적으로 본원에 언급된 하나 이상의 부가적인 성분을 포함할 수 있다. 대안적으로, 볼 투여에 적합한 제형은 활성 성분을 포함하는 분말 또는 에어로졸화되거나 또는 미립화된 용액이나 현탁액을 포함할 수 있다. 이러한 분말화된, 에어로졸화된 또는 미립화된 제형은 분산되는 경우에, 바람직하기로는 액적의 평균 입자 크기가 약 0.1 내지 약 200 nm이며, 본원에 언급된 추가적인 성분 한가지 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 안 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장 또는 판매할 수 있다. 이러한 제형은, 예컨대 수성 또는 오일성 액체 담체 중의 활성 성분의 0.1/1.0% (w/w) 용액 또는 현탁액 등의 점안제일 수 있다. 이러한 점악제는 완충제, 염 또는 본원에 언급된 하나 이상의 다른 추가적인 성분을 더 포함할 수 있다. 그외 사용가능한 눈으로 투여가능한 제형은 미세결정형 또는 리포좀 조제물 내에 활성 성분을 포함하는 것이 있다.
본원에서, "추가적인 성분"은 비제한적으로 하기한 성분들 중 하나 이상을 포함한다: 부형제; 계면활성제; 분산제; 무활성 희석제; 과립제 및 붕괴제; 결합제; 윤활제; 감미제; 향료; 착색제; 보존제; 생리 분해성 조성물, 예컨대 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 오일성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 완화제; 완충제; 염; 점증제; 충진제; 유화제; 항산화제; 항생제; 항진균제; 안정화제 및 약제학적으로 허용가능한 폴리머 또는 소수성 물질. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 그외 "추가적인 성분"은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 Genaro, ed., 1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA에 개시되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
전형적으로, 본 발명에 따른 화합물의 투여량은 동물, 바람직하기로는 인간에게 개체의 체중 1 kg 당 1 ㎍ 내지 약 100 g으로 투여될 수 있다. 투여되는 정확한 투여량은 동물의 타입 치료되는 질병 상태의 타입, 동물의 나이와 투여 경로를 비제한적으로 포함하는, 다양한 인자에 따라 변경될 것이다. 바람직하기로는, 화합물의 투여량은 동물의 체중 1 kg 당 약 1 mg 내지 약 10 g으로 다양할 수 있다. 더 바람직하기로는, 투여량은 개체의 체중 1 kg 당 약 10 mg 내지 약 1 g으로 다양할 수 있다.
화합물은 매일 수차례씩 자주 개체에게 투여하거나, 또는 하루에 한번, 일부일에 한번, 2주마다 1번, 한달에 한번 또는 수 개월 마다 한번 또는 일년 이하마다 한번과 같이 보다 드물게 투여할 수 있다. 투약 횟수는 당업자라는 쉽게 알 것이며, 비제한적으로 치료되는 질병의 타입 및 중증도, 개체의 타입과 나이 등의 다양한 인자에 의해 결정될 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 개체의 세포나 조직에 조성물의 투여를 설명하는 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 다른 예로, 이러한 키트는 화합물을 개체에게 투여하기 전에 본 발명의 조성물을 용해 또는 현탁하기에 적합한 (바람직하기로는 멸균된) 용매를 포함한다. 또한, 본 발명은 본원에 따라 혈관 투과성의 조절자를 동정하기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 p21-활성화된 키나제를 포함하고 있는 조직 또는 세포의 샘플, p21-활성화된 키나제의 표준 조절자, 어플리케이터(applicator) 및 이의 학습 자료를 포함한다.
추가적인 설명 없이도, 당업자라면 전술한 상세한 설명과 하기 예시된 실시예를 이용하여 본 발명의 화합물을 제조 및 이용하고 청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, 하기 실제 실시예는 본 발명의 바람직한 예를 구체적으로 나타내지만, 어떠한 방식으로도 나머지 내용을 제한하는 것으로 해석되지는 않는다.
도 1. 폐 염증에서의 혈관 투과성.
A. 1 mg Nck-차단 펩티드(PAK 차단 펩티드라 함; 서열번호 7 포함) 또는 대조군 펩티드을 복막내 주사하거나 또는 주사하지 않은 후 에어로졸화된 LPS를 마우스에 흡입시켰다. 6시간 후에, 폐를 적출하고, 추출한 다음 pSer141 및 총 PAK2에 대한 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 2가지 실험은 유사한 결과를 나타내었다.
B. A에 나타낸 바와 같이 대조군 또는 Nck 차단 펩티드와 함께 LPS를 마우스에 흡입시켰다. 6시간 후에, 에반스 블루 염료를 주사하고, 1시간 후에 폐로의 누출을 분석하였다. 수치는 평균 ± S.D.로 나타내고, n는 최소 4마리이다. *는 통 계학적 유의성을 의미하며, p<0.01는 펩티드를 사용하지 않은 LPS-처리 마우스에 대비한 것이다.
도 2. Erk는 PAK의 하류이다.
A. BAEC에, Nck 결합을 차단하는 20 ㎍/ml의 N-말단 PAK 펩티드, 돌연변이된 대조군 펩티드 또는 MEK 저해제 U0126(25 μM)을 미리 처리하였다. 한시간 후, 30분간 25 ng/ml의 VEGF를 첨가하였다. 이후, 세포를 고정하여 활성화된 Erk에 대해 염색하였다.
B. A에서와 같이 세포를 추출하고, 웨스턴 블롯으로 Erk 인산화를 분석하였다.
C. 3 ㎛의 필터 상의 BAEC를 우성적 네거티브 MEK1(DN MEK)으로 형질감염하고, 한시간 동안 20 ㎍/ml의 PAK N-말단 펩티드 또는 돌연변이된 대조군 펩티드를 미리 처리하거나 25 μM U0126을 미리 처리하였다. 세포는 무처리한 상태로 두거나 또는 1시간 동안 25 ng/ml VEGF, 50 ng/ml bFGF, 또는 10 μM 히스타민으로 자극시켰다. HRP(horseradish peroxidase)의 필터를 통한 누출을 방법에 언급된 바와 같이 분석하였다.
도 3. 생체내 Erk.
A. 마우스에 Nck-차단 펩티드(1 mg; 서열번호 7 포함), 대조군 펩티드(1 mg) 또는 UO126(0.5 ml, 70 μM)을 주사하고, 도 1에서와 같이 LPS를 처리 또는 무처리하였다. 6시간 후에, 폐를 적출하고, 단편화한 다음, pT202/pY204 항체를 이용하여 활성화된 Erk를 염색하였다. 작은 화살 표시는 양성으로 염색된 대조군 폐에서 미동정된 세포를 나타낸다. 큰 화살 표시는 도관 혈관(conduit blood vessel)을 나타낸다.
B. 마우스에, MEK 저해제 U0126 (0.5 ml, 70 μM)를 주사한 다음, 또는 주사하지 않고 LPS를 처리하였다. 하거나, 상기 저해제를 주사하지 않고 LPS를 처리하였다. 에반스 블루 염료의 노출은 A에서와 같이 분석하였다. *는 통계학적 유의성을 의미하며, p<0.05는 UO126를 사용하지 않은 LPS-처리 마우스에 대비한 것이다. n = 4 이상.
도 4. βPIX 및 GIT1에 대한 요건.
A. VEGF로 자극된 BAEC를 고정한 다음 GIT1 또는 βPIX에 대해 면역염색하였다.
B. WT GIT1, βPIX에 결합하지 않는, SPA2 상동 도메인(SHD)이 결손된 GIT1; WT βPIX; 또는 GIT1에 결합하지 않는, ΔGBD가 결손된 βPIX에 대한 형질감염 효율이 80-90%인, 핵천공(nucleoporation) 프로토콜을 이용하여 BAEC를 형질감염시켰다. 세포를 VEGF로 30분간 자극하고, 고정한 다음 포스포-S141 PAK에 대해 염색하였다.
C & D. B에서와 같이 세포를 형질감염시키고, VEGF로 자극한 다음, 세정제로 추출하고, 웨스턴 블롯으로 분석하여, Erk 인산화(C) 및 미오신 경쇄(MLC) ser 19 인산화(D)를 검출하였다.
도 5. GIT1 및 βPIX는 시험관내에서 투과성을 조절한다.
A. 도 4C에서와 같이 형질감염시킨 세포를 기공 크기 3.0 ㎛의 필터 상에서 컨플루언트 밀도로 평판 배양하였다. 배양물을 VEGF로 자극하고 방법에 언급된 바와 같이 HRP에 대한 투과성을 분석하였다.
B. HUVEC에 GIT1에 특이적인 siRNA 올리고뉴클레오티드나 또는 대조군의 스크램블드(scrambled) isRNA를 형질감염시켰다. 72시간째의 전체 세포 용혈물은 웨스턴 블롯(상단)으로 GIT1 발현을 분석하였다. 필터 위의 세포에서, VEGF(50 ng/ml), 히스타민(10 μM) 또는 트롬빈(0.2 U/ml)으로 처리한 후의 HRP에 대한 투과성을 분석하였다.
도 6. PAK 및 PIX간의 상호작용 차단
A. PIX SH3-차단 펩티드 및 돌연변이된 대조군의 서열. 투과성 서열은 서열번호 3이고, PIX 결합 서열은 서열번호 1이고, 이 두가지 서열의 조합인 PIX 결합 펩티드는 서열번호 4이다. 서열번호 4와 함께 사용하기 위한 대조군 펩티드는 서열번호 5의 서열을 가진다.
B. 세포 용혈물은 스트렙타비딘 비드에 고정된 펩티드와 함께 배양하고, 전체 세포 용혈물(WCL) 또는 결합된 단백질을 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
C. BAEC는 PIX 결합 펩티드 또는 대조군 펩티드와 함께 20 ㎍/ml 농도에서 한시간동안 배양하고, 30분간 VEGF로 자극하였다. 세포를 헹구로, 용혈시키고, βPIX로 면역침강하였다. IP's를 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
D. C에서와 같이 BAEC를 펩티드와 함께 배양하고, 용혈시킨 후, 웨스턴 블롯에 의해 Erk 활성화를 분석하였다.
E. C에서와 같이 세포를 펩티드와 함께 배양하고 bFGF로 60분간 자극한 다 음, F-액틴을 염색하였다.
도 7. PIX-PAK 상호작용의 펩티드 차단
A. 기공 크기가 3.0 ㎛인 필터 위에 둔 BAEC를 20 ㎍/ml PIX 차단 펩티드 또는 대조군 펩티드로 한시간 처리한 다음, 30분간 VEGF로 자극하였다. 단일층을 통과하는 HRP의 이동을 방법에 기재한 바와 같이 분석하였다
B. 마우스에 정해진 함량의 PIX 차단 펩티드 또는 대조군 펩티드를 복막내 주사하였다. 이 마우스에 6시간동안 에어로졸화된 LPS를 처리한 다음 에반스 블루 염료의 폐로의 누출을 방법에 언급된 바와 같이 분석하였다. 수치는 평균 ± S.D.로 나타내고, n는 4-8이다. *는 펩티드를 사용하지 않은 LPS-처리 마우스와 비교하여, p<.02를 의미하며, **는 p<.001를 의미한다.
C. 도 3A에서와 같이 1 mg/ml PIX 차단 펩티드를 미리 처리한 다음 LPS에 노출시킨 마우스의 폐에서, 포스포-Erk를 염색하였다. 무처리 및 LPS-처리 샘플을 비교할 수 있는 도 3A를 참조한다. 화살표는 도관 혈관을 표시한다.
도 8. 혈관 투과성의 PAK 유도에 대한 모델.
PAK은 염증, 혈전 및 신생혈관 자극에 반응하여 활성화된다. PAK에서 비전형적인 프롤린 다량 함유 서열이 βPIX SH3 도메인에 결합한다. PIX은 PAK의 C-말단에 있는 영역과 GIT1의 Spa1 상동 도메인(SHD)를 통해 GIT1에 결합한다. 또한, SHD도 MEK1/2에 결합한다. PAK은 MEK의 ser298을 인산화하여, Raf에 의한 MEK의 활성화를 촉진시킨다. 이후의 MEK에 의한 Erk의 활성화는, 미오신 경쇄 키나제(MLCK)의 활성화 및 수축성을 유도하여, 세포간 정션을 파괴한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 기술된다. 본 실시예는 예시의 목적으로 제공되는 것일 뿐, 본 발명을 실시예의 범위로 제한하려는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본 명세서에 제공된 내용의 결과로서 명백한 임의의 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에 기술된 실험은 Erk가 PAK 경로에서 PAK의 하류에 있는지 없는지를 조사한 것이다. 이 실험에서 PIX 결합 영역이 제거된 GIT1 구조체(GIT1-ΔSHD)와 GIT1 결합 영역이 제거된 βPIX 구조체(PIX-ΔGBD)가 사용되었다. Erk에 대한 PAK의 효과는 PIX 및 GIT의 어댑터(adapter) 기능을 요하는 것으로 가정하였으나, 이러한 가설에 제한되는 것은 아니다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, PIX 및 GIT의 돌연변이체를 발현하여 서로 결합하지 못하도록 하였으며, 이를 위해서 2가지 상이한 수단에 의해 복합체로부터 PAK를 제거해야 한다.
방법
세포 배양 및 형질전환
소 대동맥 내피 세포(BAEC)를 10% 우아혈청(bovine calf serum)(Atlanta Biologicals, Atlanta, GA), 100 μg/ml 디하이드로스트렙토마이신, 및 60 U/ml 페니실린 (Sigma, St. Louis, MO)이 포함된 저-글루코스 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 증식시켰다 (Stockton 2004 참조). 인간 제정맥 내피 세포 (HUVEC)는 Dr. Brett Blackman (University of Virginia)으로부터 입수하여, 제조자의 "SingleQuot" 첨가물 및 10% 우태아혈청 (Atlanta Biologicals)이 보충된 EGM-2 배 지 (Clonetics)에서 증식시키고, 3-10회 계대 배양하였다.
도면에 나타난 바와 같이, 필터 상의 일부 투과도 분석을 목적으로, 100 mm조직 배양 디쉬의 0.5% CS-DMEM 중 융합성 BAEC를, 제조자의 지식에 따라, 이펙텐(Effectene)을 이용하여 총 5 μg의 지시된 cDNA로 형질전환시켰다. 밤새 배양 후, 세포를 10% 혈청이 포함된 DMEM에 옮기고, 48시간째 사용하였다. 일부 분석을 목적으로, 세포를 뉴클레오포레이션(nucleoporation)으로 형질전환시켰다. 2개의 15 cm 플레이트로부터 90% 융합된 세포들을 분리하고, 1.5 ml 뉴클레오펙션(nucleofection) 버퍼 (10 mM HEPES 함유 페놀 레드-프리(red-free) M199)에서 재부양시켰다. 형질전환 각각에 대해, 0.2 μl 큐벳 중의 100 μl 세포 현탁액에 2.5 μg DNA를 수용하였다. 각 세포를 5 ml 성장 배지를 포함하는 60 mm에 옮긴 지 48시간 후에, Amaxa Nucleofector II M3 프로그램 사이클을 이용하여 뉴클레오펙션이 수행되었다. 면역형광을 목적으로, 디쉬에 FN-코팅 글래스 커버 슬립을 올려놓았다. PAK 펩티드를 peptides were synthesized by the Biomolecular Research Facility at the University of Virginia 또는 EZ Biolabs Inc. (Westfield IN)의 생물분자 연구 설비(Biomolecular Research Facility)를 이용하여 합성하고, 1회의 HPLC로 정제시켰다.
βPIX 및 GIT1 구조체는 Dr. A.F. Horwitz로부터 입수하였다. ΔGBD βPIX (GIT1 결합 돌연변이) 및 GIT1의 ΔSHD 돌연변이(PIX 및 MEK 결합 돌연변이)는 Zhang et al ., 2003에 개시되어 있다. 우성적 네거티브(dominant negative) MEK1는 Renshaw et al ., 1997에 기재되어 있다. 인간 서열에 대한 GIT1 Smartpool siRNA 올리고를 Dharmacon으로부터 입수하고, HUVEC에서 실험을 수행하였다. Smartpool 혼합물은 4가지 상이한 siRNA 올리고를 함유한다. 4가지 상이한 센스 서열은 다음과 같다:
5'GGCCAAAGCUGCUAAGAAGUU3'(서열번호 8)
5'GGACGACGCCAUCUAUUCAUU3' (서열번호 9)
5'GCACACCCAUUGACUAUGCUU3' (서열번호 10)
5'GGACGCCACAUCUCCAUUGUU3'(서열번호 11).
LPS -유도 폐 미세혈관 투과성
모든 동물 시험은 버지니아대학의 Animal Care and Use Committee 로부터 승인받았다. 야생형 숫컷 마우스 ( C57Bl /6, 8 내지 12주령, Jackson Labs , Bar Harbor , ME )를 30분간 분무된 LPS(살모넬라 엔테리티디스 ( Salmonella enteritidis ), Sigma Co ., St . Louis, MO )에 노출시켰다. 그 결과 미세혈관 투과성이 현저히 증가하였다 ( Reutershan et al ., 2005). 대조군 동물은 식염수를 흡입시켰다. 처치 30분 전에 일부 마우스에 PAK 억제 펩티드 또는 대조군 펩티드를 복강(ip) 주사하였다. 생체내 MEK의 역할을 시험하기 위해, 0.5 ml의 70 μM UO126를 복강 주사하였다. 6시간째 Evans 블루 염료 혈관외유출(extravasation) 기술 (Green et al ., 1988)을 이용하여 투과도를 분석하였다. 간단히 말하면, Evans 블루 (20 mg/kg; Sigma)를 안락사시키기 30분 전에 정맥내로 주입하였다. 우심실의 자발적인 박동을 통하여 폐를 관류시켜, 정맥내 염료를 제거하였다. 폐를 제거하고, Evans 블루를 Peng et al ., 2004에 개시된 바와 같이 추출하였다. Evans 블루 의 흡수도를 620 nm에서 측정하고, 헴색소의 존재량에 대해 수정하였다: A620 (수정) = A620 - (1.426 x A740 + 0.030)(Wang le et al ., 2002). 혈관외 유출된 Evans 블루를 표준 곡선에 대해 산출하였다 (폐중량 당 mg Evans 블루 염료).
면역침전 및 웨스턴 블롯팅
세포를 자극하고, 냉 PBS로 세정한 후, 0.5 ml의 차가운 면역침전 (IP) 버퍼로 (20 mM Tris pH 7.6, 0.5% NP40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 3 mM EGTA; + Sigma 단백분해효소 및 포스페이타아제 저해제 칵테일) 10분간 추출하였다. 상기 세포를 18 게이지 바늘 3X을 관통시키고, 10분간 마이크로퓨즈(microfuge)에서 12,000 X g으로 원심분리하였다. 상청액을 precleared with 25 μl의 단백질 G-아가로스 비드로 미리 검증 후, 2시간 동안 4°에서 지시된 1차 항체로 배양하였다. 항-포스포PAk는 Biosource International로부터 입수하고; 항-총 PAK는 Transduction Labs로부터 입수하고; 항-포스포-Erk 및 총 Erk는 Cell Signaling로부터 입수하였다. 항-GIT1 및 항-βPIX는 Santa Cruz Biotechnology로부터 입수하였다. 25 μl의 단백질 A- 또는 단백질 G-아가로스 비드를 첨가하고, 4℃에서 순환시키면서 추가의 2시간 동안 배양하였다. 비드를 침전시키고 0.5 ml IP 버퍼로 3회(3X) 세척하고, SDS-PAGE로 분리하였다. 펩티드에 결합시키기 위해, 25 μg의 비오틴-태그 펩티드를 30분간 25 μl의 스트렙타비딘 비드로 배양한 후, 세정하고 30분간 0.5 세포 용해물로 배양하였다. 결합된 단백질은 지시된 항체로 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하였다. βPIX에 대해, 세포를 HA-PIX로 형질전환하고, 항-HA로 블롯을 탐침 하였다. 단백질을 전기영동으로 트리스-버퍼 식염수(TBS) 중의 5% 우유로 차단된 PVDF 막에 이동시키고, 동일한 버퍼 중 1차 항체로 밤새 탐침시켰다. 막을 4쇠 세척하고, 2시간 동안 2차 항체로 탐침시킨 후, 화학 발광 (ECL, Amersham)으로 가시화하였다.
시험관내 투과성
융합에 가까운 (near-confluence) FN-코팅된 3 μm 필터 상의 BAEC를 전술한 이펙텐(Effectene)을 이용하여 0.5 μg cDNA로 형질전환하였다. 48시간 후, 세포를 지시된 바와 같이, PAK 펩티드로 60분간 전처리하였다. 일부 시험에서, 세포를 뉴클레오펙션시킨 후, 필터 상에 두고 48시간 동안 융합하도록 증식시켰다. 그 후, 필터를, 500 μl의 신선한 DMEM을 포함하나 페놀 레드 또는 혈청을 포함하지 않는 외부 웰에 위치시켰다. 각 필터 웰에, 사이토카인을 함유하거나 함유하지 않은 200 μl의 배지 + 50 μl의 1.5 μg/ml 당근과산화효소 (HRP)에 가하였다. 30분 후, 필터를 제거하고 고정시킨 후, 웰 하부의 배지를 Stockton et al ., 2004에 기재된 바와 같이 HRP에 대해 분석하였다. 측정치를 대조군인 비처리 웰에 대해 표준화하였다.
면역형광
세포를 60분간 3.5% 포름알데히드 중에서 고정시키고, 세척한 후, 10분간 0.2% TX100 중에서 투과시켰다. 커버슬립을 60분간 10% 산양 혈청이 함유된 PBS로 차단한 후, 다음 항체를 포함하는 200 μl로 8시간 동안 탐침하였다: 포스포-ERK ( 1:500); 포스포-MEK (1:500); 포스포-PAK (1:500); 포스포-MLC (1:500) (모두 BioSource International에서 입수); βPIX (1:200) 또는 GIT1 (1:200) (Santa Cruz Biotechnology). 커버슬립을 세척하고 200 μl 항-마우스 IgG-Alexa 568 또는 항-래빗 IgG-Alexa 488 (Molecular Probes) (1:1000)로 4℃에서 밤새 탐침하였다. 커버슬립을 세척하고 FluoroMount (Invitrogen)로 표본 제작하였다.
면역조직화학
마우스 폐를 15분간 일정한 압력 하에서(20 cm H 2 O ) PFA 4%를 기관내 점적주입하여 팽창시켰다. 다음에, 폐를 제거하고 24시간 동안 PFA 4% 중에서 고정시킨 후, 파라핀 중에 함몰시켰다. IHC 를 위해 단편(5 μm)을 절단하고 항원 노출( unmasking ) 용액( Vector Laboratories )으로 처리하였다. 절편을 밤새 모노클로날 래빗 항 p- ERK (1:400 세포 신호전달( Cell Signaling ))로 염색하고, Vectastain Elite 키트 ( Vector Laboratories)로 검출하였다. DAB ( Dako Corp )로 가시화하고, 헤마토실린으로 대조염색하였다. ImagePro 소프트웨어 프로그램을 이용한 디지털 카메라(( model DP70 Olympus)가 장착된 현미경( model BX51 ; Olympus ) 상의 20 또는 40x 대물렌즈로 상을 얻었다.
결과
PAK 저해는 마우스 내 급성 폐손상에서의 액체 수송을 감소시킨다
이전의 연구들은 시험관내 내피 접합의 완전성(endothelial junctional integrity)의 조절에서 PAK를 관련시켰으나 (Zeng et al., 2000; Stockton et al., 2004), 생체내 혈관 투과성에 대한 관련성은 측정하지 않았다. PAK 저해가 생체내 혈관 누출을 감소시키는지 여부를 시험하기 위하여, 분무된 리포폴리사카라이드 (LPS)의 흡입이 폐 내 액체 축적을 유발하는, 급성 폐손상 마우스 모델을 사용하였다 (Reutershan et al., 2005). LPS는 주로 폐 상주 마크로파지에 작용하여 다양한 사이토카인의 방출을 유발한다. PAK 키나제 활성 증가와 관련된 PAK 상의 인산화 부위에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해, LPS에 노출된 마우스로부터 폐 내 인산화 증가가 나타났다 (도 1A). The normalized increase was 2.1 ± 0.5 fold relative to 대조군 (n=2)에 대해 2.1 ± 0.5배의 표준 증가가 관찰되었으며, 이는 상기 시스템에서 PAK 활성화를 입증하는 것이다.
종래에, 전장 우성적 네거티브 PAK의 저해 효과는 Nck의 SH3 도메인에 결합하는 N-말단 프롤린-풍부한 서열에 대해 맵핑하는 것으로 밝혀졌다 (Kiosses et al., 1999). 이 서열이 HIV TAT 단백질로부터 폴리베이직 서열과 결합된 펩티드는, 용이하게 세포로 유입되고 우성적 네거티브 PAK의 발현과 유사하게 PAK 기능을 차단한다 (Kiosses et al., 2001). 또한, 상기 펩티드는 성장 인자나 염증성 사이토카인으로 자극된 내피 세포 배양물 내 투과성을 저해하였다 (Stockton et al., 2004).
따라서, 마우스에 TAT-PAK N-말단 펩티드를 주입하고 LPS를 흡입시킨 후, Evans 블루 염료의 폐로의 유출을 시험하였다. Nck-결합 펩티드는 염료 축적을 강하게 저해하는 반면, SH3에 필수적인 프롤린 2개가 알라닌으로 치환된 대조군 펩티드는 아무런 효과를 나타내지 않았다 (도 1B). 비록 이 펩티드가 다른 SH3 단백질 과 결합하거나 PAK 이외의 Nck 타겟에 영향을 미칠 수도 있다는 점을 배제할 수는 없으나, 상기 데이터는 생체내 투과성 조절에서 PAK의 역할을 시사한다.
시험관내 혈관 투과성에서 Erk 에 대한 역할
다음에, Erk 경로의 관련성 여부를 조사하였다. 1차 분석으로, 배양물 내 융합성 소 대동맥 내피 세포에서 Erk의 국소화와 활성을 측정하였다. VEGF 자극은, 세포-세포 경계면에 위치한 실질적인 분획과 함께, 활성 Erk에 대한 전체 염색의 증가를 유도하였다 (도 2A). 이 염색은 MEK 저해제 UO126로 전처리 시 거의 제거되었는데, 이는 신호가 특이적임을 입증하는 것이다. 그 후, PAK 저해 펩티드를 이용하여 Erk가 이 경로의 PAK 하류에 위치하는지 아닌지를 시험하였다. 총 세포 용해물의 웨스턴 블롯팅에 의해, VEGF에 의한 Erk의 활성화가 거의 PAK N-말단 펩티드 및 MEK 저해제 UO126에 의해 차단되는 것으로 나타났다 (도 2B). 또한, 활성 Erk에 대한 면역염색 시 세포-세포 경계면에서 포스포Erk의 감소가 나타났다 (도 2A). bFGF에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다 (도시 안 함).
시험관내 혈관 투과성에 대한 효과를 조사하기 위하여, 내피 세포를 구멍이 3μm인 필터 상에서 증식시키고, 단층을 통한 당근과산화효소(HRP)의 수송을 분석하였다. VEGF, bFGF 또는 히스타민에 의해 유도된 투과성이 UO126 또는 우성적 네거티브 MEK, 및 PAK N-말단 펩티드에 의해 차단되었다 (도 2C).
그리고 나서, 배양된 내피 세포를 이용한 상기 결과들이 생체내 혈관계에도 적용될 수 있는지 여부를 조사하였다. 우선, 폐 단편을 포스포Erk에 대한 항체로 염색하였다. 비처리 마우스로부터 유래된 폐에서, 대부분의 폐는 폐포벽에 희박하 게 분포된 세포를 제외하고는 거의 신호를 보이지 않았다 (작은 화살표; 도 3A). 이들 세포는 상주 마크로파지 또는 수지상세포처럼 보이지만, 이들 세포의 정체는 불분명하다. LPS-처리 마우스의 경우, 혈관벽을 따라 특정 부위의 여러가지 세포 형태의 혈관 내피에서 Erk 활성의 현저한 증가가 관찰되었다 (큰 화살촉). 혈관보다는 덜 하지만, 폐포도 양성적으로 염색되었다. 이러한 염색은 폐포 모세관 또는 상피를 나타낼 수는 있지만, 광현미경에 의해 특정 세포 형태가 결정되지는 않는다. Nck-PAK 상호작용을 차단하는 펩티드로 마우스를 처리하면 Erk 활성을 크게 방해하는데, 이는 Erk가 PAK의 하류에 위치함을 시사한다. 대조군으로서, 마우스를 MEK 저해제 UO126로 전처리한 경우, 이 역시 조직을 통하여 Erk 활성을 차단하였다 (도 3A). Erk가 이 시스템에서 혈관 누출에 필수적인지 여부를 결정하기 위하여, 폐 투과성에 대한 UO126의 효과를 분석하였다. 이 모델에서 MEK 저해제는 LPS에 의한 혈관 누출의 유도를 차단하였다 (도 3B). 상기 데이터는 MEK-Erk 경로가 혈관 투과성에 대한 PAK의 효과를 조정할 수 있음을 시사하나, 이러한 원리에 제한되는 것은 아니다.
β PIX 및 GIT1 의 관련성
다음으로, 특정 단백질 간 상호작용이, PAK의 Erk 하류 활성화를 촉진하는지에 대한 가능성이 고려되었다. PAK는, PAK 내 통상적이지 않은 프롤린-풍부 서열이 PIX의 SH3 도메인에 결합함으로써, PIX 단백질과 결합되는 것으로 공지되어 있다 (Manser et al ., 1998). PIX는 또한, Rac 및 Cdc42에 대해 뉴클레오타이드 교환 활성을 가진 DH/PH 중심 모듈, 및 GIT1에 결합하는 C-말단 부근의 영역을 포함 한다 (Bagrodia et al ., 1999; Zhao et al ., 2000). GIT1은 그 N-말단에 Arf GAP 도메인과 PIX에 결합하는 Spa2-상동성 도메인(SHD)을 포함한다 (Turner et al., 2001). 이 SHD 영역은 또한 MEK1 및 2에 결합한다 (Premont et al ., 2004; Yin et al ., 2004). 따라서, PIX-GIT 복합체는 PAK와 MEK를 근접시키는 능력을 가지며, 이로 인해 MEK의 활성을 촉진할 수 있다.
βPIX 및 GIT1에 대한 항체를 이용한 내피세포 단일층 염색은, 이들 단백질의 일부가 세포-세포 경계에 존재하고 있음을 나타내었다(도 4A). 또한, 폐 단편의 염색은, 내피에 2가지 단백질 모두가 발현됨을 나타내었다(데이타 미기재). 이들 상호작용의 기능적 참여를 조사하기 위해, 내피 세포에 WT βPIX 또는 C-말단의 GIT 결합 영역이 제거된 돌연변이에 대한 벡터를 형질감염시켰다. 부가적으로, 세포에 WT GIT1 또는 PIX 및 MEK에 결합하는 SHD가 제거된 돌연변이를 형질감염시켰다. 돌연변이 βPIX 및 GIT1의 발현은, 포스포-S141 PAK의 세포-세포 정션으로의 국지화를 완전히 차단시켰지만, WT 구조체는 아무런 효과가 없었다(도 4B). 또한, 돌연변이 구조체는 Erk 및 MLC의 활성화는 차단하지 못하였지만, WT 구조체는 활성화를 증가시키거나 또는 아무런 효과가 없었다(도 4C 및 D). 마지막으로, 2종의 βPIX 및 GIT1 돌연변이 모두 VEGF (도 5A) 및 bFGF (미지개)에 대해 반응하여, 시험관내에서 내피 단일층을 통과하는 투과성 증가를 효과적으로 차단하였다. 이와는 반대로, WT 구조체의 발현시에는 투과성이 증가되었다. 이에, PIX-GIT 복합체가 PAK의 하류인 Erk 및 MLC 활성화를 촉진시키는데 주된 역할을 한다고 결론내렸다.
이러한 결과는, GIT1 낫 아웃이 트롬빈에 반응하여 혈관 투과성을 증가시킨다고 보고한 Berk 및 동료(van Nieuw Amerongen et al ., 2004)의 결과와 상충하는 것으로 보일 수 있다. 이러한 차이를 해결하기 위해, 복수개의 사이토카인에 대한 반응에 의한 시험관내 투과성에 대한 GIT1 낫 아웃 효과를 본원에서 조사하였다. HUVEC에서, GIT1을 타겟으로 하는 siRNA 올리고뉴클레오티드는 베이스라인을 낮추었으며, bFGF 및 히스타민에 의해 유도된 투과성 증가를 효과적으로 차단시켰지만, 트롬빈으로 인해 유도된 투과성에는 통계학적인 유의한 효과는 없었다(도 5B). 이전에 관찰된 투과성 강화(van Nieuw Amerongen et al ., 2004)는 본 연구에서 나타나지 않았지만, GIT1이 사이토카인과 비교하여, 트롬빈 경로에서 별개의 작용을 수행하는 것은 명백하다. 강화가 나타나지 않는 것은 실험 조건 차이 또는 기원 세포 차이로 인한 것일 수 있다.
PIX - GIT 복합체의 펩티드 저해
PAK-PIX-GIT 복합체의 기능적 관련성을 추가적으로 테스트하기 위해, PAK-PIX 상호작용의 펩티드 저해자를 사용하였다(도 6A). PAK는 SH3 결합에 대한 보존적인 서열에 맞지 않는 변칙적인 프롤린 다량 함유 부위를 통해 PIX SH3 도메인에 결합한다(Manser et al ., 1998). 이의 세포내 도입을 촉진시키기 위해, 서열이 이의 N-말단에 있는 HIV Tat 폴리베이직 영역과 융합된 펩티드를 합성하였다(Schwarze et al ., 1999). 또한, 본 발명자들은 검출 및 풀-다운 분석에서 고정화를 용이하게 하기 위해 그것의 c-말단에 바이오틴 텍(tag)을 추가하였다.
세포 용혈물을 스트렙타비딘 비드에 결합된 펩티드와 함께 인큐베이션하였을 때, PIX-결합 펩티드는 βPIX에 고효율로 결합하였다(도 6B). 2개의 중요한 잔기가 돌연변이된 대조군 펩티드에서의 βPIX의 결합은 관찰되지 않았다. 코르탁틴(cortactin)이 약하지만 재현가능한 결합으로 나타났지만, 다른 SH3-함유 단백질에서는 결합이 나타나지 않았다. 세포 용혈물을 보다 많은 양으로 사용하였을 때에는, 약하지만 특이적인 CD2AP의 결합과 약하고 비특이적인 DOCK180 결합도 검출할 수 있었다(미기재). 따라서, 펩티드는 다른 것에도 그렇지만, PIX에 낮은 친화성 상호작용으로 선택적인 것으로 보인다.
PAK 및 PIX 사이의 상호작용을 파괴하는 능력을 테스트하기 위해, 내피 세포를 세포에 도일하도록 하는 TAT 서열이 융합된 돌연변이된ㄴ 대조군 펩티드나 또는 PIX 결합 펩티드 20 ㎍/ml과 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 헹구고 세정제로 추출한 다음 βPIX를 면역침강시켰다. 펩티드는 다량의 PIX 에서도 효과가 없었지만 침전물에서는 PAK를 약 70%로 감소시켰다(도 6C). 이러한 결과는, 펩티드가 라이시스(lysis) 전에 씻겨 제거되었기 때문에 저해 정도를 결정할 수 없을 수 있어, 이에 면역 침강 동안에 일부 재-조합이 이루어질 수 있음을 제외시키지 않았다. Erk 활성화를 분석하였을 때, PIX 차단 펩티드는 효과적으로 VEGF-자극을 저해하였으나, 대조군 펩티드는 아무런 효과가 없었다(도 6D). bFGF에 의한 Erk 자극도 차단되었다(미기재). 또한, bFGF(도 6E) 또는 VEGF(미기재)에 대한 반응에 의한 액틴 세포골격의 재구성화를 조사하였다. 이러한 성장 인자는 처리된 세포에서의 액틴 스트레스 섬유 증가를 촉발시켰으며, 이는 돌연변이되지 않은 활성형의 펩티드에 의해 차단되었다. 또한, 20 ㎍/ml에서 PIX-결합 펩티드는 VEGF에 대한 반응으 로 소 내피세포(도 7A) 및 HUVECS(미기재)에서의 시험관내 투과성 증가를 약 80%로 차단하였다. 유사한 결과가 bFGF에서도 나타났다(미기재).
생체내 PIX 차단 펩티드
생체내 혈관 투과성에 PAK 및 PIX 사이의 상호작용이 필요한지를 조사하기 위해, LPS를 흡입시킨 후 마우스를 조사하였다. 이들 실험에서, NMR 구조를 토대로 이들 잔기는 PIX과의 상호작용에 참여하지 않는 것으로 나타난(Mott et al ., 2005), 3개의 C-말단 잔기와 바이오틴이 없는 TAT-PAK 펩티드를 사용하였다. PIX 차단 펩티드는 에반스 블루 염료의 폐로의 누출을 농도 의존적인 양상으로(1 mg에서 62% 저해, 2 mg에서 85% 저해)을 현저하게 감소시켰지만, 대조군 펩티드는 유의한 효과가 없었다(도 7B). 포스포-Erk 염색의 저해는 폐 조직 단편에서도 관찰되었다(도 7C; 3A와 비교, +LPS 샘플, 화살표는 혈관을 나타냄). PAK과 PIX간의 복합체는 폐 염증의 생체내 모델에서 Erk의 활성화 및 혈관 누출 유발에 필요하다.
결론
Erk를 활성화시키고 혀관 투과성을 유도하는 PAK의 능력은 PAK-PIX-GIT 복합체의 완전성에 달려있다. 이 요건은 염증, 혈전 및 혈관신생 매개자와 관련된 것이다. 이러한 결론은 세포-세포 경계에 관련 성분의 공동-국지화 및 저해 구조체, siRNA-매개 낫 아웃 및 세포-침투 펩티드에 의한 경로 파괴를 근거로 한 것이다. 현재 공개된 데이타를 토대로한 모델을 도 8에 나타낸다. 이 모델에서, 사이토카인은 βPIX에 결합되는 PAK의 활성화를 촉발한다(Stockton et al., 2004). GIT1은 PIX 및 MEK1 또는 2 둘다에 결합하여, 활성 PAK를 MEK와 가깝게 한다. 이후, PAK 는 MEK의 ser298을 인산화시켜, Raf에 의한 MEK 결합성 및 활성화를강화한다(Frost et al., 1997). 인산화된 MEK는 Erk를 활성화시키고, 이는 MLCK를 활성화시켜, 종래에 개시된 바와 같이 미오신-의존적인 수축성을 조성하고(Klemke et al., 1997), 그로 인해 세포-세포 정션이 파괴되는(Stockton et al., 2004) 것으로 생각된다. 그러나, MEK가 Erk과 독립적으로 혈관 투과성을 자극하는 것으로 보고되었다(Wu et al., 2005). 어떠한 특정 이론에 결부되길 원하지 않으며, Erk의 특이적인 소분획(subfraction)이 적절한 스캐폴딩 단백질에 결합하여 이러한 효과들을 매개하는 것으로 가정된다. 한부위 유착(focal adhesion)에 위치하는 Erk의 소량의 분획이 전체 활성형 Erk과는 다른 특성을 가지기 때문에, 이러한 개념에 대한 선례가 있다(Hughes et al., 2002).
LPS 흡입 모델에서의 PAK 활성화는 다양한 인자를 분비하는 수종의 세포 타입이 참여하는 케스케이트로 인한 것임이 틀림없다. 혈관벽에서의 Erk 할성화의 지역적 특성(focal nature)은, 백혈구와의 국소 상호작용이 틀림없이 중요하다고 제시한다. 여러가지 인자들은 별개의 시그널링 경로를 이용하여 혈관 투과성을 유도한다는 증거가 있다. 예컨대, VEGF는 src-의존적 경로에 따르지만, bFGF는 그렇지 않다(Eliceiri et al., 1999). 트롬빈 작용은 주로 Rho 및 Rho 키나제에 의해 매개된다(Essler et al., 1998; van Nieuw Amerongen et al., 2004). 그러나, PAK 및 Erk는 이들 이잔들 모두가 공유하는 공통된 시그널링 중간산물인 것으로 보인다. GIT1의 완전한 낫 아웃은 PAK-PIX-GIT 복합체의 파괴와는 별개인 효과를 가지고 있다는 것은 흥미로운 일이다. GIT1 낫 아웃은 트롬빈-유도성 투과성을 강화시 키거나(van Nieuw Amerongen et al., 2004) 또는 아무런 효과가 없지만(본 출원), 복합체의 파괴는 확실히 차단된다. GIT1의 다른 활성은 트롬빈 반응을 조절하는데 관여되는 것 같다. 예컨대, GIT1은 Arf GAP 활성을 가지며, 이것은 일부위 유착 분해(focal adhesion disassembly)를 자극할 수 있다(Turner et al., 2001). 이러한 생각과 일관되게, GIT1 발현의 억제는 트롬빈 처리된 세포에서 일부위 유착을 강화하였다(van Nieuw Amerongen et al., 2004). 그러나, PAK-PIX-GIT 상호작용의 특이적인 파괴는 다른 효과를 가지는 것으로 보인다.
본원에 언급된 각각 및 모든 특허, 특허 출원 및 공개문헌들의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
참조 및 특정 섹션을 찾는 것을 보조하기 위해, 표제가 기재된다. 이들 표제는 본원에 언급된 개념의 범위로 한정되고자 하는 의도는 아니며, 이들 개념은 명세서 전체에 거쳐 다른 섹션에서 적용가능할 수 있다.
기재된 예에 대한 전술한 사항을 제공하여, 당업자가 본 발명을 실행하거나 이용가능하게 한다. 이러한 예에 대한 다양한 변형은 당업자들이라면 용이하게 알 것이며, 본원에 명시된 일반적인 원칙은 본 발명의 사상이나 범위로부터 이탈되지 않으면서 다른 예에 적용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 나타낸 예로만 한정되는 것은 아니며, 본원에 언급된 원칙 및 새로운 특징에 부합되는 가장 넓은 범위에 해당된다.
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Claims (32)

  1. 필요한 개체에서 혈관 투과성(vascular permeability)을 조절하는 방법으로서,
    상기 방법은 PAK, PIX, GIT, MEK, Erk 및 MLCK로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 단백질 조절 경로에 대한 유효량의 조절자 1종 이상과, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 혈관 투과성은 PAK, PIX, GIT, MEK, Erk 및 MLCK로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 단백질 조절 경로에 의해 조절되고, 그로 인해 혈관 투과성이 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조절자 1종 이상은 한가지 이상의 상기 단백질 조절 경로의 저해자인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 조절자는 혈관 투과성을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 조절자는 혈관 투과성 증가를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 저해자는 성장 인자에 의해 자극된 혈관 투과성 증가를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 저해자는 사이토카인에 의해 자극된 혈관 투과성 증가를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 저해자는 박테리아 독소에 의해 자극된 혈관 투과성 증가를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 경로는 PAK 경로인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 PAK 경로는 PAK-PIX-GIT-MEK-Erk 경로인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 4항에 있어서, 상기 저해자는 펩티드, 핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 아프타머(aptamer), 키나제 저해자 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 1, 2, 4, 6 및 7, 및 이들의 생 물학적 활성의 상동체, 유도체 및 변형체로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 펩티드는 세포막 투과성을 강화하기 위한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 siRNA는 GIT에 대한 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 siRNA 서열은 서열번호 8, 9, 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 2항에 있어서, 상기 1종 이상의 조절자들 중 하나는 UO126인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10항에 있어서, 상기 저해자는 단백질 상호작용 또는 복합체 형성을 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 단백질 상호작용 또는 복합체 형성은 PAK-PIX, PAK-MEK, PIX-GIT 및 GIT-MEK로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, PIX는 PIXα 또는 PIXβ인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, GIT는 GIT1 또는 GIT2인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17항에 있어서, MEK는 MEK1 또는 MEK2인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 10항에 있어서, 상기 저해자는 Erk 활성화를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 10항에 있어서, 상기 저해자는 MLCK 활성화를 저해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 10항에 있어서, 상기 핵산은 분리된 핵산이며, 상기 분리된 핵산은 서열번호 1, 2, 4, 6 및 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 개체는 조직 손상, 허혈증, 염증, 발작, 상처 치유, 급성 호흡 곤란 증후군, 고혈압, 심근경색, 패혈증, 저산소증, 감염, 알레르기 반응, 열손상, X-조사 및 자외선 조사로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈관 투과성 관련 질환, 장애 또는 상태를 앓고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 혈관 투과성 관련 질환, 장애 또는 상태를 조절하는 화합물을 투여하기 위한 키트로서,
    상기 키트는 제1항에 따른 하나 이상의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 어플리케이터(applicator) 및 이의 사용을 위한 학습 자료(instructional material)를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  26. 혈관 투과성을 저해하는 화합물을 동정하는 방법으로서,
    상기 화합물은 PAK, PIX, GIT, MEK, Erk 및 MLCK 조절 경로로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 단백질 조절 경로를 저해하며,
    상기 방법은
    상기 조절 경로들 중 적어도 하나의 경로를 포함하고 있는 테스트 세포를 테스트 화합물과 접촉시키는 단계;
    상기 조절 경로들 중 적어도 하나의 경로의 활성 또는 기능을 측정하는 단계를 포함하며,
    상기 테스트 세포에서의 활성 또는 기능이 상기 테스트 화합물과 접촉시키지 않은 동일한 세포에서의 활성 또는 기능에 비해 그 수준이 낮으면, 이는 상기 테스트 화합물이 혈관 투과성을 저해함을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 조절 경로는 PAK인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 방법은 PAK 인산화를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 방법은 PAK의 세포-세포 정션(junction)으로의 전좌를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 26항에 있어서, 상기 방법은 혈관 투과성을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 26항에 있어서, 상기 방법은 생체내 유체 이동을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 26항에 있어서, 상기 방법은 단백질-단백질 상호작용 또는 복합체 형성을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
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