BR112017022994A2 - proteína de ligação de rgma e uso da mesma - Google Patents

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Hashimoto Motonori
Yamashita Toshihide
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Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Univ Chiba Nat Univ Corp
Univ Osaka
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Abstract

a presente invenção visa obter um anticorpo anti-molécula orientadora repulsiva a (rgma) tendo uma alta atividade de ligação e poucos efeitos colaterais que pode ser usada como um remédio para a prevenção, tratamento, ou prevenção da recaída de doenças neurológicas ou imunológicas. o problema é resolvido fornecendo-se uma proteína de ligação de rgma isolada que não inibe a ligação entre rgma e neogenina mas neutraliza a atividade inibidora do crescimento de neurite de rgma, preferivelmente fornecendo-se um anticorpo anti-rgma que tenha regiões determinadoras de complementaridade tendo sequências de aminoácido das seq id nos: 30 a 35 ou seq id nos: 36 a 40 na listagem de sequência, e sfg.

Description

“PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE RGMa E USO DA MESMA”
CAMPO TÉCNICO [0001] A presente invenção se refere a uma proteína de ligação de RGMa e um uso da mesma.
TÉCNICA FUNDAMENTAL [0002] RGM (molécula orientadora repulsiva), que é uma proteína de membrana ancorada ao GPI com um peso molecular de cerca de 33 kDa, foi inicialmente identificada como uma molécula orientadora de axon no sistema visual (ver Documento Não Patente 1). A família RGM inclui três membros chamados RGMa, RGMb e RGMc. Entre eles, RGMa é re-expresso depois da lesão ao sistema nervoso central em seres humanos adultos e ratos assim como no estágio desenvolvimental, e a inibição da RGMa em rato acelera o crescimento de neurite depois da lesão da medula espinhal e promove a recuperação funcional (ver Documento Não Patente 2). Assim, a RGMa é considerada ser um inibidor de neurite depois da lesão ao sistema nervoso central.
[0003] A RGMa também foi relatada ter efeitos no sistema imune. A RGMa é expressa nas células dendríticas e atua sobre as células T, realçando deste modo a adesão de células T a ICAM-1 e fibronectina e induzindo a produção de citocina (Documento de Patente 4). Em um modelo de camundongo de esclerose múltipla, a administração de anticorpo anti-RGMa suprime os sintomas devido à encefalomielite e também mostra efeitos de supressão do início e recaída. É considerado que anticorpo anti-RGMa se liga à RGMa expressa nas células dendríticas para inibir a ativação de células T, exercendo deste modo efeitos sobre a esclerose múltipla.
[0004] Os mecanismos de transdução de sinal de RGMa também estão sendo elucidados, e a proteína neogenina foi relatada como um receptor de RGMa (Documento de Patente 3). A neogenina é uma proteína de transmembrana única expressa nos neurônios e células T.
[0005] A RGMa se liga à neogenina em uma membrana celular para induzir a ativação de RhoA intracelular e inativação de Ras, fornecendo deste modo um efeito inibidor do crescimento de neurite. Entretanto, a neogenina é conhecida causar a
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2/65 apoptose na ausência de ligação de RGMa em um cérebro de galinha em desenvolvimento (Matsunaga et al., Dev. Growth Differ, 46, 481, 2004). Assim, o caminho da RGMa/neogenina é considerado ter dois efeitos conflitantes de promover a sobrevivência neuronal, que é um efeito favorável para a regeneração de nervo, e de inibir o crescimento de neurite, um efeito negativo.
[0006] Como um agente farmacêutico que alveja RGM, o Documento de Patente 1 divulga um agente promotor da regeneração de axon contendo um anticorpo neutralizante anti-RGM como um ingrediente ativo. Os Documentos de Patente 2 e 3 divulgam um agente terapêutico para dano mecânico ao cérebro e medula espinhal, um anticorpo anti-RGM que regula a ligação de RGM à sua neogenina receptora. O Documento de Patente 4 divulga usos médicos de anticorpo anti-RGM tal como para a esclerose múltipla. O Documento de Patente 5 divulga usos terapêuticos de anticorpo anti-RGM para doenças incluindo esclerose múltipla, lesão cerebral de mamífero, lesão da medula espinhal, apoplexia, doença neurodegenerativa e esquizofrenia. Além disso, o Documento de Patente 6 divulga usos terapêuticos de moduladores de RGM tais como anticorpo anti-RGM para lesão da medula espinhal e esclerose múltipla, e o Documento Não Patente 3 divulga um uso terapêutico para a esclerose múltipla progressiva.
DOCUMENTOS DA TÉCNICA ANTERIOR
DOCUMENTOS DE PATENTE [0007] Documento de Patente 1: W02005/087268 [0008] Documento de Patente 2: Pedido de Patente PCT Traduzido Japonês
Aberto ao Público No. 2010-537655 [0009] Documento de Patente 3: Pedido de Patente PCT Traduzido Japonês
Aberto ao Público No. 2009-510002 [0010] Documento de Patente 4: WO2011/071059 [0011] Documento de Patente 5: Pedido de Patente PCT Traduzido Japonês
Aberto ao Público No. 2011 -512806 [0012] Documento de Patente 6: Pedido de Patente PCT Traduzido Japonês
Aberto ao Público No. 2004-525875
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DOCUMENTOS NÃO PATENTES [0013] Documento Não Patente 1: Neuron 5, 735-743 (1990) [0014] Documento Não Patente 2: J. Cell Biol. 173, 47-58 (2006) [0015] Documento Não Patente 3: Cell Reports 10, 1-12 (2015)
SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO [0016] Usos terapêuticos de anticorpo anti-RGMa contra doenças neurológicas e imunológicas são divulgados como descrito acima, mas anticorpos convencionais têm problemas tais como atividade insuficiente, possibilidade de prejudicar funções intrínsecas de RGMa, e efeitos colaterais. Em particular, os anticorpos convencionais podem inibir a ligação entre RGMa e neogenina, inibindo também deste modo efeitos favoráveis tais como supressão da apoptose exercida pela neogenina ligada a RGMa. [0017] Assim, um objetivo da presente invenção é fornecer uma proteína de ligação de RGMa que não inibe a interação da RGMa/neogenina mas neutraliza a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa.
SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA [0018] Os inventores da presente invenção intensivamente estudaram de modo a resolver os problemas acima. Como um resultado, os presentes inventores tiveram sucesso na obtenção de uma proteína de ligação de RGMa que não inibe a ligação entre RGMa e neogenina mas neutraliza a atividade de inibição do crescimento de neurite de RGMa, e descobriram que a proteína de ligação de RGMa pode ser usada como um remédio doenças neurológicas ou imunológicas, completando deste modo a presente invenção.
[0019] A presente invenção é como segue.
[0020] [1 ] Uma proteína de ligação de RGMa isolada, que não inibe a ligação entre
RGMa e neogenina mas neutraliza a atividade inibidora do crescimento de neurite da RGMa.
[0021] [2] A proteína de ligação de RGMa descrita em [1], que se liga à RGMa humana, de rato e/ou camundongo.
[0022] [3] A proteína de ligação de RGMa descrita em [1] ou [2], que se liga aos
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4/65 peptídeos de EEVVNAVEDWDSQG (SEQ ID NO: 26 na Listagem de Sequência),
NQQIDFQAFHTNAE (SEQ ID NO: 27 na Listagem de Sequência), PTAPETFPYET (SEQ ID NO: 28 na Listagem de Sequência), e/ou KLPVEDLYYQA (SEQ ID NO: 29 na Listagem de Sequência).
[0023] [4] A proteína de ligação de RGMa descrita em qualquer um de [1] a [3], que se liga aos peptídeos das SEQ ID NOS: 26 e 27 na Listagem de Sequência.
[0024] [5] A proteína de ligação de RGMa descrita em qualquer um de [1] a [4], que se liga aos peptídeos das SEQ ID NOS: 26, 27 e 28 na Listagem de Sequência.
[0025] [6] A proteína de ligação de RGMa descrita em qualquer um de [1] a [4], que se liga aos peptídeos das SEQ ID NOS: 26, 27 e 29 na Listagem de Sequência.
[0026] [7] A proteína de ligação de RGMa descrita em qualquer um de [1] a [6], em que a proteína de ligação de RGMa é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico, ou um antígeno-fragmento de ligação do mesmo.
[0027] [8] Uma molécula de ácido nucléico codificando a porção de proteína da proteína de ligação de RGMa descrita em qualquer um de [1] a [7], [0028] [9] Um vetor recombinante compreendendo a molécula de ácido nucléico descrita em [8].
[0029] [10] Uma célula hospedeira contendo o vetor recombinante descrito em [9]. [0030] [11] Um método para produzir a proteína de ligação de RGMa descrita em [1 ] a [7], o método compreendendo uma etapa de cultivar a célula hospedeira descrita em [10], [0031] [12] Uma composição farmacêutica compreendendo a proteína de ligação de RGMa descrita em qualquer um de [1] a [7], [0032] [13] A composição farmacêutica descrita em [12] para o uso na prevenção, tratamento, ou prevenção da recaída de doenças neurológicas ou imunológicas.
[0033] [14] A composição farmacêutica descrita em [13], em que as doenças neurológicas são selecionadas do grupo consistindo de esclerose lateral amiotrófica, lesão do plexo braquial, dano cerebral (incluindo lesão cerebral traumática), paralisia cerebral, síndrome de Guillain-Barre, leucodistrofia cerebral, esclerose múltipla
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5/65 (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária), neuromielite óptica, síndrome pós-pólio, espinha bífida, lesão da medula espinhal, atrofia muscular espinhal, neoplasma espinhal, mielite transversa, demência (incluindo demência senil, deterioração cognitiva branda, doença de Alzheimer, demência associada com a doença de Alzheimer), doença de Huntington, discinesia tardia, mania, doença de Parkinson, síndrome de Steele-Richardson, síndrome de Down, miastenia grave, neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico), amiloidose vascular, hemorragia cerebral associada com amiloidose, infartação cerebral, cerebrite, estado confusional agudo, glaucoma, esquizofrenia e degeneração da camada fibrosa do nervo retinal (incluindo retinopatia diabética, neuropatia óptica isquêmica, retinosquises ligadas ao cromossoma X, neuropatia óptica induzida por medicamento, distrofia retinal, degeneração macular relacionada com a idade, doenças oculares caracterizadas pelas drusas de disco óptico, doenças oculares caracterizadas por determinante genético para a degeneração de fotorreceptor, distrofia recessiva autossômica do cone-bastonete, distúrbio mitocondrial associado com neuropatia óptica).
[0034] [15] A composição farmacêutica descrita em [13], em que as doenças imunológicas são selecionadas do grupo consistindo de esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária), neuromielite óptica, psoríase, artrite (incluindo artrite reumatóide, osteoartrite, artrite psoriática), síndrome de GuillainBarre, doença neuro-Behcet, anemia perniciosa, diabete melito tipo I (insulinodependente), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), doença intestinal inflamatória (IBD), síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, anemia hemolítica autoimune, púrpura trombocitopênica autoimune, asma, polinose, dermatite atópica, glomerulonefrite, miastenia grave, doença de Hashimoto, e sarcoidose.
[0035] [16] A composição farmacêutica descrita em [13], em que as doenças neurológicas ou imunológicas são selecionadas do grupo consistindo de lesão da medula espinhal, neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico) e esclerose múltipla
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6/65 (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária).
[0036] [17] Um anticorpo anti-RGMa isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em que a sequência de aminoácido de cada uma da região determinadora de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), a região determinadora de complementaridade de cadeia leve 2 (LCDR2), a região determinadora de complementaridade de cadeia leve 3 (LCDR3), região determinadora de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), região determinadora de complementaridade de cadeia pesada 2 (HCDR2) e região determinadora de complementaridade de cadeia pesada 3 (HCDR3) compreende o seguinte:
[0037] LCDR1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO: 30 na Listagem de Sequência) [0038] LCDR2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 31 na Listagem de Sequência) [0039] LCDR3: QQLNTLP (SEQ ID NO: 32 na Listagem de Sequência) [0040] HCDR1: DAWMD (SEQ ID NO: 33 na Listagem de Sequência) [0041] HCDR2: EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID NO: 34 na Listagem de Sequência) e [0042] HCDR3: RDGAY (SEQ ID NO: 35 na Listagem de Sequência);
[0043] ou [0044] LCDR1: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 36 na Listagem de Sequência) [0045] LCDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 37 na Listagem de Sequência) [0046] LCDR3: SQSTHVP (SEQ ID NO: 38 na Listagem de Sequência) [0047] HCDR1: TSYYWN (SEQ ID NO: 39 na Listagem de Sequência) [0048] HCDR2: YISYDGTNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 40 na Listagem de Sequência) e [0049] HCDR3: SFG, e [0050] em que em cada uma das sequências de CDR de um a vários aminoácidos podem ser substituídos, deletados, e/ou adicionados.
[0051] [18] O anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do
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7/65 mesmo descrito em [17], [0052] em que a região variável de cadeia pesada (VH) compreende o seguinte:
[0053] VH:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSK ANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGT TVTVSS (SEQ ID NO: 41 na Listagem de Sequência) ou uma sequência de aminoácido tendo uma identidade de pelo menos 90% com a dita sequência de aminoácido; e [0054] em que a região variável de cadeia leve (VL) compreende o seguinte: [0055] VL:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME (SEQ ID NO: 42 na Listagem de Sequência) ou uma sequência de aminoácido tendo uma identidade de pelo menos 90% com a dita sequência de aminoácido.
[0056] [19] O anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito em [17] ou [18], em que o anticorpo anti-RGMa é um anticorpo humanizado.
[0057] [20] O anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito em qualquer um de [17] a [19], em que o anticorpo anti-RGMa compreende uma região constante de IgG humana.
[0058] [21 ] Uma proteína de ligação de RGMa, que compete com o anticorpo antiRGMa descrito em [17] ou [18] quanto à ligação à RGMa.
[0059] [22] Uma molécula de ácido nucléico codificando a porção de proteína do anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrita em qualquer um de [17] a [20].
[0060] [23] A molécula de ácido nucléico descrita em [22], em que as sequências de nucleotídeo codificando as sequências de aminoácido de VH e VL cada uma é uma sequência de nucleotídeo compreendendo:
[0061] VH: gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcagatccctgagactgtcctgtaccgcctccgg
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8/65 cttcaccttctccgacgcctggatggattgggtgcgacaggctcctggcaagggcctggaatgggtggccgagatccg gtccaaggccaacaaccacgccacctactacgccgagtctgtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactcc aagtccatcgtgtacctgcagatgaactccctgcggaccgaggacaccgccctgtactactgcaccagaagggacg gcgcctactggggcaagggcaccacagtgacagtgtcctcc (SEQ ID NO: 43 na Listagem de
Sequência), e [0062] VL: gacatccagatgacccagtccccctcctccgtgtctgcttccgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcgggcctccc aggacatctcctcctacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactacacctcc cggctgcactccggcgtgccctctagattttccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgca gcccgaggacttcgcctcctacttctgtcagcagctgaacaccctgccctggacctttggcggaggcaccaaggtgga aatggaa (SEQ ID NO: 44 na Listagem de Sequência).
[0063] [24] Um vetor recombinante compreendendo a molécula de ácido nucléico descrito em [22] ou [23].
[0064] [25] Uma célula hospedeira contendo o vetor recombinante descrito em [24].
[0065] [26] Um método para produzir o anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrita em qualquer um de [17] a [20], o método compreendendo uma etapa de cultivar a célula hospedeira descrita em [25].
[0066] [27] Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrita em qualquer um de [17] a [20].
[0067] [28] A composição farmacêutica descrita em [27] para o uso na prevenção, tratamento, ou prevenção da recaída de doenças neurológicas ou imunológicas.
[0068] [29] A composição farmacêutica descrita em [28], em que as doenças neurológicas são selecionadas do grupo consistindo de esclerose lateral amiotrófica, lesão do plexo braquial, dano cerebral (incluindo lesão cerebral traumática), paralisia cerebral, síndrome de Guillain-Barre, leucodistrofia cerebral, esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária), neuromielite óptica, síndrome pós-pólio, espinha bífida, lesão da medula espinhal, atrofia muscular espinhal,
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9/65 neoplasma espinhal, mielite transversa, demência (incluindo demência senil, deterioração cognitiva branda, doença de Alzheimer, demência associada com doença de Alzheimer), doença de Huntington, discinesia tardia, mania, doença de Parkinson, síndrome de Steele-Richardson, síndrome de Down, miastenia grave, neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico), amiloidose vascular, hemorragia cerebral associada com amiloidose, infartação cerebral, cerebrite, estado confusional agudo, glaucoma, esquizofrenia e degeneração da camada fibrosa do nervo retinal (incluindo retinopatia diabética, neuropatia óptica isquêmica, retinosquises ligadas ao cromossoma X, neuropatia óptica induzida por medicamento, distrofia retinal, degeneração macular relacionada com a idade, doenças oculares caracterizadas pelas drusas de disco óptico, doenças oculares caracterizadas pelo determinante genético para a degeneração de fotorreceptor, distrofia recessiva autossômica do cone-bastonete, distúrbio mitocondrial associada com neuropatia óptica).
[0069] [30] A composição farmacêutica descrita em [28], em que as doenças imunológicas são selecionadas do grupo consistindo de esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária), neuromielite óptica, psoríase, artrite (incluindo artrite reumatóide, osteoartrite, artrite psoriática), síndrome de GuillainBarre, doença neuro-Behcet, anemia perniciosa, diabete melito tipo I (insulinodependente), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), doença intestinal inflamatória (IBD), síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, anemia hemolítica autoimune, púrpura trombocitopênica autoimune, asma, polinose, dermatite atópica, glomerulonefrite, miastenia grave, doença de Hashimoto, e sarcoidose.
[0070] [31] A composição farmacêutica descrita em [28], em que as doenças neurológicas ou imunológicas são selecionadas do grupo consistindo de lesão da medula espinhal, neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico) e esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária).
[0071] [32] Um método para a prevenção, tratamento, ou prevenção da recaída de
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10/65 doenças neurológicas ou imunológicas, o método compreendendo uma etapa de administrar uma dose eficaz da proteína de ligação de RGMa descrita em qualquer um de [1] a [7] a um sujeito em necessidade do mesmo.
[0072] [33] Um método para prevenção, tratamento, ou prevenção da recaída de doenças neurológicas ou imunológicas, o método compreendendo uma etapa de administrar uma dose eficaz do anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo descrito em qualquer um de [17] a [20] a um sujeito em necessidade do mesmo.
EFEITO VANTAJOSO DA INVENÇÃO [0073] A proteína de ligação de RGMa da presente invenção não inibe a interação entre RGMa e neogenina, sendo deste modo capaz de manter efeitos tais como inibição da apoptose sobre os neurônios e os semelhantes exercida pela neogenina ligada à RGMa, tendo assim um forte efeito protetivo sobre os neurônios e pouca preocupação quanto aos efeitos colaterais associada com a depleção neuronal. Além disso, o anticorpo anti-RGMa humanizado da presente invenção é superior aos anticorpos convencionais em propriedades tais como ligação à RGMa humano e estabilidade térmica. Portanto, o anticorpo pode ser usado como um remédio para doenças neurológicas ou imunológicas que tem uma eficácia excelente e poucos efeitos colaterais.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0074] A Fig. 1 mostra um resultado de um ensaio de inibição da ligação de RGManeogenina usando um anticorpo policlonal anti-RGMa (AF2459), um anticorpo do exemplo comparativo (r5F9), e anticorpos da presente invenção (r70E4 e 116A3).
[0075] A Fig. 2 mostra um resultado de um ensaio de inibição da ligação de RGMaBMP2 usando um IgG de camundongo de controle e anticorpos da presente invenção (B5,70E4e B5,116A3).
[0076] A Fig. 3 mostra um resultado de um teste de estabilidade térmica para anticorpos usando um anticorpo de exemplo comparativo (rH5F9), um anticorpo quimérico da presente invenção (r116A3C) e anticorpos humanizados da presente invenção (HE/KA e HA/KC).
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11/65 [0077] A Fig. 4 mostra um resultado de um ensaio de crescimento de neurite usando os anticorpos da presente invenção (B5,70E4 (esquerda) e B5,116A3 (direita)).
[0078] A Fig. 5 mostra um resultado de um teste de eficácia usando um IgG de camundongo de controle (mo-lgG2bk), e os anticorpos da presente invenção (r70E4 e r116A3) e usando um modelo de rato de lesão da medula espinhal. Os resultados dos testes de eficácia em (A) um modelo de esmagamento da medula espinhal e (B) um modelo de hemissecção da medula espinhal são mostrados.
[0079] A Fig. 6 mostra um resultado de um teste de eficácia para o anticorpo da presente invenção (B5,116A3) usando um modelo de camundongo de esclerose múltipla induzida por um peptídeo PLP139-151. O lado esquerdo mostra as contagens EAE, 0 lado direito mostra as mudanças no peso corporal, e as partes de topo e fundo mostram resultados quando os anticorpos de teste foram administrados depois de 7 e 10 dias e depois de 18 e 21 dias, respectivamente.
DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO [0080] De modo a facilitar 0 entendimento da presente invenção, os termos usados na presente invenção serão explicados abaixo.
RGMa [0081] RGMa é uma proteína inibidora do crescimento de neurite no sistema nervoso central e a proteína RGMa humana é biossintetizada como uma proteína precursora compreendendo 450 aminoácidos como mostrada na SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência. O peptídeo de sinal Met 1 a Pro 47 presente no terminal N (que se refere ao peptídeo do primeiro resíduo de metionina até 0 47° resíduo de prolina do lado do terminal N, similarmente descrito a seguir) é removido, a ligação peptídica entre Asp 168 e Pro 169 é clivada, e 0 peptídeo do terminal C Arg 423 a Cys 450 é removido e simultaneamente uma âncora GPI é adicionada ao grupo carboxila do terminal C de Gly 422 que se tornou 0 terminal C. Uma proteína RGMa humana é expressa em uma membrana celular via a âncora GPI como uma proteína madura na qual 0 domínio de terminal N (Cys 48 a Asp 168) e 0 domínio de terminal C (Pro 169 a Ala 424) são unidos entre si por uma ligação de dissulfeto. Uma proteína precursora
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12/65 de RGMa de camundongo compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequência e uma proteína precursora de RGMa de rato compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequência. Visto que seus peptídeos de terminal C são removidos, as suas proteínas maduras têm a mesma sequência de aminoácidos. Na presente invenção, RGMa pode se referir a uma proteína precursora, uma proteína madura ou um fragmento ativo da mesma, ou pode ser um derivado ou variante da mesma, contanto que a mesma atue via ligação à neogenina como descrito mais tarde. A RGMa pode ser RGMa humana ou RGMa derivada de outros organismos, mas a RGMa humana é preferida.
Neogenina [0082] A neogenina é expressa, por exemplo, nos neurônios nervosos centrais e funciona como um dos receptores de RGMa. Como mostrado na SEQ ID NO: 10 na Listagem de Sequência, a proteína neogenina humana compreende 1461 aminoácidos e é expresso como uma proteína de membrana madura depois da remoção do peptídeo de sinal Met 1 a Ala 33. Na presente invenção, a neogenina pode se referir a uma proteína precursora, uma proteína madura ou um fragmento de ligação de RGMa, ou pode ser um derivado ou variante das mesmas, contanto que a mesma se ligue à RGMa. A neogenina pode ser neogenina humana ou neogenina derivada de outros organismos, mas a neogenina humana é preferida.
Neutralização [0083] O termo neutralização como aqui usado se refere a uma ação através da qual a ligação a um alvo de interesse e inibição de qualquer função do alvo pode ocorrer. Em outras palavras, a frase “neutralizar a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa” significa que uma proteína de ligação de RGMa se liga à RGMa, inibindo deste modo a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa. A atividade inibidora do crescimento de neurite pode ser avaliada por um ou mais de vários ensaios in vitro ou in vivo conhecidos na técnica, e pode ser avaliada, por exemplo, pelo ensaio de inibição do crescimento de neurite aqui descrito.
Isolado
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13/65 [0084] O termo “isolada” tal como em proteína de ligação de RGMa isolada significa ser identificada, e separada e/ou recuperada dos componentes no seu estado natural. Impurezas no estado natural são substâncias que podem interferir com o diagnóstico ou uso terapêutico do anticorpo, incluindo enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Geralmente, a isolação de proteína de ligação de RGMa ou similares pode ser obtida em pelo menos uma etapa de purificação. A proteína de ligação de RGMa purificada em pelo menos uma etapa de purificação pode ser aludida como “proteína de ligação de RGMa isolada”.
Proteína de ligação de RGMa [0085] Como aqui usado, o termo “proteína de ligação de RGMa” se refere a uma molécula compreendendo uma proteína que se liga à RGMa. Os exemplos das proteínas de ligação de RGMa incluem anticorpos anti-RGMa e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos; proteínas de esqueleto de ligação de RGMa; proteínas receptoras de RGMa solúveis tais como domínio extracelular de Neogenina; e proteínas de fusão das mesmas. O termo “proteínas de esqueleto de ligação de RGMa” se refere a uma proteína que realiza a função de ligação à RGMa pela introdução de mutações dentro do domínio Kunitz de um inibidor da serina protease, o domínio extracelular de fibronectina humana, anquirina, lipocalina ou similares. O termo “proteína de fusão” se refere às proteínas de ligação de RGMa química ou geneticamente ligadas às moléculas funcionais outras que não a proteína de ligação de RGMa do presente pedido tais como polímeros não peptídicos tais como polietileno glicol (PEG), substâncias radioativas, toxinas, compostos de peso molecular baixo, citocinas, fatores de crescimento (por exemplo, TGF-β, NGF, neurotrofina), albumina, enzimas, e outros anticorpos.
Anticorpo humano [0086] O termo “anticorpo humano” se refere a um anticorpo em que as cadeias leve e pesada são ambas derivadas da imunoglobulina humana. Dependendo da diferença nas regiões constantes de cadeia pesada, os anticorpos humanos incluem IgG tendo cadeias pesadas γ (incluindo IgG 1, lgG2, lgG3 e lgG4), IgM tendo cadeias pesadas μ, IgA tendo cadeias pesadas α (incluindo lgA1 e lgA2), IgD tendo cadeia
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14/65 pesadas δ, ou IgE tendo cadeias pesadas ε. As cadeias leves, em princípio, compreendem cadeias κ ou cadeias λ.
Anticorpo humanizado [0087] O termo “anticorpo humanizado” se refere a um anticorpo compreendendo as regiões variáveis compreendendo as regiões determinadoras de complementaridade de um anticorpo derivado de um animal não humano e regiões de armação derivadas de um anticorpo humano, e regiões constantes derivadas de um anticorpo humano.
Anticorpo quimérico [0088] O termo “anticorpo quimérico” se refere a um anticorpo no qual a cadeia leve, a cadeia pesada, ou ambas compreendem uma região variável derivada de não ser humano e uma região constante derivada de ser humano.
Anticorpo anti-RGMa [0089] Como aqui usado, o termo “anticorpo anti-RGMa” se refere a moléculas de imunoglobulina que se ligam à RGMa, ou moléculas modificadas da mesma. As moléculas modificadas incluem anticorpos multiespecíficos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos funcionalmente modificados, e anticorpos conjugados.
Anticorpo Multiespecífico [0090] O termo “anticorpo multiespecífico” se refere a um anticorpo assimétrico compreendendo dois ou mais sítios de reconhecimento de antígeno independentes tendo duas ou mais especificidades antigênicas diferentes, incluindo anticorpo biespecífico tendo duas especificidades antigênicas e anticorpo triespecífico tendo três especificidades antigênicas.
Anticorpo Funcionalmente Modificado [0091] Como aqui usado, o termo “anticorpo funcionalmente modificado” se refere a um anticorpo em que funções outras que não a função de ligação de antígeno do anticorpo, incluindo função de morte celular, função ativadora de complemento e função prolongadora da meia-vida sérica, são modificadas modificando-se principalmente a cadeia de aminoácido ou açúcar da região Fc do anticorpo.
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Anticorpo Conjugado [0092] Como aqui usado, o termo “anticorpo conjugado” se refere a um anticorpo química ou geneticamente ligado às moléculas funcionais outras que não o anticorpo tal como polímeros não peptídicos tais como polietileno glicol (PEG), substâncias radioativas, toxinas, compostos de peso molecular baixo, citocinas, fatores de crescimento (por exemplo, TGF-β, NGF, neurotrofina), albumina, e enzimas. Fragmento de ligação de antígeno [0093] Como aqui usado, o termo “fragmento de ligação de antígeno” se refere a uma proteína que compreende uma parte de um anticorpo e pode se ligar a um antígeno. Os exemplos do fragmento de ligação de antígeno incluem F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv (fragmento variável de anticorpo), Fv ligado a dissulfeto, anticorpo de cadeia única (scFv), e polímeros do mesmo. Além disso, o fragmento de ligação de antígeno inclui fragmentos de ligação de antígeno química ou geneticamente ligados conjugados às moléculas funcionais outras que não o anticorpo anti-RGMa no presente pedido tal como polímeros não peptídicos tais como polietileno glicol (PEG), substâncias radioativas, toxinas, compostos de peso molecular baixo, citocinas, fatores de crescimento (por exemplo, TGF-β, NGF, neurotrofina), albumina, enzimas, e outros anticorpos.
Região Determinadora de Complementaridade [0094] O termo “região determinadora de complementaridade (CDR)” se refere a uma região que forma um sítio de ligação de antígeno em uma região variável de uma molécula de imunoglobulina, que também é chamada de uma região hipervariável, e particularmente se refere a uma porção em que a sequência de aminoácido muda enormemente para cada molécula de imunoglobulina. Como CDR, as cadeias leve e pesada cada uma tem três CDRs (LCDR1, LCDR2, LCDR3, e HCDR1, HCDR2, HCDR3). No presente pedido, as CDRs de uma molécula de imunoglobulina são determinadas de acordo com o sistema de numeração de Kabat (Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA).
Identidade percentual (%) de Sequência de Aminoácido
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16/65 [0095] “Identidade percentual (%)” com respeito à sequência de polipeptídeo de referência identificada, tal como a região variável, é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácido em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido de uma sequência de polipeptídeo de referência particular, depois de dispor as sequências e introduzir intervalos como necessário de modo a se obter a identidade % máxima e assumindo que nenhuma das substituições conservatives é considerada parte da identidade de sequência. O alinhamento para os propósitos de determinar a identidade % pode ser realizado usando-se vários métodos dentro da habilidade da técnica, por exemplo, usando software de computador publicamente disponível tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ou Megalign (DNASTAR). Aqueles habilitados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para se obter alinhamento máximo no comprimento total das sequências que são comparadas. Entretanto, para os propósitos aqui, os valores de identidade % são obtidos usando-se o programa de computador de comparação de sequência BLAST em alinhamentos aos pares.
[0096] Em situações onde BLAST é usada para comparações de sequência de aminoácido, a identidade % de uma dada sequência de aminoácido A para uma dada sequência de aminoácido B é calculada como segue:
[0097] 100 vezes a fração X/Y [0098] onde X é o número de resíduos de aminoácido marcados como emparelhamentos idênticos pelo programa de alinhamento de sequência Blast em que o alinhamento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Será avaliado que se o comprimento da sequência de aminoácido A for diferente do comprimento da sequência de aminoácido B, a identidade % de A para B será diferente da identidade % de B para A. A menos que de outro modo estabelecido, todo os valores da identidade % aqui são obtidos usando o programa de computador BLAST como mostrado no parágrafo imediatamente precedente. Competição [0099] Como aqui usado, o termo “competir” com o anticorpo anti-RGMa da presente invenção significa que, como medido pela ressonância plasmônica
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17/65 superficial (SPR) aqui descrita, a ligação entre o anticorpo anti-RGMa da presente invenção e RGMa é diminuída com uma diferença significante devido à presença do dito anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
[0100] A presente invenção será descrita em detalhes abaixo.
Proteína de ligação de RGMa [0101] A proteína de ligação de RGMa da presente invenção é uma proteína de ligação de RGMa isolada, que não inibe a ligação entre RGMa e neogenina mas neutraliza a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa.
[0102] Preferivelmente, as proteínas de RGMa são proteínas de RGMa derivadas de mamíferos. Por exemplo, as proteínas de RGMa humanas incluem uma proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência, as proteínas de RGMa de camundongo incluem uma proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequência, e as proteínas RGMa de rato incluem uma proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequência. Um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido em que de um a vários (preferivelmente de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10, ainda mais preferivelmente de 1 a 5) aminoácidos nestas sequências são substituídos, deletados, inseridos e/ou adicionados e tendo substancialmente a mesma atividade como a proteína RGMa; ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo 90% ou mais (preferivelmente 95% ou mais) identidade com a sequência de aminoácido também pode ser preferido.
[0103] Como aqui usado, um polipeptídeo “tendo substancialmente a mesma atividade como a proteína RGMa” inclui qualquer polipeptídeo contanto que o polipeptídeo tenha a ação inibidora do crescimento de neurite.
[0104] A substituição de aminoácido é preferivelmente substituição conservativa. Como aqui usado, “substituição conservativa” significa substituir um resíduo de aminoácido com um outro resíduo de aminoácido quimicamente similar de modo a não alterar substancialmente a atividade do peptídeo. Por exemplo, a substituição de um resíduo hidrofóbico por um outro resíduo hidrofóbico, a substituição de um resíduo polar por um outro resíduo polar tendo a mesma carga elétrica, e os semelhantes são
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18/65 incluídos. Os exemplos de aminoácidos funcionalmente similares com os quais tal substituição é possível incluem, como aminoácidos não polares (hidrofóbicos), alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptofano, fenilalanina e metionina. Os exemplos de aminoácidos polares (neutros) incluem glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina, e cisteína. Os exemplos de aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, histidina e lisina. Os exemplos de aminoácidos negativamente carregados (ácido) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.
[0105] A ligação da proteína de ligação de RGMa da presente invenção à RGMa significa ligação específica a RGMa. Mais preferida é uma proteína de ligação de RGMa tendo uma constante de dissociação (Kd) baixa para a RGMa humana, por exemplo, de 10’8 M ou menos, mais preferivelmente 10’9 M ou menos, ainda mais preferivelmente 10’10 M ou menos como o valor de limite superior, e por exemplo sem limitação, de 10’14 M ou mais, mais preferivelmente 10’13 ou mais como o valor de limite inferior.
[0106] A proteína RGMa compreende um domínio de terminal N e um domínio de terminal C como uma proteína madura, mas tem a atividade inibidora do crescimento de neurite apenas com o domínio de terminal C. A proteína de ligação de RGMa da presente invenção preferivelmente se liga apenas ao domínio de terminal C de RGMa para neutralizar a atividade inibidora do crescimento de neurite. Mais preferida é uma proteína de ligação de RGMa tendo uma constante de dissociação (Kd) baixa para o domínio de terminal C da RGMa humana, por exemplo, de 10’8 M ou menos, mais preferivelmente 10’9 M ou menos, ainda mais preferivelmente 10’10 M ou menos como o valor de limite superior, e por exemplo sem limitação, de 10’14 M ou mais, mais preferivelmente 10’13 ou mais como o valor de limite inferior.
[0107] A proteína de ligação de RGMa da presente invenção não inibe a ligação entre RGMa e neogenina. Aqui, a frase “não inibe a ligação entre RGMa e neogenina” significa que, no sistema de ligação de RGMa e neogenina mostrado no Exemplos descrito mais tarde, mesmo quando a concentração da proteína de ligação de RGMa é aumentada, a ligação entre RGMa e neogenina não é substancialmente diminuída. Por exemplo, no caso onde a proteína de ligação de RGMa é adicionada ao sistema
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19/65 de ligação de RGMa e neogenina e a sua concentração é aumentada, se a concentração da proteína de ligação de RGMa apresentar IC50 que não seja menor do que 10 pg/ml, mais preferivelmente não menor do que 50 pg/ml, o mais preferivelmente não menor do que 100 pg/ml, pode ser dito que a proteína de ligação de RGMa não inibe a ligação entre RGMa e neogenina.
[0108] A neogenina usada para o ensaio de ligação com RGMa é preferivelmente neogenina do mesmo tipo como RGMa. Em outras palavras, é preferido que a neogenina de camundongo ou ser humano seja usada para RGMa de camundongo ou ser humano, respectivamente. Um exemplo de neogenina humana inclui uma proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 na Listagem de Sequência. Entretanto, contanto que a mesma seja capaz de ligação à RGMa, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido com 90% ou mais (preferivelmente 95% ou mais) identidade com a SEQ ID NO: 10 na Listagem de Sequência pode ser preferida.
[0109] A proteína de ligação de RGMa da presente invenção neutraliza a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa. A atividade inibidora do crescimento de neurite pode ser avaliada por um ensaio de crescimento de neurite mostrado nos Exemplos descritos mais tarde. A adição de RGMa inibe o crescimento de neurite, mas a adição da proteína de ligação de RGMa impede a inibição do crescimento de neurite pela RGMa. A proteína de ligação de RGMa da presente invenção pode neutralizar a inibição do crescimento de neurite pela adição de RGMa em 50% ou mais, mais preferivelmente em 80% ou mais, e o mais preferivelmente em 90% ou mais.
[0110] Visto que a sequência de aminoácidos das proteínas RGMa variam dependendo da espécie animal, também existe diferenças na sequência de aminoácido entre a RGMa humana representada pela SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência, a RGMa de camundongo representada pela SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequência, e a RGMa de rato representada pela SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequência. Visto que roedores tais como camundongos e ratos são geralmente usados como materiais experimentais nos testes farmacológicos e de segurança de
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20/65 preparações de proteína tais como preparações de anticorpo, a proteína de ligação de RGMa da presente invenção preferivelmente se liga à RGMa de camundongo e/ou rato, e as mais preferidas são aquelas tendo um Kd baixo para a RGMa de camundongo e/ou rato. As proteínas de ligação de RGMa cujo Kd tem o limite superior, por exemplo, de 5 x 10’7 M ou menos, mais preferivelmente 10’8 M ou menos, ainda mais preferivelmente 10’9 M ou menos, e o valor de limite inferior, por exemplo sem limitação, de 10’12 M ou mais, mais preferivelmente 10’11 ou mais são incluídas.
[0111] A proteína de ligação de RGMa da presente invenção é preferivelmente excelente na estabilidade térmica. A estabilidade térmica pode ser avaliada por uma diminuição na ligação com RGMa pelo tratamento térmico, e a proteína de ligação de RGMa da presente invenção é preferivelmente estável ainda pelo tratamento térmico a 60°C ou mais alto, mais preferivelmente ainda pelo tratamento térmico a 65°C ou mais alto, o mais preferivelmente ainda pelo tratamento térmico a 70°C ou mais alto. [0112] O sítio de ligação quando a proteína de ligação de RGMa da presente invenção se liga à RGMa não é partícularmente limitada. Por exemplo, na RGMa humana, a ligação a um ou mais dos seguintes peptídeos é preferida: EEVVNAVEDWDSQG (SEQ ID NO: 26 na Listagem de Sequência) (números de aminoácido 298-311 da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência), NQQIDFQAFHTNAE (SEQ ID NO: 27 na Listagem de Sequência) (números de aminoácido 322-335 da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência), PTAPETFPYET (SEQ ID NO: 28 na Listagem de Sequência) (números de aminoácido 349-359 da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência), KLPVEDLYYQA (SEQ ID NO: 29 na Listagem de Sequência) (números de aminoácido 367-377 da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência). A proteína de ligação de RGMa da presente invenção se liga mais preferivelmente às SEQ ID NOS: 26 e 27 da listagem de Sequência, mais preferivelmente às SEQ ID NOS: 26 e 27 da listagem de Sequência e às SEQ ID NOs: 28 ou 29 da listagem de Sequência.
[0113] Os exemplos específicos de proteína de ligação de RGMa incluem anticorpo anti-RGMa, proteínas de esqueleto de ligação de RGMa, e proteínas de fusão dos mesmos.
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Anticorpo anti-RGMa [0114] O anticorpo anti-RGMa da presente invenção inclui anticorpos policlonais ou monoclonais obtidos usando-se a proteína RGMa ou um fragmento parcial da mesma (por exemplo, um fragmento contendo uma ou mais das SEQ ID NOS: 26 a 29 na Listagem de Sequência acima) como um antígeno e imunizante mamíferos tais como camundongos com os antígenos; anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados produzidos usando a tecnologia de recombinação de gene; anticorpos humanos produzidos usando, por exemplo, animais transgênicos que produzem anticorpo humano; e os semelhantes. Quando o anticorpo da presente invenção é administrado como um produto farmacêutico aos seres humanos, um anticorpo humanizado ou um anticorpo humano são preferíveis do ponto de vista dos efeitos colaterais.
[0115] Os antígenos podem ser diretamente usados para a imunização ou podem ser usados como um complexo com uma proteína carregadora. Para preparar um complexo de um antígeno e uma proteína carregadora, agentes de condensação tais como glutaraldeído, carbodiimida e éster ativo em maleimida podem ser usados. Os exemplos da proteína carregadora incluem albumina sérica bovina, tiroglobulina, hemocianina, e KLH.
[0116] Os exemplos de mamíferos a serem imunizados incluem camundongos, ratos, hamsters, porquinhos da índia, coelhos, gatos, cães, porcos, cabras, cavalos e gado, e os métodos de inoculação incluem administração subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal. Na administração, antígenos podem ser administrados em mistura com adjuvante de Freund completo ou adjuvante de Freund incompleto, e a administração é usualmente realizada uma vez a cada 2 a 5 semanas. As células que produzem anticorpo obtidas do baço ou linfônodos dos animais imunizados são fundidos com células de mieloma e isoladas como hibridomas. Como as células de mieloma, aquelas derivadas de um mamífero tal como camundongo, rato, ou ser humano são usadas.
Anticorpo Policlonal [0117] Os anticorpos policlonais podem ser obtidos pelos métodos de produção
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22/65 comum existentes. Isto é, anticorpos policlonais podem ser obtidos do soro obtido de animais submetidos à imunização, por exemplo, pela imunização de um mamífero como descrito acima com um antígeno como descrito acima junto com adjuvante de
Freund como necessário.
Anticorpo Monoclonal [0118] Especificamente, anticorpos monoclonais podem ser obtidos como segue. Isto é, um antígeno como descrito acima é usado como um imunógeno, e o imunógeno é injetado ou transplantado de uma a várias vezes em combinação com Adjuvante de Freund, se necessário, a um mamífero como descrito acima subcutânea, intramuscular, intravenosamente, em uma almofada da pata ou intraperitonealmente para imunização. Geralmente, a imunização é realizada de 1 a 4 vezes a cada 1 a 14 dias da imunização inicial, e as células que produzem anticorpo são obtidas do mamífero imunizado de cerca de 1 a 5 dias depois da imunização final.
[0119] Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos usando métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica (por exemplo, “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))).
[0120] A preparação de anticorpos monoclonais que secretam “hibridomas” pode ser realizada de acordo com o método de Kohler e Milstein et al. (Nature, 256, 495, 1975) e métodos similares a este. Isto é, os hibridomas são preparados fundindo-se uma célula que produz anticorpo contida em um baço ou similares obtidas de um mamífero imunizado com uma célula de mieloma não tendo nenhuma capacidade produtora de autoanticorpo derivado de um mamífero, preferivelmente camundongo, rato ou ser humano.
[0121] Os exemplos de células de mieloma que podem ser usadas para a fusão celular incluem mieloma derivado de camundongo P3/X63-AG8,653 (653), P3/NSI/1 Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/0, Sp2), PAI, F0 e BW5147, mieloma derivado de rato 210RCY3-Ag,2,3., e mieloma derivado de ser humano U266AR1, GM1500-6TG-A1 -2, UC729-6, CEM-AGR, D1 R11 e CEM-T15.
[0122] Os exemplos de aceleradores de fusão incluem polietileno glicol e os
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23/65 semelhantes. No geral, as células que produzem anticorpo e células de mieloma em uma razão numérica usualmente de cerca de 1:1 a 10:1 são deixadas reagir, usando polietileno glicol (peso molecular médio: de 1000 a 4000) em uma concentração de cerca de 20 a 50%, em uma temperatura de 20 a 40°C, preferivelmente de 30 a 37°C durante cerca de 1 a 10 minutos, por meio do que a fusão celular pode ser realizada. [0123] A triagem de anticorpos monoclonais que produzem clones de hibridoma pode ser realizada cultivando-se os hibridomas, por exemplo, em placas microtituladoras e medindo-se a reatividade dos sobrenadantes de cultura nos reservatórios ao imunógeno pelos métodos imunoquímicos tais como ELISA.
[0124] Na triagem dos hibridomas que produzem anticorpo, além do ensaio de ligação com a proteína RGMa, se o anticorpo não inibe a ligação entre a proteína RGMa e neogenina e se o anticorpo neutraliza a função da proteína RGMa (a atividade inibidora do crescimento de neurite) também são avaliados. Estes métodos de triagem permitem a seleção do anticorpo anti-RGMa da presente invenção.
[0125] Clones podem ser obtidos ainda dos reservatórios contendo hibridomas que produzem os anticorpos desejados pela clonagem usando a diluição limitante. A seleção e cruzamento de hibridomas são usualmente realizados em um meio de cultura de célula animal contendo de 10 a 20% de soro bovino fetal suplementado com HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina).
[0126] Anticorpos monoclonais de hibridomas podem ser produzidos cultivandose os hibridomas in vitro ou cultivando-os in vivo, por exemplo, em fluido ascítico de mamíferos tais como camundongos e ratos e isolando-se anticorpos monoclonais do sobrenadante de cultura resultante ou do fluido ascítico do mamífero.
[0127] Quando cultivados in vitro, os hibridomas são cultivados, mantidos, e armazenados de acordo com várias condições tais como as características das espécies celulares e o seu método de cultura a serem cultivadas, e um meio nutriente adequado para produzir anticorpos monoclonais no sobrenadante de cultura pode ser usado.
[0128] Os exemplos de meios básicos incluem um meio de cálcio baixo tal como meio F12 de Ham, meio MCDB 153 ou meio MEM de cálcio baixo e um meio de cálcio
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24/65 alto tal como meio MCDB 104, meio MEM, meio D-MEM, meio RPMI 1640, meio ASF
104 ou meio RD. O meio básico pode conter, por exemplo, soro, hormônios, citocinas e/ou várias substâncias inorgânicas ou orgânicas de acordo com o propósito.
[0129] Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados, por exemplo, submetendo-se o sobrenadante de cultura mencionado acima ou fluido ascítico ao sulfato de amônio saturado, método de precipitação com euglobulina, método do ácido capróico, método do ácido caprilico, cromatografia de troca iônica (tal como DEAE ou DE52) ou cromatografia de coluna de afinidade tal como coluna anti-imunoglobulina ou cromatografia de coluna de proteína A. Especificamente, a purificação do anticorpo monoclonal pode ser realizada por quaisquer métodos conhecidos como o método da purificação com imunoglobulina, e pode ser facilmente obtida por meios tais como fracionamento com sulfato de amônio, fracionamento com PEG, fracionamento com etanol, e cromatografia de afinidade utilizando um trocador de ânion e usando ainda proteínas de RGMa.
[0130] Anticorpos monoclonais também podem ser obtidos por um método de demonstração de fago. No método de demonstração de fago, fagos selecionados de uma biblioteca de anticorpo de fago opcional são triados usando o imunógeno desejado e fagos tendo capacidade de ligação desejada ao imunógeno são selecionados. Em seguida, a sequência correspondente ao anticorpo contido no fago é isolada ou sequenciada e um vetor de expressão compreendendo uma molécula de ácido nucléico codificando um anticorpo ou um domínio de ligação de antígeno é construído com base na sequência isolada ou na informação de sequência determinada. Finalmente, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos cultivando-se linhagens de célula transfectadas com tais vetores de expressão. Uma biblioteca de anticorpo humano pode ser usada como uma biblioteca de anticorpo de fago para gerar anticorpos humanos tendo as propriedades de ligação desejadas.
[0131] Como uma proteína de esqueleto, por exemplo, um domínio Kunitz de inibidor da serina protease humana e um domínio extracelular de fibronectina humana são utilizados, e a sequência de um sítio de ligação alvo no esqueleto pode ser modificada para gerar uma proteína de esqueleto que se liga à RGMa (Clifford Mintz
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25/65 et al., BioProcess International, 2013, Vol. 11(2), pp 40-48).
[0132] As proteínas de fusão incluem as proteínas de ligação de RGMa química ou geneticamente ligadas às moléculas funcionais outras que não a proteína de ligação de RGMa do presente pedido tal como polímeros não peptídicos tais como polietileno glicol (PEG), substâncias radioativas, toxinas, compostos de peso molecular baixo, citocinas, fatores de crescimento (por exemplo, TGF-β, NGF, neurotrofina), albumina, enzimas, e outros anticorpos.
[0133] Quando PEG é ligado como uma molécula funcional, PEG pode ser usado tendo um peso molecular, sem limitação, de 2.000 a 100.000 Da, mais preferivelmente de 10.000 a 50.000 Da, que pode ser linear ou ramificado. Usando-se, por exemplo, um grupo ativo em NHS, PEG pode ser ligado, por exemplo, aos grupos amino do terminal N de aminoácidos da proteína de ligação de RGMa.
[0134] No caso de usar uma substância radioativa como uma molécula funcional, por exemplo, 1311, 125l, 90Y, 64Cu, Tc, 77Lu ou 211At são usados. As substâncias radioativas podem ser diretamente ligadas à proteína de ligação de RGMa, por exemplo, pelo método da cloramina-T.
[0135] Quando do uso de uma toxina como uma molécula funcional, por exemplo, toxinas bacterianas (por exemplo, toxina da difteria), fitotoxinas (por exemplo, ricina), toxinas pequenas (por exemplo, geldanamicina), maitansinóides e caliqueamicina são usados.
[0136] Quando do uso de um composto de peso molecular baixo como uma molécula funcional, por exemplo, daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, mitomicina, neocarzinostatina, vindesina e corantes fluorescentes tais como FITC são usados.
[0137] Quando do uso de uma enzima como uma molécula funcional, por exemplo, luciferase (por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana; Pat. US No.
4.737.456), malato desidrogenase, urease, peroxidase (por exemplo, peroxidase de rábano (HRPO)), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidase (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6fosfato desidrogenase), oxidase heterocíclica (por exemplo, uricase e xantina
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26/65 oxidase), lactoperoxidase, e microperoxidase são usadas.
[0138] Os exemplos de ligadores usados para ligar quimicamente uma toxina, urn composto de peso molecular baixo ou uma enzima incluem radicais bivalentes (por exemplo, alquileno, arileno, heteroarileno), uma unidade de repetição de um ligador ou alcóxi representada por -(CR2)nO(CR2)n- (em que R é um substituinte opcional, e n é um número inteiro positivo) (por exemplo, polietilenoóxi, PEG e polimetilenoóxi) e alquilamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine®) e um éster de diácido e amida (por exemplo, succinato, succinamida, diglicolato, malonato, e caproamida). Os métodos de modificação química para a ligação de moléculas funcionais já foram estabelecidos neste campo (D. J. King, Applications and Engineering of Monoclonals Antibodies, 1998, T. J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer, 1998, Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol 152: 127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93: 8681).
[0139] Uma forma de realização preferida da proteína de ligação de RGMa da presente invenção é um anticorpo quimérico. Como o “anticorpo quimérico”, um anticorpo quimérico em que a região variável é uma região variável derivada de uma imunoglobulina de um animal não humano (tal como camundongo, rato, hamster ou galinha) e a região constante é uma região constante da imunoglobulina humana é exemplificada. Um anticorpo quimérico pode ser preparado, por exemplo, imunizandose um camundongo com um antígeno, cortando-se uma região variável que se liga ao antígeno do gene codificando o anticorpo monoclonal de camundongo, e combinandose a região variável com uma região constante de um anticorpo derivado da medula óssea humana. A região constante derivada da imunoglobulina humana tem uma sequência de aminoácido única dependendo do isótopo tal como IgG (lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4), IgM, IgA (IgA1 e lgA2), IgD e IgE, mas a região constante do anticorpo quimérico recombinante de acordo com a presente invenção pode ser uma região constante de imunoglobulina humana pertencente a qualquer isótipo. A região constante é preferivelmente uma região constante de IgG humana. Um vetor de expressão pode ser preparado usando o gene do anticorpo quimérico assim preparado. As células hospedeiras são transformadas com o vetor de expressão para
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27/65 se obter células transformantes que produzem anticorpo quimérico, e depois as células transformadas são cultivadas para se obter o anticorpo quimérico desejado do sobrenadante de cultura.
[0140] Uma outra forma de realização preferida da proteína de ligação de RGMa da presente invenção é um anticorpo humanizado. O “anticorpo humanizado” na presente invenção é um anticorpo obtido enxertando-se apenas a sequência de DNA do sítio de ligação de antígeno (CDR; região determinadora de complementaridade) de um anticorpo de animal não humano tal como camundongo a um gene de anticorpo humano (enxerto de CDR). Os anticorpos humanizados podem ser preparados recorrendo-se aos métodos descritos, por exemplo, no Pedido de Patente PCT Traduzido Japonês Aberto ao Público No. Hei 4-506458 e Patente Japonesa No. 2912618. Especificamente, um anticorpo humanizado é considerado caracterizado em que parte ou todas das CDRs são CDRs derivadas de anticorpos monoclonais de mamíferos não humanos (tais como camundongo, rato e hamster), que as regiões de armação da região variável são regiões de armação de regiões variáveis derivadas da imunoglobulina humana, e que as regiões constantes são regiões constantes derivadas da imunoglobulina humana.
[0141] O anticorpo humanizado da presente invenção pode ser produzido, por exemplo, como segue, mas é desnecessário dizer que o método de produção não é limitado a este.
[0142] Por exemplo, um anticorpo humanizado recombinante derivado de um anticorpo monoclonal de camundongo pode ser produzido pelo engendramento genético com referência aos Pedidos de Patente PCT Traduzidos Japoneses Abertos ao Público Nos. Hei 4-506458 e Sho 62-296890. Isto é, DNA codificando a porção de CDR de cadeia pesada de camundongo e DNA codificando a porção de CDR de cadeia leve de camundongo são isolados de hibridomas produzindo um anticorpo monoclonal de camundongo, e um gene de cadeia pesada humano codificando a região inteira outra que não o CDR de cadeia pesada humana e um gene de cadeia leve humano codificando a região inteira outra que não a CDR de cadeia leve humana são isolados de um gene da imunoglobulina humana.
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28/65 [0143] O gene da cadeia pesada humana ao qual o DNA isolado codificando a porção de CDR de cadeia pesada de camundongo é enxertado é introduzido em um vetor de expressão apropriado de modo que a expressão do mesmo seja possível. Similarmente, o gene da cadeia leve humano ao qual o DNA codificando a porção de CDR de cadeia leve de camundongo é enxertado é introduzido em um outro vetor de expressão apropriado de modo que a expressão do mesmo é possível. Alternativamente, os genes das cadeias pesada e leve humanos aos quais a CDR de camundongo é enxertada podem ser introduzidos no mesmo vetor de expressão de modo que a expressão dos mesmos seja possível. As células hospedeiras são transformadas com o vetor de expressão assim preparado para se obter células transformantes produzindo anticorpo humanizado, e depois as células transformadas são cultivadas para se obter o anticorpo humanizado desejado do sobrenadante de cultura.
[0144] Uma outra forma de realização preferida da proteína de ligação de RGMa da presente invenção é um anticorpo humano. Um anticorpo humano se refere a um anticorpo em que todas as regiões incluindo as regiões variáveis de cadeia pesada e regiões constantes de cadeia pesada e regiões variáveis de cadeia leve e regiões constantes de cadeia leve constituindo a imunoglobulina são derivadas de genes codificando a imunoglobulina humana. Os anticorpos humanos podem ser preparados introduzindo-se genes de anticorpo humano em camundongos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos da mesma maneira como o método mencionado acima para preparar anticorpos policlonais ou anticorpos monoclonais, especificamente, por exemplo, imunizando-se um animal transgênico preparado integrando-se pelo menos genes da imunoglobulina humana em um local de gene de um mamífero outro que não um ser humano tal como um camundongo.
[0145] Por exemplo, camundongos transgênicos que produzem anticorpos humanos podem ser preparados de acordo com os métodos descritos, por exemplo, em Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; Pedidos de Patente PCT Traduzidos Japoneses Abertos ao Público Nos. Hei 4504365 e Hei 7-509137; WO 94/25585; Nature, Vol. 368, p. 856-859, 1994; e Pedido
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29/65 de Patente PCT Traduzido Japonês Aberto ao Público No. Hei 6-500233. Os exemplos específicos dos camundongos transgênicos incluem camundongo HuMab® (Medarex,
Princeton NJ), camundongo KMTM (Kirin Pharma Company, Japão), e camundongo
KM (FCyRllb-KO).
[0146] Os exemplos específicos do anticorpo monoclonal da presente invenção incluem aqueles em que as CDRs na região variável de cadeia pesada compreendem as sequências de aminoácido das SEQ ID NOS: 33 (HCDR 1), 34 (HCDR 2) e 35 (HCDR 3) na Listagem de Sequência e em que as CDRs na região variável de cadeia leve compreendem as sequências de aminoácido das SEQ ID NOS: 30 (LCDR 1), 31 (LCDR 2) e 32 (LCDR 3) na Listagem de Sequência. Um a vários aminoácidos em uma ou mais das CDRs podem ser substituídos contanto que as propriedades do anticorpo da presente invenção de ter a capacidade para se ligar à RGMa, não inibir a ligação entre RGMa e neogenina, e neutralizar a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa sejam mantidas. Um a vários meios, por exemplo, um ou dois. A substituição de aminoácido é preferivelmente substituição conservative de modo a manter as propriedades da presente invenção. Manter as propriedades do anticorpo significa que estas propriedades são mantidas no mesmo grau, por exemplo, 80% ou mais, preferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais quando comparadas com as propriedades antes das modificações da sequência de aminoácido da CDR. Manutenção também inclui melhora.
[0147] A região outra que não das CDRs não é particularmente limitada contanto que a mesma seja uma sequência que possa manter a estrutura como um anticorpo e exercer a sua função, e pode ser qualquer uma das sequências derivadas de camundongo, ser humano, e outros mamíferos, sequências quiméricas, e sequências artificiais dos mesmos. No caso de compreender uma região constante, as sequências de aminoácido das regiões constantes na cadeia pesada e cadeia leve são exemplificadas por aquelas descritas em Nucleic Acids Research vol. 14, p 1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol. 257, p 1516, 1982 e Cell vol. 22, p 197, 1980.
[0148] Os exemplos de anticorpos de camundongo tendo estas CDRs incluem
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30/65 anticorpos em que a cadeia leve tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequência e em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 na Listagem de Sequência. Nestas sequências de aminoácido, pode haver substituição, deleção, adição ou inserção de um a vários (1 a 20, de 1 a 10 ou de 1 a 5) aminoácidos contanto que as propriedades do anticorpo de ter a capacidade para se ligar à RGMa, não inibir a ligação entre RGMa e neogenina, e neutralizar a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa sejam mantidas. Tal substituição, deleção ou adição pode ser introduzida nas CDRs, mas é preferivelmente introduzida em uma região outra que não as CDRs. A substituição de aminoácido é preferivelmente substituição conservativa de modo a manter as propriedades da presente invenção.
[0149] Os anticorpos quiméricos de camundongo/ser humano em que as regiões constantes no anticorpo de camundongo mencionadas acima são derivadas de ser humano também são incluídas. Um exemplo de tais anticorpos quiméricos de camundongo/ser humano é um anticorpo em que a cadeia leve tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8 na Listagem de Sequência (a região variável se estende de 1 a 107) e em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 na Listagem de Sequência (a região variável se estende de 1 a 116). Nestas sequências de aminoácido, pode haver substituição, deleção, adição ou inserção de um a vários (1 a 20, de 1 a 10 ou de 1 a 5) aminoácidos contanto que as propriedades do anticorpo de ter a capacidade para se ligar à RGMa, não inibindo a ligação entre RGMa e neogenina, e neutralizando a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa sejam mantidas. Tal substituição, deleção ou adição pode ser introduzida nas CDRs, mas é preferivelmente introduzida em uma região outra que não as CDRs. A substituição de aminoácido é preferivelmente substituição conservativa de modo a manter as propriedades da presente invenção.
[0150] Além disso, anticorpos humanizados em que a região outra que não as CDRs é derivada de ser humano são exemplificadas. Um exemplo de tais anticorpos humanizados é um anticorpo em que a cadeia pesada tem uma sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 18 (a região variável é até o 116o
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31/65 resíduo do lado do terminal N) e em que a cadeia leve tem uma sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19 a 25 na Listagem de Sequência (a região variável se estende do 1o ao 107° resíduos no lado do terminal N).
[0151] Nas sequências de aminoácido do anticorpo humanizado (cadeia pesada: SEQ ID NOS: 11 a 18 na Listagem de Sequência, cadeia leve: SEQ ID NOS: 19 a 25 na Listagem de Sequência), pode haver substituição, deleção, adição ou inserção de um a vários (1 a 20, de 1 a 10 ou de 1 a 5) aminoácidos contanto que as propriedades do anticorpo de ter a capacidade para se ligar à RGMa, não inibir a ligação entre RGMa e neogenina, e neutralizar a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa sejam mantidas. Tal substituição, deleção ou adição pode ser introduzida em CDRs, mas é preferivelmente introduzida em uma região outra que não as CDRs. A substituição de aminoácido é preferivelmente substituição conservative de modo a manter as propriedades da presente invenção.
[0152] A sequência de aminoácido da cadeia pesada e a sequência de aminoácido da cadeia leve pode ser qualquer combinação das mesmas, mas particularmente preferida é um anticorpo tendo as cadeias pesadas compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 15 na Listagem de Sequência e cadeias leves compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 19 na Listagem de Sequência. Na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 15 na Listagem de Sequência, a sequência de aminoácido correspondendo à região variável de cadeia pesada é mostrada na SEQ ID NO: 41 na Listagem de Sequência e a sequência de aminoácido correspondendo à região variável de cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 42 na Listagem de Sequência. Assim, o anticorpo particularmente preferido da presente invenção é um anticorpo em que a região variável de cadeia pesada tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 41 na Listagem de Sequência e em que a região variável de cadeia leve tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 42 na Listagem de Sequência.
[0153] Nestas sequências de aminoácido, pode haver substituição, deleção, adição ou inserção de um a vários (1 a 20, de 1 a 10 ou de 1 a 5) aminoácidos contanto que as propriedades do anticorpo de ter a capacidade para se ligar à RGMa, não inibir
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32/65 a ligação entre RGMa e neogenina, e neutralizar a atividade inibidora do crescimento de neurite da RGMa sejam mantidas. Tal substituição, deleção ou adição pode ser introduzida em CDRs, mas é preferivelmente introduzida em uma região outra que não as CDRs. A substituição de aminoácido é preferivelmente substituição conservative de modo a manter as propriedades da presente invenção.
[0154] Na sequência de aminoácido do anticorpo da presente invenção compreendendo substituição, deleção ou similares na sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 41 e/ou 42 na Listagem de Sequência como descritas acima, a região variável de cadeia pesada é uma sequência de aminoácido tendo 90% ou mais (mais preferivelmente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) identidade com a SEQ ID NO: 41 da listagem de Sequência, e a região variável de cadeia leve é uma sequência de aminoácido tendo 90% ou mais (mais preferivelmente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) identidade com SEQ ID NO: 42 da listagem de Sequência.
[0155] Outros exemplos específicos do anticorpo monoclonal da presente invenção incluem aqueles em que as CDRs na região variável de cadeia pesada compreendem as sequências de aminoácido das SEQ ID NOS: 39 (HCDR 1), 40 (HCDR 2) e SFG (HCDR 3) na Listagem de Sequência e em que as CDRs na região variável de cadeia leve compreendem as sequências de aminoácido das SEQ ID NOS: 36 (LCDR 1), 37 (LCDR 2) e 38 (LCDR 3) na Listagem de Sequência. Um a vários aminoácidos em uma ou mais das CDRs podem ser substituídos contanto que as propriedades do anticorpo da presente invenção de ter a capacidade para se ligar à RGMa, não inibir a ligação entre RGMa e neogenina, e neutralizar a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa sejam mantidas.
[0156] Um a vários meios, por exemplo, um ou dois. A substituição de aminoácido é preferivelmente substituição conservative de modo a manter as propriedades da presente invenção.
[0157] A região outra que não as CDRs não é particularmente limitada contanto que a mesma seja uma sequência que possa manter a estrutura como um anticorpo e exerça a sua função, e pode ser qualquer uma das sequências derivadas de camundongo, ser humano, e outros mamíferos, sequências quiméricas, e sequências
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33/65 artificiais dos mesmos. No caso de compreender uma região constante, as sequências de aminoácido das regiões constantes na cadeia pesada e cadeia leve são exemplificadas por aquelas descritas em Nucleic Acids Research vol. 14, p1779,1986, The Journal of Biological Chemistry vol. 257, p1516, 1982 e Cell vol. 22, p197, 1980. [0158] Os exemplos de anticorpos de camundongo tendo estas CDRs incluem anticorpos em que a cadeia leve tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 na Listagem de Sequência e em que a cadeia pesada tem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7 na Listagem de Sequência. Nestas sequências de aminoácido, pode haver substituição, deleção, adição ou inserção de um a vários (1 a 20, de 1 a 10 ou de 1 a 5) aminoácidos contanto que as propriedades do anticorpo de ter a capacidade para se ligar à RGMa, não inibir a ligação entre RGMa e neogenina, e neutralizar a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa sejam mantidas. Tal substituição, deleção ou adição pode ser introduzida nas CDRs, mas é preferivelmente introduzida em uma região outra que não as CDRs. A substituição de aminoácido é preferivelmente substituição conservativa de modo a manter as propriedades da presente invenção.
[0159] Como o anticorpo de camundongo mencionado acima, anticorpos quiméricos cujas regiões constantes são derivadas de ser humano também são incluídas. Anticorpos humanizados em que a região outra que não as CDRs é derivada de ser humano são ainda incluídos.
[0160] O anticorpo anti-RGMa da presente invenção inclui anticorpos multiespecíficos, anticorpos funcionalmente modificados, e anticorpos conjugados tendo CDRs compreendendo sequências de aminoácido específicas (por exemplo, as sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 30 na Listagem de Sequência para LCDR1, SEQ ID NO: 31 na Listagem de Sequência para LCDR2, SEQ ID NO: 32 na Listagem de Sequência para a LCDR3, SEQ ID NO: 33 na Listagem de Sequência para a HCDR1, SEQ ID NO: 34 na Listagem de Sequência para HCDR2, e SEQ ID NO: 35 na Listagem de Sequência para a HCDR3), ou tendo regiões variáveis compreendendo sequências de aminoácido específicas (por exemplo, sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 41 na Listagem de Sequência para a região variável de
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34/65 cadeia pesada, e SEQ ID NO: 42 para a região variável de cadeia leve).
[0161] O próprio anticorpo anti-RGMa da presente invenção pode ser ligado a um anticorpo tendo uma outra especificidade de ligação de antígeno outra que não a especificidade anti-RGMa pelas técnicas de engenharia genética para preparar anticorpos multiespecíficos tais como anticorpos biespecíficos. As técnicas de engenharia genética já foram estabelecidas neste campo. Por exemplo, usando-se uma técnica para DVD-lg em que as regiões variáveis são conectadas em série (Wu et al., Nature Biotechnology 25(11), 1290 (2007)) ou uma técnica para ART-lg em que as cadeias pesadas de dois tipos de ligação de anticorpos aos diferentes antígenos são combinadas modificando-se a região de Fc de um anticorpo (Kitazawa et al., Nature Medicine 18(10), 1570(2012), os anticorpos biespecíficos desejados podem ser obtidos. Outros antígenos que não a RGMa incluem, mas não são limitados a, fatores que inibem o crescimento de neurite tais como Nogo, MAG, Omgp, CSPG, Serna 3A e Lingo-1, e moléculas imuno-relacionadas tais como TNF-α, receptor de IL6, CD3, CD20, integrina a4, BLys, Linfopoietina Estrômica Tímica, IgE, IL-1, IL-2, IL4, IL-5, IL-6, IL- 13, IL- 17, IL-23 e IL-25.
[0162] Anticorpos funcionalmente modificados são exemplificados como moléculas modificadas do anticorpo anti-RGMa da presente invenção. Anticorpo funcionalmente modificado significa um anticorpo em que as funções tais como a função de morte celular, função ativadora de complemento e função para prolongar a meia-vida no sangue são modificadas modificando-se principalmente a região Fc ou similares (Shitara, Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 2009, Vol. 129(1), p3; Ishii et al., Nippon Yakubutsugaku Zasshi (Folia Pharmacologica Japonica), 2010, Vol. 136(5), p280; Hashiguchi et al., The Journal of Japanese Biochemical Society, 2010, Vol. 82(8), p710).
[0163] Anticorpos funcionalmente modificados do anticorpo anti-RGMa são preparados pelo seguinte método. Por exemplo, quando o anticorpo anti-RGMa do presente pedido é produzido usando, como células hospedeiras, células CHO cujo gene da a1,6-fucosiltransferase (FUT 8) foi rompido, anticorpos com teor reduzido de fucose da cadeia de açúcar e função aumentada de morte celular são obtidos, e
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35/65 quando o anticorpo anti-RGMa do presente pedido é produzido usando, como uma célula hospedeira, células CHO dentro das quais o gene FUT8 foi introduzido, anticorpos com função de morte celular baixa são obtidos (WO 2005/035586, WO 2002/31140 e WO 00/61739). A função de ativação de complemento pode ser regulada modificando-se resíduos de aminoácido na região Fc (Patentes U.S. Nos: 6737056, 7297775 e 7317091). A extensão da meia-vida no sangue pode ser obtida usando-se variantes da região Fc com ligação aumentada para FcRn que é um dos receptores de Fc (Hashiguchi et al., The Journal of Japanese Biochemical Society, 2010, Vol. 82 (8), p710). Estes anticorpos funcionalmente modificados podem ser produzidos pelas técnicas de engenharia genética.
[0164] Os anticorpos conjugados são exemplificados como moléculas modificadas do anticorpo anti-RGMa da presente invenção. Os exemplos do anticorpo conjugado incluem anticorpos conjugados em que anticorpos anti-RGMa são química ou geneticamente ligados às moléculas funcionais outras que não o anticorpo anti-RGMa no presente pedido tais como polímeros não peptídicos tais como polietileno glicol (PEG), substâncias radioativas, toxinas, compostos de peso molecular baixo, citocinas, fatores de crescimento (por exemplo, TGF-β, NGF, neurotrofina), albumina, enzimas, e outros anticorpos.
[0165] Quando PEG é ligado como uma molécula funcional, PEG pode ser usado tendo um peso molecular, sem limitação, de 2.000 a 100.000 Da, mais preferivelmente de 10.000 a 50.000 Da, que pode ser linear ou ramificado. Usando-se, por exemplo, um grupo ativo em NHS, PEG pode ser ligado, por exemplo, aos grupos amino do terminal N de aminoácidos de anticorpos.
[0166] No caso de usar uma substância radioativa como uma molécula funcional, por exemplo, 1311, 125l, 90Y, 64Cu, Tc, 77Lu ou 211At são usados. As substâncias radioativas podem ser diretamente ligadas aos anticorpos, por exemplo, pelo método T de cloramina.
[0167] Quando do uso de uma toxina como uma molécula funcional, por exemplo, toxinas bacterianas (por exemplo, toxina da difteria), fitotoxinas (por exemplo, ricina), toxinas pequenas (por exemplo, geldanamicina), maitansinóides e caliqueamicina são
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36/65 usados.
[0168] Quando do uso de um composto de peso molecular baixo como uma molécula funcional, por exemplo, daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, mitomicina, neocarzinostatina, vindesina e corantes fluorescentes tais como FITC são usados.
[0169] Quando do uso de uma enzima como uma molécula funcional, por exemplo, luciferase (por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana; Pat. US No.
4.737.456), malato desidrogenase, urease, peroxidase (por exemplo, peroxidase de rábano (HRPO)), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, oxidase de sacarídeo (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidase heterocíclicas (por exemplo, uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, e microperoxidase são usadas.
[0170] Os exemplos de ligadores usados para ligar quimicamente uma toxina, um composto de peso molecular baixo ou uma enzima incluem radicais bivalentes (por exemplo, alquileno, arileno, heteroarileno), uma unidade de repetição de um ligador ou alcóxi representada pela -(CR2)nO(CR2)n- (em que R é um substituinte opcional, e n é um número inteiro positivo) (por exemplo, polietilenoóxi, PEG e polimetilenoóxi) e alquilamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine®) e um éster de diácido e amida (por exemplo, succinato, succinamida, diglicolato, malonato, e caproamida). Os métodos de modificação química para ligar moléculas funcionais já foram estabelecidos neste campo (D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies., 1998 T. J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol. 152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93: 8681).
[0171] “Fragmentos de ligação de antígeno” de anticorpos na presente invenção significa uma região parcial tendo propriedade de ligação de antígeno, dos anticorpos descritos acima, incluindo, em particular, F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv (fragmento variável de anticorpo), Fv ligado a dissulfeto, anticorpo de cadeia única (scFv), e polímeros dos mesmos. Os fragmentos de ligação de antígeno incluem ainda fragmentos de ligação de antígeno conjugados química ou geneticamente ligados às moléculas funcionais
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37/65 outras que não o anticorpo anti-RGMa no presente pedido tais como polímeros não peptídicos tais como polietileno glicol (PEG), substâncias radioativas, toxinas, compostos de peso molecular baixo, citocinas, fatores de crescimento (por exemplo,
TGF-β, NGF, neurotrofina), albumina, enzimas, e outros anticorpos.
[0172] Como aqui usados, “F(ab’)2” e “Fab” significam fragmentos de anticorpo que são produzidos pelo tratamento de imunoglobulinas com uma protease pepsina ou papaína e são gerados pela digestão a montante e a jusante da ligação de dissulfeto que existe entre duas cadeias pesadas na região de dobradiça. Por exemplo, o tratamento com papaína de IgG pode causar a divagem a montante da ligação de dissulfeto que existe entre duas cadeias pesadas na região de dobradiça para produzir dois fragmentos homólogos de anticorpo cada um compreendendo uma cadeia leve compreendendo uma VL (região variável de cadeia leve) e uma CL (região constante de cadeia leve) e um fragmento de cadeia pesada compreendendo uma VH (região variável de cadeia pesada) e uma CHy1 (região γ1 dentro da região constante de cadeia pesada) em que os fragmentos de cadeia leve e de cadeia pesada são ligados entre si via uma ligação de dissulfeto no domínio de terminal C. Cada um dos dois fragmentos de anticorpo homólogos é aludido como Fab. O tratamento com pepsina de IgG pode causar a divagem a jusante da ligação de dissulfeto que existe entre duas cadeias pesadas na região de dobradiça para produzir um fragmento de anticorpo levemente maior do que um em que os dois Fabs são ligados entre si na região de dobradiça. Este fragmento de anticorpo é aludido como F(ab’)2.
[0173] Os fragmentos de ligação de antígeno conjugados são exemplificados como moléculas modificadas do fragmento de ligação de antígeno do anticorpo antiRGMa da presente invenção. Os exemplos do fragmento de ligação de antígeno conjugado incluem aqueles em que uma região parcial tendo a propriedade de ligação de antígeno do anticorpo anti-RGMa é química ou geneticamente ligada a uma molécula funcional outra que não o anticorpo anti-RGMa no presente pedido tal como polímeros não peptídicos tais como polietileno glicol (PEG), substâncias radioativas, toxinas, compostos de peso molecular baixo, citocinas, fatores de crescimento (por exemplo, TGF-β, NGF, neurotrofina), albumina, enzimas, e outros anticorpos.
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38/65 [0174] Quando PEG é ligado como uma molécula funcional, PEG pode ser usado tendo um peso molecular, sem limitação de 2.000 a 100.000 Da, mais preferivelmente de 10.000 a 50.000 Da, que pode ser linear ou ramificado. PEG pode ser ligado, por exemplo, ao grupo amino do terminal N de uma região parcial tendo a propriedade de ligação de antígeno do anticorpo anti-RGMa usando-se, por exemplo, um grupo ativo em NHS.
[0175] No caso de usar uma substância radioativa como uma molécula funcional, por exemplo, 1311, 125l, 90Y, 64Cu, Tc, 77Lu ou 211At são usados. As substâncias radioativas podem ser diretamente ligadas a uma região parcial tendo a propriedade de ligação de antígeno do anticorpo anti-RGMa, por exemplo, pelo método T da cloramina.
[0176] Quando do uso de uma toxina como uma molécula funcional, por exemplo, toxinas bacterianas (por exemplo, toxina da difteria), fitotoxinas (por exemplo, ricina), toxinas pequenas (por exemplo, geldanamicina), maitansinóides e caliqueamicina são usadas.
[0177] Quando do uso de um composto de peso molecular baixo como uma molécula funcional, por exemplo, daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, mitomicina, neocarzinostatina, vindesina e corantes fluorescentes tais como FITC são usados.
[0178] Quando do uso de uma enzima como uma molécula funcional, por exemplo, luciferase (por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana; Pat. US No.
4.737.456), malato desidrogenase, urease, peroxidase (por exemplo, peroxidase de rábano (HRPO)), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidase (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6fosfato desidrogenase), oxidase heterocíclica (por exemplo, uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, e microperoxidase são usadas.
[0179] Os exemplos de ligadores usados para ligar quimicamente uma toxina, um composto de peso molecular baixo ou uma enzima incluem radicais bivalentes (por exemplo, alquileno, arileno, heteroarileno), uma unidade de repetição de um ligador ou alcóxi representada pela -(CR2)nO(CR2)n- (em que R é um substituinte opcional, e
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39/65 n é um número inteiro positivo) (por exemplo, polietilenoóxi, PEG e polimetilenoóxi) e alquilamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine®) e um éster de diácido e amida (por exemplo, succinato, succinamida, diglicolato, malonato, e caproamida). Os métodos de modificação química para a ligação de moléculas funcionais já foram estabelecidos neste campo (D. J. King, Applications and Engineering of Monoclonais Antibodies, 1998 T. J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer, 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol. 152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93: 8681).
[0180] No anticorpo anti-RGMa compreendendo CDRs ou regiões variáveis tendo as sequências de aminoácido específicas da presente invenção, a região constante preferivelmente é uma região constante de IgG humana (lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4) para a manutenção com uma meia-vida longa no sangue.
[0181] A presente invenção também inclui um anticorpo anti-RGMa que compete com o anticorpo tendo as sequências de aminoácido das CDRs específicas como descrito acima para a ligação às proteínas de RGMa, e fragmentos de ligação de antígeno das mesmas. O anticorpo que compete com o anticorpo tendo as sequências de aminoácido das CDRs específicas como descrito acima para a ligação às proteínas de RGMa incluem epítopos nas regiões selecionadas de Glu 298 a Gly 311, Asn 322 a Glu 335, Lys 367 a Ala 377, e Pro 349 a Thr 359.
[0182] O anticorpo pode ser obtido (triado) ou avaliado permitindo-se que o anticorpo coexista no sistema de ligação do anticorpo tendo as sequências de CDR como descritas acima e proteínas de RGMa. Por exemplo, o anticorpo pode ser obtido pela triagem usando o seguinte método de ressonância plasmônica superficial (SPR). [0183] A proteína RGMa humana biotinilada (4 pg/ml) como um ligante é carregada sobre um chip sensor imobilizado em avidina para imobilizar proteínas de RGMa humanas equivalentes a 1300 a 1600 RU. Em seguida, um anticorpo antiRGMa opcional (15 pg/ml) é carregado como um análito e ligado à proteína RGMa humana imobilizada sobre o chip sensor. Repetindo-se isto uma pluralidade de vezes, um estado no qual o anticorpo anti-RGMa opcional é ligado a todas as moléculas da proteína RGMa humana sobre o chip sensor é criado (estado saturado) e a quantidade
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40/65 de ligação no estado saturado (quantidade de ligação saturada 1) é determinada.
[0184] Um experimento similar é realizado com o anticorpo anti-RGMa compreendendo as sequências de aminoácido das CDRs específicas da presente invenção para determinar a quantidade de ligação no estado saturado (quantidade de ligação saturada 2).
[0185] Em seguida, as proteínas de RGMa humanas sobre o chip sensor são saturadas com o anticorpo anti-RGMa compreendendo as sequências de aminoácido das CDRs específicas da presente invenção, e depois um anticorpo anti-RGMa opcional (15 pg/ml) é carregado como um análito para investigar se o anticorpo antiRGMa opcional se liga adicionalmente à proteína RGMa humana saturada com o anticorpo anti-RGMa compreendendo as sequências de aminoácido das CDRs específicas da invenção.
[0186] Se o anticorpo anti-RGMa opcional pode se ligar adicionalmente à proteína RGMa humana saturada com o anticorpo anti-RGMa compreendendo as sequências de aminoácido das CDRs específicas da invenção enquanto mostra a quantidade de ligação saturada 1 de um anticorpo anti-RGMa opcional calculada acima, então o anticorpo é julgado como “não competidor”. Por outro lado, se o anticorpo anti-RGMa opcional não pode se ligar adicionalmente à proteína RGMa humana saturada com o anticorpo anti-RGMa compreendendo as sequências de aminoácido das CDRs específicas da invenção, então o anticorpo é julgado como “competidor”. Mesmo se o anticorpo anti-RGMa opcional possa se ligar adicionalmente à proteína RGMa humana saturada com o anticorpo anti-RGMa compreendendo as sequências de aminoácido das CDRs específicas da invenção, quando a quantidade de ligação adicionada não atinge a quantidade de ligação saturada 1 com uma diferença significante, então o anticorpo é julgado como “competidor”. As diferenças significantes são examinadas pelos métodos estatísticos gerais (por exemplo, teste t de Student), e o nível de significância é ajustado para 5% ou menos.
[0187] O anticorpo anti-RGMa que compete com um anticorpo anti-RGMa compreendendo a sequência de aminoácido da CDR específica como descrito acima para a ligação com RGMa pode ser um anticorpo derivado de qualquer animal tal
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41/65 como anticorpo de camundongo, ser humano, rato, coelho, cabra, ou camelo, ou pode ser um anticorpo quimérico ou humanizado que é uma combinação destes anticorpos, mas preferivelmente é um anticorpo quimérico, humanizado, ou humano.
Moléculas de ácido nucléico da presente Invenção [0188] Os exemplos das moléculas de ácido nucléico da presente invenção incluem polinucleotídeos em que a região codificando uma região variável de cadeia pesada compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido das SEQ ID NOS: 33, 34, e 35 na Listagem de Sequência, respectivamente (em que de um a vários aminoácidos podem ser substituídos, deletados, inseridos ou adicionados) e a região codificando uma região variável de cadeia leve compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido das SEQ ID NOS: 30, 31, e 32 na Listagem de Sequência, respectivamente (em que de um a vários aminoácidos podem ser substituídos, deletados, inseridos ou adicionados); e polinucleotídeos em que a região codificando uma região variável de cadeia pesada compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido das SEQ ID NOS: 39, 40, e SFG na Listagem de Sequência, respectivamente (em que de um a vários aminoácidos podem ser substituídos, deletados, inseridos ou adicionados) e a região codificando uma região variável de cadeia leve compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido das SEQ ID NOS: 36, 37, e 38 na Listagem de Sequência, respectivamente (em que de um a vários aminoácidos podem ser substituídos, deletados, inseridos ou adicionados).
[0189] Outros exemplos da molécula de ácido nucléico da presente invenção incluem polinucleotídeos em que a região codificando uma cadeia pesada compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 5 na Listagem de Sequência e a região codificando uma cadeia leve compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequência; e polinucleotídeos em que a região codificando uma cadeia pesada compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 7 na Listagem de Sequência e a região codificando uma cadeia leve compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID
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NO: 6 na Listagem de Sequência.
[0190] Outros exemplos da molécula de ácido nucléico da presente invenção incluem polinucleotídeos em que a região codificando uma cadeia pesada compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 na Listagem de Sequência e a região codificando uma cadeia leve compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8 na Listagem de Sequência.
[0191] Outros exemplos da molécula de ácido nucléico da presente invenção incluem polinucleotídeos em que a região codificando uma cadeia pesada compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOS: 11 a 18 na Listagem de Sequência e a região codificando uma cadeia leve compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOS: 19 a 25 na Listagem de Sequência.
[0192] Os exemplos partícularmente preferidos da molécula de ácido nucléico da presente invenção incluem polinucleotídeos em que a região codificando uma cadeia pesada compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 15 na Listagem de Sequência e a região codificando uma cadeia leve compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 19 na Listagem de Sequência.
[0193] Outros exemplos da molécula de ácido nucléico da presente invenção incluem polinucleotídeos em que a região codificando uma região variável de cadeia pesada compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 41 na Listagem de Sequência e a região codificando uma região variável de cadeia leve compreende uma sequência base codificando a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 42 na Listagem de Sequência.
[0194] Os exemplos específicos da molécula de ácido nucléico da presente invenção incluem polinucleotídeos em que a região codificando uma região variável de cadeia pesada compreende a sequência base da SEQ ID NO: 43 na Listagem de Sequência e a região codificando uma região variável de cadeia leve compreende a sequência base da SEQ ID NO: 44 na Listagem de Sequência.
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43/65 [0195] A molécula de ácido nucléico da presente invenção pode ser polinucleotídeos que hibridizam sob condições severas a um DNA de filamento complementar tendo a sequência base da SEQ ID NO: 43 na Listagem de Sequência e polinucleotídeos que hibridizam sob condições severas a um DNA de filamento complementar tendo a sequência base da SEQ ID NO: 44 na Listagem de Sequência contanto que a molécula de ácido nucléico da presente invenção codifica um anticorpo monoclonal que tem a capacidade para se ligar à RGMa, não inibe a ligação entre RGMa e neogenina, e neutraliza a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa. Os exemplos das condições severas incluem uma condição de conduzir a hibridização de southern e lavagem em uma concentração salina correspondendo a 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 68°C.
[0196] A molécula de ácido nucléico da presente invenção pode codificar todas as regiões constantes e as regiões variáveis de cadeias pesada e leve, e pode codificar apenas as regiões variáveis de cadeias pesada e leve. A sequência base da região constante das cadeias pesada e leve no caso de codificar toda da região constante e da região variável é preferivelmente aquela descrita em Nucleic Acids Research vol. 14, p1779,1986, The Journal of Biological Chemistry vol. 257, p1516, 1982 e Cell vol. 22, p197, 1980.
[0197] A molécula de ácido nucléico da presente invenção pode ser obtida, por exemplo, pelo seguinte método. Primeiro, o RNA total é preparado a partir das células tais como hibridomas usando um kit de extração de RNA comercial, e o cDNA é sintetizado com transcriptase reversa usando iniciadores aleatórios ou similares. Em seguida, cDNAs codificando o anticorpo são amplificados por um método de PCR usando, para os iniciadores, oligonucleotídeos tendo sequências conservadas nas regiões variáveis de genes de cadeia pesada e leve conhecidos de anticorpo humano, respectivamente. Para a sequência codificando a região constante, o mesmo pode ser obtido amplificando-se a sequência conhecida pelo método de PCR. A sequência base do DNA pode ser determinada por um método convencional, por exemplo incorporando-a dentro de um plasmídeo para o sequenciamento.
[0198] Alternativamente, um DNA codificando o anticorpo monoclonal da presente
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44/65 invenção também pode ser obtido sintetizando-se quimicamente uma sequência da região variável ou uma parte da mesma e ligando-a a uma sequência compreendendo a região constante.
[0199] A presente invenção também fornece um vetor recombinante compreendendo a molécula de ácido nucléico da presente invenção e um transformante (célula hospedeira) compreendendo o vetor recombinante. O vetor recombinante pode ser vetores que podem ser expressos em células procarióticas tais como E. coli (Escherichia coli) (por exemplo, pBR322, pUC119 ou um derivado da mesma), e preferivelmente são vetores que podem ser expressos em células eucarióticas, e mais preferivelmente são vetores que podem ser expressos em células derivadas de mamífero. Os exemplos dos vetores que podem ser expressos em células derivadas de mamífero incluem vetores plasmídico tais como pcDNA 3.1 (Invitrogen), pConPlus, pcDM8, pcDNA Ι/Amp, pcDNA 3.1, pREP4; e vetores virais tais como pDON-AI DNA (Takara Bio). O vetor pode ser um vetor compreendendo uma sequência codificando a cadeia pesada e uma sequência codificando a cadeia leve ou pode ser dois vetores de um vetor compreendendo uma sequência codificando a cadeia pesada e um vetor compreendendo uma sequência codificando a cadeia leve.
[0200] O transformante dentro do qual o vetor recombinante da presente invenção é introduzido pode ser uma célula procariótica tal como Escherichia coli ou Bacillus subtilis, preferivelmente uma célula eucariótica, mais preferivelmente uma célula de mamífero. Os exemplos da célula de mamífero incluem células do ovário do hamster chinês (células CHO), COS, mieloma, BHK, HeLa, Vero, 293, NSO, Namalwa e YB2/0. [0201] O anticorpo anti-RGMa ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo obtido pode ser purificado até a homogeneidade. Os métodos de separação e purificação usados para as proteínas comuns podem ser usadas para a separação e purificação de anticorpos e os semelhantes. A separação e purificação de anticorpos podem ser obtidas selecionando-se e combinando-se apropriadamente, por exemplo, mas não limitado a, colunas de cromatografia tais como cromatografia de afinidade, filtros, ultrafiltração, salting out, diálise, eletroforese em gel de SDS poliacrilamida ou
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45/65 focalização isoelétrica (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Os exemplos de colunas usadas para a cromatografia de afinidade incluem coluna de proteína A, coluna de proteína G, coluna conjugada a anticorpo anti-imunoglobulina e coluna conjugada a antígeno. Os exemplos da coluna de proteína A incluem Hyper D, POROS e Sepharose F. F. (Amersham Biosciences).
Agentes para Prevenir ou Tratar Doenças Imunológicas e Neurológicas [0202] A proteína de ligação de RGMa, particularmente o anticorpo anti-RGMa ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção neutraliza a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa para promover o reparo da função neuronal e assim pode ser usada como um agente para prevenção, tratamento, ou prevenção da recaída de doenças neurológicas.
[0203] A proteína de ligação de RGMa, particularmente o anticorpo anti-RGMa ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção também neutraliza a ativação de célula T pela RGMa e assim pode ser usada como um agente para prevenção, tratamento, ou prevenção da recaída de doenças imunológicas.
[0204] Os exemplos da doença neurológica incluem esclerose lateral amiotrófica, lesão do plexo braquial, dano cerebral (incluindo lesão cerebral traumática), paralisia cerebral, síndrome de Guillain-Barre, leucodistrofia cerebral, esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária), neuromielite óptica, síndrome pós-pólio, espinha bífida, lesão da medula espinhal, atrofia muscular espinhal, neoplasma espinhal, mielite transversa, demência (incluindo demência senil, deterioração cognitiva branda, doença de Alzheimer, demência associada com doença de Alzheimer), doença de Huntington, discinesia tardia, mania, doença de Parkinson, síndrome de Steele-Richardson, síndrome de Down, miastenia grave, neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico), amiloidose vascular, hemorragia cerebral associada com amiloidose, infartação cerebral, cerebrite, estado confusional agudo, glaucoma, esquizofrenia e degeneração da camada fibrosa do nervo retinal (incluindo retinopatia diabética, neuropatia óptica isquêmica, retinosquises ligadas ao
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46/65 cromossoma X, neuropatia óptica induzida por medicamento, distrofia retinal, degeneração macular relacionada com a idade, doenças oculares caracterizadas pelas drusas de disco óptico, doenças oculares caracterizadas pelo determinante genético para a degeneração de fotorreceptor, distrofia recessiva autossômica do cone-bastonete, distúrbio mitocondrial associada com neuropatia óptica). Lesão da medula espinhal e neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico) são preferidas. [0205] Os exemplos da doença imunológica incluem esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária), neuromielite óptica, psoríase, artrite (incluindo artrite reumatóide, osteoartrite, artrite psoriática), síndrome de GuillainBarre, doença neuro-Behcet, anemia perniciosa, diabete melito tipo I (insulinodependente), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), doença intestinal inflamatória (IBD), síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, anemia hemolítica autoimune, púrpura trombocitopênica autoimune, asma, polinose, dermatite atópica, glomerulonefrite, miastenia grave, doença de Hashimoto, e sarcoidose. Esclerose múltipla é preferida.
[0206] A proteína de ligação de RGMa, particularmente o anticorpo anti-RGMa ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção pode ser usada como um agente para prevenção, tratamento, ou prevenção da recaída de doenças neurológicas/imunológicas, que preferivelmente incluem lesão da medula espinhal, neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico) e esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária).
[0207] Como aqui usado, o termo “tratamento” inclui qualquer tratamento de doenças em um mamífero, particularmente um ser humano, e inclui inibir sintomas de doença, isto é, inibir a sua progressão ou eliminação das doenças ou sintomas, e aliviar sintomas de doença, isto é, causar a regressão das doenças ou sintomas ou uma demora no desenvolvimento dos sintomas.
[0208] “Prevenção” inclui a prevenção do início das doenças descritas acima em um mamífero, particularmente um ser humano.
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47/65 [0209] “Prevenção da recaída” inclui a prevenção da recaída das acima-descrito doenças repetição, remissão e recaída em um mamífero, particularmente um ser humano.
[0210] A proteína de ligação de RGMa (anticorpo anti-RGMa ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) da presente invenção pode ser usada como uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de doenças neurológicas ou imunológicas.
[0211] A forma de administração da proteína de ligação de RGMa (anticorpo antiRGMa ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) da presente invenção não é particularmente limitada e pode ser administrada aos mamíferos incluindo seres humanos por qualquer via de administração oral ou parenteral (por exemplo, intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, transcutânea, intracerebral, intraespinhal ou outra administração tópica).
[0212] As formas de dosagem para a administração oral e parenteral e métodos de preparação das mesmas são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica, e uma composição farmacêutica pode ser preparada combinando-se o anticorpo de acordo com a invenção com um carregador farmaceuticamente aceitável ou similares. [0213] As formas de dosagem para a administração parenteral incluem preparações injetáveis (por exemplo, injeções por infusão intravenosa, injeções intravenosas, injeções intramusculares, injeções subcutâneas, injeções intradérmicas, preparações de administração intracerebral, e preparações de administração intraespinhal), preparações externas (por exemplo, unguentos, cataplasmas, e loções), supositórios, inalantes, gotas oculares, unguentos oftálmicos, gotas nasais, gotas auriculares, e lipossomas. Em particular, quando o anticorpo de acordo com a presente invenção deva atuar diretamente sobre um tecido nervoso central, o mesmo pode ser infundido continuamente usando uma microbomba médica que é uma bomba osmótica, ou misturado com cola de fibrina ou similares para preparar uma preparação de liberação prolongada e depois colocado no tecido afetado.
[0214] Por exemplo, preparações injetáveis são usualmente preparadas dissolvendo-se o anticorpo em água destilada injetável e, se necessário, um agente
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48/65 solubilizante, um tampão, um agente ajustador de pH, um agente isotonizante, um agente suavizante, um preservante, e um agente de estabilização podem ser adicionados. As preparações injetáveis também podem ser preparações liofilizadas preparadas antes do uso.
[0215] As formas de dosagem para a administração oral incluem formas de dosagem sólida ou líquida, em particular, tabletes, tabletes revestidos, pílulas, grânulos finos, grânulos, pós, cápsulas, xaropes, emulsões, suspensões, injeções e pastilhas.
[0216] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter ainda outros medicamentos terapeuticamente eficazes, e se necessário, componentes tais como microbicidas, antiflogísticos, vitaminas e aminoácidos podem ser combinados.
[0217] Os carregadores farmacologicamente aceitáveis incluem, por exemplo, excipientes, lubrificantes, aglutinantes e desintegrantes para as preparações sólidas; e solventes, agentes de solubilização, agentes de suspensão, agentes isotonizantes, tampões e agentes suavizantes para as preparações líquidas. Se necessário, aditivos tais como antissépticos usuais, antioxidantes, corantes, adoçantes, adsorventes, e agentes de umectação podem ser apropriadamente usados em quantidades apropriadas.
[0218] A dosagem do anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser determinada com base em vários fatores tais como a via de administração, o tipo de doença, o grau de sintomas, idade, sexo, peso corporal, severidade da doença dos pacientes, descobertas farmacológicas tais como características farmacocinéticas e toxicológicas, seja usado ou não um sistema de liberação de medicamento, e seja o mesmo administrado ou não como uma parte de uma combinação com outros medicamentos. Usualmente, de 1 a 5.000 pg/dia, preferivelmente de 10 a 2.000 pg/dia, mais preferivelmente de 50 a 2.000 pg/dia para a administração oral ou de 1 a 5.000 pg/dia, preferivelmente de 5 a 2.000 pg/dia, mais preferivelmente de 50 a 2.000 pg/dia para injeção podem ser administrados por adulto (60 kg de peso corporal) em uma a várias doses. Para a administração parenteral ao corpo inteiro, de 10 a 100.000 pg/kg, mais preferivelmente de 100 a 50.000 pg/kg, e ainda mais preferivelmente de
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500 a 20.000 pg/kg por peso corporal podem ser administrados em um intervalo de uma vez ao dia, uma vez por semana, uma vez ao mês, ou de 1 a 7 vezes ao ano. Para a administração tópica o uso de uma bomba osmótica ou similares, na fusão contínua usual em uma taxa de 10 a 100.000 pg/dia, mais preferivelmente de 100 a 10.000 pg/dia, ainda mais preferivelmente de 500 a 5.000 pg/dia por adulto (60 kg de peso corporal) é possível.
EXEMPLOS [0219] A presente invenção será descrita em detalhes abaixo com referência aos Exemplos, mas a presente invenção não é limitada aos aspectos dos seguintes Exemplos.
Exemplo 1: Preparação de Proteína de RGMa Humana (Domínio de terminal C) [0220] Uma célula CHO expressando uma proteína RGMa humana recombinante em que um rótulo de histidina foi fundido ao terminal C de Pro 169 a Gly 422 (que se refere ao resíduo de prolina na posição 169 até o resíduo de glicina na posição 422 do lado de terminal N, daqui em diante similarmente descrito) da proteína RGMa humana (SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência) foi estabelecida.
[0221] O domínio de terminal C da proteína RGMa humana contida no sobrenadante de cultura de células CHO foi adsorvido em uma coluna de níquel (GE Healthcare, 17-5247-01), e eluído com uma solução a 100 mM de imidazol. Pela diálise, a fração de elução de imidazol foi substituída com Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) e usada como um imunógeno.
Exemplo 2: Preparação de Anticorpo Monoclonal Anti-RGMa Humana de Camundongo [0222] Dez microgramas da proteína RGMa humana recombinante preparada no Exemplo 1 foi misturada com Adjuvante de Freund completo (Sigma) para preparar uma emulsão, e um camundongo BALB/c (Charles River Japan) foi imunizado com ela em vários locais subcutâneos no dorso. Depois disso, a imunização foi realizada similarmente em intervalos de 1 a 2 semanas com 10 pg de proteína RGMa humana recombinante preparada em uma emulsão com Adjuvante de Freund incompleto (Sigma), e o sangue foi coletado depois de várias imunizações. O título de anticorpo
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50/65 foi medido pelo ELISA descrito abaixo em que as proteínas de RGMa humanas ou de camundongo foram imobilizadas. Nos indivíduos que apresentaram um título de anticorpo aumentado, 10 pg de proteína RGMa humana foram intravenosamente administrados para reforço, e os esplenócitos foram recuperados 2 ou 3 dias mais tarde.
[0223] Para a fusão de célula, as células esplênicas e células de mieloma de camundongo (SP2/0, Dainippon Sumitomo Pharma) com metade do número das células esplênicas foram misturadas e centrifugadas, e polietileno glicol (Roche Diagnostics) foi adicionado à fração precipitada resultante para se obter fusões de célula. As células foram depois centrifugadas e lavadas duas vezes com D-MEM (Invitrogen). As células foram recolocadas em suspensão em meio GIT (Nippon Pharmaceutical) contendo 10% de soro bovino fetal (Invitrogen), 1% de BM condimed (Roche Diagnostics) e HAT (Sigma-Aldrich) e semeadas em cada reservatório de uma placa de 96 reservatórios a 5 χ 104 células de mieloma/reservatório. O sobrenadante de cultura foi recuperado e triado quanto às células que produzem anticorpo pelo ELISA imobilizado na proteína RGMa humana do Exemplo 3.
[0224] As células que produzem anticorpo obtidas pela triagem foram clonadas pelo método da diluição limitante, e as células de hibridoma produzindo dois tipos de anticorpos monoclonais (B5,116A3 e B5,70E4) foram selecionadas.
[0225] Os isótipos de ambos dos anticorpos monoclonais determinados usandose um kit de isotipagem (Mouse MonoAB ID/SP KIT, ZYMED, 93-6550) foram lgG2b de camundongo para a cadeia pesada e capa para a cadeia leve.
[0226] Os sobrenadantes de cultura dos hibridomas foram submetidos à cromatografia de afinidade usando agarose sobre a qual os anticorpos anti-lgG de camundongo foram imobilizados (IgG Anti-Camundongo-Agarose fabricado pela Sigma) para purificar os anticorpos monoclonais. Depois o anticorpo foi ligado à coluna, a coluna foi lavada com PBS. Depois o anticorpo foi eluído com 10 mM de cloridreto de glicina (pH 2,7) e o eluído foi neutralizado imediatamente. Depois disso, o eluído neutralizado foi substituído com PBS através de um ultrafiltro.
Exemplo 3: ELISA no Qual as Proteínas de RGMa Humanas ou de Camundongo são
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Imobilizadas [0227] A proteína RGMa humana (R&D systems, 2459-RM) ou proteína RGMa de camundongo (R&D systems, 2458-RG) preparadas a 2 pg/ml com PBS foram dispensadas em uma placa de 96 reservatórios a 50 pL/reservatório cada, e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois da remoção da solução, ApplieBlock (Seikagaku Bio-Business, 200150) diluído 5 vezes com PBS foi dispensada a 200 pL/reservatório cada e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear a ligação não específica. Depois de lavar três vezes com PBST (PBS contendo 0,05% de Tween 20), as amostras (por exemplo, soro de camundongo, sobrenadante de cultura de hibridoma, sobrenadante de cultura expresso em anticorpo recombinante descrito mais tarde, ou anticorpo purificado) diluídos em série com PBS foram adicionados a 50 pL/reservatório cada, e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois disso, a placa foi lavada três vezes com PBST, e depois anticorpo de ovelha anti-lgG de camundongo rotulado com peroxidase (GE Healthcare, NA9310V) diluído com PBS foi dispensado a 50 pL/reservatório cada, e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois de lavar três vezes, um kit de colorir peroxidase (Sumitomo Bakelite, ML-1130O) foi adicionado e deixado desenvolver a cor durante um certo período de tempo, e a absorbância a 492 nm foi medida com uma leitora de placa. Exemplo 4: Análise de Epítopo de Anticorpo [0228] Epítopos aos quais os anticorpos se ligam foram determinados pelo método de varredura de peptídeo. Um total de 83 tipos de peptídeos foi sintetizado fundindose o lado de terminal N das sequências de aminoácido consistindo de 11 resíduos consecutivos trocados em 3 resíduos contidos em Arg 172 a Ala 424 da proteína RGMa humana (SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência) com uma sequência espaçadora (SGSG) com o terminal N biotinilado (SEQ ID NO: 46 na Listagem de Sequência). Depois de imobilizar os peptídeos sobre as placas revestidas com avidina, os anticorpos de teste (B5,116A3 e B5,70E4) foram deixados reagir. Subsequentemente, um anticorpo de coelho anti-lg de camundongo rotulado com peroxidase (Dako, P026002) foi deixado reagir. Depois uma solução de substrato foi
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52/65 adicionada e a cor desenvolvida durante um certo tempo, a absorbância foi medida com uma leitora de placa.
[0229] Como um resultado, B5,116A3 ligado aos peptídeos derivados da RGMa humana de Glu 298 a Gly 311 (dois tipos de peptídeos: Glu 298 a Asp 308 e Vai 301 a Gly 311), Asn 322 a Glu 335 (dois tipos de peptídeos: Asn 322 a Thr 332 e He 325 a Glu 335), e Lys 367 a Ala 377; e B5,70E4 ligado aos peptídeos derivados da RGMa humana de Glu 298 a Gly 311 (dois tipos de peptídeos: Glu 298 a Asp 308 e Vai 301 a Gly 311), Asn 322 a Glu 335 (dois tipos de peptídeos: Asn 322 a Thr 332 e He 325 a Glu 335), e Pro 349 a Thr 359.
Exemplo 5: Análise de Sequência e Clonagem de Gene de Anticorpo de Camundongo [0230] O RNA total foi extraído das células de hibridoma produzindo um anticorpo monoclonal de camundongo (B5,116A3 ou B5,70E4). Usando o RNA total como um padrão, o cDNA foi sintetizado pela reação de transcrição reversa. Usando o cDNA como um padrão, os genes das regiões variáveis e constantes de cadeia leve, e regiões variáveis e constantes de cadeia pesada foram amplificadas pela PCR e as sequências de DNA foram determinadas. Em seguida, com base nas sequências determinadas das regiões variáveis e constantes, os genes de anticorpo de tamanho natural foram amplificados pela PCR e clonados. As sequências de aminoácido codificadas por estes genes de anticorpo foram como segue.
(1) B5,116A3 sequência de aminoácido de cadeia leve (SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequência) [0231] DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQKPDGTVKLLIYY TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQLNTLPWTFGGGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSW TDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (2) B5,116A3 sequência de aminoácido de cadeia pesada (SEQ ID NO: 5 na Listagem de Sequência) [0232] EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLE WVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRD GAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTW
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NSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKL EPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDV SEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKC KVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVE WTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNY YLKKTISRSPGK (3) B5,70E4 sequência de aminoácido de cadeia leve (SEQ ID NO: 6 na Listagem de Sequência) [0233] DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQS PKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPYTFGG GTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQN GVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNE C (4) B5,70E4 sequência de aminoácido de cadeia pesada (SEQ ID NO: 7 na Listagem de Sequência) [0234] DVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITTSYYWNWIRQFPGNKLEW MGYISYDGTNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLRLNSVTTEDTATYYCAGSFGYSQG TLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSS VHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTI NPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQ ISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPS PIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTE ENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSP GK
Exemplo 6: Preparação de Anticorpo de Camundongo Recombinante e Anticorpo Quimérico de Rato e Camundongo Recombinante [0235] Os anticorpos de camundongo recombinantes de dois tipos de anticorpos anti-RGMa B5,116A3 e B5,70E4 derivados de hibridomas foram preparados (daqui em diante aludidos como “r116A3” e “r70E4”, respectivamente).
[0236] Além disso, como um exemplo comparativo, anticorpo quimérico de rato e
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54/65 camundongo recombinante (daqui em diante aludido como “r5F9’j foi preparado fundindo-se as regiões variáveis de anticorpo 5F9 de rato com as regiões constantes de anticorpo de camundongo (lgG2bK) (a região constante de cadeia leve é Arg 108 a Cys 214 da SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequência, e a região constante de cadeia pesada é Ala 117 a Lys 452 da SEQ ID NO: 5 da listagem de Sequência) de acordo com o Documento de Patente 1 (W02009/106356).
[0237] O DNA codificando as cadeias leve e pesada de cada um dos anticorpos foi inserido no pcDNA 3,3 (Life Technologies) para preparar um vetor de expressão. O vetor de expressão foi introduzido nas células HEK293F (Life Technologies) usando Neofection 293 (ASTEC). As células foram cultivadas a 37°C sob 8% de atmosfera de gasosa de dióxido de carbono durante 6 dias, e depois o sobrenadante de cultura foi recuperado. Para a purificação do anticorpo recombinante, o sobrenadante de cultura foi aplicado a uma coluna de afinidade na qual a Proteína A ou Proteína G foi imobilizada (GE Healthcare), e os anticorpos ligados à coluna foram eluídos com 10 mM de cloridreto de glicina (pH 2,8). O eluído foi neutralizado imediatamente, e depois substituído com PBS.
[0238] No caso onde pureza refinada precisa ser aumentada de acordo com o propósito de uso, os anticorpos purificados com a coluna de proteína A foram purificados com uma coluna de Hidroxiapatita Cerâmica Tipo 1 (CHT) (BIORAD). Os anticorpos ligados à coluna de CHT foram lavados com 10 mM de KH2PO4 (pH 6,5) e depois eluídos com 20 mM de KH2PO4 (pH 6,5), 0,5 M de NaCI. As frações eluídas foram coletadas e depois substituídas com PBS.
Exemplo 7: Ensaio de ligação nas Células Expressando Proteína de RGMa [0239] Um vetor expressando a proteína RGMa humana de tamanho natural (Met 1 a Cys 450 da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência), 0 domínio de terminal C da proteína RGMa humana (Pro 169 a Cys 450 da SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência), a proteína RGMa de camundongo de tamanho natural (Met 1 a Trp 454 da SEQ ID NO: 2 na Listagem de Sequência), ou 0 domínio de terminal C da proteína RGMa de rato (Pro 170 a Trp 449 da SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequência) foi introduzido em células CHO ou HEK 293 para preparar células que expressam
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55/65 antígeno.
[0240] Nas proteínas de RGMa, o peptídeo de terminal C é processado durante a reação de adição da âncora GPI. As proteínas de RGMa de camundongo e rato são ambas clivadas em Ala 427 e o peptídeo de terminal C é removido. Portanto, as sequências de aminoácido da proteína de tamanho natural e o domínio de terminal C expressos em uma célula via uma âncora GPI são os mesmos em camundongo e rato. [0241] Os anticorpos de teste (r116A3 e r70E4) e r5F9 (Exemplo comparativo) com uma concentração final de 10 pg/ml foram reagidos com as células que expressam antígeno descritas acima e depois as células foram lavadas com PBS contendo 0,1% de albumina sérica bovina e 0,05% de NaNa. O anticorpo de imunoglobulina anti-camundongo rotulado com FITC (DAKO) foi deixado reagir e as células foram lavadas. A fluorescência foi medida com a citometria de fluxo (FACSCalibur fabricada pela Beckton Dickinson), e as propriedades de ligação dos anticorpos de teste às células que expressam antígeno foram avaliadas (Tabela 1).
[0242] Como um resultado, r116A3 e r70E4 foram descobertos ligar ao domínio de terminal C das proteínas de RGMa humana e de rato, diferente de r5F9. A proteína RGMa tem o efeito inibidor do crescimento de neurite ainda que apenas no domínio de terminal C, e r116A3 e r70E4 inibem tanto a proteína RGMa de tamanho natural quanto o domínio de terminal C.
Tabela 1: Avaliação da ligação de vários anticorpos anti-RGMa recombinantes às células que expressam antígeno*
RGMa humana de tamanho natural Domínio de terminal C da RGMa humana RGMa de camundongo de tamanho natural Domínio de terminal C da RGMa de rato
r116A3 ++ ++ ++ ++
r70E4 ++ ++ + ++
r5F9 ++ - ++ -
*; ++Ligam fortemente +ligam fracamente
-Não ligam
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Exemplo 8: Determinação da Constante de Dissociação para a Proteína de RGMa [0243] A afinidade dos anticorpos de teste (r116A3 e r70E4) e r5F9 (Exemplo comparativo) para a proteína RGMa foram medidos pelo método da ressonância plasmônica superficial (SPR) usando Proteon XPR36 (Bio-Rad).
[0244] A proteína RGMa humana (R&D Systems, 2459-RM), o domínio de terminal C da proteína RGMa humana (preparada no Exemplo 1) ou proteína RGMa de camundongo (R&D Systems, 2458-RG) diluídos para 10 pg/ml com tampão de acetato a 10 mM (pH 4,5) foi imobilizado em um chip sensor GLC pelo método de ligação de amina. Os anticorpos de teste diluídos em série foram aplicados como análitos em uma taxa de fluxo de 100 pL/min durante 60 segundos para determinar a constante de dissociação (valor Kd).
[0245] Como mostrado na Tabela 2, r116A3 e r70E4 também ligaram ao domínio de terminal C da proteína RGMa humana, mas r5F9 não. R116A3 ligou à proteína RGMa humana 32 vezes mais forte do que r5F9 e à proteína RGMa de camundongo 44 vezes mais forte do que r5F9.
Tabela 2: Afinidade de anticorpo monoclonal anti-RGMa
Anticorpo Constante Dissociação (valor Kd, nM)
RGMa Humana Domínio de terminal C da RGMa humana RGMa de Camundongo
r116A3 0,0487 0,0568 0,201
r70E4 2,43 1,12 174
r5F9 (Exemplo comparativo) 1,59 Não ligam 8,98
Exemplo 9: Ensaio de Inibição da Ligação de RGMa-Neogenina [0246] O domínio extracelular (Ala 34 a Leu 1105) da proteína neogenina humana recombinante (SEQ ID NO: 10 na Listagem de Sequência) foi purificada. Uma linhagem de célula CHO expressando o domínio extracelular da proteína Neogenina humana foi estabelecida. Um rótulo de histidina foi fundido ao terminal C. A partir do sobrenadante de cultura de células CHO, o domínio extracelular foi adsorvido em uma coluna de níquel (GE Healthcare, 17-5247-01), e depois eluído com uma solução a
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100 mM de imidazol. Pela diálise, a fração de elução de imidazol foi substituída com
PBS.
[0247] A proteína RGMa humana (R&D systems, 2459-RM) foi rotulada com biotina usando o Kit de Rotulação com Biotina ChromaLink (Solulink). Quantidades iguais da proteína RGMa humana rotulada com biotina ajustada a 2 pg/ml e os anticorpos de teste (r116A3 e r70E4) submetidas à diluição em série de 2 vezes foram misturados e deixados reagir na temperatura ambiente durante 2 horas para preparar uma solução mista.
[0248] Ao mesmo tempo, 50 pL/reservatório do domínio extracelular da proteína neogenina humana ajustada para 2 pg/ml com PBS foram adicionados a uma placa de 96 reservatórios, e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora para preparar uma placa imobilizada com neogenina. Depois da remoção da solução, solução a 2,5% de albumina sérica bovina foi adicionada e a placa foi deixada repousar durante 1 hora para bloquear a ligação não específica. À placa imobilizada com neogenina, a solução mista descrita acima foi adicionada a 50 pL/reservatório, e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois, uma operação de lavagem foi realizada, e Avidina rotulada com peridoxidase (VECTASTAIN ABC system, fabricado pela Vector Laboratories) foi adicionado, e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Uma operação de lavagem foi depois realizada, uma solução de substrato foi adicionada, o desenvolvimento de cor foi realizado durante um certo período de tempo, e a absorbância foi medida com uma leitora de placa. A razão de absorbância na ausência do anticorpo foi plotada como 1, e a inibição da ligação de RGMa-neogenina dependente da concentração pelo anticorpo foi avaliada (Fig. 1).
[0249] Como um resultado, diferente do anticorpo policlonal anti-RGMa humana (R&D Systems, AF2459) e r5F9, r116A3 e r70E4 não inibiram a ligação de RGManeogenina.
Exemplo 10: Ensaio de Inibição da Ligação de RGMa-BMP2 [0250] A proteína RGMa humana (R&D systems, 2459-RM) ajustada para 2 pg/ml com PBS foi adicionada a uma placa de 96 reservatórios a 50 pL/reservatório cada, e
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58/65 a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Uma solução a 2,5% de albumina sérica bovina foi adicionada e a mistura foi deixada repousar durante 1 hora para bloquear a ligação não específica, preparando deste modo a placa imobilizada com a proteína RGMa. Os anticorpos de teste (B5,116A3 e B5,70E4) diluídos em série de 0,01 a 10 pg/ml foram adicionados à placa imobilizada com a proteína RGMa e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois, uma operação de lavagem foi realizada, e a proteína BMP2 humana (R&D systems, 355-BM) diluída para 0,5 pg/ml foi adicionada e a placa foi deixada repousar na temperatura ambiente durante 1 hora.
[0251] Um anticorpo anti-BMP2 rotulado com biotina foi deixado reagir, e adicionado ainda com Avidina rotulada com peroxidase (VECTASTAIN ABC system, fabricado pela Vector Laboratories) e uma solução de substrato foi adicionada, o desenvolvimento de cor foi realizado durante um certo período de tempo, e a absorbância foi medida com uma leitora de placa (Fig. 2).
[0252] Como um resultado, em particular, o anticorpo anti-RGMa (B5,116A3) fracamente inibiu a ligação de RGMa-BMP2 em uma maneira dependente da concentração (Absorbância: 0,45 a 0,01 pg/ml, 0,4 a 0,1 pg/ml, 0,32 a 1 pg/ml, e 0,1 a 10 pg/ml).
Exemplo 11: Planejamento de Anticorpo Humanizado [0253] A humanização do anticorpo monoclonal de camundongo B5,116A3 foi realizada pelo enxerto da região determinadora de complementaridade (CDR) de acordo com o método por Winter et al. descrito na Patente No. 2912618.
[0254] Primeiro, modelos de homologia 3D das regiões variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo monoclonal de camundongo B5,116A3 foram preparadas e os resíduos de aminoácido dentro da região de armação (FW), localizados próximos à CDR foram identificados. FWs de anticorpos humanos em que estes aminoácidos são mantidos tantos quanto possível foram selecionadas, as CDRs do anticorpo de camundongo foram enxertadas nela, e assim planejando um anticorpo humanizado. Na sequência de anticorpo humanizado planejada, a cadeia pesada é descrita como HA (SEQ ID NO: 11 na Listagem de Sequência) e a cadeia leve é descrita como KA
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59/65 (SEQ ID NO: 19 na Listagem de Sequência). Além disso, uma pluralidade de sequências de anticorpo humanizadas foi planejada pela introdução de mutações adicionais nos aminoácidos dentro das FWs envolvidas na estabilidade estrutural da região variável (Um total de 8 cadeias pesadas variando de HB a HH incluindo HA e um total de 7 cadeias leves variando de KB a KG incluindo KA).
Tabela 3: Sequências de anticorpo humanizado planejadas
Cadeia pesada SEQ ID NO na listagem de Sequência
HA Sequência em que as CDRs de anticorpo de camundongo B5,116A3 são enxertadas nas FWs de anticorpo humano 11
HB Sequência HA com substituição de Ala 81 por Vai e Lys 89 por Arg 12
HC Sequência de HA com substituição de Ala 81 por Vai 13
HD Sequência de HA com substituição de Lys 89 por Arg 14
HE Sequência HA com substituição de Ala 81 por Vai, Lys 89 por Arg, e Phe 37 por Vai 15
HF Sequência HA com substituição de Leu 95 por Vai 16
HG sequência HA com substituição de Phe 37 por Vai 17
HH sequência HA com substituição de Phe 37 por Vai, e Leu 95 por Vai 18
Cadeia Leve
KA Sequência em que as CDRs de anticorpo de camundongo B5,116A3 são enxertadas às FWs de anticorpo humano 19
KB Sequência KA com substituição de Phe 71 por Tyr 20
KC Sequência KA com substituição de Phe 71 por Tyr, e Phe 44 por Vai 21
KD Sequência KA com substituição de Ser 85 por Thr 22
KE Sequência KA com substituição de Pro 44 por Vai 23
KF Sequência KA com substituição de Pro 44 por Vai, e Ser 85 por Thr 24
KG Sequência KA com substituição de Phe 71 por Tyr, Pro 44 por Vai, e Ser 85 por Thr 25
Exemplo 12: Preparação de Anticorpo Quimérico de Camundongo e Ser Humano Recombinante e Anticorpo Humanizado Recombinante [0255] (1) Anticorpo anti-RGMa quimérico de camundongo e ser humano recombinante 116A3 (r116A3C) tendo as seguintes sequências de aminoácido foi preparado de acordo com o Exemplo 6.
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Cadeia leve (SEQ ID NO: 8 na Listagem de Sequência) [0256] DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQKPDGTVKLLIYY TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQLNTLPWTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Cadeia pesada (SEQ ID NO: 9 na Listagem de Sequência) [0257] EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLE
WVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRD GAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (2) Um total de 20 anticorpos anti-RGMa humanizados compreendendo as seguintes combinações de cadeias pesada e leve foi preparado de acordo com o Exemplo 6. Combinações de cadeia pesada/cadeia leve;
[0258] HA/KA, HA/KB, HA/KC, HA/KG, HB/KC, HC/KA, HC/KB, HD/KA, HD/KB, HD/KC, HD/KD, HE/KA, HF/KA, HF/KF, HF/KG, HG/KD, HG/KH, HH/KA, HH/KD, HH/KF (3) Um anticorpo anti-RGMa humanizado recombinante (daqui em diante aludido como rH5F9) foi preparado de acordo com o Exemplo 6 (Exemplo comparativo). [0259] A região variável do anticorpo monoclonal anti-RGMa humanizado h5F9 descrito no Documento de Patente 1 (WQ2009/106356) (a cadeia leve é a seq ID_53 do Documento de Patente 1, e a cadeia pesada é a seq ID_50 do Documento de Patente 1) foi ligada com a região constante do anticorpo humano (a cadeia leve é Arg 108 a Cys 214 da SEQ ID NO: 26 na Listagem de Sequência, e a cadeia pesada é Ala 117 a Lys 446 da SEQ ID NO: 27 na Listagem de Sequência).
Exemplo 13: Teste de Estabilidade Térmica para o Anticorpo
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61/65 [0260] Alíquotas de vinte μΙ_ do sobrenadante de cultura em que o anticorpo recombinante descrito no Exemplo 12 foi expresso foram coletadas e tratadas com calor durante 10 minutos em 8 pontos de temperatura de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 e 75°C, respectivamente, usando um ciclador térmico (Takara bio, TP 600). O sobrenadante de cultura foi diluído com PBS de modo que a concentração final do anticorpo fosse de 125 ng/ml. Depois disso, o sobrenadante de cultura foi submetido ao ELISA no qual as proteínas RGMa humanas são imobilizadas descrito no Exemplo 3 para avaliar a propriedade de ligação de antígeno do anticorpo (Fig. 3).
[0261] Como um resultado, um anticorpo humanizado compreendendo uma combinação de cadeia pesada HE e cadeia leve KA (daqui em diante aludida como “rH116A3’j, e um anticorpo quimérico de camundongo e ser humano (r116A3C) mostraram melhor estabilidade térmica do que o anticorpo humanizado (rH5F9). Daqui em diante, o anticorpo humanizado compreendendo esta combinação de HE/KA é descrito como rH116A3.
[0262] Quando o tratamento térmico não foi realizado, o anticorpo quimérico de camundongo e ser humano (r116A3C) e o anticorpo humanizado (rH116A3) mostraram propriedades de ligação a antígeno equivalentes, e não houve nenhuma diminuição na propriedade de ligação de antígeno associada com a humanização.
Exemplo 14: Estabelecimento de uma Linhagem de Célula Estável CHO Produzindo Anticorpo anti-RGMa Humanizado (rH116A3) [0263] Uma linhagem de célula estável CHO produzindo anticorpo anti-RGMa humanizado (rH116A3) foi estabelecida usando o sistema GS Xceed da Lonza (Lonza). Um vetor de gene duplo pXC compreendendo a sequência codificando a cadeia leve (SEQ ID NO: 44 na Listagem de Sequência) e a sequência codificando a cadeia pesada (SEQ ID NO: 43 na Listagem de Sequência) do anticorpo anti-RGMa humanizado (rH116A3) foi introduzido em uma linhagem de célula precursora silenciada em GS CHOK1SV, e uma reunião de células transformadas foi obtida sob seleção com metionina sulfoximina (MSX). Depois de separar em células únicas pela citometria de fluxo, a quantidade de produção de anticorpo no sobrenadante de cultura, a proliferação de célula e os semelhantes foram avaliados, e uma linhagem
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62/65 de célula estável CHO foi obtida.
Exemplo 15: Ensaio de crescimento de neurite [0264] Um cerebelo foi excisado de um rato neonatal (P7), colocado em suspensão em uma solução de tripsina (solução a 0,25% de tripsina em PBS contendo 0,2% de DNase) e digerido a 37 °C durante 10 a 15 minutos. Em seguida, meio DMEM contendo 10% de soro bovino fetal foi adicionado e a mistura foi centrifugada. As células foram recolocadas em suspensão no mesmo meio e centrifugada, e o mesmo procedimento foi repetido duas vezes para lavar as células. Além disso, esta suspensão de célula foi filtrada através de um coador de célula de 70 pm e centrifugada, e a fração precipitada foi recolocada em suspensão no mesmo meio. O suplemento B27 (GIBCO) foi adicionado à suspensão de célula para preparar as células de grânulo cerebelar de rato neonatal.
[0265] Em seguida, as células de grânulo cerebelar de rato neonatal foram semeadas em uma placa de cultura de célula e cultivadas a 37 °C durante 1 dia.
[0266] A proteína RGMa recombinante (R&D systems, 2459-RM) com uma concentração final de 2 pg/ml foi adicionada e as células foram cultivadas a 37°C durante 2 dias. O comprimento de neurite foi medido pela microscopia. Como mostrado na Fig. 4, a adição de RGMa resultou em mudanças no comprimento de neurite de 37 pm para 26 pm no experimento na figura da esquerda e de 38 pm a 27 pm na figura da direita, inibindo assim o crescimento de neurite. Embora a adição apenas do anticorpo de teste (B5,116A3 ou B5,70E4) em uma concentração final de 10 pg/ml não mudasse o comprimento de neurite, a adição simultânea da proteína RGMa recombinante e do anticorpo de teste induziu o crescimento de neurite ao mesmo grau como um controle (nenhuma RGMa adicionada), que indica efeito neutralizador do anticorpo contra a proteína RGMa.
Exemplo 16: Teste de Eficácia Usando um Modelo de Lesão da Medula Espinhal de Rato.
[0267] Um rato Wistar (fêmea, 8 semanas de idade, pesando cerca de 200 g) anestesiado pela aspiração de halotano (Takeda Pharmaceutical) foi submetido a uma laminectomia das vértebras anterior e posterior em torno do nível espinhal T9 (T8 a
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T10), e a medula espinhal foi exposta. No caso de avaliação usando modelo de esmagamento da medula espinhal, pressão de 200 kdyn (2 N) foi aplicada à medula espinhal exposta usando pêndulo IH (Precision System).
[0268] Imediatamente depois de causar dano à medula espinhal como descrito acima, uma minibomba osmótica cheia com 400 pg/ml do anticorpo de teste (r116A3 ou r70E4) ou um anticorpo de camundongo de controle (mo-lgG2bK) (200 pL de volume, 0,5 pL/hora, liberação de 14 Dias) (Alzet, modelo 2002) foi colocado sob a pele do dorso do rato. A ponta de um tubo de silício conectada à saída da minibomba osmótica foi colocada sob a dura-máter no local da lesão da medula espinhal. O tubo foi costurado e fixado aos processos espinhosos no lado do membro inferior direito do local laminectomizado, as camadas musculares e dérmicas foram suturadas, e o rato foi levantado.
[0269] A função motora do rato modelo de lesão da medula espinhal foi avaliada usando a contagem de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Basso, D. M., Beattie, M. S., & Bresnahan, J. C., Uma escala de classificação motora sensível e confiável para teste em campo aberto em ratos. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995)) em 0, 1,3 e 7 dias depois da lesão, e a cada semana depois disso durante até 8 semanas. Como um resultado, como mostrado na Fig. 5(A), r116A3 ou r70E4 significantemente melhoraram a contagem de BBB 4 ou 3 semanas depois da administração, respectivamente, comparados com o anticorpo de controle (mo-lgG2bK) (p<0,05, teste t de Student).
[0270] No caso de avaliação usando um modelo de hemissecção da medula espinhal, o lado dorsal da medula espinhal exposta foi cortado a uma profundidade de 1,8 mm a 2,0 mm. Da mesma maneira como acima, o anticorpo de teste (B5,116A3) ou o anticorpo de camundongo de controle (mo-lgG2bK) foi administrado usando minibomba osmótica e avaliado usando a contagem BBB a 0, 1,3 e 7 dias depois da lesão, e a cada semana depois disso durante até 10 semanas. Como mostrado na Fig. 5(B), B5,116A3 significantemente melhorou a contagem BBB 4 semanas depois da administração comparada com o anticorpo de controle (mo-lgG2bK) (p<0,01, teste t de Student).
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Exemplo 17: Teste de Eficácia Usando Modelo de Camundongo com Esclerose
Múltipla [0271] O peptídeo PLP139-151 (HSLGKWLGHPDKF: SEQ ID NO: 45 na Listagem de Sequência, Peptide Institute) foi dissolvido em solução salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Factory) e misturado com Adjuvante de Freund incompleto (Sigma) ao qual 0 bacilo da tuberculose morto H37 Ra (Difco Laboratories) foi adicionado para preparar uma emulsão. O camundongo SJL/JorllcoCrj (SJL/J) (Charles River Japan) foi imunizado subcutaneamente no dorso com 0 peptídeo PLP139-151 a 50 pg/cabeça, e contagem EAE e a mudança de peso corporal foi avaliada (H. Kataoka, K Sugahara, K. Shimano, K. Teshima, M. Koyama, A. Fukunari e K. Chiba. FTY720, moduladordo receptor de esfingosina 1-fosfato, melhora encefalomielite autoimune experimental pela inibição da infiltração de célula T. Cellular & Molecular Immunology 6, 439-448, 2005.) (Fig. 6).
[0272] O anticorpo de teste (B5,116A3) diluído em solução salina fisiológica foi intraperitonealmente administrado a 20 mg/kg cada um em 7 e 10 dias ou 18 e 21 dias depois da imunização com peptídeo PLP139-151.
[0273] Como um resultado, como mostrado na Fig. 6, comparado com 0 anticorpo de controle (mo-lgG2bK), 0 anticorpo monoclonal de camundongo anti-RGMa (B5,116A3) inibiu a deterioração da contagem de EAE pela administração antes do início (parte superior da Fig. 6) e mostrou efeito da prevenção de recaída pela administração depois do início (parte inferior da Fig. 6).
Exemplo 18: Teste de imunogenicidade de Anticorpo [0274] As células dendríticas não diferenciadas contidas no derivado de sangue periférico de 51 doadores saudáveis foram maturadas pelo fator estimulador de colônia de granulócito-monócito (GM-CSF) e estimulações Interleucina 4. O anticorpo de teste (rH116A3) em uma concentração final de 50 pg/ml foi adicionado às células dendríticas maduras e as células foram cultivadas durante 4, 5 dias para permitir que 0 anticorpo seja absorvido nas células dendríticas. As células T de CD4+ de sangue periférico (células T auxiliares) derivadas do mesmo doador foram misturadas com as células dendríticas, e co-cultivadas durante mais uma semana, e depois a proliferação
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65/65 de células T foi medida pela citometria de fluxo. Usando a atividade de proliferação de célula T do anticorpo de teste como um índice, o risco de imunogenicidade em ser humano foi avaliada. Como um resultado, a proliferação de célula T foi observada em (7,8%) dos 51 doadores, e assim o risco de imunogenicidade foi baixo.

Claims (31)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Proteína de ligação de RGMa isolada, caracterizada pelo fato de que não inibe a ligação entre a Molécula Orientadora Repulsiva A (RGMa) e neogenina mas neutraliza a atividade inibidora do crescimento de neurite de RGMa.
  2. 2. Proteína de ligação de RGMa de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que se liga à RGMa humana, de rato e/ou de camundongo.
  3. 3. Proteína de ligação de RGMa de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que se liga aos peptídeos de EEVVNAVEDWDSQG (SEQ ID NO: 26 na Listagem de Sequência), NQQIDFQAFHTNAE (SEQ ID NO: 27 na Listagem de Sequência), PTAPETFPYET (SEQ ID NO: 28 na Listagem de Sequência), e/ou KLPVEDLYYQA (SEQ ID NO: 29 na Listagem de Sequência).
  4. 4. Proteína de ligação de RGMa de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que se liga aos peptídeos das SEQ ID NOS: 26 e 27 na Listagem de Sequência.
  5. 5. Proteína de ligação de RGMa de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que se liga aos peptídeos das SEQ ID NOS: 26, 27 e 28 na Listagem de Sequência.
  6. 6. Proteína de ligação de RGMa de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que se liga aos peptídeos das SEQ ID NOS: 26, 27 e 29 na Listagem de Sequência.
  7. 7. Proteína de ligação de RGMa de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação de RGMa é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
  8. 8. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que codifica a porção de proteína da proteína de ligação de RGMa como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.
  9. 9. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 8.
  10. 10. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que contém o vetor
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    2/7 recombinante como definida na reivindicação 9.
  11. 11. Método para produzir a proteína de ligação de RGMa como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, o método caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de cultivar a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10.
  12. 12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de ligação de RGMa como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.
  13. 13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que é para o uso na prevenção, tratamento, ou prevenção da recaída de doenças neurológicas ou imunológicas.
  14. 14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que as doenças neurológicas são selecionadas do grupo consistindo de esclerose lateral amiotrófica, lesão do plexo braquial, dano cerebral (incluindo lesão cerebral traumática), paralisia cerebral, síndrome de Guillain-Barre, leucodistrofia cerebral, esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrenteremitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária), neuromielite óptica, síndrome pós-pólio, espinha bífida, lesão da medula espinhal, atrofia muscular espinhal, neoplasma espinhal, mielite transversa, demência (incluindo demência senil, deterioração cognitiva branda, doença de Alzheimer, demência associada com doença de Alzheimer), doença de Huntington, discinesia tardia, mania, doença de Parkinson, síndrome de Steele-Richardson, síndrome de Down, miastenia grave, neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico), amiloidose vascular, hemorragia cerebral associada com amiloidose, infartação cerebral, cerebrite, estado confusional agudo, glaucoma, esquizofrenia e degeneração da camada fibrosa do nervo retinal (incluindo retinopatia diabética, neuropatia óptica isquêmica, retinosquises ligadas ao cromossoma X, neuropatia óptica induzida por medicamento, distrofia retinal, degeneração macular relacionada com a idade, doenças oculares definidas pelas drusas de disco óptico, doenças oculares definidas pelo determinante genético para a degeneração de fotorreceptor, distrofia recessiva
    Petição 870170081662, de 25/10/2017, pág. 79/93
    3/7 autossômica do cone-bastonete, distúrbio mitocondrial associado com neuropatia óptica).
  15. 15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que as doenças imunológicas são selecionadas do grupo consistindo de esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária), neuromielite óptica, psoríase, artrite (incluindo artrite reumatóide, osteoartrite, artrite psoriática), síndrome de Guillain-Barre, doença neuro-Behcet, anemia perniciosa, diabete melito tipo I (insulino-dependente), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), doença intestinal inflamatória (IBD), síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, anemia hemolítica autoimune, púrpura trombocitopênica autoimune, asma, polinose, dermatite atópica, glomerulonefrite, miastenia grave, doença de Hashimoto, e sarcoidose.
  16. 16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que as doenças neurológicas ou imunológicas são selecionadas do grupo consistindo de lesão da medula espinhal, neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico) e esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária).
  17. 17. Anticorpo anti-RGMa isolado, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácido de cada uma das região determinadoras de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), a região determinadora de complementaridade de cadeia leve 2 (LCDR2), a região determinadora de complementaridade de cadeia leve 3 (LCDR3), região determinadora de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), região determinadora de complementaridade de cadeia pesada 2 (HCDR2) e região determinadora de complementaridade de cadeia pesada 3 (HCDR3) compreende o seguinte:
    LCDR1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO: 30 na Listagem de Sequência),
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    4/7
    LCDR2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 31 na Listagem de Sequência),
    LCDR3: QQLNTLP (SEQ ID NO: 32 na Listagem de Sequência),
    HCDR1: DAWMD (SEQ ID NO: 33 na Listagem de Sequência),
    HCDR2: EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID NO: 34 na Listagem de
    Sequência) e
    HCDR3: RDGAY (SEQ ID NO: 35 na Listagem de Sequência);
    ou
    LCDR1: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 36 na Listagem de Sequência)
    LCDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 37 na Listagem de Sequência) LCDR3:SQSTHVP (SEQ ID NO: 38 na Listagem de Sequência) HCDR1: TSYYWN (SEQ ID NO: 39 na Listagem de Sequência) HCDR2: YISYDGTNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 40 na Listagem de Sequência) e
    HCDR3: SFG, e em que em cada uma das sequências de CDR de um a vários aminoácidos podem ser substituídos, deletados, e/ou adicionados.
  18. 18. Anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada (VH) compreende o seguinte:
    VH:
    EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSK ANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGT TVTVSS (SEQ ID NO: 41 na Listagem de Sequência) ou uma sequência de aminoácido tendo uma identidade de pelo menos 90% com a dita sequência de aminoácido; e em que a região variável de cadeia leve (VL) compreende o seguinte: VL:
    DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSG
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    5/7
    VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME (SEQ ID
    NO: 42 na Listagem de Sequência) ou uma sequência de aminoácido tendo uma identidade de pelo menos 90% com a dita sequência de aminoácido.
  19. 19. Anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com as reivindicações 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-RGMa é um anticorpo humanizado.
  20. 20. Anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-RGMa compreende regiões constantes da IgG humana.
  21. 21. Proteína de ligação de RGMa, caracterizada pelo fato de que compete com o anticorpo anti-RGMa como definido nas reivindicações 17 ou 18 quanto à ligação à RGMa.
  22. 22. Molécula de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de que codifica a porção de proteína do anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 17 a 20.
  23. 23. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que as sequências de nucleotídeo codificando as sequências de aminoácido VH e VL cada uma é uma sequência de nucleotídeo compreendendo:
    VH:
    gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcagatccctgagactgtcctgtaccgcctccgg cttcaccttctccgacgcctggatggattgggtgcgacaggctcctggcaagggcctggaatgggtggccgagatccg gtccaaggccaacaaccacgccacctactacgccgagtctgtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactcc aagtccatcgtgtacctgcagatgaactccctgcggaccgaggacaccgccctgtactactgcaccagaagggacg gcgcctactggggcaagggcaccacagtgacagtgtcctcc (SEQ ID NO: 43 na Listagem de Sequência), e
    VL:
    gacatccagatgacccagtccccctcctccgtgtctgcttccgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcgggcctccc aggacatctcctcctacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactacacctcc cggctgcactccggcgtgccctctagattttccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgca
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    6/7 gcccgaggacttcgcctcctacttctgtcagcagctgaacaccctgccctggacctttggcggaggcaccaaggtgga aatggaa (SEQ ID NO: 44 na Listagem de Sequência).
  24. 24. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico como definida nas reivindicações 22 ou 23.
  25. 25. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que contém o vetor recombinante como definido na reivindicação 24.
  26. 26. Método para produzir o anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 17 a 20, o método caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 25.
  27. 27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo anti-RGMa ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 17 a 20.
  28. 28. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que é para o uso na prevenção, tratamento, ou prevenção da recaída de doenças neurológicas ou imunológicas.
  29. 29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que as doenças neurológicas são selecionadas do grupo consistindo de esclerose lateral amiotrófica, lesão do plexo braquial, dano cerebral (incluindo lesão cerebral traumática), paralisia cerebral, síndrome de Guillain-Barre, leucodistrofia cerebral, esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrenteremitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária), neuromielite óptica, síndrome pós-pólio, espinha bífida, lesão da medula espinhal, atrofia muscular espinhal, neoplasma espinhal, mielite transversa, demência (incluindo demência senil, deterioração cognitiva branda, doença de Alzheimer, demência associada com doença de Alzheimer), doença de Huntington, discinesia tardia, mania, doença de Parkinson, síndrome de Steele-Richardson, síndrome de Down, miastenia grave, neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico), amiloidose vascular, hemorragia cerebral associada com amiloidose, infartação cerebral, cerebrite, estado confusional agudo, glaucoma, esquizofrenia e degeneração da
    Petição 870170081662, de 25/10/2017, pág. 83/93
    7/7 camada fibrosa do nervo retinal (incluindo retinopatia diabética, neuropatia óptica isquêmica, retinosquises ligadas ao cromossoma X, neuropatia óptica induzida por medicamento, distrofia retinal, degeneração macular relacionada com a idade, doenças oculares definidas pelas drusas de disco óptico, doenças oculares definidas pelo determinante genético para a degeneração de fotorreceptor, distrofia recessiva autossômica do cone-bastonete, distúrbio mitocondrial associado com neuropatia óptica).
  30. 30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que as doenças imunológicas são selecionadas do grupo consistindo de esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária), neuromielite óptica, psoríase, artrite (incluindo artrite reumatóide, osteoartrite, artrite psoriática), síndrome de Guillain-Barre, doença neuro-Behcet, anemia perniciosa, diabete melito tipo I (insulino-dependente), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), doença intestinal inflamatória (IBD), síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, doença de Graves, anemia hemolítica autoimune, púrpura trombocitopênica autoimune, asma, polinose, dermatite atópica, glomerulonefrite, miastenia grave, doença de Hashimoto, e sarcoidose.
  31. 31. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que as doenças neurológicas ou imunológicas são selecionadas do grupo consistindo de lesão da medula espinhal, neurotrauma (incluindo trauma do nervo óptico), esclerose múltipla (incluindo esclerose múltipla recorrente-remitente, esclerose múltipla progressiva primária, esclerose múltipla progressiva secundária).
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