TW201710296A

TW201710296A - ＲＧＭａ結合蛋白質及其使用

Info

Publication number: TW201710296A
Application number: TW105113270A
Authority: TW
Inventors: Motonori Hashimoto; Toshihide Yamashita
Original assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp; Univ Osaka; Nat Univ Corp Chiba Univ
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2016-04-28
Publication date: 2017-03-16
Also published as: KR20170138565A; SA517390230B1; US20180100012A1; IL287291B; US20210277098A1; SI3290441T1; RU2017135353A; RU2017135353A3; CN107531791B; US10287346B2; JP2021106587A; PH12017501941A1; AU2019210655A1; JP2023030057A; KR102040235B1; IL255293A0; DOP2017000248A; EP3584260A1; EP3290441A4; AU2016253886B2

Abstract

本發明之課題為得到可使用作為神經學疾病或免疫學疾病之預防、治療或復發預防用之醫藥的結合活性高、且副作用少之抗Repulsive Guidance Molecule a(RGMa)抗體，藉由提供不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性的經單離之RGMa結合蛋白質，較佳為，互補性決定區域之胺基酸序列為序列表之序列編號30~35或序列表之序列編號36~40及SFG的抗RGMa抗體，而解決其課題。

Description

RGMa結合蛋白質及其使用

本發明係關於RGMa結合蛋白質及其使用。

RGM(repulsive guidance molecule)，為分子量約33kDa之GPI錨定型膜蛋白質，當初，係作為視覺系統之軸索誘導分子而被鑑定到的膜蛋白質(參照非專利文獻1)。RGM家族係包含稱為RGMa、RGMb及RGMc之3種成員，其中尤以RGMa，由於除了發育階段以外，亦於成人人類及大鼠之中樞神經系統損傷後再表現，及於大鼠中之RGMa阻礙，會使脊髓損傷後之神經突成長亢進，促進功能回復(參照非專利文獻2參照)，故RGMa被認為是中樞神經系統損傷後之神經突阻礙物質。

RGMa亦有報告於免疫系統的作用。RGMa係於樹狀細胞上表現，藉由對T細胞作用而提高T細胞對ICAM-1．纖維接合素(fibronectin)之接著性、或誘導細胞激素之產生(專利文獻4)。於多發性硬化症模式小鼠中，若投與抗RGMa抗體時，腦脊髓炎之症狀會被抑制，亦顯示抑制發病、復發的效果。抗RGMa抗體，被認為藉由與於樹狀細胞表現之RGMa結合，抑制T細胞之活性化，對多發性硬化症顯示效果。

RGMa之訊息傳導機構亦逐漸被解明，作為RGMa之受體，報告有Neogenin蛋白質(專利文獻3)。Neogenin為單次跨膜型之蛋白質，於神經細胞或T細胞上表現。

RGMa係藉由與細胞膜上之Neogenin結合，誘導細胞內之RhoA之活性化、Ras之不活性化，帶來神經突成長阻礙效果。另一方面，已知於發育途中之雞腦中，未結合RGMa時，Neogenin會引起細胞凋亡(Matsunaga等、Dev.Growth Differ.46,481,2004)。亦即，RGMa/Neogenin路徑，可認為具有促進神經細胞之生存的對神經再生而言較佳的作用、及阻礙神經突成長之負的作用的二個相反作用。

作為以RGM為標的之醫藥，於專利文獻1中揭示含有抗RGM中和抗體作為有效成分的軸索再生促進劑。又，專利文獻2及3中，揭示調節RGM對Neogenin受體之結合的抗RGM抗體之對腦及脊髓的機械損傷之治療劑。又，專利文獻4中，揭示抗RGM抗體之多發性硬化症等的醫藥用途。又，專利文獻5中，揭示抗RGM抗體對包含多發性硬化症、哺乳動物之腦外傷、脊髓損傷、中風、神經退化疾病及思覺失調症之疾病的治療用途。進一步地，專利文獻6中，揭示抗RGM抗體等之RGM調節子對脊髓損傷或多發性硬化症之治療用途，非專利文獻 3中揭示對漸進型多發性硬化症之治療用途。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開WO2005/087268號小冊

[專利文獻2]日本特表2010-537655號公報

[專利文獻3]日本特表2009-510002號公報

[專利文獻4]國際公開WO2011/071059號小冊

[專利文獻5]日本特表2011-512806號公報

[專利文獻6]日本特表2004-525875號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Neuron 5, 735-743 (1990)

[非專利文獻2] J. Cell Biol. 173, 47-58 (2006)

[非專利文獻3] Cell Reports 10, 1-12(2015)

如上所述，抗RGMa抗體對神經學疾病或免疫學疾病之治療用途雖被揭示，但以往的抗體係有活性不充分、或有亦損及RGMa本來的功能之虞、副作用之問題等。特別是以往的抗體，因為阻礙RGMa與Neogenin間之結合，係有亦會阻礙與RGMa結合之Neonigenin所具有的細胞凋亡抑制等之較佳作用之虞。

因而，本發明之課題為提供不阻礙RGMa/Neogenin之相互作用，且會中和RGMa之神經突成長阻礙活性的RGMa結合蛋白質。

本發明者等人為了解決上述課題進行了努力探討。其結果，成功得到不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且會中和RGMa之神經突成長阻礙活性的RGMa結合蛋白質，發現其可作為對神經學疾病或免疫學疾病之醫藥來使用，而完成了本發明。

本發明係如以下所示。

[1]一種經單離之RGMa結合蛋白質，其係不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性。

[2]如[1]之RGMa結合蛋白質，其係與人類RGMa、大鼠RGMa及/或小鼠RGMa結合。

[3]如[1]或[2]之RGMa結合蛋白質，其係結合於EEVVNAVEDWDSQG(序列表之序列編號26)、NQQIDFQAFHTNAE(序列表之序列編號27)、PTAPETFPYET(序列表之序列編號28)、及/或KLPVEDLYYQA(序列表之序列編號29)之胜肽。

[4]如[1]至[3]中任一項之RGMa結合蛋白質，其係結合於序列表之序列編號26及序列編號27之胜肽。

[5]如[1]至[4]中任一項之RGMa結合蛋白質，其係結合於序列表之序列編號26、序列表之序列編號27及序列表之序列編號28之胜肽。

[6]如[1]至[4]中任一項之RGMa結合蛋白質，其係結合於序列表之序列編號26、序列表之序列編號27及序列表之序列編號29之胜肽。

[7]如[1]至[6]中任一項之RGMa結合蛋白質，其中RGMa結合蛋白質為人類抗體、人類化抗體或嵌合體抗體、或此等之抗原結合片段。

[8]一種核酸分子，其係編碼如[1]至[7]中任一項之RGMa結合蛋白質的蛋白質部分。

[9]一種重組載體，其係包含如[8]之核酸分子。

[10]一種宿主細胞，其係包含如[9]之重組載體。

[11]一種方法，其係如[1]至[7]中任一項之RGMa結合蛋白質之製造方法，其包含培養如[10]之宿主細胞之步驟。

[12]一種醫藥組成物，其包含如[1]至[7]中任一項之RGMa結合蛋白質。

[13]如[12]之醫藥組成物，其係神經學疾病或免疫學疾病之預防、治療或復發預防用。

[14]如[13]之醫藥組成物，其中神經學疾病，係由包含肌萎縮性側索硬化症、上臂神經叢損傷、腦損傷(包含外傷性腦損傷)、腦性麻痺、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、大腦白質萎縮症、多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)、視神經脊髓炎、小兒麻痺後症候群、脊柱裂、脊髓損傷、脊髓性肌肉萎縮症、脊椎腫瘤、橫貫性脊髓炎、失智症(包含老年性失智症、輕度認知功能障礙、阿茲海默症、阿茲海默相關失智症)、杭丁頓氏舞蹈症、遲發性運動障礙、躁症、巴金森氏症、史蒂爾-理查症候群(Steele-Richard syndrome)、唐氏症、重症肌無力症、神經外傷(包含視神經外傷)、血管類澱粉症、類澱粉症所伴隨之大腦出血、腦梗塞、腦炎、急性混亂障礙、青光眼、思覺失調症及視網膜神經纖維層病變(包含藉由糖尿病性視網膜病、缺血性視神經病變、X染色體連結性視網膜分裂症、藥物誘發性視神經病變、視網膜營養性萎縮、老年性黃斑部病變、視神經乳頭玻璃疣而賦予特徵之眼病；藉由光受器病變之遺傳性決定因子而賦予特徵之眼病、體染色體隱性錐狀細胞-桿狀細胞失養症、視神經病變所伴隨之粒線體受損)之群中選擇。

[15]如[13]之醫藥組成物，其中免疫學疾病，係由包含多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)、視神經脊髓炎、乾癬、關節炎(包含風濕性關節炎、變形性關節病、乾癬性關節炎)、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、神經貝賽特氏症、惡性貧血、I型(胰島素依賴型)糖尿病、全身紅斑性狼瘡(SLE)、發炎性腸疾病(IBD)、休格倫氏症候群、古巴士德氏症候群(Goodpasture’s syndrome)、葛瑞夫茲氏症 (Graves’disease)、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性血小板減少性紫斑病、氣喘、花粉症、異位性皮膚炎、絲球體腎炎、重症肌無力症、橋本氏病、及肉狀瘤病之群中選擇。

[16]如[13]之醫藥組成物，其中神經學疾病或免疫學疾病，係由包含脊髓損傷、神經外傷(包含視神經外傷)及多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)之群中選擇。

[17]一種經單離之抗RGMa抗體、或其抗原結合片段，其輕鏈之互補性決定區域1(LCDR1)、輕鏈之互補性決定區域2(LCDR2)、輕鏈之互補性決定區域3(LCDR3)、重鏈之互補性決定區域1(HCDR1)、重鏈之互補性決定區域2(HCDR2)及重鏈之互補性決定區域3(HCDR3)之各自的胺基酸序列，係包含

LCDR1：RASQDISSYLN(序列表之序列編號30)

LCDR2：YTSRLHS(序列表之序列編號31)

LCDR3：QQLNTLP(序列表之序列編號32)

HCDR1：DAWMD(序列表之序列編號33)

HCDR2：EIRSKANNHATYYAESVKG(序列表之序列編號34)及

HCDR3：RDGAY(序列表之序列編號35)；或包含

LCDR1：RSSQSLVHSNGNTYLH(序列表之序列編號 36)

LCDR2：KVSNRFS(序列表之序列編號37)

LCDR3：SQSTHVP(序列表之序列編號38)

HCDR1：TSYYWN(序列表之序列編號39)

HCDR2：YISYDGTNNYNPSLKN(序列表之序列編號40)及

HCDR3：SFG，且各CDR序列中，1或數個胺基酸亦可經取代、缺失、及/或附加。

[18]如[17]之抗RGMa抗體或其抗原結合片段，其中重鏈可變區域(VH)係包含 VH： (序列表之序列編號41)或與該胺基酸序列具有至少 90%之同一性的胺基酸序列，且輕鏈可變區域(VL)係包含 VL： (序列表之序列編號42)或與該胺基酸序列具有至少90%之同一性的胺基酸序列。

[19]如[17]或[18]之抗RGMa抗體或其抗原結合片段，其中抗RGMa抗體為人類化抗體。

[20]如[17]至[19]中任一項之抗RGMa抗體或其抗原結合片段，其中抗RGMa抗體具有人類IgG之恆定區域。

[21]一種RGMa結合蛋白質，其中與RGMa之結合係與如[17]或[18]之抗RGMa抗體競爭。

[22]一種核酸分子，其係編碼如[17]至[20]中任一項之抗RGMa抗體或其抗原結合片段的蛋白質部分。

[23]如[22]之核酸分子，其中編碼VH及VL之胺基酸序列的核酸序列，為包含 VH： (序列表之序列編號43)、及 VL： (序列表之序列編號44)之核酸序列。

[24]一種重組載體，其係包含如[22]或[23]之核酸分子。

[25]一種宿主細胞，其係包含如[24]之重組載體。

[26]一種方法，其係如[17]至[20]中任一項之抗RGMa抗體或其抗原結合片段之製造方法，其包含培養如[25]之宿主細胞之步驟。

[27]一種醫藥組成物，其係包含如[17]至[20]中任一項之抗RGMa抗體或其抗原結合片段。

[28]如[27]之醫藥組成物，其係神經學疾病或免疫學疾病之預防、治療或復發預防用。

[29]如[28]之醫藥組成物，其中神經學疾病，係由包含肌萎縮性側索硬化症、上臂神經叢損傷、腦損傷(包含外傷性腦損傷)、腦性麻痺、格林-巴利症候群、大腦白質萎縮症、多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)、視神經脊髓炎、小兒麻痺後症候群、脊柱裂、脊髓損傷、脊髓性肌肉萎縮症、脊椎腫瘤、橫貫性脊髓炎、失智症(包含老年性失智症、輕度認知功能障礙、阿茲海默症、阿茲海默相關失智症)、杭丁頓氏舞蹈症、遲發性運動障礙、躁症、巴金森氏症、史蒂爾-理查症候群、唐氏症、重症肌無力症、神經外傷(包含視神經外傷)、血管類澱粉症、類澱粉症所伴隨之大腦出血、腦梗塞、腦炎、急性混亂障礙、青光眼、思覺失調症及視網膜神經纖維層病變(包含藉由糖尿病性視網膜病、缺血性視神經病變、X染色體連結性視網膜分裂症、藥物誘發性視神經病變、視網膜營養性萎縮、老年性黃斑部病變、視神經乳頭玻璃疣而賦予特徵之眼病；藉由光受器病變之遺傳性決定因子而賦予特徵之眼病、體染色體隱性錐狀細胞-桿狀細胞失養症、視神經病變所伴隨之粒線體受損)之群中選擇。

[30]如[28]之醫藥組成物，其中免疫學疾病，係由包含多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)、視神經脊髓炎、乾癬、關節炎(包含風濕性關節炎、變形性關節病、乾癬性關節炎)、格林-巴利症候群、神經貝賽特氏症、惡性貧血、I型(胰島素依賴型)糖尿病、全身紅斑性狼瘡(SLE)、發炎性腸疾病(IBD)、休格倫氏症候群、古巴士德氏症候群、葛瑞夫茲氏症、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性血小板減少性紫斑病、氣喘、花粉症、異位性皮膚炎、絲球體腎炎、重症肌無力症、橋本氏病、及肉狀瘤病之群中選擇。

[31]如[28]之醫藥組成物，其中神經學疾病或免疫學疾病，係由包含脊髓損傷、神經外傷(包含視神經外傷)及多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)之群中選擇。

[32]一種神經學疾病或免疫學疾病之預防、治療或復發預防方法，其係包含將如[1]至[7]中任一項之RGMa結合蛋白質，投與有效量至以其為必要的對象之步驟。

[33]一種神經學疾病或免疫學疾病之預防、治療或復發預防方法，其係包含將如[17]至[20]中任一項之抗 RGMa抗體或其抗原結合片段，投與有效量至以其為必要的對象之步驟。

本發明之RGMa結合蛋白質，藉由不阻礙RGMa與Neogenin之相互作用，可維持與RGMa結合之Neogenin所具有的對神經細胞等之Apoptosis的阻礙等之作用，因此神經細胞之保護效果強，神經細胞減少所伴隨之副作用的顧慮少。又，本發明之人類化抗RGMa抗體，相較於以往的抗體而言，與人類RGMa之結合性及熱安定性等的特性優良。因此，可使用作為藥效優良、副作用少之對神經學疾病或免疫學疾病之醫藥。

[圖1]顯示使用RGMa多株抗體(AF2459)、比較例抗體(r5F9)、及本發明之抗體(r70E4、116A3)之RGMa-Neogenin結合阻礙試驗的結果之圖。

[圖2]顯示使用控制組小鼠IgG、及本發明之抗體(B5.70E4、B5.116A3)之RGMa-BMP2結合阻礙試驗的結果之圖。

[圖3]顯示使用比較例抗體(rH5F9)、本發明之嵌合體抗體(r116A3C)及本發明之人類化抗體(HE/KA、HA/KC)之抗體之熱安定性試驗的結果之圖。

[圖4]顯示使用本發明之抗體(B5.70E4(左)、B5.116A3(右))之神經突成長試驗的結果之圖。

[圖5]顯示使用控制組小鼠IgG(mo-IgG2bk)、及本發明之抗體(r70E4、r116A3)之使用脊髓損傷模式大鼠之效力試驗的結果之圖。其顯示於(A)脊髓壓碎模式、(B)脊髓半側切斷模式之效力試驗的結果。

[圖6]顯示使用以PLP_139-151胜肽所誘發之多發性硬化症模式小鼠的本發明之抗體(B5.116A3)之效力試驗的結果之圖。左側表示EAE分數、右側表示體重之變化，上段表示7日及10日後投與被驗抗體的情況、下段表示18日及21日後投與被驗抗體的情況之結果。

為了容易理解本發明，故以下說明本發明所用之用語。

[RGMa]

RGMa為中樞神經系統中之神經突成長阻礙蛋白質，人類RGMa蛋白質，係如序列表之序列編號1所示般，係作為由450個胺基酸所成之前驅蛋白質而被生合成。存在於N末端之訊息胜肽Met1~Pro47(係指由N末端側起第1號之甲硫胺酸殘基至47號之脯胺酸殘基為止之胜肽，以後係同樣之記載)被去除，Asp168與Pro169之間的胜肽鍵被切斷，且C末端胜肽Arg423~Cys450被去除，而且於作為C末端Gly422之C末端羧基上附加GPI錨定。人類RGMa蛋白質，係作為N末側結構域(Cys48~Asp168)與C末側結構域(Pro169~Ala424)係被雙硫鍵連結的成熟蛋白質，而透過GPI錨定於細胞膜上表現。小鼠之RGMa的前驅蛋白質係由序列表之序列編號2所示之胺基酸序列、大鼠之RGMa的前驅蛋白質係由序列表之序列編號3所示之胺基酸序列所成，但因C末端胜肽被去除，故作為成熟蛋白質而言係成為相同之胺基酸序列。本發明中，RGMa只要係結合於後述之Neogenin而進行作用者，則可指前驅蛋白質、成熟蛋白質或其活性型片段之任一者、亦可為該等之衍生物或突變體。又，可為人類RGMa亦可為來自其他生物之RGMa，但較佳為人類RGMa。

[Neogenin]

Neogenin係於中樞神經之神經細胞等表現，作為RGMa之受體之一而發揮功能。人類Neogenin蛋白質係如序列表之序列編號10所示般，由1461個胺基酸所成，去除訊息胜肽Met1~Ala33而作為成熟的膜蛋白質表現。本發明中，Neogenin只要係結合於RGMa者，則可指前驅蛋白質、成熟蛋白質或其RGMa結合片段之任一者、亦可為該等之衍生物或突變體。又，可為人類Neogenin亦可為來自其他生物之Neogenin，但較佳為人類Neogenin。

[中和]

本案中，「中和」係指可與目標之標的結合，且阻礙該標的之任一功能的作用。亦即，「中和RGMa之神經突成長阻礙活性」，係指藉由RGMa結合蛋白質結合於RGMa，來阻礙RGMa之神經突成長阻礙活性。神經突成長阻礙活性，可藉由本領域中已知之數個in vitro或in vivo分析之1者或其以上來評估，例如，可藉由本案說明書記載之神經突成長阻礙試驗來評估。

[經單離]

經單離之RGMa結合蛋白質等之「經單離」，意指經鑑定、且經分離、及/或由自然狀態之成分回收的意義。自然狀態之雜質，為可妨礙該抗體之診斷或治療上的使用之物質，可列舉酵素、激素及其他之蛋白質性或非蛋白質性之溶質。一般而言，欲將RGMa結合蛋白質等單離，只要藉由至少1個純化步驟來純化即可，藉由至少1個純化步驟而純化之RGMa結合蛋白質，可稱為「經單離之RGMa結合蛋白質」。

[RGMa結合蛋白質]

本案中，「RGMa結合蛋白質」係指包含結合於RGMa之蛋白質的分子。RGMa結合蛋白質，可列舉抗RGMa抗體及其抗原結合片段、以及RGMa結合支架蛋白質(scaffold protein)、以及Neogenin之細胞外結構域等的可溶性RGMa受體蛋白質、以及此等之融合蛋白質。RGMa結合支架蛋白質，係指藉由對絲胺酸蛋白酶阻礙劑之Kunitz結構域或人類之纖維黏附蛋白(fibronectin)之細胞外結構域、錨蛋白、脂質載運蛋白(lipocalin)等導人變異，而實現與RGMa之結合功能的蛋白質。融合蛋白質，係指對RGMa結合蛋白質予以化學地或基因工程地結合了聚乙二醇(PEG)等之非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、白蛋白、酵素、其他抗體等之本案之RGMa結合蛋白質以外的功能分子而得之RGMa結合蛋白質。

[人類抗體]

人類抗體，係指輕鏈、重鏈均為來自人類免疫球蛋白之抗體。人類抗體，依重鏈恆定區域之不同，而包含具有γ鏈之重鏈的IgG(包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、具有μ鏈之重鏈的IgM、具有α鏈之重鏈的IgA(包含IgA1、IgA2)、具有δ鏈之重鏈的IgD、或具有ε鏈之重鏈的IgE。又，原則上，輕鏈係包含κ鏈與λ鏈之任一者。

[人類化抗體]

人類化抗體，係指由：由來自非人類動物之抗體之互補性決定區域、與來自人類抗體之框架(framework)區域所構成的可變區域、及來自人類抗體之恆定區域所構成的抗體。

[嵌合體抗體]

嵌合體抗體，係指輕鏈、重鏈、或其兩者，係由來自非人類之可變區域、與來自人類之恆定區域所構成之抗體。

[抗RGMa抗體]

本案中，抗RGMa抗體係指結合於RGMa之免疫球蛋白分子或其改變分子。改變分子為包含多特異性抗體、嵌合體抗體、人類化抗體、功能改變抗體、及連結抗體(conjugated antibody)者。

[多特異性抗體]

多特異性抗體，係指具備具有2個以上之不同的抗原特異性之2個以上之獨立的抗原認識部位之非對稱抗體，可列舉具有2個抗原特異性之雙特異性抗體、具有3個抗原特異性之三特異性抗體等。

[功能改變抗體]

本案中，功能改變抗體，係指藉由主要改變抗體之Fc區域之胺基酸或糖鏈，而改變抗體所具有之抗原結合功能以外的功能，例如改變了細胞殺傷功能、補體活性化功能或血中半衰期延長功能之抗體。

[連結抗體]

本案中，連結抗體，係指對抗體予以化學地或基因工程地結合了聚乙二醇(PEG)等之非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、白蛋白、酵素等之抗體以外的功能分子而得之抗體。

[抗原結合片段]

本案中，抗原結合片段，係指包含抗體之一部分的蛋白質，且可結合於抗原者。抗原結合片段之例子，可列舉F(ab')₂、Fab'、Fab、Fv(variable fragment of antibody)、雙硫鍵Fv、單鏈抗體(scFv)、及此等之聚合物等。進一步地，抗原結合片段，係包含化學地或基因工程地結合了聚乙二醇(PEG)等之非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、白蛋白、酵素、其他抗體等之本案之抗RGMa抗體以外的功能分子而得之連結抗原結合片段(conjugated antigen binding fragment)者。

[互補性決定區域]

互補性決定區域(CDR)，係指免疫球蛋白分子之可變區域當中，形成抗原結合部位之區域，亦稱為超可變區域，係指每個免疫球蛋白分子胺基酸序列之變化特別大的部分。CDR中，輕鏈及重鏈係各有3個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、及HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本案中，免疫球蛋白分子之CDR係遵照Kabat之編號系統(Kabat等、1987、Sequences of Proteins of Immunological Interest、US Department of Health and Human Services、NIH、USA)來決定。

[胺基酸序列之百分率(%)同一性]

此處，可變區域等之關於經鑑定之參照聚胜肽序列的「百分率(%)同一性」，係將序列予以排比(align)，為了得到最大之%同一性，依需要導入間隙，任何的保存性取代(conservative substitution)均設定成不考慮為序列同一性之一部分之後，作為與特定之參照聚胜肽序列的胺基酸殘基相同之候補序列中的胺基酸殘基之百分率來進行定義。以測定%同一性為目的之排比(alignment)，可藉由使用所屬技術領域中具有通常知識者之技術範圍內的各種方法，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、或Megalign(DNASTAR)軟體般可為公眾獲得之電腦軟體來達成。所屬技術領域中具有通常知識者，為了對所比較之序列的全長達成最大之排比，可決定包含必要之任意演算法的用以排比序列之適切的參數。但是，為了達成此處之目的，%同一性值，可於一對一序列排比(pairwise alignment)中，藉由使用序列比較電腦程式BLAST而得到。

於胺基酸序列比較中使用BLAST的狀況中，所給定的胺基酸序列A之與給定之胺基酸序列B的%同一性，係如下述般計算：分率X/Y之100倍

此處，X為依序列排比程式BLAST之A及B的程式排比，符合為相同之分數的胺基酸殘基之數目，Y為B之全部胺基酸殘基數目。胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度相異時，A對B之%同一性，應可理解為與B對A之%同一性不同。若無特別指明，此處之全部的%同一性值，係如前一段所示般使用BLAST電腦程式而得到。

[競爭]

本案中，與本發明之抗RGMa抗體「競爭」，係指藉由本說明書記載之表面電漿共振(SPR)法來測定時，藉由該抗RGMa抗體或其抗原結合片段的存在，具備顯著差地使本發明之抗RGMa抗體與RGMa之結合降低。

以下，詳細說明本發明。

<RGMa結合蛋白質>

本發明之RGMa結合蛋白質，為不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性的經單離之RGMa結合蛋白質。

作為RGMa蛋白質，較佳為來自哺乳類之 RGMa蛋白質，例如，作為人類之RGMa蛋白質，可列舉具有序列表之序列編號1之胺基酸序列的蛋白質，作為小鼠之RGMa蛋白質，可列舉具有序列表之序列編號2之胺基酸序列的蛋白質，作為大鼠之RGMa蛋白質，可列舉具有序列表之序列編號3之胺基酸序列的蛋白質。又，亦可為含有此等之序列中，包含1或數個(較佳為1~20個、更佳為1~10個、又更佳為1~5個)之胺基酸經取代、缺失、插入、及/或附加的胺基酸序列而成，且具有與RGMa蛋白質實質相同之活性，對聚胜肽或前述胺基酸序列具有90%以上(較佳為95%以上)之同一性的胺基酸序列之聚胜肽。

此處，「具有與RGMa蛋白質實質相同之活性」，只要該聚胜肽為具有神經突成長阻礙作用者，則任意者均包含其中。

上述胺基酸之取代較佳為保存性取代。此處「保存性取代」意指以實質上不改變胜肽活性的方式，將胺基酸殘基以其他化學上類似之胺基酸殘基取代。例如，可列舉將某個疏水性殘基以其他疏水性殘基取代的情況、將某個極性殘基以具有相同電荷之其他極性殘基取代的情況等。作為可進行如此取代之功能上類似的胺基酸之例子，就非極性(疏水性)胺基酸而言，可列舉丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸等。就極性(中性)胺基酸而言，可列舉甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺、天門冬醯胺、半胱胺酸等。就具備正電荷(鹼性)之胺基酸而言，可列舉精胺酸、組胺酸、離胺酸等。又，就具備負電荷(酸性)之胺基酸而言，可列舉天門冬胺酸、麩胺酸等。

本發明之RGMa結合蛋白質結合於RGMa，意指RGMa特異性的結合，更佳為對人類RGMa之解離常數(Kd)低者，上限值例如為10^-8M以下、更佳為10^-9M以下、又更佳為10^-10M以下；下限值並無特殊限定，例如可列舉10^-14M以上、更佳為10^-13以上之RGMa結合蛋白質。

RGMa蛋白質，作為成熟蛋白質而言，係由N末側結構域與C末側結構域所成，但僅以C末側結構域單獨亦具有神經突成長阻礙活性。本發明之RGMa結合蛋白質，較佳為亦僅結合於RGMa之C末側結構域而中和神經突成長阻礙活性。更佳為對人類RGMa之C末側結構域的解離常數(Kd)低者，上限值例如為10^-8M以下、更佳為10^-9M以下、又更佳為10^-10M以下；下限值並無特殊限定，例如可列舉10^-14M以上、更佳為10^-13以上之RGMa結合蛋白質。

本發明之RGMa結合蛋白質，不阻礙RGMa與Neogenin之結合。此處，「不阻礙RGMa與Neogenin之結合」，意指於後述實施例所示之RGMa與Neogenin之結合系統中，即使增加RGMa結合蛋白質之濃度，RGMa與Neogenin之結合實質上亦不減少。例如，於RGMa與Neogenin之結合系統中添加RGMa結合蛋白質，且增加其濃度的情況時，表示IC50之RGMa結合蛋白質濃度若為10μg/mL以上、更佳為50μg/mL以上、最佳為100μg/mL以上，則可說該RGMa結合蛋白質不會阻礙RGMa與Neogenin之結合。

於與RGMa之結合試驗中使用的Neogenin，較佳為與RGMa同種之Neogenin。亦即，對於小鼠之RGMa較佳為使用小鼠之Neogenin、對於人類之RGMa較佳為使用人類之Neogenin。人類Neogenin之一例，可例示具有序列表之序列編號10之胺基酸序列的蛋白質，但只要可與RGMa結合者，亦可為具有與序列表之序列編號10具有90%以上(較佳為95%以上)之同一性的胺基酸序列者。

本發明之RGMa結合蛋白質，會中和RGMa之神經突成長阻礙活性。神經突成長阻礙活性，可藉由後述實施例所示之神經突成長試驗來評估。添加RGMa時，會抑制神經突之成長，藉由於其中添加RGMa結合蛋白質，使RGMa所致之神經突成長抑制變得不發生。本發明之RGMa結合蛋白質，可中和RGMa添加所致之神經突成長抑制50%以上、更佳為80%以上、最佳為90%以上。

RGMa蛋白質之胺基酸序列係依動物種類而異，因此於序列表之序列編號1表示之人類RGMa與序列表之序列編號2表示之小鼠RGMa、序列表之序列編號3表示之大鼠RGMa，胺基酸序列亦有不同。一般而言，於抗體醫藥等之蛋白質製劑之藥理試驗或安全性試驗中，係使用小鼠或大鼠等之囓齒類作為實驗材料，因此本發明之RGMa結合蛋白質，較佳為結合於小鼠或大鼠之RGMa，更佳為對小鼠或大鼠之RGMa的Kd為低者。Kd之上限值例如為5X10^-7M以下、更佳為10^-8M以下、又更佳為10^-9M以下，下限值並無特殊限定，例如可列舉10^-12M以上、更佳為10^-11以上之RGMa結合蛋白質。

本發明之RGMa結合蛋白質較佳為熱安定性優良。熱安定性可藉由加熱處理所致之與RGMa結合的降低來評估，較佳為經60℃以上之熱處理亦為安定、更佳為經65℃以上之熱處理亦為安定、最佳為經70℃以上之熱處理亦為安定。

本發明之RGMa結合蛋白質結合於RGMa時的結合部位並無特殊限定，例如，為人類RGMa時，較佳為結合於EEVVNAVEDWDSQG(序列表之序列編號26)(序列表之序列編號1之胺基酸編號298-311)、NQQIDFQAFHTNAE(序列表之序列編號27)(序列表之序列編號1之胺基酸編號322-335)、PTAPETFPYET(序列表之序列編號28)(序列表之序列編號1之胺基酸編號349-359)、KLPVEDLYYQA(序列表之序列編號29)(序列表之序列編號1之胺基酸編號367-377)之1者以上之胜肽。更佳為結合於序列表之序列編號26與27、又更佳為結合於序列表之序列編號26與27、且結合於序列表之序列編號28或29。

RGMa結合蛋白質，具體而言可列舉抗RGMa 抗體、RGMa結合支架蛋白質、及此等之融合蛋白質。

<抗RGMa抗體>

本發明之抗RGMa抗體，係包含以RGMa蛋白質或其部分片段(例如包含上述序列表之序列編號26~29之一者以上的片段)為抗原，且將該抗原對小鼠等之哺乳動物誘發免疫所得到之多株抗體或單株抗體、使用基因重組技術所製造之嵌合體抗體及人類化抗體、以及使用人類抗體產生基因轉殖動物等所製造之人類抗體等。將本發明之抗體作為醫藥對人類投與時，由副作用之觀點，期望為人類化抗體或人類抗體。

抗原可直接使用於誘發免疫、亦可作為與攜載蛋白質(carrier protein)之複合體來使用。抗原與攜載蛋白質之複合體的配製，可使用戊二醛、碳二醯亞胺、馬來醯亞胺活性酯等之縮合劑。攜載蛋白質可例示牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、血氰蛋白、KLH等。

被誘發免疫之哺乳動物，可列舉小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔子、貓、狗、豬、山羊、馬或牛，接種方法可列舉皮下、肌肉或腹腔內之投與。投與時可與完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑混合來投與，投與係通常每2~5週各1次來進行。由被誘發免疫之動物的脾臟或淋巴結中得到之抗體產生細胞係與骨髓瘤細胞進行細胞融合，作為融合瘤被單離。骨髓瘤細胞係使用來自哺乳動物，例如來自小鼠、大鼠、人類等者。

<多株抗體>

多株抗體可藉由既存之一般的製造方法取得。亦即，例如，將如前述之抗原，依需要與弗氏佐劑(Freund's Adjuvant)一起，對如上述之哺乳動物誘發免疫，藉此可由自該免疫致敏動物得到之血清中取得。

<單株抗體>

單株抗體，具體而言係可如下述般取得。亦即，以如前述之抗原為免疫原，將該免疫原依需要與弗氏佐劑(Freund's Adjuvant)一起，對如上述之哺乳動物的皮下、肌肉內、靜脈內、足墊內或腹胺內注射1~數次或移植，藉以實施免疫致敏。通常，自初次免疫起約每1~14日進行1~4次免疫，自最終免疫起約1~5日後由經免疫致敏之該哺乳動物中取得抗體產生細胞。

單株抗體可使用所屬技術領域中具有通常知識者周知之方法而得到(例如、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987))、Antibodies：A Laboratory Manual,Ed.Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。

分泌單株抗體之「融合瘤」之配製，可遵照Koehler及Milstein等之方法(自然(Nature),256,495,1975)及根據其之修飾方法來進行。亦即，藉由使由經免疫致敏之哺乳動物中取得的脾臟等中含有的抗體產生細胞，與來自哺乳動物，較佳為小鼠、大鼠或人類之無自我抗體產生能力的骨髓瘤細胞進行細胞融合而配製。

細胞融合所用之骨髓瘤細胞，例如可使用來自小鼠之骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/O、Sp2)、PAI、F0或BW5147、來自大鼠之骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.、來自人類之骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11或CEM-T15等。

融合促進劑可列舉聚乙二醇等，通常可藉由使用20~50%左右之濃度的聚乙二醇(平均分子量1000~4000)，於20~40℃、較佳為30~37℃之溫度下，使抗體產生細胞數與骨髓瘤細胞數之比通常為1：1~10：1左右，反應約1~10分鐘左右，來實施細胞融合。

產生單株抗體之融合瘤殖株的篩選，可藉由將融合瘤於例如微量滴定盤中培養，以ELISA等之免疫化學方法測定孔之培養上清液對免疫抗原之反應性來進行。

抗體產生融合瘤之篩選時，除了與RGMa蛋白質之結合分析以外，亦進行該抗體是否不阻礙RGMa蛋白質與Neogenin之結合的評估、與該抗體是否中和RGMa蛋白質之功能(神經突成長阻礙活性)的評估。藉由此等篩選方法，可選擇本發明之抗RGMa抗體。

由含有產生目標抗體之融合瘤的孔中，可進一步藉由極限稀釋法進行選殖，得到殖株。融合瘤之篩選、育種，通常係以添加HAT(次黃嘌呤、胺喋呤、胸苷)，含有10~20%胎牛血清之動物細胞用培養基來進行。

由融合瘤製造單株抗體，可藉由將融合瘤於體外培養；或於小鼠、大鼠等之哺乳動物之腹水中等進行體內增殖，且自所得之培養上清液、或哺乳動物之腹水中單離來進行。

於體外培養時，可配合所培養之細胞種類的特性及培養方法等之各種條件，將融合瘤增殖、維持及保存，並使用適合於在培養上清液中產生單株抗體的營養培養基。

基本培養基可列舉例如Ham’F12培養基、MCDB153培養基或低鈣MEM培養基等之低鈣培養基及MCDB104培養基、MEM培養基、D-MEM培養基、RPMI1640培養基、ASF104培養基或RD培養基等之高鈣培養基等，該基本培養基，可依目的，含有例如血清、激素、細胞激素及/或各種無機或有機物質等。

單株抗體之單離、純化，可藉由將上述培養上清液或腹水，進行飽和硫酸銨、真球蛋白沈澱法、己酸法、辛酸法、離子交換層析(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白管柱或蛋白質A管柱等之親和性管柱層析等來進行。具體而言，單株抗體之純化，只要使用已知作為免疫球蛋白之純化法的方法即可，例如，可藉由硫酸銨分部法 (ammonium sulfate fractionation)、PEG分部法、乙醇分部法、陰離子交換體之利用、進而使用RGMa蛋白質之親和性層析等之手段而容易地達成。

單株抗體亦可藉由噬菌體展現法來取得。噬菌體展現法中，係使用目標的免疫原，將由任意噬菌體抗體基因庫中選出的噬菌體來進行篩選，來選擇對免疫原具有所期望之結合性的噬菌體。接著，對噬菌體內所含之抗體對應序列予以單離或決定序列，基於經單離之序列或經決定之序列資訊，來構築包含編碼抗體或抗原結合結構域之核酸分子的表現載體。然後藉由培養轉染有該表現載體之細胞株，可產生單株抗體。作為噬菌體抗體基因庫，藉由使用人類抗體基因庫，可生成具有所期望之結合性的人類抗體。

作為支架蛋白質，係利用人類之絲胺酸蛋白酶阻礙劑之Kunitz結構域或人類之纖維黏附蛋白之細胞外結構域等，若改變支架上之標的結合部位的序列，則可生成結合於RGMa之支架蛋白質(Clifford Mintz et.al BioProcess International,2013,Vol.11(2),pp40-48)。

作為融合蛋白質，可列舉對RGMa結合蛋白質予以化學或基因工程地結合有聚乙二醇(PEG)等之非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、白蛋白、酵素、其他抗體等之本案之RGMa結合蛋白質以外的功能分子之RGMa結合蛋白質。

結合PEG作為功能分子時，PEG係非限定地可使用分子量2000至100000Da、更佳為10000至50000Da者，可為直鏈型、亦可為分支型者。PEG，例如藉由使用NHS活性基，可結合於RGMa結合蛋白質之胺基酸的N末端胺基等。

使用放射性物質作為功能分子時，可使用¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、⁶⁴Cu、⁹⁹Tc、⁷⁷Lu或²¹¹At等。放射性物質，可藉由氯胺T法等而直接結合於RGMa結合蛋白質。

使用毒素作為功能分子時，可使用細菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如菌麻毒素)、低分子毒素(例如geldanamycin)、美坦素(maytansinoid)、及卡奇黴素(calicheamicin)等。

使用低分子化合物作為功能分子時，可列舉道諾黴素(daunomycin)、阿黴素(doxorubicin)、胺甲葉酸(methotrexate)、絲裂黴素、新抑癌素(neocarzinostatin)、長春地辛(vindesine)及FITC等之螢光色素等。

使用酵素作為功能分子時，可使用螢光酵素(例如螢火蟲螢光酵素及細菌螢光酵素；美國專利第4737456號)、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化酶(例如辣根過氧化酶(HRPO))、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、醣類氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環式氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶等)、乳過氧化酶、微過氧化酶等。

將毒素、低分子化合物或酵素予以化學性結合時所使用的連結子(linker)，可列舉二價自由基(例如伸烷基、伸芳基、伸雜芳基)、以-(CR₂)nO(CR₂)n-(R為任意取代基、n為正整數)表示之連結子或烷氧基之重複單位(例如聚伸乙基氧、PEG、聚亞甲基氧等)及烷基胺基(例如聚伸乙基胺基、JeffamineTM)、以及二酸酯及醯胺(可列舉琥珀酸酯、琥珀二醯胺、氧代戊二酸酯、丙二酸酯及己醯胺等)。使功能分子結合之化學的修飾方法於本領域中係已確立(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal antibodies.,1998 T.J.International Ltd,Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.,1998 Marcel Dekker Inc；Chari et al.,Cancer Res.,1992 Vol152：127；Liu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,1996 Vol 93：8681)。

本發明之RGMa結合蛋白質的較佳態樣可列舉嵌合體抗體。「嵌合體抗體」，可例示可變區域為來自非人類動物(小鼠、大鼠、倉鼠、雞等)之免疫球蛋白的可變區域，且恆定區域為來自人類免疫球蛋白之恆定區域的嵌合體抗體。例如，可使抗原對小鼠誘發免疫，由該小鼠單株抗體之基因切出與抗原結合之可變區域，與來自人類骨髓之抗體恆定區域結合而製作。來自人類免疫球蛋白之恆定區域，係依IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD及IgE等之同型而各具有固有之胺基酸序列，本發明中之重組嵌合體抗體之恆定區域係可為屬任意之同型的人類免疫球蛋白之恆定區域。較佳為人類IgG之恆定區域。可使用如此方式所製作之嵌合體抗體之基因來製作表現載體。藉由以該表現載體對宿主細胞轉形(transform)而得到產生嵌合體抗體之轉形細胞，藉由培養該轉形細胞，由培養上清液中得到目標之嵌合體化抗體。

本發明之RGMa結合蛋白質之其他較佳態樣，可列舉人類化抗體。本發明中之「人類化抗體」，為僅將小鼠等之非人類動物抗體之抗原結合部位(CDR；互補性決定區域)的DNA序列移植至人類抗體基因(CDR移植)的抗體。例如，可參照日本特表平4-506458號公報及日本專利2912618號說明書等記載之方法來製作。具體而言，意指一種人類化抗體，其特徵為，其CDR之一部分或全部為來自非人類哺乳動物(小鼠、大鼠、倉鼠等)之單株抗體的CDR，其可變區域之框架區域為來自人類免疫球蛋白的可變區域之框架區域，且其恆定區域為來自人類免疫球蛋白之恆定區域。

本發明中之人類化抗體，例如可由以下方式製造。但是，當然不限定於如此的製造方法。

例如，來自小鼠單株抗體之重組人類化抗體，可參照日本特表平4-506458號公報及日本特開昭62-296890號公報等，予以基因工程性地製作。亦即，由產生小鼠單株抗體之融合瘤中，單離小鼠重鏈CDR部分之 DNA與小鼠輕鏈CDR部分之DNA，且由人類免疫球蛋白基因中單離人類重鏈CDR以外之全部區域的人類重鏈基因、與人類輕鏈CDR以外之全部區域的人類輕鏈基因。

將經移植單離之小鼠重鏈CDR部分的DNA後的人類重鏈基因，導入於適當的表現載體，使其能夠表現，同樣地，將經移植小鼠輕鏈CDR部分之DNA後的人類輕鏈基因，導入於適當的另一表現載體，使其能夠表現。或者，亦可將移植小鼠CDR後的人類之重鏈及輕鏈基因導入於同一表現載體，使其能夠表現。藉由以如此方式製作之表現載體對宿主細胞轉形，得到人類化抗體產生轉形細胞，藉由培養該轉形細胞，由培養上清液中得到目標之人類化抗體。

本發明之RGMa結合蛋白質之其他較佳態樣，可列舉人類抗體。人類抗體係指包含構成免疫球蛋白之重鏈可變區域及重鏈恆定區域以及輕鏈可變區域及輕鏈恆定區域的全部區域均為來自編碼人類免疫球蛋白之基因的免疫球蛋白之抗體，可將人類抗體基因導入於小鼠來製作。具體而言，例如，藉由至少將人類免疫球蛋白基因接入於小鼠等之人類以外之哺乳動物的基因座中，並將所製作之基因轉殖動物以抗原免疫致敏，藉此可與前述之多株抗體或單株抗體之製作法同樣地進行製造。

例如，產生人類抗體之基因轉殖小鼠，可遵照Nature Genetics,Vol.7,p.13-21,1994；Nature Genetics,Vol.15,p.146-156,1997；日本特表平4-504365 號公報；日本特表平7-509137號公報；國際公開WO94/25585號小冊；Nature,Vol.368,p.856-859,1994；及日本特表平6-500233號公報等記載之方法來製作。更具體而言，可列舉HuMab(註冊商標)小鼠(Medarex,Princeton NJ)、KMTM小鼠(Kirin Pharma Company,Japan)、KM(FCγRIIb-KO)小鼠等。

本發明之單株抗體，具體而言，可列舉重鏈可變區域之CDR包含序列表之序列編號33(HCDR1)、34(HCDR2)及35(HCDR3)之胺基酸序列、輕鏈可變區域之CDR包含序列表之序列編號30(LCDR1)、31(LCDR2)及32(LCDR3)之胺基酸序列者。

再者，只要會維持具有與RGMa之結合能力，不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性的本發明之抗體的特性，於此等CDR之1者以上，1~數個之胺基酸亦可被取代。此處，1~數個係指例如1個或2個。再者，為了維持本發明之特性，該胺基酸取代較佳為保存性取代。維持抗體之特性，係指此等特性相較於CDR之胺基酸序列改變前，為相同程度，例如維持為80%以上、較佳為維持為90%以上、更佳為維持為95%以上。再者，維持亦包含提高。

CDR以外之區域，只要係維持作為抗體之構造，可發揮功能之序列，則無特殊限制，可為來自小鼠之序列、來自人類之序列、來自其他哺乳動物之序列、該等之嵌合體序列、人工序列的任意者。包含恆定區域的情況時，重鏈及輕鏈之恆定區域之胺基酸序列，可例示Nucleic Acids Research vol.14,p1779,1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257,p1516,1982及Cell vol.22,p197,1980所記載者。

具有此等之CDR的小鼠抗體，可例示輕鏈具有序列表之序列編號4之胺基酸序列、重鏈具有序列表之序列編號5之胺基酸序列的抗體。再者，此等之胺基酸序列中，只要會維持具有與RGMa之結合能力，不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性的特性，則亦可具有1或數個胺基酸(1~20個、1~10個或1~5個)的取代、缺失、附加或插入。如此之取代、缺失、附加亦可導入於CDR中，但較佳為導入於CDR以外之區域。又，為了維持本發明之特性，該胺基酸取代較佳為保存性取代。

又，上述小鼠抗體中，亦可例示恆定區域為來自人類之小鼠/人類嵌合體抗體。如此之小鼠/人類嵌合體抗體，可例示輕鏈具有序列表之序列編號8之胺基酸序列(可變區域為1~107)、重鏈具有序列表之序列編號9之胺基酸序列(可變區域為1~116)的抗體。再者，此等之胺基酸序列中，只要會維持具有與RGMa之結合能力，不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性的特性，則亦可具有1或數個胺基酸(1~20個、1~10個或1~5個)的取代、缺失、附加或插入。如此之取代、缺失、附加亦可導入於CDR中，但較佳為導入於CDR以外之區域。又，為了維持本發明之特性，該胺基酸取代較佳為保存性取代。

進一步地，亦可例示CDR以外為來自人類之人類化抗體。如此之人類化抗體，可例示重鏈具有序列表之序列編號11~18(可變區域為至N末端側116殘基為止)之任一者的胺基酸序列、輕鏈具有序列表之序列編號19~25(可變區域為至N末端側1~107殘基為止)之任一者的胺基酸序列之抗體。

再者，於人類化抗體之胺基酸序列(重鏈：序列表之序列編號11~18、輕鏈：序列表之序列編號19~25)中，只要會維持具有與RGMa之結合能力，不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性的特性，則亦可具有1或數個胺基酸(1~20個、1~10個或1~5個)的取代、缺失、附加或插入。如此之取代、缺失、附加亦可導入於CDR中，但較佳為導入於CDR以外之區域。又，為了維持本發明之特性，該胺基酸取代較佳為保存性取代。

重鏈胺基酸序列與輕鏈胺基酸序列可為此等之任意的組合，但特佳者為重鏈具有序列表之序列編號15之胺基酸序列、輕鏈具有序列表之序列編號19之胺基酸序列的抗體。序列表之序列編號15之胺基酸序列當中，相當於重鏈可變區域之胺基酸序列係如序列表之序列編號41所示，相當於輕鏈可變區域之胺基酸序列係如序列表之序列編號42所示。亦即，本發明之特佳之抗體，為重鏈可變區域具有序列表之序列編號41之胺基酸序列，且輕鏈可變區域具有序列表之序列編號42之胺基酸序列的抗體。

再者，此等之胺基酸序列中，只要會維持具有與RGMa之結合能力，不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性的特性，則亦可具有1或數個胺基酸(1~20個、1~10個或1~5個)的取代、缺失、附加或插入。如此之取代、缺失、附加亦可導入於CDR中，但較佳為導入於CDR以外之區域。又，為了維持本發明之特性，該胺基酸取代較佳為保存性取代。

如此之序列表之序列編號41及/或序列表之序列編號42之胺基酸序列中包含取代、缺失等的本發明之抗體之胺基酸序列，為重鏈可變區域具有與序列表之序列編號41之90%以上(更佳為95%、96%、97%、98%、99%以上)之同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區域具有與序列表之序列編號42之90%以上(更佳為95%、96%、97%、98%、99%以上)之同一性的胺基酸序列。

本發明之單株抗體的其他具體例，可列舉重鏈可變區域之CDR包含序列表之序列編號39(HCDR1)、40(HCDR2)及SFG(HCDR3)之胺基酸序列，且輕鏈可變區域之CDR包含序列表之序列編號36(LCDR1)、37(LCDR2)及38(LCDR3)之胺基酸序列者。再者，只要會維持具有與RGMa之結合能力，不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性之本發明之抗體的特性，於此等CDR之1者以上，1~數個之胺基酸亦可被取代。

此處，1~數個係指例如1個或2個。再者，為了維持本發明之特性，該胺基酸取代較佳為保存性取代。

CDR以外之區域，只要係維持作為抗體之構造，可發揮功能之序列，則無特殊限制，可為來自小鼠之序列、來自人類之序列、來自其他哺乳動物之序列、該等之嵌合體序列、人工序列的任意者。包含恆定區域的情況時，重鏈及輕鏈之恆定區域之胺基酸序列，可例示Nucleic Acids Research vol.14,p1779,1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257,p1516,1982及Cell vol.22,p197,1980記載者。

具有此等之CDR的小鼠抗體，可例示輕鏈具有序列表之序列編號6之胺基酸序列、重鏈具有序列表之序列編號7之胺基酸序列的抗體。再者，此等之胺基酸序列中，只要會維持具有與RGMa之結合能力，不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性的特性，則亦可具有1或數個胺基酸(1~20個、1~10個或1~5個)的取代、缺失、附加或插入。如此之取代、缺失、附加亦可導入於CDR中，但較佳為導入於CDR以外之區域。又，為了維持本發明之特性，該胺基酸取代較佳為保存性取代。

又，上述小鼠抗體中，亦可例示恆定區域為來自人類之嵌合體抗體。進一步地，亦可例示CDR以外為來自人類之人類化抗體。

本發明之抗RGMa抗體，係包含具有由特定之胺基酸序列所成之CDR(例如作為LCDR1之序列表之序列編號30、作為LCDR2之序列表之序列編號31、作為LCDR3之序列表之序列編號32、作為HCDR1之序列表之序列編號33、作為HCDR2之序列表之序列編號34、作為HCDR3之序列表之序列編號35之胺基酸序列)、或由特定之胺基酸序列所成之可變區域(例如作為重鏈可變區域之序列表之序列編號41、作為輕鏈可變區域之42之胺基酸序列)的多特異性抗體、功能改變抗體、連結抗體。

本發明之抗RGMa抗體，藉由使其本身與具有RGMa以外之別的抗原結合特異性之抗體以基因工程的手法結合，可製作雙特異性抗體等之多特異性抗體。該基因工程的手法，於本領域已被確立。例如，藉由改變將可變區域直列連結的DVD-Ig(Wu等、Nature Biotechnology 25(11),1290(2007))、或抗體之Fc區域，利用組合結合於不同抗原之2種抗體的重鏈之ART-Ig技術(Kitazawa等、Nature Medicine 18(10),1570(2012))，可取得所期望之雙特異性抗體。作為RGMa以外之其他抗原，可非限定地列舉Nogo、MAG、Omgp、CSPG、Sema3A、Lingo-1等之阻礙神經突成長之因子，或TNF-α、IL-6受體、CD3、CD20、α4整聯蛋白、BLys、Thymic Stromal Lymphopoietin、IgE、IL-1、IL-2，IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、IL-23、IL-25等之免疫相關分子。

本發明之抗RGMa抗體之改變分子，可列舉功能改變抗體。功能改變抗體，意指主要藉由改變Fc區域等，而改變細胞殺傷功能或補體活性化功能、血中半衰期延長功能等之功能的抗體(設樂研也、藥學雜誌、2009、Vol.129(1),p3；石井明子等、日本藥理學雜誌、2010、Vol.136(5),p280；橋口周平等、生化學、2010、Vol.82(8),p710)。

抗RGMa抗體之功能改變抗體，係由如以下之方法配製。例如，使用經破壞了α1,6-岩藻糖轉移酵素(FUT8)基因的CHO細胞作為宿主細胞來製造本案抗RGMa抗體時，可得到糖鏈之岩藻糖含量降低，細胞殺傷功能提高之抗體，以導入了FUT8基因之CHO細胞為宿主細胞來製造時，可得到細胞殺傷功能低之抗體(國際公開第2005/035586號、國際公開第2002/31140號、國際公開第00/61739號)。又，藉由改變Fc區域之胺基酸殘基，可調節補體活性化功能(美國專利第6737056號、美國專利第7297775號、美國專利第7317091號)。進一步地，藉由使用提高了對Fc受體之一的FcRn之結合的Fc區域突變體，可實現血中半衰期之延長(橋口周平等、生化學、2010、Vol.82(8),p710)。此等之功能改變抗體，能夠以基因工程來製造。

本發明之抗RGMa抗體之改變分子，可列舉連結抗體。連結抗體，可列舉對抗RGMa抗體予以化學地或基因工程地結合了聚乙二醇(PEG)等之非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、白蛋白、酵素、其他抗體等之本案抗RGMa抗體以外之功能分子而得的連結抗體。

結合PEG作為功能分子時，PEG可非限定地使用分子量2000至100000Da、更佳為10000至50000Da者，可為直鏈型、亦可為分支型者。PEG例如藉由使用NHS活性基，可結合於抗體之胺基酸的N末端胺基等。

使用放射性物質作為功能分子時，可使用¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、⁶⁴Cu、⁹⁹Tc、⁷⁷Lu或²¹¹At等。放射性物質，可藉由氯胺T法等而直接結合於抗體。

使用毒素作為功能分子時，可使用細菌毒素(例如白喉毒素)、植物毒素(例如蓖麻毒素)、低分子毒素(例如geldanamycin)、美坦素、及卡奇黴素等。

使用低分子化合物作為功能分子時，可列舉道諾黴素、阿黴素、胺甲葉酸、絲裂黴素、新抑癌素、長春地辛及FITC等之螢光色素等。

將毒素、低分子化合物或酵素予以化學性結合時所使用的連結子，可列舉二價自由基(例如伸烷基、伸芳基、伸雜芳基)、以-(CR₂)nO(CR₂)n-(R為任意取代基、n為正整數)表示之連結子或烷氧基之重複單位(例如聚伸乙基氧、PEG、聚亞甲基氧等)及烷基胺基(例如聚伸乙基胺基、JeffamineTM)、以及二酸酯及醯胺(可列舉琥珀酸酯、琥珀二醯胺、氧代戊二酸酯、丙二酸酯及己醯胺等)。使功能分子結合之化學的修飾方法於本領域中係已確立(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal antibodies.,1998 T.J.International Ltd,Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.,1998 Marcel Dekker Inc；Chari et al.,Cancer Res.,1992 Vol152：127；Liu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,1996 Vol 93：8681)。

本發明中之抗體的「抗原結合片段」，意指如前述之抗體的具有抗原結合性之一部分的區域，具體而言可列舉F(ab')₂、Fab'、Fab、Fv(variable fragment ofantibody)、雙硫鍵Fv、單鏈抗體(scFv)、及此等之聚合物等，進一步地，抗原結合片段，係包含化學地或基因工程地結合了聚乙二醇(PEG)等之非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、白蛋白、酵素、其他抗體等之本案之抗RGMa抗體以外的功能分子而得的連結抗原結合片段。

此處，「F(ab')₂」及「Fab」，意指藉由將免疫球蛋白以蛋白分解酵素胃蛋白酶或木瓜酶等進行處理而製造，於絞鏈區域中之2條重鏈間所存在之雙硫鍵前後被消化所生成的抗體片段。例如，將IgG以木瓜酶處理時，絞鏈區域中之2條重鏈間所存在的雙硫鍵之上游被切斷，可製造由VL(輕鏈可變區域)與CL(輕鏈恆定區域)所成之輕鏈、及由VH(重鏈可變區域)與CHγ1(重鏈恆定區域中之γ1區域)所成之重鏈片段於C末端區域以雙硫鍵鍵結的相同之2個抗體片段。此等2個相同之抗體片段各稱為Fab。又，將IgG以胃蛋白酶處理時，絞鏈區域中之2條重鏈間所存在之雙硫鍵之下游被切斷，可製造比前述2個Fab以絞鏈區域連結者稍大之抗體片段。該抗體片段稱為F(ab')₂。

本發明之抗RGMa抗體之抗原結合片段的改變分子，可列舉連結抗原結合片段。連結抗原結合片段，可列舉於抗RGMa抗體之具有抗原結合性的一部分區域上化學地或基因工程地結合了聚乙二醇(PEG)等之非胜肽性聚合物、放射性物質、毒素、低分子化合物、細胞激素、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophin等)、白蛋白、酵素、其他抗體等之本案之抗RGMa抗體以外的功能分子而得的連結抗原結合片段。

結合PEG作為功能分子時，PEG可非限定地使用分子量2000至100000Da、更佳為10000至50000Da 者，可為直鏈型、亦可為分支型者。PEG例如藉由使用NHS活性基，可結合於抗RGMa抗體之具有抗原結合性的一部分區域之N末端胺基等。

使用放射性物質作為功能分子時，可使用¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、⁶⁴Cu、⁹⁹Tc、⁷⁷Lu或²¹¹At等。放射性物質，可藉由氯胺T法等而直接結合於抗RGMa抗體之具有抗原結合性的一部分區域。

本發明之包含具有特定胺基酸序列之CDR或可變區域的抗RGMa抗體，由欲維持長的血中半衰期而言，該恆定區域較佳為人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)之恆定區域。

本發明中，亦包含於具有如上述特定的CDR之胺基酸序列的抗體、與RGMa蛋白質之結合上進行競爭之抗RGMa抗體、及其抗原結合片段。

作為於具有如上述特定的CDR之胺基酸序列的抗體與RGMa之結合上進行競爭的抗體，可例示作為抗原決定位為於選自Glu298~Gly311、Asn322~Glu335、Lys367~Ala377、及Pro349~Thr359之區域中具有抗原決定位的抗體。

該抗體藉由於具有如上述之CDR序列的抗體與 RGMa蛋白質之結合系統中共存，來進行取得(篩選)、或評估。例如，可藉由以如下之表面電漿共振(SPR)法進行篩選而取得。

對固定有卵白素之感測晶片，加入經生物素化之人類RGMa蛋白質(4μg/mL)作為配位子，藉以固定相當1300至1600RU之人類RGMa蛋白質。接著加入任意之抗RGMa抗體(15μg/mL)作為分析物，結合於固定在感測晶片上之人類RGMa蛋白質。藉由重複其複數次，作成感測晶片上之人類RGMa蛋白質的全部分子上結合有任意之抗RGMa抗體的狀態(飽和狀態)，求得於飽和狀態之結合量(飽和結合量1)。

同樣的實驗亦於包含本發明之特定CDR之胺基酸序列的抗RGMa抗體上實施，求得於飽和狀態之結合量(飽和結合量2)。

接著，將感測晶片上之人類RGMa蛋白質以包含本發明之特定CDR之胺基酸序列的抗RGMa抗體予以飽和後，加入任意之抗RGMa抗體(15μg/mL)作為分析物，調查是否可對經包含本發明之特定CDR之胺基酸序列的抗RGMa抗體進行飽和過的人類RGMa蛋白質以追加的形態進行結合。

任意之抗RGMa抗體，若可對經包含本發明之特定CDR之胺基酸序列的抗RGMa抗體進行飽和過的人類RGMa蛋白質以追加的形態，在顯示上述所算出之任意之抗RGMa抗體的飽和結合量1的情況下結合時，判斷該抗體「不進行競爭」。另一方面，任意之抗RGMa抗體，若無法對經包含本發明之特定CDR之胺基酸序列的抗RGMa抗體進行飽和過的人類RGMa蛋白質以追加的形態進行結合時，則判斷該抗體「進行競爭」。又，即使任意之抗RGMa抗體可對經包含本發明之特定CDR之胺基酸序列的抗RGMa抗體進行飽和過的人類RGMa蛋白質以追加的形態進行結合，但追加之結合量未以顯著差達到飽和結合量1時，則該抗體判斷為「進行競爭」。顯著差係以一般的檢定方法(例如Student之t檢定)進行調查，顯著水準為5%以下。

對包含上述特定CDR之胺基酸序列的抗RGMa抗體競爭與RGMa之結合的抗RGMa抗體，可為小鼠抗體、人類抗體、大鼠抗體、兔子抗體、山羊抗體、駱駝抗體等來自任意動物之抗體，亦可為此等抗體之組合的嵌合體抗體或人類化抗體，但較佳為嵌合體抗體、人類化抗體、或人類抗體。

<本發明之核酸分子>

本發明之核酸分子為編碼本發明之單株抗體的多核苷酸，作為例子，可列舉編碼重鏈可變區域之區域分別包含編碼序列表之序列編號33、34、及35之胺基酸序列(1或數個胺基酸可經取代、缺失、插入或附加)的鹼基序列，且編碼輕鏈可變區域之區域分別包含編碼序列表之序列編號30、31、及32之胺基酸序列(1或數個胺基酸可經取代、缺失、插入或附加)的鹼基序列之多核苷酸；或編碼重鏈可變區域之區域分別包含編碼序列表之序列編號39、40、及SFG之胺基酸序列(1或數個胺基酸可經取代、缺失、插入或附加)的鹼基序列，且編碼輕鏈可變區域之區域分別包含編碼序列表之序列編號36、37、及38之胺基酸序列(1或數個胺基酸可經取代、缺失、插入或附加)的鹼基序列之多核苷酸。

本發明之核酸分子之其他例子，可列舉編碼重鏈之區域包含編碼序列表之序列編號5之胺基酸序列的鹼基序列，且編碼輕鏈之區域包含編碼序列表之序列編號4之胺基酸序列的鹼基序列之多核苷酸；或編碼重鏈之區域包含編碼序列表之序列編號7之胺基酸序列的鹼基序列，且編碼輕鏈之區域包含編碼序列表之序列編號6之胺基酸序列的鹼基序列之多核苷酸。

本發明之核酸分子之其他例子，可列舉編碼重鏈之區域包含編碼序列表之序列編號9之胺基酸序列的鹼基序列，且編碼輕鏈之區域包含編碼序列表之序列編號8之胺基酸序列的鹼基序列之多核苷酸。

本發明之核酸分子之其他例子，可例示編碼重鏈之區域包含編碼序列表之序列編號11~18中任一者之胺基酸序列的鹼基序列，且編碼輕鏈之區域包含編碼序列表之序列編號19~25中任一者之胺基酸序列的鹼基序列之多核苷酸。

本發明之核酸分子的特佳之例子，可例示編碼重鏈之區域包含編碼序列表之序列編號15之胺基酸序列的鹼基序列，且編碼輕鏈之區域包含編碼序列表之序列編號19之胺基酸序列的鹼基序列之多核苷酸。

本發明之核酸分子之其他例子，可例示編碼重鏈可變區域之區域包含編碼序列表之序列編號41之胺基酸序列的鹼基序列，且編碼輕鏈可變區域之區域包含編碼序列表之序列編號42之胺基酸序列的鹼基序列之多核苷酸。

本發明之核酸分子之具體例子，可列舉編碼重鏈可變區域之區域包含序列表之序列編號43之鹼基序列，且編碼輕鏈可變區域之區域包含序列表之序列編號44之鹼基序列的多核苷酸。

再者，本發明之核酸分子，只要係編碼具有與RGMa之結合能力，不阻礙RGMa與Neogenin之結合，且中和RGMa之神經突成長阻礙活性的單株抗體，則可為包含與序列表之序列編號43之鹼基序列的互補鏈DNA於嚴苛(stringent)條件下雜交之多核苷酸及與序列表之序列編號44之鹼基序列的互補鏈DNA於嚴苛條件下雜交之多核苷酸者。此處，嚴苛條件可列舉例如南方氏雜交之後，於68℃、0.1×SSC、相當於0.1%SDS的鹽濃度下進行洗淨之條件。

本發明之核酸分子可為編碼重鏈與輕鏈之恆定區域與可變區域全部者，亦可為僅編碼重鏈與輕鏈之可變區域者。編碼恆定區域與可變區域全部時的重鏈及輕鏈之恆定區域的鹼基序列，較佳為Nucleic Acids Research vol.14,p1779,1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257,p1516,1982及Cell vol.22,p197,1980所記載者。

本發明之核酸分子，例如可藉由以下方法得到。首先，由融合瘤等之細胞中，使用市售RNA萃取套組配製全RNA，使用隨機引子等，藉由反轉錄酵素合成cDNA。接著，於已知之人類抗體重鏈基因、輕鏈基因之可變區域，藉由使用各自被保存之序列的寡核苷酸作為引子之PCR法，放大編碼抗體之cDNA。關於編碼恆定區域之序列，可藉由將已知之序列以PCR法放大而得到。DNA之鹼基序列，可接入序列決定用質體等，依一般方法來決定。

或者，亦可藉由化學合成可變區域或其一部分的序列，並結合於包含恆定區域之序列，來得到編碼本發明之單株抗體的DNA。

又，本發明提供包含本發明之核酸分子的重組載體及包含該重組載體的轉形體(宿主細胞)。作為重組載體，可為能夠於如大腸菌(Echerichia coli)之原核細胞中表現的載體(例如pBR322、pUC119或此等之衍生物)，但較佳為可於真核細胞中表現的載體、更佳為可於來自哺乳動物之細胞中表現的載體。可於來自哺乳動物之細胞中表現的載體，可列舉例如pcDNA3.1(Invitrogen公司製)、pConPlus、pcDM8、pcDNA I/Amp、pcDNA3.1、 pREP4般的質體載體、pDON-AI DNA(TAKARA BIO公司製)等之病毒載體。可為包含重鏈編碼序列與輕鏈編碼序列之1個載體、亦可為包含重鏈編碼序列之載體與包含輕鏈編碼序列之載體的2個載體。

導入本發明之重組載體的轉形體，可為如大腸菌、枯草菌之原核細胞，但較佳為真核細胞、更佳為來自哺乳動物之細胞。來自哺乳動物之細胞，可列舉例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、COS、骨髓瘤、BHK、HeLa、Vero、293、NS0、Namalwa、YB2/0等。

所得到之抗RGMa抗體或其抗原結合片段，可純化至成為均勻。抗體等之分離、純化，只要使用通常之蛋白質中所使用的分離、純化方法即可。例如，若適當選擇、組合親和性層析等之層析管柱、過濾器、超微過濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等，則可分離、純化抗體(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)，但不限定於此等。親和性層析所用之管柱，可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G管柱、抗免疫球蛋白抗體結合管柱、抗原結合管柱等。例如，作為蛋白質A管柱，可列舉Hyper D,POROS,Sepharose F.F.(Amersham Biosciences)等。

<免疫學疾病及神經學疾病之預防或治療藥>

本發明之RGMa結合蛋白質，特別是抗RGMa抗體或其抗原結合片段，係藉由中和RGMa之神經突成長阻礙活性來促進神經功能之修復，因而可使用作為神經學疾病之預防、治療或復發預防藥。

又，本發明之RGMa結合蛋白質，特別是抗RGMa抗體或其抗原結合片段，會中和RGMa所致的T細胞活性化，因而可使用作為免疫學疾病之預防、治療或復發預防藥。

神經學疾病，可例示肌萎縮性側索硬化症、上臂神經叢損傷、腦損傷(包含外傷性腦損傷)、腦性麻痺、格林-巴利症候群、大腦白質萎縮症、多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)、視神經脊髓炎、小兒麻痺後症候群、脊柱裂、脊髓損傷、脊髓性肌肉萎縮症、脊椎腫瘤、橫貫性脊髓炎、失智症(包含老年性失智症、輕度認知功能障礙、阿茲海默症、阿茲海默相關失智症)、杭丁頓氏舞蹈症、遲發性運動障礙、躁症、巴金森氏症、史蒂爾-理查症候群、唐氏症、重症肌無力症、神經外傷(包含視神經外傷)、血管類澱粉症、類澱粉症所伴隨之大腦出血、腦梗塞、腦炎、急性混亂障礙、青光眼、思覺失調症及視網膜神經纖維層病變(包含藉由糖尿病性視網膜病、缺血性視神經病變、X染色體連結性視網膜分裂症、藥物誘發性視神經病變、視網膜營養性萎縮、老年性黃斑部病變、視神經乳頭玻璃疣而賦予特徵之眼病；藉由光受器病變之遺傳性決定因子而賦予特徵之眼病、體染色體隱性錐狀細胞-桿狀細胞失養症、視神經病變所伴隨之粒線體受損)。較佳為脊髓損傷、神經外傷(包含視神經外傷)。

免疫學疾病，可例示多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)、視神經脊髓炎、乾癬、關節炎(包含風濕性關節炎、變形性關節病、乾癬性關節炎)、格林-巴利症候群、神經貝賽特氏症、惡性貧血、I型(胰島素依賴型)糖尿病、全身紅斑性狼瘡(SLE)、發炎性腸疾病(IBD)、休格倫氏症候群、古巴士德氏症候群、葛瑞夫茲氏症、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性血小板減少性紫斑病、氣喘、花粉症、異位性皮膚炎、絲球體腎炎、重症肌無力症、橋本氏病、及肉狀瘤病。較佳為多發性硬化症。

本發明之RGMa結合蛋白質，特別是抗RGMa抗體或其抗原結合片段，可使用作為神經學疾病/免疫學疾病之預防、治療或復發預防藥，較佳之神經學疾病/免疫學疾病，可列舉脊髓損傷、神經外傷(包含視神經外傷)、多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)。

此處，「治療」，係包含哺乳動物、特別是人類之疾病的任意治療，其包含阻礙疾病症狀，亦即阻止其進行或消滅疾病或症狀、及減輕疾病症狀，亦即引發疾病或症狀之後退、或症狀之進行延遲。

又，「預防」，係包含於哺乳動物、特別是人類中，防止上述疾病之發病。

又，「復發預防」，係包含於哺乳動物、特別是人類中，防止重複緩解、復發之上述疾病的復發。

本發明之RGMa結合蛋白質(抗RGMa抗體或其抗原結合片段)，可作為用於預防或治療神經學疾病或免疫學疾病的醫藥組成物。

本發明之RGMa結合蛋白質(抗RGMa抗體或其抗原結合片段)之投與形態並無特殊限制，可由經口投與、非經口投與(例如靜脈注射、肌肉注射、皮下投與、直腸投與、經皮投與、腦內投與、脊髓內投與、其他局部投與)之任一投與路徑對包含人類的哺乳類投與。

用於經口投與及非經口投與之劑型及其配製方法係所屬技術領域中具有通常知識者所周知，可藉由將本發明之抗體，與藥學上容許之藥載體等摻合，來製造醫藥組成物。

用於非經口投與之劑型，可列舉注射用製劑(例如點滴注射劑、靜脈注射劑、肌肉注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑、腦內投與製劑、脊髓內投與製劑)、外用劑(例如、軟膏劑、泥罨劑、洗劑)、栓劑吸入劑、眼劑、眼軟膏劑、點鼻劑、點耳劑、微脂體劑等。特別是欲直接作用於中樞神經組織的情況時，可利用滲透壓泵之醫療用微型泵持續地注入、亦可與纖維蛋白膠等混合來作為緩釋製劑後，留置於患部組織。

例如，注射用製劑通常可將抗體溶解於注射用蒸餾水來配製，但可依需要添加溶解輔助劑、緩衝劑、pH調整劑、等張劑、無痛劑、保存劑、安定劑等。又，亦可作為使用時配製用的冷凍乾燥製劑。

用於經口投與之劑型，可列舉固體或液體之劑型，具體而言可列舉錠劑、被覆錠劑、丸劑、細粒劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑、注射劑、片劑等。

本發明之醫藥組成物，亦可進一步含有治療上有效的其他藥劑，又，亦可依需要摻合殺菌劑、消炎劑、維生素類、胺基酸等之成分。

藥理學上容許之藥載體，可列舉例如固形製劑中之賦形劑、潤滑劑、結合劑及崩解劑；或液狀製劑中之溶劑、溶解輔助劑、懸浮劑、等張劑、緩衝劑及無痛劑等。亦可進一步依需要適當、適量使用通常之防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甘味劑、吸附劑、濕潤劑等之添加物。

本發明之抗體之投與量，係基於例如投與路徑、疾病之種類、症狀之程度、患者之年齡、性別、體重、疾病之嚴重度、藥物動態及毒物學的特徵等之藥理學上的見解、有無利用藥物傳遞系統、以及是否以與其他藥物之組合的一部分的形式投與等各種因子，而由醫師決定，但通常每個成人(體重60kg)，於經口投與可為1~5000μg/日、較佳為10~2000μg/日、更佳為50~2000μg/日；於注射投與可為1~5000μg/日、較佳為5~2000μg/ 日、更佳為50~2000μg/日，予以1次或分為數次投與。對全身之非經口投與，可為將每單位體重10~100000μg/kg、更佳為100~50000μg/kg、又更佳為500~20000μg/kg以1日、1週、1月1次、或1年1~7次之間隔投與。利用了滲透壓泵等之局部投與，通常可為每個成人(體重60kg)，以10~100000μg/日、更佳為100~10000μg/日、又更佳為500~5000μg/日之速度持續注入。

[實施例]

以下，列舉實施例以具體說明本發明，但本發明不限定為以下實施例之態樣。

實施例1：人類RGMa蛋白質(C末側結構域)之配製

建立會表現於人類RGMa蛋白質(序列表之序列編號1)之Pro169~Gly422(意指由N末端側起第169號之脯胺酸殘基至第422號之甘胺酸殘基，以後係同樣記載)之C末端融合有組胺酸標籤的重組人類RGMa蛋白質之CHO細胞。

使CHO細胞之培養上清液中所含有的人類RGMa蛋白質C末側結構域，吸附於鎳管柱(GE Healthcare公司製、17-5247-01)後，以100mM咪唑溶液溶出。藉由透析，由咪唑溶出區分取代為Phosphate bufferd saline(PBS)，使用作為免疫原。

實施例2：小鼠抗人類RGMa單株抗體之製作

將實施例1中配製之重組人類RGMa蛋白質10μg，與完全弗氏佐劑(Sigma公司製)混合，製作乳化液，對BALB/c小鼠(日本Charles River股份有限公司)之背部皮下數個部位誘發免疫。之後每隔1~2週將以不完全弗氏佐劑(Sigma公司製)製作乳化液之重組人類RGMa蛋白質10μg同樣地誘發免疫，數次誘發免疫後進行採血。以將後述之人類或小鼠RGMa蛋白質固相化的ELISA法測定抗體價。對於觀察到抗體價之上昇的個體，將人類RGMa蛋白質10μg予以靜脈內投與，進行增幅(boost)，2~3日後回收脾細胞。

細胞融合係將前述脾細胞與其半數之小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0、大日本住友製藥)混合，對離心所得之沈澱區分添加聚乙二醇(Roche Diagnostics公司製)使其細胞融合。接著將經離心之細胞以D-MEM(Invitrogen公司製)洗淨2次。將細胞於含有10%胎牛血清(Invitrogen公司製)、1% BM condimed(Roche Diagnostics公司製)及HAT(Sigma-Aldrich公司製)之GIT培養基(日本製藥製)中再懸浮，以各孔5×10⁴骨髓瘤細胞/well播種於96孔盤。回收培養上清液，藉由實施例3之人類RGMa蛋白質固相化ELISA法，進行抗體產生細胞之篩選。

將於篩選所得之抗體產生細胞藉由極限稀釋法選殖，選定產生2種單株抗體(B5.116A3及B5.70E4)之融合瘤細胞。

使用同型套組(Mouse MonoAB ID/SP KIT、ZYMED公司製、93-6550)所判定之兩單株抗體的同型，均為重鏈為小鼠IgG2b、輕鏈為κ。

單株抗體之純化，係由融合瘤之培養上清液，藉由使用固定有抗小鼠IgG抗體之洋菜糖(Sigma公司製Anti-Mouse IgG-Agarose)的親和性層析來進行。使抗體結合於管柱後，以PBS洗淨管柱，接著以10mM甘胺酸鹽酸鹽(pH2.7)溶出，迅速中和。之後，將溶出中和液藉由超微過濾膜取代為PBS。

實施例3：將人類或小鼠RGMa蛋白質固相化之ELISA

將以PBS配製為2μg/mL之人類RGMa蛋白質(R&D systems公司製、2459-RM)或小鼠RGMa蛋白質(R&D systems公司製、2458-RG)各分注50μL/well於96孔盤，於室溫靜置1小時。去除液體後，將以PBS稀釋5倍之ApplieBlock(Seikagaku Biobusiness公司製、200150)各分注200μL/well，於室溫靜置1小時，阻斷非特異結合。以PBST(含有0.05% Tween20之PBS)洗淨3次後，將以PBS階段稀釋之檢體(小鼠血清、融合瘤培養上清液、後述之重組抗體表現培養上清液、或純化抗體等)，各添加50μL/well，於室溫靜置1小時。之後以PBST洗淨3次，接著將以PBS稀釋之過氧化酶標識羊抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare公司製、NA9310V)各分注50μL/well，於室溫靜置1小時。洗淨3次後，添加過氧化酶顯色套組(住友Bakelite公司製、ML-1130O)顯色一定時間，以微量盤分析儀測定492nm之吸光度。

實施例4：抗體之抗原決定位解析

抗體所結合之抗原決定位，係以胜肽掃描法決定。合成於人類RGMa蛋白質(序列表之序列編號1)之Arg172~Ala424中所包含之由各偏移3殘基之連續的11殘基所成之胺基酸序列的N末端側，融合有N末端生物素化之間隙序列(SGSG)(序列表之序列編號46)的合計83種類之胜肽。將胜肽固定於卵白素微量盤後，使被驗抗體(B5.116A3、B5.70E4)進行反應。接著，使過氧化酶標識兔子抗小鼠Ig抗體(Dako公司、P026002)進行反應，添加基質溶液顯色一定時間後，以微量盤分析儀測定吸光度。

其結果，B5.116A3係結合於Glu298~Gly311(Glu298~Asp308、Val301~Gly311之2種類之胜肽)、Asn322~Glu335(ASn322~Thr332、Ile325~Glu335之2種類之胜肽)、及Lys367~Ala377之來自人類RGMa之胜肽，B5.70E4係結合於Glu298~Gly311(Glu298~Asp308、Val301~Gly311之2種類之胜肽)、ASn322~Glu335(Asn322~Thr332、Ile325~Glu335之2種類之胜肽)、及Pro349~Thr359之來自人類RGMa之胜肽。

實施例5：小鼠抗體基因之序列解析與選殖

由產生小鼠單株抗體(B5.116A3、B5.70E4)之融合瘤細胞中萃取total RNA。以Total RNA為模板，藉由反轉錄反應合成cDNA。以cDNA為模板，PCR放大輕鏈可變區域及恆定區域、以及重鏈可變區域及恆定區域之基因，決定DNA序列。接著，基於所決定之可變區域序列及恆定區域序列，以PCR放大抗體全長基因，進行選殖。此等抗體基因所編碼之胺基酸序列，係如以下所述。

(1)B5.116A3輕鏈胺基酸序列(序列表之序列編號4)

(2)B5.116A3重鏈胺基酸序列(序列表之序列編號5)

(3)B5.70E4輕鏈胺基酸序列(序列表之序列編號6)

(4)B5.70E4重鏈胺基酸序列(序列表之序列編號7)

實施例6：重組小鼠抗體及重組大鼠小鼠嵌合體抗體之配製

配製來自融合瘤之2種抗RGMa抗體B5.116A3或B5.70E4的重組小鼠抗體(以後分別記載為「r116A3」、「r70E4」)。

又，作為比較例，基於專利文獻1(WO2009/106356)，融合大鼠抗體5F9之可變區域與小鼠抗體(IgG2bκ)之恆定區域(輕鏈恆定區域為序列表之序列編號4之Arg108~Cys214、重鏈恆定區域為序列表之序列編號5之Ala117~Lys452)，配製重組大鼠小鼠嵌合體抗體(以後載為「r5F9」)。

將編碼各抗體之輕鏈及重鏈的DNA，插入pcDNA3.3(Life Technologies公司製)，製作表現載體。使用Neofection 293(Astec公司製)，將表現載體導入HEK293F細胞(Life Technologies公司製)。將細胞於37℃、8%二氧化碳氣體條件下培養6日後，回收培養上清液。重組抗體之純化，係將培養上清液，加入固定化有Protein A或Protein G之親和性管柱(GE healthcare公司製)，將結合於管柱之抗體以10mM甘胺酸鹽酸鹽(pH2.8)溶出，迅速中和後，取代為PBS。

依使用目的，必須提高純化純度時，係將Protein A管柱純化後之抗體，以Ceramic Hydroxyapatite Typel(CHT)管柱(BIORAD公司製)純化。將結合於CHT管柱之抗體以10mM KH₂PO₄(pH6.5)洗淨後，以20mM KH₂PO₄(pH6.5)、0.5M NaCl溶出。回收溶出區分後，取代為PBS。

實施例7：對RGMa蛋白質表現細胞之結合試驗

將表現全長人類RGMa蛋白質(序列表之序列編號1之Met1~Cys450)、人類RGMa蛋白質C末側結構域(序列表之序列編號1之Pro169~Cys450)、全長小鼠RGMa蛋白質(序列表之序列編號2之Met1~Trp454)、或大鼠RGMa蛋白質C末側結構域(序列表之序列編號3之Pro170~Trp449)的載體，導入CHO細胞或HEK293細胞，製作抗原表現細胞。

再者，RGMa蛋白質，於GPI錨定附加反應之時，C末端胜肽係受到加工。小鼠RGMa蛋白質及大鼠RGMa蛋白質，均為於Ala427被切斷，C末端側之胜肽被去除。因此，透過GPI錨定而於細胞上表現的全長蛋白質及C末側結構域之胺基酸序列，於小鼠與大鼠係相同。

始終濃度10μg/mL之被驗抗體(r116A3及r70E4)及r5F9(比較例)，與上述之抗原表現細胞反應後，以含有0.1%牛血清白蛋白、0.05%NaN₃之PBS洗淨細胞。使FITC標識抗小鼠免疫球蛋白抗體(DAKO公司製)進行反應，洗淨細胞。以流式細胞儀(Becton Dickinson公司製、FACSCalibur)測定螢光，評估被驗抗體對抗原表現細胞之結合性(表1)。

其結果，可知r116A3及r70E4，與r5F9不同地，亦會結合於人類及大鼠RGMa蛋白質之C末側結構域。RGMa蛋白質僅以C末側結構域亦觀察到神經突成長阻礙作用，r116A3及r70E4，會阻礙全長RGMa蛋白質及C末側結構域之兩者。

實施例8：對RGMa蛋白質之解離常數測定

被驗抗體(r116A3、r70E4)及r5F9(比較例)對RGMa蛋白質之親和性，係藉由使用Proteon XPR36(BIORAD公司製)之表面電漿共振(SPR)法來測定。

將經10mM乙酸緩衝液(pH4.5)稀釋為10μg/mL之人類RGMa蛋白質(R&D Systems公司製、2459-RM)、人類RGMa蛋白質C末端側結構域(於實施例1配製)、或小鼠RGMa蛋白質(R&D Systems公司製、2458-RG)，藉由胺偶合法固定於GLC感測晶片。將經階段稀釋之被驗抗體以流速100μL/min加入60秒，作為分析物，來測定解離常數(Kd值)。

如表2所示，r116A3及r70E4，係與r5F9不同地，亦會結合於人類RGMa蛋白質之C末側結構域。r116A3相較於r5F9，對人類RGMa蛋白質係強32倍、對小鼠RGMa蛋白質係強44倍地結合。

實施例9：RGMa-Neogenin結合阻礙試驗

純化重組人類Neogenin蛋白質(序列表之序列編號10)之細胞外結構域(Ala34~Leu1105)。建立會表現人類Neogenin蛋白質細胞外結構域之CHO細胞株。於C末端融合組胺酸標籤。由CHO細胞之培養上清液，吸附於鎳管柱(GE Healthcare公司製、17-5247-01)後，以100mM咪唑溶液溶出。藉由透析，由咪唑溶出區分取代為PBS。

使用ChromaLink Biotin Labeling Kit(Solulink公司製)，將人類RGMa蛋白質(R&D systems公司製、2459-RM)予以生物素標識。將配製為2μg/mL之生物素標識人類RGMa蛋白質，與2倍階段稀釋之被驗抗體(r116A3、r70E4)等量混合，於室溫反應2小時，配製混合溶液。

同時地，將以PBS配製為2μg/mL之人類Neogenin蛋白質細胞外結構域各添加50μL/well於於96孔盤，於室溫靜置1小時，製作Neogenin固相微量盤。將液體去除後，添加2.5%牛血清白蛋白溶液，靜置1小時以阻斷非特異結合。對該Neogenin固相微量盤，添加上述混合溶液50μL/well，於室溫靜置1小時。之後進行洗淨操作，添加過氧化酶標識Avidin(VECTASTAIN ABC系統、Vector Laboratories公司製)，於室溫靜置1小時。之後進行洗淨操作，添加基質溶液顯色一定時間，以微量盤分析儀測定吸光度。以抗體不存在時之吸光度比為1來作圖，評估抗體所致之濃度依存性的RGMa-Neogenin之結合阻礙(圖1)。

其結果，與抗人類RGMa多株抗體(R&D Systems公司製、AF2459)及r5F9不同地，r116A3及r70E4不阻礙RGMa-Neogenin之結合。

實施例10：RGMa-BMP2結合阻礙試驗

將以PBS配製為2μg/mL之人類RGMa蛋白質(R&D systems公司製、2459-RM)各添加50μL/well於96孔盤，於室溫靜置1小時。添加2.5%牛血清白蛋白溶液，靜置1小時以阻斷非特異結合，配製RGMa蛋白質固相化微量盤。對該RGMa蛋白質固相微量盤添加階段稀釋為0.01~10μg/mL之被驗抗體(B5.116A3、B5.70E4)，於室溫靜置1小時。之後進行洗淨操作，添加稀釋為0.5μg/mL之人類BMP2蛋白質(R&D systems公司製、355-BM)，於室溫靜置1小時。

使生物素標識抗BMP2抗體進行反應，進一步添加過氧化酶標識Avidin(VECTASTAIN ABC系統、Vector Laboratories公司製)、基質溶液，顯色一定時間，以微量盤分析儀測定吸光度(圖2)。

其結果，特別是抗RGMa抗體(B5.116A3)，係濃度依存性地微弱地阻礙RGMa-BMP2之結合(於0.01μg/mL吸光度為0.45、於0.1μg/mL吸光度為0.4、於1μg/mL吸光度為0.32、於10μg/mL吸光度為0.1)。

實施例11：人類化抗體之設計

小鼠單株抗體B5.116A3之人類化，係遵照日本專利第2912618號公報記載之Winter等之方法，以互補性決定區域(CDR)移植法進行。

首先，製成小鼠單株抗體B5.116A3之輕鏈及重鏈可變區域之3D homology model，特定出於框架(FW)區域，位於CDR附近之胺基酸殘基。選擇此等胺基酸儘可能被維持的人類抗體FW，移植小鼠抗體之CDR，設計人類化抗體序列。所設計之人類化抗體序列，重鏈記載為HA(序列表之序列編號11)、輕鏈記載為KA(序列表之序列編號19)。進一步地，對可變區域之構造安定性相關的FW內之胺基酸進行追加導入變異，設計複數個人類化抗體序列(重鏈包含HA，至HB~HH共8種、輕鏈包含KA，至KB~KG共7種)。

實施例12：重組小鼠人類嵌合體及重組人類化抗體之配製

(1)根據實施例6，配製具有以下胺基酸序列之重組小鼠人類嵌合體抗RGMa抗體116A3(r116A3C)。

輕鏈(序列表之序列編號8)

重鏈(序列表之序列編號9)

(2)根據實施例6，配製由以下重鏈及輕鏈之組合所成之共20種人類化抗RGMa抗體。

重鏈/輕鏈之組合；HA/KA、HA/KB、HA/KC、HA/KG、HB/KC、HC/KA、HC/KB、HD/KA、HD/KB、HD/KC、HD/KD、HE/KA、HF/KA、HF/KF、HF/KG、HG/KD、HG/KH、HH/KA、HH/KD、HH/KF

(3)根據實施例6，配製重組人類化抗RGMa抗體(以後記載為rH5F9)(比較例)。

將專利文獻1(WO2009/106356)記載之人類化抗RGMa單株抗體h5F9之可變區域(輕鏈為專利文獻1之seq ID_53、重鏈為專利文獻1之seq ID_50)，與人類抗體恆定區域(輕鏈為序列表之序列編號26的Arg108~Cys214、重鏈為序列表之序列編號27的Ala117~Lys446)連結。

實施例13：抗體之熱安定性試驗

將表現實施例12記載之重組抗體的培養上清液各分取20μL，使用熱循環器(Takara bio公司製、TP600)，以40、45、50、55、60、65、70、75℃之8點溫度各自熱處理10分鐘。

以抗體終濃度成為125ng/mL的方式將培養上清液以PBS稀釋。之後，將實施例3記載之人類RGMa蛋白質固相化，進行ELISA，評估抗體之抗原結合性(圖3)。

其結果，由重鏈HE、輕鏈KA之組合所成之人類化抗體(以下稱為「rH116A3」)、及小鼠人類嵌合體抗體(r116A3C)，顯示較人類化抗體(rH5F9)更優良的熱安定性。以後，將由該HE/KA之組合所成之人類化抗體記載為rH116A3。

再者，未進行熱處理時，小鼠人類嵌合體抗體(r116A3C)與人類化抗體(rH116A3)顯示同等之抗原結合性，並無伴隨人類化之抗原結合性的降低。

實施例14：產生人類化抗RGMa抗體(rH116A3)之CHO安定表現株之建立

生產人類化抗RGMa抗體(rH116A3)之CHO安定表現株，係以Lonza GS Xceed系統(Lonza公司)建立。將包含人類化抗RGMa抗體(rH116A3)之輕鏈編碼序列(序列表之序列編號44)及重鏈編碼序列(序列表之序列編號43)的pXC double-gene載體，導入CHOK1SV GS knock out親細胞株，於methionine sulphoximine(MSX)選擇下取得轉形細胞池。以流式細胞儀分離為單一細胞後，評估於培養上清液中之抗體產生量、細胞增殖性等，取得CHO安定表現株。

實施例15：神經突成長試驗

由大鼠新生兒(P7)中摘出小腦，懸浮於胰蛋白酶溶液(含有0.2%DNase之0.25%胰蛋白酶PBS溶液)，於37℃消化10~15分鐘。接著添加含有10%胎牛血清之DMEM培養基予以離心分離。以同培養基再懸浮，進行離心分離，同樣地重複操作2次，洗淨細胞。進一步地將該細胞懸浮液以70μm細胞濾篩過濾後予以離心分離，將沈澱區分以同培養基再懸浮。於細胞浮游液添加B27 supplement(GIBCO公司製)，配製大鼠新生兒小腦顆粒細胞。

接著，對細胞微量盤播種大鼠新生兒小腦顆粒細胞，於37℃進行培養1日。

添加終濃度2μg/mL之重組RGMa蛋白質(R&D systems公司製、2459-RM)，於37℃培養2日。以顯微鏡觀察測定神經突長度後，如圖4所示，藉由RGMa之添加，於左圖之實驗中神經突長度由37μm變成26μm、於右圖中由38μm變成27μm，神經突成長被阻礙。僅將被驗抗體(B5.116A3、B5.70E4)以終濃度10μg/mL添加，雖於神經突長度亦未見到變化，但與重組RGMa蛋白質同時地添加被驗抗體時，神經突與對照(RGMa非添加)相同程度地成長，觀察到抗體所致之RGMa蛋白質之中和作用。

實施例16：使用脊髓損傷模式大鼠之效力試驗

對經鹵乙烷(武田藥品工業公司製)吸引麻醉之Wistar系大鼠(雌、8週齡、體重約200g)，以脊椎節段 T9為中心，施以前後1椎骨部分(T8~T10)之椎弓切除術，使脊髓露出。使用脊髓挫傷模式評估時，係使用IH impactor(Precision System公司製)，對露出之脊髓施加200kdyn之壓力。

於剛如前述般使脊髓損傷之後，將充滿400μg/mL之被驗抗體(r116A3,r70E4)或對照小鼠抗體(mo-IgG2bκ)之滲透壓小型泵(200μL液量、0.5μL/小時、14日送達)(Alzet公司製、model 2002)放置於大鼠之背部皮下。滲透壓小型泵之出口所連接之矽製管路的前端，係放置於脊髓損傷部位之硬膜下。該管路係縫於椎弓切除術部位之正下肢側之棘突並固定，縫合肌肉及皮膚層並予以飼育。

脊髓損傷模式大鼠之運動功能，係使用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)分數(Basso,D.M.,Beattie,M.S.,& Bresnahan,J.C.,A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats.J Neurotrauma 12,1-21(1995))，以損傷後第0、1、3、7日、以後每1週，最長至8週來進行評估。其結果，如圖5(A)所示，r116A3或r70E4與對照抗體(mo-IgG2bκ)比較，分別於投與後4或3週以後顯著地改善了BBB分數(p<0.05,Student's t-檢定)。

使用脊髓半側切斷模式來評估時，係將露出之脊髓背側部於1.8mm~2.0mm之深度切斷。與上述同樣地使用滲透壓小型泵來投與被檢抗體(B5.116A3)或對照小鼠抗體 (mo-IgG2bκ)，以損傷後第0、1、3、7日目、以後每1週，最長至10週，使用BBB分數來進行評估。如圖5(B)所示，B5.116A3與對照抗體(mo-IgG2bκ)比較，於投與後4週以後顯著地改善了BBB分數(p<0.01,Student's t-檢定)。

實施例17：使用多發性硬化症模式小鼠之效力試驗

將PLP_139-151胜肽(HSLGKWLGHPDKF：序列表之序列編號45、胜肽研究所製)以生理食鹽液(大塚製藥工廠製)溶解，與添加了結核死菌H37 Ra(Difco Laboratories公司製)之不完全弗氏佐劑(Sigma公司製)混合，製作乳化液。作為PLP_139-151胜肽，係以50μg/head對SJL/JorllcoCrj(SJL/J)小鼠(日本Charles River)之背部皮下誘發免疫，評估EAE分數(H.Kataoka,K Sugahara,K.Shimano,K.Teshima,M.Koyama,A.Fukunari and K.Chiba.FTY720,sphingosine 1-phosphate receptor modulator,ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis by inhibition of T cell infiltration.Cellular & Molecular Immunology 6,439-448,2005.)及體重變化(圖6)。

將經生理食鹽液稀釋之被驗抗體(B5.116A3)，於經PLP_139-151胜肽誘發免疫之7日及10日後或18日及21日後分別以20mg/kg對腹腔內投與。

其結果，如圖6所示，抗RGMa小鼠單株抗體 (B5.116A3)，與對照抗體(mo-IgG2bκ)比較，於發病前之投與會抑制EAE分數惡化(圖6上段)、於發病後之投與，顯示了復發預防效果(圖6下段)。

實施例18：抗體之免疫原性試驗

將來自51名健康人捐贈者之末梢血中所含有的未分化樹狀細胞，以顆粒球單核球集落刺激因子(GM-CSF)及Interleukin-4刺激使其成熟。對成熟樹狀細胞添加終濃度50μg/mL之被驗抗體(rH116A3)，藉由培養4、5日，使抗體攝入樹狀細胞。對其混合來自同一捐贈者之末梢血CD4+T細胞(輔助T細胞)，進一步共培養1週後，以流式細胞儀測定T細胞增殖。以被驗抗體之T細胞增殖活性為指標，評估於人類之免疫原性風險。其結果，51名捐贈者當中，於4名(7.8%)觀察到T細胞之增殖，免疫原性風險低。

<110> Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Osaka University National University Corporation Chiba University

<120> RGMa binding protein and its use

<130> OP-16140-PCT

<150> JP2015-091095

<151> 2015-04-28

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 450

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 454

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

<210> 3

<211> 449

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 3

<210> 4

<211> 234

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

<210> 5

<211> 471

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

<210> 6

<211> 238

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

<210> 7

<211> 466

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric antibody light chain

<400> 8

<210> 9

<211> 446

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> chimeric antibody heavy chain

<400> 9

<210> 10

<211> 1461

<212> PRT

<213> Homo sapieng

<400> 10

<210> 11

<211> 446

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody heavy chain HA

<400> 11

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody heavy chain HB

<400> 12

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<211> 446

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody heavy chain HC

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody heavy chain HD

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody heavy chain HE

<400> 15

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody heavy chain HF

<400> 16

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody heavy chain HG

<400> 17

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody heavy chain HH

<400> 18

<210> 19

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody light chain KA

<400> 19

<210> 20

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody light chain KB

<400> 20

<210> 21

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody light chain KC

<400> 21

<210> 22

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody light chain KD

<400> 22

<210> 23

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody light chain KE

<400> 23

<210> 24

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody light chain KF

<400> 24

<210> 25

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody light chain KG

<400> 25

<210> 26

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 26

<210> 27

<211> 14

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 27

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 29

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 31

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 32

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 33

<210> 34

<211> 19

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 34

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 35

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 36

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 37

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 38

<210> 39

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 39

<210> 40

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 40

<210> 41

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody heavy chain

<400> 41

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> humanized antibody light chain

<400> 42

<210> 43

<211> 348

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> a gene encoding humanized antibodv heavy chain

<400> 43

<210> 44

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> a gene encoding humanized antibody light chain

<400> 44

<210> 45

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PLP139-151

<400> 45

<210> 46

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> spacer

<400> 46

Claims

一種經單離之RGMa結合蛋白質，其係不阻礙Repulsive Guidance Molecule a(RGMa)與Neogenin之結合，且會中和RGMa之神經突成長阻礙活性。
如請求項1之RGMa結合蛋白質，其係與人類RGMa、大鼠RGMa及/或小鼠RGMa結合。
如請求項1或2之RGMa結合蛋白質，其結合於EEVVNAVEDWDSQG(序列表之序列編號26)、NQQIDFQAFHTNAE(序列表之序列編號27)、PTAPETFPYET(序列表之序列編號28)、及/或KLPVEDLYYQA(序列表之序列編號29)之胜肽。
如請求項1至3中任一項之RGMa結合蛋白質，其結合於序列表之序列編號26及序列表之序列編號27之胜肽。
如請求項1至4中任一項之RGMa結合蛋白質，其結合於序列表之序列編號26、序列表之序列編號27及序列表之序列編號28之胜肽。
如請求項1至4中任一項之RGMa結合蛋白質，其結合於序列表之序列編號26、序列表之序列編號27及序列表之序列編號29之胜肽。
如請求項1至6中任一項之RGMa結合蛋白質，其中RGMa結合蛋白質為人類抗體、人類化抗體或嵌合體抗體、或此等之抗原結合片段。
一種核酸分子，其係編碼如請求項1至7中任一項之RGMa結合蛋白質的蛋白質部分。
一種重組載體，其係包含如請求項8之核酸分子。
一種宿主細胞，其係包含如請求項9之重組載體。
一種如請求項1至7中任一項之RGMa結合蛋白質之製造方法，其係包含培養如請求項10之宿主細胞之步驟。
一種醫藥組成物，其係包含如請求項1至7中任一項之RGMa結合蛋白質。
如請求項12之醫藥組成物，其係神經學疾病或免疫學疾病之預防、治療或復發預防用。
如請求項13之醫藥組成物，其中神經學疾病，係由包含肌萎縮性側索硬化症、上臂神經叢損傷、腦損傷(包含外傷性腦損傷)、腦性麻痺、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、大腦白質萎縮症、多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)、視神經脊髓炎、小兒麻痺後症候群、脊柱裂、脊髓損傷、脊髓性肌肉萎縮症、脊椎腫瘤、橫貫性脊髓炎、失智症(包含老年性失智症、輕度認知功能障礙、阿茲海默症、阿茲海默相關失智症)、杭丁頓氏舞蹈症、遲發性運動障礙、躁症、巴金森氏症、史蒂爾-理查症候群(Steele-Richard syndrome)、唐氏症、重症肌無力症、神經外傷(包含視神經外傷)、血管類澱粉症、類澱粉症所伴隨之大腦出血、腦梗塞、腦炎、急性混亂障礙、青光眼、思覺失調症及視網膜神經纖維層病變(包含藉由糖尿病性視網膜病、缺血性視神經病變、X染色體連結性視網膜分裂症、藥物誘發性視神經病變、視網膜營養性萎縮、老年性黃斑部病變、視神經乳頭玻璃疣而賦予特徵之眼病；藉由光受器病變之遺傳性決定因子而賦予特徵之眼病、體染色體隱性錐狀細胞-桿狀細胞失養症、視神經病變所伴隨之粒線體受損)之群中選擇。
如請求項13之醫藥組成物，其中免疫學疾病，係由包含多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)、視神經脊髓炎、乾癬、關節炎(包含風濕性關節炎、變形性關節病、乾癬性關節炎)、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、神經貝賽特氏症、惡性貧血、I型(胰島素依賴型)糖尿病、全身紅斑性狼瘡(SLE)、發炎性腸疾病(IBD)、休格倫氏症候群、古巴士德氏症候群(Goodpasture’s syndrome)、葛瑞夫茲氏症(Graves’disease)、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性血小板減少性紫斑病、氣喘、花粉症、異位性皮膚炎、絲球體腎炎、重症肌無力症、橋本氏病、及肉狀瘤病之群中選擇。
如請求項13之醫藥組成物，其中神經學疾病或免疫學疾病，係由包含脊髓損傷、神經外傷(包含視神經外傷)及多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)之群中選擇。
一種經單離之抗RGMa抗體、或其抗原結合片段，其輕鏈之互補性決定區域1(LCDR1)、輕鏈之互補性決定區域2(LCDR2)、輕鏈之互補性決定區域3(LCDR3)、重鏈之互補性決定區域1(HCDR1)、重鏈之互補性決定區域2(HCDR2)及重鏈之互補性決定區域3(HCDR3)之各自的胺基酸序列，係包含LCDR1：RASQDISSYLN(序列表之序列編號30)LCDR2：YTSRLHS(序列表之序列編號31)LCDR3：QQLNTLP(序列表之序列編號32)HCDR1：DAWMD(序列表之序列編號33)HCDR2：EIRSKANNHATYYAESVKG(序列表之序列編號34)及HCDR3：RDGAY(序列表之序列編號35)；或包含LCDR1：RSSQSLVHSNGNTYLH(序列表之序列編號36)LCDR2：KVSNRFS(序列表之序列編號37)LCDR3：SQSTHVP(序列表之序列編號38)HCDR1：TSYYWN(序列表之序列編號39)HCDR2：YISYDGTNNYNPSLKN(序列表之序列編號40)及 HCDR3：SFG，且各CDR序列中，1或數個胺基酸亦可經取代、缺失、及/或附加。
如請求項17之抗RGMa抗體或其抗原結合片段，其中重鏈可變區域(VH)係包含 VH： (序列表之序列編號41)或與該胺基酸序列具有至少 90%之同一性的胺基酸序列，且輕鏈可變區域(VL)係包含 VL： (序列表之序列編號42)或與該胺基酸序列具有至少90%之同一性的胺基酸序列。
如請求項17或18之抗RGMa抗體或其抗原結合片段，其中抗RGMa抗體為人類化抗體。
如請求項17至19中任一項之抗RGMa抗體或其抗原結合片段，其中抗RGMa抗體具有人類IgG之恆定區域。
一種RGMa結合蛋白質，其與RGMa之結合係與如請求項17或18之抗RGMa抗體競爭。
一種核酸分子，其係編碼如請求項17至20中任一項之抗RGMa抗體或其抗原結合片段的蛋白質部分。
如請求項22之核酸分子，其中編碼VH及VL之胺基酸序列的核酸序列，為包含 VH： (序列表之序列編號43)、及 VL： (序列表之序列編號44)之核酸序列。
一種重組載體，其係包含如請求項22或23之核酸分子。
一種宿主細胞，其係包含如請求項24之重組載體。
一種如請求項17至20中任一項之抗RGMa抗體或其抗原結合片段之製造方法，其係包含培養如請求項 25之宿主細胞的步驟。
一種醫藥組成物，其係包含如請求項17至20中任一項之抗RGMa抗體或其抗原結合片段。
如請求項27之醫藥組成物，其係神經學疾病或免疫學疾病之預防、治療或復發預防用。
如請求項28之醫藥組成物，其中神經學疾病，係由包含肌萎縮性側索硬化症、上臂神經叢損傷、腦損傷(包含外傷性腦損傷)、腦性麻痺、格林-巴利症候群、大腦白質萎縮症、多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)、視神經脊髓炎、小兒麻痺後症候群、脊柱裂、脊髓損傷、脊髓性肌肉萎縮症、脊椎腫瘤、橫貫性脊髓炎、失智症(包含老年性失智症、輕度認知功能障礙、阿茲海默症、阿茲海默相關失智症)、杭丁頓氏舞蹈症、遲發性運動障礙、躁症、巴金森氏症、史蒂爾-理查症候群、唐氏症、重症肌無力症、神經外傷(包含視神經外傷)、血管類澱粉症、類澱粉症所伴隨之大腦出血、腦梗塞、腦炎、急性混亂障礙、青光眼、思覺失調症及視網膜神經纖維層病變(包含藉由糖尿病性視網膜病、缺血性視神經病變、X染色體連結性視網膜分裂症、藥物誘發性視神經病變、視網膜營養性萎縮、老年性黃斑部病變、視神經乳頭玻璃疣而賦予特徵之眼病；藉由光受器病變之遺傳性決定因子而賦予特徵之眼病、體染色體隱性錐狀細胞-桿狀細胞失養症、視神經病變所伴隨之粒線體受損)之群中選擇。
如請求項28之醫藥組成物，其中免疫學疾病，係由包含多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)、視神經脊髓炎、乾癬、關節炎(包含風濕性關節炎、變形性關節病、乾癬性關節炎)、格林-巴利症候群、神經貝賽特氏症、惡性貧血、I型(胰島素依賴型)糖尿病、全身紅斑性狼瘡(SLE)、發炎性腸疾病(IBD)、休格倫氏症候群、古巴士德氏症候群、葛瑞夫茲氏症、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性血小板減少性紫斑病、氣喘、花粉症、異位性皮膚炎、絲球體腎炎、重症肌無力症、橋本氏病、及肉狀瘤病之群中選擇。
如請求項28之醫藥組成物，其中神經學疾病或免疫學疾病，係由包含脊髓損傷、神經外傷(包含視神經外傷)、多發性硬化症(包含復發緩解型多發性硬化症、首發漸進型多發性硬化症、次發漸進型多發性硬化症)之群中選擇。