ES2758480T3

ES2758480T3 - Proteína de unión a RGMa y uso de la misma

Info

Publication number: ES2758480T3
Application number: ES16786512T
Authority: ES
Inventors: Motonori Hashimoto; Toshihide Yamashita
Original assignee: Chiba University NUC; Osaka University NUC; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Current assignee: Chiba University NUC; Osaka University NUC; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2036-04-27
Also published as: PE20230381A1; CR20200517A; CR20170539A; AU2019210655A1; TW202138389A; EP3290441A4; ZA201708047B; TW201710296A; IL287291A; PH12017501941A1; CN107531791B; US10287346B2; CA2983898A1; PL3290441T3; EP3584260A1; BR112017022994A2; US20190270799A1; AU2016253886A1; SG11201708848TA; DOP2017000248A

Abstract

Un anticuerpo anti-RGMa, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, donde la secuencia de aminoácidos de cada una de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (LCDR1), la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (LCDR2), la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (LCDR3), la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (HCDR1), la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (HCDR2) y la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (HCDR3) comprende lo siguiente: LCDR1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO: 30 en el Listado de secuencias), LCDR2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 31 en el Listado de secuencias), LCDR3: QQLNTLP (SEQ ID NO: 32 en el Listado de secuencias), HCDR1: DAWMD (SEQ ID NO: 33 en el Listado de secuencias), HCDR2: EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID NO: 34 en el Listado de secuencias) y HCDR3: RDGAY (SEQ ID NO: 35 en el Listado de secuencias); o LCDR1: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 36 en el Listado de secuencias) LCDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 37 en el Listado de secuencias) LCDR3: SQSTHVP (SEQ ID NO: 38 en el Listado de secuencias) HCDR1: TSYYWN (SEQ ID NO: 39 en el Listado de secuencias) HCDR2: YISYDGTNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 40 en el Listado de secuencias) y HCDR3: SFG.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína de unión a RGMa y uso de la misma

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a una proteína de unión a RGMa y un uso de la misma.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA

La RGM (molécula de guía repulsiva), que es una proteína de membrana anclada mediante GPI con un peso molecular de aproximadamente 33 kDa, se ha identificado inicialmente como una molécula de guía axonal en el sistema visual (véase el Documento no de patente 1). La familia RGM incluye tres miembros denominados RGMa, RGMb y RGMc. Entre ellos, RGMa se reexpresa después de una lesión del sistema nervioso central en humanos adultos y ratas, así como en la etapa de desarrollo, y la inhibición de la RGMa en ratas acelera el crecimiento de las neuritas después de una lesión de la médula espinal y favorece la recuperación funcional (véase el Documento no de patente 2). Por tanto, se cree que la RGMa es un inhibidor de las neuritas después de una lesión del sistema nervioso central.

También se ha descrito que la RGMa tiene efectos en el sistema inmune. La RGMa se expresa sobre las células dendríticas y actúa sobre las células T, mejorando de ese modo la adherencia de las células T a la ICAM-1 y la fibronectina e induciendo la producción de citoquinas (Documento de patente 4). En un modelo de ratón de esclerosis múltiple, la administración de anticuerpo anti-RGMa suprime los síntomas debidos a encefalomielitis y también muestra efectos de supresión de su comienzo y recaída. Se cree que el anticuerpo anti-RGMa se une a la RGMa expresada sobre las células dendríticas para inhibir la activación de las células T, ejerciendo de ese modo efectos sobre la esclerosis múltiple.

También se ha esclarecido el mecanismo de transducción se señales de la RGMa, y se ha descrito la proteína neogenina como receptor de la RGMa (Documento de patente 3). La neogenina es una proteína transmembrana única expresada sobre las neuronas y células T.

La RGMa se une a la neogenina sobre una membrana celular para inducir la activación de la RhoA e inactivación de la Ras intracelular, proporcionando de ese modo un efecto inhibidor del crecimiento de las neuritas. Sin embargo, se sabe que la neogenina provoca apoptosis en ausencia de unión a la RGMa en un cerebro de gallina en desarrollo (Matsunaga y col., Dev. Growth Differ.46, 481,2004). Por tanto, se cree que la ruta RGMa/neogenina tiene dos efectos contradictorios, el de favorecer la supervivencia neuronal, que es un efecto favorable para la regeneración nerviosa, y el de inhibir el crecimiento de las neuritas, un efecto negativo.

Como agente farmacéutico dirigido a la RGM, el Documento de patente 1 describe un agente que favorece la regeneración axonal que contiene un anticuerpo neutralizante anti-RGM como principio activo. Los Documentos de patente 2 y 3 describen un agente terapéutico para el daño mecánico al cerebro y la médula espinal, un anticuerpo anti-RGM que regula la unión de la RGM a su receptor neogenina. El Documento de patente 4 describe usos médicos del anticuerpo anti-RGM tales como para esclerosis múltiple. El Documento de patente 5 describe usos terapéuticos del anticuerpo anti-RGM para enfermedades que incluyen la esclerosis múltiple, lesión cerebral en mamíferos, lesión de la médula espinal, apoplejía, enfermedad neurodegenerativa y esquizofrenia. Asimismo, el Documento de patente 6 describe usos terapéuticos de moduladores de la RGM tales como el anticuerpo anti-RGM para lesiones de la médula espinal y esclerosis múltiple, y el Documento no de patente 3 describe un uso terapéutico para la esclerosis múltiple progresiva.

DOCUMENTOS DE LA TÉCNICA ANTERIOR

DOCUMENTOS DE PATENTE

Documento de patente 1: WO2005/087268

Documento de patente 2: Solicitud de patente PCT japonesa traducida puesta a disposición

del público n.° 2010-537655

Documento de patente 3: Solicitud de patente PCT japonesa traducida puesta a disposición

del público n.° 2009-510002

Documento de patente 4: WO2011/071059

Documento de patente 5: Solicitud de patente PCT japonesa traducida puesta a disposición

del público n.° 2011-512806

Documento de patente 6: Solicitud de patente PCT japonesa traducida puesta a disposición

del público n.° 2004-525875

Documento de patente 7: WO 2011/070045

DOCUMENTOS NO DE PATENTE

Documento no de patente 1: Neuron 5, 735-743 (1990)

Documento no de patente 2: J. Cell Biol. 173, 47-58 (2006)

Documento no de patente 3: Cell Reports 10, 1-12 (2015)

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

PROBLEMA TÉCNICO

Los usos terapéuticos del anticuerpo anti-RGMa contra enfermedades neurológicas e inmunológicas se han descrito anteriormente, pero los anticuerpos convencionales presentan problemas tales como actividad insuficiente, posibilidad de deteriorar las funciones intrínsecas de la RGMa y efectos secundarios. En particular, los anticuerpos convencionales pueden inhibir la unión entre la RGMa y la neogenina, inhibiendo también de ese modo efectos favorables tales como la supresión de la apoptosis ejercida por la neogenina unida a la RGMa.

Por tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una proteína de unión a RGMa que no inhibe la interacción RGMa/neogenina, pero que neutraliza la actividad de inhibición del crecimiento de las neuritas de la RGMa.

SOLUCIÓN AL PROBLEMA

Los inventores de la presente invención estudiaron intensamente con el fin de solucionar los problemas anteriores. Como resultado, los presentes inventores han conseguido obtener una proteína de unión a RGMa que no inhibe la unión entre la RGMa y la neogenina, pero que neutraliza la actividad de inhibición del crecimiento de las neuritas de la RGMa, y han encontrado que la proteína de unión a RGMa se puede usar como medicamento para enfermedades neurológicas o inmunológicas.

La presente invención es como se indica a continuación.

[1] Un anticuerpo anti-RGMa, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, donde la secuencia de aminoácidos de cada una de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (LCDR1), la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (LCDR2), la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (LCDR3), la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (HCDR1), la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (HCDR2) y la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (HCDR3) comprende lo siguiente:

LCDR1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO: 30 en el Listado de secuencias)

LCDR2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 31 en el Listado de secuencias)

LCDR3: QQLNTLP (SEQ ID NO: 32 en el Listado de secuencias)

HCDR1: DAWMD (SEQ ID NO: 33 en el Listado de secuencias)

HCDR2: EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID NO: 34 en el Listado de secuencias) y HCDR3:

RDGAY (SEQ ID NO: 35 en el Listado de secuencias);

o

LCDR1: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 36 en el Listado de secuencias)

LCDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 37 en el Listado de secuencias)

LCDR3: SQSTHVP (SEQ ID NO: 38 en el Listado de secuencias)

HCDR1: TSYYWN (SEQ ID NO: 39 en el Listado de secuencias)

HCDR2: YISYDGTNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 40 en el Listado de secuencias) y

HCDR3: SFG, y

donde en cada una de las secuencias CDR, se pueden sustituir, seleccionar y/o añadir uno o más aminoácidos.

[2] El anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito

en [1], donde la región variable de la cadena pesada (VH) comprende lo siguiente:

VH:EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKAN-NHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 41 en el Listado de secuencias) o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90 % con dicha secuencia de aminoácidos; y donde la región variable de la cadena ligera (VL) comprende lo siguiente:

VL:DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTL

TISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME (SEQ ID NO: 42 en el Listado de secuencias) o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90 % con dicha secuencia de aminoácidos.

[3] El anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en [1] o [2], donde el anticuerpo anti-RGMa es un anticuerpo humanizado.

[4] El anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en uno cualquiera de [1] a [3], donde el anticuerpo anti-RGMa comprende una región constante de IgG humana.

[5] Una molécula de ácido nucleico que codifica la porción de proteína del anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en uno cualquiera de [1] a [4].

[6] La molécula de ácido nucleico descrita en [5], donde cada una de las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de VH y VL es una secuencia de nucleótidos que comprende:

VH:

gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcagatccctgagactgtcctgtaccgcctccggct

tcaccttctccgacgcctggatggattgggtgcgacaggctcctggcaagggcctggaatgggtggccgagatccggtc

caaggccaacaaccacgccacctactacgccgagtctgtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtcc

atcgtgtacctgcagatgaactccctgcggaccgaggacaccgccctgtactactgcaccagaagggacggcgcctact

ggggcaagggcaccacagtgacagtgtcctcc (SEQ ID NO: 43 en el Listado de Secuencias), y

VL:

gacatccagatgacccagtccccctcctccgtgtctgcttccgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcgggcctccca

ggacatctcctcctacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactacacctcccggc

tgcactccggcgtgccctctagattttccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgcagcccg

aggacttcgcctcctacttctgtcagcagctgaacaccctgccctggacctttggcggaggcaccaaggtggaaatggaa

(SEQ ID NO: 44 en el Listado de Secuencias).

[7] Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en [5] o [6].

[8] Una célula huésped que contiene el vector recombinante descrito en [7].

[9] Un procedimiento para producir el anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en uno cualquiera de [1] a [4], que comprende el procedimiento una etapa de cultivar la célula huésped descrita en [8].

[10] Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo descrito en uno cualquiera de [1] a [4].

[11] La composición farmacéutica descrita en [10] para uso en la prevención, el tratamiento, o la prevención de recaídas de enfermedades neurológicas o inmunológicas.

[12] La composición farmacéutica descrita en [11], donde las enfermedades neurológicas se seleccionan del grupo que consiste en esclerosis lateral amiotrófica, lesión del plexo braquial, daño cerebral (que incluye lesión cerebral traumática), parálisis cerebral, síndrome de Guillain-Barre, leucodistrofia cerebral, esclerosis múltiple (que incluye esclerosis múltiple recurrente-remitente, esclerosis múltiple progresiva primaria, esclerosis múltiple progresiva secundaria), neuromielitis óptica, síndrome pospoliomielítico, espina bífida, lesión de la médula espinal, atrofia muscular espinal, neoplasia espinal, mielitis transversa, demencia (que incluye demencia senil, deterioro cognitivo leve, enfermedad de Alzheimer, demencia asociada a enfermedad de Alzheimer), enfermedad de Huntington, disquinesia tardía, manía, enfermedad de Parkinson, síndrome de Steele-Richardson, síndrome de Down, miastenia grave, neurotrauma (que incluye traumatismo del nervio óptico), amiloidosis vascular, hemorragia cerebral asociada a amiloidosis, infarto cerebral, cerebritis, estado confusional agudo, glaucoma, esquizofrenia y degeneración de la capa de fibras del nervio retiniano (que incluye retinopatía diabética, neuropatía óptica isquémica, retinosquisis ligada al cromosoma X, neuropatía óptica inducida por fármacos, distrofia retiniana, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades oculares caracterizadas por drusas del disco óptico, enfermedades oculares caracterizadas por determinante genético para la degeneración de los fotorreceptores, distrofia de conos y bastones autosómica recesiva, trastorno mitocondrial asociado a neuropatía óptica).

[13] La composición farmacéutica descrita en [11], donde las enfermedades inmunológicas se seleccionan del grupo que consiste en esclerosis múltiple (que incluye esclerosis múltiple recurrente-remitente, esclerosis múltiple progresiva primaria, esclerosis múltiple progresiva secundaria), neuromielitis óptica, psoriasis, artritis (que incluye artritis reumatoide osteoartritis, artritis psoriásica), síndrome de Guillain-Barre, enfermedad neuro-Behcet, anemia perniciosa, diabetes mellitus de tipo I (dependiente de insulina), lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica autoinmune, asma, polinosis, dermatitis atópica, glomerulonefritis, miastenia grave, enfermedad de Hashimoto y sarcoidosis.

[14] La composición farmacéutica descrita en [11], donde las enfermedades neurológicas o inmunológicas se seleccionan del grupo que consiste en lesión de la médula espinal, neurotrauma (que incluye traumatismo del nervio óptico) y esclerosis múltiple, que incluye esclerosis múltiple recurrente-remitente, esclerosis múltiple progresiva primaria, esclerosis múltiple progresiva secundaria).

EFECTO VENTAJOSO DE LA INVENCIÓN

La proteína de unión a RGMa de la presente invención no inhibe la interacción entre la RGMa y la neogenina, siendo capaz de ese modo de mantener efectos tales como la inhibición de la apoptosis sobre las neuronas y similares ejercidos por la neogenina unida a la RGMa, teniendo así un efecto protector fuerte sobre las neuronas y pocos problemas de efectos secundarios asociados a la depleción neuronal. Además, el anticuerpo anti-RGMa humanizado de la presente invención es superior a los anticuerpos convencionales en propiedades tales como la unión a RGMa humana y la estabilidad térmica. Por lo tanto, el anticuerpo se puede usar como un medicamento para enfermedades neurológicas e inmunológicas que tiene una eficacia excelente y pocos efectos secundarios.

BREVE DESCRIPACIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 muestra un resultado de un ensayo de inhibición de la unión de RGMa-neogenina que usa un anticuerpo policlonal anti-RGMa (AF2459), un anticuerpo del ejemplo comparativo (r5F9) y anticuerpos de la presente invención (r70E4 y 116A3). La Fig. 2 muestra un resultado de un ensayo de inhibición de la unión de RGMa-BMP2 que usa una IgG de ratón de control y anticuerpos de la presente invención (B5.70E4 y B5.116A3).

La Fig. 3 muestra un resultado de un ensayo de estabilidad térmica para anticuerpos que usa un anticuerpo del ejemplo comparativo (rH5F9), un anticuerpo quimérico de la presente invención (r116A3C) y anticuerpos humanizados de la presente invención (HE/KA y HA/KC).

La Fig. 4 muestra un resultado de un ensayo de crecimiento de las neuritas que usa los anticuerpos de la presente invención (B5.70E4 (izquierda) y B5.116A3 (derecha)).

La Fig. 5 muestra un resultado de un ensayo de eficacia que usa una IgG de ratón de control (mo-IgG2bk) y los anticuerpos de la presente invención (r70E4 y r116A3) y que usa un modelo de rata de lesión de la médula espinal. Se presentan los resultados de los ensayos de eficacia en (A) un modelo de aplastamiento de la médula espinal y (B) un modelo de hemisección de la médula espinal.

La Fig. 6 muestra un resultado de un ensayo de eficacia para el anticuerpo de la presente invención (B5.116A3) que usa un modelo de ratón de esclerosis múltiple inducida por un péptido PLP^139-151. El lado izquierdo muestra las puntuaciones EAE, el lado derecho muestra los cambios en el peso corporal, y las partes superior e inferior muestran los resultados cuando se administraron los anticuerpos de ensayo después de 7 y 10 días y después de 18 y 21 días, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES

Con el fin de facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se explicarán los términos usados en la presente invención.

RGMa

La RGMa es una proteína inhibidora del crecimiento de las neuritas en el sistema nervioso central y la proteína RGMa humana se biosintetiza como una proteína precursora que comprende 450 aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 en el Listado de secuencias. El péptido señal Met 1 a Pro 47 presente en el extremo N-terminal (que se refiere al péptido desde el primer residuo de metionina hasta el 47° residuo de prolina desde el lado N-terminal, descrito de forma similar en lo sucesivo) se elimina, el enlace peptídico entre Asp 168 y Pro 169 se escinde, y el péptido del extremo C-terminal Arg 423 a Cys 450 se elimina y, simultáneamente, se añade un anclaje GPI al grupo carboxilo C-terminal de Gly 422 que se ha convertido en el extremo C-terminal. Una proteína RGMa humana se expresa sobre una membrana celular a través del anclaje GPI como una proteína madura en la que el dominio N-terminal (Cys 48 a Asp 168) y el dominio C-terminal (Pro 169 a Ala 424) están unidos mediante un enlace disulfuro. Una proteína precursora de la RGMa de ratón comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 en el Listado de secuencias y una proteína precursora de la RGMa de rata comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 en el Listado de secuencias. Como se eliminan sus péptidos C-terminales, las proteínas maduras de las mismas tienen las mismas secuencias de aminoácidos. En la presente invención, RGMa se puede referir indistintamente a una proteína precursora, una proteína madura o un fragmento activo de la misma, o puede ser un derivado o variante de la misma, siempre y cuando actúe mediante unión a la neogenina como se describe más adelante. La RGMa puede ser RGMa humana o RGMa obtenida de otros organismos, pero la RGMa humana es preferida.

Neogenina

La neogenina se expresa en, por ejemplo, las neuronas nerviosas centrales y actúa como uno de los receptores de la RGMa. Como se muestra en la SEQ ID NO: 10 en el Listado de secuencias, la proteína neogenina humana comprende 1461 aminoácidos y se expresa como una proteína de membrana madura después de la eliminación del péptido señal Met 1 a Ala 33. En la presente invención, neogenina se puede referir indistintamente a una proteína precursora, una proteína madura o un fragmento de unión a RGMa, o puede ser un derivado o variante de la misma, siempre y cuando se una a la RGMa. La neogenina puede ser neogenina humana o neogenina obtenida de otros organismos, pero la neogenina humana es preferida.

Neutralización

El término «neutralización», como se emplea en esta memoria, se refiere a una acción a través de la que se puede producir la unión a una diana de interés y la inhibición de cualquier función de la diana. En otras palabras, la expresión «que neutraliza la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa» significa que una proteína de unión a RGMa se une a la RGMa, inhibiendo de ese modo la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa. La actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas se puede evaluar mediante uno o más de varios ensayos in vitro o in vivo conocidos en la técnica, y se puede evaluar mediante, por ejemplo, el ensayo de inhibición del crecimiento de las neuritas descrito en esta memoria.

Aislada

El término «aislada», tal como en proteína de unión a RGMa aislada, significa que está identificada y separada y/o recuperada de los componentes presentes en su estado natural. Las impurezas presentes en el estado natural son sustancias que pueden interferir con el uso diagnóstico o terapéutico del anticuerpo, lo que incluye enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos y no proteináceos. Generalmente, el aislamiento de la proteína de unión a RGMa o similares se puede conseguir mediante al menos una etapa de purificación. La proteína de unión a RGMa purificada mediante al menos una etapa de purificación se puede denominar «proteína de unión a RGMa aislada». Proteína de unión a RGMa

Como se emplea en esta memoria, el término «proteína de unión a RGMa» se refiere a una molécula que comprende una proteína que se une a la RGMa. Los ejemplos de proteínas de unión a RGMa incluyen anticuerpos anti-RGMa y fragmentos de unión al antígeno de los mismos; proteínas de andamiaje de unión a RGMa; proteínas solubles de receptor de la RGMa tales como el dominio extracelular de la neogenina; y proteínas de fusión de las mismas. El término «proteína de andamiaje de unión a RGMa» se refiere a una proteína que realiza la función de unirse a la RGMa mediante la introducción de mutaciones en el dominio de Kunitz de un inhibidor de la serina proteasa, el dominio extracelular de la fibronectina, anquirina y lipocalina humanas o similares. El término «proteína de fusión» se refiere a proteínas de unión a RGMa unidas química o genéticamente a moléculas funcionales distintas de la proteína de unión a RGMa de la presente invención tales como polímeros no peptídicos, tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radioactivas, toxinas, compuestos de bajo peso molecular, citoquinas, factores de crecimiento (p. ej., TGF-p, NGF, neurotrofina), albúmina, enzimas y otros anticuerpos.

Anticuerpo humano

El término «anticuerpo humano» se refiere a un anticuerpo en el que ambas cadenas ligera y pesada se obtienen de inmunoglobulina humana. En función de la diferencia en las regiones constantes de las cadenas pesadas, los anticuerpos humanos incluyen la IgG que tiene cadenas pesadas y (que incluye IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM que tiene cadenas pesadas p, IgA que tiene cadenas pesadas a (que incluye IgA1 e IgA2), IgD que tiene cadenas pesadas 8 o IgE que tiene cadenas pesadas £. Las cadenas ligeras, en principio, comprenden indistintamente cadenas k o cadenas A.

Anticuerpo humanizado

El término «anticuerpo humanizado» se refiere a un anticuerpo que comprende regiones variables que comprenden regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo obtenido de un animal no humano y regiones marco obtenidas de un anticuerpo humano, y regiones constantes obtenidas de un anticuerpo humano.

Anticuerpo quimérico

El término «anticuerpo quimérico» se refiere a un anticuerpo en el que la cadena ligera, la cadena pesada o ambas comprenden una región variable no obtenida de humanos y una región constante obtenida de humanos.

Anticuerpo anti-RGMa

Como se emplea en esta memoria, el término «anticuerpo anti-RGMa» se refiere a moléculas de inmunoglobulina que se une a la RGMa, o moléculas modificadas de las mismas. Las moléculas modificadas incluyen anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos modificados funcionalmente y anticuerpos conjugados.

Anticuerpo multiespecífico

El término «anticuerpo multiespecífico» se refiere a un anticuerpo asimétrico que comprende dos o más sitios independientes de reconocimiento del antígeno que tienen dos o más especificidades diferentes por el antígeno, lo que incluye anticuerpo biespecífico que tiene dos especificidades por el antígeno y anticuerpo triespecífico que tiene tres especificidades por el antígeno.

Anticuerpo modificado funcionalmente

Como se emplea en esta memoria, el término «anticuerpo modificado funcionalmente» se refiere a un anticuerpo en el que las funciones del anticuerpo distintas de la unión al antígeno, que incluyen la función de muerte celular, función de activación del complemento y función de prolongación de la semivida en suero, se modifican principalmente modificando la cadena de aminoácidos o azúcar de la región Fc del anticuerpo. Anticuerpo conjugado

Como se emplea en esta memoria, el término «anticuerpo conjugado» se refiere a un anticuerpo unido química o genéticamente a moléculas funcionales distintas del anticuerpo tales como polímeros no peptídicos, tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radioactivas, toxinas, compuestos de bajo peso molecular, factores de crecimiento (p. ej., TGF-p, NGF, neurotrofina), albúmina y enzimas.

Fragmento de unión al antígeno

Como se emplea en esta memoria, el término «fragmento de unión al antígeno» se refiere a una proteína que comprende una parte de un anticuerpo y puede unirse a un antígeno. Los ejemplos del fragmento de unión al antígeno incluyen F(ab')2, Fab', Fab, Fv (fragmento variable de anticuerpo), Fv unido mediante enlaces disulfuro, anticuerpos de cadena sencilla (scFv), y polímeros de los mismos. Además, el fragmento de unión al antígeno incluye fragmentos conjugados de unión al antígeno unidos química o genéticamente a moléculas funcionales distintas del anticuerpo anti-RGMa de la presente solicitud tales como polímeros no peptídicos, tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radioactivas, toxinas, compuestos de bajo peso molecular, citoquinas, factores de crecimiento (p. ej., TGF-p, NGF, neurotrofina), albúmina, enzimas y otros anticuerpos.

Región determinante de la complementariedad

El término «región determinante de la complementariedad (CDR)» se refiere a una región que forma un sitio de unión al antígeno en una región variable de una molécula de inmunoglobulina, que también se denomina región hipervariable, y se refiere particularmente a una porción en la que la secuencia de aminoácidos cambia enormemente para cada molécula de inmunoglobulina. Como CDR, las cadenas ligera y pesada tienen tres CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3 y HCDR1, HCDR2, HCDR3). En la presente solicitud, las Cd R de una molécula de inmunoglobulina se determinan según el sistema de numeración de Kabat (Kabat y col., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, EE. UU.).

Tanto por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos

«Tanto por ciento (%) de identidad» con respecto a la secuencia polipeptídica de referencia identificada, tal como la región variable, se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos de una secuencia polipeptídica de referencia particular, después de organizar las secuencias e introducir huecos según proceda con el fin de obtener el % de identidad máximo y suponiendo que las sustituciones no conservadoras se consideran parte de la identidad de secuencia. La alineación con fines de determinación del % de identidad se puede lograr usando diversos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, usando software de ordenador disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear las secuencias, lo que incluye todos los algoritmos necesarios para conseguir la alineación máxima a lo largo de la longitud total de las secuencias que se están comparando. Sin embargo, para los fines de esta memoria, los valores de % de identidad se obtienen usando el programa de ordenador de comparación de secuencias BLAST en alineaciones por pares.

En las situaciones donde se usa BLAST para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de una secuencia de aminoácidos dada A a una secuencia de aminoácidos dada B se calcula como se indica a continuación:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácidos calificados como concordancias idénticas por el programa de alineación de secuencias Blast en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se entenderá que, si la longitud de la secuencia de aminoácidos A es diferente de la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de A a B será diferente del % de identidad de B a A. Salvo que se indique de otro modo, todos los valores de % de identidad de esta memoria se obtienen usando el programa de ordenador BLAST como se mostró en el párrafo inmediatamente anterior.

Competititivo

Como se emplea en la presente memoria, el término «competitivo» con el anticuerpo anti-RGMa de la presente invención significa que, como se mide mediante resonancia de plasmón superficial (SPR), descrita en esta memoria, la unión entre el anticuerpo anti-RGMa de la presente invención y la RGMa se reduce con una diferencia significativa debido a la presencia de dicho anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

Proteína de unión a RGMa

La proteína de unión a RGMa descrita en esta memoria es una proteína de unión a RGMa aislada, que no inhibe la unión entre la RGMa y la neogenina, pero que neutraliza la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa.

Preferentemente, las proteínas RGMa son proteínas RGMa obtenidas de mamíferos. Por ejemplo, las proteínas RGMa humanas incluyen una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 en el Listado de secuencias, las proteínas RGMa de ratón incluyen una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 en el Listado de secuencias y las proteínas RGMa de rata incluyen una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 en el Listado de secuencias. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos donde uno o varios (preferentemente 1 a 20, más preferentemente 1 a 10, aún más preferentemente 1 a 5) aminoácidos en estas secuencias están sustituidos, delecionados, insertados y/o añadidos y que tiene sustancialmente la misma actividad que la proteína RGMa; o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 90 % o más (preferentemente 95 % o más) de identidad a la secuencia de aminoácidos también puede ser preferido.

Como se emplea en esta memoria, un polipéptido «que tiene sustancialmente la misma actividad que la proteína RGMa» incluye cualquier polipéptido siempre y cuando el polipéptido tenga acción inhibidora del crecimiento de las neuritas.

La sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservadora. Como se emplea en esta memoria, «sustitución conservadora» significa sustituir un residuo de aminoácido con otro residuo de aminoácido químicamente similar para no alterar sustancialmente la actividad del péptido. Por ejemplo, la sustitución de un residuo hidrófobo por otro residuo hidrófobo, sustitución de un residuo polar por otro residuo polar que tiene la misma carga eléctrica y similares están incluidas. Los ejemplos de aminoácidos funcionalmente similares con los que tal sustitución es posible incluyen, como aminoácidos no polares (hidrófobos), alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptófano, fenilalanina y metionina. Los ejemplos de aminoácidos polares (neutros) incluyen glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina y cisteína. Los ejemplos de aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, histidina y lisina. Los ejemplos de aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

La unión de la proteína de unión a RGMa descrita en esta memoria a la RGMa significa unión específica a la RGMa. Más preferida es una proteína de unión a RGMa que tiene una constante de disociación (Kd) baja para la RGMa humana, por ejemplo, de 10'8 M o menos, más preferentemente 10'9 M o menos, aún más preferentemente 10'10 M o menos como valor límite superior y, por ejemplo, sin limitación, de 10'14 M o más, más preferentemente 10'13 o más como valor límite inferior.

La proteína de unión a RGMa comprende un dominio N-terminal y un dominio C-terminal como proteína madura, pero tiene actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas con el dominio C-terminal solo. La proteína de unión a RGMa descrita en esta memoria de la presente invención se une preferentemente solo al dominio C-terminal de la RGMa para neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas. Más preferida es una proteína de unión a RGMa que tiene una constante de disociación (Kd) baja para el dominio C-terminal de la RGMa humana, por ejemplo, de 10 8 M o menos, más preferentemente 10'9 M o menos, aún más preferentemente 10'10 M o menos como valor límite superior y, por ejemplo, sin limitación, de 10'14 M o más, más preferentemente 10'13 o más como valor límite inferior.

La proteína de unión a RGMa no inhibe la unión entre la RGMa y la neogenina. Aquí, la expresión «no inhibe la unión entre la RGMa y la neogenina» significa que, en el sistema de unión de la RGMa y la neogenina presentado en los Ejemplos descritos más adelante, incluso cuando la concentración de proteína de unión a RGMa aumenta, la unión entre la RGMa y la neogenina no se reduce sustancialmente. Por ejemplo, en el caso donde la proteína de unión a RGMa se añade al sistema de unión de la RGMa y la neogenina y su concentración aumenta, si la concentración de la proteína de unión a RGMa que presenta CI50 no es inferior a 10 pg/mL, más preferentemente no inferior a 50 pg/mL, lo más preferentemente no inferior a 100 pg/mL, se puede afirmar que la proteína de unión a RGMa no inhibe la unión entre la RGMa y la neogenina.

La neogenina usada para el ensayo de unión con RGMa es preferentemente neogenina del mismo tipo que la RGMa. En otras palabras, es preferible que se use neogenina de ratón o humana para RGMa de ratón o humana, respectivamente. Un ejemplo de la neogenina humana incluye una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 en el Listado de secuencias. Sin embargo, siempre y cuando sea capaz de unirse a la RGMa, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos con 90 % o más (preferentemente 95 % o más) de identidad con la SEQ ID NO: 10 en el Listado de secuencias puede ser preferida.

La proteína de unión a RGMa neutraliza la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa. La actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas se puede evaluar mediante un ensayo de crecimiento de las neuritas presentado en los Ejemplos descritos más adelante. La adición de RGMa inhibe el crecimiento de las neuritas, pero la adición de proteína de unión a RGMa impide la inhibición del crecimiento de las neuritas por la RGMa. La proteína de unión a RGMa de la presente invención puede neutralizar la inhibición del crecimiento de las neuritas mediante adición de RGMa en 50 % o más, más preferentemente en 80 % o más y lo más preferentemente en 90 % o más.

Como las secuencias de aminoácidos de las proteínas RGMa varían en función de la especie animal, también hay diferencias en la secuencia de aminoácidos entre la RGMa humana representada por la SEQ ID NO: 1 en el Listado de secuencias, la RGMa de ratón representada por la SEQ ID NO: 2 en el Listado de secuencias y la RGMa de rata representada por la SEQ ID NO: 3 en el Listado de secuencias. Como generalmente se usan roedores tales como ratones y ratas como materiales experimentales en los ensayos farmacológicos y de seguridad de preparaciones de proteínas tales como las preparaciones de antibióticos, la proteína de unión a RGMa de la presente invención se une preferentemente a RGMa de ratón y/o rata, y son más preferidas las que tienen una Kd baja para la RGMa de ratón y/o rata. Las proteínas de unión a RGMa cuya Kd tiene el límite superior de, por ejemplo, 5 x 10-7 M o menos, más preferentemente 10-8 M o menos, aún más preferentemente 10-9 M o menos, y el valor del límite inferior de, por ejemplo, sin limitación, 10-12 M o más, más preferentemente 10-11 o más, están incluidas.

La proteína de unión a RGMa es preferentemente excelente en cuanto a estabilidad térmica. La estabilidad térmica se puede evaluar mediante una reducción en la unión con la RGMa mediante tratamiento térmico, y la proteína de unión a RGMa de la presente invención es preferentemente estable incluso mediante tratamiento térmico a 60 °C o superior, más preferentemente incluso mediante tratamiento térmico a 65 °C o superior, lo más preferentemente incluso mediante tratamiento térmico a 70 °C o superior.

El sitio de unión cuando la proteína de unión a RGMa de la presente invención se une a la RGMa no está particularmente limitado. Por ejemplo, en la RGMa humana, la unión a uno o más de los péptidos siguientes es preferida: EEVVNAVEDWDSq G (SEQ ID NO: 26 en el Listado de secuencias) (números de aminoácidos 298-311 de la SEQ ID NO: 1 en el Listado de secuencias), NQQIDFQAFHTNAE (SEQ iD NO: 27 en el Listado de secuencias) (números de aminoácidos 322-335 de la SEQ ID NO: 1 en el Listado de secuencias), PTAPETFPYET (SEQ ID NO: 28 en el Listado de secuencias) (números de aminoácidos 349-359 de la SEQ ID NO: 1 en el Listado de secuencias), KLPVEDLYYQA (SEQ ID NO: 29 en el Listado de secuencias) (números de aminoácidos 367-377 de la SEQ ID NO: 1 en el Listado de secuencias). La proteína de unión a RGMa de la presente invención se une más preferentemente a las SEQ ID NO: 26 y 27 del listado de secuencias, más preferentemente a las SEQ ID NO: 26 y 27 del listado de secuencias y a las SEQ ID NO: 28 o 29 del listado de secuencias.

Los ejemplos específicos de proteína de unión a RGMa incluyen anticuerpo anti-RGMa, proteína de andamiaje de unión a RGMa y proteínas de fusión de las mismas.

Anticuerpo anti-RGMa

El anticuerpo anti-RGMa de la presente invención incluye anticuerpos policlonales o monoclonales obtenidos usando la proteína RGMa o un fragmento parcial de la misma (por ejemplo, un fragmento que contiene una o más de las SEQ ID NO: 26 a 29 en el listado de secuencias anterior) como antígeno e inmunizando mamíferos tales como ratones con los antígenos; anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados producidos usando tecnología de recombinación genética, anticuerpos humanos producidos usando, por ejemplo, animales transgénicos productores de anticuerpos humanos; y similares. Cuando el anticuerpo de la presente invención se administra como producto farmacéutico a humanos, es preferible un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano desde el punto de vista de los efectos secundarios.

Los antígenos se pueden usar directamente para la inmunización o se pueden usar como un complejo con una proteína transportadora. Para preparar un complejo de un antígeno y una proteína transportadora, se pueden usar agentes condensadores tales como glutaraldehído, carbodiimida y éster activo de maleimida. Los ejemplos de proteína transportadora incluyen albúmina sérica bovina, tiroglobulina, hemocianina y KLH.

Los ejemplos de mamíferos que se van a inmunizar incluyen ratones, ratas, hámsteres, cobayas, conejos, gatos, perros, cerdos, cabras, caballo y ganado bovino, y los procedimientos de inoculación incluyen la administración subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. En la administración, los antígenos se pueden administrar mezclados con adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund, y la administración normalmente se lleva a cabo una vez cada 2 a 5 semanas. Las células productoras de anticuerpo obtenidas del bazo o los nódulos linfáticos de los animales inmunizados se fusionan con células de mieloma y se aíslan como hibridomas. Como células de mieloma, se usan las obtenidas de un mamífero tal como ratón, rata o humano.

Anticuerpo policlonal

Los anticuerpos policlonales se pueden obtener mediante procedimientos de producción existentes. Es decir, los anticuerpos policlonales se pueden obtener a partir de suero obtenido de animales sometidos a inmunización, por ejemplo, inmunizando un mamífero como se describió anteriormente con un antígeno como se describió anteriormente junto con adyuvante de Freund, según proceda.

Anticuerpo monoclonal

Específicamente, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener como se indica a continuación. Es decir, se usa un antígeno como se describió anteriormente como inmunógeno, y el inmunógeno se inyecta o trasplanta una o varias veces en combinación con adyuvante de Freund, si procede, a un mamífero como se describió anteriormente subcutáneamente, intramuscularmente, intravenosamente, en una almohadilla plantar o intraperitonealmente para la inmunización. Generalmente, la inmunización se realiza 1 a 4 veces cada 1 a 14 días a partir de la inmunización inicial, y las células productoras de anticuerpo se obtienen del mamífero inmunizado a partir de 1 a 5 días después de la inmunización final.

Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica (por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))).

La preparación de «hibridomas» que secretan anticuerpos monoclonales se puede llevar a cabo según el procedimiento de Kohler and Milstein y col. (Nature, 256, 495, 1975) y procedimientos similares al mismo. Es decir, los hibridomas se preparan fusionando una célula productora de anticuerpo contenida en un bazo o similares obtenidos de un mamífero inmunizado con una célula de mieloma que no tiene capacidad productora de autoanticuerpo obtenida de un mamífero, preferentemente ratón, rata o humano.

Los ejemplos de células de mieloma que se pueden usar para la fusión celular incluyen mieloma obtenido de ratón P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/O, Sp2), PAI, F0 y BW5147, mieloma obtenido de rata 210RCY3-Ag.2.3., y mieloma obtenido de humano U-266AR1, g M1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 y CEM-T15.

Los ejemplos de acelerantes de la fusión incluyen polietilenglicol y similares. En general, las células productoras de anticuerpo y las células de mieloma en una relación en número de normalmente aproximadamente 1:1 a 10:1 se permite que reaccionen, usando polietilenglicol (peso molecular promedio: 1000 a 4000) en una concentración de aproximadamente 20 a 50 %, a una temperatura de 20 a 40 °C, preferentemente 30 a 37 °C durante aproximadamente 1 a 10 minutos, mediante lo cual se puede llevar a cabo la fusión celular.

El cribado de clones de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales se puede llevar a cabo cultivando los hibridomas, por ejemplo, en placas de microtitulación y midiendo la reactividad de los sobrenadantes de cultivo en los pocillos al inmunógeno mediante procedimientos inmunoquímicos tales como ELISA.

En el cribado de los hibridomas productores de anticuerpo, además del ensayo de unión con proteína RGMa, también se evalúa si el anticuerpo no inhibe la unión entre la proteína RGMa y la neogenina y si el anticuerpo neutraliza la función de la proteína RGMa (actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas). Estos procedimientos de cribado permiten la selección del anticuerpo anti-RGMa de la presente invención.

Los clones se pueden obtener además a partir de los pocillos que contienen hibridomas que producen los anticuerpos deseados mediante clonación por dilución limitante. La selección y el cultivo de hibridomas normalmente se llevan a cabo en un medio de cultivo celular animal que contiene 10 a 20 % de suero fetal bovino suplementado con HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina).

Los anticuerpos monoclonales de hibridomas se pueden producir cultivando los hibridomas in vitro o haciéndolos crecer in vivo, por ejemplo, en fluido ascítico de mamíferos tales como ratones y ratas y aislando los anticuerpos monoclonales del sobrenadante del cultivo o el fluido ascítico del mamífero resultantes.

Cuando se cultivan in vitro, los hibridomas se hacen crecer, mantienen y almacenan según diversas condiciones tales como las características de, y el procedimiento de cultivo para, la especie celular que se va a cultivar, y se puede usar un medio nutritivo adecuado para producir anticuerpos monoclonales en el sobrenadante del cultivo.

Los ejemplos de medios básicos incluyen un medio con bajo contenido en calcio tal como medio F12 de Ham, medio MCDB 153 o medio MEM con bajo contenido en calcio y un medio con alto contenido en calcio tal como medio MCDB 104, medio MEM, medio D-MEM, medio RPMI 1640, medio ASF 104 o medio RD. El medio básico puede contener, por ejemplo, suero, hormonas, citoquinas y/o diversas sustancias inorgánicas u orgánicas según el fin.

Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar, por ejemplo, sometiendo el sobrenadante del cultivo o el fluido ascítico antes mencionados a sulfato amónico saturado, mediante el procedimiento de precipitación de euglobulina, procedimiento del ácido caproico, procedimiento del ácido caprílico, cromatografía de intercambio iónico (tal como DEAE o DE52) o cromatografía en columna de afinidad tal como cromatografía en columna de antiinmunoglobulina o columna de proteína A. Específicamente, la purificación del anticuerpo monoclonal se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento conocido como el procedimiento de purificación de inmunoglobulina, y se puede conseguir fácilmente por medios tales como fraccionamiento con sulfato amónico, fraccionamiento con PEG, fraccionamiento con etanol y cromatografía de afinidad que utiliza un intercambiador de aniones y que usa además proteínas RGMa.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden obtener mediante un procedimiento de presentación en fago. En el procedimiento de presentación en fago, los fagos seleccionados de una biblioteca de anticuerpos de fago opcional se criban usando el inmunógeno deseado y se seleccionan los fagos que tienen la capacidad de unión al inmunógeno deseada. A continuación, se aísla o secuencia la secuencia correspondiente al anticuerpo contenido en el fago y se construye un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o dominio de unión al antígeno con base en la información de la secuencia aislada o la secuencia determinada. Por último, los anticuerpos monoclonales se pueden producir cultivando líneas celulares transfectadas con tales vectores de expresión. Se puede usar una biblioteca de anticuerpos humanos como biblioteca de anticuerpos de fago para generar anticuerpos humanos que tienen las propiedades de unión deseadas.

Como proteína de andamiaje, por ejemplo, se utiliza un dominio de Kunitz de inhibidor de la serina proteasa humana y un dominio extracelular de fibronectina humana, y la secuencia de un sitio de unión a la diana en el andamiaje se puede modificar para generar una proteína de andamiaje que se une a la RGMa (Clifford Mintz y col., BioProcess International, 2013, Vol.11(2), páginas 40-48).

Las proteínas de fusión incluyen proteínas de unión a RGMa unidas química o genéticamente a moléculas funcionales distintas de la proteína de unión a RGMa de la presente solicitud tales como polímeros no peptídicos, tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radioactivas, toxinas, compuestos de bajo peso molecular, citoquinas, factores de crecimiento (p. ej., TGF-p, NGF, neurotrofina), albúmina, enzimas y otros anticuerpos.

Cuando se une PEG como molécula funcional, se puede usar PEG que tiene un peso molecular de, sin limitación, 2000 a 100000 Da, más preferentemente 10000 a 50000 Da, que puede ser lineal o ramificado. Usando, por ejemplo, un grupo activo NHS, el PEG se puede unir, por ejemplo, a grupos amino N-terminales de aminoácidos de la proteína de unión a RGMa.

En el caso de usar una sustancia radioactiva como molécula funcional, se usa, por ejemplo, 131I, 125I, 9°Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu o 211At. Las sustancias radioactivas se pueden unir directamente a la proteína de unión a RGMa mediante, por ejemplo, el procedimiento de la cloramina-T.

Cuando se usa una toxina como molécula funcional, se usan, por ejemplo, toxinas bacterianas (p. ej., toxina diftérica), fitotoxinas (p. ej., ricina), toxinas pequeñas (p. ej., geldanamicina), maitasinoides y caliqueamicina.

Cuando se usa un compuesto de bajo peso molecular como molécula funcional, se usa, por ejemplo, daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, mitomicina, neocarcinostatina, vindesina y colorantes fluorescentes tales como FITC.

Cuando se usa una enzima como molécula funcional, se usa, por ejemplo, luciferasa (p. ej., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana, patente de EE. UU. n.° 4737456), malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa (p. ej., peroxidasa de rábano picante (HRPO)), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasa (p. ej., glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasa heterocíclica (p. ej., uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa y microperoxidasa.

Los ejemplos de conectores usados para unir químicamente una toxina, un compuesto de bajo peso molecular o una enzima incluyen radicales divalentes (p. ej., alquileno, arileno, heteroarileno), una unidad repetitiva de un conector o alcoxi representado por -(CR2)nO(CR2)n-(donde R es un sustituyente opcional y n es un número entero positivo) (p. ej., polietilenoxi, PEG y polimetilenoxi) y alquilamino (p. ej., polietilenamino, Jeffamine™) y un éster y una amida de diácido (p. ej., succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida). Los procedimientos de modificación química para unir moléculas funcionales ya se han consolidado en este campo (D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998, T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer, 1998, Marcel Dekker Inc; Chari y col., Cancer Res., 1992 Vol 152:127; Liu y col., Proc Natl Acad Sci u SA., 1996 Vol 93:8681).

Una realización preferida de la presente invención es un anticuerpo quimérico. Como «anticuerpo quimérico», se ejemplifica un anticuerpo quimérico en el que la región variable es una región variable obtenida de una inmunoglobulina de un animal no humano (tal como ratón, rata, hámster o gallina) y la región constante es una región constante de inmunoglobulina humana. Un anticuerpo quimérico se puede preparar, por ejemplo, inmunizando un ratón con un antígeno, cortando una región variable que se une al antígeno del gen que codifica el anticuerpo monoclonal de ratón, y combinando la región variable con una región constante de un anticuerpo obtenido de médula ósea humana. La región constante obtenida de inmunoglobulina humana tiene una secuencia de aminoácidos única en función del isotipo, tal como IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgA (IgA1 e IgA2), IgD e IgE, pero la región constante del anticuerpo quimérico recombinante según la presente invención puede ser una región constante de inmunoglobulina humana que pertenezca a cualquier isotipo. La región constante es preferentemente una región constante de IgG humana. Un vector de expresión se puede preparar usando el gen del anticuerpo quimérico así preparado. Las células huésped se transforman con el vector de expresión para obtener células transformantes productoras de anticuerpo quimérico y, a continuación, la células transformadas se cultivan para obtener el anticuerpo quimérico deseado a partir del sobrenadante del cultivo.

Otra realización preferida de la presente invención es un anticuerpo humanizado. El «anticuerpo humanizado» en la presente invención es un anticuerpo obtenido injertando solo la secuencia de ADN del sitio de unión al antígeno (CDR, región determinante de la complementariedad) de un anticuerpo de un animal no humano tal como un ratón a un gen de anticuerpo humano (injerto de CDR). Los anticuerpos humanizados se pueden preparar consultando los procedimientos descritos en, por ejemplo, la solicitud de patente PCT japonesa traducida puesta a disposición del público n.° Hei 4-506458 y la patente japonesa n.° 2912618. Específicamente, un anticuerpo humanizado se considera caracterizado porque parte de, o todas, las CDR son CDR obtenidas de anticuerpos monoclonales de mamíferos no humanos (tales como ratón, rata y hámster), las regiones marco de la región variable son regiones marco de regiones variables obtenidas de inmunoglobulina humana, y las regiones constantes son regiones constantes obtenidas de inmunoglobulina humana.

El anticuerpo humanizado de la presente invención se puede producir, por ejemplo, como se indica a continuación, pero cabe mencionar que el procedimiento de producción no se limita al mismo.

Por ejemplo, un anticuerpo humanizado recombinante obtenido de un anticuerpo monoclonal de ratón se puede producir mediante ingeniería genética consultando las solicitudes de patente PCT japonesas traducidas puestas a disposición del público n.° Hei 4-506458 y Sho 62-296890. Es decir, el ADN que codifica la porción CDR de la cadena pesada de ratón y el ADN que codifica la porción CDR de la cadena ligera de ratón se aíslan a partir de hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal de ratón, y un gen de la cadena pesada humana que codifica la región completa distinta de la CDR de la cadena pesada humana y un gen de la cadena ligera humana que codifica la región completa distinta de la CDR de la cadena ligera humana se aíslan a partir de un gen de inmunoglobulina humana.

El gen de la cadena pesada humana al que se injerta el ADN aislado que codifica la porción CDR de la cadena pesada de ratón se introduce en un vector de expresión apropiado para que la expresión del mismo sea posible. De forma similar, el gen de la cadena ligera humana al que se injerta el ADN que codifica la porción CDR de la cadena ligera de ratón se introduce en otro vector de expresión apropiado para que la expresión del mismo sea posible. Alternativamente, los genes de la cadena pesada y ligera humanas a los que se injerta la CDR de ratón se pueden introducir en el mismo vector de expresión para que la expresión de los mismos sea posible. Las células huésped se transforman con el vector de expresión así preparado para obtener células transformantes productoras de anticuerpo humanizado y, a continuación, las células transformadas se cultivan para obtener el anticuerpo humanizado deseado a partir del sobrenadante del cultivo.

Otra realización preferida de la presente invención es un anticuerpo humano. Un anticuerpo humano se refiere a un anticuerpo en el que todas las regiones que incluyen regiones variables de la cadena pesada y regiones constantes de la cadena pesada que constituyen la inmunoglobulina se obtienen de genes que codifican inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanos se pueden preparar introduciendo genes de anticuerpo humano en ratones. Los anticuerpos humanos se pueden producir de la misma forma que en el procedimiento antes mencionado para preparar anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales, específicamente, por ejemplo, inmunizando un animal transgénico preparado integrando al menos genes de inmunoglobulina humana en un locus genético de un mamífero distinto a un humano tal como un ratón.

Por ejemplo, los ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos se pueden preparar según los procedimientos descritos en, por ejemplo, Nature Genetics, Vol. 7, páginas 13-21, 1994; Nature Genetics, Vol. 15, páginas 146-156, 1997; las solicitudes de patente PCT japonesas traducidas puestas a disposición del público n.° Hei 4-504365 y Hei 7-509137; WO 94/25585; Nature, Vol. 368, páginas 856-859, 1994; y la solicitud de patente PCT japonesa traducida puesta a disposición del público n.° Hei 6-500233. Los ejemplos específicos de los ratones transgénicos incluyen el ratón HuMab™ (Medarex, Princeton NJ), ratón KMTM (Kirin Pharma Company, Japón) y el ratón KM (FCyRIIb-KO).

Los ejemplos específicos del anticuerpo monoclonal de la presente invención incluyen aquellos en los que las CDR en la región variable de la cadena pesada comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (HCDR 1), 34 (HCDR 2) y 35 (HCDR 3) en el Listado de secuencias y en los que las CDR de la región variable de la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de Se Q ID NO: 30 (LCDR 1), 31 (LCDR 2) y 32 (LCDR 3) en el Listado de secuencias. Se pueden sustituir de uno a varios aminoácidos en una o más de las CDR siempre y cuando se mantengan las propiedades del anticuerpo de la presente invención de tener la capacidad de unirse a la RGMa, no inhibir la unión entre la RGMa y la neogenina y neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa. De uno a varios significa, por ejemplo, uno o dos. La sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservadora con el fin de mantener las propiedades del anticuerpo de la presente invención. Mantener las propiedades del anticuerpo significa que estas propiedades se mantienen en la misma medida, por ejemplo, 80 % 0 más, preferentemente 90 % o más, más preferentemente 95 % o más en comparación con las propiedades antes de las modificaciones de la secuencia de aminoácidos de la CDR. El mantenimiento también incluye mejora.

La región distinta de la CDR no está particularmente limitada siempre y cuando sea una secuencia que pueda mantener la estructura como anticuerpo y ejercer su función, y puede ser cualquiera de las secuencias obtenidas de ratón, humano y otros mamíferos, secuencias quiméricas de las mismas, y secuencias artificiales. En el caso de comprender una región constante, las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes en la cadena pesada y la cadena ligera se ejemplifican mediante las descritas en Nucleic Acids Research vol. 14, página 1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol. 257, página 1516, 1982 y Cell vol. 22, página 197, 1980.

Los ejemplos de anticuerpos de ratón que tienen estas CDR incluyen los anticuerpos en los que la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 en el Listado de secuencias y en los que la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 en el Listado de secuencias. En estas secuencias de aminoácidos, puede haber sustitución, deleción, adición o inserción de uno o varios (1 a 20, 1 a 10 o 1 a 5) aminoácidos siempre y cuando se mantengan las propiedades del anticuerpo de tener la capacidad de unirse a la RGMa, no inhibir la unión entre la RGMa y la neogenina y neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa. Tal sustitución, deleción o adición se puede introducir en las CDR, pero preferentemente se introduce en una región distinta de las CDR. La sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservadora con el fin de mantener las propiedades del anticuerpo de la presente invención.

Los anticuerpos quiméricos de ratón/humano en los que las regiones constantes en el anticuerpo de ratón antes mencionado se obtienen de humanos también están incluidos. Un ejemplo de tales anticuerpos quiméricos de ratón/humano es un anticuerpo en el que la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 en el Listado de secuencias (la región variable se prolonga de 1 a 107) y en el que la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 en el Listado de secuencias (la región variable se prolonga de 1 a 116). En estas secuencias de aminoácidos, puede haber sustitución, deleción, adición o inserción de uno o varios (1 a 20, 1 a 10 o 1 a 5) aminoácidos siempre y cuando se mantengan las propiedades del anticuerpo de tener la capacidad de unirse a la RGMa, no inhibir la unión entre la RGMa y la neogenina y neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa. Tal sustitución, deleción o adición se puede introducir en las CDR, pero preferentemente se introduce en una región distinta de las CDR. La sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservadora con el fin de mantener las propiedades del anticuerpo de la presente invención.

Además, se ejemplifican anticuerpos humanizados en los que la región distinta de las CDR se obtiene de humanos. Un ejemplo de tales anticuerpos humanizados es un anticuerpo en el que la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 11 a 18 (la región variable es hasta el 116° residuo sobre el lado N-terminal) y en el que la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 19-25 en el Listado de secuencias (la región variable se prolonga del residuo 1° al 107° sobre el lado N-terminal).

En las secuencias de aminoácidos del anticuerpo humanizado (cadena pesada: SEQ ID NO: 11-18 en el Listado de secuencias, cadena ligera: SEQ ID NO: 19 a 25 en el Listado de secuencias), puede haber sustitución, deleción, adición o inserción de uno o varios (1 a 20, 1 a 10 o 1 a 5) aminoácidos siempre y cuando se mantengan las propiedades del anticuerpo de tener la capacidad de unirse a la RGMa, no inhibir la unión entre la RGMa y la neogenina y neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas. Tal sustitución, deleción o adición se puede introducir en las CDR, pero preferentemente se introduce en una región distinta de las CDR. La sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservadora con el fin de mantener las propiedades del anticuerpo de la presente invención.

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera pueden ser cualquier combinación de las mismas, pero es particularmente preferido un anticuerpo que tiene cadenas pesadas que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 en el Listado de secuencias y cadenas ligeras que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 en el Listado de secuencias. En la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 en el Listado de secuencias, la secuencia de aminoácidos que corresponde a la región variable de la cadena pesada se muestra en la SEQ ID NO: 41 en el Listado de secuencias y la secuencia de aminoácidos que corresponde a la región variable de la cadena ligera se muestra en la SEQ ID NO: 42 en el Listado de secuencias. Por tanto, el anticuerpo de la presente invención particularmente preferido es un anticuerpo en el que la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 en el Listado de secuencias y en el que la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 en el Listado de secuencias.

En estas secuencias de aminoácidos, puede haber sustitución, deleción, adición o inserción de uno o varios (1 a 20, 1 a 10 o 1 a 5) aminoácidos siempre y cuando se mantengan las propiedades del anticuerpo de tener la capacidad de unirse a la RGMa, no inhibir la unión entre la RGMa y la neogenina y neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa. Tal sustitución, deleción o adición se puede introducir en las CDR, pero preferentemente se introduce en una región distinta de las CDR. La sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservadora con el fin de mantener las propiedades del anticuerpo de la presente invención.

En la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la presente invención que comprende la sustitución, deleción o similares en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 y/o 42 en el Listado de secuencias como se describió anteriormente, la región variable de la cadena pesada es una secuencia de aminoácidos que tiene 90 % o más (más preferentemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) de identidad con la SEQ ID NO: 41 del listado de secuencias, y la región variable de la cadena ligera es una secuencia de aminoácidos que tiene 90 % o más (más preferentemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más) de identidad con la SEQ ID NO: 42 del listado de secuencias.

Otros ejemplos específicos del anticuerpo monoclonal de la presente invención incluyen aquellos en los que las CDR en la región variable de la cadena pesada comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 (HCDR 1), 40 (HCDR 2) y SFG (HCDR 3) en el Listado de secuencias y en los que las CDR en la región variable de la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 (LCDR 1), 37 (LCDR 2) y 38 (LCDR 3) en el Listado de secuencias. Se pueden sustituir de uno a varios aminoácidos en una o más de las CDR siempre y cuando se mantengan las propiedades del anticuerpo de la presente invención de tener la capacidad de unirse a la RGMa, no inhibir la unión entre la RGMa y la neogenina y neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa.

De uno a varios significa, por ejemplo, uno o dos. La sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservadora con el fin de mantener las propiedades del anticuerpo de la presente invención.

Los ejemplos de anticuerpos de ratón que tienen estas CDR incluyen los anticuerpos en los que la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 en el Listado de secuencias y en los que la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 en el Listado de secuencias. En estas secuencias de aminoácidos, puede haber sustitución, deleción, adición o inserción de uno o varios (1 a 20, 1 a 10 o 1 a 5) aminoácidos siempre y cuando se mantengan las propiedades del anticuerpo de tener la capacidad de unirse a la RGMa, no inhibir la unión entre la RGMa y la neogenina y neutralizar la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa. Tal sustitución, deleción o adición se puede introducir en las CDR, pero preferentemente se introduce en una región distinta de las CDR. La sustitución de aminoácidos es preferentemente una sustitución conservadora con el fin de mantener las propiedades del anticuerpo de la presente invención.

Como los anticuerpos de ratón antes mencionados, los anticuerpos quiméricos cuyas regiones constantes se obtienen de humanos también están incluidos. Los anticuerpos humanizados en los que la región distinta de las CDR se obtiene de humanos también están incluidos.

El anticuerpo anti-RGMa de la presente invención incluye anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos modificados funcionalmente y anticuerpos conjugados que tienen CDR que comprenden secuencias de aminoácidos específicas (por ejemplo, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 en el Listado de secuencias para LCDR1, SEQ ID NO: 31 en el Listado de secuencias para LCDR2, SEQ ID NO: 32 en el Listado de secuencias para LCDR3, SEQ ID NO: 33 en el Listado de secuencias para HCDR1, SEQ ID NO: 34 en el Listado de secuencias para HCDR2 y SEQ ID NO: 35 en el Listado de secuencias para HCDR3), o que tienen regiones variables que comprenden secuencias de aminoácidos específicas (por ejemplo, secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 en el Listado de secuencias para la región variable de la cadena pesada y SEQ ID NO: 42 para la región variable de la cadena ligera).

El propio anticuerpo anti-RGMa de la presente invención se puede unir a un anticuerpo que tiene otra especificidad de unión al antígeno distinta de la especificidad del anti-RGMa mediante técnicas de ingeniería genética para preparar anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos. Las técnicas de ingeniería genética ya se han consolidado en este campo. Por ejemplo, usando una técnica para DVD-lg en la que las regiones variables se conectan en serie (Wu y col., Nature Biotechnology 25(11), 1290 (2007)) o una técnica para ART-Ig en la que las cadenas ligeras de dos tipos de anticuerpos que se unen a antígenos diferentes se combinan modificando la región Fc de un anticuerpo (Kitazawa y col., Nature Medicine 18(10), 1570(2012), se pueden obtener los anticuerpos biespecíficos deseados. Otros antígenos distintos del RGMa incluyen, pero no se limitan a, factores que inhiben el crecimiento de las neuritas tales como Nogo, MAG, Omgp, CSPG, Sema 3A y Lingo-1, y moléculas inmunológicamente relacionadas tales como TNF-a, receptor de IL-6, CD3, CD20, integrina a4, BLys, linfopoyetina estromal tímica, IgE, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL- 13, IL- 17, IL-23 e IL-25.

Los anticuerpos modificados funcionalmente se ejemplifican como moléculas modificadas del anticuerpo anti-RGMa de la presente invención. Anticuerpo modificado funcionalmente significa un anticuerpo en el que funciones tales como la función de muerte celular, función de activación del complemento y función de prolongar la semivida se modifican principalmente modificando la región Fc o similares (Shitara, Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 2009, Vol. 129(1), página 3; Ishii y col., Nippon Yakubutsugaku Zasshi (Folia Pharmacologica Japonica), 2010, Vol. 136(5), página 280; Hashiguchi y col., The Journal of Japanese Biochemical Society, 2010, Vol. 82(8), página 710).

Los anticuerpos modificados funcionalmente del anticuerpo anti-RGMa se preparan mediante el procedimiento siguiente. Por ejemplo, cuando el anticuerpo anti-RGMa de la presente solicitud se produce usando, como células huésped, células CHO cuyo gen a1,6-fucosiltransferasa (FUT 8) ha sufrido una disrupción, se obtienen anticuerpos con un contenido reducido de cadena de azúcar fucosa y una función de muerte celular aumentada, y cuando el anticuerpo anti-RGMa de la presente solicitud se produce usando, como célula huésped, células CHO en las que se ha introducido el gen FUT8, se obtienen anticuerpos con una función de muerte celular baja (WO 2005/035586, WO 2002/31140 y WO 00/61739). La función de activación del complemento se puede regular modificando residuos de aminoácido en la región Fc (patente de EE. UU. n.°: 6737056, 7297775 y 7317091). La prolongación de la semivida en sangre se puede conseguir usando variantes de la región Fc con unión aumentada a FcRn, que es uno de los receptores Fc (Hashiguchi y col., The Journal of Japanese Biochemical Society, 2010, Vol. 82 (8), página 710). Estos anticuerpos modificados funcionalmente se pueden producir mediante técnicas de ingeniería genética.

Los anticuerpos conjugados se ejemplifican como moléculas modificadas del anticuerpo anti-RGMa de la presente invención. Los ejemplos del anticuerpo conjugado incluyen anticuerpos conjugados en los que los anticuerpos anti-RGMa se unen química o genéticamente a moléculas funcionales distintas del anticuerpo anti-RGMa de la presente solicitud tales como polímeros no peptídicos, tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radioactivas, toxinas, compuestos de bajo peso molecular, citoquinas, factores de crecimiento (p. ej., TGF-p, NGF, neurotrofina), albúmina, enzimas y otros anticuerpos.

Cuando se une PEG como molécula funcional, se puede usar PEG que tiene un peso molecular de, sin limitación, 2000 a 100000 Da, más preferentemente 10000 a 50000 Da, que puede ser lineal o ramificado. Usando, por ejemplo, un grupo activo NHS, el PEG se puede unir, por ejemplo, a grupos amino N-terminales de aminoácidos de anticuerpos.

En el caso de usar una sustancia radioactiva como molécula funcional, se usa, por ejemplo, ¹³¹I, ¹²⁵I, ^9°Y, ⁶⁴Cu, ⁹⁹Tc, ⁷⁷Lu o ²¹¹At. Las sustancias radioactivas se pueden unir directamente a anticuerpos mediante, por ejemplo, el procedimiento de la cloramina-T.

Los ejemplos de conectores usados para unir químicamente una toxina, un compuesto de bajo peso molecular o una enzima incluyen radicales divalentes (p. ej., alquileno, arileno, heteroarileno), una unidad repetitiva de un conector o alcoxi representado por -(CR²)ⁿO(CR²)n-(donde R es un sustituyente opcional y n es un número entero positivo) (p. ej., polietilenoxi, PEG y polimetilenoxi) y alquilamino (p. ej., polietilenamino, Jeffamine™) y un éster y una amida de diácido (p. ej., succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida). Los procedimientos de modificación química para unir moléculas funcionales ya se han consolidado en este campo (D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998, T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998, Marcel Dekker Inc; Chari y col., Cancer Res., 1992 Vol 152:127; Liu y col., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681).

«Fragmentos de unión al antígeno» de los anticuerpos en la presente invención significa una región parcial que tiene la propiedad de unión al antígeno de los anticuerpos antes descritos, lo que incluye, en particular, F(ab')², Fab', Fab, Fv (fragmento variable de anticuerpo), Fv conectado mediante enlaces disulfuro, anticuerpo de cadena sencilla (scFv) y polímeros de los mismos. Los fragmentos de unión al antígeno incluyen además fragmentos conjugados de unión al antígeno unidos química o genéticamente a moléculas funcionales distintas del anticuerpo anti-RGMa de la presente solicitud tales como polímeros no peptídicos, tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radioactivas, toxinas, compuestos de bajo peso molecular, citoquinas, factores de crecimiento (p. ej., TGF-p, NGF, neurotrofina), albúmina, enzimas y otros anticuerpos.

Como se emplea en esta memoria, «F(ab')2» y «Fab» significa fragmentos de anticuerpo que se producen tratando inmunoglobulinas con una pepsina o papaína proteasa y se generan mediante digestión en la dirección hacia arriba y hacia abajo del enlace disulfuro que existe entre dos cadenas pesadas en la región bisagra. Por ejemplo, el tratamiento de IgG con papaína puede provocar la escisión en la dirección hacia arriba del enlace disulfuro que existe entre dos cadenas pesadas en la región bisagra para producir dos fragmentos de anticuerpo homólogos que comprenden cada uno una cadena ligera que comprende una VL (región variable de la cadena ligera) y una CL (región constante de la cadena ligera) y un fragmento de la cadena pesada que comprende una VH (región variable de la cadena pesada) y una CHyI (región y1 dentro de la región constante de la cadena pesada) en los que el fragmento de la cadena ligera y la cadena pesada están conectados entre sí de forma distinta a un enlace disulfuro en el dominio C-terminal. Cada uno de los dos fragmentos de anticuerpo homólogos se denomina Fab. El tratamiento de IgG con pepsina puede provocar la escisión en la dirección hacia abajo del enlace disulfuro que existe entre dos cadenas pesadas en la región bisagra para producir un fragmento de anticuerpo ligeramente mayor que uno en el que los dos Fab están conectados entre sí en la región bisagra. Este fragmento de anticuerpo se denomina F(ab')².

Los fragmentos conjugados de unión al antígeno se ejemplifican como moléculas modificadas del fragmento de unión al antígeno del anticuerpo anti-RGMa de la presente invención. Los ejemplos del fragmento conjugado de unión al antígeno incluyen aquellos en los que una región parcial que tiene la propiedad de unión al antígeno del anticuerpo anti-RGMa se unen química o genéticamente a una molécula funcional distinta del anticuerpo anti-RGMa de la presente solicitud tales como polímeros no peptídicos, tales como polietilenglicol (PEG), sustancias radioactivas, toxinas, compuestos de bajo peso molecular, citoquinas, factores de crecimiento (p. ej., TGF-p, NGF, neurotrofina), albúmina, enzimas y otros anticuerpos.

Cuando se une PEG como molécula funcional, se puede usar PEG que tiene un peso molecular de, sin limitación, 2000 a 100000 Da, más preferentemente 10000 a 50000 Da, que puede ser lineal o ramificado. El PEG se puede unir, por ejemplo, al grupo amino N-terminal de una región parcial que tiene la propiedad de unión al antígeno del anticuerpo anti-RGMa usando, por ejemplo, un grupo activo NHS.

En el caso de usar una sustancia radioactiva como molécula funcional, se usa, por ejemplo, 131I, 125I, ^9°Y, 64Cu, 99Tc, 77Lu o 211At. Las sustancias radioactivas se pueden unir directamente a una región parcial que tiene la propiedad de unión al antígeno del anticuerpo anti-RGMa mediante, por ejemplo, el procedimiento de la cloramina-T.

Los ejemplos de conectores usados para unir químicamente una toxina, un compuesto de bajo peso molecular o una enzima incluyen radicales divalentes (p. ej., alquileno, arileno, heteroarileno), una unidad repetitiva de un conector o alcoxi representado por -(CR²)ⁿO(CR²)ⁿ-(donde R es un sustituyente opcional y n es un número entero positivo) (p. ej., polietilenoxi, PEG y polimetilenoxi) y alquilamino (p. ej., polietilenamino, Jeffamine™) y un éster y una amida de diácido (p. ej., succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida). Los procedimientos de modificación química para unir moléculas funcionales ya se han consolidado en este campo (D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998, T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998, Marcel Dekker Inc; Chari y col., Cancer Res., 1992 Vol 152:127; Liu y col., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681).

En el anticuerpo anti-RGMa que comprende CDR o regiones variables que tienen las secuencias de aminoácidos específicas de la presente invención, la región constante es preferentemente una región constante de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) humana para el mantenimiento con una semivida en sangre larga.

La presente invención también incluye un anticuerpo anti-RGMa que compite con el anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos de las CDR específicas como se describieron anteriormente por la unión a las proteínas RGMa, y fragmentos de unión al antígeno del mismo. El anticuerpo que compite con el anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos de las CDR específicas como se describieron anteriormente por la unión a las proteínas RGMa incluye epítopos en las regiones seleccionadas entre Glu 298 a Gly 311, Asn 322 a Glu 335, Lys 367 a Ala 377 y Pro 349 a Thr 359.

El anticuerpo se puede obtener (cribar) o evaluar permitiendo que el anticuerpo coexista en el sistema de unión del anticuerpo que tiene las secuencias CDR como se describieron anteriormente y proteínas RGMa. Por ejemplo, el anticuerpo se puede obtener mediante cribado usando el procedimiento de resonancia de plasmón superficial (SPR).

La proteína RGMa humana biotinilada (4 pg/ml) como ligando se carga sobre un chip sensor con avidina inmovilizada para inmovilizar las proteínas RGMa humanas equivalentes a 1300 a 1600 UR. A continuación, se carga un anticuerpo anti-RGMa opcional (15 pg/ml) como analito y se une a la proteína RGMa humana inmovilizada sobre el chip sensor. Repitiendo esto una pluralidad de veces, se crea un estado en el que el anticuerpo anti-RGMa opcional está unido a todas las moléculas de proteína RGMa humana sobre el chip sensor (estado saturado) y se determina la cantidad de unión en el estado saturado (cantidad de unión saturada 1).

Se lleva a cabo un experimento similar con el anticuerpo anti-RGMa que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR específicas de la presente invención para determinar la cantidad de unión en el estado saturado (cantidad de unión saturada 2).

A continuación, las proteínas RGMa humanas sobre el chip sensor se saturan con el anticuerpo anti-RGMa que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR específicas de la presente invención y, a continuación, se carga un anticuerpo anti-RGMa opcional (15 |jg/ml) como analito para investigar si el anticuerpo anti-RGMa opcional se une adicionalmente a la proteína RGMa humana saturada con el anticuerpo anti-RGMa que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR específicas de la invención.

Si el anticuerpo anti-RGMa opcional se puede unir adicionalmente a la proteína RGMa humana saturada con el anticuerpo anti-RGMa que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR específicas de la invención a la vez que presenta la cantidad de unión saturada 1 de un anticuerpo anti-RGMa calculado anteriormente, entonces en anticuerpo se considera «no competitivo». Por otro lado, si el anticuerpo anti-RGMa no se puede unir adicionalmente a la proteína RGMa humana saturada con el anticuerpo anti-RGMa que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR específicas de la invención, entonces el anticuerpo se considera «competitivo». Incluso si el anticuerpo anti-RGMa opcional se puede unir adicionalmente a la proteína RGMa humana saturada con el anticuerpo anti-RGMa que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR específicas de la invención, cuando la cantidad de unión añadida no alcanza la cantidad de unión saturada 1 por una diferencia significativa, entonces el anticuerpo se considera «competitivo». Las diferencias significativas se examinan mediante procedimientos estadísticos generales (por ejemplo, prueba t de Student) y el nivel de significancia se ajusta a 5 % o menos.

El anticuerpo anti-RGMa que compite con un anticuerpo anti-RGMa que comprende las secuencias de aminoácidos de las CDR específicas como se describieron anteriormente por la unión con la RGMa puede ser un anticuerpo obtenido de cualquier animal tal como anticuerpo de ratón, humano, rata, conejo, cabra o camélido, o puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado que sea una combinación de estos anticuerpos, pero preferentemente es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

Moléculas de ácido nucleico de la presente invención

Los ejemplos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención incluyen polinucleótidos en los que la región que codifica una región variable de la cadena pesada comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, 34 y 35 en el Listado de secuencias, respectivamente (en la que uno o varios aminoácidos pueden estar sustituidos, delecionados, insertados o añadidos) y la región que codifica una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, 31 y 32 en el Listado de secuencias, respectivamente (en la que uno o varios aminoácidos pueden estar sustituidos, delecionados, insertados o añadidos); y polinucleótidos en los que la región que codifica una región variable de la cadena pesada comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, 40 y SFG en el Listado de secuencias, respectivamente (en la que uno o varios aminoácidos pueden estar sustituidos, delecionados, insertados o añadidos) y la región que codifica una región variable de la cadena ligera comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, 37 y 38 en el Listado de secuencias, respectivamente (en la que uno o varios aminoácidos pueden estar sustituidos, delecionados, insertados o añadidos).

Otros ejemplos de la molécula de ácido nucleico de la presente invención incluyen polinucleótidos en los que la región que codifica una cadena pesada comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 en el Listado se secuencias y la región que codifica una cadena ligera que comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 en el Listado se secuencias; y polinucleótidos en los que la región que codifica una cadena pesada comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 en el Listado se secuencias y la región que codifica una cadena ligera comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 en el Listado de secuencias.

Otros ejemplos de la molécula de ácido nucleico de la presente invención incluyen polinucleótidos en los que la región que codifica una cadena pesada comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 en el Listado se secuencias y la región que codifica una cadena ligera comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 en el Listado de secuencias.

Otros ejemplos de la molécula de ácido nucleico de la presente invención incluyen polinucleótidos en los que la región que codifica una cadena pesada comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 11 a 18 en el Listado se secuencias y la región que codifica una cadena ligera comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 19 a 25 en el Listado de secuencias.

Los ejemplos particularmente preferidos de la molécula de ácido nucleico de la presente invención incluyen polinucleótidos en los que la región que codifica una cadena pesada comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 en el Listado se secuencias y la región que codifica una cadena ligera comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 en el Listado de secuencias.

Otros ejemplos de la molécula de ácido nucleico de la presente invención incluyen polinucleótidos en los que la región que codifica una región variable de la cadena pesada comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 en el Listado se secuencias y la región que codifica una región variable de la cadena ligera comprende una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 en el Listado de secuencias.

Los ejemplos específicos de la molécula de ácido nucleico de la presente invención incluyen polinucleótidos en los que la región que codifica una región variable de la cadena pesada comprende una secuencia base de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 en el Listado se secuencias y la región que codifica una región variable de la cadena ligera comprende la secuencia base de SEQ ID NO: 44 en el Listado de secuencias.

La molécula de ácido nucleico de la presente invención pueden ser polinucleótidos que se hibridan en condiciones estrictas a un ADN de cadena complementaria que tiene la secuencia base de SEQ ID NO: 43 en el Listado de secuencias y polinucleótidos que se hibridan en condiciones estrictas a un ADN de cadena complementaria que tiene la secuencia base de SEQ ID NO: 44 en el Listado de secuencias, siempre y cuando la molécula de ácido nucleico de la presente invención codifique un anticuerpo monoclonal que tiene la capacidad de unirse a la RGMa, no inhibe la unión entre la RGMa y la neogenina y neutraliza la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa. Los ejemplos de las condiciones estrictas incluyen una condición de realizar una hibridación Southern y lavar a una concentración salina que corresponde a 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS a 68 °C.

La molécula de ácido nucleico de la presente invención puede codificar todas las regiones constantes y regiones variables de las cadenas pesada y ligera, y puede codificar solo las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. Las secuencias base de la región constante de las cadenas pesada y ligera, en el caso de codificar toda la región constante y región variable son preferentemente las descritas en Nucleic Acids Research vol. 14, página 1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol. 257, página 1516, 1982 y Cell vol. 22, página 197, 1980.

La molécula de ácido nucleico de la presente invención se puede obtener, por ejemplo, mediante el procedimiento siguiente. Primero, se prepara el ARN total a partir de células tales como hibridomas usando un kit comercial de extracción de ARN, y se sintetiza el ADNc con transcriptasa inversa usando cebadores aleatorios o similares. A continuación, se amplifican los ADNc que codifican el anticuerpo mediante un procedimiento PCR que usa, para los cebadores, oligonucleótidos que tienen secuencias conservadas en las regiones variables de genes conocidos de la cadena pesada y ligera del anticuerpo, respectivamente. Para la secuencia que codifica la región constante, se puede obtener amplificando la secuencia conocida mediante el procedimiento PCR. La secuencia base del ADN se puede determinar mediante un procedimiento convencional, por ejemplo, incorporándola en un plásmido para secuenciación.

Alternativamente, un ADN que codifica el anticuerpo monoclonal de la presente invención también se puede obtener sintetizando químicamente una secuencia de la región variable o una parte de la misma y uniéndola a una secuencia que comprende la región constante.

La presente invención también proporciona un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención y un transformante (célula huésped) que comprende el vector recombinante. El vector recombinante pueden ser vectores que se pueden expresar en células procariotas tales como E. coli (Escherichia coli) (p. ej., pBR322, pUC119 o un derivado de los mismos), y preferentemente son vectores que se pueden expresar en células eucariotas, y más preferentemente son vectores que se pueden expresar en células obtenidas de mamíferos. Los ejemplos de los vectores que se pueden expresar en células obtenidas de mamíferos incluyen vectores plásmidos tales como pcDNA 3.1 (Invitrogen), pConPlus, pcDM8, pcDNA I/Amp, pcDNA 3.1, pREP4; y vectores virales tales como pDON-AI DNA (Takara Bio). El vector puede ser un vector que comprende una secuencia codificadora de la cadena pesada y una secuencia codificadora de la cadena ligera o pueden ser dos vectores de un vector que comprende una secuencia codificadora de la cadena pesada y un vector que comprende una secuencia codificadora de la cadena ligera.

El transformante en el que se introduce el vector recombinante de la presente invención puede ser una célula procariota tal como Escherichia coli o Bacillus subtilis, preferentemente una célula eucariota, más preferentemente una célula de mamífero. Los ejemplos de las células de mamífero incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO), COS, mieloma, BHK, HeLa, Vero, 293, NS0, Namalwa e YB2/0.

El anticuerpo anti-RGMa o el fragmento de unión al antígeno del mismo obtenidos se pueden purificar hasta su homogeneidad. Los procedimientos de separación y purificación usados para proteínas comunes se pueden usar para la separación y purificación de anticuerpos y similares. La separación y purificación de anticuerpos se puede conseguir seleccionando y combinando apropiadamente, por ejemplo, pero no limitado a, columnas cromatográficas tales como de cromatografía de afinidad, filtros, ultrafiltración, precipitación con sales, diálisis, electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS o isoelectroenfoque (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Los ejemplos de columnas usadas para cromatografía de afinidad incluyen columna de proteína A, columna de proteína G, columna conjugada a anticuerpo antiinmunoglobulina y columna conjugada a antígeno. Los ejemplos de la columna de proteína A incluyen Hyper D, POROS y Sepharose F. F. (Amersham Biosciences).

Agentes para prevenir o tratar enfermedades inmunológicas o neurológicas

El anticuerpo anti-RGMa o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la presente invención neutraliza la actividad inhibidora del crecimiento de las neuritas de la RGMa para favorecer la reparación de la función neuronal y, por tanto, se puede usar como agente para prevenir, tratar o prevenir las recaídas de enfermedades neurológicas.

El anticuerpo anti-RGMa o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la presente invención también neutraliza la activación de las células T por la RGMa para favorecer la reparación de la función neuronal y, por tanto, se puede usar como agente para prevenir, tratar o prevenir las recaídas de enfermedades inmunológicas.

Los ejemplos de la enfermedad neurológica incluyen esclerosis lateral amiotrófica, lesión del plexo braquial, lesión cerebral (que incluye lesión cerebral traumática), parálisis cerebral, síndrome de Guillain-Barre, leucodistrofia cerebral, esclerosis múltiple (que incluye esclerosis múltiple recurrente-remitente, esclerosis múltiple progresiva primaria, esclerosis múltiple progresiva secundaria), neuromielitis óptica, síndrome pospoliomielítico, espina bífida, lesión de la médula espinal, atrofia muscular espinal, neoplasia espinal, mielitis transversa, demencia (que incluye demencia senil, deterioro cognitivo leve, enfermedad de Alzheimer, demencia asociada a enfermedad de Alzheimer), enfermedad de Huntington, disquinesia tardía, manía, enfermedad de Parkinson, síndrome de Steele-Richardson, síndrome de Down, miastenia grave, neurotrauma (que incluye traumatismo del nervio óptico), amiloidosis vascular, hemorragia cerebral asociada a amiloidosis, infarto cerebral, cerebritis, estado confusional agudo, glaucoma, esquizofrenia y degeneración de la capa de fibras del nervio retiniano (que incluye retinopatía diabética, neuropatía óptica isquémica, retinosquisis ligada al cromosoma X, neuropatía óptica inducida por fármacos, distrofia retiniana, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades oculares caracterizadas por drusas del disco óptico, enfermedades oculares caracterizadas por determinante genético para la degeneración de los fotorreceptores, distrofia de conos y bastones autosómica recesiva, trastorno mitocondrial asociado a neuropatía óptica). La lesión de la médula espinal y el neurotrauma (que incluye traumatismo del nervio óptico) son preferidos.

Los ejemplos de la enfermedad inmunológica incluyen esclerosis múltiple (que incluye esclerosis múltiple recurrenteremitente, esclerosis múltiple progresiva primaria, esclerosis múltiple progresiva secundaria), neuromielitis óptica, psoriasis, artritis (que incluye artritis reumatoide osteoartritis, artritis psoriásica), síndrome de Guillain-Barre, enfermedad neuro-Behcet, anemia perniciosa, diabetes mellitus de tipo I (dependiente de insulina), lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica autoinmune, asma, polinosis, dermatitis atópica, glomerulonefritis, miastenia grave, enfermedad de Hashimoto y sarcoidosis. La esclerosis múltiple es preferida.

El anticuerpo anti-RGMa o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la presente invención se puede usar como un agente para prevenir, tratar o prevenir las recaídas de enfermedades neurológicas/inmunológicas, que incluyen preferentemente lesión de la médula espinal, neurotrauma (que incluye traumatismo del nervio óptico) y esclerosis múltiple (que incluye esclerosis múltiple recurrente-remitente, esclerosis múltiple progresiva primaria, esclerosis múltiple progresiva secundaria)

Como se emplea en esta memoria, el término «tratar» incluye cualquier tratamiento de enfermedades en un mamífero, particularmente un humano, e incluye inhibir los síntomas de la enfermedad, es decir, inhibir su progresión o eliminar las enfermedades o los síntomas, y aliviar los síntomas de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de las enfermedades o los síntomas o un retardo en el desarrollo de los síntomas.

«Prevenir» incluye la prevención de la aparición de las enfermedades antes descritas en un mamífero, particularmente un humano.

«Prevenir las recaídas» incluye la prevención de las recaídas de las enfermedades antes descritas y la remisión y recaída repetitiva en un mamífero, particularmente un humano.

El anticuerpo anti-RGMa o el fragmento de unión al antígeno del mismo de la presente invención se puede usar como una composición farmacéutica para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades neurológicas o inmunológicas.

La forma de administración del anticuerpo anti-RGMa o el fragmento de unión al antígeno de la presente invención no está particularmente limitada y se puede administrar a mamíferos, lo que incluye humanos, mediante cualquier vía de administración oral o parenteral (p. ej., administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, transcutánea, intracerebral, intraespinal u otra administración tópica).

Las formas de dosificación para administración oral y parenteral y los procedimientos de preparación de las mismas son bien conocidos por los expertos en la técnica, y una composición farmacéutica se puede preparar combinando el anticuerpo según la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable o similares.

Las formas de dosificación para administración parenteral incluyen preparaciones inyectables (p. ej., inyecciones por gotero, inyecciones intravenosas, inyecciones intramusculares, inyecciones subcutáneas, inyecciones intradérmicas, preparaciones de administración intracerebral y preparaciones de administración intraespinal), preparaciones externas (p. ej., ungüentos, cataplasmas y lociones), supositorios, inhalantes, gotas oculares, ungüentos oftálmicos, gotas nasales, gotas óticas y liposomas. En particular, cuando el anticuerpo según la presente invención va a actuar directamente sobre un tejido nervioso central, se puede infundir continuamente usando una microbomba médica, que es una bomba osmótica, o mezclar con adhesivo de fibrina o similares para preparar una preparación de liberación prolongada y a continuación colocarla en el tejido afectado.

Por ejemplo, las preparaciones inyectables normalmente se preparan disolviendo el anticuerpo en agua destilada inyectable y, si procede, se puede añadir un agente solubilizante, un tampón, u agente ajustador del pH, un agente isotonizante, un agente calmante, un conservante y un agente estabilizante. Las preparaciones inyectables también pueden ser preparaciones liofilizadas preparadas antes de su uso.

Las formas de dosificación para administración oral incluyen formas de dosificación sólidas o líquidas, en particular, comprimidos, comprimidos revestidos, píldoras, gránulos finos, gránulos, polvos, cápsulas, jarabes, emulsiones, suspensiones, inyecciones y pastillas.

La composición farmacéutica de la presente invención puede contener además otros fármacos terapéuticamente eficaces y, si procede, se pueden mezclar componentes tales como microbiocidas, antiflogísticos, vitaminas y aminoácidos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, excipientes, lubricantes, aglutinantes y desintegrantes para las preparaciones sólidas; y disolventes, agentes solubilizantes, agentes de suspensión, agentes isotonizantes, tampones y agentes calmantes para las preparaciones líquidas. Si procede, se pueden usar apropiadamente aditivos tales como antisépticos, antioxidantes, colorantes, edulcorantes, adsorbentes y agentes humectantes habituales en cantidades apropiadas.

La dosificación del anticuerpo según la presente invención se puede determinar en función de diversos factores tales como la vía de administración, el tipo de enfermedad, la magnitud de los síntomas, la edad, sexo, peso corporal y gravedad de la enfermedad de los pacientes, hallazgos farmacológicos tales como características farmacocinéticas y toxicológicas, si se usa o no un sistema de administración del fármaco y si se administra o no como parte de una combinación con otros fármacos. Normalmente, se pueden administrar 1 a 5000 pg/día, preferentemente 10 a 2000 pg/día, más preferentemente 50 a 2000 pg/día para administración oral o 1 a 5000 pg/día, preferentemente 5 a 2000 pg/día, más preferentemente 50 a 2000 pg/día para inyección por adulto (60 kg de peso corporal) en una o varias dosis. Para administración parenteral a todo el cuerpo, se pueden administrar 10 a 100000 pg/kg, más preferentemente 100 a 50000 pg/kg, e incluso más preferentemente 500 a 20000 pg/kg de peso corporal en un intervalo de una vez al día, una vez a la semana, una vez al mes o 1 a 7 veces al año. Para administración tópica usando una bomba osmótica o similares, habitualmente, es posible la infusión continua a una velocidad de 10 a 100000 pg/día, más preferentemente 100 a 10000 pg/día, aún más preferentemente 500 a 5000 pg/día por adulto (60 kg de peso corporal).

EJEMPLOS

La presente invención se describirá pormenorizadamente a continuación con referencia a los Ejemplos, pero la presente invención no está limitada a los aspectos de los Ejemplos siguientes.

Ejemplo 1: Preparación de proteína RGMa humana (dominio C-terminal)

Se creó una célula CHO que expresaba una proteína RGMa humana recombinante en la que se fusionó una cola de histidina al extremo C-terminal de Pro 169 a Gly 422 (que se refiere al residuo de prolina en la posición 169 al residuo de glicina en la posición 422 desde el lado N-terminal, en lo sucesivo descrito de forma similar) de la proteína RGMa humana (SEQ ID NO: 1 en el Listado de secuencias).

El dominio C-terminal de la proteína RGMa humana contenido en el sobrenadante del cultivo de células CHO se adsorbió sobre una columna de níquel (GE Healthcare, 17-5247-01) y se eluyó con una solución de imidazol 100 mM. Mediante diálisis, la fracción de elución de imidazol se sustituyó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se usó como inmunógeno. Ejemplo 2: Preparación de anticuerpo monoclonal de ratón anti-RGMa humana

Se mezclaron diez microgramos de la proteína RGMa humana recombinante preparada en el Ejemplo 1 con adyuvante completo de Freund (Sigma) para preparar una emulsión y se inmunizó un ratón BALB/c (Charles River Japón) con la misma en varios puntos subcutáneos sobre la espalda. A continuación, se llevó a cabo la inmunización de forma similar a intervalos de 1 a 2 semanas con 10 pg de proteína RGMa humana recombinante preparada en una emulsión con adyuvante incompleto de Freund (Sigma) y se recogió la sangre después de varias inmunizaciones. La titulación de anticuerpo se midió mediante el ELISA descrito más adelante en el que se inmovilizaron proteínas RGMa humanas o de ratón. En los individuos que presentaron un título de anticuerpo aumentado, se administraron intravenosamente 10 |jg de proteína RGMa humana para el cebado y se recuperaron los esplenocitos 2 o 3 días más tarde.

Para la fusión celular, las células del bazo y células de mieloma de ratón (SP2/0, Dainippon Sumitomo Pharma) con la mitad del número de las células del bazo se mezclaron y centrifugaron y se añadió polietilenglicol (Roche Diagnostics) a la fracción de precipitado resultante para obtener las fusiones celulares. Las células se centrifugaron a continuación y se lavaron dos veces con D-MEM (Invitrogen). Las células se resuspendieron en medio GIT (Nippon Pharmaceutical) que contenía 10 % de suero fetal bovino (Invitrogen), 1 % de BM Condimed (Roche Diagnostics) y HAT (Sigma-Aldrich) y se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos a 5 x 104 células de mieloma/pocillo. El sobrenadante del cultivo se recuperó y se cribó para obtener las células productoras de anticuerpo mediante el ELISA con proteína RGMa humana inmovilizada del Ejemplo 3.

Las células productoras de anticuerpo obtenidas mediante el cribado se clonaron mediante el procedimiento de dilución limitante y se seleccionaron las células de hibridoma que producían dos clases de anticuerpos monoclonales (B5.116A3 y B5.70E4)

Los isotipos de ambos anticuerpos monoclonales determinados usando un kit de isotipificación (monoanticuerpo de ratón ID/SP KIT, ZYMED, 93-6550) fueron IgG2b para la cadena pesada y kappa para la cadena ligera.

Los sobrenadantes del cultivo de los hibridomas se sometieron a cromatografía de afinidad usando agarosa sobre la que se inmovilizaron anticuerpos de IgG anti-ratón (IgG anti-ratón-Agarosa fabricada por Sigma) para purificar los anticuerpos monoclonales. Después de que el anticuerpo se uniera a la columna, la columna se lavó con PBS. A continuación, el anticuerpo se eluyó con 10 mM de clorhidrato de glicina (pH 2,7) y el eluato se neutralizó inmediatamente. Posteriormente, el eluato neutralizado se sustituyó con PBS a través de un ultrafiltro.

Ejemplo 3: ELISA en el que se inmovilizan proteínas RGMa humanas o de ratón

La proteína RGMa humana (R&D systems, 2459-RM) o proteína RGMa de ratón (R&D systems, 2458-RG) preparada a 2 jg/m L con PBS se repartió en una placa de 96 pocillos a 50 jL/pocillo cada una y se permitió que la placa reposara a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la retirada de la solución, se repartió ApplieBlock (Seikagaku Bio-Business, 200150) diluido 5 veces con PBS a 200 jL/pocillo en cada uno y se permitió que la placa reposara a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear la unión inespecífica. Después de lavar tres veces con PBST (PBS que contiene 0,05 % de Tween 20), las muestras (p. ej., suero de ratón, sobrenadante del cultivo de hibridoma, sobrenadante del cultivo con anticuerpo recombinante expresado) se diluyeron en serie con PBS, se añadieron a 50 jL/pocillo cada uno y se permitió que la placa reposara a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, la placa se lavó tres veces con PBST y a continuación se repartió anticuerpo de IgG de oveja anti-ratón marcado con peroxidasa (GE Healthcare, NA9310V) diluido con PBS a 50 jL/pocillo cada uno y se permitió que la placa reposara a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces, se añadió un kit de coloración de la peroxidasa (Sumitomo Bakelite, ML-1130O), se permitió que el color se desarrollara durante un cierto periodo de tiempo y se midió la absorbancia a 492 nm con un lector de placas.

Ejemplo 4: Análisis de epítopos de anticuerpo

Los epítopos a los que se unen los anticuerpos se determinaron mediante el procedimiento de escaneo peptídico. Se sintetizaron un total de 83 clases de péptidos fusionando el lado N-terminal de las secuencias de aminoácidos que consistían en 11 residuos consecutivos desplazados en 3 residuos contenidos en Arg 172 a Ala 424 de la proteína RGMa humana (SEQ ID NO: 1 en el Listado se secuencias) con una secuencia de espaciador (SGSG) con el extremo N-terminal biotinilado (SEQ ID NO: 46 en el Listado de secuencias). Después de inmovilizar los péptidos sobre placas revestidas con avidina, se permitió que los anticuerpos de ensayo (B5.116A3 y B5.70E4) reaccionaran. Posteriormente, se permitió que reaccionara un anticuerpo de IgG de conejo anti-ratón marcado con peroxidasa (Dako, P026002). Después de añadir una solución de sustrato y desarrollar el color durante un cierto tiempo, se midió la absorbancia con un lector de placas.

Como resultado, se obtuvo B5.116A3 unido a péptidos obtenidos de RGMa humana de Glu 298 a Gly 311 (dos tipos de péptidos: Glu 298 a Asp 308 y Val 301 a Gly 311), Asn 322 a Glu 335 (dos tipos de péptidos: Asn 322 a Thr 332 e Ile 325 a Glu 335), y Lys 367 a Ala 377; y B5.70E4 unido a péptidos obtenidos de RGMa humana de Glu 298 a Gly 311 (dos tipos de péptidos: Glu 298 a Asp 308 y Val 301 a Gly 311), Asn 322 a Glu 335 (dos tipos de péptidos: Asn 322 a Thr 332 e Ile 325 a Glu 335), y Pro 349 a Thr 359.

Ejemplo 5: Análisis y clonación de la secuencia del gen de anticuerpo de ratón

El ARN total se extrajo a partir de células de hibridoma que producían un anticuerpo monoclonal de ratón (B5.116A3 o B5.70E4). Usando el ARN total como molde, se sintetizó el ADNc mediante reacción de la transcriptasa inversa. Usando el ADNc como molde, los genes de las regiones variable y constante de la cadena ligera y las regiones variable y constante de la cadena pesada se amplificaron mediante PCR y se determinaron las secuencias de ADN. A continuación, con base en las secuencias determinadas de las regiones variable y constante, se amplificaron los genes del anticuerpo de longitud total mediante PCR y se clonaron. Las secuencias de aminoácidos codificadas por estos genes del anticuerpo fueron como se indica a continuación.

(1) Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de B5.116A3 (SEQ ID NO: 4 en el Listado de secuencias) DIQM TQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNW YQQKPDGTVKLLIYYTSR LHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDTATYFCQQLNTLPW TFGGGTKLEI KRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKW KIDGSERQNG VLNSW TDQDSKDSTYSM SSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFN RNEC

(2) Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de B5.116A3 (SEQ ID NO: 5 en el Listado de secuencias) EVKLEESGGGLVQPGGSM KLSCAASGFTFSDAW M DW VRQSPEKGLEW VAE IRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQM NNLRAEDTGIYYCTRRD GAYW GQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESV TVTW NSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTM SSSVTVPSSTW PSQTVTCSVAHPASS TTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLM ISLT PKVTCVVVDVSEDDPDVQISW FVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPI QHQDW M SGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRK DVSLTCLVVGFNPGDISVEW TSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNM K TSKW EKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK

(3) Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de B5.70E4 (SEQ ID NO: 6 en el Listado de secuencias) DW M TQTPLSLPV SLGDQ ASISCRSSQSLV HSNGN TYLHW YLQRPGQSPK LL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLJGISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPYTFGG GTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKW KIDGS ERQNGVLNSW TDQDSKDSTYSM SSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPI VKSFNRNEC

(4) Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de B5.70E4 (SEQ ID NO: 7 en el Listado de secuencias) DVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITTSYYW NW IRQFPGNKLEW M GYI

SYDGTNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLRFNSVTTEDTATYYCAGSFGYSQG

TFVTVSAAKTTPPSVYPFAPGCGDTTGSSVTLGCFVKGYFPESVTVTW NSGS

ES S S VHTFPAFFQSGFYTM S SS VTVP S ST WPSQTVTCS V AHP AS STTVDKKFE

PSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNFEGGPSVFIFPPNIKDVFM ISFTPKVTCVVV

D V SEDDPDVQIS WF VNN VE VHT AQT QT HRED YNSTIR V V STF PIQHQ D WM S

GKEFKCKVNNKDFPSPIERTISKIKGFVRAPQVYIFPPPAEQFSRKDVSFTCFV

VGFNPGDISVEW TSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNM KTSKW EKT

DSFSCNVRHEGFKNYYLKKTISRSPGK

Ejemplo 6: Preparación de anticuerpo recombinante de ratón y anticuerpo quimérico recombinante de rata y ratón

Se prepararon anticuerpos recombinantes de ratón de dos tipos de anticuerpos anti-RGMa, B5.116A3 y B5.70E4, obtenidos a partir de hibridomas (en lo sucesivo denominados «r116A3» y «r70E4», respectivamente).

Además, como ejemplo comparativo, se preparó anticuerpo quimérico recombinante de rata y ratón (en lo sucesivo denominado «r5F9») fusionando las regiones variables del anticuerpo de rata 5F9 con las regiones constantes del anticuerpo de ratón (IgG2bk) (la región constante de la cadena ligera es Arg 108 a Cys 214 de la SEQ ID NO: 4 en el Listado de secuencias, y la región constante de la cadena pesada es Ala 117 a Lys 452 de la SEQ ID NO: 5 del listado de secuencias) según el Documento de patente 1 (WO2009/106356).

El ADN que codificaba las cadenas ligera y pesada de cada uno de los anticuerpos se insertó en pcDNA 3.3 (Life Technologies) para preparar un vector de expresión. El vector de expresión se introdujo en células HEK293F (Life Technologies) usando Neofection 293 (ASTEC). Las células se cultivaron a 37 °C en atmósfera de gas dióxido de carbono al 8 % durante 6 días y, a continuación, se recuperó el sobrenadante del cultivo. Para la purificación del anticuerpo recombinante, el sobrenadante del cultivo se aplicó a una columna de afinidad sobre la que inmovilizó proteína A o proteína G (GE Healthcare) y los anticuerpos unidos a la columna se eluyeron con clorhidrato de glicina 10 mM (pH 2,8). El eluato se neutralizó inmediatamente y, a continuación, se sustituyó con PBS.

En el caso donde se necesita aumentar la pureza refinada según el propósito de uso, los anticuerpos purificados con columna de proteína A se purificaron con una columna de hidroxiapatita cerámica de tipo 1 (CHT) (BIORAD). Los anticuerpos unidos a la columna de CHT se lavaron con KH²PO⁴10 mM (pH 6,5) y a continuación se eluyeron con KH²PO⁴20 mM (pH 6,5), NaCl 0,5 M. Se recogieron las fracciones eluidas y a continuación se sustituyeron con PBS.

Ejemplo 7: Ensayo de unión sobre células que expresan proteína RGMa

Se introdujo un vector que expresaba la proteína RGMa humana de longitud total (Met 1 a Cys 450 de la SEQ ID NO: 1 en el Listado de secuencias), el dominio C-terminal de la proteína RGMa humana (Pro 169 a Cys 450 de la SEQ ID NO: 1 en el Listado de secuencias), la proteína RGMa de ratón de longitud total (Met 1 a Trp 454 de la SEQ ID NO: 2 en el Listado de secuencias), o el dominio C-terminal de la proteína RGMa de rata (Pro 170 a Cys 449 de la SEQ ID NO: 3 en el Listado de secuencias) en células CHO o HEK 293 para preparar células que expresaban el antígeno.

En las proteínas RGMa, el péptido C-terminal se procesa durante la reacción de adición del anclaje GPI. Las proteínas RGMa de ratón y rata se escinden ambas en Ala 427 y se retira el péptido C-terminal. Por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de la proteína de longitud total y el dominio C-terminal expresado sobre una célula a través de un anclaje GPI son las mismas en ratón y rata.

Los anticuerpos de ensayo (r116A3 y r70E4) y r5F9 (Ejemplo comparativo) con una concentración final de 10 pg/mL se hicieron reaccionar con las células que expresaban antígeno antes descritas y a continuación la células se lavaron con PBS que contenía 0,1 % de albúmina sérica bovina y 0,05 % de NaN³. Se permitió que reaccionara el anticuerpo de inmunoglobulina anti-ratón marcado con FITC (DAKO) y se lavaron las células. La fluorescencia se midió mediante citometría de flujo (FACSCalibur fabricado por Beckton Dickinson) y se evaluaron las propiedades de unión de los anticuerpos de ensayo a las células que expresaban antígeno (Tabla 1).

Como resultado, se encontró que r116A3 y r70E4 se unían al dominio C-terminal de las proteínas RGMa humanas y de rata, a diferencia de r5F9. La proteína RGMa tiene efecto inhibidor del crecimiento de las neuritas incluso en el dominio C-terminal solo, y r116A3 y r70E4 inhiben tanto la proteína RGMa de longitud total como el dominio C-terminal. T a l 1: Ev l i n l ni n iv r ni r r m in n ni-R M l l x r n n í no*

Ejemplo 8: Determinación de la constante de disociación para la proteína RGMa humana

La afinidad de los anticuerpos de ensayo (r116A3 y r70E4) y r5F9 (Ejemplo comparativo) por la proteína RGMa se midió mediante el procedimiento de resonancia de plasmón superficial (SPR) usando Proteon XPR36 (Bio-Rad). La proteína RGMa humana (R&D Systems, 2459-RM), el domino C-terminal de la proteína RGMa humana (preparado en el Ejemplo 1) o la proteína RGMa de ratón (R&D Systems, 2458-RG) diluida a 10 pg/mL con tampón acetato 10 mM (pH 4,5) se inmovilizó sobre un chip sensor de GLC mediante el procedimiento de acoplamiento de amina. Los anticuerpos de ensayo diluidos en serie se aplicaron como analitos a un caudal de 100 pL/min durante 60 segundos para determinar la constante de disociación (valor Kd).

Como se muestra en la Tabla 2, r116A3 y r70E4 también se unieron al dominio C-terminal de la proteína RGMa humana, pero r5F9 no lo hizo. R116A3 se unió a la proteína RGMa humana 32 veces más fuerte que r5F9 y a la proteína RGMa de ratón 44 veces más fuerte que r5F9.

Tabla 2: Afinidad del anticuer o monoclonal anti-RGMa

Ejemplo 9: Ensayo de inhibición de la unión de RGMa-neogenina

Se purificó el dominio extracelular (Ala 34 a Leu 1105) de la proteína neogenina humana recombinante (SEQ ID NO: 10 en el Listado de secuencias). Se creó una línea celular c Ho que expresaba el dominio extracelular de la proteína neogenina humana. Se fusionó una cola de histidina al extremo C-terminal. A partir del sobrenadante del cultivo de células CHO, el dominio celular se adsorbió sobre una columna de níquel (GE Healthcare, 17-5247-01) y, a continuación, se eluyó con una solución de imidazol 100 mM. Mediante diálisis, se sustituyó la fracción de elución de imidazol con PBS.

La proteína RGMa humana (R&D systems, 2459-RM) se marcó con biotina usando el kit de marcado con biotina ChromaLink (Solulink). Se ajustaron cantidades iguales de la proteína RGMa humana marcada con biotina a 2 pg/mL y se sometieron los anticuerpos de ensayo (r116A3 y r70E4) a dilución en serie 2 veces, se mezclaron y se permitió que reaccionaran a temperatura ambiente durante 2 horas para preparara una solución mixta.

Al mismo tiempo, se ajustaron 50 pL/pocillo del dominio extracelular de la proteína neogenina humana a 2 pg/mL con PBS, se añadieron a una placa de 96 pocillos y se permitió que la placa permaneciera a temperatura ambiente durante 1 hora para preparar una placa de neogenina inmovilizada. Después de la retirada de la solución, se añadió 2,5 % de solución de albúmina sérica bovina y se dejó que la placa reposara durante 1 hora para bloquear la unión inespecífica. Se añadió la solución mixta antes descrita a la placa de neogenina inmovilizada a 50 pUpocillo y se permitió que la placa reposara a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se realizó una operación de lavado y se añadió avidina marcada con peroxidasa (sistema VECTASTAIN ABC, fabricado por Vector Laboratories) y se permitió que la placa reposara a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se realizó una operación de lavado, se añadió una solución de sustrato, se llevó a cabo el desarrollo del color durante un cierto periodo de tiempo y se midió la absorbancia con un lector de placas. La relación de absorbancia en ausencia del anticuerpo se representó gráficamente como 1 y se evaluó la inhibición de la unión de RGMa-neogenina dependiente de la concentración por el anticuerpo (Fig. 1).

Como resultado, a diferencia del anticuerpo policlonal anti-RGMa humana (R&D Systems, AF2459) y r5F9, r116A3 y r70E4 no inhibieron la unión de RGMa-neogenina.

Ejemplo 10: Ensayo de inhibición de la unión de RGMa-BMP2

Se añadió proteína RGMa humana (R&D systems, 2459-RM) ajustada a 2 pg/mL con PBS a una placa de 96 pocillos a 50 pL/pocillo cada uno y se permitió que la placa reposara a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió 2,5 % de solución de albúmina sérica bovina y se permitió que la mezcla reposara durante 1 hora para bloquear la unión inespecífica, preparando de ese modo una placa de proteína RGMa inmovilizada. Los anticuerpos de ensayo (B5.116A3 y B5.70E4) diluidos en serie a 0,01 a 10 pg/mL se añadieron a la placa de proteína RGMa inmovilizada y se permitió que la placa reposara a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se realizó una operación de lavado, se añadió proteína BMP2 humana (R&D systems, 355-BM) diluida a 0,5 pg/mL y se permitió que la placa reposara a temperatura ambiente durante 1 hora.

Se permitió que el anticuerpo anti-BMP2 marcado con biotina reaccionara, se añadió adicionalmente avidina marcada con peroxidasa (sistema VECTASTAIN ABC, fabricado por Vector Laboratories) y una solución de sustrato, se llevó a cabo el desarrollo del color durante un cierto periodo de tiempo y se midió la absorbancia con un lector de placas (Fig. 2).

Como resultado, el anticuerpo anti-RGMa (B5.116A3) inhibió débilmente la unión de RGMa-BMP2 de una forma dependiente de la concentración (Absorbancia: 0,45 a 0,01 pg/mL, 0,4 a 0,1 pg/mL, 0,32 a 1 pg/mL y 0,1 a 10 pg/mL).

Ejemplo 11: Diseño de anticuerpo humanizado

La humanización del anticuerpo monoclonal de ratón B5.116A3 se llevó a cabo mediante injerto de la región determinante de la complementariedad (CDR) según el procedimiento de Winter y col. descrito en la patente n.° 2 912618.

Primero, se prepararon modelos de homología en 3D de las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de ratón B5.116A3 y se identificaron los residuos de aminoácido dentro de la región marco (FW), situada cerca de la CDR. Se seleccionaron las FW de los anticuerpos humanos en las que se mantenían tantos de estos aminoácidos tanto como fuera posible, se injertaron las CDR del anticuerpo de ratón a las mismas y se diseñó así un anticuerpo humanizado. En la secuencia del anticuerpo humanizado diseñado, la cadena pesada se describe como HA (SEQ ID NO: 11 en el Listado de secuencias) y la cadena ligera se describe como KA (SEQ ID NO: 19 en el Listado de secuencias). Además, se diseñaron una pluralidad de secuencias de anticuerpo humanizado introduciendo mutaciones adicionales en aminoácidos dentro de las FW implicadas en la estabilidad estructural de la región variable (un total de 8 cadenas pesadas que variaban de HB a HH, lo que incluye HA, y un total de 7 cadenas ligeras que variaban de KB a KG, lo que incluye KA).

Tabla 3: Secuencias del anticuer o humanizado diseñado

Ejemplo 12: Preparación de anticuerpo quimérico recombinante de ratón y humano y anticuerpo humanizado recombinante

(1) Se preparó el anticuerpo anti-RGMa quimérico recombinante de ratón y humano 116A3 (r116A3C) que tiene las secuencias de aminoácidos siguientes según el Ejemplo 6.

Cadena ligera (SEQ ID NO: 8 en el Listado de secuencias)

DIQM TQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNW YQQKPDGTVKLLIYYTSR LHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTTSNLEQEDIATYFCQQLNTLPW TFGGGTKLEI KRTV AAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV Q W KVDNALQ S G NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC

Cadena pesada (SEQ ID NO: 9 en el Listado de secuencias)

EVKLEESGGGLVQPGGSM KLSCAASGFTFSDAW M DW VRQSPEKGLEW VAE IRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQM NNLRAEDTGIYYCTRRD GAYW GQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT V S W NSGALTSG VHTFPAVLQS S GL Y SL S S V VT VPS S S LGT QT YICN VNHKP S NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVT C V V VD V SHEDPEVKFN WYVD GVEVHN AKTKPREEQ YN STYR VV S VLT VLH QDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ

VSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK

SRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK

(2) Se prepararon un total de 20 anticuerpos anti-RGMa humanizados que comprendían las combinaciones siguientes de cadenas ligera y pesada según el Ejemplo 6:

Combinaciones de cadena pesada/cadena ligera

HA/KA, HA/KB, HA/KC, HA/KG, HB/KC, HC/KA, HC/KB, HD/KA, HD/KB, HD/KC, HD/KD, HE/KA, HF/KA, HF/KF, HF/KG, HG/KD, HG/KH, HH/KA, HH/KD, HH/KF

(3) Se preparó un anticuerpo anti-RGMa humanizado recombinante (en lo sucesivo denominado rH5F9) según el Ejemplo 6 (Ejemplo comparativo).

La región variable del anticuerpo monoclonal anti-RGMa humanizado h5F9 descrito en el Documento de patente 1 (WO2009/106356) (la cadena ligera es la SEQ ID_53 del Documento de patente 1 y la cadena pesada es la SEQ ID_50 del documento de patente 1) se ligó con la región constante del anticuerpo humano (la cadena ligera es Arg 108 a Cys 214 de la SEQ ID NO: 26 en el Listado de secuencias, y la cadena pesada es Ala 117 a Lys 446 de la SEQ ID NO: 27 en el Listado de secuencias).

Ejemplo 13: Ensayo de estabilidad térmica del anticuerpo

Se recogieron alícuotas de veinte pL de sobrenadante del cultivo en las que se expresaba el anticuerpo recombinante descrito en el Ejemplo 12 y se trataron térmicamente durante 10 minutos a 8 puntos de temperatura de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 y 75 °C, respectivamente, usando un termociclador (Takara bio, TP 600). El sobrenadante del cultivo se diluyó con PBS para que la concentración final del anticuerpo fuera 125 ng/mL. Posteriormente, el sobrenadante del cultivo se sometió a ELISA en el que las proteínas RGMa humanas están inmovilizadas descrito en el Ejemplo 3 para evaluar la propiedad de unión al antígeno del anticuerpo (Fig. 3).

Como resultado, un anticuerpo humanizado que comprendía una combinación de la cadena pesada HE y la cadena ligera KA (en lo sucesivo denominado «rH116A3»), y un anticuerpo quimérico de ratón y humano (r116A3C) presentaron mejor estabilidad térmica que el anticuerpo humanizado (rH5F9). En lo sucesivo, el anticuerpo humanizado que comprende esta combinación de HE/KA se describe como rH116A3.

Cuando no se realizaba el tratamiento térmico, el anticuerpo quimérico de ratón y humano (r116A3C) y el anticuerpo humanizado (rH116A3) presentaban propiedades de unión al antígeno equivalentes y no hubo reducción en la propiedad de unión al antígeno asociada a la humanización.

Ejemplo 14: Generación de una línea celular estable CHO que produce anticuerpo anti-RGMa humanizado (rH116A3)

Se creó una línea celular estable CHO que producía anticuerpo anti-RGMa humanizado (rH116A3) usando el sistema Lonza GS Xceed (Lonza). Se introdujo un vector génico doble pXC que comprendía la secuencia codificadora de la cadena ligera (SEQ ID NO: 44 en el Listado de secuencias) y la secuencia codificadora de la cadena pesada (SEQ ID NO: 43 en el Listado de secuencias) del anticuerpo anti-RGMa humanizado (rH116A3) en una línea celular precursora CHOK1 SV con desactivación genética de GS y se obtuvo un conjunto de células transformantes por selección mediada por metionina sulfoximina (MSX). Después de separar en células individuales mediante citometría de flujo, se evaluó la cantidad de producción de anticuerpo en el sobrenadante del cultivo, la proliferación celular y similares, y se obtuvo una línea celular estable CHO.

Ejemplo 15: Ensayo de crecimiento de las neuritas

Se extirpó un cerebelo de una rata neonata (P7), se suspendió en una solución de tripsina (0,25 % de solución de tripsina en PBS que contenía 0,2 % de DNasa) y se digirió a 37 °C durante 10 a 15 minutos. A continuación, se añadió medio DMEM que contenía 10 % de suero fetal bovino y se centrifugó la mezcla. Las células se resuspendieron en el mismo medio y se centrifugaron, y se repitió el mismo procedimiento dos veces para lavar las células. Además, esta suspensión de células se filtró a través de un tamiz celular de 70 pm y se centrifugó, y la fracción precipitada se resuspendió en el mismo medio. Se añadió suplemento B27 (GIBCO) a la suspensión de células para preparar células granulares cerebelares de rata neonata.

A continuación, las células granulares cerebelares de rata neonata se sembraron en una placa de cultivo celular y se cultivaron a 37 °C durante 1 día.

Se añadió proteína RGMa recombinante (R&D systems, 2459-RM) con una concentración final de 2 pg/mL y las células se cultivaron a 37 °C durante 2 días. La longitud de las neuritas se midió mediante microscopía. Como se muestra en la Fig. 4, la adición de RGMa tuvo como resultado cambios en la longitud de las neuritas de 37 pm a 26 pm en el experimento de la figura izquierda y de 38 pm a 27 pm en la figura derecha, inhibiendo así el crecimiento de las neuritas. Aunque la adición del anticuerpo de ensayo (B5.116A3 o B5.70E4) a una concentración final de 10 pg/mL no cambió la longitud de las neuritas, la adición simultánea de proteína RGMa recombinante y el anticuerpo de ensayo indujo el crecimiento de las neuritas en la misma magnitud que un control (sin RGMa añadida), lo que indica el efecto neutralizante del anticuerpo contra la proteína RGMa.

Ejemplo 16: Ensayo de eficacia que usa un modelo de rata de lesión de la médula espinal

Una rata Wistar (hembra, 8 semanas de edad, que pesaba aproximadamente 200 g) anestesiada mediante aspiración de halotano (Takeda Pharmaceutical) se sometió a laminectomía de las vértebras anteriores y posteriores alrededor del nivel espinal T9 (T8 a T10) y se expuso la médula espinal. En el caso de la evaluación que usa el modelo de aplastamiento de la médula espinal, se aplicó una presión de 2 N (200 kdyn) a la médula espinal expuesta usando un impactador IH (Precision System).

Inmediatamente después de dañar la médula espinal como se describió anteriormente, se colocó una minibomba osmótica rellena con 400 pg/mL del anticuerpo de ensayo (r116A3 o r70E4) o un anticuerpo de ratón de control (mo-IgG2bK) (volumen de 200 pL, 0,5 pL/hora, administración durante 14 días) (Alzet, modelo 2002) bajo la piel de la espalda del animal. Se colocó la punta de un tubo de silicona conectado a la salida de la minibomba osmótica bajo la duramadre en el punto de lesión de la médula espinal. El tubo se cosió y fijó a los procesos espinales sobre el lateral de la extremidad inferior derecha del punto laminectomizado, se suturó el músculo y las capas cutáneas y se despertó a la rata.

La función motora de la rata del modelo de lesión de la médula espinal se evaluó usando la puntuación de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) (Basso, D.M., Beattie, M.S., & Bresnahan, J.C., A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995)) a 0, 1, 3 y 7 días después de la lesión, y posteriormente cada semana durante hasta 8 semanas. Como resultado, como se muestra en la Fig. 5(A), r116A3 o r70E4 mejoraron significativamente la puntuación BBB 4 o 3 semanas después de la administración, respectivamente, en comparación con el anticuerpo de control (mo-IgG2bK) (p < 0,05, prueba t de Student).

En el caso de la evaluación que usa un modelo de hemisección de la médula espinal, el lado dorsal de la médula espinal expuesta se cortó a una profundidad de 1,8 mm a 2,0 mm. De la misma forma que anteriormente, se administró el anticuerpo de ensayo (B5.116A3) o el anticuerpo de ratón de control (mo-IgG2bK) usando una minibomba osmótica y se evaluó usando la puntuación BBB a 0, 1, 3 y 7 días después de la lesión, y posteriormente cada semana durante hasta 10 semanas. Como se muestra en la Fig. 5(B), B5.116A3 mejoró significativamente la puntuación BBB 4 semanas después de la administración en comparación con el anticuerpo de control (mo-IgG2bK) (p < 0,01, prueba t de Student).

Ejemplo 17: Ensayo de eficacia que usa un modelo de ratón con esclerosis múltiple

El péptido PLP139-151 (HSLGKWLGHPDKF: SEQ ID NO: 45 en el Listado de secuencia, Instituto de Péptidos) se disolvió en solución salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Factory) y se mezcló con adyuvante incompleto de Freund (Sigma) al que se añadió Mycobacterium tuberculosis H37 Ra muerta (Difco Laboratories) para preparar una emulsión. Se inmunizó un ratón SJL/JorllcoCrj (SJL/J) (Charles River Japan) subcutáneamente en la espalda con el péptido PLP139-151 a 50 pg/cabeza y se evaluó el cambio en la puntuación EAE y el peso corporal (H. Kataoka, K Sugahara, K. Shimano, K. Teshima, M. Koyama, A. Fukunari and K. Chiba. FTY720, sphingosine 1-phosphate receptor modulator, ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis by inhibition of T cell infiltration. Cellular & Molecular Immunology 6, 439-448, 2005.) (Fig. 6).

El anticuerpo de ensayo (B5.116A3) diluido en solución salina fisiológica se administró peritonealmente a 20 pg/kg cada uno a 7 y 10 días o 18 y 21 días después de la inmunización con péptido PLP139-151.

Como resultado, como se muestra en la Fig. 6, en comparación con el anticuerpo de control (mo-IgG2bK), el anticuerpo monoclonal de ratón anti-RGMa (B5.116A3) inhibió el deterioro de la puntuación EAE mediante administración antes de la aparición de la enfermedad (parte superior de la Fig. 6) y presentó un efecto de prevención de las recaídas mediante administración después de la aparición de la enfermedad (parte inferior de la Fig. 6).

Ejemplo 18: Ensayo de inmunogenicidad del anticuerpo

Se maduraron células dendríticas no diferenciadas contenidas en sangre periférica obtenida de 51 donantes sanos mediante estimulaciones con el factor estimulante de colonias de granulocitos-monocitos (GM-CSF) e interleucina-4. Se añadió el anticuerpo de ensayo (rH116A3) a una concentración final de 50 pg/mL a las células dendríticas maduras y las células se cultivaron durante 4, 5 días para permitir que el anticuerpo fuera aceptado por las células dendríticas. Las células T CD4+ de la sangre periférica (células T auxiliares) obtenidas del mismo donante se mezclaron con las células dendríticas y se cocultivaron durante otra semana y, a continuación, se midió la proliferación de células T

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-RGMa, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, donde la secuencia de aminoácidos de cada una de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera (LCDR1), la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera (LCDR2), la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera (LCDR3), la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada (HCDR1), la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada (HCDR2) y la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada (HCDR3) comprende lo siguiente:

LCDR1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO: 30 en el Listado de secuencias),

LCDR2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 31 en el Listado de secuencias),

LCDR3: QQLNTLP (SEQ ID NO: 32 en el Listado de secuencias),

HCDR1: DAWMD (SEQ ID NO: 33 en el Listado de secuencias),

HCDR2: EIRSKANNHATYYAESVKG (SEQ ID NO: 34 en el Listado de

secuencias) y HCDR3: RDGAY (SEQ ID NO: 35 en el Listado de secuencias);

o

LCDR1: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 36 en el Listado de secuencias)

LCDR2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 37 en el Listado de secuencias)

LCDR3: SQSTHVP (SEQ ID NO: 38 en el Listado de secuencias)

HCDR1: TSYYWN (SEQ ID NO: 39 en el Listado de secuencias)

HCDR2: YISYDGTNNYNPSLKN (SEQ ID NO: 40 en el Listado de secuencias) y

HCDR3: SFG.

2. El anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1, donde la región variable de la cadena pesada (VH) comprende lo siguiente: VH:EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKAN-NHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO: 41 en el Listado de secuencias) o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90 % con dicha secuencia de aminoácidos; y donde la región variable de la cadena ligera (VL) comprende lo siguiente:

VL:DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTL TISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME (SEQ ID NO: 42 en el Listado de secuencias) o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90 % con dicha secuencia de aminoácidos.

3. El anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo anti-RGMa es un anticuerpo humanizado.

4. El anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo según una de las reivindicaciones 1 a 3, donde el anticuerpo anti-RGMa comprende regiones constantes de IgG humana.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica la porción de proteína del anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo según una de las reivindicaciones 1 a 4.

6. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5, donde cada una de las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de VH y VL es una secuencia de nucleótidos que comprende:

VH:

gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcagatccctgagactgtcctgtaccgcctccggct

tcaccttctccgacgcctggatggattgggtgcgacaggctcctggcaagggcctggaatgggtggccgagatccggtc

caaggccaacaaccacgccacctactacgccgagtctgtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtcc

atcgtgtacctgcagatgaactccctgcggaccgaggacaccgccctgtactactgcaccagaagggacggcgcctact

ggggcaagggcaccacagtgacagtgtcctcc (SEQ ID NO: 43 en el Listado de Secuencias), y

VL:

ggacatctcctccíacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactacacctcccggc

(SEQ ID NO: 44 en el Listado de Secuencias).

7. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5 o 6.

8. Una célula huésped que contiene el vector recombinante según la reivindicación 7.

9. Un procedimiento para producir el anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo según una de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo el procedimiento una etapa de cultivar la célula huésped según la reivindicación 8.

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-RGMa o un fragmento de unión al antígeno del mismo según una de las reivindicaciones 1 a 4.

11. La composición farmacéutica según la reivindicación 10 para uso en la prevención, el tratamiento, o la prevención de recaídas de enfermedades neurológicas o inmunológicas.

12. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 11, donde las enfermedades neurológicas se seleccionan del grupo que consiste en esclerosis lateral amiotrófica, lesión del plexo braquial, lesión cerebral (que incluye lesión cerebral traumática), parálisis cerebral, síndrome de Guillain-Barre, leucodistrofia cerebral, esclerosis múltiple (que incluye esclerosis múltiple recurrente-remitente, esclerosis múltiple progresiva primaria, esclerosis múltiple progresiva secundaria), neuromielitis óptica, síndrome pospoliomielítico, espina bífida, lesión de la médula espinal, atrofia muscular espinal, neoplasia espinal, mielitis transversa, demencia (que incluye demencia senil, deterioro cognitivo leve, enfermedad de Alzheimer, demencia asociada a enfermedad de Alzheimer), enfermedad de Huntington, disquinesia tardía, manía, enfermedad de Parkinson, síndrome de Steele-Richardson, síndrome de Down, miastenia grave, neurotrauma (que incluye traumatismo del nervio óptico), amiloidosis vascular, hemorragia cerebral asociada a amiloidosis, infarto cerebral, cerebritis, estado confusional agudo, glaucoma, esquizofrenia y degeneración de la capa de fibras del nervio retiniano (que incluye retinopatía diabética, neuropatía óptica isquémica, retinosquisis ligada al cromosoma X, neuropatía óptica inducida por fármacos, distrofia retiniana, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades oculares caracterizadas por drusas del disco óptico, enfermedades oculares caracterizadas por determinante genético para la degeneración de los fotorreceptores, distrofia de conos y bastones autosómica recesiva, trastorno mitocondrial asociado a neuropatía óptica).

13. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 11, donde las enfermedades inmunológicas se seleccionan del grupo que consiste en esclerosis múltiple (que incluye esclerosis múltiple recurrente-remitente, esclerosis múltiple progresiva primaria, esclerosis múltiple progresiva secundaria), neuromielitis óptica, psoriasis, artritis (que incluye artritis reumatoide osteoartritis, artritis psoriásica), síndrome de Guillain-Barre, enfermedad neuro-Behcet, anemia perniciosa, diabetes mellitus de tipo I (dependiente de insulina), lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad inflamatoria intestinal (EII), síndrome de Sjogren, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica autoinmune, asma, polinosis, dermatitis atópica, glomerulonefritis, miastenia grave, enfermedad de Hashimoto y sarcoidosis.

14. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 11, donde las enfermedades neurológicas o inmunológicas se seleccionan del grupo que consiste en lesión de la médula espinal, neurotrauma (que incluye traumatismo del nervio óptico), esclerosis múltiple que incluye esclerosis múltiple recurrente-remitente, esclerosis múltiple progresiva primaria, esclerosis múltiple progresiva secundaria).