CN1950108A - 轴突再生促进剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含有RGM样蛋白质抑制剂作为有效成分的轴突再生促进剂。RGM样蛋白质抑制剂包括抗RGM样蛋白质抗体、Y27632等RGM样蛋白质抑制剂、以及能抑制RGM样蛋白质的转录或翻译的反义核酸、双链RNA等。本发明的轴突再生促进剂对中枢神经的轴突再生有效，有助于由交通事故或脑血管障碍等引起的脊髓等中枢神经系统受损伤的患者的治疗等。

Description

轴突再生促进剂

技术领域

本发明涉及能够促进神经细胞、特别是中枢神经系统的神经细胞的轴突再生的轴突再生促进剂。

背景技术

如果脊髓等中枢神经因交通事故等受到伤害或由于脑血管障碍等受损，则神经功能丧失，不能再生。而末梢神经可以再生。由于中枢神经一旦损伤则不能再生，所以，损伤中枢神经经常导致部分或完全瘫痪。因此，再生损伤的中枢神经是医疗领域的重要课题。

不过，由于成人中枢神经的轴突可以通过末梢神经的移植(graft)再生(非专利文献1)，所以，提示成人中枢神经不再生的主要原因在于包围神经细胞的局部环境。迄今为止，抑制中枢神经再生的3个主要抑制物质被确定为Nogo、髓鞘相关糖蛋白(MAG)以及少突神经胶质细胞-髓鞘糖蛋白(OMgp)。Nogo已经被确定为单克隆抗体IN-1的对应抗原(非专利文献2～4)。已经发现对髓鞘的形成及维持起重要作用的MAG(非专利文献5～8)抑制某种神经元的轴突生长(非专利文献9、10)。成人中枢神经白质中主要的花生凝集素-结合多肽OMgp(非专利文献11)被确定为轴突生长的第3种抑制物质(非专利文献12、13)。已知Nogo、MAG以及OMgp以p75作为辅助受体(coreceptor)与NgR结合，由此暗示这些物质具有相同的信号传递途径(非专利文献14～17)。

已经研究了通过除去或抑制上述抑制物质而再生轴突。但是，通过研究敲除上述各种抑制物质的小鼠，发现仅除去上述抑制物质并不能再生中枢神经轴突(非专利文献18～22)。还报道即使使功能性的p75NTR枯竭，或给与可溶性的p75N-Fc，仍然不能促进损伤的脊髓的再生(非专利文献23)。

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发明内容

本发明的目的是提供能够促进中枢神经轴突再生的新型轴突再生促进剂。

本发明人等进行了深入研究，发现与参与鸡胚视网膜顶盖系统突起形成的RGM(排斥性导引分子(repulsive guidance molecule))(非专利文献24及25)具有同源性的蛋白质(在本说明书及权利要求书中，将其称为“RGM样蛋白质”)在脊髓白质及灰质中表达，而且当损伤脊髓时，该蛋白质的表达增加。另外，还发现该蛋白质具有抑制中枢神经轴突生长的活性。而且，与抗RGM样蛋白质抗体或Y27632相同，通过利用RGM样蛋白质抑制剂处理RGM样蛋白质，RGM样蛋白质的轴突生长抑制活性消失，因此想到可以利用RGM样蛋白质抑制剂作为轴突生长促进剂，从而完成了本发明。

即，本发明提供含有RGM样蛋白质抑制剂作为有效成分的轴突再生促进剂。所述RGM样蛋白质抑制剂优选为抗RGM样蛋白质抗体。所述RGM样蛋白质抑制剂进一步优选为Y27632。

所述轴突优选为中枢神经系统的轴突。

在本发明的其他方面，本发明提供鉴定轴突再生促进剂的候选物质的方法，该方法包括使试验物质与RGM样蛋白质接触，判断所述试验物质是否抑制RGM样蛋白质的功能。

利用本发明可提供能够促进中枢神经轴突再生的新型轴突再生促进剂。本发明的轴突再生促进剂对于中枢神经轴突的再生是有效的，期待非常有助于脊髓等中枢神经系统受到损伤的患者的治疗等。

具体实施方式

如上所述，本发明人等首先发现鸡胚的RGM样蛋白质在脊髓白质及灰质中表达。已经确认与鸡胚RGM样蛋白质具有同源性的基因在人脑中表达。将人RGM样蛋白质基因的碱基序列以及该基因编码的氨基酸序列表示为序列号1和2。另外，将大鼠RGM样蛋白质基因的碱基序列以及该基因编码的氨基酸序列表示为序列号3和4。

在以下实施例中已经具体记载了RGM样蛋白质具有抑制轴突生长的活性，而且，一旦脊髓损伤，其表达增加。另外，在下面的实施例中还明确了通过使抗RGM样蛋白质抗体作用于神经元，未见RGM样蛋白质引起的轴突生长抑制。所以，抗RGM样蛋白质抗体之类的中和RGM样蛋白质的轴突生长抑制活性的物质，可以用作轴突再生促进剂。

所以，本发明的轴突再生促进剂含有RGM样蛋白质抑制剂作为有效成分。此处，“RGM样蛋白质抑制剂”是指灭活或至少显著地降低RGM样蛋白质轴突生长抑制活性的物质。RGM样蛋白质的轴突生长抑制活性可以根据后述实施例中的记载测定。

作为本发明的RGM样蛋白质抑制剂，特别优选抗RGM样蛋白质抗体。在本说明书中，“抗RGM样蛋白质抗体”是指能通过抗原抗体反应与RGM样蛋白质结合的抗体。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。

结合在RGM样蛋白质上的多克隆抗体，可以根据本技术领域熟知的方法，以RGM样蛋白质作为致敏原(sensitizing antigen)免疫动物，从其血清中获得。结合在RGM样蛋白质上的单克隆抗体，可以根据本技术领域熟知的方法，以RGM样蛋白质作为致敏原免疫动物，收集得到的免疫细胞，与骨髓肿瘤细胞融合，克隆产生抗体的杂交瘤，培养该杂交瘤，从而得到单克隆抗体。

本发明的单克隆抗体除杂交瘤产生的抗体以外，还包括利用含有抗体基因的表达载体转化得到的转化体产生的基因重组抗体、嵌合抗体(chimeric antibody)、CDR移植抗体、以及上述抗体的片段等。

基因重组抗体可以如下制备，克隆编码来自产生抗RGM样蛋白质抗体的杂交瘤的抗体的cDNA，将其插入表达载体中，转化至动物细胞、植物细胞等，培养该转化体，从而制备基因重组抗体。所述嵌合抗体由来源于某动物的抗体的重链可变区以及轻链可变区、和来源于其他动物的抗体的重链恒定区以及轻链恒定区构成。作为能结合在RGM样蛋白质上的抗体片段，可以举出Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、二聚体等。

抗体产生细胞的制备

产生结合在RGM样蛋白质上的抗体的细胞可以利用本技术领域熟知的方法获得。使用RGM样蛋白质作为致敏原免疫动物，收集得到的免疫细胞，与骨髓肿瘤细胞融合，克隆产生抗体的杂交瘤。更详细而言，首先，制备作为抗原的RGM样蛋白质。市售的脑cDNA库中含有RGM样蛋白质的cDNA，所以，可以利用以市售的脑cDNA库为模板的PCR容易地得到该基因的扩增产物，将该基因插入适当的载体，即可重组生成RGM样蛋白质。然后，以上述制备的RGM样蛋白质作为抗原，在动物皮下、静脉内或腹腔内给药。作为免疫动物，可以使用小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、山羊等哺乳动物。优选使抗原与载体蛋白质结合，或一同给与抗原和弗氏完全佐剂等适当的佐剂。或可以使用RGM样蛋白质的部分肽作为抗原。

在下面的实施例中，当使用化学合成具有序列号4所示的氨基酸序列的大鼠RGM样蛋白质的从第309个氨基酸残基(以下记为“309aa”)至322aa的部分肽作为免疫原时，发现相对于该部分肽的多克隆抗体对RGM样蛋白质的轴突生长抑制活性具有中和活性。所以，使用人类基因的含有对应区域的多肽作为免疫原，能获得对应于人类RGM样蛋白质的中和抗体。

每1～3周给与数次抗原。通过利用ELISA法等测定血清中免疫球蛋白的量来监测抗体价。抗体价充分升高后，从该动物中提取免疫细胞。作为免疫细胞，优选脾脏细胞。融合抗体产生免疫细胞与来源于同种哺乳动物的骨髓肿瘤细胞，制备杂交瘤。目前，可以购得适合制备杂交瘤的各种骨髓肿瘤细胞株。可以根据本技术领域熟知的方法进行融合，例如，在PEG的存在下进行，利用HAT培养基选择融合细胞。利用ELISA法等检测培养基上清液，选择产生与抗原结合的抗体的杂交瘤。然后，可以利用极限稀释法克隆产生目标抗体的杂交瘤。进一步将得到的杂交瘤产生的单克隆抗体进行下面实施例中记载的轴突生长试验，从而可以选择对RGM样蛋白质轴突生长抑制活性具有中和活性的杂交瘤。

单克隆抗体的制备

可以如下制备单克隆抗体，从培养单克隆抗体产生细胞得到的培养液的上清液中制备单克隆抗体，或对预先用2，4，10，14-四甲基十五烷进行前处理的小鼠腹腔内给与单克隆抗体产生细胞，接种后第7日～10日，收集小鼠腹水，离心分离分取上清液，从而制备单克隆抗体。单克隆抗体的精制可以利用常规的蛋白质精制方法进行，例如，盐析、超滤、凝胶过滤、离子交换色谱、亲合色谱、HPLC等方法。优选进行利用蛋白质A柱的亲合色谱。精制的单克隆抗体的亚类(subclass)可以利用市售的小鼠单克隆抗体分型试剂盒(isotyping kit)进行分型确定。

抗体基因碱基序列的解析

编码本发明的单克隆抗体的抗体基因碱基序列可以通过解析得到的单克隆抗体产生细胞的基因而得到。从单克隆抗体产生细胞中提取全部RNA，以其为模板，使用逆转录酶合成cDNA片段。然后，使用适当设计的引物，利用PCR扩增抗体基因的V区域，并确定该区域cDNA的碱基序列。

抗体特异性的确认

本发明的单克隆抗体的结合特异性，可以使用ELISA、RIA、免疫薄层色谱、BIAcore、荧光抗体法等本技术领域已知的方法进行确认。例如，向固定有RGM样蛋白质的微板中加入2倍稀释系列的本发明单克隆抗体，进行培养，然后加入酶标记二级抗体(secondary antibody)，加入基质，发色，利用微板读数仪测定吸光度。

重组型抗体

利用编码本发明抗体的氨基酸序列的基因，使用基因重组技术，可以制备重组型抗体。为了制备重组型抗RGM样蛋白质单克隆抗体，将编码本发明抗体的基因组装到适当的表达载体中，导入宿主细胞。作为宿主细胞，可以使用大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，特别是哺乳类细胞，例如，优选使用CHO、COS、BHK。将载体导入宿主细胞，例如，可以通过氯化钙法、磷酸钙法、DEAE右旋糖酐法、使用阳离子型脂质体DOTAP(Boehringer Mannheim社制)的方法、电穿孔法(electroporation)、脂质体转染法(lipofection)等方法进行。培养得到的转化宿主细胞，使其表达抗体，从而制备重组型抗体。

嵌合抗体

所谓嵌合抗体，是指由来源于某种动物(例如，小鼠)的抗体的重链可变区以及轻链可变区、和来源于其他动物(例如，人)的抗体的重链恒定区以及轻链恒定区构成的抗体。可以如下重组制备嵌合抗体，克隆编码抗体的重链可变区以及轻链可变区的cDNA，所述抗体来源于产生结合在RGM样蛋白质上的单克隆抗体的杂交瘤，另一方面，克隆编码来源于其他动物的抗体的重链恒定区以及轻链恒定区的cDNA，组合上述cDNA，将其插入适当的表达载体中，使其在宿主细胞中表达，从而重组制备嵌合抗体。

CDR移植抗体

CDR移植抗体是将某种动物(例如，小鼠)的抗体的互补性决定区(CDR)移植到其他动物(例如，人)的抗体的互补性决定区所形成的抗体。可以如下获得编码CDR移植抗体的基因，基于被克隆的抗体的重链可变区以及轻链可变区的基因序列，所述抗体来源于产生结合在RGM样蛋白质上的单克隆抗体的杂交瘤，分别设计编码CDR1、2、3的基因序列，与含有编码来源于其他动物的抗体的重链可变区以及轻链可变区的基因的载体中的对应CDR1、2、3序列进行置换，从而制备CDR移植抗体。例如，可以使用为连接小鼠抗体的CDR与人抗体的构架区而设计的多个引物，利用PCR法合成。或利用合成DNA构建全序列。通过使该表达载体在适当的宿主细胞中表达，能够重组制备CDR移植抗体。

抗体片段

能结合RGM样蛋白质的Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、二聚体等抗体片段可以如下制备，利用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等酶处理上述本发明的抗RGM样蛋白质单克隆抗体，或将组装有编码上述抗体片段的基因的表达载体导入宿主细胞得到转化体，从而制备上述抗体片段。

作为RGM样蛋白质抑制剂的其他例子，可以举出已知作为丝氨酸/苏氨酸激酶即Rho激酶抑制剂的Y27632(非专利文献31)。在下面的实施例中确认了Y27632对RGM样蛋白质的轴突生长抑制活性具有中和活性。Y27632具有下面的化学结构。

本发明的轴突再生促进剂作为RGM样蛋白质抑制剂还可以包括反义寡核苷酸、核酶、引起RNA干涉(RNAi)的分子(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA)等。上述核酸可以与RGM样蛋白质基因或编码RGM样蛋白质的mRNA结合，抑制其表达。利用反义、核酶技术以及RNAi技术控制基因表达的一般方法、或利用上述技术表达外因性基因的基因治疗方法在本技术领域是熟知的。

所谓反义寡核苷酸，表示具有与编码RGM样蛋白质的mRNA互补的序列的核酸分子或其衍生物。反义寡核苷酸与mRNA特异性结合，通过抑制转录和/或翻译，从而抑制蛋白质的表达。可以是通过Watson-Crick或Hoogsteen型碱基对互补性的结合，也可以是通过形成三螺旋的结合。

所谓核酶，表示1个或1个以上的RNA的具有催化性的RNA结构。核酶通常具有核酸内切酶、连接酶或聚合酶活性。已知各种二级结构的核酶，例如，锤头状核酶及发夹状核酶。所谓RNA干涉(RNAi)，是指利用双链RNA分子使目标基因沉默(silencing)的方法。

RGM样蛋白质抑制剂，可以直接给药，但通常使用用于药物的载体进行制剂。作为制剂中使用的载体，可以使用制剂领域通常使用的任一种载体，例如，配制注射剂时，优选使用生理盐水或磷酸缓冲生理盐水等。还可以含有乳化剂或渗透压调节剂等常用的添加剂。

本发明轴突再生促进剂的给药途径优选非经口给药，特别优选在神经损伤部位直接注射。

根据RGM样蛋白质抑制剂的种类或给药途径、神经损伤的程度等适当选择给药量，直接在损伤部位给药时，成人1日每个损伤部位的RGM样蛋白质抑制剂的给药量如下，抗RGM样蛋白质抗体的情况下，通常为1mg～20mg，优选5mg～10mg，Y27632的情况下，通常为20mg～100mg，优选30mg～50mg。直接给药以外的非经口给药的情况下，例如，静脉注射等，通常是上述给药量的10倍左右。

另外，本发明还提供鉴定轴突再生促进剂的候选物质的方法。该方法包括使试验物质与RGM样蛋白质接触，判断该试验物质是否抑制RGM样蛋白质的功能。在RGM样蛋白质功能的抑制中，包括结合在RGM样蛋白质上抑制RGM样蛋白质正常功能的发挥，特别是抑制促进轴突再生的能力，以及抑制RGM样蛋白质与其受体的结合。可以利用本领域技术人员熟知的结合试验判断该试验物质与RGM样蛋白质结合的能力、或抑制RGM样蛋白质与其受体新生素(neogenin)结合的能力，没有特别限定，例如，可以利用凝胶迁移试验、放射性标识竞争试验、色谱分离等进行判断。另外，也可以在RGM样蛋白质的受体新生素的存在下，使试验物质与RGM样蛋白质接触，测定Rho活性。由于如果RGM样蛋白质与新生素结合，则Rho活性提高，所以，在试验物质的存在下，未见Rho活性提高的情况下，则认为该试验物质抑制RGM样蛋白质的功能。

利用上述试验被确定为抑制RGM样蛋白质的功能的物质是轴突再生促进剂的候选物质。然后，利用本技术领域中已知的轴突生长试验法，在该候选物质的存在下以及不存在下，测定并比较神经元的轴突生长，由此可以判断该候选物质是否具有轴突再生促进效果。上述试验方法的具体例记载在下面的实施例中。

本说明书中明确引用的全部专利文献以及参考文献的内容都作为本说明书的一部分被引用于此。另外，作为本申请享有优先权基础的申请的日本专利申请2004-68849号以及2004-273041号说明书以及附图中记载的内容全部被引用作为本说明书的一部分。

下面利用实施例详细说明本发明，但本发明的范围并不限定于这些

实施例。

实施例1

RGM样蛋白质的克隆

利用鸡胚RGM(非专利文献24)的氨基酸序列作为查询(query)序列，进行GenBank数据库的BLAST检索。结果被鉴定为登录号为XM_218791(褐鼠)的大鼠cDNA。推定的氨基酸序列与鸡胚RGM样蛋白质具有79％的同源性，所以将XM_218791命名为大鼠RGM样蛋白质。利用PCR从成熟的大鼠脑cDNA库中分离得到了全长大鼠RGM样蛋白质cDNA。使用的正向引物的碱基序列为agtggtaacaggccgagctggatgg(序列号5)，反向引物的碱基序列为ccacaaccttgtcgcgtgcactaat(序列号6)，反复25次由95℃30秒的变性步骤、55℃30秒的退火步骤、以及72℃3分30秒的伸长步骤组成的循环。被编码的蛋白质由431个氨基酸残基组成。基于非专利文献24，由于本地大鼠RGM被推测从152aa开始，所以，利用HA(血细胞凝集素)以及大鼠RGM样蛋白质的152～431aa作用于pSecTag2(Invitrogen社制)的信号肽，在pSecTag2-Hygro(Invitrogen社制)中制备HA-RGM载体。该操作具体如下进行。首先，以全长大鼠RGM样蛋白质cDNA为模板，利用PCR制备BamHI-HAtag-(对应于RGM样蛋白质152-431aa的cDNA)-XhoI的片段。然后，利用2种限制酶(BamHI以及XhoI)切断制备的片段与pSecTag2-Hygro(Invitrogen社制)，进行二者的接合后，转化到大肠杆菌中。通过DNA测序确认全部PCR扩增片段。

RGM样蛋白质-CHO细胞的生成

利用Flp-In System(商品名，Invitrogen社制)，按照制造者的指示生成RGM样蛋白质表达细胞。利用2种限制酶(NheI以及XhoI)，从pSecTag2载体制备含有信号肽的HA-RGM片段，将其连接在pcDNA5FRT(Invitrogen社制)上。将该构建物(pcDNA5FRT/Igκleader/HA/RGM)以及pOG44一起转染到Flp-in CHO细胞中，在含有潮霉素B(500μg/mL，Invitrogen社制)的培养基中繁殖2周，生成稳定地表达HA-RGM的细胞。利用Western blot以及免疫细胞化学(图2)确认了HA-RGM的表达。

轴突生长试验

利用胰蛋白酶处理(0.25％胰蛋白酶PBS，37℃，15分钟)，从出生后8天(P8)的幼大鼠分离小脑颗粒细胞，然后悬浮于含有血清的培养基中，粉碎，用PBS洗涤3次。在细胞培养玻片中的RGM-CHO细胞或对照CHO细胞的汇合单细胞层上接种神经元，进行共存培养试验。在培养物中添加10μM的Y27632(大阪的Welfide社制)抑制ROCK(Rho激酶)。将培养物在无血清的DMEM/F12培养基中繁殖24小时。

在含有或不含有2.5U/mL的PI-PLC(磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，Sigma社制)的无血清DMEM/F12中，培养RGM-CHO细胞或对照CHO细胞的汇合单细胞层，用于进行可溶性RGM试验。将培养物在13000g下离心10分钟，收集上清液，以除去浮游细胞。一部分上清液用于Western blot分析。在涂有聚L-赖氨酸的细胞培养玻片上的条件培养基上接种神经元，培养12小时或24小时。用4％(w/v)多聚甲醛固定细胞，利用识别神经元中特异性的β微管蛋白III蛋白质的单克隆抗体(TuJl，1∶1000，Covance Research Products，Inc.，美国丹佛)免疫染色，以进行轴突试验。然后，分别测定β微管蛋白III阳性神经元的最长突起(轴突)的长度。

脊髓损伤

对麻醉(戊巴比妥钠，40mg/kg)的雌性Wistar大鼠(200～250g)实施脊椎水平T10椎板切除手术，暴露脊髓。利用No.11刀片切断脊髓，从而在后脊柱、皮质脊髓束以及背角的一部分造成损伤部位。然后，缝合肌肉和皮肤层。每日至少2次对腹腔施加压力，压迫膀胱，直至膀胱功能恢复。

抗大鼠RGM样蛋白质抗体的产生

化学合成RGM样蛋白质的部分肽(309-322aa)，将其用作免疫原，得到抗大鼠RGM样蛋白质家兔抗血清。将该抗血清进行亲合精制，以1μg/mL的浓度用于免疫组织化学以及免疫印迹，以10μg/mL的浓度用于中和抗体试验。

组织制作以及免疫组织化学

从未损伤脊髓或损伤后6小时、1日、3日或7日的脊髓中获得新鲜的冷冻组织，用于免疫组织化学。用乙醚深度麻醉后，切除头部，取出脊髓，包于Tissue Tek OCT(商品名)中，马上放于干冰上，在-80℃下冷冻。在低温保持器上在18μm的位置处，切成一系列旁矢状切片，放置于涂有APS的Superfrost-Plus载玻片(商品名，大阪的松浪硝子工业社制)上。利用4％(w/v)多聚甲醛在室温下将切片固定1小时，用PBS洗涤3次，在含有5％山羊血清(GS)以及0.1％Triton X-100(商品名)的PBS中，室温下阻断1小时。将切片与初级抗体(primary antibody)一起在4℃下培养一夜，用PBS洗涤3次，与结合有荧光素的二级抗体(1∶1000，Mo1ecular Probes社制)一同在室温下培养1小时。使用下列抗体作为初级抗体：抗大鼠RGM样蛋白质多克隆抗体(1μg/mL)、抗神经胶质纤维酸性蛋白质(GFAP)单克隆抗体(1∶1000，Sigma社制)、抗髓鞘/少突神经胶质细胞特异性蛋白(MOSP)单克隆抗体(1∶500，Chemicon社制)或识别β微管蛋白III蛋白质的单克隆抗体(TuJl，1∶1000，Covance社制)。利用共聚焦扫描电子显微镜(德国耶拿的Carl Zeiss社制)观察试样。为了研究抗大鼠RGM样蛋白质抗体的特异性，在大鼠RGM样蛋白质特异性肽(309-322aa)的存在下，将对照以及脊髓损伤(SCI)切片染色。由于添加10μg/mL的该肽，组织全部没有被染色(无数据显示)。

中和抗体试验

在对照CHO细胞或RGM-CHO细胞经PI-PLC处理衍生的条件培养基中的涂有聚L-赖氨酸的细胞培养玻片上接种小脑颗粒神经元。向RGM-CHO细胞经PI-PLC处理衍生的条件培养基中添加抗大鼠RGM样蛋白质抗体(10μg/mL)。培养24小时后，与上述相同地进行生长试验。

Western blot试验

利用含有蛋白酶抑制剂混和物片(cocktail tablet)(德国曼海姆的Roche Diagnostics社制)的50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、10％甘油、0.5％ Brij-58(Sigma社制)溶解对照CHO细胞或RGM-CHO细胞。在13000g、4℃下将细胞溶解物离心10分钟，使其澄清，收集上清液，利用Bio-Rad DC蛋白浓度测定试剂盒(商品名)标化蛋白浓度。在含有12％β-巯基乙醇的试样缓冲液中，将等量的蛋白质煮沸5分钟，然后进行SDS-PAGE。除了溶解缓冲液处理，条件培养基也进行同样的处理。将蛋白质转移到PVDF膜上，在含有5％脱脂乳以及0.05％吐温20(商品名)的PBS中，于室温下阻断1小时。利用抗大鼠RGM样蛋白质多克隆抗体(1μg/mL)或抗HA单克隆抗体(1∶1000，Sigma社制)将膜印迹(blot)一夜。利用ECL化学发光系统(商品名，AmershamBiosciences社制)以及结合HRP(辣根过氧化酶)的二级抗体(1∶1000，Cell Signaling Technology社制)进行检测。

结果

轴突生长试验

轴突生长试验的结果如图1所示，该试验是在大鼠RGM样蛋白质表达CHO细胞或对照CHO细胞的汇合单细胞层上接种小脑颗粒神经元而进行的。如图1所示，在RGM样蛋白质表达CHO细胞上培养小脑颗粒神经元时，与对照比较，轴突生长显著缩短。另一方面，在培养基中添加本发明的轴突生长促进剂Y27632的情况下，轴突生长与对照同等程度，与在RGM样蛋白质表达CHO细胞上培养的情况下比较，轴突显著生长。

研究了溶液状态的RGM样蛋白质能否抑制轴突生长。试验时首先利用PI-PLC处理培养基，通过使用抗HA抗体的免疫染色确认了HA-RGM样蛋白质游离于培养基中。另外，利用PI-PLC从膜中游离GPI(糖基磷脂酰肌醇)锚定蛋白质。RGM样蛋白质，如上所述，与鸡胚RGM同源性高，推测为GPI锚定蛋白质，所以进行了PI-PLC处理。结果为只在进行了PI-PLC处理的RGM样蛋白质表达CHO细胞的培养基中，通过免疫染色检出HA-RGM样蛋白质，在对照CHO细胞的培养基以及未进行PI-PLC处理的RGM样蛋白质表达CHO细胞的培养基中，完全没有检出HA-RGM样蛋白质。因此，确认了RGM样蛋白质是GPI锚定蛋白质，并通过PI-PLC处理，游离在溶液中。

利用各条件培养基处理的神经元的轴突长度如图2所示。如图2所示，只有利用经PI-PLC处理RGM样蛋白质表达CHO细胞的培养基处理的神经元的轴突生长被显著抑制。这表示RGM样蛋白质具有抑制轴突生长的作用。另外，在对照的CHO细胞培养基中，无论是否进行PI-PLC处理，轴突生长都无变化。这表示PI-PLC处理本身对轴突生长无影响。

RGM样蛋白质在脊髓中的分布

首先进行制备的抗RGM样蛋白质抗体对RGM样蛋白质是否具有特异性的确认试验。利用抗HA抗体或制备的抗RGM样蛋白质抗体，对进行了PI-PLC处理的RGM样蛋白质表达CHO细胞的培养基进行Western印迹。结果为使用抗HA抗体的情况下和使用制备的抗RGM样蛋白质抗体的情况下都在相同的位置(约35K道尔顿)处检出带，而在对照中未检出。而且，制备抗RGM样蛋白质抗体时，以10μg/mL的浓度向抗RGM样蛋白质抗体中添加作为免疫原的上述肽，如果使用该抗RGM样蛋白质抗体进行成熟大鼠的损伤脊髓或正常脊髓的新鲜冷冻切片的免疫组织染色，则都没有被染色。因此，确认了制备的抗RGM样蛋白质抗体对RGM样蛋白质具有特异性(抗原抗体反应)。

为了研究RGM样蛋白质的分布，制备来自成熟大鼠的新鲜冷冻切片，进行免疫组织染色。所述免疫组织染色具体如下进行。首先，使新鲜冷冻切片在室温下充分干燥。用4％多聚甲醛磷酸缓冲溶液固定1小时，进行1小时阻断操作，然后在4℃初级抗体处理一夜，室温下二级抗体处理1小时。作为阻断溶液，使用含有10％山羊血清、0.1％tritonX的0.1M磷酸缓冲食盐水。作为初级抗体溶液，使用含有1μg/mL抗RGM样蛋白质的上述阻断溶液。作为二级抗体溶液，使用含有10％的山羊血清和结合有荧光素的二级抗体(1∶1000，Molecular Probes社制)的0.1M磷酸缓冲食盐水。结果显示RGM样蛋白质在白质和灰质中恒久地表达。

通过利用抗RGM样蛋白质-抗MOSP(髓鞘/少突神经胶质细胞特异性蛋白)进行双重染色，发现RGM样蛋白质在少突神经胶质细胞以及白质中少突神经胶质细胞的突起中表达。另外，RGM样蛋白质局部存在于Tujl(神经元特异性β-微管蛋白III蛋白质)阳性神经元的细胞体中，而不局部存在于白质中上述细胞的轴突中。利用抗大鼠RGM样蛋白质抗体以及抗星状细胞标识物GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白质)进行双重免疫组织化学染色时，没有检测到二者都存在的部位。这表示星状细胞中不存在RGM样蛋白质。综上所述，RGM样蛋白质由神经元以及星状细胞表达，其在脊髓中的表达谱类似于Nogo或OMgp。

脊髓损伤后的RGM样蛋白质表达

在损伤部位的中心以及损伤部位的头侧和尾侧的白质中检测出RGM样蛋白质的表达。在中心区域，损伤6小时后，组织结构可见正常。在开始观察到退行变化的损伤1日～3日后，在损伤部位以及异常细胞外基质中也可观察到针对RGM样蛋白质的免疫反应。该细胞外免疫反应也许起因于RGM样蛋白质表达细胞的退行。为了赋予中心区域RGM样蛋白质表达细胞特征，利用抗GFAP-抗RGM样蛋白质、抗MOSP-抗RGM样蛋白质、以及抗Tujl-抗RGM样蛋白质，对损伤7日后的组织进行双重标记实验时，未观察到双重标记细胞(即，GFAP阳性以及RGM样蛋白质阳性、MOSP阳性以及RGM样蛋白质阳性、或Tujl阳性以及RGM样蛋白质阳性)。如果考虑对中枢神经系统的损伤导致胶质细胞性瘢痕，则上述细胞可能是构成胶质细胞性瘢痕的其它种类的细胞，例如，小胶质细胞、巨噬细胞、少突神经胶质前驱细胞、纤维芽细胞、软膜细胞及/或许旺氏细胞等。

在与中心区域相邻的白质中，RGM样蛋白质-免疫阳性细胞以及免疫反应强度直至6小时后几乎无变化。但是，术后1日至3日，免疫反应强度连续增大。7日后，与无损伤的脊髓比较其密度明显变高。为了赋予白质中的RGM样蛋白质表达细胞特征，对损伤7日后的组织进行了双重标记实验。使用抗RGM样蛋白质-抗GFAP以及抗RGM样蛋白质-抗Tujl进行双重染色时，未观察到双重标记细胞。由此可以确认上述细胞不是星状细胞，也不是神经元。利用RGM样蛋白质以及MOSP进行双重染色时，检测出双重染色的细胞。这表示脊髓损伤后，RGM样蛋白质在少突神经胶质细胞中表达增强。最后，确认所有的MOSP表达细胞都表达RGM样蛋白质，而未观察到RGM样蛋白质阳性、MOSP阴性细胞。白质中的上述细胞与损伤部位中心观察到的细胞相同。因此，RGM样蛋白质在损伤部位的中心以及与其相邻的白质中对脊髓的损伤作出应答，表达增加。

抗RGM样蛋白质抗体对RGM样蛋白质轴突生长抑制活性的中和

结果如图3所示。图3中，“*”表示RGM相对于对照明显缩短，“**”表示RGM+抗RGM相对于RGM明显变长。如图3所示，如果添加抗RGM样蛋白质抗体，RGM样蛋白质的轴突生长抑制活性明显被中和。由此确认抗RGM样蛋白质多克隆抗体能作为轴突生长促进剂使用。

实施例2

1.方法

(1)外科手术

对麻醉(戊巴比妥钠，40mg/kg)的雄性Wistar大鼠(200～250g)实施脊椎水平T9/10椎板切除手术，暴露脊髓。利用No.11刀片在脊髓的背侧部分切至1.8mm深。通过组织学检查，在所有的动物中，上述损伤切断了后柱中所有背侧皮质脊髓束(CST)纤维以及外侧皮质脊髓束，伸长超过中心管。脊髓切断半侧后马上装配到充满对照抗体(8只，22.3μg/kg·日，2周)或实施例1中制备的抗RGM样蛋白质抗体(8只，22.3μg/kg·日，2周)的渗透压微型泵(200μL溶液，0.5μL/小时，输送14日)(美国加利福尼亚州Cupertino的Durect社制)。该微型泵置于动物背部皮下，与微型泵的出口相连的硅树脂管置于脊髓半侧切断部位的硬膜下，末端紧靠近损伤部位的头侧。将该管缝合到紧靠近椎板切除部位的末端侧的棘突而使其固定。然后，缝合肌肉以及皮肤层。至少每日2次，用手对腹部施加压力，压迫膀胱，直至膀胱的功能恢复。

(2)组织制作以及免疫组织化学

组织制作以及免疫组织化学与实施例1相同地进行。

(3)CST的顺行性标记

损伤8周后，在麻醉状态下，向下行CST纤维的左右运动皮质注射(坐标：前囱后2mm，前囱旁2mm，深1.5mm)生物素葡聚糖胺(biotin-dextran amine)(BDA，10％生理盐水溶液，每个皮质3.5μL，分子量10000，美国俄勒冈州Eugene的Molecular Probes社制)。在各注射时利用安装在微升注射器上的内径15～20μm的玻璃毛细管，经30秒钟注入0.25μLBDA。对合计6只对照、以及8只SCI后抗RGM样蛋白质抗体给与大鼠进行检查并比较。BDA注射14日后，灌流PBS、以及接下来的多聚甲醛，处死动物。将穿过损伤部位的脊髓的低温保持器切片切成旁矢状(50μm)。收集损伤部位头侧以及末端侧的横切片。将切片在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中阻断1小时，然后在含有0.15％BSA的PBS中与结合有Alexa Fluor 488(商品名)的链亲和素(streptavidin)(1∶400，Molecular Probes社)一起培养1日。测定损伤部位中心距离伸长至最末端侧的BDA检出CST纤维的距离。

(4)行为试验

根据Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动评价基准(Basso，D.M.，Beattie，M.S.，&Bresnahan，J.C.，A sensitive and reliable locomotor ratingscale for open field testing in rats.J Neurotrauma 12，1-21(1995))，评价经损伤后7周、开放环境下的行为恢复。进行盲检定量。

2.结果

(1)RGM样蛋白质的中和产生的功能改善

如上所述地评价了内源性RGM样蛋白质是否作为损伤中枢神经系统的轴突再生抑制剂发挥作用。在大鼠脊椎水平Th9/10处切除脊髓背侧的2/3，由此切除了主皮质脊髓束以及外侧皮质脊髓束。利用渗透压微型泵，通过设置在胸部损伤部附近的硬膜下的导管输送抗RGM样蛋白质中和抗体或作为对照的IgG。对照组与处理组的损伤深度没有显著差别。监测了运动行为。对于进行了未损伤脊髓的模拟手术的大鼠，Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)运动分数为满分。所有大鼠在损伤1日后，几乎完全处于两侧瘫状态(图4)。然后，利用BBB分数进行评价的运动行为部分地慢慢恢复。至脊髓损伤后4周，抗RGM样蛋白质抗体给与动物与对照动物之间的BBB分数无差别。值得注意的是，关于从手术6周后至7周后之间的运动行为，给与抗RGM样蛋白质抗体的大鼠与对照大鼠比较显著优异。所以，抗RGM样蛋白质抗体对于脊髓损伤大鼠的治疗是有效的。

图4表示将给与抗RGM样蛋白质抗体或对照抗体的大鼠的中央胸部背侧切除一半后，经过图中所示时间后的BBB分数。表示各组6只或8只大鼠的平均值±标准偏差。*表示给与抗RGM样蛋白质抗体的组在那一周与对照组比较存在显著差异。*：相对于对照p＜0.05。

(2)RGM样蛋白质抑制产生的轴突再生促进

如上所述地通过向感觉-运动皮质注入BDA，研究进行过实验的一部分大鼠的背侧CST(皮质脊髓束)的完整性。来自给与抗RGM样蛋白质抗体的损伤大鼠的试样(图5b)，与来自对照大鼠的试样(图5a)比较显示完全不同的标记谱。在未给与抗RGM样蛋白质抗体的大鼠中，在损伤部位端部，由于损伤，主CST在头侧中断(图5a、c)。该基本谱(basic pattern)反映在中枢神经系统通常不发生轴突再生。相反，在给与抗RGM样蛋白质抗体的大鼠中可以观察到从标记的CST发出多条纤维(图5b、d)。生长的轴突在灰质中比在白质中更好地伸长。该类型的多条纤维在给与该抗体的全部损伤动物中都可观察到。这不是由于BDA摄取程度的不同引起的。因为从损伤部位至头侧背部CST中的纤维总数在给与抗体的动物与对照动物之间未见差异。对于两组大鼠，如果观察穿过损伤部位的纵切面，在给与中和抗体的大鼠中，CST纤维的缩短更小，多数侧枝CST发芽(图5a、b、i)。在给与抗RGM样蛋白质抗体的大鼠中，在损伤部位水平处的组织间桥(tissue bridge)，可以高频观察到显示典型的不规则的屈折生长的再生纤维(图5d、f)。上述再生纤维朝向背侧的白质以及损伤瘢痕内，而且，沿着囊肿生长(图5f、h)。值得注意的是，多数轴突横穿损伤组织，在腔周围生长或在损伤中心内生长。如果用高倍显微镜观察给与中和抗体的大鼠的损伤部位的CST纤维，可以观察到类似突触样肿胀的状态。而在对照大鼠中，未检出BDA(图5e)。在给与抗体的大鼠中，轴突束穿过损伤组织生长至3.5mm，也有从损伤部位向末端侧伸长5mm的轴突束，多数标记纤维都可以被观察到(图5g、h、j)。另一方面，在对照大鼠中未观察到纤维。上述大部分纤维不是直线形，而是伴随分枝和弯曲。在再生纤维的最末侧可以观察到从主纤维束发出的多个分枝。所以，给与抗RGM样蛋白质抗体促进CST轴突的再生。

图5中，a、b是BDA标记的CST纤维的代表性照片，左侧表示头侧。表示给与对照IgG(a)或抗RGM样蛋白质抗体(b)的脊髓损伤10周后的CST纤维，并进行了顺行性标记(在图5和图6中，RGM样蛋白质记为“RGMa”)。用星号表示损伤部位的中心。图5中，c～g是利用更高倍显微镜观察图5a和b中用正方形包围的区域的照片。在给与抗RGM样蛋白质抗体的大鼠中，增加的侧枝CST纤维发芽于头侧(d)，在损伤部位观察到再生纤维(f，箭头)，而在给与对照IgG的大鼠中，在对应区域未观察到上述现象(c、e)。h是b所示切片的动物的其他切片，表示距离损伤部位中心(箭头)2.6mm的末端侧的再生纤维。比例尺在a和b中为500μm，在c～f中为100μm，在g和h中为200μm。i表示给与抗RGM样蛋白质抗体或IgG(n＝6～8/组)的大鼠中，脊髓损伤10周后的BDA检出主CST纤维距离损伤部位中心的距离。*：相对于对照p＜0.01。抗RGM样蛋白质抗体显示抑制损伤的主CST纤维的缩短。j表示给与抗RGM样蛋白质抗体或IgG(n＝6～8/组)的大鼠中，脊髓损伤10周后的最末端的BDA检出主CST纤维距离损伤部位中心的距离。*：相对于对照p＜0.01。

实施例3

1.方法

(1)GTP-RhoA的亲合性沉淀

将细胞溶解于含有1％Triton X-100(商品名)、0.5％去氧胆酸钠、0.1％SDS、500mM NaCl以及10mM MgCl₂、10μg/ml的亮抑酶肽及10μg/ml的抑酶肽的50mM Tris(pH7.5)。在13000g、4℃条件下将该细胞溶解物离心10分钟，使其澄清，将上清液与Rhotekin beads(商品名，Upstate Biotech社制)的20μgGST-Rho结合区域一起在4℃下培养45分钟。用含有洗涤缓冲液(1％Triton X-100(商品名)、150mM NaCl、10mM MgCl₂、10μg/ml亮抑酶肽以及10μg/ml抑肽酶的50mM Tris(pH7.5))将微珠(beads)洗涤4次。根据使用对应于RhoA的单克隆抗体(美国加利福尼亚州Santa Cruz的Santa Cruz Biotech社制)的Western blot检测结合的Rho。

2.结果

(2)GTP-RhoA的亲合性沉淀

测定了神经元中的RhoA活性。向出生后7日的大鼠的小脑神经元中添加各条件培养基，在经过30分钟的时刻测定RhoA的活性(图6)。如图6所示，在利用PI-PLC处理RGM样蛋白质表达CHO细胞的培养基培养的神经元中，与利用对照的CHO细胞培养基培养的神经元比较，可见Rho的活化。结果显示RGM样蛋白质活化Rho。

产业上的可利用性

本发明的轴突再生促进剂对于损伤的中枢神经的再生是有效的，作为损伤中枢神经的患者的治疗剂是有用的。

附图说明

[图1]表示轴突生长试验结果，该试验是在大鼠RGM样蛋白质表达CHO细胞或对照CHO细胞的汇合单细胞层上接种(plate)小脑颗粒神经元而进行的。纵轴表示每个神经元的最长轴突的平均长度。所示数据为3次实验的平均值±标准偏差。“*”表示与对照比较p＜0.01，“**”表示与RGM比较p＜0.01(Student检验)。

[图2]表示利用各种条件培养基处理的神经元的轴突长度。纵轴表示每个神经元的最长轴突的平均长度。所示数据为3次实验的平均值±标准偏差。“*”表示与在经PI-PLC处理的对照CHO细胞的条件培养基中培养的神经元轴突长度比较p＜0.01。

[图3]表示在添加或未添加抗RGM样蛋白质多克隆抗体的含有RGM样蛋白质的培养基中培养的小脑颗粒神经元的轴突生长试验结果。纵轴表示每个神经元的最长轴突的平均长度。所示数据为3次实验的平均值±标准偏差。“*”表示与对照比较p＜0.01，“**”表示与RGM比较p＜0.01(Student检验)。对照与RGM+抗RGM之间无显著性差别。

[图4]是表示将给与抗RGM样蛋白质抗体或对照抗体的大鼠的中央胸部背侧切除一半后，经过图中所示时间后的BBB分数的图。

[图5]是表示将中央胸部背侧切除一半的给与抗RGM样蛋白质抗体或对照抗体的大鼠的脊髓显微镜照片、及再生皮质脊髓束(CST)纤维距离损伤中心部位的距离的图。

[图6]是表示测定经RGM样蛋白质处理的大鼠小脑神经元中的活化Rho得到的Western blot结果的图。

                        序列表

<110>生物线索株式会社

<120>轴突生长促进剂

<130>PBC-9002WO

<150>JP 2004-68849

<151>2004-03-11

<150>JP 2004-273041

<151>2004-09-21

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1299

<212>DNA

<213>

<400>1

atggggagag gggcaggacg ttcagccctg ggattctggc cgaccctcgc cttccttctc     60

tgcagcttcc ccgcagccac ctccccgtgc aagatcctca agtgcaactc tgagttctgg    120

agcgccacgt cgggcagcca cgccccagcc tcagacgaca cccccgagtt ctgtgcagcc    180

ttgcgcagct acgccctgtg cacgcggcgg acggcccgca cctgccgggg tgacctggcc    240

taccactcgg ccgtccatgg catagaggac ctcatgagcc agcacaactg ctccaaggat    300

ggccccacct cgcagccacg cctgcgcacg ctcccaccgg ccggagacag ccaggagcgc    360

tcggacagcc ccgagatctg ccattacgag aagagctttc acaagcactc ggccaccccc    420

aactacacgc actgtggcct cttcggggac ccacacctca ggactttcac cgaccgcttc    480

cagacctgca aggtgcaggg cgcctggccg ctcatcgaca ataattacct gaacgtgcag    540

gtcaccaaca cgcctgtgct gcccggctca gcggccactg ccaccagcaa gctcaccatc    600

atcttcaaga acttccagga gtgtgtggac cagaaggtgt accaggctga gatggacgag    660

ctcccggccg ccttcgtgga tggctctaag aacggtgggg acaagcacgg ggccaacagc    720

ctgaagatca ctgagaaggt gtcaggccag cacgtggaga tccaggccaa gtacatcggc    780

accaccatcg tggtgcgcca ggtgggccgc tacctgacct ttgccgtccg catgccagag    840

gaagtggtca atgctgtgga ggactgggac agccagggtc tctacctctg cctgcggggc    900

tgccccctca accagcagat cgacttccag gccttccaca ccaatgctga gggcaccggt    960

gcccgcaggc tggcagccgc cagccctgca cccacagccc ccgagacctt cccatacgag   1020

acagccgtgg ccaagtgcaa ggagaagctg ccggtggagg acctgtacta ccaggcctgc   1080

gtcttcgacc tcctcaccac gggcgacgtg aacttcacac tggccgccta ctacgcgttg   1140

gaggatgtca agatgctcca ctccaacaaa gacaaactgc acctgtatga gaggactcgg   1200

gacctgccag gcagggcggc tgcggggctg cccctggccc cccggcccct cctgggcgcc   1260

ctcgtcccgc tcctggccct gctccctgtg ttctgctag                          1299

<210>2

<211>432

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met G1y Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro Thr Leu

1               5                   10                  15

Ala Phe Leu Leu Cys Set Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys Lys Ile

            20                  25                  30

Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser His Ala

        35                  40                  45

Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Ser Tyr

    50                  55                  60

Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu Ala

65                  70                  75                  80

Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His Asn

                85                  90                  95

Cys Set Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr Leu Pro

            100                 105                 110

Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys His

        115                 120                 125

Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr Thr His

    130                 135                 140

Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp Arg Phe

145                 150                 155                 160

Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn Tyr

                165                 170                 175

Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala Ala

            180                 185                 190

Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln Glu Cys

        195                 200                 205

Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ala Ala

    210                 215                 220

Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn Ser

225                 230                 235                 240

Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile Gln Ala

                245                 250                 255

Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr Leu

            260                 265                 270

Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu Asp

        275                 280                 285

Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu Asn

    290                 295                 300

Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly Thr Gly

305                 310                 315                 320

Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro Glu Thr

                325                 330                 335

Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val

            340                 345                 350

Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly

        355                 360                 365

Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Val Lys

    370                 375                 380

Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg Thr Arg

385                 390                 395                 400

Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro Arg Pro

                405                 410                 415

Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val Phe Cys

            420                 425                 430

<210>3

<211>1296

<212>DNA

<213>褐鼠

<400>3

atggggagag gggcaggacg ttcagccctg ggattgtggc cgaccctcgc cttccttctc     60

tgcagctttc ccgcagctat ctctccctgc aagatcctca agtgcaactc tgagttctgg    120

agcgccacgt cgtcaggcag ccacgcccct gcctctgacg acgtgcccga gttctgtgct    180

gccctgcgca cctacgccct gtgcacgcga cggacagccc gcacctgccg gggcgacctg    240

gcttaccact cggctgtcca tggcatagag gacctcatga gccagcacaa ctgctccaag    300

gatggcccca cctcacagcc tcgagtgcgc acgctcccgc cagctgggga cagccaggag    360

cgctcagata gccccgagat ctgccactat gagaagagtt tccacaagca ctcagctgcc    420

cccaactaca ctcactgcgg cctctttggg gacccacacc tcaggacttt cacagaccac    480

ttccagacat gtaaggtgca aggcgcttgg cctctcatcg acaataatta cctgaacgtg    540

caggtcacca atacacctgt gctgcccggc tctgccgcca ctgccaccag caagctcacc    600

atcatcttca agaacttcca agagtgtgtg gaccagaaag tataccaagc cgagatggac    660

gagcttccgt ccgcctttgc cgatggctcc aaaaacggtg gagataaaca cggagccaac    720

agcctgaaga tcacagagaa ggtgtcaggc cagcacgtgg agatccaggc caagtacatc    780

ggcaccacca tcgtggtgag acaggtgggc cgctacctga ccttcgccgt ccggatgccc    840

gaggaggtag tcaacgccgt ggaggaccgt gacagccaag gcctctacct ctgcctgcgg    900

ggctgcccgc tcaaccagca gatcgacttc caggctttcc gtgccaacgc cgagagccct    960

cgcaggccag cagctgccag cccctctcct gtggtccccg agacatttcc gtacgagaca   1020

gctgtggcca agtgcaaaga gaagctgcct gtagaagact tgtactacca ggcctgtgtc   1080

ttcgacctcc tcacgactgg cgacgtgaac ttcacgctgg ccgcctacta tgctttggag   1140

gatggcaaga tgctccactc caacaaggac aagctacacc tgtttgaaag gactcgggag   1200

ctgcctggcg ctgtggccgc tgcagcattt cccttggccc ccgagatgct cccgggcacc   1260

gtcacacttc tggtcctgct gcctctgttc tggtag                             1296

<210>4

<211>431

<212>PRT

<213>褐鼠

<400>4

Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Leu Trp Pro Thr Leu

1               5                   10                  15

Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Ile Ser Pro Cys Lys Ile

            20                  25                  30

Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ser His

        35                  40                  45

Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Thr

    50                  55                  60

Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu

65                  70                  75                  80

Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His

                85                  90                  95

Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg Thr Leu

            100                 105                 110

Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys

        115                 120                 125

His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn Tyr Thr

    130                 135                 140

His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp His

145                 150                 155                 160

Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn

                165                 170                 175

Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser Ala

            180                 185                 190

Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln Glu

        195                 200                 205

Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro Ser

    210                 215                 220

Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala Asn

225                 230                 235                 240

Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile Gln

                245                 250                 255

Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr

            260                 265                 270

Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu

        275                 280                 285

Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro Leu

    290                 295                 300

Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu Ser Pro

305                 310                 315                 320

Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu Thr Phe

                325                 330                 335

Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu

            340                 345                 350

Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Asp

        355                 360                 365

Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly Lys Met

    370                 375                 380

Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr Arg Glu

385                 390                 395                 400

Leu Pro Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro Glu Met

                405                 410                 415

Leu Pro Gly Thr Val Thr Leu Leu Val Leu Leu Pro Leu Phe Trp

            420                 425                 430

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人

<400>5

agtggtaaca ggccgagctg gatgg                                            25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人

<400>6

ccacaacctt gtcgcgtgca ctaat                                            25

Claims (5)

1、一种轴突再生促进剂，其中含有RGM样蛋白质抑制剂作为有效成分。

2、如权利要求1所述的轴突再生促进剂，其中，所述RGM样蛋白质抑制剂是抗RGM样蛋白质抗体。

3、如权利要求1所述的轴突再生促进剂，其中，所述RGM样蛋白质抑制剂是Y27632。

4、如权利要求1～3中任一项所述的轴突再生促进剂，其中，所述轴突是中枢神经系统的轴突。

5、一种鉴定轴突再生促进剂的候选物质的方法，该方法包括使试验物质与RGM样蛋白质接触，判断所述试验物质是否抑制RGM样蛋白质的功能。

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