CN107531791B - RGMa结合蛋白质及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于得到可用作神经学疾病或免疫学疾病的预防、治疗或复发预防用的医药品的、结合活性高、副作用少的抗反义导向分子a(RGMa)抗体。通过提供不抑制RGMa与Neogenin的结合且中和RGMa的神经突起生长抑制活性的、分离得到的RGMa结合蛋白质，优选互补性决定区域的氨基酸序列为序列表的序列号30～35或序列表的序列号36～40和SFG的抗RGMa抗体，从而解决该课题。

Description

RGMa结合蛋白质及其使用
技术领域
本发明涉及RGMa结合蛋白质及其使用。
背景技术
RGM(反义导向分子，repulsive guidance molecule)是分子量约33kDa的GPI锚固型膜蛋白质，最初，是被鉴定为视觉系统的轴突导向分子的膜蛋白质(参照非专利文献1)。RGM家族中包含称为RGMa、RGMb和RGMc的3类成员，其中，RGMa除发育阶段以外，还在成年人和大鼠的中枢神经系统损伤后再表达，以及在大鼠中RGMa抑制使脊髓损伤后的神经突起生长亢进，促进功能恢复(参照非专利文献2)，因此认为RGMa是中枢神经系统损伤后的神经突起抑制物质。
对RGMa还报道有免疫系统的作用。RGMa在树突状细胞上表达，作用于T细胞而提高T细胞与ICAM-1·纤维连接蛋白的粘接性，或者诱导细胞因子产生(专利文献4)。在多发性硬化症模型小鼠中，如果将抗RGMa抗体进行给药，则脑脊髓炎的症状得到抑制，还显示抑制发病、复发的效果。认为抗RGMa抗体与在树突状细胞中表达的RGMa结合而抑制T细胞的活化，对多发性硬化症有效。
还逐渐阐明了RGMa的信号传递机制，作为RGMa的受体，报道了Neogenin蛋白质(专利文献3)。Neogenin是单次跨膜型蛋白质，在神经细胞或T细胞上表达。
RGMa与细胞膜上的Neogenin结合，诱导细胞内的RhoA的活化、Ras的非活化，从而带来神经突起生长抑制效果。另一方面，已知在发育途中的鸡脑中，RGMa未结合时Neogenin会引起细胞凋亡(Matsunaga等，Dev.Growth Differ.46,481,2004)。即，认为RGMa/Neogenin途径具有促进神经细胞生存的对神经再生而言优选的作用和抑制神经突起生长的负面作用这二种相反的作用。
作为以RGM为目标的医药品，在专利文献1中公开了含有抗RGM中和抗体作为有效成分的轴突再生促进剂。另外，在专利文献2和3中公开了调节RGM与Neogenin受体的结合的抗RGM抗体的对脑和脊髓的机械损伤的治疗剂。另外，在专利文献4中公开了抗RGM抗体的多发性硬化症等医药用途。另外，在专利文献5中公开了抗RGM抗体的对包括多发性硬化症、哺乳动物的脑外伤、脊髓损伤、中风、神经变性疾病和精神分裂症在内的疾病的治疗用途。此外，在专利文献6中公开了抗RGM抗体等RGM调节器的对脊髓损伤或多发性硬化症的治疗用途，在非专利文献3中公开了对进行型多发性硬化症的治疗用途。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2005/087268号小册子
专利文献2：日本特表2010-537655号公报
专利文献3：日本特表2009-510002号公报
专利文献4：国际公开WO2011/071059号小册子
专利文献5：日本特表2011-512806号公报
专利文献6：日本特表2004-525875号公报
非专利文献
非专利文献1：Neuron 5,735-743(1990)
非专利文献2：J.Cell Biol.173,47-58(2006)
非专利文献3：Cell Reports 10,1-12(2015)
发明内容
如上所述，公开了抗RGMa抗体对神经学疾病或免疫学疾病的治疗用途，但以往的抗体活性不充分，或者有可能损害RGMa本来的功能，存在副作用的问题等。特别是，以往的抗体有可能通过抑制RGMa与Neogenin间的结合而也抑制了与RGMa结合的Neogenin所具有的细胞凋亡抑制等优选的作用。
因此，本发明的课题在于提供一种不抑制RGMa/Neogenin的相互作用且中和RGMa的神经突起生长抑制活性的RGMa结合蛋白质。
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究。其结果成功地得到了不抑制RGMa与Neogenin的结合且中和RGMa的神经突起生长抑制活性的RGMa结合蛋白质，发现它可以作为对神经学疾病或免疫学疾病的医药品使用，从而完成了本发明。
本发明如下。
[1]一种分离得到的RGMa结合蛋白质，不抑制RGMa与Neogenin的结合，且中和RGMa的神经突起生长抑制活性。
[2]根据[1]所述的RGMa结合蛋白质，其中，与人类RGMa、大鼠RGMa和/或小鼠RGMa结合。
[3]根据[1]或[2]所述的RGMa结合蛋白质，其中，与EEVVNAVEDWDSQG(序列表的序列号26)、NQQIDFQAFHTNAE(序列表的序列号27)、PTAPETFPYET(序列表的序列号28)和/或KLPVEDLYYQA(序列表的序列号29)的肽结合。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的RGMa结合蛋白质，其中，与序列表的序列号26和序列号27的肽结合。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的RGMa结合蛋白质，其中，与序列表的序列号26、序列表的序列号27和序列表的序列号28的肽结合。
[6]根据[1]～[4]中任一项所述的RGMa结合蛋白质，其中，与序列表的序列号26、序列表的序列号27和序列表的序列号29的肽结合。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的RGMa结合蛋白质，其中，RGMa结合蛋白质为人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体、或它们的抗原结合片段。
[8]一种核酸分子，编码[1]～[7]中任一项所述的RGMa结合蛋白质的蛋白质部分。
[9]一种重组载体，含有[8]所述的核酸分子。
[10]一种宿主细胞，含有[9]所述的重组载体。
[11]一种[1]～[7]中任一项所述的RGMa结合蛋白质的制造方法，包含培养[10]所述的宿主细胞的工序。
[12]一种医药组合物，含有[1]～[7]中任一项所述的RGMa结合蛋白质。
[13]根据[12]所述的医药组合物，其中，用于神经学疾病或免疫学疾病的预防、治疗或复发预防。
[14]根据[13]所述的医药组合物，其中，神经学疾病选自：肌萎缩性侧索硬化症、臂丛神经损伤、脑损伤(包括外伤性脑损伤)、脑性麻痹、格林-巴利综合征、大脑白质萎缩症、多发性硬化症(包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症)、视神经脊髓炎、脊髓灰质炎后综合征、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩症、脊椎肿瘤、横贯性脊髓炎、痴呆症(包括老年性痴呆症、轻度认知功能障碍、阿尔茨海默病、阿尔茨海默相关痴呆症)、亨廷顿氏舞蹈病、迟发性运动障碍、狂躁症、帕金森氏病、斯蒂尔-理查德综合征、唐氏综合征、重症肌无力症、神经外伤(包括视神经外伤)、血管淀粉样变病、伴随淀粉样变病的大脑出血、脑梗塞、脑炎、急性精神错乱、青光眼、精神分裂症和视网膜神经纤维层变性(包括糖尿病视网膜病变、缺血性视神经病变、X染色体连锁性视网膜劈裂症、药物诱发性视神经病变、视网膜营养不良、老年性黄斑变性、以视乳头玻璃疣为特征的眼病、以光感受器变性的遗传性决定因素为特征的眼病、常染色体隐性锥-杆细胞营养不良、伴随着视神经病变的线粒体疾病)。
[15]根据[13]所述的医药组合物，其中，免疫学疾病选自：多发性硬化症(包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症)、视神经脊髓炎、银屑病、关节炎(包括风湿性关节炎、变形性关节炎、银屑病性关节炎)、格林-巴利综合征、神经白塞氏病、恶性贫血、I型(胰岛素依赖型)糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症性肠病(IBD)、干燥综合征、古巴士德氏综合征、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、哮喘、花粉症、特应性皮肤炎、肾小球肾炎、重症肌无力症、桥本病和结节病。
[16]根据[13]所述的医药组合物，其中，神经学疾病或免疫学疾病选自脊髓损伤、神经外伤(包括视神经外伤)和多发性硬化症(包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症)。
[17]一种分离得到的抗RGMa抗体或其抗原结合片段，其轻链的互补性决定区域1(LCDR1)、轻链的互补性决定区域2(LCDR2)、轻链的互补性决定区域3(LCDR3)、重链的互补性决定区域1(HCDR1)、重链的互补性决定区域2(HCDR2)和重链的互补性决定区域3(HCDR3)各自的氨基酸序列为如下：
LCDR1：包含RASQDISSYLN(序列表的序列号30)
LCDR2：包含YTSRLHS(序列表的序列号31)
LCDR3：包含QQLNTLP(序列表的序列号32)
HCDR1：包含DAWMD(序列表的序列号33)
HCDR2：包含EIRSKANNHATYYAESVKG(序列表的序列号34)和
HCDR3：RDGAY(序列表的序列号35)，
或者为：
LCDR1：包含RSSQSLVHSNGNTYLH(序列表的序列号36)
LCDR2：包含KVSNRFS(序列表的序列号37)
LCDR3：包含SQSTHVP(序列表的序列号38)
HCDR1：包含TSYYWN(序列表的序列号39)
HCDR2：包含YISYDGTNNYNPSLKN(序列表的序列号40)和
HCDR3：包含SFG，
在各CDR序列中，可以取代、缺失和/或附加1个或几个氨基酸。
[18]根据[17]所述的抗RGMa抗体或其抗原结合片段，其中，重链可变区域(VH)为：
VH：包含EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS(序列表的序列号41)或与该氨基酸序列至少有90％同一性的氨基酸序列，
轻链可变区域(VL)为：
VL：包含DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME(序列表的序列号42)或与该氨基酸序列至少有90％同一性的氨基酸序列。
[19]根据[17]或[18]所述的抗RGMa抗体或其抗原结合片段，其中，抗RGMa抗体为人源化抗体。
[20]根据[17]～[19]中任一项所述的抗RGMa抗体或其抗原结合片段，其中，抗RGMa抗体具有人类IgG的恒定区域。
[21]一种RGMa结合蛋白质，其与RGMa的结合跟[17]或[18]所述的抗RGMa抗体进行竞争。
[22]一种核酸分子，其编码[17]～[20]中任一项所述的抗RGMa抗体或其抗原结合片段的蛋白质部分。
[23]根据[22]所述的核酸分子，其中，编码VH和VL的氨基酸序列的核酸序列是含有以下序列的核酸序列：
VH：gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcagatccctgagactgtcctgtaccgcctccggcttcaccttctccgacgcctggatggattgggtgcgacaggctcctggcaagggcctggaatgggtggccgagatccggtccaaggccaacaaccacgccacctactacgccgagtctgtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgtgtacctgcagatgaactccctgcggaccgaggacaccgccctgtactactgcaccagaagggacggcgcctactggggcaagggcaccacagtgacagtgtcctcc(序列表的序列号43)，和
VL：gacatccagatgacccagtccccctcctccgtgtctgcttccgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcgggcctcccaggacatctcctcctacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactacacctcccggctgcactccggcgtgccctctagattttccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgcctcctacttctgtcagcagctgaacaccctgccctggacctttggcggaggcaccaaggtggaaatggaa(序列表的序列号44)。
[24]一种重组载体，含有[22]或[23]所述的核酸分子。
[25]一种宿主细胞，含有[24]所述的重组载体。
[26]一种[17]～[20]中任一项所述的抗RGMa抗体或其抗原结合片段的制造方法，包含培养[25]所述的宿主细胞的工序。
[27]一种医药组合物，含有[17]～[20]中任一项所述的抗RGMa抗体或其抗原结合片段。
[28]根据[27]所述的医药组合物，其中，用于神经学疾病或免疫学疾病的预防、治疗或复发预防。
[29]根据[28]所述的医药组合物，其中，神经学疾病选自：肌萎缩性侧索硬化症、臂丛神经损伤、脑损伤(包括外伤性脑损伤)、脑性麻痹、格林-巴利综合征、大脑白质萎缩症、多发性硬化症(包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症)、视神经脊髓炎、脊髓灰质炎后综合征、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩症、脊椎肿瘤、横贯性脊髓炎、痴呆症(包括老年性痴呆症、轻度认知功能障碍、阿尔茨海默病、阿尔茨海默相关痴呆症)、亨廷顿氏舞蹈病、迟发性运动障碍、狂躁症、帕金森氏病、斯蒂尔-理查德综合征、唐氏综合征、重症肌无力症、神经外伤(包括视神经外伤)、血管淀粉样变病、伴随淀粉样变病的大脑出血、脑梗塞、脑炎、急性精神错乱、青光眼、精神分裂症和视网膜神经纤维层变性(包括糖尿病视网膜病变、缺血性视神经病变、X染色体连锁性视网膜劈裂症、药物诱发性视神经病变、视网膜营养不良、老年性黄斑变性、以视乳头玻璃疣为特征的眼病、以光感受器变性的遗传性决定因素为特征的眼病、常染色体隐性锥-杆细胞营养不良、伴随着视神经病变的线粒体疾病)。
[30]根据[28]所述的医药组合物，其中，免疫学疾病选自：多发性硬化症(包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症)、视神经脊髓炎、银屑病、关节炎(包括风湿性关节炎、变形性关节炎、银屑病性关节炎)、格林-巴利综合征、神经白塞氏病、恶性贫血、I型(胰岛素依赖型)糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症性肠病(IBD)、干燥综合征、古巴士德氏综合征、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、哮喘、花粉症、特应性皮肤炎、肾小球肾炎、重症肌无力症、桥本病和结节病。
[31]根据[28]所述的医药组合物，其中，神经学疾病或免疫学疾病选自脊髓损伤、神经外伤(包括视神经外伤)和多发性硬化症(包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症)。
[32]一种神经学疾病或免疫学疾病的预防、治疗或复发预防方法，包含将[1]～[7]中任一项所述的RGMa结合蛋白质对需要其的对象给予有效量的工序。
[33]一种神经学疾病或免疫学疾病的预防、治疗或复发预防方法，包括将[17]～[20]中任一项所述的抗RGMa抗体或其抗原结合片段对需要其的对象给予有效量的工序。
本发明的RGMa结合蛋白质不抑制RGMa与Neogenin的相互作用，从而能够维持与RGMa结合的Neogenin所具有的对神经细胞等的凋亡抑制等作用，因此神经细胞的保护效果强，伴随着神经细胞减少的副作用的担心少。另外，本发明的人源化抗RGMa抗体与以往的抗体相比，与人类RGMa的结合性和热稳定性等特性优异。因此，可以作为药效优异、副作用少的针对神经学疾病或免疫学疾病的医药品使用。
附图说明
图1是表示使用RGMa多克隆抗体(AF2459)、比较例抗体(r5F9)和本发明的抗体(r70E4，116A3)的RGMa-Neogenin结合抑制试验的结果的图。
图2是表示使用对照组小鼠IgG和本发明的抗体(B5.70E4，B5.116A3)的RGMa-BMP2结合抑制试验的结果的图。
图3是表示使用比较例抗体(rH5F9)、本发明的嵌合抗体(r116A3C)和本发明的人源化抗体(HE/KA，HA/KC)的抗体的热稳定性试验的结果的图。
图4是表示使用本发明的抗体(B5.70E4(左)，B5.116A3(右))的神经突起生长试验的结果的图。
图5是表示使用对照组小鼠IgG(mo-IgG2bk)和本发明的抗体(r70E4，r116A3)的使用脊髓损伤模型大鼠的效价试验的结果的图。图5中的(A)表示在脊髓压挫模型中的效价试验的结果，图5中的(B)表示在脊髓半切模型中的效价试验的结果。
图6是表示使用由PLP139-151肽诱发的多发性硬化症模型小鼠的本发明的抗体(B5.116A3)的效价试验的结果的图。左侧表示EAE评分，右侧表示体重的变化，上层表示在7日和10日后给予被检抗体时的结果，下层表示在18日和21日后给予被检抗体时的结果。
具体实施方式
为了容易地理解本发明，以下对在本发明中使用的术语进行说明。
[RGMa]
RGMa是中枢神经系统的神经突起生长抑制蛋白质，人类RGMa蛋白质如序列表的序列号1所示作为由450个氨基酸构成的前体蛋白质被生物合成。除去存在于N末端的信号肽Met1～Pro47(指从N末端侧第1位的蛋氨酸残基到第47位的脯氨酸残基为止的肽，以后同样记载)，切断Asp168与Pro169之间的肽键，除去C末端肽Arg423～Cys450，并且在成为C末端的Gly422的C末端羧基附加GPI锚。人类RGMa蛋白质以N末侧结构域(Cys48～Asp168)与C末侧结构域(Pro169～Ala424)通过二硫键连接而得的成熟蛋白质的形式介由GPI锚在细胞膜上表达。小鼠的RGMa的前体蛋白质由序列表的序列号2所示的氨基酸序列构成，大鼠的RGMa的前体蛋白质由序列表的序列号3所示的氨基酸序列构成，但因为除去C末端肽，所以作为成熟蛋白质成为相同的氨基酸序列。在本发明中，RGMa只要是与后述的Neogenin结合而发挥作用，就可以指前体蛋白质、成熟蛋白质或其活性型片段中的任一者，也可以为它们的衍生物或突变体。另外，可以为人类RGMa或来自其它生物的RGMa，但优选人类RGMa。
[Neogenin]
Neogenin在中枢神经的神经细胞等中表达，作为RGMa的受体之一发挥功能。如序列表的序列号10所示，人类Neogenin蛋白质由1461个氨基酸构成，以除去了信号肽Met1～Ala33而成熟的膜蛋白质形式进行表达。在本发明中，Neogenin只要与RGMa结合，则可以指前体蛋白质、成熟蛋白质或其RGMa结合片段中的任一者，也可以为它们的衍生物或突变体。另外，可以为人类Neogenin或来自其它生物的Neogenin，但优选人类Neogenin。
[中和]
本申请中“中和”是指能够与目标靶结合且抑制该靶的任一功能的作用。即，“中和RGMa的神经突起生长抑制活性”是指通过RGMa结合蛋白质与RGMa结合而抑制RGMa的神经突起生长抑制活性。神经突起生长抑制活性可以通过本领域中已知的几种体外(in vitro)或体内(in vivo)分析中的一种或一种以上进行评价，例如可以通过本申请说明书中记载的神经突起生长抑制试验进行评价。
[分离]
分离得到的RGMa结合蛋白质等的“分离得到的”表示经鉴定且分离得到的、和/或从自然状态下的成分中回收得到的。自然状态下的杂质是能妨碍该抗体的诊断使用或治疗使用的物质，可举出酶、激素和其它蛋白质性的或非蛋白质性的溶质。一般，为了分离RGMa结合蛋白质等，通过至少1个纯化工序进行纯化即可，可以将通过至少1个纯化工序纯化而得的RGMa结合蛋白质称为“分离得到的RGMa结合蛋白质”。
[RGMa结合蛋白质]
本申请中“RGMa结合蛋白质”是指含有与RGMa结合的蛋白质的分子。作为RGMa结合蛋白质，可举出抗RGMa抗体及其抗原结合片段、以及RGMa结合支架蛋白质、以及Neogenin的细胞外结构域等可溶性RGMa受体蛋白质、以及它们的融合蛋白质。RGMa结合支架蛋白质是指通过对丝氨酸蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域或人类的纤维连接蛋白的细胞外结构域、锚蛋白、脂质转运蛋白等导入突变而实现与RGMa的结合功能的蛋白质。融合蛋白质是指将RGMa结合蛋白质与聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF-β、NGF、神经营养因子等)、白蛋白、酶、其它抗体等除本申请的RGMa结合蛋白质以外的功能分子进行化学结合或基因工程结合而得的RGMa结合蛋白质。
[人类抗体]
人类抗体是指轻链、重链都来自人类免疫球蛋白的抗体。人类抗体因重链的恒定区域不同而包含具有γ链的重链的IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、具有μ链的重链的IgM、具有α链的重链的IgA(包括IgA1、IgA2)、具有δ链的重链的IgD、或具有ε链的重链的IgE。另外，原则上，轻链包含κ链和λ链中的任一者。
[人源化抗体]
人源化抗体是指由以下可变区域和以下恒定区域构成的抗体，所述可变区域由来自非人类动物的抗体的互补性决定区域和来自人类抗体的框架区域所构成，所述恒定区域来自人类抗体。
[嵌合抗体]
嵌合抗体是指轻链、重链或这两者由来自非人类的可变区域和来自人类的恒定区域构成的抗体。
[抗RGMa抗体]
本申请中抗RGMa抗体是指与RGMa结合的免疫球蛋白分子或其改变分子。改变分子中包括多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、功能改变抗体和偶联抗体。
[多特异性抗体]
多特异性抗体是指具有2种以上不同的抗原特异性的具有2个以上的独立的抗原识别部位的非对称抗体，可举出具有2种抗原特异性的双特异性抗体、具有3种抗原特异性的三特异性抗体等。
[功能改变抗体]
本申请中功能改变抗体是指主要通过改变抗体的Fc区域的氨基酸、糖链来改变抗体所具有的抗原结合功能以外的功能例如细胞杀伤功能、补体活化功能或血中半衰期延长功能的抗体。
[偶联抗体]
本申请中偶联抗体是指使抗体与聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF-β、NGF、神经营养因子等)、白蛋白、酶等除抗体以外的功能分子进行化学结合或基因工程结合而得的抗体。
[抗原结合片段]
本申请中抗原结合片段是指包含抗体的一部分的蛋白质，能够与抗原结合。作为抗原结合片段的例子，可举出F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv(variable fragment of antibody)、二硫键Fv、单链抗体(scFv)和它们的聚合物等。此外，抗原结合片段包含化学或基因工程地结合了聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF-β、NGF、神经营养因子等)、白蛋白、酶、其它抗体等除本申请的抗RGMa抗体以外的功能分子的偶联抗原结合片段。
[互补性决定区域]
互补性决定区域(CDR)是指免疫球蛋白分子的可变区域中的形成抗原结合部位的区域，也称为超可变区域，是指每个免疫球蛋白分子中氨基酸序列的变化特别大的部分。CDR中轻链和重链各自有3个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3和HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本申请中，免疫球蛋白分子的CDR由Kabat编号系统(Kabat等，1987，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Department of Health and Human Services，NIH，USA)决定。
[氨基酸序列的百分比(％)同一性]
这里，可变区域等的涉及经鉴定的参照多肽序列的“百分比(％)同一性”是将序列整列，为了得到最大的％同一性而根据需要导入间隙，任何的保守性取代均不视为序列同一性的一部分后，作为与特定的参照多肽序列的氨基酸残基相同的候补序列中的氨基酸残基的百分比来进行定义。以测定％同一性为目的的比对可以通过使用本领域技术人员的技能范围内的各种方法、例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件这样的可公开获得的计算机软件而实现。本领域技术人员可以决定用于比对序列的适当参数，其包括为了对被比较的序列的全长实现最大的比对所需的任意算法。但是，为了达成此处的目的，％同一性值可以通过在双序列比对中使用序列比较计算机程序BLAST而得到。
在氨基酸序列比较中使用BLAST时，所给的氨基酸序列A与所给的氨基酸序列B的％同一性如下进行计算：
分率X/Y的100倍
这里，X为在序列比对程序BLAST的对A和B的程序比对中判断为相同这样一致的得分的氨基酸残基数目，Y为B的总氨基酸残基数目。可知：氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不同时，A相对于B的％同一性与B相对于A的％同一性不同。只要没有特别说明，这里的全部的％同一性值正如上方的段落所示，使用BLAST计算机程序而得到。
[竞争]
本申请中，与本发明的抗RGMa抗体进行“竞争”是指利用本说明书中记载的表面等离子共振(SPR)法进行测定时，由于该抗RGMa抗体或其抗原结合片段的存在，因此本发明的抗RGMa抗体与RGMa的结合以显著差异降低。
以下，对本发明进行详细说明。
＜RGMa结合蛋白质＞
本发明的RGMa结合蛋白质是不抑制RGMa与Neogenin的结合且中和RGMa的神经突起生长抑制活性的经分离得到的RGMa结合蛋白质。
作为RGMa蛋白质，优选来自哺乳类的RGMa蛋白质，例如，作为人类的RGMa蛋白质，可举出具有序列表的序列号1的氨基酸序列的蛋白质，作为小鼠的RGMa蛋白质，可举出具有序列表的序列号2的氨基酸序列的蛋白质，作为大鼠的RGMa蛋白质，可举出具有序列表的序列号3的氨基酸序列的蛋白质。另外，可以为含有在上述序列中取代、缺失、插入和/或附加了1个或几个(优选1～20个、更优选1～10个、更优选1～5个)氨基酸的氨基酸序列而成的且具有与RGMa蛋白质实质上相同的活性的多肽，或含有相对于上述氨基酸序列具有90％以上(优选95％以上)同一性的氨基酸序列的多肽。
这里，“具有与RGMa蛋白质实质上相同的活性”是指该多肽只要具有神经突起生长抑制作用，则可以包含任意多肽。
上述氨基酸的取代优选保守性取代。这里“保守性取代”表示以实质上不改变肽活性的方式用其它化学上类似的氨基酸残基来取代氨基酸残基。例如可举出将某疏水性残基用另一疏水性残基取代的情况、将某极性残基用具有相同电荷的另一极性残基取代的情况等。作为可以进行这样的取代的、功能上类似的氨基酸的例子，作为非极性(疏水性)氨基酸，可举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为具有正电荷(碱性)的氨基酸，可举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外，作为具有负电荷(酸性)的氨基酸，可举出天冬氨酸、谷氨酸等。
本发明的RGMa结合蛋白质与RGMa结合表示RGMa特异性结合，优选相对于人类RGMa的解离常数(Kd)低，可举出如下RGMa结合蛋白质：作为上限值，例如为10-8M以下，更优选为10-9M以下，进一步优选为10-10M以下，作为下限值，没有特别限定，但例如为10-14M以上，更优选为10-13以上。
RGMa蛋白质作为成熟蛋白质由N末侧结构域和C末侧结构域构成，但C末侧结构域单独也具有神经突起生长抑制活性。优选本发明的RGMa结合蛋白质仅与RGMa的C末侧结构域结合且中和神经突起生长抑制活性。进一步优选相对于人类RGMa的C末侧结构域的解离常数(Kd)低，可举出如下RGMa结合蛋白质：作为上限值，例如为10-8M以下，更优选为10-9M以下，进一步优选为10-10M以下，作为下限值，没有特别限定，但例如为10-14M以上，更优选为10-13以上。
本发明的RGMa结合蛋白质不抑制RGMa与Neogenin的结合。这里，“不抑制RGMa与Neogenin的结合”表示在后述的实施例所示的RGMa与Neogenin的结合系统中即便增加RGMa结合蛋白质的浓度，RGMa与Neogenin的结合实质上也不减少。例如，在RGMa与Neogenin的结合系统中添加RGMa结合蛋白质来增加其浓度的情况下，如果表示IC50的RGMa结合蛋白质浓度为10μg/mL以上、更优选为50μg/mL以上、最优选为100μg/mL以上，则可以说该RGMa结合蛋白质不抑制RGMa与Neogenin的结合。
作为在与RGMa的结合试验中使用的Neogenin，优选与RGMa同种的Neogenin。即，优选对小鼠RGMa使用小鼠Neogenin，对人类RGMa使用人类Neogenin。作为人类Neogenin的一个例子，可例示具有序列表的序列号10的氨基酸序列的蛋白质，但只要能够与RGMa结合，也可以是具有与序列表的序列号10具有90％以上(优选95％以上)同一性的氨基酸序列的蛋白质。
本发明的RGMa结合蛋白质中和RGMa的神经突起生长抑制活性。神经突起生长抑制活性可以通过后述的实施例所示的神经突起生长试验进行评价。如果添加RGMa，则抑制神经突起的生长，结果通过添加RGMa结合蛋白质而不发生因RGMa所致的神经突起生长抑制。本发明的RGMa结合蛋白质可以中和50％以上、更优选80％以上、最优选90％以上的RGMa添加所致的神经突起生长的抑制。
RGMa蛋白质的氨基酸序列因动物种类而不同，因此在序列表的序列号1所示的人类RGMa与序列表的序列号2所示的小鼠RGMa、序列表的序列号3所示的大鼠RGMa之间氨基酸序列存在差异。一般在抗体医药等蛋白质制剂的药理试验或安全性试验中，使用小鼠或大鼠等啮齿类作为实验材料，因此本发明的RGMa结合蛋白质优选与小鼠或大鼠的RGMa结合，进一步优选相对于小鼠或大鼠的RGMa的Kd低。可举出如下RGMa结合蛋白质：作为Kd的上限值，例如为5x10-7M以下，更优选为10-8M以下，进一步优选为10-9M以下，作为下限值，没有特别限定，但例如为10-12M以上，更优选为10-11以上。
本发明的RGMa结合蛋白质优选热稳定性优异。热稳定性可以通过因加热处理所致的与RGMa的结合的降低来进行评价，优选经60℃以上的热处理也稳定，更优选经65℃以上的热处理也稳定，最优选经70℃以上的热处理也稳定。
本发明的RGMa结合蛋白质与RGMa结合时的结合部位没有特别限定，例如，为人类RGMa时，优选与EEVVNAVEDWDSQG(序列表的序列号26)(序列表的序列号1的氨基酸编号298-311)、NQQIDFQAFHTNAE(序列表的序列号27)(序列表的序列号1的氨基酸编号322-335)、PTAPETFPYET(序列表的序列号28)(序列表的序列号1的氨基酸编号349-359)、KLPVEDLYYQA(序列表的序列号29)(序列表的序列号1的氨基酸编号367-377)中的1个以上的肽结合。更优选与序列表的序列号26和27结合，更优选与序列表的序列号26和27结合且与序列表的序列号28或29结合。
作为RGMa结合蛋白质，具体而言，可举出抗RGMa抗体、RGMa结合支架蛋白质以及它们的融合蛋白质。
＜抗RGMa抗体＞
本发明的抗RGMa抗体包含：将RGMa蛋白质或其部分片段(例如，包含上述序列表的序列号26～29中的1个以上的片段)作为抗原并以该抗原对小鼠等哺乳动物免疫而得到的多克隆抗体或单克隆抗体、使用基因重组技术制造的嵌合抗体和人源化抗体、以及使用产生人类抗体的转基因动物等制造的人类抗体等。将本发明的抗体作为医药品向人类给药时，从副作用的观点考虑，优选人源化抗体或人类抗体。
抗原可以直接用于免疫，也可以作为与载体蛋白质的复合体使用。在抗原与载体蛋白质的复合体的制备中可以使用戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活性酯等缩合剂。载体蛋白质可例示牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、血蓝蛋白、KLH等。
作为免疫的哺乳动物，可举出小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、猪、山羊、马或牛，接种方法可举出皮下、肌肉或腹腔内的给药。给药时可以与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂混和给药，给药通常每2～5周各进行1次。由免疫的动物的脾脏或淋巴结得到的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，以杂交瘤的形式被分离。作为骨髓瘤细胞，使用来自哺乳动物、例如来自小鼠、大鼠、人类等的骨髓瘤细胞。
＜多克隆抗体＞
多克隆抗体可以利用现有的一般的制造方法而获得。即，例如可以将如前所述的抗原与根据需要的弗氏佐剂(Freund’s Adjuvant)一起对如上所述的哺乳动物进行免疫，从而从由该免疫致敏动物得到的血清中获得。
＜单克隆抗体＞
单克隆抗体具体而言可以如下获得。即，将如前所述的抗原作为免疫原，将该免疫原与根据需要的弗氏佐剂(Freund’s Adjuvant)一起向如上所述的哺乳动物的皮下、肌肉内、静脉内、足垫内或腹腔内注射1～几次或进行移植，从而实施免疫致敏。通常，自初次免疫起约每1～14天进行1～4次免疫，自最终免疫起约1～5天后从经免疫致敏的该哺乳动物中获得抗体生成细胞。
单克隆抗体可以使用本领域技术人员公知的方法而得到(例如，《CurrentProtocols in Molecular Biology》(John Wiley&Sons(1987))，Antibodies:ALaboratory Manual,Ed.Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。
分泌单克隆抗体的“杂交瘤”的制备可以按照Koehler和Milstein等的方法(自然(Nature),256,495,1975)和基于该方法的修饰方法进行。即，通过使由经免疫致敏的哺乳动物获得的脾脏等中含有的抗体生成细胞与来自哺乳动物优选小鼠、大鼠或人类的无自身抗体产生能力的骨髓瘤细胞进行细胞融合来制备。
作为在细胞融合中使用的骨髓瘤细胞，例如可以使用来自小鼠的骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653)、P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)、P3/X63-Ag8.U1(P3U1)、SP2/0-Ag14(Sp2/O，Sp2)、PAI、F0或BW5147，来自大鼠的骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.，来自人类的骨髓瘤U-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11或CEM-T15等。
作为融合促进剂，可举出聚乙二醇等，通常可以使用20～50％左右的浓度的聚乙二醇(平均分子量1000～4000)在20～40℃、优选30～37℃的温度下，通常使抗体生成细胞数与骨髓瘤细胞数之比为1：1～10：1左右，反应约1～10分钟左右来实施细胞融合。
产生单克隆抗体的杂交瘤克隆体的筛选可以通过如下方式进行：将杂交瘤在例如微孔板中培养，利用ELISA等免疫化学方法来测定孔的培养上清液的对免疫抗原的反应性。
在产生抗体的杂交瘤的筛选中，除了与RGMa蛋白质的结合分析以外，还进行该抗体是否不抑制RGMa蛋白质与Neogenin的结合的评价、以及该抗体是否中和RGMa蛋白质的功能(神经突起生长抑制活性)的评价。可以通过这些筛选方法来选择本发明的抗RGMa抗体。
可以从含有产生目标抗体的杂交瘤的孔中进一步利用有限稀释法进行克隆而得到克隆体。杂交瘤的分选、育种通常在添加HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)、含有10～20％胎牛血清的动物细胞用培养基中进行。
由杂交瘤制造单克隆抗体可以通过如下方式进行：将杂交瘤在体外培养，或者使其在小鼠、大鼠等哺乳动物的腹水中等进行体内增殖，从得到的培养上清液或哺乳动物的腹水中进行分离。
在体外培养时，可以配合培养的细胞种类的特性和培养方法等各种条件，使用使杂交瘤增殖、维持并保存且适合在培养上清液中产生单克隆抗体的营养培养基。
作为基础培养基，例如可举出Ham’F12培养基、MCDB153培养基或低钙MEM培养基等低钙培养基和MCDB104培养基、MEM培养基、D-MEM培养基、RPMI1640培养基、ASF104培养基或RD培养基等高钙培养基等，该基础培养基可以根据目的含有例如血清、激素、细胞因子和/或各种无机或有机物质等。
单克隆抗体的分离、纯化可以通过将上述培养上清液或腹水供于饱和硫酸铵、优球蛋白沉淀法、己酸法、辛酸法、离子交换色谱(DEAE或DE52等)、抗免疫球蛋白柱或蛋白A柱等亲和柱色谱等而进行。具体而言，单克隆抗体的纯化使用已知的方法作为免疫球蛋白纯化法即可，例如可以通过利用硫酸铵分级法、PEG分级法、乙醇分级法、阴离子交换剂，以及使用了RGMa蛋白质的亲和色谱等方法而容易地实现。
单克隆抗体也可以通过噬菌体展示法获得。在噬菌体展示法中，使用目标免疫原对由任意噬菌体抗体文库选出的噬菌体进行筛选，选择对免疫原具有期望的结合性的噬菌体。接着，对噬菌体内含有的抗体对应序列进行分离或测序，基于分离得到的序列或测定的序列信息，构建含有编码抗体或抗原结合结构域的核酸分子的表达载体。然后，可以通过培养转染了上述表达载体的细胞株而生成单克隆抗体。作为噬菌体抗体文库，可以通过使用人类抗体文库而生成具有期望的结合性的人类抗体。
作为支架蛋白质，可利用人类的丝氨酸蛋白酶抑制剂的Kunitz结构域或人类的纤维连接蛋白的细胞外结构域等，如果改变支架上的靶结合部位的序列，则可以生成与RGMa结合的支架蛋白质(Clifford Mintz et.al BioProcess International,2013,Vol.11(2),pp40-48)。
作为融合蛋白质，可举出将RGMa结合蛋白质与聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF-β、NGF、神经营养因子等)、白蛋白、酶、其它抗体等除本申请的RGMa结合蛋白质以外的功能分子进行化学结合或基因工程结合而得的RGMa结合蛋白质。
结合PEG作为功能分子时，PEG可以非限定地使用分子量2000～100000Da、更优选10000～50000Da的PEG，可以为直链型，也可以为支链型。PEG例如可以通过使用NHS活性基团而与RGMa结合蛋白质的氨基酸的N末端氨基等结合。
使用放射性物质作为功能分子时，可使用131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性物质可以利用氯胺T法等与RGMa结合蛋白质直接结合。
使用毒素作为功能分子时，可使用细菌毒素(例如，白喉毒素)、植物毒素(例如，蓖麻毒素)、低分子毒素(例如，格尔德霉素)、美登素类和卡奇霉素等。
使用低分子化合物作为功能分子时，可举出柔红霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、新制癌菌素、长春地辛和FITC等荧光色素等。
使用酶作为功能分子时，可使用荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4737456号)、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环式氧化酶(例如，尿酸酶和黄嘌呤氧化酶等)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
作为将毒素、低分子化合物或酶进行化学结合时使用的连接子，可举出二价自由基(例如，亚烷基、亚芳基、亚杂芳基)、-(CR2)nO(CR2)n-(R为任意取代基，n为正整数)表示的连接子、烷氧基的重复单元(例如，聚亚乙基氧、PEG、聚亚甲基氧等)和烷基氨基(例如，聚亚乙基氨基、JeffamineTM)、以及二酸酯和酰胺(可举出琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酯、丙二酸酯和己酰胺等)。结合功能分子的化学修饰方法在该领域已经被确立(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal antibodies.,1998T.J.InternationalLtd,Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.,1998Marcel Dekker Inc；Chariet al.,Cancer Res.,1992Vol152:127；Liu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,1996Vol93:8681)。
作为本发明的RGMa结合蛋白质所优选的形态，可举出嵌合抗体。作为“嵌合抗体”，可例示可变区域为来自非人类动物(小鼠、大鼠、仓鼠、鸡等)的免疫球蛋白的可变区域、恒定区域为来自人类免疫球蛋白的恒定区域的嵌合抗体。例如可以通过将抗原对小鼠进行免疫，从该小鼠单克隆抗体的基因中切出与抗原结合的可变区域，与来自人类骨髓的抗体恒定区域结合而制作。来自人类免疫球蛋白的恒定区域根据IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD和IgE等同型而各自具有固有的氨基酸序列，本发明中的重组嵌合抗体的恒定区域可以为属于任意同型的人类免疫球蛋白的恒定区域。优选为人类IgG的恒定区域。可以使用这样制作的嵌合抗体的基因来制作表达载体。用该表达载体对宿主细胞进行转化而得到产生嵌合抗体的转化细胞，通过培养该转化细胞，从而从培养上清液中得到目标嵌合化抗体。
作为本发明的RGMa结合蛋白质的另一优选形态，可举出人源化抗体。本发明中的“人源化抗体”是仅将小鼠等非人类动物抗体的抗原结合部位(CDR；互补性决定区域)的DNA序列移植(CDR移植)到人类抗体基因而得的抗体。例如可以参照日本特表平4-506458号公报和日本专利2912618号说明书等所记载的方法进行制作。具体而言，是指具有如下特征的人源化抗体：其CDR的一部分或全部为来自非人类哺乳动物(小鼠、大鼠、仓鼠等)的单克隆抗体的CDR，其可变区域的框架区域为来自人类免疫球蛋白的可变区域的框架区域，且其恒定区域为来自人类免疫球蛋白的恒定区域。
本发明中的人源化抗体例如可以如下进行制造。然而，当然不限定于这样的制造方法。
例如，来自小鼠单克隆抗体的重组人源化抗体可以参照日本特表平4-506458号公报和日本特开昭62-296890号公报等以基因工程的方式进行制作。即，从产生小鼠单克隆抗体的杂交瘤中分离小鼠重链CDR部分的DNA和小鼠轻链CDR部分的DNA，从人类免疫球蛋白基因中分离除人类重链CDR以外的全部区域的人类重链基因和除人类轻链CDR以外的全部区域的人类轻链基因。
将移植了经分离得到的小鼠重链CDR部分的DNA的人类重链基因以可表达的方式导入到适当的表达载体中，同样地将移植了小鼠轻链CDR部分的DNA的人类轻链基因以可表达的方式导入到适当的另一个表达载体中。或者，也可以将移植了小鼠的CDR的人类的重链和轻链基因以可表达的方式导入到同一表达载体中。用这样制作的表达载体对宿主细胞进行转化而得到产生人源化抗体的转化细胞，培养该转化细胞，由此从培养上清液中得到目标人源化抗体。
作为本发明的RGMa结合蛋白质的另一优选形态，可举出人类抗体。人类抗体是指包括构成免疫球蛋白的重链的可变区域和重链的恒定区域以及轻链的可变区域和轻链的恒定区域的全部区域均为来自编码人类免疫球蛋白的基因的免疫球蛋白的抗体，可以通过将人类抗体基因导入到小鼠而制作。具体而言，例如可以通过至少将人类免疫球蛋白基因接入小鼠等人类以外的哺乳动物的基因座中，将由此制作的转基因动物用抗原进行免疫致敏，从而与前述的多克隆抗体或单克隆抗体的制作方法同样地进行制造。
例如，产生人类抗体的转基因小鼠可以按照Nature Genetics,Vol.7,p.13-21,1994；Nature Genetics,Vol.15,p.146-156,1997；日本特表平4-504365号公报；日本特表平7-509137号公报；国际公开WO94/25585号小册子；Nature,Vol.368,p.856-859,1994；和日本特表平6-500233号公报等中记载的方法进行制作。更具体而言，可举出HuMab(注册商标)小鼠(Medarex,Princeton NJ)、KMTM小鼠(Kirin Pharma Company,Japan)、KM(FCγRIIb-KO)小鼠等。
作为本发明的单克隆抗体，具体而言，可举出在重链可变区域的CDR中包含序列表的序列号33(HCDR1)、34(HCDR2)和35(HCDR3)的氨基酸序列且在轻链可变区域的CDR中包含序列表的序列号30(LCDR1)，31(LCDR2)和32(LCDR3)的氨基酸序列的单克隆抗体。
应予说明，只要维持具有与RGMa的结合能力、不抑制RGMa与Neogenin的结合、中和RGMa的神经突起生长抑制活性这样的本发明的抗体的特性，则对于这些CDR中的1个以上也可以取代1～几个氨基酸。这里，1～几个是指例如为1个或2个。应予说明，为了维持本发明的特性，该氨基酸取代优选为保守性取代。维持抗体的特性是指这些特性与CDR的氨基酸序列改变前相比为相同程度，例如维持80％以上、优选90％以上、进一步优选95％以上。应予说明，维持也包含提高。
CDR以外的区域只要是能够维持作为抗体的结构并发挥功能的序列，就没有特别限制，可以为来自小鼠的序列、来自人类的序列、来自其它哺乳动物的序列以及它们的嵌合体序列、人工序列中的任一者。包含恒定区域时，重链和轻链的恒定区域的氨基酸序列可例示Nucleic Acids Research vol.14,p1779,1986，The Journal of BiologicalChemistry vol.257,p1516,1982和Cell vol.22,p197,1980中记载的氨基酸序列。
作为具有这些CDR的小鼠抗体，可例示在轻链中具有序列表的序列号4的氨基酸序列、在重链中具有序列表的序列号5的氨基酸序列的抗体。应予说明，在这些氨基酸序列中，只要维持具有与RGMa的结合能力、不抑制RGMa与Neogenin的结合、中和RGMa的神经突起生长抑制活性这样的特性，也可以取代、缺失、附加或插入1个或几个氨基酸(1～20个、1～10个或1～5个)。这样的取代、缺失、附加可以导入到CDR中，但优选导入到CDR以外的区域。而且，为了维持本发明的特性，该氨基酸取代优选为保守性取代。
另外，在上述小鼠抗体中，还可例示恒定区域来自人类的小鼠/人类嵌合抗体。作为这样的小鼠/人类嵌合抗体，可例示在轻链中具有序列表的序列号8的氨基酸序列(可变区域为1～107)、在重链中具有序列表的序列号9的氨基酸序列(可变区域为1～116)的抗体。应予说明，在这些氨基酸序列中，只要维持具有与RGMa的结合能力、不抑制RGMa与Neogenin的结合、中和RGMa的神经突起生长抑制活性这样的特性，也可以取代、缺失、附加或插入1个或几个氨基酸(1～20个、1～10个或1～5个)。这样的取代、缺失、附加可以导入到CDR中，但优选导入到CDR以外的区域。另外，为了维持本发明的特性，该氨基酸取代优选为保守性取代。
此外，也可例示CDR以外来自人类的人源化抗体。作为这样的人源化抗体，可例示重链具有序列表的序列号11～18(可变区域是到N末端侧116残基为止)中的任一氨基酸序列、轻链具有序列表的序列号19～25(可变区域是到N末端侧1～107残基为止)中的任一氨基酸序列的抗体。
应予说明，在人源化抗体的氨基酸序列(重链：序列表的序列号11～18，轻链：序列表的序列号19～25)中，只要维持具有与RGMa的结合能力、不抑制RGMa与Neogenin的结合、中和RGMa的神经突起生长抑制活性这样的特性，也可以取代、缺失、附加或插入1个或几个氨基酸(1～20个、1～10个或1～5个)。这样的取代、缺失、附加可以导入到CDR中，但优选导入到CDR以外的区域。另外，为了维持本发明的特性，该氨基酸取代优选为保守性取代。
重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列可以为它们的任意组合，但特别优选为重链具有序列表的序列号15的氨基酸序列、轻链具有序列表的序列号19的氨基酸序列的抗体。在序列表的序列号15的氨基酸序列中，将相当于重链可变区域的氨基酸序列示于序列表的序列号41，将相当于轻链可变区域的氨基酸序列示于序列表的序列号42。即，本发明的特别优选的抗体是重链可变区域具有序列表的序列号41的氨基酸序列、轻链可变区域具有序列表的序列号42的氨基酸序列的抗体。
应予说明，在这些氨基酸序列中，只要维持具有与RGMa的结合能力、不抑制RGMa与Neogenin的结合、中和RGMa的神经突起生长抑制活性这样的特性，也可以取代、缺失、附加或插入1个或几个氨基酸(1～20个、1～10个或1～5个)。这样的取代、缺失、附加可以导入到CDR中，但优选导入到CDR以外的区域。而且，为了维持本发明的特性，该氨基酸取代优选为保守性取代。
对于这样的在序列表的序列号41和/或序列表的序列号42的氨基酸序列中包含了取代、缺失等的本发明的抗体的氨基酸序列，重链可变区域为与序列表的序列号41具有90％以上(更优选95％、96％、97％、98％、99％以上)同一性的氨基酸序列，轻链可变区域为与序列表的序列号42具有90％以上(更优选95％、96％、97％、98％、99％以上)同一性的氨基酸序列。
作为本发明的单克隆抗体的另一具体例，可举出重链可变区域的CDR包含序列表的序列号39(HCDR1)、40(HCDR2)和SFG(HCDR3)的氨基酸序列且轻链可变区域的CDR包含序列表的序列号36(LCDR1)、37(LCDR2)和38(LCDR3)的氨基酸序列的单克隆抗体。应予说明，只要维持具有与RGMa的结合能力、不抑制RGMa与Neogenin的结合、中和RGMa的神经突起生长抑制活性这样的本发明的抗体的特性，则对于这些CDR的1个以上也可以取代1～几个氨基酸。
这里，1～几个是指例如为1个或2个。应予说明，为了维持本发明的特性，该氨基酸取代优选为保守性取代。
CDR以外的区域只要是能够维持作为抗体的结构并发挥功能的序列，就没有特别限制，可以为来自小鼠的序列、来自人类的序列、来自其它哺乳动物的序列以及它们的嵌合体序列、人工序列中的任一者。包含恒定区域时，重链和轻链的恒定区域的氨基酸序列可例示Nucleic Acids Research vol.14,p1779,1986，The Journal of BiologicalChemistry vol.257,p1516,1982和Cell vol.22,p197,1980中记载的氨基酸序列。
作为具有这些CDR的小鼠抗体，可例示轻链具有序列表的序列号6的氨基酸序列、重链具有序列表的序列号7的氨基酸序列的抗体。应予说明，在这些氨基酸序列中，只要维持具有与RGMa的结合能力、不抑制RGMa与Neogenin的结合、中和RGMa的神经突起生长抑制活性这样的特性，也可以取代、缺失、附加或插入1个或几个氨基酸(1～20个、1～10个或1～5个)。这样的取代、缺失、附加可以导入到CDR中，但优选导入到CDR以外的区域。另外，为了维持本发明的特性，该氨基酸取代优选为保守性取代。
另外，在上述小鼠抗体中，也可例示恒定区域来自人类的嵌合抗体。此外，也可例示CDR以外来自人类的人源化抗体。
本发明的抗RGMa抗体中包含具有由特定的氨基酸序列构成的CDR(例如，作为LCDR1的序列表的序列号30、作为LCDR2的序列表的序列号31、作为LCDR3的序列表的序列号32、作为HCDR1的序列表的序列号33、作为HCDR2的序列表的序列号34、作为HCDR3的序列表的序列号35的氨基酸序列)或由特定的氨基酸序列构成的可变区域(例如，作为重链可变区域的序列表的序列号41、作为轻链可变区域的42的氨基酸序列)的多特异性抗体、功能改变抗体、偶联抗体。
本发明的抗RGMa抗体可以通过利用基因工程方法将具有RGMa以外的其它抗原结合特异性的抗体与其本身结合来制作双特异性抗体等多特异性抗体。该基因工程方法已经在该领域中确立。例如如果利用串联连接了可变区域的DVD-Ig(Wu等，NatureBiotechnology 25(11),1290(2007))、通过改变抗体的Fc区域从而将与不同抗原结合的2种抗体的重链组合的ART-Ig的技术(Kitazawa等，Nature Medicine 18(10),1570(2012))，则能够获得期望的双特异性抗体。作为RGMa以外的其它抗原，可非限定地举出Nogo、MAG、Omgp、CSPG、Sema3A、Lingo-1等抑制神经突起生长的因子或TNF-α、IL-6受体、CD3、CD20、α4整合蛋白、BLys、胸腺基质淋巴细胞生成素、IgE、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17、IL-23、IL-25等免疫相关分子。
作为本发明的抗RGMa抗体的改变分子，可举出功能改变抗体。功能改变抗体是指主要通过改变Fc区域等而改变细胞杀伤功能、补体活化功能、血中半衰期延长功能等功能的抗体(设乐研也，药学杂志，2009，Vol.129(1),p3；石井明子等，日本药理学杂志，2010，Vol.136(5),p280；桥口周平等，生化学，2010，Vol.82(8),p710)。
抗RGMa抗体的功能改变抗体利用如下方法进行制备。例如，如果使用破坏了α1,6-岩藻糖转移酶(FUT8)基因的CHO细胞作为宿主细胞来制造本申请抗RGMa抗体，则得到糖链的岩藻糖含量降低、细胞杀伤功能提高的抗体，如果将导入了FUT8基因的CHO细胞作为宿主细胞进行制造，则得到细胞杀伤功能低的抗体(国际公开第2005/035586号，国际公开第2002/31140号，国际公开第00/61739号)。另外，可以通过改变Fc区域的氨基酸残基来调节补体活化功能(美国专利第6737056号、美国专利第7297775号、美国专利第7317091号)。此外，可以通过使用增强了与作为Fc受体之一的FcRn的结合的Fc区域变异体来实现血中半衰期的延长(桥口周平等，生化学，2010，Vol.82(8),p710)。这些功能改变抗体可以进行基因工程制造。
作为本发明的抗RGMa抗体的改变分子，可举出偶联抗体。作为偶联抗体，可举出使抗RGMa抗体与聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF-β、NGF、神经营养因子等)、白蛋白、酶、其它抗体等除本申请的抗RGMa抗体以外的功能分子进行化学结合或基因工程结合而得的偶联抗体。
结合PEG作为功能分子时，PEG可以非限定地使用分子量2000～100000Da、更优选10000～50000Da的PEG，可以为直链型，也可以为支链型。PEG例如可以通过使用NHS活性基团而与抗体的氨基酸的N末端氨基等结合。
使用放射性物质作为功能分子时，可使用131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性物质可以利用氯胺T法等与抗体直接结合。
使用毒素作为功能分子时，可使用细菌毒素(例如，白喉毒素)、植物毒素(例如，蓖麻毒素)、低分子毒素(例如，格尔德霉素)、美登素类和卡奇霉素等。
使用低分子化合物作为功能分子时，可举出柔红霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、新制癌菌素、长春地辛和FITC等荧光色素等。
使用酶作为功能分子时，可使用荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4737456号)、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环式氧化酶(例如，尿酸酶和黄嘌呤氧化酶等)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
作为将毒素、低分子化合物或酶进行化学结合时使用的连接子，可举出二价自由基(例如，亚烷基、亚芳基、亚杂芳基)、-(CR2)nO(CR2)n-(R为任意取代基，n为正整数)表示的连接子、烷氧基的重复单元(例如，聚亚乙基氧、PEG、聚亚甲基氧等)和烷基氨基(例如，聚亚乙基氨基、JeffamineTM)、以及二酸酯和酰胺(可举出琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酯、丙二酸酯和己酰胺等)。结合功能分子的化学修饰方法已经在该领域中确立(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal antibodies.,1998T.J.InternationalLtd,Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.,1998Marcel Dekker Inc；Chariet al.,Cancer Res.,1992Vol152:127；Liu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,1996Vol93:8681)。
本发明中的抗体的“抗原结合片段”是指如前所述的抗体的具有抗原结合性的一部分区域，具体而言，可举出F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv(抗体可变区域片段、variablefragment of antibody)、二硫键Fv、单链抗体(scFv)以及它们的聚合物等，另外在抗原结合片段中包含化学结合或基因工程结合有聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF-β、NGF、神经营养因子等)、白蛋白、酶、其它抗体等除本申请的抗RGMa抗体以外的功能分子的偶联抗原结合片段。
这里，“F(ab’)2”和“Fab”是指将免疫球蛋白用属于蛋白分解酶的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等处理而制造、在铰链区域中的存在于2条重链间的二硫键的前后被消化而生成的抗体片段。例如，如果用木瓜蛋白酶对IgG进行处理，则在铰链区域中的存在于2条重链间的二硫键的上游被切断，能够制造由VL(轻链可变区域)和CL(轻链恒定区域)构成的轻链以及由VH(重链可变区域)和CHγ1(重链恒定区域中的γ1区域)构成的重链片段在C末端区域由二硫键结合的相同的2个抗体片段。将这2个相同的抗体片段各自称为Fab。另外，如果用胃蛋白酶对IgG进行处理，则在铰链区域中的存在于2条重链间的二硫键的下游被切断，能够制造比在铰链区域连接了上述2个Fab的抗体片段稍大的抗体片段。将该抗体片段称为F(ab’)2。
作为本发明的抗RGMa抗体的抗原结合片段的改变分子，可举出偶联抗原结合片段。作为偶联抗原结合片段，可举出在抗RGMa抗体的具有抗原结合性的一部分区域化学结合或基因工程结合有聚乙二醇(PEG)等非肽性聚合物、放射性物质、毒素、低分子化合物、细胞因子、生长因子(TGF-β、NGF、神经营养因子等)、白蛋白、酶、其它抗体等除本申请的抗RGMa抗体以外的功能分子的偶联抗原结合片段。
结合PEG作为功能分子时，PEG可以非限定地使用分子量2000～100000Da、更优选10000～50000Da的PEG，可以为直链型，也可以为支链型。PEG例如通过使用NHS活性基团而与抗RGMa抗体的具有抗原结合性的一部分区域的N末端氨基等结合。
使用放射性物质作为功能分子时，可使用131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性物质可以利用氯胺T法等与抗RGMa抗体的具有抗原结合性的一部分区域直接结合。
使用毒素作为功能分子时，可使用细菌毒素(例如，白喉毒素)、植物毒素(例如，蓖麻毒素)、低分子毒素(例如，格尔德霉素)、美登素类和卡奇霉素等。
使用低分子化合物作为功能分子时，可举出柔红霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、丝裂霉素、新制癌菌素、长春地辛和FITC等荧光色素等。
使用酶作为功能分子时，可使用荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利第4737456号)、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环式氧化酶(例如，尿酸酶和黄嘌呤氧化酶等)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
作为将毒素、低分子化合物或酶进行化学结合时使用的连接子，可举出二价自由基(例如，亚烷基、亚芳基、亚杂芳基)、-(CR2)nO(CR2)n-(R为任意取代基，n为正整数)表示的连接子、烷氧基的重复单元(例如，聚亚乙基氧、PEG、聚亚甲基氧等)和烷基氨基(例如，聚亚乙基氨基、JeffamineTM)、以及二酸酯和酰胺(可举出琥珀酸酯、琥珀酰胺、二甘醇酯、丙二酸酯和己酰胺等)。结合功能分子的化学修饰方法已经在该领域中确立(D.J.King.,Applications and Engineering of Monoclonal antibodies.,1998T.J.InternationalLtd,Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer.,1998Marcel Dekker Inc；Chariet al.,Cancer Res.,1992Vol152:127；Liu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,1996Vol93:8681)。
本发明的包含具有特定氨基酸序列的CDR或可变区域的抗RGMa抗体为了维持较长的血中半衰期，优选其恒定区域为人类IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的恒定区域。
本发明中还包含：在具有如上所述的特定的CDR的氨基酸序列的抗体与RGMa蛋白质的结合中进行竞争的抗RGMa抗体及其抗原结合片段。
作为在具有如上所述的特定的CDR的氨基酸序列的抗体与RGMa的结合中进行竞争的抗体，可例示作为表位在选自Glu298～Gly311、Asn322～Glu335、Lys367～Ala377和Pro349～Thr359的区域具有表位的抗体。
该抗体可以通过在具有如上所述的CDR序列的抗体与RGMa蛋白质的结合系统中共存而获得(筛选)或进行评价。例如可以通过利用以下的表面等离子共振(SPR)法进行筛选而获得。
通过在固定有抗生物素蛋白的传感器芯片上装载经生物素化的人类RGMa蛋白质(4μg/mL)作为配体，从而固定相当于1300～1600RU的人类RGMa蛋白质。接着，装载任意的抗RGMa抗体(15μg/mL)作为分析物，使其与固定在传感器芯片上的人类RGMa蛋白质结合。将上述操作重复几次，从而制成任意的抗RGMa抗体与传感器芯片上的人类RGMa蛋白质的全部分子结合的状态(饱和状态)，求出饱和状态下的结合量(饱和结合量1)。
还用本发明的包含特定的CDR的氨基酸序列的抗RGMa抗体实施同样的实验，求出饱和状态下的结合量(饱和结合量2)。
接下来，用本发明的包含特定的CDR的氨基酸序列的抗RGMa抗体使传感器芯片上的人类RGMa蛋白质饱和后，装载任意的抗RGMa抗体(15μg/mL)作为分析物，调查是否对被本发明的包含特定的CDR的氨基酸序列的抗RGMa抗体饱和的人类RGMa蛋白质以追加的方式结合。
任意的抗RGMa抗体能够对被本发明的包含特定的CDR的氨基酸序列的抗RGMa抗体饱和的人类RGMa蛋白质以追加的方式在显示上述算出的任意的抗RGMa抗体的饱和结合量1的情况下进行结合时，判断为该抗体“不进行竞争”。另一方面，任意的抗RGMa抗体无法对被本发明的包含特定的CDR的氨基酸序列的抗RGMa抗体饱和的人类RGMa蛋白质以追加的方式进行结合时，判断为该抗体“进行竞争”。另外，即便任意的抗RGMa抗体能够对被本发明的包含特定的CDR的氨基酸序列的抗RGMa抗体饱和的人类RGMa蛋白质以追加的方式进行结合时，如果追加的结合量具有显著差异而达不到饱和结合量1时，则判断该抗体“进行竞争”。显著差异用一般的测定方法(例如，Student’s t检验)进行检查，显著性水平为5％以下。
对上述的包含特定的CDR的氨基酸序列的抗RGMa抗体竞争与RGMa的结合的抗RGMa抗体可以为小鼠抗体、人类抗体、大鼠抗体、兔子抗体、山羊抗体、骆驼抗体等来自任意动物的抗体，也可以为作为这些抗体的组合的嵌合抗体或人源化抗体，但优选为嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。
＜本发明的核酸分子＞
本发明的核酸分子为编码本发明的单克隆抗体的多核苷酸，但作为例子，可举出：编码重链可变区域的区域分别包含编码序列表的序列号33、34和35的氨基酸序列(可以取代、缺失、插入或附加1个或几个氨基酸)的碱基序列且编码轻链可变区域的区域分别包含编码序列表的序列号30、31和32的氨基酸序列(可以取代、缺失、插入或附加1个或几个氨基酸)的碱基序列的多核苷酸；编码重链可变区域的区域分别包含编码序列表的序列号39、40和SFG的氨基酸序列(可以取代、缺失、插入或附加1个或几个氨基酸)的碱基序列且编码轻链可变区域的区域分别包含编码序列表的序列号36、37和38的氨基酸序列(可以取代、缺失、插入或附加1个或几个氨基酸)的碱基序列的多核苷酸。
作为本发明的核酸分子的其它例子，可举出：编码重链的区域包含编码序列表的序列号5的氨基酸序列的碱基序列且编码轻链的区域包含编码序列表的序列号4的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸；编码重链的区域包含编码序列表的序列号7的氨基酸序列的碱基序列且编码轻链的区域包含编码序列表的序列号6的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸。
作为本发明的核酸分子的其它例子，可举出编码重链的区域包含编码序列表的序列号9的氨基酸序列的碱基序列且编码轻链的区域包含编码序列表的序列号8的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸。
作为本发明的核酸分子的其它例子，可例示编码重链的区域包含编码序列表的序列号11～18中的任一氨基酸序列的碱基序列且编码轻链的区域包含编码序列表的序列号19～25中的任一氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸。
作为本发明的核酸分子的特别优选的例子，可例示编码重链的区域包含编码序列表的序列号15的氨基酸序列的碱基序列且编码轻链的区域包含编码序列表的序列号19的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸。
作为本发明的核酸分子的其它例子，可例示编码重链可变区域的区域包含编码序列表的序列号41的氨基酸序列的碱基序列且编码轻链可变区域的区域包含编码序列表的序列号42的氨基酸序列的碱基序列的多核苷酸。
作为本发明的核酸分子的具体例子，可举出编码重链可变区域的区域包含序列表的序列号43的碱基序列且编码轻链可变区域的区域包含序列表的序列号44的碱基序列的多核苷酸。
应予说明，本发明的核酸分子只要编码具有与RGMa的结合能力、不抑制RGMa与Neogenin的结合、中和RGMa的神经突起生长抑制活性的单克隆抗体，也可以包含与序列表的序列号43的碱基序列的互补链DNA在严苛条件下杂交的多核苷酸、以及与序列表的序列号44的碱基序列的互补链DNA在严苛条件下杂交的多核苷酸。这里，作为严苛条件，例如可举出如下条件：Southern杂交之后，在68℃以相当于0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度进行清洗。
本发明的核酸分子可以编码重链、轻链的恒定区域和可变区域的全部，也可以仅编码重链、轻链的可变区域。编码恒定区域和可变区域的全部时的重链和轻链的恒定区域的碱基序列优选Nucleic Acids Research vol.14,p1779,1986，The Journal ofBiological Chemistry vol.257,p1516,1982和Cell vol.22,p197,1980中记载的碱基序列。
本发明的核酸分子例如可以通过以下方法而得到。首先，使用市售的RNA提取试剂盒由杂交瘤等的细胞制备全RNA，使用随机引物等，利用逆转录酶合成cDNA。接着，在已知的人类抗体重链基因、轻链基因的可变区域中，通过使用各自保留的序列的寡核苷酸作为引物的PCR法来扩增编码抗体的cDNA。编码恒定区域的序列可以通过利用PCR法来扩增已知的序列而得到。DNA的碱基序列可以接入测序用质粒等，利用常规方法来确定。
或者，也可以化学合成可变区域或其一部分的序列并与包含恒定区域的序列结合，从而得到编码本发明的单克隆抗体的DNA。
本发明还提供包含本发明的核酸分子的重组载体和包含该重组载体的转化体(宿主细胞)。作为重组载体，可以为能够在大肠杆菌(Echerichia coli)这样的原核细胞中表达的载体(例如，pBR322，pUC119或它们的衍生物)，但优选能够在真核细胞中表达的载体，更优选能够在来自哺乳动物的细胞中表达的载体。作为能够在来自哺乳动物的细胞中表达的载体，例如可以举出pcDNA3.1(Invitrogen公司制)、pConPlus、pcDM8、pcDNA I/Amp、pcDNA3.1、pREP4这样的质粒载体，pDON-AI DNA(TAKARA BIO公司制)等病毒载体。可以为包含重链编码序列和轻链编码序列的1个载体，也可以为包含重链编码序列的载体和包含轻链编码序列的载体这2个载体。
导入本发明的重组载体的转化体可以为大肠杆菌、枯草杆菌这样的原核细胞，但优选真核细胞，更优选来自哺乳动物的细胞。作为来自哺乳动物的细胞，例如可以举出中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、COS、骨髓瘤、BHK、HeLa、Vero、293、NS0、Namalwa、YB2/0等。
得到的抗RGMa抗体或其抗原结合片段可以纯化至达到均匀。抗体等的分离、纯化使用通常的蛋白质所用的分离、纯化方法即可。例如只要适当地选择、组合亲和色谱等的色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等，就能够分离、纯化抗体(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)，但不限定于此。作为在亲和色谱中使用的柱，可举出蛋白A柱、蛋白G柱、抗免疫球蛋白抗体结合柱、抗原结合柱等。例如作为蛋白A柱，可举出Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Amersham Biosciences)等。
＜免疫学疾病和神经学疾病的预防或治疗药＞
本发明的RGMa结合蛋白质、特别是抗RGMa抗体或其抗原结合片段通过中和RGMa的神经突起生长抑制活性来促进神经功能的修复，因此能够作为神经学疾病的预防、治疗或复发预防药使用。
本发明的RGMa结合蛋白质、特别是抗RGMa抗体或其抗原结合片段还中和因RGMa所致的T细胞活化，因此能够作为免疫学疾病的预防、治疗或复发预防药使用。
作为神经学疾病，可例示：肌萎缩性侧索硬化症、臂丛神经损伤、脑损伤(包括外伤性脑损伤)、脑性麻痹、格林-巴利综合征、大脑白质萎缩症、多发性硬化症(包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症)、视神经脊髓炎、脊髓灰质炎后综合征、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓性肌萎缩症、脊椎肿瘤、横贯性脊髓炎、痴呆症(包括老年性痴呆症、轻度认知功能障碍、阿尔茨海默病、阿尔茨海默相关痴呆症)、亨廷顿氏舞蹈病、迟发性运动障碍、狂躁症、帕金森氏病、斯蒂尔-理查德综合征、唐氏综合征、重症肌无力症、神经外伤(包括视神经外伤)、血管淀粉样变病、伴随淀粉样变病的大脑出血、脑梗塞、脑炎、急性精神错乱、青光眼、精神分裂症和视网膜神经纤维层变性(包括糖尿病视网膜病变、缺血性视神经病变、X染色体连锁性视网膜劈裂症、药物诱发性视神经病变、视网膜营养不良、老年性黄斑变性、以视乳头玻璃疣为特征的眼病、以光感受器变性的遗传性决定因素为特征的眼病、常染色体隐性锥-杆细胞营养不良、伴随着视神经病变的线粒体疾病)。优选为脊髓损伤、神经外伤(包括视神经外伤)。
作为免疫学疾病，可例示：多发性硬化症(包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症)、视神经脊髓炎、银屑病、关节炎(包括风湿性关节炎、变形性关节炎、银屑病性关节炎)、格林-巴利综合征、神经白塞氏病、恶性贫血、I型(胰岛素依赖型)糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎症性肠病(IBD)、干燥综合征、古巴士德氏综合征、格雷夫斯病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、哮喘、花粉症、特应性皮肤炎、肾小球肾炎、重症肌无力症、桥本病和结节病。优选为多发性硬化症。
本发明的RGMa结合蛋白质、特别是抗RGMa抗体或其抗原结合片段能够作为神经学疾病/免疫学疾病的预防、治疗或复发预防药使用，作为优选的神经学疾病/免疫学疾病，可举出脊髓损伤、神经外伤(包括视神经外伤)、多发性硬化症(包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症)。
这里，“治疗”包含哺乳动物、特别是人类的疾病的任意的治疗，包括抑制疾病症状即阻止其发展或消除疾病或症状，以及减轻疾病症状即引发疾病或症状的后退、或症状发展的延迟。
另外，“预防”包含在哺乳动物、特别是人类中防止上述疾病的发病。
另外，“复发预防”包含在哺乳动物、特别是人类中防止反复缓解、复发的上述疾病的复发。
本发明的RGMa结合蛋白质(抗RGMa抗体或其抗原结合片段)可以制成用于预防或治疗神经学疾病或免疫学疾病的医药组合物。
本发明的RGMa结合蛋白质(抗RGMa抗体或其抗原结合片段)的给药方式没有特别限制，可以通过口服给药、非口服给药(例如静脉注射、肌肉注射、皮下给药、直肠给药、经皮给药、脑内给药、脊髓内给药、其它局部给药)中的任一种给药途径对包括人类在内的哺乳类进行给药。
用于口服给药和非口服给药的剂型及其制备方法对本领域技术人员而言是公知的，可以通过将本发明的抗体与药学上允许的载体等配合来制造医药组合物。
用于非口服给药的剂型可举出注射用制剂(例如，点滴注射剂、静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、脑内给药制剂、脊髓内给药制剂)、外用剂(例如，软膏剂、巴布剂、乳液剂)、栓剂、吸入剂、眼剂、眼软膏剂、点鼻剂、点耳剂、脂质体剂等。特别是，要直接作用于中枢神经组织时也可以利用渗透泵的医用微型泵持续地注入，也可以与纤维蛋白胶等混合制成缓释制剂后留置于患部组织。
例如，注射用制剂通常将抗体溶解于注射用蒸留水来制备，可以根据需要添加助溶剂、缓冲剂、pH调节剂、等张化剂、无痛化剂、保存剂、稳定化剂等。另外，也可以制成使用时制备用的冻干制剂。
用于口服给药的剂型可举出固体或液体的剂型，具体而言，可举出片剂、包衣片剂、丸剂、细粒剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、注射剂、含片剂等。
本发明的医药组合物可以进一步含有治疗上有效的其它药剂，另外，也可以根据需要而配合杀菌剂、消炎剂、维生素类、氨基酸等成分。
作为药理学上允许的载体，例如可举出固形制剂中的赋形剂、润滑剂、结合剂和崩解剂，或液状制剂中的溶剂、助溶剂、悬浮化剂、等张化剂、缓冲剂和无痛化剂等。也可以进一步根据需要适当地适量使用通常的防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、吸附剂、润湿剂等添加物。
本发明的抗体的给药量根据例如给药途径、疾病的种类、症状程度、患者的年龄、性别、体重、疾病的严重程度、药代动力学和毒理学特征等药理学上的见解、有无利用药物传递系统、以及是否以与其它药物的组合的一部分的形式给药等各种因素而由医师决定，通常，每个成人(体重60kg)，在口服给药时可以1次或分成几次给予1～5000μg/天、优选10～2000μg/天、进一步优选50～2000μg/天，在注射给药时可以1次或分成几次给予1～5000μg/天、优选5～2000μg/天、进一步优选50～2000μg/天。在对全身的非口服给药时，可以按1天、1周、1个月1次或1年1～7次的间隔给予每单位体重10～100000μg/kg、更优选100～50000μg/kg、进一步优选500～20000μg/kg。在利用渗透泵等的局部给药时，通常可以每个成人(体重60kg)按10～100000μg/天、更优选100～10000μg/天、进一步优选500～5000μg/天的速度持续注入。
实施例
以下，举出实施例对本发明进行具体说明，但本发明不限定于以下的实施例的形态。
实施例1：人类RGMa蛋白质(C末侧结构域)的制备
建立表达在人类RGMa蛋白质(序列表的序列号1)的Pro169～Gly422(指从N末端侧起第169位的脯氨酸残基到第422位的甘氨酸残基，以后同样进行记载)的C末端融合有组氨酸标签的重组人类RGMa蛋白质的CHO细胞。
使CHO细胞的培养上清液中含有的人类RGMa蛋白质C末侧结构域吸附于镍柱(GEHealthcare公司制，17-5247-01)后，用100mM咪唑溶液洗脱。通过透析由咪唑洗脱部分置换为磷酸盐缓冲液(Phosphate bufferd saline，PBS)，作为免疫原使用。
实施例2：小鼠抗人类RGMa单克隆抗体的制作
将实施例1中制备的重组人类RGMa蛋白质10μg与完全弗氏佐剂(Sigma公司制)混合来制作乳液，在BALB/c小鼠(日本Charles River株式会社)的背部皮下的几处进行免疫。之后每隔1～2周将用不完全弗氏佐剂(Sigma公司制)制作成乳液的重组人类RGMa蛋白质10μg同样地进行免疫，几次免疫后进行采血。利用将后述的人类或小鼠RGMa蛋白质固相化的ELISA法来测定抗体效价。对发现抗体效价上升的个体，将人类RGMa蛋白质10μg进行静脉内给药，进行扩增，2～3天后回收脾细胞。
对于细胞融合，将上述脾细胞与其半数的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0，大日本住友制药)混合，在离心得到的沉淀部分中加入聚乙二醇(Roche Diagnostics公司制)进行细胞融合。接着将经离心的细胞用D-MEM(Invitrogen公司制)清洗2次。将细胞在含有10％胎牛血清(Invitrogen公司制)、1％BM condimed(Roche Diagnostics公司制)和HAT(Sigma-Aldrich公司制)的GIT培养基(日本制药制)中再悬浮，各孔按5×104骨髓瘤细胞/孔在96孔板中接种。回收培养上清液，利用实施例3的人类RGMa蛋白质固相化ELISA法进行抗体生成细胞的筛选。
利用有限稀释法对筛选得到的抗体生成细胞进行克隆，选定产生2种单克隆抗体(B5.116A3和B5.70E4)的杂交瘤细胞。
对于使用分型试剂盒(Mouse MonoAB ID/SP KIT，ZYMED公司制，93-6550)进行判定的两单克隆抗体的同型而言，都是重链为小鼠IgG2b、轻链为κ。
单克隆抗体的纯化由杂交瘤的培养上清液通过使用了固定有抗小鼠IgG抗体的琼脂糖(Sigma公司制Anti-Mouse IgG-Agarose)的亲和色谱进行。使抗体与柱结合后，用PBS清洗柱，接着用10mM甘氨酸盐酸(pH2.7)进行洗脱，迅速中和。其后，利用超滤膜将洗脱中和液置换为PBS。
实施例3：将人类或小鼠RGMa蛋白质固相化的ELISA
将用PBS配制成2μg/mL的人类RGMa蛋白质(R&D systems公司制，2459-RM)或小鼠RGMa蛋白质(R&D systems公司制，2458-RG)各按50μL/孔分注于96孔板，室温下静置1小时。除去液体后，将用PBS稀释了5倍的ApplieBlock(Seikagaku Biobusiness公司制，200150)各按200μL/孔进行分注，在室温下静置1小时，封闭非特异结合。用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)清洗3次后，各按50μL/孔添加用PBS进行了阶段稀释的被检测物(小鼠血清、杂交瘤培养上清液、后述的重组抗体表达培养上清液或纯化抗体等)，室温下静置1小时。之后用PBST清洗3次，接着各按50μL/孔分注用PBS稀释过的过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG抗体(GE Healthcare公司制，NA9310V)，在室温下静置1小时。清洗3次后，添加过氧化物酶显色试剂盒(Sumitomo Bakelite公司制，ML-1130O)使其显色一定时间，使用微孔板检测仪测定492nm的吸光度。
实施例4：抗体的表位分析
抗体结合的表位由肽扫描法决定。合成在人类RGMa蛋白质(序列表的序列号1)的Arg172～Ala424中包含的、由每次移动3个残基的连续的11个残基构成的氨基酸序列的N末端侧融合有将N末端生物素化的间隔序列(SGSG)(序列表的序列号46)而成的合计83种肽。将肽固定于抗生物素蛋白板后，使被检抗体(B5.116A3，B5.70E4)进行反应。接着，使过氧化物酶标记兔子抗小鼠Ig抗体(Dako公司，P026002)进行反应，添加基质溶液显色一定时间后，使用微孔板检测仪测定吸光度。
其结果，B5.116A3与Glu298～Gly311(Glu298～Asp308、Val301～Gly311这2种肽)、Asn322～Glu335(Asn322～Thr332、Ile325～Glu335这2种肽)和Lys367～Ala377的来自人类RGMa的肽结合，B5.70E4与Glu298～Gly311(Glu298～Asp308、Val301～Gly311这2种肽)、Asn322～Glu335(Asn322～Thr332、Ile325～Glu335这2种肽)和Pro349～Thr359的来自人类RGMa的肽结合。
实施例5：小鼠抗体基因的序列分析和克隆
从产生小鼠单克隆抗体(B5.116A3，B5.70E4)的杂交瘤细胞中提取总RNA。以总RNA为模板利用逆转录反应合成cDNA。以cDNA为模板，对轻链可变区域和恒定区域以及重链可变区域和恒定区域的基因进行PCR扩增，确定DNA序列。接着，基于已确定的可变区域序列和恒定区域序列，通过PCR对抗体全长基因进行扩增、克隆。这些抗体基因编码的氨基酸序列如下。
(1)B5.116A3轻链氨基酸序列(序列表的序列号4)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQLNTLPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
(2)B5.116A3重链氨基酸序列(序列表的序列号5)
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRDGAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK
(3)B5.70E4轻链氨基酸序列(序列表的序列号6)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
(4)B5.70E4重链氨基酸序列(序列表的序列号7)
DVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITTSYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGTNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLRLNSVTTEDTATYYCAGSFGYSQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK
实施例6：重组小鼠抗体和重组大鼠小鼠嵌合抗体的制备
制备来自杂交瘤的2种抗RGMa抗体B5.116A3或B5.70E4的重组小鼠抗体(以后，分别记载为“r116A3”、“r70E4”)。
另外，作为比较例，根据专利文献1(WO2009/106356)，融合大鼠抗体5F9的可变区域和小鼠抗体(IgG2bκ)的恒定区域(轻链恒定区域为序列表的序列号4的Arg108～Cys214，重链恒定区域为序列表的序列号5的Ala117～Lys452)来制备重组大鼠小鼠嵌合抗体(以后，记载为“r5F9”)。
将编码各个抗体的轻链和重链的DNA插入到pcDNA3.3(Life Technologies公司制)中，制作表达载体。使用Neofection 293(Astec公司制)将表达载体导入到HEK293F细胞(Life Technologies公司制)中。将细胞在37℃、8％二氧化碳条件下培养6天后，回收培养上清液。对于重组抗体的纯化，将培养上清液加入到固定有蛋白A或蛋白G的亲和柱(GEhealthcare公司制)中，用10mM甘氨酸盐酸(pH2.8)洗脱与柱结合的抗体，迅速中和后，置换为PBS。
根据使用目的而需要提高纯化纯度时，将蛋白A柱纯化后的抗体用CeramicHydroxyapatite Type1(CHT)柱(BIORAD公司制)进行纯化。将与CHT柱结合的抗体用10mMKH2PO4(pH6.5)清洗后，用20mM KH2PO4(pH6.5)、0.5M NaCl洗脱。回收洗脱部分后，置换为PBS。
实施例7：对RGMa蛋白质表达细胞的结合试验
将表达全长人类RGMa蛋白质(序列表的序列号1的Met1～Cys450)、人类RGMa蛋白质C末侧结构域(序列表的序列号1的Pro169～Cys450)、全长小鼠RGMa蛋白质(序列表的序列号2的Met1～Trp454)或大鼠RGMa蛋白质C末侧结构域(序列表的序列号3的Pro170～Trp449)的载体导入到CHO细胞或HEK293细胞中，制作抗原表达细胞。
应予说明，RGMa蛋白质在GPI锚固加成反应时C末端肽受到加工。小鼠RGMa蛋白质和大鼠RGMa蛋白质都在Ala427被切断而除去C末端侧的肽。因此，介由GPI锚固在细胞上表达的全长蛋白质和C末侧结构域的氨基酸序列在小鼠和大鼠中相同。
使终浓度10μg/mL的被检抗体(r116A3和r70E4)和r5F9(比较例)与上述的抗原表达细胞反应后，用含有0.1％牛血清白蛋白、0.05％NaN3的PBS清洗细胞。使FITC标记抗小鼠免疫球蛋白抗体(DAKO公司制)进行反应，清洗细胞。利用流式细胞仪(Becton Dickinson公司制，FACSCalibur)测定荧光，评价被检抗体的与抗原表达细胞的结合性(表1)。
其结果，可知r116A3和r70E4与r5F9不同，还与人类和大鼠RGMa蛋白质的C末侧结构域结合。RGMa蛋白质仅在C末侧结构域看到神经突起生长抑制作用，r116A3和r70E4抑制全长RGMa蛋白质和C末侧结构域这两者。
[表1]
表1.各种重组抗RGMa抗体的与抗原表达细胞的结合评价*
Figure BDA0001444668880000421
*；++ 结合较强
+ 结合较弱
- 不结合
实施例8：对RGMa蛋白质的解离常数测定
被检抗体(r116A3,r70E4)和r5F9(比较例)的与RGMa蛋白质的亲和性通过使用Proteon XPR36(BIORAD公司制)的表面等离子共振(SPR)法进行测定。
利用胺偶联法将用10mM乙酸缓冲液(pH4.5)稀释成10μg/mL的人类RGMa蛋白质(R&D Systems公司制，2459-RM)、人类RGMa蛋白质C末端侧结构域(在实施例1中制备)或小鼠RGMa蛋白质(R&D Systems公司制，2458-RG)固定于GLC传感器芯片。将作为分析物的经阶段稀释的被检抗体以流速100μL/min加入60秒，测定解离常数(Kd值)。
如表2所示，r116A3和r70E4与r5F9不同，还与人类RGMa蛋白质的C末侧结构域结合。r116A3与r5F9相比，与人类RGMa蛋白质结合强32倍，与小鼠RGMa蛋白质结合强44倍。
[表2]
表2.抗RGMa单克隆抗体的亲和性
Figure BDA0001444668880000431
实施例9：RGMa-Neogenin结合抑制试验
对重组人类Neogenin蛋白质(序列表的序列号10)的细胞外结构域(Ala34～Leu1105)进行纯化。建立表达人类Neogenin蛋白质细胞外结构域的CHO细胞株。在C末端融合组氨酸标签。由CHO细胞的培养上清液吸附于镍柱(GE Healthcare公司制，17-5247-01)后，用100mM咪唑溶液进行洗脱。通过透析由咪唑洗脱部分置换为PBS。
使用ChromaLink Biotin Labeling Kit(Solulink公司制)对人类RGMa蛋白质(R&D systems公司制，2459-RM)进行生物素标记。将制备成2μg/mL的生物素标记人类RGMa蛋白质与阶段稀释了2倍的被检抗体(r116A3，r70E4)等量混和，在室温下反应2小时，制备混合溶液。
同时，将用PBS制备成2μg/mL的人类Neogenin蛋白质细胞外结构域在96孔板中各加入50μL/孔，在室温下静置1小时，制作Neogenin固相板。将液体除去后，添加2.5％牛血清白蛋白溶液，静置1小时，从而封闭非特异结合。在该Neogenin固相板以50μL/孔添加上述混合溶液，在室温下静置1小时。之后进行清洗操作，添加过氧化物酶标记抗生物素蛋白(VECTASTAIN ABC系统，Vector Laboratories公司制)，在室温下静置1小时。之后进行清洗操作，添加基质溶液显色一定时间，用微孔板检测仪测定吸光度。将不存在抗体时的吸光度比设为1来作图，对抗体的浓度依赖性的RGMa-Neogenin的结合抑制进行评价(图1)。
其结果，与抗人类RGMa多克隆抗体(R&D Systems公司制，AF2459)和r5F9不同，r116A3和r70E4不抑制RGMa-Neogenin的结合。
实施例10：RGMa-BMP2结合抑制试验
将用PBS制备成2μg/mL的人类RGMa蛋白质(R&D systems公司制，2459-RM)在96孔板上各加入50μL/孔，在室温下静置1小时。添加2.5％牛血清白蛋白溶液，静置1小时，从而封闭非特异结合，制备RGMa蛋白质固相化板。在该RGMa蛋白质固相板加入阶段稀释为0.01～10μg/mL的被检抗体(B5.116A3，B5.70E4)，在室温下静置1小时。之后进行清洗操作，加入稀释为0.5μg/mL的人类BMP2蛋白质(R&D systems公司制，355-BM)在室温下静置1小时。
使生物素标记抗BMP2抗体进行反应，进一步添加过氧化物酶标记抗生物素蛋白(VECTASTAIN ABC系统，Vector Laboratories公司制)、基质溶液使其显色一定时间，利用微孔板检测仪测定吸光度(图2)。
其结果，特别是抗RGMa抗体(B5.116A3)浓度依赖性较弱地抑制RGMa-BMP2的结合(0.01μg/mL时吸光度为0.45，0.1μg/mL时吸光度为0.4，1μg/mL时吸光度为0.32，10μg/mL时吸光度为0.1)。
实施例11：人源化抗体的设计
小鼠单克隆抗体B5.116A3的人源化按照专利第2912618号公报中记载的Winter等的方法，用互补性决定区域(CDR)移植法进行。
首先，制成小鼠单克隆抗体B5.116A3的轻链和重链可变区域的3D同源模建(homology model)，在框架(FW)区域特定位于CDR附近的氨基酸残基。选择尽可能维持这些氨基酸的人类抗体FW，移植小鼠抗体的CDR，设计人源化抗体序列。对于所设计的人源化抗体序列，重链记载为HA(序列表的序列号11)，轻链记载为KA(序列表的序列号19)。进一步对与可变区域的结构稳定性有关的FW内的氨基酸进行追加的变异导入，设计多个人源化抗体序列(重链包括HA到HB～HH为止共计8种，轻链包括KA到KB～KG为止共计7种)。
[表3]
表3.所设计的人源化抗体序列
Figure BDA0001444668880000451
实施例12：重组小鼠人类嵌合体和重组人源化抗体的制备
(1)按照实施例6，制备具有以下氨基酸序列的重组小鼠人类嵌合抗RGMa抗体116A3(r116A3C)。
轻链(序列表的序列号8)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQLNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重链(序列表的序列号9)
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRDGAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(2)按照实施例6，制备由以下的重链和轻链的组合构成的共计20种人源化抗RGMa抗体。
重链/轻链的组合：
HA/KA，HA/KB，HA/KC，HA/KG，HB/KC，HC/KA，HC/KB，HD/KA，HD/KB，HD/KC，HD/KD，HE/KA，HF/KA，HF/KF，HF/KG，HG/KD，HG/KH，HH/KA，HH/KD，HH/KF
(3)按照实施例6，制备重组人源化抗RGMa抗体(以后记载为rH5F9)(比较例)。
将专利文献1(WO2009/106356)中记载的人源化抗RGMa单克隆抗体h5F9的可变区域(轻链为专利文献1的seq ID_53，重链为专利文献1的seq ID_50)与人类抗体恒定区域(轻链为序列表的序列号26的Arg108～Cys214，重链为序列表的序列号27的Ala117～Lys446)连接。
实施例13：抗体的热稳定性试验
将表达实施例12中记载的重组抗体的培养上清液各分取20μL，使用热循环仪(Takara bio公司制，TP600)在40、45、50、55、60、65、70、75℃这8点的温度下分别进行10分钟热处理。
以抗体终浓度为125ng/mL的方式用PBS稀释培养上清液。其后，供于实施例3中记载的将人类RGMa蛋白质固相化的ELISA，评价抗体的抗原结合性(图3)。
其结果，由重链HE、轻链KA的组合构成的人源化抗体(以下，称为“rH116A3”)和小鼠人类嵌合抗体(r116A3C)显示出比人源化抗体(rH5F9)优异的热稳定性。以后，将由该HE/KA的组合构成的人源化抗体记载为rH116A3。
应予说明，不进行热处理时，小鼠人类嵌合抗体(r116A3C)与人源化抗体(rH116A3)显示出同等的抗原结合性，并不随着人源化而抗原结合性降低。
实施例14：产生人源化抗RGMa抗体(rH116A3)的CHO稳定表达株的建立
产生人源化抗RGMa抗体(rH116A3)的CHO稳定表达株通过Lonza GS Xceed系统(Lonza公司)建立。将包含人源化抗RGMa抗体(rH116A3)的轻链编码序列(序列表的序列号44)和重链编码序列(序列表的序列号43)的pXC双基因载体导入到CHOK1SV GS knock out母细胞株中，在蛋氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine，MSX)选择下获得转化细胞池。利用流式细胞仪分离成单一细胞后，对培养上清液中的抗体产生量、细胞增殖性等进行评价，获得CHO稳定表达株。
实施例15：神经突起生长试验
从新生大鼠(P7)中取出小脑，悬浮于胰蛋白酶溶液(含有0.2％DNase的0.25％胰蛋白酶PBS溶液)，在37℃下消化10～15分钟。接着加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基进行离心分离。在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中再悬浮，进行离心分离，同样地重复操作2次，清洗细胞。进而，将该细胞悬浮液用70μm细胞滤网过滤后，进行离心分离，将沉淀部分在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中再悬浮。在细胞悬液中加入B27补充物(GIBCO公司制)来制备新生大鼠小脑颗粒细胞。
接下来，将新生大鼠小脑颗粒细胞接种于细胞板，在37℃下培养1天。
添加终浓度2μg/mL的重组RGMa蛋白质(R&D systems公司制，2459-RM)，在37℃下培养2天。使用显微镜观察测定神经突起长度，结果如图4所示，由于添加RGMa，在左图的实验中神经突起长度从37μm变为26μm，在右图中从38μm变为27μm，抑制了神经突起生长。即使仅将被检抗体(B5.116A3，B5.70E4)以终浓度10μg/mL进行添加，也没有看到神经突起长度变化，但与重组RGMa蛋白质同时添加被检抗体时，神经突起与对照(不添加RGMa)相同程度地生长，确认了因抗体所致的RGMa蛋白质的中和作用。
实施例16：使用脊髓损伤模型大鼠的效价试验
对利用氟烷(武田药品工业公司制)进行了吸入麻醉的Wistar系大鼠(雌，8周龄，体重约200g)以脊椎节段T9为中心实施前后1椎骨节(T8～T10)的椎板切除术，露出脊髓。使用脊髓压挫模型进行评价时，使用IH impactor(Precision System公司制)对露出的脊髓施加200kdyn的压力。
如上所述损伤脊髓之后，将充满400μg/mL的被检抗体(r116A3,r70E4)或对照小鼠抗体(mo-IgG2bκ)的渗透压微泵(200μL液量，0.5μL/小时，14天送达)(Alzet公司制，model2002)置于大鼠的背中的皮下。与渗透压微泵的出口连接的硅管的前端置于脊髓损伤部位的硬膜下。该管缝在椎板切除术部位的正下肢侧的棘突处并固定，缝合肌肉和皮肤层，进行饲养。
对于脊髓损伤模型大鼠的运动功能，使用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分(Basso,D.M.,Beattie,M.S.,&Bresnahan,J.C.,A sensitive and reliable locomotorrating scale for open field testing in rats.J Neurotrauma 12,1-21(1995))，损伤后第0、1、3、7天，以后每1周、最长至8周进行评价。其结果，如图5(A)所示，r116A3或r70E4与对照抗体(mo-IgG2bκ)相比，分别在给药后4或3周以后显著地改善了BBB评分(p<0.05,Student’s t-检验)。
使用脊髓半切模型进行评价时，将露出的脊髓的背侧部切断至1.8mm～2.0mm的深度。与上述同样地使用渗透压微泵将被检抗体(B5.116A3)或对照小鼠抗体(mo-IgG2bκ)进行给药，损伤后第0、1、3、7天，以后每1周、最长至10周使用BBB评分进行评价。如图5(B)所示，B5.116A3与对照抗体(mo-IgG2bκ)相比在给药后4周以后显著地改善了BBB评分(p<0.01,Student’s t-检验)。
实施例17：使用多发性硬化症模型小鼠的效价试验
将PLP139-151肽(HSLGKWLGHPDKF：序列表的序列号45，肽研究所制)用生理盐水(大冢制药工厂制)溶解，与加入了结核杆菌死菌H37Ra(Difco Laboratories公司制)的不完全弗氏佐剂(Sigma公司制)混合，制作乳液。作为PLP139-151肽以50μg/只对SJL/JorllcoCrj(SJL/J)小鼠(日本Charles River)的背部皮下进行免疫，对EAE评分(H.Kataoka,KSugahara,K.Shimano,K.Teshima,M.Koyama,A.Fukunari and K.Chiba.FTY720,sphingosine 1-phosphate receptor modulator,ameliorates experimentalautoimmune encephalomyelitis by inhibition of T cell infiltration.Cellular&Molecular Immunology 6,439-448,2005.)和体重变化进行评价(图6)。
将经生理盐水稀释的被检抗体(B5.116A3)在用PLP139-151肽诱发免疫的7天和10天后或18天和21天后分别以20mg/kg向腹腔内给药。
其结果，如图6所示，抗RGMa小鼠单克隆抗体(B5.116A3)与对照抗体(mo-IgG2bκ)相比，在发病前的给药中抑制EAE评分的劣化(图6上部)，在发病后的给药中显示出复发预防效果(图6下部)。
实施例18：抗体的免疫原性试验
利用粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-4(Interleukin-4)刺激使来自51名健康受试者的末梢血中含有的未分化树突状细胞成熟。在成熟树突状细胞中添加终浓度50μg/mL的被检抗体(rH116A3)，培养4、5天，由此使抗体摄入树突状细胞。对其混合来自相同受试者的末梢血CD4+T细胞(辅助性T细胞)，进一步共培养1周后，利用流式细胞仪测定T细胞的增殖。将被检抗体的T细胞增殖活性作为指标，对人类的免疫原性风险进行评价。其结果，在51名受试者中，对4名(7.8％)确认了T细胞的增殖，免疫原性风险低。
序列表
<110> 田边三菱制药株式会社
国立大学法人大阪大学
国立大学法人千叶大学
<120> RGMa结合蛋白质及其使用
<130> A16005-16140
<150> JP2015-091095
<151> 2015-04-28
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp
1 5 10 15
Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro
20 25 30
Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys
35 40 45
Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser
50 55 60
His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg
65 70 75 80
Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln
100 105 110
His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile
130 135 140
Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr
145 150 155 160
Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp
165 170 175
Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn
180 185 190
Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser
195 200 205
Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln
210 215 220
Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro
225 230 235 240
Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala
245 250 255
Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile
260 265 270
Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg
275 280 285
Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val
290 295 300
Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro
305 310 315 320
Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly
325 330 335
Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro
340 345 350
Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu
355 360 365
Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr
370 375 380
Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp
385 390 395 400
Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Asp Arg
405 410 415
Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro
420 425 430
Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val
435 440 445
Phe Cys
450
<210> 2
<211> 454
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 2
Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp
1 5 10 15
Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Leu Trp Pro
20 25 30
Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Ile Ser Pro Cys
35 40 45
Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly
50 55 60
Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu
65 70 75 80
Arg Thr Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly
85 90 95
Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser
100 105 110
Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu
130 135 140
Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn
145 150 155 160
Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr
165 170 175
Asp His Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp
180 185 190
Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly
195 200 205
Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe
210 215 220
Gln Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu
225 230 235 240
Pro Ser Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly
245 250 255
Ala Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu
260 265 270
Ile Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly
275 280 285
Arg Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala
290 295 300
Val Glu Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys
305 310 315 320
Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu
325 330 335
Ser Pro Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu
340 345 350
Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro
355 360 365
Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr
370 375 380
Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly
385 390 395 400
Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr
405 410 415
Arg Glu Leu Pro Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr
420 425 430
Phe Pro Leu Ala Pro Gln Ile Leu Leu Gly Thr Ile Pro Leu Leu Val
435 440 445
Leu Leu Pro Val Leu Trp
450
<210> 3
<211> 449
<212> PRT
<213> 大鼠
<400> 3
Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp
1 5 10 15
Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Leu Trp Pro
20 25 30
Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Ile Ser Pro Cys
35 40 45
Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly
50 55 60
Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu
65 70 75 80
Arg Thr Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly
85 90 95
Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser
100 105 110
Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg
115 120 125
Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu
130 135 140
Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn
145 150 155 160
Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr
165 170 175
Asp His Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp
180 185 190
Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly
195 200 205
Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe
210 215 220
Gln Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu
225 230 235 240
Pro Ser Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly
245 250 255
Ala Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu
260 265 270
Ile Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly
275 280 285
Arg Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala
290 295 300
Val Glu Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys
305 310 315 320
Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu
325 330 335
Ser Pro Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu
340 345 350
Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro
355 360 365
Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr
370 375 380
Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly
385 390 395 400
Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr
405 410 415
Arg Glu Leu Pro Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro
420 425 430
Glu Met Leu Pro Gly Thr Val Thr Leu Leu Val Leu Leu Pro Leu Phe
435 440 445
Trp
<210> 4
<211> 234
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 4
Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230
<210> 5
<211> 471
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
Met Tyr Leu Gly Leu Asn Tyr Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Asn Gly
1 5 10 15
Val Gln Ser Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asp Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85 90 95
Lys Arg Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Asp Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu
180 185 190
Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
195 200 205
Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser
210 215 220
Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr
225 230 235 240
Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys
260 265 270
Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn
290 295 300
Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
325 330 335
Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu
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Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg
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Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg
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Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys
405 410 415
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465 470
<210> 6
<211> 238
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 6
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly
165 170 175
Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp
195 200 205
Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr
210 215 220
Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235
<210> 7
<211> 466
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 7
Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Ile Pro Gly Ile
1 5 10 15
Met Ser Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
20 25 30
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
35 40 45
Thr Ser Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
85 90 95
Phe Phe Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Gly Ser Phe Gly Tyr Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120 125
Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly
130 135 140
Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys
145 150 155 160
Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr
180 185 190
Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln
195 200 205
Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro
225 230 235 240
Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly
245 250 255
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile
260 265 270
Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp
275 280 285
Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His
290 295 300
Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg
305 310 315 320
Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys
325 330 335
Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu
340 345 350
Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr
355 360 365
Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu
370 375 380
Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp
385 390 395 400
Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val
405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys
420 425 430
Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His
435 440 445
Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro
450 455 460
Gly Lys
465
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体轻链
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 9
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗体重链
<400> 9
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Arg Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Arg Asp Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 10
<211> 1461
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Ala Ala Glu Arg Gly Ala Arg Arg Leu Leu Ser Thr Pro Ser Phe
1 5 10 15
Trp Leu Tyr Cys Leu Leu Leu Leu Gly Arg Arg Ala Pro Gly Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Arg Ser Gly Ser Ala Pro Gln Ser Pro Gly Ala Ser Ile Arg
35 40 45
Thr Phe Thr Pro Phe Tyr Phe Leu Val Glu Pro Val Asp Thr Leu Ser
50 55 60
Val Arg Gly Ser Ser Val Ile Leu Asn Cys Ser Ala Tyr Ser Glu Pro
65 70 75 80
Ser Pro Lys Ile Glu Trp Lys Lys Asp Gly Thr Phe Leu Asn Leu Val
85 90 95
Ser Asp Asp Arg Arg Gln Leu Leu Pro Asp Gly Ser Leu Phe Ile Ser
100 105 110
Asn Val Val His Ser Lys His Asn Lys Pro Asp Glu Gly Tyr Tyr Gln
115 120 125
Cys Val Ala Thr Val Glu Ser Leu Gly Thr Ile Ile Ser Arg Thr Ala
130 135 140
Lys Leu Ile Val Ala Gly Leu Pro Arg Phe Thr Ser Gln Pro Glu Pro
145 150 155 160
Ser Ser Val Tyr Ala Gly Asn Asn Ala Ile Leu Asn Cys Glu Val Asn
165 170 175
Ala Asp Leu Val Pro Phe Val Arg Trp Glu Gln Asn Arg Gln Pro Leu
180 185 190
Leu Leu Asp Asp Arg Val Ile Lys Leu Pro Ser Gly Met Leu Val Ile
195 200 205
Ser Asn Ala Thr Glu Gly Asp Gly Gly Leu Tyr Arg Cys Val Val Glu
210 215 220
Ser Gly Gly Pro Pro Lys Tyr Ser Asp Glu Val Glu Leu Lys Val Leu
225 230 235 240
Pro Asp Pro Glu Val Ile Ser Asp Leu Val Phe Leu Lys Gln Pro Ser
245 250 255
Pro Leu Val Arg Val Ile Gly Gln Asp Val Val Leu Pro Cys Val Ala
260 265 270
Ser Gly Leu Pro Thr Pro Thr Ile Lys Trp Met Lys Asn Glu Glu Ala
275 280 285
Leu Asp Thr Glu Ser Ser Glu Arg Leu Val Leu Leu Ala Gly Gly Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Asp Val Thr Glu Asp Asp Ala Gly Thr Tyr Phe Cys
305 310 315 320
Ile Ala Asp Asn Gly Asn Glu Thr Ile Glu Ala Gln Ala Glu Leu Thr
325 330 335
Val Gln Ala Gln Pro Glu Phe Leu Lys Gln Pro Thr Asn Ile Tyr Ala
340 345 350
His Glu Ser Met Asp Ile Val Phe Glu Cys Glu Val Thr Gly Lys Pro
355 360 365
Thr Pro Thr Val Lys Trp Val Lys Asn Gly Asp Met Val Ile Pro Ser
370 375 380
Asp Tyr Phe Lys Ile Val Lys Glu His Asn Leu Gln Val Leu Gly Leu
385 390 395 400
Val Lys Ser Asp Glu Gly Phe Tyr Gln Cys Ile Ala Glu Asn Asp Val
405 410 415
Gly Asn Ala Gln Ala Gly Ala Gln Leu Ile Ile Leu Glu His Ala Pro
420 425 430
Ala Thr Thr Gly Pro Leu Pro Ser Ala Pro Arg Asp Val Val Ala Ser
435 440 445
Leu Val Ser Thr Arg Phe Ile Lys Leu Thr Trp Arg Thr Pro Ala Ser
450 455 460
Asp Pro His Gly Asp Asn Leu Thr Tyr Ser Val Phe Tyr Thr Lys Glu
465 470 475 480
Gly Ile Ala Arg Glu Arg Val Glu Asn Thr Ser His Pro Gly Glu Met
485 490 495
Gln Val Thr Ile Gln Asn Leu Met Pro Ala Thr Val Tyr Ile Phe Arg
500 505 510
Val Met Ala Gln Asn Lys His Gly Ser Gly Glu Ser Ser Ala Pro Leu
515 520 525
Arg Val Glu Thr Gln Pro Glu Val Gln Leu Pro Gly Pro Ala Pro Asn
530 535 540
Leu Arg Ala Tyr Ala Ala Ser Pro Thr Ser Ile Thr Val Thr Trp Glu
545 550 555 560
Thr Pro Val Ser Gly Asn Gly Glu Ile Gln Asn Tyr Lys Leu Tyr Tyr
565 570 575
Met Glu Lys Gly Thr Asp Lys Glu Gln Asp Val Asp Val Ser Ser His
580 585 590
Ser Tyr Thr Ile Asn Gly Leu Lys Lys Tyr Thr Glu Tyr Ser Phe Arg
595 600 605
Val Val Ala Tyr Asn Lys His Gly Pro Gly Val Ser Thr Pro Asp Val
610 615 620
Ala Val Arg Thr Leu Ser Asp Val Pro Ser Ala Ala Pro Gln Asn Leu
625 630 635 640
Ser Leu Glu Val Arg Asn Ser Lys Ser Ile Met Ile His Trp Gln Pro
645 650 655
Pro Ala Pro Ala Thr Gln Asn Gly Gln Ile Thr Gly Tyr Lys Ile Arg
660 665 670
Tyr Arg Lys Ala Ser Arg Lys Ser Asp Val Thr Glu Thr Leu Val Ser
675 680 685
Gly Thr Gln Leu Ser Gln Leu Ile Glu Gly Leu Asp Arg Gly Thr Glu
690 695 700
Tyr Asn Phe Arg Val Ala Ala Leu Thr Ile Asn Gly Thr Gly Pro Ala
705 710 715 720
Thr Asp Trp Leu Ser Ala Glu Thr Phe Glu Ser Asp Leu Asp Glu Thr
725 730 735
Arg Val Pro Glu Val Pro Ser Ser Leu His Val Arg Pro Leu Val Thr
740 745 750
Ser Ile Val Val Ser Trp Thr Pro Pro Glu Asn Gln Asn Ile Val Val
755 760 765
Arg Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Gly Ile Gly Ser Pro His Ala Gln Thr
770 775 780
Ile Lys Val Asp Tyr Lys Gln Arg Tyr Tyr Thr Ile Glu Asn Leu Asp
785 790 795 800
Pro Ser Ser His Tyr Val Ile Thr Leu Lys Ala Phe Asn Asn Val Gly
805 810 815
Glu Gly Ile Pro Leu Tyr Glu Ser Ala Val Thr Arg Pro His Thr Asp
820 825 830
Thr Ser Glu Val Asp Leu Phe Val Ile Asn Ala Pro Tyr Thr Pro Val
835 840 845
Pro Asp Pro Thr Pro Met Met Pro Pro Val Gly Val Gln Ala Ser Ile
850 855 860
Leu Ser His Asp Thr Ile Arg Ile Thr Trp Ala Asp Asn Ser Leu Pro
865 870 875 880
Lys His Gln Lys Ile Thr Asp Ser Arg Tyr Tyr Thr Val Arg Trp Lys
885 890 895
Thr Asn Ile Pro Ala Asn Thr Lys Tyr Lys Asn Ala Asn Ala Thr Thr
900 905 910
Leu Ser Tyr Leu Val Thr Gly Leu Lys Pro Asn Thr Leu Tyr Glu Phe
915 920 925
Ser Val Met Val Thr Lys Gly Arg Arg Ser Ser Thr Trp Ser Met Thr
930 935 940
Ala His Gly Thr Thr Phe Glu Leu Val Pro Thr Ser Pro Pro Lys Asp
945 950 955 960
Val Thr Val Val Ser Lys Glu Gly Lys Pro Lys Thr Ile Ile Val Asn
965 970 975
Trp Gln Pro Pro Ser Glu Ala Asn Gly Lys Ile Thr Gly Tyr Ile Ile
980 985 990
Tyr Tyr Ser Thr Asp Val Asn Ala Glu Ile His Asp Trp Val Ile Glu
995 1000 1005
Pro Val Val Gly Asn Arg Leu Thr His Gln Ile Gln Glu Leu Thr
1010 1015 1020
Leu Asp Thr Pro Tyr Tyr Phe Lys Ile Gln Ala Arg Asn Ser Lys
1025 1030 1035
Gly Met Gly Pro Met Ser Glu Ala Val Gln Phe Arg Thr Pro Lys
1040 1045 1050
Ala Asp Ser Ser Asp Lys Met Pro Asn Asp Gln Ala Ser Gly Ser
1055 1060 1065
Gly Gly Lys Gly Ser Arg Leu Pro Asp Leu Gly Ser Asp Tyr Lys
1070 1075 1080
Pro Pro Met Ser Gly Ser Asn Ser Pro His Gly Ser Pro Thr Ser
1085 1090 1095
Pro Leu Asp Ser Asn Met Leu Leu Val Ile Ile Val Ser Val Gly
1100 1105 1110
Val Ile Thr Ile Val Val Val Val Ile Ile Ala Val Phe Cys Thr
1115 1120 1125
Arg Arg Thr Thr Ser His Gln Lys Lys Lys Arg Ala Ala Cys Lys
1130 1135 1140
Ser Val Asn Gly Ser His Lys Tyr Lys Gly Asn Ser Lys Asp Val
1145 1150 1155
Lys Pro Pro Asp Leu Trp Ile His His Glu Arg Leu Glu Leu Lys
1160 1165 1170
Pro Ile Asp Lys Ser Pro Asp Pro Asn Pro Ile Met Thr Asp Thr
1175 1180 1185
Pro Ile Pro Arg Asn Ser Gln Asp Ile Thr Pro Val Asp Asn Ser
1190 1195 1200
Met Asp Ser Asn Ile His Gln Arg Arg Asn Ser Tyr Arg Gly His
1205 1210 1215
Glu Ser Glu Asp Ser Met Ser Thr Leu Ala Gly Arg Arg Gly Met
1220 1225 1230
Arg Pro Lys Met Met Met Pro Phe Asp Ser Gln Pro Pro Gln Pro
1235 1240 1245
Val Ile Ser Ala His Pro Ile His Ser Leu Asp Asn Pro His His
1250 1255 1260
His Phe His Ser Ser Ser Leu Ala Ser Pro Ala Arg Ser His Leu
1265 1270 1275
Tyr His Pro Gly Ser Pro Trp Pro Ile Gly Thr Ser Met Ser Leu
1280 1285 1290
Ser Asp Arg Ala Asn Ser Thr Glu Ser Val Arg Asn Thr Pro Ser
1295 1300 1305
Thr Asp Thr Met Pro Ala Ser Ser Ser Gln Thr Cys Cys Thr Asp
1310 1315 1320
His Gln Asp Pro Glu Gly Ala Thr Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Ser
1325 1330 1335
Ser Gln Glu Glu Asp Ser Gly Gln Ser Leu Pro Thr Ala His Val
1340 1345 1350
Arg Pro Ser His Pro Leu Lys Ser Phe Ala Val Pro Ala Ile Pro
1355 1360 1365
Pro Pro Gly Pro Pro Thr Tyr Asp Pro Ala Leu Pro Ser Thr Pro
1370 1375 1380
Leu Leu Ser Gln Gln Ala Leu Asn His His Ile His Ser Val Lys
1385 1390 1395
Thr Ala Ser Ile Gly Thr Leu Gly Arg Ser Arg Pro Pro Met Pro
1400 1405 1410
Val Val Val Pro Ser Ala Pro Glu Val Gln Glu Thr Thr Arg Met
1415 1420 1425
Leu Glu Asp Ser Glu Ser Ser Tyr Glu Pro Asp Glu Leu Thr Lys
1430 1435 1440
Glu Met Ala His Leu Glu Gly Leu Met Lys Asp Leu Asn Ala Ile
1445 1450 1455
Thr Thr Ala
1460
<210> 11
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体 重链 HA
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Arg Asp Gly Ala Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 12
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体 重链 HB
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Arg Asp Gly Ala Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体 重链 HC
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
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<223> 人源化抗体 轻链 KA
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体 轻链 KB
<400> 20
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体 轻链 KC
<400> 21
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体 轻链 KD
<400> 22
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<210> 23
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体 轻链 KE
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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<210> 24
<211> 214
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<220>
<223> 人源化抗体 轻链 KF
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Glu Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 25
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体 轻链 KG
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Glu Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 26
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 26
Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 27
Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 28
Pro Thr Ala Pro Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr
1 5 10
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 29
Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 30
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 31
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 32
Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro
1 5
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 33
Asp Ala Trp Met Asp
1 5
<210> 34
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 34
Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser
1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 35
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 35
Arg Asp Gly Ala Tyr
1 5
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 36
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 37
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 38
Ser Gln Ser Thr His Val Pro
1 5
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 39
Thr Ser Tyr Tyr Trp Asn
1 5
<210> 40
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 40
Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 41
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体 重链
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Arg Asp Gly Ala Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体 轻链
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Glu
100 105
<210> 43
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码人源化抗体重链的基因
<400> 43
gaagtgcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcagatc cctgagactg 60
tcctgtaccg cctccggctt caccttctcc gacgcctgga tggattgggt gcgacaggct 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtggccgag atccggtcca aggccaacaa ccacgccacc 180
tactacgccg agtctgtgaa gggccggttc accatctccc gggacgactc caagtccatc 240
gtgtacctgc agatgaactc cctgcggacc gaggacaccg ccctgtacta ctgcaccaga 300
agggacggcg cctactgggg caagggcacc acagtgacag tgtcctcc 348
<210> 44
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码人源化抗体轻链的基因
<400> 44
gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc gtgtctgctt ccgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggcctccca ggacatctcc tcctacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac acctcccggc tgcactccgg cgtgccctct 180
agattttccg gctctggctc cggcaccgac tttaccctga ccatctccag cctgcagccc 240
gaggacttcg cctcctactt ctgtcagcag ctgaacaccc tgccctggac ctttggcgga 300
ggcaccaagg tggaaatgga a 321
<210> 45
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PLP139-151
<400> 45
His Ser Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe
1 5 10
<210> 46
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 间隔序列
<400> 46
Ser Gly Ser Gly
1

Claims (15)

1.一种分离得到的抗RGMa抗体，其轻链的互补性决定区域1即LCDR1、轻链的互补性决定区域2即LCDR2、轻链的互补性决定区域3即LCDR3、重链的互补性决定区域1即HCDR1、重链的互补性决定区域2即HCDR2和重链的互补性决定区域3即HCDR3各自的氨基酸序列为如下：
LCDR1：为RASQDISSYLN即序列表的序列号30
LCDR2：为YTSRLHS即序列表的序列号31
LCDR3：为QQLNTLP即序列表的序列号32
HCDR1：为DAWMD即序列表的序列号33
HCDR2：为EIRSKANNHATYYAESVKG即序列表的序列号34和
HCDR3：为RDGAY即序列表的序列号35，
或者为：
LCDR1：为RSSQSLVHSNGNTYLH即序列表的序列号36
LCDR2：为KVSNRFS即序列表的序列号37
LCDR3：为SQSTHVP即序列表的序列号38
HCDR1：为TSYYWN即序列表的序列号39
HCDR2：为YISYDGTNNYNPSLKN即序列表的序列号40和
HCDR3：为SFG。
2.根据权利要求1所述的抗RGMa抗体，其为选自F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv即抗体可变片段、二硫键Fv、单链抗体即scFv和它们的聚合物中任一个的抗RGMa抗体的抗原结合片段。
3.根据权利要求1所述的抗RGMa抗体，其中，重链可变区域即VH为：
VH：为EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS即序列表的序列号41，
轻链可变区域即VL为：
VL：为DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME即序列表的序列号42。
4.根据权利要求1所述的抗RGMa抗体，其中，抗RGMa抗体为人源化抗体。
5.根据权利要求1所述的抗RGMa抗体，其中，抗RGMa抗体具有人类IgG的恒定区域。
6.一种核酸分子，其编码权利要求1～5中任一项所述的抗RGMa抗体的蛋白质部分。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其中，编码VH和VL的氨基酸序列的核酸序列是由以下序列构成的核酸序列，
VH：gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcagatccctgagactgtcctgtaccgcctccggcttcaccttctccgacgcctggatggattgggtgcgacaggctcctggcaagggcctggaatgggtggccgagatccggtccaaggccaacaaccacgccacctactacgccgagtctgtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgtgtacctgcagatgaactccctgcggaccgaggacaccgccctgtactactgcaccagaagggacggcgcctactggggcaagggcaccacagtgacagtgtcctcc即序列表的序列号43，和
VL：gacatccagatgacccagtccccctcctccgtgtctgcttccgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcgggcctcccaggacatctcctcctacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactacacctcccggctgcactccggcgtgccctctagattttccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgcctcctacttctgtcagcagctgaacaccctgccctggacctttggcggaggcaccaaggtggaaatggaa即序列表的序列号44。
8.一种重组载体，含有权利要求6或7所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞，含有权利要求8所述的重组载体。
10.一种权利要求1～5中任一项所述的抗RGMa抗体的制造方法，包含培养权利要求9所述的宿主细胞的工序。
11.一种医药组合物，含有权利要求1～5中任一项所述的抗RGMa抗体。
12.根据权利要求11所述的医药组合物，其中，用于神经学疾病或免疫学疾病的预防、治疗或复发预防。
13.根据权利要求12所述的医药组合物，其中，神经学疾病选自：肌萎缩性侧索硬化症；臂丛神经损伤；包括外伤性脑损伤的脑损伤；脑性麻痹；格林-巴利综合征；大脑白质萎缩症；包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症的多发性硬化症；视神经脊髓炎；脊髓灰质炎后综合征；脊柱裂；脊髓损伤；脊髓性肌萎缩症；脊椎肿瘤；横贯性脊髓炎；包括老年性痴呆症、轻度认知功能障碍、阿尔茨海默病、阿尔茨海默相关痴呆症的痴呆症；亨廷顿氏舞蹈病；迟发性运动障碍；狂躁症；帕金森氏病；斯蒂尔-理查德综合征；唐氏综合征；重症肌无力症；包括视神经外伤的神经外伤；血管淀粉样变病；伴随淀粉样变病的大脑出血；脑梗塞；脑炎；急性精神错乱；青光眼；精神分裂症；和包括糖尿病视网膜病变、缺血性视神经病变、X染色体连锁性视网膜劈裂症、药物诱发性视神经病变、视网膜营养不良、老年性黄斑变性、以视乳头玻璃疣为特征的眼病、以光感受器变性的遗传性决定因素为特征的眼病、常染色体隐性遗传锥-杆细胞营养不良、伴随视神经病变的线粒体疾病的视网膜神经纤维层变性。
14.根据权利要求12所述的医药组合物，其中，免疫学疾病选自：包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症的多发性硬化症；视神经脊髓炎；银屑病；包括风湿性关节炎、变形性关节炎、银屑病性关节炎的关节炎；格林-巴利综合征；神经白塞氏病；恶性贫血；I型即胰岛素依赖型糖尿病；系统性红斑狼疮即SLE；炎症性肠病即IBD；干燥综合征；古巴士德氏综合征；格雷夫斯病；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性血小板减少性紫癜；哮喘；花粉症；特应性皮肤炎；肾小球肾炎；重症肌无力症；桥本病；和结节病。
15.根据权利要求12所述的医药组合物，其中，神经学疾病或免疫学疾病选自：脊髓损伤；包括视神经外伤的神经外伤；包括复发缓解型多发性硬化症、原发性进展型多发性硬化症、继发性进展型多发性硬化症的多发性硬化症。
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