JP7306660B2 - RGMa結合タンパク質及びその使用 - Google Patents
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Description
含まれるが、その中でも、RGMaが発生段階に加えて、成人ヒトおよびラットの中枢神経系損傷後に再発現すること、ラットにおいてRGMa阻害が脊髄損傷後の神経突起成長を亢進し、機能回復を促進することから(非特許文献2参照)、RGMaは中枢神経系損傷後の神経突起阻害物質であると考えられている。
作用することでT細胞のICAM-1・フィブロネクチンへの接着性を高めたり、サイトカイン
の産生を誘導する(特許文献4)。多発性硬化症モデルマウスにおいて、抗RGMa抗体を投与すると、脳脊髄炎による症状が抑制され、発症、再発を抑制する効果も示す。抗RGMa抗体は、樹状細胞に発現するRGMaに結合することで、T細胞の活性化を抑制し、多発性硬化
症に効果を示すものと考えられている。
RGMaは、細胞膜上のNeogeninに結合して、細胞内のRhoAの活性化、Rasの不活性化を誘導
することで、神経突起成長阻害効果をもたらす。一方で、発生途上のニワトリの脳において、RGMaが結合していない場合、Neogeninはアポトーシスを引き起こすことが知られている(Matsunagaら、Dev.Growth Differ.46, 481, 2004)。すなわち、RGMa/Neogenin経路
は、神経細胞の生存を促進する、神経再生にとって好ましい作用、および神経突起成長を阻害する負の作用の二つの相反する作用を有していると考えられる。
た、特許文献5には、抗RGM抗体の多発性硬化症、哺乳動物の脳外傷、脊髄損傷、卒中、
神経変性疾患及び統合失調症を含む疾患への治療用途が開示されている。さらに、特許文献6には、抗RGM抗体などのRGMモデュレーターの脊髄損傷や多発性硬化症への治療用途が開示されており、非特許文献3には進行型多発性硬化症への治療用途が開示されている。
そこで、本発明は、RGMa/Neogeninの相互作用を阻害せず、かつRGMaの神経突起成長阻害
活性を中和するRGMa結合タンパク質を提供することを課題とする。
[1]RGMaとNeogeninの結合を阻害せず、かつRGMaの神経突起成長阻害活性を中和する、単離されたRGMa結合タンパク質。
[2]ヒトRGMa、ラットRGMa及び/又はマウスRGMaと結合する、[1]に記載のRGMa結合タンパク質。
[3]EEVVNAVEDWDSQG(配列表の配列番号26)、NQQIDFQAFHTNAE(配列表の配列番号27)、PTAPETFPYET(配列表の配列番号28)、及び/又はKLPVEDLYYQA(配列表の配列番号29)のペプチドに結合する、[1]または[2]に記載のRGMa結合タンパク質。
[4]配列表の配列番号26及び配列番号27のペプチドに結合する、[1]から[3]のいずれかに記載のRGMa結合タンパク質。
[5]配列表の配列番号26、配列表の配列番号27及び配列表の配列番号28のペプチドに結合する、[1]から[4]のいずれかに記載のRGMa結合タンパク質。
[6]配列表の配列番号26、配列表の配列番号27及び配列表の配列番号29のペプチドに結合する、[1]から[4]のいずれかに記載のRGMa結合タンパク質。
[7]RGMa結合タンパク質がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、またはこれらの抗原結合断片である、[1]から[6]のいずれかに記載のRGMa結合タンパク質。
[8][1]から[7]のいずれかに記載のRGMa結合タンパク質のタンパク質部分をコードする核酸分子。
[9][8]に記載の核酸分子を含む組み換えベクター。
[10][9]に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
[11][1]から[7]のいずれかに記載のRGMa結合タンパク質の製造方法であって、[10]に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
[12][1]から[7]のいずれかに記載のRGMa結合タンパク質を含む、医薬組成物。[13]神経学的疾患または免疫学的疾患の予防、治療または再発予防用の[12]に記載の医薬組成物。
[14]神経学的疾患が、筋萎縮性側索硬化症、上腕神経叢損傷、脳損傷(外傷性脳損傷を含む)、脳性麻痺、ギランバレー、大脳白質萎縮症、多発性硬化症(再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症を含む)、視神経脊髄炎、ポリオ後症候群、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症、脊椎腫瘍、横断性脊髄炎、認
知症(老年性認知症、軽度認知機能障害、アルツハイマー病、アルツハイマー関連認知症を含む)、ハンチントン舞踏病、遅発性ジスキネジー、そう病、パーキンソン病、スティール-リチャード症候群、ダウン症、重症筋無力症、神経外傷(視神経外傷を含む)、血管アミロイド症、アミロイド症を伴う大脳出血、脳梗塞、脳炎、急性混乱障害、緑内障、統合失調症及び網膜神経線維層変性(糖尿病性網膜症、虚血性視神経症、X染色体連鎖性網膜分離症、薬物誘発性視神経症、網膜ジストロフィー、加齢黄斑変性、視神経乳頭ドルーゼンにより特徴づけられる眼病、光受容器変性の遺伝的決定因子により特徴づけられる眼病、常染色体劣性錐体-桿性ジストロフィー、視神経症を伴うミトコンドリア障害を含む)を含む群から選択される、[13]に記載の医薬組成物。
[15]免疫学的疾患が、多発性硬化症(再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症を含む)、視神経脊髄炎、乾癬、関節炎(関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む)、ギランバレー症候群、神経ベーチエツト病、悪性貧血、I型(インスリン依存型)糖尿病、全身エリテマトーデス(SLE) 、炎症性腸疾患(IBD) 、シェーグレン症候群、グッドバスチャー症候群、グレーブス病、自己免疫性溶血
性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎、糸球体腎炎、重症筋無力症、橋本病、及びサルコイドーシスを含む群から選択される、[13]に記載の医薬組成物。
[16]神経学的疾患または免疫学的疾患が、脊髄損傷、神経外傷(視神経外傷を含む)及び多発性硬化症(再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症を含む)を含む群から選択される[13]に記載の医薬組成物。
[17]軽鎖の相補性決定領域1(LCDR1)、軽鎖の相補性決定領域2(LCDR2)、軽鎖の相補性決定領域3(LCDR3)、重鎖の相補性決定領域1(HCDR1)、重鎖の相補性決定領域2(HCDR2)及び重鎖の相補性決定領域3(HCDR3)のそれぞれのアミノ酸配列が、
LCDR1:RASQDISSYLN(配列表の配列番号30)
LCDR2:YTSRLHS(配列表の配列番号31)
LCDR3:QQLNTLP(配列表の配列番号32)
HCDR1:DAWMD(配列表の配列番号33)
HCDR2:EIRSKANNHATYYAESVKG(配列表の配列番号34)及び
HCDR3:RDGAY(配列表の配列番号35)を含む、
または、
LCDR1:RSSQSLVHSNGNTYLH(配列表の配列番号36)
LCDR2:KVSNRFS(配列表の配列番号37)
LCDR3:SQSTHVP(配列表の配列番号38)
HCDR1:TSYYWN(配列表の配列番号39)
HCDR2:YISYDGTNNYNPSLKN(配列表の配列番号40)及び
HCDR3:SFGを含み、
各CDR配列においては、1または数個のアミノ酸が置換、欠失、及び/または付加されて
いてもよい、単離された抗RGMa抗体、またはその抗原結合断片。
[18]重鎖可変領域(VH)が
VH:EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS(配列表の配列番号41)または該アミノ酸配列に少なくとも90%の同一性のあるアミノ酸配列を含み、
軽鎖可変領域(VL)が
VL:DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME(配列表の配列番号42)または該アミノ酸配列に少
なくとも90%の同一性のあるアミノ酸配列を含む、[17]に記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片。
[19]抗RGMa抗体がヒト化抗体である、[17]または[18]に記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片。
[20]抗RGMa抗体がヒトIgGの定常領域を有する、[17]から[19]のいずれかに
記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片。
[21]RGMaとの結合が[17]または[18]に記載の抗RGMa抗体と競合する、RGMa結合タンパク質。
[22][17]から[20]のいずれかに記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片のタンパク質部分をコードする核酸分子。
[23]VH及びVLのアミノ酸配列をコードする核酸配列が
VH:gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcagatccctgagactgtcctgtaccgcctccggcttcaccttctccgacgcctggatggattgggtgcgacaggctcctggcaagggcctggaatgggtggccgagatccggtccaaggccaacaaccacgccacctactacgccgagtctgtgaagggccggttcaccatctcccgggacgactccaagtccatcgtgtacctgcagatgaactccctgcggaccgaggacaccgccctgtactactgcaccagaagggacggcgcctactggggcaagggcaccacagtgacagtgtcctcc(配列表の配列番号43)、及び
VL:gacatccagatgacccagtccccctcctccgtgtctgcttccgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcgggcctcccaggacatctcctcctacctgaactggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctactacacctcccggctgcactccggcgtgccctctagattttccggctctggctccggcaccgactttaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgcctcctacttctgtcagcagctgaacaccctgccctggacctttggcggaggcaccaaggtggaaatggaa(配列表の配列番号44)を含む核酸配列である、[22]に記載の核酸分子。
[24][22]または[23]に記載の核酸分子を含む組み換えベクター。
[25][24]に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
[26][17]から[20]のいずれかに記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片の製造方法であって、[25]に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
[27][17]から[20]のいずれかに記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片を含む、医薬組成物。
[28]神経学的疾患または免疫学的疾患の予防、治療または再発予防用の[27]に記載の医薬組成物。
[29]神経学的疾患が、筋萎縮性側索硬化症、上腕神経叢損傷、脳損傷(外傷性脳損傷を含む)、脳性麻痺、ギランバレー、大脳白質萎縮症、多発性硬化症(再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症を含む)、視神経脊髄炎、ポリオ後症候群、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症、脊椎腫瘍、横断性脊髄炎、認知症(老年性認知症、軽度認知機能障害、アルツハイマー病、アルツハイマー関連認知症を含む)、ハンチントン舞踏病、遅発性ジスキネジー、そう病、パーキンソン病、スティール-リチャード症候群、ダウン症、重症筋無力症、神経外傷(視神経外傷を含む)、血管アミロイド症、アミロイド症を伴う大脳出血、脳梗塞、脳炎、急性混乱障害、緑内障、統合失調症及び網膜神経線維層変性(糖尿病性網膜症、虚血性視神経症、X染色体連鎖性網膜分離症、薬物誘発性視神経症、網膜ジストロフィー、加齢黄斑変性、視神経乳頭ドルーゼンにより特徴づけられる眼病、光受容器変性の遺伝的決定因子により特徴づけられる眼病、常染色体劣性錐体-桿性ジストロフィー、視神経症を伴うミトコンドリア障害を含む)を含む群から選択される、[28]に記載の医薬組成物。
[30]免疫学的疾患が、多発性硬化症(再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症を含む)、視神経脊髄炎、乾癬、関節炎(関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む)、ギランバレー症候群、神経ベーチエツト病、悪性貧血、I型(インスリン依存型)糖尿病、全身エリテマトーデス(SLE) 、炎症性腸疾患(IBD) 、シェーグレン症候群、グッドバスチャー症候群、グレーブス病、自己免疫性溶血
性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎、糸球体腎炎、重症筋無力症、橋本病、及びサルコイドーシスを含む群から選択される、[28]に記載の医薬組成物。
[31]神経学的疾患または免疫学的疾患が、脊髄損傷、神経外傷(視神経外傷を含む)及び多発性硬化症(再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症を含む)を含む群から選択される[28]に記載の医薬組成物。
[32][1]から[7]のいずれかに記載のRGMa結合タンパク質を、それを必要とする対象に、有効量投与する工程を含む、神経学的疾患または免疫学的疾患の予防、治療また
は再発予防方法。
[33][17]から[20]のいずれかに記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片を、それを必要とする対象に、有効量投与する工程を含む、神経学的疾患または免疫学的疾患の予防、治療または再発予防方法。
ので、神経細胞の保護効果が強く、神経細胞減少に伴う副作用の心配が少ない。また、本発明のヒト化抗RGMa抗体は、従来の抗体よりもヒトRGMaとの結合性および熱安定性などの特性に優れている。したがって、薬効に優れ、副作用の少ない神経学的疾患や免疫学的疾患に対する医薬として使用し得る。
RGMaは中枢神経系における神経突起成長阻害タンパク質であり、ヒトRGMaタンパク質は配列表の配列番号1に示すように450アミノ酸からなる前駆タンパク質として生合成される。N末端に存在するシグナルペプチドMet1~Pro47(N末端側から1番目のメチオニン残基から47番前のプロリン残基までのペプチドを指す、以後同様に
記載)が除去され、Asp168とPro169の間のペプチド結合が切断され、C末端ペプチドArg423~Cys450が除去されるとともに、C末端となったGly422のC末端カルボキシル基にGPIアンカーが付加される。ヒトRGMaタンパク質は、N末側ドメイン(Cys48~Asp168)とC末側ドメイン(Pro169~Ala424)がジスルフィド結合により繋がった成熟タンパク質として、GPIアンカーを介して細胞膜上に発現する。マウスのRGMaの前駆タンパク質は配列表の配列番号2に示すアミノ酸配列、ラットのRGMaの前駆タンパク質は配列表の配列番号3に示すアミノ酸配列からなるが、C末端ペプチドが除去されるため、成熟タンパク質としては同一のアミノ酸配列となる。本発明では、RGMaは後述するNeogeninに結合して作用するものであれば、前駆タンパク質、成熟タンパク質またはその活性型断片のいずれかを指してもよいし、それらの誘導体若しくは変異体であってもよい。また、ヒトRGMaでも他の生物由来のRGMaでもよいが、ヒトRGMaが好ましい。
Neogeninは中枢神経の神経細胞等に発現し、RGMaの受容体の1つとして機能している。ヒトNeogeninタンパク質は配列表の配列番号10に示すように、1461アミノ酸からなり、シグナルペプチドMet1~Ala33が除かれ成熟した膜タンパク質として発現する。本発明では、NeogeninはRGMaに結合するものであれば、前駆タンパク質、成熟タンパク質またはそのRGMa結合断片のいずれかを指してもよいし、それらの誘導体若しくは変異体であってもよい。また、ヒトNeogeninでも他の生物由来のNeogeninでもよいが、ヒトNeogeninが好ましい。
本願において「中和」とは目的の標的に結合し、かつ、その標的のいずれかの機能を阻害することができる作用のことをいう。すなわち、「RGMaの神経突起成長阻害活性を中和する」とは、RGMa結合タンパク質がRGMaに結合することにより、RGMaの神経突起成長阻害活性を阻害することをいう。神経突起成長阻害活性は、当分野において知られたいくつかのin vitroまたはin vivo分析の1つまたはそれ以上によって評価することができるが、例えば、本願明細書に記載の神経突起成長阻害試験により評価することができる。
単離されたRGMa結合タンパク質等の「単離された」とは、同定され、かつ、分離された、及び/または、自然状態での成分から回収された、という意味である。自然状態での不純物は、その抗体の診断的または治療的使用を妨害し得る物質であり、酵素、ホルモン及びその他の蛋白質性のまたは非蛋白質性の溶質が挙げられる。一般的に、RGMa結合タンパク質等を単離するには、少なくとも1つの精製工程によって精製すればよく、少なくとも1つの精製工程により精製されたRGMa結合タンパク質を「単離されたRGMa結合タンパク質」ということができる。
本願において「RGMa結合タンパク質」とはRGMaに結合するタンパク質を含む分子をいう。RGMa結合タンパク質としては、抗RGMa抗体及びその抗原結合断片、並びにRGMa結合スキャフォールドタンパク質、並びにNeogeninの細胞外ドメインなどの可溶性RGMa受容体タンパク質、並びにこれらの融合タンパク質があげられる。RGMa結合スキャフォールドタンパク質とは、セリンプロテアーゼ阻害剤のKunitzドメインやヒトのファイブロネクチンの細胞外ドメイン、アンキリン、リポカリンなどに変異を導入することにより、RGMaとの結合機能を実現するタンパク質をいう。融合タンパク質とは、RGMa結合タンパク質にポリエチレングリコール(PEG)等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophinなど)、アルブミン、酵素、他の抗体などの本願のRG
Ma結合タンパク質以外の機能分子を化学的または遺伝子工学的に結合したRGMa結合タンパク質をいう。
ヒト抗体とは、軽鎖、重鎖ともにヒト免疫グロブリン由来の抗体をいう。ヒト抗体は、重鎖の定常領域の違いにより、γ鎖の重鎖を有するIgG(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含む)、μ鎖の重鎖を有するIgM、α鎖の重鎖を有するIgA(IgA1,IgA2を含む)、δ鎖の重鎖を有するIgD、またはε鎖の重鎖を有するIgEを含む。また原則として軽鎖は、κ鎖とλ鎖のどちらか一方を含む。
ヒト化抗体は、非ヒト動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域とからなる可変領域、及びヒト抗体由来の定常領域からなる抗体をいう。
キメラ抗体とは、軽鎖、重鎖、またはその両方が、非ヒト由来の可変領域と、ヒト由来の定常領域からなる抗体をいう。
本願において抗RGMa抗体は、RGMaに結合する免疫グロブリン分子またはその改変分子のことをいう。改変分子には、マルチスペシフィック抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、機能改変抗体、及びコンジュゲート抗体を含むものとする。
マルチスペシフィック抗体とは、2つ以上の異なる抗原特異性を有する2つ以上の独立した抗原認識部位を持ち合わせた非対称の抗体であり、2つの抗原特異性を有するバイスペシフィック抗体、3つの抗原特異性を有するトリスペシフィック抗体などが挙げられる。
本願において機能改変抗体とは、主に抗体のFc領域のアミノ酸や糖鎖を改変することにより、抗体の有する抗原結合機能以外の機能、例えば細胞殺傷機能、補体活性化機能や血中半減期延長機能を改変した抗体をいう。
本願においてコンジュゲート抗体とは、抗体にポリエチレングリコール(PEG)等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophinなど)、アルブミン、酵素などの抗体以外の機能分子
を化学的または遺伝子工学的に結合した抗体をいう。
本願において抗原結合断片とは、抗体の一部分を含む蛋白質であり、抗原に結合できるものをいう。抗原結合断片の例としては、F(ab')2 、Fab'、Fab 、Fv(variable fragment of antibody)、ジスルフィド結合Fv、一本鎖抗体(scFv)、およびこれらの
重合体等が挙げられる。さらに、抗原結合断片は、ポリエチレングリコール(PEG)等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophinなど)、アルブミン、酵素、他の抗体などの本願の
抗RGMa抗体以外の機能分子を化学的または遺伝子工学的に結合しているコンジュゲート抗原結合断片を含むものとする。
相補性決定領域(CDR)とは免疫グロブリン分子の可変領域のうち、抗原結合部位を形成する領域をいい、超可変領域とも呼ばれ、免疫グロブリン分子ごとに特にアミノ酸配列の変化が大きい部分をいう。CDRには軽鎖及び重鎖それぞれに3つのCDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3、及びHCDR1、HCDR2、HCDR3)がある。本願では、免疫グロブリン分子のCDRはカバット(Kabat)の番号付けシステム(Kab
atら、1987、Sequences of Proteins of Immunological Interest、US Department of Health and Human Services、NIH、USA)に従って決定される。
ここで可変領域等の、同定した参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(%)同一性」とは、配列を整列させ、最大の%同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。%同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することによ
り達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%同一性値は、ペアワイズアラインメントにおいて、配列比較コンピュータプログラムBLASTを使用することによって得られる。
アミノ酸配列比較にBLASTが用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの%同一性は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムBLASTのA及びBのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%同一性は、BのAに対する%同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての%同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにBLASTコンピュータプログラムを用いて得られる。
本願において、本発明の抗RGMa抗体と「競合する」とは、本明細書に記載された表面プラズモン共鳴(SPR)法によって測定した場合に、該抗RGMa抗体またはその抗原結
合断片の存在により、有意差をもって本発明の抗RGMa抗体とRGMaとの結合が低下することをいう。
<RGMa結合タンパク質>
本発明のRGMa結合タンパク質は、RGMaとNeogeninの結合を阻害せず、かつRGMaの神経突起成長阻害活性を中和する、単離されたRGMa結合タンパク質である。
場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合等が挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸の例として、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
あり、下限値としては特に限定されないが、例えば10-14M以上、より好ましくは10-13以上であるRGMa結合タンパク質が挙げられる。
として用いられるため、本発明のRGMa結合タンパク質は、マウスやラットのRGMaに結合することが好ましく、マウスやラットのRGMaに対するKdが低いものがさらに好ましい。Kdの上限値として例えば5x10-7M以下、より好ましくは10-8M以下、さらにより好ましくは10-9M以下であり、下限値としては特に限定されないが、例えば10-12M以上、より好ましくは10-11以上であるRGMa結合タンパク質が挙げられる。
(配列表の配列番号1のアミノ酸番号349-359)、KLPVEDLYYQA(配列表の配列番
号29)(配列表の配列番号1のアミノ酸番号367-377)の1つ以上のペプチドに
結合することが好ましい。配列表の配列番号26と27に結合することがより好ましく、配列表の配列番号26と27、かつ配列表の配列番号28または29に結合することがより好ましい。
本発明の抗RGMa抗体は、RGMaタンパク質またはその部分断片(例えば、上記配列表の配列番号26~29の一つ以上を含む断片)を抗原として、該抗原をマウス等の哺乳動物に免疫して得られるポリクローナル抗体やモノクローナル抗体、遺伝子組換え技術を用いて製造されるキメラ抗体およびヒト化抗体、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造されるヒト抗体などが含まれる。本発明の抗体を医薬としてヒトに投与する場合は、副作用の観点から、ヒト化抗体またはヒト抗体が望ましい。
ポリクローナル抗体は、既存の一般的な製造方法によって取得することができる。即ち、例えば、前述のような抗原を、必要に応じてフロイントアジュバント(Freund's Adjuvant)とともに、上記のような哺乳動物に免疫することで該免疫感作動物から得た血清か
ら取得することができる。
モノクローナル抗体は、具体的には下記のようにして取得することができる。即ち、前述のような抗原を免疫原とし、該免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント(Freund's Adjuvant)とともに、上記のような哺乳動物の皮下、筋肉内、静脈内、フッドパッ
ド内あるいは腹腔内に1~数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約1~14日毎に1~4回免疫を行って、最終免疫より約1~5日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。
養するか、またはマウス、ラット等の哺乳動物の腹水中等でのインビボで増殖させ、得られた培養上清、または哺乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
uまたは211Atなどが用いられる。放射性物質は、ク口ラミンT法などによってRGM
a結合タンパク質に直接結合させることができる。
(CR2)n-(Rは任意の置換基、nは正の整数)で表されるリンカーやアルコキシの
反復単位(例えば、ポリエチレンオキシ、PEG、ポリメチレンオキシ等)及びアルキルアミノ(例えば、ポリエチレンアミノ、JeffamineTM)、並びに、二酸エステル及びアミド(スクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミド等が挙げられる)が挙げられる。機能分子を結合させる化学的修飾方法はこの分野において既に確立されている (D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of
Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681)。
細書等に記載の方法を参照して作製することができる。具体的には、そのCDRの一部または全部が非ヒト哺乳動物(マウス、ラット、ハムスター等)のモノクローナル抗体に由来するCDRであり、その可変領域のフレームワーク領域がヒトイムノグロブリン由来の可変領域のフレームワーク領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト化抗体を意味する。
号33(HCDR1)、34(HCDR2)および35(HCDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変
領域のCDRに配列表の配列番号30(LCDR1)、31(LCDR2)および32(LCDR3)のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
なお、RGMa との結合能を有し、RGMa とNeogeninの結合を阻害せず、RGMaの神経突起成長阻害活性を中和するという本発明の抗体の特性が維持される限り、これらのCDRの1つ
以上において、1~数個のアミノ酸が置換されてもよい。ここで、1~数個とは、例えば、1個または2個である。なお、該アミノ酸置換は本発明の特性を維持するために保存的置換であることが好ましい。抗体の特性が維持されるとは、これらの特性がCDRのアミノ
酸配列改変前と比較して同程度、例えば、80%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上に維持されることをいう。なお、維持は向上も含む。
されず、マウス由来の配列、ヒト由来の配列、他の哺乳動物由来の配列、それらのキメラ配列、人工配列のいずれであってもよい。定常領域を含む場合においては、重鎖および軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 およびCell vol.22, p197, 1980に記載のものが例示される。
を、重鎖に配列表の配列番号5のアミノ酸配列を有する抗体が例示される。なお、これらのアミノ酸配列においては、RGMa との結合能を有し、RGMa とNeogeninの結合を阻害せず、RGMaの神経突起成長阻害活性を中和するという特性が維持される限り、1または数個のアミノ酸(1~20個、1~10個または1~5個)の置換、欠失、付加又は挿入があってもよい。このような置換、欠失、付加はCDRに導入されてもよいが、CDR以外の領域に導入されることが好ましい。また、該アミノ酸置換は本発明の特性を維持するために保存的置換であることが好ましい。
しては、重鎖に配列表の配列番号11~18(可変領域はN末端側116残基まで)のいずれかのアミノ酸配列を有し、軽鎖に配列表の配列番号19~25(可変領域はN末端側1~107残基まで)のいずれかのアミノ酸配列を有する抗体が例示される。
なお、ヒト化抗体のアミノ酸配列(重鎖:配列表の配列番号11~18、軽鎖:配列表の配列番号19~25)においては、RGMa との結合能を有し、RGMa とNeogeninの結合を阻害せず、RGMaの神経突起成長阻害活性を中和するという特性が維持される限り、1または数個のアミノ酸(1~20個、1~10個または1~5個)の置換、欠失、付加又は挿入があってもよい。このような置換、欠失、付加はCDRに導入されてもよいが、CDR以外の領域に導入されることが好ましい。また、該アミノ酸置換は本発明の特性を維持するために保存的置換であることが好ましい。
なお、これらのアミノ酸配列において、RGMa との結合能を有し、RGMa とNeogeninの結
合を阻害せず、RGMaの神経突起成長阻害活性を中和するという特性が維持される限り、1または数個のアミノ酸(1~20個、1~10個または1~5個)の置換、欠失、付加又は挿入があってもよい。このような置換、欠失、付加はCDRに導入されてもよいが、CDR以外の領域に導入されることが好ましい。また、該アミノ酸置換は本発明の特性を維持するために保存的置換であることが好ましい。
このような配列表の配列番号41および/または配列表の配列番号42のアミノ酸配列において置換、欠失等が含まれた本発明の抗体のアミノ酸配列は、重鎖可変領域が配列表の配列番号41と90%以上(より好ましくは95%、96%、97%、98%、99%以上、)の同一性を有するアミノ酸配列であり,軽鎖可変領域が配列表の配列番号42と90%以上(より好ましくは95%、96%、97%、98%、99%以上)の同一性を有するアミノ酸配列である。
番号39(HCDR1)、40(HCDR2)およびSFG(HCDR3)のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域のCDRに配列表の配列番号36(LCDR1)、37(LCDR2)および38(LCDR3)のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。なお、RGMa との結合能を有し、RGMa とNeogeninの結合を阻害せず、RGMaの神経突起成長阻害活性を中和するという本発明の抗体の特性が維持される限り、これらのCDRの1つ以上において、1~数個のアミノ酸が置換されてもよい
。ここで、1~数個とは、例えば、1個または2個である。なお、該アミノ酸置換は本発明の特性を維持するために保存的置換であることが好ましい。
CDR以外の領域は抗体としての構造を維持し、機能を発揮できる配列であれば特に制限
されず、マウス由来の配列、ヒト由来の配列、他の哺乳動物由来の配列、それらのキメラ配列、人工配列のいずれであってもよい。定常領域を含む場合においては、重鎖および軽鎖の定常領域のアミノ酸配列は、Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986、The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 およびCell vol.22, p197, 1980に記載のものが例示される。
を、重鎖に配列表の配列番号7のアミノ酸配列を有する抗体が例示される。なお、これらのアミノ酸配列において、RGMa との結合能を有し、RGMa とNeogeninの結合を阻害せず、RGMaの神経突起成長阻害活性を中和するという特性が維持される限り、1または数個のアミノ酸(1~20個、1~10個または1~5個)の置換、欠失、付加又は挿入があってもよい。このような置換、欠失、付加はCDRに導入されてもよいが、CDR以外の領域に導入されることが好ましい。また、該アミノ酸置換は本発明の特性を維持するために保存的置換であることが好ましい。
て既に確立されている。例えば、可変領域を直列に連結したDVD-Ig(Wuら、Nature
Biotechnology 25(11), 1290(2007))や、抗体のFc領域を改変することにより、異な
った抗原に結合する2種類の抗体の重鎖が組み合わされるART-Igの技術(Kitazawaら、Nature Medicine 18(10), 1570(2012))を利用すれば所望のバイスペシフィック抗体が
取得できる。RGMa以外の別の抗原としては、非限定的にNogo、MAG、Omgp、CSPG、Sema3A、Lingo-1等の神経突起成長を阻害する因子や、TNF―α、IL―6受容体、CD3、CD20、α4インテグリン、BLys、Thymic
Stromal Lymphopoietin、IgE、IL-1、IL-2,IL-4、IL-5、IL-6,IL-13、IL-17、IL-23、IL-25等の免疫関連分子が挙げられる。
これらの機能改変抗体は、遺伝子工学的に製造することができる。
抗体以外の機能分子を化学的または遺伝子工学的に結合したコンジュゲート抗体があげられる。
直接結合させることができる。
レキサート、マイトマイシン、ネオカルチノスタチン、ビンデシン及びFITC等の蛍光色素等が挙げられる。
(CR2)n-(Rは任意の置換基、nは正の整数)で表されるリンカーやアルコキシの
反復単位(例えば、ポリエチレンオキシ、PEG、ポリメチレンオキシ等)及びアルキルアミノ(例えば、ポリエチレンアミノ、JeffamineTM)、並びに、二酸エステル及びアミド(スクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミド等が挙げられる)が挙げられる。機能分子を結合させる化学的修飾方法はこの分野において既に確立されている (D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of
Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681)。
体等が挙げられ、さらに、抗原結合断片にはポリエチレングリコール(PEG)等の非ペプチド性ポリマー、放射性物質、毒素、低分子化合物、サイトカイン、成長因子(TGF-β、NGF、Neurotrophinなど)、アルブミン、酵素、他の抗体などの本願の抗RG
Ma抗体以外の機能分子を化学的または遺伝子工学的に結合しているコンジュゲート抗原結合断片が含まれる。
たIgGをペプシンで処理すると、ヒンジ領域中の2本の重鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記2つのFabがヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗
体フラグメントを製造することができる。この抗体フラグメントをF(ab')2という。
を化学的または遺伝子工学的に結合したコンジュゲート抗原結合断片があげられる。
Ma抗体の抗原結合性を有する一部分の領域に直接結合させることができる。
(CR2)n-(Rは任意の置換基、nは正の整数)で表されるリンカーやアルコキシの
反復単位(例えば、ポリエチレンオキシ、PEG、ポリメチレンオキシ等)及びアルキルアミノ(例えば、ポリエチレンアミノ、JeffamineTM)、並びに、二酸エステル及びアミド(スクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミド等が挙げられる)が挙げられる。機能分子を結合させる化学的修飾方法はこの分野において既に確立されている (D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of
Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681)。
との結合において競合する抗RGMa抗体、及びその抗原結合断片も含まれる。
上記のような特定のCDRのアミノ酸配列を有する抗体とRGMaとの結合において競合する抗
体としては、エピトープとして、Glu298~Gly311、Asn322~Glu335、Lys367~Ala377、およびPro349~Thr359から選ばれる領域にエピトープを有する抗体が例示される。
該抗体は、上記のようなCDR配列を有する抗体とRGMaタンパク質との結合系において、
共存させることにより、取得(スクリーニング)したり、評価したりすることができる。例えば、以下の表面プラズモン共鳴(SPR)法によりスクリーニングすることにより取得で
きる。
同様の実験を本発明の特定のCDRのアミノ酸配列を含む抗RGMa抗体でも実施し、飽和状態での結合量(飽和結合量2)を求める。
続いて、センサーチップ上のヒトRGMa蛋白質を本発明の特定のCDRのアミノ酸配列を含む抗RGMa抗体で飽和させた後、任意の抗RGMa抗体(15μg/mL)をアナライトとしてロードし、本発明の特定のCDRのアミノ酸配列を含む抗RGMa抗体で飽和されたヒトRGMa蛋白質に追加される形で結合するかどうかを調べる。
任意の抗RGMa抗体が、本発明の特定のCDRのアミノ酸配列を含む、抗RGMa抗体で飽和されたヒトRGMa蛋白質に追加される形で、上記で算出した任意の抗RGMa抗体の飽和結合量1を示しながら結合できる場合は、その抗体は「競合しない」と判断される。一方、任意の抗RGMa抗体が、本発明の特定のCDRのアミノ酸配列を含む、抗RGMa抗体で飽和されたヒトRGMa蛋白質に追加される形で結合できない場合は、その抗体は「競合する」と判断される。また任意の抗RGMa抗体が、本発明の特定のCDRのアミノ酸配列を含む、抗RGMa抗体で飽和されたヒトRGMa蛋白質に追加される形で結合できる場合でも、追加される結合量が有意差をもって飽和結合量1に達しない場合は、その抗体は「競合する」と判断される。有意差は一般的な検定方法(例えば、スチューデントのt検定)で調べ、有意水準は5%以下とする。
本発明の核酸分子は本発明のモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドであるが、例として、重鎖可変領域をコードする領域が配列表の配列番号33、34、および35のアミノ酸配列(1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されてよい)をコードする塩基配列をそれぞれ含み、かつ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列表の配列番号30、31、および32のアミノ酸配列(1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されてよい)をコードする塩基配列をそれぞれ含むポリヌクレオチドや、重鎖可変領域をコードする領域が配列表の配列番号39、40、およびSFGのアミノ酸
配列(1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されてよい)をコードする塩基配列をそれぞれ含み、かつ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列表の配列番号36、37、および38のアミノ酸配列(1または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されてよい)をコードする塩基配列をそれぞれ含むポリヌクレオチドが挙げられる。
4のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドや、重鎖をコードする領域が配列表の配列番号7のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、かつ、軽鎖をコードする領域が配列表の配列番号6のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
ダイズするポリヌクレオチド及び配列表の配列番号44の塩基配列の相補鎖DNAとストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、サザンハイブリダイゼーションの後、68℃、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度で洗浄を行う条件が挙げられる。
p1516, 1982 および Cell vol.22, p197, 1980 に記載のものが好ましい。
あるいは、可変領域又はその一部の配列を化学合成し、定常領域を含む配列に結合することによっても本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAを得ることができる。
)のような原核細胞において発現可能なベクター(例えば、pBR322、pUC119又はこれらの派生物)であってもよいが、真核細胞において発現可能なベクターが好ましく、哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターがより好ましい。哺乳動物由来の細胞において発現可能なベクターとしては、例えば、pcDNA3.1(Invitrogen社製)、pConPlus、pcDM8、pcDNA I/Amp、pcDNA3.1、pREP4のようなプラスミドベクター、pDON-AI DNA(宝バイオ社製)などのウイルスベクターを挙げることができ
る。重鎖コード配列と軽鎖コード配列を含む1つのベクターでもよいし、重鎖コード配列含むベクターと軽鎖コード配列を含むベクターの2つのベクターでもよい。
エローマ、BHK、HeLa、Vero、293、NS0、Namalwa、YB2/0などを挙げることができる。
ane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)が
、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラム、抗免疫グロブリン抗体結合カラム、抗原結合カラム等が挙げられる。例えばプロテインAカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.(Amersham Biosciences)等が挙げられる。
本発明のRGMa結合タンパク質、特に抗RGMa抗体またはその抗原結合断片は、RGMaの神経突起成長阻害活性を中和することで神経機能の修復を促すことから、神経学的疾患の予防、治療または再発予防薬として使用することができる。
本発明のRGMa結合タンパク質、特に抗RGMa抗体またはその抗原結合断片はまた、RGMaによるT細胞活性化を中和することから、免疫学的疾患の予防、治療または再発予防薬として
使用することができる。
網膜分離症、薬物誘発性視神経症、網膜ジストロフィー、加齢黄斑変性、視神経乳頭ドルーゼンにより特徴づけられる眼病、光受容器変性の遺伝的決定因子により特徴づけられる眼病、常染色体劣性錐体-桿性ジストロフィー、視神経症を伴うミトコンドリア障害を含む)が例示される。好ましくは脊髄損傷、神経外傷(視神経外傷を含む)である。
性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎、糸球体腎炎、重症筋無力症、橋本病、及びサルコイドーシスが例示される。好ましくは、多発性硬化症である。
非経口投与のための剤型は、注射用製剤(例えば、点滴注射剤、静脈注射剤、筋肉注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、脳内投与製剤、脊髄内投与製剤)、外用剤(例えば、軟膏剤、パップ剤、ローション剤)、坐剤吸入剤、眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、点耳剤、リポソーム剤等が挙げられる。特に、中枢神経組織に直接作用させたい場合は浸透圧ポンプの医療用マイクロポンプを利用して持続的に注入することもできるし、フィブリン糊などと混合し徐放製剤としたうえで患部組織に留置することもできる。
て溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、安定化剤等を添加することができる。また、用事調製用の凍結乾燥製剤とすることもできる。
ヒトRGMaタンパク質(配列表の配列番号1)のPro169~Gly422(N末端側から169番目のプロリン残基から422番目のグリシン残基までを指す、以後同様に記載)のC末端にヒスチジン
タグを融合した組換えヒトRGMaタンパク質発現するCHO細胞を樹立した。
CHO細胞の培養上清中に含まれるヒトRGMaタンパク質C末側ドメインを、ニッケルカラム(GE Healthcare 社製、17-5247-01)に吸着させた後、100mMイミダゾール溶液で溶出した。透析により、イミダゾール溶出画分からPhosphate bufferd saline(PBS)に置換し、免疫
原として用いた。
実施例1で調製した組換えヒトRGMaタンパク質10μgを、完全フロイントアジュバント(
シグマ社製)と混合してエマルジョンを作製し、BALB/cマウス(日本チャールス・リバー株式会社)の背部皮下の数か所に免疫した。その後1~2週間おきに不完全フロイントアジュ
バント(シグマ社製)でエマルジョンを作製した組換えヒトRGMaタンパク質10μgを同様に
免疫し、数回免疫後に採血した。後述するヒトまたはマウスRGMaタンパク質を固相化したELISA法にて抗体価を測定した。抗体価の上昇が認められた個体について、ヒトRGMaタン
パク質10μgを静脈内投与してブーストし、2~3日後に脾細胞を回収した。
細胞融合は前記脾細胞とその半数のマウスミエローマ細胞(SP2/0、大日本住友製薬)を
混合し、遠心して得た沈殿画分にポリエチレングリコール(ロシュ・ダイアグノスティッ
ク社製)を加えて細胞融合させた。次いで遠心した細胞をD-MEM(インビトロジェン社製)で2回洗浄した。細胞を10%ウシ胎児血清(インビトロジェン社製)、1% BM condimed(ロシ
ュ・ダイアグノスティック社製)およびHAT(シグマアルドリッチ社製)を含むGIT培地(日本製薬製)に再懸濁し、各ウェル5 ×104ミエローマ細胞/wellで96穴プレートに播種した。
培養上清を回収し、実施例3のヒトRGMaタンパク質固相化ELISA法により、抗体産生細胞
のスクリーニングを行った。
スクリーニングで得られた抗体産生細胞を限界希釈法によりクローニングし、2種類の
モノクローナル抗体(B5.116A3およびB5.70E4)を産生するハイブリドーマ細胞を選定した
。アイソタイピングキット(Mouse MonoAB ID/SP KIT、ZYMED社製、93-6550)を用いて判定した両モノクローナル抗体のアイソタイプは、いずれも重鎖はマウスIgG2b、軽鎖はκで
あった。
モノクローナル抗体の精製は、ハイブリドーマの培養上清から、抗マウスIgG抗体を固
定したアガロース(Sigma社製 Anti-Mouse IgG -Agarose)を用いたアフィティークロマト
グラフィーにより行った。抗体をカラムに結合させた後、PBSでカラムを洗浄し、次いで10mMグリシン塩酸(pH2.7)で溶出し、すみやかに中和した。その後、溶出中和液を限外濾過膜によりPBSに置換した。
PBSで2μg/mLに調製したヒトRGMaタンパク質(R&D systems社製、2459-RM)またはマウスRGMaタンパク質(R&D systems社製、2458-RG)を96穴プレートに50μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置した。液を除去後、PBSで5倍希釈したApplieBlock(生化学バイオビジネス
社製、200150)を200μL/wellずつ分注し室温で1時間静置し、非特異結合をブロックした
。PBST (0.05% Tween20を含むPBS)で3回洗浄後、PBSで段階希釈した検体(マウス血清、
ハイブリドーマ培養上清、後述する組換え抗体発現培養上清、または精製抗体など)を、50μL/wellずつ添加し、室温で1時間静置した。その後PBSTで3回洗浄し、次いでPBSで希
釈したペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウスIgG抗体(GE Healthcare社製、NA9310V)を50
μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置した。3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ発色キット(住友ベークライト社製、ML-1130O)を添加して一定時間発色させ、プレートリーダーにて492nmの吸光度を測定した。
抗体が結合するエピトープは、ペプチドスキャン法にて決定した。ヒトRGMaタンパク質
(配列表の配列番号1)のArg172~Ala424に含まれる、3残基ずつずらした連続する11残基から成るアミノ酸配列のN末端側に、N末端をビオチン化したスペーサ―配列(SGSG) (配列表の配列番号46)を融合した計83種類のペプチドを合成した。ペプチドをアビジンプレートに固定した後、被験抗体(B5.116A3、B5.70E4)を反応させた。次いで、ペルオキシ
ダーゼ標識ウサギ抗マウスIg抗体(Dako社、P026002)を反応させ、基質溶液を添加して一
定時間発色させた後、プレートリーダーにて吸光度を測定した。
その結果、B5.116A3は、Glu298~Gly311(Glu298~Asp308、Val301~Gly311の2種類の
ペプチド)、Asn322~Glu335(Asn322~Thr332、Ile325~Glu335の2種類のペプチド)、およびLys367~Ala377のヒトRGMa由来のペプチドに結合し、B5.70E4はGlu298~Gly311(Glu298~Asp308、Val301~Gly311の2種類のペプチド)、Asn322~Glu335(Asn322~Thr332、Ile325~Glu335の2種類のペプチド)、およびPro349~Thr359のヒトRGMa由来のペプチドに結合した。
マウスモノクローナル抗体(B5.116A3、B5.70E4)を産生するハイブリドーマ細胞から、total RNAを抽出した。Total RNAを鋳型にして、逆転写反応によりcDNAを合成した。cDNA
を鋳型に、軽鎖可変領域および定常領域、並びに重鎖可変領域および定常領域の遺伝子をPCR増幅し、DNA配列を決定した。次いで、決定した可変領域遺配列および定常領域配列に基づき、抗体全長遺伝子をPCRにより増幅し、クローニングした。これらの抗体遺伝子が
コードするアミノ酸配列は、以下の通りであった。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQLNTLPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKRSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRDGAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQRPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
DVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYSITTSYYWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGTNNYNPSLKNRISITRDTSKNQFFLRLNSVTTEDTATYYCAGSFGYSQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK
ハイブリドーマ由来の2種類の抗RGMa抗体B5.116A3またはB5.70E4の組換えマウス抗体を調製した(それぞれ以後、「r116A3」、「r70E4」と記載する。)。
また、比較例として、特許文献1(WO2009/106356)に基づき、ラット抗体5F9の可変領域とマウス抗体(IgG2bκ)の定常領域(軽鎖定常領域は配列表の配列番号4のArg108~Cys214、
重鎖定常領域は配列表の配列番号5のAla117~Lys452)を融合し組換えラットマウスキメラ抗体(以後、「r5F9」と記載する。)を調製した。
それぞれの抗体の軽鎖および重鎖をコードするDNAを、pcDNA3.3(Life Technologies社
製)に挿入し、発現ベクターを作製した。発現ベクターを、HEK293F細胞(Life Technologies社製)にNeofection 293(アステック社製)を用いて導入した。細胞を37℃、8%炭酸ガス
条件下で6日間培養した後、培養上清を回収した。組換え抗体の精製は、培養上清を、Protein AまたはProtein Gを固定化したアフィニティーカラム(GE healthcare社製)にアプライし、カラムに結合した抗体を10mMグリシン塩酸(pH2.8)で溶出し、すみやかに中和した
後、PBSに置換した。
使用目的により、精製純度を高める必要がある場合は、Protein Aカラム精製後の抗体
を、Ceramic Hydroxyapatite Type1(CHT)カラム(BIORAD社製)にて精製した。CHTカラムに結合した抗体を10 mM KH2PO4(pH6.5)で洗浄後、20 mM KH2PO4(pH6.5),0.5 M NaClで溶出した。溶出画分を回収後、PBSに置換した。
全長ヒトRGMaタンパク質(配列表の配列番号1のMet1~Cys450)、ヒトRGMaタンパク質C
末側ドメイン(配列表の配列番号1のPro169~Cys450)、全長マウスRGMaタンパク質(配列表の配列番号2のMet1~Trp454)、またはラットRGMaタンパク質C末側ドメイン(配列表の配
列番号3のPro170~Trp449)を発現するベクターを、CHO細胞またはHEK293細胞に導入し、
抗原発現細胞を作製した。
尚、RGMaタンパク質は、GPIアンカー付加反応の際にC末端ペプチドがプロセッシングを受ける。マウスRGMaタンパク質およびラットRGMaタンパク質は、いずれもAla427で切断され、C末端側のペプチドは除去される。従って、GPIアンカーを介して細胞上に発現する全長タンパク質およびC末側ドメインのアミノ酸配列は、マウスとラットでは同一である。
終濃度10μg/mLの被験抗体(r116A3およびr70E4)及びr5F9(比較例)を、上記の抗原
発現細胞と反応させた後、0.1%ウシ血清アルブミン、0.05%NaN3を含むPBSにて細胞を洗浄した。FITC標識抗マウスイムノグロブリン抗体(DAKO社製)を反応させ、細胞を洗浄した。フローサイトメトリー(ベクトン・ディッキンソン社製、ファックスキャリバー)にて蛍光を測定し、被験抗体の抗原発現細胞への結合性を評価した(表1)。
その結果、r116A3およびr70E4は、r5F9と異なり、ヒトおよびラットRGMaタンパク質の
C末側ドメインにも結合することが分かった。RGMaタンパク質はC末側ドメインのみでも神経突起成長阻害作用が認められており、r116A3およびr70E4は、全長RGMaタンパク質お
よびC末側ドメインの両者を阻害する。
被験抗体(r116A3, r70E4)及びr5F9(比較例)のRGMaタンパク質に対する親和性は、Proteon XPR36(バイオラッド社製)を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)法により測定した。
10mM 酢酸バッファー(pH4.5)で10μg/mLに希釈したヒトRGMaタンパク質(R&D Systems社製、2459-RM)、ヒトRGMaタンパク質C末端側ドメイン(実施例1にて調製)、またはマウスRGMaタンパク質(R&D Systems社製、2458-RG)を、アミンカップリング法によりGLCセンサー
チップに固定した。アナライトとして段階希釈した被験抗体を流速100 μL/minで60 秒間アプライし、解離定数(Kd値)を測定した。
表2に示すように、r116A3およびr70E4は、r5F9と異なり、ヒトRGMaタンパク質のC末側ドメインにも結合した。r116A3はr5F9よりも、ヒトRGMaタンパク質に対して32倍、マウスRGMaタンパク質に対しては44倍強く結合した。
組換えヒトNeogeninタンパク質(配列表の配列番号10)の細胞外ドメイン(Ala34~Leu1105)を精製した。ヒトNeogeninタンパク質細胞外ドメインを発現するCHO細胞株を樹立し
た。C末端にヒスチジンタグを融合した。CHO細胞の培養上清から、ニッケルカラム(GE Healthcare 社製、17-5247-01) に吸着させた後、100mMイミダゾール溶液で溶出した。透析により、イミダゾール溶出画分からPBSに置換した。
ChromaLink Biotin Labeling Kit(Solulink社製)を用いて、ヒトRGMaタンパク質(R&D systems社製、2459-RM)をビオチン標識した。2μg/mLに調製したビオチン標識ヒトRGMaタ
ンパク質を、2倍段階希釈した被験抗体(r116A3、r70E4)と等量混和し、室温で2時間反
応させ、混合溶液を調製した。
同時に、PBSで2μg/mLに調製したヒトNeogeninタンパク質細胞外ドメインを96穴プレートに50μL/wellずつ加えて室温で1時間静置し、Neogenin固相プレートを作製した。液を
除去後、2.5%ウシ血清アルブミン溶液を添加し、1時間静置することで非特異結合をブロックした。このNeogenin固相プレートに、上記の混合溶液を50μL/wellで添加し、室温で1時間静置した。その後洗浄操作を行い、ペルオキシダーゼ標識Avidin(VECTASTAIN ABC
システム、ベクターラボラトリーズ社製)を添加し、室温で1時間静置した。その後洗浄操作を行い、基質溶液を添加して一定時間発色させ、プレートリーダーにて吸光度を測定した。抗体が存在しない場合の吸光度比を1としてプロットし、抗体による濃度依存的なRGMa-Neogeninの結合阻害を評価した(図1)。
その結果、抗ヒトRGMaポリクローナル抗体(R&D Systems社製、AF2459)およびr5F9と
は異なり、r116A3およびr70E4は、RGMa-Neogeninの結合を阻害しなかった。
PBSで2μg/mLに調製したヒトRGMaタンパク質(R&D systems社製、2459-RM)を96穴プレートに50μL/wellずつ加えて室温で1時間静置した。2.5%ウシ血清アルブミン溶液を添加し
、1時間静置することで非特異結合をブロックし、RGMaタンパク質固相化プレートを調製
した。このRGMaタンパク質固相プレートに0.01~10μg/mLに段階希釈した被験抗体(B5.116A3、B5.70E4)を加えて室温で1時間静置した。その後洗浄操作を行い、0.5μg/mLに希
釈したヒトBMP2タンパク質(R&D systems社製、355-BM)を加え室温で1時間静置した。
ビオチン標識抗BMP2抗体を反応させ、更にペルオキシダーゼ標識Avidin(VECTASTAIN ABCシステム、ベクターラボラトリーズ社製)、基質溶液を添加して一定時間発色させ、プレートリーダーにて吸光度を測定した(図2)。
その結果、特に、抗RGMa抗体(B5.116A3)は、濃度依存的にRGMa-BMP2の結合を弱く阻害した(0.01μg/mL で吸光度0.45、0.1μg/mL で吸光度0.4、1μg/mL で吸光度0.32、10μg/mLで吸光度0.1)。
マウスモノクローナル抗体B5.116A3のヒト化は、特許第2912618号公報に記載のWinter
らの方法に従い、相補性決定領域(CDR)移植法にて行った。
まず、マウスモノクローナル抗体B5.116A3の軽鎖および重鎖可変領域の3D homology modelを作成し、フレームワーク(FW)領域で、CDR近傍に位置するアミノ酸残基を特定した。これらアミノ酸が可能な限り維持されるヒト抗体FWを選択し、マウス抗体のCDRを移植し
、ヒト化抗体配列を設計した。設計したヒト化抗体配列は、重鎖はHA(配列表の配列番号11)、軽鎖はKA(配列表の配列番号19)と記載する。更に、可変領域の構造安定性に関与するFW内のアミノ酸に追加の変異導入を行い、複数のヒト化抗体配列を設計した(重鎖はHAを
含めHB~HHまで計8種、軽鎖はKAを含めKB~KGの計7種)。
(1)実施例6に準じて、以下のアミノ酸配列を有する組換えマウスヒトキメラ抗RGMa抗体116A3(r116A3C)を調製した。
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQLNTLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKRS
VYLQMNNLRAEDTGIYYCTRRDGAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HA/KA、HA/KB、HA/KC、HA/KG、HB/KC、HC/KA、HC/KB、HD/KA、HD/KB、HD/KC、HD/KD、HE/KA、HF/KA、HF/KF、HF/KG、HG/KD、HG/KH、HH/KA、HH/KD、HH/KF
例)。
特許文献1(WO2009/106356)に記載されたヒト化抗RGMaモノクローナル抗体h5F9の可変
領域(軽鎖は特許文献1のseq ID_53、重鎖は特許文献1のseq ID_50)を、ヒト抗体定常領
域(軽鎖は配列表の配列番号26のArg108~Cys214、重鎖は配列表の配列番号27のAla117~Lys446)と連結した。
実施例12に記載の組換え抗体を発現する培養上清を20μLずつ分取し,サーマルサイク
ラー(Takara bio社製、TP600)を用いて、40、45、50、55、60、65、70、75℃の8点の温度でそれぞれ10分間熱処理した。
抗体終濃度が125ng/mLになるよう培養上清をPBSで希釈した。その後、実施例3に記載したヒトRGMaタンパク質を固相化したELISAに供し、抗体の抗原結合性を評価した(図3)
。その結果、重鎖HE、軽鎖KAの組み合わせから成るヒト化抗体(以下、「rH116A3」と称
する。)、およびマウスヒトキメラ抗体(r116A3C)は、ヒト化抗体(rH5F9)より優れた熱安定性を示した。以後、このHE/KAの組み合わせから成るヒト化抗体をrH116A3と記載する。
尚、熱処理をしなかった場合、マウスヒトキメラ抗体(r116A3C)とヒト化抗体(rH116A3)は同等の抗原結合性を示し、ヒト化に伴う抗原結合性の低下は無かった。
ヒト化抗RGMa抗体(rH116A3)を生産するCHO安定発現株は、Lonza GS Xceedシステム(Lonza社)にて樹立した。ヒト化抗RGMa抗体(rH116A3)の軽鎖コード配列(配列表の配列番号44)および重鎖コード配列(配列表の配列番号43)を含むpXCダブルジーンベクターを
、CHOK1SV GS knock out親細胞株に導入し、methionine sulphoximine (MSX)選択下にて
形質転換細胞プールを取得した。フローサイトメトリーにて単一細胞に分離した後、培養上清中への抗体産生量、細胞増殖性などを評価し、CHO安定発現株を取得した。
ラット新生仔(P7)より小脳を摘出し、トリプシン溶液(0.2%DNaseを含む0.25%トリプシ
ンPBS溶液)に懸濁し、37℃で10~15分間消化した。続いて10%ウシ胎児血清含有DMEM培地
を加えて遠心分離した。同培地にて再懸濁して遠心分離し、同様に操作を2回繰り返し細
胞を洗浄した。更に、この細胞懸濁液を70μmセルストレーナーで濾過後、遠心分離して
沈殿画分を同培地にて再懸濁した。細胞浮遊液にB27 supplement(GIBCO社製)を加えてラ
ット新生仔小脳顆粒細胞を調製した。
次に、細胞プレートにラット新生仔小脳顆粒細胞を播種し、37℃で1日間培養を行った
。終濃度2μg/mLの組換えRGMaタンパク質(R&D systems社製、2459-RM)を添加して37℃、2日間培養した。神経突起長を顕微鏡観察により測定したところ、図4に示すように、RG
Maの添加により、左図の実験では神経突起長が37μmから26μmとなり、右図では38μmから27μmとなり、神経突起成長が阻害された。被験抗体(B5.116A3、B5.70E4)のみを終濃度10μg/mLで添加しても、神経突起長に変化は見られなかったが、組換えRGMaタンパク質と同時に被験抗体を添加した場合には、対照(RGMa非添加)と同程度に神
経突起が成長し、抗体によるRGMaタンパク質の中和作用が認められた。
ハロタン(武田薬品工業社製)にて吸引麻酔したWistar系ラット(雌、8週齢、体重約200g)に、脊椎レベルT9を中心に前後1椎骨分(T8~T10)の椎弓切除術を施し、脊髄を露出さ
せた。脊髄圧挫モデルを用いて評価する場合には、IH impactor(Precision System社製)
を用いて、露出した脊髄に200 kdynの圧力をかけた。
前記のように脊髄を損傷させた直後に、400μg/mLの被験抗体(r116A3, r70E4)または対照マウス抗体(mo-IgG2bκ)を満たした浸透圧ミニポンプ(200μL液量、0.5μL/時間、14日間送達)(Alzet社製、model 2002)をラットの背中の皮下に置いた。浸透圧ミニポンプの出口に接続されたシリコン製チューブの先端は、脊髄損傷部位の硬膜下に置いた。該チューブは、椎弓切除術部位の直下肢側の棘突起に縫いつけて固定し、筋肉及び皮膚層を縫合して、飼育した。
脊髄損傷モデルラットの運動機能は、Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)スコア(Basso, D.
M., Beattie, M.S., & Bresnahan, J.C., A sensitive and reliable locomotor rating
scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995))を用い、損
傷後0、1、3、7日目、以降1週間毎に最長8週間に亘り、評価した。その結果、図5(A)に示すように、r116A3またはr70E4は、対照抗体(mo-IgG2bκ)と比較してそれぞれ投与後4
または3週間以後に有意にBBBスコアを改善した(p<0.05, Student's t-検定)。
脊髄半側切断モデル用いて評価する場合には、露出させた脊髄の背側部を1.8mm~2.0mmの深さに切断した。上記と同様に被検抗体(B5.116A3)または対照マウス抗体(mo-IgG2bκ)を浸透圧ミニポンプを用いて投与し、損傷後0、1、3、7日目、以降1週間毎に最長10
週間に亘り、BBBスコアを用いて評価した。図5(B)に示すように、B5.116A3は対照抗体(mo-IgG2bκ)と比較して投与後4週間以後に有意にBBBスコアを改善した(p<0.01, Student's t-検定)。
PLP139-151ペプチド(HSLGKWLGHPDKF:配列表の配列番号45、ペプチド研究所製) を生理食塩液(大塚製薬工場製)で溶解し、結核死菌H37 Ra (Difco Laboratories社製) を加えた不完全フロイントアジュバント (シグマ社製) と混合し、エマルジョンを作製した。PLP139-151ペプチドとして50 μg/headでSJL/JorllcoCrj (SJL/J) マウス (日本チャールス・リバー) の背部皮下に免疫し、EAEスコア(H. Kataoka, K Sugahara, K. Shimano, K. Teshima, M. Koyama, A. Fukunari and K. Chiba. FTY720, sphingosine 1-phosphate receptor modulator, ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis by inhibition of T cell infiltration. Cellular & Molecular Immunology 6, 439-448, 2005.) および体重変化を評価した(図6)。
生理食塩液に希釈した被験抗体 (B5.116A3)を、PLP139-151ペプチドで免疫した7日及び10日後 または18日及び21日後にそれぞれ20 mg/kgで腹腔内に投与した。
その結果、図6に示すように、抗RGMaマウスモノクローナル抗体 (B5.116A3) は、対照
抗体(mo-IgG2bκ)と比較して、発症前の投与でEAEスコアの悪化を抑制し(図6上段)、発症後の投与で再発予防効果を示した(図6下段)。
51名の健常人ドナー由来の末梢血中に含まれる未分化樹状細胞を顆粒球単球コロニー刺激因子(GM-CSF)およびInterleukin-4刺激により成熟させた。成熟樹状細胞に終濃度50μg/mLの被験抗体(rH116A3)を添加し、4、5日間培養することで、抗体を樹状細胞に取り込ま
せた。ここへ、同一ドナー由来の末梢血CD4+T細胞(ヘルパーT細胞)を混合し、更に1週間
共培養した後、T細胞の増殖をフローサイトメトリーにて測定した。被験抗体のT細胞増殖活性を指標として、ヒトにおける免疫原性リスクを評価した。その結果、51名のドナーのうち、4名(7.8%)についてT細胞の増殖が認められ、免疫原性リスクは低かった。
Claims (14)
- 軽鎖可変領域(VL)がVL:DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME(配列表の配列番号42)で
示されるアミノ酸配列を含み、
重鎖の相補性決定領域1(HCDR1)のアミノ酸配列がDAWMD(配列表の配列番号33)を含み、
重鎖の相補性決定領域2(HCDR2)のアミノ酸配列がEIRSKANNHATYYAESVKG(配列表の配列番号34)を含み、及び、
重鎖の相補性決定領域3(HCDR3)のアミノ酸配列がRDGAY(配列表の配列番号35)を含む、
単離された抗RGMa抗体、またはその抗原結合断片。 - 重鎖可変領域(VH)がVH:EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS(配列表の配列番号41)で示されるアミノ酸配列を含み、
軽鎖可変領域(VL)がVL:DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME(配列表の配列番号42)で
示されるアミノ酸配列を含む、
単離された抗RGMa抗体またはその抗原結合断片。 - 重鎖可変領域(VH)がVH:EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGKGTTVTVSS(配列表の配列番号41)で示されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片。
- 抗RGMa抗体がヒト化抗体である、請求項1から3のいずれか1項に記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片。
- 抗RGMa抗体がヒトIgGの定常領域を有する、請求項1から4のいずれか1項に記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1から5のいずれか1項に記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片のタンパク質部分をコードする核酸分子。
- 請求項6に記載の核酸分子を含む組み換えベクター。
- 請求項7に記載の組み換えベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1から5のいずれか1項に記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片の製造方法であって、請求項8に記載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
- 請求項1から5のいずれか1項に記載の抗RGMa抗体またはその抗原結合断片を含む、医薬組成物。
- 神経学的疾患または免疫学的疾患の予防、治療または再発予防用の請求項10に記載の医薬組成物。
- 神経学的疾患が、筋萎縮性側索硬化症、上腕神経叢損傷、外傷性脳損傷を含む脳損傷、脳性麻痺、ギランバレー、大脳白質萎縮症、再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症を含む多発性硬化症、ポリオ後症候群、二分脊椎、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症、脊椎腫瘍、横断性脊髄炎、老年性認知症、軽度認知機能障害、アルツハイマー病、アルツハイマー関連認知症を含む認知症、ハンチントン舞踏病、遅発性ジスキネジー、そう病、パーキンソン病、スティール-リチャード症候群、ダウン症、重症筋無力症、視神経外傷を含む神経外傷、血管アミロイド症、アミロイド症を伴う大脳出血、脳梗塞、脳炎、急性混乱障害、緑内障、及び統合失調症からなる群から選択される、請求項11に記載の医薬組成物。
- 免疫学的疾患が、再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症を含む多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む関節炎、ギランバレー症候群、神経ベーチエツト病、悪性貧血、I型(インスリン依存型)糖尿病、全身エリテマトーデス(SLE) 、炎症性腸疾患(IBD) 、シェーグレン症候群、
グッドバスチャー症候群、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎、糸球体腎炎、重症筋無力症、橋本病、及びサルコイドーシスからなる群から選択される、請求項11に記載の医薬組成物。 - 神経学的疾患または免疫学的疾患が、脊髄損傷、視神経外傷を含む神経外傷、及び再発寛解型多発性硬化症、一次性進行型多発性硬化症、二次性進行型多発性硬化症を含む多発性硬化症からなる群から選択される、請求項11に記載の医薬組成物。
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