JP2010537655A - 反発性ガイダンス分子(rgm)タンパク質ファミリーのタンパク質の骨形成タンパク質(bmp)結合ドメイン及びその機能的断片及びそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書中で別段の定義がない限り、本発明に関して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。これらの用語の意味及び範囲は明確であるが、しかし、何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書中で提供される定義が、あらゆる辞書又は付帯的な定義よりも優先される。さらに、内容により必要とされない限り、単数形である語は、複数性を含み、複数形の語は単数性を含む。本願において、「又は」の使用は、別段の断りがない限り、「及び/又は」を意味する。さらに、「含む(including)」という用語ならびに「含む(includes)」及び「含まれる(included)」などのその他の形態の使用は限定ではない。また、別段の断りがない限り、「要素」又は「成分」などの用語は、1単位を含む要素及び成分及び複数のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。
本発明の第一の目的は、グリコシル化又は特に非グリコシル化型における、好ましくは哺乳動物RGM由来の(例えば、ヒト、ラット又はマウス又は家禽例えばニワトリ)、骨形成タンパク質(BMP)結合ドメイン又は反発性ガイダンス分子(RGM)の結合ペプチド断片に関する。別段の指示がない限り、「結合ドメイン」という用語は、RGM由来の少なくとも1つのBMPに結合する何らかのポリペプチドを包含する。
X1C(K/R)IX2(K/R)CX3(S/T/A)(E/D)(F/Y)X4SX5T(配列番号7)
(式中、X1からX5は何らかのアミノ酸基を表す。);又は
X6CX7ALRX8YAX9CTX10RTX11(配列番号8)
(式中、X6からX11は何らかのアミノ酸基を表す。);
又は式:
(配列番号7)−Link1−(配列番号8)
の部分配列(式中、Link1は、10から45、例えば13から28の何らかの連続アミノ酸基を含有する配列番号7−及び8−架橋アミノ酸配列を表す。)。
X1はPro又はGlnを表し、
X2はLeu又はGlnを表し、
X3はAsn又はThrを表し、
X4はVal又はTrpを表し、
X5はSer、Ala又はLeuを表し、
X6はPhe又はLeuを表し、
X7はAla、Lys又はArgを表し、
X8はSer又はAlaを表し、
X9はLeu又はGlyを表し、
X10はArg又はGlnを表し、及び/又は
X11はAla又はSerを表す。
47前後から168前後もしくは41前後から168前後のアミノ酸位置
47前後から90前後もしくは41前後から90前後のアミノ酸位置又は
75前後から121前後のアミノ酸位置;
又は、配列番号4の次のアミノ酸配列の1つ:
94前後から209前後のアミノ酸位置
94前後から137前後のアミノ酸位置又は
122前後から168前後のアミノ酸位置;
配列番号6の次のアミノ酸配列の1つ:
36前後から172前後のアミノ酸位置
36前後から94前後のアミノ酸位置又は
80前後から125前後のアミノ酸位置;
又は、その機能的BMP結合断片、例えば上記配列の1つの断片(これに対して、BMP結合能(本明細書中に記載の結合試験で検出可能。)を喪失することなく、C及び/又はN末端において、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15又は20アミノ酸基が短縮され得る。)。
60−120、61−120、62−120、64−120、65−120、66−120、67−120、68−120、69−120、70−120;
60−119、61−119、62−119、64−119、65−119、66−119、67−119、68−119、69−119、70−119;
60−118、61−118、62−118、64−118、65−118、66−118、67−118、68−118、69−118、70−118;
60−117、61−117、62−117、64−117、65−117、66−117、67−117、68−117、69−117、70−117;
60−116、61−116、62−116、64−116、65−116、66−116、67−116、68−116、69−116、70−116;
60−115、61−115、62−115、64−115、65−115、66−115、67−115、68−115、69−115、70−115;
60−114、61−114、62−114、64−114、65−114、66−114、67−114、68−114、69−114、70−114;
60−90、61−90、62−90、64−90、65−90、66−90、67−90、68−90、69−90、70−90;
60−89、61−89、62−89、64−89、65−89、66−89、67−89、68−89、69−89、70−89;
60−88、61−88、62−88、64−88、65−88、66−88、67−88、68−88、69−88、70−88;
60−87、61−87、62−87、64−87、65−87、66−87、67−87、68−87、69−87、70−87;
60−86、61−86、62−86、64−86、65−86、66−86、67−86、68−86、69−86、70−119;
60−85、61−85、62−85、64−85、65−85、66−85、67−85、68−85、69−85、70−85;
60−84、61−84、62−84、64−84、65−84、66−84、67−84、68−84、69−84、70−84;
60−83、61−83、62−83、64−83、65−83、66−83、67−83、68−83、69−83、70−83;
60−82、61−82、62−82、64−82、65−82、66−82、67−82、68−82、69−82、70−82;
60−81、61−81、62−81、64−81、65−81、66−81、67−81、68−81、69−81、70−81;
60−80、61−80、62−80、64−80、65−80、66−80、67−80、68−80、69−80、70−80;
60−79、61−79、62−79、64−79、65−79、66−79、67−79、68−79、69−79、70−79;
60−78、61−78、62−78、64−78、65−78、66−78、67−78、68−78、69−78;
60−77、61−77、62−77、64−77、65−77、66−77、67−77、68−77;
60−76、61−76、62−76、64−76、65−76、66−76、67−76;
60−75、61−75、62−75、64−75、65−75、66−75;
60−74、61−74、62−74、64−74、65−74;
60−73、61−73、62−73、64−73;
60−72、61−72、62−72;
60−71、61−71;
60−70;
60−69。
LX20LC(V/L)X21GCP(配列番号26)(式中、X20及びX21は何らかのアミノ酸基を表す。);又は
TAX22X23X24C(K/H)EX25(L/M)PV(E/K)DX26Y(F/Y)(Q/H)(A/S)CVFD(V/L)LX27(T/S)G(配列番号27)(式中、X22からX27は何らかのアミノ酸基を表す。);
又は式
(配列番号26)−Link2−(配列番号27)
の部分配列(式中、Link2は、10から45、例えば19前後から38の何らかの連続アミノ酸基を含有する、配列番号26及び27架橋アミノ酸配列を表す。)。
X20は、Tyr又はGlnを表し
X21は、Arg、Asn又はGlyを表し
X22は、Arg、Asn又はValを表し、
X23は、Ala、Thr又はArgを表し
X24は、Lys、Gln又はLeuを表し
X25は、Lys又はGlyを表し
X26は、Leu、Ile又はAlaを表し、及び/又は
X27は、Thr又はIleを表す。
a)頭蓋骨、脳及び脊髄への機械的損傷、
b)神経変性、炎症又は自己免疫疾患から選択される慢性疾患、
c)神経再生、軸索発芽、神経突起伸展及び神経可塑性の疾患、
d)腫瘍性疾患及び腫瘍転移
から選択される。
a)過剰な神経突起発芽及び/又は病的シナプス形成により引き起こされる精神状態及び慢性疼痛状態における神経突起生成プロセスの変化;
b)鉄代謝障害に関連する疾病;
c)骨の成長障害に関連する疾病;
d)軟骨の退行性変化に関連する疾病;
e)椎間板及び椎体への損傷に関連する疾病;
f)無秩序な無制御の細胞移動プロセスに関連する疾病
から選択される場合の、RGM又はRGM断片と関連受容体(例えば、ネオゲニン又はBMP)との相互作用の異常又は障害が介在する疾患又は病期の診断又は治療のための薬剤を調製するための、上記定義に従うBMP受容体結合ドメイン又は上記定義に従う融合タンパク質の使用に関する。
又は脱毛性疾患、特に円形脱毛症、全頭脱毛症、全身性脱毛症、男性型脱毛症、休止期脱毛症、成長期脱毛症及び化学療法誘発脱毛症から選択されるものの、診断又は治療用の薬剤の調製のための、上記定義に従うBMP結合ドメイン又はその結合断片又は上記定義に従う融合タンパク質の使用に関する。
a)上記定義に従うBMP結合ドメイン、上記定義に従うポリペプチド断片又は上記定義に従う融合タンパク質、
b)上記定義に従うモノクローナル又はポリクローナル抗体
から選択される少なくとも1つの活性成分の医薬的に許容可能な担体を含有する医薬品に関する。
1.ポリペプチド
本発明の主題は、特に、RGMファミリーのタンパク質のBMP結合ドメイン、及びこれらのドメイン由来のペプチド断片に関する。RGM A及びその結合ドメイン及びそれ由来の断片が本発明により特に詳細に調べられたが、本発明の主題はまた、相同的なタンパク質、例えば、特にRGM B及びRGM CなどのRGMファミリーの相同的なメンバーの対応するドメイン及び断片にも関する。
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln;His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn;Gln
Ile Leu;Val
Leu Ile;Val
Lys Arg;Gln;Glu
Met Leu;Ile
Phe Met;Leu;Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp;Phe
Val Ile;Leu
複数のアラインメントパラメータ
ギャップオープニングペナルティ 10
ギャップエクステンションペナルティ 10
ギャップセパレーションペナルティ範囲 8
ギャップセパレーションペナルティ 切
アラインメントディレイに対する%同一性 40
残基特異的ギャップ 切
親水性残基ギャップ 切
遷移計量 0
ペアワイズ配列パラメータ:
FASTアルゴリズム 入
K−チュプルサイズ 1
ギャップペナルティ 3
ウィンドウサイズ 5
最良のダイアゴナルの数 5。
本発明のさらなる主題は、さらに、上述のBMP結合ドメイン及びポリペプチドに対するコード核酸配列、特に、上述のペプチド断片をコードする、配列番号1、3及び5ならびにそれら由来の核酸配列又は部分配列に関する。
本発明はのさらなる主題は、調節核酸配列の遺伝子制御下での、本発明によるRGMペプチド又は機能的同等物又は免疫グロブリンをコードする核酸配列を含有する発現コンストラクト;ならびにこれらの発現コンストラクトの少なくとも1つを含むベクターに関する。
グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE−結合タンパク質又はプロテインAが組み換え標的タンパク質に融合させられる、pGEX(Pharmacia Biotech Inc;Smith、D.B.及びJohnson、K.S.(1988)Gene 67:31−40)、pMAL(New Engl及びBiolabs、Beverly、MA)及びpRIT5(Pharmacia、Piscataway、NJ)などの従来の融合発現ベクター、
pTrc(Amannら(1988)Gene 69:301−315)及びpET 11d(Studierら、Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、California(1990)60−89)などの非融合タンパク質発現ベクター、
pYepSec1(Baldariら(1987)Embo J.6:229−234)、pMFa(Kurjan及びHerskowitz(1982)Cell 30:933−943)、pJRY88(Schultzら(1987)Gene 54:113−123)及びpYES2(Invitrogen Corporation、San Diego、CA)などのS.cerevisiae(S.セレビシエ)酵母における発現のための酵母発現ベクターである。糸状菌などのその他の真菌において用いるのに適切なベクター及びベクター構築法は、van den Hondel、C.A.M.J.J.及びPunt、PJ.(1991)「Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi」、Applied Molecular Genetics of Fungi、J.F.Peberdyら編、p.1−28、Cambridge University Press:Cambridgeに詳細に開示されるものを含む。
本発明によるベクターの使用により、例えば、本発明による少なくとも1つのベクターを用いて形質転換された組み換え生物を生成させ得、本発明によるドメイン又はポリペプチドを生成させるために使用し得る。本発明による上述の組み換えコンストラクトは、適切な宿主系に有利に導入され発現される。特定の発現系において前記の核酸の発現を誘発するために、当業者にとって公知の一般的なクローニング及び遺伝子移入法、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルス遺伝子移入などが、好ましくは用いられる。適切な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology、F.Ausubelら編、Wiley Interscience、New York 1997又はSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載されている。
5.1定義
本発明の主題は、本発明によるRGMタンパク質又はその誘導体/同等物と特異的に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体、即ち、本発明によるRGMタンパク質又はその誘導体/同等物に対して特異性を有する抗体に関する。本発明の主題は、さらに、これらの抗体の一部、特にその抗原結合部位、即ち、本発明によるRGMタンパク質又はその誘導体/同等物と結合する抗体断片に関する。
5.2.1 ポリクローナル抗体の作製
本発明は、本発明によるRGMドメイン及びポリペプチドに対するポリクローナル抗体、及びその作製に関する。
本発明により使用され得る免疫グロブリンは、それ自体公知の方法を用いて得ることができる。従って、ハイブリドーマ技術によって、関心のある抗原に対して単一特異性抗体を作製することが可能になる。さらに、抗体ライブラリのインビトロスクリーニングなどの組み換え抗体技術が開発され、これにより、このような特異抗体が同様に産生される。
インビボで作製される抗体産生細胞から開始し、元々Kohler及びMilsteinにより記載されたハイブリドーマ技術などの標準化技術を用いて、モノクローナル抗体が作製され得る(1975、Nature 256:495−497)(Brownら(1981)J.Immunol 127:539−46;Brownら(1980)J Biol Chem 255:4980−83;Yehら(1976)PNAS 76:2927−31;及びYehら(1982)Int.J.Cancer 29:269−75を参照のこと。)。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は周知である(一般的に、R.H.Kenneth、Monoclonal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses、Plenum Publishing Corp.、New York、New York(1980);E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.、54:387−402;M.L.Gefterら(1977)Somatic Cell Genet.、3:231−36を参照のこと)。この目的のために、不死化細胞株(通常は骨髄腫)を、本発明によるRGMタンパク質又はその誘導体/同等物で免疫付与した哺乳動物のリンパ球(通常、脾臓細胞、リンパ節細胞又は末梢血リンパ球)と融合させ、本発明によるRGMタンパク質又はその誘導体/同等物に対して特異性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングする。この目的のために、リンパ球及び不死化細胞株を融合するために、多くの公知のプロトコールの何れかのプロトコールを用い得る(G.Galfreら(1977)Nature 266:550−52;前出のGefterら、Somatic Cell Genet;前出のLerner、Yale J.Biol.Med.;前出のKenneth、Monoclonal Antibodiesを参照のこと。)。さらに、当業者は、同様に用いられ得るこのような方法の多くの変法を知っている。不死化細胞株(例えば骨髄腫細胞株)は通常、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、本発明による免疫原性調製物で免疫付与したマウス由来のリンパ球を、不死化マウス細胞株と融合させることにより、マウスハイブリドーマが確立され得る。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地(HAT培地)に対して感受性があるマウス骨髄腫細胞株である。多くのもののうち何れの骨髄腫細胞株も、標準的な方法で融合パートナーとして用いられ得る(例えば、P3−NS1/1−Ag4−1、P3−x63−Ag8.653又はSp2/O−Ag14骨髄腫株)。これらの骨髄腫細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC)、Rockville、MDから入手可能である。通常、HAT感受性マウス骨髄腫細胞は、ポチエチレングリコール(PEG)を用いてマウス脾臓細胞と融合される。次いで、HAT培地を用いて、融合により得られたハイブリドーマ細胞を選択し、これにより、非融合又は非産生融合骨髄腫細胞を死滅させる(非融合脾臓細胞は、形質転換されていないので、数日後に死滅する)。本発明によるRGMタンパク質又は誘導体/同等物を特異的に認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞は、例えば、本発明によるRGMタンパク質又はその誘導体/同等物と特異的に結合することができる抗体を選択するために標準的ELISAアッセイを用いることによってこのような抗体においてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより、同定される。
免疫付与及び選択による本発明による抗体の産生についての代替法として、本発明によるRGMタンパク質又はその誘導体/同等物に対して特異的に結合する免疫グロブリンライブラリのメンバーを単離するために、本発明によるRGMタンパク質又はその誘導体/同等物を用いて組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリをスクリーニングすることによって、本発明による抗体が同定され単離され得る。ディスプレイライブラリを作製しスクリーニングするためのキットは市販されている(例えば、PharmaciaからのRecombinant Phage Antibody System、カタログ番号27−9400−01;及びStratageneからののSurfZAP(R)ファージディスプレイキット、カタログ番号240612)。多くの実施態様において、ディスプレイライブラリはScFvライブラリ又はFabライブラリである。組み換え抗体ライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイは既に記載されている。抗体ディスプレイライブラリを作製し、スクリーニングするための特に有利な方法において使用され得る方法及び化合物の例は、McCaffertyら、WO92/01047、米国特許第5,969,108号及び欧州特許第589877号(特にsdFvのディスプレイを記載)、Ladnerら米国特許第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,571,698号、同第5,837,500号及び欧州特許第436597号(例えばPIII融合を記載。);Dowerら、WO91/17271、米国特許第5,427,908号、同第5,580,717号及び欧州特許第527839号(特にFabのディスプレイを記載。);Winterら、WO92/20791及び欧州特許第368,684号(特に免疫グロブリン可変ドメインに対する配列のクローニングを記載);Griffithsら、米国特許第5,885,793号及び欧州特許第589877号(特に組み換えライブラリを用いたヒト抗原に対するヒト抗体の単離を記載);Garrardら、WO92/09690(特にファージ発現技術を記載);Knappikら、WO97/08320(HuCalヒト組み換え型抗体ライブラリを記載);Salfeldら、WO97/29131(ヒト抗原(ヒト腫瘍壊死因子α)に対する組み換えヒト抗体の産生及び組み換え抗体のインビトロ親和性成熟を記載)及びSalfeldら、米国特許仮出願第60/126,603号及びそれに基づく特許出願(同様に、ヒト抗原(ヒトインターロイキン−12)に対する組み換えヒト抗体の産生及び組み換え抗体のインビトロ親和性成熟をを記載)で見出すことができる。
本発明による抗体はまた、インビボ及びインビトロにおけるアプローチの組み合わせ、例えば最初に本発明によるRGMタンパク質又はその誘導体/同等物が、RGMタンパク質−又はその誘導体/同等物−結合抗体の産生を促進するために宿主動物においてインビボで抗体レパートリーに対して機能することを可能にし、次いで、さらなる抗体の選択及び/又は抗体成熟(即ち最適化)が、1以上のインビトロ技術を用いて行われる方法を使用することによっても作製され得る。ある実施態様によると、このような組み合わせ法は、最初に、抗原に対する抗体反応を刺激するために非ヒト動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ又はそれらのトランスジェニック動物又はキメラマウス)を、本発明によるRGMタンパク質又はその誘導体/同等物で免役付与し、次いで、RGMタンパク質又はその誘導体/同等物の作用によりインビボで刺激されているリンパ球由来の免疫グログリン配列を用いてファージディスプレイ抗体ライブラリを作製及びスクリーニングすることを含み得る。この組み合わせ手順の最初の段階は、インビボアプローチに対して上記で述べたように行われ得るが、この手順の第二の段階は、インビトロアプローチに対して上記で述べたように行われ得る。刺激されたリンパ球から作製されたファージディスプレイライブラリのインビトロスクリーニングに続く、非ヒト動物の過剰免疫付与のための好ましい方法には、BioSite Inc.により記載される方法が含まれ、例えば、WO98/47343、WO91/17271、米国特許第5,427,908号及び同第5,580,717号を参照のこと。
6.1 概略
本発明の主題はまた、本発明によるタンパク質(RGMタンパク質;RGMタンパク質結合リガンド、抗RGMタンパク質抗体など)又はコードRGMタンパク質核酸配列及び場合によっては医薬的に許容可能な担体を活性物質として含有する医薬品(組成物)にも関する。本発明による医薬組成物はまた、少なくとも1つのさらなる治療剤、例えば本明細書中に記載の疾病の1つを治療するための1以上のさらなる治療剤も含有し得る。
本発明によるRGMタンパク質及びその誘導体/同等物は、治療されるべき患者のワクチン接種のための免疫原として使用され得る。
7.1.神経性疾患の治療
中枢神経系に対する損傷において、損傷部位でRGMタンパク質の蓄積が観察されることが先行技術(Schwabら(前出)を参照)から知られている。同時に、これにより、神経線維の新たな増殖が妨害される。ポリクローナルRGM A特異的抗体の使用によるラットでの脊髄損傷モデルにおけるRGM Aの中和の結果、再生及び機能回復が起こった(Hata K.ら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006)。神経線維の増殖における損傷及び抑制効果には、受容体分子ネオゲニンへのRGM Aの結合が介在する(Conrad S.ら、J.Biol.Chem.282:16423−16433、2007)。従って、RGMと受容体分子ネオゲニンとの間の相互作用の調節、特に阻害は、神経線維の増殖におけるRGMの阻害活性を阻止するのに適している。
長い間、ネオゲニンが、腫瘍性疾患の発現及び/又は進行に原因として関係していることが示されてきた。例えば、Meyerhardtらは、Oncogene(1997)14、1129−1136において、研究した、膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫細胞株を含む50種を超える様々な癌細胞株ならびに結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌及び子宮癌の細胞株においてネオゲニンが検出可能であることを報告した。ネオゲニンの過剰発現はまた、食道癌細胞株においても観察されている(Hueら、Clinical Cancer Research(2001)7、2213−2221)。211人の肺腺癌患者における3588個の遺伝子の発現プロフィールの最近の系統的な分析から、腫瘍性疾患の発現及び進行におけるネオゲニンの関与に関するさらなる情報が得られた(Berrarら、J.Comput.Biol.(2005)12(5)、534−544)。
ヘモジュベリンとしても知られるRGM Cは、ヒト及び動物の体内における鉄代謝に非常に重要である。若年性ヘモクロマトーシスは、生物における鉄の過剰負荷として現れる遺伝性の比較的稀な鉄代謝性障害である。この疾患は、ヘモジュベリン分子における突然変異によって起こる(Huangら、The Journal of Clinical Investigation(2005)115、2087−2091)。従って、本発明による機能RGMタンパク質又はその活性ドメインの投与は、このような鉄代謝障害を緩和するための有用な治療的アプローチである。慢性疾患における貧血の場合、炎症又は悪性経過の結果、例えば腫瘍壊死因子αなどのある一定のサイトカインの非常に大きな上方制御が起こる(Weiss M.D.及びGoodnough、L.T.、New Engl.J.Med.352:1011−1022、2005)。これらのサイトカインは、鉄代謝の最も重要な制御因子の強力な誘導因子、ペプチドホルモンヘプシジンであり、ヘプシジンの過剰産生又は蓄積は、慢性疾患における貧血の発症機序に対する重要な理由とみなされる。マウスに対する最近のインビボデータから、Fc−結合RGM C(Fcヘモジュベリン)がヘプシジン発現を阻害し、血清鉄レベルを上昇させることが示される(Babitt、J.L.ら、The Journal of Clinical Investigation、2007、Vol.117、7、1933−1939)。BMPタンパク質とのRGMタンパク質の相互作用は、この制御における重要な因子である(Babitt、J.L.ら、Nature Genetics、2006、Vol.48、5、531−539)。従って、BMPタンパク質と相互作用する、Fc結合RGM C又は、RGM C、RGM Aもしくは[RGM] BのFc結合断片は、慢性疾患における貧血の治療用の治療剤として使用され得る。
先行技術から、DRAGONという名称でも知られているタンパク質のRGMファミリーのメンバー、即ちRGM Bが、骨の形態形成に関与しているという情報が得られている。例えば、Samadらは、JBC論文、2005、Vol.280.14122−14129において、DRAGONと、タイプI及びタイプIIの骨形成タンパク質(BMP)受容体との間の相互作用を記載する。従って、本発明によるRGMポリペプチドを投与することにより、骨成長促進効果、及びこれによる骨成長疾患又は骨損傷の治療のための新規治療アプローチが考えられ得る。3種類全てのRGMタンパク質(RGM A、B、C)は、様々なBMPファミリーのメンバーと相互作用し、BMPシグナル経路の活性化を向上させる(Babitt、J.L.ら、Nature Genetics、2006、Vol.48、5、531−539;Babitt、J.L.ら、J.Biol.Chem.、2005、Vol.280、33、29820−29827;Babitt、J.L.ら、The Journal of Clinical Investigation、2007、Vol.117、7、1933−1939;Samad、T.A.ら、J.Biol.Chem.、2005、Vol.280.14、14122−14129;Halbrooksら、J.Molecular Signaling 2、4:2007(電子形態で公開))。
本発明による活性物質が自己免疫疾患の治療に適切であり得るという指摘は、次の刊行物で見出される:Uristら、Prog.Clin.Biol.Res.1985、Vol.187:77−96;Lories及びLuyten、Cytokine & Growth Factor Reviews 2005、Vol.16、287−298。
上記定義に従うRGMタンパク質及び誘導体/同等物ならびにこれらに対する抗体は、特に本発明による診断試薬と呼ばれる。
本発明の主題はさらに、RGM受容体(ネオゲニン及び/又はBMP)のエフェクターを検出するための方法に関し、この方法において、エフェクターである疑いがある試料をRGMタンパク質又はポリペプチドと温置し、エフェクター−RGMタンパク質複合体の形成に関してアッセイが分析される。
1.一般的手順
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
タンパク質の分子量に従い、SDSポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離した(4−20%トリスグリシンゲル:Invitrogen EC6025BOX;10−20%トリシンゲル:Invitrogen#EC6625BOX)。還元剤を用いてNuPage SDS試料緩衝液(4x)と試料を混合した。サーモミキサーにおいて95℃にて10分間温置した後、トリスグリシン又はトリシンSDSランニング緩衝液(Invitrogen)を用いて、125Vで試料を展開させた。See Blue又はBlue Plus 2(Invitrogen)を分子量標準タンパク質として使用した。クーマシー染色でゲルを染色するか又はニトロセルロース(ニトロセルロース膜ろ紙サンドイッチ(Invitrogen#LC2001))に転写した。
ポリアクリルアミドゲルでのタンパク質の検出のために、ゲルに流した後、タンパク質をクーマシー染色により染色した。膜上で(0.2−μm孔)SimplyBlue Safestain染色溶液(Invitrogen)中で、又は、あるいは、コロイドクーマシー染色(0.25%クーマシーブルーR250/L、45%メタノール、10%酢酸)中で、1時間ゲルを染色した。タンパク質バンドが明確に見えるようになるまで、脱イオン水又は脱色液(40%メタノール、10%酢酸)を用いて脱色を行った。
ろ紙及びニトロセルロースを20%メタノール入りのNovexトランスファー緩衝液に10分間浸した。室温で2時間にわたり、定電流(100mA)でNovexチャンバー中でブロッティング処理を行った。
TTBS緩衝液中の様々な濃度の2μLタンパク質を乾燥ニトロセルロース膜上に軽く叩くように添加した。次の希釈液を使用した:
希釈液:
a)100μg/mL=200ng/スポット
b)50μg/mL=100ng/スポット
c)10μg/mL=20ng/スポット
d)5μg/mL=10ng/スポット
e)1μg/mL=2ng/スポット
f)500μg/mL=1ng/スポット
試料添加後、室温で10分間膜を乾燥させ、その後免疫検出プロトコールを開始した。
このために、HEK293F細胞の遺伝子移入に対してInvitrogenにより開発されたプロトコールを使用した。2−3日間にわたり、Free Style 293発現培地中で細胞を培養し、次いで400xgで遠心し、上清を捨てた。培地中で細胞ペレットを再懸濁し、28mLの新鮮培地中で3x107個の細胞になるように調整した。125mLエレンマイヤーフラスコに細胞ペレットを移し、150rpmのオービタル振盪機上で遺伝子移入混合液が生成するまで37℃、8%CO2の恒温槽中で温置した。
(1)1000μLの総体積になるまで30μg DNAをOpti−MEM Iで希釈し、混合した(1000μL Opti−MEM Iを対照として使用した。)。
Ni−NTA Superflowビーズ(Qiagen#1018611)を使用した。13,500rpmでビーズ上清を遠心することにより、リン酸緩衝食塩水(PBS)溶液(Invitrogen)中で3分間、ビーズを洗浄した。上清を捨て、新鮮PBS中でビーズを再懸濁した。細胞培養上清30mLに対してビーズ縣濁液200μLを使用した。ビーズをペレット化するために、振盪機(60rpm)上で、4℃で一晩、細胞培養上清とともにビーズを温置し、温置後遠心した(10分間、3000rpm)。上清を捨て、PBSで3回ビーズを洗浄した。250μL溶出緩衝液(PBS、160mM NaCl、150mM イミダゾール)を用いて、結合タンパク質をビーズから溶出した。振盪機上で室温にて30分間温置した後、遠心(3分間、13,500rpm)によってビーズをペレット化した。上清を回収した。さらなる分析のために、溶出タンパク質を−20℃で凍結した。
ニトロセルロース上での固定化タンパク質の免疫検出のために、室温又は4℃で、TTBS(0.1%Tween20、トリス緩衝食塩水溶液(TBS))中で一晩、ブロットを1時間温置することによって、タンパク質の非特異的結合を阻止(ブロッキング処理)した。室温にて2時間にわたり、TTBS中の10μg/mの濃度で一次抗体を使用した。TTBS中で3回、ブロットを洗浄し、TTBS中1:5000の二次抗体(アルカリホスファターゼ結合抗マウスIgG抗体;Sigma)で希釈し、次いで室温で1時間温置した。TTBS中で3回、ブロットを洗浄し、染色溶液でブロットを被覆することにより、3分間、AP基質NBT/BCIP(Roche、10mL精製水により1錠の錠剤を溶解)で発色させた。ブロットに精製水を添加することにより染色反応を停止させた。
SH−SY5Y細胞は、ヒト神経芽細胞腫細胞である。芽細胞腫は、組織及び器官形成中に由来する胚性腫瘍である。初期胚の状態では多くの細胞の分化がまだ未熟であるため、芽細胞腫細胞の起源は未知である場合が多く、即ち、芽細胞腫細胞は不均一な細胞集団である。神経芽と呼ばれる神経芽細胞腫の細胞は、自律神経組織からの神経堤(胚性状態の構造)由来であり、実際には未熟な段階で停止している。この場合の細胞は、神経芽細胞腫の転移がある4歳女児の骨髄バイオプシーで1970年に単離された神経上皮腫細胞株SK−N−SHのクローン性の継代培養由来であった[http://www.dsmz.de/human_and_animal_cell_lines]。
細胞培養モデルとして、ヒト多能性癌細胞株NTera2(DSMZ ACC527)を確立する。神経突起は、細胞集合体から成長し、特定の集団の周囲で神経突起の冠を形成する。
細胞を分化させるために、細胞を同じ培養フラスコ中で3週間にわたり維持することから、細胞株の培地に抗生物質を導入することが必要であった。前もって、未分化培養物をトリプシン処理して剥離(detrypsinated)し、Neubauer計数チャンバーを用いて細胞数を調べた。25mL培地とともに2.5百万個の細胞を新しい培養フラスコに移した。薄暗い条件下で25μLのレチノイン酸(10μM)を培地に再び添加した。冷蔵庫中で分注して(10M)培養物を保存し、使用前にサーモミキサー中で22℃にて再懸濁した。
ポリ−L−リジン/ラミニンで被覆することにより、培養皿のベースにおいてNTera−2細胞の成長が促進された。この試験に対して様々なプレート方式を使用した。タンパク質の単離のために、十分な量を回収するための6ウェルのプレートが必要であった。RNA単離及び免疫蛍光の場合は、24ウェルプレートが的確であり、一方、最初に96ウェルプレートでアッセイを確立した。表で示されるように、ウェルの収容能に対応して、コーティング及び洗浄液の様々な体積を使用した。
分化3週間後、神経細胞を選択するために、6本のフラスコへ培養物を1:6に分割(継代)した。この時点で、培地にはレチノイン酸を添加していなかった。次の2日間内に、及び第3日に、細胞を回収し、好ましくは、その他の非神経細胞上で神経細胞を沈降させるが、しかし、強力には接着しなかったので、トップ層としてそれらは容易に除去され得た。この目的のために、培地を除去し、およそ10mL PBSで洗浄し、10mL PBSをフラスコに再添加した。瓶の側面を軽く叩くと、細胞が徐々に払い落とされた。しかし、非神経細胞は接着し続けると想定されたので、光学顕微鏡下で目視チェックを場合によっては行った。それらの明るく光る縁及び非常に丸い形態によって神経細胞を同定した。神経細胞が過剰に強固に成長した場合、これらは、除去後、短い時間、神経突起を保持する。3本のフラスコのそれぞれの中のPBS−細胞溶液を50mL遠心管で合わせ、室温にて1000rpmで5分間、細胞を遠心した。次に、2本の試験管に上清を吸引除去して添加し、ニューロベーサル液10mL中でペレットを再懸濁し、即ち10mL中で混合した。
細胞集合体の形成のために、細胞数計数後、ニューロベーサル液中で剥離させた分化細胞(前出セクション参照)をおよそ百万個の細胞/mLの濃度になるようにニューロベーサル液で希釈した。この細胞縣濁液の20mLを100mLの使い捨て滅菌振盪フラスコに移し、37℃及び5%CO2ガスの恒温槽中で一定に撹拌させながら一晩温置した。液体の循環が起こらず、細胞が満足する集団を形成しないので、20mLの体積を超えないことは重要であった。
a)材料
・イムノプレート:Cert.Maxi Sorp F96(NUNC、439454)
・組み換えヒトRGM A、R&D Systems;Prod.#2495−RM(260μg/mL)
・組み換えヒトネオゲニンFc、Abbott;Ludwigshafen(ALU 1514/122;425μg/mL)
・ペルオキシダーゼ−結合、アフィニティ精製マウス抗−ヒトIgG Fc断片AK(Jackson Immuno Research、Code:209−035−098)(0.8mg/mL)
・現像剤基質:ImmunoPure TMB基質キット(Pierce、#34021)
・硫酸(Merck、#4.80354.1000)
b)方法:
1.イムノプレートへのRGM A結合:
・50mM Na2CO3中の2.5μg/mL RGM A(R&D)(50μL/ウェル)
・37℃で1時間温置
2.洗浄段階:
・PBS/0.02%Tween20で3回洗浄(100μL/ウェル)
3.非特異的結合部位のブロッキング処理:
・PBS/0.02%Tween中の3%BSAでのブロッキング処理(200μL/ウェル)
・37℃で1時間温置
4.ネオゲニン結合:
・1%BSA PBS/0.02%Tween中の希釈液(最初の濃度1μg/mL)中にネオゲニンの添加(最初の濃度1μg/mL)
・37℃で1時間温置
5.洗浄段階:
・PBS/0.02%Tween20で3回洗浄(100μL/ウェル)
6.結合ネオゲニンの抗体検出:
・HRPカップリングマウス抗−ヒトIgG Fc断片AK(PBS/1%BSA中で1:2500に希釈)の添加(50μL/ウェル)
・37℃で1時間温置
7.洗浄段階:
・PBS/0.02%Tween20で3回洗浄(100μL/ウェル)
8.現像
・50μL発色基質/ウェルの添加(ImmunoPure TMB基質、Pierce)
・室温で1〜30分間温置
・50μLの2.5M H2SO4/ウェルを用いて反応停止
下記のように相互作用試験を行った:
変法A:BMP−2/又は−4タンパク質の固定化及び様々なRGM A−Fc融合タンパク質の結合の検出
1.プレート:
・Immunoplate Cert.MaxiSorp F96(Nunc、439454)
2.被覆:
組み換えヒトBMP−2、カタログ番号355−BM 会社:R&D Systems;組み換えヒトRGM A、R&D Systems;製品番号2495−RM又は組み換えヒトBMP−4、カタログ番号314−BM、会社:R&D Systems;
・濃度:10μg/mL
・使用量:Na2CO3中2.5μg/mL;添加:50μL/ウェル
・湿潤チャンバー中37℃で1時間
3.洗浄段階:
PBS/0.02%Tween20で3回洗浄
4.ブロッキング処理:
・PBS/0.02%Tween中の3%BSA、湿潤チャンバー中、37℃で1時間;添加:200μL/ウェル
5.RGM Aペプチド:
RGM A−Fc断片
・1μg/mL開始濃度、次いでPBS/0.02%Tween20を用いて1:2に希釈。
・室温で1時間温置
・湿潤チャンバー中、37℃で1時間
6.洗浄段階:
・PBS/0.02%Tween20で3回洗浄
7.抗体:
・ビオチン抗ヒトFc(R&D−Systems)、カタログ番号709065;1mg/mL;
・0.6%BAS/PBS−T(0.02%Tween)中で1:200
・添加:50μL/ウェル
・湿潤チャンバー中、37℃で1時間
8.二次抗体:Strep.POD(Roche);カタログ番号11089153001
・500U;0.6%BAS/PBS−T(0.02%Tween)中1:5000
・添加:50μL/ウェル
・湿潤チャンバー中、37℃で1時間
9.洗浄段階:
・PBS/0.02%Tween20で3回洗浄
10.基質:
・ImmunoPure TMB基質キット;Pierce、#34021
・発色時間:およそ1−30分、PBS/0.02%Tween20の1:1混合物;添加:50μL/ウェル
11.停止:
・2.5M H2SO4;添加:50μL/ウェル
変法B:様々なRGM A−Fc融合タンパク質の固定化及びBMP−2/又は−4タンパク質の結合の検出
1.プレート:
Immunoplate Cert.MaxiSorp F6(Nunc、439454)
2.コーティング:
RGM A−Fc断片
・使用量:Na2CO3中2.5μg/mL;添加:50μL/ウェル、
・湿潤チャンバー中、37℃で1時間
3.洗浄段階:
・PBS/0.02%Tween20で3回洗浄
4.ブロッキング処理:
・PBS/0.02%Tween中3%BSA、湿潤チャンバー中、37℃で1時間
・添加:200μL/ウェル、温置:湿潤チャンバー中、37℃で1時間
5.BMPペプチド:
組み換えヒトBMP−2、カタログ番号355−BM、会社:R&D Systems;又は組み換えヒトRGM A、R&D Systems;製品番号2495−RM、組み換えヒトBMP−4、カタログ番号314−BM、会社:R&D Systems;各場合の濃度:10μg/mL
希釈段階:各場合、PBS/0.02%Tween20で1:2
6.洗浄段階:
・PBS/0.02%Tween20で3回洗浄
7.抗体:
抗ヒトBMP−4ビオチン抗体;カタログ番号BAM7572、1%BSA−PBS−T中1:200
8.洗浄段階:
・PBS/0.02%Tween20で3回洗浄
9.二次抗体:
Strep.POD(Roche)
カタログ番号11089153001;500U;0.6%BAS/PBS−T(0.02%Tween)中1:5000
添加:50μL/ウェル
・湿潤チャンバー中、37℃で1時間
10.洗浄段階:
・PBS/0.02%Tween20で3回洗浄
11.基質:
ImmunoPure TMB基質キット;(Pierce、#34021)
・発色時間:およそ1−30分間
・PBS/0.02%Tween20の1:1混合物;添加:50μL/ウェル
12.停止:
・2.5M H2SO4;添加:50μL/ウェル
変法C:MAB 4A9によるBMP−4への全長ヒトRGM Aの結合の阻害
1.プレート:Immuno Plate Cert.Maxi Sorp F96(Fa.NUNC、439454)
2.被覆:
組み換えヒトBMP−4 Canto.:314−BP
入手元:R&D Systems
濃度:10μg/mL
使用量:中2.5μg/mL(Na2CO3)/50μL/ウェル
湿潤チャンバー中、37℃で1時間温置
3.洗浄:3xPBS/0.02%Tween20
4.ブロッキング処理:PBS/0.02%Tween中3%BSA、湿潤チャンバー中、37℃で1時間温置、200μL/ウェル
5.hRGM A:
#788 RGMA(47−422)290μg/mL
ALU 2821/117 11.12.07断片0.5μg/mL一定(50μl)
+
MAB 4A9開始濃度:10μg/mL、1:2希釈(50μL)
6.洗浄:3xPBS/0.02%Tween20
7.一次検出抗体:
ビオチン抗ヒトFc 1mg/mL
Jackson Immuno Research(カタログ番号:709−065−149)1.5%BSA/PBS−T中で1:1000希釈、75μL/ウェル
湿潤チャンバー中、37℃で1時間温置
8.洗浄:3xPBS/0.02%Tween20
9.二次検出ツール:
ストレプトアビジンカップリングペルオキシダーゼ(Roche)
カタログ番号:11089153001、500U
1.5%BSA/PBS−T(0.02%Tween)75μL/ウェル中で1:5000、
湿潤チャンバー中、37℃で1時間温置
10.洗浄:3xPBS/0.02%Tween20
11.基質:Immuno Pure TMB基質キット(Pierce、#34021)発色時間:1−30分間、1:1混合
12.停止:2.5M H2SO4
調製実施例1:哺乳動物細胞におけるRGM Aタンパク質断片の調製
活性RGM Aの特徴を調べるために、次のRGM A分子をFc融合タンパク質の形態で哺乳動物細胞(HEK293)において発現させた。
41−168/Xa
47−90
47−168
316−386
1−450
AM131:
プラスミド名:pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGM A 41−168/Xa/Xa/hIgGλ hc 257−停止(attなし)
47−90:
AM169:
TOP10細胞、Laboratory journal ALU2163/5への形質転換
プラスミド名:pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGM A47−90/Xa/hIgGλ hc 257−停止(attなし)
47−168:
AM169:
TOP10細胞への形質転換
プラスミド名:pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGMA47−168/Xa/hIgGλ hc 257−停止(attなし)
316−386:
AM181:
TOP10細胞への形質転換
プラスミド名:pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGMA 166−386/Xa/hIgGλ hc 257−停止(attなし)
1−450:
Mey 744:
70−120
110−169
169−422
266−335
47−422 Myc His
HEK293F細胞(DSMZ番号ACC305)にプラスミドを遺伝子移入し、発現された融合タンパク質を上記のように単離した。
操作実施例1
BMP−4とのインビトロ相互作用アッセイ;RGMAとの様々なRGMA断片の比較
試験した融合タンパク質:
RGMA−Fc
47−168−Fc(「断片0」)
218−284−Fc(「断片2」)
266−335−Fc(「断片3」)
169−422−Fc(「断片6」)
上記の試験方法4、変法Bに従い、融合タンパク質(1mg/mL)の固定化によって、試験を行った。抗BMP−4ビオチン抗体を用いてBMP−4の結合を検出した。
BMP−4及びBMP−2とのインビトロ相互作用アッセイ;RGMAに対するRGMA断片47−168の比較
試験された融合タンパク質:
RGM A−Fc
47−168−Fc(「断片0」)
上記の試験方法4、変法Bに従い、融合タンパク質(1mg/mL)の固定化によって、試験を行った。抗BMP−4及び抗BMP−2ビオチン抗体をそれぞれ用いてBMP−4及び−2の結合を検出した。
BMP−4とのインビトロ相互作用アッセイ;様々なRGMA断片の比較
試験した融合タンパク質:
47−90−Fc(#785)
47−168−Fc(#786)
316−386−Fc(#790)
169−422−Fc(#769)
70−120−Fc(#779)
110−169−Fc(#780)
266−335−Fc(#789)
47−422MyC−HIS(#801)
上記の試験方法4、変法Aに従い、BMP−4(1mg/mL)の固定化によって、試験を行った。抗ヒトFc又は抗Myc抗ウサギ(Invitrogen)抗体を用いて、融合タンパク質の結合を検出した。
BMP−4とのインビトロ相互作用アッセイ;様々な結合RGM A断片の比較
試験した融合タンパク質:
47−90−Fc(#785)
47−168−Fc(#786)
316−386−Fc(#790)
上記の試験方法4、変法Aに従い、BMP−4(1mg/mL)の固定化によって、試験を行った。抗ヒト抗体を用いて、融合タンパク質の結合を検出した。
神経線維成長試験での合成RGMA断片の研究
ヒトNTera神経細胞又はヒトSH−SY5Y細胞を用いて、調製実施例1に従い作製される下記で挙げるRGMA断片:
47−168−Fc(#786)
316-386−Fc(#790)
を神経突起成長試験での阻害活性について試験した(上記試験方法1及び2参照)。図7A(SH−SY5Yに対して)及び7B(NTeraに対して)で結果を示す。
hRGM A断片47−168に結合するモノクローナル抗体4A9の作製及び特性評価
別段の断りがない限り、抗体作製及び特性評価の標準的な方法を使用した。
全長ヒトRGM Aタンパク質を用いてラットに免疫付与した。
抗体の固定化:
MAB 4A9のエピトープを正確に説明するために、エピトープマッピング実験を行った。この目的に対して、4A9をCNBr−活性化セファロースレジンに結合させた。4A9溶液のおよそ5−6nmol(5.76mg/mLの141μL)を緩衝液A(100mM NaHCO3、500mM NaCl、pH8)中のセファロースレジン20mgに添加し、室温で4時間混合した。緩衝液B(100mM NaHCO3、100mM NaCl、pH8)で抗体結合レジンを3回洗浄した後、hRGM A断片47−168Fc(1.18mg/mL、1.5nmol)を200μL緩衝液Bとともにレジンに添加した。混合物を回転器上で4℃で一晩温置した。抗体4A9及び抗原hRGM A47−168を含有するレジンを緩衝液Bで3回洗浄し、トリプシンでのエピトープ切断に対して使用した。
この目的に対して、MAB及び抗原を含有するレジンを200μL緩衝液B中で縣濁した。0.1μg/μLの濃度になるように、再懸濁緩衝液(50mM HOAc)200μL中でトリプシン20μg(Promega、Madison WI)を溶解させた。それぞれトリプシン0.6μg及び0.35μgを用いて、1:100及び1:200の比(w/w)の酵素:抗原で、抗原切断を行った。GCオーブン中にて37℃で回転させながら、7.5時間、反応を行った。消化後、緩衝液Bでレジンを2回洗浄した。
2%ギ酸200μLずつで3回レジンを洗浄することによって、MABに依然として結合した残りの抗原ペプチドを放出させ、各溶出分画を個々に回収した(溶出液1、2及び3)。溶出された分画は、MAB 4A9エピトープを構成するペプチドを含有すると予想される。
脱塩後、トリプシン消化からの溶出分画を質量分析に供した。α−シアノ−4−ヒドロキシけい皮酸(CHCA)マトリクス(飽和、50%アセトニトリル、0.3%TFA中)を用いて、Voyager DE−Pro(Applied Biosystems、Foster City、CA)においてマトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI)MSを行った。Agilent6510QTOF MSを用いて、LC−ESI−MS/MSを行った。8μLの注入を使用し、特定のMSシグナル基準に合致する上位3種類のイオンにおいてMS/MSを行った。MASCOT(Matrix Science)を用いてデータを検索したが、データの殆どは手動で判断した。
トリプシンエピトープ切断実験の溶出1分画において、hRGM Aの断片47−168のペプチド50−89及び96−126を同定した。ヒトRGM AにおけるMAB4A9ペプチドの位置を下記に示す。hRGM Aの断片47−168を太字で示す。MAB 4A9保護ペプチドとして同定される2つのペプチドに下線を付す。これらのペプチドの1つの中に正確なエピトープが位置し、その他のペプチドがジスルフィド結合を介して連結され得る。
MAB 4A9のエピトープを同定するために、領域15から168に広がるネスト化された重複ペプチド15アミノ酸長を使用した。ELISAによってペプチドの結合を評価し、このために、このペプチドでポリスチレンプレートを被覆した。次に、MAB 4A9を用いてペプチドを調べ、ペルオキシダーゼ結合抗ラットFc抗体及びTMB基質を用いて、ELISAによって結合を可視化した。
MAB 4A9は、太字で下線を付して強調した文字のペプチドに結合する。このペプチドはアミノ酸66−80内にあり、エピトープ切断及び質量分析解析により同定されるペプチドの1つによく合致した。
BRE−Lucアッセイを用いたBMPシグナル伝達におけるhRGM Aのアゴニスト性又はアンタゴニスト性効果の評価
a)材料:
・200μg/mLで3種類の化合物を提供した。
断片#785;断片#786及び断片#788(IgK/hRGM A47−422/Xa切断部位/Fc)
・R&D Systems Europe、Lille、Franceから、組み換えhBMP−2(CHO細胞より;#355−BM)及びモノクローナル抗ヒトBMP2/4抗体(#MAB3552)を得た。
・PromegaからBright−Gloルシフェラーゼアッセイキットを購入した。
BMP−反応性C3H10−B12(Logeart−Avramoglou D、Bourguignon M、Oudina K、Ten Dijke P、Petite H。分化プロモーター−ルシフェラーゼコンストラクトの阻害剤を遺伝子移入した細胞を用いた生物学的活性骨形成タンパク質の判定のためのアッセイ。Anal Biochem 2006;349:78−86)を4x104細胞/cm2の密度で96ウェルプレートに播種し、湿度を与えた37℃、5%CO2/95%大気環境中で24時間、BME(BME=イーグル基礎培地)(10%FBS添加)中で培養した。細胞をPBSで2回すすぎ、rhBMP−2(50ng/mL)あり又は無しで、試験される各AS化合物又は抗ヒトBMP2/4抗体(0.01から10,000ng/mL)の何れかを含有するBME/0.5%(w/v)BSA下で24時間培養し、その後、含有されるルシフェラーゼ活性についてアッセイした。実験は全て、トリプリケート(各3回測定)で行い、時間をおいて2回繰り返した。
固相ELISA実験において、MAB 4A9は、BMP−4に対する全長ヒトRGM Aの結合を完全に阻止するが、これは、47−168ヒトRGM A断片内にある4A9のドメインがBMP−4との相互作用に重要であるという明確な例となる。
それら自身における試験化合物はBMPシグナル伝達経路を誘導せず、結果として、BMPアゴニストとしてみなされ得ない。対して、rhBMP−2と組み合わせられた場合、これらのうち2つ(断片#786及び#788)は、用量依存的にrhBMP−2−誘導性活性を阻害した。BMP−2タンパク質とのこのような化合物の複合体形成は、細胞膜受容体へのBMP−2の結合が損なわれ得、続いて、BMP−介在シグナル伝達が阻止され得る。しかし、この実験に対して使用される細胞モデルを考慮すると、BMP−2シグナル伝達経路における試験化合物の直接的細胞内阻害効果は除外され得ない。
Claims (40)
- 反発性ガイダンス分子(RGM)の骨形成タンパク質(BMP)結合ドメイン。
- 哺乳動物のRGM由来の、請求項1に記載のBMP結合ドメイン。
- 配列番号2に従うヒトRGM A、配列番号4に従うヒトRGM B又は配列番号6に従うヒトRGM C由来の、請求項1又は請求項2に記載のBMP結合ドメイン。
- およそ170以下の長さ及びRGM Aのフォンウィルブランド因子ドメインに対するN末端を有するアミノ酸配列範囲に位置する、請求項1から請求項3の一項に記載のBMP結合ドメイン。
- 少なくとも1つのさらなる異なるアミノ酸配列との機能的連結において少なくとも1つのBMP結合ドメインを含有する、およそ30から150アミノ酸基の長さを有する請求項4に記載のBMP結合ドメイン、その機能的誘導体及び融合タンパク質。
- 配列番号7及び8に従う次の部分的配列の少なくとも1つを特徴とする、請求項1から請求項5の一項に記載のBMP結合ドメイン:
X1C(K/R)IX2(K/R)CX3(S/T/A)(E/D)(F/Y)X4SX5T(配列番号7)
(式中、X1からX5は、何らかのアミノ酸基を表す。);又は
X6CX7ALRX8YAX9CTX10RTX11(配列番号8)
(式中、X6からX11は何らかのアミノ酸基を表す。);
又は式:
(配列番号7)−Link1−(配列番号8)
の部分配列(式中、Link1は、13から28個の何らかの連続アミノ酸基を含有する配列番号7−及び8−架橋アミノ酸配列を表す。)。 - 配列番号2の次のアミノ酸配列の1つ:
47前後から168前後のアミノ酸位置
47前後から90前後のアミノ酸位置もしくは
75前後から121前後のアミノ酸位置;
又は配列番号4の次のアミノ酸配列の1つ:
94前後から209前後のアミノ酸位置
94前後から137前後のアミノ酸位置もしくは
122前後から168前後のアミノ酸位置;
配列番号6の次のアミノ酸配列の1つ:
36前後から172前後のアミノ酸位置
36前後から94前後のアミノ酸位置もしくは
80前後から125前後のアミノ酸位置;
を含有する、請求項1から請求項6の一項に記載のBMP結合ドメイン又はその機能的BMP結合断片。 - 配列番号2に従う位置316前後から386前後の配列範囲からの、配列番号4に従う位置350前後から421前後の配列範囲からの、又は配列番号6に従う位置314前後から369前後の配列範囲からの、少なくとも10連続アミノ酸基を含有する、請求項1から請求項3の一項に記載のBMP結合ドメイン又はその結合断片。
- 配列番号2に従う位置47前後から168前後の配列範囲からの、配列番号4に従う位置94前後から209前後の配列範囲からの、又は配列番号6に従う位置36前後から172前後の配列範囲からの、少なくとも10連続アミノ酸基を含有する、請求項7に記載のBMP結合ドメイン又はその結合断片。
- BMP−2、BMP−4、BMP−5、BMP−6及びBMP−12から選択される少なくとも1つのBMPに結合する、特にBMP−2及び/又はBMP−4に結合する、請求項1から請求項9の一項に記載のBMP結合ドメイン。
- ネオゲニンにも結合する、請求項10に記載のBMP結合ドメイン。
- 請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメインの抗原性ポリペプチド断片。
- BMP及び/又はネオゲニンへのRGMの結合を調節する、免疫グロブリン分子の産生のために使用され得る、請求項12に記載の抗原性ポリペプチド断片。
- 配列番号2、4又は6に従う配列の1つを有するペプチドの少なくとも10連続アミノ酸基を含有する、請求項12又は請求項13に記載の抗原性ポリペプチド断片。
- 一価もしくは多価担体ポリペプチド又は第二の生物学的活性ポリペプチドから選択される第二のポリペプチドに操作可能に連結される、請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメインから選択される少なくとも1つの第一の生物学的活性ポリペプチドを含有する、融合タンパク質
- 多価担体が少なくとも1つのFc又はFc’’を含有し、その2本のポリペプチド鎖のそれぞれが、請求項1から請求項10の一項に記載の同じ又は異なるBMP結合ドメインに操作可能に連結される、請求項15に記載の融合タンパク質。
- RGMに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を産生させるための、請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメインの使用又は請求項12から請求項14の一項に記載のポリペプチド断片の使用。
- 抗血清又は抗体が、ネオゲニン(ネオゲニン受容体)へのRGMの結合を調節する、請求項17に記載の使用。
- 診断又は治療用途のための、請求項17及び請求項18の一項での定義に従う、RGMに対するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体。
- RGM又はRGM断片とのネオゲニン受容体(ネオゲニン)の相互作用が介在する疾病又は病期の診断又は治療のための医薬品を調製するための、請求項19に記載のポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体の使用。
- 疾病又は病期が、
a)頭蓋骨、脳及び脊髄への機械的損傷、
b)神経変性、炎症又は自己免疫疾患から選択される慢性疾患、
c)神経再生、軸索発芽、神経突起伸展及び神経可塑性の疾患、
d)腫瘍性疾患及び腫瘍転移
から選択される、請求項20に記載の使用。 - 関連する受容体(ネオゲニン又はBMP)とのRGMもしくはRGM断片の相互作用の異常又は障害が介在する疾病又は病期の診断又は治療用の薬剤を調製するための、請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメインの使用又は請求項15及び請求項16の一項に記載の融合タンパク質の使用。
- 疾病又は病期が、
a)過剰な神経突起発芽及び/又は病的シナプス形成により引き起こされる精神状態及び慢性疼痛状態における神経突起生成プロセスの変化;
b)慢性疾患に伴う貧血、若年型ヘモクロマトーシスなどの鉄代謝障害に関連する疾患;
c)骨の成長障害に関連する疾患;
d)軟骨の退行性変化に関連する疾患;
e)椎間板及び椎体への損傷に関連する疾患;
f)無秩序で無制御の細胞移動プロセスに関連する疾患
から選択される、請求項22に記載の使用。 - (BMP−2、BMP−4、BMP−5、BMP−6及び/又はBMP−12への、特にBMP−2及び/又は4への結合による)BMPシグナル経路の刺激又は増幅により治療され得る疾患又は病期の診断用又は治療用の薬剤を調製するための、請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメインもしくはその結合断片の使用又は請求項15及び請求項16の一項に記載の融合タンパク質の使用。
- 骨成長障害が関与する疾患の治療のための、又は骨折の治療のための、請求項24に記載の使用。
- 自己免疫疾患、特に、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性リンパ球増殖症候群(ALPS)、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、ベーチェット病、類天疱瘡、心筋ミオパチー、セリアック病、疱疹状皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発神経障害(CIDP)、瘢痕性類天疱瘡、全身性硬化症(CREST症候群)、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚血管炎、デゴス病、皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、円板状紅斑性狼瘡、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛、グッドパスチャー症候群、グレーブズ病、ギランバレー症候群、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、免疫グロブリンAニューロパシー、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、川崎病、扁平苔癬、膜性糸球体腎炎、メニエール病、混合結合組織病、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発筋炎、皮膚筋炎、原発性低γグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ロイター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、尋常性白斑及びウェゲナー肉芽腫症から選択されるもの;
又は脱毛性疾患、特に、円形脱毛症、全頭脱毛症、全身性脱毛症、男性型脱毛症、休止期脱毛症、成長期脱毛症及び化学療法誘発脱毛症から選択されるもの、の診断又は治療のための薬剤を調製するための、請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメインもしくはその結合断片の使用又は請求項15及び16の一項に記載の融合タンパク質の使用。 - RGM結合リガンドの検出又は同定のための標的としての、請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメインの使用。
- 能動又は受動免疫付与のための免疫原としての、請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメイン又は請求項12から請求項14の一項に記載の断片の使用。
- 請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメイン又は請求項12から請求項14の一項に記載のポリペプチド断片の抗原量で哺乳動物に免疫付与をすることにより獲得可能な、ポリクローナル抗血清。
- 請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメインに対するかもしくは請求項12から請求項14の一項に記載のポリペプチド断片に対するモノクローナル抗体;又はモノクローナル抗RGM A抗体(RGM Aへの該抗体の結合は、請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメインによるか又は請求項12から請求項14の一項に記載のポリペプチド断片により調節される。);又は場合によってはヒト化型のその抗原結合断片。
- a)請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメイン又は請求項12から請求項14の一項に記載のポリペプチド断片又は請求項15及び請求項16の一項に記載の融合タンパク質、
b)請求項29及び請求項30の一項に記載のモノクローナル又はポリクローナル抗体
から選択される少なくとも1つの活性成分の医薬的に許容可能な担体を含有する、医薬品。 - 髄腔内、静脈内、皮下(subcutaneous)、経口又は非経口、経皮、皮下(subdermal)、骨内(intraosseal)、鼻腔、体外及び吸入投与のための、請求項31に記載の医薬品。
- 液体、半固体又は固体担体中の、請求項1から請求項11の一項に記載の少なくとも1つのBMP結合ドメイン又は請求項15及び請求項16の一項に記載の融合タンパク質を含有する、骨折の治療のための医薬品。
- 少なくとも1つの制御核酸配列に操作可能に連結される、請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメイン、請求項15及び請求項16の一項に記載の融合タンパク質又は請求項12から請求項14の一項に記載のポリペプチド断片に対する少なくとも1つのコード核酸配列を含有する発現ベクター。
- 請求項34に記載の少なくとも1つのベクターを有する組み換え微生物。
- 請求項30に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
- 請求項35に記載の組み換え微生物が培養され、産生されるタンパク質産物が培養物から単離される、請求項1から請求項11の一項に記載のBMP結合ドメイン、請求項15及び請求項16の一項に記載の融合タンパク質又は請求項12から請求項14の一項に記載のポリペプチド断片を作製するための方法。
- 請求項36に記載のハイブリドーマ細胞株が培養され、産生されるタンパク質産物が培養物から単離される、請求項30に記載のモノクローナル抗体を作製するための方法。
- RGM受容体、特にネオゲニンの受容体又はBMP−2、BMP−4、BMP−5、BMP−6及びBMP−12から選択される少なくとも1つのBMPを刺激するための医薬品を調製するための、請求項1から請求項16の一項に記載のBMP結合ドメイン又は請求項15及び請求項16の一項に記載の融合タンパク質の使用。
- 特にネオゲニンなどのRGMの受容体の活性化を阻止するための医薬品を調製するための、請求項30に記載のモノクローナル抗体の使用。
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