CN101778864A - 排斥性引导分子(rgm)蛋白质家族的蛋白的骨形态发生蛋白(bmp)-结合结构域及其功能片段,和它们的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及排斥性引导分子(RGM)蛋白质家族成员的骨形态发生蛋白(BMP)-结合结构域及从它们衍生的多肽片段和融合蛋白的鉴定和用途。本发明结构域，即肽片段和融合蛋白，适用作个体主动或被动免疫的药物，或作为用于疾病或医学病症的诊断和治疗药物，所述疾病或医学病症的起因或进展涉及RGM家族成员和与这一分子相关的细胞受体，例如再生蛋白和/或特别是BMP。本发明进一步涉及抗本发明结合结构域以及抗自其衍生的多肽的单克隆抗体和多克隆抗体，以及产生本发明多肽、蛋白质和抗体的方法。

Description

排斥性引导分子(RGM)蛋白质家族的蛋白的骨形态发生蛋白(BMP)-结合结构域及其功能片段，和它们的用途

本发明涉及排斥性引导分子(RGM)蛋白质家族成员的骨形态发生蛋白(BMP)-结合结构域及从它们衍生的多肽片段和融合蛋白的鉴定和用途。本发明结构域，即肽片段和融合蛋白，适用作个体主动或被动免疫的药物，或作为用于疾病或医学病症的诊断和治疗药物，所述疾病或医学病症的起因或进展涉及RGM家族成员和与这一分子相关的细胞受体，例如再生蛋白和/或特别是BMP。本发明进一步涉及抗本发明结合结构域以及抗自其衍生的多肽的单克隆抗体和多克隆抗体，以及产生本发明多肽、融合蛋白质和抗体的方法。

发明背景

RGM蛋白质家族的功能最先描述于Monnier，P.P.等，Nature，419，392-395，2002。这一家族包括三个之前已知的成员，它们被称作RGMA、RGM B(亦称作DRAGON)和RGM C(亦称作血幼素)(Niederkofler V.等，J.Neurosci.24，808-18，2004)。这些是通过脂质锚(甘油基磷脂酰肌醇(GPI)锚)与胞质膜结合的糖蛋白。这一蛋白质家族的成员与其他蛋白质不具有广泛的序列同源性，并在以下区域中基本鉴定了结构特征：N-端信号肽；一个RGD序列；在GDPH氨基酸序列上的溶蛋白性裂解位点；Willebrand因子结构域(vWF D)的结构同源物；C-端附近的疏水序列；和C-端GPI锚共有序列(也参见图2)。

在人类中，RGM A的编码序列位于染色体15上，RGM B的位于染色体5上并且RGM C的位于染色体1上。观察到以下特征性表达模式：RGM A和B尤其表达于成人大脑和脊髓中，RGM C尤其表达于骨骼肌、肝脏和心肌中，并且RGM B也表达于软骨组织中。

RGM蛋白最初被鉴定为在局部解剖学神经元投射(topographicalneuronal projections)的形成中发挥重要作用的候选蛋白质(Stahl B.等，Neuron 5：735-43，1990；Mueller B.K.等，Curr.Biol.6，1497-1502，1996；Mueller，B.K.Molecular Basis of Axon Growth and Nerve PatternFormation(神经突生长和神经类型形成的分子基础)，H.Fujisawa编辑，Japan Scientific Societies Press，215-229，1997)。RGM蛋白排斥或抑制生长神经纤维的能力是在其分离、克隆和表征中发挥重要作用的重要功能特征。在简单的细胞测定系统中可容易地验证活性。RGM蛋白在两种不同的细胞测定法中具有排斥和抑制作用。在萎陷检测中，将RGM蛋白加入正在生长的神经纤维中。RGM和RGM受体的结合引起剧烈的反应，其中神经生长锥的所有膜元件收缩。原来扩展的手样生长锥被转化成细线。在RGM存在下，神经纤维保持被抑制并强烈收缩，并且不能够继续生长。

RGM蛋白通过结合至RGM受体再生蛋白发挥它们的一部分作用(Rajagopalan S.等，Nat.Cell.Biol.6，756-62，2004)。再生蛋白与结直肠癌缺失(DCC)受体紧密相关。两种受体均是免疫球蛋白超家族的成员并且具有胞外、跨膜和胞内结构域。二者均被描述为另一种配体即神经生长因子-1的受体，但是仅再生蛋白而不是DCC与RGM蛋白结合。这些受体的胞外结构域由四个免疫球蛋白-样结构域组成，后面为六个纤维连接蛋白重复结构域。

RGM A的功能在神经系统中最好理解，并且其以非常低的浓度对神经纤维生长的抑制作用值得注意。成长中的人类和成年大鼠中枢神经系统的损伤引起RGM蛋白在受损部位的积累(Schwab J.M.等，Arch.Neurol.，第62卷，1561-1568，2005；Schwab J.M.等，Eur.J.Neurosci.，21，387-98，2005)。受损神经纤维的新生长因此受到抑制，导致长久的更严重或较不严重的功能缺陷，这取决于受损部位的位置。RGM抑制神经纤维生长的活性由结合至受体再生蛋白介导(Rajagopalan S.等，在上述引文中)。该相同受体通过神经生长因子-1的结合介导，但是也介导刺激神经纤维生长的相反作用。如果RGM A蛋白在大鼠脊髓中的受损部位被多克隆抗体中和，则神经纤维在受损部位再生并形成新的突触接触，引起显著的功能改善(Hata K.等，J.Cell.Biol.173，47-58，2006)。

近期的研究表明RGM蛋白也在中枢和外周神经系统中，在铁代谢的调控中，在肿瘤疾病和炎性过程中以及在骨和软骨组织的形成中发挥重要作用。

从WO 2007/039256已知RGM家族蛋白质的神经突生长-抑制结构域。例如RGMA的显著抑制活性定位在序列范围260-290中。

也已知RGM A、B、和C可与BMP家族的各个成员相互作用。BMP是配体TGF-β超家族的成员，其参与多个生理和病理过程。BMPs通过专门的信号转导途径发挥它们的功能，所述信号转导起始于BMP配体结合至两种类型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的组合。之前已证实了BMP-2、-4、-5、-6和-12与RGM的相互作用(参见，例如，Babitt，J.L.等，Nature Genetics，2006，第48卷，5，531-539；Babitt，J.L.等，J.Biol.Chem.，2005，第280卷，33，29820-29827；Babitt，J.L.等，TheJournal of Clinical Investigation，2007，第117卷，7，1933-1939；Samad，T.A.等，J.Biol.Chem.，2005，第280卷，14，14122-14129；和Halbrooks等，J.Molecular Signaling 2，4，2007(以电子形式出版))。

在此之前未描述RGM蛋白的BMP-结合结构域。

因此本发明的目的为定位RGM蛋白的BMP-结合结构域及其表征。

发明概述

令人惊奇的是上述目标已通过分离和表征人RGM蛋白尤其是RGM A的BMP-结合结构域及其活性多肽片段完成。

附图简述

图1显示了人形式的RGMA(GenBank #NP_064596.1)、RGM B(GenBank #NP_001012779)和RGM C(GenBank #NP_998818.1)的序列比对。

图2显示了RGM分子的结构示意图。在N-端信号肽和C-端GPI锚之间显示的为RGD序列，即血管假性血友病因子(vWF D)，以及锚区域前C端附近的疏水序列。神经突生长-抑制结构域(OID)位于vWFD和疏水区之间，在约260-290位的范围内。人RGM的对应氨基酸位点显示在图的下方；人RGM A的溶蛋白性裂解位点位于氨基酸168至169之间。

图3显示了BMP 4和各种固定化RGM A-Fc融合蛋白之间的体外相互作用测定的结果。

图4显示了比较各种固定化RGM A-Fc融合蛋白与BMP-4和BMP-2之间相互作用的体外相互作用测定的结果。

图5显示了固定化BMP-4和各种RGM A-Fc融合蛋白之间的体外相互作用测定的结果。

图6显示了固定化BMP-4和不同浓度的本发明融合蛋白47-90-Fc(图6A)、47-168-Fc(图6B)和316-386-Fc(图6c)之间的体外相互作用测定的结果。

图7显示了使用人神经母细胞瘤细胞(图7A中为SH-SY5Y，图7B中为NTera)的两种不同神经突生长检测的结果。hRGM A片段786(47-168)和790(316-386)二者均抑制神经突生长，47-168-Fc具有更强的作用。

图8A显示了单克隆抗体4A9的免疫印迹实验结果。MAB 4A9识别人RGM A的片段47-168(泳道5)。4A9也结合其他的hRGM A片段，70-120(泳道2)和片段47-90(泳道4)，并识别全长hRGMA(47-422)(泳道6和9)。分子量标准表明在泳道1。图8B显示了ELISA实验的结果，其中全长hRGM A和hBMP-4的相互作用被MAB 4A9以剂量依赖方式完全抑制。

图9显示了用rhBMP-2以不同浓度(从0至50ng/ml)处理C3H-B12后得到的荧光素酶活性的剂量依赖型应答。

图10显示了使用BRE-Luc测定法hRGM A肽片段对BMP信号转导的拮抗作用，如通过将C3H-B12暴露于不同浓度的待测化合物24小时并检测各自细胞荧光素酶活性的变化所测定。

发明详述

I.通用术语解释

除非本文另外定义，与本发明相关使用的科学和技术术语应具有与本领域普通技术人员普遍理解的含义。这些术语的含义和范围应是清晰的，然而在任何可能模棱两可的情况下，本文提供的定义优先于任何字典的或非固有的定义。而且，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。在这一申请中，除非另外指明“或者”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式例如“可包括”和“被包括”的使用是非限制性的。而且，除非另外指明，术语例如“元件”或“组分”包括包含一个单位的元件和组件以及包含多于一个亚单位的多个元件或多个组分。

一般而言，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交相关的命名法和技术为本领域熟知和通常使用的。除非另外指明，本发明的方法和技术通常根据本领域已知的常规方法并如本说明书通篇引用和讨论的各一般性或更具体的参考文献所描述的进行。酶促反应和纯化技术根据使用说明书进行，如本领域通常完成的或本文所述。与本文所述分析化学、合成有机化学、药物化学和药剂化学相关的命名法以及实验室操作及其技术为本领域已知和通常使用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者治疗。

为使本发明更容易理解，下文中定义经选择的术语。

如本文所使用术语“多肽”指任何氨基酸多聚体链。术语“肽”和“蛋白质”可与术语多肽互换使用并且也指氨基酸多聚体链。术语“多肽”包括天然或人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可为单体或多聚体。

术语“分离蛋白质”或“分离多肽”指以下蛋白质或多肽：就其来源或衍生源而言与在其天然状态下伴随它的天然相关组分不相关；基本不含同种的其他蛋白质；由不同种的细胞表达；或自然界不存在。因此，化学合成的或在与其天然来源的细胞不同的细胞体系中合成的多肽可与其天然相关组分“分离”。也可使用本领域已知的蛋白质纯化技术通过分离使蛋白质基本不含天然相关组分。

如本文所使用术语“回收”指例如使用本领域已知的蛋白质纯化技术通过分离使化学种类例如多肽基本不含天然相关组分的过程。

在本发明范围内，术语“受体”特别指与细胞膜结合的表面分子，该分子可与例如可溶性配体相互作用并且这一相互作用的结果例如可触发定向细胞内部的信号或信号级联(也称作“信号转导”)。

“配体”指“受体”天然的即体内产生的或合成的低分子或高分子结合配偶体。配体优选可在胞外环境中自由移动。

“免疫原”指糖基化或非糖基化形式的本发明肽片段，其适用于诱导形成抗免疫原的抗体。免疫原(半抗原形式)与大分子底物的结合是有利的。

“表位”或抗原决定簇指决定抗体特异性的抗原(例如蛋白质)区域。如果这一表位是由例如外部影响(如蛋白质与配体的相互作用)引起的在蛋白质区段内新形成的或表达于可接近的分子表面，这被称作“新表位”。特别是术语“表位”或“抗原决定簇”包括可特异结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，许多具有特异的三维结构特征，和/或特异的电荷特征。表位是与抗体结合的抗原区域。在某些实施方案中，当其优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时抗体被称作与抗原特异结合。

如本文所使用术语“中和”指当结合蛋白特异结合靶蛋白时对靶蛋白生物学活性的中和。中和性结合蛋白优选为中和性抗体，其与RGM A、B或C的结合引起所述RGM分子生物学活性的抑制。优选中和性结合蛋白结合RGM并将RGM的生物学活性降低至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多。中和性结合蛋白对RGM生物学活性的抑制可通过测定本领域已知的一个或多个RGM生物学活性指示物测定。

术语“活性”包括例如以下活性：抗体对抗原的结合特异性/亲和性，例如结合至RGM抗原的抗-RGM抗体，和/或抗体的中和效能，例如与RGM A的结合可抑制RGM A生物学活性的抗-RGM A抗体。

蛋白质或抗体的“结构域”指界定在蛋白质内的复杂结构，其可由例如α螺旋和/或β片层的结构元件构成。

除非另外指明，术语“本发明RGM蛋白”包括RGM分子家族成员尤其是RGM A、B和C的BMP-结合结构域以及从其衍生的多肽。特别是包括“刺激”BMP信号转导途径的功能多肽片段。本发明的多肽也可包括“具有抑制活性的”多肽，特别是结合再生蛋白或具有抑制神经纤维生长活性(由本文所述的神经突生长检测方法阐明)的那些。

本发明结构域或多肽的“结合”在最广义上理解为与结合配偶体例如BMP或再生蛋白的任何类型的相互作用，任选限定为时间的函数。这一结合可为特异的或非特异的，优选为特异的。该结合可使用适当的结合测定法检测，例如本文实验部分描述的结合检测。特别是本发明结构域或多肽可通过形成共价或非共价相互作用例如离子和/或疏水相互作用与具体的结合配偶体接触。特别是该相互作用足以调节即正面或负面影响以促进或部分或完全抑制由结合配偶体介导的特性，例如生物学功能，如结合配偶体与第三配偶体的相互作用。

特别是当不同结合配偶体或不同结合配偶体类型的数量是数量有限时本发明的结合为“特异的”。特别是，结合不应与多于10个，例如1、2、3、4或5个不同的结合配偶体或结合配偶体类型进行。例如，BMP代表一个结合配偶体类型。尽管与多个结合配偶体发生相互作用，但是仅与有限数量的结合配偶体的相互作用具有足够的强度影响上述意义上的生物学功能，此时同样存在特异性。例如，当包含至少一个BMP(特别是选自BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-12)的本发明结构域或多肽尤其与BMP-2和/或BMP-4结合；和/或与再生蛋白结合时存在特异性。

“抑制性”或“具有抑制活性的”多肽为如本文所述在神经细胞生长检测中可减少或完全抑制神经细胞生长的那些。

上述“刺激”和“抑制”活性对于给定多肽可相互独立地限定；然而，优选BMP信号途径-“刺激”活性经常存在，而神经细胞生长-“抑制”活性仅任选存在。

“BMP信号转导”-刺激活性是可由至少一种选自BMP-2、-4、-5、-6和-12的BMP蛋白触发的活性。当本发明的BMP结合多肽经本文所述的体外结合检测阐明与至少一种选自BMP-2、-4、-5、-6和-12的BMP分子相互作用时存在这一刺激活性。

除非另外指明“RGM”表示RGM A、B和C，特别是RGM A。

“再生蛋白(neogenin)”和“再生蛋白受体”为同义术语并特别指哺乳动物再生蛋白，特别是人再生蛋白。

BMP-结合结构域或BMP-结合多肽与另一氨基酸序列的“功能连接”特别应理解为例如使得结构域或多肽可与至少一个选自BMP-2、-4、-5、-6和-12的BMP分子和/或再生蛋白结合的共价肽连接。术语“调控”或“调节”可互换使用并且如本文所使用指目标分子活性(例如RGMA的生物学活性)的改变或变化。调节可为目标分子某些活性或功能量值的增加或减少。分子的示例性活性和功能包括但不限于结合特性、酶促活性、细胞受体活化和信号转导。

相应的，如本文所使用术语“调节剂”为可改变或变化目标分子活性或功能(例如RGM A的生物学活性)的化合物。例如，与不存在调节剂时观察到的活性或功能的量值相比，调节剂可引起分子某些活性或功能量值的增加或减少。在某些实施方案中，调节剂为抑制剂，其可减少分子至少一种活性或功能的量值。示例性抑制剂包括但不限于蛋白质、肽、抗体、肽体、糖类或小的有机分子。肽体描述于例如WO01/83525。

如本文所使用术语“激动剂”指这样一种调节剂，与不存在该激动剂时观察到的活性或功能的量值相比，当其与目标分子接触时引起分子的某些活性或功能的量值增加。具体的目标激动剂包括但不限于RGMA多肽或与RGMA结合的多肽、核酸、糖类或任何其他分子。

如本文所使用术语“拮抗剂”或“抑制剂”指这样一种调节剂，与不存在该拮抗剂时观察到的活性或功能的量值相比，当其与目标分子接触时引起分子的某些活性或功能的量值减少。具体的目标拮抗剂包括阻断或调节RGM A生物学或免疫学活性的那些。RGM A的拮抗剂和抑制剂包括但不限于与RGMA结合的蛋白质、核酸、糖类或任何其他分子。

如本文所使用术语“有效量”指这样一种治疗量，其足以减少或缓解病症或其一种或多种症状的严重程度和/或持续时间，阻止病症的进展，引起病症的退行，防止复发、发展、发病或疾病相关的一种或多种症状的进展，检测病症或增强或提高另一疗法的预防或治疗作用(例如预防或治疗药物)。

如本文所使用，术语“样品”以其最广义使用。如本文所使用“生物样品”包括但不限于来自生命体或先前生命体(formerly livingthing)的任何数量的物质。该类生命体包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴子、狗、兔和其他动物。该类物质包括但不限于血、血清、尿、滑膜液、细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。

II本发明的特定主题

本发明的第一个主题涉及糖基化或特别是非糖基化形式的排斥性引导分子(RGM)的骨形态发生蛋白(BMP)-结合结构域或结合肽片段，其优选衍生自哺乳动物RGM，例如人、大鼠或小鼠，或家禽，例如鸡。除非另外指明，术语“结合结构域”涵盖与至少一个衍生自RGM的BMP结合的多肽。

一个优选的实施方案涉及衍生自SEQ ID NO：2的人RGM A，SEQ ID NO：4的人RGM B或SEQ ID NO：6的人RGM C的BMP-结合结构域。结合结构域特别涵盖长度多达170，例如多达125、多达100、多达80、多达60、多达50、多达40、多达30、多达20或多达10个优选来自RGM氨基酸序列范围(具体为vWF结构域的N-端或RGM例如特别是RGM A的神经纤维生长-抑制结构域(OID)的C-端)，或来自可由序列比对衍生的RGM B和C的对应序列范围的连续氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明的主题特别涉及具有约30至150个连续氨基酸残基长度的BMP-结合结构域及其功能衍生物和包含至少一个BMP-结合结构域以及与其功能性连接的至少一个不同的另一氨基酸序列的融合蛋白。

本发明主题也涉及BMP-结合结构域，其特征为至少下列SEQ IDNO：7和8的部分序列之一：

X₁C(K/R)IX₂(K/R)CX₃(S/T/A)(E/D)(F/Y)X₄SX₅T(SEQ ID NO：7)

其中X₁至X₅表示任何给定的氨基酸残基；或

X₆CX₇ALRX₈YAX₉CTX₁₀RTX₁₁(SEQ ID NO：8)

其中X₆至X₁₁表示任何给定的氨基酸残基；

或式

(SEQ ID NO：7)-接头(Link)1-(SEQ ID NO：8)

的部分序列

其中接头1表示包含10至45个例如13至28个任何给定连续氨基酸残基的SEQ ID NO：7-和8-桥接氨基酸序列。

特别是，

X₁表示Pro或Gln

X₂表示Leu或Gln

X₃表示Asn或Thr

X₄表示Val或Trp

X₅表示Ser、Ala或Leu

X₆表示Phe或Leu

X₇表示Ala、Lys或Arg

X₈表示Ser或Ala

X₉表示Leu或Gly

X₁₀表示Arg或Gln，和/或

X₁₁表示Ala或Ser。

列出以下SEQ IQ NO：7具体实例：

PCKILKCNSEFWSAT

QCRIQKCTTDFVSLT

QCKILRCNAEYVSST

列出以下SEQ IQ NO：8具体实例：

FCAALRSYALCTRRTA

FCKALRAYAGCTQRTS

LCRALRSYALCTRRTA

列出以下接头1接头具体实例：

SGSHAPASDDTPE

SHLNSAVDGFDSE

LSLRGGGSSGALRGGGGGGRGGGVGSGG

BMP-结合结构域的实例包括以下范围的氨基酸序列：SEQ IDNO：2的氨基酸30至180位、SEQ ID NO：4的氨基酸80至230位或SEQ ID NO：6的氨基酸20至150位，或其功能性再生蛋白受体-结合片段。这些结合结构域(及从其衍生的片段)亦称作高-亲和力BMP-结合结构域。特别是高-亲和力BMP-结合结构域也与再生蛋白具有高-亲和力相互作用并因此亦称作高-亲和力再生蛋白-结合结构域。另一方面，低亲和力再生蛋白-结合结构域的一个实例为WO 2007/039256(其公开内容明确在本文作为参考)描述的SEQ ID NO：2的RGM A片段218-284。不受限于此，例如当K_D(解离常数)＞1μM例如2至10μM时存在低-亲和力结合；例如当K_D＜10nM，例如1至9nM时存在高亲和力结合。

高亲和力BMP-结合结构域的实例为包含以下SEQ ID NO：2氨基酸序列之一的那些：

约47至约168的氨基酸位，或约41至168的氨基酸位

约47至约90的氨基酸位，或约41至约90的氨基酸位或

约75至约121的氨基酸位；

或以下SEQ ID NO：4氨基酸序列之一：

约94至约209的氨基酸位

约94至约137氨基酸位或

约122至约168的氨基酸位；

以下SEQ ID NO：6氨基酸序列之一：

约36至约172的氨基酸位

约36至约94的氨基酸位或

约80至约125的氨基酸位；

或其功能性BMP结合片段，例如上述序列之一的片段，其中C和/或N端可缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或多至20个氨基酸残基而不失去BMP结合能力(在本文描述的结合检测中可检测)。

本发明结构域的其他具体实例为包含至少10个连续氨基酸残基例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45个连续残基的BMP-结合结构域或其结合片段，所述残基来自SEQ ID NO：2约47位至约168位的序列范围，来自SEQ ID NO：4约94位至约209位的序列范围，或来自SEQID NO：6约36位至约172位的序列范围。

这一点在说明书末尾所附的表A中通过参考SEQ ID NO：2进一步例证。

下文显示了氨基酸位点60至120范围内的适当片段的非限制性数量的实例(给出第一个和最后一个氨基酸残基)。

60-120，61-120，62-120，64-120，65-120，66-120，67-120，68-120，69-120，70-120；

60-119，61-119，62-119，64-119，65-119，66-119，67-119，68-119，69-119，70-119；

60-118，61-118，62-118，64-118，65-118，66-118，67-118，68-118，69-118，70-118；

60-117，61-117，62-117，64-117，65-117，66-117，67-117，68-117，69-117，70-117；

60-116，61-116，62-116，64-116，65-116，66-116，67-116，68-116，69-116，70-116；

60-115，61-115，62-115，64-115，65-115，66-115，67-115，68-115，69-115，70-115；

60-114，61-114，62-114，64-114，65-114，66-114，67-114，68-114，69-114，70-114；

60-90，61-90，62-90，64-90，65-90，66-90，67-90，68-90，69-90，70-90；

60-89，61-89，62-89，64-89，65-89，66-89，67-89，68-89，69-89，70-89；

60-88，61-88，62-88，64-88，65-88，66-88，67-88，68-88，69-88，70-88；

60-87，61-87，62-87，64-87，65-87，66-87，67-87，68-87，69-87，70-87；

60-86，61-86，62-86，64-86，65-86，66-86，67-86，68-86，69-86，70-119；

60-85，61-85，62-85，64-85，65-85，66-85，67-85，68-85，69-85，70-85；

60-84，61-84，62-84，64-84，65-84，66-84，67-84，68-84，69-84，70-84；

60-83，61-83，62-83，64-83，65-83，66-83，67-83，68-83，69-83，70-83；

60-82，61-82，62-82，64-82，65-82，66-82，67-82，68-82，69-82，70-82；

60-81，61-81，62-81，64-81，65-81，66-81，67-81，68-81，69-81，70-81；

60-80，61-80，62-80，64-80，65-80，66-80，67-80，68-80，69-80，70-80；

60-79，61-79，62-79，64-79，65-79，66-79，67-79，68-79，69-79，70-79；

60-78，61-78，62-78，64-78，65-78，66-78，67-78，68-78，69-78；

60-77，61-77，62-77，64-77，65-77，66-77，67-77，68-77；

60-76，61-76，62-76，64-76，65-76，66-76，67-76；

60-75，61-75，62-75，64-75，65-75，66-75；

60-74，61-74，62-74，64-74，65-74；

60-73，61-73，62-73，64-73；

60-72，61-72，62-72；

60-71，61-71；

60-70；

60-69。

相似片段可基于图1的序列比对类似地衍生自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的对应部分。

本发明的另一主题涉及例如位于OID C端的BMP-结合结构域(见图2)。这些结合结构域(和从它们衍生的片段)亦称作低亲和力BMP-结合结构域，因为与上文提到的高亲和力BMP-结合结构域相比它们的结合亲和力在相当的检测条件下可能较低。

因此本发明的主题也涉及其特征为至少以下SEQ ID NO：26和27部分序列之一的BMP-结合结构域：

LX₂₀LC(V/L)X₂₁GCP(SEQ ID NO：26)

其中X₂₀和X₂₁表示任何给定的氨基酸残基；或者

TAX₂₂X₂₃X₂₄C(K/H)EX₂₅(L/M)PV(E/K)DX₂₆Y(F/Y)(Q/H)(A/S)CVFD(V/L)LX₂₇(T/S)G(SEQ ID NO：27)

其中X₂₂至X₂₇表示任何给定的氨基酸残基；

或式

(SEQ ID NO：26)-接头2-(SEQ ID NO：27)

的部分序列

其中接头2表示包含10至45个例如约19至38个任何给定连续氨基酸残基的SEQ ID NO：26和27-桥接氨基酸序列。

特别是，

X₂₀表示Tyr或Gln

X₂₁表示Arg、Asn或Gly

X₂₂表示Arg、Asn或Val

X₂₃表示Ala、Thr或Arg

X₂₄表示Lys、Gln或Leu

X₂₅表示Lys或Gly

X₂₆表示Leu、Ile或Ala和/或

X₂₇表示Thr或Ile

列出以下SEQ IQ NO：26具体实例

LYLCLRGCP

LQLCVNGCP

LQLCVGGCP

列出以下SEQ IQ NO：27具体实例

TAVAKCKEKLPVEDLYYQACVFDLLTTG

TANTQCHEKMPVKDIYFQSCVFDLLTTG

TARRLCKEGLPVEDAYFHSCVFDVLISG

列出以下接头2接头具体实例：

LNQQIDFQAFHTNAEGTGARRLAAASPAPTAPETFPYE

LSERIDDGQGQVSAILGHSLPRTSLVQAWPGYTLE

PSQRLSRSERNRRGAITID

本发明低亲和力结构域的实例为包含至少10个连续氨基酸残基的BMP-结合结构域或其结合片段，所述残基来自SEQ ID NO：2约316位至约386位的序列范围，来自SEQ ID NO：4约350位至约421位的序列范围或来自SEQ ID NO：6约314位至369位的序列范围。

上文提及的“包含10个氨基酸残基的结合片段”的实例为包含例如10-50、10-40、10-30、10-25、10-20或10-15，特别是10、11、12、13、14或15个来自上文提及的肽或序列范围之一的连续氨基酸残基的那些。

本发明主题尤其涉及与至少一个选自BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-12的BMP，特别是BMP-2和/或BMP-4结合的BMP-结合结构域；以及也结合再生蛋白的BMP-结合结构域。

本发明的另一主题涉及根据上文定义的BMP-结合结构域的抗原性多肽片段。特别是可用于产生免疫球蛋白分子并且可调节RGM与BMP受体分子结合，特别是可部分或完全激动或拮抗并任选调节与再生蛋白受体的结合，特别是可部分或完全拮抗上述结合的抗原性多肽片段代表了本发明主题。作为实例提及以下抗原多肽片段，其包含至少10个例如10-30、10-25、10-20或10-15个，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个上文提及的肽之一或附加表A列出的衍生自SEQ IDNO：2或相似地衍生自SEQ ID NO：4或6的肽的连续氨基酸残基。

本发明的另一主题涉及上文定义的BMP-结合结构域或上文定义的多肽片段在制备抗RGM多克隆抗血清或单克隆抗体中的用途，其中所述抗血清或抗体特别调节，优选部分或完全拮抗RGM与再生蛋白受体的结合。

本发明主题也涉及上文定义的用于诊断或治疗用途的抗RGM多克隆抗血清或单克隆抗体。

本发明的另一主题涉及融合蛋白，其包含至少一个第一生物活性多肽以及与之可操作地连接(即在N或C端)的第二多肽，所述第一生物活性多肽选自上文定义的BMP-结合结构域，所述第二多肽选自单价或多价载体多肽或第二生物活性多肽。所述多价载体特别包含至少一个特别是来自哺乳动物免疫球蛋白(例如特别是衍生自人免疫球蛋白)的Fc或FC″分子，其中它的两条多肽链中的每一个均与上文定义的相同或不同的BMP-结合结构域可操作地连接。

本发明的另一主题涉及上文定义的BMP-结合结构域或上文定义的多肽片段在制备抗RGM的多克隆抗血清或单克隆抗体中的用途，其中所述抗血清或抗体调节RGM与再生蛋白(即再生蛋白受体)的结合。

本发明的主题也涉及用于诊断或治疗用途的抗RGM多克隆抗血清或单克隆抗体。

本发明主题也涉及上文定义的多克隆抗血清或单克隆抗体在制备用于诊断或治疗由再生蛋白受体(再生蛋白)与RGM或RGM片段相互作用介导的疾病或疾病阶段的药物，特别是选自以下的疾病或疾病阶段：

a)对颅、脑和脊髓的机械损伤；

b)选自神经变性、炎性或自身免疫疾病的慢性病；

c)神经元再生、轴突出芽、神经突延伸和神经元可塑性障碍；

d)肿瘤疾病和肿瘤转移。

本文主题另涉及上文定义的BMP-结合结构域或上文定义的融合蛋白在制备用于诊断或治疗由RGM或RGM片段与相关受体缺陷或受损的相互作用介导的疾病或疾病阶段的药物中的用途，其中所述疾病或疾病阶段特别是选自：

a)精神病状况下经改变的神经突发生过程和由过量神经突萌发和/或病理性突触发生引起的慢性疼痛状态；

b)与铁代谢紊乱相关的疾病；

c)与骨生长受损相关的疾病；

d)与软骨退化性变化相关的疾病；

e)与椎间盘和椎体损伤相关的疾病；

f)与不受调节的、不可控的细胞迁移过程相关的疾病。

本发明的另一主题涉及上文定义的BMP-结合结构域或上文定义的融合蛋白在制备用于诊断或治疗可通过刺激或扩增BMP信号途径(通过抑制BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和/或BMP[-12])治疗的疾病或疾病阶段，特别是用于治疗涉及受损骨生长的疾病，或用于治疗骨折的药物中的用途。

本发明的另一主题涉及上文定义的BMP-结合结构域或其结合片段或上文定义的融合蛋白在制备用于诊断或治疗特别是选自以下的自身免疫疾病的药物中的用途：关节强硬性脊椎炎、抗磷脂综合征、阿狄森氏综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝赛特氏症、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻、疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘多神经炎(CIDP)、疤痕性类天疱疮、全身性硬化症(CREST综合征)、冷凝集素病、克隆氏病、皮肤脉管炎、德戈斯病、皮肌炎、青少年型皮肌炎、盘状红斑狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、免疫球蛋白A肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型关节炎、川畸病、扁平苔、膜性肾小球肾炎、梅尼尔氏症、混合性结缔组织病、多病灶运动神经病、多发性硬化症、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌病、多发性肌炎、皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、全身性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病；或脱发病，尤其是选自局限性脱发、全部脱发、全身脱毛、雄激素性脱发、静止期脱发、再生期脱发和化学疗法诱导的脱发。

本发明主题也涉及上文定义的BMP-结合结构域作为检测或鉴定RGM-结合配体的靶标的用途。

本发明的另一主题涉及上文定义的BMP-结合结构域或上文定义的片段作为主动或被动免疫免疫原的用途。

本发明的另一主题涉及多克隆抗血清，其可通过用抗原量的上文定义的BMP-结合结构域或上文定义的多肽片段免疫哺乳动物获得。

本发明的主题也涉及抗上文定义的BMP-结合结构域或抗上文定义的多肽片段的单克隆抗体或单克隆抗-RGM A抗体，所述抗体与RGM A的结合受上文定义的BMP-结合结构域或上文定义的多肽片段调节；或其抗原结合片段，任选为人源化形式。

本发明的主题涉及包含药学可接受载体和至少一种选自以下的活性组分的药物：

a)上文定义的BMP-结合结构域，上文定义的多肽片段或上文定义的融合蛋白，

b)上文定义的单克隆抗体或多克隆抗体。

根据本发明尤其适用的为用于鞘内、静脉内、皮下、口服或肠胃外、经皮、真皮下、骨内、鼻、体外和吸入给药的药物。

本发明的另一些药物适合用于治疗骨折，并包含液体、半固体或固体载体中的上文定义的至少一种BMP-结合结构域或上文定义的融合蛋白。

本发明的另一些药物适合用于治疗铁代谢紊乱(例如慢性疾病的贫血、青少年血色病)并包含液体、半固体或固体载体中的上文定义的至少一种BMP-结合结构域或上文定义的融合蛋白。

本发明的另一主题涉及一种表达载体，其包含至少一种上文定义的BMP-结合结构域、上文定义的融合蛋白或上文定义的多肽片段的编码核酸序列，该序列与至少一个调控核酸序列可操作地连接。

本发明另涉及以下内容：

-携带至少一种上文定义的载体的重组微生物。

-产生上文定义的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。培养上文定义的杂交瘤细胞系并从该培养物中分离产生的蛋白质产物。

-产生上文定义的BMP-结合结构域或上文定义的多肽片段或融合蛋白的方法，其中培养上文定义的重组微生物并从培养物中分离产生的蛋白质产物。

本文的另一主题为产生上文定义的单克隆抗体的方法，其中培养上文定义的杂交瘤细胞系并从培养物中分离产生的蛋白质产物。

本发明的另一主题涉及上文定义的BMP-结合结构域或上文定义的融合蛋白在产生用于刺激RGM受体特别是再生蛋白或者选自BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-12的BMP的药物中的用途。

最后，本发明涉及上文定义的单克隆抗体在产生用于阻断RGM受体(例如特别是再生蛋白)活化的药物中的用途。

III实施本发明的更多信息

I多肽

本发明主题尤其涉及RGM家族蛋白的BMP-结合结构域和从这些结构域衍生的肽片段。尽管根据本发明已对RGMA及其结合结构域和从其衍生的片段进行了研究，但是本发明主题也涉及同源蛋白例如特别是RGM家族的同源成员尤其是RGM B和RGM C的对应结构域和片段。

在本发明范围内，明确公开的RGM结构域或多肽的“功能等价物”或类似物是与其不同的多肽，例如对于SEQ ID NO：2、4或6蛋白质的BMP-结合结构域而言具有小于100％同源性但是仍然具有所需生物活性的多肽。特别是这些功能等价物应可以结合至少一种BMP和/或在本文描述的结合检测中显示出结合，并且也任选在本文描述的神经纤维生长检测中显示抑制作用，并且统计学显著(p＜＝0.05)地部分或完全抑制神经纤维生长。

根据本发明，“功能等价物”应特别理解为其中上文提及的特异序列的至少一个序列位点包含与明确提及的氨基酸不同的氨基酸但仍然具有本文提及的生物活性之一的突变体。“功能等价物”因此涵盖可通过一个或多个氨基酸添加、替换、缺失和/或倒置获得的突变体，其中所提及的变化可发生在任何序列位点只要它们可得到具有本发明特性谱图的突变体。特别是当突变体和未改变多肽之间的反应性类型性质上匹配(即例如观察到相同的生物作用但是它们的表现水平差异很大)时存在功能等价物。以下为适当氨基酸残基替换的实例。

原始残基           替换实例

Ala                Ser

Arg                Lys

Asn                Gln；His

Asp                Glu

Cys                Ser

Gln                Asn

Glu                Asp

Gly                Pro

His                Asn；Gln

Ile                Leu；Val

Leu                Ile；Val

Lys                Arg；Gln；Glu

Met                Leu；Ile

Phe                Met；Leu；Tyr

Ser                Thr

Thr                Ser

Trp                Tyr

Tyr                Trp；Phe

Val                Ile；Leu

上述意义的“功能等价物”也是所述多肽的前体以及多肽的功能衍生物和盐。术语“盐”应理解为意指本发明蛋白质分子羧基的盐和氨基的酸加成盐。可按照已知方式制备羧基的盐，包括无机盐，例如钠、钙、铵、铁和锌盐，以及与有机碱的盐，例如胺盐，如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶盐等。酸加成盐例如与矿物酸如盐酸或硫酸的盐以及与有机酸例如乙酸和草酸的盐都同样为本发明主题。本发明多肽的“功能衍生物”也可使用已知技术提供于功能性氨基酸侧链基团上或其N-或C-端。该衍生物包括例如羧酸基团的脂肪族酯、通过与氨或与伯胺或仲胺反应可获得的羧酸基团的酰胺；通过与酰基反应制备的游离氨基的N-酰基衍生物；或通过与酰基反应制备的游离羟基的O-酰基衍生物。

当然，“功能等价物”也包括可从其他生物体以及天然变异体获得的多肽。举例而言，可通过序列比对确定同源序列范围并且根据本发明的特定要求确定等价酶。

“功能等价物”也是具有上文提及的多肽序列或从它们衍生的功能等价物之一，和功能性N-或C-端连键中的至少一个另外的、不同的异源序列的融合蛋白(即融合蛋白部分显著的共有功能性缺损)。该类异源序列的非限制性实例包括酶和免疫球蛋白。

“功能等价物”根据本发明涵盖明确公开的蛋白质即肽的同源物。这些功能等价物与明确公开序列之一具有至少40％至50％，或至少60％，例如75％或特别是至少85％，例如90％、95％或99％的同源性，例如根据Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448研究的算法计算。本发明同源多肽的同源性百分比特别指相对于本文明确描述的氨基酸序列之一全长的氨基酸残基一致性百分比。

除非另外指明，根据本发明，“衍生的”氨基酸序列意指具有至少80％或至少90％特别是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的原始序列的序列。

两个序列之间的“一致性”或“同源性”意指氨基酸残基在各自完整序列长度上的一致性，例如通过对比采用InforMax(USA)的VectorNTI Suite 7.1软件应用Clustal方法(Higgins D.G.和Sharp，P.M.，Fastand sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer(在微型计算机上快速和灵敏的多序列比对)，Comput.Appl.Biosci.April 1989，5(2)：151-1)并采用以下参数设置计算的一致性：

多重比对参数：

空位开放罚分                        10

空位延伸罚分                        10

空位分离罚分范围                    8

空位分离罚分                        关闭

比对延迟一致性百分比                40

残基特异空位                        关闭

亲水残基空位                        关闭

转变加权(Transition weighing)       0

成对序列比对参数：

FAST算法                            开启

K-tuple大小                         1

空位罚分                            3

窗口大小                            5

最佳对角线数量                      5

在可能存在蛋白质糖基化的情况下，等价物涵盖脱糖基化或糖基化形式以及可通过改变糖基化模式获得的经修饰形式的上文所述类型的蛋白质。

本发明的肽同源物可通过筛选突变体(例如截短突变体)组合库进行鉴定。举例而言，可通过核酸水平(例如通过酶促连接合成寡核苷酸的混合物)的组合突变产生肽突变体的多样库(variegated bank)。有许多可用于从简并寡核苷酸序列产生潜在同源物库的方法。简并基因序列的化学合成可在DNA合成仪中进行，并且可在适当的表达载体中将合成基因连接。简并基因集合的应用使得编码所需集合至可能的蛋白质序列的所有序列可以在混合物中制备。合成简并寡核苷酸的方法为本领域技术人员已知(例如，Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等.(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等.(1984)Science 198：1056；Ike等.(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。

2.核酸

本发明的另一主题涉及上文所述BMP-结合结构域和多肽(例如特别是SEQ ID NO：1、3和5)的编码核酸序列以及编码上文所述肽片段的核酸序列或从它们衍生的部分序列。

本发明的所有核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)已知为通过从核苷酸结构单位的化学合成，例如通过双链的单个重叠、互补的核酸结构单位的片段缩合。寡核苷酸的化学合成可按照已知方式进行，例如根据亚磷酰胺法(Voet，Voet，第2版，Wiley Press New York，896-897)。添加合成的寡核苷酸和使用DNA聚合酶的Klenow片段和连接反应填补空位以及通用的克隆方法描述于Sambrook等.(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press。

除非另外指明，根据本发明，“衍生的”核酸序列指原始序列具有至少80％或至少90％，特别是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％一致性的序列。

两个核酸之间的“一致性”指核苷酸在各自完整核酸长度上的一致性，特别是使用InforMax(USA)的Vector NTI Suite 7.1软件应用Clustal方法(见上文)计算的一致性。

本发明的主题也涉及编码上述肽之一及其功能等价物的核酸序列并且其可例如使用合成核苷酸类似物获得。

本发明涉及编码本发明的肽或其生物活性区段的分离核酸分子，以及可用作例如杂交样品或引物用于鉴定或扩增本发明编码核酸的核酸片段。

本发明的核酸分子也包含编码基因区3’和/或5’端的非翻译序列。

“分离的”核酸分子与该核酸的天然来源中存在的其他核酸分子分离并且如果是采用重组技术产生也可基本不含其他细胞物质或培养基，或如果是化学合成则可不含化学前体或其它化学品。

本发明核酸分子可使用分子生物学的标准技术和本发明提供的序列信息分离。举例而言，cDNA可分离自适当的cDNA库，其方式为采用明确公开的完整序列之一或其片段作为杂交样品并采用标准的杂交技术(例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述的那些)。此外，包括本发明序列之一的核酸分子或其区段可通过聚合酶链式反应采用基于该序列产生的寡核苷酸引物分离。以这一方式扩增的核酸可在适当的载体中克隆并通过DNA序列分析表征。本发明的寡核苷酸也可采用标准的合成方法例如使用DNA合成仪产生。

本发明也涵盖与明确描述的核苷酸序列互补的互补核酸分子或其区段。

本发明核苷酸序列使得可以产生用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物体中的同源序列的样品和引物。这些样品或引物通常包括在严格条件下杂交至少约12个，优选至少约25个例如约40、40或75个本发明核酸序列有义链或对应反义链的连续核苷酸的核苷酸序列范围。

本发明的其他核酸序列衍生自本发明RGM结构域和肽的编码序列并且由于添加、替换、插入或缺失单个或多个核苷酸而不同，但是仍然编码具有所需特性谱图的肽。

本发明也涵盖包括所谓沉默突变或与明确提及的序列相比经修饰的核酸序列(与特定来源的生物体或宿主生物体的密码子使用一致)，以及天然存在的变异体，例如剪接变异体或等位基因变异体。本发明主题也涉及通过保守核苷酸替换(即用具相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸替换目标氨基酸)得到的序列。

本发明的主题也涉及通过序列多态性衍生自明确公开的核酸的分子。这些遗传多态性可由于天然变异存在于群体的个体中。这些天然变异通常引起基因核苷酸序列1至5％的变化。

本发明也涵盖与上文提及的编码序列或其互补序列杂交的核酸序列。这些多核苷酸可通过从基因组或cDNA库取样来定位并且可任选使用适当的引物通过PCR扩增并接着使用适当的样品从中分离。另一种可能性为使用本发明的多核苷酸或载体转化适当的微生物，扩增所述微生物并因此扩增所述多肽，之后从其中分离。本发明的多核苷酸也可化学合成。

能够“杂交”多核苷酸的性质指多或寡核苷酸在严格条件下结合基本互补序列的能力而在这些条件下不发生非互补配偶体之间的非特异性结合。为此，这些序列应70-100％，特别是90-100％，例如95％、96％、97％、98％或99％互补。互补序列相互特异结合的性质应用于例如RNA印迹或DNA印迹技术或用于PCR或RT-PCR中的引物结合。以30个碱基对长度起始的寡核苷酸通常用于这一目的。“在严格条件下”例如在RNA印迹技术中指在50-70℃特别是60-65℃的温度下使用例如含有0.1％SDS的0.1x SSC缓冲液(20x SSC：3M NaCl、0.3M柠檬酸钠、pH 7.0)的洗涤液，用于例如洗脱非特异杂交cDNA样品或寡核苷酸。如前述，只有高度互补的核酸之间仍然保持相互结合。严格条件的设定为本领域技术人员已知并描述于例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。

本发明的另一方面涉及“反义核酸”。反义核酸包括与编码“有义”核酸互补的核苷酸序列。反义核酸可与整个编码链互补或仅与其片段互补。在另一实施方案中，反义核酸分子与核苷酸序列编码链的非编码区反义。术语“非编码区”涉及被称作5’-和3’-非翻译区的序列区段。

反义寡聚核苷酸具有例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸的长度。本发明的反义核酸可通过化学合成和酶促连接反应采用该技术领域已知的方法构建。反义核酸可使用天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸化学合成，所述经修饰的核苷酸具有的构型增加了这些分子的生物稳定性或增加了反义和有义核酸之间产生的双螺旋的物理稳定性。可使用例如硫代磷酸酯(Phosphorthioate)衍生物和吖啶-取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的经修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。反义核酸也可使用其中以反义方向亚克隆的核酸的表达载体用生物学方法产生。

3.表达构建体和载体

本发明的另一主题涉及包含在调控核酸序列遗传控制下的编码本发明RGM肽或其功能等价物或免疫球蛋白的核酸序列的表达构建体；以及包括至少这些表达构建体之一的载体。

本发明的这些构建体优选包括特定编码序列5’上游的启动子，和终止序列以及任选其他位于3’下游的普通调控元件，并且各自与该编码序列可操作地连接。“可操作连接”指启动子、编码序列、终止子和任选其他调控元件经顺序放置使得各调控元件能够准确地完成其表达该编码序列的功能。可操作连接的序列的实例为靶向序列以及增强子、多腺苷酸化信号等。其他调控元件包括选择性标记、扩增信号、复制起点等。适当的调控序列描述于例如Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185(基因表达技术：酶方法学185)，Academic Press，San Diego，CA(1990)。

除了人工调控序列，在实际结构基因之前可存在天然调控序列。这一天然调控在需要时可通过遗传修饰去除，从而使基因的表达增加或降低。然而，基因构建体也可具有更简单的结构；即在结构基因前没有插入附加的调节信号，并且没有去除天然启动子及其调控。而天然调控序列以这样一种方式突变使得调控不再发生，并且基因表达增加或降低。核酸序列可包含在基因构建体的一个或多个拷贝中。

以下为可使用的启动子实例：cos、tac、trp、tet、trptet、lpp、lac、lpplac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λPR或λPL启动子，其可有利地用于革兰氏阴性细菌中；除了amy和SPO2革兰氏阳性启动子，ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1或GAPDH酵母启动子、植物启动子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33或非植物启动子或泛素或菜豆素启动子。尤其优选使用诱导型启动子，例如光诱导特别是温度诱导启动子例如P_rP₁启动子。原理上可使用所有的天然启动子与它们的调控序列。也可有利地使用合成启动子。

所提及的调控序列预期使得核酸序列的靶向表达和蛋白质表达成为可能。根据宿主生物体，这可指例如该基因被表达或仅在诱导后表达或该基因立即表达和/或过表达。

调控序列或因子可优选正向影响表达，因此增加或降低表达。因此调控元件的扩增可通过使用强转录信号作为启动子和/或“增强子”有利地发生在转录水平。然而，也可以例如通过增强mRNA的稳定性来扩增翻译。

表达盒为通过将适当的启动子与适当的编码序列和终止子或多腺苷酸化信号融合产生。为此使用普通的重组和克隆技术，如以下文献中所述：T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experimentswith Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)，和Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)。

对于适当宿主生物体中的表达，重组核酸构建体即基因构建体可有利地插入宿主-特异性载体中，其使得基因在宿主中最优表达。载体为本领域技术人员熟知并如Cloning Vectors(Pouwels，P.H.等，编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中所述。除质粒之外，载体应理解为意指本领域技术人员已知的所有其他载体，例如噬菌体，病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、粘粒以及线性或环状DNA。这些载体可在宿主生物体中自主复制或随染色体复制。

以下为合适的表达载体的实例：

普通的融合表达载体，例如pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT 5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或蛋白A与重组靶蛋白融合。

非融合蛋白表达载体例如pTrc(Amann等.(1988)Gene69：301-315)和pET 11d(Studier等，Gene Expression Technology：Methodsin Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)，60-89)。

用于酿酒酵母中表达的酵母表达载体，例如pYepSec1(Baldari等.(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell30：933-943)、pJRY88(Schultz等.(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。适用于其他真菌例如丝状真菌的载体和构建载体的方法包括以下参考文献中详细描述的那些：van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)“Gene transfer systemsand vector development for filamentous fungi”(用于丝状真菌的基因转移系统和载体研发)，Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy等，编辑，1-28，Cambridge University Press：Cambridge。

可用于培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中蛋白质表达的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等.(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。

植物表达载体，例如以下参考文献中详细描述的那些：Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.，和Masterson，R.(1992)，“New plant binaryvectors with selectable markers located proximal to the left border”(具有邻近左边界的选择标记的新植物双元载体)，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.(1984)，“Binary agrobacterium vectors forplant transformation”(用于植物转化的双元农杆菌载体)，Nucl.AcidsRes.12：8711-8721。

哺乳动物表达载体例如pCDM8(Seed，B.(1987)，Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等.(1987)，EMBO J.6：187-195)。

用于原核和真核细胞的更多适当的表达系统描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，16章和17章，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。

4.重组宿主生物体

通过使用本发明载体，可产生使用至少一种本发明载体转化的重组生物体并可用于产生本发明的结构域或多肽。本发明的上述重组构建体可有利地引入适当的宿主系统并表达。优选采用本领域技术人员已知的普通克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，以使所提及的核酸在特定的表达系统中表达。适当的系统描述于例如以下文献中：Molecular Biology，F.Ausubel等编辑.Wiley Interscience，New York 1997，或Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。

原理上所有的生物体均适用作使得本发明核酸、它们的等位基因变异体、功能等价物或其衍生物可以表达的宿主生物体。“宿主生物体”应理解为意指细菌、真菌、酵母或植物或动物细胞。优选的生物体为细菌，例如大肠杆菌属如大肠杆菌、链霉菌属、杆菌属或假单胞菌属，真核微生物例如酿酒酵母或曲霉，以及来自动物或植物的更高级的真核细胞例如Sf9、CHO或HEK293细胞。

可使用标记基因选择成功转化的生物体，标记基因相似地包含在载体或表达盒中。该类标记基因的实例为用于抗生素抗性和用于催化显色反应的酶并引起转化细胞染色的基因。可采用自动细胞分选选择这些标记基因。由载体成功转化并携带对应的抗生素(例如G418或潮霉素)抗性基因的微生物可使用适当的含抗生素介质或培养基选择。存在于细胞表面的标记蛋白可用于通过亲和色谱法的选择。

需要时，基因产物也可在转基因生物体例如转基因动物特别是小鼠和绵羊或转基因植物中表达。

本发明的另一主题涉及重组产生本发明RGM结构域或多肽或其功能性、生物活性片段的方法，通过该方法培养产生肽的重组宿主生物体并任选诱导多肽的表达，从培养物中分离这些多肽。需要时也可以在商业规模上以这一方式产生肽。

可根据已知方法培养和发酵重组宿主细胞。可在TB或LB培养基中并在20至40℃的温度下在pH 6至9增殖细菌。适当的培养条件详细描述于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)。

如果多肽不分泌到培养基中，那么将细胞分解(macerated)并使用已知的蛋白质分离方法从裂解物中收获产物。可任选使用高频超声、高压例如使用弗氏压碎器，通过渗透作用(通过去污剂、裂解酶或有机溶剂的作用)、通过匀浆或通过数种所列方法的组合将细胞分解。

可使用已知色谱法纯化肽，例如分子筛色谱法(凝胶过滤)例如Q琼脂糖色谱法、离子交换色谱法和疏水色谱法并使用其他普通方法例如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳。适当的方法描述于例如Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden[BiochemicalProcedural Methods]，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York，或Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin。

对于重组肽的分离尤其适于采用将cDNA延伸给定核苷酸序列并因此编码经修饰多肽或融合蛋白(其可用于例如更简单的纯化)的载体系统或寡核苷酸。所谓的作为锚的“标签”代表了适当修饰的实例，例如已知为六组氨酸锚的修饰，或经鉴定可作为抗体抗原的表位(例如描述于Harlow，E.和Lane，D.，1988，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press(New York))。这些锚可用于将肽与固定底物例如可填充至色谱柱中的聚合物或用于微量滴定板上的基质或其他底物连接。

同时，这些锚可用于鉴定肽。对于肽的鉴定，普通标记例如荧光染料、在与底物反应后形成可检测反应产物的酶标记或放射性标记可单独或与锚组合使用用于肽的衍生化。

5.免疫球蛋白

5.1定义

本发明主题涉及可特异结合本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物的单克隆或多克隆抗体，即对本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物具有特异性的抗体。本发明主题另涉及这些抗体的部分特别是其结合部分，即结合本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物的抗体片段。

本发明抗体优选以其对与本发明RGM蛋白的特异结合具有给定结合动力学(例如高亲和力、低解离、低解离速度(low off-speed)(k_off)、强中和活性)的方式选择。

因此，可提供对本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物具有K_D＝10^-6-10^-12M范围内亲和力的抗体。

根据另一方面，可选择本发明抗体使得它们以0.1s^-1或更低的k_off速度常数结合RGM蛋白或其衍生物/等价物。

抗体优选为分离的抗体。根据另一方面，抗体为中和抗体。本发明抗体特别包括单克隆和重组抗体。本发明抗体可包含完全来源于单一物种的氨基酸序列；因此，例如人抗体可为大鼠抗体或小鼠抗体。根据另一实施方案，抗体可为嵌合抗体或CDR移植物抗体或其他形式的人源化抗体。

术语“抗体”指由四个多肽链即两个(H)链和两个(L)轻链形成的免疫球蛋白分子。这些链通常以二硫键互相连接。各重链由链的可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链的恒定区组成。重链的恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。各轻链由轻链的可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链的恒定区组成。轻链的恒定区由CL结构域形成。VH和VL区可进一步划分为高可变区，称作互补决定区(CDR)，其间分散有保守区，称作骨架(FR)区。各VH和VL区由三个CDRs和四个FRs组成，从N端到C端按照以下顺序排位：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

术语抗体的“抗原-结合部分”(或简称为“抗体部分”)指对本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物具有特异性的抗体的一个或多个片段，其中所述一个片段或多个片段仍然可以特异结合RGM蛋白或其衍生物/等价物。已显示抗体的抗原-结合功能可从完整抗体的片段确定。术语抗体的“抗原-结合部分”意义上的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，即包含在铰链区通过二硫键相互连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域或VH、CH1、CH2、DH3，或VH、CH2、CH3组成的dAb片段(Ward等.(1989)Nature341：544-546)，和(vi)分离的互补决定区(CDR)。尽管Fv片段的两个结构域即VL和VH由不同的基因编码，可根据重组方法使用合成接头将它们连接起来，它们可通过这一方法以单蛋白链产生，其中VL和VH区相遇形成单价分子(称作单链Fv(ScFv)；参见，例如，Bird等.(1988)Science 242：423-426；和Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也涵盖于术语抗体的“抗原-结合部分”。其它形式的单链抗体例如“双特异性抗体”也包括于其中。双特异性抗体为二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达在单个多肽链上，除了使用的接头太短使得两个结构域不能在相同的链上相遇，藉此迫使该结构域与不同链的互补结构域配对并形成两个抗原-结合位点(参见，例如，Holliger，P.等.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等.(1994)Structure 2：1121-1123)。

此外，抗体或其抗原-结合部分可为更大的免疫黏附分子的一部分，其通过抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成。该类免疫黏附分子包括使用链霉亲和素核心区域产生四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.等.(1995)“Human antibodies andhybridomas”6：93-101)和使用半胱氨酸残基、标记肽和C-端多聚组氨酸标签产生二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov，S.M.等.(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。

抗体部分，例如Fab和F(ab′)₂片段可通过采用常规技术例如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化从完整抗体产生。抗体、抗体部分和免疫黏附分子也可通过使用标准的重组DNA技术获得。“对本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物具有特异性的分离抗体”涵盖对本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物具有特异性的抗体，其基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体。

术语“中和抗体”描述了与给定抗原的结合引起该抗原生物学活性抑制的抗体。这一抗原生物学活性的抑制可通过采用合适的体外或体内测定法检测该抗原生物学活性的一个或多个指示物检测。

术语“单克隆抗体”描述了来源于杂交瘤的抗体(举例而言，由使用杂交瘤技术例如根据

和Milstein的标准杂交瘤方法产生的杂交瘤分泌的抗体)。对本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物具有特异性并来源于杂交瘤的抗体因此被称作单克隆抗体。

术语“重组抗体”描述了采用重组方法表达、产生或分离的抗体，例如使用转染至宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体；分离自重组组合抗体库的抗体；分离自用人免疫球蛋白基因制成的转基因动物的抗体(参见，例如，Taylor，L.D.等.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)；或以一些其他方式表达、产生或分离的抗体，其中给定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)与其他DNA序列组合。重组抗体包括例如嵌合抗体、CDR移植物抗体和人源化抗体。

术语“人抗体”描述了其可变区和恒定区对应于或来源于人种系免疫球蛋白序列的抗体，例如Kabat等.(参见Kabat等.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.美国卫生及公共服务部，NIH出版号.91-3242)所描述。然而，本发明的人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDRs中，特别是在CDR3中。本发明的重组人抗体具有可变区，并也可包含来源于人种系的免疫球蛋白序列的恒定区(参见Kabat，E.A.等.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生及公共服务部，NIH出版号.91-3242)。但是根据某些实施方案，将该类重组人抗体进行体外突变(或者，如果使用用人Ig序列制备的转基因动物则进行体内体细胞突变)这样重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为天然不存在于体内人抗体种系库(repertoire)中的序列，尽管它们来源于人种系的VH和VL序列或与其相关。根据某些实施方案，该类重组抗体是由选择性突变或回复突变或二者引起的。

术语“回复突变”指人抗体的一些或所有体细胞突变氨基酸被同源种系抗体序列的对应种系残基取代的方法。将本发明人抗体的重链和轻链的序列分别与VBASE数据库的种系序列对比以鉴定具有最高同源性的抗体。本发明人抗体的差异归因于在编码这些不同氨基酸的确定核苷酸位点突变的种系序列。应研究经这一方式鉴定为回复突变候选的各氨基酸对抗原结合的直接或间接重要性，在突变后破坏人抗体有利特性的氨基酸不应包括于最终的人抗体中。为了保持回复突变氨基酸的数量尽可能小，那些尽管与下一个种系序列不同但与第二种系对应的氨基酸序列相同的氨基酸位点可保持不变，只要第二种系序列与本发明的人抗体序列至少就相关氨基酸两边的10个并优选12个氨基酸而言是相同的并共线性。回复突变可在抗体优化的任何给定阶段进行。

术语“嵌合抗体”涵盖分子的各部分衍生自不同物种的抗体。因此，嵌合抗体(不受限于此)为例如包含一个物种的重链和轻链可变区但是VH和/或VL的一个或多个CDR-区序列被另一物种的CDR序列取代的抗体。该类抗体可包含来自小鼠的重链和轻链可变区，其中一个或多个小鼠CDRs(例如CDR3)被人CDR序列取代。

术语“人源化抗体”描述这样一种抗体，其包含非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、山羊)的重链和轻链可变区序列但是其中至少一部分的VH和/或VL序列经修饰成为“类似人的”即更类似人种系的可变序列。人源化抗体的一个类型为CDR移植抗体，其中通过向非人VH和VL序列插入人CDR序列替换对应的非人CDR序列。

检测抗体结合动力学的一种方法是基于所谓的表面等离振子共振。术语“表面等离振子共振”指这样一种光学现象，其可通过使用例如Biacore system(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden andPiscataway，NJ)采用生物传感器矩阵的方式检测蛋白质浓度的变化分析生物特异性相互作用。更多信息可参见U.等.(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；

U.等.(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.等.(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.等.(1991)Anal.Biochem.198：268-277。

术语“K_off”描述了抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速度常数。

术语“K_d”描述了给定抗体-抗原相互作用的解离常数。

本发明抗体的结合亲和力可通过使用标准化体外免疫测定法例如ELISA或Biacore分析评价。

5.2免疫球蛋白的产生

5.2.1多克隆抗体的产生

本发明涉及抗本发明RGM结构域和多肽的多克隆抗体及其产生。

对于这一目的，免疫具有至少一种本发明RGM蛋白或衍生物/等价物的宿主，并从宿主回收响应免疫的含抗体血清。

如果使用的RGM多肽不具有免疫原性或仅具有较低的免疫原性，可通过将它们与载体偶联增强它们的免疫原性，所述载体优选载体蛋白例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、鲎蛛血蓝素(LPH)、牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。普遍已知的许多偶联选择是本领域技术人员可用的。例如与戊二醛反应是可操作的，其方式为例如将RGM蛋白与适当的水或液体溶剂中的肽或肽混合物温育。这一反应可在室温下即按常规于室温下进行。但是可以进行降温或轻微加热。该反应通常可在数小时内提供需要的结果，例如2小时的反应期在典型的范围之内。戊二醛浓度通常在ppm至％范围内，有利地从10ppm至1％，优选从100ppm至0.5％。反应参数的优化在本领域技术人员的技能之内。

除了抗原，所述组合物通常另包含辅助物质，特别是普遍用于免疫的佐剂例如弗氏佐剂。特别是完全弗氏佐剂用于初次免疫，而所有的进一步免疫使用不完全弗氏佐剂进行。通过向辅助物质中加入抗原(免疫源)，优选以上述组分混合物形式的抗原来产生免疫混合物(immunization cocktails)。按照常规抗原是经乳化的。

啮齿类或兔子尤其适于作为宿主。优选皮下注射免疫混合物至这些或其他适当的宿主中。可使用免疫测定法测定抗体滴度，例如竞争性使用抗宿主IgG和被标记RGM蛋白的绵羊抗血清。因此，在免疫结束时，可决定一种给定的宿主是否适用于抗体回收。例如，如果进行了四次免疫可在第三次免疫后测定抗体滴度，接着可从具有足够抗体滴度的动物中回收抗体。

对于所产生抗体的回收，优选在数周或数月内从宿主采血。然后将宿主放血。包含所需抗体的血清可按照已知方式从血液中回收。必要时如此获得的全血清可以本领域技术人员已知的方式进一步纯化以富集其中包含的抗体部分尤其是RGM蛋白-识别抗体。

根据本方法的一个具体实施方案，至少一种抗体是选自特异识别用作免疫原的RGM或其衍生物/等价物的血清。在这一背景下，“特异性”指抗体对免疫原比对特别是免疫原相关的其他蛋白质更高的抗体结合亲和力。

5.2.2单克隆抗体的产生

根据本发明可使用的免疫球蛋白可通过已知方式获得。因此，杂交瘤技术使得可以产生对一种目标抗原的单特异性抗体。而且，已研发了重组抗体技术例如体外筛选抗体库，藉此可相似地产生该类特异抗体。

因此，举例而言，可免疫具有目标抗原的动物。这一体内方法也可包括从动物的淋巴细胞或脾细胞建立一系列杂交瘤并选择分泌特异结合该抗原的一种抗体的杂交瘤。被免疫的动物可为例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼或绵羊，或为上文提及动物的转基因形式，例如在抗原刺激后可产生人抗体的具有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。可免疫的其他类型的动物包括使用人外周单核血细胞(嵌合人-PBMC-SCID小鼠)或使用淋巴样细胞或其前体重建的患重度联合免疫缺陷症(SCID)的小鼠，以及给予致死剂量的全身照射然后使用来自重度联合免疫缺陷症(SCID)小鼠的骨髓细胞保护其对抗照射损害并接着接受功能性人淋巴细胞(所谓的Trimera系统)移植物的小鼠。另一类可被免疫的动物为其基因组中通过例如同源重组清除(“敲除”)了编码目标抗原的内源基因的动物(例如小鼠)，这样用该抗原免疫后这一动物将该抗原鉴定为外源的。本领域技术人员了解根据这一方法产生的多克隆或单克隆抗体可通过使用已知的筛选方法包括但不限于ELISA技术进行表征和选择。

根据另一实施方案，使用所述抗原筛选重组抗体库。重组抗体库可表达于例如噬菌体表面、酵母细胞表面或细菌细胞表面。重组抗体库可为例如scFv库或Fab库。根据另一实施方案，抗体库可表达为RNA蛋白融合体。

产生本发明抗体的另一方法包括体内方法和体外方法的组合。举例而言，可通过用抗原体内免疫动物并接着使用该抗原体外筛选由该动物的淋巴样细胞产生的重组抗体库或单个结构域抗体库(例如使用重链和/或轻链)使该抗原作用于抗体库。根据另一方法，可通过用该抗原体内免疫动物并接着使由该动物的淋巴样细胞产生的重组抗体库或单结构域抗体库亲和力成熟使得该抗原作用于抗体库。根据另一方法，可通过以下方式使抗原作用于抗体库：用抗原体内免疫动物并接着选择分泌目标抗体的单个产抗体细胞，从这些选择的细胞收获重链和轻链可变区的cDNAs(例如使用PCR)并在哺乳动物宿主细胞中体外表达重链和轻链可变区(称作选定淋巴细胞抗体法(SLAM))，因此使得可以进一步选择和操作所选抗体基因序列。此外，单克隆抗体可通过表达克隆选择，其方式为在哺乳细胞中表达重链和轻链的抗体基因并选择分泌具有所需结合亲和力的抗体的哺乳动物细胞。

根据本发明，提供RGM-结合结构域或多肽形式的确定抗原用于筛选和反筛选。因此，根据本发明可筛选具有如上文定义的本发明所需特性谱图的多克隆和单克隆抗体。

使用本发明方法可产生各种类型的抗体。这些基本包括人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和CDR移植物抗体以及它们的抗原-结合部分。

产生本发明抗体的方法具体描述于下文。将体内方法、体外方法或二者组合之间区别开来。

体内方法：

从产生体内生成抗体的细胞开始，可使用标准化技术例如杂交瘤技术产生单克隆抗体，例如

和Milstein(1975，Nature 256：495-497)最初描述的杂交瘤技术(也可参见Brown等.(1981)J.Immunol 127：539-46；Brown等.(1980)J.Biol.Chem.255：4980-83；Yeh等.(1976)PNAS 76：2927-31；和Yeh等.(1982)Int.J.Cancer 29：269-75)。用于产生单克隆抗体杂交瘤的技术是熟知的(一般性参见R.H.Kenneth，Monoclonal Antibodies：A New Dimension In BiologicalAnalyses(单克隆抗体：生物分析中的新视角)，Plenum PublishingCorp.，New York，New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.，54：387-402；M.L.Gefter等.(1977)Somatic Cell Genet.，3：231-36)。对于这一目的，将固定化细胞系(通常是骨髓瘤)与用本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物免疫的哺乳动物的淋巴细胞(通常是脾细胞、淋巴结细胞或外周血淋巴细胞)融合，筛选所得杂交瘤细胞的培养物上清以鉴定可产生对本发明RGM蛋白或对其衍生物/等价物具有特异性的单克隆抗体。为此，许多已知方案中的任何给定方案可用于融合淋巴细胞和固定化细胞系(也可参见Galfre等.(1977)Nature 266：550-52；Gefter等.Somatic Cell Genet.，上文引用；Lerner，Yale J.Biol.Med.，上文引用；和Kenneth，Monoclonal Antibodies，上文引用)。此外，本领域技术人员知道同样可使用的该类方法的许多变体。固定化细胞系(例如骨髓瘤细胞系)通常与淋巴细胞源自相同的哺乳动物种。举例而言，鼠杂交瘤可通过融合用本发明的免疫原性制剂免疫的小鼠淋巴细胞与固定化小鼠细胞系建立。优选的固定化细胞系为对包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基(HAT)敏感的小鼠杂交瘤细胞系。可将许多杂交瘤细胞系中的任何给定杂交瘤细胞系以标准方式用作融合伴侣，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14杂交瘤系。这些杂交瘤细胞系可获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))，Rockville，MD。通常，使用聚乙二醇(PEG)将HAT-敏感小鼠杂交瘤细胞与小鼠脾细胞融合。然后使用HAT培养基筛选融合得到的杂交瘤细胞，藉此杀灭非融合的和无生产能力的融合杂交瘤细胞(非融合细胞在数天后死亡因为它们是未转化的)。特异识别本发明RGM蛋白或衍生物/等价物的产单克隆抗体杂交瘤细胞可通过筛选杂交瘤培养物上清中这种抗体进行鉴定，例如通过使用标准的ELISA测定法筛选可特异结合本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物的抗体。

根据所需的抗体类型，各种宿主动物可用于体内免疫。可使用表达目标抗原自身的内源形式的宿主。或者，可使用目标抗原的内源形式为缺陷型的宿主。例如研究已显示通过同源重组在给定内源蛋白质的对应内源基因为缺陷型的小鼠(即敲除小鼠)产生对免疫它们的蛋白质的体液应答，并因此可用于产生抗该蛋白质的高亲和力单克隆抗体(参见，例如，Roes，J.等.(1995)J.Immunol.Methods 183：231-237；Lunn，M.P.等.(2000)J.Neurochem.75：404-412)。

对于抗本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物的非人抗体的产生，许多非人哺乳动物可用作抗体产生的适当宿主。这些包括小鼠、大鼠、鸡、骆驼、兔和山羊(及它们的敲除形式)，尽管优选小鼠用于杂交瘤生产。此外，对于具有双特异性的抗人抗原的大体上人抗体的产生，可使用表达人抗体库的非人宿主动物。该非人动物包括携带人免疫球蛋白转基因(嵌合人--PBMC-SCID小鼠)的转基因动物(例如小鼠)，和人/小鼠辐射嵌合体，详细描述于下文。

根据一个实施方案，用本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物免疫的动物为非人哺乳动物，优选小鼠，使用人免疫球蛋白基因将其制备成转基因小鼠，从而使该非人哺乳动物在抗原刺激后产生人抗体。通常将具有人种系构型的重链和轻链的免疫球蛋白转基因插入该类动物中，这些动物经修饰使得它们的重链和轻链内源基因座是非活性的。如果用抗原(例如用人抗原)刺激该类动物，可产生来源于人免疫球蛋白序列的抗体(即人抗体)。可使用标准化杂交瘤技术从该类动物的淋巴细胞产生人单克隆抗体。对于用人免疫球蛋白制备的转基因小鼠和它们在产生人抗体中的用途的进一步描述参见例如US5,939,598、WO 96/33735、WO 96/34096、WO 98/24893和WO 99/53049(Abgenix Inc.)，以及US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US5,633,425、US 5,661,016、US 5,770.429、US 5,814,318、US 5,877,397和WO 99/45962(Genpharm Inc.)；也可参见MacQuitty，J.J.和Kay，R.M.(1992)Science 257：1188；Taylor，L.D.等.(1992)Nucleic AcidsRes.20：6287-6295；Lonberg，N.等.(1994)Nature 368：856-859；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Int.Rev.Immunol.13：65-93；Harding，F.A.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546；Fishwild，D.M.等.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；Mendez，M.J.等.(1997)Nature Genetics 15：146-156；Green，L.L.和Jakobovits，A.(1998)J.Exp.Med.188：483-495；Green，L.L.(1999)J.Immunol.Methods 231：11-23；Yang，X.D.等.(1999)J.Leukoc.Biol.66：401-410；和Gallo，M.L.等.(2000)Eur.J.Immunol.30：534-540。

根据另一实施方案，用本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物免疫的动物可为患重度联合免疫缺陷症(SCID)的小鼠，其可用人外周血单核血细胞或淋巴样细胞或其前体重建。该类小鼠称为嵌合hu-PBMC-SCID小鼠，在抗原性刺激后产生已验证的人免疫球蛋白应答。对于这些小鼠和它们在抗体产生中的用途的进一步描述参见例如Leader，K.A.等.(1992)Immunology 76：229-234；Bombil，F.等.(1996)Immunobiol.195：360-375；Murphy，W.J.等.(1996)Semin.Immunol.8：233-241；Herz，U.等.(1997)Int.Arch.Allergy Immunol.113：150-152；Albert，S.E.等.(1997)J.Immunol.159：1393-1403；Nguyen，H.等.(1997)Microbiol.Immunol.41：901-907；Arai，K.等.(1998)J.Immunol.Methods 217：79-85；Yoshinari，K.和Arai，K.(1998)Hybridoma 17：41-45；Hutchins，W.A.等.(1999)Hybridoma 18：121-129；Murphy，W.J.等.(1999)Clin.Immunol.90：22-27；Smithson，S.L.等.(1999)Mol.Immunol.36：113-124；Chamat，S.等.(1999)J.Infect.Diseases 180：268-277；和Heard，C.等.(1999)Molec.Med.5：35-45。

根据另一个实施方案，用本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物免疫的动物为给予致死剂量的全身照射然后使用来自重度联合免疫缺陷症(SCID)小鼠的骨髓细胞保护其不受照射损伤并接着接受功能性人淋巴细胞移植物的小鼠。这一被称作Trimera系统的嵌合类型可用于产生人单克隆抗体，其方式为用目标抗原免疫该小鼠并接着采用标准化杂交瘤技术产生单克隆抗体。这些小鼠和它们在抗体产生中的用途的进一步描述可参见例如，Eren，R.等.(1998)Immunology 93：154-161；Reisner，Y.和Dagan，S.(1998)Trends Biotechnol.16：242-246；Ilan，E.等.(1999)Hepatology 29：553-562；和Bocher，W.O.等.(1999)Immunology 96：634-641。

体外方法

作为通过免疫和选择产生本发明抗体的另一选择，可通过以下方式鉴定本发明抗体：用本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物筛选重组组合免疫球蛋白库以分离特异结合RGM蛋白或其衍生物/等价物的免疫球蛋白库成员。产生和筛选展示库的试剂盒可购买(例如，Pharmacia的重组噬菌体抗体系统，目录号.27-9400-01；和Stratagene的

噬菌体展示试剂盒，目录号.240612)。在许多实施方案中，该展示库为scFv库或Fab库。之前已描述用于筛选重组抗体库的噬菌体展示技术。可以尤其有利的方式用于产生和筛选抗体展示库的方法和化合物的实例参见McCafferty等.WO 92/01047、US 5,969,108和EP 589 877(特别描述scFv展示)，Ladner等.US 5,223,409、US 5,403,484、US 5,571,698、US 5,837,500和EP 436 597(例如描述pIII融合)；Dower等.WO 91/17271、US5,427,908、US 5,580,717和EP 527 839(特别描述Fab展示)；Winter等.WO 92/20791和EP 368 684(特别描述可变免疫球蛋白结构域的序列克隆)；Griffiths等.US 5,885,793和EP 589 877(特别描述使用重组库分离抗人抗原的抗体)；Garrard等.WO 92/09690(特别描述噬菌体表达技术)；Knappik等.WO 97/08320(描述HuCal人重组抗体库)；Salfeld等.WO 97/29131(描述抗人抗原(人肿瘤坏死因子α)的重组人抗体的产生和重组抗体的体外亲和力成熟)，和Salfeld等.美国临时申请案号60/126,603和以其为基础的专利申请(相似地描述了抗人抗原(人白介素-12)的重组人抗体的产生和重组抗体的体外亲和力成熟)。

筛选重组抗体库的进一步描述可参见以下科学出版物，例如Fuchs等.(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等.(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse等.(1989)Science 246：1275-1281；Griffiths等.(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等.(1992)J Mol.Biol.226：889-896；Clarkson等.(1991)Nature 352：624-628；Gram等.(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等.(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等.(1991)Nuc.Acid Res.19：4133-4137；Barbas等.(1991)PNAS 88：7978-7982；McCafferty等.Nature(1990)348：552-554；和Knappik等.(2000)J.Mol.Biol.296：57-86。

作为噬菌体展示系统用途的另一选择，重组抗体库可表达于酵母细胞或细菌细胞的表面。产生和筛选表达于酵母细胞表面库的方法描述于WO 99/36569。产生和筛选表达于细菌细胞表面库的方法更详细地描述于WO 98/49286。

只要从组合库中鉴定出目标抗体，即可使用分子生物学的标准化方法分离编码该抗体轻链和重链的DNAs，例如通过PCR扩增在库筛选过程中分离的来自展示包装(display packing)(例如噬菌体)的DNA。本领域技术人员熟悉可用于产生PCR引物的抗体轻链和重链基因的核苷酸序列。这些序列的许多类型描述于例如Kabat，E.A.，等.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生及公共服务部，NIH出版号.91-3242，和人种系序列的VBASE数据库。

本发明的抗体或抗体部分可通过在宿主细胞中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因产生。为了重组表达抗体，用一种或多种携带编码抗体免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的载体转染宿主细胞，这样宿主细胞中的轻链和重链表达并优选分泌至培养宿主细胞的培养基中。可从这一培养基中回收抗体。采用标准化重组DNA方法获得轻链和重链的基因，将这些基因插入重组表达载体中并将载体引入宿主细胞。这一方法描述于例如Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)；Ausubel，F.M.等.(编辑.)，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates，(1989)；和Boss等.US4,816,397。

只要获得编码抗体VH和VL区段的DNA片段，即可采用标准化重组DNA技术进一步操作这些基因，例如将可变区的基因转化成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，VL-或VH-编码DNA片段与编码另一蛋白例如恒定抗体区域或柔性接头的附加DNA片段可操作地连接。在这一情况下术语“可操作地连接”指两个DNA片段以这样一种方式连接在一起使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列仍然在阅读框中(框内)。

编码VH区的分离DNA可转化成全长重链基因，其方式为将编码VH区的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可操作地连接。人重链恒定区的基因序列已知(参见，例如，Kabat，E.A.，等.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生及公共服务部，NIH出版号.91-3242)，并且可使用标准化PCR扩增获得跨越这些区域的DNA片段。重链的恒定区可为由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD组成的恒定区，优选由IgG1或IgG4组成的恒定区。为了获得重链Fab片段的基因，VH-编码DNA与仅编码重链恒定区CH1的附加DNA分子可操作地连接。

编码VL区的分离DNA可被转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)，其方式为将VL-编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操作地连接。人轻链恒定区的基因序列已熟知(参见Kabat，E.A.，等.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生及公共服务部，NIH出版号.91-3242)，并且可使用标准化PCR扩增获得跨越这些区域的DNA片段。轻链的恒定区可为恒定κ或λ区，优选恒定κ区。

为了产生scFv基因，可将VH-和VL-编码DNA片段与编码柔性接头例如氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃的附加编码片段可操作地连接，这样VH和VL序列以连续单链蛋白表达，通过柔性接头将VL和VH区连接在一起(参见Bird等.(1988)Science 242：423-426；Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；和McCafferty等，Nature(1990)348：552-554)。

对本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物具有特异性的VH和VL单-结构域可通过使用上述方法分离自单-结构域库。两个VH单-结构域链(含有或不含CH1)或两个VL链，或由具所需特异性的一个VH链和一个VL链组成的对可用于结合本发明的RGM蛋白或其衍生物/等价物。

为了表达本发明的重组抗体或抗体部分，可将编码部分或全长轻链和重链的DNAs插入表达载体，藉此将这些基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在这一情况下，术语“可操作地连接”指抗体基因在载体中以这样的方式连接使得载体中的转录和翻译控制序列完成它们调控该抗体基因转录和翻译的预期功能。

选择表达载体和表达控制序列使得它们与用于表达的宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入不同的载体或将两个基因插入相同的载体，这为通常的情况。使用标准化方法(例如抗体基因片段和载体互补限制性界面的连接或如果不存在限制性界面则为平端的界面)将抗体基因插入表达载体中。表达载体可在插入的轻链和重链序列之前携带抗体恒定区序列。举例而言，在一种方法中将VH和VL序列转化成全长抗体基因，其方式为将这些序列插入已编码轻链和重链恒定区的表达载体中，藉此将VH区段与CH区段在载体中可操作地连接，并且将VL区段与CL区段在载体中可操作地连接。此外或可选择的，该重组表达载体可编码简化抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体，藉此将阅读框内的信号肽与抗体链基因的N-端可操作地连接。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。除了抗体链的基因，本发明表达载体可具有在宿主细胞中控制抗体链基因表达的调控序列。术语“调控序列”包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录和翻译的其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。该类调控元件描述于例如Goeddel；Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。本领域技术人员已知表达载体的设计(包括调控序列的选择)取决于例如用于转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质表达强度等因素。优选的用于哺乳动物细胞内表达的调控序列包括可引起哺乳动物细胞中强效蛋白质表达的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。病毒调控元件及其序列的进一步描述参见例如Stinski，US 5,168,062，Bell等，US 4,510,245和Schaffner等，US 4,968,615。

除了抗体链基因和调控序列，本发明重组表达载体可包含附加序列，例如调控宿主细胞中载体复制的序列(例如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因简化其中引入了载体的宿主细胞的选择(参见，例如Axel等，US 4,399,216、US 4,634,665和US 5,179,017)。举例而言，通常使用选择性标记使引入了载体的宿主细胞对活性物质例如G418、潮霉素或甲氨喋呤具有抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)(用于具有甲氨喋呤筛选/扩增的dhfr^-宿主细胞)的基因和新生基因(neogene)(用于G418选择)。

对于轻链和重链的表达，采用标准化技术将编码重链和轻链的表达载体转染至宿主细胞中。各种形式的“转染”包括通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的许多技术例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管理论上可能在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但是优选在真核细胞尤其是哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为在这些真核细胞尤其是哺乳动物细胞中比在原核细胞中更可能结合和分泌正确折叠的具有免疫活性的抗体。就抗体基因的原核表达而言，已报导这样对于活性抗体的高产率产生是无效的(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。

优选用于本发明重组抗体表达的哺乳动物细胞包括CHO细胞(包括描述于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220的dhfr^-CHO细胞，与例如描述于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621的DHFR-选择性标记一起使用)、NS0骨髓细胞瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞直至该抗体在宿主细胞中表达产生抗体，或优选该抗体分泌至宿主细胞生长的培养基中。可使用纯化蛋白质的标准化方法从培养基中回收抗体。

宿主细胞也可用于产生完整抗体的部分，例如Fab片段或scFv分子。当然，前述操作的变体包含于本发明中。举例而言，可能需要用编码本发明抗体轻链或重链(但不是二者)的DNA转染宿主细胞。如果存在对于目标抗原结合而言非必需的轻链或重链，可采用重组DNA技术部分或完全清除编码该轻链或该重链的DNA。通过该类截短DNA分子表达的分子相似地包括在本发明抗体中。此外，可产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链组成本发明抗体，另一条重链和轻链对不是该目标抗原的抗原具有特异性，其产生方式为采用标准化学方法将本发明抗体与第二抗体交联。

在一个重组表达本发明抗体抗原-结合部分的优选系统中，将编码抗体重链和抗体轻链二者的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr^-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链的基因各自与调控性CMV增强子/AdMLP启动子元件可操作连接以达到这些基因的强转录。重组表达载体也携带DHFR基因，通过这一基因被载体转染的CHO细胞可采用甲氨蝶呤筛选/扩增筛选。培养所筛选的已转化宿主细胞使得抗体重链和轻链表达并且从培养物中回收完整的抗体。使用分子生物学的标准化技术产生重组表达载体、转染宿主细胞、筛选转化子、培养宿主细胞并从培养基中回收抗体。因此，本发明涉及合成本发明重组抗体的方法，其方式为在适当的培养基中培养宿主细胞直至合成本发明的重组抗体。该方法也包括从培养基中分离重组抗体。

作为通过噬菌体展示筛选重组抗体库的另一选择，本领域技术人员已知的其他方法可用于筛选大型组合库以鉴定本发明抗体。在可选择表达载体的一种类型中，重组抗体库以RNA蛋白融合物的形式表达，如Szostak和Roberts，WO 98/31700和Roberts，R.W.和Szostak，J.W.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297-12302中所述。在这一系统中通过体外翻译合成的mRNA产生共价融合物，所述mRNA在它们的3’端在mRNA和肽或其编码的蛋白质之间具有肽基受体抗生素嘌呤霉素。因此，可基于所编码肽或蛋白质(例如抗体或其部分)的特性例如抗体或其部分与本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物的结合从mRNAs的复杂混合物(例如，组合库)中富集特异的mRNA。编码抗体或其部分并可从筛选这些库中回收的核酸序列可采用重组方法以所述方式表达(例如在哺乳动物宿主细胞中)并且可进行进一步的亲和力成熟，或者通过在其中突变插入原来筛选的序列中的进一步途径(passes)中筛选mRNA肽融合物，或者通过采用以上述方式进行的重组抗体体外亲和力成熟的其他方法。

体内和体外方法的组合

本发明抗体也可通过采用体内和体外方法的组合产生，例如以下方法：首先使得本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物体内作用于宿主动物的抗体库以刺激RGM蛋白或衍生物/等价物-结合抗体的产生，接着采用一种或多种体外技术进行进一步的抗体筛选和/或抗体成熟。根据一个实施方案，这一组合方法可在于首先使用本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物免疫非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、山羊或其转基因形式或嵌合小鼠)以刺激对抗原的抗体应答，接着使用通过RGM蛋白或其衍生物/等价物的作用体内刺激的淋巴细胞的免疫球蛋白序列产生并筛选噬菌体展示抗体库。这一组合方法的第一步可按照上述用于体内方法的方式进行，而这一操作的第二步可按照上述用于体外方法的方式进行。用于超免疫非人动物并接着体外筛选从被刺激的淋巴细胞产生的噬菌体库的优选方法包括BioSiteInc描述的那些，参见，例如，WO 98/47343、WO 91/17271、US 5,427,908和US 5,580,717。

根据另一实施方案，一种组合方法在于首先使用本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物免疫非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、山羊或其转基因形式或嵌合小鼠)以刺激对抗原的抗体应答，并通过筛选杂交瘤(例如由被免疫动物产生的)筛选可产生具有所需特异性抗体的淋巴细胞。抗体或单-结构域抗体的基因分离自所选克隆(使用标准化克隆方法例如逆转录聚合酶链式反应)并进行体外亲和力成熟以提高所选抗体的结合特性。这一操作的第一步可按照上述用于体内方法的方式进行，而这一操作的第二步可按照上述用于体外方法的方式进行，特别是通过使用WO 97/29131和WO 00/56772描述的体外亲和力成熟法。

在另一个组合方法中，从个体的淋巴细胞中产生重组抗体，其方式为采用本领域技术人员已知称作选定淋巴细胞抗体法(SLAM)的操作，描述于US 5,627,052、WO 92/02551和Babcock，J.S.等.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848。在这一方法中，首先用本发明RGM蛋白或其衍生物/等价物体内免疫非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡、骆驼、山羊或其转基因形式或嵌合小鼠)以刺激对RGM蛋白或其衍生物/等价物的抗体应答，接着通过采用抗原特异性溶血空斑试验筛选单个的抗原-分泌细胞。为此，可使用生物素等接头将RGM蛋白或其衍生物/等价物或结构相关的目标分子与绵羊血红细胞偶联，藉此可使用溶血空斑试验鉴定分泌具有适当特异性的抗体的单个细胞。在鉴定分泌目标抗体的细胞之后，从这些细胞中通过逆转录酶PCR回收轻链和重链可变区的cDNAs，并且这些可变区可接着与适当的哺乳动物宿主细胞例如COS或CHO细胞的免疫球蛋白恒定区(例如人恒定区)协同表达。用来自体内筛选的淋巴细胞的经扩增免疫球蛋白转染的宿主细胞可进一步进行体外分析和筛选，例如通过增殖转染细胞以分离表达具有所需特异性抗体的细胞。经扩增的免疫球蛋白序列可进一步体外操作。

6.药物

6.1一般信息

本发明主题也涉及药物(组合物)，其包含作为活性物质的本发明蛋白质(RGM蛋白；RGM蛋白-结合配体，例如抗-RGM蛋白-抗体)或编码RGM蛋白的核酸序列以及任选药学可接受的载体。本发明的药物组合物也包含至少一种附加药物，例如一种或多种用于治疗至少本文所述疾病之一的附加药物。

药学可接受的载体包括所有溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，只要这些是生理相容的。

药学可接受载体包括例如水、盐水溶液、磷酸盐缓冲的盐水溶液、乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。制剂也可包括药学可接受的载体或普通的辅料，例如润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和混悬剂；防腐剂，例如羟基苯甲酸甲酯和丙酯；抗氧化剂；抗-刺激物；螯合剂；包衣剂；乳液稳定剂；成膜剂；胶凝剂；遮味剂；芳香剂；树脂；水胶体；溶剂；增溶剂；中和剂；渗透促进剂；色素；季胺类化合物；增湿剂和软化剂；药膏、乳剂或油基质；硅酮衍生物；涂铺剂；稳定剂；杀菌剂；栓剂基质；压片辅料例如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或包衣；抛射剂；干燥剂；遮光剂；增稠剂；蜡；软化剂和白油。这一方面的设计基于本领域技术人员的知识，例如以下文献所述：Fiedler，H.P.，Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie，Kosmetik und angrenzende Gebiete[Lexicon of Adjuvants forPharmaceutical，Cosmetic，and Related Areas]，第4版，Aulendorf：ECV-Editio-Kantor-Verlag，1996.也可参见Hager’s Handbuch derPharmazeutischen Praxis[Hager’s Handbook of Pharmaceutical Practice]，Springer Verlag，Heidelberg。

药物组合物可适于例如肠胃外给药。对于这一目的，活性物质即抗体优选以活性物质浓度为0.1-250mg/mL的注射液形式制备。注射液可通过以液体或冻干形式提供于火石玻璃或管形瓶、安瓿或填充注射器中作为剂型。

缓冲液可包含L-组氨酸(1-50mM，优选5-10mM)并且pH为5.0-7.0，优选6.0。不受限于此，另外的适当缓冲液包括琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾缓冲液。

氯化钠可用于调节溶液的张力至0-300mM的浓度(对于液体剂型优选150mM)。低温保护剂例如蔗糖(例如0-10％，优选0.5-1.0％(w/w))可掺入冻干剂型中。其他适当的低温保护剂包括海藻糖和乳糖。填充剂例如甘露醇(例如，1-10％，优选2-4％(w/w))可掺入冻干剂型中。稳定剂例如L-蛋氨酸(例如，51-50mM，优选5-10mM)可用于液体剂型和冻干剂型中。其他适当的填充剂包括甘氨酸和精氨酸。也可使用表面活性剂，例如聚山梨酯80(例如，0-0.05％，优选0.005-0.01％(w/w))其他表面活性剂包括聚山梨酯20和Brij表面活性剂。

本发明组合物可采用多种形式。这些包括液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如注射液和可输注溶液、洗液、滴眼剂和滴耳剂)，脂质体，分散体或混悬液，以及固体形式例如膳(meals)、粉末、颗粒剂、片剂、锭剂、囊剂、扁囊剂、糖锭(dragées)，胶囊例如硬胶囊和软胶囊，栓剂或阴道给药形式，或半固体给药形式例如软膏(salves)、乳剂、水凝胶、糊剂或硬膏剂。植入式给药器也可用于给予本发明活性物质。优选形式取决于预期的给药形式和治疗应用。通常优选注射液或可输注溶液形式的组合物。一种适当的给药途径的实例为肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。根据一个优选的实施方案，活性物质通过静脉内输注或注射给予。根据另一优选的实施方案，活性物质通过肌肉内或皮下注射给予。

治疗性组合物通常必须为无菌的并且在生产和储存条件下稳定。组合物可配制成溶液、微乳剂、分散剂、脂质体结构或其他适于高活性物质浓度的有序结构的形式。无菌注射液是通过将必需量的活性化合物(例如抗体)加入适当的溶剂中(任选上文所列成分之一或组合)并接着进行无菌过滤制备。分散体通常是通过将活性化合物加入包含基础分散介质和任选其他必要成分的无菌容器中制备。当使用无菌冻干粉末制备无菌注射液时，真空干燥和喷雾干燥代表了从经过无菌过滤的溶液中获得活性成分和任选其他所需成分的粉末的优选生产方法。正确的溶液流动特性可通过采用包衣例如卵磷脂维持，对于分散体而言需保持所需粒径或使用表面活性剂。注射用组合物的延迟吸收可通过向组合物中加入延迟吸收的物质例如单硬脂酸盐和明胶达成。

本发明的活性物质可通过使用许多本领域技术人员已知的方法给予，尽管对于许多治疗性应用皮下注射、静脉内注射或输注代表了优选的给药类型。本领域技术人员了解给药途径和/或类型取决于所需结果。根据某些实施方案，可使用防止化合物快速降解的载体制备活性化合物，例如控释制剂，如，其包括埋植剂、经皮贴剂和微囊化递送系统。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，例如醋酸乙烯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。制备该类制剂的方法为本领域技术人员普遍已知；参见，例如，Sustained和Controlled ReleaseDrug Delivery Systems，J.R.Robinson，Ed.，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1978。

根据某些实施方案，本发明活性物质可在例如惰性稀释剂或可吸收的食用载体中口服给予。活性物质(和其他成分，如果需要)可装入硬胶囊或软胶囊中、压制成片或直接添加入食物中。对于口服治疗性给药，活性物质可与辅料混合并以咀嚼片、含化片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆等形式使用。如果本发明活性物质经肠胃外之外的途径给予，有必要从可防止该活性物质失活的材料中选择包衣。

本发明活性物质也可与一种或多种适用于治疗上述疾病的药物一起给予。

本发明的药物组合物一般包含治疗有效量或预防有效量的至少一种本发明活性物质。根据所需的治疗或需要治疗性还是预防性治疗选择和调整剂量方案。举例而言，可给予单次剂量、分布在一段时间内的数个分离剂量或不断增加或减少的剂量，这取决于治疗情况的要求。尤其适合配制单次-剂量形式的肠胃外组合物以简化给药并确保剂量的均一性。

主治医师可轻松确定最适合具体治疗和具体活性物质的给药形式、给药类型和剂量。

治疗或预防有效量的本发明活性物质可在例如0.1-20mg/kg的范围内，优选1-10mg/kg，并不受限于此。当然，这些量可根据预缓解病症的性质和严重程度而变化。

6.2疫苗

本发明RGM蛋白及其衍生物/等价物可用作接受治疗的患者接种的免疫原。

对于这一目的，适当的疫苗通常为包含至少一种本发明RGM蛋白和/或至少一种本发明其衍生物/等价物的药物组合物。该组合物也可包含生理可接受的载体并任选另包含佐剂，例如免疫刺激剂。

尽管理论上可如所需选择适当的载体，但是载体类型通常取决于给药途径。因此，本发明疫苗可特别配制成适于肠胃外例如静脉内、肌肉内和皮下给药的形式。在这些情况下，载体优选包含水、盐溶液、醇、脂肪、蜡和/或缓冲剂。

任何给定数量的免疫刺激剂可用于本发明疫苗中。举例而言，可加入佐剂。绝大部分的佐剂包含一种物质，例如氢氧化铝或矿物油以及衍生自脂质A、百日咳杆菌或结核分支杆菌的蛋白质，其经设计用于防止抗原被快速破坏。适当的佐剂通常可购买，例如完全或不完全弗氏佐剂；AS-2；铝盐，例如氢氧化铝(任选凝胶的形式)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性混悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；生物可降解微球或单磷酰脂质A。细胞因子例如GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可用作佐剂。

7.治疗方法

7.1神经疾病的治疗

从现有技术已知在中枢神经系统损伤中在损伤部位观察到RGM蛋白的积累(参见Schwab等，在上述引文中)。同时，这阻止了神经纤维的重新生长。在大鼠脊髓受损模型中用多克隆RGMA-特异性抗体中和RGM A引起再生和功能恢复(Hata K.等，J.Cell Biol.173：47-58，2006)。对神经纤维生长的破坏或抑制作用由RGM A与受体分子再生蛋白的结合介导(Conrad S.等，J.Biol.Chem.282：16423-16433，2007)。对RGM和受体分子再生蛋白之间相互作用的调节特别是抑制将因此适用于阻止RGM对神经纤维生长的抑制活性。

7.2肿瘤疾病的治疗

表明再生蛋白涉及肿瘤疾病病因学和/或进展的证据已获得了相当长的时间。例如，Meyerhardt等在Oncogene(1997)14，1129-1136中报导了可在多于五十种癌症细胞系中检测出再生蛋白，包括成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤和神经母细胞瘤细胞系，以及结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌和子宫颈癌的细胞系中。在食道癌中也观察到再生蛋白的过表达(Hue等，Clinical Cancer Research(2001)7，2213-2221)。近期对211名肺腺癌患者中3588个基因表达谱的系统分析提供了关于再生蛋白参与肿瘤疾病病因学和进展的更多信息(Berrar等，J.Comput.Biol.(2005)12(5)，534-544)。

因为也已知RGM具有潜在的肿瘤-促进作用因为它可以通过结合与肿瘤细胞相关的再生蛋白受体阻止细胞死亡(Matsunaga等，Nature Cell Biol.6，749-755，2004)，所以通过调节RGM-再生蛋白相互作用特别是通过使用特异抗-RGM抗体干扰相互作用可提供治疗肿瘤疾病的新治疗方法。

另一方面，活化再生蛋白受体的人RGM A蛋白片段可抑制肿瘤细胞迁移或再生蛋白-阳性肿瘤细胞的转移。这一肿瘤细胞迁移抑制可以与抑制神经纤维生长相似的方式发生。神经纤维也以侵袭方式增长，但是与肿瘤细胞相反通常为可控的侵袭性方式。近期在典型的何杰金氏淋巴瘤中鉴定hRGM A为潜在的候选肿瘤抑制剂(Feys等，Haematologica 2007，第92卷，913-20)支持了这一点。

7.3铁代谢疾病的治疗

RGM C也称作血幼素，对于人和动物体内的铁代谢至关重要。青少年血色病是一种遗传性、相对罕见的铁代谢病，其表现为生物体铁过载的形式。这一疾病由血幼素分子的突变引起(参见Huang等，The Journal of Clinical Investigation(2005)，115，2087-2091)。给予本发明功能性RGM蛋白或其活性结构域代表了缓解该铁代谢疾病的可行治疗方法。对于慢性疾病中的贫血，炎性或恶性进程引起某些细胞因子例如肿瘤坏死因子α的大量上调(Weiss M.D.和Goodnough，L.T.，New Engl.J.Med.352：1011-1022，2005)。这些细胞因子是最重要的铁代谢调节剂即肽激素hepcidin的强效诱导剂并且hepcidin的过量产生或积累被认为是慢性疾病中贫血发病机制的重要原因。近期在小鼠中的体内研究数据表明Fc-缀合RGM C(Fc血幼素)抑制hepcidin表达并升高血清铁水平(Babitt，J.L.等，The Journal of Clinical Investigation，2007，第117卷，7，1933-1939)。RGM蛋白与BMP蛋白的相互作用是这一调节的重要因子(Babitt，J.L.等，Nature Genetics，2006，第48卷，5，531-539)。Fc-缀合RGM C或Fc-缀合RGM C片段、RGM A或[RGM]B(与BMP蛋白相互作用)可因此用作治疗慢性疾病贫血的治疗药物。

7.4促进骨组织形成

从现有技术可到以下信息：RGM蛋白质家族的成员即RGM B(也称作DRAGON)参与骨形态发生。例如Samad等在JBC Papers2005，第280卷，14122-14129中描述了DRAGON与I型和II型骨形态发生蛋白(BMP)受体之间的相互作用。因此可通过给予本发明RGM多肽设想骨生长促进作用以及治疗骨生长疾病或骨损伤的新颖治疗方法。所有三种RGM蛋白(RGM A、B、C)与BMP家族的各个成员相互作用并增加BMP信号途径的活化(Babitt，J.L.等，NatureGenetics，2006，第48卷，5，531-539；Babitt，J.L.等，J.Biol.Chem.，2005，第280卷，33，29820-29827；Babitt，J.L.等，The Journal of ClinicalInvestigation，2007，第117卷，7，1933-1939；Samad，T.A.等，J.Biol.Chem.，2005，第280卷.14，14122-14129；Halbrooks等，J.MolecularSignaling 2，4：2007(以电子形式出版))。

7.5治疗自身免疫疾病

在以下出版物中可发现本发明活性物质可用于治疗自身免疫疾病的指示：Urist等，Prog.Clin.Biol.Res.1985，第187卷：77-96；Lories和Luyten，Cytokine & Growth Factor Reviews 2005，第16卷，287-298。

8.诊断方法

本发明RGM蛋白和衍生物/等价物以及抗它们的抗体特别称作本发明的诊断药物。

本发明因此使得通过检测这些疾病典型的抗原或抗体改进上文定义的医学病症的定性或定量测定成为可能。

该测定优选采用免疫学方法进行。原理上，可采用任何使用抗体的分析或诊断检测法完成。这些包括凝集和沉淀技术、免疫测定法、免疫组织化学法和免疫印迹技术，例如蛋白质印迹法或斑点印迹法。也包括体内方法例如成像过程。

在免疫测定法中的用途是有利的。竞争性免疫测定法即抗原和标记抗原(示踪剂)竞争抗体结合，以及夹心免疫测定法即特异抗体与抗原的结合，使用通常被标记的第二抗体检测。这些测定法可为同质的，即不必分离至固相和液相中，和异质的，即结合标记与未结合标记分离，例如使用与固相结合的抗体。各种同质和异质免疫测定形式可指定到给定种类，这取决于标记和测定方法，例如放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、荧光免疫测定发(FIA)、发光免疫测定法(LIA)、时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)、免疫活化(IMAC)、酶倍增免疫测定法(EMIT)、比浊免疫测定法(TIA)和免疫-PCR(I-PCR)。

对于本发明的抗体测定优选竞争性免疫测定法。标记抗原(示踪剂)与待定量的相同抗原竞争结合所使用的抗体。样品中抗原的量即抗原量可使用标准曲线从被替换的示踪剂的量测定。

可用于这一目的标记中已证明酶是有利的。举例而言，可使用基于过氧化物酶尤其是辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和β-D-半乳糖苷酶的系统。可获得这些酶的特异底物，其反应可被例如光化学追踪。适当的底物系统是基于磷酸对硝基苯酯(PNPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)、用于碱性磷酸酶的Fast Red/萘酚AS-TS磷酸盐；2，2-叠氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPT)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、邻联二茴香胺、5-氨基水杨酸、3-二甲基氨基苯甲酸(DMAB)和用于过氧化酶的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)；邻-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)、间-硝基苯基-β-D-半乳糖苷和用于β-D-半乳糖苷酶的4-甲基伞形酮酰-β-D-半乳糖苷酸(MUG)。在许多情况下这些底物系统可以即用形式(例如药片形式)购买，其也可包含另外的试剂例如可用的缓冲剂等。

标记可与肽或抗体偶联以已知的方式照原样产生示踪剂。此外，许多标记已成功地经修饰用于结合至可用蛋白，所述标记例如生物素、卵白素、extravidin或链霉亲和素-缀合酶、马来酰亚胺-活化的酶等。这些标记可直接与用于本发明的分子反应。

如果选择异质免疫测定形式，对于分离目的，例如使用与载体偶联的抗-独特型抗体，例如抗兔IgG的抗体，抗原-抗体复合物可结合至底物。用对应的抗体包被的底物(特别是在微量滴定板中)为已知并可购买。

本发明的另一主题涉及包含至少一种上文所述抗体的免疫测定集合。这些集合为用于实施本发明测定的通常为包装单位形式的组件。这些物质优选以基本即用的形式提供以尽量简化操作。在一套有利的布置中，免疫测定法以试剂盒的形式提供。试剂盒通常包括若干容器用于分开提供各组分。所有的组分可以用于稀释的浓缩物或以用于溶解或混悬的冻干剂提供于即用的稀释液中；单个组分或所有组分可为冷冻的或储存于室温下直至使用。血清优选在例如-20℃速冻，这样在这些情况下免疫测定优选在使用之前必须保持于冰冻温度。

可包括在免疫测定中的附加组分包括以下物质：标准蛋白、示踪剂、对照血清、微量滴定板(优选用抗体包被)、缓冲液(例如用于检测、洗涤)，或反应底物和酶底物自身。

免疫测定法的一般原理和抗体的产生以及用作实验室和临床辅助物描述于例如Antibodies，A Laboratory Manual(Harlow，E.，andLane，D.，编辑，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1988)。

9.筛选方法

本发明的主题另涉及检测RGM受体(再生蛋白和/或BMP)效应子的方法，其中将疑似效应子的样品与RGM蛋白或多肽温育并且分析该测定中效应子-RGM蛋白复合物的形成。

该类效应子可具有激动、部分激动、拮抗或反向激动作用。这些可为合成的低分子量物质、合成肽、天然或合成的抗体分子或天然物质。

本发明该类方法通常以体外筛选过程进行，通过这一方式可从大量的各式各样的物质中分拣出最有希望用于将来使用的物质。

举例而言，通过使用组合化学可产生包含许多潜在活性物质的大容量物质库。从组合物质库中寻找具有所需活性的物质样品的过程可以自动化。使用筛选机器人有效评价单个测定法，其优选提供于微量滴定板上。因此，本发明也涉及筛选方法即第一和第二筛选方法二者，其中优选使用至少一种下文描述的方法。如果使用了数种方法，可在相同或不同时间对待分析物质的单个样品或许多样品应用这些方法。

实施该类方法的一个有效技术为闪烁亲近分析法或缩写为SPA，其在活性物质筛选领域为已知。用于实施这一测定法的试剂盒和组分可购买，例如可购自Amersham Pharmacia Biotech。该方法基于将增溶的或膜结合的受体固定化至包含闪烁物质的小荧光微球上的原理操作。如果例如放射性配体与固定化受体结合，闪烁物质被刺激发光，因为闪烁物质与放射配体的空间邻近度是特定的。

实施该方法的另一有效技术为

技术，其为活性物质筛选领域已知。进行这一测定法的试剂盒和组分可购买，例如购自NENLife Science Products。操作原理相似地基于用发光物质包被的微量滴定板(96-孔或384-孔)。

可使用这些方法鉴定的物质或物质混合物部分相似地为本发明主题。

参考以下非限制性产生和应用实施例更详细地描述本发明。

实验部分

1.一般操作

SDS聚丙酰胺凝胶电泳

蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶(4-20％ tris-甘氨酸凝胶1：Invitrogen  EC6025BOX；10-20％ Tricine  凝胶：Invitrogen#EC6625BOX)中根据它们的分子量被分离。将样品使用还原剂与NuPage SDS样品缓冲液(4x)混合。在Thermomixer中于95℃温育10分钟后，在125V使用tris-甘氨酸或Tricine SDS跑胶缓冲液(Invitrogen)分离样品。SeeBlue或SeeBlue Plus 2(Invitrogen)用作分子量标准蛋白。凝胶用考马斯染料染色或转移至硝酸纤维(硝酸纤维薄膜滤纸夹层(Invitrogen#LC2001))上。

考马斯染色

对于聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的检测，在跑胶结束后用考马斯染料将蛋白染色。在SimplyBlue Safestain染色液(Invitrogen)中在薄膜(0.2-μm孔)上或者在胶体考马斯染料(0.25％考马斯蓝R250/L、45％甲醇、10％乙酸)中将凝胶染色1小时。使用去离子水或脱色液(40％甲醇、10％乙酸)进行脱色直至蛋白条带清晰可见。

蛋白印迹法

用Novex转移缓冲液和20％甲醇将滤纸和硝酸纤维浸渍10分钟。在Novex室中于恒定电流下(100mA)室温杂交2小时。

点印迹法

将TTBS缓冲液中各个浓度的2μL蛋白点在干硝酸纤维膜上。采用下列稀释度：

稀释度：

a)100μg/mL≈200ng/点

b)50μg/mL≈100ng/点

c)10μg/mL≈20ng/点

d)5μg/mL≈10ng/点

e)1μg/mL≈2ng/点

f)500μg/mL≈1ng/点

点样后在进行免疫检测操作方案开始之前将膜于室温下干燥10分钟。

RGM A片段在HEK293F细胞中的转染和表达

将Invitrogen研发的用于转染HEK293F细胞的方案用于这一目的。将细胞在Free Style 293表达培养基中培养2-3天，接着400xg离心并弃去上清。细胞沉淀重悬于培养基中并调节成28mL新鲜培养基中3×10⁷细胞。将细胞沉淀转移至125-mL锥形瓶中并于37℃和8％CO₂在定轨摇床上150rpm温育。

含293fectin DNA复合物的转染混合物如下制备：

(1)用Opti-MEM I将30μg DNA稀释至总体积1000μL并混合(1000μL Opti-MEM I作为对照)。

(2)用Opti-MEM I将35μL 293fectin(Invitrogen #12347-019；1mL)稀释至总体积1000μL，混合，并于室温下温育5分钟。

(3)将步骤1的DNA混合物和293fectin溶液转移至新试管中并仔细混匀，室温下温育25分钟后加入锥形瓶中的细胞中。

如上所述在培养箱内于37℃，8％ CO₂，在定轨摇床上于150rpm将细胞与这一转染混合物温育40至48小时。400xg离心10分钟收获细胞上清。

使用Ni螯合亲和力(Ni-NTA)纯化蛋白

使用Ni-NTA Superflow小珠(Qiagen #1018611)。在经磷酸盐缓冲的盐水(PBS)溶液(Invitrogen)中通过13,500rpm离心小珠悬液将小珠洗涤3分钟。弃去上清，将小珠重悬于新鲜的PBS中。将200μL小珠悬液用于30mL细胞培养物上清。于4℃在摇床上(60rpm)将小珠与细胞培养物上清温育过夜，温育后离心(10分钟，3000rpm)使小珠沉淀，用PBS洗涤小珠三次。用250μL洗脱缓冲液(PBS、160mMNaCl、150mM咪唑)从小珠上洗脱结合蛋白。在摇床上于室温下温育30分钟后离心(3分钟，13,500rpm)沉淀小珠。收集上清。将洗脱蛋白-20℃冷冻用于进一步分析。

免疫检测

对于硝酸纤维上固定化蛋白的免疫检测，通过在TTBS (0.1％Tween 20、tris-缓冲的盐水溶液(TBS))中于室温下或4℃将印迹温育1小时封闭蛋白的非特异性结合。以TTBS中10μg/mL的浓度在室温下使用一抗2小时。在TTBS中将印迹洗涤三次并在TTBS中用二抗(碱性磷酸酶-缀合的抗-小鼠IgG-抗体；Sigma)以1∶5000稀释，接着于室温下温育1小时。印迹在TTBS中洗涤三次并通过用染色液将印迹覆盖用AP底物NBT/BCIP(Roche，1片溶于10mL纯化水中)显色3分钟。通过向印迹加入纯化水终止染色反应。

检测方法1：使用SH-SY5Y细胞，证明RGM肽在神经突生长中的作用

SH-SY5Y细胞为人神经母细胞瘤细胞。母细胞瘤是产生于组织和器官形成中的胚胎瘤。母细胞瘤细胞的来源经常是未知的，因为在早期胚胎状态下许多细胞的分化仍不成熟，即母细胞瘤细胞是异源细胞群。神经母细胞瘤细胞，称作成神经细胞，源自自主神经组织的神经嵴(胚胎状态的结构)并在未成熟阶段停止。本案中的细胞源自神经上皮细胞系SK-N-SH的克隆继代培养，该细胞系于1970年分离自患神经母细胞瘤转移的4岁女孩的骨髓活检中。

[http://www.dsmz.de/human_and_animal_cell_lines]

SH-SY5Y细胞(ECACC No.94030304)培养基

250mL	50％EBSS(Invitrogen)
		250mL	50％F12(Ham)NUT MIX+Glutamax I
	(Invitrogen)
		50mL	10％FBS(JRH Biosciences)(热灭活)
5mL	1％NEAA(Sigma)(100x)
		5mL	1％青霉素/链霉素(Invitrogen)

使用Nunc 500-mL滤器将培养基无菌过滤，并于冰箱4℃保存备用。使用前将培养基水浴加热至37℃。

SH-SY5Y细胞为上皮、神经元样细胞，其可缓慢黏附性生长在单层中并从不达到100％(最高80％)汇合。细胞培养物每周按1∶3分传。细胞分离需要在培养箱中与胰蛋白酶温育1-3分钟。

因为这是仍未成熟的前体细胞群，有可能使用维甲酸使细胞分化，这样一部分细胞获得神经突-样扩展。对于这一目的，将培养物在含有10μM维甲酸的培养基中直接在培养皿或烧瓶(取决于检测)中温育3天。

另用hRGM A片段包被微量滴定板(96-孔)(包含胶原-I包被的板)。用PBS洗涤两次后接种细胞。18-24小时后固定培养物并染色。在定量分析中将生长在hRGMA片段上的SH-SY5Y细胞与仅生长在胶原-I上的SH-SY5Y比较。可自动检测细胞的神经突长度并用于分析。

检测方法2：使用NTera-2细胞，证明RGM肽在神经突生长检测中的作用

建立人多潜能癌细胞系NTera2(DSMZ ACC527)作为细胞培养物模型。神经突从细胞团块和具体团块周围的神经突放射冠生长出来

NTera-2细胞为人胚胎畸胎癌细胞。癌瘤是癌性肿瘤，而畸胎瘤或畸胎癌是胚细胞的混合肿瘤，其由各种分化的和未分化的组织组成，因此和SH-SY5Y培养物一样包含异源群。肿瘤通常以各种类型的被包裹形式存在，例如毛发、皮肤、牙齿、肌肉和神经组织。肿瘤通常起源于卵巢、睾丸、腹腔或大脑。该细胞系克隆自Tera-2系，其获自22岁男性高加索人的转移性畸胎癌。

[http://de.wikipedia.org/wiki/]

[http://www.dsmz.de/human_and_animal_cell_lines]

NTera-2细胞为上皮的、黏附性生长的细胞，其可形成单层。由于它们所包含的大量颗粒，NTera-2细胞很容易与其他细胞区分开来。每两周1∶5分传培养细胞。可在神经元细胞中使用维甲酸使这一混合培养物的细胞分化。

生长培养基

500mL	Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)
		50mL	10％FBS(热灭活)
10mL	5％马血清(HS)(热灭活)

使用Nunc 500-mL滤器将培养基无菌过滤，并于冰箱4℃保存。使用前将培养基水浴加热至37℃。

NTera-2的分化

为了使细胞分化，有必要向细胞系的培养基中加入抗生素，因为细胞在相同的培养瓶中保持三周。之前已将未分化的培养物脱胰蛋白酶并采用Neubauer计数器测定细胞计数。将250万细胞和25mL培养基一起转移至新的培养瓶中。在暗光条件下向培养基中再次加入25μL维甲酸(10μM)。将培养物以等分试样形式(10M)保存于冰箱中并在使用前于22℃在Thermomixer中重悬。

分化培养基

500mL	Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)
		50mL	10％FBS(热灭活)
10mL	5％马血清(HS)(热灭活)
		5mL	1％青霉素/链霉素

将培养物37℃、5％CO₂通气保存于培养箱中，在一周的开始和结束时更换培养基。一段时间后细胞不再以单层形式生长，而是形成细胞团块的小堆，看上去(不需光学显微镜的辅助)就像细胞层上的亮点。对于进一步培养，通过吸去旧培养基更换培养基，用10mL PBS洗涤，接着向维甲酸中加入25mL新鲜培养基。三周后细胞分化并可用于试验。

NTera-2的板包被

通过用多聚-L-赖氨酸/层粘连蛋白包被辅助NTera-2在培养皿底部的生长。

这些检测使用不同的板格式。对于蛋白质分离，有必要使用6-孔板回收足够的量。对于RNA分离和免疫荧光，24-孔板足够使用，但是该测定法主要建立在96-孔板中。对应于孔的容量使用不同体积的包被和洗涤，如下表所示。

首先将多聚-L-赖氨酸溶液(100μg/mL)置于孔中并室温下温育15分钟。接着吸去溶液，并用PBS将孔洗涤3遍，持续5-10分钟。然后使用无菌Millipore水进行洗涤步骤。

洗涤后向孔中用移液枪加入层粘连蛋白溶液(20μg/mL)，板子在培养箱中于37℃、5％CO₂通气温育2小时。再次用PBS进行洗涤三次，持续5-10分钟，最后用含有或不含青霉素/链霉素的神经基质培养基替换PBS。

板子类型	聚-L-赖氨酸或层粘连蛋白	PBS
			6-孔	1mL	2mL
24-孔	250μL	500μL
			24-孔+玻璃板	350μL	500μL
96-孔	50μL	100μL

使用NTera-2的神经突外生长

分化3周后，将培养物1∶6分传至6个培养瓶中以筛选神经元细胞。这时培养基不再与维甲酸混合。在之后的两天内[和]在第三天收获细胞，神经元细胞优选沉淀在其他非神经元细胞上但是没有很强烈的黏附，这样可容易地敲除顶层。对于这一目的，去除培养基并用约10mLPBS洗涤，并向培养瓶中再加入10mL PBS。细胞逐渐与基质分离同时在侧面轻敲培养瓶。但是，因为非神经元细胞应该保持黏附，有时需在光学显微镜下进行目测。神经元细胞通过它们发亮的边缘和非常圆的形状得以鉴别。如果神经元细胞长得太牢固，它们在敲除后会保留神经突较短的时间。将三个培养瓶中的PBS-细胞溶液混合在50-mL的离心管中，细胞于室温下1000rpm离心5分钟。将上清吸入两个试管中，沉淀重悬于10mL神经基质培养基中，即合并于10mL中。使用Neubauer计数器测定细胞计数。神经基质培养基是用于进一步培养已分化NTera-2细胞的专门培养基。

培养基

100mL	神经基质培养基1)
		2mL	2％B27添加剂
1mL	1％2mM L-谷氨酰胺
		1mL	1％青霉素/链霉素

¹⁾神经基质培养基(Gibco/Invitrogen 21103-049)

使用已分化NTera-2的团块形成

对于细胞团块的形成，在细胞计数测定之后用神经基质培养基稀释溶解于神经基质培养基中的敲除的已分化细胞(见之前部分)至约1百万细胞/mL的浓度。将20mL这一细胞悬液转移至无菌的100-mL一次性摇瓶中并在培养箱中于37℃、5％CO₂通气和恒速振荡下温育过夜。体积不超过20mL是重要的，因为否则不会出现液体旋转并且细胞不会形成令人满意的团块。

用多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的96-孔板另用hRGM A片段包被。用PBS洗涤两次后接种NTera团块。18-24小时之后将培养物固定并染色。在定量分析中，比较生长在hRGM A片段上的NTera团块和仅生长在多聚赖氨酸/层粘连蛋白上的NTera团块。NTera团块的神经突长度根据Lingor等(J.Neurochem，2007，以电子形式出版)的方法可自动测定。

通过加入不同浓度的待测物质分析RGM肽和片段的抑制作用。或者提供RGM片段作为底物。

检测方法3：RGMA-再生蛋白结合实验检测

a)材料：

酶标板：Cert.MaxiSorp F96(Nunc，439454)

重组人RGM A，R&D Systems；Prod.#2495-RM(260μg/mL)

重组人再生蛋白-Fc，Abbott；Ludwigshafen(ALU 1514/122；425μg/mL)

过氧化物酶-缀合的，经亲和纯化的小鼠抗-人IgG-Fc片段AK

(Jackson Immuno Research，Code：209-035-098(0.8mg/mL))

显色底物：ImmunoPure TMB底物试剂盒(Pierce，#34021)

硫酸(Merck#4.80354.1000)

b)方法

1.RGM A结合至酶标板：

·50mM Na₂CO₃(50μL/孔)中2.5μg/mL RGM A(R&D)

·37℃温育1小时

2.洗涤步骤：

·用PBS/0.02％Tween 20(100μL/孔)洗涤三次

3.非特异性结合部位的封闭

·用3％BSA的PBS/0.02％Tween(200μL/孔)溶液封闭

·37℃温育1小时

4.再生蛋白结合：

·加入再生蛋白的1％BSA PBS/0.02％ Tween稀释液(起始浓度1μg/mL)

·37℃温育1小时

5.洗涤步骤：

·用PBS/0.02％Tween 20(100μL/孔)洗涤三次

6.结合再生蛋白的抗体检测：

·加入HRP-偶联小鼠抗-人IgG-Fc片段AK(1∶2500稀释于PBS/1％BSA)(50μL/孔)

·37℃温育1小时

7.洗涤步骤：

·用PBS/0.02％Tween 20(100μL/孔)洗涤三次

8.显色

·加入50μL显色底物/孔(ImmunoPure TMB底物，Pierce)

·室温下温育1-30分钟

·用50μL 2.5M H₂SO₄/孔终止反应

检测方法4：用于测定RGMA与BMP-2和4之间相互作用的体外相互作用检测

按照以下所述进行相互作用检测：

变型A：BMP-2/或-4蛋白质的固定化以及各种RGMA-Fc融合蛋白结合的检测

1.板：

·酶标板Cert.MaxiSorp F96(Nunc，439454)

2.包被：

重组人BMP-2，目录号：355-BM，公司：R&D Systems；

重组人RGM A，R&D Systems；Prod.#2495-RM，或

重组人BMP-4，目录号：314-BM，公司：R&D Systems；

·浓度：10μg/mL

·使用体积：Na₂CO₃中2.5μg/mL；加样：每孔50μL

·恒湿箱中37℃1小时

3.洗涤步骤：

·用PBS/0.02％Tween 20(100μL/孔)洗涤三次

4.封闭：

·3％BSA的PBS/0.02％Tween溶液，恒湿箱中37℃1小时；加样：每孔200μL

5.RGMA肽：

RGMA-Fc片段，

·起始浓度1μg/mL，然后用PBS/0.02％Tween20稀释至1∶2

·室温下温育1小时

·恒湿箱中37℃1小时

6.洗涤步骤

·用PBS/0.02％Tween 20洗涤三次

7.抗体：

生物素抗-人Fc(R&D-Systems)，目录号：709065；1mg/mL；

·0.6％BAS/PBS-T(0.02％Tween)中1∶200稀释

·加样：每孔50μL

·恒湿箱中37℃1小时

8.二抗：Strep.POD(Roche)；目录号：11089153001

·500U；0.6％BAS/PBS-T(0.02％Tween)中1∶5000稀释

·加样：每孔50μL

·恒湿箱中37℃1小时

9.洗涤步骤：

·用PBS/0.02％Tween 20洗涤三次

10.底物：

·ImmunoPure TMB底物试剂盒；Pierce，#34021

·显色时间：约1-30分钟

·与PBS/0.02％Tween 20 1∶1混合；加样：每孔50μL

11.终止：

·2.5M H₂SO₄；加样：每孔50μL

变型B：各种RGMA-Fc融合蛋白的固定化和BMP-2/或-4蛋白结合的检测

1.板：

酶标板Cert.MaxiSorp F96(Nunc，439454)

2.包被：

RGMA-Fc片段

·使用体积：Na₂CO溶液中2.5μg/mL；加样：每孔50μL

·恒湿箱中37℃1小时

3.洗涤步骤：

·用PBS/0.02％Tween 20洗涤三次

4.封闭：

·3％BSA的PBS/0.02％Tween溶液，恒湿箱中37℃1小时

·加样：每孔200μL，温育：恒湿箱中37℃1小时

5.BMP肽：

重组人BMP-2，目录号：355-BM，公司：R&D Systems；或

重组人RGM A，R&D Systems；Prod.#2495-RM，

重组人BMP-4，目录号：314-BM，公司：R&D Systems；

各种情况下的浓度：10μg/mL

稀释步骤：各种情况下用PBS/0.02％Tween 20 1∶2稀释

6.洗涤步骤

·用PBS/0.02％Tween 20洗涤三次

7.抗体：

抗-人BMP-4生物素抗体；目录号：BAM7572，1％ BSA-PBS-T中1∶200稀释

8.洗涤步骤：

·用PBS/0.02％Tween 20洗涤三次

9.二抗：

Strep.POD(Roche)

目录号：11089153001；500U；0.6％ BAS/PBS-T(0.02％ Tween)中1∶5000稀释

·加样：每孔50μL

·恒湿箱中37℃1小时

10.洗涤步骤：

·用PBS/0.02％ Tween 20洗涤三次

11.底物：

ImmunoPure TMB底物试剂盒；(Pierce，#34021)

·显色时间：约1-30分钟

·与PBS/0.02％Tween 20 1∶1混合；加样：每孔50μL

12.终止：

·2.5M H₂SO₄；加样：每孔50μL

变型C：MAB4A9对全长人RGM A与BMP-4结合的抑制

1.板：Immuno Plate Cert.Maxi Sorp F96(Fa.NUNC，439454)

2.包被：

重组人BMP-4目录号：314-BP

来源：R&D Systems

浓度：10μg/ml

使用体积：Na₂CO₃中2.5μg/ml/每孔50μL

恒湿箱中37℃1小时

3.洗涤：

PBS/0.02％Tween20洗涤3次

4.封闭：3％BSA的PBS/0.02％ Tween溶液，恒湿箱中37℃1小时，每孔200μL

5.hRGMA：

#788 RGMA(47-422)290μg/ml

ALU 2821/117 11.12.07 片段0.5μg/ml恒定(50μl)

+

MAB4A9 起始浓度：10μg/ml，_1∶2稀释(50μl)

6.洗涤：PBS/0.02％Tween20洗涤3次

7.第一检测抗体：

生物素抗-人Fc 1mg/ml

Jackson Immuno Research(Catno.：709-065-149)

1∶1000稀释于1.5％BSA/PBS-T中，每孔75μl

恒湿箱中37℃1小时

8.洗涤：PBS/0.02％Tween20洗涤3次

9.第二检测工具：

链霉亲和素-偶联的过氧化物酶(Roche)

目录号：11089153001，500U

1∶5000稀释于1.5％BSA/PBS-T(0.02％Tween)中

每孔75μl

恒湿箱中37℃1小时

10.洗涤：3x PBS/0.02％Tween20

11.底物：Immuno Pure TMB底物试剂盒(Pierce，#34021)

显色时间：1-30分钟1∶1混合

12.终止：2.5M H₂SO₄

2.生产实施例

生产实施例1：在哺乳动物细胞中产生RGMA蛋白

为了表征活性RGM A，在哺乳动物细胞(HEK293)中以Fc融合蛋白形式表达以下RGM A分子：

-41-168/Xa

-47-90

-47-168

-316-386

-1-450

对于这一目的，克隆编码具体分子至载体pcDNA3.1(+)ZeoIgK/Xa/hIgG lambda hc 257-终止)x HindIII/EcoRI/磷酸酶(Invitrogen)的DNA。为此，采用PCR从RZPD克隆(克隆AL136826(DKFZp434D0727)；公开的RZPD序列：BC015886，AL136826)中扩增编码具体片段区域的DNA。对于这一目的，使用衍生自公开RGMA序列(公开序列：NM_020211)的下文所列寡核苷酸引物。

在各情况下使用这些引物和AccuPrime聚合酶在上文提及的RZPD克隆pSport-1 DKFZp434D0727上进行PCR。纯化PCR产物后用HindIII/EcoRI消化，洗脱所得条带，将所需片段连接至pcDNA3.1(+)Zeo IgK/Xa/hIgG lambda hc 257-终止)x HindIII/EcoRI/磷酸酶。使用所得产物转化NEBTurbo细胞(Invitrogen)或TOP10细胞(Invitrogen)。通过测序检测所得克隆的获得序列的正确性。

41-168/Xa：

AM 131：GGGGAAGCTTTTCCCCGCAGCCACCTCC(SEQ ID NO：17)

(从氨基酸开始的hRGMA有义引物)；具有HindIII区段的F41

AM132：

GGGGGAATTCAA

TGTCCCCGAAGAGGCCACAGTG

(SEQ ID NO：18)

hRGMA反义引物直至具有

和EcoRI界面的氨基酸D168

转化至NEBTurbo细胞

质粒名称：pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGMA 41-168/Xa/Xa/hIgGlambda hc 257-终止(无att)

47-90：

AM 169：GGGGAAGCTTCCGTGCAAGATCCTCAAGTGCAAC(SEQ IDNO：19)

从氨基酸P47开始的具有HindIII区段的hRGMA有义引物

AM 171：CCCCGAATTCAAGGCCGTCCGCCGCG(SEQ ID NO：20)

hRGMA反义引物直至具有EcoRI界面的氨基酸A90

转化至TOP10细胞，Laboratory journal ALU2163/5

质粒名称：pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGMA 47-90/Xa/hIgG lambdahc 257-终止(无att)

47-168：

AM 169：GGGGAAGCTTCCGTGCAAGATCCTCAAGTGCAAC(SEQ IDNO：19)

从氨基酸P47开始的具有HindIII区段的hRGMA有义引物

AM 175：CCCCGAATTCAAGTCCCCGAAGAGGCCACAGTG(SEQ IDNO：21)

hRGMA反义引物直至具有EcoRI界面的氨基酸D168

转化至TOP10细胞，

质粒名称：pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGMA 47-168/Xa/hIgGlambda hc 257-终止(无att)

316-386：

AM 181：GGGGAAGCTTCTGCGGGGCTGCCCCC(SEQ ID NO：22)

从氨基酸L316开始的具有HindIII区段的hRGMA有义引物

AM 182：CCCCGAATTCAAGCCCGTGGTGAGGAGGTCG(SEQ ID NO：23)

hRGMA反义引物直至具有EcoRI界面的氨基酸G386

转化至TOP10细胞，

质粒名称：pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGMA 166-386/Xa/hIgGlambda hc 257-终止(无att)

1-450：

Mey 744：ATGCAGCCGCCAAGGGAGAG(SEQ ID NO：24)

具有起始ATG的hRGMA引物

Mey 745：GCAGAACACAGGGAGCAGGGC(SEQ ID NO：25)

hRGMA反义引物直至氨基酸C450没有终止

为了比较的目的，使用另外的RGMA以相似方式产生以下Fc融合蛋白，它们的产生不再单独描述：

-266-284

-70-120

-110-169

-169-422

-266-335

-47-422Myc His

用这些质粒转染HEK293F细胞(DSMZ No.ACC 305)并如上所述分离表达的融合蛋白。

采用上文描述的方法进行蛋白质分析和浓度测定。

3.操作实施例

操作实施例1：采用BMP-4的体外相互作用测定；将各种RGMA片段与RGMA进行比较

待测融合蛋白

RGMA-Fc

47-168-Fc  (“片段0”)

218-284-Fc (“片段2”)

266-335-Fc (“片段3”)

169-422-Fc (“片段6”)

根据上文检测方法4变型B用融合蛋白(1mg/mL)的固定化进行检测。使用抗-BMP-4生物素抗体检测BMP-4的结合。

结果图解于图3。观察到BMP-4与RGMA的显著结合以及与47-168片段令人惊奇的更显著结合。

操作实施例2：采用BMP-4和BMP-2的体外相互作用测定法；

比较RGMA片段47-168和RGMA

待测融合蛋白：

RGMA-Fc

47-168-Fc(“片段0”)

根据上文检测方法4变型B用融合蛋白(1mg/mL)的固定化进行检测。使用抗-BMP-4和抗-BMP-2生物素抗体分别检测BMP-4和-2结合。

结果图解于图4。观察到BMP-4和-2与RGMA的显著结合以及与47-168片段令人惊奇的更显著结合。BMP-2和4在各种情况下结合强度大约相等。

操作实施例3：采用BMP-4的体外相互作用；比较各种RGMA片段

待测融合蛋白：

47-90-Fc     (#785)

47-168-Fc    (#786)

316-386-Fc   (#790)

169-422-Fc   (#769)

70-120-Fc    (#779)

110-169-Fc   (#780)

266-335-Fc   (#789)

47-422Myc-HIS(#801)

根据上文检测方法4变型B用BMP-4(1mg/mL)的固定化进行检测。使用抗-人-Fc或抗-Myc抗-兔(Invitrogen)抗体检测融合蛋白的结合。

结果显示于附图5。

观察到本发明片段#785、#786和#790的显著浓度依赖型结合，其中#786结合最强烈。

操作实施例4：采用BMP-4的体外相互作用检测；比较各种结合RGMA片段

待测融合蛋白：

47-90-Fc   (#785)

47-168-Fc  (#786)

316-386-Fc (#790)

根据上文检测方法4变型A用BMP-4(1mg/mL)固定化进行检测。使用抗-人-抗体检测融合蛋白的结合。

结果显示于图6A、B和C。这些结果确证了示例性实施方案3的发现。

操作实施例5：在神经纤维生长检测中研究合成RGMA片段

以下列出RGMA片段

47-168-Fc  (#786)

316-386-Fc (#790)，

根据生产实施例1产生，在神经突生长检测(见上文的检测方法1和2)中使用人NTera神经细胞或人SH-SY5Y细胞检测抑制活性。结果显示于图7A(SH-SY5Y)和7B(NTera)。

47-168-Fc(#786)显示出显著更高的活性。

明确参考本说明书部分所引用文件的公开内容。

操作实施例6：单克隆抗体4A9结合至hRGMA片段47-168的生成和表征

除非另外表明，采用抗体产生和表征的标准方法。

a)生成和免疫印迹法

用全长人RGMA蛋白免疫大鼠。

Sprague-Dawley大鼠用人RGM A皮下免疫和强化。动物每三周接受注射，从首次注射完全弗氏佐剂中25μg剂量开始，强化注射不完全弗氏佐剂中25μg剂量。在融合前四天给选择用于融合的大鼠皮下注射25μghRGM A的盐水溶液。去除被免疫动物的脾并制备单细胞悬液。从培养物中收获SP2/0骨髓瘤细胞并洗涤。脾细胞和肿瘤细胞以5∶1的比例混合并使用50％PEG 3000采用标准技术(Kohler andMilstein，1975)融合。已融合细胞以2.5×10⁵个脾细胞每孔的密度接种于96孔板的选择性培养基中。融合细胞于37℃温育7-10天。当观察到肉眼可见的克隆时，去除上清并在hRGMAELISA中检测。

通过有限稀释法亚克隆产生具所需特性的mABs的杂交瘤。通过ELISA和FACs采用hRGM A转染的HEK293细胞测定含亚克隆上清与hRGM A的结合。

用全长人RGM A及其片段筛选杂交瘤后，分离MAB 4F9，因为其可在蛋白质印迹(图8A)中识别片段47-168(泳道5)。这一抗体阻断了BMP-4和全长人RGM A在固相ELISA测定法中的相互作用(图8B)。

b)4A9的表位作图

抗体固定化

为了精确地描述MAB 4A9的表位，进行表位作图试验。为此，使4A9结合至CNBr-活化的Seharose树脂。将约5-6nmol 4A9溶液(5.76mg/ml，141μl)加入缓冲液A(100mM NaHCO₃、500mM NaCl、pH 8)中的20mg Sepharose树脂并于室温下混合4小时。用缓冲液B(100mM NaHCO₃、100mM NaCl、pH 8)洗涤抗体结合树脂三次后，向200μl缓冲液B中的树脂加入hRGMA片段47-168fc(1.18mg/ml，1.5nmol)。将混合物在摇床上4℃温育过夜。用缓冲液B洗涤含抗体4A9和抗原hRGM A47-168的树脂并用于用胰蛋白酶切除表位。

表位切除

为达到这一目的，将含MAB的树脂和抗原悬浮于200μl缓冲液B中。将20μg胰蛋白酶(Promega，Madison WI)溶解于200μl重悬缓冲液(50mM HOAc)中，浓度为0.1μg/μl。用1∶100和1∶200(w/w)的酶：抗原比例分别使用0.6μg和0.35μg胰蛋白酶进行抗原裂解。反应在GC烘箱中于37℃旋转进行7.5小时。消化后，用缓冲液B洗涤树脂两次。

表位释放

通过用三个200μl 2％甲酸的等分试样洗涤树脂释放仍然结合MAB的剩余抗体肽，各洗脱流分单独收集(洗脱1、2和3)。洗脱流分预计包含组成MAB 4A9表位的肽。

通过质谱(MS)进行肽分析

脱盐后，将从胰蛋白酶消化洗脱的流分进行质谱分析。在VoyagerDE-Pro(Applied Biosystems，Foster City，CA)上使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)基质(50％乙腈中饱和的、0.3％TFA)进行基质辅助激光解吸电离(MALDI)MS。使用Agilent 6510 QTOF MS进行LC-ESI-MS/MS。进样8μl，在满足特定MS信号标准的前三个离子上进行MS/MS。使用MASCOT(Matrix Science)搜索数据，但是绝大多数的数据为人工解释。

尽管通过LC-MS/MS最初分析了所有的洗涤和洗脱流分并且许多通过MALDI-MS进行分析，但是所得数据对应于洗脱1流分。

结果：

在胰蛋白酶表位剪切试验的洗脱1流分中鉴定出hRGM A片段47-168的肽50-89和96-126。MAB 4A9肽在人RGM A中的定位如下所示。hRGM A的片段47-168以粗体表示。鉴定为MAB 4A9保护肽的两个肽加下划线。精确的表位可能位于这些肽之一中，另一个肽通过二硫键连接。

＞hRGMA-NP_064596

MQPPRERLVVTGRAGWMGMGRGAGRSALGFWPTLAFLLCSFPAATSPC KILKCNSEFWSATSGSHAPASDDTPEFCAALRSYALCTRRTARTCRGDLAY HSAVHGIEDLMSQHNCSKDGPTSQPRLRTLPPAGDSQERSDSPEICHYEKSFHKHSATPNYTHCGLFGDPHLRTFTDRFQTCKVQGAWPLIDNNYLNVQATNTPVLPGSAATATSKLTIIFKNFQECVDQKVYQAEMDELPAAFVDGSKNGGDKHGANSLKITEKVSGQHVEIQAKYIGTTIVVRQVGRYLTFAVRMPEEVVNAVEDWDSQGLYLCLRGCPLNQQIDFQAFHTNAEGTGARRLAAASPAPTAPETFPYETAVAKCKEKLPVEDLYYQACVFDLLTTGDVNFTLAAYYALEDVKMLHSNKDKLHLYERTRDLPGRAAAGLPLAPRPLLGALVPLLALLPVFC

c)通过肽扫描进行表位作图

采用巢式重叠肽(长度为15个氨基酸跨越51-168区域)鉴定MAB 4A9的表位。通过ELISA评价肽结合，为此，用这些肽包被聚苯乙烯板。接着用MAB 4A9探测肽并通过ELISA使用过氧化物酶-缀合抗大鼠-fc抗体和TMB底物将结合可视化。

观察到MAB 4A9的一个反应性肽，这一肽如下所示。

51LKCNSEFWSA TSGSHAPASD DTPEFCAALR SYALCTRRTARTCRGDLAYH SAVHGIEDLM SQHNCSKDGP TSQPRLRTLP PAGDSQERSDSPEICHYEKS FHKHSATPNY THCGLFGD 168

MAB 4A9结合以粗体加下划线的字母突出表示的肽。该肽位于氨基酸66-80内并与通过表位剪切和质谱分析鉴定的肽之一很好地契合。

操作实施例7：采用BRE-Luc测定法评价h RMGA对BMP信号转导的激动或拮抗作用

a)材料：

·以200μg/ml提供三种化合物。

片段#785；

片段#786和

片段#788(IgK/hRGM A47-422/Xa剪切位点/Fc)

·重组h BMP-2(来自CHO cells；#355-BM)和单克隆抗-人BMP2/4抗体(#MAB3552)获自R&D Systems Europe，Lille，France

·Bright-Glo Luciferase检测试剂盒购自Promega。

b)细胞培养

将BMP-响应性C3H10-B12(Logeart-Avramoglou D，BourguignonM，Oudina K，Ten Dijke P，Petite H.An assay for the determination ofbiologically active bone morphogenetic proteins using cells transfectedwith an inhibitor of differentiation promoter-luciferase construct(一种使用分化启动子-荧光素酶构建体转染的细胞测定生物活性骨形态发生蛋白的测定法).Anal Biochem 2006；349：78-86)以4×10⁴个细胞/cm²的密度接种至96-孔板并在BME(BME＝Eagle’s Basal Medium)(添加10％FBS)中于加湿、37℃、5％ CO₂/95％空气的环境下培养24小时。用PBS冲洗细胞两遍并在检测所包含荧光酶活性前在BME/0.5％(w/v)BSA中培养24小时，其包含各待测AS化合物或包含抗-rhBMP2/4抗体(从0.01至10000ng/ml)，含有或不含rhBMP-2(50ng/ml)。所有试验一式三份并在两个不同的时间重复。

c)结果：

在固相ELISA试验中，MAB 4A9完全阻止全长人RGM A与BMP-4的结合，这形成了一个明显的实例，即位于人RGM A片段的47-168中4A9的结构域对与BMP-4的相互作用是重要的。

在细胞测定法中，用rhBMP-2以不同浓度(从0至50ng/ml)处理C3H-B12后得到的荧光酶活性剂量依赖型响应显示于图9。

采用BRE-Luc测定法通过暴露C3H-B12于不同浓度的待测化合物24小时并检测各自细胞荧光酶活性(图10)的变化来测定待测多肽对BMP信号转导的激动作用。三个待测化合物中的任何一个均可独立诱导荧光酶活性。

当与rhBMP-2(50ng/ml)组合时，片段#785不能显著改变BMP-2诱导的荧光酶活性。相反，片段#786和#788显示出对荧光酶活性的剂量依赖型抑制，当以10μg/ml使用化合物时对rhBMP-2-诱导活性的抑制达到88％和93％。片段#786和#788与用作BMP-2拮抗剂对照的抗-rhBMP-2抗体相比显示相似的抑制作用。片段#786和#788以及抗-BMP-2Ab 50％抑制(ED50)值的等价剂量分别为100ng/ml、～80ng/ml和～50ng/ml。

d)推论：

待测化合物自身不诱导BMP信号转导途径，因此不认为是BMP激动剂。相反，当与rhBMP-2组合时，它们中的两个(片段#786和#788)以剂量依赖方式抑制rhBMP-2-诱导活性。这些化合物与BMP-2蛋白的络合物形成可削弱BMP-2结合至细胞膜受体并接着阻止BMP-介导的信号转导。但是，考虑到用于本试验的细胞模型，不排除待测化合物对BMP-2信号转导途径的直接胞外抑制作用。

本文所引用文件的公开内容以参考形式并于本文。

序列表

<110>Abbott GmbH&Co.KG

 

<120>BONE MORPHOGENETIC(BMP)-BINDING DOMAINS OF PROTEINS OF THE REPULSIVE GUIDANCE MOLECULE(RGM)PROTEIN

FAMILY AND FUNCTIONAL FRAGMENTS THEREOF，AND USE OF SAME

 

<130>M/48272-PCT

 

<160>27

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>1353

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1353)

 

<400>1

atg cag ccg cca agg gag agg cta gtg gta aca ggc cga gct gga tgg    48

Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp

1               5                   10                  15

atg ggt atg ggg aga ggg gca gga cgt tca gcc ctg gga ttc tgg ccg    96

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro

            20                  25                  30

acc ctc gcc ttc ctt ctc tgc agc ttc ccc gca gcc acc tcc ccg tgc    144

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys

        35                  40                  45

aag atc ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc acg tcg ggc agc    192

Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser

    50                  55                  60

cac gcc cca gcc tca gac gac acc ccc gag ttc tgt gca gcc ttg cgc    240

His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg

65                  70                  75                  80

agc tac gcc ctg tgc acg cgg cgg acg gcc cgc acc tgc cgg ggt gac    288

Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp

                85                  90                  95

ctg gcc tac cac tcg gcc gtc cat ggc ata gag gac ctc atg agc cag    336

Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln

            100                 105                 110

cac aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tcg cag cca cgc ctg cgc acg    384

His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr

        115                 120                 125

ctc cca ccg gcc gga gac agc cag gag cgc tcg gac agc ccc gag atc    432

Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile

    130                 135                 140

tgc cat tac gag aag agc ttt cac aag cac tcg gcc acc ccc aac tac    480

Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr

145                 150                 155                 160

acg cac tgt ggc ctc ttc ggg gac cca cac ctc agg act ttc acc gac    528

Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp

                165                 170                 175

cgc ttc cag acc tgc aag gtg cag ggc gcc tgg ccg ctc atc gac aat    576

Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn

            180                 185                 190

aat tac ctg aac gtg cag gcc acc aac acg cct gtg ctg ccc ggc tca    624

Asn Tvr Leu Asn Val Gln Ala Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser

        195                 200                 205

gcg gcc act gcc acc agc aag ctc acc atc atc ttc aag aac ttc cag    672

Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln

    210                 215                 220

gag tgt gtg gac cag aag gtg tac cag gct gag atg gac gag ctc ccg    720

Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro

225                 230                 235                 240

gcc gcc ttc gtg gat ggc tct aag aac ggt ggg gac aag cac ggg gcc    768

Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala

                245                 250                 255

aac agc ctg aag atc act gag aag gtg tca ggc cag cac gtg gag atc    816

Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile

            260                 265                 270

cag gcc aag tac atc ggc acc acc atc gtg gtg cgc cag gtg ggc cgc    864

Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg

        275                 280                 285

tac ctg acc ttt gcc gtc cgc atg cca gag gaa gtg gtc aat gct gtg    912

Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val

    290                 295                 300

gag gac tgg gac agc cag ggt ctc tac ctc tgc ctg cgg ggc tgc ccc    960

Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro

305                 310                 315                 320

ctc aac cag cag atc gac ttc cag gcc ttc cac acc aat gct gag ggc    1008

Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly

                325                 330                 335

acc ggt gcc cgc agg ctg gca gcc gcc agc cct gca ccc aca gcc ccc    1056

Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro

            340                 345                 350

gag acc ttc cca tac gag aca gcc gtg gcc aag tgc aag gag aag ctg    1104

Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu

        355                 360                 365

ccg gtg gag gac ctg tac tac cag gcc tgc gtc ttc gac ctc ctc acc    1152

Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr

    370                 375                 380

acg ggc gac gtg aac ttc aca ctg gcc gcc tac tac gcg ttg gag gat    1200

Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp

385                 390                 395                 400

gtc aag atg ctc cac tcc aac aaa gac aaa ctg cac ctg tat gag agg    1248

Val Lvs Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg

                405                 410                 415

act cgg gac ctg cca ggc agg gcg gct gcg ggg ctg ccc ctg gcc ccc    1296

Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro

            420                 425                 430

cgg ccc ctc ctg ggc gcc ctc gtc ccg ctc ctg gcc ctg ctc cct gtg    1344

Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val

        435                 440                 445

ttc tgc tag                                                        1353

Phe Cys

450

 

<210>2

<211>450

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>2

 

Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp

1               5                   10                  15

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro

            20                  25                  30

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys

        35                  40                  45

Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser

    50                  55                  60

His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg

65                  70                  75                  80

Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp

                85                  90                  95

Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln

            100                 105                 110

His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr

        115                 120                 125

Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile

    130                 135                 140

Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr

145                 150                 155                 160

Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp

                165                 170                 175

Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn

            180                 185                 190

Asn Tyr Leu Asn Val Gln Ala Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser

        195                 200                 205

Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln

    210                 215                 220

Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro

225                 230                 235                 240

Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala

                245                 250                 255

Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile

            260                 265                 270

Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg

        275                 280                 285

Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val

    290                 295                 300

Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro

305                 310                 315                 320

Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly

                325                 330                 335

Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro

            340                 345                 350

Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu

        355                 360                 365

Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr

    370                 375                 380

Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp

385                 390                 395                 400

Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg

                405                 410                 415

Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro

            420                 425                 430

Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val

        435                 440                 445

Phe Cys

    450

 

<210>3

<211>1437

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1437)

 

<400>3

atg ata agg aag aag agg aag cga agc gcg ccc ccc ggc cca tgc cgc    48

Met Ile Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Ala Pro Pro Gly Pro Cys Arg

1               5                   10                  15

agc cac ggg ccc aga ccc gcc acg gcg ccc gcg ccg ccg ccc tcg ccg    96

Ser His Gly Pro Arg Pro Ala Thr Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ser Pro

            20                  25                  30

gag ccc acg aga cct gca tgg acg ggc atg ggc ttg aga gca gca cct    144

Glu Pro Thr Arg Pro Ala Trp Thr Gly Met Gly Leu Arg Ala Ala Pro

        35                  40                  45

tcc agc gcc gcc gct gcc gcc gcc gag gtt gag cag cgc cgc cgc ccc    192

Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Val Glu Gln Arg Arg Arg Pro

    50                  55                  60

ggg ctc tgc ccc ccg ccg ctg gag ctg ctg ctg ctg ctg ctg ttc agc    240

Gly Leu Cys Pro Pro Pro Leu Glu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Ser

65                  70                  75                  80

ctc ggg ctg ctc cac gca ggt gac tgc caa cag cca gcc caa tgt cga    288

Leu Gly Leu Leu His Ala Gly Asp Cys Gln Gln Pro Ala Gln Cys Arg

                85                  90                  95

atc cag aaa tgc acc acg gac ttc gtg tcc ctg act tct cac ctg aac    336

Ile Gln Lys Cys Thr Thr Asp Phe Val Ser Leu Thr Ser His Leu Asn

            100                 105                 110

tct gcc gtt gac ggc ttt gac tct gag ttt tgc aag gcc ttg cgt gcc    384

Ser Ala Val Asp Gly Phe Asp Ser Glu Phe Cys Lys Ala Leu Arg Ala

        115                 120                 125

tat gct ggc tgc acc cag cga act tca aaa gcc tgc cgt ggc aac ctg    432

Tyr Ala Gly Cys Thr Gln Arg Thr Ser Lys Ala Cys Arg Gly Asn Leu

    130                 135                 140

gta tac cat tct gcc gtg ttg ggt atc agt gac ctc atg agc cag agg    480

Val Tyr His Ser Ala Val Leu Gly Ile Ser Asp Leu Met Ser Gln Arg

145                 150                 155                 160

aat tgt tcc aag gat gga ccc aca tcc tct acc aac ccc gaa gtg acc    528

Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Ser Thr Asn Pro Glu Val Thr

                165                 170                 175

cat gat cct tgc aac tat cac agc cac gct gga gcc agg gaa cac agg    576

His Asp Pro Cys Asn Tyr His Ser His Ala Gly Ala Arg Glu His Arg

            180                 185                 190

aga ggg gac cag aac cct ccc agt tac ctt ttt tgt ggc ttg ttt gga    624

Arg Gly Asp Gln Asn Pro Pro Ser Tyr Leu Phe Cys Gly Leu Phe Gly

        195                 200                 205

gat cct cac ctc aga act ttc aag gat aac ttc caa aca tgc aaa gta    672

Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Lys Asp Asn Phe Gln Thr Cys Lys Val

    210                 215                 220

gaa ggg gcc tgg cca ctc ata gat aat aat tat ctt tca gtt caa gtg    720

Glu Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn Tyr Leu Ser Val Gln Val

225                 230                 235                 240

aca aac gta cct gtg gtc cct gga tcc agt gct act gct aca aat aag    768

Thr Asn Val Pro Val Val Pro Gly Ser Ser Ala Thr Ala Thr Asn Lys

                245                 250                 255

atc act att atc ttc aaa gcc cac cat gag tgt aca gat cag aaa gtc    816

Ile Thr Ile Ile Phe Lys Ala His His Glu Cys Thr Asp Gln Lys Val

            260                 265                 270

tac caa gct gtg aca gat gac ctg ccg gcc gcc ttt gtg gat ggc acc    864

Tyr Gln Ala Val Thr Asp Asp Leu Pro Ala Ala Phe Val Asp Gly Thr

        275                 280                 285

acc agt ggt ggg gac agc gat gcc aag agc ctg cgt atc gtg gaa agg    912

Thr Ser Gly Gly Asp Ser Asp Ala Lys Ser Leu Arg Ile Val Glu Arg

    290                 295                 300

gag agt ggc cac tat gtg gag atg cac gcc cgc tat ata ggg acc aca    960

Glu Ser Gly His Tyr Val Glu Met His Ala Arg Tyr Ile Gly Thr Thr

305                 310                 315                 320

gtg ttt gtg cgg cag gtg ggt cgc tac ctg acc ctt gcc atc cgt atg    1008

Val Phe Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr Leu Thr Leu Ala Ile Arg Met

                325                 330                 335

cct gaa gac ctg gcc atg tcc tac gag gag agc cag gac ctg cag ctg    1056

Pro Glu Asp Leu Ala Met Ser Tyr Glu Glu Ser Gln Asp Leu Gln Leu

            340                 345                 350

tgc gtg aac ggc tgc ccc ctg agt gaa cgc atc gat gac ggg cag ggc    1104

Cys Val Asn Gly Cys Pro Leu Ser Glu Arg Ile Asp Asp Gly Gln Gly

        355                 360                 365

cag gtg tct gcc atc ctg gga cac agc ctg cct cgc acc tcc ttg gtg    1152

Gln Val Ser Ala Ile Leu Gly His Ser Leu Pro Arg Thr Ser Leu Val

    370                 375                 380

cag gcc tgg cct ggc tac aca ctg gag act gcc aac act caa tgc cat    1200

Gln Ala Trp Pro Gly Tyr Thr Leu Glu Thr Ala Asn Thr Gln Cys His

385                 390                 395                 400

gag aag atg cca gtg aag gac atc tat ttc cag tcc tgt gtc ttc gac    1248

Glu Lys Met Pro Val Lys Asp Ile Tyr Phe Gln Ser Cys Val Phe Asp

                405                 410                 415

ctg ctc acc act ggt gat gcc aac ttt act gcc gca gcc cac agt gcc    1296

Leu Leu Thr Thr Gly Asp Ala Asn Phe Thr Ala Ala Ala His Ser Ala

            420                 425                 430

ttg gag gat gtg gag gcc ctg cac cca agg aag gaa cgc tgg cac att    1344

Leu Glu Asp Val Glu Ala Leu His Pro Arg Lys Glu Arg Trp His Ile

        435                 440                 445

ttc ccc agc agt ggc aat ggg act ccc cgt gga ggc agt gat ttg tct    1392

Phe Pro Ser Ser Gly Asn Gly Thr Pro Arg Gly Gly Ser Asp Leu Ser

    450                 455                 460

gtc agt cta gga ctc acc tgc ttg atc ctt atc gtg ttt ttg tag        1437

Val Ser Leu Gly Leu Thr Cys Leu Ile Leu Ile Val Phe Leu

465                 470                 475

 

<210>4

<211>478

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>4

 

Met Ile Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Ala Pro Pro Gly Pro Cys Arg

1               5                   10                  15

Ser His Gly Pro Arg Pro Ala Thr Ala Pro Ala Pro Pro Pro Ser Pro

            20                  25                  30

Glu Pro Thr Arg Pro Ala Trp Thr Gly Met Gly Leu Arg Ala Ala Pro

        35                  40                  45

Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Val Glu Gln Arg Arg Arg Pro

    50                  55                  60

Gly Leu Cys Pro Pro Pro Leu Glu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Ser

65                  70                  75                  80

Leu Gly Leu Leu His Ala Gly Asp Cys Gln Gln Pro Ala Gln Cys Arg

                85                  90                  95

Ile Gln Lys Cys Thr Thr Asp Phe Val Ser Leu Thr Ser His Leu Asn

            100                 105                 110

Ser Ala Val Asp Gly Phe Asp Ser Glu Phe Cys Lys Ala Leu Arg Ala

        115                 120                 125

Tyr Ala Gly Cys Thr Gln Arg Thr Ser Lys Ala Cys Arg Gly Asn Leu

    130                 135                 140

Val Tyr His Ser Ala Val Leu Gly Ile Ser Asp Leu Met Ser Gln Arg

145                 150                 155                 160

Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Ser Thr Asn Pro Glu Val Thr

                165                 170                 175

His Asp Pro Cys Asn Tyr His Ser His Ala Gly Ala Arg Glu His Arg

            180                 185                 190

Arg Gly Asp Gln Asn Pro Pro Ser Tyr Leu Phe Cys Gly Leu Phe Gly

        195                 200                 205

Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Lys Asp Asn Phe Gln Thr Cys Lys Val

    210                 215                 220

Glu Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn Asn Tyr Leu Ser Val Gln Val

225                 230                 235                 240

Thr Asn Val Pro Val Val Pro Gly Ser Ser Ala Thr Ala Thr Asn Lys

                245                 250                 255

Ile Thr Ile Ile Phe Lys Ala His His Glu Cys Thr Asp Gln Lys Val

            260                 265                 270

Tyr Gln Ala Val Thr Asp Asp Leu Pro Ala Ala Phe Val Asp Gly Thr

        275                 280                 285

Thr Ser Gly Gly Asp Ser Asp Ala Lys Ser Leu Arg Ile Val Glu Arg

    290                 295                 300

Glu Ser Gly His Tyr Val Glu Met His Ala Arg Tyr Ile Gly Thr Thr

305                 310                 315                 320

Val Phe Val Arg Gln Val Gly Arg Tyr Leu Thr Leu Ala Ile Arg Met

                325                 330                 335

Pro Glu Asp Leu Ala Met Ser Tyr Glu Glu Ser Gln Asp Leu Gln Leu

            340                 345                 350

Cys Val Asn Gly Cys Pro Leu Ser Glu Arg Ile Asp Asp Gly Gln Gly

        355                 360                 365

Gln Val Ser Ala Ile Leu Gly His Ser Leu Pro Arg Thr Ser Leu Val

    370                 375                 380

Gln Ala Trp Pro Gly Tyr Thr Leu Glu Thr Ala Asn Thr Gln Cys His

385                 390                 395                 400

Glu Lys Met Pro Val Lys Asp Ile Tyr Phe Gln Ser Cys Val Phe Asp

                405                 410                 415

Leu Leu Thr Thr Gly Asp Ala Asn Phe Thr Ala Ala Ala His Ser Ala

            420                 425                 430

Leu Glu Asp Val Glu Ala Leu His Pro Arg Lys Glu Arg Trp His Ile

        435                 440                 445

Phe Pro Ser Ser Gly Asn Gly Thr Pro Arg Gly Gly Ser Asp Leu Ser

    450                 455                 460

Val Ser Leu Gly Leu Thr Cys Leu Ile Leu Ile Val Phe Leu

465                 470                 475

 

<210>5

<211>1281

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1281)

 

<400>5

 

atg ggg gag cca ggc cag tcc cct agt ccc agg tcc tcc cat ggc agt    48

Met Gly Glu Pro Gly Gln Ser Pro Ser Pro Arg Ser Ser His Gly Ser

1               5                   10                  15

ccc cca act cta agc act ctc act ctc ctg ctg ctc ctc tgt gga cat    96

Pro Pro Thr Leu Ser Thr Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Cys Gly His

            20                  25                  30

gct cat tct caa tgc aag atc ctc cgc tgc aat gct gag tac gta tcg    144

Ala His Ser Gln Cys Lys Ile Leu Arg Cys Asn Ala Glu Tyr Val Ser

        35                  40                  45

tcc act ctg agc ctt aga ggt ggg ggt tca tca gga gca ctt cga gga    192

Ser Thr Leu Ser Leu Arg Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ala Leu Arg Gly

    50                  55                  60

gga gga gga gga ggc cgg ggt gga ggg gtg ggc tct ggc ggc ctc tgt    240

Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Val Gly Ser Gly Gly Leu Cys

65                  70                  75                  80

cga gcc ctc cgc tcc tat gcg ctc tgc act cgg cgc acc gcc cgc acc    288

Arg Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr

                85                  90                  95

tgc cgc ggg gac ctc gcc ttc cat tcg gcg gta cat ggc atc gaa gac    336

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Phe His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp

            100                 105                 110

ctg atg atc cag cac aac tgc tcc cgc cag ggc cct aca gcc cct ccc    384

Leu Met Ile Gln His Asn Cys Ser Arg Gln Gly Pro Thr Ala Pro Pro

        115                 120                 125

ccg ccc cgg ggc ccc gcc ctt cca ggc gcg ggc tcc ggc ctc cct gcc    432

Pro Pro Arg Gly Pro Ala Leu Pro Gly Ala Gly Ser Gly Leu Pro Ala

    130                 135                 140

ccg gac cct tgt gac tat gaa ggc cgg ttt tcc cgg ctg cat ggt cgt    480

Pro Asp Pro Cys Asp Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Arg Leu His Gly Arg

145                 150                 155                 160

ccc ccg ggg ttc ttg cat tgc gct tcc ttc ggg gac ccc cat gtg cgc    528

Pro Pro Gly Phe Leu His Cys Ala Ser Phe Gly Asp Pro His Val Arg

                165                 170                 175

agc ttc cac cat cac ttt cac aca tgc cgt gtc caa gga gct tgg cct    576

Ser Phe His His His Phe His Thr Cys Arg Val Gln Gly Ala Trp Pro

            180                 185                 190

cta ctg gat aat gac ttc ctc ttt gtc caa gcc acc agc tcc ccc atg    624

Leu Leu Asp Asn Asp Phe Leu Phe Val Gln Ala Thr Ser Ser Pro Met

        195                 200                 205

gcg ttg ggg gcc aac gct acc gcc acc cgg aag ctc acc atc ata ttt    672

Ala Leu Gly Ala Asn Ala Thr Ala Thr Arg Lys Leu Thr Ile Ile Phe

    210                 215                 220

aag aac atg cag gaa tgc att gat cag aag gtg tat cag gct gag gtg    720

Lys Asn Met Gln Glu Cys Ile Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Val

225                 230                 235                 240

gat aat ctt cct gta gcc ttt gaa gat ggt tct atc aat gga ggt gac    768

Asp Asn Leu Pro Val Ala Phe Glu Asp Gly Ser Ile Asn Gly Gly Asp

                245                 250                 255

cga cct ggg gga tcc agt ttg tcg att caa act gct aac cct ggg aac    816

Arg Pro Gly Gly Ser Ser Leu Ser Ile Gln Thr Ala Asn Pro Gly Asn

            260                 265                 270

cat gtg gag atc caa gct gcc tac att ggc aca act ata atc att cgg    864

His Val Glu Ile Gln Ala Ala Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Ile Ile Arg

        275                 280                 285

cag aca gct ggg cag ctc tcc ttc tcc atc aag gta gca gag gat gtg    912

Gln Thr Ala Gly Gln Leu Ser Phe Ser Ile Lys Val Ala Glu Asp Val

    290                 295                 300

gcc atg gcc ttc tca gct gaa cag gac ctg cag ctc tgt gtt ggg ggg    960

Ala Met Ala Phe Ser Ala Glu Gln Asp Leu Gln Leu Cys Val Gly Gly

305                 310                 315                 320

tgc cct cca agt cag cga ctc tct cga tca gag cgc aat cgt cgg gga    1008

Cys Pro Pro Ser Gln Arg Leu Ser Arg Ser Glu Arg Asn Arg Arg Gly

                325                 330                 335

gct ata acc att gat act gcc aga cgg ctg tgc aag gaa ggg ctt cca    1056

Ala Ile Thr Ile Asp Thr Ala Arg Arg Leu Cys Lys Glu Gly Leu Pro

            340                 345                 350

gtg gaa gat gct tac ttc cat tcc tgt gtc ttt gat gtt tta att tct    1104

Val Glu Asp Ala Tyr Phe His Ser Cys Val Phe Asp Val Leu Ile Ser

        355                 360                 365

ggt gat ccc aac ttt acc gtg gca gct cag gca gca ctg gag gat gcc    1152

Gly Asp Pro Asn Phe Thr Val Ala Ala Gln Ala Ala Leu Glu Asp Ala

    370                 375                 380

cga gcc ttc ctg cca gac tta gag aag ctg cat ctc ttc ccc tca gat    1200

Arg Ala Phe Leu Pro Asp Leu Glu Lys Leu His Leu Phe Pro Ser Asp

385                 390                 395                 400

gct ggg gtt cct ctt tcc tca gca acc ctc tta gct cca ctc ctt tct    1248

Ala Gly Val Pro Leu Ser Ser Ala Thr Leu Leu Ala Pro Leu Leu Ser

                405                 410                 415

ggg ctc ttt gtt ctg tgg ctt tgc att cag taa                        1281

Gly Leu Phe Val Leu Trp Leu Cys Ile Gln

            420                 425

 

<210>6

<211>426

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>6

 

Met Gly Glu Pro Gly Gln Ser Pro Ser Pro Arg Ser Ser His Gly Ser

1               5                   10                  15

Pro Pro Thr Leu Ser Thr Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Cys Gly His

            20                  25                  30

Ala His Ser Gln Cys Lys Ile Leu Arg Cys Asn Ala Glu Tyr Val Ser

        35                  40                  45

Ser Thr Leu Ser Leu Arg Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ala Leu Arg Gly

    50                  55                  60

Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Val Gly Ser Gly Gly Leu Cys

65                  70                  75                  80

Arg Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr

                85                  90                  95

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Phe His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp

            100                 105                 110

Leu Met Ile Gln His Asn Cys Ser Arg Gln Gly Pro Thr Ala Pro Pro

        115                 120                 125

Pro Pro Arg Gly Pro Ala Leu Pro Gly Ala Gly Ser Gly Leu Pro Ala

    130                 135                 140

Pro Asp Pro Cys Asp Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Arg Leu His Gly Arg

145                 150                 155                 160

Pro Pro Gly Phe Leu His Cys Ala Ser Phe Gly Asp Pro His Val Arg

                165                 170                 175

Ser Phe His His His Phe His Thr Cys Arg Val Gln Gly Ala Trp Pro

            180                 185                 190

Leu Leu Asp Asn Asp Phe Leu Phe Val Gln Ala Thr Ser Ser Pro Met

        195                 200                 205

Ala Leu Gly Ala Asn Ala Thr Ala Thr Arg Lys Leu Thr Ile Ile Phe

    210                 215                 220

Lys Asn Met Gln Glu Cys Ile Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Val

225                 230                 235                 240

Asp Asn Leu Pro Val Ala Phe Glu Asp Gly Ser Ile Asn Gly Gly Asp

                245                 250                 255

Arg Pro Gly Gly Ser Ser Leu Ser Ile Gln Thr Ala Asn Pro Gly Asn

            260                 265                 270

His Val Glu Ile Gln Ala Ala Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Ile Ile Arg

        275                 280                 285

Gln Thr Ala Gly Gln Leu Ser Phe Ser Ile Lys Val Ala Glu Asp Val

    290                 295                 300

Ala Met Ala Phe Ser Ala Glu Gln Asp Leu Gln Leu Cys Val Gly Gly

305                 310                 315                 320

Cys Pro Pro Ser Gln Arg Leu Ser Arg Ser Glu Arg Asn Arg Arg Gly

                325                 330                 335

Ala Ile Thr Ile Asp Thr Ala Arg Arg Leu Cys Lys Glu Gly Leu Pro

            340                 345                 350

Val Glu Asp Ala Tyr Phe His Ser Cys Val Phe Asp Val Leu Ile Ser

        355                 360                 365

Gly Asp Pro Asn Phe Thr Val Ala Ala Gln Ala Ala Leu Glu Asp Ala

    370                 375                 380

Arg Ala Phe Leu Pro Asp Leu Glu Lys Leu His Leu Phe Pro Ser Asp

385                 390                 395                 400

Ala Gly Val Pro Leu Ser Ser Ala Thr Leu Leu Ala Pro Leu Leu Ser

                405                 410                 415

Gly Leu Phe Val Leu Trp Leu Cys Ile Gln

            420                 425

 

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>共有序列

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Xaa为K或R

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)(3)

<223>Xaa为Lys(K)或Arg(R)

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>Xaa为K或R

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>Xaa为Ser，Thr或Ala

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>Xaa为E或D

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>Xaa为F或Y

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<400>7

 

Xaa Cys Xaa Ile Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Thr

1               5                   10                  15

 

<210>8

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>共有2

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(16)..(16)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<400>8

 

Xaa Cys Xaa Ala Leu Arg Xaa Tyr Ala Xaa Cys Thr Xaa Arg Thr Xaa

1               5                   10                  15

 

<210>9

<211>933

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>hRGMA 47-90Fc质粒

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(933)

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(55)

<223>鼠Ig k-链V-J2-C信号肽

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(103)..(234)

<223>RGMA 47-90

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(250)..(260)

<223>因子Xa

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(261)..(933)

<223>Fc

 

<400>9

atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca    48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcg cgc cgt acg    96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

            20                  25                  30

aag ctt ccg tgc aag atc ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc    144

Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala

        35                  40                  45

acg tcg ggc agc cac gcc cca gcc tca gac gac acc ccc gag ttc tgt    192

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys

    50                  55                  60

gca gcc ttg cgc agc tac gcc ctg tgc acg cgg cgg acg gcc ttg aat    240

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Leu Asn

65                  70                  75                  80

tct gca gat atc gag gga cga atg gat cca ccg tgc cca gca cct gaa    288

Ser Ala Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

                85                  90                  95

ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac    336

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

            100                 105                 110

acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac    384

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

        115                 120                 125

gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc    432

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

    130                 135                 140

gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac    480

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

145                 150                 155                 160

agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg    528

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

                165                 170                 175

ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca    576

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

            180                 185                 190

gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa    624

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

        195                 200                 205

cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac    672

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

    210                 215                 220

cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc    720

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

225                 230                 235                 240

gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc    768

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

                245                 250                 255

acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag    816

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

            260                 265                 270

ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc    864

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

        275                 280                 285

tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc    912

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

    290                 295                 300

tcc ctg tct ccg ggt aaa tga                                        933

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

305                 310

 

<210>10

<211>310

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成构建体

 

<400>10

 

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

            20                  25                  30

Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala

        35                  40                  45

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys

    50                  55                  60

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Leu Asn

65                  70                  75                  80

Ser Ala Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

                85                  90                  95

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

            100                 105                 110

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

        115                 120                 125

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

    130                 135                 140

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

145                 150                 155                 160

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

                165                 170                 175

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

            180                 185                 190

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser LysA la Lys Gly Gln Pro Arg Glu

        195                 200                 205

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

    210                 215                 220

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

225                 230                 235                 240

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

                245                 250                 255

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

            260                 265                 270

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

        275                 280                 285

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

    290                 295                 300

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

305                 310

 

<210>11

<211>1167

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>hRGMA 47-168Fc质粒

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1167)

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(103)..(468)

<223>hRGMA 47-168

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(496)..(1167)

<223>Fc

 

<400>11

atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca    48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcg cgc cgt acg    96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

            20                  25                  30

aag ctt ccg tgc aag atc ctc aag tgc aac tct gag ttc tgg agc gcc    144

Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala

        35                  40                  45

acg tcg ggc agc cac gcc cca gcc tca gac gac acc ccc gag ttc tgt    192

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys

    50                  55                  60

gca gcc ttg cgc agc tac gcc ctg tgc acg cgg cgg acg gcc cgc acc    240

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr

65                  70                  75                  80

tgc cgg ggt gac ctg gcc tac cac tcg gcc gtc cat ggc ata gag gac    288

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp

                85                  90                  95

ctc atg agc cag cac aac tgc tcc aag gat ggc ccc acc tcg cag cca    336

Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro

            100                 105                 110

cgc ctg cgc acg ctc cca ccg gcc gga gac agc cag gag cgc tcg gac    384

Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp

        115                 120                 125

agc ccc gag atc tgc cat tac gag aag agc ttt cac aag cac tcg gcc    432

Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala

    130                 135                 140

acc ccc aac tac acg cac tgt ggc ctc ttc ggg gac ttg aat tct gca    480

Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Leu Asn Ser Ala

145                 150                 155                 160

gat atc gag gga cga atg gat cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg    528

Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

                165                 170                 175

ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc    576

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

            180                 185                 190

atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc    624

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

        195                 200                 205

cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag    672

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

    210                 215                 220

gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg    720

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

225                 230                 235                 240

tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat    768

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

                245                 250                 255

ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc    816

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

            260                 265                 270

atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag    864

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

        275                 280                 285

gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc    912

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

    290                 295                 300

agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg    960

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

305                 310                 315                 320

gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct    1008

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

                325                 330                 335

ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc    1056

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

            340                 345                 350

gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg    1104

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

        355                 360                 365

atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg    1152

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

    370                 375                 380

tct ccg ggt aaa tga                                                1167

Ser Pro Gly Lys

385

 

<210>12

<211>388

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成构建体

 

<400>12

 

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

            20                  25                  30

Lys Leu Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala

        35                  40                  45

Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys

    50                  55                  60

Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr

65                  70                  75                  80

Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp

                85                  90                  95

Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro

            100                 105                 110

Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp

        115                 120                 125

Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala

    130                 135                 140

Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Leu Asn Ser Ala

145                 150                 155                 160

Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

                165                 170                 175

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

            180                 185                 190

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

        195                 200                 205

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

    210                 215                 220

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

225                 230                 235                 240

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

                245                 250                 255

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

            260                 265                 270

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

        275                 280                 285

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

    290                 295                 300

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

305                 310                 315                 320

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

                325                 330                 335

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

            340                 345                 350

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

        355                 360                 365

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

    370                 375                 380

Ser Pro Gly Lys

385

 

<210>13

<211>1197

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>hRGMa 41-168Fc质粒

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1197)

 

<400>13

atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca    48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcg cgc cgt acg    96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

            20                  25                  30

aag ctt ttc ccc gca gcc acc tcc ccg tgc aag atc ctc aag tgc aac    144

Lys Leu Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn

        35                  40                  45

tct gag ttc tgg agc gcc acg tcg ggc agc cac gcc cca gcc tca gac    192

Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp

    50                  55                  60

gac acc ccc gag ttc tgt gca gcc ttg cgc agc tac gcc ctg tgc acg    240

Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr

65                  70                  75                  80

cgg cgg acg gcc cgc acc tgc cgg ggt gac ctg gcc tac cac tcg gcc    288

Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala

                85                  90                  95

gtc cat ggc ata gag gac ctc atg agc cag cac aac tgc tcc aag gat    336

Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp

            100                 105                 110

ggc ccc acc tcg cag cca cgc ctg cgc acg ctc cca ccg gcc gga gac    384

Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp

        115                 120                 125

agc cag gag cgc tcg gac agc ccc gag atc tgc cat tac gag aag agc    432

Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser

    130                 135                 140

ttt cac aag cac tcg gcc acc ccc aac tac acg cac tgt ggc ctc ttc    480

Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe

145                 150                 165                 160

ggg gac atc gaa ggt cgt ttg aat tct gca gat atc gag gga cga atg    528

Gly Asp Ile Glu Gly Arg Leu Asn Ser Ala Asp Ile Glu Gly Arg Met

                165                 170                 175

gat cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc    576

Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

            180                 185                 190

ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct    624

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

        195                 200                 205

gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc    672

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

    210                 215                 220

aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca    720

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

225                 230                 235                 240

aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc    768

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

                245                 250                 255

ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc    816

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

            260                 265                 270

aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc    864

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

        275                 280                 285

aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca    912

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

    290                 295                 300

tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc    960

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

305                 310                 315                 320

aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg    1008

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

                325                 330                 335

cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac    1056

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

            340                 345                 350

ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg    1104

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

        355                 360                 365

cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac    1152

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

    370                 375                 380

aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga        1197

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385                 390                 395

 

<210>14

<211>398

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成构建体

 

<400>14

 

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                  10                  15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

            20                  25                  30

Lys Leu Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn

        35                  40                  45

Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp

    50                  55                  60

Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr

65                  70                  75                  80

Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala

                85                  90                  95

Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln His Asn Cys Ser Lys Asp

            100                 105                 110

Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp

        115                 120                 125

Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser

    130                 135                 140

Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe

145                 150                 155                 160

Gly Asp Ile Glu Gly Arg Leu Asn Ser Ala Asp Ile Glu Gly Arg Met

                165                 170                 175

Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

            180                 185                 190

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

        195                 200                 205

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

    210                 215                 220

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

225                 230                 235                 240

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

                245                 250                 255

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

            260                 265                 270

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

        275                 280                 285

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

    290                 295                 300

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

305                 310                 315                 320

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

                325                 330                 335

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

            340                 345                 350

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

        355                 360                 365

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

    370                 375                 380

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385                 390                 395

<210>15

<211>1014

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>hRGMA 316-386Fc质粒

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1014)

 

<400>15

atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca    48

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

ggt tcc act ggt gac gcg gcc cag ccg gcc agg cgc gcg cgc cgt acg    96

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

            20                  25                  30

aag ctt ctg cgg ggc tgc ccc ctc aac cag cag atc gac ttc cag gcc    144

Lys Leu Leu Arg Gly Cys Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala

        35                  40                  45

ttc cac acc aat gct gag ggc acc ggt gcc cgc agg ctg gca gcc gcc    192

Phe His Thr Asn Ala Glu Gly Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala

    50                  55                  60

agc cct gca ccc aca gcc ccc gag acc ttc cca tac gag aca gcc gtg    240

Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val

65                  70                  75                  80

gcc aag tgc aag gag aag ctg ccg gtg gag gac ctg tac tac cag gcc    288

Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala

                85                  90                  95

tgc gtc ttc gac ctc ctc acc acg ggc ttg aat tct gca gat atc gag    336

Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Leu Asn Ser Ala Asp Ile Glu

            100                 105                 110

gga cga atg gat cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg    384

Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

        115                 120                 125

tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc    432

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

    130                 135                 140

cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac    480

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

145                 150                 155                 160

cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat    528

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

                165                 170                 175

gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg    576

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

            180                 185                 190

gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag    624

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

        195                 200                 205

tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa    672

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

    210                 215                 220

acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc    720

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

225                 230                 235                 240

ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc    768

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

                245                 250                 255

tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag    816

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

            260                 265                 270

agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg    864

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

        275                 280                 285

gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag    912

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

    290                 295                 300

agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag    960

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

305                 310                 315                 320

gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt    1008

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

                325                 330                 335

aaa tga                                                            1014

Lys

 

<210>16

<211>337

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成构建体

 

<400>16

 

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1               5                   10                  15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr

            20                  25                  30

Lys Leu Leu Arg Gly Cys Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala

        35                  40                  45

Phe His Thr Asn Ala Glu Gly Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala

    50                  55                  60

Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val

65                  70                  75                  80

Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala

                85                  90                  95

Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Leu Asn Ser Ala Asp Ile Glu

            100                 105                 110

Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

        115                 120                 125

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

    130                 135                 140

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

145                 150                 155                 160

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

                165                 170                 175

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

            180                 185                 190

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

        195                 200                 205

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

    210                 215                 220

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

225                 230                 235                 240

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

                245                 250                 255

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

            260                 265                 270

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

        275                 280                 285

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

    290                 295                 300

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

305                 310                 315                 320

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

                325                 330                 335

Lys

 

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>PCR引物

 

<400>17

ggggaagctt ttccccgcag ccacctcc                                    28

 

<210>18

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

 

<400>18

gggggaattc aaacgacctt cgatgtcccc gaagaggcca cagtg                 45

 

<210>19

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

 

<400>19

ggggaagctt ccgtgcaaga tcctcaagtg caac                             34

 

<210>20

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>PCR引物

 

<400>20

ccccgaattc aaggccgtcc gccgcg                                      26

 

<210>21

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>PCR引物

 

<400>21

ccccgaattc aagtccccga agaggccaca gtg                              33

 

<210>22

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<23>PCR引物

 

<400>22

ggggaagctt ctgcggggct gccccc                                      26

 

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>PCR引物

<400>23

ccccgaattc aagcccgtgg tgaggaggtc g                                        31

 

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>PCR引物

 

<400>24

atgcagccgc caagggagag                                                     20

 

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>PCR引物

 

<400>25

gcagaacaca gggagcaggg c                                                   21

 

<210>26

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>共有序列

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>Xaa为Val或Leu

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<400>26

 

Leu Xaa Leu Cys Xaa Xaa Gly Cys Pro

1               5

 

<210>27

<211>28

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>共有序列

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(5)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>Xaa为Lys或His

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(10)

<223>Xaa为Leu或Met

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(13)..(13)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(17)..(17)

<223>Xaa为Phe或Tyr

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>Xaa为His或Gln

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(19)..(19)

<223>Xaa为Ala或Ser

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(24)..(24)

<223>Xaa为Val或Leu

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(26)..(26)

<223>Xaa为任何氨基酸

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(27)..(27)

<223>Xaa为Thr或Ser

 

<400>27

 

Thr Ala Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Glu Xaa Xaa Pro Val Xaa Asp Xaa Tyr

1               5                   10                  15

Xaa Xaa Xaa Cys Val Phe Asp Xaa Leu Xaa Xaa Gly

            20                  25

Claims (40)

1.排斥性引导分子(RGM)的骨形态发生蛋白(BMP)-结合结构域。

2.权利要求1的BMP-结合结构域，其衍生自哺乳动物的RGM。

3.权利要求1或2的BMP-结合结构域，其衍生自SEQ ID NO：2的人RGM A、SEQ ID NO：4的人RGM B或SEQ ID NO：6的人RGMC。

4.前述权利要求之一的BMP-结合结构域，其位于具有长度多达约170的氨基酸序列范围并且就RGM A的血管假性血友病因子结构域而言位于N-端。

5.权利要求4的BMP-结合结构域、其功能衍生物和融合蛋白，所述BMP-结合结构域具有约30至150个氨基酸残基的长度，所述融合蛋白包含至少一个BMP-结合结构域和与之功能性连接的至少一个附加的不同氨基酸序列。

6.前述权利要求之一的BMP-结合结构域，其特征为至少以下SEQ ID NO：7和8的部分序列之一：

X₁C(K/R)IX₂(K/R)CX₃(S/T/A)(E/D)(F/Y)X₄SX₅T(SEQ ID NO：7)

其中X₁至X₅表示任何给定的氨基酸残基；或

X₆CX₇ALRX₈YAX₉CTX₁₀RTX₁₁(SEQ ID NO：8)

其中X₆至X₁₁表示任何给定的氨基酸残基；

或式

(SEQ ID NO：7)-接头1-(SEQ ID NO：8)

的部分序列

其中接头1表示包含13至28个任何给定连续氨基酸残基的SEQID NO：7-和8-桥接氨基酸序列。

7.前述权利要求之一的BMP-结合结构域，其包含以下SEQ IDNO：2氨基酸序列之一：

约47至约168的氨基酸位

约47至约90的氨基酸位或

约75至约121的氨基酸位；

或以下SEQ ID NO：4氨基酸序列之一：

约94至约209的氨基酸位

约94至约137的氨基酸位或

约122至约168的氨基酸位；

以下SEQ ID NO：6氨基酸序列之一：

约36至约172的氨基酸位

约36至约94的氨基酸位或

约80至约125的氨基酸位

或其功能性BMP-结合片段。

8.权利要求1至3之一的BMP-结合结构域或其结合片段，其包含至少10个连续氨基酸残基，所述残基来自SEQ ID NO：2约316位至约386位的序列范围，来自SEQ ID NO：4约350位至约421位的序列范围或来自SEQ ID NO：6约314至369位的序列范围。

9.权利要求7的BMP-结合结构域或其结合片段，其包含至少10个连续氨基酸残基，所述残基来自SEQ ID NO：2约47位至约168位的序列范围，来自SEQ ID NO：4约94位至约209位的序列范围或来自SEQ ID NO：6约36至172位的序列范围。

10.前述权利要求之一的BMP-结合结构域，其结合至少一个选自BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-12的BMP并特别结合BMP-2和/或BMP-4。

11.权利要求10的BMP-结合结构域，其亦结合再生蛋白。

12.前述权利要求之一的BMP-结合结构域的抗原性多肽片段。

13.权利要求12的抗原性多肽片段，其可用于产生调节RGM与BMP和/或再生蛋白结合的免疫球蛋白分子。

14.权利要求12或13的抗原性多肽片段，其包含具有SEQ IDNO：2、4或6的序列之一的肽的至少10个连续氨基酸残基。

15.一种融合蛋白，其包含至少一个选自权利要求1至11之一的BMP-结合结构域的第一生物活性多肽以及与之可操作地连接的选自单价或多价载体多肽的第二多肽或第二生物活性多肽。

16.权利要求15的融合蛋白，其中所述多价载体包含至少一个Fc或Fc”，其中两条多肽链各自与相同或不同的权利要求1至10之一的BMP-结合结构域可操作地连接。

17.权利要求1至11之一的BMP-结合结构域，或权利要求12至14之一的多肽片段在制备抗RGM多克隆抗血清或单克隆抗体中的用途。

18.权利要求17的用途，其中所述抗血清或抗体调节RGM与再生蛋白(再生蛋白受体)的结合。

19.权利要求17和18之一定义的抗RGM多克隆抗血清或单克隆抗体，用于诊断或治疗用途。

20.权利要求19的多克隆抗血清或单克隆抗体在制备用于诊断或治疗由再生蛋白受体(再生蛋白)与RGM或RGM片段相互作用介导的疾病或疾病阶段的药物中的用途。

21.权利要求20的用途，其中所述疾病或疾病阶段选自：

a)对颅、脑和脊髓的机械损伤，

b)选自神经变性、炎性或自身免疫疾病的慢性病，

c)神经元再生、轴突出芽、神经突延伸和神经元可塑性障碍，

d)肿瘤疾病和肿瘤转移。

22.权利要求1至11之一的BMP-结合结构域或权利要求15和16之一的融合蛋白在制备用于诊断或治疗由RGM或RGM片段与相关受体(再生蛋白或BMP)的缺陷或受损的相互作用介导的疾病或疾病阶段的药物中的用途。

23.权利要求22的用途，其中所述疾病或疾病阶段选自：

a)精神病状况下经改变的神经突发生过程和由过量神经突萌发和/或病理性突触发生引起的慢性疼痛状态；

b)与铁代谢紊乱相关的疾病，例如慢性疾病的贫血、青少年血色病；

c)与骨生长受损相关的疾病；

d)与软骨退化性变化相关的疾病；

e)与椎间盘和椎体损伤相关的疾病；

f)与不受调节的、不可控的细胞迁移过程相关的疾病。

24.权利要求1至11之一的BMP-结合结构域或其结合片段或权利要求15和16之一的融合蛋白在制备用于诊断或治疗可通过刺激或扩增BMP信号途径(通过结合至BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和/或BMP-12，特别是结合至BMP-2和/或4)治疗的疾病或疾病阶段的药物中的用途。

25.权利要求24在治疗涉及骨生长受损的疾病或用于治疗骨折中的用途。

26.权利要求1至11之一的BMP-结合结构域或其结合片段或权利要求15和16之一的融合蛋白在制备用于诊断或治疗自身免疫疾病特别是选自以下的自身免疫疾病的药物中的用途：关节强硬性脊椎炎、抗磷脂综合征、阿狄森氏综合征、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝赛特氏症、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻、疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘多神经炎(CIDP)、疤痕性类天疱疮、全身性硬化症(CREST综合征)、冷凝集素病、克隆氏病、皮肤脉管炎、德戈斯病、皮肌炎、青少年型皮肌炎、盘状红斑狼疮、特发性混合型冷沉淀球蛋白血症、纤维肌痛、古德帕斯彻氏综合征、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维变性、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、免疫球蛋白A肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型关节炎、川畸病、扁平苔、膜性肾小球肾炎、梅尼尔氏症、混合性结缔组织病、多病灶运动神经病、多发性硬化症、重症肌无力、寻常天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌病、多发性肌炎、皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、全身性红斑狼疮、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病；或

脱发病，尤其是选自局限性脱发、全部脱发、全身脱毛、雄激素性脱发、静止期脱发、再生期脱发和化学疗法诱导的脱发。

27.权利要求1至11之一的BMP-结合结构域作为检测或鉴定RGM-结合配体靶标的用途。

28.权利要求1至11之一的BMP-结合结构域或权利要求12至14之一的片段作为主动或被动免疫的免疫原的用途。

29.一种多克隆抗血清，其通过用抗原量的权利要求1至11之一的BMP-结合结构域或权利要求12至14之一的多肽片段免疫哺乳动物获得。

30.抗权利要求1至11之一的BMP-结合结构域或抗权利要求12至14之一的多肽片段的单克隆抗体；或单克隆抗-RGM A抗体，所述抗体与RGMA的结合受任选为人源化形式的权利要求1至11之一的BMP-结合结构域或权利要求12至14之一的多肽片段或其抗原结合片段调控。

31.一种药物，其包含至少一种活性组分的药学可接受载体，所述活性组分选自：

a)权利要求1至11之一的BMP-结合结构域或权利要求12至14之一的多肽片段或权利要求15和16之一的融合蛋白，

b)权利要求29和30之一的单克隆或多克隆抗体。

32.权利要求31的药物，其可用于鞘内、静脉内、皮下、口腔或肠胃外、经皮、真皮下、骨内、鼻、体外和吸入给药。

33.治疗骨折的药物，其包含在液体、半固体或固体载体中的至少一种权利要求1至11之一的BMP-结合结构域或权利要求15和16之一的融合蛋白。

34.一种表达载体，其包含至少一种权利要求1至11之一的BMP-结合结构域的编码核酸序列、权利要求15和16之一的融合蛋白或权利要求12至14之一的多肽片段以及与之可操作地连接的至少一种调控核酸序列。

35.一种重组微生物，其具有至少一种权利要求34的载体。

36.一种杂交瘤细胞系，其可产生权利要求30的单克隆抗体。

37.产生权利要求1至11之一的BMP-结合结构域、权利要求15和16之一的融合蛋白或权利要求12至14之一的多肽片段的方法，其中权利要求35的重组微生物通过该方法培养并从培养物中分离所产生的蛋白质产物。

38.产生权利要求30的单克隆抗体的方法，其中权利要求36的杂交瘤细胞系通过该方法培养并且从培养物中分离所产生的蛋白质产物。

39.权利要求1至16之一的BMP-结合结构域或权利要求15和16之一的融合蛋白在制备用于刺激RGM受体特别是再生蛋白或至少一种选自BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6和BMP-12的BMP的药物中的用途。

40.权利要求30的单克隆抗体在制备用于阻断RGM受体例如特别是再生蛋白的活化的药物中的用途。

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