CN108430508A

CN108430508A - 用于产生移植相关性免疫应答的RGMb的阻断

Info

Publication number: CN108430508A
Application number: CN201680077523.3A
Authority: CN
Inventors: 马基叠·佩雷斯·克鲁兹; 埃弗雷特·于尔托·迈耶; 罗斯玛丽·H·德克入夫; 帕纳塔·伊洛泊洛; 徐玉乔
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2018-08-21
Also published as: US10669335B2; WO2017079486A2; EP3370772A4; AU2016349445A1; EP3370772A2; BR112018008887A2; US20170121404A1; US20190077861A1; RU2018120173A; US10093734B2; IL259094A; BR112018008887A8

Abstract

RGMb拮抗剂减少与组织或器官移植相关的不期望的免疫应答。

Description

用于产生移植相关性免疫应答的RGMb的阻断

交叉引用

本申请要求2015年11月3日提交的美国临时专利申请号62/250,411的权益，所述申请全文以引用方式并入本文中。

背景技术

移植是将细胞、组织或器官从一个部位转移至另一个部位的行为。器官系统故障可能与来自供体的器官(例如，肾、肝、心、肺或胰腺)的移植相关。然而，免疫系统保持为作为常规医学治疗的移植的最强障碍。免疫系统已发展对抗外来物的详尽且有效的机制。这些机制还参与排斥移植的器官，所述移植的器官被受体免疫系统识别为外来物。

理解这些机制是重要的，因为这有助于理解排斥的临床特性并且因此有助于进行早期诊断并递送适当的治疗。这些机制的知识在发展使排斥最小化的策略方面以及在发展使免疫系统对移植的器官的作用钝化从而确保这些器官存活更长时间的新药物和治疗方面也十分重要。

对移植物的免疫应答程度部分取决于所移植的器官与宿主之间的遗传差异程度。异种移植物为不同物种的成员之间的移植物，具有最大差异性并且引起最大免疫应答，从而经历快速排斥。同种移植物为从身体一部分到另一部分的移植物(例如，皮肤移植物)，并不是外来组织并且因此不会引起排斥。同系移植物为遗传上相同的个体(例如，单卵孪生)之间的移植物，也不会经历排斥。同种异体移植物为相同物种的遗传上不同的成员之间的移植物。这是移植的最常见形式。同种异体移植物经历排斥的程度部分取决于供体与受体之间的类似性或组织相容性程度。

应答的程度和类型也随着移植的类型而改变。一些部位诸如眼睛和大脑具有免疫特权。皮肤移植物最初未有血管形成并且因此在血液供应产生之前未表现出排斥。心脏、肾和肝是高度血管化器官并且可在宿主中导致剧烈的细胞介导的应答。

更常见移植之一涉及例如癌症治疗中的血液干细胞移植，具体地为同种异体干细胞移植，并且具有用于治疗血液疾病诸如镰状细胞性贫血、地中海贫血等的前景。在同种异体移植中，从匹配的供体收集干细胞并且将其移植到患者中以抑制疾病并恢复患者的免疫系统。同种异体干细胞移植不同于使用来自患者自身身体的干细胞的自体干细胞移植。供体细胞可以是循环干细胞/祖细胞；动员的周围血液、脐带血等。在同种异体干细胞移植之前，通常用强效高剂量化学疗法或高剂量化学疗法与辐射疗法的组合治疗患者。然而因为免疫细胞在所述过程中转移，所以可能存在移植物抗宿主疾病(GVHD)，这是其中捐赠的细胞攻击受体组织的病状。

在实体器官移植领域中包括胰岛细胞移植。虽然已做出显著进展，但仍保留阻止其广泛应用的许多障碍。重要的限制为当前不适当的用于预防胰岛排斥的手段。当前免疫抑制方案能够预防胰岛衰竭数月至数年，但用于这些治疗中的药剂十分昂贵并且可能增加特定恶性肿瘤和机会性感染的风险。另外，已知钙调磷酸酶抑制性免疫抑制剂诸如环孢霉素、FK-506、雷帕霉素等损害正常的胰岛功能和/或胰岛素作用。某些广泛使用的免疫抑制剂对肾功能的有害作用是特别关注的问题。对于患有糖尿病的患者，肾功能是决定长期结果的关键性因素，并且钙调磷酸酶抑制剂显示显著的肾毒性。对于糖尿病患者，甚至患有长期存在且难以控制的疾病的那些患者，存活的预后可能相对更好地用胰岛素对比移植治疗。虽然大部分胰岛受体实现更好的血糖过多控制并罹患较不严重的低血糖，胰岛移植目前继续落入短期的确定的糖尿病治愈。

改进在移植之后患者健康的改进方法极受关注，包括提供靶向GVHD、具有较低副作用的有效治疗策略。

出版物

Severyn CJ、Shinde U、Rotwein P.Molecular biology，genetics andbiochemistry of the repulsive guidance molecule family.Biochem.J.2009；422(3):393–403。

Xiao Y、Yu S、Zhu B等人RGMb is a novel binding partner for PD-L2 andits engagement with PD-L2 promotes respiratory tolerance.J.Exp.Med.2014；211(5):943–959。

Metzger M、Conrad S、Alvarez-Bolado G、Skutella T、Just L.Gene expressionof the repulsive guidance molecules during development of the mouseintestine.Dev.Dyn.2005；234(1):169–175。

发明概要

提供用于减少与组织移植相关的不期望的免疫应答的组合物和方法，所述组织移植包括造血细胞、实体组织、器官、胰岛细胞等的移植。在本发明的方法中，RGMb拮抗剂以有效于减少不期望的免疫应答的剂量施用至移植受体。在一些实施方案中，不期望的免疫应答在移植物抗宿主疾病(GVHD)中通过供体淋巴细胞活化。在一些实施方案中，不期望的免疫应答为导致移植的胰岛的功能丧失的炎症。在本文中显示，用拮抗性抗体阻断RGMb防止了GVHD和移植的胰岛功能损失，例如减少胰岛同种异体移植物移植排斥并在炎症期间保护胰岛代谢功能。在一些情况下，本文所提供的方法包括在移植HLA-匹配的或HLA-错配的实体器官之后将RGMb拮抗剂施用至受体。

本发明涉及排斥性导向分子(RGMb，Dragon)的阻断，所述排斥性导向分子为三个排斥性导向分子(RGM)家族成员之一，并且为糖磷脂酰肌醇锚定膜蛋白。RGMb为骨形态发生蛋白(BMP)共同受体和BMP信号传导的敏化剂。还据报告，RGMb与已知的PD-1配体程序性死亡配体2(PD-L2)相互作用。PD-L2和BMP-2/4结合至RGMb上的不同位点。

在一些实施方案中，RGMb的阻断通过使细胞与RGMb拮抗剂接触来实现。在一些实施方案中，拮抗剂为多肽，包括但不限于抗体。在其他实施方案中，阻断使用多核苷酸，例如反义寡核苷酸、RNAi等来实现。在一些实施方案中，抗体为人类抗体或人源化抗体，例如用于治疗人类患者。抗体可以被选择用于通过Fc受体进行低活化；或者可以被选择以在ADCC或ADCP中具有活性。在一些实施方案中，抗体为二价抗体。在一些实施方案中，抗体干扰由RGMb介导的信号传导。

在一些实施方案中，移植为造血细胞移植，例如干细胞、祖细胞等。在一些此类实施方案中，对患者进行治疗以预防或治疗GVHD。在一些实施方案中，GVHD为急性GVHD。在一些实施方案中，GVHD为慢性GVHD。在一些实施方案中，移植受体在移植之前经历清髓性、强度减小的或非清髓性调理并经历用RBMB拮抗剂进行的治疗。本发明的治疗性方法在造血移植情况下促进免疫耐受和更好的免疫力。

在一些实施方案中，移植为实体组织移植，包括器官及其片段。在一些情况下，实体器官为HLA匹配的或HLA错配的。在一些情况下，实体器官选自由以下组成的组：心脏、肠、肝、肺、胰腺以及肾。实体器官可以是整体器官的一部分，可以从活供体或死亡的供体获得和/或可以与受体有亲缘关系或无亲缘关系。在一些实施方案中，实体组织是胰腺组织。在一些实施方案中，胰腺组织包括郎格罕氏岛，其任选地从其他胰腺组织纯化。所述胰岛或来源于所述胰岛的细胞通常包括β细胞。

在一些情况下，在通过将供体和受体中的HLA等位基因分型为HLA-A、HLA-B和HLA-DR来确定供体和受体是HLA匹配或是HLA错配之后施用治疗。HLA匹配的可以是指一种匹配，其中在HLA-A、HLA-B和HLA-DR处的每个HLA等位基因在供体与受体之间是相同的。HLA错配的可以是指一种匹配，其中在HLA-A、HLA-B和HLA-DR处的至少一个HLA等位基因在供体与受体之间是不同的。

在一些实施方案中，向移植受体施用有效剂量的RGMb拮抗剂。在一些实施方案中，施用在移植之前进行。在一些实施方案中，施用在移植之后执行，例如基本上同时、在约1天之后、在约2天之后、在约3天之后、在约4天之后、在约5天之后、在约6天之后、在约一周之后、在约2周之后、在约3周之后、在约4周之后、或更长时间。在一些实施方案中，向移植受体施用与用有效剂量的RGMb拮抗剂离体治疗移植物组合进行。

在一些实施方案中，本发明提供一种RGMb拮抗剂以及所述拮抗剂的药物制剂，所述拮抗剂例如为特异性结合至RGMb并阻断活性的抗体。在另一方面，本发明提供含有一种或多种RGMb拮抗剂和药学上可接收的载体的药物制剂。所述制剂可包含一种或多种活性剂或具有不同活性的药剂的混合物或“鸡尾酒混合物(cocktail)”，例如包含一种或多种另外的免疫抑制剂。所述制剂可以单位剂量(例如有效剂量)的激动剂提供在适用于临床使用的无菌容器中。

本文还公开了用于器官移植的试剂盒。在一些情况下，本文所提供的试剂盒描述了一种RGMb拮抗剂的组合物，所述组合物可以在移植HLA匹配或HLA错配的实体器官、器官组织或造血细胞之后施用至受体。

下文更详细地描述本发明的这些方面和其他方面以及实施方案。

附图简述

图1.用拮抗性大鼠抗小鼠mAb 9D1阻断RGMb预防小鼠中的GVHD。9D1在第-1、+1、+5、+9、+15天给药并且治疗的小鼠比同种型对照更好地存活(在2个实验中重复，n＝5只小鼠/组，Kaplan Meier存活分析p＝0.01。

图2(A-D).RGMB结合的阻断延长了胰岛存活和代谢功能。

实施方案详述

定义

在描述本发明方法和组合物之前，应理解本发明不限于所述的特定方法或组合物，因而，当然也可有所变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并且不意图具有限制性，因为本发明的范围将仅受限于所附权利要求书。

在提供数值范围的情况下，应理解，还明确公开了此范围的上下限之间的各中间值，其中除非上下文另外明确地指出，精确到下限单位的十分位一。在规定范围中的任何规定值或中间值与在此规定范围中的任何其他规定值或中间值之间的各个较小范围涵盖在本发明内。这些较小范围的上下限可被独立地包括在所述范围中或排除在所述范围外，并且当两个界限之一、都不或全都包括在所述较小范围中时各个范围也涵盖在本发明内，除非是所述规定范围中的任何明确排除的极限值。在所述规定范围包括所述极限值中的一个或两个的情况下，本发明中还包括排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然在实践或测试本发明时可使用与本文所描述的那些类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述一些可能和优选的方法和材料。为了公开和描述公布在引用时所涉及的方法和/或材料，本文中提到的所有公布均以引用的方式并入本文。应理解，如果有矛盾，本公开取代所并入公布的任何公开内容。

必须指出，除非上下文明确地另外规定，否则如在本文和所附权利要求书中使用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞且提及“肽”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种肽及其等效物，例如多肽，诸如此类。

本文中讨论的出版物仅仅提供它们在本申请的提交日期之前的公开内容。本文中的任何内容均不应解释为承认由于先前发明而使本发明无权先于这些公布。此外，所提供的公布日期可不同于可能需要独立确认的实际公布日期。

分子生物化学和细胞生物化学中的一般方法可见于如下的标准教科书中：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版(Sambrook等人，CSH Laboratory Press2001)；Short Protocols in Molecular Biology，第4版(Ausubel等人编著，John Wiley &Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人，John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectorsfor Gene Therapy(Wagner等人编著，Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编著，Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编著，Academic Press 1997)；以及Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures inBiotechnology(Doyle&Griffiths，John Wiley&Sons 1998)，其公开内容以引用的方式并入本文。用于本公开中提到的遗传操控的试剂、克隆载体及试剂盒可从如下的供应商处购得：BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich及ClonTech。

“包含(comprising)”意指叙述的要素为组合物/方法/试剂盒中所需要的，但是可以包括其他要素以形成处于权利要求书的范围内的组合物/方法/试剂盒等。

“基本上由…组成(consisting essentially of)”意指对于未实质上影响本发明的基本特征和新颖特征的指定材料或步骤进行描述的组合物或方法的范围的限制。

“由…组成(consisting of)”意指从组合物、方法或试剂盒中排除权利要求书中未指定的任何要素、步骤或成分。

本文使用术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等一般意指获得希望的药理作用和/或生理作用。作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可为预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可为治疗性的。如本文所使用的“治疗”涵盖对哺乳动物的任何疾病治疗，并且包括：(a)防止可能易患疾病但尚未诊断为患有疾病的受试者发生疾病；(b)抑制疾病，即拦阻疾病的发展；或(c)缓解疾病，即导致疾病消退。可在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。对其中治疗使患者的不期望临床症状稳定或减少的正在进行的疾病的治疗为特别感兴趣的。此种治疗希望在受影响组织功能完全失去之前进行。本发明的治疗在疾病症状期被施用，并且在某些情况下，在疾病症状期之后被施用。

如本文所用，术语“预防(prevention)”是指减轻疾病或病状在未诊断为患有所述疾病或病状的受试者中发生。如本文所用，术语“受试者”表示哺乳动物，诸如啮齿动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。优选地，根据本发明的受试者是人。

术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指希望诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，具体是人。

术语“受试者(subject)”包括哺乳动物，例如猫、狗、马、猪、牛、羊、啮齿类动物、兔、松鼠、熊、灵长类动物(诸如黑猩猩、大猩猩和人类)。

如本文所用，术语“实体器官移植(solid organ transplantation)”根据所述术语的常规含义使用，其中来自供体(所述供体可能是存活或死亡的)的器官放置到受体身体内的适当位置中并且心血管连接在生理上整合到受体中。包含β细胞的胰腺组织(例如胰岛)的移植对于本发明的方法具有特别的意义，所述方法如造血细胞移植，例如在干细胞和/或祖细胞移植中，尽管所述方法并不排除其他器官的移植，所述其他器官例如包括肾、胰岛细胞；心脏；肠、肝；肺、皮肤等，如本领域已知的。在一些实施方案中，移植涉及多种吻合术，例如肺、心脏、肝、肾的移植。移植的器官可以作为“移植物”提及，并且器官的生理整合可被称为植入。

术语“移植物管理”是指诱导和/或促进实体器官的修复植入(但不限于胰岛细胞移植)的治疗性方法。

RGMb。排斥性导向分子(RGM)构成糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定轴突导向分子的家族并且在神经发育期间执行若干种功能。Dragon(RGMb)为在正发育的神经系统中早期表达的家族成员。骨形态发生蛋白(BMP)为调节许多胚胎发育和器官发生的重要方面的配体转化生长因子(TGF)β超家族。DRAGON增强BMP但未增强TGFβ信号传导。DRAGON直接结合至BMP2和BMP4，但未结合至BMP7或其他TGFβ配体。DRAGON对BMP信号传导的增强作用也通过施用可溶性BMP拮抗剂Noggin来减小，这表明DRAGON的作用是配体依赖性的。DRAGON与BMP I型(ALK2、ALK3和ALK6)和II型(ActRII和ActRIIB)受体直接缔合，并且其信号传导通过显性阴性Smad1和ALK3或-6受体来减少。在爪蟾胚胎中，DRAGON减小Smad1诱导中胚层和内胚层标记物的能力阈值并且改变神经元和神经嵴模式。DRAGON与BMP配体和受体的直接相互作用指示其为加强BMP信号传导的BMP共同受体。已知的PD-1配体程序性死亡配体2(PD-L2)也结合至RGMb。PD-L2和BMP-2/4结合至RGMb上的不同位点。

人类RGMb的遗传序列在Genbank，NM_001012761处评定，参见Samad等人(2004)J.Neurosci.24(8)，2027-2036和Samad等人(2005)J.Biol.Chem.280(14)，14122-14129，所述文献各自以引用的方式具体地并入本文中。

RGMb抑制剂或拮抗剂意指抑制活性的药剂，所述活性例如结合至结合配偶体；干扰所述结合配偶体；减少表达；减少信号传导；等。抑制剂可以通过许多不同的机制抑制活性。在某些实施方案中，抑制剂为结合至RGMb并且因此抑制其活性的抑制剂。

代表性RGMb抑制剂包括但不限于：反义寡核苷酸等。其他感兴趣的药剂包括但不限于：抗体、天然存在或合成的感兴趣的小分子化合物，所述小分子化合物包括许多化学类别，尽管通常它们是有机分子，优选地是分子量大于50且小于约2,500道尔顿的小有机化合物。候选药剂包含与蛋白质发生结构相互作用(具体地为氢键结)所必需的官能团，并且通常至少包括氨基、羰基、羟基或羧基，优选包括所述化学官能团中的至少两者。候选试剂常常包含被一个或多个以上官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多环芳族结构。还在生物分子之中发现候选试剂，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。此类分子可以在其他方式中通过使用适当的筛选方案来鉴别。

反义试剂可以是反义寡核苷酸(ODN)，特别是具有来自天然核酸的化学修饰的合成ODN，或者表达此类反义分子诸如RNA的核酸构建体。反义序列与RGMb互补并且抑制其表达。可以施用一种反义分子或反义分子的组合，其中组合可包含多种不同的序列。

反义分子可通过表达适当载体中的所有或部分靶RGMb序列来产生，其中转录起始被取向为使得反义链作为RNA分子产生。另选地，反义分子为合成的寡核苷酸。反义寡核苷酸将大体上为至少约7个、通常至少约12个、更通常地至少约20个核苷酸长度，并且不超过25个、通常不超过约23-22个核苷酸长度，其中所述长度由抑制效率、特异性(包括交叉反应性的不存在)等来控制。

反义寡核苷酸可通过本领域已知的方法化学合成(参见Wagner等人(1993)同上，以及Milligan等人，同上)优选的寡核苷酸由天然磷酸二酯结构化学修饰，以便增加其细胞内稳定性和结合亲和力。许多此类修饰已在文献中描述，所述修饰改变主链、糖或杂环碱基的化学。

感兴趣的反义分子包括antagomir RNA，例如如Krutzfeldt等人所述的，其以引用的方式具体地并入本文。已工程化为具有某些‘药样’特性诸如用于稳定性的化学修饰和用于递送的胆固醇缀合的小干扰双链RNA(siRNA)已显示在体内实现内源性基因的治疗性沉默。为了开发用于体内沉默RGMb的药理学方法，开发与RGMb mRNA序列互补的化学修饰的、胆固醇缀合的单链RNA类似物，其称为‘antagomirs’。Antagomir RNA可以使用标准固相寡核苷酸合成方法来合成。RNA缀合至胆固醇并且还可具有在一个或多个位置处的硫代磷酸主链。

在某些实施方案中，还感兴趣的是RNAi药剂。在代表性实施方案中，RNAi药剂靶向RGMb mRNA序列的前体分子。RNAi药剂意指通过RNA干扰机制调节表面的药剂。在本发明的一个实施方案中使用的RNAi药剂为存在于双链体结构中的小核糖核酸分子(在本文中也称为干扰核糖核酸)，即寡核糖核苷酸，例如彼此杂交的两个不同寡核糖核苷酸或确保小发夹形成以产生双链体结构的单一核糖寡核苷酸。寡核糖核苷酸意指长度不超过约100nt并且通常长度不超过约75nt的核糖核酸，其中在某些实施方案中所述长度小于约70nt。在RNA药剂为彼此杂交的两个不同核糖核酸的双链体结构(例如，siRNA)时，双链体结构的长度范围通常为约15至30bp、通常约15至29bp，其中在某些实施方案中约20与29bp之间的长度(例如，21bp、22bp)特别有意义。在RNA药剂为以发夹形式存在的单一核糖核酸的双链体结构(即shRNA)时，发夹的杂交部分的长度通常与以上对于siRNA类型的药剂提供的长度相同或者长4-8个核苷酸。此实施方案的RNAi药剂的重量范围通常为5,000道尔顿至约35,000道尔顿，并且在许多实施方案中为至少约10,000道尔顿且小于约27,500道尔顿，通常小于约25,000道尔顿。

dsRNA可以根据本领域已知的许多方法(包括体外和体内方法)中的任一种以及通过合成化学方案来制备。此类方法的实例包括但不限于由以下各项所述的方法：Sadher等人(Biochem.Int.14:1015，1987)；Bhattacharyya(Nature 343:484，1990)；以及Livache等人(美国专利号5,795,715)，每份所述文献以引用的方式整体并入本文。单链RNA也可以使用酶合成和有机合成的组合或通过总体有机合成来产生。使用合成化学方法使得能够将所需修饰的核苷酸或核苷酸类似物引入到dsRNA中。dsRNA也可以根据许多已建立的方法中体内制备(参见例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑，1984)；DNACloning，第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑，1985)；以及Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984，所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。

在某些实施方案中，RNAi药剂不是如以上所述的干扰核糖核酸例如siRNA或shRNA，相反地RNAi药剂可以编码如以上所述的干扰核糖核酸，例如shRNA。换言之，RNAi药剂可以是干扰核糖核酸的转录模板。在这些实施方案中，转录模板通常为编码干扰核糖核酸的DNA。DNA可以存在于载体中，其中许多不同的载体为本领域中已知的，例如质粒载体、病毒载体等。

拮抗剂可以具体地包括选择性结合RGMb并且抑制或阻断活性的抗体。对于人类RGMb具有特异性的抗体包括例如大鼠抗人类抗体BFH-5C9；小鼠抗人类抗体(Clone398528)；等，或者抗体可以使用本领域公认的技术来生成。

抗体也称为免疫球蛋白，常规地包含至少一条重链和一条轻链，其中所述重链和轻链的氨基端结构域的序列为可变的，因此通常称为可变区结构域或者可变重链(VH)或可变轻链(VH)结构域。两个结构域常规地缔合以形成特异性结合区，尽管特异性结合也可以使用仅重链可变序列来获得，并且抗体的各种非天然构型为本领域中已知并使用的。

“官能化”或“生物活性”抗体或抗原结合分子为能够在结构性、调节性、生物化学或生物物理事件中发挥其天然活性中的一种或多种的抗体或抗原结合分子。例如，功能性抗体可具有特异性结合抗原的能力并且所述结合可进而引起或改变细胞或分子事件，诸如信号传导转导或酶活性。功能性抗体也阻断受体的配体活化或用作激动剂或拮抗剂。

本文的术语“抗体”以最广泛的意义使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、单体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、仅重链抗体、三链抗体、单链Fv、纳米抗体等，并且还包括抗体片段，只要它们展现出所需生物活性(Miller等人(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠类的、人的、人源化的、嵌合的或衍生自其他物种。

术语抗体可以提及全长重链、全长轻链、完整免疫球蛋白分子；或这些多肽中任一种的免疫活性部分，即包含免疫特异性地结合所感兴趣的靶标抗原或其部分的抗原结合位点的多肽，这些靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文所公开的免疫球蛋白可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、以及IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)或子类别的免疫球蛋白分子，包括具有改变的Fc部分的工程化子类别，其提供减小的或增强的效应子细胞活性。免疫球蛋白可来源于任何物种。在一方面，免疫球蛋白大部分为人类来源。

术语“可变”是指这样的事实，可变结构域的某些部分在抗体间的序列上广泛不同，并且用于各特定抗体对它的特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并非在抗体的整个可变结构域中均匀分布。在轻链与重链可变结构域中，所述可变性集中在三个称为高变区的片段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，主要采用由形成环连接的三个高变区连接的β-折叠构型，并且在一些情况下，形成β-折叠结构的一部分。各链的高变区由FR紧密靠近地结合在一起，并且与来自其他链的高变区一起有助于形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.)。虽然恒定结构域并不直接参与抗体与抗原结合，但表现各种效应功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指自大致上均质抗体的群体获得的抗体，即除可以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成所述群体的个别抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。除特异性外，单克隆抗体的优势还在于，其合成不会受到其他抗体的污染。修饰语“单克隆”指示抗体是从实质上均质的抗体群体获得的特性，且不应解释为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。

本文中的抗体明确包括“嵌合”抗体，其中一部分重链和/或轻链与源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源；以及所述抗体的片段，只要其展现所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；以及Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。本文所关注的嵌合抗体包括包含源于非人类灵长类动物(例如旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人类恒定区序列的“灵长类化”抗体。

如本文所用的“完整抗体链”是包含全长可变区和全长恒定区的抗体链。完整“常规”抗体包含所分泌IgG的完整轻链和完整重链以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、铰链CH2和CH3。其他同种型诸如IgM或IgA可具有不同的CH结构域。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一种或多种“效应子功能”，其指可归因于抗体Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应功能的实例包括：C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；以及下调细胞表面受体。恒定区变体包括改变效应子分布、与Fc受体的结合等的那些变体。

根据其重链的恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可分成不同的“类别”。存在五种主要类别的完整免疫球蛋白抗体：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，并且这些类别中的几种可进一步划分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA以及IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ以及μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。Ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(Roux等人(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund等人(2000)Eur.生物化学杂志。267:7246-7256；US 2005/0048572；US2004/0229310)。来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链可基于其恒定结构域的氨基酸序列指定为两种明显不同类型(称为κ和λ)中的一者。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性效应子功能包括C1q结合；CDC；Fc受体结合；ADCC；ADCP；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)等。此类效应子功能大体上需要Fc区与受体相互作用，所述受体例如FcγRI；FcγRIIA；FcγRIIB1；FcγRIIB2；FcγRIIIA；FcγRIIIB受体、以及低亲和力FcRn受体；并且可以使用如例如本文中的定义所公开的各种测定来评定。“死亡”Fc为已被诱变处理以保持关于例如延长血清半衰期的活性但不会活化高亲和力Fc受体的Fc。

“天然序列Fc区”包含与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1Fc区(非-A和A同种异型)；天然序列人类IgG2Fc区；天然序列人类IgG3Fc区；以及天然序列人类IgG4Fc区、以及其天然存在的变体。

“变体Fc区”所包含的氨基酸序列与天然序列Fc区的氨基酸序列的不同之处在于至少一个氨基酸修饰，优选地为一个或多个氨基酸取代。优选地，与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如天然序列Fc区中或亲本多肽的Fc区中的约一个至约十个氨基酸取代，并且优选地约一个至约五个氨基酸取代。本文中的变体Fc区将优选地与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，以及最优选地与其具有至少约90％同源性，更优选地至少约95％同源性。

变体Fc序列可包含CH2区中的三个氨基酸取代以减少在EU检索位置234、235和237处的FcγRI结合(参见Duncan等人，(1988)Nature 332:563)。在EU索引位置330和331处的补体C1q结合位点中的两个氨基酸取代减少了补体结合(参见Tao等人，J.Exp.Med.178:661(1993)以及Canfield和Morrison，J.Exp.Med.173:1483(1991))。在233-236处的IgG2残基和在位置327、330和331处的IgG4残基取代到人类IgG1中极大地减少了ADCC和CDC(参见例如，Armour KL.等人，1999Eur J Immunol.29(8):2613-24；以及Shields RL.等人，2001.JBiol Chem.276(9):6591-604)。其他Fc变体是可能的，包括但不限于其中缺失能够形成二硫键的区域的变体或其中在天然Fc形式的N末端处消除某些氨基酸残基或将甲硫氨酸残基添加到其中的变体。因此，在本发明的一个实施方案中，scFc分子的一个或多个Fc部分可包含铰链区中消除二硫键合的一个或多个突变。在另一个实施方案中，Fc的铰链区可以整体去除。在另一个实施方案中，分子可包含Fc变体。

另外，Fc变体可被构造为通过取代、缺失或添加氨基酸残基来去除或基本上减少效应子功能，以实现补体结合或Fc受体结合。例如但不限于，缺失可出现在补体结合位点诸如C1q结合位点中。制备免疫球蛋白Fc片段的此类序列衍生物的技术公开在国际专利公布号WO 97/34631和WO 96/32478中。WO 97/34631和WO 96/32478。另外，Fc结构域可以通过磷酸化、硫酸盐化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等来修饰。

Fc可以呈具有天然糖链、与天然形式相比增加的糖链或与天然形式相比减少的糖链的形式，或者可以呈糖基化(aglycosylated)或去糖基化的形式。糖链的增加、减少、去除或其他修饰可以通过本领域常见方法，诸如化学方法、酶方法或通过在遗传工程化生产细胞系中表达所述糖链来实现。此类细胞系可包括天然表达糖基化酶的微生物，例如巴斯德毕赤酵母，以及哺乳动物细胞系，例如CHO细胞。另外，微生物或细胞可以被工程化以表达糖基化酶，或者可以使得不能表达糖基化酶(参见例如Hamilton等人，Science，313:1441(2006)；Kanda等人，J.Biotechnology，130:300(2007)；Kitagawa等人，J.Biol.Chem.，269(27)：17872(1994)；Ujita-Lee等人，J.Biol.Chem.，264(23)：13848(1989)；Imai-Nishiya等人，BMC Biotechnology 7:84(2007)；以及WO 07/055916)。作为工程化为具有改变的唾液酸化活性的细胞的一个实例，α-2,6-唾液酸转移酶1基因已工程化到中国仓鼠卵巢细胞和sf9细胞中。由这些工程化细胞表达的抗体因此被外源基因产物唾液酸化。另一种用于获得具有与多种天然分子相比改变量的糖残基的Fc分子的方法包括例如使用凝集素亲和色谱法将所述多种分子分离成糖基化和非糖基化级分(参见例如WO 07/117505)。特定糖基化部分的存在已显示改变免疫球蛋白的功能。例如，将糖链从Fc分子中去除导致与第一补体组分C1的C1q部分的结合亲和力显著减小以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的减小或损失，从而不会在体内诱导不需要的免疫应答。另外的重要修饰包括唾液酸化和岩藻糖基化：唾液酸在IgG中的存在已与抗炎活性相关(参见例如Kaneko等人，Science 313:760(2006))，而从IgG中去除岩藻糖导致ADCC活性增强(参见例如Shoj-Hosaka等人，J.Biochem.，140:777(2006))。

在替代性实施方案中，抗体可以具有效应子功能增强的Fc序列，例如他用过增加其与FcγRIIIA的结合能力以及增加ADCC活性。例如，在Fc的Asn-297处附接到N-连接的聚糖的岩藻糖在空间上阻碍Fc与FcγRIIIA的相互作用，并且通过糖基工程化去除岩藻糖可以增加与FcγRIIIA的结合，这转换成与野生型IgG1对照相比高>50倍的ADCC活性。通过IgG1的Fc部分中的氨基酸突变进行的蛋白质工程化已生成增加Fc与FcγRIIIA的结合亲和力的多种变体。值得注意的是，三丙氨酸突变体S298A/E333A/K334A展现出与FcγRIIIA的结合的2倍增加和ADCC功能。S239D/I332E(2X)和S239D/I332E/A330L(3X)变体具有与FcγRIIIA的结合亲和力的显著增加以及ADCC能力的体外和体内扩增。由酵母展示识别的其他Fc变体也在小鼠异种移植模型中显示改进的与FcγRIIIA的结合和增强的肿瘤细胞杀伤。参见，例如Liu等人(2014)JBC 289(6):3571-90，其以引用的方式具体地并入本文中。

术语“含Fc区抗体”是指包含Fc区的抗体。Fc区的C-端赖氨酸(残基447，根据EU编号系统)可以例如在抗体纯化期间去除或通过编码抗体的核酸的重组工程化去除。因此，具有根据本发明的Fc区的抗体可以包含具有或不具有K447的抗体。

“人源化”形式的非人(例如啮齿动物)抗体(包括单链抗体)是含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体(包括单链抗体)。参见例如Jones等人，(1986)Nature 321:522-525；Chothia等人(1989)Nature 342:877；Riechmann等人(1992)J.Mol.Biol.224，487-499；Foote和Winter，(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；Presta等人(1993)J.Immunol.151，2623-2632；Werther等人(1996)J.Immunol.Methods 157:4986-4995；以及Presta等人(2001)Thromb.Haemost.85:379-389。对于其他细节，参见美国专利号5,225,539；6,548,640；6,982,321；5,585,089；5,693,761；6,407,213；Jones等人(1986)Nature，321:522-525；以及Riechmann等人(1988)Nature 332:323-329。

如本文所用，“受体”是来自另一个体(供体)(通常为相同物种)的器官、组织或细胞已转移至的个体。出于本公开的目的，受体和供体是HLA匹配的或HLA错配的。

如本文所用，术语“实体器官移植(solid organ transplantation)”根据所述术语的常规含义使用，其中来自可能存活或死亡的供体的器官放置到受体身体内的适当位置中并且心血管连接在生理上整合到受体中。胰岛的移植对于本公开的方法而言是特别有意义的，尽管所述方法不排除其他器官的移植，例如肾；心脏；肺、肠、肝等，如本领域中已知的。移植的器官可以作为“移植物”提及，并且器官的生理整合可被称为植入。

实体器官可以从供体移植到受体，使得所述器官被放置到受体身体内的适当位置中。在一些情况下，实体器官之间的心血管连接可以在生理上整合到受体身体中。在一些情况下，器官可以是来自活供体。在其他情况下，器官可以是来自死亡供体。在一些情况下，实体器官在供体与受体之间可以是HLA匹配的。在其他情况下，实体器官在供体与受体之间可以是HLA错配的。

可以用于器官移植的任何实体器官可以用于本文所述的方法中。在一些情况下，器官可以是肾、肺、胰腺、胰岛细胞、心脏、肠、结肠、肝、皮肤、肌肉、牙龈、眼睛、牙齿等，如本领域技术人员已知的。在一些情况下，器官可以是完整器官。在其他情况下，器官可以是器官的一部分。在其他情况下，器官可以是来自器官的组织的细胞。使用本文所述的方法，收获实体器官并根据常规实践移植。

造血干细胞移植(HCT)是多能造血干细胞的移植，所述多能造血干细胞通常来源于骨髓、外周血或脐带血。在供体死亡时，造血细胞可从骨髓(例如，脊椎、骨盆骨等)获得。在供体是活供体时，造血细胞可以被动员(例如使用G-CSF)，并且通过单采血液成分术或类似方法收集。或者，细胞可从骨髓(例如，骨盆骨等)获得。

造血细胞可以被冷冻(例如低温保存)延长的时间段而未损害显著量的细胞。为了低温保存HSC，必须添加防腐剂DMSO并且所述细胞必须在速率控制的冷冻机中缓慢冷却以防止在冰晶体形成期间的渗透性细胞损伤。HSC可以在低温冷冻机中保存数年，所述低温冷冻机通常使用液氮。

受体的免疫系统可以在输注造血细胞之前用非清髓性程序调理。调理方案可以包括用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)；全身淋巴照射以及皮质类固醇(例如泼尼松)处理，通常持续约10至12天(例如约11天)的时间段。

“主要组织相容性复合体抗原”(“MHC”，也称为“人类白细胞抗原”，HLA)为在细胞表面上表达的、赋予这些细胞独特抗原身份的蛋白质分子。MHC/HLA抗原是由T细胞和自然杀伤(NK)细胞识别为来源于与免疫效应子细胞相同来源的造血干细胞(“自身(self)”)或来源于另一种来源的造血重构细胞(“非自身(non-self)”)的靶分子。识别两种主要类别的HLA抗原：HLA I类和HLA II类。HLA I类抗原(在人类中为A、B和C)使得每个细胞可识别为“自身”，而HLA II类抗原(在人类中为DR、DP和DQ)参与淋巴细胞与抗原呈递细胞之间的反应。两种抗原涉及移植的器官的排斥。

HLA基因系统的重要方面为其多态性。每种基因MHC I类(A、B和C)和MHC II类(DP、DQ和DR)存在于不同的等位基因中。HLA等位基因由数字和下标命名。例如，两个无亲缘关系的个体可以分别携带I类HLA-B、基因B5和Bw41。等位基因产物的不同之处在于α和/或β结构域中的一个或多个氨基酸。使用大量特异性抗体或核酸试剂，使用表达I类和II类分子的白细胞确定个体的HLA单倍型分型。对于HLA分型最重要的基因为六种MHC I类和II类蛋白质，对于HLA-A；HLA-B和HLA-DR中的每一个有两个等位基因。

HLA基因以存在于染色体位置6p21上的“超级基因座”形式成簇，所述染色体位置6p21编码六种经典移植HLA基因和至少132种蛋白质编码基因，所述基因在免疫系统的调节以及一些其他基本分子和细胞过程中具有重要作用。完整基因座测量大约3.6Mb，其具有至少224个基因座位。此成簇的一种效应为从一个亲本遗传的“单倍型”(即存在于单个染色体上的等位基因组)倾向于作为一组遗传。从每个亲本遗传的等位基因组形成单倍型，其中一些等位基因倾向于缔合在一起。识别患者单倍型可以帮助预测找到匹配供体的概率并且有助于开发搜索策略，因为一些等位基因和单倍型比其他等位基因和单倍型更常见并且它们以不同的频率分布在不同的种族和人种组中。

如本文所用，术语“HLA匹配的”是指其中HLA抗原没有在供体与受体之间错配的供体受体对。HLA匹配的(即其中所有6个等位基因均匹配)供体/受体对相对于错配对(即其中6个等位基因中的至少一个错配)具有减小的移植物抗宿主疾病(GVHD)的风险。

如本文所用，术语“HLA错配”是指其中至少一种HLA抗原(具体地对于HLA-A、HLA-B和HLA-DR)在供体与受体之间是错配的供体受体对。在一些情况下，一个单倍型是匹配的并且另一个是错配的。此情况在来自活供体或死亡供体的器官的情况下频繁发现。HLA错配的供体/受体对相对于完全匹配对(即其中所有6个等位基因均匹配)具有增加的GVHD风险。

HLA等位基因通常用多种水平的细节标注。大部分名称以HLA-和基因座名称开始、然后为*以及一些(均匀)数目的指示等位基因的位数。前两个位数指示一组等位基因。较早的分型方法通常不能完全区分等位基因并且因此在此水平下停止。第三至第四个位数指示同义等位基因。第五至第六个位数表示基因编码框内的任何同义突变。第七和第八个位数区分编码区外部的突变。字母诸如L、N、Q或S可在等位基因名称之后，以指示表达水平或关于它已知的其他非基因组学数据。因此，完全描述的等位基因可以是多至9个位长，不包括HLA-前缀和基因座符号。

如本文所用，“免疫抑制”是指用药剂治疗移植物受体以主要减小宿主免疫系统针对移植物的免疫应答，尽管所述药剂也可以减小供体造血细胞的GVHD。移植患者的免疫抑制治疗以诱导阶段、围手术期以及在移植之后立即开始。然后继续维持疗法。诱导和维持策略使用特定剂量或被调节以实现目标治疗水平的剂量的不同药物，以给予移植患者长期移植物存活的最佳希望。

主要免疫抑制剂包括钙调磷酸酶抑制剂，其与结合蛋白组合以抑制钙调磷酸酶活性，并且所述结合蛋白包括例如他克莫司、环孢霉素A等。环孢霉素和他克莫司二者的水平必须小心监测。最初，水平可以保持在10-20ng/mL范围内，但是在3个月之后，水平可保持较低(5-10ng/mL)以减小肾毒性风险。

辅助药剂通常与钙调磷酸酶抑制剂组合并且包括类固醇、硫唑嘌呤、麦考酚酸莫酯、以及西罗莫司。感兴趣的方案包括钙调磷酸酶抑制剂与麦考酚酸莫酯。使用辅助药剂允许临床医生实现足够的免疫抑制同时降低个别药剂的剂量和毒性。在若干临床试验已显示与硫唑嘌呤相比显著减小的急性细胞排斥患病率和1年治疗失败的减少之后，肾移植受体中的麦考酚酸莫酯已假定在免疫抑制中有重要的作用。

基于抗体的疗法使用单克隆(例如莫罗单抗-CD3)或多克隆抗体或抗-CD25抗体(例如，巴利昔单抗、达利珠单抗)并且在早期移植后时间段(多至8周)中施用。基于抗体的疗法允许避免钙调磷酸酶抑制剂或减小其剂量，从而可以减小肾毒性风险。多克隆抗体和单克隆抗体的不利影响限制了其在一些患者中的使用。

“急性移植排斥”为免疫系统对移植的器官的排斥。急性排斥的特征在于受体免疫细胞对移植的组织的浸润，所述免疫细胞执行其效应子功能并破坏移植的组织。急性排斥的发作快速并且大体上在人类中发生在移植手术之后数周内。

大体上，急性排斥使用免疫抑制药物阻止或抑制。类固醇为用于急性排斥发作的主要疗法。典型剂量为3-5mg/kg/d，持续3-5天，所述剂量然后逐渐减小至维持剂量。ATG和莫罗单抗-CD3也发现用途。

“慢性移植排斥”通常在植入之后数月至数年内发生于人类中，甚至在急性排斥的成功免疫抑制存在下也如此。纤维化是所有类型的器官移植的慢性排斥中的常见因素。慢性排斥通常可以通过一系列特定器官特征性的特定病症描述。例如，在肺移植中，此类病症包括气道纤维增生性破坏(闭塞性细支气管炎)；在心脏移植或心脏组织移植(诸如瓣膜置换)中，此类病症包括纤维化动脉粥样硬化；在肾移植中，此类病症包括阻塞性肾病变、肾硬化、小管间质性肾病；并且在肝移植中，此类病症包括胆管消失综合症。

慢性排斥的特征也在于缺血伤害、移植的组织的神经切除、血脂过多以及与免疫抑制药物相关的高血压。除非不适当的免疫抑制是排斥的原因，否则免疫抑制疗法的改变通常不能有效逆转慢性排斥。血压的控制、血脂过多的治疗和糖尿病的管理为用于移植物保护的当前主要治疗。

术语“移植排斥”涵盖急性和慢性移植排斥。在移植排斥中，移植的组织被受体的免疫系统排斥并破坏。急性排斥在一定程度上可以发生在所有移植中，除了在相同孪生的情况下或在免疫抑制期间。急性排斥可以在移植之后一周开始并且急性排斥发生的最大风险出现在移植之后的前三个月内。慢性排斥为移植的器官的长期功能损失。

移植物抗宿主疾病(GVHD)为骨髓移植的主要使人虚弱且潜在致命的副作用。当来自供体的存在于骨髓接种物中的淋巴细胞攻击和破坏受体的健康组织时发生所述疾病。

急性GVHD发生在同种异体HSC移植受体中(在40％HLA匹配的同胞移植物受体和80％无亲缘关系供体移植物受体中)。其引起发烧、皮疹、肝炎伴随高胆红素血症、呕吐、痢疾、腹痛(可进行至肠梗阻)、以及体重减轻。风险因素包括HLA和性别错配；无亲缘关系供体；老年受体、供体或二者；供体预致敏；以及不适当的GVHD预防。诊断明显是基于历史、身体检查和肝功能测试结果；常规治疗为甲泼尼龙2mg/kg IV一天一次，如果在5天内没有应答则增加至10mg/kg。

慢性GVHD可单独地发生，由急性GVHD发展，或者在急性GVHD消退之后发生。它通常在HSC移植之后4至7个月发生(范围为2个月至2年)。慢性GVHD发生在同种异体HSC移植受体中(在约35％至50％HLA匹配的同胞移植物受体和60％至70％无亲缘关系供体移植物受体中)。它主要影响皮肤(例如苔癣样皮疹、硬皮病)和黏膜(例如，干燥性角膜结膜炎、牙周炎、口腔苔癣样反应)，但是它也影响GI道和肝。免疫缺陷为主要特性；还可发生类似于肺移植之后的闭塞性细支气管炎。最终，GVHD在患有它的20％至40％患者中造成死亡。

大约一半在同种异体HCT之后存活超过100天的患者发展cGvHD。器官受累的常见位点包括口腔、眼睛、皮肤、胃肠道、肝以及肺。cGvHD的临床表现不利地影响患者生活品质和死亡率。患有最新诊断的“有利的”且“不良的”危险cGvHD的患者的三年存活率分别为约80％和40％。另外，仅50％患有cGvHD的患者能够在其发作之后5年内中断免疫抑制治疗。慢性免疫抑制疗法增加HCT后发病率和死亡率，其中HCT后皮质类固醇的剂量与非复发性死亡率(NRM之间存在直接相关性；

预防性GVHD疗法为在HCT之后的标准护理。减少GVHD的常见策略包括使用控制T细胞增殖和活化的药剂，包括环孢霉素、他克莫司、西罗莫司、麦考酚酸莫酯、类固醇、以及移植后环磷酰胺。

用于急性和慢性GVHD的当前主要治疗为静脉内施用的糖皮质激素，诸如甲泼尼龙，尽管也可以使用口服类固醇诸如类固醇。使用这些糖皮质激素被设计为抑制对宿主组织的T细胞介导的免疫攻击；然而，在高剂量下，此免疫抑制引起感染和癌症复发的风险。

胰岛移植。胰岛也称为郎格罕氏岛，是在整个胰腺中分散的微小细胞簇。胰腺为位于胃部下部分之后约一手大小的器官。胰岛含有产生激素胰岛素的若干种类型的细胞，包括β细胞。胰腺还产生有助于身体消化并利用食物的酶。在胰岛同种异体移植中，将来自死亡器官供体胰腺的胰岛纯化、处理并转移到另一个人。胰岛同种异体移植为当前标记的实验程序。酶通常用于从单个供体的胰腺取出胰岛。移植患者通常接受每次输注平均400,000至500,000个胰岛的两次输注。一旦移植，这些胰岛中的β细胞就开始形成和释放胰岛素。移植通常通过将胰岛通过导管输注到肝门静脉中来执行。

胰岛在移植后不久开始释放胰岛素。然而，完整胰岛功能和来自新胰岛的新血管生长消耗时间。移植受体通常进行胰岛素注射，直到胰岛具有完整功能。他们还可以在移植之前和之后接受不同的药物以促进胰岛的成功移植和长期功能。然而，首先破坏移植受体自身胰岛的自身免疫应答可再次发生并且攻击移植的胰岛。

胰岛同种异体移植的风险包括与移植程序(特别是出血和血凝块)相关的风险。移植的胰岛可能不能作用良好或者可能完全停止工作。其他风险为来自移植受体必须服用以使免疫系统停止排斥移植的移动的免疫抑制药物的副作用。

“治疗有效量”意图是赋予受试者治疗益处所需要的活性剂的量。例如，“治疗有效量”为诱导、减轻或另外引起与疾病相关的病理症状、疾病进展或生理病状的改进或者改进对病症的抗性的量。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，以是指正在评定治疗和/或正在治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物为人类。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体、患有自身免疫疾病的个体、患有病理感染的个体等。受试者可以是人类，而且还包括其他哺乳动物，特别是适用作人类疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。

术语“分离的”意指材料从其原始环境(例如，如果它是天然存在的，则为天然环境)中移出。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分离的，但与天然系统中的一些或全部共存物质分离的相同的多核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，且它们仍然是分离的，因为这种载体或组合物不是其自然环境的一部分。

“药学上可接受的赋形剂”意指适用于制备药物组合物的通常安全、无毒且合乎需要的赋形剂，并且包括可为兽医学用途以及人医药用途所接受的赋形剂。此类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或在气雾剂组合物的情况下可为气体。

“药学上可接受的盐和酯”意指药学上可接受的并具有所需药理学特性的盐和酯。此类盐包括可以形成的盐，其中存在于化合物中的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应。适合的无机盐包括用碱金属形成的那些，所述碱金属例如钠和钾、镁、钙以及铝。适合的有机盐包括用有机碱形成的那些，所述有机碱诸如胺碱，例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N甲基葡糖胺等。此类盐还包括用无机酸(例如，盐酸和氢溴酸)和有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、马来酸、以及烷烃-和芳烃-磺酸诸如甲烷磺酸和苯磺酸)形成的酸加成盐。药学上可接受的酯包括由存在于化合物中的羧基、磺酰基和膦酰基形成的酯，例如，C_1-6烷基酯。当存在两个酸性基团时，药学上可接受的盐或酯可以是单酸单盐或酯或二盐或酯；并且类似地在存在超过两个酸性基团时，一些或所有此类基团可以被盐化或酸化。本发明中命名的化合物可以未盐化或未酯化形式、或以盐化和/或酯化形式存在，并且此类化合物的命名意图包括初始(未盐化和未酯化)化合物及其药学上可接受的盐和酯。而且，本发明中命名的某些化合物可以超过一种立体异构形式存在，并且此类化合物的命名意图包括所有单一立体异构体和此类立体异构体的所有混合物(外消旋的或其他的)。

术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”以及其语法变体当是指组合物、载体、稀释剂和试剂时可互换使用并且表示材料能够施用至或施用于人类而不会产生将禁止施用该组合物的程度的不期望的生理作用。

方法

根据本发明，RGMb拮抗剂的治疗组合物作为治疗药物施用至经历移植的受试者和/或作为预防性药物施用至移植物。如以上所述的移植物包括器官、组织、造血细胞等。

在一些实施方案中，移植物包括造血细胞(骨髓、外周干细胞、造血干细胞等)，并且拮抗剂被提供来治疗或预防GVHD的发展。本领域技术人员可以确定将潜在地受益于治疗剂的患者，所述治疗剂将减少或预防GVHD的发展。本领域技术人员可以基于若干种考虑因素确定待施用至受试者的组合物的治疗有效量，所述考虑因素诸如局部作用、药效动力学、吸收、代谢、递送方法、年龄、体重、疾病严重性以及对疗法的应答。

另一个实施方案为通过在供体组织或细胞移植到受体中之前向所述供体组织或细胞施用RGMb拮抗剂来治疗、预防或减少发展移植物抗宿主疾病的风险。据设想向供体组织或细胞施用组合物将减弱供体中的免疫细胞并防止发展针对受体组织的免疫应答，从而预防或减弱GVHD。

在其他实施方案中，移植物为实体组织或器官，具体地包括胰腺和/或胰岛。治疗可以是治疗性的或预防性的，以减少对组织的排斥并改进功能，例如在炎症存在下。

RGMb拮抗剂组合物也可以胃肠外施用，这包括但不限于真皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、动脉内、心肌内、经心内膜、经心外膜、鞘内、以及输注技术。另外，RGMb拮抗剂可以在移植之前与供体组织或细胞离体接触。

在本发明的一个实施方案中，组合物以有效量施用以降低、减少、抑制或消除GVHD和与标准疗法相关的毒性。组合物中抗体的量可以从约1ng至约1g，更优选地0.1mg至约100mg改变。

治疗方案也可以改变并且通常取决于患者的健康和年龄。某些类型的疾病将需要更积极的治疗，同时某些患者不能耐受更繁重的方案。临床医生将最佳地适于基于治疗性制剂的已知功效和毒性(如果有的话)来做出此类决定。

在具体的实施方案中，组合物以单一剂量或多个剂量给予。单一剂量可以每日一次或每日多次、或每周多次、或者每月一次或每月多次施用。一系列剂量可以每日一次或每日多次、每周一次或每周多次、或者每月一次或每月多次施用。

所述改进为任何可观察的或可测量的改进。因此，本领域技术人员认识到治疗可以改善患者或受试者的病状，但不能完全治愈所述疾病。在某些方面，组合物以有效量施用以降低、减少、抑制或消除针对受体的免疫应答水平。

GHVD或移植物存活和功能的改进也是任何可观察的或可测量的改进。因此，本领域技术人员认识到治疗可以改善患者或受试者的病状，但不能完全治愈所述疾病。在某些方面，组合物以有效量施用以降低、减少、抑制或消除来自供体细胞、组织和/或器官的针对宿主组织的免疫应答水平。GVHD可以是急性的或慢性的或轻度的或严重的。急性症状的改进包括以下任一种：例如减少皮疹、减少痢疾、增加肝功能、减少对感染的易感性。慢性症状的改进包括但不限于减少、减少皮炎、减少毛发损失、减少肝损害、减少干眼和口干、减少对感染的易感性以及减少肺和/或胃肠病症。

为了增加本发明的组合物的施用效果，希望将这些组合物与标准疗法组合。例如，已知的免疫抑制剂可以与本发明的组合物组合使用。已知预防器官排斥的示例性药剂为T细胞修饰剂诸如环孢霉素(Neoral^TM，Sandimmune^TM)、泼尼松(Novo Prednisone^TM，ApoPrednisone^TM)、硫唑嘌呤(Imuran^TM)、他克莫司或FK506(Prograf^TM)、麦考酚酸莫酯(CellCept^TM)、OKT3(Muromorab CO3^TM，Orthoclone^TM)、ATGAM^TM&Thymoglobulin^TM或丝氨酸-苏氨酸磷酸酶钙调磷酸酶(CN)抑制剂。在具体实施方案中，GVHD的标准或批准的治疗为高剂量皮质类固醇，主要为高剂量甲泼尼龙，其与本发明的组合物组合使用。

除免疫抑制之外，其他抗排斥和/或抗-GVHD疗法可以与本发明的方法组合使用。例如，用于预先调理和预防GVHD的疗法包括但不限于全身照射、全淋巴照射、阿糖胞苷、L-苯丙氨酸氮芥、环磷酰胺、依托泊苷、三乙烯硫代磷酰胺、抗胸腺细胞球蛋白、白消安、他克莫司、甲泼尼龙、环孢菌素、或甲氨蝶呤。用于治疗GVHD的实验性疗法包括但不限于细胞因子抑制剂/拮抗剂(例如，抗-TNFα抗体)；IL-1受体拮抗剂；重组IL-1受体；T-细胞活化抑制剂(例如，他克莫司)；抗代谢物(例如，麦考酚酸莫酯)；抗-CD3抗体(莫罗单抗，OKT3)；抗-CD25抗体；抗-IL2受体单克隆抗体达利珠单抗；使用离体8-甲氧基补骨脂素的体外光分离置换法；抗胸腺细胞球蛋白(Thymoglobulin^TM或ATGAM^TM)；ABX-CBL或CBL-1；或维西力珠单抗(Nuvion^TM)。

本发明的组合物可在其他药剂之前、与其他药剂同时和/或在其他药剂之后以数分钟至数周范围的间隔进行。在向细胞、组织或生物体单独施加本发明的组合物和其他药剂的实施方案中，通常将确保在每次递送时间之间，有相当长的时间段不会到期，使得所述组合物和药剂仍能够对细胞、组织或生物体发挥有利的组合效应。

采用组合物和一种或多种药剂的不同组合方案。本领域技术人员知道本发明的组合物和药剂可以任何顺序或组合施用。

RGMb拮抗剂，例如结合至RBMB并阻断其活性的抗体，可以与药学上可接受的赋形剂以及任选地持续释放的基质诸如生物可降解聚合物组合，以形成治疗性组合物。

“药学上”或“药学上可接受的”是指在适当时当向哺乳动物(特别是人类)施用时不产生副作用、过敏或其他不利反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或任何类型的配制助剂。

药物组合物的形式、施用路径、剂量和方案自然地取决于待治疗的病状、疾病严重性、患者的年龄、体重、性别等。

本发明的药物组合物可以被配制用于局部、口服、胃肠外、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内施用等。

优选地，药物组合物包含对于能够注射的制剂为药学上可接受的媒介物。这些制剂具体地可以是等张的无菌盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或此类盐的混合物)、或者干燥的尤其冷冻干燥的组合物，所述干燥的组合物根据情况在添加无菌水或生理盐水时允许构成可注射溶液。

用于施用的剂量可以适用作不同参数的函数，并且具体地适用作所使用的施用模式、相关病理学或可替代地所需治疗持续时间的函数。为了制备药物组合物，可以将有效量的抗体溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包含芝蔴油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须为无菌的且必须为易于注射的流体。在制造和储存条件下，所述组合物必须稳定且必须在贮存中防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。

作为游离碱的活性化合物或药理学上可接受的盐的溶液可以在适当地与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)混合的水中制备。分散液也可在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

本发明的抗体可配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐类包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，所述盐类由例如像盐酸或磷酸的无机酸，或诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸形成。由游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱(诸如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物)和有机碱(诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

载体也可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油的溶剂或分散介质。

可例如通过使用诸如卵磷脂等包衣、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

对微生物作用的防止可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等)来实现。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。

可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

无菌可注射溶液是通过将在适当溶剂中的所需量的活性化合物与以上列举的各种其他成分(根据需要)合并，随后进行过滤灭菌来制备。

通常，通过将各种灭菌活性成分合并到包含基本分散介质和来自以上列举的所需其他成分的无菌媒介物中来制备混悬液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，此举产生活性成分加来自其前述无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。

还涵盖用于直接注射的更大浓度或高度浓缩溶液的制备，其中设想使用DMSO作为溶剂以引起极端快速的渗透，从而向小肿瘤区域递送高浓度的活性剂。

在配制时，溶液将以可与剂量配制物相容的方式并且以如治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型，诸如上述可注射溶液类型施用，但也可采用药物释放胶囊等。

关于以水溶液肠胃外施用，举例来说，所述溶液在需要时应适当缓冲并且液体稀释剂首先使得用充足生理盐水或葡萄糖等张。

这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就这一点而言，可以使用的无菌水性介质将为本领域技术人员根据本公开内容所已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等张的NaCl溶液中并且将其添加到1000ml皮下灌注流体中或者注射在所提出的输注部位(参见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版，第1035-1038和1570-1580页)。取决于受治疗受试者的状况，将必需对剂量进行一些变化。负责施用的个人将在任何情况下决定用于个别受试者的适当剂量。

本发明的抗体可以被配制在治疗性混合物中以包含每剂量约0.0001至1.0毫克、或约0.001至0.1毫克、或约0.1至1.0或甚至约10毫克等。也可施用多个剂量。除了配制用于胃肠外施用诸如静脉内或肌内注射的化合物之外，其他药学上可接受的形式包括例如用于口服施用的片剂或其他固体；定时释放胶囊；以及目前使用的任何其他形式。

在某些实施方案中，涵盖使用脂质体和/或纳米颗粒来将抗体引入到宿主细胞中。所述脂质体和/或纳米颗粒的形成和用途为本领域技术人员所已知的。

本发明将根据以下附图和实施例来进一步说明。

施用

在移植实体器官或组织之后，可存在其中出现针对器官的免疫应答的发作。在此类发作期间，移植的组织受到应激并且可能遭受功能减弱。移植的组织的功能通过施用RGMb的拮抗剂来改进。

排斥发作的诊断可以利用临床数据、用于活化免疫功能的标记、组织损害的标记等。组织学体征包括：浸润的T细胞，可能伴随浸润的嗜酸性粒细胞、浆细胞和中性粒细胞(特别是指示比率)，组织解剖结构的结构受损，通过移植的组织类型而改变，以及对血管的损伤。然而，组织活检受到取样限制和侵入性程序的风险/并发症的限制。体内反射性标记的免疫细胞的细胞磁共振成像(MRI)可以提供非侵入性测试。

本发明的制剂可以在排斥发作的初始指示时施用至受影响组织，并且可以维持一个时间段；例如按需要约1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周等。施用可以像需要一样频繁，例如每小时、约3至4小时、半天、每天等。

实验

排斥性导向分子b(RGMb)为作为排斥性轴突生长导向因子发现的表面受体，所述排斥性轴突生长导向因子通过结合至细胞表面受体神经发生素(neugenin)和表面或可溶性骨形态发生蛋白(BMP；确切地为2和4)来指导胚胎大脑发育。最近，RGMb已显示在肺粘膜免疫力中起重要作用，部分因为它也通过与其BMP/神经发生素结合位点分开的结合位点结合至程序性细胞死亡蛋白质2(PDL-2)。RGMb在大脑、肺、胰腺和肠内表达。RGMb在肠隐窝中表达，所述肠隐窝为GVHD活性的主要位点。BMP2和4似乎在粘膜表面中介导与RGMb结合一致的显著炎性信号，而PDL-2结合似乎促进粘膜耐受性。RGMb可对于GVHD的发作于在HCT情况下重要的粘膜耐受性中起作用。

图1中示出RGMb的阻断，以防止GVHD并允许或促进植入。使用其中向小鼠给予白血病细胞系(A20和BCL2)连同HCT(n＝5只小鼠/组，在至少3次独立实验中)的HCT标准小鼠模型，用对RGMb有特异性的抗体治疗动物，并且确定动物清除A20和BCL2而不发展GVHD的能力。

RGMb在人类(7种所述的)和小鼠(3+种所述的)中具有许多剪接变体。尚未描述在非神经组织中这些变体的组织特异性表达。从获自本身生物样本库或斯坦福大学癌症研究所生物样本库的鼠类和人类肠、血液和神经组织来源提取mRNA。扩增RGMb基因座，接着进行尺寸选择和使用公开引物进行验证的Sanger测序，以确定剪接变体的组织特异性表达。

用由2个剂量的以4小时间隔施用的4.0Gy组成的致命性全身照射处理BALB/c受体小鼠。在同一天，将5x10⁶TCD-BM(T-细胞消耗的骨髓)细胞连同来自C57BL/6小鼠的10⁶Tcon(常规T细胞)一起经由尾静脉注射。在骨髓移植前一天以及在第3天，7只小鼠接受抗-RGMBmAb(9D1)(400μg/小鼠)。评定在GVHD诱导后的存活。

接受同种异体Tcon并用抗-RGMB mAb预防性治疗的小鼠得到保护，使其与接受单独的Tcon的小鼠相比免于致命性GVHD。

图2所示，将C57Bl/6luc⁺(C57Bl/6荧光素酶阳性)小鼠用作胰腺供体。将小鼠处死并且通过灌注和消化组织来分离胰岛。手动挑选高品质胰岛并计数。每只雌性近交Balb/c小鼠均接受大约500个胰岛。在左肾下的凹部植入胰岛。通过注射萤火虫荧光素，之后用IVIS谱成像系统(Xenogen)进行图像采集来进行成像。用Living Image软件4.2(Xenogen)分析图像。

通过在胰岛移植第-1天、第+3天和第+7天注射3个剂量的抗-RGMb抗体(克隆9D1)来阻断RGMb与同种型对照相比显著延长了胰岛植入。

Claims

1.一种用于减少移植中不期望的免疫应答的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用治疗有效量的RGMb拮抗剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述拮抗剂是抗体。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中移植物细胞在移植之前与所述RGMb拮抗剂接触。

4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述RGMb拮抗剂在移植所述移植物之后施用。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述移植是实体器官或来源于所述实体器官的组织的移植。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述器官为胰腺。

7.如权利要求5或权利要求6所述的方法，其中胰岛被移植。

8.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述移植是造血细胞移植。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述不期望的免疫应答是移植物抗宿主疾病。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述移植物抗宿主疾病是急性移植物抗宿主疾病(aGVHD)。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述移植物抗宿主疾病是慢性移植物抗宿主疾病(cGVHD)。