KR102138998B1 - 제어성 t 세포의 활성화제 및 그의 사용 - Google Patents

Abstract

DNAX 보조 분자-1(DNAM-1) 및 CD155의 결합을 저해하는 물질을 포함하는 제어성 T 세포의 활성화제.

Description

제어성 T 세포의 활성화제 및 그의 사용

본 발명은 제어성 T 세포의 활성화제 및 그의 사용에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 제어성 T 세포의 활성화제, 제어성 T 세포 활성화용 의약 조성물, 항인간 DNAX 보조 분자-1(DNAX Accessory Molecule-1; DNAM-1) 모노클로날 항체 또는 그의 단편, 핵산, 벡터 및 형질 전환체에 관한 것이다. 본원은 2016년 4월 20일에 일본에 출원된 일본 특허 출원 제2016-084170호에 기초하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.

수혈 또는 줄기 세포 이식 후에, 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD)이 발병하는 경우가 있다. 이식편대숙주병은, 이식 세포 중에 존재하는 도너 유래의 활성화 T 세포가 레시피언트의 세포를 상해함으로써 발생한다. 또한, 도너의 장기를 레시피언트에 이식하면 거절 반응이 일어나는 경우가 있다. 예를 들어, 심장 이식, 혈관 이식, 신장 이식 등에 있어서, 이식된 심장, 혈관, 신장은 일시적으로는 생착하지만, 점차 박리 등이 확인되는 경우가 있다. 이 때문에, 이식편대숙주병이나 장기 이식 거절을 억제하는 기술이 요구되고 있다.

예를 들어, 특허문헌 1에는, 마우스 DNAM-1 단백질에 대한 중화 항체가, 마우스에 있어서의 이식 심장, 이식 혈관 또는 이식 신장의 생착을 유지하는 약제로서 사용 가능한 것이 기재되어 있다.

DNAM-1 단백질은 CD226이라고도 불리는 분자량 65kDa의 면역 글로불린 슈퍼 패밀리에 속하는 접착 분자이다. DNAM-1 단백질의 발현은 인간이나 마우스의 CD4⁺T 세포, CD8⁺T 세포, NK 세포, 마크로파지, 수상(樹狀) 세포 등의 각종 면역 세포에서 확인된다. 인간 DNAM-1의 RefSeq ID는 NP_001290547이며, 마우스 DNAM-1의 RefSeq ID는 NP_001034238이다. 발명자들은 이전에, DNAM-1 단백질이 폴리오 바이러스 리셉터로서 알려져 온 CD155에 결합하는 것을 밝혀내었다. CD155는 이뮤노글로불린 수퍼패밀리에 속하는 I형 막관통 당단백질이다.

일본 특허 공개 제2013-245162호 공보

이러한 배경 하에, 본 발명은 인간의 면역 반응을 억제할 수 있는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 이하의 양태를 포함한다.

[1] DNAM-1 및 CD155의 결합을 저해하는 물질을 포함하는, 제어성 T 세포의 활성화제.

[2] DNAM-1 및 CD155의 결합을 저해하는 상기 물질이, DNAM-1에 대한 특이적 결합 물질, DNAM-1 발현 저해제, CD155에 대한 특이적 결합 물질 또는 CD155 발현 저해제인, [1]에 기재된 제어성 T 세포의 활성화제.

[3] 이식편대숙주병, 장기 이식 거절, 자기 면역 질환, 섬유화 질환, 염증성 장염 또는 알레르기의 예방 또는 치료용인, [1] 또는 [2]에 기재된 제어성 T 세포의 활성화제.

[4] DNAM-1 및 CD155의 결합을 저해하는 상기 물질이, DNAM-1에 대한 특이적 결합 물질이며, 상기 DNAM-1은 인간 DNAM-1이고, 상기 특이적 결합 물질은 항체 또는 그의 단편이고, 상기 항체 또는 그의 단편은, 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자와 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 100ng 이하로 상기 인간 DNAM-1 분자를 포화할 수 있는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 제어성 T 세포의 활성화제.

[5] DNAM-1 및 CD155의 결합을 저해하는 상기 물질이, DNAM-1에 대한 특이적 결합 물질이며, 상기 DNAM-1은 인간 DNAM-1이고, 상기 특이적 결합 물질은 항체 또는 그의 단편이고, 상기 항체 또는 그의 단편은, 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자를, 인간 CD155와 IgG형 항체 정상 영역의 융합 단백질 1000ng으로 포화시킨 후에 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 500ng 이하로, 상기 융합 단백질과 상기 인간 DNAM-1 분자의 결합을 완전히 저해할 수 있는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 제어성 T 세포의 활성화제.

[6] 상기 항체는 인간형 항체인, [4] 또는 [5]에 기재된 제어성 T 세포의 활성화제.

[7] 상기 항체 또는 그의 단편은, 상보성 결정 영역(CDR) 1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖거나, 또는 인간 DNAM-1과 결합시킨 경우에, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체와 경합하는, [4] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 제어성 T 세포의 활성화제.

[8] 상기 항체 또는 그의 단편은, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, [4] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 제어성 T 세포의 활성화제.

[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 제어성 T 세포의 활성화제와, 약학적으로 허용할 수 있는 담체를 포함하는, 제어성 T 세포 활성화용 의약 조성물.

[10] 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자와 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 100ng 이하로 상기 인간 DNAM-1 분자를 포화할 수 있는, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

[11] 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자를, 인간 CD155와 IgG형 항체 정상 영역의 융합 단백질 1000ng으로 포화시킨 후에 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 500ng 이하로, 상기 융합 단백질과 상기 인간 DNAM-1 분자의 결합을 완전히 저해할 수 있는, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

[12] 인간형 항체 또는 그의 단편인, [10] 또는 [11]에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

[13] CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖거나, 또는 인간 DNAM-1과 결합시킨 경우에, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체와 경합하는, [10] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

[14] CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, [10] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

[15] CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, [10] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

[16] 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열 또는 서열 번호 8의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, [10] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

[17] 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, [16]에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

[18] 서열 번호 9의 아미노산 서열 또는 서열 번호 9의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 10의 아미노산 서열 또는 서열 번호 10의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, [10] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

[19] 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, [18]에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편.

[20] [10] 내지 [19] 중 어느 하나에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산.

[21] [20]에 기재된 핵산을 함유하는 벡터.

[22] [21]에 기재된 벡터를 함유하는 형질 전환체.

(1) CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 항인간 DNAX 보조 분자-1(DNAM-1) 모노클로날 항체 또는 항체 프래그먼트(항체 단편).

(2) CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, (1)에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 항체 프래그먼트.

(3) 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열 또는 서열 번호 8의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, (1) 또는 (2)에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 항체 프래그먼트.

(4) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 항체 프래그먼트.

(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 항체 프래그먼트를 코딩하는 핵산.

(6) (5)에 기재된 핵산을 함유하는 재조합 벡터.

(7) (6)에 기재된 재조합 벡터를 함유하는 형질 전환체.

(8) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 항체 프래그먼트를 유효 성분으로서 함유하는 면역 제어제.

(9) 이식편대숙주병의 예방 또는 치료제인, (8)에 기재된 면역 제어제.

(10) 장기 이식 거절의 예방 또는 치료제인, (8)에 기재된 면역 제어제.

본 발명에 따르면, 인간의 면역 반응을 억제할 수 있는 기술을 제공할 수 있다.

도 1은 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 No.1 내지 6의 중쇄 아미노산 서열을 얼라인먼트한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 No.1 내지 6의 경쇄 아미노산 서열을 얼라인먼트한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3의 (a) 내지 (d)는 실험예 2의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4의 (a) 내지 (l)은 실험예 3의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5의 (a) 내지 (e)는 실험예 4에 있어서, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 No.1 내지 6의 반응성을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6의 (a) 내지 (e)는 실험예 5에 있어서, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 No.1 내지 6의 반응성을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7의 (a) 내지 (e)는 실험예 6에 있어서, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 No.1 내지 6의 반응성을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8의 (a) 내지 (e)는 실험예 7에 있어서, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 No.1 내지 6의 반응성을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 실험예 8에 있어서의 혼합 림프구 반응 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 실험예 9의 실험 프로토콜을 나타내는 도면이다.
도 11은 실험예 9에 있어서의 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 12의 (a) 및 (b)는 실험예 9에 있어서의 마우스의 간 기능을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 실험예 10의 실험 프로토콜을 나타내는 도면이다.
도 14는 실험예 10에 있어서의 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 15는 실험예 11에 있어서, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체를 반응시킨 CD8⁺T 세포의 세포 상해 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16의 (a)는 실험예 12에 있어서, 모노클로날 항체 No.1을 투여하고 나서 14일 후의 마우스의 비장 중의 CD4⁺T 세포에 있어서의 제어성 T 세포의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. (b)는 실험예 12에 있어서, 모노클로날 항체 No.1을 투여하고 나서 14일 후의 마우스의 말초혈 중의 CD4⁺T 세포에 있어서의 제어성 T 세포의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17의 (a)는 실험예 13에 있어서, 뇌척수염의 발병율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 또한, (b)는 실험예 13에 있어서, 임상 스코어의 평균값을 산출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18의 (a)는 실험예 14에 있어서, 혈청 중의 알칼리 포스파타아제를 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. (b)는 실험예 14에 있어서, 혈청 중의 총 빌리루빈을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19의 (a)는 실험예 14)에 있어서의 대조 마우스의 간장 조직의 현미경 사진이다. (b)는 실험예 14에 있어서의 DNAM-1 유전자 결손 마우스의 간장 조직의 현미경 사진이다.
도 20의 (a)는 실험예 15에 있어서 마손 트리크롬 염색한 신장의 절단면의 사진이다. (b)는 (a)에 기초하여 신장 피질의 면적을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 21의 (a)는 실험예 15에 있어서, 대조 마우스의 신장 조직 절편을 항α-SMA 항체로 면역 염색한 대표적인 결과를 나타내는 현미경 사진이다. (b)는 실험예 15에 있어서, DNAM-1 유전자 결손 마우스의 신장 조직 절편을 항α-SMA 항체로 면역 염색한 대표적인 결과를 나타내는 현미경 사진이다. (c)는 실험예 15에 있어서, 각 군의 마우스 신장 조직에 있어서의 α-SMA 양성 영역의 면적을 산출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 22는 실험예 16에 있어서, 대조 마우스 및 DNAM-1 유전자 결손 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 23의 (a)는 실험예 16에 있어서, 실험 개시로부터 9일째에 적출한, DNAM-1 유전자 결손 마우스의 대장 사진이다. (b)는 실험예 16에 있어서, 실험 개시로부터 9일째에 적출한 대조 마우스의 대장 사진이다. (c)는 (a) 및 (b)의 결과를 수치화한 그래프이다.

[제어성 T 세포의 활성화제]

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, DNAM-1 및 CD155의 결합을 저해하는 물질을 포함하는, 제어성 T 세포의 활성화제를 제공한다.

실시예에 있어서 후술하는 바와 같이, 발명자들은 DNAM-1과 CD155의 결합을 저해함으로써, 제어성 T 세포를 활성화할 수 있음을 밝혀내었다. 따라서, DNAM-1 및 CD155의 결합을 저해하는 물질은, 제어성 T 세포의 활성화 용도로 사용할 수 있다.

DNAM-1 및 CD155의 결합을 저해하는 물질로서는, 예를 들어 DNAM-1에 대한 특이적 결합 물질, DNAM-1 발현 저해제, CD155에 대한 특이적 결합 물질, CD155 발현 저해제 등을 들 수 있다.

DNAM-1에 대한 특이적 결합 물질, CD155에 대한 특이적 결합 물질로서는, DNAM-1 및 CD155의 결합을 저해할 수 있는 물질이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 항체, 항체 단편, 앱타머 등을 들 수 있다. 항체는 마우스 등의 동물을 면역시킴으로써 제작한 것이어도 되고, 파지 라이브러리 등의 항체 라이브러리의 스크리닝에 의해 제작한 것이어도 된다. 또한, 항체 단편으로서는, F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv 등을 들 수 있다. 또한, 앱타머로서는, 예를 들어 핵산 앱타머, 펩티드 앱타머 등을 들 수 있다.

또한, DNAM-1에 대한 특이적 결합 물질은, 가용화한 CD155여도 된다. 가용화한 CD155로서는, 예를 들어 CD155와 항체 정상 영역의 융합 단백질 등을 들 수 있다. 또한, CD155에 대한 특이적 결합 물질은, 가용화한 DNAM-1이어도 된다. 가용화한 DNAM-1로서는, 예를 들어 DNAM-1과 항체 정상 영역의 융합 단백질 등을 들 수 있다.

DNAM-1 발현 저해제, CD155 발현 저해제로서는, DNAM-1 또는 CD155의 발현을 저감시켜, 결과적으로 DNAM-1 및 CD155의 결합을 저해할 수 있는 물질이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임, 안티센스 핵산, 저분자 화합물 등을 들 수 있다. siRNA, shRNA, miRNA, 리보자임 및 안티센스 핵산은, 안정성이나 활성을 향상시키기 위해서, 각종 화학 수식을 포함하고 있어도 된다. 예를 들어, 뉴클레아제 등의 가수 분해 효소에 의한 분해를 방지하기 위해서, 인산 잔기를, 예를 들어 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오네이트 등의 화학 수식 인산 잔기로 치환해도 된다. 또한, 적어도 일부를 펩티드 핵산(PNA) 등의 핵산 유사체에 의해 구성해도 된다.

제어성 T 세포란, Treg, 조절성 T 세포라고도 불리는 T 세포의 일종이다. 제어성 T 세포는 면역 응답의 억제적 제어를 행하는 것이 밝혀져 있다. 제어성 T 세포로서는, 예를 들어 CD4⁺CD25⁺T 세포, Foxp3⁺CD25⁺T 세포, CD4⁺Foxp3⁺세포 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 제어성 T 세포의 활성화란, 제어성 T 세포의 세포수의 증가, 제어성 T 세포가 발현하는 TGF-β, IL-10 등의 억제성 사이토카인의 발현량의 증가, T 세포에 의한 면역 응답의 억제, 면역 응답 전반의 억제 등을 의미한다.

본 실시 형태의 제어성 T 세포의 활성화제는, 제어성 T 세포의 활성화에 의해 증상을 경감시킬 수 있는 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 이러한 질환으로서는, 예를 들어 이식편대숙주병, 장기 이식 거절, 자기 면역 질환, 섬유화 질환, 염증성 장염, 알레르기 등을 들 수 있다.

여기서, 자기 면역 질환으로서는, 예를 들어 류머티즘, I형 당뇨병, 자기 면역성 뇌척수염 등을 들 수 있다. 또한, 섬유화 질환이란, 폐, 심장, 간장, 신장 등의 각종 장기에 있어서, 조직이 I형 콜라겐 등으로 치환되는 질환이며, 예를 들어 간경변, 당뇨병성 신증, 폐섬유증 등을 들 수 있다. 알레르기로서는, 예를 들어 알레르기성 비염, 아토피성 피부염 등을 들 수 있다.

본 실시 형태의 제어성 T 세포의 활성화제는, 예를 들어 DNAM-1에 대한 특이적 결합 물질이어도 되고, 특이적 결합 물질은 항체 또는 그의 단편이어도 된다. 여기서, DNAM-1은 제어성 T 세포를 활성화하는 대상의 종의 DNAM-1이면 되고, 예를 들어 인간 DNAM-1이어도 된다. 즉, 본 실시 형태의 제어성 T 세포의 활성화제는 항인간 DNAM-1 항체 또는 그의 단편이어도 된다.

여기서, 항인간 DNAM-1 항체 또는 그의 단편으로서는, 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자와 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 100ng 이하, 바람직하게는 80ng 이하, 보다 바람직하게는 50ng 이하, 더욱 바람직하게는 40ng 이하, 특히 바람직하게는 30ng 이하로, 상기 림프구의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자를 포화할 수 있는 반응성을 갖는 것이 바람직하다. 실시예에 있어서 후술하는 바와 같이, 이러한 반응성을 갖는 항인간 DNAM-1 항체는, 제어성 T 세포의 활성화능이 높다.

여기서, 예를 들어 대상의 항체가 예를 들어 항체 단편 등인 경우에는, IgG형 항체 전체 길이의 질량으로 환산하여 반응성을 계산하면 된다. 이 경우, 예를 들어 항체 단편과 IgG형 항체 전체 길이의 분자량에 기초하여 질량을 환산하면 된다.

또한, 본 실시 형태의 제어성 T 세포의 활성화제로서 적합한 항인간 DNAM-1 항체 또는 그의 단편은, 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자를, 인간 CD155와 IgG형 항체 정상 영역의 융합 단백질 1000ng으로 포화시킨 후에, 상기 림프구와 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 500ng 이하, 바람직하게는 400ng 이하, 보다 바람직하게는 300ng 이하, 더욱 바람직하게는 200ng 이하, 특히 바람직하게는 100ng 이하로, 상기 융합 단백질과 상기 림프구의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자의 결합을 완전히 저해할 수 있는 반응성을 갖는 것이어도 된다.

즉, 이러한 반응성을 갖는 항인간 DNAM-1 항체는, DNAM-1과 CD155가 미리 결합되어 있는 경우에 있어서도, 이 결합을 해제할 수 있다. 실시예에 있어서 후술하는 바와 같이, 이러한 반응성을 갖는 항인간 DNAM-1 항체는, 제어성 T 세포의 활성화능이 높다.

여기서, 완전히 저해한다는 것은, 실질적으로 완전히 저해할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자를, 인간 CD155와 IgG형 항체 정상 영역의 융합 단백질 1000ng으로 포화시킨 후에, 상기 림프구와 반응시킨 경우에, 상기 림프구의 표면에 결합되어 있던 융합 단백질 중, 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 99％ 이상을 해리시켜, 림프구의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자와 결합할 수 있음을 의미한다.

또한, 본 실시 형태의 제어성 T 세포의 활성화제는, 항인간 CD155 항체 또는 그의 단편이어도 된다.

본 실시 형태의 제어성 T 세포의 활성화제에 있어서, 항인간 DNAM-1 항체 혹은 그의 단편, 또는 항인간 CD155 항체 혹은 그의 단편은, 인간형 항체 혹은 그의 단편인 것이 바람직하다.

제어성 T 세포의 활성화제가 인간형 항체 또는 그의 단편이면, 인간에게 투여해도 면역원성이 낮기 때문에, 아나필락시스 쇼크 등의 부작용을 억제할 수 있다. 인간형 항체로서는, 키메라 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 키메라 항체란, 가변 영역이 비인간 동물 유래의 항체이며, 정상 영역의 적어도 일부가 인간 유래의 항체인 항체를 의미한다. 또한, 인간화 항체란, 중쇄 및 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR)만이 비인간 동물 유래의 항체이며, 정상 영역 및 프레임워크 영역이 인간 유래의 항체인 항체를 의미한다. 또한, 완전 인간 항체란, 상보성 결정 영역을 포함하여 전체가 인간 유래의 항체를 의미한다.

본 실시 형태의 제어성 T 세포의 활성화제에 있어서, 항인간 DNAM-1 항체 또는 그의 단편은, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 단편이어도 된다.

여기서, 중쇄 가변 영역의 CDR1 또는 CDR2에 있어서의 수개란, 4개, 3개 또는 2개를 의미한다. 또한, 중쇄 가변 영역의 CDR3에 있어서의 수개란 2개를 의미한다. 또한, 경쇄 가변 영역의 CDR1 또는 CDR3에 있어서의 수개란, 4개, 3개 또는 2개를 의미한다. 또한, 경쇄 가변 영역의 CDR2에 있어서의 수개란 2개를 의미한다.

CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체로서는, 예를 들어 실시예에 있어서 후술하는 모노클로날 항체 No.1, 모노클로날 항체 No.1을 인간형화한 항체 등을 들 수 있다.

또한, 항인간 DNAM-1 항체는 모노클로날 항체 No.1에 한정되지 않고, 모노클로날 항체 No.1과 동등 이상의 반응성을 갖는 것이면 본 실시 형태의 제어성 T 세포의 활성화제로서 사용할 수 있다. 따라서, 항인간 DNAM-1 항체는, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체여도 된다. 이러한 항체로서는, 예를 들어 실시예에 있어서 후술하는 모노클로날 항체 No.2 내지 6, 모노클로날 항체 No.2 내지 6을 인간형화한 항체 등을 들 수 있다.

또는, 항인간 DNAM-1 항체 또는 그의 단편은, 인간 DNAM-1과 결합시킨 경우에, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체와 경합하는 항체 또는 그의 단편이어도 된다. 즉, 항인간 DNAM-1 항체는, 인간 DNAM-1과의 결합에 대해서, 실시예에 있어서 후술하는 모노클로날 항체 No.1과 경합하는 항체여도 된다. 모노클로날 항체 No.1과 경합하는 항체는, 인간 DNAM-1과의 결합에 대해서, 모노클로날 항체 No.1과 동등 이상의 반응성을 갖는다.

여기서, 대상의 항체가 경합한다는 것은, 예를 들어 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자에, 실시예에 있어서 후술하는 모노클로날 항체 No.1을 반응시킨 후에, 대상의 항체를 상기 림프구와 반응시킨 경우에, 모노클로날 항체 No.1과 인간 DNAM-1 분자의 결합을 적어도 일부 해리시켜, 인간 DNAM-1 분자와 결합할 수 있음을 의미한다.

여기서, 적어도 일부란, 상기 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자 전체의 10％ 이상이어도 되고, 30％ 이상이어도 되고, 50％ 이상이어도 되고, 70％ 이상이어도 되고, 90％ 이상이어도 된다.

[제어성 T 세포 활성화용 의약 조성물]

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 상술한 제어성 T 세포의 활성화제와, 약학적으로 허용할 수 있는 담체를 포함하는, 제어성 T 세포 활성화용 의약 조성물을 제공한다.

약학적으로 허용되는 담체로서는, 일반적으로 제제에 사용되는 것을 사용할 수 있고, 예를 들어 부형제, 안정제, 주사제용 용제 등을 들 수 있다. 주사제용 용제로서는, 예를 들어 생리 식염수, 포도당, D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨 등의 보조약을 포함하는 등장액을 들 수 있다.

본 실시 형태의 의약 조성물은, 상술한 제어성 T 세포의 활성화제, 약학적으로 허용할 수 있는 담체 이외에도 첨가물을 포함하고 있어도 된다. 첨가물로서는, 예를 들어 pH 조절제, 점도 개량제, 착색제, 이식편대숙주병이나 장기 이식 거절의 치료에 있어서 종래 사용되어 온 스테로이드류, 면역 제어제 등을 들 수 있다.

본 실시 형태의 의약 조성물의 제형은 한정되지 않고, 예를 들어 동결 건조제, 분말 제제, pH가 조정된 완충액에 의한 용액 제제, 주사용 마이크로캡슐제 등을 들 수 있다.

본 실시 형태의 의약 조성물은, 예를 들어 주사제 또는 점적 주입제로서, 정맥 내 투여 등에 의해 환자에게 투여된다. 그 투여량, 투여 경로, 처방은 환자의 증상, 체중, 연령, 성별 등에 따라서 적절히 결정하면 된다.

본 실시 형태의 의약 조성물의 투여량은, 환자의 증상, 체중, 연령, 성별 등에 따라서 상이하여, 일률적으로는 결정할 수 없지만, 처치를 필요로 하는 인간 환자에 대하여, 1회의 투여에 있어서 1kg 체중당, 유효 성분(DNAM-1 및 CD155의 결합을 저해하는 물질)이 예를 들어 1μg 내지 100mg, 예를 들어 50μg 내지 50mg 포함되는 양을, 1일당 1회 내지 수회 투여하면 된다.

[항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편]

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자와 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 100ng 이하, 바람직하게는 80ng 이하, 보다 바람직하게는 50ng 이하, 더욱 바람직하게는 40ng 이하, 특히 바람직하게는 30ng 이하로, 상기 림프구의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자를 포화할 수 있는, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 제공한다.

실시예에 있어서 후술하는 바와 같이, 이러한 반응성을 갖는 항인간 DNAM-1 항체는, 제어성 T 세포의 활성화나, 이식편대숙주병, 장기 이식 거절, 자기 면역 질환, 섬유화 질환, 염증성 장염 등의 증상의 경감 등에 유용하다.

여기서, 예를 들어 대상의 항체가 예를 들어 항체 단편 등인 경우에는, IgG형 항체 전체 길이의 질량으로 환산하여 반응성을 계산하면 된다. 이 경우, 예를 들어 항체 단편과 IgG형 항체 전체 길이의 분자량에 기초하여 질량을 환산하면 된다. 또한, 본 실시 형태의 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편은, 임의의 기지의 항체 및 그의 단편을 제외한 것이어도 된다.

본 실시 형태의 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편은, 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자를, 인간 CD155와 IgG형 항체 정상 영역의 융합 단백질 1000ng으로 포화시킨 후에, 상기 림프구와 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 500ng 이하, 바람직하게는 400ng 이하, 보다 바람직하게는 300ng 이하, 더욱 바람직하게는 200ng 이하, 특히 바람직하게는 100ng 이하로, 상기 융합 단백질과 상기 림프구의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자와의 결합을 완전히 저해할 수 있는 반응성을 갖는 것이어도 된다.

즉, 이러한 반응성을 갖는 항인간 DNAM-1 항체는, DNAM-1과 CD155가 미리 결합되어 있는 경우에 있어서도, 이 결합을 해제할 수 있다. 여기서, 「완전히 저해하는」에 대해서는 상술한 것과 동일하다.

본 실시 형태의 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편은, 인간형 항체 또는 그의 단편이어도 된다. 인간형 항체에 대해서는 상술한 것과 동일하다.

본 실시 형태의 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편은, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 것이어도 된다.

여기서, 중쇄 가변 영역의 CDR1 또는 CDR2에 있어서의 수개란, 4개, 3개 또는 2개를 의미한다. 또한, 중쇄 가변 영역의 CDR3에 있어서의 수개란 2개를 의미한다. 또한, 경쇄 가변 영역의 CDR1 또는 CDR3에 있어서의 수개란, 4개, 3개 또는 2개를 의미한다. 또한, 경쇄 가변 영역의 CDR2에 있어서의 수개란 2개를 의미한다.

본 명세서에 있어서, 항체 단편으로서는, Fab, F(ab')₂, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 적절한 링커로 연결한 단일 쇄(single-chain) Fv(scFv) 등을 들 수 있다. scFv의 링커로서는, 예를 들어 (GGGGS)₃(서열 번호 21) 등의 펩티드를 들 수 있다.

실시예에 있어서 후술하는 바와 같이, 본 실시 형태의 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편은, 인간 DNAM-1 단백질에 양호하게 결합하고, 생체내 및 시험관내에 있어서 인간의 면역 반응을 억제할 수 있다. 이 때문에, 면역 제어제로서 이용할 수 있다.

또는, 본 실시 형태의 항인간 DNAM-1 항체 또는 그의 단편은, 인간 DNAM-1과 결합시킨 경우에, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체와 경합하는 항체 또는 그의 단편이어도 된다. 즉, 항인간 DNAM-1 항체는, 인간 DNAM-1과의 결합에 대해서, 실시예에 있어서 후술하는 모노클로날 항체 No.1과 경합하는 항체여도 된다. 모노클로날 항체 No.1과 경합하는 항체는, 인간 DNAM-1과의 결합에 대해서, 모노클로날 항체 No.1과 동등 이상의 반응성을 갖는다. 여기서, 항체의 경합에 대해서는 상술한 것과 동일하다.

항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편은, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 것이어도 된다. 이러한 항체로서는, 예를 들어 실시예에 있어서 후술하는 모노클로날 항체 No.1, 모노클로날 항체 No.1을 인간형화한 항체 등을 들 수 있다.

또한, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편은, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 것이어도 된다. 이러한 항체로서는, 예를 들어 실시예에 있어서 후술하는 모노클로날 항체 No.1, 모노클로날 항체 No.1을 인간형화한 항체 등을 들 수 있다.

또는, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편은, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 것이어도 된다. 이러한 항체로서는, 예를 들어 실시예에 있어서 후술하는 모노클로날 항체 No.2, 모노클로날 항체 No.2를 인간형화한 항체 등을 들 수 있다.

또한, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편은, 인간 DNAM-1에 대한 반응성을 갖고 있는 한, 서열 번호 7의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 것이어도 된다.

또는, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편은, 인간 DNAM-1에 대한 반응성을 갖고 있는 한, 서열 번호 9의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 10의 아미노산 서열에 있어서 1 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 것이어도 된다.

여기서, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에 있어서의 수개란, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개 또는 2개를 의미한다. 이러한 항체로서는, 예를 들어 실시예에 있어서 후술하는 모노클로날 항체 No.3 내지 6, 모노클로날 항체 No.3 내지 6을 인간형화한 항체 등을 들 수 있다.

[항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산]

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.

이러한 핵산으로서는, 예를 들어 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역 유전자, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역 유전자, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역 및 정상 영역의 일부를 코딩하는 유전자, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역 및 정상 영역의 일부를 코딩하는 유전자, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 중쇄 전체 길이를 코딩하는 유전자, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 경쇄 전체 길이를 코딩하는 유전자, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 적절한 링커로 연결한 scFv를 코딩하는 유전자 등을 들 수 있다.

상기 중쇄 가변 영역 유전자는, 서열 번호 19에 기재된 염기 서열을 포함하는 유전자여도 된다. 또한, 상기 경쇄 가변 영역 유전자는, 서열 번호 20에 기재된 염기 서열을 포함하는 유전자여도 된다.

또한, 상기 중쇄 가변 영역 유전자는, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, CDR 이외의 프레임워크 영역이 비마우스 항체 유래인 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자여도 된다. 또한, 상기 경쇄 가변 영역 유전자는, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, CDR 이외의 프레임워크 영역이, 비마우스 항체 유래인 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자여도 된다. 여기서, 비마우스 항체로서는, 예를 들어 인간 항체를 들 수 있다.

본 실시 형태의 핵산은, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역 유전자 또는 이것에서 유래되는 유전자와, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 경쇄 가변 영역 유전자 또는 이것에서 유래되는 유전자와의 조합인 것이 바람직하다.

여기서, 중쇄 가변 영역 유전자에서 유래되는 유전자로서는, 예를 들어 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, CDR 이외의 프레임워크 영역이 비마우스 항체 유래인 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 들 수 있다. 또한, 동일하게, 경쇄 가변 영역 유전자에서 유래되는 유전자로서는, 예를 들어 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, CDR 이외의 프레임워크 영역이 비마우스 항체 유래인 경쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자를 들 수 있다.

[벡터]

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 상술한 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 실시 형태의 재조합 벡터는 발현 벡터여도 된다. 본 실시 형태의 벡터가 발현 벡터인 경우, 숙주에 도입하여 발현시킴으로써, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 제조할 수 있다.

본 실시 형태의 재조합 벡터에 있어서, 상술한 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에, 히스티딘 태그, FLAG 태그, GST 태그 등의 태그 배열을 코딩하는 DNA가 부가되어 있어도 된다. 상기 발현 벡터로서는, 숙주 세포에 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 발현시키는 세포계 벡터와, 적당한 세포로부터 추출된 단백질 합성능을 갖는 성분을 포함하는 단백질 번역계에 있어서 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 발현시키는 무세포계 벡터를 들 수 있다.

세포계 벡터로서는, 숙주 세포에 적합한 공지된 발현 벡터가 사용된다. 예를 들어, 대장균에 있어서는 pBR322 유도체로 대표되는 ColE계 플라스미드, p15A 오리진을 갖는 pACYC계 플라스미드, pSC계 플라스미드, Bac계 등의 F 인자 유래 미니 F 플라스미드를 들 수 있다. 그 밖에도, trc나 tac 등의 트립토판 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, T5 프로모터, T3 프로모터, SP6 프로모터, 아라비노오스 유도 프로모터, 콜드 쇼크 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터 등을 갖는 발현 벡터를 들 수 있다. 또한, 숙주가 대장균 이외의 벡터로서는, 예를 들어 효모 발현용 pAUR계 플라스미드, 곤충 세포 발현용 pIEx계 플라스미드, 동물 세포 발현용 pBApo-CMV계 플라스미드 등을 들 수 있다.

무세포계 벡터로서는, 세포계 벡터에 있어서 열거된 T7 프로모터를 갖는 발현 벡터나 T3 프로모터를 갖는 발현 벡터; SP6 프로모터 또는 T7 프로모터를 갖는 pEU계 플라스미드 등의 소맥 무세포 단백질 합성용 벡터 등을 들 수 있다.

무세포계 벡터를 사용한 단백질 합성에 있어서는, 우선, 전사계를 사용하여 SesA 유전자를 전사하고, mRNA를 합성한다. 전사계로서는, RNA 폴리메라제에 의해 전사시키는 종래 공지된 것을 들 수 있다. RNA 폴리메라제로서는, 예를 들어 T7RNA 폴리메라제, SP6 폴리메라제 등을 들 수 있다.

계속해서, 번역계인 무세포 단백질 합성계를 사용하여, mRNA를 번역하고, 단백질을 합성한다. 이 계에는 리보좀, 번역 개시 인자, 번역 신장 인자, 해리 인자, 아미노아실 tRNA 합성 효소 등, 번역에 필요한 요소가 포함되어 있다. 이러한 단백질 번역계로서는, 대장균 추출액, 토끼 망상 적혈구 추출액, 소맥 배아 추출액 등을 들 수 있다. 또한, 상기 번역에 필요한 요소가 독립적으로 정제된 인자만을 포함하는 재구성형 무세포 단백질 합성계를 들 수 있다.

세포계 벡터 또는 무세포계 벡터를 사용하여 합성된 단백질로부터 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 정제하여 사용할 수 있다. 정제 방법으로서는, 단백질 A, 단백질 G 등을 사용한 방법 등을 들 수 있다. 발현 벡터가 목적 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 히스티딘 태그 등의 태그 배열을 발현하게 설계되어 있는 경우에는, 니켈이나 코발트 등, 이 태그에 친화성을 갖는 물질을 사용한 어피니티 칼럼에 의한 정제 방법을 들 수 있다. 그 밖에, 이온 교환 크로마토그래피나 겔 여과 크로마토그래피 등을 적절히 조합하여 정제함으로써, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편의 순도를 높일 수 있다.

[형질 전환체]

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 함유하는 형질 전환체를 제공한다. 본 실시 형태의 형질 전환체 또는 그의 배지 등으로부터, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 제조할 수 있다.

본 실시 형태의 형질 전환체는, 상술한 재조합 벡터를 숙주에 도입함으로써 얻을 수 있다. 형질 전환체로서는, 예를 들어 상술한 재조합 벡터가 도입된, 대장균, 효모, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포 등의 배양 세포; 상술한 벡터가 도입된, 누에 등의 곤충 생체; 상술한 벡터가 도입된, 담배 등의 식물체 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 숙주로의 도입(형질 전환)은 종래 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들어, 칼슘 처리된 균체를 사용하는 적격 세포법이나, 전기 천공법 등을 들 수 있다. 또한, 플라스미드 벡터 이외에도, 파지 벡터, 바이러스 벡터 등을 숙주에 감염시켜 형질 전환하는 방법을 이용해도 된다.

[면역 제어제]

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 유효 성분으로서 함유하는 면역 제어제를 제공한다.

실시예에 있어서 후술하는 바와 같이, 본 실시 형태의 면역 제어제는, 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 분석에 있어서의 CD8⁺T 세포의 증식을 억제할 수 있다.

또한, 실시예에 있어서 후술하는 바와 같이, 본 실시 형태의 면역 제어제는, 이식편대숙주병 마우스 모델에 있어서, 이식편대숙주병의 예방 및 치료 중 어느 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

따라서, 본 실시 형태의 면역 제어제는 이식편대숙주병의 예방 또는 치료제라고 할 수 있다. 또한, 본 실시 형태의 면역 제어제는 장기 이식 거절의 예방 또는 치료제라고도 할 수 있다.

본 실시 형태의 면역 제어제는 약학적으로 허용되는 담체, 기타의 첨가물을 함유하는 의약 조성물이어도 된다. 약학적으로 허용되는 담체로서는, 부형제, 안정제, 주사제용 용제 등을 들 수 있다. 주사제용 용제로서는, 예를 들어 생리 식염수, 포도당, D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨 등의 보조약을 포함하는 등장액을 들 수 있다. 기타의 첨가물로서는, 예를 들어 pH 조절제, 점도 개량제, 착색제, 이식편대숙주병이나 장기 이식 거절의 치료에 있어서 종래 사용되어 온 스테로이드류, 면역 제어제 등을 들 수 있다.

본 실시 형태의 면역 제어제 또는 상기 의약 조성물의 제형은 한정되지 않고, 예를 들어 동결 건조제, 분말 제제, pH가 조정된 완충액에 의한 용액 제제, 주사용 마이크로캡슐제 등을 들 수 있다.

본 실시 형태의 면역 제어제 또는 상기 의약 조성물은, 주사제 또는 점적 주입제로서 정맥 내 투여 등에 의해 환자에게 투여된다. 그 투여량, 투여 경로, 처방은 환자의 증상, 체중, 연령, 성별 등에 따라서 적절히 결정하면 된다.

본 실시 형태의 면역 제어제 또는 상기 의약 조성물의 투여량은, 환자의 증상, 체중, 연령, 성별 등에 따라서 상이하여, 일률적으로 결정할 수는 없지만, 처치를 필요로 하는 인간 환자에 대하여, 1회의 투여에 있어서 1kg 체중당, 유효 성분(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편)이 예를 들어 1μg 내지 100mg, 예를 들어 50μg 내지 50mg 포함되는 양을, 1일당 1회 내지 수회 투여하면 된다.

[기타 실시 형태]

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질의 유효량을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 공정을 구비하는, 제어성 T 세포의 활성화 방법을 제공한다. DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질로서는 상술한 것을 들 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 제어성 T 세포의 활성화 위한, DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질을 제공한다. DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질로서는, 상술한 것을 들 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 제어성 T 세포의 활성화제를 제조하기 위한, DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질의 사용을 제공한다. DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질로서는, 상술한 것을 들 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질의 유효량을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 공정을 구비하는, 이식편대숙주병, 장기 이식 거절, 자기 면역 질환, 섬유화 질환, 염증성 장염 또는 알레르기의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질로서는, 상술한 것을 들 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은 이식편대숙주병, 장기 이식 거절, 자기 면역 질환, 섬유화 질환, 염증성 장염 또는 알레르기의 예방 또는 치료를 위한, DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질을 제공한다. DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질로서는, 상술한 것을 들 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 이식편대숙주병, 장기 이식 거절, 자기 면역 질환, 섬유화 질환, 염증성 장염 또는 알레르기의 예방제 또는 치료제를 제조하기 위한, DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질의 사용을 제공한다. DNAM-1 및 CD155의 결합 저해 물질로서는, 상술한 것을 들 수 있다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편의 유효량을, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 공정을 구비하는, 이식편대숙주병 또는 장기 이식 거절의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 이식편대숙주병 또는 장기 이식 거절의 치료 또는 예방을 위한, 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 제공한다.

일 실시 형태에 있어서, 본 발명은, 이식편대숙주병 또는 장기 이식 거절의 치료제 또는 예방제를 제조하기 위한 상술한 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 단편의 사용을 제공한다.

실시예

다음으로 실험예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실험예에 한정되는 것은 아니다.

[실험예 1]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 제작)

마우스 림프구 세포인 BW5147 세포주에 인간 DMAM-1 유전자를 도입하여, 인간 DMAM-1 단백질을 발현시켰다. 이 세포를 항원으로 하여 마우스를 면역시키고, 통상의 방법에 의해 하이브리도마를 제작하였다. 얻어진 하이브리도마주 내에서 인간 DNAM-1 단백질에 대한 반응성을 지표로 하여 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 No.1 내지 6을 산생하는 클론을 각각 취득하였다.

계속해서, 통상의 방법에 의해 수립한 하이브리도마주로부터 항체 중쇄 유전자 및 항체 경쇄 유전자를 클로닝하여, 항체 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 동정하였다. 도 1은, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 No.1 내지 6의 중쇄 아미노산 서열을 얼라인먼트한 결과를 나타내는 도면이다. 도 1 중, 밑줄은 CDR1 내지 3을 나타낸다. 도 2는, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 No.1 내지 6의 경쇄 아미노산 서열을 얼라인먼트한 결과를 나타내는 도면이다. 도 2 중, 밑줄은 CDR1 내지 3을 나타낸다. 또한, 하기 표 1에, 각 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열과 서열표의 서열 번호의 대응을 나타낸다.

[실험예 2]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 반응성의 검토 1)

실험예 1에서 제작한 모노클로날 항체 No.1 및 No.2의 반응성을 검토하였다. 구체적으로는, 마우스 림프구 세포인 BW5147 세포주(이하, 「BW」라고 하는 경우가 있음), 및 인간 DMAM-1 단백질을 발현시킨 BW5147 세포주(이하, 「DNAM-1/BW」라고 하는 경우가 있음)에, 모노클로날 항체 No.1 및 No.2를 반응시켜, 플로우 사이토메트리 해석을 행하였다. 대조에는 컨트롤 IgG1 항체를 사용하였다. 1×10⁵개의 각 세포에 대하여 30ng의 각 항체를 반응시켰다. 항체는 빙상에서 30분간 반응시켰다.

도 3의 (a)는 BW 세포에 모노클로날 항체 No.1을 반응시킨 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3의 (b)는 DNAM-1/BW 세포에 모노클로날 항체 No.1을 반응시킨 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3의 (c)는 BW 세포에 모노클로날 항체 No.2를 반응시킨 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3의 (d)는 DNAM-1/BW 세포에 모노클로날 항체 No.2를 반응시킨 결과를 나타내는 그래프이다.

그 결과, 모노클로날 항체 No.1 및 No.2의 모두 BW 세포에 발현시킨 DNAM-1 단백질을 특이적으로 인식하는 것이 확인되었다.

[실험예 3]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 반응성의 검토 2)

실험예 1에서 제작한 모노클로날 항체 No.1 및 No.2의 인간 말초혈 림프구 표면에 존재하는 DNAM-1 단백질에 대한 반응성을 검토하였다.

인간 말초혈 림프구 중에 존재하는 CD3⁺CD4⁺ 세포(CD4⁺T 세포), CD3⁺CD8⁺ 세포(CD8⁺T 세포), CD3^-CD19⁺ 세포(B 세포), CD3^-CD56⁺ 세포(NK 세포), CD3⁺CD56⁺ 세포(NKT 세포), CD14⁺ 세포(단구)에 대한 모노클로날 항체 No.1 및 No.2의 반응성을 검토하였다. 대조에는 컨트롤 IgG1 항체를 사용하였다. 1×10⁵개의 말초혈 림프구에 대하여, 모노클로날 항체 No.1 및 No.2를 각각 100ng 반응시켰다. 항체는 빙상에서 30분간 반응시켰다.

도 4의 (a)는 CD4⁺T 세포에 대한 모노클로날 항체 No.1의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (b)는 CD8⁺T 세포에 대한 모노클로날 항체 No.1의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (c)는 B 세포에 대한 모노클로날 항체 No.1의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (d)는 CD4⁺T 세포에 대한 모노클로날 항체 No.2의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (e)는 CD8⁺T 세포에 대한 모노클로날 항체 No.2의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (f)는 B 세포에 대한 모노클로날 항체 No.2의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (g)는 NK 세포에 대한 모노클로날 항체 No.1의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (h)는 NKT 세포에 대한 모노클로날 항체 No.1의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (i)는 단구에 대한 모노클로날 항체 No.1의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (j)는 NK 세포에 대한 모노클로날 항체 No.2의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (k)는 NKT 세포에 대한 모노클로날 항체 No.2의 반응성을 나타내는 결과이다. 도 4의 (l)은 단구에 대한 모노클로날 항체 No.2의 반응성을 나타내는 결과이다.

그 결과, 모노클로날 항체 No.1 및 No.2의 모두, CD4⁺T 세포, CD8⁺T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 단구의 세포 표면에 존재하는 DNAM-1 단백질에 대한 반응성을 갖는 것이 확인되었다.

[실험예 4]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 반응성의 검토 3)

실험예 1에서 제작한 모노클로날 항체 No.1 내지 No.6을 사용한 경합 분석을 행하였다. 보다 구체적으로는 먼저, 상술한 DNAM-1/BW 세포 1×10⁵개에 대하여, 100ng의 모노클로날 항체 No.2를 반응시켰다(전처리). 계속해서, 단계 희석한 모노클로날 항체 No.1, 3 내지 6을 각각 반응시켰다. 항체는 빙상에서 30분간 반응시켰다. 전처리 없음의 DNAM-1/BW 세포에 대한 각 항체의 반응성도 검토하였다.

도 5의 (a)는 모노클로날 항체 No.1의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5의 (b)는 모노클로날 항체 No.3의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5의 (c)는 모노클로날 항체 No.4의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5의 (d)는 모노클로날 항체 No.5의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5의 (e)는 모노클로날 항체 No.6의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5의 (a)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.1은, 미리 모노클로날 항체 No.2를 반응시킨 DNAM-1/BW 세포와도 양호한 반응성을 나타내는 것이 명확해졌다. 이 결과는, 모노클로날 항체 No.1이, 모노클로날 항체 No.2보다도 DNAM-1 단백질에 대한 반응성이 높은 것을 나타낸다.

또한, 도 5의 (b)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.3은, 미리 모노클로날 항체 No.2를 반응시킨 DNAM-1/BW 세포에는 별로 반응하지 않는 것이 명확해졌다. 이 결과는, 모노클로날 항체 No.2가, 모노클로날 항체 No.3보다도 DNAM-1 단백질에 대한 반응성이 높은 것을 나타낸다.

또한, 도 5의 (c)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.4는, 미리 모노클로날 항체 No.2를 반응시킨 DNAM-1/BW 세포에는 별로 반응하지 않는 것이 명확해졌다. 이 결과는, 모노클로날 항체 No.2가, 모노클로날 항체 No.4보다도 DNAM-1 단백질에 대한 반응성이 높은 것을 나타낸다.

또한, 도 5의 (d)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.5는, 미리 모노클로날 항체 No.2를 반응시킨 DNAM-1/BW 세포에 대한 반응성을 갖는 것이 나타났다. 후술하는 실험예 5의 결과와 종합하면, 모노클로날 항체 No.5와 모노클로날 항체 No.2는 에피토프가 경합하지 않을 가능성이 생각되었다.

또한, 도 5의 (e)의 결과도 도 5의 (d)의 결과와 마찬가지이며, 후술하는 실험예 5의 결과와 종합하면, 모노클로날 항체 No.6과 모노클로날 항체 No.2는 에피토프가 경합하지 않을 가능성이 생각되었다.

[실험예 5]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 반응성의 검토 4)

DNAM-1/BW 세포에 미리 반응시키는 항체를 교체하고, 실험예 4와 동일한 실험을 행하였다. 보다 구체적으로는 먼저, 상술한 DNAM-1/BW 세포 1×10⁵개에 대하여, 포화량의 모노클로날 항체 No.1, 3 내지 6을 각각 반응시켰다(전처리). 구체적으로는, 모노클로날 항체 No.1을 30ng, No.3을 300ng, No.4를 300ng, No.5를 500ng, No.6을 1000ng 사용하였다.

또한, 상술한 DNAM-1/BW 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 발현한 인간 DNAM-1 항체를 포화할 수 있는 항체의 최저량은, 모노클로날 항체 No.1에서는 30ng이며, 모노클로날 항체 No.2에서는 50ng이며, 모노클로날 항체 No.3에서는 100ng이며, 모노클로날 항체 No.4에서는 100ng이며, 모노클로날 항체 No.5에서는 300ng이며, 모노클로날 항체 No.6에서는 300ng이었다. 계속해서, 단계 희석한 모노클로날 항체 No.2를 각각 반응시켰다. 항체는 빙상에서 30분간 반응시켰다. 전처리 없음의 DNAM-1/BW 세포에 대한 각 항체의 반응성도 검토하였다.

도 6의 (a)는 모노클로날 항체 No.1의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6의 (b)는 모노클로날 항체 No.3의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6의 (c)는 모노클로날 항체 No.4의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6의 (d)는 모노클로날 항체 No.5의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6의 (e)는 모노클로날 항체 No.6의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6의 (a)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.2는, 미리 모노클로날 항체 No.1을 반응시킨 DNAM-1/BW 세포에는 별로 반응하지 않는 것이 명확해졌다. 이 결과는, 상술한 실험예 4의 결과와 종합하면, 모노클로날 항체 No.1이, 모노클로날 항체 No.2보다도 DNAM-1 단백질에 대한 반응성이 높은 것을 더욱 지지하는 것이다.

또한, 도 6의 (b)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.2는, 미리 모노클로날 항체 No.3을 반응시킨 DNAM-1/BW 세포와도 비교적 양호하게 반응하는 것이 명확해졌다. 이 결과는, 상술한 실험예 4의 결과와 종합하면, 모노클로날 항체 No.2가, 모노클로날 항체 No.3보다도 DNAM-1 단백질에 대한 반응성이 높은 것을 더욱 지지하는 것이다.

또한, 도 6의 (c)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.2는, 미리 모노클로날 항체 No.4를 반응시킨 DNAM-1/BW 세포와도 비교적 양호하게 반응하는 것이 명확해졌다. 이 결과는, 상술한 실험예 4의 결과와 종합하면, 모노클로날 항체 No.2가, 모노클로날 항체 No.4보다도 DNAM-1 단백질에 대한 반응성이 높은 것을 더욱 지지하는 것이다.

또한, 도 6의 (d)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.2는, 미리 모노클로날 항체 No.5를 반응시킨 DNAM-1/BW 세포에 대한 반응성을 갖는 것이 나타났다. 이 결과와 상술한 실험예 4의 결과를 종합하면, 모노클로날 항체 No.2와 모노클로날 항체 No.5와는 에피토프가 경합하지 않을 가능성이 생각되었다.

또한, 도 6의 (e)의 결과도 도 6의 (d)의 결과와 마찬가지이며, 상술한 실험예 4의 결과와 종합하면, 모노클로날 항체 No.2와 모노클로날 항체 No.6과는 에피토프가 경합하지 않을 가능성이 생각되었다.

[실험예 6]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 반응성의 검토 5)

DNAM-1 단백질은 CD155 단백질과 상호 작용하는 것이 알려져 있다. 그래서, 실험예 1에서 제작한 모노클로날 항체 No.1 내지 No.6이, DNAM-1 단백질과 CD155 단백질과의 상호 작용을 저해할 수 있는지 여부를 검토하였다.

먼저, 가용화 인간 CD155 단백질을 준비하였다. 구체적으로는, 인간 CD155 단백질과 인간 IgG 항체 정상 영역의 융합 단백질(이하, 「hCD155-Fc」라고 하는 경우가 있음)을 통상적인 방법에 의해 제작하였다. 또한, 인간 CD155 단백질의 RefSeq ID는 NP_001129240이다.

계속해서, 상술한 DNAM-1/BW 세포 1×10⁵개에 hCD155-Fc 단백질의 포화량(1000ng)을 미리 반응시켰다. 계속해서, 상기 DNAM-1/BW 세포에, 단계 희석한 모노클로날 항체 No.1 내지 No.6을 각각 반응시켰다. 반응은 빙상에서 30분간 행하였다.

도 7의 (a) 내지 (e)는 각각 모노클로날 항체 No.1, 3 내지 6의 결과를 나타내는 그래프이다. 비교를 위해서, 도 7의 (a) 내지 (e)의 모두 모노클로날 항체 No.2의 결과를 나타낸다.

도 7의 (a)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.1은, hCD155-Fc 단백질을 미리 반응시킨 DNAM-1/BW 세포에 양호하게 반응할 수 있고, 그 반응성은, 모노클로날 항체 No.2보다도 높은 것이 명확해졌다.

또한, 도 7의 (b)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.3은, hCD155-Fc 단백질을 미리 반응시킨 DNAM-1/BW 세포에 양호하게 반응할 수 있고, 그 반응성은, 모노클로날 항체 No.2와 동일한 정도인 것이 명확해졌다.

또한, 도 7의 (c)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.4는, hCD155-Fc 단백질을 미리 반응시킨 DNAM-1/BW 세포에 양호하게 반응할 수 있고, 그 반응성은, 모노클로날 항체 No.2와 동일한 정도인 것이 명확해졌다.

또한, 도 7의 (d)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.5는, hCD155-Fc 단백질을 미리 반응시킨 DNAM-1/BW 세포와 반응하기는 하지만, 그 반응성은, 모노클로날 항체 No.2보다도 낮은 것이 명확해졌다.

또한, 도 7의 (e)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.6은, hCD155-Fc 단백질을 미리 반응시킨 DNAM-1/BW 세포와 반응하기는 하지만, 그 반응성은, 모노클로날 항체 No.2보다도 낮은 것이 명확해졌다.

[실험예 7]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 반응성의 검토 6)

실험예 6에 있어서, hCD155-Fc 단백질을 미리 반응시킨 DNAM-1/BW 세포에, 단계 희석한 모노클로날 항체 No.1 내지 No.6을 각각 반응시킨 후, DNAM-1/BW 미세 표면의 DNAM-1 단백질에 결합한 hCD155-Fc 단백질을 검출하였다. hCD155-Fc 단백질의 검출은 항인간 IgG 항체를 사용하여 행하였다. 반응은 빙상에서 30분간 행하였다.

도 8의 (a) 내지 (e)는 각각 모노클로날 항체 No.1, 3 내지 6의 결과를 나타내는 그래프이다. 비교를 위해서, 도 8의 (a) 내지 (e)의 모두 모노클로날 항체 No.2의 결과를 나타낸다.

도 8의 (a)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.1을 반응시킨 후에 잔존하는 hCD155-Fc 단백질의 양은, 모노클로날 항체 No.1의 농도 의존적으로 감소하는 것이 명확해졌다.

또한, 반응시킨 모노클로날 항체의 농도가 높은 영역에서는, hCD155-Fc 단백질이 완전히 없어지는 것이 명확해졌다. 이 결과는, 모노클로날 항체 No.1 및 No.2 모두, DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 완전히 저해할 수 있음을 나타낸다. 또한, DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 완전히 저해하기 위해 필요한 항체량은, 모노클로날 항체 No.1쪽이 모노클로날 항체 No.2보다도 적었다. 보다 구체적으로는, DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 완전히 저해하기 위해 필요한 항체량은, 모노클로날 항체 No.1에서는 100ng이며, 모노클로날 항체 No.2에서는 300ng이었다.

도 8의 (b)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.3을 반응시킨 후에 잔존하는 hCD155-Fc 단백질의 양은, 모노클로날 항체 No.3의 농도 의존적으로 감소하는 것이 명확해졌다.

또한, 반응시킨 모노클로날 항체의 농도가 낮은 영역에서는, 모노클로날 항체 No.3을 반응시킨 후에 잔존하는 hCD155-Fc 단백질의 양은, 모노클로날 항체 No.2를 반응시킨 후에 잔존하는 hCD155-Fc 단백질의 양보다도 적었다. 이 결과는, 반응시킨 모노클로날 항체의 농도가 낮은 영역에서는, 모노클로날 항체 No.3이, 모노클로날 항체 No.2보다도, DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 저해하는 활성이 높은 것을 나타낸다. 또한, 반응시킨 모노클로날 항체의 농도가 높은 영역에서는, 모노클로날 항체 No.2와 모노클로날 항체 No.3의 반응성의 차가 작았다. DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 완전히 저해하기 위해 필요한 모노클로날 항체 No.3의 양은, 300ng이었다.

도 8의 (c)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.4를 반응시킨 후에 잔존하는 hCD155-Fc 단백질의 양은, 모노클로날 항체 No.4의 농도 의존적으로 감소하는 것이 명확해졌다.

또한, 모노클로날 항체 No.4를 반응시킨 후에 잔존하는 hCD155-Fc 단백질의 양은, 모노클로날 항체 No.2를 반응시킨 후에 잔존하는 hCD155-Fc 단백질의 양보다도 많았다. 이 결과는, 모노클로날 항체 No.2가, 모노클로날 항체 No.4보다도, DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 저해하는 활성이 높은 것을 나타낸다. DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 완전히 저해하기 위해 필요한 모노클로날 항체 No.4의 양은, 1000ng이었다.

도 8의 (d)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.5를 반응시켜도, hCD155-Fc 단백질의 양은 별로 감소하지 않는 것이 명확해졌다. 이 결과는, 모노클로날 항체 No.5는, DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 저해하는 활성이 낮은 것을 나타낸다. 모노클로날 항체 No.5를 3000ng 사용해도, DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 완전히 저해할 수는 없었다.

또한, 도 8의 (e)의 결과로부터, 모노클로날 항체 No.6을 반응시켜도, hCD155-Fc 단백질의 양은 별로 감소하지 않는 것이 명확해졌다. 이 결과는, 모노클로날 항체 No.6은, DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 저해하는 활성이 낮은 것을 나타낸다. 모노클로날 항체 No.6을 3000ng 사용해도, DNAM-1 단백질과 CD155 단백질의 상호 작용을 완전히 저해할 수는 없었다.

[실험예 8]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 기능 해석 1)

실험예 1에서 제작한 모노클로날 항체 No.1 또는 No.2의 존재 하에서 혼합 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 분석을 행하여, T 세포의 증식에 대한 모노클로날 항체의 영향을 검토하였다.

MLR 분석이란, 동종 이계 자극 세포와 T 세포를 혼합한 경우에 관찰되는 T 세포의 증식을 측정하는 것이다. 구체적으로는 먼저, 인간 말초혈 림프구로부터 CD14⁺ 세포(5×10⁵개)를 분취하고, 인터류킨(IL)-4(40ng/웰) 및 GM-CSF(50ng/웰)의 존재 하에서 1주일 배양하고, 수상 세포를 유도하였다. CD14⁺ 세포의 배양은 24웰 플레이트에서 행하였다. 한편, 별도의 도너 유래의 인간 말초혈 림프구로부터 CD8⁺T 세포를 분취하였다.

계속해서, CD8⁺T 세포를, 포화량 이상(1μg/mL)의, F(ab')₂형 모노클로날 항체 No.1, F(ab')₂형 모노클로날 항체 No.2, 또는 F(ab')₂형 컨트롤 IgG(대조)와 반응시킨 후, 상기 수상 세포와 공배양하였다. CD8⁺T 세포는 5×10⁴개이며, 수상 세포는 5×10³개였다.

공배양의 개시로부터 48시간 후에 상기 항체를 1μg/mL씩 다시 첨가하였다. 또한, 공배양의 개시로부터 72시간 후에 브로모데옥시우리딘(BrdU)을 첨가하였다. 또한, 공배양의 개시로부터 96시간 후에 항 BrdU 항체로 염색함으로써 CD8⁺T 세포의 증식을 측정하였다.

도 9는 MLR 분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 도 9 중, 「*」은 위험율 5％ 미만으로 유의차가 있음을 나타낸다. 그 결과, 모노클로날 항체 No.1 및 No.2 중 어느 것을 첨가한 경우에 있어서도, CD8⁺T 세포의 증식이 유의미하게 억제된 것이 명확해졌다. 이 결과는, 모노클로날 항체 No.1 및 No.2가, 인간 T 세포의 기능에 작용할 수 있음을 나타낸다.

[실험예 9]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 기능 해석 2)

이식편대숙주병 마우스 모델을 사용하여, 실험예 1에서 제작한 모노클로날 항체 No.1의 기능을 해석하였다.

본 실험예에서 사용한 이식편대숙주병 마우스 모델은, 면역 부전 마우스인 NOG 마우스(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull 마우스)와 인간 CD155 트랜스제닉 마우스를 교배하여 얻어진 hCD155Tg/NOG 마우스에 방사선 조사한 후, 인간 말초혈 림프구를 이식하여, 체중의 변화 또는 생존율에 의해 이식편대숙주병의 증상을 측정하는 모델이다.

도 10은 본 실험의 실험 프로토콜을 나타내는 도면이다. 실험 개시의 전날에, hCD155Tg/NOG 마우스(암컷, 8주령)에 1.2Gy의 방사선 조사를 행하였다. 계속해서, 실험 개시일에 2.5×10⁶개/마리의 인간 말초혈 림프구를 꼬리 정맥 주사에 의해 이식하고, 추가로 300μg/0.2mL의 F(ab')₂형 모노클로날 항체 No.1을 복강 내 투여하였다(n=6). 대조로서, 항체 대신에 인산 완충액(PBS)을 투여한 마우스를 사용하였다(n=6). 계속해서, 마우스의 체중 변화 및 생존율을 측정하고, 이식편대숙주병의 증상을 측정하였다. 실험 개시로부터 3, 7, 11, 14, 18 및 21일째에도 상기와 동량의 항체를 복강 내 투여하였다.

도 11은 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다. 그 결과, 모노클로날 항체 No.1을 투여한 마우스에서는 유의미하게 생존율이 상승하였다. 이 결과는, 모노클로날 항체 No.1을 투여함으로써, 이식편대숙주병을 예방할 수 있음을 나타낸다.

또한, 상기 마우스에 대해서, 혈액 내의 글루탐산피루브산 트랜스아미나제(ALT) 활성 및 글루탐산옥살로아세트산 트랜스아미나제(AST) 활성을 측정하여, 간 기능의 저하를 검토하였다. 혈액 내의 ALT 및 AST의 활성이 상승하는 것은, 간장이 장애를 받고 있음을 나타낸다.

도 12의 (a)는 ALT 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 또한, 도 12의 (b)는 AST 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 그 결과, 모노클로날 항체 No.1을 투여한 마우스에서는, 간 기능의 저하가 억제되는 것이 명확해졌다.

[실험예 10]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 기능 해석 3)

실험예 9와 동일한 이식편대숙주병 마우스 모델을 사용하여, 실험예 1에서 제작한 모노클로날 항체 No.1의 기능을 해석하였다. 실험예 9와는 실험 프로토콜을 변경하고, 모노클로날 항체 No.1에 의한 이식편대숙주병의 치료 효과를 검토하였다.

도 13은 본 실험의 실험 프로토콜을 나타내는 도면이다. 실험 개시 전날에, hCD155Tg/NOG 마우스(암컷, 8주령)에 1.2Gy의 방사선 조사를 행하였다. 계속해서, 실험 개시일에 2.5×10⁶개/마리의 인간 말초혈 림프구를 꼬리 정맥 주사에 의해 이식하였다. 계속해서, 마우스의 체중 변화 및 생존율을 측정하고, 이식편대숙주병의 증상을 측정하였다. 실험 개시로부터 10, 13, 17, 20일째에 300μg/0.2mL의 F(ab')₂형 모노클로날 항체 No.1을 복강 내 투여하였다. 모노클로날 항체 No.1의 투여는 마우스가 사망할 때까지 주 2회의 비율로 계속하였다. 대조로서, 항체 대신에 PBS를 투여한 마우스를 사용하였다.

도 14는 마우스의 생존율을 나타내는 그래프이다. 그 결과, 모노클로날 항체 No.1을 투여한 마우스에서는 유의미하게 생존율이 상승하였다. 이 결과는, 모노클로날 항체 No.1을 투여함으로써, 이식편대숙주병을 치료할 수 있음을 나타낸다.

[실험예 11]

(항인간 DNAM-1 모노클로날 항체의 기능 해석 4)

실험예 1에서 제작한 모노클로날 항체 No.1과 모노클로날 항체 No.2의 기능을 비교하였다. 보다 구체적으로는 먼저, 인간 말초혈 단핵 세포로부터 CD8⁺T 세포를 분리하고, 항CD3 항체(형식 「555336」, BD Bioscience사, 0.25μg/mL), 항CD28 항체(형식 「555725」, BD Bioscience사, 1μg/mL) 및 IL-2(형식 「554603」, BD Bioscience사, 0.02μg/mL)의 존재 하에서 7일간 배양하고, 활성화하였다.

계속해서, 활성화한 CD8⁺T 세포에, 컨트롤 IgG1 항체(대조), 모노클로날 항체 No.1 또는 모노클로날 항체 No.2를 10mg/10⁶ 세포의 비율로 첨가하고, 4℃, 30분간 인큐베이트하여 결합시켰다.

계속해서, 항체 처리 후의 CD8⁺T 세포에, 표적 세포가 되는 hCD155 발현 세포를, CD8⁺T 세포: hCD155 발현 세포=1:5의 비율로 혼합하여 37℃에서 4시간 공배양하였다. hCD155 발현 세포로서는, BW5147 세포에 hCD155를 강제 발현시킨 세포를 사용하였다.

그 후, 각 CD8⁺T 세포의 세포 상해 활성을 평가하였다. CD8⁺T 세포의 세포 상해 활성은, CD8⁺T 세포에 있어서의 CD107a의 발현에 의해 평가하였다. 또한, CD107a는 CD8⁺T 세포의 탈과립 마커이다.

도 15는 검토 결과를 나타내는 그래프이다. 컨트롤 IgG1 항체(대조)로 처리한 CD8⁺T 세포에 있어서의 CD107a 발현 세포의 비율을 100％로 하고, 모노클로날 항체 No.1 또는 모노클로날 항체 No.2로 처리한 CD8⁺T 세포에 있어서의 CD107a 발현 세포의 비율을 나타냈다.

도 15 중, p=0.002는 위험율 0.2％ 미만으로 유의차가 존재하는 것을 나타내고, p=0.004는 위험율 0.4％ 미만으로 유의차가 존재하는 것을 나타내고, p=0.02는 위험율 2％ 미만으로 유의차가 존재하는 것을 나타낸다.

그 결과, CD8⁺T 세포 상의 DNAM-1과 표적 세포 상의 hCD155의 결합을 항DNAM-1 항체로 저해하면, CD8⁺T 세포의 세포 상해 활성이 저해되는 것이 명확해졌다. 또한, 그 저해의 정도는, 모노클로날 항체 No.1쪽이 모노클로날 항체 No.2보다도 유의미하게 높은 것이 명확해졌다.

[실험예 12]

(제어성 T 세포에 관한 검토)

실험예 9와 동일한 이식편대숙주병 마우스 모델을 사용하여, 실험예 1에서 제작한 모노클로날 항체 No.1의 기능을 해석하였다.

구체적으로는 먼저, 실험 개시의 전날에, 면역 부전 마우스인 NOG 마우스(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull 마우스)와 인간 CD155 트랜스제닉 마우스를 교배하여 얻어진 hCD155Tg/NOG 마우스(암컷, 8주령)에 1.2Gy의 방사선 조사를 행하였다. 계속해서, 실험 개시일에 2.5×10⁶개/마리의 인간 말초혈 림프구를 꼬리 정맥 주사에 의해 이식하고, 추가로 300μg/0.2mL의 F(ab')₂형 모노클로날 항체 No.1을 복강 내 투여하였다(n=6). 대조로서, 항체 대신에 인산 완충액(PBS)을 투여한 마우스를 사용하였다(n=6). 실험 개시로부터 3, 7, 11일째에도 상기와 동량의 항체를 복강 내 투여하였다.

계속해서, 실험 개시로부터 14일째에 마우스로부터 비장 및 말초혈을 채취하여 플로우 사이토메트리에 의해 해석하고, 이들에 포함되는 제어성 T 세포의 비율을 측정하였다. CD4⁺Foxp3⁺ 세포를 제어성 T 세포로서 검출하였다.

도 16의 (a)는, 모노클로날 항체 No.1을 투여하고 나서 14일 후의 마우스의 비장 중의 CD4⁺T 세포에 있어서의 제어성 T 세포의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 또한, 도 16의 (b)는, 모노클로날 항체 No.1을 투여하고 나서 14일 후의 마우스의 말초혈 중의 CD4⁺T 세포에 있어서의 제어성 T 세포의 비율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

그 결과, 모노클로날 항체 No.1을 투여함으로써, 제어성 T 세포의 비율이 현저하게 증가한 것이 명확해졌다.

[실험예 13]

(자기 면역 질환에 관한 검토)

실험적 자기 면역성 뇌척수염 모델을 사용하여 항DNAM-1 항체의 기능을 평가하였다. 구체적으로는 먼저, 실험 개시의 전날에, C57BL/6J 마우스에 100μg/0.2mL의 항마우스 DNAM-1 항체를 복강 내 투여하였다(n=8). 또한, 대조로서, C57BL/6J 마우스에 100μg/0.2mL의 컨트롤 IgG 항체를 복강 내 투여하였다(n=9).

계속해서, 실험 개시 시에, 각 군의 마우스에 50μg/0.2mL의 미엘린 핍지교세포 당단백질(Myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)) 단백질의 제33 내지 55번째의 아미노산 서열에 상당하는 펩티드를 배부(背部) 피하 투여하였다. 또한, 200ng/0.2mL의 백일해 독소를 복강 내 투여하였다. 또한, 실험 개시로부터 2일째에도 각 군의 마우스에 200ng/0.2mL의 백일해 독소를 복강 내 투여하였다.

계속해서, 실험 개시로부터 1, 3, 7, 11, 13일째에 각 군의 마우스에 100μg/0.2mL의 항마우스 DNAM-1 항체 또는 100μg/0.2mL의 컨트롤 IgG 항체를 각각 투여하였다.

실험 개시 후의 마우스를 관찰하고, 뇌척수염의 발병율 및 임상 스코어를 측정하였다. 임상 스코어는 다음의 평가 기준에 따라서 평가한 스코어의 평균값으로 하였다.

(임상 스코어)

0: 정상

1: 꼬리의 토너스 저하

2: 꼬리의 완전 하수(下垂)

3: 보행 이상

4: 뒷다리의 완전 탈력(脫力)

5: 앞다리 마비를 포함하는 뒷다리의 완전 탈력

6: 사망

도 17의 (a)는 뇌척수염의 발병율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 또한, 도 17의 (b)는 임상 스코어의 평균값을 산출한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 17의 (a) 및 (b) 중, 횡축은 실험 개시 후의 시간(일)을 나타낸다. 그 결과, 항DNAM-1 항체를 투여함으로써, 자기 면역성 뇌척수염의 임상 스코어가 개선되는 것이 명확해졌다.

[실험예 14]

(간장의 섬유화에 관한 검토)

항DNAM-1 항체의 투여 대신에 DNAM-1 유전자 결손(이하, 「DNAM-1KO」라고 하는 경우가 있음) 마우스를 사용하여 간장의 섬유화에 관한 검토를 행하였다. 대조에는 야생형 마우스를 사용하였다. 실험에는 담관 결찰(bile duct ligation(BDL)) 모델을 사용하였다.

구체적으로는 먼저, 실험 개시 시에 각 군의 마우스를 개복하여 총담관을 결삭(結索)하고, BDL 모델을 제작하였다. 계속해서, 실험 개시로부터 3, 7, 14, 21일째에 각 군의 마우스로부터 안와 채혈을 행하였다. 계속해서, 채취한 혈액으로부터 혈청을 분리하고, 임상 화학 분석 장치(형식 「트라이켐」, 후지 필름사)를 사용하여 알칼리 포스파타아제 및 총 빌리루빈을 정량하였다. 또한, 알칼리 포스파타아제 및 총 빌리루빈은 간장 및 담관의 장애 지표이다.

또한, 실험 개시로부터 21일째에 각 군의 마우스를 전신 관류하여 간장을 적출하였다. 적출한 간장을 고정시키고, 파라핀 포매하여 조직 절편을 제작하고, 시리우스 레드 염색을 행하여 현미경 관찰하였다. 시리우스 레드는 콜라겐 삼중쇄 나선에 결합하는 색소이다.

도 18의 (a)는 혈청 중의 알칼리 포스파타아제를 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 18의 (a) 중, 「WT」는 야생형 마우스의 결과인 것을 나타내고, 「DNAM-1KO」는 DNAM-1 유전자 결손 마우스의 결과인 것을 나타내고, 「naive」는 담관 결삭 처치를 행하지 않은 마우스의 결과인 것을 나타낸다. 또한, 횡축은 실험 개시 후의 시간(일)을 나타낸다. 그 결과, DNAM-1 유전자 결손 마우스에서는, 대조의 야생형 마우스와 비교하여, 혈청 중의 알칼리 포스파타아제량이 유의미하게 적은 것이 명확해졌다.

또한, 도 18의 (b)는 혈청 중의 총 빌리루빈을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 18의 (b) 중, 「WT」는 야생형 마우스의 결과인 것을 나타내고, 「DNAM-1KO」는 DNAM-1 유전자 결손 마우스의 결과인 것을 나타내고, 「naive」는 담관 결삭 처치를 행하지 않은 마우스의 결과인 것을 나타낸다. 또한, 횡축은 실험 개시 후의 시간(일)을 나타낸다. 그 결과, DNAM-1 유전자 결손 마우스에서는, 야생형 마우스와 비교하여, 혈청 중의 총 빌리루빈량이 유의미하게 적은 것이 명확해졌다.

또한, 도 19의 (a) 및 (b)는 간장 조직의 현미경 사진이다. 도 19의 (a)는 대조의 야생형 마우스(WT)의 사진이며, 도 19의 (b)는 DNAM-1 유전자 결손 마우스(DNAM-1KO)의 사진이다. 배율은 모두 20배이다. 그 결과, DNAM-1 유전자 결손 마우스에서는, 야생형 마우스와 비교하여, 간장의 섬유화가 현저하게 경감되었음이 명확해졌다.

이상의 결과는, 항DNAM-1 항체를 생체에 투여함으로써, 간장의 섬유화를 경감시킬 수 있음을 나타낸다.

[실험예 15]

(신장의 섬유화에 관한 검토)

항DNAM-1 항체의 투여 대신에 DNAM-1 유전자 결손 마우스를 사용하여 신장의 섬유화에 관한 검토를 행하였다. 대조에는 야생형 마우스를 사용하였다. 실험에는 일측성 요관 폐쇄(Unilateral ureteral obstruction(UUO)) 모델을 사용하였다.

구체적으로는 먼저, 실험 개시 시에 각 군의 마우스를 개복하여 우신장 요관을 결삭하고, UUO 모델을 제작하였다. 한편, 좌신장은 무처치로 하였다. 계속해서, 실험 개시로부터 7일째에 각 군의 마우스를 전신 관류하여 양쪽 신장을 적출하였다. 계속해서, 적출한 신장을 포르말린 고정시키고, 파라핀 포매하여 조직 절편을 제작하였다. 계속해서, 조직 절편을 마손 트리크롬 염색하여, 관찰하였다. 또한, 파라포름알데히드 고정시킨 신장을 OCT 컴파운드로 포매하여, 조직 절편을 제작하였다. 계속해서, 조직 절편을 면역 염색하여, 섬유화의 지표의 하나인 α-평활근 액틴(α-smooth muscle actin(α-SMA)) 양성 영역의 면적을 산출하였다.

도 20의 (a)는 마손 트리크롬 염색한 신장의 절단면의 사진이다. 도 20의 (b)는 도 20의 (a)에 기초하여 신장 피질의 면적을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 20의 (a) 및 (b) 중, 「UUO」는 요관을 결삭한 우신장의 결과인 것을 나타내고, 「CON」은 무처치인 좌신장의 결과인 것을 나타내고, 「WT」는 야생형 마우스의 결과인 것을 나타내고, 「DNAM-1KO」는 DNAM-1 유전자 결손 마우스의 결과인 것을 나타낸다. 또한, 도 20의 (b) 중, 「*」은 위험율 5％ 미만으로 유의차가 있음을 나타내고, 「**」은 위험율 1％ 미만으로 유의차가 있음을 나타내고, 「N.S.」은 유의차가 없음을 나타낸다. 그 결과, DNAM-1 유전자 결손 마우스에서는, 야생형 마우스와 비교하여, 요관의 결삭에 의한 신장 조직의 파괴가 유의미하게 경감된 것이 명확해졌다.

또한, 도 21의 (a) 및 (b)는, 신장의 조직 절편을 항α-SMA 항체로 면역 염색한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 21의 (a)는 대조인 야생형 마우스에 있어서의, 요관을 결삭시킨 우신장의 조직 절편의 대표적인 결과를 나타내고, 도 21의 (b)는 DNAM-1 유전자 결손 마우스에 있어서의, 요관을 결삭시킨 우신장의 조직 절편의 대표적인 결과를 나타낸다. 또한, 도 21의 (c)는 각 군의 마우스 신장 조직에 있어서의 α-SMA 양성 영역의 면적을 산출한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 21의 (a) 내지 (c) 중, 「WT」는 야생형 마우스의 결과인 것을 나타내고, 「DNAM-1KO」는 DNAM-1 유전자 결손 마우스의 결과인 것을 나타낸다. 또한, 도 21의 (c) 중 「CON」은 무처치인 좌신장의 결과인 것을 나타낸다. 그 결과, DNAM-1 유전자 결손 마우스에서는, 야생형 마우스와 비교하여, 요관의 결삭에 의한 신장 조직의 섬유화가 현저하게 경감된 것이 명확해졌다.

이상의 결과는, 항DNAM-1 항체를 생체에 투여함으로써, 신장의 섬유화를 경감시킬 수 있음을 나타낸다.

[실험예 16]

(염증성 장염에 관한 검토)

항DNAM-1 항체의 투여 대신에 DNAM-1 유전자 결손 마우스를 사용하여 염증성 장염에 관한 검토를 행하였다. 대조에는 야생형 마우스를 사용하였다. 실험에는 덱스트란황산(DSS) 유도 마우스 장염 모델을 사용하였다.

먼저, 실험 개시의 3일 전부터 DNAM-1 유전자 결손 마우스(n=5) 및 야생형 마우스(n=5)를 사육하여 순화시켰다. 이 동안에는 통상의 물을 주었다. 계속해서, 실험을 개시하고, 물 대신에 2％ DSS 수용액을 주어 각 군의 마우스를 사육하고, 체중의 변화를 측정하였다. 실험 개시로부터 9일째에 각 군의 마우스를 죽이고, 대장을 적출하여 장관의 길이를 측정하였다.

도 22는, 대조의 야생형 마우스(WT) 및 DNAM-1 유전자 결손 마우스(KO)의 체중을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 22 중, 「*」은 위험율 5％ 미만으로 유의차가 있음을 나타낸다. 또한, 횡축은 실험 개시 후의 시간(일)을 나타낸다. 그 결과, DNAM-1 유전자 결손 마우스에서는, 야생형 마우스와 비교하여, 염증성 장염에 의한 체중의 감소가 유의미하게 경감된 것이 명확해졌다.

또한, 도 23의 (a)는 실험 개시로부터 9일째에 적출한, DNAM-1 유전자 결손 마우스의 대장 사진이다. 또한, 도 23의 (b)는 실험 개시로부터 9일째에 적출한, 대조의 야생형 마우스의 대장 사진이다. 또한, 도 23의 (c)는 도 23의 (a) 및 (b)의 결과를 수치화한 그래프이다. 도 23의 (a) 내지 (c) 중, 「WT」는 야생형 마우스의 결과인 것을 나타내고, 「DNAM-1KO」는 DNAM-1 유전자 결손 마우스의 결과인 것을 나타내고, 「naive」는 2％ DSS 수용액 대신에 물을 부여한 마우스의 결과인 것을 나타낸다. 또한, 도 23의 (c) 중, 「N.S.」은 유의차가 없었음을 나타낸다. 그 결과, DNAM-1 유전자 결손 마우스에서는, 야생형 마우스와 비교하여, 염증성 장염에 의한 장관의 단축이 유의미하게 경감된 것이 명확해졌다.

이상의 결과는, 항DNAM-1 항체를 생체에 투여함으로써, 염증성 장염의 병태를 경감시킬 수 있음을 나타낸다.

본 발명에 따르면, 인간의 면역 반응을 억제할 수 있는 기술을 제공할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF TSUKUBA <120> AGENT FOR ACTIVATING REGULATORY T CELL AND USE THEREOF <130> PC-23378 <150> JP2016-084170 <151> 2016-04-20 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.1 heavy chain CDR1 <400> 1 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.1 heavy chain CDR2 <400> 2 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn 1 5 <210> 3 <211> 2 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.1 heavy chain CDR3 <400> 3 Ala Arg 1 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.1 light chain CDR1 <400> 4 Gln Ser Val Ser Asn Asp 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.1 light chain CDR2 <400> 5 Tyr Ala Ser 1 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.1 light chain CDR3 <400> 6 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro 1 5 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.1 heavy chain variable region <400> 7 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 1 5 10 15 Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 20 25 30 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro 35 40 45 Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 50 55 60 Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Phe Asp Val 85 90 95 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro 100 105 110 Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Lys 115 120 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.1 light chain variable region <400> 8 Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val 1 5 10 15 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 20 25 30 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser 35 40 45 Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu 50 55 60 Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr 65 70 75 80 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 85 90 95 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Thr 100 105 <210> 9 <211> 126 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.2 heavy chain variable region <400> 9 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 1 5 10 15 Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 20 25 30 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Pro 35 40 45 Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 50 55 60 Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Cys Ala Glu Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 85 90 95 Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala 100 105 110 Pro Gly Asn Leu Asn Ser Ser Thr Ser Phe Ser Ser Leu Gly 115 120 125 <210> 10 <211> 150 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.2 light chain variable region <400> 10 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ser Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Asn His Glu Phe 115 120 125 Trp Ile Arg Tyr Val Thr Arg Leu Gln His Ala Trp Tyr Arg Ala Phe 130 135 140 Pro Ile Gly Val Asp Glu 145 150 <210> 11 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.3 heavy chain variable region <400> 11 Glu Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Leu 1 5 10 15 Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp 20 25 30 Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly 35 40 45 Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 50 55 60 Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Asn 65 70 75 80 Ala Tyr Tyr Arg Tyr Lys Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 85 90 95 Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu 100 105 110 Ala Pro Leu 115 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.3 light chain variable region <400> 12 Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn 1 5 10 15 Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 20 25 30 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 35 40 45 Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 50 55 60 Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 85 90 95 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 100 105 110 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.4 heavy chain variable region <400> 13 Lys Trp Gly Leu Ser Glu Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 1 5 10 15 Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 20 25 30 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn 35 40 45 Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser 50 55 60 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 65 70 75 80 Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 85 90 95 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro 100 105 110 Leu Ala Pro Trp Lys 115 <210> 14 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.4 light chain variable region <400> 14 Glu Lys Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 1 5 10 15 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 20 25 30 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 35 40 45 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 50 55 60 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp 65 70 75 80 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 85 90 95 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Arg 100 105 <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.5 heavy chain variable region <400> 15 Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile 1 5 10 15 Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr 20 25 30 Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile 35 40 45 Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val 50 55 60 Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Val Met 65 70 75 80 Ile Thr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 85 90 95 Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly 100 105 110 Lys <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.5 light chain variable region <400> 16 Ser Ala Leu Trp Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu 1 5 10 15 Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile 20 25 30 Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys 35 40 45 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 50 55 60 Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala 65 70 75 80 Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 85 90 95 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 100 105 110 <210> 17 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.6 heavy chain variable region <400> 17 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 1 5 10 15 Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 20 25 30 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro 35 40 45 Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 50 55 60 Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Val Met Ile Thr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro 100 105 110 Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Lys 115 120 <210> 18 <211> 97 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.6 light chain variable region <400> 18 Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 1 5 10 15 Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala 20 25 30 Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr 35 40 45 Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr 50 55 60 Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 65 70 75 80 Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro 85 90 95 Pro <210> 19 <211> 379 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.1 heavy chain variable region <400> 19 cagccgctac ttctcagtct ctgtctctca cctgctctgt cactggctac tccatcacca 60 gtggttatta ctggaactgg atccggcagt ttccaggaaa caaactggaa tggatgggct 120 acataagcta cgacggtagc aataactaca acccatctct caaaaatcga atctccatca 180 ctcgtgacac atctaagaac cagtttttcc tgaagttgaa ttctgtgact actgaggaca 240 cagctacata ttactgtgca agggcctact atggtaacta cgtggggtac ttcgatgtct 300 ggggcgcagg gaccacggtc accgtctcct cagccaaaac gacaccccca tcggtctatc 360 cactggcccc tggaaaaaa 379 <210> 20 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <223> mAb No.1 light chain variable region <400> 20 gttcagcagg agacagggtt accataacct gcaaggccag tcagagtgtg agtaatgatg 60 tagcttggta ccaacagaag ccagggcagt ctcctaaact gctgatatac tatgcatcca 120 atcgctacac tggagtccct gatcgcttca ctggcagtgg atatgggacg gatttcactt 180 tcaccatcag cactgtgcag gctgaagacc tggcagttta tttctgtcag caggattata 240 gctctccgct cacgttcggt gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac 300 caactgtatc catcttccca ccatccagtg agcagagag 339 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv linker <400> 21 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (23)

1. 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자와 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 100ng 이하로 상기 인간 DNAM-1 분자를 포화할 수 있는 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1 내지 3이, 각각 서열 번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
2. 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자와 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 100ng 이하로 상기 인간 DNAM-1 분자를 포화할 수 있는 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
3. 인간 DNAM-1을 강제 발현시킨 림프구 세포 1×10⁵개의 세포 표면에 존재하는 인간 DNAM-1 분자와 반응시킨 경우에, IgG형 항체 전체 길이로 환산하여 100ng 이하로 상기 인간 DNAM-1 분자를 포화할 수 있는 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는, 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 항인간 DNAM-1 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
5. 제4항에 기재된 핵산을 함유하는 벡터.
6. 제5항에 기재된 벡터를 함유하는 형질 전환체.
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