WO2017183665A1 - 制御性ｔ細胞の活性化剤及びその使用 - Google Patents

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和子 渋谷
史枝 阿部
玲 広近
元紀 奥村
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an activator of regulatory T cells and use thereof. More specifically, an activator of regulatory T cells, a pharmaceutical composition for activating regulatory T cells, an anti-human DNAX Accessory Molecule-1 (DNAM-1) monoclonal antibody or fragment thereof, a nucleic acid, a vector, and transformation About the body.
  • DNAM-1 DNAX Accessory Molecule-1
  • Graft-versus-host disease may develop after blood transfusion or stem cell transplantation.
  • Graft-versus-host disease occurs when activated T cells from a donor present in the transplanted cells damage the recipient's cells.
  • rejection may occur when a donor organ is transplanted into a recipient.
  • the transplanted heart, blood vessel, and kidney may be temporarily engrafted, but detachment may be gradually observed. For this reason, a technique for suppressing graft-versus-host disease and organ transplant rejection is required.
  • Patent Document 1 describes that a neutralizing antibody against mouse DNAM-1 protein can be used as a drug for maintaining engraftment of transplanted heart, transplanted blood vessel or transplanted kidney in mice.
  • the DNAM-1 protein is an adhesion molecule belonging to the immunoglobulin superfamily with a molecular weight of 65 kDa, also called CD226. Expression of DNAM-1 protein is observed in various immune cells such as human and mouse CD4 + T cells, CD8 + T cells, NK cells, macrophages and dendritic cells.
  • the RefSeq ID of human DNAM-1 is NP_001290547, and the RefSeq ID of mouse DNAM-1 is NP_001034238.
  • the inventors have previously shown that the DNAM-1 protein binds to CD155, which has been known as the poliovirus receptor.
  • CD155 is a type I transmembrane glycoprotein belonging to the immunoglobulin superfamily.
  • an object of the present invention is to provide a technique capable of suppressing a human immune reaction.
  • a regulatory T cell activator comprising a substance that inhibits the binding of DNAM-1 and CD155.
  • the substance that inhibits the binding between DNAM-1 and CD155 is a specific binding substance for DNAM-1, a DNAM-1 expression inhibitor, a specific binding substance for CD155, or a CD155 expression inhibitor.
  • the substance that inhibits the binding of DNAM-1 and CD155 is a specific binding substance for DNAM-1, the DNAM-1 is human DNAM-1, and the specific binding substance is an antibody or a fragment thereof
  • the antibody or fragment thereof is a human DNAM-1 molecule present on the surface of 1 ⁇ 10 5 lymphocytes in which human DNAM-1 is forcibly expressed.
  • the binding between the fusion protein and the human DNA M-1 molecule can be completely inhibited at 500 ng or less in terms of the total length of the IgG antibody.
  • the activator of regulatory T cells according to any one of [4] to [4].
  • CDRs 1 to 3 are heavy chains consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, respectively. Any of [4] to [6], wherein the variable region and CDRs 1 to 3 compete with an antibody having a light chain variable region consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6, respectively.
  • CDRs 1 to 3 are amino acids in which one or several amino acids have been deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3 or the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, respectively.
  • a heavy chain variable region comprising the sequences and CDRs 1 to 3 are amino acids in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6 or amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6, respectively.
  • a pharmaceutical composition for activating regulatory T cells, comprising the regulatory T cell activator according to any one of [1] to [8] and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the total amount is 100 ng or less in terms of the total length of an IgG-type antibody.
  • CDRs 1 to 3 are amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 or amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, respectively.
  • CDRs 1 to 3 are amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6 or amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6, respectively, wherein one or several amino acids are deleted, substituted, or added to the light chain variable region.
  • CDR1 to CDR3 are each a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOS: 1 to 3, and CDR1 to 3 are respectively SEQ ID NO: 4.
  • CDRs 1 to 3 each have a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3
  • CDRs 1 to 3 each have a light chain variable region consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 4 to 6,
  • the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8,
  • the anti-chain according to any one of [10] to [15], which has a light chain variable region consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, or
  • the anti-human DNAM according to any one of [10] to [14], which has a light chain variable region consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 -1 Monoclonal antibody or fragment thereof.
  • CDRs 1 to 3 are amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3 or amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, respectively.
  • CDRs 1 to 3 are amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6 or amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6, respectively, wherein one or several amino acids are deleted, substituted, or added to the light chain variable region.
  • CDRs 1 to 3 each have a heavy chain variable region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, and CDRs 1 to 3 each comprise a light chain variable region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6,
  • the anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or antibody fragment described in (1) The anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or antibody fragment described in (1).
  • An immunosuppressant comprising the anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (4) as an active ingredient.
  • the immunosuppressive agent according to (8) which is a preventive or therapeutic agent for graft-versus-host disease.
  • the immunosuppressive agent according to (8) which is a preventive or therapeutic agent for organ transplant rejection.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of alignment of amino acid sequences of heavy chains 1-6.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of aligning amino acid sequences of 1 to 6 light chains.
  • (A) to (d) are graphs showing the results of Experimental Example 2.
  • (A) to (l) are graphs showing the results of Experimental Example 3.
  • (A) to (e) are the same as those in Experimental Example 4, except that anti-human DNAM-1 monoclonal antibody No. 6 is a graph showing the results of examining the reactivity of 1 to 6.
  • A) to (e) are the same as those in Experimental Example 5, except that anti-human DNAM-1 monoclonal antibody No.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of examining the reactivity of 1 to 6.
  • A) to (e) are the same as those in Experimental Example 6, except that the anti-human DNAM-1 monoclonal antibody No. 6 is a graph showing the results of examining the reactivity of 1 to 6.
  • A) to (e) are the same as those in Experimental Example 7, except that the anti-human DNAM-1 monoclonal antibody No. 6 is a graph showing the results of examining the reactivity of 1 to 6.
  • 10 is a graph showing the results of a mixed lymphocyte reaction assay in Experimental Example 8. It is a figure which shows the experimental protocol of Experimental example 9.
  • FIG. is a graph which shows the survival rate of the mouse
  • FIG. 14 is a graph showing the results of measuring the cytotoxic activity of CD8 + T cells reacted with anti-human DNAM-1 monoclonal antibody in Experimental Example 11.
  • A is a monoclonal antibody No. It is a graph which shows the result of having measured the ratio of the regulatory T cell in the CD4 ⁇ +> T cell in the spleen of the mouse
  • B shows that monoclonal antibody No.
  • FIG. 1 It is a graph which shows the result of having measured the ratio of the regulatory T cell in the CD4 ⁇ +> T cell in the peripheral blood of the mouse
  • (A) is a graph which shows the result of having measured the incidence rate of encephalomyelitis in Experimental example 13.
  • FIG. Further, (b) is a graph showing the results of calculating the average clinical score in Experimental Example 13.
  • (A) is a graph showing the results of quantifying alkaline phosphatase in serum in Experimental Example 14.
  • (B) is a graph showing the results of quantifying total bilirubin in serum in Experimental Example 14.
  • (A) is a photomicrograph of liver tissue of a control mouse in Experimental Example 14.
  • (B) is a micrograph of liver tissue of DNAM-1 gene-deficient mice in Experimental Example 14.
  • (A) is a photograph of a cut surface of a kidney stained with Masson trichrome in Experimental Example 15.
  • (B) is a graph which shows the result of having measured the area of the renal cortex based on (a).
  • (A) is a photomicrograph showing typical results of immunostaining of a tissue section of a kidney of a control mouse with anti- ⁇ -SMA antibody in Experimental Example 15.
  • (B) is a photomicrograph showing representative results of immunostaining a kidney tissue section of a DNAM-1 gene-deficient mouse in Example 15 with an anti- ⁇ -SMA antibody.
  • (C) is a graph showing the results of calculating the area of the ⁇ -SMA positive region in the kidney tissue of each group of mice in Experimental Example 15.
  • it is a graph which shows the result of having measured the body weight of the control mouse
  • (A) is a photograph of the large intestine of a DNAM-1 gene-deficient mouse excised on the 9th day from the start of the experiment in Experimental Example 16.
  • (B) is a photograph of the large intestine of a control mouse excised on the ninth day from the start of the experiment in Experimental Example 16.
  • (C) is the graph which digitized the result of (a) and (b).
  • the present invention provides an activator of regulatory T cells comprising a substance that inhibits the binding of DNAM-1 and CD155.
  • regulatory T cells can be activated by inhibiting the binding between DNAM-1 and CD155. Therefore, a substance that inhibits the binding of DNAM-1 and CD155 can be used for the activation of regulatory T cells.
  • the specific binding substance for DNAM-1 and the specific binding substance for CD155 are not particularly limited as long as they can inhibit the binding of DNAM-1 and CD155, and examples thereof include antibodies, antibody fragments, and aptamers.
  • the antibody may be prepared by immunizing an animal such as a mouse, or may be prepared by screening an antibody library such as a phage library.
  • antibody fragments include F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv, scFv and the like.
  • Examples of aptamers include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • the DNAM-1 expression inhibitor and CD155 expression inhibitor are not particularly limited as long as they are substances that can reduce the expression of DNAM-1 or CD155 and consequently inhibit the binding of DNAM-1 and CD155.
  • siRNA examples include shRNA, miRNA, ribozyme, antisense nucleic acid, low molecular weight compound and the like.
  • siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme and antisense nucleic acid may contain various chemical modifications in order to improve stability and activity.
  • the phosphate residue may be substituted with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate, methylphosphonate, phosphorodithionate and the like.
  • you may comprise at least one part with nucleic acid analogs, such as a peptide nucleic acid (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • activation of regulatory T cells means an increase in the number of regulatory T cells, an increase in the expression level of inhibitory cytokines such as TGF- ⁇ and IL-10 expressed by regulatory T cells, It means suppression of immune response by T cells, suppression of overall immune response, and the like.
  • the activator of regulatory T cells of the present embodiment can be used for the prevention or treatment of diseases whose symptoms can be reduced by the activation of regulatory T cells.
  • diseases include graft-versus-host disease, organ transplant rejection, autoimmune disease, fibrotic disease, inflammatory bowel disease, allergy and the like.
  • examples of the autoimmune disease include rheumatism, type I diabetes, autoimmune encephalomyelitis and the like.
  • Fibrotic diseases are diseases in which tissues are replaced with type I collagen in various organs such as the lung, heart, liver, and kidney, and examples include cirrhosis, diabetic nephropathy, and pulmonary fibrosis.
  • Examples of allergies include allergic rhinitis and atopic dermatitis.
  • the activator of regulatory T cells of this embodiment may be, for example, a specific binding substance for DNAM-1, and the specific binding substance may be an antibody or a fragment thereof.
  • DNAM-1 may be DNAM-1 of a target species that activates regulatory T cells, for example, human DNAM-1. That is, the activator of regulatory T cells of this embodiment may be an anti-human DNAM-1 antibody or a fragment thereof.
  • Human DNAM-1 molecule present on the cell surface of the above lymphocytes in terms of the total length of the IgG type antibody of 100 ng or less, preferably 80 ng or less, more preferably 50 ng or less, still more preferably 40 ng or less, particularly preferably 30 ng or less.
  • the anti-human DNAM-1 antibody having such reactivity has high ability to activate regulatory T cells.
  • the reactivity may be calculated in terms of the total mass of the IgG type antibody.
  • the mass may be converted based on the molecular weight of the antibody fragment and the total length of the IgG type antibody.
  • the anti-human DNAM-1 antibody or fragment thereof suitable as an activator of regulatory T cells of the present embodiment is present on the surface of 1 ⁇ 10 5 lymphocyte cells in which human DNAM-1 is forcibly expressed.
  • the human DNA M-1 molecule is saturated with 1000 ng of a fusion protein of human CD155 and IgG antibody constant region and then reacted with the above lymphocytes, it is 500 ng or less in terms of the total length of IgG antibody, preferably Is not more than 400 ng, more preferably not more than 300 ng, still more preferably not more than 200 ng, particularly preferably not more than 100 ng, and completely inhibits the binding between the fusion protein and the human DNA M-1 molecule present on the cell surface of the lymphocyte. It may be reactive.
  • the anti-human DNAM-1 antibody having such a reactivity can release this binding even when DNAM-1 and CD155 are previously bound.
  • the anti-human DNAM-1 antibody having such reactivity has high ability to activate regulatory T cells.
  • complete inhibition means that it can be substantially completely inhibited.
  • This means that the above can be dissociated and bind to the human DNA M-1 molecule present on the cell surface of lymphocytes.
  • the activator of regulatory T cells of this embodiment may be an anti-human CD155 antibody or a fragment thereof.
  • the anti-human DNAM-1 antibody or fragment thereof, or the anti-human CD155 antibody or fragment thereof is preferably a human type antibody or fragment thereof.
  • the chimeric antibody means an antibody in which the variable region is an antibody derived from a non-human animal and at least a part of the constant region is an antibody derived from human.
  • the humanized antibody means an antibody in which only the complementarity determining regions (CDRs) of the heavy chain and the light chain are antibodies derived from non-human animals, and the constant region and the framework region are antibodies derived from humans.
  • CDRs complementarity determining regions
  • a fully human antibody means an antibody derived entirely from a human including a complementarity determining region.
  • CDR1 or CDR2 of the heavy chain variable region means four, three or two.
  • CDR3 of a heavy chain variable region means two.
  • CDR1 or CDR3 of the light chain variable region means four, three or two.
  • CDR2 of the light chain variable region means two.
  • CDR1 to CDR3 each comprise a heavy chain variable region comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, and CDR1 to CDR3.
  • the target antibody is competing with, for example, a monoclonal antibody described later in Examples in the human DNAM-1 molecule present on the surface of 1 ⁇ 10 5 lymphocytes forcibly expressing human DNAM-1. No.
  • the antibody of interest is reacted with the lymphocytes described above after reacting with the monoclonal antibody No. This means that at least a part of the bond between 1 and the human DNA M-1 molecule can be dissociated to bind to the human DNA M-1 molecule.
  • At least one part may be 10% or more of the whole human DNAM-1 molecule existing on the surface of 1 ⁇ 10 5 lymphocyte cells, or 30% or more, It may be 50% or more, 70% or more, or 90% or more.
  • the pharmaceutically acceptable carrier those generally used for preparations can be used, and examples thereof include excipients, stabilizers, solvents for injections, and the like.
  • the solvent for injection include isotonic solutions containing adjuvants such as physiological saline, glucose, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment may contain additives in addition to the above-mentioned activator of regulatory T cells and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • additives include pH adjusters, viscosity improvers, coloring agents, steroids, immunosuppressants and the like conventionally used in the treatment of graft-versus-host disease and organ transplant rejection.
  • the pharmaceutical composition of this embodiment is administered to a patient by intravenous administration or the like, for example, as an injection or an infusion.
  • the dosage, administration route, and prescription may be appropriately determined according to the patient's symptoms, body weight, age, sex, and the like.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present embodiment varies depending on the patient's symptoms, body weight, age, sex, etc., and cannot be determined unconditionally, but for a human patient requiring treatment per kg body weight in a single administration
  • the amount of the active ingredient for example, from 1 ⁇ g to 100 mg, for example from 50 ⁇ g to 50 mg, may be administered once to several times per day.
  • the anti-human DNAM-1 antibody having such reactivity is used to activate regulatory T cells, graft versus host disease, organ transplant rejection, autoimmune disease, fibrotic disease, It is useful for reducing symptoms such as inflammatory bowel disease.
  • the reactivity may be calculated in terms of the total mass of the IgG type antibody.
  • the mass may be converted based on the molecular weight of the antibody fragment and the total length of the IgG type antibody.
  • the anti-human DNA M-1 monoclonal antibody or fragment thereof of the present embodiment may be obtained by removing any known antibody and fragment thereof.
  • the total length of the IgG antibody is 500 ng or less, preferably 400 ng or less, more preferably 300 ng or less, even more preferably Is not more than 200 ng, particularly preferably not more than 100 ng, and has a reactivity capable of completely inhibiting the binding between the fusion protein and the human DNA M-1 molecule present on the cell surface of the lymphocyte. Also good.
  • the anti-human DNAM-1 antibody having such a reactivity can release this binding even when DNAM-1 and CD155 are previously bound.
  • “completely inhibit” is the same as described above.
  • CDR1 or CDR2 of the heavy chain variable region means four, three or two.
  • CDR3 of a heavy chain variable region means two.
  • CDR1 or CDR3 of the light chain variable region means four, three or two.
  • CDR2 of the light chain variable region means two.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2 , single-chain Fv (scFv) in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked with an appropriate linker, and the like.
  • scFv linker include peptides such as (GGGGS) 3 (SEQ ID NO: 21).
  • the anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or fragment thereof of this embodiment binds well to human DNAM-1 protein and can suppress human immune responses in vivo and in vitro. For this reason, it can utilize as an immunosuppressant.
  • CDRs 1 to 3 are each a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 3
  • CDR1-3 may be an antibody that competes with an antibody having a light chain variable region consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4-6, respectively, or a fragment thereof. That is, the anti-human DNAM-1 antibody is related to the monoclonal antibody No. described later in Examples in connection with the binding to human DNAM-1. It may be an antibody that competes with 1. Monoclonal antibody no. Antibody that competes with monoclonal antibody No. 1 for binding to human DNA M-1. Reactivity equal to or higher than 1. Here, antibody competition is the same as described above.
  • the anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or fragment thereof has a heavy chain variable region in which CDR1 to 3 are each composed of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, and CDR1 to 3 are each composed of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to It may have a light chain variable region.
  • Examples of such antibodies include monoclonal antibody No. described later in the Examples. 1, monoclonal antibody no. Examples include antibodies in which 1 is humanized.
  • the anti-human DNA M-1 monoclonal antibody or fragment thereof may have a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. .
  • Examples of such antibodies include monoclonal antibody No. described later in the Examples. 1, monoclonal antibody no. Examples include antibodies in which 1 is humanized.
  • the anti-human DNA M-1 monoclonal antibody or a fragment thereof may have a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
  • Examples of such antibodies include monoclonal antibody No. described later in the Examples. 2, monoclonal antibody no. Examples include antibodies in which 2 is humanized.
  • the anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or a fragment thereof has reactivity with human DNAM-1, one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 have been deleted, substituted or added. It may have a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence, and a light chain variable region comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. .
  • the anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or a fragment thereof has reactivity with human DNAM-1, one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 have been deleted, substituted or added. It may have a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence and a light chain variable region comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. .
  • nucleic acid encoding anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or fragment thereof In one embodiment, the present invention provides a nucleic acid encoding the above-described anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or fragment thereof.
  • Gene encoding heavy chain variable region and part of constant region of the above, gene encoding light chain variable region and part of constant region of the anti-human DNA M-1 monoclonal antibody described above, anti-human DNA M-1 monoclonal antibody described above A gene encoding the full length of the above heavy chain, a gene encoding the full length of the light chain of the above-mentioned anti-human DNA M-1 monoclonal antibody, and a heavy chain variable region and a light chain variable region of the above-mentioned anti-human DNA M-1 monoclonal antibody appropriately Examples include a gene encoding scFv linked by a linker.
  • the above heavy chain variable region gene may be a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19.
  • the light chain variable region gene may be a gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
  • CDRs 1 to 3 are each composed of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3, and a framework region other than CDRs encodes a heavy chain variable region derived from a non-mouse antibody. It may be a gene.
  • CDRs 1 to 3 each have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 4 to 6, and the framework region other than the CDRs encodes a light chain variable region derived from a non-mouse antibody. It may be a gene.
  • examples of non-mouse antibodies include human antibodies.
  • the nucleic acid of the present embodiment includes the above-described heavy chain variable region gene of an anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or a gene derived therefrom, and the light chain variable region gene of an anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or a gene derived therefrom. It is preferable that it is the combination of these.
  • CDR1 to CDR3 are each composed of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1 to 3, and a framework region other than the CDR is derived from a non-mouse antibody-derived heavy chain. And a gene encoding the chain variable region.
  • CDR1 to CDR3 are each composed of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4 to 6, and the framework region other than the CDR is derived from a non-mouse antibody. Examples include a gene encoding a light chain variable region.
  • a DNA encoding a tag sequence such as a histidine tag, a FLAG tag, or a GST tag may be added to the 5 ′ end or 3 ′ end of the nucleic acid described above.
  • the above expression vector includes an anti-human DNAM in a protein translation system comprising a cell-based vector for expressing an anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or a fragment thereof in a host cell and a component capable of synthesizing protein extracted from an appropriate cell.
  • Escherichia coli examples include ColE-type plasmids typified by pBR322 derivatives, pACYC-type plasmids having a p15A origin, pSC-type plasmids, and Bac-type F factor-derived mini-F plasmids.
  • expression vectors having tryptophan promoters such as trc and tac, lac promoter, T7 promoter, T5 promoter, T3 promoter, SP6 promoter, arabinose inducible promoter, cold shock promoter, tetracycline inducible promoter and the like can be mentioned.
  • vectors other than Escherichia coli examples include pAUR plasmids for yeast expression, pIEx plasmids for insect cell expression, pBApo-CMV plasmids for animal cell expression, and the like.
  • the cell-free vector examples include an expression vector having a T7 promoter and an expression vector having a T3 promoter mentioned in the cell-based vector; a vector for wheat cell-free protein synthesis such as a pEU-based plasmid having an SP6 promoter or a T7 promoter. It is done.
  • the SesA gene is transcribed using a transcription system to synthesize mRNA.
  • the transcription system include conventionally known ones that are transcribed by RNA polymerase.
  • the RNA polymerase include T7 RNA polymerase and SP6 polymerase.
  • the cell-free protein synthesis system which is a translation system, is used to translate the mRNA and synthesize the protein.
  • This system contains elements necessary for translation, such as ribosomes, translation initiation factors, translation elongation factors, dissociation factors, and aminoacyl-tRNA synthetases.
  • protein translation systems include Escherichia coli extract, rabbit reticulocyte extract, and wheat germ extract.
  • the elements necessary for the translation are composed solely of independently purified factors.
  • An anti-human DNA M-1 monoclonal antibody or a fragment thereof can be purified from a protein synthesized using a cell-based vector or a cell-free vector.
  • the purification method include a method using protein A, protein G and the like. If the expression vector is designed to express a tag sequence such as a histidine tag at the N-terminus or C-terminus of the target protein, use an affinity column that uses a substance having an affinity for this tag, such as nickel or cobalt. A purification method is mentioned.
  • the purity of the anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or a fragment thereof can be increased by purifying by appropriately combining ion exchange chromatography or gel filtration chromatography.
  • the present invention provides a transformant containing the above-described recombinant vector.
  • An anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or a fragment thereof can be produced from the transformant of the present embodiment or a medium thereof.
  • the transformant of this embodiment can be obtained by introducing the above-described recombinant vector into a host.
  • the transformant include cultured cells such as Escherichia coli, yeast, plant cells, insect cells, and animal cells into which the above-described recombinant vector has been introduced; insect living organisms such as silkworm into which the above-described vector has been introduced; Examples include plants such as tobacco, into which the vector is introduced.
  • Introduction of the recombinant vector into the host can be performed using a conventionally known method.
  • a competent cell method using microbial cells treated with calcium, an electroporation method, and the like can be mentioned.
  • a method of transforming a host by infecting a phage vector, virus vector or the like may be used.
  • the present invention provides an immunosuppressant comprising the above-described anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or fragment thereof as an active ingredient.
  • the immunosuppressive agent of the present embodiment can suppress the proliferation of CD8 + T cells in a mixed lymphocyte reaction (MLR) assay.
  • MLR mixed lymphocyte reaction
  • the immunosuppressive agent of the present embodiment has been confirmed to be effective in both prevention and treatment of graft-versus-host disease in a graft-versus-host disease mouse model. .
  • the immunosuppressive agent of the present embodiment may be a pharmaceutical composition containing a pharmaceutically acceptable carrier and other additives.
  • pharmaceutically acceptable carriers include excipients, stabilizers, solvents for injections, and the like.
  • solvent for injection include isotonic solutions containing adjuvants such as physiological saline, glucose, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride.
  • Other additives include, for example, pH adjusters, viscosity improvers, colorants, steroids, immunosuppressants and the like conventionally used in the treatment of graft-versus-host disease and organ transplant rejection.
  • the dosage form of the immunosuppressive agent or the above pharmaceutical composition of the present embodiment is not limited, and examples thereof include a lyophilization agent, a powder formulation, a solution formulation with a pH adjusted buffer, and a microcapsule for injection.
  • the present invention provides a method of activating regulatory T cells comprising administering an effective amount of a DNAM-1 and CD155 binding inhibitor to a patient in need of treatment.
  • a DNAM-1 and CD155 binding inhibitor examples include those described above.
  • the present invention provides the use of a DNAM-1 and CD155 binding inhibitor to produce an activator of regulatory T cells.
  • a DNAM-1 and CD155 binding inhibitor examples include those described above.
  • the present invention provides a DNAM-1 and CD155 binding inhibitor for the prevention or treatment of graft-versus-host disease, organ transplant rejection, autoimmune disease, fibrotic disease, inflammatory bowel disease or allergy.
  • a DNAM-1 and CD155 binding inhibitor for the prevention or treatment of graft-versus-host disease, organ transplant rejection, autoimmune disease, fibrotic disease, inflammatory bowel disease or allergy.
  • Examples of the binding inhibitor of DNAM-1 and CD155 include those described above.
  • the present invention relates to DNAM-1 and CD155 for producing a prophylactic or therapeutic agent for graft-versus-host disease, organ transplant rejection, autoimmune disease, fibrotic disease, inflammatory bowel disease or allergy.
  • DNAM-1 and CD155 for producing a prophylactic or therapeutic agent for graft-versus-host disease, organ transplant rejection, autoimmune disease, fibrotic disease, inflammatory bowel disease or allergy.
  • binding inhibitors examples include those described above.
  • the present invention provides for the treatment of graft-versus-host disease or organ transplant rejection comprising administering an effective amount of the above-described anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or fragment thereof to a patient in need of treatment. Or provide preventive methods.
  • the present invention provides the above-described anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or fragment thereof for the treatment or prevention of graft-versus-host disease or organ transplant rejection.
  • the present invention provides the use of the above-described anti-human DNAM-1 monoclonal antibody or fragment thereof for the manufacture of a therapeutic or prophylactic agent for graft-versus-host disease or organ transplant rejection.
  • Example 1 Preparation of anti-human DNAM-1 monoclonal antibody
  • the human DMAM-1 gene was introduced into the BW5147 cell line, which is a mouse lymphocyte, to express the human DMAM-1 protein. Mice were immunized using these cells as antigens, and hybridomas were prepared by conventional methods. Among the obtained hybridoma strains, anti-human DNA M-1 monoclonal antibody No. 1 was used as an index of reactivity with human DNA M-1 protein. Each clone producing 1-6 was obtained.
  • FIG. 3 (a) shows monoclonal antibody no. It is a graph which shows the result of having made 1 react.
  • FIG. 3 (b) shows that monoclonal antibody No. It is a graph which shows the result of having made 1 react.
  • FIG. 3 (c) shows that monoclonal antibody No. It is a graph which shows the result of having made 2 react.
  • FIG. 3 (d) shows that monoclonal antibody No. It is a graph which shows the result of having made 2 react.
  • CD3 + CD4 + cells CD4 + T cells
  • CD3 + CD8 + cells CD8 + T cells
  • CD3 ⁇ CD19 + cells B cells
  • CD3 ⁇ CD56 + cells NK present in human peripheral blood lymphocytes Cells
  • CD3 + CD56 + cells NKT cells
  • CD14 + cells CD14 + cells (monocytes). 1 and no. The reactivity of 2 was examined.
  • a control IgG1 antibody was used as a control.
  • Monoclonal antibody No. 1 against 1 ⁇ 10 5 peripheral blood lymphocytes. 1 and no. 2 were reacted with 100 ng each. The antibody was allowed to react for 30 minutes on ice.
  • FIG. 4 (a) shows monoclonal antibody No. 4 against CD4 + T cells. 1 is a result showing a reactivity of 1.
  • FIG. 4 (b) shows monoclonal antibody No. 4 against CD8 + T cells. 1 is a result showing a reactivity of 1.
  • FIG. 4 (c) shows monoclonal antibody No. 5 against B cells. 1 is a result showing a reactivity of 1.
  • FIG. 4 (d) shows monoclonal antibody No. 4 against CD4 + T cells. 2 is a result showing the reactivity of 2.
  • FIG. 4 (e) shows monoclonal antibody No. 4 against CD8 + T cells. 2 is a result showing the reactivity of 2.
  • FIG. 4 (f) shows monoclonal antibody No. 5 against B cells.
  • FIG. 6 (e) is the same as the result of FIG. 6 (d). 2 and monoclonal antibody no. There was a possibility that the epitope was not competing with 6.
  • CD8 + T cells were treated with F (ab ′) type 2 monoclonal antibody No. 2 at a saturation level or higher (1 ⁇ g / mL).
  • F (ab ′) type 2 monoclonal antibody No. 1 2 or F (ab ′) type 2 control IgG (control) was reacted and then co-cultured with the above dendritic cells.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of the MLR assay.
  • “*” indicates that there is a significant difference at a risk rate of less than 5%.
  • monoclonal antibody no. 1 and no. It was revealed that the growth of CD8 + T cells was significantly suppressed when any of the two was added. This result is shown by monoclonal antibody No. 1 and no. 2 indicates that it can affect the function of human T cells.
  • FIG. 10 is a diagram showing an experimental protocol of this experiment.
  • the day before the start of the experiment 1.2 Gy was irradiated to hCD155Tg / NOG mice (female, 8 weeks old).
  • 2.5 ⁇ 10 6 human peripheral blood lymphocytes were transplanted by tail vein injection on the day of the start of the experiment, and 300 ⁇ g / 0.2 mL of F (ab ′) type 2 monoclonal antibody No. 2 was further transplanted.
  • PBS phosphate buffer
  • changes in body weight and survival rate of mice were measured, and symptoms of graft-versus-host disease were measured.
  • the same amount of antibody was intraperitoneally administered on days 3, 7, 11, 14, 18 and 21 from the start of the experiment.
  • FIG. 11 is a graph showing the survival rate of mice. As a result, monoclonal antibody no. The survival rate was significantly increased in the mice to which 1 was administered. This result is shown by monoclonal antibody No. It shows that graft-versus-host disease can be prevented by administering 1.
  • ALT glutamate pyruvate transaminase
  • AST glutamate oxaloacetate transaminase
  • FIG. 12 (a) is a graph showing the results of measuring ALT activity.
  • FIG.12 (b) is a graph which shows the result of having measured AST activity.
  • monoclonal antibody no It was revealed that the decrease in liver function was suppressed in the mice administered with 1.
  • Example 10 (Functional analysis of anti-human DNAM-1 monoclonal antibody 3) Using the same graft versus host disease mouse model as in Experimental Example 9, the monoclonal antibody No. 1 prepared in Experimental Example 1 was used. One function was analyzed. The experimental protocol was changed from that in Experimental Example 9, and monoclonal antibody No. The therapeutic effect of graft-versus-host disease by 1 was examined.
  • FIG. 13 is a diagram showing an experimental protocol of this experiment.
  • the day before the start of the experiment 1.2 Gy was irradiated to hCD155Tg / NOG mice (female, 8 weeks old).
  • 2.5 ⁇ 10 6 human peripheral blood lymphocytes were transplanted by tail vein injection on the day of the start of the experiment.
  • changes in body weight and survival rate of mice were measured, and symptoms of graft-versus-host disease were measured.
  • 300 ⁇ g / 0.2 mL of F (ab ′) type 2 monoclonal antibody No. 1 was administered intraperitoneally. Monoclonal antibody no. Administration of 1 was continued twice a week until the mice died.
  • mice administered with PBS instead of antibody were used.
  • FIG. 14 is a graph showing the survival rate of mice. As a result, monoclonal antibody no. The survival rate was significantly increased in the mice to which 1 was administered. This result is shown by monoclonal antibody No. 1 shows that administration of 1 can treat graft-versus-host disease.
  • activated CD8 + T cells were treated with control IgG1 antibody (control), monoclonal antibody No. 1 or monoclonal antibody no. 2 was added at a rate of 10 mg / 10 6 cells and allowed to bind by incubating at 4 ° C. for 30 minutes.
  • hCD155-expressing cells cells in which hCD155 was forcibly expressed in BW5147 cells were used.
  • CD8 + T cells of cytotoxic activity was evaluated by expression of CD107a in CD8 + T cells.
  • CD107a is a degranulation marker for CD8 + T cells.
  • PBS phosphate buffer
  • FIG. 16 (a) shows monoclonal antibody no. It is a graph which shows the result of having measured the ratio of the regulatory T cell in the CD4 ⁇ +> T cell in the spleen of the mouse
  • mice 50 ⁇ g / 0.2 mL of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) protein corresponding to the 33rd to 55th amino acid sequence was subcutaneously administered to the back of each group of mice.
  • MOG myelin oligodendrocyte glycoprotein
  • 200 ng / 0.2 mL of pertussis toxin was intraperitoneally administered.
  • 200 ng / 0.2 mL of pertussis toxin was intraperitoneally administered to each group of mice.
  • mice after the start of the experiment were observed, and the incidence of encephalomyelitis and clinical score were measured.
  • the clinical score was the average of the scores evaluated according to the following evaluation criteria. (Clinical score) 0: Normal 1: Reduced tonus of the tail 2: Complete drooping of the tail 3: Abnormal gait 4: Complete weakness of the hind limbs 5: Complete weakness of the hind limbs including forelimb paralysis 6: Death
  • FIG. 17 (a) is a graph showing the results of measuring the incidence of encephalomyelitis.
  • FIG. 17B is a graph showing the results of calculating the average clinical score.
  • the horizontal axis indicates the time (day) after the start of the experiment.
  • liver fibrosis was examined using a DNAM-1 gene deficient (hereinafter sometimes referred to as “DNAM-1KO”) mouse. Wild type mice were used as controls. The experiment used a bill duct ligation (BDL) model.
  • DNAM-1KO DNAM-1 gene deficient mice
  • each group of mice was laparotomized, and the common bile duct was connected to create a BDL model. Subsequently, orbital blood was collected from each group of mice on days 3, 7, 14, and 21 from the start of the experiment. Subsequently, serum was separated from the collected blood, and alkaline phosphatase and total bilirubin were quantified using a clinical chemistry analyzer (model “Drychem”, Fujifilm). Alkaline phosphatase and total bilirubin are indicators of liver and biliary tract disorders.
  • mice in each group were perfused systemically and the liver was removed.
  • the excised liver was fixed and embedded in paraffin to prepare a tissue section, stained with sirius red, and observed with a microscope.
  • Sirius red is a dye that binds to a collagen triple-stranded helix.
  • FIG. 18 (a) is a graph showing the results of quantifying alkaline phosphatase in serum.
  • WT indicates the result of the wild-type mouse
  • DNAM-1 KO indicates the result of the DNAM-1 gene-deficient mouse
  • naive indicates the bile duct tuberculosis. It shows that it is the result of the mouse
  • the horizontal axis indicates the time (day) after the start of the experiment. As a result, it was revealed that the amount of alkaline phosphatase in the serum of the DNAM-1 gene-deficient mice was significantly smaller than that of the control wild type mice.
  • FIG. 18 (b) is a graph showing the results of quantifying total bilirubin in serum.
  • WT indicates the result of the wild type mouse
  • DNAM-1 KO indicates the result of the DNAM-1 gene-deficient mouse
  • naive indicates the bile duct tuberculosis. It shows that it is the result of the mouse
  • the horizontal axis indicates the time (day) after the start of the experiment. As a result, it was clarified that DNAM-1 gene-deficient mice have significantly less serum total bilirubin than wild-type mice.
  • FIGS. 19A and 19B are micrographs of liver tissue.
  • FIG. 19 (a) is a photograph of a control wild type mouse (WT)
  • FIG. 19 (b) is a photograph of a DNAM-1 gene-deficient mouse (DNAM-1 KO). The magnification is 20 times in all cases. As a result, it was revealed that liver fibrosis was significantly reduced in DNAM-1 gene-deficient mice compared to wild-type mice.
  • each group of mice was laparotomized, and the right renal ureter was tied to create a UUO model. On the other hand, the left kidney was not treated. Subsequently, on the seventh day from the start of the experiment, the mice of each group were perfused systemically and both kidneys were removed. Subsequently, the excised kidney was fixed in formalin and embedded in paraffin to prepare a tissue section. Subsequently, the tissue sections were stained with Masson trichrome and observed. In addition, paraformaldehyde-fixed kidneys were embedded with OCT compound to prepare tissue sections. Subsequently, tissue sections were immunostained, and the area of an ⁇ -smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) positive region, which is one of fibrosis indicators, was calculated.
  • ⁇ -SMA ⁇ -smooth muscle actin
  • FIG. 20 (a) is a photograph of the cut section of the kidney stained with Masson trichrome.
  • FIG.20 (b) is a graph which shows the result of having measured the area of the renal cortex based on Fig.20 (a). 20 (a) and 20 (b), “UUO” indicates the result of the right kidney with the ureters connected, “CON” indicates the result of the untreated left kidney, “WT” indicates the result of the wild-type mouse, and “DNAM-1 KO” indicates the result of the DNAM-1 gene-deficient mouse.
  • UUO indicates the result of the right kidney with the ureters connected
  • CON indicates the result of the untreated left kidney
  • WT indicates the result of the wild-type mouse
  • DNAM-1 KO indicates the result of the DNAM-1 gene-deficient mouse.
  • FIGS. 21A and 21B are photomicrographs showing the results of immunostaining of a kidney tissue section with an anti- ⁇ -SMA antibody.
  • FIG. 21 (a) shows a representative result of a tissue section of the right kidney in which a ureter was tied in a control wild type mouse
  • FIG. 21 (b) shows a ureter in a DNAM-1 gene-deficient mouse. Shown is a representative result of a tissue section of the right kidney that was tied.
  • FIG. 21 (c) is a graph showing the results of calculating the area of the ⁇ -SMA positive region in the kidney tissue of each group of mice.
  • FIG. 22 is a graph showing the results of measuring the body weights of control wild-type mice (WT) and DNAM-1 gene-deficient mice (KO).
  • WT wild-type mice
  • KO DNAM-1 gene-deficient mice
  • “*” indicates that there is a significant difference when the risk rate is less than 5%.
  • the horizontal axis indicates the time (day) after the start of the experiment. As a result, it was revealed that the weight loss due to inflammatory enteritis was significantly reduced in the DNAM-1 gene-deficient mice compared to the wild-type mice.
  • FIG. 23 (a) is a photograph of the large intestine of a DNAM-1 gene-deficient mouse excised on the ninth day from the start of the experiment.
  • FIG. 23B is a photograph of the large intestine of a control wild-type mouse excised on the ninth day from the start of the experiment.
  • FIG. 23C is a graph in which the results of FIGS. 23A and 23B are digitized.
  • WT indicates the result of the wild-type mouse
  • “DNAM-1 KO” indicates the result of the DNAM-1 gene-deficient mouse
  • “naive” Indicates that the results are for mice given water instead of 2% DSS aqueous solution.
  • “NS” indicates that there was no significant difference. As a result, it was revealed that shortening of the intestinal tract due to inflammatory enteritis was significantly reduced in the DNAM-1 gene-deficient mice compared to the wild-type mice.

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Abstract

ＤＮＡＸ　Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＤＮＡＭ－１）及びＣＤ１５５の結合を阻害する物質からなる、制御性Ｔ細胞の活性化剤。

Description

制御性Ｔ細胞の活性化剤及びその使用
　本発明は、制御性Ｔ細胞の活性化剤及びその使用に関する。より具体的には、制御性Ｔ細胞の活性化剤、制御性Ｔ細胞活性化用医薬組成物、抗ヒトＤＮＡＸ　Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＤＮＡＭ－１）モノクローナル抗体又はその断片、核酸、ベクター及び形質転換体に関する。本願は、２０１６年４月２０日に、日本に出願された特願２０１６－０８４１７０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　輸血又は幹細胞移植の後に、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）が発症する場合がある。移植片対宿主病は、移植細胞中に存在するドナー由来の活性化Ｔ細胞がレシピエントの細胞を傷害することにより生じる。また、ドナーの臓器をレシピエントに移植すると拒絶反応が起こる場合がある。例えば、心移植、血管移植、腎臓移植等において、移植された心臓、血管、腎臓は、一時的には生着するものの、次第に剥離等が認められる場合がある。このため、移植片対宿主病や臓器移植拒絶を抑制する技術が求められている。
　例えば、特許文献１には、マウスＤＮＡＭ－１タンパク質に対する中和抗体が、マウスにおける移植心臓、移植血管又は移植腎臓の生着を維持する薬剤として使用可能であることが記載されている。
　ＤＮＡＭ－１タンパク質は、ＣＤ２２６とも呼ばれる分子量６５ｋＤａの免疫グロブリンスーパーファミリーに属する接着分子である。ＤＮＡＭ－１タンパク質の発現は、ヒトやマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の様々な免疫細胞に認められる。ヒトＤＮＡＭ－１のＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＰ＿００１２９０５４７であり、マウスＤＮＡＭ－１のＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＰ＿００１０３４２３８である。発明者らは、以前に、ＤＮＡＭ－１タンパク質が、ポリオウイルスレセプターとして知られてきたＣＤ１５５に結合することを明らかにした。ＣＤ１５５は、イムノグロブリンスーパーファミリーに属するＩ型膜貫通糖タンパク質である。
特開２０１３－２４５１６２号公報
　このような背景のもと、本発明は、ヒトの免疫反応を抑制することができる技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する物質からなる、制御性Ｔ細胞の活性化剤。
［２］ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する前記物質が、ＤＮＡＭ－１に対する特異的結合物質、ＤＮＡＭ－１発現阻害剤、ＣＤ１５５に対する特異的結合物質又はＣＤ１５５発現阻害剤である、［１］に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
［３］移植片対宿主病、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、線維化疾患、炎症性腸炎若しくはアレルギーの予防又は治療用である、［１］又は［２］に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
［４］ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する前記物質が、ＤＮＡＭ－１対する特異的結合物質であり、前記ＤＮＡＭ－１はヒトＤＮＡＭ－１であり、前記特異的結合物質は抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子と反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して１００ｎｇ以下で前記ヒトＤＮＡＭ－１分子を飽和することができる、［１］～［３］のいずれかに記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
［５］ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する前記物質が、ＤＮＡＭ－１対する特異的結合物質であり、前記ＤＮＡＭ－１はヒトＤＮＡＭ－１であり、前記特異的結合物質は抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子を、ヒトＣＤ１５５とＩｇＧ型抗体定常領域との融合タンパク質１０００ｎｇで飽和させた後に反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して５００ｎｇ以下で、前記融合タンパク質と前記ヒトＤＮＡＭ－１分子との結合を完全に阻害することができる、［１］～［４］のいずれかに記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
［６］前記抗体はヒト型抗体である、［４］又は［５］に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
［７］前記抗体又はその断片は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するか、又は、ヒトＤＮＡＭ－１と結合させた場合に、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する抗体と競合する、［４］～［６］のいずれかに記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
［８］前記抗体又はその断片は、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、［４］～［７］のいずれかに記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
［９］［１］～［８］のいずれかに記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤と、薬学的に許容できる担体とを含む、制御性Ｔ細胞活性化用医薬組成物。
［１０］ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子と反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して１００ｎｇ以下で前記ヒトＤＮＡＭ－１分子を飽和することができる、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
［１１］ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子を、ヒトＣＤ１５５とＩｇＧ型抗体定常領域との融合タンパク質１０００ｎｇで飽和させた後に反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して５００ｎｇ以下で、前記融合タンパク質と前記ヒトＤＮＡＭ－１分子との結合を完全に阻害することができる、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
［１２］ヒト型抗体又はその断片である、［１０］又は［１１］に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
［１３］ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するか、又は、ヒトＤＮＡＭ－１と結合させた場合に、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する抗体と競合する、［１０］～［１２］のいずれかに記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
［１４］ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、［１０］～［１３］のいずれかに記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
［１５］ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、［１０］～［１４］のいずれかに記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
［１６］配列番号７のアミノ酸配列又は配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、［１０］～［１５］のいずれか一項に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
［１７］配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、［１６］に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
［１８］配列番号９のアミノ酸配列又は配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、［１０］～［１４］のいずれかに記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
［１９］配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、［１８］に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
［２０］［１０］～［１９］のいずれかに記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸。
［２１］［２０］に記載の核酸を含有するベクター。
［２２］［２１］に記載のベクターを含有する形質転換体。
（１）ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、抗ヒトＤＮＡＸ　Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＤＮＡＭ－１）モノクローナル抗体又は抗体フラグメント（抗体断片）。
（２）ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（１）に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（３）配列番号７のアミノ酸配列又は配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（１）又は（２）に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（４）配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、（１）～（３）のいずれかに記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又は抗体フラグメント。
（５）（１）～（４）のいずれかに記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸。
（６）（５）に記載の核酸を含有する組換えベクター。
（７）（６）に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
（８）（１）～（４）のいずれかに記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又は抗体フラグメントを有効成分として含有する免疫抑制剤。
（９）移植片対宿主病の予防又は治療剤である、（８）に記載の免疫抑制剤。
（１０）臓器移植拒絶の予防又は治療剤である、（８）に記載の免疫抑制剤。
　本発明によれば、ヒトの免疫反応を抑制することができる技術を提供することができる。
抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体Ｎｏ．１～６の重鎖のアミノ酸配列をアラインメントした結果を示す図である。 抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体Ｎｏ．１～６の軽鎖のアミノ酸配列をアラインメントした結果を示す図である。 （ａ）～（ｄ）は、実験例２の結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｌ）は、実験例３の結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｅ）は、実験例４において、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体Ｎｏ．１～６の反応性を検討した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｅ）は、実験例５において、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体Ｎｏ．１～６の反応性を検討した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｅ）は、実験例６において、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体Ｎｏ．１～６の反応性を検討した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｅ）は、実験例７において、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体Ｎｏ．１～６の反応性を検討した結果を示すグラフである。 実験例８における混合リンパ球反応アッセイの結果を示すグラフである。 実験例９の実験プロトコルを示す図である。 実験例９におけるマウスの生存率を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例９におけるマウスの肝機能を検討した結果を示すグラフである。 実験例１０の実験プロトコルを示す図である。 実験例１０におけるマウスの生存率を示すグラフである。 実験例１１において、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体を反応させたＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１２において、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を投与してから１４日後のマウスの脾臓中のＣＤ４＋Ｔ細胞における制御性Ｔ細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１２において、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を投与してから１４日後のマウスの末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞における制御性Ｔ細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１３において、脳脊髄炎の発症率を測定した結果を示すグラフである。また、（ｂ）は、実験例１３において、臨床スコアの平均値を算出した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１４において、血清中のアルカリフォスファターゼを定量した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例１４において、血清中の総ビリルビンを定量した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１４における対照マウスの肝臓組織の顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例１４におけるＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスの肝臓組織の顕微鏡写真である。 （ａ）は、実験例１５においてマッソントリクローム染色した腎臓の切断面の写真である。（ｂ）は、（ａ）に基づいて腎皮質の面積を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１５において、対照マウスの腎臓の組織切片を抗α－ＳＭＡ抗体で免疫染色した代表的な結果を示す顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例１５において、ＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスの腎臓の組織切片を抗α－ＳＭＡ抗体で免疫染色した代表的な結果を示す顕微鏡写真である。（ｃ）は、実験例１５において、各群のマウスの腎臓組織におけるα－ＳＭＡ陽性領域の面積を算出した結果を示すグラフである。 実験例１６において、対照マウス及びＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスの体重を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例１６において、実験開始から９日目に摘出した、ＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスの大腸の写真である。（ｂ）は、実験例１６において、実験開始から９日目に摘出した、対照マウスの大腸の写真である。（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の結果を数値化したグラフである。
［制御性Ｔ細胞の活性化剤］
　１実施形態において、本発明は、ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する物質からなる、制御性Ｔ細胞の活性化剤を提供する。
　実施例において後述するように、発明者らはＤＮＡＭ－１とＣＤ１５５との結合を阻害することにより、制御性Ｔ細胞を活性化することができることを明らかにした。したがって、ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する物質は、制御性Ｔ細胞の活性化の用途に使用することができる。
　ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する物質としては、例えば、ＤＮＡＭ－１に対する特異的結合物質、ＤＮＡＭ－１発現阻害剤、ＣＤ１５５に対する特異的結合物質、ＣＤ１５５発現阻害剤等が挙げられる。
　ＤＮＡＭ－１に対する特異的結合物質、ＣＤ１５５に対する特異的結合物質としては、ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害できる物質であれば特に限定されず、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、マウス等の動物を免疫することによって作製したものであってもよく、ファージライブラリ等の抗体ライブラリのスクリーニングにより作製したものであってもよい。また、抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。また、アプタマーとしては、例えば、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
　また、ＤＮＡＭ－１に対する特異的結合物質は、可溶化したＣＤ１５５であってもよい。可溶化したＣＤ１５５としては、例えば、ＣＤ１５５と抗体定常領域との融合タンパク質等が挙げられる。また、ＣＤ１５５に対する特異的結合物質は、可溶化したＤＮＡＭ－１であってもよい。可溶化したＤＮＡＭ－１としては、例えば、ＤＮＡＭ－１と抗体定常領域との融合タンパク質等が挙げられる。
　ＤＮＡＭ－１発現阻害剤、ＣＤ１５５発現阻害剤としては、ＤＮＡＭ－１又はＣＤ１５５の発現を低減させ、結果としてＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害できる物質であれば特に限定されず、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物等が挙げられる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
　制御性Ｔ細胞とは、Ｔｒｅｇ、調節性Ｔ細胞とも呼ばれるＴ細胞の一種である。制御性Ｔ細胞は免疫応答の抑制的制御を行うことが明らかにされつつある。制御性Ｔ細胞としては、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞等が挙げられる。
　本明細書において、制御性Ｔ細胞の活性化とは、制御性Ｔ細胞の細胞数の増加、制御性Ｔ細胞が発現するＴＧＦ－β、ＩＬ－１０等の抑制性サイトカインの発現量の増加、Ｔ細胞による免疫応答の抑制、免疫応答全般の抑制等を意味する。
　本実施形態の制御性Ｔ細胞の活性化剤は、制御性Ｔ細胞の活性化により症状を軽減することができる疾患の予防又は治療に用いることができる。このような疾患としては、例えば、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、線維化疾患、炎症性腸炎、アレルギー等が挙げられる。
　ここで、自己免疫疾患としては、例えばリウマチ、Ｉ型糖尿病、自己免疫性脳脊髄炎等が挙げられる。また、繊維化疾患とは、肺、心臓、肝臓、腎臓等の様々な臓器において、組織がＩ型コラーゲン等に置き換わる疾患であり、例えば肝硬変、糖尿病性腎症、肺線維症等が挙げられる。アレルギーとしては、例えばアレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎等が挙げられる。
　本実施形態の制御性Ｔ細胞の活性化剤は、例えば、ＤＮＡＭ－１対する特異的結合物質であってもよく、特異的結合物質は抗体又はその断片であってもよい。ここで、ＤＮＡＭ－１は、制御性Ｔ細胞を活性化する対象の種のＤＮＡＭ－１であればよく、例えばヒトＤＮＡＭ－１であってもよい。すなわち、本実施形態の制御性Ｔ細胞の活性化剤は、抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体又はその断片であってもよい。
　ここで、抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体又はその断片としては、ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子と反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して１００ｎｇ以下、好ましくは８０ｎｇ以下、より好ましくは５０ｎｇ以下、更に好ましくは４０ｎｇ以下、特に好ましくは３０ｎｇ以下で、上記のリンパ球の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子を飽和することができる反応性を有するものが好ましい。実施例において後述するように、このような反応性を有する抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体は、制御性Ｔ細胞の活性化能が高い。
　ここで、例えば、対象の抗体が例えば抗体断片等であった場合には、ＩｇＧ型抗体全長の質量に換算して反応性を計算すればよい。この場合、例えば抗体断片とＩｇＧ型抗体全長の分子量に基づいて質量を換算すればよい。
　また、本実施形態の制御性Ｔ細胞の活性化剤として好適な抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子を、ヒトＣＤ１５５とＩｇＧ型抗体定常領域との融合タンパク質１０００ｎｇで飽和させた後に、上記のリンパ球と反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して５００ｎｇ以下、好ましくは４００ｎｇ以下、より好ましくは３００ｎｇ以下、更に好ましくは２００ｎｇ以下、特に好ましくは１００ｎｇ以下で、上記の融合タンパク質と上記のリンパ球の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子との結合を完全に阻害することができる反応性を有するものであってもよい。
　すなわち、このような反応性を有する抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体は、ＤＮＡＭ－１とＣＤ１５５とが予め結合していた場合においても、この結合を解除することができる。実施例において後述するように、このような反応性を有する抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体は、制御性Ｔ細胞の活性化能が高い。
　ここで、完全に阻害するとは、実質的に完全に阻害できることを意味する。例えば、ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子を、ヒトＣＤ１５５とＩｇＧ型抗体定常領域との融合タンパク質１０００ｎｇで飽和させた後に、上記のリンパ球と反応させた場合に、上記のリンパ球の表面に結合していた融合タンパク質のうち、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上を解離させ、リンパ球の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子と結合することができることを意味する。
　また、本実施形態の制御性Ｔ細胞の活性化剤は、抗ヒトＣＤ１５５抗体又はその断片であってもよい。
　本実施形態の制御性Ｔ細胞の活性化剤において、抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体若しくはその断片、又は抗ヒトＣＤ１５５抗体若しくはその断片は、ヒト型抗体若しくはその断片であることが好ましい。
　制御性Ｔ細胞の活性化剤がヒト型抗体又はその断片であれば、ヒトに投与しても免疫原性が低いため、アナフィラキシーショック等の副作用を抑制することができる。ヒト型抗体としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等が挙げられる。
　本明細書において、キメラ抗体とは、可変領域が非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域の少なくとも一部がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、ヒト化抗体とは、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）のみが非ヒト動物由来の抗体であり、定常領域及びフレームワーク領域がヒト由来の抗体である抗体を意味する。また、完全ヒト抗体とは、相補性決定領域を含めて全体がヒト由来の抗体を意味する。
　本実施形態の制御性Ｔ細胞の活性化剤において、抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体又はその断片は、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する抗体又はその断片であってもよい。
　ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ１又はＣＤＲ２における数個とは、４個、３個又は２個を意味する。また、重鎖可変領域のＣＤＲ３における数個とは２個を意味する。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ１又はＣＤＲ３における数個とは、４個、３個又は２個を意味する。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ２における数個とは２個を意味する。
　ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及びＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体としては、例えば、実施例において後述するモノクローナル抗体Ｎｏ．１、モノクローナル抗体Ｎｏ．１をヒト型化した抗体等が挙げられる。
　また、抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１に限定されず、モノクローナル抗体Ｎｏ．１と同等以上の反応性を有するものであれば本実施形態の制御性Ｔ細胞の活性化剤として使用することができる。したがって、抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体は、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体であってもよい。このような抗体としては、例えば、実施例において後述するモノクローナル抗体Ｎｏ．２～６、モノクローナル抗体Ｎｏ．２～６をヒト型化した抗体等が挙げられる。
　あるいは、抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１と結合させた場合に、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する抗体と競合する抗体又はその断片であってもよい。すなわち、抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体は、ヒトＤＮＡＭ－１との結合に関して、実施例において後述するモノクローナル抗体Ｎｏ．１と競合する抗体であってもよい。モノクローナル抗体Ｎｏ．１と競合する抗体は、ヒトＤＮＡＭ－１との結合に関して、モノクローナル抗体Ｎｏ．１と同等以上の反応性を有する。
　ここで、対象の抗体が競合するとは、例えば、ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子に、実施例において後述するモノクローナル抗体Ｎｏ．１を反応させた後に、対象の抗体を上記のリンパ球と反応させた場合に、モノクローナル抗体Ｎｏ．１とヒトＤＮＡＭ－１分子との結合を少なくとも１部解離させて、ヒトＤＮＡＭ－１分子と結合することができることを意味する。
　ここで、少なくとも１部とは、上記のリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子全体の１０％以上であってもよく、３０％以上であってもよく、５０％以上であってもよく、７０％以上であってもよく、９０％以上であってもよい。
［制御性Ｔ細胞活性化用医薬組成物］
　１実施形態において、本発明は、上述した制御性Ｔ細胞の活性化剤と、薬学的に許容できる担体とを含む、制御性Ｔ細胞活性化用医薬組成物を提供する。
　薬学的に許容される担体としては、一般的に製剤に用いられるものを使用することができ、例えば、賦形剤、安定剤、注射剤用溶剤等が挙げられる。注射剤用溶剤としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物は、上述した制御性Ｔ細胞の活性化剤、薬学的に許容できる担体以外に添加物を含んでいてもよい。添加物としては、例えば、ｐＨ調節剤、粘度改良剤、着色剤、移植片対宿主病や臓器移植拒絶の治療において従来使用されてきた、ステロイド類、免疫抑制剤等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物の剤型は限定されず、例えば凍結乾燥剤、粉末製剤、ｐＨが調整された緩衝液による溶液製剤、注射用マイクロカプセル剤等が挙げられる。
　本実施形態の医薬組成物は、例えば、注射剤又は点滴注入剤として、静脈内投与等により患者に投与される。その投与量、投与経路、処方は、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。
　本実施形態の医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、有効成分（ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する物質）が例えば１μｇ～１００ｍｇ、例えば５０μｇ～５０ｍｇ含まれる量を、１日あたり１回～数回投与すればよい。
［抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片］
　１実施形態において、本発明は、ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子と反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して１００ｎｇ以下、好ましくは８０ｎｇ以下、より好ましくは５０ｎｇ以下、更に好ましくは４０ｎｇ以下、特に好ましくは３０ｎｇ以下で、上記のリンパ球の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子を飽和することができる、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片を提供する。
　実施例において後述するように、このような反応性を有する抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体は、制御性Ｔ細胞の活性化や、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、線維化疾患、炎症性腸炎等の症状の軽減等に有用である。
　ここで、例えば、対象の抗体が例えば抗体断片等であった場合には、ＩｇＧ型抗体全長の質量に換算して反応性を計算すればよい。この場合、例えば抗体断片とＩｇＧ型抗体全長の分子量に基づいて質量を換算すればよい。また、本実施形態の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片は、任意の既知の抗体及びその断片を除いたものであってもよい。
　本実施形態の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子を、ヒトＣＤ１５５とＩｇＧ型抗体定常領域との融合タンパク質１０００ｎｇで飽和させた後に、上記のリンパ球と反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して５００ｎｇ以下、好ましくは４００ｎｇ以下、より好ましくは３００ｎｇ以下、更に好ましくは２００ｎｇ以下、特に好ましくは１００ｎｇ以下で、上記の融合タンパク質と上記のリンパ球の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子との結合を完全に阻害することができる反応性を有するものであってもよい。
　すなわち、このような反応性を有する抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体は、ＤＮＡＭ－１とＣＤ１５５とが予め結合していた場合においても、この結合を解除することができる。ここで、「完全に阻害する」については上述したものと同様である。
　本実施形態の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片は、ヒト型抗体又はその断片であってもよい。ヒト型抗体については上述したものと同様である。
　本実施形態の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片は、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。
　ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ１又はＣＤＲ２における数個とは、４個、３個又は２個を意味する。また、重鎖可変領域のＣＤＲ３における数個とは２個を意味する。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ１又はＣＤＲ３における数個とは、４個、３個又は２個を意味する。また、軽鎖可変領域のＣＤＲ２における数個とは２個を意味する。
　本明細書において、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ　Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。ｓｃＦｖのリンカーとしては、例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２１）等のペプチドが挙げられる。
　実施例において後述するように、本実施形態の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１タンパク質に良好に結合し、インビボ及びインビトロにおいてヒトの免疫反応を抑制することができる。このため、免疫抑制剤として利用することができる。
　あるいは、本実施形態の抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１と結合させた場合に、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する抗体と競合する抗体又はその断片であってもよい。すなわち、抗ヒトＤＮＡＭ－１抗体は、ヒトＤＮＡＭ－１との結合に関して、実施例において後述するモノクローナル抗体Ｎｏ．１と競合する抗体であってもよい。モノクローナル抗体Ｎｏ．１と競合する抗体は、ヒトＤＮＡＭ－１との結合に関して、モノクローナル抗体Ｎｏ．１と同等以上の反応性を有する。ここで、抗体の競合については上述したものと同様である。
　抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片は、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。このような抗体としては、例えば、実施例において後述するモノクローナル抗体Ｎｏ．１、モノクローナル抗体Ｎｏ．１をヒト型化した抗体等が挙げられる。
　また、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片は、配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。このような抗体としては、例えば、実施例において後述するモノクローナル抗体Ｎｏ．１、モノクローナル抗体Ｎｏ．１をヒト型化した抗体等が挙げられる。
　あるいは、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片は、配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。このような抗体としては、例えば、実施例において後述するモノクローナル抗体Ｎｏ．２、モノクローナル抗体Ｎｏ．２をヒト型化した抗体等が挙げられる。
　また、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１に対する反応性を有している限り、配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。
　あるいは、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１に対する反応性を有している限り、配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するものであってもよい。
　ここで、重鎖可変領域又は軽可変領域における数個とは、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個を意味する。このような抗体としては、例えば、実施例において後述するモノクローナル抗体Ｎｏ．３～６、モノクローナル抗体Ｎｏ．３～６をヒト型化した抗体等が挙げられる。
［抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸］
　１実施形態において、本発明は、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸を提供する。
　このような核酸としては、例えば、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の重鎖可変領域遺伝子、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域遺伝子、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の重鎖可変領域及び定常領域の一部をコードする遺伝子、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び定常領域の一部をコードする遺伝子、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の重鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の軽鎖全長をコードする遺伝子、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを適切なリンカーで連結したｓｃＦｖをコードする遺伝子等が挙げられる。
　上記の重鎖可変領域遺伝子は、配列番号１９に記載の塩基配列からなる遺伝子であってもよい。また、上記の軽鎖可変領域遺伝子は、配列番号２０に記載の塩基配列からなる遺伝子であってもよい。
　また、上記の重鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非マウス抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。また、上記の軽鎖可変領域遺伝子は、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が、非マウス抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子であってもよい。ここで、非マウス抗体としては、例えばヒト抗体が挙げられる。
　本実施形態の核酸は、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の重鎖可変領域遺伝子又はこれに由来する遺伝子と、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の軽鎖可変領域遺伝子又はこれに由来する遺伝子との組み合わせであることが好ましい。
　ここで、重鎖可変領域遺伝子に由来する遺伝子としては、例えば、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非マウス抗体由来である重鎖可変領域をコードする遺伝子が挙げられる。また、同様に、軽鎖可変領域遺伝子に由来する遺伝子としては、例えば、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６に記載のアミノ酸配列からなり、ＣＤＲ以外のフレームワーク領域が非マウス抗体由来である軽鎖可変領域をコードする遺伝子が挙げられる。
［ベクター］
　１実施形態において、本発明は、上述した核酸を含有する組換えベクターを提供する。本実施形態の組換えベクターは、発現ベクターであってもよい。本実施形態のベクターが発現ベクターである場合、宿主に導入して発現させることにより、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片を製造することができる。
　本実施形態の組換えベクターにおいて、上述した核酸の５’末端又は３’末端に、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ等のタグ配列をコードするＤＮＡが付加されていてもよい。上記の発現ベクターとしては、宿主細胞に抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片を発現させる細胞系ベクターと、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系において抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片を発現させる無細胞系ベクターが挙げられる。
　細胞系ベクターとしては、宿主細胞に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他にも、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターが挙げられる。また、宿主が大腸菌以外のベクターとしては、例えば、酵母発現用のｐＡＵＲ系プラスミド、昆虫細胞発現用のｐＩＥｘ系プラスミド、動物細胞発現用のｐＢＡｐｏ－ＣＭＶ系プラスミド等が挙げられる。
　無細胞系ベクターとしては、細胞系ベクターにおいて挙げられたＴ７プロモーターを有する発現ベクターやＴ３プロモーターを有する発現ベクター；ＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
　無細胞系ベクターを用いたタンパク質合成においては、先ず、転写系を用いて、ＳｅｓＡ遺伝子を転写して、ｍＲＮＡを合成する。転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ等が挙げられる。
　続いて、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いて、ｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系としては、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。
　細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質から抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片を精製して用いることができる。精製方法としては、プロテインＡ、プロテインＧ等を用いた方法等が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて精製することにより、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片の純度を高めることができる。
［形質転換体］
　１実施形態において、本発明は、上述した組換えベクターを含有する形質転換体を提供する。本実施形態の形質転換体又はその培地等より、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片を製造することができる。
　本実施形態の形質転換体は、上述した組換えベクターを宿主に導入することにより得ることができる。形質転換体としては、例えば、上述した組換えベクターが導入された、大腸菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等の培養細胞；上述したベクターが導入された、カイコ等の昆虫生体；上述したベクターが導入された、タバコ等の植物体等が挙げられる。
　組換えベクターの宿主への導入（形質転換）は従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にも、ファージベクター、ウイルスベクター等を宿主に感染させて形質転換する方法を利用してもよい。
［免疫抑制剤］
　１実施形態において、本発明は、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片を有効成分として含有する免疫抑制剤を提供する。
　実施例において後述するように、本実施形態の免疫抑制剤は、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）アッセイにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制することができる。
　また、実施例において後述するように、本実施形態の免疫抑制剤は、移植片対宿主病マウスモデルにおいて、移植片対宿主病の予防及び治療のいずれにも効果を示すことが確認されている。
　したがって、本実施形態の免疫抑制剤は、移植片対宿主病の予防又は治療剤であるということができる。また、本実施形態の免疫抑制剤は、臓器移植拒絶の予防又は治療剤であるということもできる。
　本実施形態の免疫抑制剤は、薬学的に許容される担体、その他の添加物を含有する医薬組成物であってもよい。薬学的に許容される担体としては、賦形剤、安定剤、注射剤用溶剤等が挙げられる。注射剤用溶剤としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液が挙げられる。その他の添加物としては、例えば、ｐＨ調節剤、粘度改良剤、着色剤、移植片対宿主病や臓器移植拒絶の治療において従来使用されてきた、ステロイド類、免疫抑制剤等が挙げられる。
　本実施形態の免疫抑制剤又は上記の医薬組成物の剤型は限定されず、例えば凍結乾燥剤、粉末製剤、ｐＨが調整された緩衝液による溶液製剤、注射用マイクロカプセル剤等が挙げられる。
　本実施形態の免疫抑制剤又は上記の医薬組成物は、注射剤又は点滴注入剤として、静脈内投与等により患者に投与される。その投与量、投与経路、処方は、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。
　本実施形態の免疫抑制剤又は上記の医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、処置を必要とするヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、有効成分（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片）が例えば１μｇ～１００ｍｇ、例えば５０μｇ～５０ｍｇ含まれる量を、１日あたり１回～数回投与すればよい。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を備える、制御性Ｔ細胞の活性化方法を提供する。ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、制御性Ｔ細胞の活性化のための、ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質を提供する。ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、制御性Ｔ細胞の活性化剤を製造するための、ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質の使用を提供する。ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を備える、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、線維化疾患、炎症性腸炎若しくはアレルギーの予防又は治療方法を提供する。ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、線維化疾患、炎症性腸炎若しくはアレルギーの予防又は治療のための、ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質を提供する。ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、線維化疾患、炎症性腸炎若しくはアレルギーの予防剤又は治療剤を製造するための、ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質の使用を提供する。ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合阻害物質としては、上述したものが挙げられる。
　１実施形態において、本発明は、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を備える、移植片対宿主病又は臓器移植拒絶の治療又は予防方法を提供する。
　１実施形態において、本発明は、移植片対宿主病又は臓器移植拒絶の治療又は予防のための、上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片を提供する。
　１実施形態において、本発明は、移植片対宿主病又は臓器移植拒絶の治療剤又は予防剤を製造するための上述した抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片の使用を提供する。
　次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の作製）
　マウスリンパ球細胞であるＢＷ５１４７細胞株にヒトＤＭＡＭ－１遺伝子を導入し、ヒトＤＭＡＭ－１タンパク質を発現させた。この細胞を抗原としてマウスを免疫し、常法によりハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマ株の中からヒトＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性を指標として抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体Ｎｏ．１～６を産生するクローンをそれぞれ取得した。
　続いて、常法により樹立したハイブリドーマ株から抗体重鎖遺伝子及び抗体軽鎖遺伝子をクローニングし、抗体重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を同定した。図１は、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体Ｎｏ．１～６の重鎖のアミノ酸配列をアラインメントした結果を示す図である。図１中、下線はＣＤＲ１～３を示す。図２は、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体Ｎｏ．１～６の軽鎖のアミノ酸配列をアラインメントした結果を示す図である。図２中、下線はＣＤＲ１～３を示す。また、下記表１に、各モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列と配列表の配列番号との対応を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実験例２］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の反応性の検討１）
　実験例１で作製したモノクローナル抗体Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応性を検討した。具体的には、マウスリンパ球細胞であるＢＷ５１４７細胞株（以下、「ＢＷ」という場合がある。）、及びヒトＤＭＡＭ－１タンパク質を発現させたＢＷ５１４７細胞株（以下、「ＤＮＡＭ－１／ＢＷ」という場合がある。）に、モノクローナル抗体Ｎｏ．１及びＮｏ．２を反応させ、フローサイトメトリー解析を行った。対照にはコントロールＩｇＧ１抗体を使用した。１×１０５個の各細胞に対し、３０ｎｇの各抗体を反応させた。抗体は氷上で３０分間反応させた。
　図３（ａ）は、ＢＷ細胞にモノクローナル抗体Ｎｏ．１を反応させた結果を示すグラフである。図３（ｂ）は、ＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞にモノクローナル抗体Ｎｏ．１を反応させた結果を示すグラフである。図３（ｃ）は、ＢＷ細胞にモノクローナル抗体Ｎｏ．２を反応させた結果を示すグラフである。図３（ｄ）は、ＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞にモノクローナル抗体Ｎｏ．２を反応させた結果を示すグラフである。
　その結果、モノクローナル抗体Ｎｏ．１及びＮｏ．２のいずれもＢＷ細胞に発現させたＤＮＡＭ－１タンパク質を特異的に認識することが確認された。
［実験例３］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の反応性の検討２）
　実験例１で作製したモノクローナル抗体Ｎｏ．１及びＮｏ．２のヒト末梢血リンパ球表面に存在するＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性を検討した。
　ヒト末梢血リンパ球中に存在するＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ３－ＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞（ＮＫ細胞）、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞（ＮＫＴ細胞）、ＣＤ１４＋細胞（単球）に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応性を検討した。対照にはコントロールＩｇＧ１抗体を使用した。１×１０５個の末梢血リンパ球に対し、モノクローナル抗体Ｎｏ．１及びＮｏ．２をそれぞれ１００ｎｇ反応させた。抗体は氷上で３０分間反応させた。
　図４（ａ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．１の反応性を示す結果である。図４（ｂ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．１の反応性を示す結果である。図４（ｃ）は、Ｂ細胞に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．１の反応性を示す結果である。図４（ｄ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．２の反応性を示す結果である。図４（ｅ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．２の反応性を示す結果である。図４（ｆ）は、Ｂ細胞に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．２の反応性を示す結果である。図４（ｇ）は、ＮＫ細胞に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．１の反応性を示す結果である。図４（ｈ）は、ＮＫＴ細胞に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．１の反応性を示す結果である。図４（ｉ）は、単球に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．１の反応性を示す結果である。図４（ｊ）は、ＮＫ細胞に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．２の反応性を示す結果である。図４（ｋ）は、ＮＫＴ細胞に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．２の反応性を示す結果である。図４（ｌ）は、単球に対するモノクローナル抗体Ｎｏ．２の反応性を示す結果である。
　その結果、モノクローナル抗体Ｎｏ．１及びＮｏ．２のいずれも、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球の細胞表面に存在するＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性を有することが確認された。
［実験例４］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の反応性の検討３）
　実験例１で作製したモノクローナル抗体Ｎｏ．１～Ｎｏ．６を用いた競合アッセイを行った。より具体的には、まず、上述したＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞１×１０５個に対し、１００ｎｇのモノクローナル抗体Ｎｏ．２を反応させた（前処理）。続いて、段階希釈したモノクローナル抗体Ｎｏ．１、３～６をそれぞれ反応させた。抗体は氷上で３０分間反応させた。前処理なしのＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞に対する各抗体の反応性も検討した。
　図５（ａ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１の結果を示すグラフである。図５（ｂ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．３の結果を示すグラフである。図５（ｃ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．４の結果を示すグラフである。図５（ｄ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．５の結果を示すグラフである。図５（ｅ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．６の結果を示すグラフである。
　図５（ａ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．１は、予めモノクローナル抗体Ｎｏ．２を反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞とも良好な反応性を示すことが明らかとなった。この結果は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１が、モノクローナル抗体Ｎｏ．２よりもＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性が高いことを示す。
　また、図５（ｂ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．３は、予めモノクローナル抗体Ｎｏ．２を反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞にはあまり反応しないことが明らかとなった。この結果は、モノクローナル抗体Ｎｏ．２が、モノクローナル抗体Ｎｏ．３よりもＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性が高いことを示す。
　また、図５（ｃ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．４は、予めモノクローナル抗体Ｎｏ．２を反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞にはあまり反応しないことが明らかとなった。この結果は、モノクローナル抗体Ｎｏ．２が、モノクローナル抗体Ｎｏ．４よりもＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性が高いことを示す。
　また、図５（ｄ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．５は、予めモノクローナル抗体Ｎｏ．２を反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞に対する反応性を有することが示された。後述する実験例５の結果と総合すると、モノクローナル抗体Ｎｏ．５とモノクローナル抗体Ｎｏ．２とはエピトープが競合していない可能性が考えられた。
　また、図５（ｅ）の結果も図５（ｄ）の結果と同様であり、後述する実験例５の結果と総合すると、モノクローナル抗体Ｎｏ．６とモノクローナル抗体Ｎｏ．２とはエピトープが競合していない可能性が考えられた。
［実験例５］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の反応性の検討４）
　ＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞に予め反応させる抗体を入れ替えて、実験例４と同様の実験を行った。より具体的には、まず、上述したＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞１×１０５個に対し、飽和量のモノクローナル抗体Ｎｏ．１、３～６をそれぞれ反応させた（前処理）。具体的には、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を３０ｎｇ、Ｎｏ．３を３００ｎｇ、Ｎｏ．４を３００ｎｇ、Ｎｏ．５を５００ｎｇ、Ｎｏ．６を１０００ｎｇ使用した。
　なお、上述したＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞１×１０５個の細胞表面に発現したヒトＤＮＡＭ－１抗体を飽和することができる抗体の最低量は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１では３０ｎｇであり、モノクローナル抗体Ｎｏ．２では５０ｎｇであり、モノクローナル抗体Ｎｏ．３では１００ｎｇであり、モノクローナル抗体Ｎｏ．４では１００ｎｇであり、モノクローナル抗体Ｎｏ．５では３００ｎｇであり、モノクローナル抗体Ｎｏ．６では３００ｎｇであった。続いて、段階希釈したモノクローナル抗体Ｎｏ．２をそれぞれ反応させた。抗体は氷上で３０分間反応させた。前処理なしのＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞に対する各抗体の反応性も検討した。
　図６（ａ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１の結果を示すグラフである。図６（ｂ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．３の結果を示すグラフである。図６（ｃ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．４の結果を示すグラフである。図６（ｄ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．５の結果を示すグラフである。図６（ｅ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．６の結果を示すグラフである。
　図６（ａ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．２は、予めモノクローナル抗体Ｎｏ．１を反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞にはあまり反応しないことが明らかとなった。この結果は、上述した実験例４の結果と総合すると、モノクローナル抗体Ｎｏ．１が、モノクローナル抗体Ｎｏ．２よりもＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性が高いことを更に支持するものである。
　また、図６（ｂ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．２は、予めモノクローナル抗体Ｎｏ．３を反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞とも比較的良好に反応することが明らかとなった。この結果は、上述した実験例４の結果と総合すると、モノクローナル抗体Ｎｏ．２が、モノクローナル抗体Ｎｏ．３よりもＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性が高いことを更に支持するものである。
　また、図６（ｃ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．２は、予めモノクローナル抗体Ｎｏ．４を反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞とも比較的良好に反応することが明らかとなった。この結果は、上述した実験例４の結果と総合すると、モノクローナル抗体Ｎｏ．２が、モノクローナル抗体Ｎｏ．４よりもＤＮＡＭ－１タンパク質に対する反応性が高いことを更に支持するものである。
　また、図６（ｄ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．２は、予めモノクローナル抗体Ｎｏ．５を反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞に対する反応性を有することが示された。この結果と上述した実験例４の結果を総合すると、モノクローナル抗体Ｎｏ．２とモノクローナル抗体Ｎｏ．５とはエピトープが競合していない可能性が考えられた。
　また、図６（ｅ）の結果も図６（ｄ）の結果と同様であり、上述した実験例４の結果と総合すると、モノクローナル抗体Ｎｏ．２とモノクローナル抗体Ｎｏ．６とはエピトープが競合していない可能性が考えられた。
［実験例６］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の反応性の検討５）
　ＤＮＡＭ－１タンパク質はＣＤ１５５タンパク質と相互作用することが知られている。そこで、実験例１で作製したモノクローナル抗体Ｎｏ．１～Ｎｏ．６が、ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を阻害することができるか否かを検討した。
　まず、可溶化ヒトＣＤ１５５タンパク質を準備した。具体的には、ヒトＣＤ１５５タンパク質とヒトＩｇＧ抗体定常領域との融合タンパク質（以下、「ｈＣＤ１５５－Ｆｃ」という場合がある。）を定法により作製した。なお、ヒトＣＤ１５５タンパク質のＲｅｆＳｅｑ　ＩＤはＮＰ＿００１１２９２４０である。
　続いて、上述したＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞１×１０５個にｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の飽和量（１０００ｎｇ）を予め反応させた。続いて、上記のＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞に、段階希釈したモノクローナル抗体Ｎｏ．１～Ｎｏ．６をそれぞれ反応させた。反応は氷上で３０分間行った。
　図７（ａ）～（ｅ）は、それぞれモノクローナル抗体Ｎｏ．１、３～６の結果を示すグラフである。比較のために、図７（ａ）～（ｅ）のいずれにもモノクローナル抗体Ｎｏ．２の結果を示す。
　図７（ａ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．１は、ｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質を予め反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞に良好に反応することができ、その反応性は、モノクローナル抗体Ｎｏ．２よりも高いことが明らかとなった。
　また、図７（ｂ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．３は、ｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質を予め反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞に良好に反応することができ、その反応性は、モノクローナル抗体Ｎｏ．２と同程度であることが明らかとなった。
　また、図７（ｃ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．４は、ｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質を予め反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞に良好に反応することができ、その反応性は、モノクローナル抗体Ｎｏ．２と同程度であることが明らかとなった。
　また、図７（ｄ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．５は、ｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質を予め反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞と反応するものの、その反応性は、モノクローナル抗体Ｎｏ．２よりも低いことが明らかとなった。
　また、図７（ｅ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．６は、ｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質を予め反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞と反応するものの、その反応性は、モノクローナル抗体Ｎｏ．２よりも低いことが明らかとなった。
［実験例７］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の反応性の検討６）
　実験例６において、ｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質を予め反応させたＤＮＡＭ－１／ＢＷ細胞に、段階希釈したモノクローナル抗体Ｎｏ．１～Ｎｏ．６をそれぞれ反応させた後、ＤＮＡＭ－１／ＢＷ細表面のＤＮＡＭ－１タンパク質に結合したｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質を検出した。ｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の検出は、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて行った。反応は氷上で３０分間行った。
　図８（ａ）～（ｅ）は、それぞれモノクローナル抗体Ｎｏ．１、３～６の結果を示すグラフである。比較のために、図８（ａ）～（ｅ）のいずれにもモノクローナル抗体Ｎｏ．２の結果を示す。
　図８（ａ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を反応させた後に残存するｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の量は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１の濃度依存的に減少することが明らかとなった。
　また、反応させたモノクローナル抗体の濃度が高い領域では、ｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質が全くなくなることが明らかとなった。この結果は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１及びＮｏ．２のいずれも、ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を完全に阻害することができることを示す。また、ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を完全に阻害するために必要な抗体量は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１の方がモノクローナル抗体Ｎｏ．２よりも少なかった。より具体的には、ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を完全に阻害するために必要な抗体量は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１では１００ｎｇであり、モノクローナル抗体Ｎｏ．２では３００ｎｇであった。
　図８（ｂ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．３を反応させた後に残存するｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の量は、モノクローナル抗体Ｎｏ．３の濃度依存的に減少することが明らかとなった。
　また、反応させたモノクローナル抗体の濃度が低い領域では、モノクローナル抗体Ｎｏ．３を反応させた後に残存するｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の量は、モノクローナル抗体Ｎｏ．２を反応させた後に残存するｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の量よりも少なかった。この結果は、反応させたモノクローナル抗体の濃度が低い領域では、モノクローナル抗体Ｎｏ．３が、モノクローナル抗体Ｎｏ．２よりも、ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を阻害する活性が高いことを示す。また、反応させたモノクローナル抗体の濃度が高い領域では、モノクローナル抗体Ｎｏ．２と、モノクローナル抗体Ｎｏ．３との反応性の差が小さかった。ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を完全に阻害するために必要なモノクローナル抗体Ｎｏ．３の量は、３００ｎｇであった。
　図８（ｃ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．４を反応させた後に残存するｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の量は、モノクローナル抗体Ｎｏ．４の濃度依存的に減少することが明らかとなった。
　また、モノクローナル抗体Ｎｏ．４を反応させた後に残存するｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の量は、モノクローナル抗体Ｎｏ．２を反応させた後に残存するｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の量よりも多かった。この結果は、モノクローナル抗体Ｎｏ．２が、モノクローナル抗体Ｎｏ．４よりも、ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を阻害する活性が高いことを示す。ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を完全に阻害するために必要なモノクローナル抗体Ｎｏ．４の量は、１０００ｎｇであった。
　図８（ｄ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．５を反応させても、ｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の量はあまり減少しないことが明らかとなった。この結果は、モノクローナル抗体Ｎｏ．５は、ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を阻害する活性が低いことを示す。モノクローナル抗体Ｎｏ．５を３０００ｎｇ使用しても、ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を完全に阻害することはできなかった。
　また、図８（ｅ）の結果から、モノクローナル抗体Ｎｏ．６を反応させても、ｈＣＤ１５５－Ｆｃタンパク質の量はあまり減少しないことが明らかとなった。この結果は、モノクローナル抗体Ｎｏ．６は、ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を阻害する活性が低いことを示す。モノクローナル抗体Ｎｏ．６を３０００ｎｇ使用しても、ＤＮＡＭ－１タンパク質とＣＤ１５５タンパク質との相互作用を完全に阻害することはできなかった。
［実験例８］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の機能解析１）
　実験例１で作製したモノクローナル抗体Ｎｏ．１又はＮｏ．２の存在下で混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）アッセイを行い、Ｔ細胞の増殖に対するモノクローナル抗体の影響を検討した。
　ＭＬＲアッセイとは、同種異系刺激細胞とＴ細胞を混合した場合に観察されるＴ細胞の増殖を測定するものである。具体的には、まず、ヒト末梢血リンパ球からＣＤ１４＋細胞（５×１０５個）を分取し、インターロイキン（ＩＬ）－４（４０ｎｇ／ウェル）及びＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ウェル）の存在下で１週間培養し、樹状細胞を誘導した。ＣＤ１４＋細胞の培養は２４ウェルプレートで行った。一方で、別のドナー由来のヒト末梢血リンパ球からＣＤ８＋Ｔ細胞を分取した。
　続いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、飽和量以上（１μｇ／ｍＬ）の、Ｆ（ａｂ’）２型モノクローナル抗体Ｎｏ．１、Ｆ（ａｂ’）２型モノクローナル抗体Ｎｏ．２、又はＦ（ａｂ’）２型コントロールＩｇＧ（対照）と反応させた後、上記の樹状細胞と共培養した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は５×１０４個であり、樹状細胞は５×１０３個であった。
　共培養の開始から４８時間後に上記の抗体を１μｇ／ｍＬずつ再び添加した。また、共培養の開始から７２時間後にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添加した。また、共培養の開始から９６時間後に抗ＢｒｄＵ抗体で染色することによりＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を測定した。
　図９は、ＭＬＲアッセイの結果を示すグラフである。図９中、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。その結果、モノクローナル抗体Ｎｏ．１及びＮｏ．２のいずれを添加した場合においても、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖が有意に抑制されたことが明らかとなった。この結果は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１及びＮｏ．２が、ヒトＴ細胞の機能に作用できることを示す。
［実験例９］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の機能解析２）
　移植片対宿主病マウスモデルを用いて、実験例１で作製したモノクローナル抗体Ｎｏ．１の機能を解析した。
　本実験例で使用した移植片対宿主病マウスモデルは、免疫不全マウスであるＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌマウス）とヒトＣＤ１５５トランスジェニックマウスを交配して得られたｈＣＤ１５５Ｔｇ／ＮＯＧマウスに放射線照射した後、ヒト末梢血リンパ球を移植し、体重の変化又は生存率により移植片対宿主病の症状を測定するモデルである。
　図１０は、本実験の実験プロトコルを示す図である。実験開始の前日に、ｈＣＤ１５５Ｔｇ／ＮＯＧマウス（メス、８週齢）に１．２Ｇｙの放射線照射を行った。続いて、実験開始の日に２．５×１０６個／匹のヒト末梢血リンパ球を尾静脈注射により移植し、更に３００μｇ／０．２ｍＬのＦ（ａｂ’）２型モノクローナル抗体Ｎｏ．１を腹腔内投与した（ｎ＝６）。対照として、抗体の代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を投与したマウスを使用した（ｎ＝６）。続いて、マウスの体重の変化及び生存率を測定し、移植片対宿主病の症状を測定した。実験開始から３、７、１１、１４、１８及び２１日目にも上記と同量の抗体を腹腔内投与した。
　図１１は、マウスの生存率を示すグラフである。その結果、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を投与したマウスでは有意に生存率が上昇した。この結果は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を投与することにより、移植片対宿主病を予防することができることを示す。
　また、上記のマウスについて、血液中のグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）活性及びグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）活性を測定し、肝機能の低下を検討した。血液中のＡＬＴ及びＡＳＴの活性が上昇することは、肝臓が障害を受けていることを示す。
　図１２（ａ）は、ＡＬＴ活性を測定した結果を示すグラフである。また、図１２（ｂ）は、ＡＳＴ活性を測定した結果を示すグラフである。その結果、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を投与したマウスでは、肝機能の低下が抑制されることが明らかとなった。
［実験例１０］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の機能解析３）
　実験例９と同様の移植片対宿主病マウスモデルを用いて、実験例１で作製したモノクローナル抗体Ｎｏ．１の機能を解析した。実験例９とは実験プロトコルを変更し、モノクローナル抗体Ｎｏ．１による移植片対宿主病の治療効果を検討した。
　図１３は、本実験の実験プロトコルを示す図である。実験開始の前日に、ｈＣＤ１５５Ｔｇ／ＮＯＧマウス（メス、８週齢）に１．２Ｇｙの放射線照射を行った。続いて、実験開始の日に２．５×１０６個／匹のヒト末梢血リンパ球を尾静脈注射により移植した。続いて、マウスの体重の変化及び生存率を測定し、移植片対宿主病の症状を測定した。実験開始から１０、１３、１７、２０日目に３００μｇ／０．２ｍＬのＦ（ａｂ’）２型モノクローナル抗体Ｎｏ．１を腹腔内投与した。モノクローナル抗体Ｎｏ．１の投与はマウスが死亡するまで週２回の割合で継続した。対照として、抗体の代わりにＰＢＳを投与したマウスを使用した。
　図１４は、マウスの生存率を示すグラフである。その結果、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を投与したマウスでは有意に生存率が上昇した。この結果は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を投与することにより、移植片対宿主病を治療することができることを示す。
［実験例１１］
（抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体の機能解析４）
　実験例１で作製したモノクローナル抗体Ｎｏ．１とモノクローナル抗体Ｎｏ．２の機能を比較した。より具体的には、まず、ヒト末梢血単核細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞を分離し、抗ＣＤ３抗体（型式「５５５３３６」、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、０．２５μｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ２８抗体（型式「５５５７２５」、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１μｇ／ｍＬ）及びＩＬ－２（型式「５５４６０３」、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、０．０２μｇ／ｍＬ）の存在下で７日間培養し、活性化した。
　続いて、活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞に、コントロールＩｇＧ１抗体（対照）、モノクローナル抗体Ｎｏ．１又はモノクローナル抗体Ｎｏ．２を１０ｍｇ／１０６細胞の割合で添加し、４℃、３０分間インキュベートして結合させた。
　続いて、抗体処理後のＣＤ８＋Ｔ細胞に、標的細胞となるｈＣＤ１５５発現細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞：ｈＣＤ１５５発現細胞＝１：５の割合で混合して３７℃で４時間共培養した。ｈＣＤ１５５発現細胞としては、ＢＷ５１４７細胞にｈＣＤ１５５を強制発現させた細胞を使用した。
　その後、各ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を評価した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａの発現により評価した。なお、ＣＤ１０７ａはＣＤ８＋Ｔ細胞の脱顆粒マーカーである。
　図１５は、検討結果を示すグラフである。コントロールＩｇＧ１抗体（対照）で処理したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ発現細胞の割合を１００％とし、モノクローナル抗体Ｎｏ．１又はモノクローナル抗体Ｎｏ．２で処理したＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ発現細胞の割合を示した。
　図１５中、ｐ＝０．００２は危険率０．２％未満で有意差が存在することを示し、ｐ＝０．００４は危険率０．４％未満で有意差が存在することを示し、ｐ＝０．０２は危険率２％未満で有意差が存在することを示す。
　その結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＤＮＡＭ－１と標的細胞上のｈＣＤ１５５の結合を抗ＤＮＡＭ－１抗体で阻害すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性が阻害されることが明らかとなった。また、その阻害の程度は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１の方がモノクローナル抗体Ｎｏ．２よりも有意に高いことが明らかとなった。
［実験例１２］
（制御性Ｔ細胞に関する検討）
　実験例９と同様の移植片対宿主病マウスモデルを用いて、実験例１で作製したモノクローナル抗体Ｎｏ．１の機能を解析した。
　具体的には、まず、実験開始の前日に、免疫不全マウスであるＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌマウス）とヒトＣＤ１５５トランスジェニックマウスを交配して得られたｈＣＤ１５５Ｔｇ／ＮＯＧマウス（メス、８週齢）に１．２Ｇｙの放射線照射を行った。続いて、実験開始の日に２．５×１０６個／匹のヒト末梢血リンパ球を尾静脈注射により移植し、更に３００μｇ／０．２ｍＬのＦ（ａｂ’）２型モノクローナル抗体Ｎｏ．１を腹腔内投与した（ｎ＝６）。対照として、抗体の代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を投与したマウスを使用した（ｎ＝６）。実験開始から３、７、１１日目にも上記と同量の抗体を腹腔内投与した。
　続いて、実験開始から１４日目にマウスから脾臓及び末梢血を採取してフローサイトメトリーにより解析し、これらに含まれる制御性Ｔ細胞の割合を測定した。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞を制御性Ｔ細胞として検出した。
　図１６（ａ）は、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を投与してから１４日後のマウスの脾臓中のＣＤ４＋Ｔ細胞における制御性Ｔ細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。また、図１６（ｂ）はモノクローナル抗体Ｎｏ．１を投与してから１４日後のマウスの末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞における制御性Ｔ細胞の割合を測定した結果を示すグラフである。　
　その結果、モノクローナル抗体Ｎｏ．１を投与することにより、制御性Ｔ細胞の割合が顕著に増加したことが明らかとなった。
［実験例１３］
（自己免疫疾患に関する検討）
　実験的自己免疫性脳脊髄炎モデルを用いて抗ＤＮＡＭ－１抗体の機能を評価した。具体的には、まず、実験開始の前日に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１００μｇ／０．２ｍＬの抗マウスＤＮＡＭ－１抗体を腹腔内投与した（ｎ＝８）。また、対照として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１００μｇ／０．２ｍＬのコントロールＩｇＧ抗体を腹腔内投与した（ｎ＝９）。
　続いて、実験開始時に、各群のマウスに５０μｇ／０．２ｍＬのＭｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＯＧ）タンパク質の第３３～５５番目のアミノ酸配列に相当するペプチドを背部皮下投与した。また、２００ｎｇ／０．２ｍＬの百日咳毒素を腹腔内投与した。更に、実験開始から２日目にも各群のマウスに２００ｎｇ／０．２ｍＬの百日咳毒素を腹腔内投与した。
　続いて、実験開始から１、３、７、１１、１３日目に各群のマウスに１００μｇ／０．２ｍＬの抗マウスＤＮＡＭ－１抗体又は１００μｇ／０．２ｍＬのコントロールＩｇＧ抗体をそれぞれ投与した。
　実験開始後のマウスを観察し、脳脊髄炎の発症率及び臨床スコアを測定した。臨床スコアは次の評価基準にしたがって評価したスコアの平均値とした。
（臨床スコア）
　０：正常
　１：尾のトーヌス低下
　２：尾の完全下垂
　３：歩行異常
　４：後肢の完全脱力
　５：前肢麻痺を含む後肢の完全脱力
　６：死亡
　図１７（ａ）は脳脊髄炎の発症率を測定した結果を示すグラフである。また、図１７（ｂ）は臨床スコアの平均値を算出した結果を示すグラフである。図１７（ａ）及び（ｂ）中、横軸は実験開始後の時間（日）を示す。その結果、抗ＤＮＡＭ－１抗体を投与することにより、自己免疫性脳脊髄炎の臨床スコアが改善されることが明らかとなった。
［実験例１４］
（肝臓の線維化に関する検討）
　抗ＤＮＡＭ－１抗体の投与の代わりにＤＮＡＭ－１遺伝子欠損（以下、「ＤＮＡＭ－１ＫＯ」という場合がある。）マウスを用いて肝臓の線維化に関する検討を行った。対照には野生型マウスを使用した。実験にはｂｉｌｅ　ｄｕｃｔ　ｌｉｇａｔｉｏｎ（ＢＤＬ）モデルを使用した。
　具体的には、まず、実験開始時に各群のマウスを開腹して総胆管を結索し、ＢＤＬモデルを作製した。続いて、実験開始から３、７、１４、２１日目に各群のマウスから眼窩採血を行った。続いて、採取した血液から血清を分離し、臨床化学分析装置（型式「ドライケム」、富士フイルム社）を用いてアルカリフォスファターゼ及び総ビリルビンを定量した。なお、アルカリフォスファターゼ及び総ビリルビンは肝臓及び胆道の障害の指標である。
　また、実験開始から２１日目に各群のマウスを全身灌流して肝臓を摘出した。摘出した肝臓を固定し、パラフィン包埋して組織切片を作製し、シリウスレッド染色を行い顕微鏡観察した。シリウスレッドは、コラーゲン三本鎖らせんに結合する色素である。
　図１８（ａ）は、血清中のアルカリフォスファターゼを定量した結果を示すグラフである。図１８（ａ）中、「ＷＴ」は野生型マウスの結果であることを示し、「ＤＮＡＭ－１　ＫＯ」はＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスの結果であることを示し、「ｎａｉｖｅ」は胆管結索処置を行っていないマウスの結果であることを示す。また、横軸は実験開始後の時間（日）を示す。その結果、ＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスでは、対照の野生型マウスと比較して、血清中のアルカリフォスファターゼ量が有意に少ないことが明らかとなった。
　また、図１８（ｂ）は、血清中の総ビリルビンを定量した結果を示すグラフである。図１８（ｂ）中、「ＷＴ」は野生型マウスの結果であることを示し、「ＤＮＡＭ－１　ＫＯ」はＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスの結果であることを示し、「ｎａｉｖｅ」は胆管結索処置を行っていないマウスの結果であることを示す。また、横軸は実験開始後の時間（日）を示す。その結果、ＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、血清中の総ビリルビン量が有意に少ないことが明らかとなった。
　また、図１９（ａ）及び（ｂ）は肝臓組織の顕微鏡写真である。図１９（ａ）は対照の野生型マウス（ＷＴ）の写真であり、図１９（ｂ）はＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウス（ＤＮＡＭ－１　ＫＯ）の写真である。倍率はいずれも２０倍である。その結果、ＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、肝臓の線維化が顕著に軽減していることが明らかとなった。
　以上の結果は、抗ＤＮＡＭ－１抗体を生体に投与することにより、肝臓の線維化を軽減できることを示す。
［実験例１５］
（腎臓の線維化に関する検討）
　抗ＤＮＡＭ－１抗体の投与の代わりにＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスを用いて腎臓の線維化に関する検討を行った。対照には野生型マウスを使用した。実験にはＵｎｉｌａｔｅｒａｌ　ｕｒｅｔｅｒａｌ　ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ（ＵＵＯ）モデルを使用した。
　具体的には、まず、実験開始時に各群のマウスを開腹して右腎尿管を結索し、ＵＵＯモデルを作製した。一方、左腎は無処置とした。続いて、実験開始から７日目に各群のマウスを全身灌流して両腎を摘出した。続いて、摘出した腎臓をホルマリン固定し、パラフィン包埋して組織切片を作製した。続いて、組織切片をマッソントリクローム染色し、観察した。また、パラホルムアルデヒド固定した腎臓をＯＣＴコンパウンドで包埋し、組織切片を作製した。続いて、組織切片を免疫染色し、繊維化の指標の一つであるα－ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ（α－ＳＭＡ）陽性領域の面積を算出した。
　図２０（ａ）はマッソントリクローム染色した腎臓の切断面の写真である。図２０（ｂ）は、図２０（ａ）に基づいて腎皮質の面積を測定した結果を示すグラフである。図２０（ａ）及び（ｂ）中、「ＵＵＯ」は尿管を結索した右腎の結果であることを示し、「ＣＯＮ」は無処置である左腎の結果であることを示し、「ＷＴ」は野生型マウスの結果であることを示し、「ＤＮＡＭ－１　ＫＯ」はＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスの結果であることを示す。また、図２０（ｂ）中、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示し、「＊＊」は危険率１％未満で有意差があることを示し、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示す。その結果、ＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、尿管の結索による腎組織の破壊が有意に軽減したことが明らかとなった。
　また、図２１（ａ）及び（ｂ）は腎臓の組織切片を抗α－ＳＭＡ抗体で免疫染色した結果を示す顕微鏡写真である。図２１（ａ）は対照である野生型マウスにおける、尿管を結索した右腎の組織切片の代表的な結果を示し、図２１（ｂ）はＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスにおける、尿管を結索した右腎の組織切片の代表的な結果を示す。また、図２１（ｃ）は各群のマウスの腎臓組織におけるα－ＳＭＡ陽性領域の面積を算出した結果を示すグラフである。
　図２１（ａ）～（ｃ）中、「ＷＴ」は野生型マウスの結果であることを示し、「ＤＮＡＭ－１　ＫＯ」はＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスの結果であることを示す。また、図２１（ｃ）中「ＣＯＮ」は無処置である左腎の結果であることを示す。その結果、ＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、尿管の結索による腎組織の線維化が顕著に軽減したことが明らかとなった。
　以上の結果は、抗ＤＮＡＭ－１抗体を生体に投与することにより、腎臓の線維化を軽減できることを示す。
［実験例１６］
（炎症性腸炎に関する検討）
　抗ＤＮＡＭ－１抗体の投与の代わりにＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスを用いて炎症性腸炎に関する検討を行った。対照には野生型マウスを使用した。実験にはデキストラン硫酸（ＤＳＳ）誘導マウス腸炎モデルを使用した。
　まず、実験開始の３日前からＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウス（ｎ＝５）及び野生型マウス（ｎ＝５）を飼育して馴化させた。この間は通常の水を与えた。続いて、実験を開始し、水の代わりに２％ＤＳＳ水溶液を与えて各群のマウスを飼育し、体重の変化を測定した。実験開始から９日目に各群のマウスをと殺し、大腸を摘出して腸管の長さを測定した。
　図２２は、対照の野生型マウス（ＷＴ）及びＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウス（ＫＯ）の体重を測定した結果を示すグラフである。図２２中、「＊」は危険率５％未満で有意差があることを示す。また、横軸は実験開始後の時間（日）を示す。その結果、ＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、炎症性腸炎による体重の減少が有意に軽減したことが明らかとなった。
　また、図２３（ａ）は、実験開始から９日目に摘出した、ＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスの大腸の写真である。また、図２３（ｂ）は、実験開始から９日目に摘出した、対照の野生型マウスの大腸の写真である。また、図２３（ｃ）は図２３（ａ）及び（ｂ）の結果を数値化したグラフである。図２３（ａ）～（ｃ）中、「ＷＴ」は野生型マウスの結果であることを示し、「ＤＮＡＭ－１　ＫＯ」はＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスの結果であることを示し、「ｎａｉｖｅ」は２％ＤＳＳ水溶液の代わりに水を与えたマウスの結果であることを示す。また、図２３（ｃ）中、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がなかったことを示す。その結果、ＤＮＡＭ－１遺伝子欠損マウスでは、野生型マウスと比較して、炎症性腸炎による腸管の短縮が有意に軽減したことが明らかとなった。
　以上の結果は、抗ＤＮＡＭ－１抗体を生体に投与することにより、炎症性腸炎の病態を軽減できることを示す。
　本発明によれば、ヒトの免疫反応を抑制することができる技術を提供することができる。

Claims (22)

  1. 　ＤＮＡＸ　Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＤＮＡＭ－１）及びＣＤ１５５の結合を阻害する物質からなる、制御性Ｔ細胞の活性化剤。
  2. 　ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する前記物質が、ＤＮＡＭ－１に対する特異的結合物質、ＤＮＡＭ－１発現阻害剤、ＣＤ１５５に対する特異的結合物質又はＣＤ１５５発現阻害剤である、請求項１に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
  3. 　移植片対宿主病、臓器移植拒絶、自己免疫疾患、線維化疾患、炎症性腸炎若しくはアレルギーの予防又は治療用である、請求項１又は２に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
  4. 　ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する前記物質が、ＤＮＡＭ－１対する特異的結合物質であり、
    　前記ＤＮＡＭ－１はヒトＤＮＡＭ－１であり、
    　前記特異的結合物質は抗体又はその断片であり、
    　前記抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子と反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して１００ｎｇ以下で前記ヒトＤＮＡＭ－１分子を飽和することができる、
    　請求項１～３のいずれか一項に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
  5. 　ＤＮＡＭ－１及びＣＤ１５５の結合を阻害する前記物質が、ＤＮＡＭ－１対する特異的結合物質であり、
    　前記ＤＮＡＭ－１はヒトＤＮＡＭ－１であり、
    　前記特異的結合物質は抗体又はその断片であり、
    　前記抗体又はその断片は、ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子を、ヒトＣＤ１５５とＩｇＧ型抗体定常領域との融合タンパク質１０００ｎｇで飽和させた後に反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して５００ｎｇ以下で、前記融合タンパク質と前記ヒトＤＮＡＭ－１分子との結合を完全に阻害することができる、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
  6. 　前記抗体はヒト型抗体である、請求項４又は５に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
  7. 　前記抗体又はその断片は、
    　相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するか、又は
    　ヒトＤＮＡＭ－１と結合させた場合に、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する抗体と競合する、
    　請求項４～６のいずれか一項に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
  8. 　前記抗体又はその断片は、
    　ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、
    　請求項４～７のいずれか一項に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤。
  9. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の制御性Ｔ細胞の活性化剤と、薬学的に許容できる担体とを含む、制御性Ｔ細胞活性化用医薬組成物。
  10. 　ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子と反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して５０ｎｇ以下で前記ヒトＤＮＡＭ－１分子を飽和することができる、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
  11. 　ヒトＤＮＡＭ－１を強制発現させたリンパ球細胞１×１０５個の細胞表面に存在するヒトＤＮＡＭ－１分子を、ヒトＣＤ１５５とＩｇＧ型抗体定常領域との融合タンパク質１０００ｎｇで飽和させた後に反応させた場合に、ＩｇＧ型抗体全長に換算して３００ｎｇ以下で、前記融合タンパク質と前記ヒトＤＮＡＭ－１分子との結合を完全に阻害することができる、抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
  12. 　ヒト型抗体又はその断片である、請求項１０又は１１に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
  13. 　ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有するか、又は
    　ヒトＤＮＡＭ－１と結合させた場合に、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する抗体と競合する、
    　請求項１０～１２のいずれか一項に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
  14. 　ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列又は配列番号１～３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列又は配列番号４～６のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
  15. 　ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、ＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
  16. 　配列番号７のアミノ酸配列又は配列番号７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、
    　配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
  17. 　配列番号７のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１６に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
  18. 　配列番号９のアミノ酸配列又は配列番号９のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、
    　配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
  19. 　配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号１０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、を有する、請求項１８に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片。
  20. 　請求項１０～１９のいずれか一項に記載の抗ヒトＤＮＡＭ－１モノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸。
  21. 　請求項２０に記載の核酸を含有するベクター。
  22. 　請求項２１に記載のベクターを含有する形質転換体。
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