CN109072226A - 调节性t细胞的激活剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种调节性T细胞的激活剂，其中，由抑制DNAX辅助分子‑1(DNAX Accessory Molecule‑1，DNAM‑1)以及CD155的结合的物质构成。

Description

调节性T细胞的激活剂及其应用
技术领域
本发明涉及调节性T细胞的激活剂及其应用。更具体而言，涉及调节性T细胞的激活剂、调节性T细胞激活用医药组合物、抗人DNAX辅助分子-1(DNAX Accessory Molecule-1，DNAM-1)单克隆抗体或其片段、核酸、载体以及转化体。本申请基于2016年4月20日在日本提交申请的日本专利特愿2016-084170号要求优先权，在此援引其内容。
背景技术
在输血或干细胞移植之后，有时会发生移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)。移植物抗宿主病是由于移植细胞中存在的来源于供体的激活的T细胞对受体的细胞进行伤害而产生的。此外，如果将供体的脏器移植到受体，则有时发生排异反应。例如，在心移植、血管移植、肾脏移植等中，被移植的心脏、血管、肾脏虽然暂时植活(日语：生着)，但有时发现逐渐剥离。因此，需求抑制移植物抗宿主病或脏器移植排异的技术。
例如，专利文献1中，记载了针对小鼠DNAM-1蛋白质的中和抗体能够作为维持小鼠中的移植心脏、移植血管或移植肾脏的植活的药剂使用。
DNAM-1蛋白质是也称为CD226的分子量65kDa的属于免疫球蛋白超家族的粘附分子。DNAM-1蛋白质的表达在人或小鼠的CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突细胞等各种免疫细胞中被确认到。人DNAM-1的参考序列(RefSeq)ID为NP_001290547，小鼠DNAM-1的参考序列ID为NP_001034238。发明人先前已经明确，DNAM-1蛋白质与作为脊髓灰质炎病毒受体而知的CD155结合。CD155是属于免疫球蛋白超家族的I型跨膜糖蛋白。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特开2013-245162号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
基于这样的背景，本发明的目的在于提供可抑制人的免疫反应的技术。
解决技术问题所采用的技术方案
本发明包括以下的实施方式。
[1]一种调节性T细胞的激活剂，其中，其由抑制DNAM-1以及CD155的结合的物质构成。
[2]如[1]所述的调节性T细胞的激活剂，其中，抑制DNAM-1以及CD155的结合的上述物质是针对DNAM-1的特异性结合物质、DNAM-1表达抑制剂、针对CD155的特异性结合物质或CD155表达抑制剂。
[3]如[1]或[2]所述的调节性T细胞的激活剂，其中，其是移植物抗宿主病、脏器移植排异、自身免疫疾病、纤维化疾病、炎症性肠炎或过敏的预防或治疗用的调节性T细胞的激活剂。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的调节性T细胞的激活剂，其中，抑制DNAM-1以及CD155的结合的上述物质是针对DNAM-1的特异性结合物质，上述DNAM-1是人DNAM-1，上述特异性结合物质是抗体或其片段，上述抗体或其片段在与存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子发生反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，以100ng以下的量可使上述人DNAM-1分子饱和。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的调节性T细胞的激活剂，其中，抑制DNAM-1以及CD155的结合的上述物质是针对DNAM-1的特异性结合物质，上述DNAM-1是人DNAM-1，上述特异性结合物质是抗体或其片段，上述抗体或其片段在用人CD155和IgG型抗体恒定区域的融合蛋白质1000ng使存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子饱和后与其发生反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，以500ng以下的量可完全抑制上述融合蛋白质和上述人DNAM-1分子的结合。
[6]如[4]或[5]所述的调节性T细胞的激活剂，其中，上述抗体是人源化抗体。
[7]如[4]～[6]中任一项所述的调节性T细胞的激活剂，其中，上述抗体或其片段具有互补性决定区域(CDR)1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域；或在使其与人DNAM-1结合的情况下，与具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域的抗体进行竞争。
[8]如[4]～[7]中任一项所述的调节性T细胞的激活剂，其中，上述抗体或其片段具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
[9]一种调节性T细胞激活用医药组合物，其中，包含[1]～[8]中任一项所述的调节性T细胞的激活剂、和药学上允许的载体。
[10]一种抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其中，在与存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子发生反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，以100ng以下的量可使上述人DNAM-1分子饱和。
[11]一种抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其中，在用人CD155和IgG型抗体恒定区域的融合蛋白质1000ng使存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子饱和后与其发生反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，以500ng以下的量可完全抑制上述融合蛋白质和上述人DNAM-1分子的结合。
[12]如[10]或[11]所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其中，其是人源化抗体或其片段。
[13]如[10]～[12]中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其中，其具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域；或在使其与人DNAM-1结合的情况下，与具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域的抗体进行竞争。
[14]如[10]～[13]中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其中，其具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
[15]如[10]～[14]中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其中，其具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
[16]如[10]～[15]中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其中，其具有由序列编号7的氨基酸序列或在序列编号7的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及由序列编号8的氨基酸序列或在序列编号8的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
[17]如[16]所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其中，其具有由序列编号7的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及由序列编号8的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
[18]如[10]～[14]中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其中，其具有由序列编号9的氨基酸序列或在序列编号9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及由序列编号10的氨基酸序列或在序列编号10的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
[19]如[18]所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其中，其具有由序列编号9的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及由序列编号10的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
[20]一种核酸，其中，其编码如[10]～[19]中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段。
[21]一种载体，其中，其含有如[20]所述的核酸。
[22]一种转化体，其中，其含有如[21]所述的载体。
(1)一种抗人DNAX辅助分子-1(DNAM-1)单克隆抗体或抗体片段(抗体片段)，其中，其具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
(2)如(1)所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或抗体片段，其中，其具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
(3)如(1)或(2)所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或抗体片段，其中，其具有由序列编号7的氨基酸序列或在序列编号7的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个的氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及由序列编号8的氨基酸序列或在序列编号8的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个的氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或抗体片段，其中，其具有由序列编号7的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及由序列编号8的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
(5)一种核酸，其中，其编码(1)～(4)中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或抗体片段。
(6)一种重组载体，其中，其含有如(5)所述的核酸。
(7)一种转化体，其中，其具有如(6)所述的重组载体。
(8)一种免疫抑制剂，其中，其作为有效成分含有如(1)～(4)中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或抗体片段。
(9)如(8)所述的免疫抑制剂，其中，其是移植物抗宿主病的预防或治疗剂。
(10)如(8)所述的免疫抑制剂，其中，其是脏器移植排异的预防或治疗剂。
发明的效果
如果采用本发明，则可提供可抑制人的免疫反应的技术。
附图说明
图1是表示对抗人DNAM-1单克隆抗体1～6号的重链的氨基酸序列进行比对的结果的图。
图2是表示对抗人DNAM-1单克隆抗体1～6号的轻链的氨基酸序列进行比对的结果的图。
图3的(a)～(d)是表示实验例2的结果的图。
图4的(a)～(l)是表示实验例3的结果的图。
图5的(a)～(e)是表示实验例4中、对抗人DNAM-1单克隆抗体1～6号的反应性进行考察的结果的图。
图6的(a)～(e)是表示实验例5中、对抗人DNAM-1单克隆抗体1～6号的反应性进行考察的结果的图。
图7的(a)～(e)是表示实验例6中、对抗人DNAM-1单克隆抗体1～6号的反应性进行考察的结果的图。
图8的(a)～(e)是表示实验例7中、对抗人DNAM-1单克隆抗体1～6号的反应性进行考察的结果的图。
图9是表示实验例8中的混合淋巴细胞反应试验的结果的图。
图10是表示实验例9的实验方案的图。
图11是表示实验例9中的小鼠的生存率的图。
图12的(a)以及(b)是表示对实验例9中的小鼠的肝功能进行考察的结果的图。
图13是表示实验例10的实验方案的图。
图14是表示实验例10中的小鼠的生存率的图。
图15是表示实验例11中、测定使抗人DNAM-1单克隆抗体反应的CD8+T细胞的细胞伤害活性的结果的图。
图16的(a)是表示实验例12中、对给予单克隆抗体1号起14天后的小鼠的脾脏中的CD4+T细胞中的调节性T细胞的比例进行测定的结果的图。(b)是表示实验例12中、对给予单克隆抗体1号起14天后的小鼠的外周血中的CD4+T细胞中的调节性T细胞的比例进行测定的结果的图。
图17的(a)是表示实验例13中、对脑脊髓炎的发病率进行测定的结果的图。此外，(b)是表示实验例13中、算出临床评分的平均值的结果的图。
图18的(a)是表示实验例14中、对血清中的碱性磷酸酶进行定量的结果的图。(b)是表示实验例14中、对血清中的总胆红素进行定量的结果的图。
图19的(a)是实验例14中的对照小鼠的肝脏组织的显微镜照片。(b)是实验例14中的DNAM-1基因缺损小鼠的肝脏组织的显微镜照片。
图20的(a)是实验例15中进行了马森三色染色的肾脏的切割面的照片。(b)是表示基于(a)、对肾皮质的面积进行测定的结果的图。
图21的(a)是表示实验例15中、用抗α-SMA抗体对对照小鼠的肾脏的组织切片进行免疫染色的代表性的结果的显微镜照片。(b)是表示实验例15中、用抗α-SMA抗体对DNAM-1基因缺损小鼠的肾脏的组织切片进行免疫染色的代表性的结果的显微镜照片。(c)是表示实验例15中、算出各组的小鼠的肾脏组织中的α-SMA阳性区域的面积的结果的图。
图22是表示实验例16中、对对照小鼠以及DNAM-1基因缺损小鼠的体重进行测定的结果的图。
图23的(a)是实验例16中、从实验开始起第9天摘出的、DNAM-1基因缺损小鼠的大肠的照片。(b)是实验例16中、从实验开始起第9天摘出的、对照小鼠的大肠的照片。(c)是将(a)以及(b)的结果数值化而成的图。
具体实施方式
[调节性T细胞的激活剂]
在一个实施方式中，本发明提供由抑制DNAM-1以及CD155的结合的物质构成的调节性T细胞的激活剂。
如实施例中后述的，发明人明确了通过抑制DNAM-1和CD155的结合，可激活调节性T细胞。因此，抑制DNAM-1以及CD155的结合的物质可用于调节性T细胞的激活的用途。
作为抑制DNAM-1以及CD155的结合的物质，例如可例举针对DNAM-1的特异性结合物质、DNAM-1表达抑制剂、针对CD155的特异性结合物质、CD155表达抑制剂等。
作为针对DNAM-1的特异性结合物质、针对CD155的特异性结合物质，只要是可抑制DNAM-1以及CD155的结合的物质则没有特别限定，例如可例举抗体、抗体片段、适体等。抗体可以是通过对小鼠等动物进行免疫来制造的，也可以是通过噬菌体文库等抗体文库的筛选来制造的。此外，作为抗体片段，可例举F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等。此外，作为适体，例如可例举核酸适体、肽适体等。
此外，针对DNAM-1的特异性结合物质也可以是可溶化了的CD155。作为可溶化了的CD155，例如可例举CD155和抗体恒定区域的融合蛋白质等。此外，针对CD155的特异性结合物质可以是可溶化了的DNAM-1。作为可溶化了的DNAM-1，例如可例举DNAM-1和抗体恒定区域的融合蛋白质等。
作为DNAM-1表达抑制剂、CD155表达抑制剂，只要是使DNAM-1或CD155的表达减少、作为结果可抑制DNAM-1以及CD155的结合的物质则没有特别限定，例如可例举siRNA、shRNA、miRNA、核酶、反义核酸、低分子化合物等。siRNA、shRNA、miRNA、核酶以及反义核酸也可以为了提高稳定性或活性而包括各种化学修饰。例如，为了防止核酸酶等水解酶导致的分解，磷酸残基例如也可以取代为硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯等化学修饰磷酸残基。此外，至少一部分也可以用肽核酸(PNA)等核酸类似物构成。
调节性T细胞是也称为Treg、调节T细胞的一种T细胞。越来越明确调节性T细胞进行免疫应答的抑制性控制。作为调节性T细胞，例如可例举CD4+CD25+T细胞、Foxp3+CD25+T细胞、CD4+Foxp3+细胞等。
本说明书中，调节性T细胞的激活是指调节性T细胞的细胞数量的增加，调节性T细胞所表达的TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子的表达量的增加，T细胞导致的免疫应答的抑制，所有免疫应答的抑制等。
本实施方式的调节性T细胞的激活剂可用于可通过调节性T细胞的激活来减轻症状的疾病的预防或治疗。作为这样的疾病，例如可例举移植物抗宿主病、脏器移植排异、自身免疫疾病、纤维化疾病、炎症性肠炎、过敏等。
此处，作为自身免疫疾病，例如可例举风湿、I型糖尿病、自身免疫性脑脊髓炎等。此外，纤维化疾病是指在肺、心脏、肝脏、肾脏等各种脏器中，组织被I型胶原等置换所导致的疾病，例如可例举肝硬化、糖尿病性肾病、肺纤维症等。作为过敏，例如可例举过敏性鼻炎、特应性皮炎等。
本实施方式的调节性T细胞的激活剂例如可以是针对DNAM-1的特异性结合物质，特异性结合物质也可以是抗体或其片段。此处，DNAM-1只要是激活调节性T细胞的对象的种类的DNAM-1即可，例如可以是人DNAM-1。即，本实施方式的调节性T细胞的激活剂可以是抗人DNAM-1抗体或其片段。
此处，作为抗人DNAM-1抗体或其片段，优选具有在使上述抗体或其片段与存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子进行反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，以100ng以下、优选80ng以下、更优选50ng以下、进一步优选40ng以下、特别优选30ng以下的量可使存在于上述的淋巴细胞的细胞表面的人DNAM-1分子饱和的反应性。如实施例中后述的，具有这样的反应性的抗人DNAM-1抗体的调节性T细胞的激活能力高。
此处，例如在对象的抗体例如是抗体片段等的情况下，换算为IgG型抗体全长的质量来计算反应性即可。在该情况下，例如基于抗体片段和IgG型抗体全长的分子量来换算质量即可。
此外，适合作为本实施方式的调节性T细胞的激活剂的抗人DNAM-1抗体或其片段在用人CD155和IgG型抗体恒定区域的融合蛋白质1000ng使存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子饱和后与上述的淋巴细胞发生反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，具有以500ng以下、优选400ng以下、更优选300ng以下、进一步优选200ng以下、特别优选100ng以下的量可完全抑制上述的融合蛋白质和存在于上述的淋巴细胞的细胞表面的人DNAM-1分子的结合的反应性。
即，具有这样的反应性的抗人DNAM-1抗体即使在预先结合DNAM-1和CD155的情况下，也可解除该结合。如实施例中后述的，具有这样的反应性的抗人DNAM-1抗体的调节性T细胞的激活能力高。
此处，完全抑制是指在实质上可完全地抑制。例如，是指可在用人CD155和IgG型抗体恒定区域的融合蛋白质1000ng使存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子饱和后与上述的淋巴细胞发生反应的情况下，使结合于上述的淋巴细胞的表面的融合蛋白质中的80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选99％以上解离，与存在于淋巴细胞的细胞表面的人DNAM-1分子结合。
此外，本实施方式的调节性T细胞的激活剂可以是抗人CD155抗体或其片段。
本实施方式的调节性T细胞的激活剂中，优选抗人DNAM-1抗体或其片段、或抗人CD155抗体或其片段、人源化抗体或其片段。
如果调节性T细胞的激活剂是人源化抗体或其片段，则由于即使给予人也免疫原性低，因此可抑制过敏性休克等副作用。作为人源化抗体，可例举嵌合抗体、人化抗体、完全人抗体等。
本说明书中，嵌合抗体是指可变区域是来源于非人动物的抗体、恒定区域的至少一部分是来源于人的抗体的抗体。此外，人化抗体是指仅重链以及轻链的互补性决定区域(CDR)是来源于非人动物的抗体、恒定区域以及骨架区域是来源于人的抗体的抗体。此外，完全人抗体是指包括互补性决定区域、整体来源于人的抗体。
本实施方式的调节性T细胞的激活剂中，抗人DNAM-1抗体或其片段可以是具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域的抗体或其片段。
此处，重链可变区域的CDR1或CDR2中的数个是指4个、3个或2个。此外，重链可变区域的CDR3中的数个是指2个。此处，轻链可变区域的CDR1或CDR3中的数个是指4个、3个或2个。此外，轻链可变区域的CDR2中的数个是指2个。
作为具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域的抗体，例如可例举实施例中后述的单克隆抗体1号、将单克隆抗体1号人源化后的抗体等。
此外，抗人DNAM-1抗体不限于单克隆抗体1号，只要是具有与单克隆抗体1号同等以上的反应性的抗体，则可作为本实施方式的调节性T细胞的激活剂使用。因此，抗人DNAM-1抗体也可以是具有CDR1～3分别由在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域的抗体。作为这样的抗体，例如可例举实施例中后述的单克隆抗体2～6号、将单克隆抗体2～6号人源化后的抗体等。
或者，在使抗人DNAM-1抗体或其片段与人DNAM-1结合的情况下，也可以是与具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域的抗体进行竞争的抗体或其片段。即，抗人DNAM-1抗体也可以是和与人DNAM-1的结合相关、与实施例中后述的单克隆抗体1号进行竞争的抗体。与单克隆抗体1号进行竞争的抗体和与人DNAM-1的结合相关、具有与单克隆抗体1号同等以上的反应性。
此处，对象的抗体进行竞争是指，例如在使实施例中后述的单克隆抗体1号与存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子发生反应后，在使对象的抗体与上述的淋巴细胞发生反应的情况下，单克隆抗体1号和人DNAM-1分子的结合至少部分被解离，可与人DNAM-1分子进行结合。
此处，至少部分是指可以是存在于上述的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子全体的10％以上、30％以上、50％以上、70％以上、90％以上。
[调节性T细胞激活用医药组合物]
在一个实施方式中，本发明提供包含上述的调节性T细胞的激活剂、和药学上允许的载体的调节性T细胞激活用医药组合物。
作为药学上允许的载体，可使用通常用于制剂的载体，例如可例举赋形剂、稳定剂、注射剂用溶剂等。作为注射剂用溶剂，例如可例举生理食盐水、包含葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠等佐剂的等渗液。
本实施方式的医药组合物也可在上述的调节性T细胞的激活剂、药学上允许的载体以外，包括添加物。作为添加物，例如可例举pH调节剂、粘度改良剂、着色剂、以往在移植物抗宿主病或脏器移植排异的治疗中使用的类固醇类、免疫抑制剂等。
本实施方式的医药组合物的剂型不受限定，例如可例举冻干剂、粉末制剂、基于pH经调整的缓冲液的溶液制剂、注射用微胶囊剂等。
本实施方式的医药组合物例如作为注射剂或滴注剂、通过静脈给药等来对患者进行给药。其给药量、给药途径、处方根据患者的症状、体重、年龄、性别等适当决定即可。
本实施方式的医药组合物的给药量根据患者的症状、体重、年龄、性别等而不同，不能一概而定，但对于需要处置的人患者，在1次给药中每1kg体重含有例如1μg～100mg、例如50μg～50mg的量的有效成分(抑制DNAM-1以及CD155的结合的物质)，每1天1次～数次给药即可。
[抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段]
在一个实施方式中，本发明提供在与存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子进行反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，以100ng以下、优选80ng以下、更优选50ng以下、进一步优选40ng以下、特别优选30ng以下的量可使存在于上述的淋巴细胞的细胞表面的人DNAM-1分子饱和的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段。
如实施例中后述的，具有这样的反应性的抗人DNAM-1抗体对调节性T细胞的激活或、移植物抗宿主病、脏器移植排异、自身免疫疾病、纤维化疾病、炎症性肠炎等症状的减轻等有用。
此处，例如在对象的抗体例如是抗体片段等的情况下，换算为IgG型抗体全长的质量来计算反应性即可。在该情况下，例如基于抗体片段和IgG型抗体全长的分子量来换算质量即可。此外，本实施方式的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段可以是除去任意的已知抗体及其片段的抗体或其片段。
本实施方式的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段也可以是在用人CD155和IgG型抗体恒定区域的融合蛋白质1000ng使存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子饱和后与上述的淋巴细胞发生反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，具有以500ng以下、优选400ng以下、更优选300ng以下、进一步优选200ng以下、特别优选100ng以下的量可完全抑制上述的融合蛋白质和存在于上述的淋巴细胞的细胞表面的人DNAM-1分子的结合的反应性。
即，具有这样的反应性的抗人DNAM-1抗体即使在预先结合DNAM-1和CD155的情况下，也可解除该结合。此处，“完全抑制”与上述相同。
本实施方式的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段也可以是人源化抗体或其片段。人源化抗体与上述相同。
本实施方式的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段可以具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
此处，重链可变区域的CDR1或CDR2中的数个是指4个、3个或2个。此外，重链可变区域的CDR3中的数个是指2个。此处，轻链可变区域的CDR1或CDR3中的数个是指4个、3个或2个。此外，轻链可变区域的CDR2中的数个是指2个。
本说明书中，作为抗体片段，可例举Fab、F(ab’)2、用适当的连接物将重链可变区域和轻链可变区域连结而成的单链Fv(single-chain Fv，scFv)等。作为scFv的连接物，例如可例举(GGGGS)3(序列编号21)等肽。
如实施例中后述的，本实施方式的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段可与人DNAM-1蛋白质良好地结合、在体内以及体外中抑制人的免疫反应。因此，可作为免疫抑制剂使用。
或者，在使本实施方式的抗人DNAM-1抗体或其片段与人DNAM-1结合的情况下，也可以是与具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域的抗体进行竞争的抗体或其片段。即，抗人DNAM-1抗体也可以是和与人DNAM-1的结合相关、与实施例中后述的单克隆抗体1号进行竞争的抗体。与单克隆抗体1号进行竞争的抗体和与人DNAM-1的结合相关、具有与单克隆抗体1号同等以上的反应性。此处，抗体的竞争与上述相同。
抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段也可以具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域。作为这样的抗体，例如可例举实施例中后述的单克隆抗体1号、将单克隆抗体1号人源化后的抗体等。
此外，抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段也可以具有由序列编号7的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及由序列编号8的氨基酸序列构成的轻链可变区域。作为这样的抗体，例如可例举实施例中后述的单克隆抗体1号、将单克隆抗体1号人源化后的抗体等。
或者，抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段也可以具有由序列编号9的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及由序列编号10的氨基酸序列构成的轻链可变区域。作为这样的抗体，例如可例举实施例中后述的单克隆抗体2号、将单克隆抗体2号人源化后的抗体等。
此外，抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段在具有针对人DNAM-1的反应性的范围内，也可以具有由在序列编号7的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及由在序列编号8的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
或者，抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段在具有针对人DNAM-1的反应性的范围内，也可以具有由在序列编号9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及由在序列编号10的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
此处，重链可变区域或轻链可变区域中的数个是指15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个。作为这样的抗体，例如可例举实施例中后述的单克隆抗体3～6号、将单克隆抗体3～6号人源化后的抗体等。
[编码抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段的核酸]
在一个实施方式中，本发明提供编码上述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段的核酸。
作为这样的核酸，例如可例举上述的抗人DNAM-1单克隆抗体的重链可变区域基因、上述的抗人DNAM-1单克隆抗体的轻链可变区域基因、编码上述的抗人DNAM-1单克隆抗体的重链可变区域以及恒定区域的一部分的基因、编码上述的抗人DNAM-1单克隆抗体的轻链可变区域以及恒定区域的一部分的基因、编码上述的抗人DNAM-1单克隆抗体的重链全长的基因、编码上述的抗人DNAM-1单克隆抗体的轻链全长的基因、编码用适当的连接物将上述的抗人DNAM-1单克隆抗体的重链可变区域和轻链可变区域连结而成的scFv的基因等。
上述的重链可变区域基因也可以是由序列编号19中记载的碱基序列构成的基因。此外，上述的轻链可变区域基因也可以是由序列编号20中记载的碱基序列构成的基因。
此外，上述的重链可变区域基因也可以是编码CDR1～3分别由序列编号1～3中记载的氨基酸序列构成、CDR以外的骨架区域来源于非小鼠抗体的重链可变区域的基因。此外，上述的轻链可变区域基因也可以是编码CDR1～3分别由序列编号4～6中记载的氨基酸序列构成、CDR以外的骨架区域来源于非小鼠抗体的轻链可变区域的基因。此处，作为非小鼠抗体，例如可例举人抗体。
本实施方式的核酸优选上述的抗人DNAM-1单克隆抗体的重链可变区域基因或来源于此的基因、和抗人DNAM-1单克隆抗体的轻链可变区域基因或来源于此的基因的组合。
此处，作为来源于重链可变区域基因的基因，例如可例举编码CDR1～3分别由序列编号1～3中记载的氨基酸序列构成、CDR以外的骨架区域来源于非小鼠抗体的重链可变区域的基因。此外，相同地，作为来源于轻链可变区域基因的基因，例如可例举编码CDR1～3分别由序列编号4～6中记载的氨基酸序列构成、CDR以外的骨架区域来源于非小鼠抗体的轻链可变区域的基因。
[载体]
在一个实施方式中，本发明提供含有上述的核酸的重组载体。本实施方式的重组载体也可以是表达载体。在本实施方式的载体是表达载体的情况下，可通过导入到宿主中使其表达，来制造抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段。
本实施方式的重组载体中，也可以在上述的核酸的5’末端或3’末端中，添加编码组氨酸标签、FLAG标签、GST标签等标签序列的DNA。作为上述的表达载体，可例举使宿主细胞表达抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段的细胞系载体，和在由从适当的细胞提取的具有蛋白质合成能力的成分构成的蛋白质翻译体系中、使抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段表达的无细胞系载体。
作为细胞系载体，可使用适于宿主细胞的公知的表达载体。例如，可例举大肠杆菌中以pBR322衍生物为代表的ColE系质粒、具有p15A起始位点的pACYC系质粒、pSC系质粒、Bac系等来源于F因子的小型F质粒。其它，还可例举具有trc或tac等色氨酸启动子、lac启动子、T7启动子、T5启动子、T3启动子、SP6启动子、阿拉伯糖诱导启动子、冷休克启动子、四环素诱导性启动子等的表达载体。此外，作为宿主为大肠杆菌以外的载体，例如可例举酵母表达用的pAUR系质粒、昆虫细胞表达用的pIEx系质粒、动物细胞表达用的pBApo-CMV系质粒等。
作为无细胞系载体，可例举细胞系载体中举出的具有T7启动子的表达载体或具有T3启动子的表达载体；具有SP6启动子或T7启动子的pEU系质粒等小麦无细胞蛋白质合成用载体等。
在使用无细胞系载体的蛋白质合成中，首先，使用转录体系，对SesA基因进行转录，合成mRNA。作为转录体系，可例举通过RNA聚合酶使其转录的以往公知的转录体系。作为RNA聚合酶，例如可例举T7RNA聚合酶、SP6聚合酶等。
接着，使用作为翻译体系的无细胞蛋白质合成体系，对mRNA进行翻译，合成蛋白质。在该体系中，包括核糖体、翻译起始因子、翻译延伸因子、解离因子、氨酰tRNA合成酶等翻译所必需的要素。作为这样的蛋白质翻译体系，可例举大肠杆菌提取液、兔网织红细胞提取液、小麦胚芽提取液等。而且，可例举仅由将上述翻译所必需的要素独立纯化后的因子构成的重组型无细胞蛋白质合成体系。
可以从用细胞系载体或无细胞系载体合成的蛋白质纯化抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段来使用。作为纯化方法，可例举使用蛋白A、蛋白G等的方法等。在设计为使表达载体在靶蛋白的N末端或C末端上表达组氨酸标签等标签序列的情况下，可例举基于使用了镍或钴等对该标签具有亲和性的物质的亲和柱的纯化方法。另外，可通过将离子交换色谱或凝胶过滤色谱等适当组合来进行纯化，来提高抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段的纯度。
[转化体]
在一个实施方式中，本发明提供含有上述的重组载体的转化体。可通过本实施方式的转化体或其培养基等，来制造抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段。
本实施方式的转化体可通过将上述的重组载体导入宿主来得到。作为转化体，例如可例举导入了上述重组载体的大肠杆菌、酵母、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞等培养细胞；导入了上述的载体的蚕等的昆虫生物体；导入了上述的载体的烟草等植物体等。
重组载体的对宿主的导入(转化)可使用以往公知的方法进行。例如，可例举使用经钙处理后的菌体的感受态细胞法、或电穿孔法等。此外，在质粒载体以外，也可采用使噬菌体载体、病毒载体等感染宿主、进行转化的方法。
[免疫抑制剂]
在一个实施方式中，本发明提供将上述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段作为有效成分而含有的免疫抑制剂。
如实施例中后述的，本实施方式的免疫抑制剂可抑制混合淋巴细胞反应(mixedlymphocyte reaction，MLR)试验中的CD8+T细胞的增殖。
此外，如实施例中后述的，本实施方式的免疫抑制剂在移植物抗宿主病小鼠模型中确认显示出移植物抗宿主病的预防以及治疗效果。
因此，本实施方式的免疫抑制剂可作为移植物抗宿主病的预防或治疗剂。此外，本实施方式的免疫抑制剂也可作为脏器移植排异的预防或治疗剂。
本实施方式的免疫抑制剂也可以是含有药学上允许的载体、其它添加物的医药组合物。作为药学上允许的载体，可例举赋形剂、稳定剂、注射剂用溶剂等。作为注射剂用溶剂，例如可例举生理食盐水、包含葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠等佐剂的等渗液。作为其它添加物，例如可例举pH调节剂、粘度改良剂、着色剂、以往在移植物抗宿主病或脏器移植排异的治疗中使用的类固醇类、免疫抑制剂等。
本实施方式的免疫抑制剂或上述的医药组合物的剂型不受限定，例如可例举冻干剂、粉末制剂、基于pH经调整的缓冲液的溶液制剂、注射用微胶囊剂等。
本实施方式的免疫抑制剂或医药组合物作为注射剂或滴注剂、通过静脈给药等来对患者进行给药。其给药量、给药途径、处方根据患者的症状、体重、年龄、性别等适当决定即可。
本实施方式的免疫抑制剂或上述的医药组合物的给药量根据患者的症状、体重、年龄、性别等而不同，不能一概而定，但对于需要处置的人患者，在1次给药中每1kg体重含有例如1μg～100mg、例如50μg～50mg的量的有效成分(抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段)，每1天1次～数次给药即可。
[其他实施方式]
在一个实施方式中，本发明提供具备将DNAM-1以及CD155的结合抑制物质的有效量向需要治疗的患者进行给药的工序的调节性T细胞的激活方法。作为DNAM-1以及CD155的结合抑制物质，可例举上述的物质。
在一个实施方式中，本发明提供用于调节性T细胞的激活的、DNAM-1以及CD155的结合抑制物质。作为DNAM-1以及CD155的结合抑制物质，可例举上述的物质。
在一个实施方式中，本发明提供DNAM-1以及CD155的结合抑制物质在调节性T细胞的激活剂的制造中的应用。作为DNAM-1以及CD155的结合抑制物质，可例举上述的物质。
在一个实施方式中，本发明提供具备将DNAM-1以及CD155的结合抑制物质的有效量向需要治疗的患者进行给药的工序的移植物抗宿主病、脏器移植排异、自身免疫疾病、纤维化疾病、炎症性肠炎或过敏的预防或治疗方法。作为DNAM-1以及CD155的结合抑制物质，可例举上述的物质。
在一个实施方式中，本发明提供用于移植物抗宿主病、脏器移植排异、自身免疫疾病、纤维化疾病、炎症性肠炎或过敏的预防或治疗的、DNAM-1以及CD155的结合抑制物质。作为DNAM-1以及CD155的结合抑制物质，可例举上述的物质。
在一个实施方式中，本发明提供DNAM-1以及CD155的结合抑制物质在移植物抗宿主病、脏器移植排异、自身免疫疾病、纤维化疾病、炎症性肠炎或过敏的预防剂或治疗剂的制造中的应用。作为DNAM-1以及CD155的结合抑制物质，可例举上述的物质。
在一个实施方式中，本发明提供具备将上述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段的有效量向需要治疗的患者进行给药的工序的、移植物抗宿主病或脏器移植排异的治疗或预防方法。
在一个实施方式中，本发明提供用于移植物抗宿主病或脏器移植排异的治疗或预防的、上述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段。
在一个实施方式中，本发明提供上述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段在移植物抗宿主病或脏器移植排异的治疗剂或预防剂的制造中的应用。
实施例
以下示出实验例，对本发明进行进一步详细说明，但本发明并不限于以下的实验例。
[实验例1]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的制造)
在作为小鼠淋巴细胞的BW5147细胞株中导入人DMAM-1基因，使人DMAM-1蛋白质表达。将该细胞作为抗原对小鼠进行免疫，通过常规方法制造杂交瘤。从得到的杂交瘤株中，将针对人DNAM-1蛋白质的反应性作为指标，分别获得产生抗人DNAM-1单克隆抗体1～6号的克隆。
接着，从通过常规方法建立的杂交瘤株，对抗体重链基因以及抗体轻链基因进行克隆，鉴定抗体重链以及轻链的氨基酸序列。图1是表示对抗人DNAM-1单克隆抗体1～6号的重链的氨基酸序列进行比对的结果的图。图1中，下划线表示CDR1～3。图2是表示对抗人DNAM-1单克隆抗体1～6号的轻链的氨基酸序列进行比对的结果的图。图2中，下划线表示CDR1～3。此外，下表1中示出各单克隆抗体的重链以及轻链的氨基酸序列和序列表的序列编号的对应。
[表1]
抗体 重链可变区域全长 轻链可变区域全长
1号 序列编号7 序列编号8
2号 序列编号9 序列编号10
3号 序列编号11 序列编号12
4号 序列编号13 序列编号14
5号 序列编号15 序列编号16
6号 序列编号17 序列编号18
[实验例2]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的反应性的考察1)
考察实验例1所制造的单克隆抗体1号以及2号的反应性。具体而言，使作为小鼠淋巴细胞的BW5147细胞株(以下，有时称为“BW”。)、以及使人DMAM-1蛋白质表达的BW5147细胞株(以下，有时称为“DNAM-1/BW”。)与单克隆抗体1号以及2号反应，进行流式细胞仪分析。作为对照，使用对照组IgG1抗体。对于1×105个的各细胞，使30ng的各抗体与其反应。使抗体在冰上反应30分钟。
图3(a)是表示使单克隆抗体1号与BW细胞反应的结果的图。图3(b)是表示使单克隆抗体1号与DNAM-1/BW细胞反应的结果的图。图3(c)是表示使单克隆抗体2号与BW细胞反应的结果的图。图3(d)是表示使单克隆抗体2号与DNAM-1/BW细胞反应的结果的图。
其结果是，确认单克隆抗体1号以及2号均可特异性地识别在BW细胞中表达的DNAM-1蛋白质。
[实验例3]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的反应性的考察2)
考察实验例1所制造的单克隆抗体1号以及2号的针对存在于人外周血淋巴细胞表面上的DNAM-1蛋白质的反应性。
考察针对存在于人外周血淋巴细胞中的CD3+CD4+细胞(CD4+T细胞)、CD3+CD8+细胞(CD8+T细胞)、CD3-CD19+细胞(B细胞)、CD3-CD56+细胞(NK细胞)、CD3+CD56+细胞(NKT细胞)、CD14+细胞(单核细胞)的单克隆抗体1号以及2号的反应性。作为对照，使用对照组IgG1抗体。使100ng单克隆抗体1号以及2号分别与1×105个的外周血淋巴细胞反应。使抗体在冰上反应30分钟。
图4(a)是表示针对CD4+T细胞的单克隆抗体1号的反应性的结果。图4(b)是表示针对CD8+T细胞的单克隆抗体1号的反应性的结果。图4(c)是表示针对B细胞的单克隆抗体1号的反应性的结果。图4(d)是表示针对CD4+T细胞的单克隆抗体2号的反应性的结果。图4(e)是表示针对CD8+T细胞的单克隆抗体2号的反应性的结果。图4(f)是表示针对B细胞的单克隆抗体2号的反应性的结果。图4(g)是表示针对NK细胞的单克隆抗体1号的反应性的结果。图4(h)是表示针对NKT细胞的单克隆抗体1号的反应性的结果。图4(i)是表示针对单核细胞的单克隆抗体1号的反应性的结果。图4(j)是表示针对NK细胞的单克隆抗体2号的反应性的结果。图4(k)是表示针对NKT细胞的单克隆抗体2号的反应性的结果。图4(l)是表示针对单核细胞的单克隆抗体2号的反应性的结果。
其结果是，确认单克隆抗体1号以及2号均具有针对存在于CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞的细胞表面的DNAM-1蛋白质的反应性。
[实验例4]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的反应性的考察3)
进行使用实验例1所制造的单克隆抗体1号～6号的竞争试验。更具体而言，首先，使100ng的单克隆抗体2号与上述的DNAM-1/BW细胞1×105个发生反应(前处理)。接着，分别与连续稀释的单克隆抗体1、3～6号发生反应。使抗体在冰上反应30分钟。还考察针对无前处理的DNAM-1/BW细胞的各抗体的反应性。
图5(a)是表示单克隆抗体1号的结果的图。图5(b)是表示单克隆抗体3号的结果的图。图5(c)是表示单克隆抗体4号的结果的图。图5(d)是表示单克隆抗体5号的结果的图。图5(e)是表示单克隆抗体6号的结果的图。
从图5(a)的结果，可知单克隆抗体1号与预先与单克隆抗体2号反应的DNAM-1/BW细胞也显示出良好的反应性。该结果显示，单克隆抗体1号对DNAM-1蛋白质的反应性高于单克隆抗体2号。
此外，从图5(b)的结果，可知单克隆抗体3号与预先与单克隆抗体2号反应的DNAM-1/BW细胞不怎么反应。该结果显示，单克隆抗体2号对DNAM-1蛋白质的反应性高于单克隆抗体3号。
此外，从图5(c)的结果，可知单克隆抗体4号与预先与单克隆抗体2号反应的DNAM-1/BW细胞不怎么反应。该结果显示，单克隆抗体2号对DNAM-1蛋白质的反应性高于单克隆抗体4号。
此外，从图5(d)的结果，可知单克隆抗体5号具有与预先与单克隆抗体2号反应的DNAM-1/BW细胞的反应性。如果与后述的实验例5的结果进行综合，则认为有单克隆抗体5号和单克隆抗体2号不竞争表位的可能性。
此外，图5(e)的结果也与图5(d)的结果相同，如果与后述的实验例5的结果进行综合，则认为有单克隆抗体6号和单克隆抗体2号不竞争表位的可能性。
[实验例5]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的反应性的考察4)
替换预先与DNAM-1/BW细胞进行反应的抗体，进行与实验例4相同的实验。更具体而言，首先，使饱和量的单克隆抗体1、3～6号分别与上述的DNAM-1/BW细胞1×105个发生反应(前处理)。具体而言，单克隆抗体1号使用30ng，3号使用300ng，4号使用300ng，5号使用500ng，6号使用1000ng。
另外，可使在上述的DNAM-1/BW细胞1×105个的细胞表面表达的人DNAM-1抗体饱和的抗体的最低量在单克隆抗体1号的情况下为30ng，单克隆抗体2号的情况下为50ng，单克隆抗体3号的情况下为100ng，单克隆抗体4号的情况下为100ng，单克隆抗体5号的情况下为300ng，单克隆抗体6号的情况下为300ng。接着，分别与连续稀释的单克隆抗体2号发生反应。使抗体在冰上反应30分钟。还考察针对无前处理的DNAM-1/BW细胞的各抗体的反应性。
图6(a)是表示单克隆抗体1号的结果的图。图6(b)是表示单克隆抗体3号的结果的图。图6(c)是表示单克隆抗体4号的结果的图。图6(d)是表示单克隆抗体5号的结果的图。图6(e)是表示单克隆抗体6号的结果的图。
从图6(a)的结果，可知单克隆抗体2号与预先与单克隆抗体1号反应的DNAM-1/BW细胞不怎么反应。如果将该结果与上述的实验例4的结果进行综合，则进一步支持单克隆抗体1号对DNAM-1蛋白质的反应性高于单克隆抗体2号。
此外，从图6(b)的结果，可知单克隆抗体2号与预先与单克隆抗体3号反应的DNAM-1/BW细胞较良好地反应。如果将该结果与上述的实验例4的结果进行综合，则进一步支持单克隆抗体2号对DNAM-1蛋白质的反应性高于单克隆抗体3号。
此外，从图6(c)的结果，可知单克隆抗体2号与预先与单克隆抗体4号反应的DNAM-1/BW细胞较良好地反应。如果将该结果与上述的实验例4的结果进行综合，则进一步支持单克隆抗体2号对DNAM-1蛋白质的反应性高于单克隆抗体4号。
此外，从图6(d)的结果，可知单克隆抗体2号具有与预先与单克隆抗体5号反应的DNAM-1/BW细胞的反应性。如果将该结果与上述的实验例4的结果进行综合，则认为有单克隆抗体2号和单克隆抗体5号不竞争表位的可能性。
此外，图6(e)的结果也与图6(d)的结果相同，如果与上述的实验例4的结果进行综合，则认为有单克隆抗体2号和单克隆抗体6号不竞争表位的可能性。
[实验例6]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的反应性的考察5)
DNAM-1蛋白质已知与CD155蛋白质相互作用。于是，考察实验例1所制造的单克隆抗体1号～6号可否抑制DNAM-1蛋白质与CD155蛋白质的相互作用。
首先，准备可溶化人CD155蛋白质。具体而言，通过常规方法制造人CD155蛋白质和人IgG抗体恒定区域的融合蛋白质(以下，有时称为“hCD155-Fc”。)。另外，人CD155蛋白质的参考序列ID是NP_001129240。
接着，使饱和量(1000ng)的hCD155-Fc蛋白质与1×105个上述的DNAM-1/BW细胞发生反应。接着，使连续稀释的单克隆抗体1号～6号分别与上述的DNAM-1/BW细胞发生反应。反应在冰上进行30分钟。
图7(a)～(e)分别是表示单克隆抗体1、3～6号的结果的图。用于比较，图7(a)～(e)均显示单克隆抗体2号的结果。
从图7(a)的结果，可知单克隆抗体1号可与预先与hCD155-Fc蛋白质反应的DNAM-1/BW细胞良好地反应，其反应性高于单克隆抗体2号。
首先，从图7(b)的结果，可知单克隆抗体3号可与预先与hCD155-Fc蛋白质反应的DNAM-1/BW细胞良好地反应，其反应性与单克隆抗体2号为同等程度。
首先，从图7(c)的结果，可知单克隆抗体4号可与预先与hCD155-Fc蛋白质反应的DNAM-1/BW细胞良好地反应，其反应性与单克隆抗体2号为同等程度。
首先，从图7(b)的结果，可知单克隆抗体5号可与预先与hCD155-Fc蛋白质反应的DNAM-1/BW细胞反应，但其反应性低于单克隆抗体2号。
首先，从图7(e)的结果，可知单克隆抗体6号可与预先与hCD155-Fc蛋白质反应的DNAM-1/BW细胞反应，但其反应性低于单克隆抗体2号。
[实验例7]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的反应性的考察6)
实验例6中，使连续稀释的单克隆抗体1号～6号分别与预先与hCD155-Fc蛋白质反应的DNAM-1/BW细胞反应后，检出了结合于DNAM-1/BW细胞表面的DNAM-1蛋白质上的hCD155-Fc蛋白质。hCD155-Fc蛋白质的检出使用抗人IgG抗体进行。反应在冰上进行30分钟。
图8(a)～(e)分别是表示单克隆抗体1、3～6号的结果的图。用于比较，图8(a)～(e)均显示单克隆抗体2号的结果。
从图8(a)的结果，可知与单克隆抗体1号反应后，残留的hCD155-Fc蛋白质的量依赖于单克隆抗体1号的浓度而减少。
此外，可知在进行反应的单克隆抗体的浓度高的区域中，hCD155-Fc蛋白质完全消失。该结果显示，单克隆抗体1号以及2号均可完全抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用。此外，对于为了完全抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用所需的抗体量，单克隆抗体1号少于单克隆抗体2号。更具体而言，对于为了完全抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用所需的抗体量，单克隆抗体1号为100ng，单克隆抗体2号为300ng。
从图8(b)的结果，可知与单克隆抗体3号反应后，残留的hCD155-Fc蛋白质的量依赖于单克隆抗体3号的浓度而减少。
此外，在进行反应的单克隆抗体的浓度低的区域中，与单克隆抗体3号反应后残留的hCD155-Fc蛋白质的量少于与单克隆抗体2号反应后残留的hCD155-Fc蛋白质的量。该结果显示，在进行反应的单克隆抗体的浓度低的区域中，与单克隆抗体2号相比，单克隆抗体3号的抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用的活性更高。此外，在进行反应的单克隆抗体的浓度高的区域中，单克隆抗体2号与单克隆抗体3号的反应性之差较小。为了完全抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用所需的单克隆抗体3号的量为300ng。
从图8(c)的结果，可知与单克隆抗体4号反应后，残留的hCD155-Fc蛋白质的量依赖于单克隆抗体4号的浓度而减少。
此外，与单克隆抗体4号反应后残留的hCD155-Fc蛋白质的量多于与单克隆抗体2号反应后残留的hCD155-Fc蛋白质的量。该结果显示，与单克隆抗体4号相比，单克隆抗体2号的抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用的活性更高。为了完全抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用所需的单克隆抗体4号的量为1000ng。
从图8(d)的结果可知，即使与单克隆抗体5号反应，hCD155-Fc蛋白质的量几乎不减少。该结果显示，单克隆抗体5号的抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用的活性较低。即使使用3000ng单克隆抗体5号，也不能完全抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用。
此外，从图8(e)的结果可知，即使与单克隆抗体6号反应，hCD155-Fc蛋白质的量几乎不减少。该结果显示，单克隆抗体6号的抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用的活性较低。即使使用3000ng单克隆抗体6号，也不能完全抑制DNAM-1蛋白质和CD155蛋白质的相互作用。
[实验例8]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的功能分析1)
在实验例1所制造的单克隆抗体1号或2号的存在下，进行混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)试验，考察针对T细胞的增殖的单克隆抗体的影响。
MLR试验是指，在将同种异体刺激细胞与T细胞进行混合的情况下，测定观察到的T细胞的增殖。具体而言，首先，从人外周血淋巴细胞分离CD14+细胞(5×105个)，在白细胞介素(IL)-4(40ng/孔)以及GM-CSF(50ng/孔)的存在下培养1周，诱导树突细胞。CD14+细胞的培养用24孔板进行。另一方面，从来源于其它供体的人外周血淋巴细胞中分离CD8+T细胞。
接着，使CD8+T细胞与饱和量以上(1μg/mL)的F(ab’)2型单克隆抗体1号、F(ab’)2型单克隆抗体2号、或F(ab’)2型对照组IgG(对照)进行反应后，与上述的树突细胞共培养。CD8+T细胞为5×104个，树突细胞为5×103个。
从共培养的开始起48小时后，再次以1μg/mL逐个添加上述的抗体。此外，从共培养的开始起72小时后添加溴化去氧尿苷(BrdU)。此外，从共培养开始起96小时后通过用抗BrdU抗体进行染色，测定CD8+T细胞的增殖。
图9是表示MLR试验的结果的图。图9中，“*”表示风险比低于5％，存在显著差异。其结果是，可知在添加单克隆抗体1号以及2号的任一种的情况下，CD8+T细胞的增殖被显著地抑制。该结果显示单克隆抗体1号以及2号可作用于人T细胞的功能。
[实验例9]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的功能分析2)
使用移植物抗宿主病小鼠模型，分析实验例1所制造的单克隆抗体1号的功能。
本实验例所使用的移植物抗宿主病小鼠模型是对作为免疫缺陷小鼠的NOG小鼠(NOD/Shi-scid,IL-2Rγnull小鼠)和人CD155转基因小鼠交配而得的hCD155Tg/NOG小鼠照射放射线后，移植人外周血淋巴细胞，通过体重的变化或生存率来测定移植物抗宿主病的症状的模型。
图10是表示本实验的实验方案的图。在实验开始的前日，对hCD155Tg/NOG小鼠(雌，8周龄)照射1.2Gy的放射线。接着，在实验开始之日，通过尾静脈注射移植2.5×106个/只的人外周血淋巴细胞，进一步将300μg/0.2mL的F(ab’)2型单克隆抗体1号进行腹腔内给药(n＝6)。作为对照，使用给药了磷酸缓冲液(PBS)来代替抗体的小鼠(n＝6)。接着，测定小鼠的体重的变化以及生存率，测定移植物抗宿主病的症状。从实验开始起第3、7、11、14、18以及21天也腹腔内给药与上述相同量的抗体。
图11是表示小鼠的生存率的图。其结果是，给药了单克隆抗体1号的小鼠中，生存率显著上升。该结果显示，通过给药单克隆抗体1号，可预防移植物抗宿主病。
此外，对上述的小鼠测定血液中的谷氨酸丙酮酸转氨酶(ALT)活性以及谷氨酸草酰乙酸转氨酶(AST)活性，考察肝功能的下降。血液中的ALT以及AST的活性上升显示肝脏受到损害。
图12(a)是表示测定ALT活性的结果的图。此外，图12(b)是表示测定AST活性的结果的图。其结果是，可知在给药了单克隆抗体1号的小鼠中，抑制了肝功能的下降。
[实验例10]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的功能分析3)
使用与实验例9相同的移植物抗宿主病小鼠模型，分析实验例1所制造的单克隆抗体1号的功能。改变实验例9的实验方案，考察基于单克隆抗体1号的移植物抗宿主病的治疗效果。
图13是表示本实验的实验方案的图。在实验开始的前日，对hCD155Tg/NOG小鼠(雌，8周龄)照射1.2Gy的放射线。接着，在实验开始之日通过尾静脈注射移植2.5×106个/只的人外周血淋巴细胞。接着，测定小鼠的体重的变化以及生存率，测定移植物抗宿主病的症状。从实验开始起第10、13、17、20天腹腔内给药300μg/0.2mL的F(ab’)2型单克隆抗体1号。单克隆抗体1号的给药以一周2次的比例继续，直至小鼠死亡为止。作为对照，使用给药了PBS来代替抗体的小鼠。
图14是表示小鼠的生存率的图。其结果是，给药了单克隆抗体1号的小鼠中，生存率显著上升。该结果显示，通过给药单克隆抗体1号，可治疗移植物抗宿主病。
[实验例11]
(抗人DNAM-1单克隆抗体的功能分析4)
比较实验例1所制造的单克隆抗体1号和单克隆抗体2号的功能。更具体而言，首先，从人外周血单核细胞分离CD8+T细胞，在抗CD3抗体(型号“555336”，BD生物科学公司(BDBioscience社)，0.25μg/mL)、抗CD28抗体(型号“555725”，BD生物科学公司，1μg/mL)以及IL-2(型号“554603”，BD生物科学公司，0.02μg/mL)的存在下培养7天，进行激活。
接着，在激活后的CD8+T细胞中，以10mg/106个细胞的比例添加对照组IgG1抗体(对照)、单克隆抗体1号或单克隆抗体2号，在4℃孵育30分钟，使其结合。
接着，在抗体处理后的CD8+T细胞中，以CD8+T细胞∶hCD155表达细胞＝1∶5的比例混合作为靶细胞的hCD155表达细胞，在37℃下共培养4小时。作为hCD155表达细胞，使用在BW5147细胞中使hCD155强制表达的细胞。
之后，评价各CD8+T细胞的细胞伤害活性。CD8+T细胞的细胞伤害活性通过CD8+T细胞中的CD107a的表达来评价。另外，CD107a是CD8+T细胞的脱粒标记。
图15是表示考察结果的图。将用对照组IgG1抗体(对照)处理的CD8+T细胞中的CD107a表达细胞的比例作为100％，示出用单克隆抗体1号或单克隆抗体2号处理的CD8+T细胞中的CD107a表达细胞的比例。
图15中，p＝0.002表示风险比低于0.2％，存在显著差异，p＝0.004表示风险比低于0.4％，存在显著差异，p＝0.02表示风险比低于2％，存在显著差异。
其结果是，可知如果用抗DNAM-1抗体抑制CD8+T细胞上的DNAM-1和靶细胞上的hCD155的结合，则可抑制CD8+T细胞的细胞伤害活性。此外，可知单克隆抗体1号的抑制的程度显著高于单克隆抗体2号。
[实验例12]
(关于调节性T细胞的考察)
使用与实验例9相同的移植物抗宿主病小鼠模型，分析实验例1所制造的单克隆抗体1号的功能。
具体而言，首先，在实验开始的前日，对作为免疫缺陷小鼠的NOG小鼠(NOD/Shi-scid,IL-2Rγnull小鼠)和人CD155转基因小鼠交配而得的hCD155Tg/NOG小鼠(雌，8周龄)进行1.2Gy的放射线照射。接着，在实验开始之日，通过尾静脈注射移植2.5×106个/只的人外周血淋巴细胞，进一步将300μg/0.2mL的F(ab’)2型单克隆抗体1号进行腹腔内给药(n＝6)。作为对照，使用给药了磷酸缓冲液(PBS)来代替抗体的小鼠(n＝6)。从实验开始起第3、7、11天也腹腔内给药与上述相同量的抗体。
接着，从实验开始起第14天从小鼠中采集脾脏以及外周血，通过流式细胞仪进行分析，测定这些中含有的调节性T细胞的比例。CD4+Foxp3+细胞作为调节性T细胞检出。
图16的(a)是表示对给予单克隆抗体1号起14天后的小鼠的脾脏中的CD4+T细胞中的调节性T细胞的比例进行测定的结果的图。此外，图16的(b)是表示对给予单克隆抗体1号起14天后的小鼠的外周血中的CD4+T细胞中的调节性T细胞的比例进行测定的结果的图。
其结果是，可知通过给药单克隆抗体1号，调节性T细胞的比例显著增加。
[实验例13]
(关于自身免疫疾病的考察)
使用实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，评价抗DNAM-1抗体的功能。具体而言，首先，在实验开始的前日，对C57BL/6J小鼠腹腔内给药100μg/0.2mL的抗小鼠DNAM-1抗体(n＝8)。此外，作为对照，对C57BL/6J小鼠腹腔内给药100μg/0.2mL的对照组IgG抗体(n＝9)。
接着，在实验开始时，对各组的小鼠背部皮下给药50μg/0.2mL的相当于髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)蛋白质的第33～55个氨基酸序列的肽。此外，腹腔内给药200ng/0.2mL的百日咳毒素。而且，从实验开始起第2天也对各组的小鼠腹腔内给药200ng/0.2mL的百日咳毒素。
接着，从实验开始起第1、3、7、11、13天对各组的小鼠分别给药100μg/0.2mL的抗小鼠DNAM-1抗体或100μg/0.2mL的对照组IgG抗体。
观察实验开始后的小鼠，测定脑脊髓炎的发病率以及临床评分。将临床评分设为根据以下评价基准评估的评分的平均值。
(临床评分)
0：正常
1：尾的紧张减弱
2：尾的完全下垂
3：步行异常
4：后肢的完全脱力
5：包括前肢麻痹的后肢的完全脱力
6：死亡
图17(a)是表示测定脑脊髓炎的发病率的结果的图。此外，图17(b)是表示算出临床评分的平均值的结果的图。图17(a)以及(b)中，横轴表示实验开始后的时间(天)。其结果是，可知通过给药抗DNAM-1抗体，改善了自身免疫性脑脊髓炎的临床评分。
[实验例14]
(关于肝脏的纤维化的考察)
使用DNAM-1基因缺损(以下，有时称为“DNAM-1KO”。)小鼠来代替抗DNAM-1抗体的给药，进行关于肝脏的纤维化的考察。对照使用野生型小鼠。实验中使用胆管结扎(bileduct ligation，BDL)模型。
具体而言，首先，在实验开始时对各组的小鼠进行开腹，结扎总胆管，制造BDL模型。接着，从实验开始起第3、7、14、21天从各组的小鼠进行眼眶采血。接着，从采集的血液中分离血清，使用临床化学分析装置(型号“DRI-CHEM”，富士胶卷株式会社(富士フイルム社))，对碱性磷酸酶以及总胆红素进行定量。另外，碱性磷酸酶以及总胆红素是肝脏以及胆道的损伤的指标。
此外，从实验开始起第21天对各组的小鼠进行全身灌流，摘出肝脏。固定摘出的肝脏，进行石蜡包埋，制造组织切片，进行天狼星红染色，用显微镜观察。天狼星红是结合在胶原三螺旋上的染料。
图18的(a)是表示对血清中的碱性磷酸酶进行定量的结果的图。图18(a)中，“WT”表示野生型小鼠的结果，“DNAM-1 KO”表示DNAM-1基因缺损小鼠的结果，“naive”表示没有进行胆管结扎处置的小鼠的结果。此外，横轴表示实验开始后的时间(天)。其结果是，可知与对照的野生型小鼠进行比较，在DNAM-1基因缺损小鼠中，血清中的碱性磷酸酶量显著较少。
此外，图18(b)是表示对血清中的总胆红素进行定量的结果的图。图18(b)中，“WT”表示野生型小鼠的结果，“DNAM-1 KO”表示DNAM-1基因缺损小鼠的结果，“naive”表示没有进行胆管结扎处置的小鼠的结果。此外，横轴表示实验开始后的时间(天)。其结果是，可知与野生型小鼠进行比较，在DNAM-1基因缺损小鼠中，血清中的总胆红素量显著较少。
此外，图19(a)以及(b)是肝脏组织的显微镜照片。图19(a)是对照的野生型小鼠(WT)的照片，图19(b)是DNAM-1基因缺损小鼠(DNAM-1KO)的照片。倍率均为20倍。其结果是，可知与野生型小鼠进行比较，在DNAM-1基因缺损小鼠中，肝脏的纤维化显著减轻。
以上的结果表示，通过对生物体给药抗DNAM-1抗体，可减轻肝脏的纤维化。
[实验例15]
(关于肾脏的纤维化的考察)
使用DNAM-1基因缺损小鼠来代替DNAM-1抗体的给药，进行关于肾脏的纤维化的考察。对照使用野生型小鼠。实验中使用单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteralobstruction，UUO)模型。
具体而言，首先，在实验开始时对各组的小鼠进行开腹，结扎右肾输尿管，制造UUO模型。另一方面，将左肾设为无处置。接着，从实验开始起第7天对各组的小鼠进行全身灌流，摘出双肾。接着，对摘出的肾脏进行福尔马林固定，进行石蜡包埋，制造组织切片。接着，对组织切片进行马森三色染色，观察。此外，用OCT包埋剂包埋多聚甲醛固定的肾脏，制造组织切片。接着，对组织切片进行免疫染色，算出作为纤维化的指标之一的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)阳性区域的面积。
图20的(a)是进行了马森三色染色的肾脏的切割面的照片。图20(b)是表示基于图20(a)、对肾皮质的面积进行测定的结果的图。在图20(a)以及(b)中，“UUO”表示结扎了输尿管的右肾的结果，“CON”表示无处置的左肾的结果，“WT”表示野生型小鼠的结果，“DNAM-1KO”表示DNAM-1基因缺损小鼠的结果。此外，图20(b)中，“*”表示风险比低于5％，存在显著差异，“**”表示风险比低于1％，存在显著差异，“N.S.”表示没有显著差异。其结果是，可知与野生型小鼠进行比较，在DNAM-1基因缺损小鼠中，输尿管的结扎导致的肾组织的破坏显著减轻。
此外，图21(a)以及(b)是表示用抗α-SMA抗体对肾脏的组织切片进行免疫染色的结果的显微镜照片。图21(a)表示作为对照的野生型小鼠中的、结扎了输尿管的右肾的组织切片的代表性的结果，图21(b)表示DNAM-1基因缺损小鼠中的、结扎了输尿管的右肾的组织切片的代表性的结果。此外，图21(c)是表示算出各组的小鼠的肾脏组织中的α-SMA阳性区域的面积的结果的图。
图21(a)～(c)中，“WT”表示野生型小鼠的结果，“DNAM-1 KO”表示DNAM-1基因缺损小鼠的结果。此外，图21(c)中“CON”表示无处置的左肾的结果。其结果是，可知与野生型小鼠进行比较，在DNAM-1基因缺损小鼠中，输尿管的结扎导致的肾组织的纤维化显著减轻。
以上的结果表示，通过对生物体给药抗DNAM-1抗体，可减轻肾脏的纤维化。
[实验例16]
(关于炎症性肠炎的考察)
使用DNAM-1基因缺损小鼠来代替DNAM-1抗体的给药，进行关于炎症性肠炎的考察。对照使用野生型小鼠。实验中使用葡聚糖硫酸酯(DSS)诱导小鼠肠炎模型。
首先，从实验开始的3天前起饲育DNAM-1基因缺损小鼠(n＝5)以及野生型小鼠(n＝5)使其驯化。其间给予普通的水。接着，开始实验，给予2％DSS水溶液来代替水对各组小鼠进行饲育，测定体重的变化。从实验开始起第9天处死各组小鼠，摘出大肠，测定肠管的长度。
图22是表示对对照的野生型小鼠(WT)以及DNAM-1基因缺损小鼠(KO)的体重进行测定的结果的图。图22中，“*”表示风险比低于5％，存在显著差异。此外，横轴表示实验开始后的时间(天)。其结果是，可知与野生型小鼠进行比较，在DNAM-1基因缺损小鼠中，炎症性肠炎导致的体重的减少显著减轻。
此外，图23的(a)是从实验开始起第9天摘出的、DNAM-1基因缺损小鼠的大肠的照片。此外，图23的(b)是从实验开始起第9天摘出的、对照的野生型小鼠的大肠的照片。此外，图23(c)是将(a)以及(b)的结果数值化而成的图。图23(a)～(c)中，“WT”表示野生型小鼠的结果，“DNAM-1 KO”表示DNAM-1基因缺损小鼠的结果，“naive”表示给予水来代替2％DSS水溶液的小鼠的结果。此外，图23(c)中，“N.S.”表示没有显著差异。其结果是，可知与野生型小鼠进行比较，在DNAM-1基因缺损小鼠中，炎症性肠炎导致的肠管的缩短显著减轻。
以上的结果表示，通过对生物体给药抗DNAM-1抗体，可减轻炎症性肠炎的病理状态。
产业上利用的可能性
如果采用本发明，则可提供可抑制人的免疫反应的技术。
序列表
<110> 茨城大学
<120> 调节性T细胞的激活剂及其使用
<130> PC-23378
<150> JP2016-084170
<151> 2016-04-20
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
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Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
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Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
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Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
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Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu
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Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr
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Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
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Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
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Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Pro
35 40 45
Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
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Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
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Tyr Cys Ala Glu Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
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Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala
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Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
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Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
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Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
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Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Asn His Glu Phe
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Trp Ile Arg Tyr Val Thr Arg Leu Gln His Ala Trp Tyr Arg Ala Phe
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Pro Ile Gly Val Asp Glu
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Glu Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Leu
1 5 10 15
Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp
20 25 30
Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly
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Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
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Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Asn
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Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu
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Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn
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Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
20 25 30
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
35 40 45
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
50 55 60
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Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<223> mAb4号重链可变区域
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Lys Trp Gly Leu Ser Glu Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
20 25 30
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn
35 40 45
Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser
50 55 60
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
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Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
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Leu Ala Pro Trp Lys
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Glu Lys Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
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Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
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<223> mAb5号重链可变区域
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Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile
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Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr
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Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Val Met
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Lys
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Ser Ala Leu Trp Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu
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Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile
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Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala
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<213> 小家鼠
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<223> mAb6号重链可变区域
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Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
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Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
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Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro
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Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Val Met Ile Thr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp
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Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Lys
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<213> 小家鼠
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Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
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Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala
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Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr
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Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr
50 55 60
Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
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Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
85 90 95
Pro
<210> 19
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
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<223> mAb1号重链可变区域
<400> 19
cagccgctac ttctcagtct ctgtctctca cctgctctgt cactggctac tccatcacca 60
gtggttatta ctggaactgg atccggcagt ttccaggaaa caaactggaa tggatgggct 120
acataagcta cgacggtagc aataactaca acccatctct caaaaatcga atctccatca 180
ctcgtgacac atctaagaac cagtttttcc tgaagttgaa ttctgtgact actgaggaca 240
cagctacata ttactgtgca agggcctact atggtaacta cgtggggtac ttcgatgtct 300
ggggcgcagg gaccacggtc accgtctcct cagccaaaac gacaccccca tcggtctatc 360
cactggcccc tggaaaaaa 379
<210> 20
<211> 339
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<223> mAb1号轻链可变区域
<400> 20
gttcagcagg agacagggtt accataacct gcaaggccag tcagagtgtg agtaatgatg 60
tagcttggta ccaacagaag ccagggcagt ctcctaaact gctgatatac tatgcatcca 120
atcgctacac tggagtccct gatcgcttca ctggcagtgg atatgggacg gatttcactt 180
tcaccatcag cactgtgcag gctgaagacc tggcagttta tttctgtcag caggattata 240
gctctccgct cacgttcggt gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac 300
caactgtatc catcttccca ccatccagtg agcagagag 339
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv连接物
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

Claims (22)

1.一种调节性T细胞的激活剂，其特征在于，由抑制DNAX辅助分子-1(DNAM-1)以及CD155的结合的物质构成。
2.如权利要求1所述的调节性T细胞的激活剂，其特征在于，抑制DNAM-1以及CD155的结合的所述物质是针对DNAM-1的特异性结合物质、DNAM-1表达抑制剂、针对CD155的特异性结合物质或CD155表达抑制剂。
3.如权利要求1或2所述的调节性T细胞的激活剂，其特征在于，其是移植物抗宿主病、脏器移植排异、自身免疫疾病、纤维化疾病、炎症性肠炎或过敏的预防或治疗用的调节性T细胞的激活剂。
4.如权利要求1～3中任一项所述的调节性T细胞的激活剂，其特征在于，
抑制DNAM-1以及CD155的结合的所述物质是针对DNAM-1的特异性结合物质，
所述DNAM-1是人DNAM-1，
所述特异性结合物质是抗体或其片段，
所述抗体或其片段在与存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子发生反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，以100ng以下的量可使所述人DNAM-1分子饱和。
5.如权利要求1～4中任一项所述的调节性T细胞的激活剂，其特征在于，
抑制DNAM-1以及CD155的结合的所述物质是针对DNAM-1的特异性结合物质，
所述DNAM-1是人DNAM-1，
所述特异性结合物质是抗体或其片段，
所述抗体或其片段在用人CD155和IgG型抗体恒定区域的融合蛋白质1000ng使存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子饱和后与其发生反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，以500ng以下的量可完全抑制所述融合蛋白质和所述人DNAM-1分子的结合。
6.如权利要求4或5所述的调节性T细胞的激活剂，其特征在于，所述抗体是人源化抗体。
7.如权利要求4～6中任一项所述的调节性T细胞的激活剂，其特征在于，
所述抗体或其片段
具有互补性决定区域(CDR)1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域；或
在使其与人DNAM-1结合的情况下，与具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域的抗体进行竞争。
8.如权利要求4～7中任一项所述的调节性T细胞的激活剂，其特征在于，
所述抗体或其片段
具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
9.一种调节性T细胞激活用医药组合物，其特征在于，其包含权利要求1～8中任一项所述的调节性T细胞的激活剂、和药学上允许的载体。
10.一种抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其特征在于，在与存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子发生反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，以50ng以下的量可使所述人DNAM-1分子饱和。
11.一种抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其特征在于，在用人CD155和IgG型抗体恒定区域的融合蛋白质1000ng使存在于使人DNAM-1强制表达的淋巴细胞1×105个的细胞表面的人DNAM-1分子饱和后与其发生反应的情况下，换算为IgG型抗体全长，以300ng以下的量可完全抑制所述融合蛋白质和所述人DNAM-1分子的结合。
12.如权利要求10或11所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其特征在于，其是人源化抗体或其片段。
13.如权利要求10～12中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其特征在于，
其具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域；或
在使其与人DNAM-1结合的情况下，与具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域的抗体进行竞争。
14.如权利要求10～13中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其特征在于，其具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列、或在序列编号1～3的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列、或在序列编号4～6的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
15.如权利要求10～14中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其特征在于，其具有CDR1～3分别由序列编号1～3的氨基酸序列构成的重链可变区域、以及CDR1～3分别由序列编号4～6的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
16.如权利要求10～15中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其特征在于，其具有
由序列编号7的氨基酸序列或在序列编号7的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及
由序列编号8的氨基酸序列或在序列编号8的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
17.如权利要求16所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其特征在于，其具有由序列编号7的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及由序列编号8的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
18.如权利要求10～14中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其特征在于，其具有
由序列编号9的氨基酸序列或在序列编号9的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及
由序列编号10的氨基酸序列或在序列编号10的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
19.如权利要求18所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段，其特征在于，其具有由序列编号9的氨基酸序列构成的重链可变区域，以及由序列编号10的氨基酸序列构成的轻链可变区域。
20.一种核酸，其特征在于，其编码如权利要求10～19中任一项所述的抗人DNAM-1单克隆抗体或其片段。
21.一种载体，其特征在于，其含有如权利要求20所述的核酸。
22.一种转化体，其特征在于，其含有如权利要求21所述的载体。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI728400B (zh) * 2018-07-26 2021-05-21 美商美國禮來大藥廠 Cd226促效劑抗體
JPWO2020250593A1 (zh) * 2019-06-11 2020-12-17
AU2021478400A1 (en) 2021-12-17 2024-06-06 Tnax Biopharma Corporation Humanized anti-dnam-1 antibody

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2012123A1 (en) * 2006-04-07 2009-01-07 University of Tsukuba Marker for predicting graft-versus-host disease and utilization of the same
CN105492025A (zh) * 2013-07-16 2016-04-13 豪夫迈·罗氏有限公司 使用pd-1轴结合拮抗剂和tigit抑制剂治疗癌症的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2580238A1 (en) 2010-06-09 2013-04-17 Zymogenetics, Inc. Dimeric vstm3 fusion proteins and related compositions and methods
JP2013193995A (ja) * 2012-03-21 2013-09-30 Tokyo Medical & Dental Univ 特発性炎症性筋疾患の予防又は治療剤
JP6048949B2 (ja) 2012-05-23 2016-12-21 国立大学法人 筑波大学 同種間での移植心臓、移植血管、または移植腎臓の生着を維持するために用いられる薬剤

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2012123A1 (en) * 2006-04-07 2009-01-07 University of Tsukuba Marker for predicting graft-versus-host disease and utilization of the same
CN105492025A (zh) * 2013-07-16 2016-04-13 豪夫迈·罗氏有限公司 使用pd-1轴结合拮抗剂和tigit抑制剂治疗癌症的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ESTER LOZANO等: "The CD226/CD155 Interaction Regulates the Proinflammatory (Th1/Th17)/Anti-Inflammatory (Th2) Balance in Humans", 《J IMMUNOL》 *
SUSAN GILFI LLAN等: "DNAM-1 promotes activation of cytotoxic lymphocytes by nonprofessional antigen-presenting cells and tumors", 《J. EXP. MED.》 *
TSUKASA NABEKURA等: "Critical role of DNAX accessory molecule-1 (DNAM-1) in the development of acute graft-versus-host disease in mice", 《PNAS》 *
VALERIE DARDALHON等: "CD226 Is Specifically Expressed on the Surface of Th1 Cells and Regulates Their Expansion and Effector Functions", 《J IMMUNOL》 *
YUMI YAMASHITA等: "Establishment and characterization of a novel anti-DNAM-1 monoclonal antibody", 《MONOCLON ANTIB IMMUNODIAGN IMMUNOTHER》 *

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