CN108884141A - T细胞激活或刺激的抑制剂的治疗应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及T细胞共刺激和/或激活和/或功能性的抑制剂用于治疗和/或预防心脏病，特别是心力衰竭疾病和/或相关症状。

Description

T细胞激活或刺激的抑制剂的治疗应用

本申请要求2016年1月15日以仁爱米拉索莱有限公司名义提交的欧洲专利申请NO.16151539.0的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。本文引用的所有文献均通过引用其全部并入本文。

背景技术

心力衰竭(Heart Failure，HF)是住院治疗、发病率和死亡率的主要原因，其常作为由血液动力学超负荷引起的病理性心脏肥大和纤维化的最终阶段(Zarrinkoub et al.,2013)。某些类型的心肌病-称为炎症性心肌病-是由自身免疫或对感染的免疫反应引起的，表明心功能障碍也可由免疫系统疾病引起(Bulut et al.,2012)。有趣的是，最近研究发现，由血液动力学超负荷引起的HF也涉及显著的炎症成分(Shioi et al.,1997)(Oka etal.,2012)(Hofmann and Frantz,2013)。这种炎症的特征在于先天免疫系统(巨噬细胞)的心肌细胞的存在以及促炎细胞因子的上调，例如TNFα，IL-6和IL-1β，其对疾病结果产生负面影响(Shioi et al.,1997)(Ancey et al.,2002)(Souders et al.,2012)。即使其同源性缺失可以得到补偿(Lai等，2012)，IL-6的施用足以引发导致病理性心脏肥大的过程(Melendez et al.,2010)。据信，先天免疫细胞和细胞因子促进心脏炎症，使疾病结果恶化。尽管炎症作为HF的主要组成的观点得到巩固(Mann，2002)，但试图通过阻断细胞因子来对抗HF的临床试验尚未成功(Yndestad et al.,2006)(Hofmann and Frantz,2013)。临床试验失败的原因可能是个体细胞因子间的功能冗余(Lai et al.,2012)。因此，为了鉴定出更适合的HF免疫治疗靶标，我们需要更准确的表征不同的可溶性免疫介质和疾病中先天性和适应性免疫系统的细胞的参与和等级。

先天性免疫系统通过产生非特异性但有效而快速的对抗病原体的防御线的细胞因子起作用。然而，在持续性免疫反应中，细胞因子变得受适应性免疫系统的T淋巴细胞(T细胞)的控制(Loke et al.,2007)，其与B细胞共同介导抗原特异性免疫应答。因此，如果涉及HF发病机制，T细胞可能成为用于治疗干预的有吸引力且更具特异性的免疫靶标。T细胞在压力超负荷诱导的心脏纤维化中的作用支持了这一假设(Yu et al.,2006)。

发明内容

本发明的发明人鉴定出涉及压力超负荷引起的HF的免疫介质，且发现T细胞浸润病理性肥厚心肌，与其在持续性炎症中的作用一致。事实上，炎症是区分病理性心脏肥大和运动训练期间发生的生理性“良性”心脏肥大的关键因素。

鉴于T细胞的存在，发明人利用阿巴西普(abatacept)-一种FDA批准的CTLA4-Ig融合蛋白(以商品名销售)阻断T细胞共刺激，选择性抑制促炎性T细胞的功能(Moreland et al.,2006)，显著减轻HF模型小鼠钝性心功能不全。阿巴西普通过依赖于抗炎细胞因子白细胞介素-10(IL-10)的机制抑制T细胞活化并减少心脏T细胞浸润，从而减少心肌细胞死亡。总之，本发明的发明人发现T细胞参与病理性心脏肥大的发展并且干扰其活化，利用如现有的临床验证的方法，有可能成为心力衰竭的治疗选择。

发明的详细描述

因此，本发明的一个目的是提供一种T细胞共刺激和/或激活和/或功能性的抑制剂，用于治疗和/或预防心脏病，优选心力衰竭疾病和/或相关症状。优选地，所述抑制剂是促进T细胞共刺激的至少一种分子的抑制剂。更优选地，所述抑制剂增加了心脏中的IL-10水平。IL-10水平是指mRNA或蛋白质水平。在本发明的一个优选实施方案中，所述抑制剂包含或由选自下组中的至少一种分子组成：CTLA4、PD-1、PD-L1或PD-L2、BTLA、CD160、LAG-3、2B4、B7-H3、B7-H4、B7S3、BTNL2、阻断抗CD28抗体、其功能片段，其功能衍生物或其功能类似物。优选地，促进T细胞共刺激的分子选自下组中的至少一种分子：B7-1和B7-2(也称为CD80和CD86)、CD40、CD40L(也称为CD154)、OX40、OX40L、CD30、CD30L、4-1BB、4-BB、GITR、GITR配体、LIGHT、CD27、CD45RB、CD2、LFA-3、B7-H3、B7-H4、ICOS和ICOS配体。在本发明的一个优选实施方案中，所述抑制剂选自下组中的至少一种分子：阻断抗体或其功能片段、或小分子抑制剂或多核苷酸。优选地，所述抑制剂是包含或由CTLA4或其功能片段或其功能衍生物或其功能类似物组成的分子。更优选地，抑制剂是CTLA4-Ig分子或其功能片段或功能衍生物或其功能类似物。优选地，所述CTLA4-Ig分子是一个融合蛋白，其包括含有与CTLA4细胞外结构域相对应的氨基酸残基的第一氨基酸序列和含有免疫球蛋白IgG1的Fc区的第二氨基酸序列。更优选地，所述CTLA4-Ig分子包括或基本上由SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或其功能片段或其功能衍生物或其功能类似物组成。在更优选的实施方案中，所述抑制剂是阿巴西普。本发明的其他目的是提供一种编码如上定义的抑制剂的核酸分子，用于治疗和/或预防心脏病，优选心力衰竭疾病和/或相关症状；包含所述核酸或编码如上定义的抑制剂的表达载体，用于治疗和/或预防心脏病，优选心力衰竭疾病和/或相关症状；表达如上定义的抑制剂的基因工程宿主细胞或纳米颗粒或微囊泡，用于治疗和/或预防心脏病，优选心力衰竭疾病和/或相关症状。本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其包含如上定义的抑制剂，或如上定义的核酸分子，或如上定义的表达载体，或如上所定义的基因工程宿主细胞或纳米颗粒或囊泡，以及至少一种药学上可接受的载体，用于治疗和/或预防心脏病，优选心力衰竭疾病和/或相关症状。如上定义的抑制剂优选选自：

a)多核苷酸；

b)多肽；

c)编码所述多肽的多核苷酸；

d)包含或表达a)或c)所述多核苷酸的载体；

e)能够在合适条件下表达所述多肽或表达a)或c)所述多核苷酸的基因工程宿主细胞；

f)小分子；

g)抗体或其合成或重组衍生物。

心脏病病理学包括至少一种选自下组的病理学：心力衰竭疾病；心肌炎后心力衰竭；冠状动脉疾病，可能导致心脏病发作和心肌无力；原发性心肌无力，可能来自病毒感染或毒素，如长期接触酒精；心脏瓣膜疾病导致心肌无力，可能是由于瓣膜堵塞引起太多的血液渗漏或心肌僵硬导致的；和高血压(高血压)。所述病症罕见的原因包括甲亢(高甲状腺激素)，维生素缺乏和过量苯丙胺(“Speed”)。心脏病理学的所述相关症状优选心脏纤维化和/或呼吸短促(呼吸困难)和/或心脏引起的哮喘(心源性哮喘)和/或在全身(全身)循环或在肝脏(门静脉)循环中血液淤积(淤积)和/或肿胀(水肿)和/或昏厥(紫绀)和/或心脏肿大(肥大)。在一些实施方案中，心力衰竭不是由自身免疫引起的炎症性心肌病。在一些实施方案中，心力衰竭不是由对感染的免疫应答引起的炎症性心肌病。这种感染如病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，心力衰竭不是由自身免疫或由对感染的免疫应答引起的炎症性心肌病(例如：不是由对病毒感染的免疫应答引起的)。

在本发明的上下文中，“T细胞活化抑制剂”是指能够抑制或减少T细胞活化的试剂。本发明中，“活化”定义为T细胞通过其T细胞受体(例如通过与主要组织相容性分子复合的抗原，或通过抗CD3抗体)接收的刺激信号(也称为“信号1”)，它本身不足以在初始T细胞中驱动T细胞应答。对于完全功能性T细胞应答，需要第二信号(也称为“信号2”)，其不依赖于抗原并且共刺激T细胞受体。本发明中，该第二信号被称为“共刺激”。关于共刺激的定义的更多详情，参见A Sharpe 2009Immunological Reviews2009:229(1):5-11。

在被激活和共刺激后，T细胞表现出活化的(或功能性)T细胞的表型。“活化的(或功能性)T细胞”描述了T细胞或B细胞表现出以下一些表型：T细胞活化可以通过不限于以下的方法测定：CD69、CD25、HLA-DR、CD62L和/或CD154的表达和/或IL-2的产生、钙调动、ZAP-70磷酸化、LAT磷酸化、Lck磷酸化、NF-[κ]B活化、MEK活化、NFAT活化、Ap-I活化、T细胞增殖和细胞毒性(定义为杀死靶细胞的能力)。

在本发明的上下文中，“T细胞共刺激抑制剂”是指能够抑制或减少T细胞共刺激的试剂。在本发明的上下文中，“T细胞功能抑制剂”是指能够抑制或减少T细胞活化、共刺激、分化或功能的试剂。术语“减小”、“减少”或“抑制”是指降低指定参数(例如，至少约1.1倍、1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、甚至15倍或降低的更多)和/或指定活性的降低或减少至少约5％、10％、25％、35％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在特定的实施方案中，抑制或减少导致很少或基本上没有可检测出的活性(至多，不显著的量，例如，小于约10％或约5％)。根据本发明的抑制剂的非限制性实施例是抗体或其片段或其他配体或其片段，其特异性结合和/或抑制CD3蛋白、CD40蛋白、B7家族蛋白和/或CD28家族蛋白的活性，环孢霉素，FK504，类固醇，和/或靶向MHC-I和/或MHC-II分子的物质，免疫抑制药物，干扰素，皮质类固醇，硫唑嘌呤，环磷酰胺等的物质。还包括在转录、转录后、翻译和/或翻译后水平降低或抑制T细胞中CD3(例如OKT<(R)>3单克隆抗体)、CD40、B7和/或CD28活性的抑制剂，靶向T细胞活化转录因子的疗法，例如IKB激酶抑制剂(IKK)，其可抑制转录因子，核因子活化B细胞κ轻链增强子(NF-[κ]b)或环孢菌素，其中抑制钙调神经磷酸酶途径对转录因子的活化及活化T细胞核因子很重要。还包括巴利昔单抗(Basiliximab，抗CD25)、阿法赛特(Alefacept，LFA3-Ig融合；阻断CD2)、达利珠单抗(Daclizumab，抗CD25)、那他珠单抗(Tysabri，抗VLA4)和抗CLA4Ab。可用于本发明的其他抑制剂包括但不限于奥马珠单抗(Omalizumab，抗IgE mab；靶向肥大细胞和嗜碱性粒细胞)和鲁昔单抗(Lumiliximab，抗CD23；靶向肥大细胞和嗜碱性粒细胞)。

IL-10的前体蛋白可由NCBI登录号的序列表示：NP_000563.1GI：10835141。CTLA4可由NCBI登录号的序列表示：NP_005205.2GI：21361212和NP_001032720.1GI：83700231。PD-1可由NCBI登录号的序列表示：NP_005009.2GI：167857792。PD-L1可由NCBI登录号的序列表示：NP_001300958.1GI：930425329、NP_001254635.1GI：390979639、NP_054862.1GI:7661534。PD-L2可由NCBI登录号的序列表示：NP_079515.2GI：190014605。BTLA可由NCBI登录号的序列表示：NP_861445.3GI：145580621、NP_001078826.1GI:145580619。CD160可由NCBI登录号的序列表示：NP_008984.1GI：5901910。LAG-3可由NCBI登录号的序列表示：NP_002277.4GI：167614500。2B4可由NCBI登录号的序列表示：NP_057466.1GI:7706529、NP_001160136.1GI:262263438、NP_001160135.1GI:262263435。B7-H3可由NCBI登录号的序列表示：NP_001019907.1GI：67188443、NP_079516.1GI：13376852。B7-H4可由NCBI登录号的序列表示：NP_001240779.1GI：359718947、NP_001240778.1GI：359718944、NP_078902.2GI：99028881。B7S3可由NCBI登录号的序列表示：NP_001272892.1GI：552953846、NP_001272894.1GI：552953752。BTNL2可由NCBI登录号的序列表示：NP_001291490.1GI：752292706。

B7-1(也称为CD80)可由NCBI登录号的序列表示：NP_005182.1GI:4885123。B7-2(也称为CD86)可由NCBI登录号的序列表示：NP_001193854.1GI:332634954、NP_001193853.1GI:332634950、NP_795711.1GI:332634944、NP_787058.4GI:332634934、NP_008820.3GI:332634929。CD40可由NCBI登录号的序列表示：NP_001289682.1GI:720642787、NP_690593.1GI:23312371、NP_001241.1GI:4507581。CD40L(也称为CD154)可由NCBI登录号的序列表示：NP_000065.1GI:4557433。OX40可由NCBI登录号的序列表示：NP_003318.1GI:4507579。OX40L可由NCBI登录号的序列表示：NP_001284491.1GI:662033902、NP_003317.1GI:4507603。CD30可由NCBI登录号的序列表示：NP_001268359.2GI:597709797、NP_001234.3GI:597709795。CD30L可由NCBI登录号的序列表示：NP_001239219.1GI:356582497、NP_001235.1GI:4507607。4-1BB可由NCBI登录号的序列表示：NP_001552.2GI:5730095。4-BBL可由NCBI登录号的序列表示：NP_003802.1。GITR可由NCBI登录号的序列表示：NP_683700.1GI:23238197、NP_683699.1GI:23238194、NP_004186.1GI:4759246。GITR配体可由NCBI登录号的序列表示：NP_005083.2GI:157419142)。LIGHT可由NCBI登录号的序列表示：NP_742011.2GI:291045244、NP_003798.2GI:25952144)。CD27可由NCBI登录号的序列表示：NP_001233.1GI:4507587。CD45RB可由NCBI登录号的序列表示：NG_007730。CD2可由NCBI登录号的序列表示：NP_001758.2GI:156071472。LFA-3可由NCBI登录号的序列表示：NP_001138294.1GI:221316575、NP_001770.1GI:4502677。B7-H3可由NCBI登录号的序列表示：NP_001019907.1GI:67188443、NP_079516.1GI:13376852。B7-H4可由NCBI登录号的序列表示：NP_001240779.1GI:359718947、NP_001240778.1GI:359718944、NP_078902.2GI:99028881。ICOS(也称为B7-H2)可由NCBI登录号的序列表示：NP_036224.1GI:15029518。ICOS配体可由NCBI登录号的序列表示：NP_001269981.1GI:545688894。本发明的抑制剂优选是单克隆阻断抗体或其片段、ScFv或抑制分子的可溶性融合蛋白。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，也称为CD152，是参与免疫系统调控的蛋白质。天然存在的CTLA4在美国专利Nos.5,434,131、5,844,095及5,851,795中有描述。天然CTLA4蛋白由CTLA4基因编码。CTLA4是一种细胞表面蛋白，具有一个N-末端细胞外结构域、一个跨膜结构域和一个C-末端细胞质结构域。细胞外结构域结合和/或干扰靶抗原，例如CD80和CD86，用作T细胞刺激的自然断裂。在一些实施方案中，CTLA4分子的细胞外结构域在位置+1处以甲硫氨酸开始并且在位置+124处以天冬氨酸终止；在其他实施方案中，细胞外结构域在位置-1处以丙氨酸开始并且在位置+124处以天冬氨酸终止。

CTLA4分子是包含细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)细胞外结构域的分子。在一些实施方案中，CTLA4的细胞外结构域包括CTLA4蛋白的一部分，其识别并结合至少一种B7(CD80/86)抗原，例如B细胞和APC细胞表达的B7抗原。细胞外结构域还可以包括结合B7抗原的CTLA4的片段或衍生物。CTLA4细胞外结构域还可以识别并结合CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)。细胞外结构域还可以包括结合CD80和/或CD86的CTLA4的片段或衍生物。CTLA4分子可以是融合蛋白，其中融合蛋白定义为使用本领域熟知的方法连接在一起的一个或多个氨基酸序列。连接的氨基酸序列从而形成一个融合蛋白。在一些实施方案中，CTLA4分子至少含有免疫球蛋白的一部分，例如免疫球蛋白的Fc部分。在一些实施方案中，CTLA4分子是分离和纯化的CTLA4分子。在优选的实施方案中，T细胞共刺激抑制剂包括CTLA4的细胞外结构域，或其功能片段或其免疫活性变体。T细胞共刺激抑制剂可结合B细胞或其他抗原呈递细胞(APC)表达的B7抗原。在一些实施方案中，B7抗原在B细胞和APC上表达。在一些实施方案中，融合蛋白是阿巴西普。阿巴西普是一种可溶性融合蛋白，其由与人免疫球蛋白G1(IgG1)的经修饰的Fc(铰链，CH2和CH3结构域)部分连接的人CTLA-4的细胞外结构域组成。阿巴西普通过重组DNA技术在哺乳动物细胞表达系统中产生。阿巴西普的表观分子量为92千道尔顿。阿巴西普是由Bristol-Myers Squibb开发的，并且公开于例如美国专利5,851,795、美国专利7,455,835及美国专利Pub.2001 1/31 1529。阿巴西普选择性地结合CD80和CD86，从而阻断与CD28的相互作用并干扰T细胞活化。阿巴西普抑制初始T细胞活化，因此具有选择性抑制T细胞对特定抗原的反应而非广泛免疫抑制的潜能。在一些实施方案中，组合物进一步包括油基载体，比如油包水乳液(例如IFA或Montamide ISA)。组合物可通过静脉输液给药，如在约50-200ml生理盐水中，或以约5mg/kg至约50mg/kg的剂量或以约250-2000mg的剂量，或以500mg、750mg或1000mg的剂量给药。

药物的剂量可根据受试者和给药方式而变化，美国专利申请美国公开号US2003/0083246和美国专利申请美国公开号US 2004/0022787教导了用于治疗风湿性疾病，如类风湿性关节炎的氨基酸序列为SEQ ID NO:2的CTLA4Ig的剂量和给药方案。所有都通过引用并入本文。有效量的CTLA4Ig分子可为约0.1至100mg/kg受试者体重的量。在另一个实施方案中，有效量为约0.1至20mg/kg受试者体重的量。在一个具体的实施方案中，CTLA4Ig的有效量为约2mg/kg受试者体重的量。在另一个具体的实施方案中，CTLA4Ig的有效量是约10mg/kg受试者体重的量。在另一个具体的实施方案中，对于体重小于60kg的受试者CTLA4Ig的有效量为500mg，对于体重在60-100kg之间的受试者为750mg，对于体重超过100kg的受试者为1000mg。根据需要，可以每天、每周、每月和/或每年以每小时/每天/每周/每月/每年单次或多次向受试者施用有效量的CTLA4Ig分子。例如，在一个实施方案中，有效量的CTLA4Ig分子最初可以每两周施用一次持续一个月，然后每月施用一次。本发明的CTLA4Ig分子的给药可通过30分钟至一小时或多小时的静脉输液。或者，单次或多次皮下注射可提供所需的剂量。通常，30分钟的静脉输液是在治疗的早期阶段使用的给药途径。剂量可以在初始剂量后重复2周和4周，然后每4周一次。可单独给药或除TNF拮抗剂外的疾病调节药物一起给药。皮下注射是维护阶段使用的典型给药方式。例如，在单次静脉输液作为负荷剂量后(根据上述体重类别)，可在一天内通过皮下注射给药125mg，然后每周一次皮下注射125mg。无法接受输液的患者可在没有静脉负荷剂量的情况下每周一次皮下注射。从静脉治疗转变为皮下施药的患者可施用第一次皮下剂量而非下次预定的静脉剂量。

阿巴西普单体包含一个CTLA4-Ig多肽，序列如下：

MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1)

CTLA4的细胞外结构域对应于SEQ ID NO：1的1-125位氨基酸。CTLA4功能衍生物包括其突变体。CTLA4-Ig分子可具有野生型或突变体序列，例如，关于CTLA4细胞外结构域和免疫球蛋白恒定区序列。CTLA4-Ig单体分子包含一个人CTLA4细胞外结构域。在一个实施方案中，细胞外结构域包含SEQ ID NO：1的89-463位核苷酸的核苷酸序列，如EP1962886中公开的编码SEQ ID NO：1的序列。在另一个实施方案中，细胞外结构域包含人CTLA4的突变序列。在另一个实施方案中，细胞外结构域包含如EP1962886中公开的SEQ ID NO：1的89-463位核苷酸的核苷酸变化，从而进行保守氨基酸改变。在另一个实施方案中，细胞外结构域包含与EP1962886中公开的SEQ ID NO：1的89-463位核苷酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在一个实施方案中，CTLA4-Ig单体分子包含一个修饰的人IgG1铰链区(如EP1962886中公开的SEQ ID NO：1的464-508位核苷酸；SEQID NO：2的152-166位氨基酸)，其中SEQ ID NO：1的氨基酸残基156、162和165处的丝氨酸由野生型序列中的半胱氨酸改造而成。CTLA4突变体包含天然CTLA4蛋白或SEQ ID NO：1中至少一个氨基酸修饰。在该实施方案中，在以下一个或多个位置进行一个或多个修饰(如SEQID NO：1的编号)：29、30、31、33、35、49、51、53、59、61、63、64、93、95、97、98、102、103、104、105或106。在一些实施方案中，修饰为以下一个或多个替换：A29E、A29F、A29H、A29、A29N、A29Q、A29R、T30E、T30H、T30R、T30V、E31D、E31I、E31M、E31T、E31V、R33E、R33F、R331、R33L、R33M、R33Q、R33T、R33W、R33Y、T35D、T35E、T35F、T35M、T35V、T35Y、A49D、A49E、A49F、A49T、A49W、A49Y、T51D、T51E、T51H、T51L、T51N、T51Q、T51R、T51S、T51V、M53E、M53F、M53H、M53Q、M53W、M53Y、T59H、T59I、T59L、T59N、T59Q、T59V、T59Y、L61A、L61D、L61E、L61F、L61G、L61H、L61I、L61K、L61M、L61N、L61P、L61Q、L61R、L61S、L61T、L61V、L61W、L61Y、D63E、S64K、S64R、S64Y、K93D、K93E、K93F、K93H、K93N、K93Q、K93R、K93S、K93T、K93V、K93W、K93Y、E95D、E95H、E95L、E95Q、E95Y、M97D、M97F、M971、M97N、M97V、Y98F、Y98W、Y102F、Y102W、Y103D、Y103E、Y103F、Y103H、Y103N、Y103Q、Y103W、L104F、L104H、L104M、LI 04V、L104Y、G105D、G105E、I106E及I106Y。在一些实施方案中，CTLA4突变体具有选自A29H、T51N、M53Y、L61E和K93Q的一个或多个替换，具有特殊用途的替换组合包括A29H/K93Q、A29H/M53Y、A29H/T5IN、T51N/K93Q、T51N/M53Y、A29H/L61E/K93Q、A29H/M53Y/K93Q、A29H/M53Y/L61E、A29H/T51N/L61E、M53Y/L61E/K93Q、T51N/L61E/K93Q、T51N/M53Y/L61E、A29H/M53Y/L61E/K93Q、A29H/T51N/L61E/K93Q、A29H/T51N/M53Y/K93Q、A29H/T51N/M53Y/L61E、T51N/M53Y/L61E/K93Q以及A29H/T51N/M53Y/L61E/K93Q。可对各个替换进行任何组合，可从可能性列表中独立地包括或排除任何和所有可能的组合及各个位置或替换。一般而言，与野生型或亲本CTLA4(或Fc区)相比，通常本发明的突变体在CTLA4区具有1、2、3、4或5个氨基酸替换，尽管有时需要更多的替换，只要保留所需的功能即可。类似地，Fc结构域也可以以这种方式进行替换。CTLA4突变体通常保留或增强与一种或多种CTLA4配体的结合，例如增强与B7-1和/或B7-2的结合。Fc部分由抗体的Fc区或Fc区的一部分组成。在某些实施方案中，多肽是CTLA4和抗体的Fc区融合的蛋白质。如本文所用的“Fc”或“Fc区”是指包含抗体恒定区的多肽，其不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域和在一些情况下是铰链的部分。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的N-末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可能包括J链。本文所用的“Fc多肽”是指包含Fc区的全部或部分的多肽。Fc多肽包括抗体，Fc融合、分离的Fc和Fc片段。CTLA4蛋白可通过连接体与Fc区连接。术语“连接体”用于表示包含通过肽键连接的两个或多个氨基酸残基的多肽及用于连接一个或多个抗原结合部分。本文所述的一些实施方案中的多种连接体可将Fc区与融合配体共价连接。本文中的“连接体”也称为“连接体序列”、“间隔区”、“系链序列”或其语法同等成分。多种方法可将分子共价连接在一起。这些方法包括但不限于蛋白质或蛋白质结构域的N-和C-末端之间的多肽连接，通过二硫键的连接及通过化学交联剂的连接。在该实施方案的一个方面，连接体是通过重组技术或肽合成产生的肽键。连接体肽主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。连接体肽应具有足以连接两个分子的长度，使得它们彼此间呈现正确的构象以保持所需的活性。在一个实施方案中，连接体的长度约为1至50个氨基酸，优选长度约为1至30个氨基酸。在一个实施方案中，可使用长度为1-20个氨基酸的连接体。有用的连接体包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n，其中n是至少为1的整数，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性接接体。或者，各种非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，可用作连接体，可用作连接体。

本文公开的CTLA4-Ig蛋白可包含一个CTLA4突变体、一个Fc区突变体，或CTLA4突变体和Fc区突变体两者。突变体包含相对于亲本CTLA4-Ig蛋白的一个或多个氨基酸修饰，其中氨基酸修饰提供一种或多种所述特性。氨基酸修饰可以是多肽序列中氨基酸的替换、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸替换”或“替换”是指用另一种氨基酸取代亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。本文所用的“氨基酸插入”或“插入”是指在亲本多肽序列的特定位置加入氨基酸。本文所用的“氨基酸缺失”或“缺失”是指去除亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。抗体Fc区在重链的恒定区的保守位置含有糖类。每种抗体同种型具有不同种类的N-连接糖类结构。除了与重链连接的糖类外，高达30％的人IgG具有糖基化的Fab区域。IgG的CH2结构域具有一个单N-连接双触角糖类Asn297。对于来自血清或离体杂交瘤产生的或工程细胞的IgG，IgG相对于Asn297连接的糖类是异质的。对于人IgG，核心寡糖通常由GlcNAc2Man3GlcNAc组成，具有不同数量的外部残基。术语“CTLA4-Ig”或“CTLA4-Ig分子”或“CTLA4Ig分子”或“CTLA4-Ig融合蛋白”或“CTLA4-Ig蛋白”可互换使用，是指包含至少一种具有CTLA4细胞外结构域或其部分或其衍生物和免疫球蛋白恒定区或其部分或其衍生物的多肽的蛋白质分子。细胞外结构域和免疫球蛋白恒定区可以是野生型，或突变体或经修饰的，和哺乳动物，包括人或小鼠。多肽可进一步包含另外的蛋白质结构域。CTLA4-Ig分子也可指多肽的多聚体形式，例如二聚体、四聚体和六聚体。CTLA4-Ig分子也能结合CD80和/或CD86。术语“B7-1”是指CD80；术语“B7-2”是指CD86；术语“B7”是指B7-1和B7-2(CD80和CD86)。术语“B7-1-Ig”或“B7-Ig”是指CD80-Ig；术语“B7-2-Ig”或“B7-2Ig”是指CD86-Ig。

共刺激的介质和共刺激的抑制剂是指正面或负面影响T细胞共刺激过程的分子，如(Sharpe，2009)和(Pilat et al.,2012)所述。在一个实施方案中，“CTLA4Ig”是指具有残基的氨基酸序列的蛋白质分子：(i)SEQ ID NO：2的26-383位，(ii)SEQ ID NO：2的26-382位；(iii)SEQ ID NO：2的27-383位，或SEQ ID NO：2的(iv)27-382位，或任选的SEQ ID NO：2的(v)25-382位，或SEQ ID NO：2的(vi)25-383位。在单体形式中，这些蛋白质在本文中可称为“SEQ ID NO：2单体”，或“具有SEQ ID NO：2序列”的单体。这些SEQ ID NO：2单体可二聚化，使得二聚体组合可包括例如：(i)和(i)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)和(iv)；(i)和(v)；(i)和(vi)；(ii)和(ii)；(ii)和(iii)；(ii)和(iv)；(ii)和(v)；(ii)和(vi)；(iii)和(iii)；(iii)和(iv)；(iii)和(v)；(iii)和(vi)；(iv)和(iv)；(iv)和(v)；(iv)和(vi)；(v)和(v)；(v)和(vi)；(vi)和(vi)。这些不同的二聚体组合可彼此结合形成四聚体CTLA4Ig分子。这些单体、二聚体、四聚体和其他多聚体在本文中可称为“SEQ ID NO：2蛋白质”或“具有SEQ ID NO：2序列”的蛋白质。SEQ ID NO：2序列在如WO/2007/076354和WO/2002/002638中公开，其包括：MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:2)。相应的核苷酸序列在WO/2002/002638中公开。如本文所用的“阿巴西普”优选是指SEQ ID NO：1蛋白质。本文所用术语“心力衰竭”还包括“充血性心力衰竭(CHF)”、“慢性心力衰竭”、“急性心力衰竭”，并且指心脏不能以充足的速率泵血的任何情况或存在左心室充盈压增加的情况。当心脏在正常充盈左心室压力下无法充分泵血到身体的其他部位时，血液可回流到肺部，导致肺部充满液体。心力衰竭的典型症状包括呼吸短促(呼吸困难)，疲劳，虚弱，平躺时呼吸困难，以及腿部、脚踝或腹部肿胀(水肿)。心力衰竭的原因与各种疾病有关，包括冠状动脉疾病、系统性高血压、心肌病或心肌炎、先天性心脏病、心脏瓣膜异常或瓣膜性心脏病、严重的肺病、糖尿病、重度贫血甲状腺功能亢进、心律不齐或节律异常和心肌梗死。在正常(>50％)或减少(<50％)左心室射血分数的情况下可发生心力衰竭。人们越来越认识到这两种情况代表两种不同的疾病状态，而不是一个连续体(Borlaug BA,Redfield MM.Circulation.2011May 10；123(18):2006-13)。

根据本发明的心力衰竭包括显性和/或晚期心力衰竭。在显性心力衰竭中，受试者表现出本领域技术人员已知的心力衰竭症状。HF可分为不同的严重程度。根据NYHA(NewYork Heart Association，纽约心脏协会)分类，心力衰竭患者被归类为属于NYHA I、II、III和IV类。患有心力衰竭的患者已经经历了他的心包膜、心肌、冠脉循环或心脏瓣膜的结构和功能的改变。他无法完全恢复健康，需要进行有疗效的治疗。NYHA I级患者没有明显的心血管疾病症状，但已有功能障碍的客观证据。NYHA II级患者的肢体活动受到轻微限制。NYHA III级患者表现出明显的肢体活动限制。NYHA IV级患者在没有不适的情况下无法进行任何肢体活动。他们在休息时表现出心功能不全的症状。该功能分类由美国心脏病学会和美国心脏协会的最新分类补充(参见J.Am.Coll.Cardiol.2001；38；2101-2113,2005年更新，参见J.Am.Coll.Cardiol.2005；46；e1-e82)。定义了A，B，C和D四个时期。A期和B期不是HF，而被认为在早期发展为“真正的”HF前帮助识别患者。A期和B期患者最好定义为具有HF发展风险因素的患者。例如，患有冠状动脉疾病、高血压或糖尿病但尚未表现出左心室(LV)功能受损、肥大或几何室变形的患者被视为A期，而无症状但表现出LV肥大和/或LV功能受损的患者被视为B期。然后C期表示患有与潜在结构性心脏病相关的HF的当前或过去症状的患者(大部分患有HF的患者)，并且D期表示患有真正难治疗的HF的患者。术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用，且在本文中以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体和抗体模拟物结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、纳米抗体、抗体衍生物、抗体片段、anticalins、DARPins、affibodies、affilins、affimers、affitins、alphabody、avimers、fynomers、monobodies和其他结合域，只要它们呈现所需的抗原结合活性。“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含与完整抗体结合的抗原结合的完整抗体的一部分。

抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。VH或VL Fvs也称为“纳米抗体”。

术语“抗体模拟物”是指那些不是抗体衍生物但可以像抗体一样特异性结合抗原的有机化合物或结合结构域。它们包括anticalins、(达平斯)DARPins、affibodies、affilins、affimers、affitins、alphabody、avimers、fynomers、monobodies等。术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种的抗体，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同来源或物种。

本发明的抗体可以是任何类型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM5、IgA、IgD和/或IgE。

在本发明的上下文中，术语“多核苷酸”包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA、siRNA、shRNA)和利用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。多核苷酸可以是单链或双链的。可以利用寡核苷酸类似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸酯核苷酸)合成多核苷酸。术语多核苷酸和多肽还包括其衍生物和功能片段。“衍生物”可以是核酸分子，作为DNA分子，编码如上定义的多核苷酸，或包含如上定义的多核苷酸的核酸分子，或互补序列的多核苷酸。在本发明的上下文中，术语“衍生物”还指与提及的序列或其互补序列或其DNA或RNA对应序列具有例如至少41％、50％、60％、65％、70％或75％，更优选至少85％，例如至少90％，甚至更优选至少95％或100％的同一性百分比的更长或更短的多核苷酸和/或多肽。术语“衍生物”和术语“多核苷酸”还包括修饰的合成寡核苷酸。术语“衍生物”还可包括核苷酸类似物，即天然存在的核糖核苷酸或被非天然存在的核苷酸取代的脱氧核糖核苷酸。术语“衍生物”还包括可通过突变其序列、等同物或前体序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸产生的核酸或多肽。术语“衍生物”还包括多核苷酸的至少一个功能片段。

本发明中提到的蛋白质还包括由相应的直系同源或同源基因、其功能性突变体、其功能性衍生物、其功能片段或类似物、其亚型编码的相应蛋白质。

本文所用的术语“类似物”是指蛋白质，指经修饰的肽，其中该肽的一个或多个氨基酸残基已被其他氨基酸残基置换和/或其中一个或多个氨基酸残基已从该肽中删除和/或其中一个或多个氨基酸残基已加入该肽中。氨基酸残基的这种添加或缺失可在肽的N-末端和/或肽的C-末端发生。

本文所用的与蛋白质有关的术语“衍生物”是指经化学修饰的肽或其类似物，其中至少一个取代基不存在于未经修饰的肽或其类似物中，即指已经经共价修饰的肽。典型的修饰是酰胺、糖类、烷基、酰基、酯等。如本文所用，术语“衍生物”还指与上述定义的蛋白质或与直系同源或同源基因编码的相应区的氨基酸序列具有例如至少41％，优选至少41.5％、50％、54.9％、60％、61.2％、64.1％、65％、70％或75％，更优选至少85％，例如至少90％，甚至更优选至少95％的同一性百分比的更长或更短的的多肽。术语“衍生物”还包括可通过突变其序列，等同物或前体序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸而产生的核酸或多肽。术语“衍生物”还包括蛋白质的功能性突变体。

在本发明中，蛋白质的“功能性突变体”是通过突变其序列中的一个或多个氨基酸并维持其活性例如抑制T细胞共刺激的能力而产生的突变体。实际上，如果需要，本发明中定义的蛋白质可在体外和/或体内修饰，例如通过糖基化、豆蔻酰化、酰胺化、羧化或磷酸化，并且可通过例如本领域已知的合成或重组技术获得。

在本发明中，“功能性”是指例如“维持其活性”，例如抑制T细胞共刺激的能力。

如本文所用“片段”，是指具有优选长度为至少10个氨基酸，更优选至少15个、至少17个氨基酸或至少20个氨基酸，甚至更优选至少25个氨基酸或至少37或40个氨基酸，更优选至少50个、或100个、或150个或200个或250个或300个或350个或400个或450个或500个氨基酸的多肽。

根据本发明，组合物的“有效量”是足以达到期望的生物学效果的量，在本文中是心脏病理的改善或治疗。

可以理解，有效剂量将取决于接受者的年龄、性别、健康和体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效果的性质。所提供的本发明的抑制剂或分子的有效剂量范围(例如，从1mg/kg到100mg/kg，特别是全身给药)并非旨在限制本发明，而是代表优选的剂量范围。然而，优选的剂量可以针对个体受试者定制，如本领域技术人员所理解和确定的，无需过多的实验。

本发明的多核苷酸的给药可通过已知方法进行，其中在体外或体内将核酸引入期望的靶细胞中。

本发明的一个方面包括包含在递送载体内的核酸构建体。递送载体是可将核苷酸序列从至少一种介质转运到另一种介质的实体。递送载体通常可用于表达核酸构建体内编码的序列和/或用于该构建体的细胞内递送。在本发明的范围内，递送载体可以是从基于RNA的载体、DNA的载体/载体、脂质的载体、病毒的载体和、细胞的载体的组中选择的载体。此类递送载体的实例包括：可生物降解的聚合物微球，基于脂质的制剂，例如脂质体载体，将构建体涂覆到胶体金颗粒上，脂多糖，多肽，多糖，病毒载体的聚乙二醇化。

在本发明的一个实施方案中，可以包含病毒作为递送载体，其中病毒可以选自：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、泡沫病毒、巨细胞病毒、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)、痘病毒、RNA病毒载体和DNA病毒载体。此类病毒载体是本领域熟知的。

常用的基因转移技术包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖、转染、电穿孔和显微注射以及病毒方法。将DNA导入细胞的另一种技术是使用阳离子脂质体。可商购的阳离子脂质制剂例如Tfx 50(Promega)或Lipofectamin 2000(Life Technologies)。

上述药物组合物优选用于全身、口服、局部、优选直肠或局部给药。

本发明的组合物可以是溶液形式，例如可注射溶液、乳膏、软膏、片剂、悬浮液等。该组合物可以以任何合适的方式给药，例如通过注射，特别是通过眼内注射，通过口服、局部、鼻、直肠应用等。载体可以是任何合适的药物载体。优选地，使用能够增加多核苷酸进入靶细胞的功效的载体。这种载体的合适实例是脂质体，特别是阳离子脂质体。

本发明的表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括那些设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者兼具，例如质粒和病毒。本发明的重组表达载体可以使用标准的重组DNA技术制备。可以制备环状或线性的表达载体构建体以包含在原核或真核宿主细胞中发挥功能的复制系统。复制系统可源自例如CoIEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。

理想地，重组表达载体包含调控序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，这些密码子对于载体被引入的宿主类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)是特异性的，并适当的考虑载体是基于DNA还是基于RNA。重组表达载体可包括一个或多个标记基因，其允许选择转化或转染的宿主。标记基因包括杀菌剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型等。用于本发明表达载体的合适的标记基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组胺醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。重组表达载体可包含与编码抑制剂的核苷酸序列(包括其功能部分和其功能变体)可操作地连接的天然或标准启动子，或与编码抑制剂的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择，例如强、弱、诱导型、组织特异性和发育特异性，在技术人员的普通技术范围内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员的技能范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。本发明的重组表达载体可以设计用于瞬时表达，稳定表达或两者兼有。而且，重组表达载体可用于组成型表达或用于诱导型表达。

本发明的药物组合物包括适于口服、直肠、局部、吸入(例如通过喷雾剂)、口腔(例如舌下)、阴道、肠胃外(例如皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部和透皮给药，尽管在任何给定情况下最合适的途径将取决于本领域众所周知的因素，如受试者的种类、年龄、性别和总体状况，所治疗病症的性质和严重程度和/或所施用的特定组合物(即剂量、制剂)的性质。适合口服给药的药物组合物可以以离散单元存在，例如胶囊、扁囊剂、含糖锭或片剂，每个单元都含有预定量的本发明的抑制剂；作为粉末或颗粒；作为水溶液或悬浮液或非水溶液；或作为水包油或油包水乳液。口服递送可通过将本发明的抑制剂与能够承受动物肠道内消化酶降解的载体复合来进行。这种载体的实例包括本领域已知的塑料胶囊或片剂。这种制剂通过任何合适的药学方法制备，其包括将组合物与合适的载体(其可含有一种或多种如上所述的辅助成分)结合起来的步骤。适合于口腔(舌下)给药的药物组合物包括在有味道的基质中含本发明组合物的含糖锭，通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶；以及在惰性基质中含有本发明组合物的锭剂，如明胶、甘油或蔗糖和阿拉伯胶。适合于肠胃外给药的本发明的药物组合物，可包含本发明组合物的无菌水和非水注射溶液，该制剂优选与预期接受者的血液等渗。这些制剂可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，这些物质使组合物与预期接受者的血液等渗。水性和非水性无菌悬浮液、溶液和乳液可包括悬浮剂和增稠剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。还可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。组合物可单位剂量或多剂量存于容器中，例如，在密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以冷冻干燥(冻干)条件储存，仅需要添加无菌液体载体，例如，在立即使用前注射生理盐水或注射用水。临时注射溶液和悬浮液可由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。例如，可以提供在密封容器中的单位剂型的本发明的可注射的、稳定的无菌组合物。该组合物可以以冻干物的形式提供，所述冻干剂可以与合适的药学上可接受的载体重构，以形成适于注射入受试者的液体组合物。单位剂型可以是约0.1μg至约10克本发明的组合物。通常，用于肠胃外施用本文所述化合物的患者剂量为约1mg/天至约10,000mg/天，更通常为约10mg/天至约1,000mg/天，最通常为约50mg/天至约500mg/天。就患者体重而言，通常的剂量范围为约0.01至约150mg/kg/天，更通常为约0.1至约15mg/kg/天，最通常为约1至约10mg/kg/天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。

当组合物基本上不溶于水时，可以包含足够量的生理学上可接受的乳化剂以使组合物在含水载体中乳化。一种这样有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。适于直肠给药的药物组合物优选作为单位剂量栓剂提供。这些可以通过将组合物与一种或多种常规固体载体(例如可可脂)混合，然后将所得混合物成型来制备。适于局部施用于皮肤的本发明药物组合物优选采用软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾、气溶胶或油的形式。可以使用的载体包括但不限于凡士林、-羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮增强剂及其两种或更多种的组合。在一些实施方案中，例如，可以通过将本发明的药物组合物与能够进入皮肤的亲脂试剂(例如，DMSO)混合来进行局部给药。适合于透皮给药的药物组合物可以采用离散贴剂的形式，该贴剂适于与受试者的表皮长期保持密切接触。适用于透皮给药的组合物也可通过离子电渗疗法给药(参见，例如，-Pharmaceutical Research 3:318(1986))，并且通常采取本发明组合物的任选缓冲水溶液的形式。此外，本发明的组合物可以口服、鼻内、肠胃外(例如，静脉注射)、肌内注射、腹膜内注射、透皮、体外、局部等给药。根据受试者的种类、年龄、体重和一般情况、所使用的特定核酸或载体，其给药方式等，如上定义的所需核酸或载体的确切量将因受试者而异。因此，不可能为每种核酸或载体指定精确的量。然而，本领域普通技术人员仅使用给定本文教导的常规实验可确定适当的量。在上述组合物中，进一步的材料以及加工技术等可列于宾夕法尼亚州伊斯顿市马克出版公司雷明顿医药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)的第5部分，第20版，2000年，通过引用并入本文。本发明化合物还可以以持续释放形式或从持续释放药物递送系统给药。代表性持续释放材料的描述也可以在雷明顿医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)的混合材料中找到。此外，药物制剂可以使用制药领域通常已知的方法制备。根据本发明使用的药物组合物可以进一步包含有效量的至少另一种治疗剂。赛治疗剂可以是以下一种或多种：b-阻断剂、利尿剂、醛固酮拮抗剂、ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、利尿剂、洋地黄、磷酸二酯酶抑制剂、肼屈嗪和硝酸异山梨酯或施用机械支持物。在本发明中，当本发明的分子与另一种治疗剂一起给药时，可同时或依次给药。

T细胞活化可通过不限于以下的方法测定：检测和/或定量细胞表面标志物的蛋白质和/或mRNA，这些标志物例如CD69、CD25、HLA-DR、CD62L、CD154和/或IL-2的产生、钙动员、ZAP-70磷酸化、LAT磷酸化、Lck磷酸化、NF-[κ]B活化、MEK活化、NFAT活化、Ap-I活化、T细胞增殖和细胞毒性(后者仅针对CD8⁺T细胞)(定义为杀死靶细胞的能力)。可检测上述分子在蛋白质蛋白质和/或mRNA水平上的量的变化，由此，其量的增加或减少可分别识别T细胞随时间的活化的增加或减少。

在优选的实施方案中，根据本发明的载体是选自下组的表达载体：质粒、病毒颗粒和噬菌体。优选地，所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞，优选为动物细胞，更优选为人细胞。如本文所用，术语“基因工程宿主细胞”涉及用多核苷酸或前述载体转导、转化或转染的宿主细胞。作为适当的宿主细胞的代表性实例，可以列举细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌、鼠伤寒沙门氏菌，真菌细胞例如酵母，昆虫细胞例如Sf9，动物细胞例如CHO或COS，植物细胞等。根据本文的教导，选择合适的宿主被认为在本领域技术人员的范围内。优选地，所述宿主细胞是动物细胞，最优选是人细胞。

在一个优选的实施方案中，上述定义的抑制剂与至少一种治疗剂组合，优选至少一种：b-阻断剂、利尿剂、醛固酮拮抗剂、ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、利尿剂、洋地黄、磷酸二酯酶抑制剂、肼屈嗪和硝酸异山梨酯、机械支持物。

在本发明中，受试者(或患者)是哺乳动物，优选为人。

现在将通过参考以下附图的非限制性实施例来说明本发明。

附图说明

图1.小鼠肥厚左心室炎性特征的表征。C57BL6/J小鼠左心室炎症介质的基因表达分析(TaqMan实时qPCR)。假手术对照小鼠(白色条)和TAC实验小鼠(黑色条)在术后1周和4周时的相对mRNA表达，以18s rRNA的表达内部标准化。TAC组在TAC处理后1周，Tnfa、Il6、Tgfb1、Ccl2、Ccl4、Ccl5、Cxcl10、Cxcl11和先天细胞标志物Itgam(CD11b)的水平与假手术组相比显著升高。术后四周，Il 4和T细胞标志物Cd3e明显升高。值是平均值±SEM(n＝7-9)。双因素方差分析，Bonferroni后检验：*，p值<0.05；**，p值<0.01；***，p值<0.001。

图2.炎症与心脏功能障碍之间的关联。心脏功能障碍指数(HDI)绘制在y轴上，计算为(-1)×(％缩短分数)，对于本研究中分析的所有小鼠模型(标准化为其匹配对照组)与x轴上的炎症指数，计算为促炎细胞因子IL-6的mRNA水平除以抗炎细胞因子IL-10的mRNA水平。每个点代表一只小鼠的数据。较大的点表示每组的平均值，而阴影的椭圆表示与平均值的一个标准偏差。将HDI值标准化以避免菌株背景特异性变化。健康是指假手术对照(PBS处理的)动物。HF的TAC模型是指TAC处理的对照(PBS处理的)小鼠。用以下公式计算每只小鼠的HDI的标准化：[[样品的HDI-匹配对照的平均HDI]/匹配对照的平均HDI]。以下组用作标准化的匹配对照：对于处理后1或4周的TAC处理的小鼠：处理前的假手术小鼠(基础读数)；对于健康小鼠(假手术)：在手术前进行假手术(基础读数)；对于Akt转基因：野生型对照；对于跑动小鼠：同类久坐的小鼠。

图3.T细胞浸润衰竭的左心室。(A)4周时假手术和TAC小鼠的左心室的T细胞标记物CD3e(棕色着色)的代表性免疫组织化学(IHC)染色。原始放大倍数10X；bars＝200μm。(B)IHC分析概要。值是平均值±SEM(n＝6)。非配对t检验：**，p值<0.01。(C)手术后1周，对TAC处理的小鼠进行T细胞标记物CD3e(棕色着色)染色。原始放大倍数10X；bar＝200μm(D)CD3e+细胞的代表性FACS分析，其在TAC处理后1周从小鼠的心脏细胞悬浮液富集淋巴细胞-M梯度。(E)在TAC或假手术后2天收集纵隔(心脏引流)淋巴结、腹股沟淋巴结和脾脏，染色并通过流式细胞术分析。将CD3e+细胞上表面的CD25的平均荧光强度绘制为平均值±SEM；假(白色条)，TAC(黑色条)(n＝4)。非配对t检验*，p值<0.05。(F)对来自健康心室组织供体(n＝3)，在放置左心室辅助装置(HF LVAD 1M)之前(n＝4)的来自由于核纤层蛋白A/C突变导致的扩张型心肌病患者，在放置左心室辅助装置(HF LVAD 2M)(n＝2)之前来自由于核纤层蛋白A/C突变和肌联蛋白突变导致的严重扩张型心肌病患者的心脏活组织进行代表性Azan三色染色。蓝色(较暗)区域表示胶原沉积(原始放大率，20X；bar＝100μm)。(G)在感兴趣的相同区域中胶原沉积的统计分析。值是平均值±SEM。Fisher精确检验是否存在纤维化：*，p值<0.05；**，p值<0.01。胶原蛋白的量也与HF的程度呈正相关(单因素方差分析与线性趋势后检验：p<0.001)。(H)与(F)中相同的样品的T细胞标记物CD3e(棕色着色；即右侧组中“严重心力衰竭”的棕色/深色斑点)的代表性染色。(I)CD3e IHC的统计分析。值是平均值±SEM。单因素方差分析及Dunn后检验：*，p值<0.05。(J)在感兴趣的相同区域中，来自健康心室组织(n＝3)的心脏活检组织和由于主动脉瓣狭窄(n＝2)的HF患者用Azan三色染色的胶原沉积统计分析。值是平均值±SEM。健康的心室组织(白色条)，由于主动脉瓣狭窄的HF(黑色条)。Fisher精确检验是否存在纤维化：***，p值<0.001。(K)与(J)中相同样品的CD3e IHC分析的统计分析。健康的心室组织(白色条)，由于主动脉瓣狭窄引起的HF(黑色条)。值是平均值±SEM。Mann-Whitney检验；*，p值<0.05。

图4.阿巴西普减轻压力超负荷小鼠心脏功能障碍的发展。小鼠接受TAC或假手术；术后2天，每周三次腹腔内注射200μg阿巴西普或PBS，持续4周。有和没有阿巴西普给药下，TAC和假手术小鼠在基线时和术后1,3和4周的时间点的(A)分数缩短(％FS)、(B)射血分数(％EF)、(C)舒张期左心室内部尺寸(LVIDd)，以及(D)收缩期左心室内部尺寸(LVIDs)。数据显示每个实验组在所有时间点±SEM(n＝7-9)的平均％FS、％EF、LVIDd和LVIDs。双因素方差分析及Bonferroni后检验：P值显示在面板中。阿巴西普改善压力超负荷引起的小鼠心脏纤维化。(E)假手术或TAC术后4周，未经处理的、PBS处理的及注射阿巴西普的小鼠心脏的代表性宏观图像(比例尺＝2mm)。(F)TAC或假手术小鼠术后4周未经处理的、PBS处理的及阿巴西普处理的用Azan三色染色(n＝2)的心脏切片。感兴趣的五个相同区域(ROI)被应用于所有样品。通过图像采集软件量化胶原染色强度；绘图点表示每个ROI中胶原像素的百分比。红色条表示每个实验组中的平均胶原百分比。胶原蛋白信号高于零的ROI被认为是纤维化的。对每种处理类别的假手术组和TAC手术组运用Fisher精确检验是否存在纤维化。虚线红线将纤维化与非纤维化ROI分开。*，p值<0.05。(G-H)小鼠在手术后2周接受TAC，每周进行三次腹腔内注射200μg的阿西巴普或PBS，持续2周。在基线和术后2周和4周测量分数缩短(％FS)和(H)射血分数(％EF)。(G)在基线和术后2周和4周测量分数缩短(％FS)和(H)射血分数(％EF)。数据显示各实验组在所有时间点±SEM(n＝7)的％FS和％EF的平均值。双因素方差分析及Bonferroni后检验：***，p值<0.001。

图5.阿托卡普给药抑制TAC小鼠的免疫应答。(A)在TAC或假手术后1周收集纵隔(心脏引流)、腹股沟淋巴结和脾脏，染色并通过流式细胞术分析。将CD3e+细胞中CD25+的百分比绘制为平均值±SEM；假手术(白色条)，TAC阿西巴普(灰色条)和TAC PBS(黑色条)(n＝3-4)。单因素方差分析及Tukey后检验：*，p值＜0.05；**，p值＜0.01，***，p值＜0.001。(B)TAC小鼠术后4周，用阿巴西普或PBS处理的左心室T细胞标记物CD3e进行免疫组织化学染色的统计分析，以及染色的代表性图像(棕色着色；原始放大倍数40X；比例尺＝50μm)。将CD3e+细胞的数目绘制为平均值±SEM；TAC阿西巴普(白色条)；TAC PBS(黑色条)。非配对t检验；*，p值＜0.00(n＝2)。(C)TAC小鼠术后1周，用阿巴西普或PBS处理的左心室巨噬细胞标记物AIF-1进行免疫组织化学染色的统计分析，以及染色的代表性图像(棕色着色；原始放大倍率20X；比例尺＝100μm)。AIF-1密度绘制为平均值±SEM；TAC阿西巴普(白色条)；TACPBS(黑色条)。非配对t检验；**，p值＜0.001(n＝2)。(D)在TAC或假手术后1周，用阿巴西普或PBS处理C57BL6/J小鼠左心室的基因表达分析(TaqMan实时qPCR)。条形图显示Il6和Il10表达的相对平均值，以18s rRNA的表达内部标准化。值是平均值±SEM(假n＝5；TAC n＝8)。单因素方差分析和Dunn的后检验：*，p值<0.05；n.s.，不显著。(E-F)手术后1周，对TAC手术小鼠的心脏单细胞悬液进行染色并通过流式细胞术分析。CD11b+CD45+活细胞中的F4-80+Ly6C+的百分比(E)和CD11b+CD45+活细胞中的F4-80+Ly6C-的百分比(F)绘制为平均值±SEM；TAC阿巴西普(黑圈)；TAC PBS(黑方块)。非配对t检验；*，p值＜0.05；**，p值＜0.01(n＝4，3)。

图6.阿巴西普通过IL-10的作用减弱HF。(A)在手术后4周时，用阿巴西普或PBS处理TAC手术的IL-10K/O小鼠左心室T细胞标记物CD3e进行免疫组织化学染色。值显示平均值±SEM(n＝2)。非配对t检验；不显著(ns)。T细胞标记物CD3e的代表性染色(棕色染色；40x放大倍数图像采集；比例尺＝50μm)。(B-E)阿巴西普处理后IL-10K/O TAC小鼠未保留心脏功能。小鼠接受TAC或假手术；术后2天，小鼠每周三次腹腔内注射200μg阿巴西普或PBS，持续4周。(B)分数缩短(％FS)。(C)射血分数(％EF)。(D)舒张期左心室内部尺寸(LVIDd)。(E)收缩期左心室内部尺寸(LVIDs)。值显示平均值±SEM(n＝5-9)。双因素方差分析及Bonferroni后检验；○，与TAC野生型阿巴西普相比p值<0.05；与TAC野生型阿巴西普相比p值<0.01；与TAC野生型阿巴西普相比p值<0.001；+，与假的未处理组相比p值<0.05；●，与假的未处理组相比p值<0.01；#，与假的未处理组相比p值<0.001；§，与TAC野生型PBS相比P值＜0.01。(F)在存在阿巴西普的治疗但不存在IL-10时，减少了TAC手术小鼠的心肌细胞凋亡。在野生型和IL10K/O小鼠中，在TAC术后4周对处理小鼠的心脏进行载玻片中TUNEL染色试验，以评价心肌细胞凋亡。条形图显示TUNEL阳性细胞的平均值±SEM(n＝2)；白色条形图，阿巴西普处理的TAC手术小鼠；黑色条形图，PBS处理的TAC手术小鼠。双因素方差分析及Bonferroni后检验；*，p值＜0.05。(G-H)IL-10KO TAC手术小鼠的野生型B细胞而非T细胞转移恢复阿巴西普的治疗效果。IL-10KO小鼠接受野生型T细胞或B细胞。随后，进行TAC或假手术；术后2天，小鼠每周三次腹腔注射200μg阿巴西普或PBS，持续1周。(G)在基线和术后1周测量分数缩短(％FS)和(H)射血分数(％EF)。数据显示各实验组在所有时间点±SEM(n＝3-7)的平均％FS和％EF。双因素方差分析及Bonferroni后检验；*，IL10KO TAC阿巴西普统计数据；+，WT B细胞；#，WT TAC阿巴西普的统计数据；§，假的未处理组统计数据。

图7.阿巴西普通过抑制免疫应答(A，B)心脏功能障碍指数(HDI)(y轴)与炎症指数(x轴)减弱心脏功能障碍，如图2所示。每个点代表一只小鼠的数据。大点表示每组的平均值，而阴影椭圆表示与平均值的一个标准偏差。以下各组用作实验组的配对对照：对于TAC术后阿巴西普或PBS处理的小鼠，在术后1周(A)或4周(B)：假手术的阿巴西普或PBS处理的小鼠，手术前(基础读数)；对于健康的(假手术的PBS处理)：在手术前进行假手术PBS处理(基础读数)。CM：心肌细胞，T：T细胞，ΜΦ：巨噬细胞；APC：抗原呈递细胞。在病理性肥大中，T细胞被激活(通过其TCR)并通过CD28从表达CD80/CD86的抗原呈递细胞(巨噬细胞、B细胞、树突状细胞)接受共刺激。

由高水平的CD25所识别的T细胞的完全活化增强心脏炎症反应的慢性化。这也涉及心脏巨噬细胞的促炎作用。结果，心肌细胞凋亡增加，纤维化和心脏功能降低。阿巴西普治疗期间，该药物阻断巨噬细胞和B细胞的CD80/CD86介导的共刺激，导致抑制T细胞的活化、增殖和/或浸润。对巨噬细胞的影响(可能是直接的和间接的)导致较低的成熟和浸润。对B细胞的直接作用导致产生抗炎细胞因子IL-10，该因子也可在较小程度上由T细胞产生。由于对T细胞、B细胞和巨噬细胞的影响，即使药物在晚期给药，心脏病理的发展也被阻断。保护作用依赖于IL-10的存在。

图8.在生理性肥大模型(A)中不存在免疫介质，与久坐小鼠(久坐)相比，运动训练小鼠(跑动)左心室炎症介质的基因表达分析。条形图显示相对平均mRNA表达，以18s rRNA的表达内部标准化。Tnfa、Il6、Ccl4、Ccl5、Cxcl10、Cxcl11、Il4、Itgam(CD11b)或Cd3e的表达无显著变化，而Ccl2在训练小鼠组显著降低。值是平均值±SEM(n＝3)。非配对t检验：*，p值<0.05。(B)通过TaqMan实时qPCR对8周龄Akt转基因小鼠(Akt-Tg，白色)(n＝6)和野生型小鼠(WT，黑色)(n＝7)的左心室炎性介质的基因表达分析。条形图显示相对平均mRNA表达，以18s rRNA的表达内部标准化。Tnfa、Il6、Il1b、Tgfb1、Ccl2、Cxcl11和先天细胞标志物Itgam(CD11b)的相对表达没有增加，而Ccl4、Ccl5、Cxcl10、Il4和Cd3e则显著增加。值表示为平均值±SEM。Mann-Whitney检验：*，p值<0.05；**，p值<0.01。

图9.在心脏中心脏肥大的发展受到阿巴西普的限制。术后4周用阿巴西普或PBS处理的TAC手术小鼠的(A)心脏重量体重(mg/g)、(B)左心室体重(mg/g)、(C)心脏重量胫骨长度(mg/cm)比值。值表示为平均值±SEM(n＝5-7)。非配对t检验：*，p值<0.05。对于在相同小鼠中表达(D)β-肌球蛋白(Mhy7)、(E)脑利钠肽(Nppb)和(F)心钠素(Nppa)的基因，通过实时qPCR将相对基因表达内部归一化至18S。值是平均值±SEM(n＝5-8)。双因素方差分析与Bonferroni后检验；*，p值<0.05；**，p值<0.01。

图10.阿巴西普或人IgG同种型治疗后，非手术小鼠的心脏功能无变化。用阿巴西普或人IgG同型对照处理的非手术小鼠，或假手术小鼠，未处理的小鼠(包括用于比较)的(A)分数缩短(％FS)和(B)射血分数(％EF)。值是平均值±SEM(n＝3-5)。双因素方差分析与Bonferroni后检验；没有观察到显着差异。TAC手术小鼠在术后2天开始用阿巴西普、PBS或人IgG同种型对照处理1周的(C)分数缩短(％FS)、(D)射血分数(％EF)、(E)收缩期左心室内部尺寸(LVIDs)和(F)舒张期左心室内部尺寸(LVIDd)。值是平均值±SEM(n＝6-9)。双因素方差分析与Bonferroni后检验；*，p值<0.05；**，p值<0.01；***，p值<0.001。TAC手术小鼠在术后2天开始用阿巴西普或PBS处理2周的(G)收缩期左心室内部尺寸(LVIDs)和(h)舒张期左心室内部尺寸(LVIDd)。值是平均值±SEM(n＝7-9)。双因素方差分析与Bonferroni后检验；*，P值＜0.05。

图11.阿巴西普在体外减弱T细胞应答并诱导IL-10产生。(A)用流式细胞术检测抗-CD3活化并用20μg/ml阿巴西普或IgG同种型对照培养72小时的8周龄C57BL/6J小鼠的总脾细胞中CD3e的表达。条形图显示4个独立实验的平均值±SEM(n＝4)。单因素方差分析采用Tukey后检验进行重复测定；*，p值＜0.05；***，p值＜0.001。(B)然后分析总脾细胞产生的IL-10。分析表达IL-10的脾细胞(CD19+B细胞、CD11c+树突细胞、CD11b+单核细胞和髓样细胞、F4/80+巨噬细胞、CD3e+T细胞和CD3e+Foxp3+Treg细胞)中的特定群体频率。条形图显示3个独立实验的平均值±SEM(n＝3)。

图12.在TAC和假手术小鼠中存在调节性T细胞。在TAC或假手术后1周、4周和8周，通过实时TaqMan qPCR对C57BL6/J小鼠左心室中的调节性T细胞标记物Foxp3进行基因表达分析。条形图显示mRNA表达，以18s rRNA的表达内部标准化。值显示平均值±SEM(n＝7-9)。双因素方差分析与Bonferroni后检验；*，p值<0.05。

图13.TAC和假手术小鼠左心室IL-6和CD3e mRNA表达的线性回归。圆圈和相应的回归线：术后4周C57BL6/J TAC手术小鼠左心室Cd3e和Il6表达之间的线性回归(n＝9)。线性回归检验；p值＝0.0002。方块和相应的回归线：术后4周C57BL6/J假手术小鼠左心室Cd3e和Il6表达之间的线性回归(n＝7)。线性回归检验；p值＝0.0037。

图14.用阿巴西普或PBS处理术后4周的TAC小鼠，其左心室AIF-1免疫组织化学染色(棕色染色；原始放大倍数20X；比例尺r＝100μm)的代表性图像和统计分析。AIF-1密度绘制为平均值±SEM；TAC阿巴西普(白色条形图)；TAC PBS(黑色条形图)。非配对t检验(n＝2)。

图15.流式细胞术分析术后1周TAC手术小鼠的心脏单细胞悬液的门控策略，与图5e，5f中的数据相对应。基于正向和侧向散射对细胞进行门控，排除双联体并对活的单细胞进行门控。基于Ly6C和F4-80的表达选择和鉴定表达CD45和CD11b的细胞：Ly6C⁺F4-80^-单核细胞，Ly6C⁺F4-80⁺未成熟巨噬细胞和Ly6C^-F4-80⁺成熟巨噬细胞。

图16.用2μg/ml抗CD3和5μg/ml LPS活化8周龄C57BL/6J小鼠的总脾细胞或T细胞耗尽的脾细胞。在培养48小时后，用流式细胞术分析20μg/ml阿巴西普对IL-10合成的影响。条形图显示了3个独立实验(n＝3)总脾细胞中产生IL10细胞的百分比的平均值±SEM。单因素方差分析采用Tukey后检验进行重复测定；*，p值<0.05。

实施例

材料和方法

动物：所有程序均符合国家和欧盟立法以及机构法规。

横向主动脉缩窄(TAC)：根据(Condorelli et al.，2001)进行的程序。对8-10周龄雄性C57BL/6J小鼠(法国查尔斯河)和8-10周龄雄性C57BL6/J IL-10-/-小鼠(美国杰克逊实验室)进行TAC。所有动物在手术前通过超声心动图筛选以确定其基线。通过腹腔注射氯胺酮(100mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)的混合物以麻醉小鼠。通过第一肋间隙水平处的小切口打开胸腔。主动脉弓分离后，在主动脉周围放置8-0聚丙烯缝合线，并在其间隙扎一根27G针。立即取出针以产生具有狭窄腔的主动脉。然后用一根6-0尼龙缝合线封闭胸腔，并分别用6-0连续可吸收和尼龙缝线封闭所有肌肉和皮肤层。以无主动脉束带手术的假手术组作为对照。

超声心动图：使用带有MS550S探针“高帧”扫描头的Vevo 2100高分辨率体内成像系统(VisualSonics Fujifilm)进行超声心动图分析。用1.0％异氟烷麻醉小鼠用于M-模式成像。通过回波多普勒测定接受TAC手术的所有动物的压力梯度(60至90mm Hg)，生物力学应力指数。

阿巴西普治疗：从TAC/假手术第2天或2周开始，小鼠腹腔注射100μl PBS或在100μl PBS中的200μg CTLA-4Ig(阿巴西普)，每周3次，持续4周。

阿巴西普是一种人CTLA-4-Ig融合体，由于人和小鼠的CTLA-4的高度相似性(75％)，它在小鼠中也起作用。阿巴西普通常在小鼠(在各种病理环境中)中使用例如100-400μg/小鼠的剂量范围具有体内功效。它可以每2天给药一次。每2天200μg/小鼠(约8mg/kg)类似于类风湿性关节炎患者(8-10mg/kg)中使用的人的剂量。因此该剂量是“翻译相关的”，并且已在本文中使用。

野生型T细胞和B细胞在IL10KO小鼠中的过继转移：在AutoMACS上分别用B细胞分离试剂盒和Pan T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)从C57BL6/J雄性小鼠中分离野生型B细胞和T细胞。通过用抗小鼠CD3ε(145-2C11，BioLegend)或抗小鼠CD19(eBiolD3，eBioscience)染色来评估纯度，并通过流式细胞术分析。在基础超声心动图筛选之前，C57BL6/J IL-10KO雄性小鼠静脉内注射2·10⁶野生型T或B细胞。小鼠接受TAC手术，并在术后第2天开始注射阿巴西普。

人体活检：从患有层核纤层蛋白A/C突变导致的扩张型心肌病和心力衰竭(HFLVAD 1M)的患者中获取严重心肌病患者样本(HF LVAD)。其中一部分在肌动蛋白(HF LVAD2M)中携带第二个突变，导致更严重的扩张型心肌病。根据医院伦理委员会批准的研究方案，所有样本在知情同意后获得，如其他地方所述(Roncarati et al.，2013)。根据医院伦理委员会批准的研究方案，在知情同意后也获得主动脉狭窄心室样本。

定量RT-PCR分析：收集左心室后在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。用GentleMACS和GentleMACS M管(Miltenyi Biotec)将组织在1ml PureZol RNA分离试剂(Biorad)中匀浆。用氯仿分离水相后，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取RNA。用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems)逆转录相同量的RNA。在REALTIME AB 7900HT循环仪中使用TaqMan探针和TaqMan Universal Master Mix进行实时qPCR反应(均为AppliedBiosystems)。使用以下TaqMan基因表达测定：作为内部对照的Rn18S(Mm03928990_g1)、Cd3e(Mm005996484_g1)、Foxp3(Mm00475162_g1)、Itgam(Mm00434455_m1)、Tnfα(Mm00443260_g1)、Il-4(Mm00445259_m1)、Il-17(Mm00439618_m1)、Ifng(Mm01168134_m1)、Tgfb1(Mm01227699_m1)、Il-10(Mm00439614_m1)、Il-6(Mm00446190_m1)、IL-1b(Mm00434228_m1)、Ccl2(Mm00441242_m1)、Ccl4(Mm00443111_m1)、Ccl5(Mm01302427_m1)、Cxcl10(Mm00445235_m1)、Cxcl11(Mm00444662_m1)。在ViiA7(Applied Biosystems)仪器上使用Sybr Select Master Mix(Applied Biosystems)以引物(IDT)测定编码脑利钠肽(Nppb)、心钠素(Nppa)和β-肌球蛋白(Mhy7)表达的基因的表达。序列列于表3中。

转基因Akt(Akt Tg)小鼠：如前所述(Condorelli et al.，2002)使用8周龄时组成型过表达活性E40K Akt突变体(Akt-E40K)的雄性Akt Tg小鼠。

运动训练的小鼠：BKS.Cg-m+/+Lepdb/+db小鼠是瘦素受体突变的杂合子，但当以正常饮食喂养时表现出野生型代谢表型。我们利用8周大的雄性小鼠，将其任意分配到两组之一：久坐和运动训练80分钟/天，5天/周，持续8周，如前所述(Stolen et al.2009)。由于遗传背景(BKS)的差异，对这些小鼠进行了所有分析，将它们与其匹配对照进行比较，以避免遗传背景特异性影响。

免疫组织化学分析：小鼠心脏样品在4℃、石蜡包埋和4μm切片下固定于4％福尔马林中。玻片用Azan三色胶原染色(BioOptica)。使用图像分析程序(ImageJ)将载玻片图像数字化并分析用于小鼠切片的五个区域和用于人活组织检查的十个区域以量化纤维化。通过测量Azan的三色染色区域作为总心肌面积的百分比来评估心脏纤维化。将载玻片上的切片样品脱蜡并通过递减比例的乙醇进行水合以用于免疫组织化学分析。使用DIVA(BiocareMedical)对小鼠样品进行抗原修复，并使用W-Cap(Biocare Medical)对人样品进行抗原修复。将切片冷却，然后用含有0.05％吐温20(Sigma)的PBS(Lonza)洗涤。通过与过氧化物酶I(Biocare Medical)在室温(RT)孵育20分钟以阻断内源性过氧化物酶，并且用RodentBlock和Background Sniper(Biocare Medical)分别对小鼠和人样品在室温下孵育20分钟阻断非特异性位点。然后将切片在室温下与1：1000稀释的大鼠抗人CD3(Serotec)或1：250稀释的AIF-1(Wako)或1:50稀释的多克隆兔抗人CD3(Dako)孵育1小时，洗涤，在室温下与大鼠-小鼠HRP聚合物(Biocare Medical)或Mach1HRP聚合物(Biocare Medical)或Envision+System抗兔HRP(Dako)孵育30分钟。最后，将切片与DAB(Biocare Medical)孵育，用苏木精复染，通过递增比例的乙醇和二甲苯脱水，并使用Eukitt(Fluka)盖上盖玻片。所有样品都用一台带有数码相机的显微镜Olympus BX53进行观察和拍照。

TUNEL分析小鼠心脏样品：将载玻片上的切片样品脱蜡并通过递减比例的乙醇脱水后进行TUNEL分析(Click-it plus TUNEL assay C10617，Life technology)。

阿西巴普体外刺激脾细胞：从8周龄雄性C57BL/6J小鼠脾脏中分离纯化总脾细胞。在AutoMACS(Miltenyi Biotec)上使用磁珠除去T细胞。用2μg/ml的抗CD3刺激总脾细胞或去除T细胞的脾细胞，并用20μg/ml的阿巴西普或IgG同种型进行对照培养。培养72小时后，在培养的最后4小时内加入Brefeldin A(eBioscience)，制备脾细胞用于FACS分析。

流式细胞术：在冷PBS-/-中通过70μm细胞过滤器获得脾脏和淋巴结的单细胞悬液。收集心脏并用Liberase TM(Roche)消化。从脾细胞和心脏细胞悬液中用裂解缓冲液(BDBiosciences)除去红细胞。用活/死Aqua荧光活性染料(Life Techonologies)对细胞进行染色，抗小鼠CD3εPerCP(145-2C11，BioLegend)、抗小鼠CD19eFluor450(eBio1D3，eBioscience)、抗小鼠CD11b Pacific Blue(M1/70，Biolegend)、CD11c APC(Bu15，eBioscience)、F4/80Alexa488(CI:A3-1，Serotec)在图11a中，F4/80(BM8，eBioscience)在图6d、6e和15中，IL-10PE(JES5-16E3，eBioscience)、FoxP3Alexa488(FJK-165，eBioscience)、Ly6C(HK1.4，eBioscience)或抗CD86Pacific Blue(GL-1，Biolegend)、抗CD80FITC(16-10A1，BD Pharmigen)或抗CD25PE(PC61.5，eBioscience)。使用eBioscience细胞内染色试剂盒。在FACS Canto II(BD)上采集样品，并用FlowJo10进行分析。

统计学：统计分析在GraphPad Prism中进行。在进行参数或非参数分析之前，使用正态性检验对所有数据集进行正态分布检验。Grubb检验为了排除假异常值。采用非配对t检验，单因素方差分析及Tukey后检验，双向方差分析及Bonferroni后检验对正态分布数据进行统计学显著性检验。用Mann-Whitney检验和单因素方差分析及Dunn后检验对没有正态分布的数据进行统计学显著性检验。Fisher的精确检验用于分析胶原沉积，检测胶原染色的存在与否。使用R中的自定义脚本计算图2和图7A、B中的标准偏差图。

结果

实施例1.对可溶性和细胞免疫介质的分析与M1型免疫应答一致，其随着心力衰竭的发展转变为Th2型应答。

我们使小鼠接受病理性心脏肥大的标准模型—横向主动脉缩窄(TAC)，并在TAC术后1周和4周通过qPCR评估心肌内可溶性和细胞免疫介质的存在(图2)。通过常规经胸超声心动图监测心脏功能(表1)。在TAC后1周，我们发现Tnfa和Il6显著上调，如前所述(Souderset al.，2012)(Kuang et al.，2013)免疫系统的细胞通过趋化因子被招募和/或保留在它们的作用位点。我们发现Ccl2和Cxcl11(Xia et al.，2009)以及Ccl4、Ccl5和Cxcl10(图1)显著的早期表达，其中大部分是1型(M1/Th1)极化炎症反应的标志物(Mantovani et al.，2004)。Itgam(CD11b)是先天免疫细胞如巨噬细胞或单核细胞存在的标志，在TAC后1周也被上调，表明1型极化先天免疫细胞早期被募集到应激心肌。

我们在术后4周观察到T细胞特异性标记物Cd3e显著上调，表明T细胞在此后的时间点扩张或募集到应激左心室。2型(M2/Th2)极化反应的标志物Il4同时上调，表明随着心肌向HF发展，从M1向M2/Th2应答逐渐转变。事实上，已报道Th2-极化的T细胞在其他病理条件下促进纤维化(Wynn，2004)。以Th1和Th17应答为特征的细胞因子，如Ifng和Il17，或抗炎细胞因子Il10的转录在任何时间点都没有显著改变。

实施例2.炎症的发生与T细胞浸润有关。

由于我们已经生成了关于Cd3e表达(指示T细胞存在)和il6表达(指示炎症)的数据，我们对炎症的发生是否与T细胞浸润和/或增殖相关抱有疑问。假设一个线性回归模型，我们首先检测来自术后4周的TAC手术小鼠样品中Cd3e和il6之间的相关性。结果(图13，圆圈和相应的回归线)显示出显著的正斜率，表明存在这种相关性。一种可能的解释是炎症驱使T细胞浸润和/或增殖进入心肌。重复对假手术动物的分析(图13，正方形和相应的回归线)也产生了显著的正斜率，但是il6和cd3e的平均值较低。这表明，即使没有主动脉缩窄，假手术产生的有限的(但仍然存在)炎症(其确实涉及手术，尽管没有永久性缩窄)也可能导致T细胞的有限浸润/增殖，即使这样显著低于TAC(如图1所示)。

实施例3.免疫应答介导的区分病理性和生理性心脏肥大。

以上结果表明导致纤维化和HF的病理性心脏肥大与炎症有关。然而，非病理形式的心脏肥大也存在时，不会导致纤维化或心脏功能障碍。这些最具生理相关性的模型是运动训练。进行跑步训练的小鼠表现出“生理性”肥大，其中心肌细胞大小的增加伴随着细胞功能的增加和纤维化的缺乏(Perrino et al.，2006)(Kemi et al.，2008)。因此，我们对HF的TAC模型中鉴定的免疫介质是否也存在于运动训练的小鼠中抱有疑问。我们发现这些小鼠的免疫应答介导的转录未显著上调(图8A)。这一发现强有力地表明，与病理性肥大不同，生理性肥大具有不仅完全无纤维化，且具有先天和适应性免疫应答的特征。

为了更好地显示这些差异，我们绘制了心脏功能障碍指数(缩短分数损失百分比，即心室泵血量的减少)与炎症指数(即促炎细胞因子IL-6与抗炎细胞因子IL-10的转录表达比率)的对比(附图2)。所得到的点图，其中每个点代表一种动物，椭圆表示两个变量的一个标准偏差，清楚地说明了炎症和心脏功能受损之间的联系。运动训练的小鼠(附图2：运动(跑动)小鼠)和TAC手术小鼠(附图2：HF TAC模型)都以心脏肥大为特征，病理性肥大的TAC手术小鼠具有增加的炎症指数(与健康对照相比数值向右移)和增加的心脏功能障碍(与健康对照相比数值向顶部移)。另一方面，运动小鼠的炎症指数与健康对照组相似，但心脏功能有所改善(y轴下移)。一种更“人工”的非病理性肥大模型，由心脏特异性过表达心脏中丝氨酸-苏氨酸激酶Akt的组成型活性E40K突变体诱导(Condorelli et al.，2002)，显示了8周龄Akt转基因小鼠左心室中存在的促炎介质不完整的阵列(附图8B)。因此，这些小鼠在心脏功能障碍与炎症点图中占据中间状态，即在TAC和跑动诱导的肥大的两个极端之间。因此，我们的结果支持炎症与心脏肥大的病理性质之间的正相关。

实施例4.T细胞存在于小鼠和人的应激心肌中。

上述发现支持了抑制炎症可能是一种有前景的抗HF策略。这种方法以前曾尝试过，但确定的目标不足以达到此目的(Yndestad et al.，2006)(Hofmann和Frantz，2013)。T细胞是维持长期免疫反应所必需的(Loke et al.，2007)，因此可以代表更好的治疗靶点。在TAC后4周TAC小鼠中发现T细胞特异性Cd3e mRNA上调的驱使下，我们进一步研究T细胞在病理性肥大中的存在。通过用抗CD3e免疫组织化学法(IHC)检测小鼠的左心室(附图3A)，我们发现在4周时TAC与假手术小鼠相比，T细胞可见的且明显的量更多(附图3B)，证实了mRNA数据。在病理学过程中，T细胞可能以抗原特异性的方式反应，涉及少量随后数量增加的特异性克隆。因此，我们假设T细胞也应该在疾病发展的早期阶段被检测到。我们在TAC后1周对小鼠进行了IHC分析，实际上我们能够检测到T细胞(附图3C)。我们还对取自TAC后1周小鼠心脏的心脏悬浮液进行了淋巴细胞富集梯度纯化，当用流式细胞术检查时观察到所得细胞群确实包括CD3e表达细胞(附图3D)。因此，即使在病理早期，T细胞也存在于肥厚心肌中。之前对TAC模型的研究已经确定，早在TAC后2天就可以检测到心脏功能障碍。T细胞活化通常在排出炎症部位的淋巴结处开始。因此，我们通过流式细胞术检测在TAC后2天，在心脏引流(纵隔)淋巴结中T细胞是否被激活。我们还检测了非引流(腹股沟)淋巴结以及相同动物的脾脏。我们发现，在第2天，在心脏引流淋巴结中的CD3+T细胞中可看到活化标记物CD25的显著上调，尽管在更远端的非引流淋巴室中未见(附图3e)。T细胞的早期存在以及T细胞在患病心肌中的存在性鉴定，从而产生了为了治疗目的而试图操纵其功能的机会。为了证实我们的发现在人体环境中的临床相关性，我们检测了来自患有原发性心肌病的心力衰竭患者的心脏组织中T细胞的丰度，其与我们的实验小鼠模型具有共同的病理特征。我们检查了携带核纤层蛋白A/C突变的患者的组织，该突变导致扩张型心肌病和心力衰竭。其中一部分在肌动蛋白中携带第二个突变，导致更严重的扩张型心肌病。我们选择这些患者是因为他们的心肌病是由非免疫原因引起的，不像炎症、自身免疫或病毒性心肌病。因此，检测这些患者的左心室中的T细胞将表明T细胞的存在不仅与由过度免疫应答引发的心肌病相关，而且与非免疫原因引发的心肌病相关。在放置左心室辅助装置(LVAD)的手术过程中获得心脏样本，证明其心脏功能障碍处于晚期。对胶原的Azan三色分析(附图3G)证实了这些标本中存在纤维化(附图3F)。通过CD3e IHC(附图3I)分析相同样本中T细胞丰度，表明存在浸润性T细胞，如在TAC后4周的小鼠心脏中(附图3B)。除了上述LVAD HF患者样本外，我们还检测了患有主动脉瓣狭窄的患者的样本。主动脉瓣狭窄导致心力衰竭24，并且代表机理上最接近TAC小鼠模型的临床状况。我们发现患有这种形式的心肌病的患者的左心室也表现出类似增加的纤维化(附图3j)和T细胞存在(附图3k)。总之，这些结果进一步支持了T细胞的存在、心脏纤维化和病理性肥厚之间的联系。

实施例5.T细胞共刺激阻断降低了小鼠的HF严重程度并延缓了HF的发展。

我们假设特异性抑制T细胞功能对HF的发展有有益的影响。CTLA4是天然存在的在生理条件下通过调节T细胞抑制T细胞活化的抑制性分子之一(Wing and Sakaguchi，2010)。它阻断T细胞必须从抗原呈递细胞(树突状细胞、B细胞或巨噬细胞)接收的CD80/CD86共刺激信号，以便完全激活(Moreland et al.，2006)。CTLA4-Ig融合蛋白(阿巴西普，FDA批准的用于治疗类风湿性关节炎、自身免疫性疾病的药物)是一种稳定的、可溶性形式的CTLA4。因此，我们测试了阿巴卡普的给药是否在HF的TAC模型中产生了有益的效果。我们从手术后2天开始治疗小鼠，这些小鼠经过TAC或假手术，每周三次腹腔注射200微克阿巴西普，持续4周。作为对照，TAC和假手术小鼠在相同的时间点接受PBS。通过经胸超声心动图监测心脏功能(见表2)。选择术后第2天作为第一个治疗时间点，因为通过临床相关的诊断技术(超声心动图)可在TAC后2天检测到显著的心脏功能障碍(左心室厚度增加)。

PBS处理的TAC手术的小鼠在术后1周和4周表现出心脏功能的显著降低，与假手术组对照相比表现为缩短分数(FS)或射血分数(EF)，而阿巴西普处理的小鼠在FS或EF方面与假手术组对照相比无显著差异(附图4A-B)。从TAC术后第一周到实验结束，FS的差异很明显(附图4A)；并且随着时间延长，PBS组和阿巴西普治疗组间的EF差异也显著增加(附图4B)。因此，通过从TAC术后2天开始施用阿巴西普，我们能够显著减少心功能退化的程度并延迟其发展。通过分析其他血流动力学参数，包括舒张末期左心室内径(LVIDd)(附图4C)和收缩末期内径(LVIDs)(附图4D)，阿巴西普的效果也很明显。其他测量参数报告在(表2)中。术后3周，可看到阿巴西普治疗组和假手术对照组动物间有短暂但显著的差异。在第四周结束时，我们评估了心脏肥大的形态学指标：心脏重量与体重之比(附图9A)、左心室与体重之比(图9B)、心脏重量与胫骨长度之比(图9C)。根据大多数这些参数，用阿巴西普处理的TAC手术小鼠比PBS处理的对照组表现出显著的更低的肥大。通过qPCR分析左心室心肌“应激基因”(心脏肥大和衰竭的标志)也表明PBS处理组而不是阿巴西普处理组的β-肌球蛋白重链(Mhy7)(附图9D)、脑利钠肽(Nppb)(附图9E)和心钠素(Nppa)(附图9F)的mRNA显著上调。因此，阿巴西普治疗可显著降低由心室压力过载引起的心脏功能障碍的严重程度并延缓其发展。

我们还检测了Azan三色染色的切片以评估纤维化水平(Condorelli et al.，1999)。对所有治疗组在相同区域取样的胶原强度的比较发现，除了用阿巴西普治疗的小鼠外，所有TAC手术组的纤维化水平显著增加(附图4F)。这些结果表明，阿巴西普的有益作用也反映在保护心脏免于纤维化，心脏纤维化是一种与心力衰竭总是有关的生物应答(Konget al.，2014)。重要的是，阿巴西普基于与人免疫球蛋白融合的人CTLA-4，因此适合人类使用，但由于人和小鼠CTLA-4的高度相似性，阿巴西普已被广泛证明在小鼠中起作用(Dhirapong et al.，2013)。由于人Ig给药可能在小鼠中具有免疫原性()，我们包括另外一组接受阿巴西普或同种型对照免疫球蛋白(Ig)的非手术小鼠，以评估接受者对融合蛋白中使用的人Ig的任何反应。单独的阿巴西普和人IgG注射对照组都不会导致心脏功能的任何显着变化(附图10)，表明对免疫球蛋白的任何同种异体反应都具有有限的作用。尽管如此，在缺乏免疫抑制性CTLA-4结构域的情况下，IgG对照的同种异体反应可能会恶化TAC诱导的炎症。由于这个原因，我们选择使用PBS给药而不是IgG给药作为我们的实验对照，以避免在对照组中产生任何有害影响，从而在阿巴西普处理组中产生更强的治疗效果。事实上，当我们评估阿巴西普在TAC手术小鼠体内的作用时，我们发现，与同种型对照组处理而不是PBS处理TAC手术小鼠相比，阿巴西普的保护作用更加显著(附图10c，d，e，f)。这证实了我们选择对照组的有效性。

实施例6.抑制T细胞共刺激在晚期疾病中是有效的。

我们接下来想知道，如果仅在疾病晚期时间点给予阿巴西普治疗，是否能够阻断心脏功能障碍的发展。由于这个原因，我们重复了阿巴西普的体内治疗，尽管在TAC后2周开始第一次治疗，而不是在TAC后2天。可以看出(附图4g，h)晚期时间点治疗仍然能够显著阻断治疗动物中FS和EF的进一步降低。在LVIDS中也观察到了显著的保护作用(附图10g)。这些结果表明，即使晚期用该药物治疗也可能对限制HF的发展具有实质性的有益效果。

实施例7.阿巴西普通过抑制T细胞活化以及通过影响巨噬细胞来保护免于病理性肥大。

大量研究表明CTLA4-Ig通过阻断抗原呈递细胞上的共刺激受体来抑制T细胞功能，抗原呈递细胞是促炎性T细胞完全活化所必需的(Linsley et al.，1991)(Moreland etal.，2006)。事实上，CTLA-4分子代表了已经启动的T细胞应答可以被生理上下调的主要可用机制之一(Bluestone，1997)(Krummey and Ford，2014)。因此，我们试图剖析阿巴西普如何影响病理性心脏肥大中的T细胞活化。

为此，我们通过流式细胞术检测早期时间点(TAC后1周)T细胞中活化标记物CD25的表达，这可能是活化事件的相关时间窗口。阿巴西普显著降低了T细胞中CD25+细胞的百分比，不仅在心脏引流(纵隔)淋巴结中，而且在腹股沟淋巴结和脾脏中(附图5A)。这表明阿巴西普对T细胞活化发挥全身抑制作用。由于在TAC后1周心脏中发现的T细胞数量较少，因此无法可靠地评估浸润心脏的T细胞上的CD25表达，这使得亚群的流式细胞术分析在技术上具有挑战性。

减少T细胞活化可能导致在晚期减少增殖和更低的T细胞数。事实上，

在手术后4周，阿巴西普处理的小鼠的心肌呈现出比PBS处理的小鼠明显更少的浸润性T细胞(附图5B)。值得注意的是，与阿巴西普本身不同，阿巴西普的IgG同种型对照对体外T细胞应答没有影响(附图11A)。我们还想知道阿巴西普介导的T细胞抑制是否导致对巨噬细胞活化的下游抑制作用，最近已证明这有助于心脏病理学(Epelman et al.，2014)。在手术小鼠的心脏中，我们用免疫组织化学方法评估了AIF-1(Iba-1)的表达，AIF-1是T细胞衍生的巨噬细胞活化的标志物(Utans et al.，1995)(Tian et al.，2006)。在TAC手术的小鼠中，与PBS处理的对照组相比，阿巴西普治疗导致AIF-1信号显著降低(附图5C)。假手术小鼠的AIF-1+细胞信号可忽略不计。术后4周，两组之间AIF-1+巨噬细胞的差异很小(附图14)，很可能是因为在TAC手术小鼠中，AIF-1+巨噬细胞的总体水平，或者实际上CD11b+先天免疫细胞(附图1)的总水平在病理学晚期降低。我们接下来通过流式细胞术分析检测在术后1周在阿巴西普或对照处理的TAC小鼠的左心室中发现的巨噬细胞³⁸的成熟状态。我们考虑了CD11b+CD45+活单细胞中Ly6C+F4-80+(未成熟巨噬细胞)或Ly6C-F4-80+(成熟巨噬细胞)的百分比(附图15所示的门控策略)。我们发现，与对照组相比，阿巴西普处理的动物的心脏中未成熟巨噬细胞的百分比(附图5e)显著较高，而成熟巨噬细胞的百分比(附图5f)显著较低。

这一发现表明，根据本发明的T细胞的抑制也可能对心肌中的致病性巨噬细胞具有下游作用，包括例如对心肌中巨噬细胞的活化和成熟状态的影响。

实施例8.阿巴西普的保护作用依赖于IL-10。

阿巴西普对T细胞活化的影响通过去除抗原呈递细胞上的促炎共刺激信号(Krummey and Ford，2014)而发生，但还可能依赖于抗炎信号的产生，从而积极抑制致病反应(Linsley et al.，1991)(Sage et al.，2014)。为了进一步研究这一点，我们在经过治疗的TAC手术动物中通过实时qPCR检测免疫介质的存在。在术后1周，在阿巴西普已经导致心脏保护作用的时间点，促炎细胞因子IL-6的mRNA表达在阿巴西普和PBS处理的TAC手术小鼠中显著上调(附图5d：il6)。这并不奇怪，因为两组动物都接受了相同的TAC处理，其中IL-6在应激心肌应答中具有重要作用(Melendez et al.，2010)。然而，仅在阿巴西普处理组中我们观察到细胞因子IL-10的mRNA显著上调(附图5d：il10)。因此，阿巴西普在TAC手术小鼠确实产生了Il10的显著上调(附图5D；il10)。IL-10是免疫系统用来关闭不想要的或不再需要的应答的最有效的抗炎细胞因子之一，并且它已被证明介导了HF的心脏保护作用(Vermaet al.，2012)，它对心肌细胞的作用与IL-6的作用相反(Melendez et al.，2010)。阿巴西普本身的施用对新生儿心肌细胞没有任何直接影响，因为在体外它不影响它们的肥大状态。综上所述，这些发现暗示阿巴西普可能通过IL-10介导抗炎和随后的抗肥大作用。由于阿巴西普处理的TAC小鼠Il10被上调，我们评估了哪些免疫细胞亚群可以作为IL-10的来源。我们通过流式细胞术检测了体外暴露于阿巴西普的脾细胞中细胞内IL-10的表达。我们发现阿巴西普主要在抗原呈递细胞上诱导IL-10，其中绝大多数是B细胞，同时也可以鉴定出一些产生IL-10的T细胞(附图11B)。

因此，我们研究了IL-10对于阿巴西普的保护作用是否是必需的。为了解决这一问题，我们分析了阿巴西普对接受TAC的IL-10缺陷小鼠(IL-10KO)的影响。如上所述，阿巴西普功能的标志是抑制T细胞应答。有趣的是，在IL-10KO小鼠中，阿巴西普不再能抑制TAC手术小鼠心脏中T细胞的存在(附图6A)，表明IL-10是药物的T细胞减少、抗炎作用所必需的。随后，我们对IL-10是否对阿巴西普介导的心脏肥大的影响是必需的抱有疑问。经TAC手术的IL-10KO小鼠的超声心动图分析证实，阿巴西普对心脏的有益作用需要IL-10(附图6B-E)。最后，心肌细胞的凋亡是病理学肥大的标志(Condorelli et al.，1999)。虽然阿巴西普显著降低了野生型TAC手术小鼠心肌细胞凋亡的程度，但这在IL-10KO小鼠中没有发生，这些小鼠经治疗无效(附图6F)。

总之，我们的结果表明阿巴西普通过去除和积极逆转病原性免疫应答，从而以依赖细胞因子IL-10的方式影响心肌肥大，以保护免于HF发展。计算和绘制心脏功能障碍和炎症指数(附图7A，B)表明阿巴西普导致炎症减少(与PBS处理的小鼠相比，向左移位)，从而改善心脏功能，评估为减少心脏功能障碍(移位至y轴降低值)。在TAC后4周，心功能也得到改善，表明该综合症的发展延迟(附图7B)。

实施例9.IL-10野生型B细胞的提供足以挽救阿巴西普介导的保护作用的丧失。

然后，我们试图确认上述鉴定的IL-10产生细胞(即主要是B细胞，并且在较小程度上是T细胞)是否足以挽救IL-10KO动物中保护作用的丧失。为此，我们首先将2·10⁶个野生型(IL-10充足的)B细胞或2·10⁶个野生型(IL-10充足的)T细胞转移到IL-10KO接受者中。然后我们从术后第2天开始进行TAC手术，随后进行阿巴西普或对照处理。IL-10野生型B细胞的转移足以挽救IL-10KO TAC手术小鼠中阿巴西普介导的保护作用的丧失(附图6g，h：实心方块)。另一方面，IL10野生型T细胞的转移不能挽救保护作用(附图6g，h：空心方块)。由此我们得出结论，由B细胞产生的IL-10对阿巴西普的响应一定参与了阿巴西普介导的心肌保护作用的机制。为了评估这种B细胞介导的作用是否依赖于药物对T细胞的影响或者它是否对B细胞有直接作用，我们评估了体外施用阿巴西普后，在存在或不存在T细胞的情况下脾细胞产生IL-10的能力。我们发现IL-10的产生不受T细胞缺乏的影响(附图16)，表明B细胞介导的作用可能是直接的。

总之，我们的研究结果表明阿巴西普可通过抑制T细胞和巨噬细胞介导的致病性免疫应答，同时还直接诱导B细胞有益地产生抗炎细胞因子IL-10来预防HF的发展。

本文的发明人证明了阿巴西普(一种FDA批准的抑制T细胞共刺激的药物)如何降低压力超负荷诱导的心脏肥大和纤维化的严重程度并延缓其发展。该结果是可能的，因为本文的发明人发现HF发病机理与先天性和适应性免疫应答相关。阿巴西普通过依赖IL-10作用的机制减弱这种应答，从而抑制心脏病理学的发展。

与HF相关的心脏炎症被认为是由受胁迫的心肌细胞分泌促炎性细胞因子引起的(Shioi et al.，1997)(Ancey et al.，2002)(Souders et al.，2012)。这些细胞因子的存在已被用于区分生理和病理性肥大(Serra et al.，2010)。在证实和扩展炎症与心脏病理学之间关联的知识的同时，重要的是，我们在此表明通过靶向适应性免疫系统的细胞，可以通过减弱炎症应答来干扰心脏重塑。这与通过靶向细胞因子限制病理学的不成功的尝试形成对比，靶向细胞因子已被证明是更难以实现的目标(Yndestad et al.，2006)(Hofmannand Frantz，2013)。

病理性心脏肥大的主要临床特征是纤维化。在其他情况下，纤维化形成似乎需要Th2-极化T细胞和先天免疫细胞的联合作用(Wynn，2004)(Niedermeier et al.，2009)。我们描述了心脏炎症最初是如何通过由M1极化的先天免疫细胞介导的，并且随着时间的推移随后可转变为M2/Th2极化。这与之前的两项研究一致，即BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠相比，前者HF更严重，这可归因于前一种小鼠中Th2偏倚更大(Yu et al.，2006)(Peng et al.，2011)。我们还证实了来自人HF患者，来自于非免疫原因引起的严重扩张型心肌病患者以及患有主动脉瓣狭窄的患者的活检组织中T细胞的存在。

免疫系统调节T细胞作用的主要手段之一是通过免疫抑制调节性T细胞(Treg)，其抑制有害或不需要的应答(Wing and Sakaguchi，2010)。有趣的是，证据表明Treg缺乏与慢性HF有关(Tang et al.，2010)。我们在TAC小鼠中通过遗传标记物Foxp3的表达检测到Treg的存在，但仅在手术后8周(附图12)。这可能表明天然免疫抑制的尝试发生太迟而无法阻断病原性免疫应答(Garetto et al.，2015)。已有两次成功的实验尝试在HF模型中利用同源Treg给药(Treg过继细胞治疗)(Kvakan et al.，2009)(Kanellakis et al.，2011)。然而，过继细胞治疗虽然非常有前景，但它是一种复杂且昂贵的程序，在转向临床应用之前仍需要改进。利用Treg抑制功能的另一种方法是通过超活化抗CD28抗体选择性激活它们。这已在心肌梗塞(MI)后的心脏修复模型中使用了两次(Tang et al.，2012)(Weirather etal.，2014)。尽管MI引起的的心脏应激及其相关的免疫应答与压力超负荷引起的HF相比有几个关键差异，但这些研究的成功仍然是一个令人鼓舞的里程碑。然而，这种方法的一个重要警告在于，人类患者具有更多数量的炎症前记忆T细胞的事实，在过去临床试验中，这些细胞被超激活抗CD28克隆激活，对患者具有近乎致命的后果(Suntharalingam et al.，2006)。尽管目前正在使用更精确的试剂解决该问题(Weirather et al.，2014)，但该解决方案尚未完全适用于临床。因此，为了寻找更容易转移的解决方案，我们选择利用基于Treg细胞的效应分子之一的CTLA-4的融合蛋白。Treg通过表面结合CTLA-4以及可溶性IL-10或TGFβ进行抑制，抑制先天性免疫细胞和适应性免疫细胞的功能(Wing and Sakaguchi，2010)。CTLA-4通过阻断T细胞共刺激的能力特异性地抑制T细胞功能。CTLA4-Ig融合蛋白阿巴西普易于给药，并且已经在临床上用于抑制自身免疫应答(Moreland et al.，2006)。由于该药物在小鼠中起作用，对于我们的尝试治疗，我们选择使用HF的TAC小鼠模型。TAC模型被认为是过载诱导HF的金标准模型，实际上它已经被用于与HF相关的各种条件的大量研究。

尽管我们确实观察到即使在阿巴西普治疗TAC手术小鼠的非引流淋巴器官中T细胞明显受到全身性抑制，但阿巴西普确立的临床安全记录降低了这种免疫抑制治疗可能使机体暴露于机会性感染的风险。

我们证明了阿巴西普可减轻心脏病理学的严重性，并延缓超负荷导致的心脏病理学症状的发展。重要的是，我们能够证明即使在疾病晚期开始给药时，该药物也能够显著限制病理学的发展。

已知该药物通过阻断抗原呈递细胞上的共刺激配体CD80和CD86来抑制T细胞功能(Moreland et al.，2006)。因此，我们发现在体内阿巴西普抑制T细胞的应答(附图5)，包括在T细胞活化似乎起始的心脏引流淋巴结中(图3e)。我们还观察到该药物抑制心脏巨噬细胞活化和成熟(附图5c、e、f)。经阿巴西普治疗的小鼠炎症减轻，影响心脏巨噬细胞的活化(附图5C)以及促细胞因子和抗细胞因子水平的平衡，因为可在心脏功能障碍与炎症图中直观的观察到(附图7A，B)。阿巴西普还诱导活性的抗炎信号，如细胞因子IL-10，我们在体内检测到IL-10(附图5D)且它可以由T细胞和抗原呈递细胞产生(附图11B)。IL-10(附图6b-d)对于发生保护作用是必需的，并且用药物体外处理后B细胞可以产生IL-10(附图11b)。IL-10充足的B细胞似乎足以挽救用阿巴西普治疗的IL-10KO TAC手术动物心脏保护作用的丧失(附图6a-h)。由于T细胞和抗原呈递细胞共同作用于它们相互间完全激活(Linsley etal.，1991)，因此两个群体都可能参与抗炎信号的诱导也不足为奇。这种联合去除促炎性T细胞活化和诱导抗炎信号(在B细胞中)的示意图在(附图7C)给出。由于IL-10已被证实可具有直接心脏保护和抗纤维化作用(Verma et al.，2012)(Wynn，2004)，阿巴西普治疗带来的益处可能是由于去除促炎信号以及IL-10的直接保护作用的综合效应。这两种作用都依赖于IL-10，因为在缺乏细胞因子的小鼠中，阿巴西普治疗不再抑制T细胞扩增，也不再保护其免于心脏功能丧失或心肌细胞凋亡。

尽管阿巴西普已被证明可诱导调节性T细胞(Ko et al.，2010)，但我们未观察到我们系统中Foxp3mRNA表达的任何显著性诱导。然而，我们确实观察到阿巴西普给药后体外Foxp3+Treg细胞产生IL-10，因此不能正式排除这种并行机制。由于我们发现被阿巴西普抑制的心脏巨噬细胞可作为表达CD80/CD86的抗原呈递细胞，我们也不能排除药物通过作用于T细胞以及直接作用于巨噬细胞本身来抑制巨噬细胞。

根据本发明的治疗靶向T细胞共刺激，从而达到其最佳活化。T细胞活化可能还与潜在的心脏病的慢性化相关，并且T细胞识别的同源抗原的持续存在可能妨碍其解决。作为已经在临床使用的T细胞共刺激和/或活化和/或功能的抑制剂的实例，CLTA4衍生的分子如CTLA4-Ig，例如阿巴西普，可能比目前正在探索的靶向T细胞的其他手段治疗压力超负荷引起的HF更具相关性。此外，共刺激需要T细胞和抗原呈递细胞之间的相互作用。因此，靶向共刺激需要靶向携带CD80/CD86的巨噬细胞和B细胞，这有助于治疗效果，因为它影响T细胞相关的B细胞和巨噬细胞应答。

IL-10具有直接的心脏保护和抗纤维化作用。我们的结果表明，IL-10的存在对于阿巴西普的心脏保护作用和抑制T细胞扩增均是必要的(附图6a)。然而，IL-10在药物给药的下游发挥作用。因此，IL-10诱导的调节将取决于药物靶标的定位和丰度。T细胞共刺激抑制剂如CTLA4-Ig型T细胞抑制剂阿巴西普，即使B细胞和巨噬细胞是其直接靶标，也仅影响T细胞相关应答。阿巴西普确实系统性影响T细胞活化(如附图5a所示)，但从上述自身免疫病理学数据推断，即使其作用依赖于IL-10，也预计不会影响T细胞非依赖性先天免疫应答。临床上已证实的阿巴西普的安全特性为以下解释提供了实质性支持：在基于CTLA4的T细胞抑制分子，如CTLA4-Ig，例如阿巴西普中，有用的免疫抑制与功能性免疫缺陷的诱导之间的平衡可能是令人满意的。综上所述，本研究的发现证明了FDA批准的抑制促炎性T细胞功能的药物在HF模型中如何产生显著的治疗效果。其根本原因在于适应性免疫应答与压力超负荷诱导的心脏肥大和纤维化的发病机理有关。由于T细胞对免疫应答的慢性作用有很大贡献，它们的靶向似乎在控制病理学发展方面是有效的。诱导免疫应答作为对心脏压力超负荷的反应可能是最初进化以应对病原体感染的应答的不希望的结果。可能是机体无法区分感染和压力过载引起的胁迫信号。然而，幸运的是，免疫与病理性心脏肥大之间的这种联系也创造了一个机会：目前临床上用于治疗免疫介导的疾病的功能性和有效的疗法可能成为抗击心力衰竭的重要工具。

因此，综上所述，本发明的发明人在本文中描述了T细胞共刺激和/或活化和/或功能的抑制剂在治疗或预防不由自身免疫或对感染的免疫应答(例如不是通过病毒感染)引起的炎症性心肌病诱导的心力衰竭病理学方面是有效的。压力超负荷引起的心力衰竭是如此治疗或预防心力衰竭病理学的代表性实例。

当然可以理解，上面仅通过实施例的方式描述了本发明，并且可在所附权利要求的范围内进行细节的修改。

表格

表1:术后1、3和4周时TAC和假手术小鼠的血液动力学参数。

°p<0.05在相同的时间点TAC与假组相比

#p<0.01在相同的时间点TAC与假组相比

§p<0.001在相同的时间点TAC与假组相比

p<0.05在每个时间点TAC基础和TAC相比

+p<0.01在每个时间点TAC基础和TAC相比

*p<0.001在每个时间点TAC基础和TAC相比

非配对t检验

表2:术后1、3和4周时TAC和假手术小鼠在用阿巴西普或PBS处理时的血液动力学参数。

假组(SHAM)

°p<0.05在相同的时间点TAC阿巴西普/PBS与假组阿巴西普/PBS相比

+p<0.01在相同的时间点TAC阿巴西普/PBS与假组阿巴西普/PBS相比

§p<0.001在相同的时间点TAC阿巴西普/PBS与假组阿巴西普/PBS相比

p<0.05在相同的时间点TAC阿巴西普与TAC PBS相比

*p<0.01在相同的时间点TAC阿巴西普与TAC PBS相比

#p<0.001在相同的时间点TAC阿巴西普与TAC PBS相比

表3:所用引物列表

本公开还包括以下项：

1.一种用于治疗和/或预防心脏病，优选心力衰竭疾病和/或相关症状的T细胞共刺激和/或激活和/或功能性的抑制剂。

2.根据第1项使用的抑制剂，其是至少一种促进T细胞共刺激的分子的抑制剂。

3.根据第1或2项使用的抑制剂，其中，所述抑制剂增加了心脏中的IL-10水平。

4.根据前述任一项使用的抑制剂，其包括或由选自下组的至少一种分子组成：CTLA4、PD-1、PD-L1或PD-L2、BTLA、CD160、LAG-3、2B4、B7-H3、B7-H4、B7S3、BTNL2、阻断抗CD28抗体、其功能片段、其功能衍生物或其功能类似物。

5.根据第2项使用的抑制剂，其中，促进T细胞共刺激的分子选自由B7-1和B7-2(也称为CD80和CD86)、CD40、CD40L(也称为CD154)、OX40、OX40L、CD30、CD30L、4-IBB、4-BBL、GITR、GITR配体、LIGHT、CD27、CD45RB、CD2、LFA-3、B7-H3、B7-H4、ICOS和ICOS配体组成的组。

6.根据前述任一项使用的抑制剂，其是选自以下组的至少一个分子：阻断抗体或其功能片段，或小分子抑制剂或多核苷酸。

7.根据第1-3项中任一项使用的抑制剂，其是包含或由CTLA4或其功能片段或其功能衍生物或其功能类似物组成的分子。

8.根据第7项使用的抑制剂，其是CTLA4-Ig分子或其功能片段或功能衍生物或其功能类似物。

9.根据第8项使用的抑制剂，其中，所述CTLA4-Ig分子是一种融合蛋白，包括含有与CTLA4的胞外结构域相对应的氨基酸残基的第一氨基酸序列和含有免疫球蛋白IgG1的Fc区域的第二氨基酸序列。

10.根据第8或9项使用的抑制剂，其中，所述CTLA4-Ig分子包括或基本由SEQ IDNO:1的氨基酸序列，或其功能片段或其功能衍生物或其功能类似物组成。

11.根据前述任一项使用的抑制剂，其中，所述抑制剂是阿巴西普。

12.一种编码第1-11中任一项定义的抑制剂的核酸分子，其用于治疗和/或预防心脏病，优选心力衰竭疾病和/或相关症状。

13.一种表达载体，其包括第12项中定义的核酸或编码第1-11项中任一项所定义的抑制剂，用于治疗和/或预防心脏病，优选心力衰竭疾病和/或相关症状。

14.一种基因工程宿主细胞或纳米颗粒或微囊，其表达如第1-11项中任一项所定义的抑制剂，用于治疗和/或预防心脏病，优选心力衰竭疾病和/或相关症状。

15.一种药物组合物，其包括第1-11项中任一项所定义的抑制剂，或第12项定义的核酸分子，或第13项定义的表达载体，或第14项定义的基因工程宿主细胞或纳米颗粒或微囊，以及至少一种药学上可接受的载体，用于治疗和/或预防心脏病，优选心力衰竭疾病和/或相关症状。

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序列表

<110> 仁爱米拉索莱有限公司

<120> T细胞激活或刺激的抑制剂的治疗应用

<130> 192353

<150> EP16151539.0

<151> 2016-01-15

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 357

<212> PRT

<213> CTLA4-Ig(人工序列)

<400> 1

Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile

1 5 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val

20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys

35 40 45

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser

50 55 60

Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln

65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu

85 90 95

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile

100 105 110

Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys

115 120 125

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu

130 135 140

Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

145 150 155 160

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

165 170 175

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

180 185 190

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

195 200 205

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

210 215 220

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

225 230 235 240

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

245 250 255

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

260 265 270

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

275 280 285

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

290 295 300

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

305 310 315 320

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

325 330 335

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

340 345 350

Leu Ser Pro Gly Lys

355

<210> 2

<211> 383

<212> PRT

<213> CTLA4-Ig(人工序列)

<400> 2

Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro

20 25 30

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu

35 40 45

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg

50 55 60

Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met

65 70 75 80

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser

85 90 95

Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp

100 105 110

Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr

115 120 125

Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu

130 135 140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

145 150 155 160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val

165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

305 310 315 320

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

340 345 350

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成引物(人工序列)

<400> 3

cgcatcaagg agctcacc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成引物(人工序列)

<400> 4

ctgcagccgc agtaggtt 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成引物(人工序列)

<400> 5

gtcagtcgtt tgggctgtaa c 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成引物(人工序列)

<400> 6

agacccaggc agagtcagaa 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成引物(人工序列)

<400> 7

cacagatctg atggatttca aga 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成引物(人工序列)

<400> 8

cctcatcttc taccggcatc 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成引物(人工序列)

<400> 9

aaatcagtta tggttccttt ggtc 24

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成引物(人工序列)

<400> 10

gctctagaat taccacagtt atccaa 26

Claims (22)

1.一种用于治疗和/或预防压力超负荷引起的心力衰竭的T细胞共刺激和/或激活和/或功能性的抑制剂。

2.权利要求1使用的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为T细胞共刺激的抑制剂。

3.权利要求1或2使用的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂增加了心脏中的IL-10水平。

4.前述权利要求中任一项使用的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂抑制CD80和/或CD86。

5.前述权利要求中任一项使用的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包含一个结合CD80和/或CD86的CTLA4细胞外结构域或其功能衍生物。

6.权利要求5使用的抑制剂，其特征在于，所述CTLA4细胞外结构域与SEQ ID NO:1的1-125位氨基酸具有至少85％的序列同一性。

7.权利要求5或6使用的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂是CTLA4-Ig分子或其结合CD80和/或CD86的功能衍生物。

8.权利要求5-7中任一项使用的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂与SEQ ID NO:1具有至少85％的序列同一性。

9.权利要求5-8中任一项使用的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包含SEQ ID NO:1的1-125位氨基酸序列。

10.权利要求5-9中任一项使用的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包含氨基酸序列SEQID NO:1。

11.前述权利要求中任一项使用的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为阿巴西普。

12.前述权利要求中任一项使用的抑制剂，其特征在于，治疗和/或预防压力超负荷引起的心脏肥大和纤维化。

13.前述权利要求中任一项使用的抑制剂，其特征在于，所述心力衰竭属于纽约心脏病协会III级或IV级，或者根据美国心脏病学会和美国心脏协会的分类中的C或D期。

14.前述权利要求中任一项使用的抑制剂，其特征在于，所述心力衰竭属于纽约心脏病协会I级或II级，或者根据美国心脏病学会和美国心脏协会的分类中的A或B期。

15.一种编码如权利要求1-14中任一项所定义的抑制剂的核酸分子，用于治疗和/或预防压力超负荷引起的心力衰竭。

16.一种包含权利要求15所定义的核酸分子或编码权利要求1-14中任一项所定义的抑制剂的核酸分子的表达载体，用于治疗和/或预防压力超负荷引起的心力衰竭。

17.一种表达权利要求1-14中任一项所定义的抑制剂的基因工程宿主细胞或纳米颗粒或微囊泡，用于治疗和/或预防压力超负荷引起的心力衰竭。

18.一种药物组合物，其包含如权利要求1-14中任一项所定义的抑制剂，或如权利要求15所定义的核酸分子，或如权利要求16所定义的表达载体，或如权利要求17所定义的基因工程宿主细胞或纳米颗粒或微囊泡，和至少一种药学上可接受的载体，用于治疗和/或预防压力超负荷引起的心力衰竭。

19.一种治疗或预防压力超负荷引起的心力衰竭的方法，包括向需要进行这种治疗或预防的受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所定义的T细胞共刺激和/或激活和/或功能性的抑制剂，或如权利要求15所定义的核酸分子，或如权利要求16所定义的表达载体，或如权利要求17所定义的基因工程宿主细胞或纳米颗粒或微囊泡或如权利要求18所定义的药物组合物。

20.一种治疗或预防压力超负荷引起的心脏肥大和纤维化的方法，包括向需要进行这种治疗或预防的受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所定义的T细胞共刺激和/或激活和/或功能性的抑制剂，或如权利要求15所定义的核酸分子，或如权利要求16所定义的表达载体，或如权利要求17所定义的基因工程宿主细胞或纳米颗粒或微囊泡或如权利要求18所定义的药物组合物。

21.一种治疗或预防压力超负荷引起的心力衰竭的方法，包括向需要进行这种治疗或预防的受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所定义的T细胞共刺激和/或激活和/或功能性的抑制剂，或如权利要求15所定义的核酸分子，或如权利要求16所定义的表达载体，或如权利要求17所定义的基因工程宿主细胞或纳米颗粒或微囊泡或如权利要求18所定义的药物组合物，所述心力衰竭属于纽约心脏病协会III级或IV级，或者根据美国心脏病学会和美国心脏协会的分类中的C或D期。

22.一种治疗或预防压力超负荷引起的心力衰竭的方法，包括向需要进行这种治疗或预防的受试者施用有效量的如权利要求1-11中任一项所定义的T细胞共刺激和/或激活和/或功能性的抑制剂，或如权利要求15所定义的核酸分子，或如权利要求16所定义的表达载体，或如权利要求17所定义的基因工程宿主细胞或纳米颗粒或微囊泡或如权利要求18所定义的药物组合物，所述心力衰竭属于纽约心脏病协会I级或II级，或者根据美国心脏病学会和美国心脏协会的分类中的A或B期。