DE69226871T3

DE69226871T3 - CTL4A-Rezeptor, ihn enthaltenden Fusionsproteine und deren Verwendung

Info

Publication number: DE69226871T3
Application number: DE69226871T
Authority: DE
Inventors: Peter S. Seattle LINSLEY; Jeffrey A. Seattle LEDBETTER; Nitin K. Hopewell DAMLE; William Bothell BRADY
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1991-06-27
Filing date: 1992-06-16
Publication date: 2009-09-24
Anticipated expiration: 2012-06-17
Also published as: NO2007013I2; FI112082B; CA2110518A1; DE122007000078I2; JP3722375B2; KR940701445A; IE922111A1; JP4159266B2; NO312465B1; CA2580812A1; NL300303I2; NO2012001I2; IL159364A; AU2240092A; MX9203605A; NO20020491L; AU661854B2; FI935795A; FI115057B; NZ264712A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression des CTLA4-Rezeptorgens, die Identifizierung der Interaktion zwischen dem Rezeptor und B7-Antigen exprimierenden Zellen, und Verfahren zur Regulierung zellulärer Interaktionen, an denen der CTLA4-Rezeptor beteiligt ist.
Hintergrund der Erfindung
Das besondere Kennzeichen des Wirbeltier-Immunsystems ist die Fähigkeit, zwischen ”eigen” und ”nicht eigen” (fremd) zu unterscheiden. Diese Eigenschaft hat zur Evolution eines Systems geführt, das multiple Signale benötigt, um eine optimale Immunaktivierung zu erreichen (Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54: 1–14 (1989)). T-Zell-B-Zell-Interaktionen sind für die Immunantwort essentiell. Die Mengen vieler kohäsiver, auf T-Zellen und B-Zellen zu findender Moleküle nehmen während einer Immunantwort zu (Springer et al., (1987), oben; Shaw und Shimuzu, Current Opinion in Immunology, Eds. Kindt und Long, 1: 92–97 (1988)); und Hemler Immunology Today 9: 109–113 (1988)). Erhöhte Mengen dieser Moleküle können bei der Erklärung behilflich sein, warum aktivierte B-Zellen effektiver die antigenspezifische T-Zell-Proliferation stimulieren als ruhende B-Zellen (Kaiuchi et al., J. Immunol. 131: 109–114 (1983); Kreiger et al., J. Immunol. 135: 2937–2945 (1985); McKenzie, J. Immunol. 141: 2907–2911 (1988); und Hawrylowicz an Unanue, J. Immunol. 141: 4083–4088 (1988)).
Die Erzeugung einer T-Lymphozyt-Immunantwort (”T-Zell-Immunantwort”) ist ein komplexer Prozess, an dem Zell-Zell-Interaktionen (Springer et al., A. Rev. Immunol. 5: 223–252 (1987)), insbesondere zwischen T-Zellen und akzessorischen Zellen, wie B-Zellen, und die Produktion löslicher Immun-mediatoren (Zytokine und Lymphokine) (Dinarello und Mier, New Engl. Jour. Med 317: 940–945 (1987)) beteiligt sind. Reguliert wird diese Antwort durch mehrere T-Zell-Ober-flächenrezeptoren, zu denen der T-Zell-Rezeptorkomplex (Weiss et al., Ann. Rev. Immunol. 4: 593–619 (1986)) und andere ”akzessorische” Oberflächenmoleküle (Springer et al., (1987), oben) gehören. Viele dieser akzessorischen Moleküle sind natürlich vorkommende Oberflächen-Differenzierungsantigene (CD-Antigene), die durch die Reaktivität monoklonaler Antikörper auf den Zelloberflächen definiert sind (McMichael, Ed., Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N. Y. (1987)).
Antigenunabhängige, intrazelluläre Interaktionen, an denen Lymphozyt-akzessorische Moleküle beteiligt sind, sind essentiell für eine Immunantwort (Springer et al., (1987), oben). Beispielsweise ist die Bindung des T-Zell-assoziierten Proteins CD2 an dessen Liganden LFA-3, einem häufig exprimierten Glycoprotein (Zusammenstellung in Shaw und Shimuzu, oben), für die Optimierung der antigenspezifischen T-Zellaktivierung wichtig (Moingeon et al., Nature 339: 314 (1988)). An einem weiteren wichtigen Adhäsionssystem beteiligt ist die Bindung des auf Lymphozyten, Makrophagen und Granulozyten zu findenden LFA-1-Glycoproteins (Springer et al., (1987), oben; Shaw und Shimuzu (1988), oben) an dessen Liganden ICAM-1 (Makgoba et al., Nature 331: 86–88 (1988)) und ICAM-2 (Staunton et al., Nature 339: 61–64 (1989)). Die T-Zell-akzessorischen Moleküle CD8 und CD4 verstärken die T-Zelladhäsion durch Interaktion mit MHC-Molekülen der Klasse I (Norment et al., Nature 336: 79–81 (1988)) beziehungsweise der Klasse II (Doyle und Strominger, Nature 330: 256–259 (1987)). ”Homing-Rezeptoren” sind für die Kontrolle der Lymphozytenmigration wichtig (Stoolman, Cell 56: 907–910 (1989)). VLA-Glycoproteine sind Integrine, die eine Adhäsion an extrazelluläre Matrixkomponenten erfordernde Lymphozytenfunktionen zu vermitteln scheinen (Hemler, oben): Die CD2/LFA-3-, LFA-1/ICAM-1- und ICAM-2- und VLA-Adhäsionssysteme sind weitverbreitet bei einer Vielzahl von Zelltypen (Springer et al., (1987), oben; Shaw und Shimuzu, (1988), oben und Hemler, (1988), oben).
Vor vielen Jahren schlug man vor, dass die B-Lymphozytenaktivierung zwei Signale erfordert (Bretscher und Cohn, Science 169: 1042–1049 (1970)); nunmehr glaubt man, dass sämtliche Lymphozyten zwei Signale für ihre optimale Aktivierung benötigen, nämlich ein antigenspezifisches oder klonales Signal sowie ein zweites antigenunspezifisches Signal (Janeway, oben). Freeman et al. (J. Immunol. 143(8): 2714–2722 (1989)) isolierten und sequenzierten einen cDNA-Klon, der für ein vom mAk B7 erkanntes B-Zell-Aktivierungsantigen kodierte (Freeman et al., J. Immunol. 138: 3260 (1987)). Es wurde gezeigt, dass mit dieser cDNA transfizierte COS-Zellen sowohl mit markiertem mAk B7 als auch mit markiertem mAk BB-1 angefärbt werden konnten (Clark et al., Human Immunol. 16: 100–113 (1986); Yokochi et al., J. Immunol. 128: 823 (1981); Freeman et al., (1989), oben; und Freedman et al., (1987), oben)). Überdies konnte die Expression dieses Antigens auf Zellen anderer Abstammung wie Monozyten nachgewiesen werden (Freeman et al., oben).
Die für eine T-Helferzell-Antigenantwort (T_h-Antigenantwort) erforderlichen Signale werden von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) zur Verfügung gestellt. Das erste Signal wird durch die Interaktion des T-Zell-Rezeptorkomplexes (Weiss, J. Clin. Invest. 86: 1015 (1990) mit einem in Zusammenhang mit Haupthistokompatibilitätskomplex-Molekülen (MHC-Molekülen) auf der APC präsentierten Antigen initiiert (Allen, Immunol. Today 8: 270 (1987)). Dieses antigenspezifische Signal reicht nicht aus, um eine vollständige Antwort zu erzeugen; das Fehlen eines zweiten Signals kann durchaus zur klonalen Inaktivierung oder Anergie führen (Schwartz, Science 248: 1349 (1990)). Das Erfordernis eines zweiten ”costimulierenden”, durch den MHC zur Verfügung gestellten Signals wurde in mehreren experimentellen Systemen belegt (Schwartz, oben; Weaver und Unanue, Immunol. Today 11: 49 (1990)). Die molekulare Art dieses zweiten Signals (oder Signale) wird nicht ganz verstanden, obwohl es in einigen Fällen klar ist, dass sowohl wasserlösliche Moleküle, wie Interleukin-1 (IL-1) (Weaver und Unanue, oben) als auch an intrazellulärer Adhäsion beteiligte Membranrezeptoren (Springer, Nature 346: 425 (1990)) costimulierende Signale zur Verfügung stellen können.
CD28-Antigen, ein homodimeres Glycoprotein der Immunglobulin-Superfamilie (Aruffo und Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8573–8577 (1987)) ist ein auf den meisten reifen menschlichen T-Zellen zu findendes akzessorisches Molekül (Damle et al., J. Immunol. 131: 2296–2300 (1983)). Derzeit spricht einiges dafür, dass dieses Molekül in einem alternativen T-Zell-Aktivierungsweg arbeitet, der sich von demjenigen unterscheidet, der durch den T-Zell-Rezeptorkomplex initiiert wird. (June et al., Mol. Cell. Biol. 7: 4472–4481 (1987)). Gegenüber CD28-Antigen reaktive monoklonale Antikörper (mAk) können durch verschiedene polyklonale Stimuli initiierte T-Zellantworten verstärken (Zusammenstellung durch June et al., oben). Diese stimulierenden Wirkungen können von einer mAk-induzierten Zytokinproduktion (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 1333–1337 (1989); und Lindsten et al., Science 244.339–343 (1989)) in Folge erhöhter mRNA-Stabilisierung (Lindsten et al., (1989), oben) herrühren. Anti-CD28-mAk können auch hemmend wirken, d. h. sie können autologe gemischte Lymphozytenreaktionen (Damle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 5096–6001 (1981)) und die Aktivierung antigenspezifischer T-Zellklone (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 16: 1289–1296 (1986)) blockieren.
Untersuchungen haben gezeigt, dass CD28 ein Gegenrezeptor für das B-Zell-Aktivierungsantigen B7/BB-1 ist (Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 87: 5031–5035 (1990)). Zur Vereinfachung wird das B7/BB-1-Antigen nachfolgend als ”B7-Antigen” bezeichnet. Man hat Interaktionen zwischen CD28 und B7-Antigen charakterisiert, indem man extrazelluläre Abschnitte des B7-Antigens und CD28-Rezeptors mit Immunglobulin (Ig) Cγ1 (konstante Region der schweren Ketten) genetisch fusioniert hat (Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721–730 (1991)). Es wurde gezeigt, dass immobilisiertes B7Ig-Fusionsprotein ebenso wie B7-positive CHO-Zellen die T-Zellproliferation costimulieren. Auch die T-Zellstimulation mit B7-positiven CHO-Zellen stimuliert spezifisch erhöhte Spiegel an Transkripten für IL-2. Weiterführende Untersuchungen haben gezeigt, dass anti-CD28-mAk die durch zelluläre Interaktionen mit einer B-Zell-Leukämie-Linie induzierte IL-2-Produktion in gewissen T-Zell-Leukämie-Zelllinien inhibierte (Kohno et al., Cell. Immunol. 131-1-10 (1990)).
CD28 besitzt eine einzelne extrazelluläre, der variablen (V)-Region ähnlichen Domäne (Aruffo und Seed, oben). Ein homologes Molekül, CTLA4, wurde durch differentielles Screenen einer murinen, cytologischen T-Zell-cDNA-Bank identifiziert (Brunet et al., Nature 328: 267–270 (1987)). Es wurden Transkripte für dieses Molekül in T-Zellpopulationen mit cytotoxischer Aktivität gefunden, was nahelegt, dass CTLA4 bei der cytolytischen Antwort wirken könnte (Brunet et al., oben; und Brunet et al., Immunol. Rev. 103-21-36 (1988)). Forscher haben über die Klonierung und Kartierung eines Gens für das menschliche Gegenstück von CTLA4 (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901–1905 (1988)) in demselben chromosomalen Abschnitt (2q33-34) wie CD28 berichtet (Lafage-Pochitaloff et al., Immunogenetics 31: 198–201 (1990)). Ein Sequenzvergleich zwischen dieser menschlichen CTLA4-DNA und derjenigen für CD28-Proteine kodierenden ergibt signifikante Sequenzhomologien, wobei das Maß an Homologie im Zwischenmembranbereich und in cytoplasmatischen Abschnitten am größten ist (Brunet et al., 1988, oben; Dariavach et al., 1988, oben)).
Das hohe Maß an Homologie zwischen CD28 und CTLA4 zusammen mit der Colokalisierung ihrer Gene wirft die Frage auf, ob diese Moleküle auch funktionell miteinander in Beziehung stehen. Da allerdings das Proteinprodukt von CTLA4 noch nicht mit Erfolg exprimiert werden konnte, bleibt die Frage unbeantwortet.
Die Expression löslicher Derivate von Zelloberflächen-Glycoproteinen der Immunglobulingen-Superfamilie wurde für CD4, dem Rezeptor für HIV-1, und für CD28 und B7-Rezeptoren vollbracht, indem man Hybridfusionsmoleküle verwendete, die aus DNA-Sequenzen bestanden, welche für Aminosäuren kodierten, die Abschnitten der mit Antikörperdomänen (Immunglobulin γ1) fusionierten extrazellulären Domäne des CD4-Rezeptors entsprachen (Capon et al., Nature 337: 525–531 (1989) (CD4) und Linsley et al., J. Exp. Med., oben (CD28 und B7)).
Es wäre nützlich, ein lösliches Proteinprodukt von bislang nicht exprimiertem CTLA4-Gen zu exprimieren und einen natürlichen Liganden für CTLA4 zu identifizieren, der an der funktionellen Antwort von T-Zellen beteiligt ist. Das lösliche Proteinprodukt könnte dann zur Regulierung der T-Zellantwort in vivo verwendet werden, um pathologische Zustände zu behandeln.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung CTLA4-Rezeptorprotein, für das die in 3 dargestellte Nukleotidsequenz kodiert, die bei Nukleotid + 76 (SEQ ID Nrn: 13 und 14) beginnt, und das reaktiv gegenüber dem Antigen B7 ist; die vorliegende Erfindung identifiziert B7-Antigen als natürlichen Liganden für den CTLA4-Rezeptor. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Expression dieser DNA als Produkt eines Fusionsproteins aus CTLA4 und Immunglobulin (Ig). Zu den Ausführungsformen der Erfindung zählen CTLA4Ig-Fusionsprotein und Hybridfusionsproteine einschließlich CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionsproteine. Die Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung eines Liganden für das B7-Antigen zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels mit Verwendbarkeit zur Regulierung von Wechselwirkungen zwischen CTLA4-positiven T-Zellen und B7-positiven Zellen, wobei der Ligand in die Reaktion von endogenem B7-Antigen mit CTLA4 einzugreifen vermag und der Ligand ein Fusionsprotein ist, das wenigstens einen Teil der extrazellulären Domäne von CTLA4 enthält.. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Liganden für CTLA4 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels mit Verwendbarkeit zur Regulierung von Wechselwirkungen zwischen CTLA4-positiven Zellen und anderen Zellen, wobei der Ligand die Wechselwirkung von CTLA4-positiven T-Zellen mit B7-positiven Zellen zu hemmen vermag und der Ligand ein gegenüber CTLA4 reaktiver monoklonaler Antikörper ist. Die Erfindung betrifft ebenfalls Verwendungen des CTLA4-Fusionsproteins und der monoklonalen Antikörper, die gegenüber CTLA4 reaktiv sind, zur Regulierung zellulärer Interaktionen und Immunantworten.
Das erfindungsgemäße menschliche CTLA-Rezeptorprotein wird durch 187 Aminosäuren kodiert und besitzt eine neu identifizierte N-gekoppelte Glycosylierungsstelle.
Das erfindungsgemäße CTLA4Ig-Fusionsprotein bindet an das auf aktivierten B-Zellen und Zellen anderer Linien exprimierte B7-Antigen, einen Liganden für den CD28-Rezeptor auf T-Zellen. CTLA4Ig bindet B7-Antigen mit signifikant höherer Affinität als B7 an den CD28-Rezeptor bindet. Das CTLA4Ig-Konstrukt besitzt eine erste Aminosäuresequenz, die der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptors entspricht und mit einer zweiten Aminosäuresequenz fusioniert ist, die der menschlichen Ig-Cγ1-Domäne entspricht. Die erste Aminosäuresequenz enthält Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entspricht, und ist mit einer zweiten Aminosäuresequenz verbunden, die Aminosäurereste enthält, welche den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen des menschlichen IgCγ1 entspricht. Das Fusionsprotein wird vorzugsweise in dimerer Form hergestellt. Lösliches CTLA4Ig ist in vitro ein starker Inhibitor von T- und B-Lymphozytenantworten.
Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind Hybridfusionsproteine, wie CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionsproteine, mit einer ersten Aminosäuresequenz, die Fragmenten der extrazellulären Domäne von CD28 entspricht, und die verbunden ist mit einer zweiten Aminosäuresequenz, die Fragmenten der extrazellulären Domäne von CTLA4Ig entspricht, und einer dritten Aminosäuresequenz, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen des menschlichen IgCγ1 entspricht. Eine Ausführungsform des Hybridfusionsproteins ist ein CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionskonstrukt mit einer ersten Aminosäuresequenz, die Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 94 derjenigen Aminosäuresequenz enthält, die der extrazellulären Domäne von CD28 entspricht, und die verbunden ist mit einer zweiten Aminosäuresequenz, die Aminosäurereste von etwa Position 94 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz enthält, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entspricht, und die verbunden ist mit einer dritten Aminosäuresequenz, die diejenigen Aminosäurereste enthält, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen des menschlichen IgCγ1 entsprechen.
Eine neue Ovarzelllinie von chinesischen Hamstern, die CTLA4Ig-Fusionsprotein stabil exprimiert, wird ebenfalls offenbart. Weitere bevorzugte Ausführungsformen können den anliegenden Ansprüchen entnommen werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Diagrammdarstellung des CTLA4Ig-Fusionskonstrukts, so unten in Beispiel 2 beschrieben.
2 ist ein Foto eines Gels, das durch SDS-PAGE-chromatographische Reinigung von CTLA4Ig erhalten wurde, so unten in Beispiel 2 beschrieben.
3 zeigt die komplette Aminosäuresequenz, die den mit dem Oncostatin M-Signalpeptid (Position –25 bis –1) fusionierten, menschlichen CTLA4-Rezeptor (SEQ ID Nrn: 13 und 14) kodiert und die neu identifizierte N-gekoppelte Glycosylierungsstelle (Position 109–111) mit einbezieht, so unten in Beispiel 3 beschrieben.
4 zeigt die Resultate der FACS^R-Analyse für die Bindung des B7Ig-Fusionsproteins an CD28- und CTLA4-transfizierte COS-Zellen, so unten in Beispiel 4 beschrieben.
5 zeigt die Resultate der FACS^R-Analyse für die Bindung von gereinigtem CTLA4Ig an B7-Antigen-positive (B7⁺) CHO-Zellen und an eine lymphoblastoide Zelllinie (PM-LCL), so unten in Beispiel 4 beschrieben.
6 ist ein Graph, der die kompetitive Bindungsanalyse von ¹²⁵I-markiertem B7Ig an immobilisiertes CTLA4Ig veranschaulicht, so unten in Beispiel 4 beschrieben.
7 ist ein Graph, der die Resultate der Scatchard-Analyse für die Bindung von ¹²⁵I-markiertem B7Ig an immobilisiertes CTLA4Ig zeigt, so beschrieben in Beispiel 4 unten.
8 ist ein Foto eines Gels aus der SDS-PAGE-Chromatographie der Immunpräzipitationsanalyse von B7-positiven CHO-Zellen und ¹²⁵I-markierten PM-LCL-Zellen, so unten in Beispiel 4 beschrieben.
9 ist ein Graph, der die mit [³H]-Thymidin-Einbau gemessenen Wirkungen von CTLA4Ig auf die Proliferation von T-Zellen zeigt, so unten in Beispiel 4 beschrieben.
10 ist ein Balkendiagramm, das die mit Enzymimmunoassay (ELISA) bestimmten Wirkungen von CTLA4Ig auf die T-Helferzell (T_h)-induzierte Immunglobulinsekretion durch menschliche B-Zellen veranschaulicht, so unten in Beispiel 4 beschrieben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Zum besseren Verständnis der Erfindung wird die folgende Beschreibung gegeben.
Diese Erfindung betrifft die Isolierung und Expression des auf T-Zelloberflächen zu findenden humanen CTLA4-Rezeptors, der an das auf aktivierten B-Zellen und Zellen anderer Linien exprimierte B7-Antigen bindet, und die Expression löslicher Fusionsprotein-Produkte des CTLA4-Rezeptorgens.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die komplette und korrekte DNA-Sequenz, die für diejenige Aminosäuresequenz kodiert, die dem erfindungsgemäßen menschlichen CTLA4-Rezeptorprotein entspricht, unter Verwendung der PCR kloniert. Wie ausführlich unten in den Beispielen beschrieben, wurde die cDNA, welche die komplette vorhergesagte kodierende Sequenz von CTLA4 enthielt, aus zwei PCR-Fragmentamplifikaten von H38-RNA zusammengesetzt und in den Expressionsvektor CDM8 insertiert. Wie von Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721.730 (1991) beschrieben, wurden Isolate in COS-Zellen transfiziert und auf die Bindung von B7Ig, einem löslichen Fusionsprotein mit einer Aminosäuresequenz, die der extrazellulären Domäne von B7 und einer menschlichen Immunglobulin (Ig)-Cγ1-Region entsprach, getestet.
Die DNA-Sequenz eines Isolats, OMCTLA4 genannt, wurde dann bestimmt, und man fand, dass sie exakt der vorhergesagten, am N-Terminus mit dem Oncostatin M-Signalpeptid fusionierten, menschlichen CTLA4-Sequenz entsprach. Der CTLA4-Rezeptor wird durch 187 Aminosäuren kodiert (ohne Signalpeptid und Stop-Codons) und beinhaltet eine neu identifizierte N-gekoppelte Glycosylierungsstelle an den Aminosäurepositionen 109–111 (siehe 3 unten). Der CTLA4-Rezeptor wird exprimiert, indem man das Oncostatin M-Signalpeptid verwendet.
So betrifft die vorliegende Erfindung ein CTLA4-Rezeptorprotein, für das die in 3 dargestellte Nukleotidsequenz kodiert, die bei Nukleotid +76 (SEQ ID Nrn: 13 und 14) beginnt, und das reaktiv gegenüber dem Antigen B7 ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden lösliche Formen des Proteinprodukts des CTLA4-Rezeptorgens (CTLA4Ig) hergestellt, indem man Fusionsproteine mit einer ersten Aminosäuresequenz, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entspricht, und einer zweiten Aminosäuresequenz, die der menschlichen IgCγ1-Domäne entspricht, verwendet. Klonierungs- und Expressionsplasmide (CDM8 und πLN) wurden konstruiert, die cDNAs enthalten, welche für Aminosäuresequenzabschnitte kodieren, die auf Basis der hier beschriebenen cDNA-Sequenz dem menschlichen CTLA4-Rezeptor entsprechen, worin die cDNA, die für eine erste, einem Fragment der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptorgens entsprechende Aminosäuresequenz kodiert, verbunden ist mit DNA, die für eine zweite, einer IgC-Region entsprechenden Aminosäuresequenz kodiert, was die Expression des CTLA4-Rezeptorgens durch Veränderung der Löslichkeit des exprimierten CTLA4-Proteins zulässt. Somit wird lösliches CTLA4Ig-Fusionsprotein durch eine erste Aminosäuresequenz kodiert, die Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäurensequenz enthält, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entspricht, und die mit einer zweiten Aminosäuresequenz verbunden ist, welche Aminosäurereste enthält, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von menschlichem IgCγ1 entspricht. Das Fusionsprotein wird vorzugsweise in dimerer Form hergestellt. Das Konstrukt wurde dann in COS- oder CHO-Zellen transfiziert, und CTLA4Ig wurde gereinigt und als Dimer identifiziert.
DNA, die für diejenige Aminosäuresequenz kodiert, die dem CTLA4Ig-Fusionsprotein entspricht, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, Maryland unter den Voraussetzungen des Budapester Vertrags am 31. Mai 1991 hinterlegt; ihr wurde die ATCC-Hinterlegungsnummer 68629 zugeteilt.
Die vorliegende Erfindung betrifft das erste Proteinprodukt eines CDLA4-Transkripts in Form eines löslichen Fusionsproteins. Das CTLA4Ig-Protein bildet ein Disulfid-gekoppeltes Dimer aus Untereinheiten mit einem M_r von annähernd 50 000, ein Hinweis darauf, dass natives CTLA4 wahrscheinlich als ein Disulfid-gekoppeltes Homodimer auf der T-Zelloberfläche vorkommt.
Es wurde gezeigt, dass B7-Antigen ein Ligand für den CD28-Rezeptor auf T-Zellen ist (Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Sci- USA, oben). Das CTLA4-Rezeptormolekül scheint funktionell und strukturell mit dem CD28-Rezeptor verwandt zu sein; beides sind Rezeptoren für das B-Zell-Aktivierungsantigen B7, während CTLA4 eine höhere Affinität für B7 zu haben scheint, die zu den höchsten gehört, über die jemals für lymphoide Adhäsionssysteme berichtet wurde. Es wurde allerdings gezeigt, dass CTLA4Ig stärker an B7-positive (B7⁺) Zelllinien bindet als CD28Ig. Weitere Experimente zeigten, dass CTLA4 ein Rezeptor mit höherer Affinität für B7-Antigen ist als der CD28-Rezeptor. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass CTLA4Ig an ein einzelnes Protein auf Lymphoblastoidzellen bindet, welches dem B7-Antigen in der Größe ähnlich ist. CTLA4Ig inhibierte die T-Zellproliferation und inhibierte die T_h-induzierte IgM-Produktion.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wurden Hybridfusionsproteine mit Aminosäuresequenzen, die den Fragmenten verschiedener Rezeptorproteine entsprachen, konstruiert. Beispielsweise wurden Aminosäuresequenzen, die ausgewählten Fragmenten extrazellulärer Domänen von CD28 und CTLA4 entsprachen, miteinander gekoppelt, um CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsproteine zu bilden. So wurde ein CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionsprotein mit einer ersten Aminosäuresequenz erhalten, welche Aminosäurereste enthielt, die einem Fragment der extrazellulären Domäne von CD28 entsprachen, und die mit einer zweiten Aminosäuresequenz, die einem Fragment der extrazellulären Domäne von CTLA4Ig entsprach, und mit einer dritten Aminosäuresequenz, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von menschlichem IgCγ1 entsprach, verbunden war. Eine Ausführungsform des Hybridfusionsproteins ist ein CD28Ig/CTLA4Ig-Fusionskonstrukt mit einer ersten Aminosäuresequenz, die Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 94 derjenigen Aminosäuresequenz enthielt, die der extrazellulären Domäne von CD28 entsprach, und die mit einer zweiten Aminosäuresequenz verbunden war, welche Aminosäurereste von etwa Position 94 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz enthielt, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entsprach, und die mit einer dritten Aminosäuresequenz verbunden war, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von menschlichem IgCγ1 entsprach.
Techniken zur Klonierung und Expression von DNA-Sequenzen, die für diejenigen Aminosäuresequenzen kodieren, die dem CTLA4-Rezeptorprotein, den löslichen Fusionsproteinen und Hybridfusionsproteinen entsprechen, beispielsweise Oligonukleotidsynthesen, PCR, Zelltransformation, Vektorkonstruktion, Expressionssysteme und dergleichen sind dem Fachmann bekannt, und die meisten Praktiker sind mit den Standardmaterialien für spezifische Bedingungen und Vorgehensweisen vertraut. Allerdings werden die folgenden Ausführungen zweckmäßigerweise und zur Aufzeichnung gegebenenfalls erforderlicher Modifikationen zur Verfügung gestellt; sie können als Richtlinie dienen.
Klonierung und Expression von kodierenden Sequenzen für Rezeptoren und Fusionsproteine
Wie von Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721–730 (1991) beschrieben und hier unter Bezugnahme eingeführt, wurden CD28, IgCγ1 und B71gCγ1 entsprechende Fusionsproteinkonstrukte zur Charakterisierung des erfindungsgemäßen CTLA4Ig und zur Herstellung von CD28Ig/CTLA4Ig-Fusions-hybriden hergestellt. Alternativ können cDNA-Klone aus RNA hergestellt werden, die aus B7-Antigen und CD28-Rezeptor exprimierenden Zellen erhalten wurde, und zwar auf Grundlage des Wissen über die publizierten Sequenzen dieser Proteine (Aruffo und Seed, und Freeman, oben), wobei man standardmäßig vorgeht.
CTLA4Ig-Fusionsprodukte aus DNA, die für diejenigen Aminosäuresequenzen kodierte, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 und den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von menschlichem IgCγ1 entsprachen, wurden durch Ligation von PCR-Fragmenten konstruiert. Die Aminosäuresequenz-kodierende cDNA wird unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktionstechnik (”PCR-Technik”) amplifiziert (siehe U.S. Patent Nrn. 4,683,195 und 4,683,202 an Mullis et al., und Mullis & Faloona, Methods Enzymol. 154: 335–350 (1987)). Es wurden CTLA4Ig-Fusionsprodukte erhalten, die DNA aufwiesen, die für Aminosäuresequenzen mit Aminosäureresten von etwa Position 1 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz kodierte, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 entsprach, und die DNA aufwiesen, welche für Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von IgCγ1 entsprachen.
Da zuvor noch nicht über die Expression von CTLA4-Rezeptorprotein in menschlichen Lymphoidzellen berichtet worden war, war es erforderlich, eine Quelle für CTLA4-mRNA auszumachen. PCR-cDNA aus zellulärer Gesamt-RNA mehrerer menschlicher Leukämiezelllinien wurde gescreent, wobei man als Primer Oligonukleotide der veröffentlichten Sequenz des CTLA4-Gens verwendete (Dariavach et al., oben). Von der getesteten cDNA ergaben H38-Zellen (eine HTLV II-assoziierte Leukämielinie) die besten Ausbeuten an PCR-Produkten mit der erwarteten Größe. Da ein Signalpeptid für CTLA4 im CTLA4-Gen nicht identifiziert wurde, wurde der N-Terminus der vorhergesagten Sequenz von CTLA4 mit dem Signalpeptid des Oncostatin M (Malik et al., Molec. und Cell. Biol. 9: 2847 (1989)) in zwei Schritten fusioniert, wobei man unten in den Beispielen beschriebene Oligonukleotide verwendete. Das Produkt aus der PCR-Reaktion wurde mit cDNA, die für die diejenigen Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von IgCγ1 entsprachen, in einen Expressionsvektor, wie CDM8 oder πLN, ligiert.
Um eine DNA zu erhalten, die für menschliches ”full-length” CTLA4 kodierte, wurde aus H38-Zellen durch PCR eine cDNA erhalten, die für die Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen von CTLA4 kodierte, und mit einem in Anlehnung an obige Beschreibung erhaltenen Fragment aus CTLA4Ig, welches das mit dem N-Terminus von CTLA4 fusionierte Oncostatin M-Signalpeptid kodierte, verbunden, wobei man Oligonukleotid-Primer in Anlehnung an die Beschreibung unten in den Beispielen verwendete. PCR-Fragmente wurden in den Plasmid CDM8 ligiert, was zu einem Expressionplasmid führte, der das ”full-length” CTLA4-Gen kodierte, und der OMCTLA4 genannt wurde.
Zwecks Konstruktion von DNA, die für Hybridfusionsproteinen entsprechende Aminosauresequenzen kodierte, wurde DNA, die für diejenigen Aminosäuren kodierte, die den Abschnitten der extrazellulären Domäne eines Rezeptorgens entsprachen, mit DNA, die für diejenigen Aminosäuren kodierte, die Abschnitten der extrazellulären Domäne eines weiteren Rezeptorgens entsprachen, und mit DNA, die für diejenigen Aminosauresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von menschlichem IgCγ1 entsprachen, verbunden, indem man wie oben für die B7Ig-, CD28Ig- und CTLA4Ig-Konstrukte beschrieben vorging. So wurde beispielsweise DNA, die für Aminosäurereste von etwa Position 1 bis etwa Position 94 derjenigen Aminosäuresequenz kodierte, die der extrazellulären Domäne des CD28-Rezeptors entsprach, mit DNA, die für Aminosäurereste von etwa Position 94 bis etwa Position 125 derjenigen Aminosäuresequenz kodierte, die der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptors entsprach, und mit DNA, die für diejenigen Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von menschlichem IgCγ1 entsprach, verbunden.
Um große Mengen klonierter DNA herzustellen, werden Vektoren, die DNA enthalten, die für die erfindungsgemäßen Fusionskonstrukte kodiert, in geeignete Wirtszellen, wie die Bakterienzelllinie E. coli-Stamm MC1061/p3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) transformiert, wobei man standardmäßig vorgeht, und Kolonien werden auf zweckmäßige Plasmide gescreent.
Die in Anlehnung an obige Beschreibung erhaltenen, Fusionskonstrukt-kodierende DNA enthaltenden Klone werden dann in geeignete Wirtszellen zur Expression transfiziert. Je nach verwendeter Wirtszelle werden standardmäßige Techniken, die für derartige Zellen zweckmäßig sind, verwendet, um die Transfektion durchzuführen. Beispielsweise gelingt die Transfektion in Säugetierzellen, indem die DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, die ”CaPO₄”-Copräzipitation, die Lipofektion, die Elektroporation oder die Protoplastfusion, und andere dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet, zu denen die Lysozymfusion oder Erythrozytenfusion, das ”Scraping”, die Direktaufnahme, der osmotische oder Sucroseschock, die direkte Mikroinjektion, die indirekte Mikroinjektion, beispielsweise über Erythrozyten-vermittelte Techniken, und/oder das Anlegen von elektrischen Strömen an Wirtszellen gehören. Die obige Liste von Transfektionstechniken soll nicht als abschließend betrachtet werden, da weitere Vorgehensweisen zur Einführung genetischer Information in Zellen ohne Zweifel entwickelt werden.
Bevorzugt wird die Expression in eukaryotischen Wirtszellkulturen, die sich von vielzelligen Organismen ableiten (siehe Tissue Cultures, Academic Press, Cruz und Patterson, Eds. (1973)). Diese Systeme besitzen den zusätzlichen Vorteil, Introne splicen zu können; sie können daher direkt zur Expression genomischer Fragmente verwendet werden. Zu den brauchbaren Wirtszelllinien gehören Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Affennierenzellen (COS), VERO- und HeLa-Zellen. Erfindungsgemäß sind Zelllinien bevorzugt, die das Fusionskonstrukt stabil exprimieren.
Üblicherweise beinhalten Expressionsvektoren für derartige Zellen Promotoren und Kontrollsequenzen, die mit Säugetierzellen kompatibel sind, wie beispielsweise der CMV-Promotor (CDM8-Vektor) und der Avian-Sarkoma-Virus (ASV) (πLN-Vektor). Zu weiteren üblicherweise verwendeten, frühen und späten Promotoren gehören diejenigen des Simian-Virus-40 (SV 40) (Fiers, et al., Nature 273: 113 (1973)), oder weitere virale Promotoren, wie diejenigen, die sich von Polyoma, Adenovirus 2 und Rinder-Papilloma-Virus ableiten. Der steuerbare Promotor hMTII (Karin, et al., Nature 299: 797–802 (1982)) kann ebenfalls verwendet werden. Allgemeine Aspekte zu Transformationen mit Säugetierzell-Wirtssystemen wurden von Axel ( U.S. Patent Nr. 4,399,216 , erteilt am 16. August 1983) beschrieben. Mittlerweile scheinen ”Enhancer”-Regionen für eine Optimierung der Expression wichtig zu sein; dies sind im Allgemeinen stromaufwärts oder stromabwärts von der Promotorregion zu findende Sequenzen in nichtkodierenden DNA-Regionen. Replikationsstartpunkte können erforderlichenfalls aus viralen Quellen erhalten werden. Allerdings ist die Integration in das Chromosom ein allgemeiner Mechanismus für die DNA-Replikation in Eukaryoten.
Wenngleich zu den bevorzugten Wirtszellen für die Expression der Fusionskonstrukte eukaryotische Zellen, wie COS- oder CHO-Zellen, gehören, können andere eukaryotische Mikroben als Wirte verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe, werden meistens verwendet, wenngleich andere Stämme, wie Schizosaccharomyces pombe verwendet werden können. Verwendet werden können Vektoren, die beispielsweise auf den 2 μ Replikationsstartpunkt von Broach, Meth. Enz. 101: 307 (1983), oder auf andere Hefe-kompatible Replikationsstartpunkte zurückgreifen (siehe beispielsweise Stinchcomb et al., Nature 282: 39 (1979)); Tschempe et al., Gene 10: 157 (1980); und Clarke et al., Meth. Enz. 101: 300 (1983)). Zu den Kontrollsequenzen für Hefevektoren gehören Promotoren für die Synthese glycolytischer Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17: 4900 (1978)). Zu weiteren dem Fachmann bekannten Promotoren gehören der in dem CDM8-Vektor zur Verfügung gestellte CMV-Promotor (Toyama und Okayama, FEBS 268: 217–221 (1990); der Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)) und diejenigen für andere glycolytische Enzyme. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Promotorregionen für die Alkoholdehydrogenase 2, das Isocytochrom C, die saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus zusammenhängende degradierende Enzyme, sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galaktoseverwertung zuständig sind. Ebenfalls glaubt man, dass Terminatorsequenzen am 3'-Ende der kodierenden Sequenzen wünschenswert sind. Derartige Terminatoren werden in der 3'- nichttranslatierten Region im Anschluss an die kodierenden Sequenzen in Hefe-abgeleiteten Genen gefunden.
Alternativ können prokaryotische Zellen als Expressionswirte verwendet werden. Am häufigsten sind Prokaryoten durch verschiedene Stämme von E. coli vertreten. Allerdings können auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden. Zu üblicherweise verwendeten prokaryotischen Kontrollsequenzen, die hier definitionsgemäß Promotoren zur Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls mit einem Operator und zusammen mit Sequenzen für Ribosombindungsstellen mit einbeziehen sollen, gehören üblicherweise verwendete Promotoren, wie die beta-Lactamase(Penicillinase)- und Laktose (lac)-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 198: 1056 (1977)), das Tryptophan(trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)) und der von Lambda abgeleitete P_L-Promotor und N-Gen-Ribosombindungsstelle (Shimatake et al., Nature 292: 128 (1981)).
Die Nukleotidsequenzen, die für CD28Ig- und CTLA4Ig-Proteine und für Fusionshybridproteine, wie CD28Ig/CTLA4Ig, kodieren, können in einer Vielzahl von nachfolgend beschriebenen Systemen exprimiert werden. Die cDNA kann mit geeigneten Restriktionsenzymen herausgeschnitten werden und in geeignete prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren für eine derartige Expression ligiert werden. Da CD28- und CTLA4-Rezeptorproteine in der Natur als Dimere vorkommen, glaubt man, dass eine erfolgreiche Expression dieser Proteine ein Expressionssystem erfordert, das diese Proteine als Dimere zu bilden vermag. Verkürzte Versionen dieser Proteine (d. h. durch Einführung eines Stop-Codons in die Sequenz an einer Position stromaufwärts der Transmembran-Region des Proteins gebildet) scheinen nicht exprimiert zu werden. Durch die Expression von CD28- und CTLA4-Rezeptoren als Fusionsproteine vermag man Dimere dieser Proteine zu bilden. Die Expression von CTLA4-Protein als Fusionsprodukt ist daher erfindungsgemäß bevorzugt.
Eine erfindungsgemäße stabile CHO-Linie, Ovarzelllinie des chinesischen Hamsters CTLA4Ig-24 genannt, wird zur Expression von CTLA4Ig bevorzugt und ist gemäß dem Budapester Vertrag bei der ATCC am 31. Mai 1991 hinterlegt worden; ihr wurde die ATCC-Hinterlegungsnummer 10762 zugeteilt.
Die Expression des erfindungsgemäßen CTLA4-Rezeptors gelingt, indem man eine Zelllinie, wie COS-Zellen, transfiziert und die Expression über die Bindung der CTLA4-transfizierten Zellen an einen Liganden für den CTLA4-Rezeptor nachweist, beispielsweise indem man auf die Bindung der Zellen an B7Ig-Fusionsprotein testet.
Sequenzen der resultierenden Konstrukte werden durch DNA-Sequenzierung bestätigt, indem man bekanntermaßen vorgeht, beispielsweise wie von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977), oder auch von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981) beschrieben, oder mit dem Verfahren von Maxam et al., Methods Enzymol. 65: 499 (1980)).
Gewinnung der Proteinprodukte
Wie oben erläutert, werden CD28- und CTLA4-Rezeptorgene nicht ohne weiteres als reife Proteine exprimiert, wenn man die für das verkürzte Protein kodierende DNA direkt exprimiert. Um die Bildung eines Homodimers zu ermöglichen, wird DNA, die für diejenige Aminosäuresequenz kodiert, die den extrazellulären Domänen von CD28 und CTLA4 entspricht und die Codons für eine Signalsequenz, wie derjenigen des Oncostatin M, in zur zweckmäßigen Prozessierung befähigten Zellen mit einbezieht, mit DNA fusioniert, die für diejenige Aminosäuresequenz kodiert, die der Fc-Domäne eines natürlich vorkommenden dimeren Proteins entspricht. Die Reinigung dieser Fusionsproteinprodukte nach Sekretion aus den Zellen wird also erleichtert, indem man Antikörper verwendet, die gegenüber dem anti-Immunglobulin-Abschnitt der Fusionsproteine reaktiv sind. Bei Sekretion in das Medium wird das Fusionsproteinprodukt gewonnen, indem man Standardtechniken zur Proteinreinigung verwendet, beispielsweise indem man Protein A-Säulen einsetzt.
Verwendung
CTLA4Ig-Fusionsprotein und/oder Fragmente des Fusionsproteins können für die Reaktion mit B7-positiven Zellen, wie B-Zellen, verwendet werden, um durch T-Zellinteraktionen mit B7-Antigen-positiven Zellen vermittelte Immunantworten zu regulieren.
CTLA4Ig-Fusionsprotein und CTLA4Ig/CD28Ig-Hybrid-Proteine und/oder Fragmente und Derivate dieser Proteine können ebenfalls für die Reaktion mit B7-positiven Zellen, einschließlich B-Zellen, verwendet werden, um durch T-Zell-abhängige B-Zellantworten vermittelte Immunantworten zu regulieren. Der Ausdruck ”Fragment” meint hier einen Abschnitt derjenigen Aminosäuresequenz, die das als ”CTLA4” bezeichnete Protein kodiert. Ein verwendbares Fragment des CTLA4Ig-Fusionsproteins ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die einem Abschnitt derjenigen Aminosäuresequenz entspricht, die dem CTLA4-Rezeptor entspricht, der verwendet wurde, um das hier beschriebene CTLA4Ig-Fusionsprotein zu erhalten.
Das auf aktivierten B-Zellen und Zellen anderer Linien exprimierte B7-Antigen und der auf T-Zellen exprimierte CD28-Rezeptor können direkt aneinander binden, und diese Interaktion kann Zell-Zell-Interaktionen vermitteln. Derartige Interaktionen triggern direkt den CD28-Aktivierungsweg in T-Zellen, was zur Zytokinproduktion, zur T-Zellproliferation und B-Zelldifferenzierung in Immunglobulin produzierenden Zellen führt. Die stattfindende Aktivierung von B-Zellen kann eine erhöhte Expression von B7-Antigen und eine weitere CD28-Stimulation verursachen, was zu einem chronischen Entzündungszustand führt, wie bei Autoimmunerkrankungen, der Fremdtransplantatabstoßung, der Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung oder chronischen allergischen Reaktionen. Diese Reaktionen können effektiv blockiert oder inhibiert werden, indem man die Zytokinproduktion durch T-Zellen verhindert und damit entzündliche Reaktionen verhindert oder umkehrt.
Hier wird gezeigt, dass CTLA4Ig ein starker Inhibitor von in vitro-Lymphozytenfunktionen ist, die T- und B-Zellinteraktionen erfordern. Dies ist ein Hinweis auf die Wichtigkeit von Interaktionen zwischen dem B7-Antigen und dessen Gegenrezeptoren CTLA4 und/oder CD28. Die cytoplasmatischen Domänen von murinem und menschlichem CTLA4 sind sich ähnlich (Dariavach et al., oben, 1988), was nahelegt, dass diese Region wichtige funktionelle Eigenschaften besitzt. Auch die cytoplasmatischen Domänen von CD28 und CTLA4 weisen Homologie auf.
CTLA4 ist in vitro ein stärkerer Inhibitor von Lymphozytenantworten, als anti-BB1- oder anti-CD28-mAk. CTLA4Ig besitzt keine seinen inhibitorischen Wirkungen entgegenwirkende, direkten stimulierenden Wirkungen auf die T-Zellproliferation. Daher kann CTLA4Ig-Fusionsprotein in vivo als besserer Inhibitor als monokionale anti-CD28-Antikörper eingesetzt werden. Die immunsupressiven Wirkungen von CTLA4Ig in vitro legen dessen Verwendung in der Therapie zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen nahe, an denen eine anormale T-Zellaktivierung oder Ig-Produktion beteiligt ist.
Es wird erwartet, dass das CTLA4Ig-Fusionsprotein in vivo inhibitorische Eigenschaften besitzt. So wird erwartet, dass CTLA4Ig inhibitorisch auf T-Zellen in einer Weise wirkt, die der für den anti-CD28-Antikörper unter ähnlichen Bedingungen in vivo beobachteten Wirkung ähnlich ist. Bei Bedingungen, unter denen T-Zell/B-Zellinteraktionen in Folge von Kontakten zwischen T-Zellen und B-Zellen auftreten, kann die Bindung von zur Reaktion mit B7-Antigen-positiven Zellen, beispielsweise B-Zellen, eingeführtem CTLA4Ig eingreifen, d. h. die T-Zell/B-Zellinteraktionen inhibieren, was zu einer Regulation von Immunantworten führt. Aufgrund dieser ausschließlich inhibitorischen Wirkung wird erwartet, dass CTLA4Ig in vivo als Inhibitor der T-Zellaktivierung im Gegensatz zu unspezifischen Inhibitoren, wie Cyclosporin und Glucosteroiden, nützlich ist.
Gemäß einer Ausführungsform können das CTLA4Ig-Fusionsprotein oder CTLA4Ig/CD28Ig-Hybridproteine in vivo in einen geeigneten pharmazeutischen Träger eingebracht werden, d. h. einer menschlichen Person zur Behandlung pathologischer Zustände, wie Immunsystemerkrankungen oder Krebs, verabreicht werden. Es wird erwartet, dass die Einführung des Fusionsproteins in vivo zum Eingriff in T-Zellinteraktionen mit anderen Zellen wie B-Zellen in Folge einer Bindung des Liganden an B7-positive Zellen führt. Die Unterbindung normaler T-Zellinteraktionen kann zu verminderter T-Zellaktivität, beispielsweise zu verminderter T-Zellproliferation, führen. Darüber hinaus erwartet man, dass die Verabreichung des Fusionsproteins in vivo zu einer Regulierung der in vivo-Spiegel von Zytokinen führt, wozu in nicht abschließender Aufzählung Interleukine, z. B. Interleukin (”IL”)-2, IL-3, IL-4, IL-6 und IL-8, Wachstumsfaktoren einschließlich des Tumorwachstumsfaktors (”TGF”), Kolonie stimulierende Faktoren (”CSF”), Interferone (”IFNs”) und der Tumornekrosefaktor (”TNF”) gehören, um die erwünschten Wirkungen in einer Person zu begünstigen. Wird beispielsweise das Fusionsprotein in vivo eingeführt, so kann es die Produktion von Zytokinen blockieren, die zu bösartigem Wachstum, z. B. von Tumorzellen, beitragen. Das Fusionsprotein kann ebenfalls die Proliferation von Viren blockieren, die von der T-Zellaktivierung abhängen, wie das AIDS, HTLV1 verursachende Virus.
Wie oben erläutert, wirkt unter gewissen Umständen die Verabreichung des CTLA4Ig-Fusionsproteins oder von dessen Fragmenten in vivo inhibitorisch, eine Folge der Blockierung des durch T-Zell/B-Zellkontakt hervorgerufenen CTLA4- und CD28-Triggerns durch das Fusionsprotein. Beispielsweise kann das CTLA4Ig-Protein die T-Zellproliferation blockieren. Die Einführung des CTLA4Ig-Fusionsproteins in vivo wird daher sowohl Wirkungen auf T- als auch auf B-Zell-vermittelte Immunantworten hervorrufen. Das Fusionsprotein kann einem Wesen ebenfalls in Kombination mit der Einführung von Zytokinen oder anderen therapeutischen Reagenzien verabreicht werden.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform werden weitere Reagenzien, wozu gegenüber dem CTLA4Ig-Fusionsprotein oder dem CTLA4-Rezeptor reaktive Derivate gehören, zur Regulierung von T-Zellinteraktionen verwendet. Beispielsweise können gegenüber dem CTLA4-Rezeptor reaktive Antikörper und/oder Antikörperfragmente gescreent werden, um diejenigen zu identifizieren, die die Bindung des CTLA4Ig-Fusionsproteins an das B7-Antigen zu inhibieren vermögen. Die Antikörper oder Antikörperfragmente, wie Fab- oder F(ab')₂-Fragmente, können dann für die Reaktion mit T-Zellen beispielsweise zur Inhibierung der T-Zellproliferation verwendet werden.
Gegenüber CTLA4-Rezeptor reaktive monoklonale Antikörper können durch Hybridome produziert werden, indem man bekanntermaßen, beispielsweise wie von Kohler und Milstein (siehe Kohler und Milstein, Nature 256: 495–97 (1975)) eingeführt, oder unter Modifizierungen zur Regulierung zellulärer Interaktionen vorgeht.
Diese Techniken beinhalten die Verwendung eines Tieres, das zur Herstellung eines bestimmten Antikörpers sensibilisiert wird (priming). Das Tier kann durch Injektion eines Immunogens (z. B. des B7Ig-Fusionsproteins, CTLA4Ig-Fusions-proteins oder CD28Ig/CTLA4Ig-Hybridfusionsproteins) sensibilisiert werden, um die erwünschte Immunantwort, d. h. die Produktion von Antikörpern durch das sensibilisierte Tier, auszulösen. Ein sensibilisiertes Tier ist auch ein Tier, dass eine Erkrankung exprimiert. Für die Suche nach einem bestimmten Antikörper können Lymphozyten verwendet werden, die aus den Lymphknoten, der Milz und dem peripheren Blut von sensibilisierten, erkrankten Tieren stammen. Die Lymphozytenchromosome, die für die erwünschten Immunglobuline kodieren, werden durch Fusion der Lymphozyten mit Myelomzellen, üblicherweise in Gegenwart eines Fusionsagens, wie Polyethylenglycol (PEG), immortalisiert. In Anlehnung an Standardtechniken kann jede einer Vielzahl von Myelomzelllinien als Fusionspartner verwendet werden, beispielsweise die Myelomlinien P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653, Sp2/0-Ag14, oder HL1-653. Diese Myelomlinien sind bei der ATCC, Rockville, Maryland erhältlich.
Die resultierenden Zellen, die die gewünschten Hybridome beinhalten, werden dann in einem selektiven Medium, wie HAT-Medium, aufgezogen, wobei gegebenenfalls nichtfusionierte Myelom- oder Lymphozyten-Ausgangszellen sterben. Nur die Hybridomzellen überleben und können unter Grenzverdünnungsbedingungen aufgezogen werden, um isolierte Klone zu erhalten. Die Überstände der Hybridome werden auf die vorhandene erwünschte Spezifität beispielsweise mit Immunoassay-Techniken gescreent, wobei man das CTLA4Ig-Protein verwendet, das zur Immunisierung verwendet worden ist. Positive Klone können dann unter Grenzverdünnungsbedingungen subkloniert werden, und der produzierte monoklonale Antikörper kann isoliert werden.
Verschiedene herkömmliche Verfahren zur Isolierung und Reinigung der monoklonalen Antikörper können verwendet werden, um sie frei von anderen Proteinen und Verunreinigungen zu erhalten. Zu üblicherweise für die Reinigung monoklonaler Antikörper verwendeten Verfahren gehören die Ammoniumsulfatfällung, die Ionenaustauschchromatographie und die Affinitätschromatographie (siehe Zola et al., in Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, Hurell (Ed.) S. 51–52 (CRC Press, 1982)). In Anlehnung an diese Verfahren produzierte Hybridome können in vitro oder in vivo (in Ascitesflüssigkeit) vermehrt werden, indem man dem Fachmann bekannte Techniken verwendet (siehe allgemein Fink et al., Prog. Clin. Pathol., 9: 121–33 (1984), 6–1 auf S. 123).
Im Allgemeinen kann die individuelle Zelllinie in vitro vermehrt werden, beispielsweise in Laborkulturgefäßen, und das hohe Konzentrationen eines einzelnen spezifischen monoklonalen Antikörpers enthaltende Kulturmedium kann durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen werden.
Darüber hinaus können Fragmente dieser Antikörper, welche die gegenüber der extrazellulären Domäne des CTLA4-Rezeptors reaktive, aktive Bindungsregion enthalten, wie Fab-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente, hergestellt werden. Derartige Fragmente können mit Hilfe von Techniken hergestellt werden, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind (siehe z. B. Rousseaux et al., in Methods Enzymol., 121: 663–69, Academic Press (1986)).
In Anlehnung an obige Beschreibung hergestellte monoklonale anti-B7-Antikörper können zur Bindung an B7-Antigen verwendet werden, um Interaktionen von CD28-positiven oder CTLA4-positiven T-Zellen mit B7-positiven Zellen zu inhibieren. Die monoklonalen anti-CTLA4-Antikörper können zur Bindung an den CTLA4-Rezeptor verendet werden, um die Interaktion von CTLA4-positiven T-Zellen mit anderen Zellen zu inhibieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das CTLA4Ig-Fusionsprotein verwendet werden, um weitere Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, die Interaktion zwischen CTLA4 und dem B7-Antigen zu regulieren. Zu derartigen Verbindungen können kleine, natürlich vorkommende Moleküle gehören, die für die Reaktion mit B-Zellen und/oder T-Zellen verwendet werden können. Beispielsweise können Fermentationsbrühen auf die Fähigkeit, CTLA4/B7-Interaktionen zu inhibieren, getestet werden. Darüber hinaus können Derivate des CTLA4Ig-Fusionsproteins, wie oben beschrieben, zur Regulierung der T-Zellproliferation verwendet werden. Beispielsweise können die Fragmente oder Derivate zur Blockierung der T-Zellproliferation bei einer Transplantat-gegen-Wirt(GVH)-Erkrankung, die allogene Knochenmarkstransplantationen begleitet, verwendet werden. Der CD28-vermittelte T-Zell-Proliferationsweg ist im Gegensatz zu der durch den CD3/Ti-Zell-Rezeptorkomplex getriebenen Proliferation Cyclosporin-resistent (June et al., 1987, oben). Als Behandlung der GVH-Erkrankung ist Cyclosporin relativ ineffektiv (Storb, Blood 68: 119–125 (1986)). Man nimmt an, dass die GVH-Erkrankung durch T-Lymphozyten vermittelt wird, die CD28-Antigen exprimieren (Storb und Thomas, Immunol. Rev. 88: 215–238 (1985)). Daher kann das CTLA4Ig-Fusionsprotein alleine oder in Kombination mit immunsuppressiven Mitteln, wie Cyclosporin, zur Blockierung der T-Zellproliferation bei der GVH-Erkrankung nützlich sein.
Die Regulierung der Interaktionen von CTLA4-positiven T-Zellen mit B7-positiven Zellen, einschließlich B-Zellen, durch die erfindungsgemäßen Verfahren kann daher verwendet werden, pathologische Zustände, wie Autoimmunität, Transplantationen, Infektionskrankheiten und Neoplasien, zu behandeln.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und helfen dem Fachmann bei ihrer Ausführung. Der Umfang der Erfindung soll nicht auf die Beispiele beschränkt sein.
BEISPIEL 1
Herstellung von B7Ig- und CD28-Fusionsproteinen
Rezeptor-Immunglobulin C gamma (IgCγ)-Fusionsproteine B7Ig und CD28Ig wurden hergestellt in Anlehnung an die Beschreibung durch Linsley et al., in J. Exp. Med. 173: 721–730 (1991), worauf Bezug genommen wird. Kurzum, DNA, die für Aminosäuresequenzen kodierte, die dem jeweiligen Rezeptorprotein (z. B. B7) entsprachen, wurde mit DNA verbunden, die für Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von menschlichem IgCγ1 entsprachen. Dies wurde wie folgt bewerkstelligt.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Für die PCR wurden DNA-Fragmente amplifiziert, wobei man unten beschriebene Primerpaare für jedes Fusionsprotein verwendete. Durchgeführt wurden PCR-Reaktionen (0,1 ml Endvolumen) in Tag-Polymerasepuffer (Stratagene, La Jolla, CA), der jeweils 20 μmol dNTP; 50–100 pmol der angegebenen Primer; Templat (1 ng Plasmid oder cDNA, hergestellt aus ≤ 1 μg Gesamt-RNA, wobei man Random-Hexamer-Primer verwendete, so beschrieben von Kawasaki in PCR Protocols, Academic Press, S. 21–27 (1990), worauf Bezug genommen wird); und Tag-Polymerase (Stratagene) enthielt. Die Reaktionen wurden auf einem Thermocycler (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT) bei 16–30 Zyklen durchge führt (ein typischer Zyklus bestand aus folgenden Schritten: 1 min bei 94°C, 1–2 min bei 50°C und 1–3 min bei 72°C).
Plasmid-Konstruktion. CD28-kodierende cDNA enthaltende Expressionsplasmide, so beschrieben von Aruffo und Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573 (1987), wurden von Drs. Aruffo und Seed (Mass General Hospital, Boston, MA) zur Verfügung gestellt. CD5-kodierende cDNA enthaltende Plasmide, so beschrieben von Aruffo, Cell 61: 1303 (1990), wurden von Dr. Aruffo zur Verfügung gestellt. B7-kodierende cDNA enthaltende Plasmide, so beschrieben von Freeman et al., J. Immunol. 143: 2714 (1989), wurden von Dr. Freeman (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA) zur Verfügung gestellt. Für anfängliche Versuche, lösliche Formen von CD28 und B7 zu exprimieren, wurden in Anlehnung an die Beschreibung durch Linsley et al., J. Exp. Med., oben, Konstrukte hergestellt, in denen stromaufwärts der Transmembrandomänen Stop-Codons eingefügt und das native Signalpeptid durch das Signalpeptid aus Oncostatin M (Malik et al., Mol. Cell Biol. 9: 2847 (1989)) ersetzt wurde. Deren Herstellung erfolgte unter Verwendung synthetischer Oligonukleotide zur Rekonstruktion (OMCD28) oder als Primer (OMB7) für die PCR. OMCD28 ist eine CD28-cDNA, die im Hinblick auf eine effizientere Expression durch Ersatz des Signalpeptids mit der analogen Region aus Oncostatin M modifiziert ist. CD28Ig- und B71g-Fusionskonstrukte wurden in zwei Teilen hergestellt. Die 5'-Abschnitte stellte man her, indem man OMCD28 und OMB7 als Template und das Oligonukleotid, CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC (SEQ ID NO: 1), (welches für die Aminosäuresequenz kodierte, die dem Oncostatin M-Signalpeptid entsprach) als vorwärts gerichteten Primer und entweder
TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA (SEQ ID NO: 2) bzw. TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT (SEQ ID NO: 3) als rückwärts gerichtete Primer verwendete. Die Produkte aus der PCR-Reaktion wurden mit Restriktionsendonukleasen (HindIII und BclI) an mit den PCR-Primern eingeführten Stellen geschnitten und gelgereinigt.
Der 3'-Abschnitt des Fusionskonstruktes, der menschlichen IgCγ1-Sequenzen entsprach, wurde mit einer Reverse Transcriptase- (aus Avian Myeloplastosevirus; Life Sciences Associates, Bayport, NY) und PCR-gekoppelten Reaktion hergestellt, wobei man RNA aus einer Mensch-Maus-chimären mAk 16 produzierenden Myelomzelllinie (zur Verfügung gestellt von Dr. P. Fell und M. Gayle, Bristol-Myers Squibb Company, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA) als Templat verwendete. Das Oligonukleotid,
AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG (SEQ ID NO: 4),
wurde als vorwärts gerichteter Primer und
CTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC (SEQ ID NO: 5)
als rückwärts gerichteter Primer verwendet. Die Reaktionsprodukte wurden mit BclI und XbaI geschnitten und gelgereinigt. Die fertigen Konstrukte wurden zusammengesetzt, indem man die CD28- oder B7-Sequenzen enthaltenden HindIII/BclI-geschnittenen Fragmente zusammen mit dem IgCγ1-Sequenzen enthaltenden BclI/Xbal-geschnittenen Fragment in HindIII/XbaI-geschnittenes CDM8 ligierte. Die Ligationsprodukte wurden in MC1061/p3-E. coli-Zellen transformiert, und es wurden Kolonien auf die zweckmäßigen Plasmide gescreent. Die Sequenzen der resultierenden Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Das B7-kodierende Konstrukt enthielt DNA, die für Aminosäuren kodierte, welche den Aminosäureresten von etwa Position 1 bis etwa Position 215 der extrazellulären Domäne von B7 entsprachen. Das CD28-kodierende Konstrukt enthielt DNA, die für Aminosäuren kodierte, welche den Aminosäureresten von etwa Position 1 bis etwa Position 134 der extrazellulären Domäne von CD28 entsprachen.
CD5Ig wurde genauso hergestellt, wobei man
CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG (SEQ ID NO: 6)
als vorwärts gerichteten Primer und
ATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC (SEQ ID NO: 7)
als rückwärts gerichteten Primer verwendete. Das PCR-Produkt wurde mit Restriktionsendonuklease verdaut und mit dem IgCγ1-Fragment, wie oben beschrieben, ligiert. Das resultierende Konstrukt (CD5Ig) kodierte für ein reifes Protein mit einer die Aminosäurereste von Position 1 bis Position 347 der CD5 entsprechenden Sequenz enthaltenden Aminosäuresequenz, zwei durch das Konstruktionsverfahren eingeführten Aminosäuren (Aminosäuren DQ) und einer sich anschließenden DNA, die für Aminosäuren kodierte, die der IgCγ1-Hinge-Region entsprachen.
Zellkultur und Transfektionen. COS (Affennierenzellen) wurden mit CD28 und B7 exprimierenden Expressionsplasmiden transfiziert, indem man ein modifiziertes Protokoll von Seed und Aruffo (Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 3365 (1987)) verwendete, worauf Bezug genommen wird. 18 bis 24 h vor der Transfektion wurden Kulturschalen mit Zellen (10⁶ pro 10 cm Durchmesser) beimpft. Plasmid-DNA (etwa 15 μg/Schale) wurde in einem Volumen von 5 ml serumfreiem DMEM, das 0,1 mM Cloroquin und 600 μg/ml DEAE-Dextran enthielt, zugegeben, und die Zellen wurden bei 37°C 3–3,5 h inkubiert. Die transfizierten Zellen wurden dann kurz (etwa 2 min) mit 10%-igem Dimethylsulfoxid in PBS behandelt und 16–24 h bei 37°C in 10% FCS enthaltendem DMEM inkubiert. 24 h nach Transfektion wurde das Kulturmedium entfernt und durch serumfreies DMEM (6 ml/Schale) ersetzt. Es wurde drei Tage bei 37°C weiter inkubiert; dann wurde das verbrauchte Medium eingesammelt, und frisches serumfreies Medium wurde zugegeben. Nach weiteren drei Tagen bei 37°C wurde das verbrauchte Medium erneut eingesammelt, und die Zellen wurden verworfen.
CD28, CD5 oder B7 exprimierende CHO-Zellen wurden in Anlehnung an die Beschreibung von Linsley et al., (1991), oben, wie folgt isoliert: kurzum, CD28, CD5 oder B7 exprimierende stabile Transfektanden wurden isoliert, nachdem man Dihydrofolatreduktase-defiziente Ovarzellen chinesischer Hamster (dhfr^–-CHO-Zellen) mit einem Gemisch aus zweckmäßigem Expressionsplasmid und selektierbarem Marker, pSV2dhfr (Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5031 (1990)), worauf Bezug genommen wird, cotransfiziert hatte. Die Transfektanden wurden dann in bis auf ein Endniveau von 1 μM ansteigenden Konzentrationen an Methotrexat aufgezogen, und sie wurden in mit 10% fötalem Rinderserum(FBS), 0,2 mM Prolin und 1 μM Methotrexat ergänztem DMEM gehalten. Große Mengen an CD28 (CD28⁺-CHO) oder B7 (B7⁺-CHO) exprimierende CHO-Linien wurden im Anschluss an eine indirekte Immunfärbung mit den mAkn 9.3 oder BB-1 durch mehrere Durchgänge fluoreszenzaktivierter Zelltrennung (FACS^R) isoliert. Im Hinblick auf die Oberflächenexpression von CD28 oder B7 negative, amplifizierte CHO-Zellen (dhfr⁺-CHO) wurden ebenfalls mit FACS^R aus CD28-transfizierten Populationen isoliert.
Immunfärbung und FACS^R-Analyse. Transfizierte CHO- oder COS-Zellen oder aktivierte T-Zellen wurden mit indirekter Immunfärbung untersucht. Bevor man färbte, wurden die CHO-Zellen aus ihren Kulturgefäßen durch Inkubation in 10 mM EDTA enthaltendem PBS entfernt. Die Zellen wurden zunächst mit murinem mAkn 9.3 (Hansen et al., Immunogenetics 10: 247 (1980)) oder BB-1 (Yokochi et al., Immunol. 128: 823 (1981)), oder mit Ig-Fusionsproteinen (alle bei 10 μg/ml in 10% FCS enthaltendem DMEM) 1–2 h bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und weitere 0,5–2 h bei 4°C mit einem FITC-konjugierten Zweitstufenreagenz (gegen Maus-Ig gerichtetes Ziegenserum für murine mAk oder gegen Mensch-Ig-Cγ gerichtetes Ziegenserum für Fusionsproteine (Tago, Inc., Burlingame, CA)) inkubiert. Die Fluoreszenz wurde auf einem FACS IV^R-Zellsorter (Becton Dickinson und Co., Mountain View, CA) untersucht, der mit einer logarithmischen Verstärkungseinheit (vier Zehner-Potenzen) ausgestattet war.
Reinigung von Ig-Fusionsproteinen. Die erste, zweite und dritte Ansammlung von verbrauchtem, serumfreien Kulturmedium aus transfizierten COS-Zellen wurden als Quellen für die Reinigung von Ig-Fusionsproteinen verwendet. Nachdem man Zelltrümmer durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt hatte, wurde das Medium auf eine mit 0,05 M Natriumcitrat, pH 8,0, äquilibrierte Säule (etwa 200–400 ml Medium/ml gepacktes Bettvolumen) von immobilisiertem Protein A (Repligen Corp., Cambridge, MA) aufgetragen. Nachdem man das Medium aufgetragen hatte, wurde die Säule mit 1 M Kaliumphosphat, pH 8, gewaschen, und gebundenes Protein wurde mit 0,05 M Natriumcitrat, pH 3, eluiert. Es wurden Fraktionen gesammelt, und diese wurden durch Zugabe von 1/10 Volumen von 2 M Tris, pH 8, sofort neutralisiert. Diejenigen Fraktionen, die den Peak von A₂₈₀-absorbierendem Material enthielten, wurden zusammengegeben und gegen PBS vor Gebrauch dialysiert. Extinktionskoeffizienten von 2,4 und 2,8 ml/mg für CD28Ig bzw. B7Ig wurden durch Aminosäureanalyse von Lösungen bekannter Extinktion ermittelt. Die Bindungsaktivitäten von gereinigtem CD28Ig und B7Ig konnten nahezu quantitativ wiedergewonnen werden, wie die FACS^R-Analyse nach indirekter Fluoreszenzfärbung von B7⁺- und CD28⁺-CHO-Zellen belegte.
BEISPIEL 2
Herstellung von CTLA4Ig-Fusionsprotein
Eine für lösliches CTLA4Ig kodierende genetische Fusion zwischen der extrazellulären Domäne von CTLA4 und einer IgCγ1-Domäne wurde in ähnlicher Weise konstruiert, wie oben für das CD28Ig-Konstrukt beschrieben ist. Die extrazelluläre Domäne des CTLA4-Gens wurde mit PCR kloniert, wobei man synthetische Oligonukleotide verwendete, die der veröffentlichten Sequenz entsprachen (Dariavach et al., Eur. Jour. Immunol. 18: 1901–1905 (1988)).
Da ein Signalpeptid für CTLA4 im CTLA4-Gen nicht identifiziert werden konnte, wurde der N-Terminus der vorhergesagten Sequenz von CTLA4 an das Signalpeptid von Oncostatin M (Malik et al., Mol. and Cell. Biol. 9: 2847 (1989)) in zwei Schritten gebunden, wobei man überlappende Oligonukleotide verwendete. Für den ersten Schritt wurde das Oligonukleotid CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCC CAGCC (SEQ ID NO: 8) (welches für die mit den N-terminalen 7 Aminosäuren von CTLA4 fusionierten C-terminalen 15 Aminosäuren des Oncostatin M-Signalpeptids kodierte) als vorwärts gerichteter Primer, und TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (SEQ ID NO: 9) (welches für die Aminosäurereste 119–125 derjenigen Aminosäuresequenz kodierte, die den CTLA4-Rezeptor kodierte und eine restriktionsenzymatische BclI-Stelle enthielt) als rückwärts gerichteter Primer verwendet. Das Templat für diesen Schritt war cDNA, die ausgehend von 1 μg Gesamt-RNA aus H38-Zellen (eine HTLV II-infizierte T-Zell-Leukämiezelllinie, durch die Drs. Salahudin und Gallo, NCI, Bethesda, MD zur Verfügung gestellt) synthetisiert worden war. Ein Teil des PCR-Produkts aus der ersten Stufe wurde erneut amplifiziert, wobei man einen überlappenden vorwärts gerichteten Primer, der für den N-terminalen Abschnitt des Oncostatin M-Signalpeptids kodierte und eine HindIII-Restriktionsendonukleasestelle enthielt, nämlich CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGC TCAGTCTGGTCCTTGCACTC (SEQ ID NO: 10), und den gleichen rückwärts gerichteten Primer verwendete. Das Produkt der PCR-Reaktion wurde mit HindIII und BclI verdaut und zusammen mit einem BclI/XbaI-geschnittenen cDNA-Fragment, das für diejenigen Aminosäuresequenzen kodierte, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen von IgCγ1 entsprachen, in den HindIII/XbaI-geschnittenen Expressionsvektor CDM8 oder HindIII/XbaI-geschnittenen Expressionsvektor πLN (durch Dr. Aruffo zur Verfügung gestellt) ligiert.
Eine Karte des resultierenden CTLA4Ig-Fusionskonstrukts ist in 1 gezeigt. Die in dieser Figur aufgeführten Sequenzen zeigen die Verbindungen zwischen CTLA4 (obere Buchstabenreihe, nicht schattierte Regionen) und dem Signalpeptid SP von Oncostatin M (dunkel schattierte Regionen), und dem Hinge H von IgCγl (gepunktete Regionen). Die Aminosäure in Klammern wurde während der Konstruktion eingeführt. Sternchen (*) verweisen auf Cystein-zu-Serin-Mutationen, die in der IgCγ-Hinge-Region eingeführt wurden. Die in CTLA4 vorhandene V-artige Domäne der Immunoglobulin-Superfamilie ist genauso angezeigt wie die CH2- und CH3-Domänen von IgCγl.
Dann wurden CTLA4Ig enthaltende Expressionsplasmide CDM8 in COS-Zellen transfiziert, wobei man eine modifizierte DEAE/Dextran-Transfektion (Linsley et al., 1991, oben) nach dem von Seed und Aruffo, 1987, oben beschriebenen Protokoll verwendete.
Expressionsplasmid-Konstrukte (πLN oder CDM8), welche die für die Aminosäuresequenz von CTLA4Ig kodierende cDNA enthielten, wurden durch Lipofektion nach Standardmethoden in dhfr^–-CHO-Linien transfiziert, wodurch CTLA4Ig stabil exprimierende, neue Zelllinien erhalten wurden.
DNA, die für die CTLA4Ig entsprechende Aminosäuresequenz kodierte, wurde bei der ATCC gemäß dem Budapester Vertrag am 31. Mai 1991 hinterlegt; ihr wurde die ATCC-Hinterlegungsnummer 68629 zugeteilt.
Ein bevorzugter stabiler Transfektand, der CTLA4Ig exprimiert und als Ovarzelllinie chinesischer Hamster CTLA4Ig-24 bezeichnet wird, wurde hergestellt, indem man B7-positive CHO-Zeillinien im Medium auf B7-Bindungsaktivität screente, wobei man Immunfärbung verwendete. Es wurden Transfektanden erhalten in DMEM, das mit 10%-igem fötalem Rinderserum (FBS), 0,2 mM Prolin und 1 μM Methotrexat ergänzt war.
Die CHO-Zelllinie CTLA4Ig-24 wurde bei der ATCC gemäß dem Budapester Vertrag am 31. Mai 1991 hinterlegt; ihr wurde die Hinterlegungsnummer ATCC 10762 zugeteilt.
CTLA4Ig wurde mit Protein A-Chromatographie aus serumfreien konditionierten Überständen gereinigt (2). Es wurden die Konzentrationen von CTLA4Ig bestimmt, wobei man einen Extinktionskoeffizienten bei 280 nm von 1,6 annahm (experimentell durch Aminosäureanalyse einer Lösung mit bekannter Extinktion bestimmt). Molekulargewichtsstandards (Bahn 1 und Bahn 3, 2) und Proben (1 μg) von CTLA4Ig (Bahn 2 und Bahn 4) wurden einer SDS-PAGE (4-12%-iger Acrylamidgradient) unter nichtreduzierenden Bedingungen (–βME, Bahn 1 und Bahn 2) oder unter reduzierenden Bedingungen (+βME, Bahn 3 und Bahn 4) unterzogen. Proteine wurden durch Färbung mit Coomassie-Brilliant-Blau sichtbar gemacht.
Unter nicht-reduzierenden Bedingungen wanderte CTLA4Ig wie eine Spezies mit einem M_r von etwa 100 000, und unter reduzierenden Bedingungen wie eine Spezies mit einem M_r von etwa 50 000 (2). Da die igCγ-Hinge-Disulfide während der Konstruktion entfernt worden waren, ist CTLA4Ig wie CD28Ig ein Dimer, das vermutlich durch eine native Disulfidbrücke verbunden ist.
BEISPIEL 3
CTLA4-Rezeptor
Zur Rekonstruktion von DNA, die für diejenige Aminosäuresequenz kodiert, die dem vollständigen menschlichen CTLA4-Gen entspricht, wurde eine cDNA, die für diejenigen Aminosäuren kodierte, die einem Fragment der Transmembran- und cytoplasmatischen Domänen von CTLA4 entsprachen, mit PCR kloniert und dann mit cDNA verbunden, die für diejenigen Aminosäuren kodierte, die einem Fragment aus CTLA4Ig entsprachen, welches wiederum dem mit dem N-Terminus von CTLA4 fusionierten Oncostatin M-Signalpeptid entsprach. Die Vorgehensweisen bezüglich PCR, Zellkultur und Transfektionen entsprachen obiger Beschreibung in Beispiel 1, wobei man COS-Zellen und die DEAE-Dextran-Transfektion verwendete.
Da über die Expression von CTLA4-Rezeptorprotein in menschlichen Lymphoidzellen bisher noch nicht berichtet worden war, ist es erforderlich gewesen, eine Quelle für CTLA4-mRNA auszumachen. Wie oben erläutert, wurde aus der gesamten zellulären RNA von H38-Zellen revers transkribierte PCR-cDNA für die PCR-Klonierung verwendet. Zu diesem Zweck wurde das Oligonukleotid GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG (SEQ ID NO: 11) (welches für die ersten 11 Aminosäuren der vorhergesagten kodierenden Sequenz kodierte) als vorwärts gerichteter Primer und TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAG GCTG (SEQ ID NO: 12) (welches zu den letzten 8 Aminosäuren in CTLA4 homolog war und eine XbaI-Stelle enthielt) als rückwärts gerichteter Primer verwendet. Das Templat war wiederum eine cDNA, die ausgehend von 1 μ RNA aus H38-Zellen synthetisiert worden war. Die Produkte der PCR-Reaktion wurden mit den Restriktionsendonukleasen NcoI und XbaI geschnitten, und das resultierende 316 bp-Produkt wurde gelgereinigt. Ein HindIII/NcoI-Fragment (340 bp) aus der oben beschriebenen CTLAIg-Fusion wurde ebenfalls gelgereinigt, und die beiden Restriktionsfragmente wurden in HindIII/XbaI-geschnittenes CDM8 ligiert, was OMCTLA ergab.
Das resultierende Konstrukt entsprach vollständigem CTLA4 (SEQ ID Nrn: 13 und 14) und dem Oncostatin M-Signalpeptid. Das Konstrukt ist in 3 gezeigt und wurde als OMCTLA4 bezeichnet. Die in 3 gezeigte Sequenz für CTLA4 unterscheidet sich von der vorhergesagten menschlichen CTLA4-DNA-Sequenz (Dariavach et al., oben) durch einen Basenaustausch derart, dass das zuvor berichtete Alanin an Aminosäureposition 111 der gezeigten Aminosäuresequenz durch ein Threonin ersetzt ist. Dieses Threonin ist Teil einer neu identifizierten N-gekoppelten Glycosylierungsstelle, die für eine erfolgreiche Expression des Fusionsproteins wichtig sein kann.
Die Ligationsprodukte wurden in E. coli-Zellen MC1061/p3 transformiert, und es wurden Kolonien auf die geeigneten Plasmide gescreent. Sequenzen der resultierenden Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt.
BEISPIEL 4
Charakterisierung von CTLA4Ig
Zur Charakterisierung des CTLA4Ig-Konstrukts wurden mehrere Isolate, nämlich CD28Ig, B7Ig und CD5Ig, in Anlehnung an obige Beschreibung hergestellt, in COS-Zellen in Anlehnung an die Beschreibung in den Beispielen 2 und 3 transfiziert und durch FACS^R-Analyse auf die Bindung von B7Ig untersucht. Zusätzlich zu den oben erwähnten Konstrukten wurden auch CD7-kodierende cDNAs enthaltende CDM8-Plasmide verwendet, so beschrieben von Aruffo und Seed, (EMBO Jour. 6: 3313–3316 (1987)), worauf Bezug genommen wird.
mAk. Murine monoklonale Antikörper (mAk) 9.3 (anti-CD28) und G19-4 (anti-CD3), G3-7 (anti-CD7), BB-1 (anti-B7-Antigen) und Ratten-mAk 187.1 (anti-Maus-K-Kette) sind zuvor beschrieben worden (Ledbetter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 1384–1388 (1987); Ledbetter et al., Blood 75: 1531 (1990); Yokochi et al., oben) und wurden aus Ascites vor Gebrauch gereinigt. Das mAk OKT8 produzierende Hybridom wurde von der ATCC, Rockville, MD erhalten, und der mAk wurde ebenfalls aus Ascites vor Gebrauch gereinigt. Der mAk 4G9 (anti-CD19) wurde durch Dr. E. Engleman, Stanford University, Palo Alto CA zur Verfügung gestellt. Gereinigter Mensch-Maus-chimärer mAk 16 (mit menschlichem Cγl-Fc-Abschnitt) war ein Geschenk von Dr. P. Fell und M. Gayle (Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA).
Immunfärbung und FACS^R-Analyse. Vor der Färbung wurden COS- oder CHO-Zellen aus Kulturgefäßen durch Inkubation in 10 mM EDTA enthaltendem PBS entfernt. Die Zellen wurden zunächst mit mAkn oder Ig-Fusionsproteinen bei 10 μg/ml in 10% FBS enthaltendem DMEM ein bis zwei Stunden bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und weitere 0,5–2 Stunden bei 4°C mit FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus-Immunglobulin oder mit FITC-konjugiertem Ziege-anti-Mensch-IgCγ-Serum (beides von Tago, Burlingame, CA) inkubiert. Wurde die Bindung sowohl von mAkn als auch von Ig-Fusions-proteinen in demselben Experiment gemessen, so wurden FITC-konjugierte anti-Maus- und anti-Mensch-Zweitstufenreagenzien vor Gebrauch zusammengemischt. Die Fluoreszenz wurde dann an insgesamt 10 000 Zellen mit FACS^R analysiert.
Abtrennung und Stimulation peripherer Blutlymphozyten. Periphere Blutlymphozyten (PBLs) wurden durch Zentrifugation mit ”Lymphocyte Separation Medium” (Litton Bionetics, Kensington, MD) isoliert. Alloreaktive T-Zellen wurden durch Stimulation von PBLs in einer primären gemischten Lymphozytenreaktion (MIR) isoliert. PBLs wurden mit 10⁶/ml bestrahlten (5 000 rad) T51-LCLs kultiviert. EBV-transformierte Lymphoblastoidzelllinien (LCL), PM (Bristol-Myers Squibb Co.) und T51 (Bristol-Myers Squibb Co.), wurden in RPMI gehalten, das mit 10% FBS ergänzt war. Nach 6 Tagen wurden alloreaktive ”Blasten”-Zellen gefriergetrocknet. Es wurde eine sekundäre MLR durchgeführt, indem man aufgetaute alloreaktive Blasten zusammen mit frischen bestrahlten T51-LCLs mit oder ohne mAk und Ig-Fusionsproteinen kultivierte. Die Zellen wurden in Platten mit 96 flachbödigen Vertiefungen (4 × 10⁴ alloreaktive Blasten und 1 × 10⁴ bestrahlte T51-LCL-Zellen/Vertiefung in einem Volumen von 0,2 ml) in 10% FBS enthaltendem RPMI kultiviert. Die zelluläre Proliferation von 4-fach-Kulturen wurde anhand der Aufnahme von [³H]-Thymidin während der letzten 6 Stunden einer 2-3-tägigen Kultur gemessen.
PHA-aktivierte T-Zellen wurden hergestellt, indem man PBLs 5 Tage mit 1 μg/ml PHA (Wellcome, Charlotte, NC) und einen Tag in Medium ohne PHA kultivierte. Lebensfähige Zellen wurden durch Sedimentation in ”Lymphocyte Separation Medium” vor Gebrauch eingesammelt. Die Zellen wurden mit mAkn oder transfizierten CHO-Zellen 4–6 Stunden bei 37°C stimuliert, durch Zentrifugation eingesammelt und zur Präparation von RNA verwendet.
CD4⁺-T-Zellen wurden aus PBLs isoliert, indem man PBLs aus gesunden Spendern in T- und Nicht-T-Zellen auftrennte, wobei man die Schaferythrozyten-Rosettentechnik verwendete, und des weiteren T-Zellen durch ”panning” in CD4⁺-Zellen auftrennte, so beschrieben von Damle et al., J. Immunol. 139: 1501 (1987), worauf Bezug genommen wird. B-Zellen wurden ebenfalls aus peripherem Blut durch ”panning” gereinigt, so beschrieben von Wysocki und Sato, Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 2844 (1978), worauf Bezug genommen wird, wobei man den anti-CD19-mAk 4G9 verwendete. Zur Messung der T_h-induzierten Ig-Produktion wurden 10⁶ CD4⁺-T-Zellen mit 10⁶ CD19⁺-B-Zellen in 1 ml 10% FBS enthaltendem RPMI vermischt. Im Anschluss an die 6-tägige Kultur bei 37°C wurde die Produktion von menschlichem IgM in den Kulturüberständen gemessen, wobei man einen Festphasen-ELISA verwendete, so beschrieben von Volkman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2528 (1981), worauf Bezug genommen wird. Kurzum, Mikrotiter-ELISA-Platten mit 96 flachbödigen Vertiefungen (Corning, Corning, NY) wurden mit 200 μl/Vertiefung Natriumcarbonatpuffer (pH 9,6), der 10 μg/ml affinitätsgereinigte Ziege-anti-Mensch-IgG- oder -IgM-Antikörper (Tago, Burlingame, CA) enthielt, beschichtet, über Nacht bei 4°C inkubiert und dann mit TBS gewaschen; des Weiteren wurden die Vertiefungen mit 2%-igem BSA in PBS (BSA-PBS) blockiert. Die zu prüfenden Proben wurden in geeigneter Verdünnung in diese Vertiefungen gegeben und mit 200 μl/Vertiefung von 1:1000 verdünnter Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierter F(ab')₂-Fraktion von affinitätsgereinigtem Ziege-anti-Mensch-IgG- oder -IgM-Antikörper (Tago) inkubiert. Die Platten wurden dann gewaschen, und 100 μl/Vertiefung einer Lösung (0,6 mg/ml in Citratphosphatpuffer mit pH 5,5 und 0,045% Wasserstoffperoxid) von o-Phenylendiamin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden zugegeben. Die Farbentwicklung wurde mit 2 N Schwefelsäure gestoppt. Es wurde die Extinktion bei 490 nm mit einem automatischen ELISA-Plattenlesegerät gemessen. Test- und Kontrollproben wurden 3-fach vorgenommen, und die Extinktionswerte wurden mit denjenigen verglichen, die mit bekannten IgG- oder IgM-Standards erhalten wurden, die gleichzeitig mit den Überstandproben vorgenommen wurden, um die Eichkurve zu erstellen, anhand derer die Konzentrationen von Ig im Kulturüberstand quantifiziert wurden. Die Daten sind ausgedrückt in ng/ml von Ig ± SEM von entweder 3-fach- oder 4-fach-Kulturen.
Immunpräzipitations-Analyse und SDS-PAGE. Zellen wurden mit 1251 oberflächenmarkiert und einer Immunpräzipitations-Analyse unterzogen. Kurzum, PHA-aktivierte T-Zellen wurden mit 1251 oberflächenmarkiert, wobei man Lactoperoxidase und H₂O₂ verwendete, so beschrieben von Vivetta et al., J. Exp. Med. 134: 242 (1971), worauf Bezug genommen wird. Die SDS-PAGE-Chromatographie wurde auf Gelen mit linearen Acrylamidgradienten als Sammelgel aus 5% Acrylamid durchgeführt. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau gefärbt, entfärbt und fotografiert, oder getrocknet und ein Röntgenfilm bestrahlt (Kodak XAR-5).
Bindungs-Untersuchungen. B7Ig wurde mit 1251 bis zu einer spezifischen Aktivität von etwa 2 × 10⁸ cpm/pmol markiert. Plastikschalen mit 96 Vertiefungen wurden 16–24 Stunden mit einer CTLA4Ig enthaltenden Lösung (0,5 μg in einem Volumen von 0,05 ml 10 mM Tris, pH 8) beschichtet. Die Vertiefungen wurden mit Bindungspuffer (50 mM BES (Sigma Chemical Co.) enthaltendem DMEM, pH 6,8, 0,1% BAS und 10% FCS) blockiert, bevor man eine ¹²⁵I-B7Ig (etwa 5 × 10⁵ cpm) enthaltende Lösung (0,09 ml) mit oder ohne Kompetitor zugab. Im Anschluss an eine 2-3-stündige Inkubation bei 23°C wurden die Vertiefungen einmal mit Bindungspuffer und viermal mit PBS gewaschen. Gebundene Radioaktivität wurde dann durch Zugabe von 0,5 N NaOH solubilisiert und mit einem Gammazähler quantifiziert.
Bindung an B7Ig. Die funktionelle Aktivität des OMCTLA4-Konstrukts, welches für das komplette menschliche CTLA4-DNA-Gen kodiert, wird in dem in 4 dargestellten Experiment gezeigt. COS-Zellen wurden in Anlehnung an obige Beschreibung mit den Expressionsplasmiden CD7, OMCD28 und OMCTLA4 transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen eingesammelt und nur mit Medium (ohne Zusatz) oder mit den mAkn 9.3, B7Ig, CD5Ig oder G3-7 inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und die Bindung wurde mit einem Gemisch aus FITC-konjugiertem, gegen Maus-Ig gerichteten Ziegenantikörper und FITC-konjugiertem, gegen Mensch-Ig gerichteten Ziegeantikörper als Zweitstufenreagenz detektiert. Die transfizierten Zellen wurden auf die Expression des geeigneten Zelloberflächenmarkers mit indirekter Immunfärbung untersucht, und die Fluoreszenz wurde in Anlehnung an obige Beschreibung mit der FACS^R-Analyse gemessen.
Wie in 4 gezeigt ist, band mAk 9.3 an CD28-trans-fizierte COS-Zellen, jedoch nicht an CTLA4-transfizierte Zellen. Dagegen band das B7Ig-Fusionsprotein (jedoch nicht das Kontroll-CD5Ig-Fusionsprotein) sowohl an CD28- als auch an CTLA4-transfizierte Zellen. CD7-transfizierte COS-Zellen banden weder an mAk 9.3 noch an die Fusionsproteine. Dies zeigt, dass sowohl CD28 als auch CTLA4 an das B-Zell-Aktivierungsantigen B7 binden. Darüber hinaus konnte keine Bindung von mAk 9.3 an CTLA4 nachgewiesen werden.
Bindung von CTLA4Ig an B7-positive CHO-Zellen. Zur weiteren Charakterisierung der Bindung von CTLA4Ig und B7 wurde die Bindungsaffinität von gereinigtem CTLA4Ig an B7⁺-CHO-Zellen und an eine Lymphoblastoidzelllinie (PM-LCL) in dem in 5 gezeigten Experiment gemessen. Amplifizierte, transfizierte CHO-Zelllinien und PM-LCLs wurden nur mit Medium (ohne Zusatz) oder einer äquivalenten Konzentration von menschliches IgCγ1 enthaltenden Proteinen (10 μg/ml) von CD5Ig, CD28Ig oder CTLA4Ig inkubiert. Nachdem man FITC-konjugierte Ziege-anti-Mensch-Ig-Zweitstufenreagenzien zugegeben hatte, wurde die Bindung mit FACS^R detektiert. Insgesamt 10 000 gefärbte Zellen wurden mit FACS^R untersucht.
Wie in 5 gezeigt ist, band CD28Ig an B7⁺-CHO-Zellen, jedoch nicht an PM-LCL, einer Zelllinie, die relativ geringe Mengen an B7-Antigen exprimierte (Linsley et al., oben, 1990). CDLA4Ig band stärker an beide Zelllinien als CD28Ig, was nahe legt, dass es mit höherer Affinität band. Weder CD28Ig noch CTLA4Ig band an CD28⁺-CHO-Zellen.
Bindungsaffinität von CTLA4Ig und B7Ig. Dann wurde die scheinbare Interaktionsaffinität zwischen CTLA4Ig und B7Ig gemessen, indem man einen Festphasen-Kompetitionsbindungstest verwendete. Plastikschalen mit 96 Vertiefungen wurden in Anlehnung an obige Beschreibung mit CTLA4Ig beschichtet. B7Ig wurde mit ¹²⁵1 (5 × 10⁵ cpm, 2 × 10⁶ cpm/pmol) radiomarkiert und in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen (siehe 6) an unmarkiertem, chimären mAk 16, mAk 9.3, mAk BB-1 oder B7Ig in einer Konzentration von 4 nM zugesetzt. Es wurde die an die Platte gebundene Radioaktivität bestimmt, und diese wurde als prozentualer Anteil derjenigen Radioaktivität ausgedrückt, die in den ohne Kompetitor behandelten Vertiefungen gebunden war (28 300 cpm). Jeder Punkt steht für den Mittelwert einer Doppelbestimmung; Wiederholungen variierten im Allgemeinen mit ≤ 20% um den Mittelwert. Die Konzentrationen wurden auf der Grundlage eines M_r von 75 000 pro Bindungsstelle für mAk und 51 000 pro Bindungsstelle für B7Ig berechnet.
Wie in 6 gezeigt ist, konkurrierten nur der mAk BB-1 und unmarkiertes B7Ig signifikant um die ¹²⁵I-B71g-Bindung (halbmaximale Wirkungen bei etwa 22 nM bzw. etwa 175 nM). Weder der chimäre mAk 16 noch der mAk 9.3 konkurrierten wirksam bei den getesteten Konzentrationen. In weiteren Experimenten reichten die Konzentrationen von mAk 9.3 aus, um die Bindung von ¹²⁵I-B7Ig an immobilisiertes CD28Ig oder an oberflächenexprimiertes CD28 mit ≥ 90% zu inhibieren.
Trägt man die Kompetitionsdaten aus 6 als Scatchard-Plot auf, wurde eine Dissoziationskonstante K_d von etwa 12 nM für die Bindung von ¹²⁵I-B7 an immobilisiertes CTLA4Ig berechnet (7). Dieser Wert liegt etwa 20-mal niedriger als die zuvor für die Bindung zwischen ¹²⁵I-B7Ig und CD28 bestimmte K_d (etwa 200 nM) (Linsley et al., (1991), oben), ein Hinweis darauf, dass CTLA4 ein Rezeptor mit höherer Affinität für das B7-Antigen ist als der CD28-Rezeptor.
Zur Identifizierung der CLTA4Ig bindenden Moleküle auf Lymphoblastoidzellen (7) wurden ¹²⁵I-Oberflächen-markierte Zellen einer Immunpräzipitations-Analyse unterzogen (8). B7⁺-CHO- und PM-LCL-Zellen wurden mit ¹²⁵1 oberflächenmarkiert und in Anlehnung an obige Beschreibung mit einer nichtionischen Detergenslösung extrahiert. Aliquots von etwa 1,5 × 10⁷ cpm in einem Volumen von 0,1 ml enthaltenden Extrakten wurden in Anlehnung an obige Beschreibung einer Immunpräzipitations-Analyse ohne Zusatz oder mit jeweils 2 μg CD28Ig, CTLA4Ig oder CD5Ig unterzogen. Die gewaschenen Immunpräzipitate wurden dann mit SDS-PAGE (10–20%-iger Acrylamidgradient) unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Das Gel wurde dann getrocknet und autoradiographiert. Der linke Teil der 8 zeigt ein nach 1-tägiger Bestrahlung erhaltenes Autoradiogramm. Der rechte Teil der 8 zeigt ein Autoradiogramm desselben Gels nach 10-tägiger Bestrahlung. Das Autoradiogramm im mittleren Teil der 8 wurde ebenfalls 10 Tage bestrahlt. Die Positionen der Molekulargewichtsstandards sind ebenfalls in dieser Figur angezeigt.
Wie durch 8 gezeigt ist, wurde ein diffus wanderndes (M_r von etwa 50 000–75 000; Zentrum bei etwa 60 000), radiomarkiertes Protein durch CTLA4Ig, jedoch nicht durch CD28Ig oder CD5Ig immunpräzipitiert. Dieses Molekül wanderte mit B7, das aus B7⁺-CHO-Zellen durch CTLA4Ig, und wesentlich schwächer durch CD28Ig, immunpräzipitiert worden war. Diese Befunde zeigen, dass CTLA4Ig an ein einzelnes Protein auf Lymphoblastoidzellen bindet, dessen Größe derjenigen des B7-Antigens ähnlich ist.
Inhibition der Immunantworten in vitro durch CTLA4Ig
Inhibition der Proliferation. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass der anti-CD28-mAk 9.3 und der anti-B7-mAk BB-1 die Proliferation von Alloantigen-spezifischen T_h-Zellen ebenso wie die Immunglobulinsekretion durch Alloantigen-präsentierende B-Zellen inhibieren (Damle, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 5096 (1981); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 16: 1289 (1986)). Da CTLA4 – wie hier gezeigt – ein hochaffiner Rezeptor für das B7-Antigen ist, wurde lösliches CTLA4Ig dahingehend untersucht, ob es diese Antworten inhibieren kann. Die Wirkungen von CTLA4Ig auf die T-Zellproliferation wurden in dem in 9 gezeigten Experiment untersucht.
Blasten aus der primären gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) wurden mit bestrahlten T51-Lymphoblastoidzellen (IC) mit oder ohne Konzentrationen an Fab-Fragmenten des murinen mAk 9.3, oder an B7Ig-, von CD28Ig- oder CTLA4Ig-Immunglobulin-Cγ-Fusionsproteinen stimuliert. Die zelluläre Proliferation wurde durch [³H]-Thymidin-Aufnahme nach 4 Tagen gemessen und als der prozentuale Anteil des Einbaus durch unbehandelte Kulturen (21 000 cpm) ausgedrückt. 9 zeigt die Mittelwerte von 4-fach-Bestimmungen (SEM < 10%).
Wie in 9 gezeigt ist, inhibierte CTLA4Ig die MLR-Reaktion dosisabhängig mit einem Maximum von > 90% und einer halbmaximalen Antwort bei etwa 30 ng/ml (etwa 0,8 nM). Das Fab-Fragment des mAks 9.3, von dem zuvor gezeigt worden war, dass es ein stärkerer Inhibitor der MLR war als der vollständige mAk 9.3 (Damle et al., J. Immunol. 140: 1753–1761 (1988)), inhibierte ebenfalls die MLR, jedoch bei höheren Konzentrationen (etwa 800 ng/ml oder etwa 30 nM für eine halbmaximale Antwort). B7Ig und CD28Ig inhibierten die MLR selbst bei höheren Konzentrationen nicht signifikant. In weiteren Experimenten hob die Zugabe von B7Ig zusammen mit CTLA4Ig teilweise die Inhibition der MIR durch CTLA4Ig auf, ein Hinweis darauf, dass die Inhibition spezifisch der Interaktion mit B7-Antigen zuzuschreiben war.
Inhibition der Immunglobulinsekretion. Die Wirkungen von CTLA4Ig auf durch T-Helferzellen (T_h)-induzierte Immunglobulinsekretion wurden ebenfalls untersucht (10). CD4⁺-T-Zellen wurden mit allogenen CD19⁺-B-Zellen in Anlehnung an obige Beschreibung mit oder ohne die angegebenen Immunglobulinmoleküle vermischt. Murine mAk OKT8, 9.3 und BB-1 wurden mit 20 μg/ml und Ig-Fusionsproteine mit 10 μg/ml zugegeben. Nach 6-tägiger Kultur wurden die Konzentrationen von menschlichem IgM (SEM < 5%) in den Kulturüberstanden durch Enzymimmunoassay (ELISA) in Anlehnung an obige Beschreibung bestimmt. Die IgM-Produktion durch B-Zellen, die ohne CD4⁺-T-Zellen kultiviert worden waren, betrug 11 ng/ml.
Wie in 10 gezeigt ist, stimulierten CD4⁺-T-Zellen die IgM-Produktion durch allogene CD19⁺-B-Zellen (ohne CD4⁺-T-Zellen wurden IgM-Spiegel um 93% reduziert). Die mAk 9.3 und BB-1 inhibierten signifikant die T_h-induzierte IgM-Produktion (63% bzw 65% Inhibition). CTLA4Ig war sogar noch effektiver als Inhibitor (89% Inhibition) als die mAk. Die Inhibition durch die Kontroll-Ig-Moleküle, dem mAk OKT8 und CD5Ig, war wesentlich geringer (≤ 30% Inhibition). Keines dieser Moleküle inhibierte signifikant die Ig-Produktion, die in Gegenwart von Staphylococcal aureus-Enterotoxin B gemessen wurde. Ähnliche Resultate wurden mit CD4⁺-T-Zellen und B-Zellen aus anderen Spendern erhalten. Diese Resultate zeigen, dass die Inhibition durch CTLA4Ig spezifisch ist.
Die obigen Daten zeigen ebenfalls, dass die CTLA4- und CD28-Rezeptoren sowohl funktionell als auch strukturell verwandt sind. Wie CD28 ist auch CTLA4 ein Rezeptor für das B-Zell-Aktivierungsantigen B7. CTLA4Ig band an ¹²⁵I-B7 mit einer Affinitätskonstante K_d von etwa 12 nM, einem etwa 20-mal höheren Wert als die Affinität zwischen CD28 und B7Ig (etwa 200 nM). Man kann daher von CTLA4 und CD28 als hoch- bzw. niedrigaffinem Rezeptor für denselben Liganden, nämlich das B7-Antigen, sprechen.
Die scheinbare Affinität zwischen CD28 und B7 ähnelt derjenigen Affinität, die für die Bindung von löslichem Alloantigen an den T-Zellrezeptor eines murinen T-Ze1l-Hybridoms berichtet worden ist (etwa 100 nM; Schnek et al., Cell 56: 47 (1989)); sie ist höher als die Interaktionen zwischen CD2 und LFA3 (Recny et al., J. Biol. Chem. 265: 8542 (1990)) oder zwischen CD4 und MHC-Klasse-II-Molekülen (Clayton et al., Nature 339: 548 (1989)). Die scheinbare Affinitätskonstante K_d zwischen CDTLA4 und B7 ist sogar noch größer und vergleichbar mit mAkn höherer Affinität (K_d 2–10 000 nM; Alzari et al., Ann. Rev. Immuno. 6: 555 (1988)). Die K_d zwischen CTLA4 und B7 ist ähnlich groß oder größer als die K_d-Werte von Integrinrezeptoren und deren Liganden (10–2000 nM; Hautanen et al., J. Biol. Chem. 264: 1437–1442 (1989)); Di Minno et al., Blood 61: 140–148 (1983); Thiagarajan und Kelley, J. Biol. Chem. 263: 3035–3038 (1988)). Die Affinität der Interaktion zwischen CTLA4 und B7 ist daher eine der höchsten, die jemals für lymphoide Adhäsionssysteme berichtet worden ist.
Diese Resultate zeigen die erste Expression eines funktionellen Proteinprodukts des CTLA4-Transkripts. CTLA4Ig, ein Fusionskonstrukt, das die an eine IgCγ1-Domäne fusionierte extrazelluläre Domäne von CTLA4 enthält, bildet ein Disulfid-gekoppeltes Dimer aus Untereinheiten mit einem M_r von etwa 50 000 (1). Da in dem Ig-Abschnitt dieses Fusionsproduktes keine Disulfide zwischen den Ketten erwartet werden, scheint es sehr wahrscheinlich zu sein, dass Cysteine aus CTLA4 an der Disulfidbindungsbildung beteiligt sind. Das analoge CD28Ig-Fusionsprotein (Linsley et al., oben, 1991) enthält ebenfalls Disulfidbrücken zwischen den Ketten. Diese Resultate legen nahe, dass der CTLA4-Rezeptor wie CD28 (Hansen et al., Immunogenetics 10: 247–260 (1980)) auf der T-Zelloberfläche als Disulfid-gekoppeltes Homodimer vorkommt. Obwohl CD28 und CTLA4 hochhomologe Proteine sind, unterscheiden sie sich immunologisch, da der anti-CD28-mAk 9.3 CTLA4 nicht erkennt (4 und 5).
Es ist nicht bekannt, ob CTLA4 T-Zellen aktivieren kann, indem es CD28-analoge Wege signalisiert. Die cytoplasmatischen Domänen von murinem und menschlichem CTLA4 sind identisch (Dariavach et al., oben, 1988), ein Hinweis darauf, dass diese Region wichtige funktionelle Eigenschaften besitzt. Die cytoplasmatischen Domänen von CD28 und CTLA4 teilen ebenfalls Homologien, obwohl unklar ist, ob dies ausreicht, um den beiden Molekülen ähnliche signalisierende Eigenschaften zu verleihen.
CTLA4Ig ist ein starker Inhibitor von in vitro-Lymphozytenfunktionen, die eine T-Zell- und B-Zellkollaboration erfordern (9 und 10). Diese Befunde zusammen mit früheren Untersuchungen zeigen, dass Interaktionen zwischen B7-Antigen und dessen Gegenrezeptoren CD28 und/oder CTLA4 von fundamentaler Bedeutung bei der Regulierung von T- und B-Lymphozytenantworten sind. CTLA4Ig sollte ein brauchbares Reagens für zukünftige Untersuchungen in Hinblick auf die Rolle dieser Interaktionen im Verlaufe von Immunantworten sein. CTLA4Ig ist ein stärkerer Inhibitor der in vitro-Lymphozytenantworten als der mAk BB-1 oder der mAk 9.3 (9 und 10). Die größere Potenz von CTLA4Ig in Bezug auf mAk BB-1 ist höchstwahrscheinlich den zwischen diesen Molekülen bestehenden Unterschieden in den Affinitäten für B7 zuzuschreiben (6). CTLA4Ig ist auch stärker als der mAk 9.3, wahrscheinlich weil es anders als der mAk keine direkten stimulierenden Wirkungen auf die T-Zellproliferation ausübt (June et al., Immunology Today 11: 211 (1989)), was dessen inhibierenden Wirkungen zuwiderlaufen würde. Die immunsuppressiven Wirkungen von CTLA4Ig in vitro legen nahe, dass zukünftige Untersuchungen im Hinblick auf mögliche therapeutische Wirkungen dieses Moleküls zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, an denen eine aus dem Gleichgewicht geratene T-Zellaktivierung oder Ig-Produktion beteiligt ist, erforderlich sein werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

CTLA4-Rezeptorprotein, für das die in 3 dargestellte Nukleotidsequenz kodiert, die bei Nukleotid +76 (SEQ ID Nrn.: 13 und 14) beginnt, und das gegenüber B7-Antigen reaktiv ist.
Fusionsprotein, das gegenüber B7-Antigen reaktiv ist, mit einer ersten Aminosäuresequenz, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 nach Anspruch 1 entspricht, welche den Aminosäurerest Thr⁺¹¹¹ umfasst, und einer zweiten Aminosäuresequenz, die Aminosäurereste enthält, welche den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen des menschlichen Immunglobulins Cγ1 entsprechen.
Fusionsprotein, das gegenüber B7-Antigen reaktiv ist, mit einer ersten Aminosäuresequenz von etwa Position 1 bis etwa Position 125 der Aminosäuresequenz, die der extrazellulären Domäne von CTLA4 nach Anspruch 1 entspricht, welche den Aminosäurerest Thr⁺¹¹¹ umfasst, und einer zweiten Aminosäuresequenz, die Aminosäurereste enthält, welche den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen des menschlichen Immunglobulins Cγ1 entsprechen.
DNA, die für die Aminosäuresequenz kodiert, welche dem Fusionsprotein CTLA4Ig nach Anspruch 2 oder 3, das gegenüber B7-Antigen reaktiv ist, entspricht und die ATCC-Nr. 68629 trägt.
Hybridfusionsprotein, das gegenüber B7-Antigen reaktiv ist, mit einer ersten Aminosäuresequenz, die einem Fragment der extrazellulären Domäne von CD28 entspricht, mit einer damit verknüpften zweiten Aminosäuresequenz, die einem Fragment der den Aminosäurerest Thr⁺¹¹¹ umfassenden extrazellulären Domäne von CTLA4 nach Anspruch 1 entspricht, und einer dritten Aminosäuresequenz, die den Hinge-, CH2- und CH3-Regionen des menschlichen Immunglobulins Cγ1 entspricht.
Ovarzelllinie von chinesischen Hamstern mit der ATCC-Nr. 10762, die das von der DNA nach Anspruch 4 kodierte Fusionsprotein stabil exprimiert.
Verwendung eines Liganden für das B7-Antigen zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels mit Verwendbarkeit zur Regulierung von Wechselwirkungen zwischen CTLA4-positiven T-Zellen und B7-positiven Zellen, wobei der Ligand in die Reaktion von endogenem B7-Antigen mit CTLA4 einzugreifen vermag und der Ligand ein Fusionsprotein ist, das wenigstens einen Teil der extrazellulären Domäne von CTLA4 enthält.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Ligand ein Fusionsprotein nach Anspruch 3 ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei der Ligand ein Fusionsprotein ist, das wie in Anspruch 2 definiert ist oder für das die DNA nach Anspruch 4 kodiert.
Verwendung eines Liganden für CTLA4 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels mit Verwendbarkeit zur Regulierung von Wechselwirkungen zwischen CTLA4-positiven Zellen und anderen Zellen, wobei der Ligand die Wechselwirkung von CTLA4-positiven T-Zellen mit B7-positiven Zellen zu hemmen vermag und der Ligand ein gegenüber CTLA4 reaktiver monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der Ligand ein Fragment des monoklonalen Antikörpers ist.
Pharmazeutisches Mittel, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge wenigstens eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.