FI112082B - Menetelmiä eristetyn CTLA4-reseptorin ja sen johdannaisten, niitä sisältävien tuotteiden ja CTLA-reseptorin tunnistavien vasta-aineiden valmistamiseksi, menetelmissä käyttökelpoisia nukleiinihapposekvenssejä, plasmideja ja isäntäsoluja sekä niiden käyttötapoja - Google Patents

Menetelmiä eristetyn CTLA4-reseptorin ja sen johdannaisten, niitä sisältävien tuotteiden ja CTLA-reseptorin tunnistavien vasta-aineiden valmistamiseksi, menetelmissä käyttökelpoisia nukleiinihapposekvenssejä, plasmideja ja isäntäsoluja sekä niiden käyttötapoja Download PDF

Info

Publication number
FI112082B
FI112082B FI935795A FI935795A FI112082B FI 112082 B FI112082 B FI 112082B FI 935795 A FI935795 A FI 935795A FI 935795 A FI935795 A FI 935795A FI 112082 B FI112082 B FI 112082B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ctla4
amino acid
protein
cells
sequence
Prior art date
Application number
FI935795A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI935795A (fi
FI935795A0 (fi
Inventor
Jeffrey A Ledbetter
Peter S Linsley
William Brady
Nitin K Damle
Original Assignee
Squibb Bristol Myers Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24907003&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI112082(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Squibb Bristol Myers Co filed Critical Squibb Bristol Myers Co
Publication of FI935795A publication Critical patent/FI935795A/fi
Publication of FI935795A0 publication Critical patent/FI935795A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI112082B publication Critical patent/FI112082B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

Ί Ί O f' C O
I ΊΑ; 0/.
Menetelmiä eristetyn CTLA4-reseptorin ja sen johdannaisten, niitä sisältävien tuotteiden ja CTLA-reseptorin tunnistavien vasta-aineiden valmistamiseksi, menetelmissä käyttökelpoisia nukleiinihapposekvenssejä, plasmideja ja isäntä-5 soluja sekä niiden käyttötapoja
Keksinnön ala
Keksintö liittyy CTLA4-reseptorigeenin ilmentämiseen, tämän reseptorin ja B7-antigeenia ilmentävien solu-10 jen välisen vuorovaikutuksen tunnistamiseen ja menetelmiin sellaisten solujen välisten vuorovaikutusten säännöste-lemiseksi, joihin liittyy CTLA4-reseptori.
Keksinnön tausta
Selkärankaisten immuunijärjestelmälle leimaa anta-15 vana piirteenä on kyky erottaa oma ("self") elimistö jostakin toisesta ("non-self") (vieraasta) elimistöstä. Tämä ominaisuus on johtanut sellaisen järjestelmän kehittymiseen, jossa optimaalisen immuuniaktivaation saavuttamiseen tarvitaan useita signaaleja [Janeway, Cold Spring 20 Harbor Symp. Quant. Biol. 54 (1989) 1 - 14]. T-solujen ja B-solujen vuorovaikutukset ovat välttämättömiä immuuni-· vasteelle. T-solujen ja B-solujen pinnalla esiintyvien mo- • · i ! t · : nien kohesiivisten molekyylien pitoisuudet lisääntyvät immuunivasteen aikana [Springer, et ai., (1987), edellä, • • 25 Shaw ja Shimuzu, Current Opinion in Immunology, Kindt ja * · · ·
Long (toim. ) 1 (1988) 92 - 97; ja Hemler, Immunology Today 9 (1988) 109 - 113]. Näiden molekyylien pitoisuuksien » · » lisääntyminen voi osaltaan selittää sen, miksi aktivoidut , , B-solut stimuloivat antigeenispesifistä T-solujen lisäänty- * » ;* 30 mistä lepotilassa olevia B-soluja tehokkaammin [Kaiuchi, et >*.* ai., J. Immunol. 131 (1983) 109 - 114; Kreiger, et ai., J.
··· Immunol. 135 (1985) 2 937 - 2 945; McKenzie, J. Immunol.
141 (1988) 2 907 - 2 911; ja Hawrylowicz ja Unanue, J.
Immunol. 141 (1988) 4 083 - 4 088], 35 T-lymfosyytti ("T-solu") -immuunivasteen muodostu- · minen on monimutkainen ilmiö, johon liittyy solujen välisiä 2 11208? vuorovaikutuksia [Springer, et ai., A. Rev. Immunol. 5 (1987) 223 - 252], jotka tapahtuvat varsinkin T-solujen ja apusolujen, kuten B-solujen välillä, sekä immuuni-järjestelmän liukoisten välittäjäaineiden (sytokiinien tai 5 lymfokiinien) muodostuminen [Dinarello ja Mier, New Engl. Jour. Med 317 (1987) 940 - 945]. Tätä vastetta säätelevät useat T-solujen pinnalla olevat reseptorit, joihin kuuluu T-solureseptorikompleksi [Weiss, et ai., Ann. Rev. Immunol. 4 (1986) 593 - 619] ja muita solun pinnalla olevia 10 "apu"molekyylejä [Springer, et ai., (1987) edellä]. Monet näistä apumolekyyleistä ovat luonnossa esiintyviä solun pinnan erinlaistumis (CD) -antigeenejä, jotka voidaan erottaa toisistaan sen perusteella, miten ne reagoivat solujen pintaa vastaan suunnattujen monoklonaalisten vasta-aineiden 15 kanssa [McMichael, toim., Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)].
Antigeenistä riippumattomat solujen väliset vuorovaikutukset, joissa lymfosyyttien apumolekyylit ovat osallisina, ovat välttämättömiä immuunivasteelle [Springer, et 20 ai., (1987), edellä]. Esimerkiksi T-soluun liittyvän proteiinin, CD2:n, sitoutuminen ligandiinsa LFA-3, joka on laa-j jalle levinnyt glykoproteiini [katsaus tähän on esitetty : julkaisussa Shaw ja Shimuzu, edellä) , on tärkeä T-solujen ·’·. antigeenispesifisen aktivaation optimoimiselle [Moingeon, : 25 et ai., Nature 339 (1988) 314]. Toiseen tärkeään adheesio- * » · järjestelmään liittyy lymfosyyttien, makrofagien ja \,! granulosyyttien pinnalla esiintyvän LFA-l-glykoproteiinin ' [Springer, et ai., (1987), edellä; Shaw ja Shimuzu (1988), edellä] sitoutuminen ligandeihinsa ICAM-1 (Makgoba, et ai., • ‘ 30 Nature 331 (1988) 86 - 88] ja ICAM-2 [Staunton, et ai.,
Nature 339 (1989) 61 - 64]. T-solujen apumolekyylit CD8 ja .:. CD4 vahvistavat T-solujen adheesiota vuorovaikutuksella MHC:n luokka I -molekyylien [Norment, et ai., Nature 336 * · ’·* (1988) 79 - 81] ja luokka II -molekyylien [Doyle ja
III
*...· 35 Strominger, Nature 330 (1987) 256 - 259] kanssa, vastaa- » vassa järjestyksessä mainittuna. "Solujen kulkeutumista 3 1121)82 ohjaavat (homing) reseptorit" ovat tärkeitä lymfosyyttien liikkumisen säännöstelyssä [Stoolman, Cell 56 (1989) 907 - 910]. VLA-glykoproteiinit ovat integriinejä, jotka vaikuttavat toimivan välittäjinä lymfosyyttien toiminnoissa, 5 joissa tarvitaan adheesiota solunulkoisen matriksin komponentteihin (Hemler, edellä). CD2/LFA-3-, LFA-l/ICAM-1- ja ICAM-2- sekä VLA -adheesiojärjestelmät ovat jakaantuneina useisiin erilaisiin solutyyppeihin [Springer, et ai., (1987), edellä; Shaw ja Shimuzu (1988), edellä, ja Hemler, 10 (1988), edellä].
Useita vuosia sitten tehtiin ehdotus, että B-lymfo-syyttien aktivaatio vaatisi kahta signaalia [Bretscher ja Cohn, Science 169 (1970) 1 042 - 1 049], ja kaikkien lymfosyyttien arvellaan nykyisin tarvitsevan optimaaliseen akti-15 voitumiseen kahta signaalia, antigeenille spesifistä eli klonaalista signaalia, sekä toista, antigeenin suhteen epäspesifistä signaalia (Janeway, edellä). Freeman, et ai. [J. Immunol. 143(8) (1989) 2 714 - 2 722] eristivät ja sekvenssoivat cDNA-kloonin, joka koodaa mAb-B7:n tunnista-20 maa B-solun aktivaatioantigeenia [Freeman, et ai., J.
Immunol. 138 (1987) 3 260]. Tällä cDNA:lla transfektoitujen \ COS-solujen on osoitettu värjäytyvän sekä leimalla varuste- tulla mAb-B7:llä että mAb BB-l:llä [Clark, et ai., Human • Immunol. 16 (1986) 100 - 113; Yokochi, et ai., J. Immunol.
: ,·. 25 128 (1981) 823; Freeman, et ai., (1989), edellä; ja
Freedman, et ai., (1987), edellä]. Lisäksi tämän antigeenin • · *..! on havaittu ilmentyvän muiden kehityslinjojen solujen, * kuten monosyyttien, pinnalla (Freeman, et ai., edellä).
Auttaja-T-solun, (Th.*n) antigeenivasteeseen tarvit- 30 tavia signaaleja muodostavat antigeeniä esittävät so- lut (APC:t). Ensimmäisen signaalin muodostuminen käynnistyy T-solureseptorikompleksin [Weiss, J. Clin. Invest. 86 .···. (1990) 1015] vuorovaikutuksesta antigeenin kanssa, jonka ·’ APC esittää MHC-kompleksin [major histocompatibility * « 1 35 complex (MHC) ] luokka II -molekyylien yhteydessä APC:n pinnalla [Allen, Immunol. Today 8 (1987) 270]. Tämä anti- 4 112082 geenispesifinen signaali ei ole riittävä täyden vasteen aikaansaamiseksi ja se voi toisen signaalin puuttuessa johtaa kloonin inaktivoitumiseen eli anergiaan [Schwartz, Science 248 (1990) 1 349]. Useissa kokeellisissa 5 järjestelmissä on osoitettu tarvittavan toista, MHCrstä saatavaa "stimuloivaa rinnakkaissignaalia" [Schwartz, edellä; Weaver ja Unanue, Immunol. Today 11 (1990) 49]. Tämän (näiden) tois(t)en signaali(e)n molekulaarista luonnetta ei täysin tunneta, vaikka joissakin tapauksissa on selvää, 10 että "stimuloivina rinnakkaissignaaleina" voivat toimia liukoiset molekyylit, kuten interleukiini (IL)-l (Weaver ja Unanue, edellä), ja solujen väliseen adheesioon liittyvät membraanireseptorit [Springer, Nature 346 (1990) 25].
CD28-antigeeni, joka on immunoglobuliinien yläryh-15 mään kuuluva homodimeerinen glykoproteiini [Aruffo ja Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) 8 573 - 8 577], on useim missa kypsissä humaani-T-soluissa esiintyvä apumolekyyli [Damle, et ai., J. Immunol. 131 (1983) 2 296 - 2 300],
Nykyiset todisteet viittaavat siihen, että tämä molekyyli 20 toimii T-solujen vaihtoehtoisessa aktivoitumisreaktioties- sä, joka poikkeaa T-solureseptorikompleksin käynnistämästä ] j j reaktiosarjasta [June, et ai., Mol. Cell. Biol. 7 (1987) 4 472 - 4 481]. Monoklonaaliset vasta-aineet (mAb:t), jotka j*.ti kykenevät reagoimaan CD28-antigeenin kanssa, voivat : .·. 25 tehostaa T-soluvasteita, jotka ovat käynnistyneet useiden • · · * * · · erilaisten polyklonaalisten stimulusten vaikutuksesta (katsaus tähän on esitetty julkaisussa June, et ai., • f 4 * » · ’ edellä). Nämä stimuloivat vaikutukset voivat johtua mAb:n käynnistämästä sytokiinien muodostumisesta [Thompson, et .* 30 ai., Proc. Natl. Acad. Sei 86 (1989) 1 333 - 1337; ja
Lindsten, et ai., Science 244 (1989) 339 - 343], mikä johtuu mRNA:n pysyvyyden parantumisesta [Lindsten, et ai., ,···. (1989), edellä]. Anti-CD28-mAb-molekyyleillä voi myös olla inhiboivia vaikutuksia, ne voivat toisin sanoen ehkäistä 35 autologisia lymf osyytt ityyppien yhteisreakt ioita (mixed U": lymphocyte reaction) [Damle, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.
λ a n* " o r, 5 I l/yb/ 78 (1981) 5 096 - 6 001] ja antigeenispesifisten T- solukloonien aktivoitumista [Lesslauer, et ai., Eur. J. Immunol. 16 (1986) 1 289 - 1 296].
Tutkimuksissa on osoitettu, että CD28 on B-solun 5 aktivaatioantigeenin, B7/BB-l:n, vastinreseptori [Linsley, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 5 031 - 5 035]. Käytännöllisyyssyistä käytetään B7/BB-l-anti-geenista tuonnempana nimitystä "B7-antigeeni". CD28:n ja B7-antigeenin välisiä vuorovaikutuksia on luonnehdittu B7-10 antigeenin ja CD28-reseptorin solunulkoisten osien sekä immunoglobuliinin (Ig) Cyl:n (muuttumattoman alueen raskaat ketjut) geneettisiä fuusioita käyttäen [Linsley, et ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730]. Immobilisoidun B7Ig- fuusioproteiinin sekä B7-positiivisten CHO-solujen on 15 osoitettu toimivan T-solujen lisääntymisen rinnakkaisina stimuloijina. T-solun stimuloiminen B7-positiivisilla CHO-soluilla stimuloi myös spesifisesti IL-2:n transkriptio-tuotteiden määrän lisääntymistä. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että anti-CD28-mAb inhiboi sellaista IL-2:n 20 muodostumista, joka oli käynnistynyt tietyissä T-soluleu- kemiasolulinjoissa solujen välisistä vuorovaikutuksista B-f ] l soluleukemia-solulinjan kanssa [Kohno, et ai., Cell.
:T: Immunol. 131 (1990) 1-10], CD28:lla on yksi solunulkoista vaihtelevaa aluetta : .·. 25 (V) muistuttava domeeni (Aruffo ja Seed, edellä) . Homologi- nen molekyyli, CTLA4, on tunnistettu sytolyyttisen muriini-T-solu-cDNA-kir jaston erotteluseulonnan avulla (Brunet, et ai., Nature 328 (1987) 267 - 270]. Tämän molekyylin transkriptiotuotteita on havaittu T-solupopulaatioissa, 30 joilla on sytotoksista aktiivisuutta, mikä viittaa siihen, että CTLA4 saattaisi toimia sytolyyttisessä reaktiossa • j. [Brunet, et ai., edellä; ja Brunet, et ai., Immunol. Rev.
.···. 103 (1988) 21 - 36] . Tutkijat ovat julkaisseet tutkimus- • raportteja CTLA4:ää vastaavan ihmisen geenin kloonauksesta '·.·* 35 ja kartoittamisesta [Dariavach, et ai., Eur. J. Immunol. 18 » ”· (1988) 1 901 - 1 905] samaan kromosomialueeseen (2q33 - 34) 1Λ n.Λ O Γ·,
IZUÖZ
kuin CD28 [Lafage-Pochitaloff, et ai., Immunogenetics 31 (1990) 198 - 201]. Tämän humaani-CTLA4-DNA:n ja CD28- proteiineja koodaavan DNA:n sekvenssien vertaaminen keskenään on paljastanut merkittävää sekvenssihomologiaa, jossa 5 homologisuusaste on suurin jukstamembraanisilla ja syto-plasmisilla alueilla (Brunet, et ai., 1986, edellä; Dariavach, et ai., 1988, edellä).
CD28:n ja CTLA4:n välinen korkeanasteinen homologia sekä niiden geenien paikantuminen samaan paikkaan nostaa 10 esiin kysymyksen siitä, muistuttavatko nämä molekyylit myös toiminnallisesti toisiaan. Koska CTLA4:n proteiinituotetta ei ole vielä onnistuttu ilmentämään, niin nämä kysymykset jäävät kuitenkin vastausta vaille.
Immunoglobuliinien yläryhmään kuuluvien solun 15 pinnan glykoproteiinien liukoisia johdannaisia, jotka ovat HIV-l:n reseptorina toimiva CD4-reseptori ja CD28- ja B7-reseptorit, on ilmennetty käyttäen sellaisista DNA-jaksois-ta eli -sekvensseistä koostuvia hybridifuusiomolekyylejä, jotka koodaavat CD4-reseptorin solunulkoisen domeenin osia 20 vastaavia aminohappoja ja jotka on yhdistetty vasta-aineen domeeneihin {immunoglobuliinin yl [Capon, et ai., Nature : : : 337 (1989) 525 - 531] (CD4) ja Linsley, et ai., J. Exp.
Med., edellä (CD28 ja B7)].
Olisi käyttökelpoista kyetä ilmentämään CTLA4- : .·. 25 geenin liukoista proteiinituotetta, jota ei ole vielä * · · · kyetty ilmentämään, ja tunnistaa CTLA4: n luonnollinen ligandi, joka osallistuu toiminnallisiin T-soluvasteisiin.
» * · ' Liukoista proteiinituotetta voitaisiin sitten käyttää T- soluvasteiden säännöstelemiseksi in vivo -olosuhteissa 30 patologisten tautitilojen hoitamiseksi.
..· Keksinnön yhteenveto
Edellä sanotun perusteella tästä keksinnöstä saadaan ,*··, käyttöön täydellinen ja virheetön DNA-sekvenssi, joka * · *' koodaa CTLA4-reseptoriproteiinia, jolla on sekvenssi * * » 35 tunnusnumero 14, vastaavaa aminohapposekvenssiä, ja B7-antigeenin on tässä keksinnössä määritetty olevan CTLA4: n 7 112032 luonnollinen ligandi. Tästä keksinnöstä saadaan myös käyttöön menetelmä tämän DNA:n ilmentämiseksi CTLA4:n ja immunoglobuliinin (Ig) fuusioproteiini tuotteena. Tämän keksinnön mukaisiin sovellutusmuotoihin kuuluvat menetelmät 5 CTLA4Ig-fuusioproteiinin ja hybridifuusioproteiinien, joi hin kuuluvat CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinit, valmistamiseksi. Siitä saadaan myös käyttöön menetelmiä CTLA4-fuusioproteiinin, hybridifuusioproteiinien ja näiden fragmenttien ja/tai johdannaisten, kuten CTLA4:n ja B7-10 antigeenin kanssa reaktiokykyisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi.
Tämän keksinnön mukaisesti saatavaa humaani-CTLA-reseptoriproteiinia koodaa 187 aminohappoa ja siihen sisältyy äskettäin tunnistettu N-välitteisen glykosylaaion 15 kohta.
Tämän keksinnön mukaisesti saatava CTLA4Ig-fuusioproteiini sitoo B7-antigeenia, joka ilmentyy aktivoitujen B-solujen ja muiden kehityslinjojen solujen pinnalla ja joka on T-solujen pinnalla olevan CD28-reseptorin ligandi. 20 CTLA4Ig sitoo B7-antigeenia merkittävästi suuremmalla affiniteetillä kuin millä B7:n sitoutuminen CD28- * · ::: reseptoriin tapahtuu. CTLA4Ig-konstruktio sisältää ensim- mäisen aminohapposekvenssin, joka koostuu sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetystä CTLA4: n solunulkoisesta domee- : ,·, 25 nista tai sen osasta tai fragmentista, ja toisesta * · » aminohapposekvenssistä, joka koostuu ihmisen immunoglobu- * · liinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2- ja CH3-alueis- * » t ‘ ta. Ensimmäinen aminohapposekvenssi sisältää aminohappo- ryhmät eli -tähteet alkaen CTLA4:n solunulkoista domeenia .* 30 esittävän sekvenssin tunnusnumero 13 alaniinista aminohap- poasemassa 1 ja päättyen asparagiinihappoon aminohappo-asemassa 125, ja jotka on liitetty toiseen aminohappo-sekvenssiin, joka koostuu ihmisen immunoglobuliinimolekyy-lin sarana-alueesta sekä CH2- ja CH3-alueista. Fuusio- *...· 35 proteiinia tuotetaan edullisesti dimeerisessä muodossa.
t ? * t t 1 1 O; ! Q O 8 I 1 L : ,· ö /.
Liukoinen CTLA4Ig on voimakas T- ja B-lymfo-syyttivasteiden inhibiittori in vitro -olosuhteissa.
Tämä keksintö koskee myös menetelmää CD28lg/CTLA4lg-fuusioproteiinihybridien valmistamiseksi, 5 joka hybridi sitoutuu B7-antigeeniin ja käsittää ensimmäisen aminohapposekvenssin, joka vastaa osaa CD28-resep-torin solunulkoisesta domeenista, tai sen fragmentin tai johdannaisen fuusioituna toiseen aminohapposekvenssiin, joka vastaa osaa sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetyn 10 CTLA4-reseptorin solunulkoisesta domeenista, tai sen fragmenttiin tai johdannaiseen ja kolmannen aminohapposekvenssin, joka vastaa ihmisen immunoglobuliini Cyl sarana-aluetta sekä CH2- ja CH3-alueita. Valmistettavien hybridi-fuusioproteiinien yksi sovellutusmuoto on CD28Ig/CTLA4Ig-15 fuusiokonstruktio, jonka ensimmäinen aminohapposekvenssi vastaa CD28-reseptorin solunulkoisen domeenin aminohappoja 1 - 94 ja toinen aminohapposekvenssi vastaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohappoja 94 - 125.
Keksintö koskee myös in vitro menetelmää funktio-20 naalisten CTLA4-positiivisten T-solujen vuorovaikutusten B7-positiivisten solujen kanssa säätelemiseksi, jossa t · j : menetelmässä B7-positiiviset solut saatetaan kosketukseen B7-antigeenin ligandin kanssa sellaisena määränä, joka on • ‘.>t tehokas häiritsemään endogeenisen B7-antigeenin reaktiota : ,·. 25 CTLA4: n kanssa. Tällainen ligandi on tämän keksinnön * » · ,>·,·, mukaisesti saatava CTLA4Ig-fuusioproteiini, proteiini, sen • * fragmentit tai johdannaiset, CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioprote- * * a • » · ’ iinihybridi tai B7-antigeenin kanssa reagoimaan kykenevä monoklonaalinen vasta-aine.
.* 30 Tämä keksintö koskee myös menetelmää CTLA4Ig-fuu- sioproteiinin kanssa reagoimaan kykenevän monoklonaalisen vasta-aineen ja CD28lg/CTLA4Ig-fuusioproteiinin kanssa rea- .··, goimaan kykenevän monoklonaalisen vasta-aineen valmista- ‘‘‘ miseksi, joita käytetään solujen vuorovaikutusten säännös- • t j 35 telemiseen.
» * * * f * • » 9 112082
Keksinnössä on myös kuvattu uusi kiinanhamsterin munasarjasolulinja, jolla on talletusnumero ATCC 10762 ja joka ilmentää pysyvästi CTLA4Ig-fuusioproteiinia.
Piirustusten kuvaus 5 Kuvio 1 on kaavio CTLA4Ig-fuusiokonstruktioista, jotka on kuvattu tuonnempana esimerkissä 2.
Kuvio 2 on valokuva geelistä, joka on saatu CTLA4Ig:n kromatografisesta puhdistuksesta SDS-PAGE:lla tuonnempana esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
10 Kuvio 3 on humaani-CTLA4-reseptoria koodaava täy dellinen aminohapposekvenssi (sekvenssit tunnusnumerot 13 ja 14), joka on fuusioitu onkostatiini M:n signaali-peptidiin (asemasta -25 asemaan -1) ja johon sisältyy äskettäin tunnistettu N-välitteisen glykosylaation kohta 15 (asemat 109 - 111), tuonnempana esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.
Kuvio 4 esittää FACSR-analyysituloksia, jotka on saatu B7Ig-fuusioproteiinin sitoutumisesta CD28:lla ja CTLA4:llä transfektoituihin COS-soluihin tuonnempana 20 esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
Kuvio 5 esittää FACSR-analyysituloksia, jotka on | saatu puhdistetun CTLA4Ig:n sitoutumisesta B7-antigeeni- ;T: positiivisten (B7+) CHO-solujen pintaan ja lymfoblas- j**>t toidisen solulinjan (PM LCL) pintaan tuonnempana esimerkis- : 25 sä 4 kuvatulla tavalla.
• I I
Kuvio 6 on graafinen esitys, joka kuvaa kompeti-*>.! tiivistä sitoutumisanalyysia, jossa on tutkittu 125I-leimal- la varustetun B7Ig:n sitoutumista immobilisoituun CTLA4Ig:hen tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
·' ' 30 Kuvio 7 on graafinen esitys, jossa on esitetty of « * t
> # IPS
'...· Scatchard-analyysin tulokset I-leimalla varustetun B7Ig:n sitoutumisesta immobilisoituun CTLA4Ig:hen tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
* Kuvio 8 on valokuva, joka esittää geeliä B7-posi- 35 tiivisten CHO-solujen ja pinnastaan 125I-leimalla varustet-’·”· tujen PM LCL -solujen immunosaostusanalyysin SDS-PAGE- Λ «1 Γ> ‘ O r' 10 I iZuÖk.
kromatografiästä, joka suoritettiin tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
Kuvio 9 on graafinen esitys CTLA4Ig:n vaikutuksista T-solujen lisääntymiseen määritettynä [3H]-tymidiinin ke-5 rääntymisestä soluihin tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
Kuvio 10 on pylväskaavio, joka kuvaa CTLA4Ig:n vaikutuksia auttaja-T-solujen (Th-solut) käynnistämään humaani-B-solujen immunoglobuliinien eritykseen määritet-10 tynä entsyymi-immunomäärityksellä (ELISA) tuonnempana esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Seuraava selitys on esitetty syventämään kuvatun keksinnön ymmärtämistä.
15 Keksintö käsittää sellaisen T-solujen pinnalla esiintyvän humaani-CTLA4-reseptorin eristämisen ja ilmentämisen, joka sitoutuu aktivoitujen B-solujen ja muiden kehityslinjojen solujen pinnalla ilmentyvään B7-anti-geeniin, sekä CTLA4-reseptorigeenin liukoisten fuusio-20 proteiinituotteiden ilmentämisen. Keksinnöstä saadaan myös käyttöön menetelmiä ilmennetyn CTLA4-reseptorin käyttöön j.- .* solujen vuorovaikutusten säännöstelemiseksi, mukaan lukien T-solujen ja B7-positiivisten solujen vuorovaikutukset.
Edullisessa sovellutusmuodossa tämän keksinnön • · · : .·. 25 mukaisesti saatavaa humaani-CTLA4-reseptoriproteiinia vas- taavaa aminohapposekvenssiä koodaava täydellinen ja vir-heetön DNA-sekvenssi kloonataan PCR:ää käyttäen. CTLA4:n * # i
• täydellisen ennustetun koodaavan sekvenssin sisältävä cDNA
koottiin kahdesta PCR-fragmentista, jotka oli amplifioitu i .· 30 H38-RNA:sta, ja se liitettiin CDM8-ilmentämisvektoriin tuonnempana esimerkeissä yksityiskohtaisesti kuvatulla tavalla. Isolaatiot transfektoitiin COS-soluihin ja niistä ,···, tutkittiin kyky sitoa B7Ig:tä, joka on liukoinen fuusio- * » proteiini, jonka aminohapposekvenssi vastaa B7:n solun- ·...· 35 ulkoista domeenia ja humaani-immunoglobuliinin (Ig) Cyl- * * * » » Λ Α Λ> = ο li I ΙΖυο/ aluetta, ja joka on kuvattu julkaisussa Linsley, et ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730.
Tämän jälkeen määritettiin yhden isolaation, jolle annettiin nimitys 0MCTLA4, DNA-sekvenssi ja sen havaittiin 5 vastaavan tarkalleen humaani-CTLA4:n ennustettua sekvenssiä, joka oli fuusioitu onkostatiini M:stä peräisin olevan signaalipeptidin N-terminaaliseen päähän. CTLA4:n reseptoria koodaa 187 aminohappoa (signaalipeptidiä ja lopetuskodoneja lukuun ottamatta) ja se sisältää äskettäin 10 tunnistetun N-välitteisen glykosylaation kohdan aminohappoasemissa 109 - 111 (katso tuonnempana oleva kuvio 3) . CTLA4-reseptoria ilmennetään käyttäen onkostatiini M:n signaalipeptidiä.
Toisessa edullisessa sovellutusmuodossa valmiste 15 taan CTLA4-reseptorigeenin proteiinituotteen (CTLA4Ig) liukoisia muotoja käyttäen fuusioproteiineja, joissa on ensimmäinen aminohapposekvenssi, joka vastaa CTLA4:n solunulkoista domeenia ja toinen aminohapposekvenssi, joka vastaa humaani-Ig:n Cyl-domeenia. Konstruoitiin kloonaus-20 ja ilmentämisplasmidit (CDM8 ja nLN), jotka sisälsivät cDNA-molekyylejä, jotka koodasivat tässä keksinnössä •§j · kuvattuun cDNArhan perustuvaa humaani-CTLA4-reseptoria :*!*: vastaavan aminohapposekvenssin osia, jossa CTLA4-resepto- rigeenin solunulkoisen domeenin fragmenttia vastaavaa • :,·. 25 ensimmäistä aminohapposekvenssiä koodaava cDNA on liitetty DNA:han, joka koodaa toista aminohapposekvenssiä, joka t · vastaa Ig:n C-aluetta, joka mahdollistaa CTLA4- * * · ‘ reseptorigeenin ilmentymisen muuttamalla ilmennetyn CTLA4- proteiinin liukoisuutta. Liukoista CTLA4Ig-fuusioproteiinia * · 30 koodaa siten ensimmäinen aminohapposekvenssi, joka sisältää ,,,· CTLA4: n solunulkoisen domeenin aminohapposekvenssiä vastaavat aminohappotähteet aseman 1 kohdalta aseman 125 .···, kohdalle ja joka on liitetty toiseen aminohapposekvenssiin, joka sisältää humaani-Ig:n Ογ1:η sarana-, CH2- ja CH3- I I t 35 alueita vastaavat aminohappotähteet. Fuusioproteiinia ’"‘ί tuotetaan edullisesti dimeerisessä muodossa. Konstruktio 12 1*1^· 'Qr· I ! «r -.. V.· transfektoitiin sitten COS- tai CHO-soluihin ja CTLA41g puhdistettiin ja sen tunnistettiin olevan dimeeri.
CTLA4Ig-fuusioproteiinia vastaavaa aminohapposekvenssiä koodaava DNA on talletettu 31.5.1991 Budapestin 5 sopimuksen ehtojen mukaisesti talletuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, ja sille on annettu ATCC:n hakunumero 68 629.
Tästä keksinnöstä saadaan ensimmäistä kertaa käyttöön liukoisen fuusioproteiinin muodossa oleva CTLA4-10 transkriptiotuotteiden tuottama proteiini. CTLA4Ig- proteiini muodostaa disulfidin yhdistämän dimeerin, jonka alayksikköjen Mr on noin 50 000, mikä viittaa siihen, että natiivi CTLA4 on todennäköisesti T-solun pinnalla disulfidin yhdistämänä homodimeerinä.
15 B7-antigeenin on osoitettu olevan T-solujen pinnalla olevan CD28-reseptorin ligandi (Linsley, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, edellä). CTLA4-reseptori-molekyyli näyttää muistuttavan toiminnallisesti ja rakenteellisesti CD28-reseptoria; kummatkin ovat B-solun 20 aktivaatioantigeenin, B7:n, reseptoreita, samalla kun CTLA4:n affiniteetti B7:ää kohtaan vaikuttaa ole-.*.* .* van suurempi, ja se on lymfoidisten adheesiojärjestelmien joukossa suurin tähän mennessä raportoitu affiniteetti, j*. CTLA4Ig:n onkin osoitettu sitoutuvan B7-positiivisiin (B7+) : ,·, 25 solulinjoihin CD28lg:tä voimakkaammin. Muut kokeet ovat _·.·* osoittaneet, että CTLA4 on B7-antigeenin reseptori, jonka \.‘ affiniteetti CD28-reseptorin affiniteettia suurempi.
* CTLA4Ig:n on osoitettu lisäksi sitoutuvan lymfoblas- toidisten solujen pinnalla olevaan yhteen proteiiniin, joka 30 on kooltaan samanlainen kuin B7-antigeeni. CTLA4Ig inhiboi ,,,· T-solujen lisääntymistä ja se inhiboi Th:n käynnistämää
IgM:n muodostumista.
,··*_ Toisessa edullisessa sovellutusmuodossa konstruoi- tiin hybridifuusioproteiineja, joissa oli erilaisten 35 reseptoriproteiinien fragmentteja vastaavia aminohappo- sekvenssejä. Esimerkiksi CD28:n ja CTLA4:n solunulkoisten λ λ γ·. "ί η ο ]_ 3 ! I Ζ ϋ O 2.
domeenien valikoituja fragmentteja vastaavat aminohappo-sekvenssit liitettiin yhteen CD28Ig/CTLA4Ig-hybridifuusio-proteiinien valmistamiseksi. Siten saatiin CD28Ig:n ja CTLA4Ig:n fuusioproteiini, jossa oli ensimmäinen amino-5 happosekvenssi, joka sisälsi CD28:n solunulkoisen domeenin fragmenttia vastaavat aminohappotähteet ja joka oli liitetty toiseen aminohapposekvenssiin, joka vastasi CTLA4Ig:n solunulkoisen domeenin fragmenttia ja jotka sekvenssit oli liitetty kolmanteen aminohapposekvenssiin, 10 joka vastasi humaani-Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita. Hybridituusioproteiinien yksi sovellutusmuoto on CD28lg:n ja CTLA4Ig:n fuusiokonstruktio, jossa on ensimmäinen aminohapposekvenssi, joka sisältää CD28:n solunulkoista domeenia vastaavassa aminohapposekvenssissä 15 olevat aminohappotähteet aseman 1 kohdalta aseman 94 kohdalle ja joka on liitetty toiseen aminohapposekvenssiin, joka sisältää CTLA4:nsolunulkoista domeenia vastaavassa aminohapposekvenssissä olevat aminohappotähteet aseman 94 kohdalta aseman 125 kohdalle, jotka sekvenssit on liitetty 20 kolmanteen aminohapposekvenssiin, joka vastaa humaani-
IgCyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita. j j CTLA4-reseptoriproteiinia, liukoisia fuusioprote- iineja ja hybridifuusioproteiineja vastaavia aminohappo-«*.φ> sekvenssejä koodaavien DNA-sekvenssien kloonaamiseen ja : .·. 25 ilmentämiseen käytetyt menetelmät, esimerkiksi oligo- nukleotidien synteesi, PCR, solujen transformointi, vekto-*..! rien, ilmentämis j är j estelmien ja muiden näitä vastaavien • järjestelmien konstruktiot ovat tällä alalla tunnettuja ja useimmat niiden käyttäjät tuntevat ne tavalliset lähtö-! 30 materiaalit, jotka vastaavat tiettyjä olosuhteita ja mene- ·,,,· telmiä. Seuraavat kappaleet on kuitenkin esitetty hel- pottamaan käsiteltävien asioiden seuraamista ja selvittä-.·<·, maan tarpeelliset muutokset minkä lisäksi ne voivat toimia suuntaviivana.
35 Reseptoreja ja fuusioproteiineja koodaavien '•‘h sekvenssien kloonaus ja ilmentäminen 112082 14 CD28IgCYl:tä ja B7IgCyl:tä vastaavat fuusioproteii-nikonstruktiot tämän keksinnön mukaisesti saatavan CTLA4Ig:n luonnehtimiseksi ja CD28Ig:n ja CTLA4Ig:n fuusiohybridien muodostamiseksi valmistettiin julkaisussa 5 Linsley, et ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730, esitetyllä tavalla. cDNA-kloonit voidaan vaihtoehtoisesti valmistaa vakiomenetelmiä käyttäen RNA:sta, joka on saatu B7-antigeenia ja CD28-reseptoria ilmentävistä soluista, näiden proteiinien julkaistuja sekvenssejä koskevan tiedon perus-10 teella (Aruffo ja Seed, sekä Freeman, edellä).
CTLA4Ig-fuusiot, jotka koostuivat CTLA4:n solun- ulkoista domeenia vastaavia aminohapposekvenssejä koodaa- vasta DNA:sta ja humaani-IgCyl:n sarana, CH2 ja CH3-alueita koodaavasta DNA:sta, konstruoitiin ligatoimalla PCR-frag- 15 mentteja. Aminohapposekvenssejä koodaava cDNA amplifioi- tiin käyttäen polymeraasiketjureaktio ("PCR") -menetelmää [tätä on käsitelty julkaisuissa US-patentti nro 4 683 195 ja US-patentti nro 4 683 202, Mullis, et ai./ ja Mullis &
Faloona, Methods Enzymol. 154 (1987) 335 - 350]. Hankittiin 20 käyttöön CTLA4Ig-fuusiopolypeptidejä menetellen niin, että hankittiin DNA:ta, joka koodasi aminohappo-sekvenssejä, jotka sisälsivät aminohappotähteet CTLA4:n solunulkoista domeenia vastaavan aminohapposekvenssin aseman 1 kohdalta I*. aseman 125 kohdalle, ja DNA: ta, joka koodasi Ig:n Cyl: n : ,·. 25 sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia aminohapposekvens- • * · sejä.
» · \s! Koska CTLA4-reseptoriproteiinin ilmentämistä humaa- • * nilymfoidisoluissa ei ole aiemmin raportoitu, oli tarpeellista paikantaa CTLA4-mRNA:n lähtömateriaali. 30 Seulottiin PCR cDNA:ta, joka oli valmistettu useiden humaanileukemiasolulinjojen solujen kokonais-RNA:sta käyttäen alukkeina CTLA4-geenin julkaistusta sekvensseistä ,···, peräisin olevia oligonukleotideja (Dariavach, et ai., edellä). Paras odotettua kokoa olevien PCR-tuotteiden ’,,,· 35 saanto tutkituista cDNA-molekyyleistä saatiin H38-soluista Ί": (HTLV II:een liittyvä leukemiasolulinja). Koska CTLA4- Α A n, ; 1 O f; 15 1 I Z U ö geenistä ei tunnistettu CTLA4:n signaalipeptidiä, fuusioitiin CTLA4:n ennustetun sekvenssin N-terminaalinen pää kahdessa vaiheessa onkostatiini M: n signaalipeptidiin [Malik, et ai., Molec. and Cell. Biol. 9 (1989) 2847] 5 käyttäen tuonnempana esimerkeissä kuvattuja oligonukleo-tidejä. PCR-reaktion tuote ligatoitiin yhdessä Ig:n Cylrn sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia aminohapposekvenssejä koodaavan cDNA:n kanssa ilmentämisvektoriin, kuten CDMS:ään tai nLN:ään.
10 Täysimittaista humaani-CTLA4:ää koodaavan DNA:n ai kaansaamiseksi hankittiin H38-soluista käyttöön PCR:n avulla tuonnempana esimerkeissä kuvattuja oligonukleotidialuk-keita käyttäen CTLA4:n transmembraani- ja sytoplasmisia domeeneja koodaava cDNA-molekyyli, joka liitettiin 15 CTLA4Ig:stä peräisin olevaan fragmenttiin, joka oli saatu edellä kuvatulla tavalla ja joka koodasi CTLA4:n N-terminaaliseen päähän fuusioitua onkostatiini M:n signaalipeptidiä. PCR-fragmentit ligatoitiin plasmidiin CDM8, josta saatiin tulokseksi täysimittaista CTLA4-geeniä 20 koodaava ilmentämisplasmidi, jolle annettiin nimitys OMCTLA4.
: : : Hybridifuusioproteiineja vastaavaa aminohappo- sekvenssiä koodaavan DNA: n konstruoimiseksi liitetään DNA, j*^ joka koodaa yhden reseptorigeenin solunulkoisen domeenin : ,·, 25 osia vastaavia aminohappoja, DNA: hän, joka koodaa toisen yV reseptorigeenin solunulkoisen domeenin osia vastaavia • · *., * aminohappoja, sekä DNA:hän, joka koodaa humaani-IgCyl:n • ♦ · * sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia aminohappo- sekvenssejä käyttäen edellä olevia B7lg:n, CD28Ig:n ja : .· 30 CTLA4Ig:n konstruktioita koskevia edellä kuvattuja valmistusmenetelmiä. Siten esimerkiksi DNA, joka koodaa aminohappotähteitä, jotka vastaavat CD28-reseptorin solun-(.·»ι ulkoisen domeenin aminohapposekvenssiä aseman 1 kohdalta aseman 94 kohdalle, liitetään DNA: hän, joka koodaa amino-’,,,· 35 happotähteitä, jotka vastaavat CTLA4-reseptorin solun- N": ulkoisen domeenin aminohapposekvenssiä aseman 94 kohdalta i6 112 Li 81" aseman 125 kohdalle, sekä DNA:hän, joka koodaa humaani-Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia aminohappo-sekvenssejä .
Jotta saataisiin valmistettua suuria määriä 5 kloonattua DNA:ta, transformoidaan tämän keksinnön mukaisesti saatavia fuusiokonstruktioita koodaavan DNA:n sisältävät vektorit sopiviin isäntäsoluihin, kuten E. coli -bak-teerisolulinjän MC1061/p3-kantaan (Invitrogen Corp., San Diego, CA) käyttäen vakiomenetelmiä ja pesäkkeistä seulo-10 taan asianmukaiset plasmidit.
Kloonit, jotka sisältävät fuusiokonstruktioita koodaavaa DNA:ta ja jotka on saatu edellä kuvatulla tavalla, transfektoidaan sitten sopiviin isäntäsoluihin niiden ilmentämistä varten. Transfektio suoritetaan käytetyn isän-15 täsolun mukaan näille soluille soveltuvia vakiomenetelmiä käyttäen. Esimerkiksi transfektio nisäkässoluihin suoritetaan käyttäen DEAE-dekstraanin avulla suoritettua trans-fektiota, saostamista yhdessä CaP04:n kanssa, lipofektiota, elektroporaatiota tai protoplastifuusiota ja muita tällä 20 alalla tunnettuja menetelmiä, joihin kuuluvat lysotsyymi- fuusio tai erytrosyyttifuusio, kaapiminen (scraping), suora : soluihin kerääntyminen, osmoottinen tai sakkaroosisokki, suora mikroinjektio, epäsuora mikroinjektio, kuten erytro-•\t syytin välityksellä käytettävät menetelmät ja/tai isäntä- : .·. 25 solujen käsittely sähkövirralla. Edellä olevan luettelon transfektiomenetelmistä ei katsota olevan tyhjentävä, koska • · *..! muita menetelmiä geneettisen informaation tuomiseksi • » * ’ soluihin tullaan epäilemättä kehittämään.
Ilmentäminen on edullista suorittaa monisoluisista 30 organismeista peräisin olevissa eukaryoottisissa isäntä- ',,,· soluviljelmissä [näitä on käsitelty teoksessa Tissue .:, Cultures, Academic Press, Cruz ja Patterson, toim. (1973)].
,·*·, Näillä järjestelmillä on lisäksi se etu, että ne kykenevät irrottamaan introneja ja niitä voidaan siten käyttää ',,,· 35 suoraan genomista peräisin olevien fragmenttien ilmentä- miseen. Käyttökelpoisiin isäntäsolulinjoihin kuuluvat 110; .
2 η 1 1 L· !Ό ί- kiinanhamsterin munasarja- (CHO), apinan munuais- (COS), VERO- ja HeLa-solut. Tässä keksinnössä ovat edullisia solulinjat, joissa fuusiokonstruktioiden ilmen-tyminen on pysyvää.
5 Näille soluille soveltuviin ilmentämisvektoreihin sisältyy tavallisesti nisäkässolujen suhteen yhteensopivia promoottoreita ja ilmentymistä ohjaavia sekvenssejä, kuten esimerkiksi CMV:n promoottori (CDM8-vektori) ja avian sarcoma -virus (ASV) (nLN-vektori). Muihin tavallisesti 10 käytettyihin varhaisiin ja myöhäisiin promoottoreihin kuuluvat Simian Virus 40:stä (SV 40) peräisin olevat promoottorit [Fiers, et ai., Nature 273 (1973) 113] tai muista viruksista, kuten polyomasta, adenovirus 2:sta ja bovine papilloma -viruksesta peräisin olevat promoottorit. 15 Voidaan myös käyttää säännösteltävissä olevaa promoottoria, hMTII:tä [Karin, et ai., Nature 299 (1982) 797 - 802].
Nisäkässoluisäntäjärjestelmien transformaatioiden yleisiä näkökohtia on kuvannut Axel (julkaisu US-patentti nro 4 399 216, joka on myönnetty 16.8.1983). Vaikuttaa nykyisin 20 siltä, että "tehostaja"-alueet ovat tärkeitä ilmentymisen optimoimisessa; nämä ovat tavallisesti sekvenssejä, jotka : esiintyvät koodaamattomilla DNA-alueilla promoottori- alueeseen nähden vastasuunnassa tai myötäsuunnassa.
» j‘. Replikaation alkukohdat voidaan tarvittaessa saada käyttöön ,* ,·. 25 viruksista. Liittyminen kromosomiin on kuitenkin yleinen • * * mekanismi DNA-replikaation aikaansaamiseksi eukaryooteissa.
t » *,,! Vaikka fuusiokonstruktioiden ilmentämiseen soveltu- • · · • · · ‘ viin edullisiin isäntäsoluihin kuuluvatkin eukaryoottiset solut, kuten COS- tai CHO-solut, voidaan isäntinä käyttää 30 muitakin eukaryoottisia mikrobeja. Useimmin käytettyjä ovat
Saccharomyces cerevisiaen, leivontahiivan, laboratoriokan- nat, vaikka muidenkin kantojen, kuten Schizosaccharomyces ,···, pomben, käyttö on mahdollista. Voidaan käyttää vektoreita, • · joissa käytetään esimerkiksi 2p-plasmidin replikaation > 4 4 35 alkukohtaa, Broach, Meth. Enz. 101 (1983) 307, tai muita hiivan suhteen yhteensopivia replikaation alkukohtia 18 110 Λ· C r; I I L· -J 0 i, [tätä kysymystä on käsitelty esimerkiksi julkaisuissa Stinchcomb, et ai., Nature 282 (1979) 39; Tschempe, et ai.,
Gene 10 (1980) 157; ja Clarke, et ai., Meth. Enz. 101 (1983) 300]. Hiivavektoreiden transkriptiota ohjaaviin 5 sekvensseihin kuuluvat glykolyyttisten entsyymien synteesin promoottorit [Hess, et ai., J. Adv. Enzyme Reg. 7 (1968) 149; ja Holland, et ai., Biochemistry 17 (1978) 4900].
Muihin tällä alalla tunnettuihin promoottoreihin kuuluvat CMV:n promoottori, joka saadaan käyttöön CDM8-vektorissa 10 (Toyama ja Okayama, FEBS 268 (1990) 217 - 221; 3-fosfoglyseraattikinaasin promoottori [Hitzeman, et ai., J. Biol. Chem. 255 (1980) 2073] ja muiden glykolyyttisten entsyymien promoottorit. Muita promoottoreja, joilla on lisäksi se etu, että transkriptio tapahtuu kasvuolo-15 suhteiden säännöstelemänä, ovat alkoholidehydrogenaasi 2:n, isosytokromi C:n, happamen fosfataasin, typpimetaboliaan liittyvien hajottavien entsyymien ja maltoosin ja galaktoosin hyväksikäytöstä vastaavien entsyymien promoottorialueet. Arvellaan myös, että koodaavien sekvenssien 3'-20 päässä olevat terminaattorisekvenssit ovat haluttuja. Tällaisia terminaattorisekvenssejä esiintyy translaatioon ! osallistumattomalla 3'-puoleisella alueella, joka sijaitsee hiivasta peräisin olevien geenien koodaavien sekvenssien jälkeen.
: ,·. 25 Ilmentämiseen soveltuvina isäntinä voidaan jiV vaihtoehtoisesti käyttää prokaryoottisia soluja. Proka- ryootteja edustavat useimmin useat erilaiset E. coli * * * • ’ -kannat; voidaan kuitenkin myös käyttää muita mikrobikantoja. Tavallisesti käytettyihin prokaryoottisiin i .· 30 transkriptiota ohjaaviin sekvensseihin, jotka tässä η,Ι keksinnössä rajoitetaan niihin sekvensseihin, joihin sisäl- tyvät transkription aloittamiseen soveltuvat promoottorit, joissa on vaihtoehtoisesti operaattori sekä ribosomin • » h* sitoutumiskohdan sekvenssi, kuuluvat sellaiset tavallisesti 35 19 112 J 8 2 käytetyt promoottorit, kuten beeta-laktamaasi- (penisil-linaasi-) ja laktoosi- (lac) promoottorijärjestelmät [Chang, et ai., Nature 198 (1977) 1056], tryptofaani (trp) -promoottorijärjestelmä [Goeddel, et ai., Nucleic Acids 5 Res. 8 (1980) 4057] ja lambdasta peräisin oleva PL- promoottori ja N-geenin ribosominsitoutumiskohta [Shima-take, et ai., Nature 292 (1981) 128].
Nukleotidisekvenssejä, jotka koodaavat CD28Ig- ja CTLA4Ig-proteiineja ja fuusiohybridiproteiineja, kuten 10 CD28Ig:n ja CTLA4Ig:n yhdistelmää, voidaan ilmentää useissa erilaisissa edellä kuvatun tyyppisissä järjestelmissä. cDNA voidaan irrottaa sopivilla restriktioentsyymeillä ja ligatoida sopiviin prokaryoottisiin tai eukaryoottisiin ilmentämisvektoreihin tällaista ilmentämistä varten. Koska 15 CD28- ja CTLA4-reseptoriproteiinit esiintyvät luonnossa dimeereinä, arvellaan, että näiden proteiinien ilmentäminen vaatii ilmentämisjärjestelmää, jossa näiden proteiinien on mahdollista muodostua dimeereinä, ennen kuin on mahdollista saavuttaa suotuisa lopputulos. Näiden proteiinien 20 typistetyt muodot (toisin sanoen muodot, jotka ovat muodostuneet lopetuskodonin lisäämisestä proteiinin : transmembraanialuetta edeltävässä sekvenssissä olevaan asemaan) eivät näytä ilmentyvän. CD28:n ja CTLA4: n • reseptorien ilmentäminen fuusioproteiineina mahdollistaa ; ,·, 25 näiden proteiinien dimeerien muodostumisen. CTLA4- • · * !!V proteiinin ilmentäminen fuusiotuotteena on edullista tässä keksinnössä.
'·’ ’ Tämän keksinnön mukainen pysyvä CHO-solulinja, jolle annettiin nimitys kiinanhamsterin munasarjasolulinja ; ,· 30 CTLA4Ig-24, on edullinen CTLA4Ig:n ilmentämiseen ja se on talletettu 31.5.1991 Budapestin sopimuksen mukaisesti ATCC:hen ja sille on annettu ATCC:n hakunumero 10 762.
Tämän keksinnön mukaisesti CTLA4-reseptoria *!' ilmennetään transfektoimalla solulinja, kuten COS-solut, ja 35 ilmentyminen havaitaan sillä perusteella, että CTLA4: llä 20 1 12082 transfektoidut solut sitoutuvat CTLA4-reseptorin ligandiin, esimerkiksi tutkimalla soluista niiden sitoutuminen B7Ig-fuusioproteiiniin.
Tulokseksi saatujen konstruktioiden sekvenssit 5 varmistetaan DNA:n sekvenssoinnilla käyttäen tunnettuja menetelmiä, esimerkiksi julkaisussa Sanger, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463, kuvattua menetelmää, jota on kuvattu tarkemmin vielä julkaisussa Messing, et ai., Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309, tai käyttäen Maxam, 10 et al.':n menetelmää, Methods Enzymol. 65 (1980) 499.
Proteiinituotteiden talteenotto
Kuten edellä mainittiin, CD28- ja CTLA4-reseptorigeenit eivät ilmenny helposti kypsinä proteiineina ilmentämällä suoraan typistettyä proteiinia koodaavaa 15 DNA:ta. Jotta olisi mahdollista muodostaa homodimeeri, yhdistettiin asianmukaisella tavalla proteiineja muok kaarnaan kykenevissä soluissa CD28:n ja CTLA4:n solunulkoisia domeeneja vastaavaa aminohapposekvenssiä koodaava DNA, joka sisältää signaalisekvenssin kodonit, 20 kuten onkostatiini M:n signaalikesvenssin kodonit, luontaisesti dimeerisen proteiinin Fc-domeenia vastaavaa ! aminohapposekvenssiä koodaavaan DNA: hän. Näiden fuusio proteiinituotteiden puhdistuksessa niiden erityttyä soluista ovat avuksi vasta-aineet, jotka reagoivat fuusio • : ,·. 25 proteiinien anti-immunoglobuliiniosan kanssa. Kun "V fuusioproteiinituote on erittynyt mediumiin, se otetaan talteen tavallisten proteiinien puhdistusmenetelmien » ♦ · ·’ * avulla, esimerkiksi käsittelemällä se proteiini A -pylväissä.
'.· 30 Käyttö CTLA4 Ig-f uusioproteiinia ja/tai -f uusioproteiinin fragmentteja voidaan käyttää saattamaan ne reagoimaan B7-y.,' positiivisten solujen, kuten B-solujen, kanssa sellaisten I * "* immuunivasteiden säännöstelemiseksi, jotka tapahtuvat T- 35 solujen ja B7-antigeenipositiivisten solujen vuoro- t”: vaikutusten välityksellä.
21 1 η n - ρ r, S I Z l.: Ö / CTLA4Ig-fuusioproteiinia ja CTLA4Ig/CD28Ig- hybridiproteiineja ja/tai näiden proteiinien fragmentteja ja johdannaisia voidaan myös käyttää saattamaan ne reagoimaan B7-positiivisten solujen kanssa, mukaan lukien 5 B-solut, sellaisten immuunivasteiden säännöstelemiseksi, jotka tapahtuvat T-soluista riippuvaisten B-soluvasteiden välityksellä. Termi "fragmentti" tarkoittaa tässä keksinnössä sellaisen aminohappossekvenssin osaa, joka koodaa "CTLA4:ksi" nimitettyä proteiinia. Käytettäväksi 10 soveltuva CTLA4Ig-fuusioproteiinin fragmentti on polypeptidi, jonka aminohapposekvenssi vastaa tässä keksinnössä kuvatun CTLA4Ig-fuusioproteiinin aikaansaamiseksi käytetyn CTLA4-reseptorin aminohapposekvenssin jotakin osaa.
15 Aktivoitujen B-solujen ja muiden kehityslinjojen solujen pinnalla ilmentyvä B7-antigeeni ja T-solujen pinnalla ilmentyvä CD28-reseptori voivat sitoutua suoraan toisiinsa ja tämä vuorovaikutus voi toimia solujen välisen vuorovaikutuksen välittäjänä. Tällaiset vuorovaikutukset 20 laukaisevat välittömästi CD28:n aktivoitumisreaktiotien T-soluissa, mikä johtaa sytokiinien muodostumiseen, T-solujen ! lisääntymiseen ja B-solujen erilaistumiseen immuno- ;’j*. globuliinia tuottaviksi soluiksi. Tapahtuva B-solujen aktivoituminen voi voimistaa B7-antigeenin ilmentymistä ja : ,·. 25 jatkaa CD28:n stimuloitumista, mikä johtaa krooniseen j.’V tulehdustilaan, jollainen esiintyy autoimmuunisairauksissa, allograftien hylkimisreaktiossa, käänteishyl j innässä tai * · t '·* * kroonisissa allergisissa reaktioissa. Tämä reaktion ehkäiseminen tai inhiboiminen voi olla tehokasta , ',· 30 ehkäisemään T-solujen sytokiinien tuottoa ja siten :,,,ί ehkäisemään tai kääntämään tulehdusreaktioiden kulun päinvastaiseksi.
CTLA4Ig:n on tässä keksinnössä osoitettu olevan in h’ vitro -olosuhteissa sellaisten lymfosyyttien toimintojen 35
Λ Α Γ ' O
2 2 I IZt, Ot voimakas inhibiittori, joissa tarvitaan T- ja B-solujen vuorovaikutusta. Tämä viittaa B7-antigeenin ja sen vastinreseptorien, CTLA4:n ja/tai CD28:n välisten vuorovaikutusten tärkeyteen. Muriini- ja humaani-CTLA4-5 molekyylien sytoplasmiset domeenit ovat samanlaiset (Dariavach, et ai., edellä, 1988), mikä viittaa siihen, että tällä alueella on tärkeitä toiminnallisia ominaisuuksia. CD28:n ja CTLA4:n sytoplasmisilla domeeneilla on myös homologiaa keskenään.
10 CTLA4 on in vitro -olosuhteissa voimakkaampi lymfosyyttivasteiden inhibiittori kuin kumpikaan anti-BBl-tai anti-CD28-mAb-molekyyleistä. CTLA4Ig:llä ei ole sellaisia suoria stimuloivia vaikutuksia T-solujen lisääntymiseen, joiden vaikutukset olisivat vastakkaisia 15 sen inhibitorisille vaikutuksille. Tämän vuoksi CTLA4Ig-fuusioproteiini voi toimia parempana inhibiittorina in vivo -olosuhteissa kuin monoklonaaliset anti-CD28-vasta-aineet. CTLA4Ig:n immunosuppressiiviset vaikutukset in vitro olosuhteissa viittaavat siihen, että sillä on käyttöä 20 sellaisten autoimmuunisairauksien hoidossa, joihin liittyy epänormaali T-solujen aktivaatio tai Ig:n muodostuminen.
• CTLA4Ig-fuusioproteiinilla odotetaan olevan 1 » » * .'h. inhibitorisia ominaisuuksia in vivo -olosuhteissa.
< t t CTLA4Ig:n odotetaan siten vaikuttavan T-soluja inhiboivasti ; 25 samalla tavoin kuin mitä on havaittu anti-CD28-vasta-aineen ollessa kyseessä, samanlaisissa olosuhteissa in vivo ’olosuhteissa. Olosuhteissa, joissa tapahtuu T-solujen ja B-* solujen keskinäisiä vuorovaikutuksia, jotka ovat seurausta siitä, että T-solut ja B-solut ovat joutuneet kosketukseen 30 keskenään, voi potilaalle annettu CTLA4Ig, jota on annettu ί sen saattamiseksi reagoimaan B7-antigeenipositiivisten solujen, esimerkiksi B-solujen, kanssa, sitoutuessaan !!! kohteeseensa häiritä, toisin sanoen inhiboida, T-solujen ja *,*’ B-solujen vuorovaikutuksia, millä saavutetaan se • (>i· 35 lopputulos, että immuunivasteet ovat säännösteltävissä.
23 1 12082 Tämän yksinomaan inhibitorisen vaikutuksen vuoksi CTLA4Ig:n odotetaan olevan in vivo -olosuhteissa T-solujen aktiivisuuden käyttökelpoisempi inhibiittori kuin epäspesifiset inhibiittorit, kuten syklosporiini ja glukosteroidit.
5 CTLA4Ig-fuusioproteiinia tai CTLA4Ig/CD28Ig- hybridiproteiineja voidaan antaa sopivassa farmaseuttisessa kantaja-aineessa in vivo olosuhteissa, toisin sanoen näitä voidaan antaa potilaalle patologisten tautitilojen, kuten immuunijärjestelmän sairauksien tai syövän, hoitamiseksi. 10 Fuusioproteiinin antamisesta in vivo -olosuhteissa odotetaan johtavan T-solujen ja muiden solujen, kuten B-solujen, välisten vuorovaikutusten häiriintymiseen, joka on seurausta ligandin sitoutumisesta B7-positiivisiin soluihin. Normaalien T-solun vuorovaikutusten ehkäiseminen 15 voi johtaa T-solujen aktiivisuuden pienenemiseen, esi merkiksi T-solujen lisääntymisen vähenemiseen. Fuusioproteiinin antamisella haluttujen vaikutusten aikaansaamiseksi potilaassa in vivo -olosuhteissa odotetaan lisäksi kyettävän säännöstelemään sytokiinien pitoisuuksia 20 in vivo -olosuhteissa, mukaan lukien, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, interleukiinit, esimerkiksi interleukiini ("IL")-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, .'j*. kasvutekijät, mukaan lukien tuumorikasvuteki jä ("TGF"), pesäkestimulaatiotekijä ("CSF"), interferonit ("IFN- • · · ; 25 molekyylit") ja tuumorinekroositekijä ("TNF"). Esimerkiksi !!’.* kun fuusioproteiinia annetaan in vivo -olosuhteissa, se voi • · · ehkäistä sellaisten sytokiinien muodostumisen, jotka voivat • « · ·* " edistää kudosten pahanlaatuista kasvua, esimerkiksi tuumorisolujen pahanlaatuista kasvua. Fuusioproteiini voi 30 myös ehkäistä T-solujen aktivaatiosta riippuvaisten ·,,,! virusten, kuten AIDS'ia aiheuttavan viruksen, HTLVltn, lisääntymisen.
1 1 Cs'ipr· 24 II L· v.> /
Kuten edellä mainittiin, vaikuttaa CTLA4Ig-fuusioproteiinin tai sen fragmenttien antaminen joissakin olosuhteissa in vivo -olosuhteissa inhibitorisesti, mikä johtuu siitä, että fuusioproteiini estää CTLA4:ää ja 5 CD28:aa käynnistämästä niitä solun toimintoja, jotka johtuvat T-solujen ja B-solujen joutumisesta kosketukseen keskenään. CTLA4Ig-proteiini voi esimerkiksi ehkäistä T-solujen lisääntymisen. CTLA4Ig-fuusioproteiiniin antaminen in vivo -olosuhteissa saa siten aikaan vaikutuksia sekä T-10 että B-solujen välityksellä tapahtuviin immuunivasteisiin. Fuusioproteiinia voidaan myös antaa potilaalle samalla kun tälle annetaan sytokiinejä tai muita terapeuttisia reagenssej a.
Vielä yhdessä tämän keksinnön mukaisessa sovellu-15 tusmuodossa käytetään T-solujen vuorovaikutusten sään- nöstelemiseksi muita reagensseja, joihin kuuluvat CTLA4Ig-fuusioproteiinin tai CTLA4-reseptorin kanssa reagoimaan kykenevät johdannaiset. Voidaan esimerkiksi seuloa esiin vasta-aineita ja/tai vasta-ainefragmentteja, jotka 20 kykenevät reagoimaan CTLA4-reseptorin kanssa, sellaisten muotojen tunnistamiseksi, jotka kykenevät inhiboimaan > CTLA4Ig-fuusioproteiinin sitoutumista B7-antigeeniin.
• · t ·
Vasta-aineita tai vasta-ainefragmentteja, kuten Fab- tai * · « ;·, F (ab' ) 2-fragmenttej a, voidaan sitten käyttää saattamalla ne ! . 25 reagoimaan T-solujen kanssa, esimerkiksi T-solujen • · · lisääntymisen inhiboimiseksi.
• · * : ;* Monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät V ’ reagoimaan CTLA4-reseptorin kanssa, voidaan valmistaa hybridoomien avulla, jotka on tehty tunnetuilla menetel-30 millä, kuten Kohler'in ja Milstein'in käyttöön tuomilla ’ : menetelmillä [tätä on käsitelty julkaisussa Kohler ja
Milstein, Nature, 256 (1975) 495 - 97], ja näiden modifikaatioilla solujen vuorovaikutusten säännöste- > » * « lemiseksi.
35
; t i : I
s\ /} Γ ( 25 \ i <1 , : Näihin menetelmiin liittyy sellaisen eläimen käyttö, joka on herkistetty (primed) valmistamaan tiettyä nimenomaista vasta-ainetta. Eläin voidaan herkistää ruiskuttamalla siihen immunogeeniä (esimerkiksi B7Ig-5 fuusioproteiinia, CTLA4lg-fuusioproteiinia tai CD28Ig/CTLA4Ig-hybridifuusioproteiinia) halutun immuunivasteen aikaansaamiseksi, toisin sanoen vasta-aineiden tuottamiseksi herkistetystä eläimestä. Herkistetty eläin on myös sellainen, jossa sairaus ilmenee. Tiettyä nimenomaista 10 vasta-ainetta voidaan hakea käyttäen lymfosyyttejä, jotka ovat peräisin herkistettyjen sairaiden eläinten imusolmukkeista, pernoista tai periferaalisesta verestä. Haluttuja immunoglobuliineja koodaavien lymfosyyttien kromosomit tehdään kuolemattomiksi fuusioimalla lymfosyytit 15 myeloomasoluihin tavallisesti fuusioitumisen aikaansaavan aineen, kuten polyetyleeniglykolin (PEG) läsnä ollessa. Fuusiopartnerina voidaan vakiomenetelmiä noudattaen käyttää mitä tahansa useista myeloomasolulinjöistä, esimerkiksi P3-NSl/l-Ag4-l-, P3-x63- Ag8.653-, Sp2/0-Agl4- tai HL1-653- 20 myeloomasolulinjoja. Nämä myeloomalinjat ovat saatavilla talletuslaitoksesta ATCC, Rockville, Maryland, j Tulokseksi saatuja soluja, joihin halutut • i 1 · hybridoomat sisältyvät, kasvatetaan sitten selektio- ;·, väliaineessa, kuten HAT-völiaineessa, jossa . 25 fuusioitumattomat parentaaliset myelooma- tai lymfo- « » « syyttisolut lopulta kuolevat. Ainoastaan hybridoomasolut ;1 jäävät eloon ja niitä voidaan kasvattaa raja- • > 1 ‘ laimennusolosuhteissa erillisten kloonien aikaansaamiseksi.
Näiden hybridoomien supernatanteista seulotaan esiin ne, 30 joiden spesifisyys on halutunlaista, esimerkiksi : immunisointiin käytetyn CTLA4Ig-proteiinin avulla ‘;t tehtävillä immunomääritysmenetelmillä. Positiiviset kloonit voidaan sitten j atkokloonata rajalaimennusolosuhteissa ja ’;· eristää niiden tuottama monoklonaalinen vasta-aine.
:’j 35 t i t t t 2«= 112·: s;
Monoklonaalisten vasta-aineiden eristämiseen ja puhdistamiseen voidaan käyttää useita erilaisia tavanomaisia menetelmiä, joilla ne on tarkoitus puhdistaa muista proteiineista ja kontaminanteista. Monoklonaalisten 5 vasta-aineiden puhdistamiseen tavallisesti käytettyihin menetelmiin kuuluvat ammoniumsulfaattisaostus, ionin-vaihtokromatografia ja affiniteettikromatografia [tätä on käsitelty julkaisussa Zola, et ai., teoksessa Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, Hurell, 10 toim. , s. 51 - 52 (CRC Press, 1982)]. Näiden menetelmien mukaisesti valmistettuja hybridoomia voidaan kasvattaa in vitro- tai in vivo -olosuhteissa (askites-nesteessä) käyttäen tällä alalla tunnettuja menetelmiä [näitä on käsitelty yleisesti julkaisussa Fink, et ai., Prog. Clin. 15 Pathol., 9 (1984) 121 - 33, kuva 6-1 sivulla 123].
Yhtä yksittäistä solulinjaa voidaan tavallisesti kasvattaa in vitro -olosuhteissa esimerkiksi laboratorio-kudosviljelypulloissa ja kudosviljelymedium, joka sisältää suuria konsentraatioita yhtä spesifistä monoklonaalista 20 vasta-ainetta, voidaan ottaa talteen dekantoimalla, suodattamalla tai sentrifugoimalla.
• Voidaan lisäksi valmistaa näiden vasta-aineiden aktiivisen sitovan alueen sisältäviä fragmentteja, kuten • · 1 2 ;·, Fab-, F(ab')2~ ja Fv-f ragmentte j a, jotka sisältävät ! , 25 aktiivisen sitovan alueen, jotka kykenevät reagoimaan "V CTLA4-reseptorin solunulkoisen domeenin kanssa. Näitä » · fragmentteja voidaan valmistaa käyttäen tällä alalla hyväksyttyjä menetelmiä (näitä on käsitelty esimerkiksi julkaisussa Rousseaux, et ai., teoksessa Methods Enzymol. ’t: 30 121 (1986) 663 - 69, Academic Press) .
1 » - » 2 t 27 a λ r>. Q f S I v,. v k,
Monoklonaalisia anti-B7-vasta-aineita, jotka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla, voidaan käyttää site, että ne saatetaan sitoutumaan B7-antigeeniin CD28-positiivisten tai CTLA4-positiivisten T-solujen ja B7-5 positiivisten solujen kesken tapahtuvien vuorovaikutusten inhiboimiseksi. Monoklonaalisia anti-CTLA4-vasta-aineita voidaan käyttää niin, että ne saatetaan sitoutumaan CTLA4-reseptoriin CTLA4-positiivisten T-solujen ja muiden solujen kesken tapahtuvien vuorovaikutusten inhiboimiseksi.
10 Toisessa sovellutusmuodossa voidaan CTLA4Ig-fuusio- proteiinia käyttää muiden sellaisten yhdisteiden tunnistamiseen, joilla CTLA4:n ja B7-antigeenin välistä vuorovaikutusta kyetään säännöstelemään. Näihin yhdisteisiin voi kuulua pieniä luonnossa esiintyviä molekyylejä, joita voi-15 daan käyttää siten, että ne saatetaan reagoimaan B-solujen ja/tai T-solujen kanssa. Fermentaatioliuoksista voidaan esimerkiksi tutkia niiden kykyä inhiboida CTLA4:n ja B7:n välisiä vuorovaikutuksia. Lisäksi edellä kuvatun tyyppisiä CTLA4Ig-fuusioproteiinijohdannaisia voidaan käyttää sään-20 nöstelemään T-solujen lisääntymistä. Fragmentteja tai johdannaisia voidaan esimerkiksi käyttää ehkäisemään T-solujen • lisääntymistä allogeeniseen luuydinsiirtoon liittyvässä • * * * ;'j‘. käänteishylj innässä (GVH) . Toisin kuin CD3/Ti-soluresepto- :·. rikompleksin ohjaama T-solujen lisääntyminen, on CD28:n ; ^ 25 välityksellä tapahtuva T-solujen lisääntymisreaktiotie on I".* syklosporiiniresistentti (June, et ai., 1987, edellä). Syk- • · · *ti; losporiini on melko tehoton GVH-sairauden hoidossa [Storb, * » > * Blood 68 (1986) 119 - 125]. CD28-antigeenia ilmentävien T-lymfosyyttien arvellaan olevan osallisena GVH-sairau- • » '.· 30 dessa [Storb ja Thomas, Immunol. Rev. 88 (1985) 215 - 238].
_ ! CTLA41g-fuusioproteiini voi siten olla käyttökel- ,poinen käytettynä joko yksinään tai yhdessä immunosup- I > a λ Vs i -Γ' r 28 I i Z -C;.· pressiivisten aineiden, kuten syklosporiinin, kanssa, Τ'-solu j en lisääntymisen estämiseksi GVH-sairaudessa.
CTLA4-positiivisten T-solujen ja B7-positiivisten solujen kesken tapahtuvien vuorovaikutusten, joihin lue-5 taan kuuluvaksi vuorovaikutukset B-solujen kanssa, säännöstelyä tämän keksinnön mukaisten menetelmien avulla voidaan siten käyttää hoidettaessa patologisia tautitiloja, kuten autoimmuunitauteja, kudossiirtoja, infektiotauteja ja neoplasiaa.
10 Seuraavat esimerkit on esitetty tämän keksinnön kuvaamiseksi ja olemaan alan ammattimiehen tukena sen soveltamisessa ja käytössä. Esimerkkien tarkoituksena ei ole millään muulla tavoin rajoittaa tämän keksinnön suojapii-riä.
15 Esimerkki 1 B7Ig- ja CD28lg-fuusioproteiin±en valmistus Reseptorin ja immunoglobuliinin C-gamma (Ig:n Cy) fuusioproteiinit B7Ig ja CD28lg valmistettiin julkaisussa Linsley, et ai., J. Exp. Med. 173 (1991) 721 - 730, kuva- 20 tulla tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. Valmistus tapahtui : .·. pääpiirteittäin siten, että reseptoriproteiinia (esimer- * » i "j.j kiksi B7:ää) vastaavia aminohappojaksoja koodaava DNA lii tettiin humaani-Ig:n Cyl:n sarana-, CH2- ja CH3-alueita ; t 25 vastaavia aminohappojaksoja koodaavaan DNA:hän. Suorituk- • · « : seen käytetyt vaiheet olivat seuraavat.
Polymeraasiketjureaktio (PCR) V · PCR:n ollessa kyseessä amplifioitiin DNA-fragmentit tuonnempana kuvattuja kullekin fuusioproteiinille soveltu- : ‘ : 30 via alukepareja käyttäen. PCR-reaktiot (lopullinen tila- vuus 0,1 ml) suoritettiin julkaisussa Kawasaki, teoksessa PCR Protocols, Academic Press, s. 21 - 27 (1990) kuvatulla ;;; tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen • » oikeuttavien säädösten nojalla), Taq-polymeraasipuskurissa : : 35 (Stratagene, La Jolla, CA), joka sisälsi 20 mikromoolia 29 112 u 8 ζ' kutakin dNTP-molekyyliä; 50 - 100 pikomoolia mainittuja alukkeita; templaatin (1 ng plasmidia tai cDNA:ta, joka oli syntetisoitu £ 1 pg:sta kokonais-RNA:ta käyttäen satunnaista heksameeristä aluketta ja Taq-polymeraasia 5 (Stratagene). Reaktiot suoritettiin lämpökäsittelyn jaksotuslaitteessa (thermocycler) (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT) 16 - 30 syklin ajan (tyypillinen sykli koostui vaiheista, jotka olivat 1 min 94 °C:ssa, 1-2 min 50 °C:ssa ja 1 - 3 min 72 °C:ssa).
10 Plasmidien konstruktio
Ilmentämisplasmidit, jotka sisälsivät CD28:aa koo-daavaa cDNA:ta ja jotka on kuvattu julkaisussa Aruffo ja Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 8573, saatiin Dr. Aruffolta ja Dr. Seed'iltä (Mass General Hospital, 15 Boston, MA). Plasmidit, jotka sisälsivät CD5:ttä koodaavaa cDNA:ta ja jotka on kuvattu julkaisussa Aruffo, Cell 61 (1990) 1303, saatiin Dr. Aruffolta. Plasmidit, jotka sisältävät B7:ää koodaavaa cDNAita ja jotka on kuvattu julkaisussa Freeman, et ai., J. Immunol. 143 (1989) 2 714, 20 saatiin Dr. Freeman'ilta (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA). Ensimmäisiin yrityksiin CD28:n ja B7:n liukoisten muotojen ilmentämiseksi tehtiin julkaisussa * » ·
Linsley, et ai., J. Exp. Med., edellä, kuvatulla tavalla ! konstruktiot (OMCD28 ja OMB7), joihin lisättiin transmem- 25 braanisten domeenien suhteen vastasuuntaan sijaitsevat : lopetuskodonit ja joissa natiivit signaalipeptidit kor- * vattiin onkostatiini M:stä saadulla signaalipeptidillä v : [Malik, et ai., Mol. Cell Biol. 9 (1989) 2847]. Nämä val mistettiin käyttäen synteettisiä oligonukleotidejä uudel-* : 30 leenkonstruktiota varten (0MCD28) tai alukkeina (0MB7) PCR:ää varten. OMCD28 on CD28-CDNA, jota on sen tehokkaamman ilmentymisen aikaansaamiseksi modifioitu korvaamalla *;;; signaalipeptidi onkostatiini M:stä peräisin olevalla ana- ’···’ logisella alueella. CD28lg- ja B7Ig-fuusiokonstruktiot 35 valmistettiin kahdessa osassa. 5'-puoleiset osat valmis- 30 Ί12 ϋ 8 Ί tettiin käyttäen templaatteina OMCD28:aa ja OMB7:ää ja eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidiä
CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC
5 (jaksotunniste nro 1) (tämä koodaa aminohappojaksoa, joka vastaa onkostatiini M:n signaalipeptidiä) ja näitä vastaavina käänteisiä alukkeina joko oligonukloetidiä TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA (jaksotunniste nro 10 2) tai oligonukleotidiä TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT (jaksotunniste nro 3). PCR-reaktioiden tuotteet pilkottiin restriktioendo-nukleaaseilla (Hind lii ja Bel I), katka!sukohtien kohdalta, jotka oli valmistettu PCR-alukkeisiin, ja ne puhdis-15 tettiin geelissä.
Fuusiokonstruktioiden humaani-Ig:n Cyl-jaksoja vastaava 3'-puoleinen osa valmistettiin yhdistetyllä kään-teistranskriptaasi (peräisin avian myeloblastosis -viruksesta; Life Sciences Associates, Bayport, NY) -PCR-reak-20 tiolla käyttäen templaattina RNA:ta, jota oli peräisin myeloomasolulinjasta, joka tuotti kimeeristä humaani-mu-: ,·. riini-mAb-L6:tta (tämä saatiin Dr. P. Fell'iltä ja M.
Gaylelta, Bristol-Myers Squibb Company, Pharmaceutical .! Research Institute, Seattle, WA). Eteenpäin suuntautuvana ; 25 alukkeena käytettiin oligonukleotidiä
i AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCC
: .·' CCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG (jaksotunniste nro 4) ja kään- v : teisenä alukkeena oligonukleotidiä CTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC : 30 (jaksotunniste nro 5). Reaktiotuotteet pilkottiin Bclltllä : ja Xbal:llä ja ne puhdistettiin geelissä. Lopulliset konstruktiot koottiin ligatoimalla HindIII:lla ja Bell;11a pilkotut fragmentit, jotka sisälsivät CD28- tai B7-jakso-‘ ··>’ ja, sekä Bcllrllä ja Xbal:llä pilkottu fragmentti, joka 35 sisälsi IgCyl-jaksot, HindIII:lla ja Xbal:llä pilkottuun 31 112082 CDM8:aan. Ligaatiotuotteet transformoitiin MC1061/p3-E. coli -soluihin ja pesäkkeistä seulottiin esiin asianmukaisia plasmideja sisältävät pesäkkeet. Tulokseksi saatujen konstruktioiden jaksot varmistettiin sekvenssoimalla 5 niiden DNA.
B7:ää koodaava konstruktio sisälsi sellaisia aminohappoja koodaavaa DNA:ta, jotka vastaavat B7:n solunulkoi-sen domeenin aseman 1 kohdalta aseman 215 kohdalle ulottuvia aminohapporyhmiä. CD28:aa koodaava konstruktio sisälsi 10 sellaisia aminohappoja koodaavaa DNA:ta, jotka vastaavat CD28:n solunulkoisen domeenin aseman 1 kohdalta aseman 134 kohdalle ulottuvia aminohapporyhmiä.
CD5Ig konstruoitiin samalla tavalla käyttäen eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidia 15 CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG (jakso-tunniste nro 6), ja käänteisenä alukkeena oligonukleotidia ATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC(jaksotunniste nro 7). PCR-tuote pilkottiin restriktioendonukleaaseilla ja ligatoitiin Ig:n Cyl:n fragmenttiin edellä kuvatulla ta-20 valla. Tulokseksi saatu konstruktio (CD5Ig) koodasi kypsää proteiinia, jonka aminohappojakso oli sellainen, että se : ,·. sisälsi CD5:ttä vastaavan jakson aminohapporyhmät asemasta 1 asemaan 347, kaksi aminohappoa, jotka olivat syntyneet .! konstruktion suoritukseen käytetyistä vaiheista (amino- ; 25 hapot DQ), joiden jälkeen tulee Ig:n Cyl:n sarana-aluetta vastaavia aminohappoja koodaava DNA.
Soluviljely ja transfektiot V : COS-solut (apinan munuaissolut) transfektoitiin CD28:aa ja B7:ää ilmentävillä ilmentämisplasmideilla käyt-30 täen Seed'in ja Aruffo’n [Proc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) :3365] menetelmän muunnosta, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. So-·;;; luja lisättiin 18 - 24 h ennen transfektiota niiden kas-
vattamiseksi käyttäen solumääränä 106 solua halkaisijaltaan :35 10 cm:n suuruista solunviljelymaljaa kohti. Plasmidi-DNA
32 112...: 8',.
lisättiin (noin 15 pg/malja) 5 ml:n tilavuudessa seerumi-tonta DMEM:ää, joka sisälsi 0,1 mM klorokiiniä ja 600 pg/ ml DEAE-Dextrania, ja soluja inkuboitiin 3 - 3,5 h 37 eC:ssa. Transfektoidut solut käsiteltiin sitten lyhyen 5 aikaa (noin 2 minuuttia) 10-prosenttisella dimetyylisulf-oksidilla PBS:ssä ja niitä inkuboitiin 37 °C:ssa 16 - 24 h DMEM:ssä, jotka sisälsi 10 % FCS:ää. 24 h transfektion jälkeen viljelymedium poistettiin ja korvattiin seerumit-tomalla DMEM:llä (6 ml/malja). Inkubointia jatkettiin 10 3 päivää 37 °C:ssa, jona ajankohtana kasvatukseen käytetty medium koottiin talteen ja maljoihin lisättiin tuoretta seerumitonta mediumia. 3 päivän jatkoikuboinnin jälkeen 37 °C:ssa solujen kasvatukseen käytetty medium koottiin uudelleen talteen ja solut heitettiin pois.
15 CD28:aa, CD5:ttä tai B7:ää ilmentävät CHO-solut eristettiin julkaisussa Linsley, et ai., (1991), edellä, kuvatulla tavalla seuraavasti: suoritus tapahtui pääpiirteittäin siten, että CD28:aa, CD5:ttä tai B7:ää ilmentävät transfektantit eristettiin sellaisen yhteistransfektion 20 jälkeen, jossa dihydrofolaattireduktaasin suhteen vaillinaiset kiinanhamsterin munasarja (dhfr- CH0) -solut oli : transfektoitu asiaankuuluvan ilmentämisplasmidin ja selek- • » · tiomarkkerin, pSV2dhfr:n, yhdistelmällä [Linsley, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) 5031], joka julkaisu ; 25 on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten · nojalla. Transfektantit kasvatettiin sitten nousevien me- • * · • ·’ totreksaattikonsentraatioiden läsnä ollessa siten, että v · lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 1 μΜ, ja niitä kasvatet tiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10-prosenttisella fet-30 aalisella naudanseerumilla (FBS), 0,2-millimolaarisella proliinilla ja 1-mikromolaarisella metotreksaatilla. CHO-solulinjat, jotka ilmensivät suuria CD28- (CD28+ CH0) tai B7- (B7+ CHO) pitoisuuksia, eristettiin käyttäen useita kierroksia fluoresenssilla aktivoituvaa solulajittelua 35 (FACSr), jonka jälkeen käytettiin 9.3- tai BB-l-mAb-mole- 33 112082 kyyleillä tehtyä epäsuoraa immunovärjäystä. CD28:lla transfektoiduista populaatioista eristettiin FACSR:llä myös amplifioituja CHO-soluja, jotka olivat negatiivisia solujen pinnalla ilmentyvien CD28:n tai B7:n (dhfr+ CHO) suh-5 teen.
Immunovärjäys ja FACSK-analyysi
Transfektoidut CHO- tai COS-solut tai aktivoidut T- solut analysoitiin epäsuoralla immunovärjäyksellä. CHO- solut poistettiin viljelypulloistaan ennen värjäystä inku- 10 boimalla niitä PBSrssä, joka sisälsi 10 mM EDTA:a. Soluja inkuboitiin ensin muriini-mAb-molekyylien 9.3 [Hansen, et ai., Immunogenetics 10 (1980) 247) tai BB-1 (Yokochi, et ai., J. Immunol. 128 (1981) 823] kanssa tai Ig-fuusio- proteiinien kanssa (näiden kaikkien konsentraatio oli 15 10 pg/ml DMEM:ssä, joka sisälsi 10-prosenttista FCS:ää) 1 - 2 h 4 °C:ssa. Tämän jälkeen solut pestiin ja niitä inkuboitiin vielä 0,5 - 2 h 4 °C:ssa FITC:llä konjugoidun toisen vaiheen reagenssin kanssa [vuohessa tehty anti-mu- riini-Ig-seerumi muriini-mAb-molekyylien kyseessä ollessa 20 tai vuohessa tehty anti-humaani-Ig Cy -seerumi fuusio- proteiinien kyseessä ollessa (Tago, Inc., Burlingame, : CA)]. Fluoresenssi analysoitiin FACS IVR -solulajittelijal- * * ♦ *!/ la (Becton Dickinson and Co., Mountain View, CA), joka oli .! varustettu neljän dekadin logaritmisella vahvistimella.
25 Ig-fuusioproteiinien puhdistus • * ♦ : Ensimmäistä, toista ja kolmatta koottua erää solu- • > · • .* jen kasvatukseen käytetystä seerumittomasta kasvatusmedi- .·’ · umista, joka oli peräisin transfektoiduista COS-soluista, käytettiin lähtömateriaalina Ig-fuusioproteiinien puhdis-: 30 tamiseen. Pienellä nopeudella sentrifugoimalla suoritetun solujätteiden poiston jälkeen medium johdettiin immobili-soitua proteiini A:ta sisältävään pylvääseen (Repligen Corp., Cambridge, MA) (noin 200 - 400 ml mediumia kutakin pakatun geelitilavuuden millilitraa kohti), joka oli tasa-; 35 painotettu 0,05 M natriumsitraatilla, jonka pH oli 8,0.
34 1 12081
Mediumin pylvääseen lisäämisen jälkeen pylväs pestiin 1 M kalieumfosfaatilla, jonka pH oli 8, ja sitoutunut proteiini eluoitiin 0,05 M natriumsitraatilla, jonka pH oli 3. Pylväästä koottiin fraktioita, jotka neutraloitiin välit-5 tömästi lisäämällä 1/10 niiden tilavuudesta 2 M Tris'iä, jonka pH oli 8. A280:ssa absorboivan materiaalin huipun sisältävät fraktiot yhdistettiin ja dialysoitiin PBS:ää vastaan ennen käyttöä. CD28lg:n ja B7Ig:n molaariset absorp-tiokertoimet olivat 2,4 ja 2,8 ml/mg, vastaavassa järjes-10 tyksessä mainittuna, määritettynä absorbanssiltaan tunnet tujen liuosten aminohappoanalyysin perusteella. Puhdistetun CD28lg:n ja B7lg:n sitoutumisaktiivisuuksien saannot olivat lähes kvantitatiiviset arvioituna B7+- ja CD28+-CHO-solujen epäsuoran fluoresenssivärjäyksen jälkeen tehdyn 15 FACSR-analyysin perusteella.
Esimerkki 2 CTLA4Ig-fuusioproteiinin valmistus CTLA4lg:tä koodaava liukoinen geneettinen fuusio CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja IgCyl-domeenin välillä 20 konstruoitiin samoin kuin edellä kuvattu CD28lg:n konstruktio. CTLA4-geenin solunulkoinen domeeni kloonattiin . . PCR:llä käyttäen synteettisiä oligonukleotideja, jotka • ♦ · vastasivat julkaistua jaksoa [Dariavach, et ai., Eur. Jour. Immunol. 18 (1988) 1 901 - 1 905].
; 25 Koska CTLA4-geenistä ei tunnistettu CTLA4:n : signaalipeptidiä, liitettiin CTLA4:n ennustetun jakson : N-terminaalinen pää onkostatiini M:n signaalipeptidiin ·',»'· [Malik, et ai., Mol. and Cell. Biol. 9 (1989) 2847] kah dessa vaiheessa käyttäen limittäisiä oligonukleotideja. 30 Ensimmäisen vaiheen ollessa kyseessä käytettiin eteenpäin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidia CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAACCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTG-;;; GCCCAGCC (jaksotunniste nro 8) (joka koodasi CTLA4:n 7 N- ' terminaaliseen aminohappoon liitettyjä onkostatiini M:stä λ a r· . o <" 35 I I Z U Ö i.
peräsin olevan signaalipeptidin 15 C-terminaalista aminohappoa), ja käänteisenä alukkeena oligonukleotidia TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (jaksotunniste nro 9) (joka koodasi aminohapporyhmiä 119 - 125 CTLA4-reseptoria 5 koodaavasta aminohappojaksosta ja joka sisältää Bel I -restriktioentsyymikohdan). Tämän vaiheen templaatti oli cDNA, joka oli syntetisoitu 1 pgista H38 soluista peräisin olevaa kokonais-RNA:ta (HTLV-II:11a infektoitu T-soluleu-kemiasolulinja, joka oli saatu Dr. Salahudin'ilta ja Dr. 10 Gallo'lta, NCX, Bethesda, MD). Osa ensimmäisestä vaiheesta peräisin olevasta PCR-tuotteesta amplifioitiin uudelleen käyttäen limittäistä eteenpäin suuntautuvaa aluketta, joka koodaa onkostatiini M:n signaalipeptidin N-terminaalista osaa ja joka sisältää Hind III -restriktioendonukleaasi-15 kohdan, CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGT CTGGTCCTTGCACTC (jaksotunniste nro 10) ja samaa käänteistä aluketta. PCR-reaktiotuote pilkottiin Hind 111:11a ja Bcl Iillä ja ligatoitiin yhdessä Bcl Iillä ja Xba Iillä pilko-20 tun ja Igin Cylin sarana-, CH2- ja CH3-alueita vastaavia aminohappojaksoja koodaavan cDNA-fragmentin kanssa Hind : ,·, Ulilla ja Xba Iillä pilkottuun CDM8-ilmentämisvektoriin tai Hind Ulilla ja Xba Iillä pilkottuun nLN-ilmentämis-vektoriin (tämä oli saatu Dr. Aruffo'lta).
; 25 Tulokseksi saadun CTLA4lg-fuusiokonstruktion kartta ’·· · on esitetty kuviossa 1. Tässä kuviossa olevat jaksot esit- : .· tävät CTLA4:n (isot kirjaimet, varjostamattomat alueet) ja ·* onkostatiini Min signaalipeptidin, SP, (tummat varjostetut alueet) sekä Igin Cylin sarana-alueen (H) (pilkutetut alu-30 eet) toisiinsa liitettyjä jaksoja. Suluissa oleva amino-happo muodostu konstruktiota tehtäessä. Asteriskit (*) osoittavat mutaatioita kysteiinistä seriiniksi, jotka muo-;;; dostettiin Igin Cyin sarana-alueeseen. Kuvioon on merkitty CTLA4:ssä oleva immunoglobuliiniyläryhmän Vitä muistuttava 35 domeeni, sekä Igin Cylin CH2- ja CH3-domeenit.
= » 7 | Α A O 1 o e 36 I izub/ CTLA4lg:n sisältävät CDM8-ilmentämisplasmidit transfektoitiin sitten COS-soluihin DEAE/dekstraani-transfektiolla, joka oli suoritettu Seed'in ja Aruffo'n, 1987, edellä, kuvaaman suoritusohjeen modifikaatiota 5 (Linsley, et ai., 1991, edellä) käyttäen.
Ilmentämisplasmidikonstruktiot (tiLN tai CDMS), jotka sisälsivät CTLA4lg:n aminohappojaksoa koodaavan cDNA:n, transfektoitiin lipofektiolla vakiomenetelmiä käyttäen dhfr“ CHO-solulinjoihin sellaisten uusien solulinjojen 10 aikaansaamiseksi, jotka ilmensivät pysyvästi CTLA4lg:tä.
CTLA4lg:tä vastaavaa aminohappojaksoa koodaava DNA on talletettiin 31.5.1991 Budapestin sopimuksen mukaisesti ATCCrhen ja sille annettiin ATCC:n hakunumero 68 629.
Edullinen CTLA4Ig:tä ilmentävä pysyvä transfektant-15 ti, jolle annettiin nimitys kiinanhamsterin munasarjasolu-linja CTLA4lg-24, tehtiin seulomalla immunovärjäyksen avulla B7-positiivisista CHO-solulinjoista mediumissa olevaa B7:ää sitovaa aktiivisuutta. Transfektantteja kasvatettiin DMEM:ssä, jota oli täydennetty 10-prosenttisella 20 fetaalisella naudanseerumilla (FBS), 0,2-millimolaarisella proliinilla ja 1-mikromolaarisella metotreksaatilla.
: t-, CHO-solulinja CTLA4lg-24 talletettiin 31.5.1991 '!!.* Budapestin sopimuksen mukaisesti ATCC:hen ja sille on an- nettiin ATCCrn hakunumero 10 762.
t · j ’’ 25 CTLA4Ig puhdistettiin proteiini A -kromatografiällä * * » ' seerumittomista solujen kasvatukseen käytetyistä superna- : .* tanteista (kuvio 2). CTLA4lg:n konsentraatiot määritettiin v ·’ olettaen molaarisen aabsorptiokertoimen 280 nm:n kohdalla olevan 1,6 (määritetty kokeellisesti absorbanssiltaan tun-30 netun liuoksen aminohappoanalyysillä). Moolimassastandar-deille (kanavat 1 ja 3, kuvio 2) ja CTLA4lg-näytteille (1 pg) (kanavat 2 ja 4) tehtiin SDS-PAGE (4 - 12 % akryy-liamidigradientti) pelkistämättömissä olosuhteissa (-βΜΕ, ’ kanavat 1 ja 2) tai pelkistävissä olosuhteissa (+ βΜΕ, ka- 37 1 12UÖ/ navat 3 ja 4). Proteiinit visualisoitiin värjäämällä ne Coomassie Brilliant Blue -väriaaineella.
CTLA4lg liikkui pelkistämättömissä olosuhteissa molekyyli tyyppinä, jonka Mr oli noin 100 000 ja pelkistä-5 vissä olosuhteissa molekyylityyppinä, jonka Mr oli noin 50 000 (kuvio 2). Koska Ig:n Cy:n saranan disulfidit poistettiin konstruktioiden aikana, on CTLA4lg CD28lg:n tavoin dimeeri, joka otaksuttavasti on liittynyt yhteen natiivin disulfidisidoksen välityksellä.
10 Esimerkki 3 CTLA4-reseptori Täysimittaista humaani-CTLA4-geeniä vastaavaa aminohappo j aksoa koodaavan DNA:n uudelleenkonstruoimiseksi kloonattiin PCR:n avulla cDNA, joka koodaa CTLA4:n trans-15 membraanisen ja sytoplasmisen domeenin fragmenttia vastaavia aminohappoja, joka sitten yhdistettiin cDNAjhan, joka koodasi aminohappoja, jotka vastasivat CTLA4lg:stä peräisin olevaa fragmenttia, joka vastasi CTLA4:n N-terminaali-seen päähän liitetyn onkostatiini M:n signaalipeptidiä. 20 Menetelmät PCR:n, solujen viljelyn ja transfektioiden suorittamiseksi olivat samoja kuin mitä oli kuvattu edellä . olevassa esimerkissä 1 ja niissä käytettiin COS-soluja ja * * · DEAE-dekstraanitransf ektiota.
Koska CTLA4-reseptoriproteiinin ilmentämistä lym- : 25 foidisissa humaanisoluissa ei ole aiemmin raportoitu, oli • * : tarpeellista paikallistaa lähtömateriaali, josta CTLA4- «* » ; mRNA:ta saataisiin. PCR-kloonaukseen käytettiin edellä ! 1 » ·\· - mainittua H38-solujen kokonais-RNA:sta käänteistranskrip- toitua PCR-cDNA:ta. Tähän tarkoitukseen käytettiin eteen-30 päin suuntautuvana alukkeena oligonukleotidia
. GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG
(jaksotunniste nro 11) (tämä koodaa ennustetussa koodaa-vassa jaksossa olevaa 11 ensimmäistä aminohappoa) ja käänteisenä alukkeena oligonukleotidia Α A n . o c.
38 1 TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG (j akso- tunniste nro 12) (tämä on homologinen CTLA4:ssä olevien viimeisten 8 aminohapon suhteen ja se sisältää Xba I -kohdan). Templaattina oli edelleen cDNA, joka oli syntetisoi-5 tu 1 pg:sta H38-soluista peräisin olevaa RNA:ta. PCR-reak-tion tuotteet pilkottiin restriktioendonukleaaseilla Neo I ja Xba I ja tulokseksi saatu 316 ep:n suuruinen tuote puhdistettiin geelissä. Edellä kuvatusta CTLAIg-fuusiosta peräisin oleva 340 ep:n suuruinen Hind III/Nco I -frag-10 mentti puhdistettiin myös geelissä ja molemmat restriktio-fragmentit ligatoitiin Hind 111:11a ja Xba I:llä pilkottuun CDM8:aan OMCTLAm muodostamiseksi.
Tulokseksi saatu konstruktio vastasi täysimittaista CTLA4:ää (jaksotunnisteet nro 13 ja 14) ja onkostatiini 15 M:n signaalipeptidiä. Konstruktio on esitetty kuviossa 3 ja sille annettiin nimitys 0MCTLA4. Kuviossa 3 esitetty CTLA4:n jakso eroaa ennustetusta humaani-CTLA4-DNA-jaksosta (Dariavach, et ai., edellä) sellaisella emäsmuutoksel-la, ettäesitetyn aminohappojakson aminohappoasemassa 111 20 aiemmin raportoitu alaniini koodaa treoniinia. Tämä treo-niini on osa äskettäin tunnistettua N-välitteisen glyko-. . sylaation kohtaa, jolla saattaa olla tärkeä merkitys sil- le, että fuusioproteiinin ilmentämisessä päästään suotui-* saan lopputulokseen.
: ’* 25 Ligaatiotuotteet transformoitiin E. coli MC1061/ : p3-soluihin ja pesäkkeistä seulottiin esiin asianmukaisia : plasmideja sisältävät pesäkkeet. Tulokseksi saatujen kons- ·' truktioiden jaksot varmistettiin DNA-jakson analyysillä.
Esimerkki 4 30 CTLA4lg:n luonnehtiminen • . CTLA4lg-konstruktioiden luonnehtimiseksi valmistet tiin edellä kuvatulla tavalla useita isolaatioita, isolaa-tiot CD28Ig, B7Ig ja CD5Ig, ja ne transfektoitiin COS-so-luihin esimerkeissä 2 ja 3 kuvatulla tavalla ja niiden 35 kyky sitoa B7Ig:tä tutkittiin FACSR-analyysillä. Edellä Ία Γ' nr.
IΖ. υ ϋ mainittujen konstruktioiden lisäksi käytettiin myös CDM8-plasmideja, jotka sisälsivät CD7:ää koodaavia cDNA-mole-kyylejä ja jotka on kuvattu julkaisussa Aruffo ja Seed, [EMBO Jour. 6 (1987) 3 313 - 3 316], joka julkaisu on lii-5 tetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla.
mAb-molekyylit
Monoklonaaliset muriinivasta-aineet (mAb-molekyy-lit) 9.3 (anti-CD28) ja G19-4 (anti-CD3), G3-7 (anti-CD7), 10 BB-1 (anti-B7-antigeeni) ja rotan mAb 187.1 (hiiren «-ketjua vastaan suunnattu mAb) on kuvattu aiemmin [Ledbetter, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 84 (1987) 1384 - 1388; Ledbetter, et ai., Blood 75 (1990) 1531; Yokochi, et ai., edellä] ja ne puhdistettiin askites-nesteestä ennen käyt-15 töä. 0KT8-mAb:tä tuottava hybridooma hankittiin ATCCrstä, Rockville, MD, ja mAb puhdistettiin samoin askites-nesteestä ennen käyttöä. mAb 4G9 (anti-CD19) saatiin Dr. E. Engleman'ilta, Stanford University, Palo Alto, CA). Puhdistettu kimeerinen humaani-muriini-mAb LG (tällä on hu-20 maani-Cyl:n Fc-osa) oli saatu lahjaksi Dr. P. Fell'iltä ja M. Gayle'lta (Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research . Institute, Seattle, WA).
V immunovärjäys ja FACSR-analyysi
Ennen värjäystä COS- tai CHO-solut poistettiin ; 25 kasvatuspulloistaan inkuboimalla niitä PBS:ssä, joka si- ' sälsi 10 mM EDTAraa. Soluja inkuboitiin ensin 1 - 2 h : 4 °C:ssa mAb-molekyylien tai Ig-fuusioproteiinien kanssa, V ·’ joiden konsentraatio oli 10 pg/ml, DMEMtssä, joka sisälsi 10-prosenttista FBS;ää. Tämän jälkeen solut pestiin ja 30 niitä inkuboitiin vielä 0,5 - 2 h 4 °C:ssa FITCrllä konju-; goidun vuohessa tehdyn anti-hiiri-immunoglobuliinin tai FITC:llä konjugoidun vuohessa tehdyn anti-humaani Ig-Cy- • > » seerumin kanssa (molemmat yhtiöstä Tago, Burlingame, CA). '·;· Kun samassa kokeessa määritettiin sekä mAb-molekyylien Γ : 35 että Ig-fuusioproteiinien sitoutuminen, sekoitettiin toi-
* * I * I
40 112082 sen vaiheen FITC:llä konjugoidut anti-hiiri- ja anti-hu-maanireagenssit keskenään ennen käyttöä. Yhteensä 10 000 solun fluoresenssi tutkittiin sitten FACSR:llä.
Periferaalisen veren lymfosyyttien erottaminen ja 5 stimulointi
Periferaalisen veren lymfosyytit (PBL-solut) eris tettiin sentrifugoimalla käyttäen Lymphocyte Separation Medium'ia (Litton Bionetics, Kensington, MD). Alloreagoi-vat T-solut eristettiin PBL-solujen stimuloinnilla primaa-10 risessa lymfosyyttityyppien yhteisreaktiossa (MLR). PBL- soluja viljeltiin käyttäen säteilytettyjä (5 000 radia) T51 LCL-soluja, joiden solutiheys oli 106/ml. EBV:llä transformoituja lymfoblastoidisolulinjoja (LCL) PM (Bristol-Myers Squibb Co. ) ja T51 (Bristol-Myers Squibb Co. ) 15 kasvatettiin RPMIrssä, jota oli täydennetty 10-prosentti- sella FBS:llä. Alloreagoivat "blasti"solut pakastettiin kuuden päivän kuluttua niiden säilyttämiseksi. Sekundaariset MLR:t suoritettiin viljelemällä sulatettuja allorea-goivia blasteja ja tuoreita säteilytettyjä T51 LCL-soluja 20 mAb-molekyylien ja Ig-fuusioproteiinien läsnä ollessa ja ilman näiden lisäystä. Soluja viljeltiin 96-kuoppaisissa ; .f tasapohjaisissa levyissä (4 X 104 alloreagoivaa blastia ja 1 X 104 säteilytettyä T51 LCL solua kuoppaa kohti 0,2 ml:n tilavuudessa) RPMl:ssä, joka sisälsi 10-prosenttista j ” 25 FBS:ää. Solujen lisääntyminen neljästä rinnakkaisesta vil- : jelmästä määritettiin [3H]-tymidiinin kerääntymisestä so- luihin 6 viimeisen tunnin aikana 2-3 päivän ikäisessä v *’ viljelmässä.
PHA:lla aktivoidut T-solut valmistettiin viljele-•; 30 mällä PBL-soluja, joihin oli lisätty 1 pg/ml PHArta (Well- come, Charlotte, NC), viiden päivän ajan ja viljelemällä niitä yhden päivän aajan mediumissa, josta PHA oli jätetty pois. Elinkykyiset solut koottiin talteen sedimentoimalla ne Lymphocyte Separation Mediumin läpi ennen käyttöä. So-35 luja stimuloitiin mAb-molekyyleillä tai transfektoiduilla 112082 41 CHO-soluilla 4 - 6 h 37 °C:ssa, ne koottiin talteen sent-rifugoimalla ja niistä valmistettiin RNA.
CD4+-T-solut eristettiin PBL-soluista erotelemalla terveiltä verenluovuttajilta saadut PBL-solut T- ja ei-T 5 soluihin käyttäen lampaan erytrosyyttien rosetinmuodostus-menetelmää ja erottelemalla T-solut edelleen maljakäsitte-lyllä CD4+-soluihin julkaisussa Damle, et ai., J. Immunol. 139 (1987) 1501 kuvatulla tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten no-10 jalla.
B-soluja puhdistettiin myös periferaalisesta verestä maljakäsittelyllä, joka on kuvattu julkaisussa Wysocki ja Sato, Proc. Natl. Acad. Sei. 75 (1978) 2 844, joka julkaisu on liitetty tähän keksintöön siihen oikeuttavien 15 säädösten nojalla, käyttäen anti-CD19-mAb-4G9:ää. Th:n aikaansaaman lg:n muodostumisen määrittämiseksi sekoitettiin keskenään 106 CD4+ T-solua ja 106 CD19+ B-solua 1 ml:ssa RPMI:tä, joka sisälsi 10-prosenttista FBS:ää. Kuuden päivän mittaisen viljelyn jälkeen 37 °C:ssa määri-20 tettiin humaani-IgM:n muodostuminen viljelmäsupernatan-teissa käyttäen kiinteän faasin ELISA:aa julkaisussa Volk-. . man, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 2 528 kuvatulla tavalla, joka julkaisu on liitetty tähän keksin-.* ’ töön siihen oikeuttavien säädösten nojalla. Suoritus ta- : 25 pahtui pääpiirteittäin siten, että 96-kuoppaiset tasa- : pohjaiset mikrotiitteri-ELISA-levyt (Corning, Corning, NY) : *.· päällystettiin käyttäen kuoppa kohti 200 μΐ natriumkarbo- naattipuskuria (pH 9,6), joka sisälsi 10 pg/ml vuohessa tehtyä affinitettipuhdistettua anti-humaani IgG- tai IgM-30 vasta-ainetta (Tago, Burlingame, CA), inkuboitiin yön yli ·. 4 °C:ssa, ja pestiin sitten PBS:llä ja kuopat tehtiin vie lä reagoimattomiksi 2-prosenttisella BSAilla PBS:ssä (BSA-PBS). Määritettävät näytteet lisättiin näihin kuoppiin '···' sopivana laimennoksena ja niitä inkuboitiin käyttäen kuop- 35 paa kohti 200 μΐ vuohessa tehdyn affiniteettipuhdistetun 112082 42 anti-humaani IgG- tai IgM-vasta-aineen (Tago) pipar-juuriperoksidaasilla (HRP) konjugoidun F(ab')2-fraktion suhteessa 1:1 000 tehtyä laimennosta. Tämän jälkeen levyt pestiin ja niihin lisättiin kuoppaa kohti 100 μΐ o-fenyy-5 leenidiamiinin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) -liuosta (liuos sisälsi tätä 0,6 mg/ml sitraatti-fosfaattipusku-rissa, jonka pH oli 5,5 ja jossa oli 0,045 % vetyperoksidia). Värin kehittyminen pysäytettiin 2 N rikkihapolla. Absorbanssi 490 nm:n kohdalta määritettiin automaattisella 10 ELISA-levyjen lukulaitteella. Tutkittavat ja kontrolli-näytteet tutkittiin kolmena rinnakkaisena näytteenä ja absorbanssiarvoja verrattiin sellaisiin absorbanssiarvoi-hin, jotka oli saatu tunnettuja IgG- tai IgM-standardeja käyttäen ja jotka oli tutkittu samanaikaisesti superna-15 tanttinäytteiden kanssa sellaisen standardikäyrän valmistamiseksi, jota käyttäen viljelmäsupernatanteissa olevat Ig-konsentraatiot kvantitoitiin. Koetulokset on ilmoitettu yksiköissä ng/ml Ig:tä ± SEM joko kolmesta tai neljästä rinnakkaisesta viljelmästä määritettynä.
20 Immunosaostusanalyysi ja SDS PAGE
Solut varustettiin pinnastaan 125I-leimalla ja niille , . suoritettiin immunosaostusanalyysi. Suoritus tapahtui pää- piirteittäin siten, että PHA:lla aktivoitujen T-solujen ’ pinta varustettiin 125I-leimalla käyttäen laktoperoksidaasia : " 25 ja H202:ta julkaisussa Vitetta, et ai., J. Exp. Med. 134 : (1971) 242, kuvatulla tavalla, joka julkaisu on liitetty : *,· tähän keksintöön siihen oikeuttavien säädösten nojalla.
• ·’ SDS-PAGE-kromatografia suoritettiin lineaarisissa akryyli- amidigradienttigeeleissä, joissa pinoutumisgeelinä oli 5-30 prosenttinen akryyliamidi. Geelit värjättiin Coomassie "*. Blue -väriaineella, niistä poistettiin ylimääräinen väri ja ne valokuvattiin tai kuivattiin ja valotettiin röntgen-filmillä (Kodak XAR-5).
43 112 0 8 2 S i toutumi smääri tykset B7lg varustettiin 125I-leimalla ominaisaktiivisuu-teen, joka oli suuruudeltaan noin 2 X 106 cpm pikomoolia kohti. 96-kuoppaiset muovilevyt päällystettiin 16 - 24 h 5 ajan liuoksella, joka sisälsi CTLA4lg:tä (0,5 pg 0,05 ml:n tilavuudessa 10-millimolaarista Tris'iä, jonka pH oli 8). Kuopat tehtiin reagoimattomiksi sitoutumispuskurilla (DMEM, joka sisälsi 50-millimolaarista BES:ää (Sigma Chemical Co.), jonka pH oli 6,8, 0,1-prosenttista BAS:ää 10 ja 10-prosenttista FCS:ää), jonka jälkeen niihin lisättiin kilpailevan yhdisteen läsnä ollessa tai tämän puuttuessa liuos (0,09 ml), joka sisälsi 125I-B7lg:tä (noin 5 x 105 cpm). 2 - 3 h pituisen inkuboinnin jälkeen 23 °C:ssa kuopat pestiin kerran sitoutumispuskurilla ja neljä kertaa 15 PBS:llä. Tämään jälkeen sitoutunut radioaktiivisuus solu-bilisoitiin lisäämällä kuoppiin 0,5-normaalista NaOH:ta ja se kvantitoitiin gammalaskennalla.
Sitoutuminen B71g:hen
Kuviossa 4 esitetty koe osoittaa, että täydellistä 20 humaani-CTLA4-DNA-geeniä koodaava OMCTLA4-konstruktio on toiminnallisesti aktiivinen. COS-solut transfektoitiin ilmentämisplasmideilla CD7, OMCD28 ja OMCTLA4 edellä kuva-tulla tavalla. 48 tuntia transfektion jälkeen solut koot-tiin talteen ja niitä inkuboitiin pelkällä mediumilla (ei ; *’ 25 lisäyksiä) tai käyttäen 9.3-, B7Ig-, CD5Ig- tai G3-7-mAb- '* · molekyylejä. Tämän jälkeen solut pestiin ja sitoutuminen : ’.· havaittiin seoksella, joka sisälsi toisen vaiheen reagens- : sit, jotka olivat vuohessa tehty FITC:llä konjugoitu anti-muriini Ig ja vuohessa tehty FITC:llä konjugoitu 30 anti-humaani Ig. Transfektoiduista soluista tutkittiin asianmukaisten solun pinnan markkerien ilmentyminen epäsuoralla immunovärjäyksellä ja fluoresenssi määritettiin käyttäen FACSR-analyysiä edellä kuvatulla tavalla.
Kuten kuviossa 4 on esitetty, sitoutui mAb 9.3 35 CD28:lla transfektoituihin COS-soluihin mutta ei CTLA4:llä 112082 44 transfektoituihin soluihin. B7Ig-fuusioproteiini sitoutui sekä CD28:lla että CTLA4:llä transfektoituihin soluihin (mutta näin ei käynyt kontrollina ollutta CD5Ig-fuusiopro-teiinia käytettäessä). CD7:llä transfektoidut COS-solut 5 eivät sitoneet mAb 9.3 eivätkä kumpaakaan fuusioproteii-neista. Tämä viittaa siihen, että CD28 ja CTLA4 sitoutuvat kumpikin B-solujen aktivaatioantigeeniin, B7:ään. Lisäksi mAb 9.3 ei havaittavissa määrin sitonut CTLA4:ää.
CTLA4lg:n sitoutuminen B7-positiivisiin CHO-solui- 10 hin CTLA4lg ja B7:n sitoutumisen tarkempaa luonnehtimista varten määritettiin puhdistetun CTLA4lg:n sitoutu-misaktiivisuus B7+-CHO-soluilla ja lymfoblastoidisolulin-jalla (PM LCL) kuviossa 5 esitetyssä kokeessa. Amplifioi-15 tuja transfektoituja CHO-solulinjoja ja PM LCL -soluja inkuboitiin käyttäen pelkkää mediumia (ei lisäyksiä) tai vastaavaa konsentraatiota humaani-Ig:n Cyl:tä sisältäviä CD5Ig-, CD28Ig- tai CTLA4lg-proteiineja (10 pg/ml). Sitoutuminen havaittiin FACSR:llä sen jälkeen, kun näytteisiin 20 oli lisätty vuohessa tehtyjä FITC:llä konjugoituja toisen vaiheen anti-humaani Ig-reagensseja. Yhteensä 10 000 vär- : .·. jättyä solua analysoitiin FACSR:llä.
< · ·
Kuten kuviossa 5 on esitetty, sitoutui CD28Ig B7+-CHO-soluihin mutta ei PM LCL -soluihin, joka solulinja on ; , 25 suhteellisen pieniä B7-antigeenimääriä ilmentävä solulinja ;;· : (Linsley, et ai., edellä, 1990). CTLA4lg sitoutui molem- t < » piin solulinjoihin voimakkaammin kuin CD28Ig, mikä viittaa v * siihen, että se sitoutuu suuremmalla affiniteetillä. Ei CD28lg eikä CTLA4Ig sitoutunut CD28*-CHO-soluihin.
30 CTLA4lg:n ja B71g:n sitoutumisaffiniteetti CTLA4lg:n ja B7Ig:n välisen vuorovaikutuksen näennäinen affiniteetti määritettiin tämän jälkeen käyttäen kiinteän faasin kompetitiivista sitoutumismääritystä. 96-kuoppaiset muovilevyt päällystettiin CTLA4lg:llä edellä : : 35 kuvatulla tavalla. B7lg varustettiin radioaktiivisella 125I- 112082 45 leimalla (5 X 105 cpm, 2 X 106 cpm pikomoolia kohti), ja sitä lisättiin 4-nanomolaarisessa konsentraatiossa seokseen, jossa oli osoitetut konsentraatiot (katso kuvio 6) leimalla varustamatonta kimeeristä mAb L6:tta, mAb 9.3, 5 mAb BB-l:tä tai B7Ig:tä. Levyihin sitoutuneen radioaktiivisuuden määrä määritettiin ja se ilmoitettiin prosentteina sellaisiin kuoppiin sitoutuneen radioaktiivisuuden määrästä, jotka oli käsitelty ilman kompetitiivista molekyyliä (28 300 cpm). Kukin piste edustaa kahden rinnakkaisen 10 määrityksen keskiarvoa, rinnakkaisten määritysten poikkeama keskiarvosta oli tavallisesti < 20 %. Konsentraatiot laskettiin sillä perusteella, että Mr yhden mAb-molekyylin sitoutumiskohdan osalta oli 75 000 ja yhden B7Ig:n sitoutumiskohdan osalta 51 000.
15 Kuten kuviossa 6 on esitetty ainoastaan mAb BB-1 ja leimalla varustamaton B7Ig kilpailivat merkittävästi 125I-B7Ig:n sitoutumisesta (näiden kummankin puolimaksimaaliset vaikutukset tapahtuivat arvojen noin 22 nM ja noin 175 nM kohdalla). Tutkituissa konsentraatioissa ei kimeerisellä 20 mAb L6:lla eikä mAb 9.3:11a ollut tehokasta kompetitiota. Muissa kokeissa käytetyt mAb 9.3:n konsentraatiot olivat riittävän suuria estämään 125I-B7Ig:n sitoutumisen immobili- soituun CD28lg:hen tai solun pinnalla ilmentyneeseen ‘ CD28:aan ä 90 %.
; 25 Kun kompetitiokoetulokset kuviosta 6 esitettiin !>! ! Scatchardin kuvaajassa, laskettiin 125I-B7:n sitoutumista : *. immobilisoituun CTLA4lg:hen kuvaavan dissosiaatiovakion, : Kd:n, arvoksi noin 12 nM (kuvio 7). Tämä arvo on noin 20 kertaa pienempi kuin 125I-B7Ig:n ja CD28:n väliselle 30 sitoutumiselle aikaisemmin määritetty Kd (noin 200 nM) [Linsley, et ai, (1991), edellä] mikä viittaa siihen, että CTLA4 on B7-antigeenille CD28-reseptoria suurempi affini-• ;; teettinen reseptori.
’··' CTLA4lg:tä sitovien lymfoblastoidisten solujen pin- 35 nalla olevan(ien) molekyylit e)n tunnistamiseksi (kuvio 7) 112082 46 analysoitiin pinnastaan 125I-leimalla varustetut solut immunosaostusta käyttäen (kuvio 8). B7+-CH0 ja PM LCL -solut varustettiin pinnastaan 125I:llä ja ne uutettiin ionit-tumattomalla detergenttiliuoksella edellä kuvatulla taval-5 la. Uutteista otetut näytteet, jotka sisälsivät noin 1,5 X 107 cpm:ää 0,1 ml:n tilavuudessa, analysoitiin immunosaos-tusanalyysilla edellä kuvatulla tavalla ilman mitään lisäyksiä tai käyttämällä 2 pg kutakin molekyyleistä CD28lg, CTLA4lg tai CD51g. Pestyt immunosaostumat analysoitiin 10 sitten SDS-PAGE:lla (10 - 20 % akryyliamidigradientti) pelkistävissä olosuhteissa. Tämä jälkeen geeli kuivattiin ja sille suoritettiin autoradiografia. Kuvion 8 vasen osa-kuvio esittää autoradiogrammia, joka saatiin 1 päivän velotuksen jälkeen. Kuvion 8 oikeanpuoleinen osakuvio esit-15 tää samasta geelistä valmistettua autoradiogrammia 10 päivän valotuksen jälkeen. Kuvion 8 keskellä olevassa osaku-viossa olevaa autoradiogrammia valotettiin myös 10 päivää. Tässä kuvassa on myös esitetty moolimassastandardien paikat.
20 Kuten kuviossa 8 on esitetty, CTLA4lg:llä suorite tussa immunosaostuksessa saostui radioaktiivisella leimal-; la varustettu diffuusisti liikkuva proteiini (Mr noin * i · 50 000 - 75 000; keskiosa noin 60 000:n kohdalla), joka ei saostunut CD28Ig:llä eikä CD5Ig:llä. Tämä molekyyli liik- I · ; *’ 25 kui samalla tavoin kuin B7, joka oli immunosaostettu B7+- * i · :·: ’ CHO-soluista CTLA4lg:llä ja jota saostui paljon heikommin : ,* CD28lg:lla. Nämä havainnot viittaavat siihen, että CTLA4lg v : sitoo yhden proteiinin lymfoblastoidisissa soluissa, joka on kooltaan samansuuruinen kuin B7-antigeeni.
30 Immuunivasteiden inhibitio in vitro -olosuhteissa CTLA4lg:llä
Solujen lisääntymisen inhibitio
Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että anti-CD28-mAb, 9.3, ja anti-B7-mAb, BB-1, inhiboivat allo-35 antigeenispesifisten Th- solujen lisääntymistä, sekä allo- 47 antigeeniä esittävien B-solujen immunoglobuliinin eritystä (Damle, et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 78 (1981) 5096; Lesslauer, et ai., Eur. J. Immunol. 16 (1986) 1 289]. Koska CTLA4 on B7-antigeenin korkea-affiniteettinen resepto-5 ri, kuten tässä keksinnössä on osoitettu olevan asianlaita, tutkittiin liukoisesta CTLA4lg:stä sen kyky inhiboida näitä vasteita. CTLA4Ig:n vaikutuksia T-solujen lisääntymiseen tutkittiin kuviossa 9 esitetyssä kokeessa.
Primaarisesta lymfosyyttityypien yhteisreaktiosta 10 (MLR) saatuja blastisoluja stimuloitiin säteilytetyillä T51-lymfoblastoidisoluilla (LC) siten, että seoksessa oli samanaikaisesti, tai siihen ei lisätty, muriini-mAb-9.3:n Fab-fragmentteja tai B7lg-, CD28lg- tai CTLA4lg-immuno-globuliini-Cy-fuusioproteiineja. Solujen lisääntyminen 15 määritettiin [3H]-tymidiinin kerääntymisestä soluihin 4 päivän kuluttua ja se on ilmoitettu prosentteina radioaktiivisuuden kerääntymisestä käsittelemättömiin viljelmiin (21 000 cpm). Kuviossa 9 on esitetty keskiarvo neljänä rinnakkaiskokeena suoritetuista määrityksistä. (SEM £ 20 10 %).
Kuten kuviosta 9 käy ilmi, CTLA4lg inhiboi MLR-: reaktiota annoksesta riippuvaisella tavalla enimmillään > *';'·[ 90 % ja puolimaksimaalinen vaste saatiin konsentraatiossa .! noin 30 ng/ml (noin 0,8 nM). mAb 9.3:n Fab-fragmentti, ; , 25 jonka on aiemmin osoitettu olevan voimakkaampi MRL:n inhi- · biittori kuin kokonainen mAb 9.3 [Damle, et ai., J. Im- * * t : V munol. 140 (1988) 1 753 - 1 761], inhiboi myös MLR:ää, v · mutta tämä tapahtui korkeammissa konsentraatioissa (noin 800 ng/ml tai noin 30 nM puolimaksimaalisen vasteen olles-30 sa kyseessä). B7Ig ja CD28lg eivät merkittävästi inhiboi-neet MLR:ää edes korkeammissa konsentraatioissa. Toisessa kokeessa B7Ig:n lisäys yhdessä CTLA4lg:n kanssa esti osit-;;; tain MLR:n inhiboitumisen CTLA4lg:llä, mikä viittaa sii- hen, että inhibitio johtui spesifisesti vuorovaikutuksista ; 35 B7-antigeenin kanssa.
* I
48 112-1.-
Immunoglobuliinin erittymisen inhibitio
Tutkittiin myös CTLA4lg:n vaikutuksia auttaja-T-solun (Th) aikaansaamaan immunoglobuliinin erittymiseen (kuvio 10). CD4*-T-soluja ja allogeenisiä CD19+-B-soluja 5 yhdistettiin keskenään mainittujen edellä kuvattujen immunoglobuliinimolekyylien läsnä ollessa ja niiden puuttuessa. Muriini-mAb-molekyylit 0KT8, 9.3 ja BB-1 lisättiin pitoisuuteen 20 pg/ml ja Ig-fuusioproteiinit pitoisuuteen 10 pg/ml. Kuusi päivää kestäneen viljelyn jälkeen määri-10 tettiin humaani-IgM:n (SEM < 5%) konsentraatio viljelmä- supernatanteissa entsyymi-immunomäärityksellä (ELISA) edellä kuvatulla tavalla. CD4+-T-solujen puuttuessa oli viljeltyjen B-solujen tuottaman IgM:n konsentraatio 11 ng/ml.
15 Kuten kuviossa 10 on esitetty, CD4*-T-solut stimu loivat allogeenisten CD19+-B-solujen lgM:n tuottoa (CD4*-T-solujen puuttuessa IgM-pitoisuudet pienenivät 93 %). mAb-molekyylit 9.3 ja BB-1 inhiboivat merkittävästi Th:n aikaansaamaa IgM:n tuottoa (nämä saivat aikaan vastaavasti 20 63-prosenttisen ja 65-prosenttisen inhibition). CTLA4lg oli inhibiittorina jopa näitä mAb-molekyylejä tehokkaampi ; (89-prosenttinen inhibitio). Kontrolli-Ig-molekyylien, mAb ( t · '!!,* 0KT8:n ja CD5Ig:n, inhibitio oli paljon pienempi (< 30- ,* prosenttinen inhibitio). Mikään näistä molekyyleistä ei t i ; 25 inhiboinut merkittävästi Ig:n muodostumista Staphylococcus » » * '··' · aureuksen enterotoksiini B:n läsnä ollessa määritettynä.
: Samanlaisia tuloksia saatiin CD4+-T-soluilla ja B-soluilla, ·,· · jotka olivat peräisin muilta verenluovuttajilta. Nämä tu lokset viittaavat siihen, että CTLA4Ig:n inhibitio on spe-30 sifinen.
Edellä olevat koetulokset osoittavat myös, että CTLA4- ja CD28-reseptorit muistuttavat toisiaan sekä toi-;;; minnallisesti että rakenteellisesti. CD28:n tavoin on CTLA4 myös B-solujen aktivaatioantigeenin, B7:n reseptori. 35 CTLA4lg sitoi 125I-B7:ää ja sitoutumisen af f initeeettivakio,
Λ ✓! O - . O
49 1 1 l U O
Kd, oli noin 12 nM, joka arvo on noin 20 kertaa suurempi kuin CD28:n ja B7Ig:n välinen affiniteetti (noin 200 nM). CTLA4:n ja CD28:n voidaan siten ajatella olevan saman li-gandin, B7-antigeenin suuri- ja pieniaffiniteettisia re-5 septorej a.
CD28:n ja B7:n välinen näennäinen affiniteetti on samanlainen kuin affiniteetti, joka on raportoitu liukoisen alloantigeenin sitoutumiselle muriini-T-soluhybridoo-man T-solureseptoriin [noin 100 nM; Schnek, et ai., Cell 10 56 (1989) 47], ja se on suurempi affiniteetti kuin CD2:n ja LFA3:n välisissä vuorovaikutuksissa [Recny, et ai., J. Biol. Chem. 265 (1990) 8542] tai CD4:n ja MHC class II -molekyylien välisissä vuorovaikutuksissa [Clayton, et ai., Nature 339 (1989) 548] esiintyvä affiniteetti.
15 CTLA4:n ja B7:n välinen näennäinen affiniteettivakio, Kd, on vielä suurempi ja se on verrattavissa odotuksiin sopivalla tavalla affiniteetiltaan suurempiin mAb-molekyylei-hin [Kd-arvo 2 - 10 000 nM; Alzari, et ai., Ann. Rev. Iramu-no. 6 (1988) 555]. CTLA4:n ja B7:n välinen Kd on samansuu-20 ruinen tai suurempi kuin integriinireseptorien ja niiden ligandien väliset Kd-arvot (10 - 2 000 nM; Hautanen, et ; . ai., J. Biol. Chem. 264 (1989) 1 437 - 1 442; Di Minno, et ai·, Blood 61 (1983) 140 - 148; Thiagarajan ja Kelley, J.
I;' * Biol. Chem. 263 (1988) 035 - 3 038]. CTLA4:n ja B7:n vuo- : 25 rovaikutusten affiniteetti on siten suurimpia lymfoidisil- * · M .* le adheesiojärjestelmille tähän mennessä raportoiduista ft » ; affiniteeteistä.
I/. : Nämä tulokset ovat osoituksena ensimmäistä kertaa suoritetusta CTLA4:n transkriptiotuotteen toiminnallisen 30 proteiinituotteen ilmentämisestä. CTLA4lg, fuusiokonstruk- ·. tio, joka sisältää IgCyl-domeeniin fuusioidun CTLA4:n solunulkoisen domeenin, muodostaa disulfidin välityksellä liittyvän dimeerin, joka sisältää alayksiköt, joiden Mr on noin 50 000 (kuvio 1). Koska tämän fuusion Ig-osassa ei ; 35 voida ennustaa muodostuvan ketjujen välisiä disulfideja, so 112 u 8 2 vaikuttaa todennäköiseltä, että CTLA4:stä peräisin olevat kysteiinit liittyvät disulfidisidoksen muodostumiseen. Analoginen CD28Ig-fuusioproteiini (Linsley, et ai, edellä, 1991) sisältää myös ketjujen väliseniiä) disulfidisidok-5 sen(ia). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CTLA4-re-septori esiintyy CD28:n [Hansen, et ai., Immunogeneties 10 (1980) 247 - 260], tavoin T-solujen pinnalla disulfidisidoksen yhdistämänä homodimeerinä. Vaikka CD28 ja CTLA4 ovat erittäin homologisia proteiineja, ne poikkeavat toi-10 sistaan immunologisesti, koska anti-CD28-mAb, 9.3, ei tunnista CTLA4:ää (kuviot 4 ja 5).
Ei tiedetä, voiko CTLA4 aktivoida T-soluja signaa-lireaktiotiellä, joka on analoginen CD28:n suhteen. Murii-ni- ja humaani-CTLA4:n sytoplasmiset domeenit ovat ident-15 tisiä (Dariavach, et ai., edellä 1988), mikä viittaa siihen, että tällä alueella on tärkeitä toiminnallisia ominaisuuksia. CD28:n ja CTLA4:n sytoplasmisilla domeeneilla on myös homologiaa keskenään, vaikka onkin epäselvää, riittääkö tämä tekemään näiden kahden molekyylin signaalia 20 muodostavat ominaisuudet samanlaisiksi.
CTLA4Ig on in vitro -olosuhteissa sellaisten lymfosyyttien toimintojen voimakas inhibiittori, joissa tarvi-, taan T-solujen ja B-solujen yhteistoimintaa (kuviot 9 ja 10). Nämä havainnot yhdessä aikaisempien tutkimusten kans-: “ 25 sa viittaavat B7-antigeenin ja sen vastinreseptorien, - · CD28:n ja/tai CTLA4:n, välisten vuorovaikutusten perimmäi- : ’.· seen tärkeyteen sekä T- että B-lymfosyyttien vasteiden V ; säännöstelyssä. CTLA4lg tulisi olemaan käyttökelpoinen reagenssi tulevia tutkimuksia varten, jotka koskevat näi-30 den vuorovaikutusten osuutta immuunivasteiden aikana.
CTLA4lg on voimakkaampi lymfosyyttivasteiden inhibiittori in vitro -olosuhteissa kuin joko mAb BB-1 tai mAb 9.3 (kuviot 9 ja 10). CTLA4lg:n suurempi tehokkuus mAb BB-l:een verrattuna johtuu todennäköisimmin näiden molekyylien 35 affiniteettieroista B7:ää kohtaan (kuvio 6). CTLA4lg on i » „ 112082:
Dl myös mAb 9.3:a voimakkaampi todennäköisesti siksi, että sillä ei mAbrstä poiketen myöskään ole T-solujen lisääntymiseen kohdistuvia suoria stimuloivia vaikutuksia (June, et ai., Immunology Today 11 (1989) 211), joilla olisi sen 5 sen inhibitorisia vaikutuksia kumoavaa vaikutusta. CTLA4lg:n immunosuppressiiviset vaikutukset in vitro -olosuhteissa viittaavat siihen, että tulevaisuudessa on syytä tutkia tämän molekyylin mahdollisia terapeuttisia vaikutuksia sellaisten autoimmuunisairauksien hoitoon, joihin 10 liittyy poikkeava T-solujen aktivaatio tai Ig:n muodostuminen .
Kuten sen alan ammattimiehille on selvää, johon tämä keksintö liittyy, voi tällä keksinnöllä olla muita sovellutusmuotoja kuin edellä nimenomaisesti tarkastellut 15 muodot tämän keksinnön hengestä tai sen olennaisista piirteistä poikkeamatta. Niiden tämän keksinnön nimenomaisten sovellutusmuotojen, joita edellä on kuvattu, on siten katsottava olevan kuvaavia eikä rajoittavia. Tämän keksinnön suojapiiri on sellainen, millaisena se on esitetty oheen 20 liitetyissä patenttivaatimuksissa eikä se siten rajoitu edellä olevan patenttiselityksen sisältämiin esimerkkei-: . ·. hin.
52 112081
SEQUENCE LISTING
(1) GENERAL INFORMATION: 5 (i) APPLICANT: Linsley, Peter 6
Ledbetter, Jeffrey A Damle, Nitin K Brady, William 10
(ii) TITLE OF INVENTION: CTLA4 RECEPTOR AND METHODS FOR ITS USE
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 14 15 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Sheldon £ Mak (B) STREET: 201 South Lake Avenue, Suite 800 (C) CITY: Pasadena 20 (D) STATE: California (E) COUNTRY: United States (F) ZIP: 91101 (V) COMPUTER READABLE FORM: 25 (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1..25 : V 30 (Vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: '···; 35 * * * * (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Mandel, SaraLynn (B) REGISTRATION NUMBER: 31,853 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 7848 53 1 1208/.
(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (818) 796-4000 (B) TELEFAX: (818) 795-6321 5 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs 1Q (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) 15
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO
2Q (Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l: . 25 • CTAGCCACTG AAGCTTCACC ATGGGTGTAC TGCTCACAC 39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: • ; 30 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 35 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO
54 1 Λ Π Γ' r I \/UÖ'.
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:
5 TGGCATGGGC TCCTGATCAG GCTTAGAAGG TCCGGGAAA
39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 10 (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 15 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO
20 (Vi) ORIGINAL SOURCE: : i (A) ORGANISM: Homo sapiens . . 25 : (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:3: I I *
TTTGGGCTCC TGATCAGGAA AATGCTCTTG CTTGGTTGT
... 39 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4: 30 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 84 base pairs :: (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single \ 35 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
55 112J82
(iv) ANTI-SENSE: NO
(Vi) ORIGINAL SOURCE: 5 (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4: 10 AAGCAAGAGC ATTTTCCTGA TCAGGAGCCC AAATCTTCTG ACAAAACTCA CACATCCCCA 60 CCGTCCCCAG CACCTGAACT CCTG 84 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5: 15 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 41 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 20 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) • · ·
(iii) HYPOTHETICAL: NO
j ... 25 (iv) ANTI-SENSE: NO
* « · « · · (Vi) ORIGINAL SOURCE: * # · ‘ (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5: 7 30 CTTCGACCAG TCTAGAAGCA TCCTCGTGCG ACCGCGAGAG C 41 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: 35 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 47 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 56 112ϋ8ν (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
5 (iv) ANTI-SENSE: NO
(Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 10 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:6: CATTGCACAG TCAAGCTTCC ATGCCCATGG GTTCTCTGGC CACCTTG 47 15 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 39 base pairs (B) TYPE: nucleic acid 20 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
J ... 25 (iii) HYPOTHETICAL: NO
;:y (iv) anti-sense: no (vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 30 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7: ATCCACAGTG CAGTGATCAT TTGGATCCTG GCATGTGAC 39 : 35 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 65 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 57 11208;· (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
5 (iii) HYPOTHETICAL: NO
(iv) ANTI-SENSE: NO (Vi) ORIGINAL SOURCE: 10 (A) ORGANISM: Homo sapiens . (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:8: CTCAGTCTGG TCCTTGCACT CCTGTTTCCA AGCATGGCGA CCATGGCAAT GCACGTGGCC 60 ^ 5 CAGCC 65 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 2q (A) LENGTH: 33 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ; 25 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic) * · » I · · i * t
: (iii) HYPOTHETICAL: NO
* « *
(iv) ANTI-SENSE: NO
30 (Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens :...: · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9: 35 TTTGGGCTCC TGATCAGAAT CTGGGCACGG TTG 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 58 Α A O .·Λ f I IZUÖ/ (A) LENGTH: 72 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 5 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL; NO
10 (iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 15 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10: CTAGCCACTG AAGCTTCACC AATGGGTGTA CTGCTCACAC AGAGCACGCT GCTCAGTCTG 60 GTCCTTGCAC TC 72 20 (.2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: • ;*; (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 33 base pairs :·, (B) TYPE: nucleic acid • t · I ,-, 25 (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear • · (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
30 (iii) HYPOTHETICAL: NO
, (iv) ANTI-SENSE: NO
(Vi) ORIGINAL SOURCE: 35 (A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11: 59 11208/ GCAATGCACG TGGCCCAGCC TGCTGTGGTA GTG 33 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12: 5 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 45 base pairs (B) TYPE: nucleic acid ' (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 10 (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
15 (iv) ANTI-SENSE: NO
(Vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens 20 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12: : TGATGTAACA TGTCTAGATC AATTGATGGG AATAAAATAA GGCTG 45 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13: : .·. 25 ;;·*/ (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ’’ V (A) LENGTH: 561 base pairs : (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 30 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(iii) HYPOTHETICAL: NO
' 35
(iv) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGINAL SOURCE: (A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:
110'· P
60 1 1 z ^ u - (λ) KAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 1..561 5 (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13: GCA ATG CAC GTG GCC CAG CCT GCT GTG GTA CTG GCC AGC AGC CGA GGC 48
Ala Met His Val Ala Gin Pro Ala Vai Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly 15 10 15 10 ATC GCC AGC TTT GTG TGT GAG TAT GCA TCT CCA GGC AAA GCC ACT GAG 9 6 lie Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu 20 25 30 GTC CGG GTG ACA GTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG ACT GAA GTC 144 ^ Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val 35 40 45 TGT GCG GCA ACC TAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG ACC TTC CTA GAT GAT 192 Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp 50 55 60 20 TCC ATC TGC ACG GGC ACC TCC AGT GGA AAT CAA GTG AAC CTC ACT ATC 24 0 I .·, Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr lie 65 70 75 80 * t * 25 CAA GGA CTG AGG GCC ATG GAC ACG GGA CTC TAC ATC TGC AAG GTG GAG 288 ; Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val Glu : 85 90 95 CTC ATG TAC CCA CCG CCA TAC TAC CTG GGC ATA GGC AAC GGA ACC CAG 336
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly He Gly Asn Gly Thr Gin 30 100 105 110 ATT TAT GTA ATT GAT CCA GAA CCG TGC CCA GAT TCT GAC TTC CTC CTC 384
He Tyr Val He Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu ns 120 125 O 35 6i 112 u 81- TGG ATC CTT GCA GCA GTT AGT TCG GGG TTG TTT TTT TAT AGC TTT CTC 432
Trp He Leu Ala Alt Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu 5 130 135 140 CTC ACA GCT GTT TCT TTG AGC AAA ATG CTA AAG AAA AGA AGC CCT CTT 480
Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lye Met Leu Lye Lye Arg Ser Pro Leu 145 150 155 160 10 ACA ACA GGG GTC TAT GTG AAA ATG CCC CCA ACA GAG CCA GAA TGT GAA 528
Thr Thr Gly Val Tyr Val Lye Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cye Glu 165 170 175 AAG CAA TTT CAG CCT TAT TTT ATT CCC ATC AAT 561
Lye Gin Phe Gin Pro Tyr Phe He Pro He Asn 180 185 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 187 amino acids (fi) TYPE: amino acid 2Q (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein : . (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:14:
Ala Met His Val Ala Gin Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly 1 5 10 15 : 25
He Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lye Ala Thr Glu ;v| 20 25 30 ·,· Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val 35 40 45 30
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp : 50 55 60
Ser He Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr He / 65 70 75 80 •at;
Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr He Cys Lys Val Glu 62 112085' 85 90 95
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr Gin 5 100 105 110
Ile Tyr Vai He Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu 115 120 125
Trp lie Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu 130 135 140 10
Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu 145 150 155 160
Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu 165 170 175 15 Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe He Pro He ASn 180 185 Λ I > · 1 » ·

Claims (41)

63 112031
1. Menetelmä eristetyn CTLA4-reseptoriproteiinin tai sen osan tai fragmentin, joista kukin sitoutuu B7-5 antigeeniin, valmistamiseksi, jolla on kuviossa 3 esitetty aminohapposekvenssi (sekvenssi tunnusnumero 14), tunnettu siitä, että kasvatetaan isäntä-vektori-systeemiä siten, että tuotetaan CTLA4-proteiinia tai sen osaa tai fragmenttia, joista kukin sitoutuu B7-antigeeniin.
2. DNA sekvenssi, tunnettu siitä, että se koo- dittaa B7-antigeenin kanssa reagoivaa CTLA4Ig-fuusio-proteiinia vastaavaa aminohapposekvenssiä ja siitä, että sen talletusnumero on ATCC 68 629.
3. Menetelmä puhdistetun, liukoisen CTLA4-prote-15 iinin valmistamiseksi, joka proteiini käsittää sekvenssissä tunnusnumero 14 esitetyt 125 aminohappoa alkaen CTLA4-proteiinin solunulkoisen domeenin aminohapposekvenssin alaniinista asemassa 1 ja päättyen asparagiinihappoon asemassa 125, tunnettu siitä, että kasvatetaan isäntä- 20 vektori-systeemiä siten, että tuotetaan CTLA4-proteiinia.
4. Menetelmä puhdistetun, liukoisen CTLA4-protein · iinin valmistamiseksi, joka sitoutuu aktivoiduilla B- ; ; : soluilla ilmentyvään B7-antigeeniin ja käsittää sekvens- ·1·,. sissä tunnusnumero 14 esitetyt 187 aminohappoa alkaen ala- : .·. 25 niinistä asemassa 1 ja päättyen asparagiiniin asemassa 187, tunnettu siitä, että kasvatetaan isäntä-vektori-systeemiä siten, että tuotetaan CTLA4-proteiinia.
5. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka sisältää patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukai- * ·1 30 sesti valmistettua puhdistettua, liukoista CTLA4-proteii- nia sekä hyväksyttävän farmaseuttisen kantajan, tunnet - · tu siitä, että sekoitetaan proteiini hyväksyttävän far- maseuttisen kantajan kanssa.
6. Eristetty nukleiinihappomolekyyli, tunnettu 35 siitä, että se koodittaa patenttivaatimuksen 3 tai 4 mu- mu ‘ 1 kaisesti valmistettua proteiinia. A AC' , n f 64 ' \£νθΐ.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen nukleiinihappo-molekyyli, tunnettu siitä, että se on cDNA, jolla on sekvenssi tunnusnumero 13.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen nukleiinihappo-5 molekyyli, tunnettu siitä, että se on sekvenssillä tunnusnumero 13 esitetty nukleiinihappo alkaen guaniinista asemassa 1 ja päättyen sytosiiniin asemassa 375.
9. Plasmidi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 6 mukaisen nukleiinihappomolekyylin.
10. Isäntä-vektori - systeemi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 9 mukaisen plasmidin sopivassa isäntäsolussa.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen isäntä-vekto-ri-systeemi, tunnettu siitä, että sopiva isäntäsolu on 15 bakteerisolu tai eukaryoottisolu.
12. Menetelmä sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetyn liukoisen CTLA4-molekyylin tai sen fragmentin tai johdannaisen valmistamiseksi, joka käsittää CTLA4:n solunul-koisen domeenin ja joka sitoutuu aktivoiduilla B-soluilla 20 ilmentyvään B7-antigeeniin, tunnettu siitä, että kasvatetaan liukoista CTLA4-molekyyliä koodittavaa isäntä- i.: : vektori-systeemiä siten, että tuotetaan CTLA4-proteiinia • » · V ’ isännässä ja otetaan talteen siten tuotettu liukoinen CTLA.4-molekyyli. : 25
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, M» · ·*.*. tunnettu siitä, että kasvatetaan isäntä-vektori-sys- • ♦ teemiä, joka käsittää sekvenssillä tunnusnumero 14 esite- • · · tyt aminohapot alkaen alaniinista asemassa 1 ja päättyen . asparagiiniin asemassa 187 tai alkaen alaniinista asemassa * · 30. ja päättyen asparagiinihappoon asemassa 12 5.
‘’ 14. Menetelmä CTLA4-proteiinituotteen valmistami- ; seksi, joka käsittää patenttivaatimuksen 13 mukaisesti tuotetun liukoisen CTLA4-molekyylin tai sen fragmentin h liitettynä ei-CTLA4-proteiinisekvenssiin, tunnettu 35 siitä, että CTLA4-proteiinia koodittava DNA-sekvenssi lii-1 ’* tetään ei-CTLA4-sekvenssiin, transfektoidaan fuusiokon- 65 112-0, struktit sopivaan isäntään ja ilmennetään liukoista CTLA4-proteiinituotetta.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ei-CTLA4-proteiini on ainakin osa 5 immunoglobuliinimolekyylistä.
16. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka käsittää jonkin patenttivaatimuksista 12 -15 mukaisesti tuotetun tuotteen, tunnettu siitä, että tuote sekoitetaan sopivan farmaseuttisen kantajan kanssa.
17. Nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se koodittaa patenttivaatimuksen 12 mukaisesti tuotettua proteiinia.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se on cDNA, jolla on 15 sekvenssi tunnusnumero 13.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen cDNA, tunnettu siitä, että sillä on sekvenssi tunnusnumero 13 alkaen guaniinista nukleiinihappoasemassa 1 ja päättyen sy-tosiiniin nukleiinihappoasemassa 375.
20. Plasmidi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 17 mukaisen nukleiinihappomolekyylin.
21. Isäntä-vektori-systeemi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 2 0 mukaisen plasmidin sopivassa isäntäsolussa. : .·. 25
22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen isäntä-vekto- XV ri-systeemi, tunnettu siitä, että sopiva isäntäsolu on bakteerisolu tai eukaryoottisolu.
• 23. Menetelmä proteiinin tuottamiseksi, tunnet- t u siitä, että kasvatetaan patenttivaatimuksen 21 mukais- 30 ta isäntä-vektori-systeemiä siten, että tuotetaan CTLA4-proteiinia isännässä ja otetaan talteen siten tuotettu proteiini.
,···, 24. Menetelmä CTLA4Ig-fuusioproteiinin tuottami seksi, joka sitoutuu B7-antigeeniin ja jonka ensimmäinen 35 aminohapposekvenssi koostuu sekvenssillä tunnusnumero 14 ‘ ‘: esitetystä CTLA4:n solunulkoisesta domeenista tai sen 66 112 u 6 λ' osasta tai fragmentista ja toinen aminohapposekvenssi koostuu ihmisen immunoglobuliinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2- ja CH3-alueista, tunnettu siitä, että kasvatetaan isäntä-vektori-systeemiä siten, että tuotetaan 5 CTLA4Ig-fuusioproteiinia.
25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä CTLA4Ig-fuusioproteiinin tuottamiseksi, joka sitoutuu B7-antigeeniin ja jolla on (a) ensimmäinen aminohapposekvenssi alkaen CTLA4:n 10 solunulkoista domeenia esittävän sekvenssin tunnusnumero 13 alaniinista aminohappoasemassa 1 ja päättyen aspara-giinihappoon aminohappoasemassa 125, ja (b) toinen aminohapposekvenssi, joka koostuu ihmisen immunoglobuliinimolekyylin sarana-alueesta sekä CH2- 15 ja CH3-alueista, tunnettu siitä, että kasvatetaan isäntä-vektori-systeemiä siten, että tuotetaan CTLA4Ig-fuusioproteiinia.
26. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka tunnistaa sekvenssillä tunnusnumero 14 esi- 20 tetyn CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu siihen, jolloin mainittu sitoutuminen estää CTLA4:n sitoutumisen : B7-antigeeniin, tunnettu siitä, että herkistetään eläin sopivalla CTLA4 - immunogeenillä ja tuotetaan siten ·’· _ monoklonaalinen vasta-aine. : .·. 25
27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, • · · • · · · ;v, tunnettu siitä, että valmistetaan vasta-aine, joka tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu siihen, joka domeeni on CTLA4-fuusioproteiinissa, joka käsittää aminohapposekvenssin, joka käsittää CTLA4-fuusiopro-; ·’ 30 teiinin solunulkoisen domeenin fragmentin, joka estää T- solujen jakaantumista.
*· 28. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan vasta-aine, joka ; tunnistaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin ja sitoutuu sii- ··* 35 hen, joka domeeni on CTLA4-fuusioproteiinissa, joka käsit- ‘ * tää aminohapposekvenssin, joka alkaa 112081 67 (a) CTLA4:n solunulkoista domeenia esittävän sekvenssin tunnusnumero 14 alaniinista aminohappoasemassa 1 ja päättyy asparagiinihappoon aminohappoasemassa 125, tai (b) alkaa CTLA4:n solunulkoista domeenia esittävän 5 sekvenssin tunnusnumero 14 metioniinistä aminohappoasemassa 2 ja päättyy asparagiinihappoon aminohappoasemassa 125.
29. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, joka käsittää patenttivaatimuksen 24 tai 25 mukaisesti valmistetun tuotteen, tunnettu siitä, että 10 sekoitetaan tuote sopivan farmaseuttisen kantajan kanssa.
30. Menetelmä CD28Ig/CTLA4Ig-fuusioproteiinihybri-din valmistamiseksi, joka hybridi sitoutuu B7-antigeeniin ja käsittää ensimmäisen aminohapposekvenssin, joka vastaa osaa CD28-reseptorin solunulkoisesta domeenista tai sen 15 fragmentista tai johdannaisesta fuusioituna toiseen aminohapposekvenssiin, joka vastaa osaa sekvenssillä tunnusnumero 14 esitetyn CTLA4-reseptorin solunulkoisesta domeenista tai sen fragmentista tai johdannaisesta ja kolmannen aminohapposekvenssin, joka vastaa ihmisen immuno- 20 globuliini Cyl sarana-aluetta sekä CH2- ja CH3-alueita, tunnettu siitä, että ·,· · (a) yhdistetään CD28-, CTLA4- ja immunoglobuliini- proteiineja koodittavat DNA-sekvenssit; (b) transf ektoidaan f uusiokonstrukt it sopivaan | 2 5 isäntään; ja » · · · (c) ilmennetään liukoista CD2 8Ig/CTLA4-fuusiopro- • · teiinituotetta. • i ·
31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuotetaan fuusioproteiinia, joka 30 on CTLA4-johdannainen, jolloin ensimmäinen aminohappose-kvenssi vastaa osaa CD28-reseptorin solunulkoisesta do- i ·· meenista ja toinen aminohapposekvenssi vastaa CTLA4: n so- lunulkoisen domeenin aminohappoja 94 - 125.
32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, * 35 tunnettu siitä, että tuotetaan fuusioproteiinia, jonka 68 1 10;)Ur. I I L ',) \j t.. lunulkoisen domeenin aminohappoja 1 - 94 ja toinen aminohapposekvenssi vastaa CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohappoja 94 - 125.
33. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmis-5 tamiseksi, joka käsittää jonkun patenttivaatimuksen 30 - 32 mukaisesti valmistetun tuotteen, tunnettu siitä, että sekoitetaan tuote sopivan farmaseuttisen kantajan kanssa.
34. In vitro menetelmä funktionaalisten CTLA4-10 positiivisten T-solujen vuorovaikutusten B7-positiivisten solujen kanssa säätelemiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan B7-positiiviset solut kosketukseen B7-antigeenin ligandin kanssa sellaisena määränä, joka on tehokas häiritsemään endogeenisen B7-antigeenin reaktiota CTLA4:n 15 kanssa.
35. Patenttivaatimuksen 34 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi on B7-antigeenin kanssa reaktiivinen monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti tai osa siitä.
36. Patenttivaatimuksen 35 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on anti-BBl-: : : monoklonaalinen vasta-aine. SE» ·
37. Ki inanhamsterin munasar j asolulinj a, tunnet-tu siitä, että sillä on talletusnumero ATCC 10762 ja se ; 25 ilmentää stabiilisti CTLA4Ig-fuusioproteiinia. s * · ;'V
38. Menetelmä CTLA4-johdannaismolekyylin valmista- miseksi, joka sitoutuu B7:aan, jolloin CTLA4:llä on sek- i I · > I · ‘ venssi tunnusnumero 14, tunnettu siitä, että kasvate taan isäntä-vektori-systeemiä siten, että tuotetaan CTLA4- » » : ** 30 johdannaista.
...* 39. Patenttivaatimuksen 38 mukainen menetelmä, • J. tunnettu siitä, että valmistetaan sellainen B7:ään si- toutuva CTLA4-johdannainen, joka käsittää sellaisen ; CTLA4:n solunulkoisen domeenin aminohapposekvenssin, jossa '··' 35 on muutos aminohapoissa 1-94. 112081 69
40. Patenttivaatimuksen 39 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan johdannainen, jonka aminohapot 94 - 125 vastaavat CTLA4:n solunulkoista domee-nia.
41. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmis tamiseksi, joka käsittää jonkun patenttivaatimuksen 38 -40 mukaisesti valmistetun CTLA4-johdannaisen, tunnettu siitä, että sekoitetaan CTLA4-johdannainen farmaseuttisesti sopivan kantajan kanssa. • · * 70 112 0 82
FI935795A 1991-06-27 1993-12-22 Menetelmiä eristetyn CTLA4-reseptorin ja sen johdannaisten, niitä sisältävien tuotteiden ja CTLA-reseptorin tunnistavien vasta-aineiden valmistamiseksi, menetelmissä käyttökelpoisia nukleiinihapposekvenssejä, plasmideja ja isäntäsoluja sekä niiden käyttötapoja FI112082B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72361791A 1991-06-27 1991-06-27
US72361791 1991-06-27
PCT/US1992/005202 WO1993000431A1 (en) 1991-06-27 1992-06-16 Ctl4a receptor, fusion proteins containing it and uses thereof
US9205202 1992-06-16

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI935795A FI935795A (fi) 1993-12-22
FI935795A0 FI935795A0 (fi) 1993-12-22
FI112082B true FI112082B (fi) 2003-10-31

Family

ID=24907003

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI935795A FI112082B (fi) 1991-06-27 1993-12-22 Menetelmiä eristetyn CTLA4-reseptorin ja sen johdannaisten, niitä sisältävien tuotteiden ja CTLA-reseptorin tunnistavien vasta-aineiden valmistamiseksi, menetelmissä käyttökelpoisia nukleiinihapposekvenssejä, plasmideja ja isäntäsoluja sekä niiden käyttötapoja
FI20022285A FI115057B (fi) 1991-06-27 2002-12-30 Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20022285A FI115057B (fi) 1991-06-27 2002-12-30 Eristetty liukoinen CTL4A-proteiini, sitä sisältäviä fuusioproteiineja, sen ligandeja, sen tunnistavia monoklonaalisia vasta-aineita ja käyttötapoja

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5434131A (fi)
EP (1) EP0606217B2 (fi)
JP (6) JP3722375B2 (fi)
KR (1) KR100238712B1 (fi)
AT (1) ATE170562T1 (fi)
AU (1) AU661854B2 (fi)
CA (2) CA2580812A1 (fi)
DE (2) DE69226871T3 (fi)
DK (1) DK0606217T4 (fi)
ES (1) ES2123001T5 (fi)
FI (2) FI112082B (fi)
IE (2) IE922111A1 (fi)
IL (4) IL102294A (fi)
LU (1) LU91375I2 (fi)
MX (1) MX9203605A (fi)
NL (1) NL300303I1 (fi)
NO (4) NO312465B1 (fi)
NZ (2) NZ264712A (fi)
PT (1) PT100637B (fi)
WO (1) WO1993000431A1 (fi)
ZA (1) ZA924782B (fi)

Families Citing this family (193)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6685941B1 (en) * 1988-11-23 2004-02-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig
CA2003455C (en) * 1988-11-23 2000-02-22 Craig B. Thompson Immunotherapy involving cd28 stimulation
US6406696B1 (en) 1989-10-27 2002-06-18 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods of stimulating the immune system with anti-CD3 antibodies
DE69032484D1 (de) * 1989-10-27 1998-08-20 Arch Dev Corp Zusammensetzungen und deren verwendung zur förderung der immunopotentiation
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6090914A (en) * 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
US5851795A (en) * 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5770197A (en) * 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US5962406A (en) * 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same
US6472510B1 (en) * 1992-02-14 2002-10-29 Bristol-Myers Squibb Company CD40 receptor ligands
IL104684A0 (en) * 1992-02-14 1993-06-10 Bristol Myers Squibb Co The cd40cr receptor and ligands therefor
DE69333580D1 (de) * 1992-04-07 2004-09-09 Univ Michigan Immunregulation über die cd28-route
US5397703A (en) * 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5747034A (en) * 1992-07-09 1998-05-05 Chiron Corporation Methods and materials for the induction of T cell anergy
US5773253A (en) * 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
US6491916B1 (en) 1994-06-01 2002-12-10 Tolerance Therapeutics, Inc. Methods and materials for modulation of the immunosuppresive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US6106834A (en) 1993-06-02 2000-08-22 Research Corporation Technologies, Inc. Use of anti-CD45 leukocyte antigen antibodies for immunomodulation
US6024957A (en) * 1993-06-02 2000-02-15 Research Corporation Technologies, Inc. Immunomodulators and methods for the prevention and reversal of organ transplant rejection using same
EP0665852A1 (en) * 1993-07-09 1995-08-09 Amgen Boulder Inc. Recombinant ctla4 polypeptides and methods for making the same
US6723705B1 (en) 1993-08-19 2004-04-20 Gentics Institute, Inc. Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor
US6130316A (en) * 1993-07-26 2000-10-10 Dana Farber Cancer Institute Fusion proteins of novel CTLA4/CD28 ligands and uses therefore
US5861310A (en) * 1993-11-03 1999-01-19 Dana-Farber Cancer Institute Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor
US20050129670A1 (en) * 1993-07-26 2005-06-16 Genetics Institute, Llc. Tumor cells modified to express B7-2 with increased immunogenicity and uses therefor
US6084067A (en) 1993-07-26 2000-07-04 Dana-Farber Cancer Institute CTLA4/CD28 ligands and uses therefor
US6824779B1 (en) 1993-07-26 2004-11-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for inhibiting the interaction of B7-2 with its natural ligand
AU7405294A (en) 1993-07-26 1995-02-20 Dana-Farber Cancer Institute B7-2: ctl a4/cd 28 counter receptor
WO1995005464A1 (en) * 1993-08-16 1995-02-23 Arch Development Corporation B7-2: ctla4/cd28 counter receptor
WO1995006738A1 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 Schering Corporation B70(b7-2):ctla-4 bonding protein
AU709711B2 (en) * 1994-03-08 1999-09-02 Dana-Farber Cancer Institute Methods for modulating T cell unresponsiveness
AU784510B2 (en) * 1994-03-08 2006-04-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for modulating T cell unresponsiveness
US6719972B1 (en) 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
EP0787188A1 (en) * 1994-11-01 1997-08-06 Targeted Genetics Corporation Chimeric receptors for the generation of selectively-activatable t h?-independent cytotoxic t cells
CA2206610A1 (en) * 1994-12-02 1996-06-06 Schering Corporation Purified genes encoding mammalian cell surface antigens; proteins and antibodies
US5576423A (en) 1994-12-02 1996-11-19 Schering Corporation Antibodies to the slam protein expressed on activated T cells
US6372208B1 (en) 1999-09-28 2002-04-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of reducing an immune response to a recombinant virus
US5872154A (en) * 1995-02-24 1999-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of reducing an immune response to a recombinant adenovirus
US6251957B1 (en) 1995-02-24 2001-06-26 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of reducing an immune response to a recombinant virus
US5652224A (en) 1995-02-24 1997-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism
WO1996031229A1 (en) * 1995-04-05 1996-10-10 Beth Israel Hospital Association Inhibiting rejection of a graft
US7175847B1 (en) * 1995-06-07 2007-02-13 Biogen Idec Inc. Treating intestinal inflammation with anti-CD80 antibodies that do not inhibit CD80 binding to CTLA-4
US6113898A (en) * 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US7153508B2 (en) * 1995-06-07 2006-12-26 Biogen Idec Inc. Treatment of B cell lymphoma using anti-CD80 antibodies that do not inhibit the binding of CD80 to CTLA-4
US6051227A (en) * 1995-07-25 2000-04-18 The Regents Of The University Of California, Office Of Technology Transfer Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5855887A (en) * 1995-07-25 1999-01-05 The Regents Of The University Of California Blockade of lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5811097A (en) * 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US7041634B2 (en) 1995-09-27 2006-05-09 Emory University Method of inhibiting immune system destruction of transplanted viable cells
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
US6107056A (en) * 1996-02-22 2000-08-22 Oaks; Martin K. SCTLA-4 gene and product
US5916560A (en) * 1996-03-20 1999-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the GP39/CD40 and CTLA4/CD28/B7 pathways and compositions for use therewith
US5786152A (en) * 1996-04-26 1998-07-28 Amgen Inc. Methods of inhibiting syp binding to a CTLA-4 receptor
CN1198646C (zh) * 1996-11-08 2005-04-27 生物基因Idec公司 抗体与人b7.1和b7.2之间独特结合相互作用的鉴定
US20060034844A1 (en) * 1996-12-04 2006-02-16 The Regents Of The University Of California Stimulation of T cells against self antigens using CTLA-4 blocking agents
US6319906B1 (en) 1996-12-31 2001-11-20 Isis Pharmaceuticals Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6077833A (en) * 1996-12-31 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US20040023917A1 (en) * 1996-12-31 2004-02-05 Bennett C. Frank Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7235653B2 (en) * 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
KR19980066046A (ko) * 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
JP2001523958A (ja) 1997-03-21 2001-11-27 ブライハム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド 免疫療法のｃｔｌａ−４結合ペプチド
SE9701127D0 (sv) * 1997-03-26 1997-03-26 Karolinska Innovations Ab Antigenic fusionprotein carrying GALal, 3GAL epitopes
CA2285692C (en) * 1997-03-27 2013-05-28 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Enhancement of immune response using targeting molecules
EP0975755B2 (en) 1997-04-16 2011-08-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Crsp protein (cysteine-rich secreted proteins), nucleic acid molecules encoding them and uses therefor
DE69823352T2 (de) * 1997-06-12 2004-09-02 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Cd28/ctla-4 inhibierende peptidomimetika und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen
WO1999015552A1 (fr) * 1997-09-19 1999-04-01 Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. Composes oligopeptidiques
US7223729B2 (en) * 1997-11-07 2007-05-29 Trillium Therapeutics Inc. Methods of treating allergy by administering a CD200 protein
US6955811B2 (en) * 1997-11-07 2005-10-18 Trillium Therapeutics Inc. Methods of inhibiting immune response suppression by administering antibodies to OX-2
PT1032662E (pt) * 1997-11-07 2006-07-31 Trillium Therapeutics Inc Metodos e composicoes para imunomodulacao.
AUPP221098A0 (en) * 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
CA2328725A1 (en) * 1998-04-15 1999-10-21 Brigham & Women's Hospital, Inc. T cell inhibitory receptor compositions and uses thereof
US7078512B2 (en) 1998-05-01 2006-07-18 Schering-Plough Animal Health Corporation Nucleic acid encoding feline CD86
US7279168B2 (en) 1998-05-01 2007-10-09 Texas A & M University System Recombinant virus expressing foreign DNA encoding feline CD86 and uses thereof
US20050031611A1 (en) * 1998-05-08 2005-02-10 Beth Israel Deaconess Medical Center Transplant tolerance by costimulation blockade and T-cell activation-induced apoptosis
US6682741B1 (en) * 1998-06-10 2004-01-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services β2 microglobulin fusion proteins and high affinity variants
US20050181482A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Meade Harry M. Method for the production of an erythropoietin analog-human IgG fusion proteins in transgenic mammal milk
ATE339507T1 (de) * 1998-06-15 2006-10-15 Gtc Biotherapeutics Inc Erythropoietin-analog-menschliches serum-albumin fusionsprotein
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
SI20626A (sl) 1998-09-21 2002-02-28 Genetics Institute, Inc. Postopki za zaviralno moduliranje imunskega odziva na terapevtske proteine
US6521419B1 (en) 1998-09-22 2003-02-18 Kanakaraju Koduri Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
US6800457B2 (en) 1998-09-22 2004-10-05 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors containing hot spot for increased recombinant protein expression in transfected cells
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
US7109003B2 (en) 1998-12-23 2006-09-19 Abgenix, Inc. Methods for expressing and recovering human monoclonal antibodies to CTLA-4
MXPA01006422A (es) 1998-12-23 2002-06-04 Pfizer Inc Abgenix Inc Anticuerpos monoclonales humanos de ctla-4.
US7011833B1 (en) 1999-05-06 2006-03-14 Genetics Institute, Inc. Enhancing immune responses with B7-1 or B7-2 in the absence of a crosslinking agent
US6613327B1 (en) 1999-07-28 2003-09-02 Genetics Institute, Inc. Methods of preventing immune-mediated abortion by inhibiting a CD28-mediated costimulatory signal
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
MXPA02001911A (es) 1999-08-24 2003-07-21 Medarex Inc Anticuerpos ctla-4 humanos y sus usos.
EP1248645B1 (en) * 2000-01-03 2007-04-18 Tr Associates, L.L.C. Novel chimeric proteins and their use
US7572631B2 (en) * 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US7541184B2 (en) 2000-02-24 2009-06-02 Invitrogen Corporation Activation and expansion of cells
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
ATE271066T1 (de) * 2000-05-26 2004-07-15 Bristol Myers Squibb Co Lösliche mutante ctla4 moleküle und deren verwendung
AU7541101A (en) * 2000-06-09 2001-12-24 Bristol Myers Squibb Co Methods for regulating a cell-mediated immune response by blocking lymphocytic signals and by blocking lfa-1 mediated adhesion
US20040034193A1 (en) * 2001-06-13 2004-02-19 Samy Ashkar Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor
US20050048614A1 (en) * 2000-06-13 2005-03-03 Children's Medical Center Corporation Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor
AU2001273174B2 (en) 2000-07-03 2006-05-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating rheumatic diseases using a soluble CTLA4 molecule
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
US6875904B2 (en) * 2000-09-20 2005-04-05 The Ohio State University Research Foundation Animal model for identifying agents that inhibit or enhance CTLA4 signaling
US7014998B2 (en) * 2000-09-30 2006-03-21 Yale University Screening immunomodulatory agents by CTLA-4 upregulation
US9249229B2 (en) * 2000-12-08 2016-02-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
JP4280803B2 (ja) * 2000-12-08 2009-06-17 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 慢性リンパ性白血病細胞株および抗体を産生するためのその使用
US7408041B2 (en) 2000-12-08 2008-08-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US20060057651A1 (en) * 2000-12-08 2006-03-16 Bowdish Katherine S Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US20040198661A1 (en) * 2000-12-08 2004-10-07 Bowdish Katherine S. Polypeptides and antibodies derived from chronic lymphocytic leukemia cells and uses thereof
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US7754208B2 (en) * 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) * 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
CA2436139A1 (en) * 2001-01-26 2002-08-01 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
TWI329129B (en) * 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
JP4499362B2 (ja) 2001-03-28 2010-07-07 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド ニューロパシーの疼痛を処置するためのニューブラスチンポリペプチドの使用
US20040058445A1 (en) * 2001-04-26 2004-03-25 Ledbetter Jeffrey Alan Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB
DE60225914T2 (de) 2001-05-23 2009-07-23 Bristol-Myers Squibb Co. Verfahren zum schützen eines allogenen inseltransplantats mit löslichen ctla4-mutationsmolekülen
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
US20030086940A1 (en) * 2001-08-10 2003-05-08 Cristina Costa Engineered recombinant molecule that regulates humoral and cellular effector functions of the immune system
US20040116675A1 (en) * 2001-12-14 2004-06-17 Tso J. Jun Silenced anti-cd28 antibodies and use thereof
US7858297B2 (en) * 2001-12-18 2010-12-28 Centre National De La Recherche Scientifique Cnrs Chemokine-binding protein and methods of use
CA2471777A1 (en) * 2001-12-18 2003-06-26 Endocube Sas Novel death associated proteins of the thap family and related par4 pathways involved in apoptosis control
US6578724B1 (en) * 2001-12-29 2003-06-17 United States Can Company Connector for use in packaging aerosol containers
AU2003219796A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Beth Israel Deaconess Medical Center Conjugates comprising a biodegradable polymer and uses therefor
US20030219436A1 (en) * 2002-03-15 2003-11-27 Ledbetter Jeffrey A. Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein
JP2005529873A (ja) * 2002-04-12 2005-10-06 メダレックス インコーポレイテッド Ｃｔｌａ−４抗体を使用した治療の方法
JP2005533015A (ja) * 2002-05-02 2005-11-04 ユニバーシティー オブ コネティカット ヘルス センター 抗体療法の有効性を増強するための熱ショックタンパク質の使用
WO2004034995A2 (en) * 2002-10-15 2004-04-29 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods and reagents for inducing immunity
WO2004058800A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
AU2003303394B2 (en) * 2002-12-23 2009-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Product quality enhancement in mammalian cell culture processes for protein production
ES2450115T3 (es) 2003-01-31 2014-03-24 Biogen Idec Ma Inc. Conjugados poliméricos de neublastina mutada
GB0303663D0 (en) * 2003-02-18 2003-03-19 Lorantis Ltd Assays and medical treatments
US7960355B2 (en) * 2003-05-23 2011-06-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7897582B2 (en) * 2003-05-23 2011-03-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6971600B2 (en) * 2003-06-30 2005-12-06 Heligear Engineering (H.K.) Co., Ltd. Oscillation mechanism for fishing reel
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
EP1670499A4 (en) * 2003-08-04 2009-07-22 Bristol Myers Squibb Co METHODS OF TREATING A CARDIOVASCULAR DISEASE USING A SOLUBLE CTLA4 MOLECULE
AU2004287431B2 (en) * 2003-10-27 2010-03-11 Amgen Inc. Compositions and methods to modulate an immune response to an immunogenic therapeutic agent
US20080152655A1 (en) * 2004-09-08 2008-06-26 The Ohio State University Research Foundation Combination Therapy With Anti-Ctla4 and Anti-4-1BB Antibodies
EP1793858A4 (en) * 2004-09-08 2008-12-10 Univ Ohio State Res Found HUMAN MONOCLONAL ANTI-CTLA4 ANTIBODIES FOR CANCER TREATMENT
GB0421465D0 (en) * 2004-09-27 2004-10-27 Chiron Srl Group A streptococcus protein
JP2008535841A (ja) * 2005-04-06 2008-09-04 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー 可溶性ｃｔｌａ４変異分子によるグラフト移植に関連する免疫不全の治療方法
AU2006267090B2 (en) 2005-07-11 2013-03-07 Provention Bio, Inc. Methods for the treatment of autoimmune disorders using immunosuppressive monoclonal antibodies with reduced toxicity
WO2007014278A2 (en) 2005-07-25 2007-02-01 Trubion Pharmaceuticals, Inc. B-cell reduction using cd37-specific and cd20-specific binding molecules
JP4899083B2 (ja) * 2005-08-29 2012-03-21 Ｓｍｃ株式会社 減速比自動切換装置
WO2007056466A2 (en) * 2005-11-08 2007-05-18 Avi Biopharma, Inc. Immunosuppression compound and treatment method
AU2013202533B2 (en) * 2005-11-08 2015-11-12 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunosuppression Compound and Treatment Method
US8501704B2 (en) 2005-11-08 2013-08-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Immunosuppression compound and treatment method
EP1954311A4 (en) 2005-12-07 2009-12-23 Medarex Inc CTLA-4 ANTIBODY DOSAGE ESCALATION THERAPY
US10508144B2 (en) 2005-12-20 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Carbohydrate content of CTLA4 molecules
US8075884B2 (en) 2006-01-12 2011-12-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to OX-2/CD200 and uses thereof
EP1996716B1 (en) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
US7528111B2 (en) * 2006-05-12 2009-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Method of vaccinating subjects receiving immune modulating therapy
WO2007146968A2 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
BRPI0713426A2 (pt) 2006-06-14 2012-10-09 Macrogenics Inc métodos de tratar, diminuir a progressão, ou melhorar um ou mais sintomas de um distúrbio, e de prevenir ou retardar o inìcio de um distúrbio
MX2010000979A (es) * 2007-07-25 2010-03-26 Alexion Pharma Inc Metodos y composiciones para tratar enfermedad autoinmune.
EP2197491A4 (en) 2007-09-04 2011-01-12 Univ California HIGHAFFINE ANTI-PROSTATE STEM CELL ANTIGEN (PSCA) ANTIBODIES TO CANCER AND TO THE DETECTION OF CANCER
CN103172750B (zh) 2007-11-01 2014-12-10 安斯泰来制药有限公司 免疫抑制性多肽与核酸
CN102099377A (zh) 2008-04-11 2011-06-15 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd37免疫治疗剂及其与双功能化学治疗剂的联合
US7915222B2 (en) 2008-05-05 2011-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis
KR20170091801A (ko) 2008-10-02 2017-08-09 압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨 Ｃｄ86 길항제 다중-표적 결합 단백질
JP2012508774A (ja) * 2008-11-13 2012-04-12 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー Ｃｄ３７免疫治療薬併用療法およびその使用
WO2011020024A2 (en) * 2009-08-13 2011-02-17 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
US9540426B2 (en) * 2009-10-06 2017-01-10 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
EP2949671A1 (en) 2009-10-12 2015-12-02 Pfizer Inc Cancer treatment
TW201134481A (en) 2010-03-12 2011-10-16 Abbott Biotherapeutics Corp CTLA4 proteins and their uses
CA2812057A1 (en) 2010-09-28 2012-04-05 Kahr Medical Ltd. Compositions and methods for treatment of hematological malignancies
WO2013010537A1 (en) 2011-07-20 2013-01-24 Aarhus Universitet Method of treating morphea
US9758566B2 (en) 2012-03-29 2017-09-12 The General Hospital Corporation Recombinant cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4)
WO2013169971A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Bristol-Myers Squibb Company Anti-tumor antibodies as predictive or prognostic biomarkers of efficacy and survival in ipilimumab-treated patients
PL3207938T3 (pl) 2012-05-11 2020-07-13 Medimmune Limited Warianty CTLA-4
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
KR20150033703A (ko) 2012-06-27 2015-04-01 오르반 바이오테크 엘엘씨 당뇨병 치료를 위한 ctla4 융합 단백질
US20140112958A1 (en) 2012-10-24 2014-04-24 Mwm Biomodels Gmbh Pancreatic islets of transgenic LEA29Y animals for treating diabetes
WO2014138188A1 (en) 2013-03-07 2014-09-12 The General Hospital Corporation Human ctla4 mutants and use thereof
EP3049442A4 (en) 2013-09-26 2017-06-28 Costim Pharmaceuticals Inc. Methods for treating hematologic cancers
EP2883883A1 (en) 2013-12-16 2015-06-17 Cardio3 Biosciences S.A. Therapeutic targets and agents useful in treating ischemia reperfusion injury
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
AU2015314756A1 (en) 2014-09-13 2017-03-16 Novartis Ag Combination therapies of alk inhibitors
PL3240801T3 (pl) 2014-12-31 2021-06-14 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Skojarzona immunoterapia nowotworów
US11319359B2 (en) 2015-04-17 2022-05-03 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
CN108367004B (zh) 2015-09-21 2022-09-13 阿帕特夫研究和发展有限公司 Cd3结合多肽
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
CN116440257A (zh) 2017-02-28 2023-07-18 百时美施贵宝公司 具有增强的adcc的抗ctla-4抗体增强对疫苗的免疫应答的用途
JP2020515637A (ja) 2017-04-03 2020-05-28 オンコロジー、インコーポレイテッド 免疫腫瘍剤を伴うｐｓ標的化抗体を用いる癌の治療方法
US11761963B2 (en) 2017-09-27 2023-09-19 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Biomarker signature for predicting tumor response to anti-CD200 therapy
CA3077509A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Alpine Immune Sciences, Inc. Ctla-4 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3617230A1 (en) 2018-09-03 2020-03-04 BioInvent International AB Novel antibodies and nucleotide sequences, and uses thereof
SG11202104337PA (en) 2018-11-26 2021-05-28 Massachusetts Inst Technology Compositions and methods for immune tolerance
KR20220101167A (ko) 2019-11-21 2022-07-19 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 무표지 n-글리칸 정량화 방법
CA3207134A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Jeffrey A. Ledbetter Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods
GB202115803D0 (en) 2021-11-03 2021-12-15 Ducentis Biotherapeutics Ltd Novel proteins
WO2023214387A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Ducentis Biotherapeutics Limited Novel cd200 fusion proteins
WO2023214388A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Ducentis Biotherapeutics Limited Novel cd200 fusion proteins
CN114686427B (zh) * 2022-05-23 2022-07-29 中国人民解放军总医院第一医学中心 一种脾脏调节型b淋巴细胞及其制备方法与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences

Also Published As

Publication number Publication date
LU91375I2 (fr) 2008-01-07
JPH06508989A (ja) 1994-10-13
NZ243286A (en) 1996-03-26
NO2007013I1 (no) 2007-11-26
NO934801D0 (no) 1993-12-23
PT100637A (pt) 1994-05-31
NO318806B1 (no) 2005-05-09
JP2003096097A (ja) 2003-04-03
ES2123001T3 (es) 1999-01-01
JP2003174872A (ja) 2003-06-24
FI20022285A (fi) 2002-12-30
FI935795A (fi) 1993-12-22
IL159364A0 (en) 2004-06-01
NZ264712A (en) 1996-03-26
CA2110518A1 (en) 1993-01-07
WO1993000431A1 (en) 1993-01-07
NO20020491L (no) 1994-02-21
EP0606217B1 (en) 1998-09-02
IL102294A (en) 2004-09-27
NO2012001I1 (no) 2012-01-09
ATE170562T1 (de) 1998-09-15
JP2003012546A (ja) 2003-01-15
IE922111A1 (en) 1992-12-30
NO20020491D0 (no) 2002-01-30
NO2012001I2 (no) 2016-02-29
JP3722375B2 (ja) 2005-11-30
AU661854B2 (en) 1995-08-10
DE69226871D1 (de) 1998-10-08
NO312465B1 (no) 2002-05-13
ES2123001T5 (es) 2009-04-16
IL159364A (en) 2005-08-31
NO934801L (no) 1994-02-21
US5434131A (en) 1995-07-18
DK0606217T3 (da) 1998-11-09
NL300303I2 (nl) 2008-01-02
JP2002003399A (ja) 2002-01-09
PT100637B (pt) 1999-06-30
IL102294A0 (en) 1993-01-14
KR940701445A (ko) 1994-05-28
EP0606217A1 (en) 1994-07-20
IL162430A0 (en) 2005-11-20
ZA924782B (en) 1993-12-27
DE69226871T3 (de) 2009-09-24
EP0606217B2 (en) 2008-12-03
MX9203605A (es) 1993-11-01
DE122007000078I1 (de) 2008-02-14
JP4159266B2 (ja) 2008-10-01
DK0606217T4 (da) 2009-03-30
CA2580812A1 (en) 1993-01-07
JP2002017349A (ja) 2002-01-22
FI115057B (fi) 2005-02-28
CA2110518C (en) 2007-05-22
DE122007000078I2 (de) 2011-01-13
KR100238712B1 (ko) 2000-01-15
AU2240092A (en) 1993-01-25
NL300303I1 (nl) 2008-01-02
FI935795A0 (fi) 1993-12-22
NO2007013I2 (no) 2011-02-21
DE69226871T2 (de) 1999-05-12
IE20010097A1 (en) 2002-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI112082B (fi) Menetelmiä eristetyn CTLA4-reseptorin ja sen johdannaisten, niitä sisältävien tuotteiden ja CTLA-reseptorin tunnistavien vasta-aineiden valmistamiseksi, menetelmissä käyttökelpoisia nukleiinihapposekvenssejä, plasmideja ja isäntäsoluja sekä niiden käyttötapoja
CA2113744C (en) Methods for regulating the immune response using ctla4-binding molecules and il4-binding molecules
FI120041B (fi) Liukoisia CTLA4-molekyyleja ja niiden käyttöjä
US5977318A (en) CTLA4 receptor and uses thereof
US5844095A (en) CTLA4 Ig fusion proteins
US7572772B2 (en) Soluble CTLA4 mutant molecules

Legal Events

Date Code Title Description
SPCF Supplementary protection certificate application filed

Spc suppl protection certif: L20070034

SPCG Supplementary protection certificate granted

Spc suppl protection certif: SPCG

Extension date: 20171216

MA Patent expired