NO318806B1 - Opploselig CTLA4-molekyl, CTLA4Ig-fusjonsprotein, anvendelse og fremgangsmate for fremstilling derav samt farmasoytisk sammensetning, isolert nukleinsyremolekyl, plasmid, vertsvektorsystem, monoklonalt antistoff og in vitro fremgangsmate for regulering av funksjonelle CTLA4 positive T-celle interaksjoner med B7 positive celler. - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen identifiserer CTLA4-reseptoren som en ligand for B7-antigenet. Den fullstendige aminosyresekvensen som koder for humant CTLA4-reseptorgen, er beskrevet. Det presenteres fremgangsmåter for å uttrykke CTLA4 som et immunoglobulinfusjonsprotein, for å fremstille hybrid-CTLA4-fusjonsproteiner, og for å anvende de løselige fusjonsproteinene, fragmenter og derivater herav, inklusive monoklonale antistoffer som reagerer med B7 og CTLA4, for å regulere T-cellereaksjoner og immunsvar betinget av slike reaksjoner.

Description

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører oppløselig CTL4A-molekyl, CTLA4Ig fusjonsprotein, anvendelse og fremgangsmåte for fremstilling derav samt farmasøytisk sammensetning, isolert nukleinsyremolekyl, plasmid, vertsvektorsystem, monoklonalt antistoff og in vitro fremgangsmåte for regulering av funksjonelle CTLA4 positive T-celle-interaksjoner med B7 positive celler.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Fundamentet i det vertebrate immunsystem er evnen til å adskille "selv" fra "ikke-selv" (fremmed). Denne evne har ledet til utvikling av et system som krever mange signaler for å oppnå optimal immunaktivering (Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54:1-14 (1989)). T-celle-B-cellereaksjoner er vesentlige for immunsvaret. Mengden av mange nøkkelmolekyler som finnes på T-celler og B-celler, øker under et immunsvar (Springer et al., (1987), supra; Shaw og Shimuzu, Current Opinion in Immunology, Eds. Kindt og Long, L.92-97 (1988); og Hemler, Immunology Today 9:109-113 (1988)). Økede mengder av disse molekylene kan forklare hvorfor aktiverte B-celler er mer effektive til å stimulere antigenspesifikk T-celledeling enn det hvilende B-celler er (Kaiuchi et al., J. Immunol. 131:109-114 (1983); Kreiger et al., J. Immunol. 135:2937-2945 (1985); McKenzie, J. Immunol. 141:2907-2911 (1988); og Hawrylowicz ogUnanue, J. Immunol. 141:4083-4088

(1988)).

Utviklingen av et T-lymfocytt- ("T-celle") immunsvar har et komplekssvar som omfatter celle-celle-reaksjoner (Springer et al., A. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987)), spesielt mellom T- og hjelperceller slik som B-celler, og produksjon av løselige immun-forbindelser (cytokiner eller lymfokiner) (Dinarello og Mier, New Engl. Jour. Med. 317:940-945 (1987)). Dette svar reguleres av flere T-celleoverflatereseptorer, deriblant T-celle-reseptorkomplekset (Weiss et al., Ann. Rev. Immunol. 4:593-618 (1986) og andre "tilleggs"-overflatemolekyler (Springer et al., (1987) supra). Mange av disse tilleggs-molekylene er naturlig forekommende celleoverflatedifferensierings- (CD) antigener som defineres ved hjelp av reaktiviteten overfor monoklonale antistoffer på celleoverflaten (McMichael, Ed., Leukocyte Typing m, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y. (1987)).

Antigen-uavhengige intercellulære reaksjoner som omfatter lymfocytt-tilleggsmolekyler, er vesentlige for et immunsvar (Springer et al., (1987), supra). F.eks., binding av T-celleforbundet protein, CD2, til dets ligand LFA-3, som er et generelt uttrykt glykoprotein (oversikt finnes i Shaw og Shimuzu, supra), er viktig for å optimalisere antigenspesifikk T-celleaktivering (Moingeon et al., Nature 339:314 (1988)). Et annet viktig adhesjonssystem omfatter binding av LFA-l-glykoprotein som finnes på lymfocytter, makrofager og granulocytter (Springer et al., (1987),supra; Shaw og Shimuzu (1988), supra) til sine ligander i ICAM-1 (Makgoba et al., Nature 331:86-88 (1988)) og ICAM-2 (Staunton et al., Nature 339:61-64 (1989)). T-celletilleggsmolekylene CD8 og CD4, forsterker T-celle-binding ved å reagere med henholdsvis MHC klasse I- (Norment et al., Nature 336:79-81

(1988)) og klasse II- (Doyle og Srrominger, Nature 330:256-259 (1987)) molekyler. "Homing receptors" ("hjemstavnsreseptorer") er viktige for å kontrollere lymfocyttvandring (Stoolman, Cell 56:907-910 (1989)). VLA-glykoproteinene er integriner som tilsynelatende formidler lymfocyttfunksjoner som krever binding (adhesjon) til ekstracellulære matriks-komponenter (Hemler, supra). CD2/LFA-3-, LFA-l/ICAM-1- og ICAM-2- adhesjonssystemer er fordelt på en lang rekke ulike celletyper (Springer et al., (1987), supra; Shaw og Shimuzu, (1988), supra og Hemler, (1988), supra).

Det ble foreslått for mange år siden at B-lymfocyttaktivering krever to signaler (Bretscher og Cohn, Science 169:1042-1049 (1970)), og nå antas det at alle lymfocytter krever to signaler for deres optimale aktivering, et antigenspesifikt eller klonalt signal, i tillegg til et annet, antigen-ikke-spesifikt signal (Janeway, supra). Freeman et al., J. Immunol. 143(8):2714-2722 (1989)) isolerte og sekvenserte en cDNA-klon som kodet for et B-celleaktiveringsantigen som ble gjenkjent av mAb B7 (Freeman et al., J. Immunol. 138:3260 (1987)). COS-celler som var transfekterte med dette cDNA, er vist å bli farget av både merket mAb B7 og mAb BB-1 (Clark et al., Human Immunol. 16:100-113 (1986); Yokochi et al., J. Immunol. 128:823 (1981); Freeman et al., (1989), supra; og Freeman et al.,

(1987), supra)). I tillegg, ekspresjon av dette antigenet er blitt påvist på andre cellelinjer, slik som monocytter (Freeman et al., supra).

Signalene som kreves for et T-hjelpercelle- (Th) antigensvar, gis av antigen-presenterende celler (APC). Det første signalet startes ved at T-cellereseptorkomplekset reagerer (Weiss, J. Clin. Invest. 86:1015 (1990)) med antigenet tilstede i sammenheng med klasse O-sterke vevsforlikelighets-(MHC) molekyler på APC (Allen, Immunol. Today 8:270 (1987)). Dette antigenspesifikke signal er ikke tilstrekkelig til å gi et fullt svar, og i fravær av et annet signal, kan det i virkeligheten føre til klonal inaktivering eller anergi (Schwartz, Science 248:1349 (1990)). Kravet for et annet "medstimulerende" signal som gis av MHC, er vist i en rekke eksperimentelle systemer (Schwartz, supra; Weaver og Unanue, Immunol. Today 11:49 (1990)). Den molekulære natur til disse andre signal(er) er ikke helt forstått, skjønt det er klart at i noen tilfeller kan både løselige molekyler, slik som interleukin (IL)-1 (Weaver og Unanue, supra) og membranreseptorer innenfor intercellulær adhesjon (Springer, Nature 346:425 (1990), gi samtidig stimulerende signaler.

CD28-antigen, et homodimert glykoprotein av immunoglobulingsuperfamilien (Aruffo og Seed, Proe. Nati. Acad. Sei. 84:8573-8577 (1987)), er et tilleggsmolekyl funnet på de fleste modne humane T-celler (Damle et al., J. Immunol. 131:2296-2300 (1983)). Nye holdepunkter antyder at dette molekylet fungerer i en alternativ T-celle-aktiverings-reaksjonsvei som er forskjellig fra den igangsatt av T-cellereseptorkomplekset (June et al., Mol. Cell. Biol. 7:4472-4481 (1987)). Monoklonale antistoffer (mAbs) som reagerer med CD28-antigen, kan øke T-cellesvarene som er startet opp av ulike polyklonale signaler (oversikt ved June et al., supra). Disse stimulerende virkninger kan være et resultat av mAb-stimulert cytokin-produksjon (Thompson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 86:1333-1337

(1989); og Lindsten et al., Science 244:339-343 (1989)) som en følge av øket mRNA-stabilisering (Lindsten et al., (1989), supra). Anti-CD28-mAbs kan også ha hemmende virkninger, dvs. de kan blokkere autologe blandede lymfocyttreaksjoner (Damle et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 78:5096-6001 (1981)) og aktivering av antigenspesifikke T-celle-kloner (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 16:1289-1296 (1986)).

Studier har vist at CD28 er en mot-reseptor for B-celle-aktiveringsantigenet, B7/BB-1 (Linsley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:5031-5035 (1990)). For enkelthets skyld blir B7/BB-l-antigenet heretter referert til som "B7-antigenet". Reaksjoner mellom CD28 og B7-antigenet har blitt karakterisert ved bruk av genetiske fusjoner mellom de ekstracellulære delene til B7-antigenet og CD28-reseptoren, og immunoglobulin (lg) CTl (konstant region tunge kjeder) (Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)). Immobilisert B7Ig-fusjonsprotein, så vel som B7-positive CHO-celler, er vist å stimulere sammen T-celledeling. T-cellestimulering med B7-positive CHO-celler stimulerer også spesifikt til økede transkriptnivåer for IL-2. Ytterligere studier har vist at anti-CD28-mAb hemmet IL-2-produksjon utløst i visse T-celle-leukemicellelinjer ved cellulær reaksjon med en B-celle-leukemilinje (Kohno et al., Cell. Immunol. 131:1-10 (1990)).

CD28 har en enkel ekstracellulær variabel region (V)-lignende område (Aruffo og Seed, supra). Et homologt molekyl, CTLA4, har blitt identifisert ved differensiell under-søkelse av et gnagercytolytisk T-celle-cDNA-bibliotek (Brunet et al., Nature 328:267-270

(1987)). Transkripter for dette molekylet er funnet i T-cellepopulasjoner som har cytotoksisk aktivitet, hvilket antydet at CTLA4 kan fungere i det cytolytiske svaret (Brunet et al., supra; og Brunet et al., Immunol. Rev. 103:21-36 (1988)). Forskere har rapportert kloning og beskrivelse av et gen for den menneskelige motpart til CTLA4 (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)) lokalisert til det samme kromosomområdet (2q33-34) som CD28 (Lafage-Pochitaloff et al., Immunogenetics 31:198-201 (1990)). Sekvens-sammenligning mellom dette humane CTLA4-DNA og det som koder for CD28-proteiner, viser betydelig sekvenshomologi, med den største homologi i de membrannære og cytoplasmatiske områdene (Brunet et al., 1988, supra; Dariavach et al., 1988, supra).

Den høye homologigrad mellom CD28 og CTLA4, sammen med samlokalisering av deres gener, stiller spørsmål med hensyn til om disse molekylene også er funksjonelt beslektet. Imidlertid, siden proteinproduktet til CTLA4 ikke ennå er blitt uttrykt på en vellykket måte, forblir disse spørsmålene ubesvart.

Dariavach et al. beskriver det humane CTLA4-genet isolert fra et genombibliotek. Den antatte proteinsekvensen til den ekstracellulære domenen av CTLA4 i Dariavach et al. og den ekstracellulære domenen til det krevde proteinet er forskjellige når det gjelder en enkelt aminosyre. Deriavach beskriver aminosyren alanin i posisjon 111, mens foreliggende oppfinnelse beskriver treonin i posisjon 111 og dette treoninet er del av et nylig identifisert N-koblet glykosyleirngssete.

Linsley et al. beskriver at CD28 er den primære reseptor for B7 på aktivert perifert blod-T-celle, at CD28 bindes til B7 i fravær av andre tilleggsmolekyler og at interaksjonen mellom CD28 og B7 er ko-simulatoriosk for T-celleaktivering.

Ekspresjon av løselige derivater av celleoverflateglykoproteiner i immunoglobulin-gensuperfamilien er oppnådd for CD4, reseptoren for HIV-1, og CD28 og B7-reseptorene, ved bruk av hybridfusjonsmolekyler som består av DNA-sekvenser som koder for aminosyrene som svarer til deler av det ekstracellulære området til CD4-reseptoren, koblet til antistoff-områdene (immunoglobulin Tl (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989) (CD4) og Linsley et al., J. Eksp. Med., supra (CD28 og B7)).

Det ville være nyttig å oppnå ekspresjon av et løselige proteinprodukt til det hittil ikke uttrykte CTLA4-genet, og å identifisere en naturlig ligand for CTLA4 som er involvert i funksjonelle svar til T-celler. Det løselige proteinproduktet kunne så benyttes for å regulere T-celleresponsen in vivo for å behandle patologiske tilstander.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Følgelig vedrører den foreliggende oppfinnelse oppløselig CTLA4 molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter den ekstracellulære domenen av CTLA4, eller fragment eller derivat derav, som binder et B7 antigen uttrykt på aktiverte B celler. Denne oppfinnelse frembringer også oppløselig CTLA4Ig molekyl ifølge krav 1, kjennetegnet ved at det oppløselige CTLA4 molekylet er et CD28IG/CTLA4Ig fusjonsproteinhybrid som binder B7 antigenet, idet nevnte fusjonshybrid omfatter en første aminosyresekvens som tilsvarer en del av den ekstracellulære domenen av CD28 reseptor fusjonert til en andre aminosyresekvens som tilsvarer en del av den ekstracelluære domenen av CTLA4 reseptoren og en tredje aminosyresekvens som tilsvarer hengsel, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin. Andre utførelsesformer av oppfinnelsen omfatter videre farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter hvilke som helst av sammensetningene i kravene 1, 2,3,4,6, 7 eller 9, og en akseptabel farmasøytisk bærer.

Også beskrevet er anvendelse av hvilke som helst av sammensetningene ifølge kravene 1, 2,3,4,6, 7 eller 9, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning.

Det er videre beskrevet anvendelse av det oppløselige CTLA4 molekylet ifølge krav 1, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling immunsystemsykdommer mediert av T-celleinteraksjoner med B7 positive celler, hvori proteinet er

a) et fusjonsprotein reaktivt med B7 antigen med en første aminosyresekvens som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresider som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin

Cyl,

b) et fusjonsprotein reaktivt med B7 antigen som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den

ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regionene av humant immunoglobulin Cyl,

c) et hybrid fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigen som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som

tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin

Cyl, eller

d) kodet av en DNA sekvens med ATCC nr. 68629.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av det oppløselige CTLA4

molekylet ifølge krav 1, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, idet det opp-løselige CTLA4 molekylet er nyttig for regulering av CTLA4 positive T-celle-interaksjoner med B7 positive celler, hvor liganden er

a) et oppløselig CTLA4 molekyl ifølge krav 2,

b) et fusjonsprotein som inneholder minst en del av den ekstracellulære domenen av

CTLA4,

c) et fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigenet som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som

tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin Cyl,

d) et fragment eller derivat av et fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigenet som har en første aminosyresekvens som tilsvarer den ekstracellulære domenen av

CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og

CH3 regioner av humant immunglobulin Cyl,

e) et fragment eller derivat av et fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigenet som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant

immunoglobulin Cyl,

f) et fragment eller derivat av et fusjonsprotein som koder for en DNA sekvens med

ATTC nr. 68629, eller

g) et hybrid fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigenet som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som

tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin Cyl.

Det er også beskrevet anvendelse av minst et monoklonalt antistoff som er spesifikt reaktivt med fusjonsproteinet ifølge krav 7 eller 9, som omfatter en aktiv bindende region som er reaktiv med den ekstracellulære domenen av en CTLA4 reseptor for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av autoimmunitet, transplantasjon, infeksiøse sykdommer eller neoplasi.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også isolert nukleinsyremolekyl, kjennetegnet ved at det koder for CTLA4 ifølge krav 1,2 eller 3.

Det er også beskrevet et plasmid, kjennetegnet ved at det omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.

Oppfinnelsen vedrører også vertsvektorsystemet, kjennetegnet ved at det omfatter et plasmid ifølge krav 22 i en egnet vertscelle.

Videre omfatter oppfinnelsen fremgangsmåte for fremstilling av et oppløselig CTLA4 molekyl, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av vertsvektorsystemet ifølge krav 23, for å produsere det oppløselige CTLA4 molekylet i verten og isolering av oppløselig CTLA4 molekyl som dermed blir produsert.

Det er videre beskrevet monoklonalt antistoff, kjennetegnet ved at det gjenkjenner og binder den ekstracellulære domenen av CTLA4 hvori nevnte binding forhindrer binding av CTLA4 til B7 antigenet.

Oppfinnelsen omfatter videre faramsøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter hvilke som helst av kravene 26-27 og en akseptabel farmasøytisk bærer.

Det er også beskrevet anvendelse av hvilke som helst av sammensetningene ifølge kravene 26-27, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning.

Videre beskriver foreliggende oppfinnelse anvendelse av det monoklonale antistoffet reaktivt med CTLA4 ifølge krav 26, eller et fragment derav, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning.

Det er også beskrevet anvendelse av minst et monoklonalt antistoff ifølge krav 26, som er spesifikt reaktivt med et CTLA4 fusjonsprotein, idet nevnte antistoff omfatter en aktiv bindende region som er reaktiv med den ekstracellulære domenen av CTLA4, omfattende en aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 125 og aminosyreresidiet treonin i posisjon 111, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av autoimmunitet, transplantasjon, infeksiøse sykdommer eller neoplasi.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av et monoklonalt antistoff, Fab eller F(ab').sub.2 fragmenter reaktive med CTLA4, for fremstilling en farmasøytisk sammensetning for å inhibere interaksjonen av CTLA4 positive T-celler og B7 positive B-celler og dermed regulere CTLA4 positive T-celleinteraksjoner med B7 positive B-celler.

Oppfinnelsen omfatter videre fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning nyttig for behandling av immunsystemforstyrrelser mediert av T-celle-interaksjoner med B7 positive celler, kjennetegnet ved at den omfatter sammenblanding av et protein ifølge kravene 1, 2,3,4,7, 8,9,26 eller 27 med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Det er også beskrevet in vitro fremgangsmåte for regulering av funksjonelle CTLA4 positive T-celle-interaksjoner med B7 positive celler, kjennetegnet ved at den omfatter kontakt med B7 positive celler med et ligand for B7 antigen, i en mengde som er effektiv for å interferere med reaksjonen av endogent B7 antigen med CTLA4.

Videre er det beskrevet anvendelse av en ligand for CTLA4, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for regulering av CTLA4 positive T-celleinteraksjoner med andre celler.

Foreliggende oppfinnelse beskriver videre anvendelse av en ligand for B7 antigenet, i en mengde som er effektiv for å interferere med reaksjonen av endogent B7 antigen med CTLA4, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning hvori nevnte B7 ligand er

a) et fusjonsprotein som inneholder en del av den ekstracellulære domenen av

CTLA4, idet delen binder B7,

b) et CTLA4Ig fusjonsprotein som inneholder en første aminosyresekvens inneholdende aminosyre residiene fra posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyresekvens residier tilsvarende hengselsregioner, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin, c) et CD28Ig/CTLA4Ig fusjonsprotein hybrid inneholdende en første aminosyresekvens tilsvarende en del av den ekstracellulære domenen av CD28 reseptoren, idet delen binder B7, fusjonert til en annen aminosyre sekvens tilsvarende en del av den ekstracellulære domenen av CTLA4 reseptoren, idet delen binder B7, og en tredje aminosyre sekvens som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regionene

av humant immunoglobulin, eller

d) et oppløselig CTLA4 molekyl.

Det humane CTLA4-reseptorproteinet ifølge oppfinnelsen, kodes for av 187 aminosyrer og omfatter et nylig identifisert N-bundet glykosyleirngssete.

CTLA4Ig-fusjonsproteinet ifølge oppfinnelsen, binder B7-antigenet som uttrykkes på aktiverte B-celler, og andre cellelinjer, en ligand for CD28-reseptoren på T-celler. CTLA4Ig binder B7-antigenet med betydelig høyere affinitet enn B7-binding til CD28-reseptoren. CTLA4Ig-konstruksjonen har en første aminosyresekvens som svarer til det ekstracellulære området til CTLA4-reseptoren, koblet til en annen aminosyresekvens som korresponderer til det humane Ig-CT-området. Den første aminosyresekvensen inneholder aminosyrerester fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 125 i aminosyresekvensen som svarer til det ekstracellulære området i CTLA4, koblet til en annen aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene som svarer til hengslet, CH2 og CH3-områdene i human IgCyl. Fusjonsproteinet fremstilles fortrinnsvis i dimer form. Løselig CTLA4Ig er en sterk hemmer in vi tro av T og B-lymfocyttsvar.

Også omfattet av oppfinnelsen er hybridfusjonsproteiner, slik som CD28Ig/ CTLA4Ig-fusjonsproteiner som har en første aminosyresekvens som korresponderer til fragmenter i det ekstracellulære området i CD28, koblet til en annen aminosyresekvens som svarer til fragmenter fra det ekstracellulære området i CTLA4Ig, og en tredje aminosyresekvens som svarer til hengslet, CH2 og CH3-områdene i det humane IgCyl. En utførelsesform av hybridfusjonsproteinene er en CD28Ig/CTLA4Ig-fusjonskonstruksjon som har en første aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 94 i aminosyresekvensen som svarer til det ekstracellulære området i CD28, koblet til en annen aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene fra omtrent posisjon 94 til omtrent posisjon 125 i aminosyresekvensen som svarer til det ekstracellulære området i CTLA4, koblet til en tredje aminosyresekvens som inneholder amino-syrerestene som korresponderer til hengslet, CH2 og CH3-områdene i human IgCyl.

T-cellereaksjoner med andre celler kan reguleres ved å hemme reaksjonen til CTLA4-positive T-celler med B7-positive celler, ved å reagere T-cellene med ligander for CTLA4-reseptoren. Ligandene omfatter B7Ig-fusjonsprotein, et monoklonalt antistoff som reagerer med CTLA4-reseptoren, og antistoff-fragmenter.

T-cellereaksjoner med B7-positive celler kan reguleres ved bruk av en ligand for B7-antigenet. En slik ligand er CTLA4Ig-fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen, dets fragmenter eller derivater, CD28Ig/CTLA4Ig-fusjonsproteinhybrid, eller et monoklonalt antistoff som reagerer med B7-antigenet.

Immunsystemsykdommer som er formidlet av T-celle-reaksjoner med B7-positive celler kan behandles ved å tilføre en ligand som reagerer med B7-antigenet for å regulere T-cellereaksjoner med B7-positive celler. Liganden er CTLA4Ig-fusjonsproteinet, eller CD28Ig/CTLA4Ig-fusjonsproteinhybridet, eller et monoklonalt antistoff som reagerer med B7-antigen.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Fig. 1 er et diagram over CTLA4Ig-fusjonskonstruksjonene som beskrevet i eksempel 2, infra. Fig. 2 er et fotografi av en gel fra SDS-PAGE-kromatografisk opprensning av CTLA4Ig, som beskrevet i eksemel 2, infra. Fig. 3 viser den fullstendige aminosyresekvensen som koder for human CTLA4-reseptor (SEQ ID NOs: 13 og 14), koblet til onkostatin M-signalpeptidet (posisjon -25 til -1), og omfattende det nylig identifiserte N-koblede glykosyleringssetet (posisjon 109-111), som beskrevet i eksempel 3, infra. Fig. 4 viser resultatene av FACSR-analyse av binding mellom B7Ig-fusjonsproteinet og CD28- og CTLA4-transfekterte COS-celler, som beskrevet i eksempel 4, infra. Fig. 5 viser resultatene av FACSR-analyse når det gjelder bidning av renset CTLA4Ig til B7-antigen-positive (B7<*>) CHO-celler og til en lymfoblastoid cellelinje (PM LCL), som beskrevet i eksempel 4, infra. Fig. 6 er en figur som illustrerer konkurrerende bindingsanalyse mellom 1251-merket B7Ig til immobilisert CTLA4Ig, som beskrevet i eksempel 4, infra. Fig. 7 er en tegning som viser resultatene av Scatchard-analyse av B7Ig-binding til immobilisert CTLA4Ig, som beskrevet i eksempel 4, infra. Fig. 8 er et fotografi av en gel fra SDS-PAGE-kromatografi etter immunpresipitasjonsanalyse av B7-positive COS-celler og PM LCL-celler overflatemerket med 1251, som beskrevet i eksempel 4, infra. Fig. 9 er en tegning som viser virkningene av CTLA4Ig på deling av T-celler som målt ved [3H]-tymidin-innbygging, som beskrevet i eksempel 4, infra. Fig. 10 er et søylediagram som illustrerer virkningene til CTLA4Ig på hjelper-T-celle- (Th) stimulert immunoglobulin-sekresjon fra humane B-celler, som målt ved enzym-immunomåling (ELISA), som beskrevet i eksempel 4, infra.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

For at oppfinnelsen som her er beskrevet, kan bli mer fullstendig forstått, gis den følgende beskrivelse.

Den uttrykte CTLA4-reseptoren kan benyttes for å regulere cellulære reaksjoner, deriblant T-cellereaksjoner med B7-positive celler.

Den fullstendige og korrekte DNA-sekvens, som koder for aminosyresekvensen som svarer til det humane CTLA4-reseptorproteinet ble klonet ved bruk av PCR. cDNA som inneholder den fullstendige avledede kodende sekvensen til CTLA4, ble satt sammen fra to PCR-fragmenter som ble forøket fra H38 RNA, og satt inn i ekspresjonsvektoren, CDM8, som beskrevet i detalj i eksemplene, infra. Isolatene ble transfektert inn i COS-celler og undersøkt med tanke på binding av B7Ig, et løselig fusjonsprotein som har en aminosyresekvens som svarer til det ekstracellulære området i B7 og et humant immunoglobulin (lg) Cri-region, som beskrevet av Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991).

DNA-sekvensen fra ett isolat, betegnet som OMCTLA4, ble så bestemt og funnet å tilsvare nøyaktig den antatte humane CTLA4-sekvensen, koblet i N-terminus til signalpeptidet fra onkostatin M. CTLA4-reseptoren kodes for av 187 aminosyrer (utenom signalpeptidet og stoppkodonene) og omfatter et nylig påvist N-bundet glykosyleringssete i aminosyreposisjonen 109-111 (se fig. 3, infra). CTLA4-reseptoren uttrykkes ved bruk av onkostatin M-signalpeptidet.

I en annen foretrukket utførelsesform, blir de løselige formene av proteinproduktet til CTLA4-reseptorgenet (CTLA4Ig) utviklet ved bruk av fusjonsproteiner som har en første aminosyresekvens som svarer til det ekstracellulære området til CTLA4, og en annen aminosyresekvens som svarer til det humane IgCyl-området. Kloning og ekspresjonsplasmider (CDM8 og uLN) ble laget som inneholder cDNA'er som koder for deler av aminosyresekvensen som svarer til den humane CTLA4-reseptor, basert på cDNA-sekvensen beskrevet her, hvor cDNA som koder for en første aminosyresekvens, svarer til et fragment i det ekstracellulære område i CTLA4-reseptorgenet, koblet til DNA som koder for en annen aminosyresekvens som svarer til et IgC-område som tillater ekspresjon av CTLA4-reseptorgenet ved å endre løseligheten til det uttrykte CTLA4-proteinet. Således blir det løselige CTLA4Ig-fusjonsproteinet kodet for av en første aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 125 i aminosyresekvensen som svarer til det ekstracellulære område i CTLA4, koblet til en annen aminosyresekvens som inneholder amino-syrerestene som svarer til hengslet, CH2 og CH3-områdene i human IgCyl. Fusjonsproteinet blir fortrinnsvis fremstilt i dimer form. Konstruksjonen ble så transfektert inn i COS- eller CHO-celler, og CTLA4Ig ble renset og identifisert som en dimer.

DNA som koder for aminosyresekvensen som svarer til CTLA4Ig-fusjonsproteinet, er blitt deponert i American Type Culture Collection (ATCC) i Rockville, Maryland, under reglene til Budapest Treaty den 31. mai 1991, og er gitt ATCC-registreringsnummer: 68629.

Den foreliggende oppfinnelse gir det første proteinproduktet til CTLA4-transkripter i form av et løselig fusjonsprotein. CTLA4Ig-proteinene danner en disulfidbundet dimer med Mr på omtrent 50.000 subenheter, hvilket indikerer at naturlig CTLA4 sannsynligvis eksisterer på T-celleoverflaten som en disulfidbundet homodimer.

B7-antigenet er vist å være en ligand for CD28-reseptoren på T-celler (Linsley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, supra). CTLA4-reseptormolekylet synes funksjonelt og strukturelt å være beslektet med CD28-reseptoren; begge er reseptorer for B-celle-aktiveringsantigenet, B7, mens CTLA4 synes å ha en høyere affinitet for B7, blant de høyeste som hittil er referert for lymfoide adhesjonssystemer. CTLA4Ig ble imidlertid vist å binde sterkere til B7-positive (B7<*>) cellelinjer enn CD28Ig. Andre eksperimenter viste at CTLA4 er en høyere affinitetsreseptor for B7-antigenet enn CD28-reseptoren. I tillegg var CTLA4Ig vist å binde et enkelt protein på lymfoblastoide celler som ligner i størrelse på B7-antigenet. CTLA4Ig hemmet T-celledeling og hemmet Th-stimulert IgM-produksjon.

Hybridfusjonsproteiner som har aminosyresekvenser som svarte til fragmenter eller ulike reseptorproteiner ble laget. F.eks. aminosyresekvenser som svarte til utvalgte fragmenter i de ekstracellulære områdene i CD28 og CTLA4, ble bundet sammen til CD28Ig/CTLA4Ig-hybirdfusjonsproteiner. Således ble et CD28Ig/CTLA4Ig-fusjonsprotein laget som har en første aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene som svarer til et fragment fra det ekstracellulære område i CD28, koblet til en annen aminosyresekvens som svarer til et fragment fra det ekstracellulære område i CTLA4Ig, og til en tredje aminosyresekvens som svarer til hengslet, CH2 og CH3-områdene i human IgCyl. Én utførelsesform av hybridfusjonsproteinene er en CD28Ig/CTLA4Ig-fusjonskonstruksjon som har en første aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 94 i aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære område i CD28, koblet til en annen aminosyresekvens som inneholder aminosyrerestene fra omtrent posisjon 94 til omtrent posisjon 125 i aminosyresekvensen tilsvarende det ekstracellulære område i CTLA4, koblet til en tredje aminosyresekvens som svarer til hengslet, CH2 og CH3 -områdene i human IgCyl.

Fremgangsmåtene for å klone og uttrykke DNA-sekvenser som koder for aminosyresekvensene som svarer til CTLA4-reseptor-proteinet, løselige fusjonsproteiner og hybridfusjonsproteiner, f.eks. syntese av oligonukleotider, PCR, transformering av celler, konstruksjon av vektorer, ekspresjonssystemer og lignende, er vel etablert i feltet, og de fleste utøvere er velkjente med standardkildemateriale for spesifikke betingelser og fremgangsmåter. Imidlertid er de følgende kapitlene beskrevet av praktiske hensyn og modifiseringer er gitt der hvor det er nødvendig, og kan tjene som en rettesnor.

Kloning og ekspresjon av kodende sekvenser for reseptorer og fusjonsproteiner

Fusjonsproteinkonstruksjoner som svarer til CD28IgCyl og B7IgCyl for å karakterisere CTLA4Ig i den foreliggende oppfinnelse, og for fremstilling av CD28Ig/CTLA4Ig-fusjonshybrider, ble laget som beskrevet av Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991), herved inntatt som referanse. Alternativt kan cDNA-kloner fremstilles fra RNA som stammer fra celler som uttrykker B7-antigen og CD28-reseptor, basert på kunnskap fra de publiserte sekvensene til disse proteinene (Aruffo og Seed, og Freeman, supra) ved bruk av standardfremgangsmåter.

CTLA4Ig-fusjoner som består av DNA som koder for aminosyresekvenser som svarer til det ekstracellulære område i CTLA4 og hengslet, CH2 og CH3-områdene i human IgCyl, ble laget ved sammenbinding av PCR-fragmenter. cDNA som koder for aminosyresekvensene blir forøket ved bruk av polymerasekjedereaksjons- ("PCR") fremgangsmåten (se U.S. patent nr. 4.683.195 og 4.683.202 til Mullis et al. og Mullis & Faloona, Methods Enzymol. 154:335-350 (1987)). CTLA4Ig-fusjonspolypeptider ble isolert som hadde DNA-kodende aminosyresekvenser som inneholdt aminosyrerestene fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 125 i aminosyresekvensen som svarte til det ekstracellulære område i CTLA4, og DNA som kodet for aminosyresekvensene som svarte til hengslet, CH2 og CH3-områdene i IgCyl.

Fordi ekspresjon av CTLA4-reseptorproteinet i humane Iymfoide celler ikke tidligere var rapportert, var det nødvendig å lokalisere en kilde for CTLA4-mRNA. PCR-cDNA laget fra totalt cellulært RNA fra flere humane leukemicellelinjer, ble undersøkt, ved bruk av "primere", oligonukleotider fra den publiserte sekvensen til CTLA4-genet (Dariavach et al., supra). Av det cDNA som ble testet, ga H38-celler (en HTLVII-forbundet leukemilinje) det beste utbytte av PCR-produkter som hadde den forventede størrelsen. Siden et signalpeptid for CTLA4 ikke ble påvist i CTLA4-genet, ble N-terminus av den antatte sekvensen til CTLA4, koblet til signalpeptidet til onkostatin M (Malik et al., Molec. and Cell. Biol. 9:2847 (1989) i to trinn ved bruk av oligonukleotider som beskrevet i eksemplene, infra. Produktet i PCR-reaksjonen ble bundet til cDNA som kodet for aminosyresekvensene som svarte til hengslet, CH2 og CH3-områdene i IgCyl inn i en ekspresjonsvektor, slik som CDM8 eller irLN.

For å oppnå DNA som koder for full-lengde human CTLA4, ble et cDNA som koder for transmembrane og cytoplasmatiske områder i CTLA4, laget ved hjelp PCR fra H38 celler og koblet til et fragment fra CTLA4Ig, som ble oppnådd som beskrevet ovenfor, og kodet for onkostatin M-signalpeptidet koblet til N-terminus av CTLA4, ved bruk av oligonukleotid-"primere", som beskrevet i eksemplene, infra. PCR-fragmentene ble bundet sammen i plasmidet CDM8, hvilket resulterte i et ekspresjonsplasmid som kodet for full-lengde CTLA4-genet, og betegnet OMCTLA4.

For konstruksjon av DNA som koder for aminosyresekvensen som svarer til hybridfusjonsproteinene, blir DNA som koder for aminosyrene som svarer til delene for det ekstracellulære område i ett reseptorgen, bundet til DNA som koder for aminosyrer som svarer til deler av det ekstracellulære område fra et armen reseptorgen, og til DNA som koder for aminosyresekvensene som svarer til hengslet, CH2 og CH3-områder i det humane IgCyl, ved bruk av fremgangsmåter som beskrevet ovenfor for B7Ig, CD28Ig og CTLA4Ig-konstruksjoner. Således blir f.eks. DNA som koder for aminosyrerestene fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 94 i aminosyresekvensen som svarer til det ekstracellulære område i CD28-reseptoren, koblet til DNA som koder for aminosyrerestene fra omtrent posisjon 94 til omtrent posisjon 125 i aminosyresekvensen som svarer til det ekstracellulære område i CTLA4-reseptoren, og til DNA som koder for aminosyresekvensene som svarer til hengslet, CH2 og CH3-områdene i human IgCyl.

For å lage store mengder av klonet DNA, blir vektorer som inneholder DNA som koder for fusjonskonstruksjonene i oppfinnelsen, transformert til passende vertsceller, slik som bakteriecellelinjen E. coli-stamme MC1061/p3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA), ved bruk av standard fremgangsmåter, og kolonier undersøkt for de riktige plasmidene.

Klonene som inneholder DNA som koder for fusjonskonstruksjoner, oppnådd som beskrevet ovenfor, blir så transfektert inn i passende vertsceller for ekspresjon. Avhengig av vertscellen som benyttes, blir transfeksjonen gjort ved bruk av standardteknikker som passer slike celler. F.eks., transfeksjon i pattedyrceller blir utført ved bruk av DEAE-dekstranformidlet transfeksjon, CaP04 ko-presipitasjon, lipofeksjon, elektroporering, eller protoplastfusjon, og andre fremgangsmåter kjent i feltet, inklusive: lysozymfusjon eller erytrocyttfusjon, avskrapning, direkte opptak, osmotisk eller sukrose-sjokk, direkte mikroinjeksjon, indirekte mikroinjeksjon, slik som via erytrocyttformidlede teknikker, og/eller ved å gj vertsceller elektrisk strømbehandling. Listen ovenfor med transfeksjonsteknikker er ikke betraktet som utfyllende, siden andre fremgangsmåter for å innføre genetisk informasjon i celler utvilsomt vil bli utviklet.

Ekspresjon i eukaryote vertscellekulturer som stammer fra multicellulære organismer, foretrekkes (se Tissue Cultures, Academic Press, Cruz og Patterson, eds.

(1973)). Disse systemene har tilleggsfordelen med evne til å kutte ut inrroner og kan således benyttes direkte til å uttrykke genomiske fragmenter. Anvendbare vertscellelinjer omfatter kinesisk hamster ovarie (CHO), apenyre (COS), VERO og HeLa-celler. I den foreliggende oppfinnelse blir cellelinjer som stabilt uttrykker fusjonskonstruksjonene, foretrukket.

Ekspresjonsvektorer for slike celler omfatter vanligvis promotorer og kontrollsekvenser som er forenelige med pattedyrceller, slik som f.eks. CMV-promotor (CDM8-vektor) og fuglesarkomavirus (ASV) (uLN-vektor). Andre vanligvis benyttede tidlige og sene promotorer, omfatter de fra Simian Virus 40 (SV 40) (Fiers et al., Nature 273:113

(1973)), eller andre virale promotorer, slik som de som stammer fra polyoma, Adenovirus 2, og bovint papillomavirus. Den kontrollerbare promotoren, hMTII (Karin et al., Nature 299:797-802 (1982), kan også benyttes. Generelle forhold med pattedyrcellevert system-transformasjoner er blitt beskrevet av Axel (U.S. patent nr. 4.399.216, publisert 16. august 1983). Det synes nå som om "enhancer"- (forsterker) områder er viktige for å oppnå optimal ekspresjon; disse er vanligvis sekvenser som finnes oppstrøms eller nedstrøms for promotorområdet i ikke-kodende DNA-områder. Origo (startsteder) for replikasjon kan oppnås, hvis nødvendig, fra viruskilder. Imidlertid er integrering i kromosomet en vanlig mekanisme for DNA-replikasjon i eukaryoter.

Skjønt foretrukne vertsceller for ekspresjon av fusjonskonstruksj onene omfatter eukaryote celler slik som COS eller CHO-celler, kan andre eukaryote mikrober benyttes som verter. Laboratoirestammer fra Saccharomyces cerevisiae, Baker's gjær, blir mest brukt, skjønt andre stammer slik som Schizosaccharomyces pombe kan benyttes. Vektorer som benytter f.eks. 2 ji-startsteder for replikasjon til Broach, Meth. Enz. 101:307 (1983), eller andre gjærforenelige startsteder for replikasjon (se f.eks. Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Tschempe et al., Gene 10:157 (1980); og Clarke et al., Meth. Enz. 101:300

(1983), kan benyttes. Kontrollsekvenser for gjærvektorer omfatter promotorer for syntesen av glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968); Holland et al., Biochemistry 17:4900 (1978). Ytterligere promotorer kjent i feltet, omfatter CMV-promotoren som finnes i CDM8-vektoren (Toyama og Okayama, FEBS 268:217-221 (1990); promotoren for 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1989)), og de som finnes for andre glykolytiske enzymer. Andre promotorer som har ytterligere transkripsjonsfordel kontrollert av vekstforbindelser, er promotorområdene for alkohol-dehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degraderende enzymer forbundet med nitrogen-metabolisme, og enzymer ansvarlige for maltose og galaktosenedbrytning. Det antas også at terminatorsekvenser er ønskelige i 3'-enden i de kodende sekvensene. Slike terminatorer finnes i S-ikke-translatert område etter de kodende sekvensene i gjæravledede gener.

Alternativt kan prokaryote celler benyttes som verter for ekspresjon. Prokaryoter som benyttes hyppigst representeres av ulike stammer E. coli; imidlertid kan også andre mikrobielle stammer benyttes. Vanlig benyttede prokaryote kontrollsekvenser som defineres her, inkluderer promotorer for transkripsjonsstart, valgfritt med en operator, sammen med ribosombindingssetesekvenser, deriblant slik vanlig benyttede promotorer som beta-laktamase- (penicillinase) og laktose- (lac) promotorsystemer (Chang et al., Nature 198:1056 (1977)), tryptofan- (trp) promotorsystemet (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)) og den lambdaavledede PL-promotoren og N-genribosombindingssetet (Shimatake et al., Nature 292:128 (1981)).

Nukleotidsekvensene som koder for CD28Ig og CTLA4Ig-proteiner og fusjons-hybridproteiner slik som CD28Ig/CTLA4Ig, kan uttrykkes i en rekke systemer som vist nedenfor. cDNA kan skjæres ut ved hjelp av passende restriksjonsenzymer og bindes inn i passende prokaryote eller eukaryote ekspresjonsvektorer for slik ekspresjon. Fordi CD28 og CTLA4-reseptorproteiner opptrer i naturen som dimerer, antas det at vellykket ekspresjon av disse proteiner krever et ekspresjonssytem som tillater disse proteinene å danne dimerer. Forkortede typer av disse proteiner (dvs. laget ved hjelp av innføring av et stopp-kodon inn i sekvensen i en posisjon oppstrøms for transmembranområdet i proteinet) synes ikke å være uttrykt. Ekspresjonen av CD28 og CTLA4-reseptorer som fusjonsproteiner, tillater dimerdannelse av disse proteiner. Således, ekspresjon av CTLA4-protein som et fusjonsprodukt, foretrekkes i den foreliggende oppfinnelse.

En stabil CHO-linje betegnet kinesisk hamster ovariecellelinje CTLA4Ig-24, foretrekkes med tanke på ekspresjon av CTLA4Ig, og er blitt deponert hos ATCC under betingelsene for Budapest Treaty den 31. mai 1991, og gitt ATCC-registreringsnummer 10762.

Ekspresjon av CTLA4-reseptoren utføres ved å transfektere en cellelinje slik som COS-celler, og påvisning av ekspresjon ved binding av CTLA4-transfekterte celler til en ligand for CTLA4-reseptoren, f.eks. ved å under-søke med tanke på binding av cellene til B7Ig-fusjonsprotein.

Sekvensene til de resulterende konstruksjonene, bekreftes ved hjelp av DNA-sekvensering ved bruk av kjente fremgangsmåter, f.eks. som beskrevet av Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463 (1977), eller videre beskrevet av Messing et al., Nucleic Acads Res. 9:309 (1981), eller ved metoden til Maxam et al., Methods Enzymol. 65:499 (1980).

Utvinning av proteinprodukter

Som vist ovenfor, blir CD28 og CTLA4-reseptorgenene ikke virkelig uttrykt som modne proteiner ved bruk av direkte ekspresjon av DNA som koder for det avkortede (trunkerte) proteinet. For å muliggjøre homodimerdannelse, blir DNA som koder for aminosyresekvensen som svarer til de ekstracellulære områdene i CD28 og CTLA4, og inkludert kodonene for en signalsekvens slik som den til onkostatin M i celler som er i stand til å foreta korrekt prosessering, koblet til DNA som koder for aminosyresekvensen som svarer til Fc-området i et naturlig forekommende dimert protein. Opprensning av disse fusjonsproteinproduktene etter sekresjon fra cellene blir således underlettet ved bruk av antistoffer som reagerer med anti-immunoglobulindelen til fusjonsproteinene. Når utskilt i medium, blir fusjonsproteinproduktene gjenvunnet ved bruk av standardprotein-rensningsteknikker, f.eks. ved bruk av protein-A-kolonner.

Anvendelse

CTLA4Ig-fusjonsprotein og/eller fragmenter av fusjonsproteinet, kan benyttes i reaksjon med B7-positive celler, slik som B-celler, for å regulere immunsvar formidlet av T-cellereaksjoner med B7-antigenpositive celler.

CTLA4Ig-fusjohsprotein og CTLA4Ig/CD28Ig-hybridproteiner, og/eller fragmenter og derivater av disse proteiner, kan også benyttes for å reagere med B7-positive celler, inklusive B-celler, for å regulere immunsvar formidlet av T-celleavhengige B-cellesvar. Betegnelsen "fragment" som benyttet her, betyr en del av aminosyresekvensen som koder for proteinet referert til som "CTLA4". Et fragment av CTLA4Ig-fusjonsproteinet som kan benyttes, er et polypeptid som har en aminosyresekvens som svarer til en del av aminosyresekvensen tilsvarende CTLA4-reseptoren, som benyttes for å oppnå CTLA4Ig-fusjonsproteinet som beskrevet her.

B7-antigenet som uttrykkes på aktiverte B-celler og andre cellelinjer, og CD28-reseptoren uttrykt på T-celler, kan direkte binde til hverandre, og denne reaksjonen kan formidle celle-celle-reaksjon. Slike reaksjoner stimulerer direkte CD28-aktiverings-reaksjonsveien i T-celler, hvilket fører til cytokinproduksjon, T-celledeling og B-celle-differensiering til immunoglobulinproduserende celler. Aktiveringen av B-celler som skjer, kan forårsake øket ekspresjon av B7-antigenet og videre CD28-stimulering, hvilket leder til en tilstand med kronisk betennelse slik som i autoimmunsykdommer, allotrans-plantatforkastelse, transplantat mot vertssykdom eller kronisk allergiske reaksjoner. Blokkering eller hemming av denne reaksjon kan være effektiv for å hindre T-cellecytokin-produksjon og således hindre eller reversere betennelsesreaksjoner.

CTLA4Ig er vist her å være en kraftig hemmer av in vitro-lymfocyttfunksjoner som krever T- og B-cellereaksjoner. Dette viser viktigheten av reaksjoner mellom B7-antigen og dets mot-reseptorer, CTLA4 og/eller CD28. De cytoplasmatiske områdene til gnager og menneske-CTLA4 er like (Dariavach et al., supra, 1988), hvilket viser at dette område har viktige funksjonelle egenskaper. De cytoplasmatiske områdene til CD28 og CTLA4 deler også homologi.

CTLA4 er en mer potent hemmer in vitro av lymfocyttsvar enn enten anti-BBl eller anti-CD28-mAbs. CTLA4Ig har ingen direkte stimulerende virkning på T-celledeling for å motvirke dets hemmende effekter. Derfor kan CTLA4Ig-fusjonsproteinet vise seg å være en bedre hemmer in vivo enn anti-CD28-monoklonale antistoffer. De immunundertrykkende virkninger til CTLA4Ig in vitro, antyder at den kan virke som behandling for autoimmunsykdornmer som omfatter sykelig T-celleaktivering eller Ig-produksjon.

CTLA4If-fusjonsproteinet er forventet å vise hemmende egenskaper in vivo. Således forventes det at CTLA4Ig vil virke for å hemme T-celler på en måte som ligner virkningene som er observert for anti-CD28-antistoffet, under lignende betingelser in vivo. Under betingelser hvor T-celle/B-celle-reaksjoner skjer som et resultat av kontakt med T-celler og B-celler, kan binding mellom tilsatte CTLA4Ig med B7-antigen-positive celler, f.eks. B-celler, påvirke, dvs. hemme, T-celle/B-cellereaksjoner, hvilket vil resultere i en regulering av immunsvar. På grunn av denne eksklusive hemmende virkning, er CTLA4Ig forventet å være nyttig som en hemmer in vivo av T-celleaktivitet, bedre enn ikke-spesifikke nemmere, slik som cyklosporin og glukosteroider.

I én utførelsesform kan CTLA4Ig-fusjonsproteinet eller CTLA4Ig/CD28Ig-hybridproteiner, innføres ved hjelp av en passende farmasøytisk bærer in vivo, dvs. tilføres et menneske for behandling av sykelige tilstander slik som immunsystemsykdommer eller kreft. Innføring av fusjonsproteinet in vivo, forventes å resultere i hemmet T-celle-reaksjoner med andre celler, slik som B-celler, som et resultat av binding av liganden til B7-positive celler. Hindringen av normale T-cellereaksjoner kan resultere i nedsatt T-celleaktivitet, f.eks. nedsette T-celledeling. I tillegg blir tilførsel av fusjonsproteinet in vivo, forventet å resultere i regulering av in vivo-nivåer av cytokiner, hvilket omfatter, men er ikke begrenset til, interleukiner, f.eks. interleukin ('TL")-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL8, vekst-faktorer omfattende tumorvekstfaktor ("TGF"), kolonistimulerende faktor ("CSF"), interferoner ("IFN^r"), og tumornekrosefaktor ("TNF") for å stimulere ønskede virkninger i en person. F.eks., når fusjonsproteinet tilføres in vivo, kan det blokkere produksjonen av cytokiner, som medvirker til kreftvekst, f.eks. vekst av svulstceller. Fusjonsproteinet kan også blokkere deling av virus som er avhengig av T-celleaktivering, slik som virus som forårsaker AIDS, HTLV1.

Under noen tilfeller, som vist ovenfor, er virkningen av tilførsel av CTLA4Ig-fusjonsproteinet eller dets fragmenter hemmende in vivo, hvilket er et resultat av fusjonsproteinets blokkering av CTLA4 og CD28-stimulering som resultat av T-celle/B-cellekontakt. F.eks. kan CTLA4Ig-proteinet blokkere T-celledeling. Innføring av CTLA4Ig-fusjonsproteinet in vivo, vil således gi virkninger på både T- og B-celleformidlet immunsvar. Fusjonsproteinet kan også tilføres til en person sammen med innføring av cytokiner eller andre terapeutiske forbindelser.

Andre reagenser, inklusive derivater som reagerer med CTLA4Ig-fusjonsproteinet eller CTLA-reseptoren kan benyttes for å regulere T-cellereaksjoner. F.eks. kan antistoffer, og/eller antistoff-fragmenter som reagerer med CTLA4-reseptoren, undersøkes med tanke på å identifisere de som kan hemme bindingen av CTLA4Ig-fusjonsproteinet til B7-antigenet. Antistoffene eller antistoff-fragmentene slik som Fab eller Ffab^-fragmenter, kan så benyttes til å reagere med T-cellene, f.eks. for å hemme T-celledeling.

Monoklonale antistoffer som reagerer med CTLA4-reseptor, kan fremstilles ved hybridomer som lages ved bruk av kjente fremgangsmåter, slik som de som er innført av Kohler og Milstein (se Kohler og Milstein, Nature, 256:495-97 (1975), og modfiseringer av disse, for å regulere cellulære reaksjoner.

Disse teknikkene omfatter anvendelsen av et dyr som blir stimulert til å lage et spesielt antistoff. Dyret kan stimuleres ved hjelp av injeksjon med en immunogen (dvs. B7Ig-fusjonsproteinet, CTLA4Ig-fusjonsproteinet eller CD28Ig/CTLA4Ig-fusjonsproteinet), for å utløse det ønskede immunsvaret, dvs. produksjon av antistoffer i det stimulerte dyret. Et stimulert dyr er også ett som kan utvise sykdom. Lymfocytter som stammer fra lymfeknuter, milt eller perifert blod fra stimulerte, syke dyr, kan benyttes for å lete etter et spesielt antistoff. Lymfocyttkromosomene som koder for de ønskede immuno-globulinene, blir udødeliggjort ved å fusjonere lymfocyttene med myelomceller, vanligvis i nærvær av en fusjonsforbindelse, slik som polyetylenglykol (PEG). Én blant en rekke myelomcellelinjer kan benyttes som fusjonspartner ifølge standard fremgangsmåter; f.eks. P3-NSl/l-Ag4-l, P3-x63-Ag8.653, Sp2/0-Agl4 eller HLl-653-myelomlinjer. Disse myelom-linjene er tilgjengelige fra ATCC, Rockville, Maryland.

De resulterende cellene som omfatter de ønskede hybridomene, dyrkes i et selektivt medium, slik som HAT-medium, hvor ikke-fusjonerte utgangsmyelomer eller lymfocytt-celler til slutt dør. Bare hybridomcellene overlever og kan dyrkes under begrensende fortynningsbetingelser for å oppnå isolerte kloner. Supernatantene til hybridomene under-søkes for tilstedeværelsen av den ønskede spesifisiteten, f.eks. ved immunoassayteknikker med bruk av CTLA4Ig-proteinet som har vært benyttet for immunisering. Positive kloner kan så subklones under begrensende fortynningsbetingelser, og det monoklonale antistoffet som lages, kan bli isolert.

Ulike konvensjonelle fremgangsmåter kan benyttes for isolering og rensing av de monoklonale antistoffene, slik at de oppnås fri fra andre proteiner og forurensninger. Vanlige benyttede fremgangsmåter for opprensing av monoklonale antistoffer omfatter ammoniumsulfatbunnfelling, ionebytterkromatografi og affinitetskromatografi (se Zola et al. i Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, Hurell (ed.), sidene 51-52 (CRC Press, 1982). Hybridomer fremstilt ifølge disse fremgangsmåtene, kan føres videre in vitro eller in vivo (i ascites væske) ved bruk av teknikker kjent i feltet (se generell Fink et al., Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984), på side 123).

I alminnelighet kan den individuelle cellelinjen føres videre in vitro, f.eks. i laboratoriekulturflasker, og kulturmediet kan inneholde høye konsentrasjoner av et enkelt spesifikt monoklonalt antistoff og høstes ved hjelp av dekantering, filtrering eller sentrifugering.

I tillegg kan fragmenter av disse antistoffene som inneholder det aktive bindings-område som reagerer med ekstracellulært område av CTLA4-reseptoren, slik som Fab, F(ab')2 og Fv-fragmenter, fremstilles. Slike fragmenter kan lages ved bruk av teknikker vel kjente i feltet (se f.eks. Rousseaux et al. i Methods Enzymol. 121:663-69, Academic Press (1986)).

Anti-B7-monoklonale antistoffer fremstilt som beskrevet ovenfor, kan benyttes for å binde til B7-antigen for å hindre reaksjoner mellom CD28-positive eller CTLA4-positive T-celler og B7-positive celler. Anti-CTLA4-monoklonale antistoffer kan benyttes for å binde til CTLA4-reseptor for å hemme reaksjonen mellom CTLA4-positive T-celler med andre celler.

CTLA4Ig-fusjonsproteinet kan benyttes for å identifisere ytterligere forbindelser som kan regulere reaksjonen mellom CTLA4 og B7-antigenet. Slike forbindelser kan omfatte små naturlig forekommende molekyler som kan benyttes for å reagere med B-celler og/eller T-celler. F.eks., fermenteringsmedier kan undersøkes for evnen til å hemme CTLA4/B7-reaksjoner. I tillegg kan derivater av CTLA4Ig-fusjonsproteinet som beskrevet ovenfor, benyttes for å regulere T-celledeling. F.eks. kan fragmentene eller derivatene benyttes til å blokkere T-celledeling i transplantat mot vert (GVH) sykdom som følger allogen benmargstransplantasjon. Den CD28-formidlede T-celledelingsreaksjonsveien er cyklosporin-motstandsdyktig, i motsetning til celledeling drevet av CD3/Ti-cellereseptorkomplekset (June et al., 1987, supra). Cyklosporin er relativt uvirksom som behandling for GVH-sykdom (Storb, Blood 68:119-125 (1986)). GVH-sykdom antas å være formidlet av

T-lymfocytter som uttrykker CD28-antigenet (Storb og Thomas, Immunol. Rev. 88:215-238

(1985)). Således kan CTLA4Ig-fusjonsproteinet være anvendbart alene, eller i kombinasjon med immunundertrykkende forbindelser, slik som cyklosporin, for å blokkere T-celledeling i GVH-sykdom.

Regulering av CTLA4-positive T-cellereaksjoner med B7-positive celler, omfatter B-celler, ved hjelp av fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen, og således kan benyttes for å behandle sykdomstilstander slik som autoimmunitet, transplantasjon, infeksjons-sykdommer og kreftsykdommer.

De følgende eksempler presenteres for å illustrere den foreliggende oppfinnelsen, og for å hjelpe en med vanlig kompetanse når det gjelder å utføre og benytte det samme.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av B7Ig oe CD28Ig- fusionsproteiner

Reseptor-immunoglobulin-C-gamma- (IgCy) fusjonsproteiner P7Ig og CD28Ig, ble fremstilt som beskrevet av Linsley et al. i J. Exp. Med. 173:721-730 (1991), herved inntatt som referanse. I korthet ble DNA som koder for aminosyresekvensene som svarte til det respektive reseptorproteinet (f.eks. B7), koblet til DNA som koder for aminosyresekvensene som svarte til hengslet, CH2 og CH3-områdene i human IgCyl. Dette ble utført som følger.

Polvmerasekiedereaksion ( PCR)

For PCR, ble DNA-fragmenter forøket ved bruk av "primer"-par som beskrevet nedenfor for hvert fusjonsprotein. PCR-reaksjonene (0,1 ml endelig volum) ble kjørt i Taq-polymerasebuffer (Stratagene, La Jolla, CA), som inneholdt 20 /«noi hver av dNTP; 50-100 pmol av de antydede "primere"; templat (1 ng plasmid eller cDNA syntetisert fra < 1 ug totalt RNA ved bruk av tilfeldig heksamer-"primer", som beskrevet av Kawasaki i PCR Protocols, Academic Press, pp. 21-27 (1990), herved inntatt som referanse; og Taq-polymerase (Stratagene). Reaksjoner ble utført på en termocykler (Perkin Eimer Corp., Norwalk, CT) i 16-30 cykler (en typisk syklus består av trinnene som omfatter 1 min. ved 94°C, 1-2 min. ved 50°C og 1-3 min. ved 72°C).

Plasmidkonstruksjon

Ekspresjonsplasmider som inneholder cDNA som koder for CD28, som beskrevet av Aruffo og Seed, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:8573 (1987), ble gitt av doktorene ArufTo og Seed (Mass General Hospital, Boston, MA). Plasmider som inneholder cDNA som koder for CD5, som beskrevet av Aruffo, Cell 61:1303 (1990), ble gitt av Dr. Aruffo. Plasmider som inneholdt cDNA som koder for B7, som beskrevet av Freeman et al., J. Immunol. 143:2714 (1989), ble gitt av Dr. Freeman (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA). De første forsøk på å utrykke løselige former av CD28 og B7, omfattet konstruksjoner (OMCD28 og OMB7) som beskrevet av Linsley et al., J. Exp. Med., supra, hvor stoppkodonene ble satt inn oppstrøms for transmembran-området, og de naturlige signalpeptidene ble erstattet med signalpeptider fra onkostatin M (Malik et al., Mol. Cell. Biol. 9:2847 (1989)). Disse ble utført ved bruk av syntetiske oligonukleotider for rekonstruksjon (OMCD28) eller som "primere" (OMB7) for PCR. OMCD28 er en CD28-cDNA modifisert for mer effektiv ekspresjon ved å erstatte signalpeptidet med det analoge område fra onkostatin M. CD28Ig og B7Ig-fusjons-konstruksoner ble laget i to deler. 5'-områdene ble laget ved bruk av OMCD28 og OMB7 som templater og oligonukletoidet,

CTAGCCACTGAAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACAC (SEQ ID NO: I),

(som koder for aminosyresekvensen som svarer til onkostatin M-signalpeptidet) som en forover-"primer", og enten henholdsvis

TGGCATGGGCTCCTGATCAGGCTTAGAAGGTCCGGGAAA (SEQ ID NO: 2), eller TTTGGGCTCCTGATCAGGAAAATGCTCTTGCTTGGTTGT (SEQ ID NO: 3) som

revers "primere". PCR-produkter fra reaksjonene ble spaltet med restriksjonsendo-nukleaser (Hind m og Bell), hvilket er seter innført i PCR-"primerne" og gelopprenset.

3'-området av fusjonskonstruksjonene tilsvarende human IgOyl-sekvensene, ble laget ved en koblet revers transkriptase- (fra Avian myeloblastosevirus; Life Sciences Associates, Bayport, NY) PCR-reaksjon ved å benytte RNA fra en myelomcellelinje som laget human-muse-chimer mAb L6 (gitt av Dr. P. fell og M. Gayle, Bristol.Myers Squibb Company, Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA) som templat. Oligonukleotidet,

AAGCAAGAGCATTTTCCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACAC

ATCCCC-ACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG (SEQ ID NO: 4), ble benyttet som

forover-"primer", og CTTCGACCAGTCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC (SEQ ID NO: 5) som revers "primer". Reaksjonsprodukter ble spaltet méd Bell og Xbal og gelopprenset. Endelige konstruksjoner ble satt sammen ved å ligere HindlH/BClI-spaltede fragmenter som inneholdt CD28 eller B7-sekvenser, sammen med BclI/Xbal-spaltet fragment som inneholdt IgCyl-sekvenser inn i HindJH/Xbal-spaltet CDM8. Sammen-bindingsprodukter ble transformert inn i MC1061/p3-E. coli-celler, og kolonier ble under-søkt for de riktige plasmidene. Sekvenser av de resulterende konstruksjoner ble bekreftet ved hjelp av DNA-sekvensering.

Konstruksjonen som koder for B7, inneholdt DNA som koder for aminosyrer som svarte til aminosyrerestene fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 215 i det ekstracellulære område til B7. Konstruksjonen som koder for CD28, inneholdt DNA som koder for aminosyrene som svarte til aminosyrerstene fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 134 i det ekstracellulære område til CD28.

CD5Ig ble konstruert på samme måte ved bruk av

CATTGCACAGTCAAGCTTCCATGCCCATGGGTTCTCTGGCCACCTTG (SEQ ID

NO: 6), som forover-"primer" og

ATCCACAGTGCAGTGATCATTTGGATCCTGGCATGTGAC (SEQ ID NO. 7) som

revers "primer". PCR-produktet ble restriksjonsendonuklease-spaltet og bundet med IgCyl-fragmentet som beskrevet ovenfor. Den resulterende konstruksjon (CD5Ig) kodet for et ferdig protein som har en aminosyresekvens som inneholder aminosyre-restene fra posisjon 1 til posisjon 347 i sekvensen som svarte til CD5, to aminosyrer innført ved hjelp av konstruksjonsfremgangsmåten (aminosyrene DQ), etterfulgt av DNA-kodende aminosyrer som svarer til IgCyl-hengselsområdet.

Cellekultur og transfeksjoner

COS (ape-nyreceller) ble transfektert med ekspresjonsplasmider som uttrykte CD28 og B7 ved bruk av en modifisert protokoll fra Seed og Aruffo (Proe. Nati. Acad. Sei. 84:3365 (1987)), herved inntatt som referanse. Cellene ble sådd ut i 106 pr. 10 cm diameter kulturskål 18-24 timer før transfeksjon. Plasmid-DNA ble tilsatt (omtrent 15 pig/skål) i et volum på 5 ml serumfritt DMEM som inneholdt 0,1 mM klorokin og 600 /tg/ml DEAE dekstran, og cellene ble inkubert i 3-3,5 timer ved 37°C. Transfekterte celler ble så kort behandlet (omtrent 2 min.) med 10% dimetylsulfoksyd i PBS, og inkubert ved 37°C i 16-24 timer i DMEM som inneholdt 10% FCS. 24 timer etter transfeksjon, ble kulturmediet fjernet og erstattet med serumfritt DMEM (6 ml/skål). Inkubasjon ble fortsatt i 3 dager ved 37°C, på hvilken tid mediet ble samlet og friskt serum-fritt medium tilsatt. Etter ytterligere 3 dager ved 37°C, ble det brukte medium igjen samlet, og cellene ble kastet.

CHO-celler som uttrykker CD28, CD5 eller B7, ble isolert som beskrevet av Linsley et al., (1991) supra, som følger: I korthet ble stabile transfektanter som uttrykte CD28, CD5 eller B7, isolert etter kotransfeksjon med dihydrofolat-reduktase-manglende kinesiske hamster ovarie- (dhfr—CHO) celler med en blanding av det passende ekspresjonsplasmidet og seleksjonsmarkøren, pSV2dhfr (Linsley et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:5031 (1990)), herved inntatt som referanse. Transfektanter ble så dyrket i økende konsentrasjoner med metotreksat til et endelig nivå på 1 /iM, og ble beholdt i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,2 mM prolin og 1 ptM metotreksat. CHO-linjer som uttrykker høye nivåer med CD28 (CD28+-CHO) eller B7 (B7+-CHO), ble isolert etter multiple runder med fluorescens-aktivert cellesortering (FACSR), etterfulgt av indirekte immunfarging med mAbs 9,3 eller BB-1. Forøkede CHO-celler som var negative med tanke på overflate-ekspresjon av CD28 eller B7 (dhfr+-CHO), ble også isolert ved

hjelp av FACSR fra CD28-transfekterte populasjoner.

Immunfarging og FACSR- analyse

Transfekterte CHO- eller COS-celler eller aktiverte T-celler, ble analysert ved hjelp av indirekte immunfarging. Før faring ble CHO-celler fjernet fra deres kulturflasker ved inkubering i PBS som inneholder 10 mM EDTA. Cellene ble først inkubert med gnager-mAbs 9,3 (Hansen et al., Immunogenetics 10:247 (1980)) eller BB-1 (Yokochi et al., J. Immunol. 128:823 (1981)), eller med Ig-fusjonsproteiner (alt ved 10 /ig/ml i DMEM som inneholdt 10% FCS) i 1-2 timer ved 4°C. Cellene ble så vasket og inkubert for ytterligere 0,5-2 timer ved 4°C med en FITC-konjugert annen trinns-reagens (geite-anti-muse-Ig-serum for gnager-mAbs, eller geite-anti-human-IgCy-serum for fusjonsproteiner (Tago, Inc., Burlingame, CA)). Fluroescens ble analysert på en FACS IVR-cellesorteringsmaksin (Becton Dickinson og Co., Mountain View, CA) utstyrt med en fire-logaritmisk forsterker.

O pprensning av Ig- fusjonsproteiner

De første, andre og tredje oppsamlingene av brukt serumfritt kulturmedium fra transfektere COS-celler ble benyttet for kilder for opprensning av Ig-fusjonsproteiner. Etter fjernelse av cellulært avfall ved lavhastighetssentrifugering, ble mediet påsatt en søyle (omtrent 200-400 ml medium/ml pakket søylevolum) med immobilisert protein A (Repligen Corp., Cambridge, MA), ekvilibrert med 0,05 M natriumcitrat, pH 8,0. Etter påsetting av mediet, ble søylen vasket med 1M kalium-fosfat, pH 8, og bundet protein ble eluert med 0,05 M natrium-citrat, pH 3. Fraksjoner ble samlet og øyeblikkelig nøytralisert ved tilsetting med 1/10 volum 2 M Tris, pH 8. Fraksjoner som inneholdt toppen med A280 absorberende materiale, ble samlet og dialysert mot PBS før bruk. Ekstinktsjons-koeffisienter på 2,4 og 2,8 ml/mg ble oppnådd henholdsvis for CD28Ig og B7Ig, ved aminosyreanalyse av løsninger med kjent absorbsjon. Gjenvinning av renset CD28Ig og B7Ig-bindings-aktiviteter, ble nærmest kvantitative som bedømt ved hjelp av FACSR-analyse etter indirekte fluorescentfaring av B7+ og CD28+-celler.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av CTLA4Ig- fusjonsprotein

En løselig genetisk fusjon som koder for CTLA4Ig mellom det ekstracellulære område til CTLA4 og et IgCyl-område, ble konstruert på en måte som lignet den beskrevet ovenfor for CD28Ig-konstruksjonen. Det ekstracellulære område til CTLA4-genet ble klonet ved hjelp av PCR ved bruk av syntetiske oligonukleotider tilsvarende den publiserte sekvensen (Dariavach et al, Eur. Jour. Immunol. 18:1901-1905 (1988)).

Fordi et signalpeptid for CTLA4 ikke var identifisert i CTLA4-genet, ble N-terminus til den avledede sekvensen til CTLA4, fusjonert til signalpeptidet til onkostatin M (Malik et al.} Mol. and Cell. Biol. 9:2847 (1989)) i to trinn, ved bruk av overlappende oligonukleotider. Til det første trinnet, ble oligonukleotidet

CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCAC

GTGGCCCAGCC (SEQ ID NO: 8) (som kodet for C-terminale 15 aminosyrer i onkostatin M-signalpeptidet, koblet til N-terminale 7 aminosyrer av CTLA4), benyttet som forover-"primer", og TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (SEQ ID NO: 9) (som koder for aminosyrerestene 119-125 i aminosyresekvensen som koder for CTLA4-reseptoren og som inneholder et Bcll-restriksjonsenzymsete) som revers "primer". Templatet for dette trinn var cDNA syntetisert fra 1 /tg totalt RNA fra H38-celler (en HTLV II-infisert T-celle-elukemicellelinje gitt av doktorene Salahudin og Gallo, NCI, Bethesda, MD). En del av PCR-produktet fra det første trinnet, ble forøket om igjen, ved bruk av en overlappende forover-"primer", som koder for den N-terminale delen av onkostatin M-signalpeptidet og som inneholder et Hind JJI-restriksjonsendonukleasesete,

CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCT

CAGTCTGGTCCTTGCACTC (SEQ ID NO: 10) og den samme revers-"pirmeren". Produktet fra PCR-reaksjonen ble spaltet med Hind III og Bel I, og bundet sammen med et BclI/Xbal-spaltet cDNA-fragment, som koder for aminosyresekvensene som svarte til hengslet, CH2 og CH3-områdene til □ Tl inn i den HindlH/Xbal-spaltede ekspresjons-ektoren, CDM8 eller Hindlll/Xbal-spaltede ekspresjonsvektoren uLN (gitt av Dr. Aruffo).

Et kart av den resulterende CTLA4Ig-fusjonskonstruksjonen er vist i fig. 1. Sekvensene som er vist i denne figur, fremstiller overgangene mellom CTLA4 (øvre rad bokstaver, ikke-skraverte områder), og signalpeptidet, SP, til onkostatin M (mørke skraverte områder), og hengslet, H, til IgCyl (stiplede områder). Aminosyren i parentes ble innført under konstruksjon. Asterisker (<*>) viser cystein til serinmutasjoner innført i IgCy-hengselregionen. Det immunoglobulin-superfamiliens V-lignende område tilstede i CTLA4, er vist, likså CH2 og CH3-områdene til IgCyl.

Ekspresjonsplasmidene, CDM8, som inneholder CTLA4Ig, ble transfektert inn i COS-celler ved bruk av DEAE/dekstran-trans-feksjon etter modifikasjon (Linsley et al., 1991, supra) til protokollen beskrevet av Seed og Aruffo, 1987, supra.

Ekspresjonsplasmidkonstruksjonene (urLN eller CDM8) som inneholdt cDNA som koder for aminosyresekvensen til CTLA4Ig, ble transfektert ved lipofektin ved bruk av standard fremgangsmåter inn i dhfr"-CHO-linjer for å fremstille nye cellelinjer som stabilt uttrykker CTLA4Ig.

DNA som koder for aminosyresekvensen tilsvarende CTLA4Ig, er blitt deponert hos ATCC under Budapest Treaty den 31. mai 1991, og er gitt ATCC-registreringsnummer 68629.

En foretrukket stabil transfektant, som uttrykker CTLA4Ig, betegnet kinesisk hamster overiecellelinje, CTLA4Ig-24, ble laget ved å undersøke B7-positive CHO-cellelinjer for B7-bindingsaktivitet i mediet, ved bruk av immunfarging. Transfektanter ble beholdt i DMEM, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,2 mM prolin og 1 jtM metotreksat.

CTLA4Ig-24-CHO-cellelinjen er blitt deponert hos ATCC under Budapest Treaty den 31. mai, 1991 og er blitt gitt registreringsnummer ATCC 10762.

CTLA4Ig ble renset ved protein A-kromatografi fra serumfrie kondisjonerte super-natanter (fig. 2). Konsentrasjoner av CTLA4Ig ble bestemt ved å anta en ekstinksjons-koeffisient ved 280 nm på 1,6 (eksperimentelt bestemt ved aminosyreanalyse av en løsning av kjent absorbsjon). Molekylvektstandarder (sporene 1 og 3, fig. 2) og prøver (1 /tg) av CTLA4IG (sporene 2 og 4) ble kjørt på SDS-PAGE (4-12% akrylamidgradient) under ikke-reduserende betingelser (-6ME, sporene 1 og 2) eller reduserende betingelser (+6ME, sporene 3 og 4). Proteiner ble synliggjort ved farging med coomassie brilliantblått.

Under ikke-reduserende betingelser, vandret CTLA4Ig som en Mr omtrent 100.000 form, og under reduserende betingelser, som en Mr omtrent 50.000 form (fig. 2). Fordi IgOy-hengsel-disulfidene ble fjernet under konstruksjonen, er CTLA4Ig, liksom CD28Ig, en dimer som sannsynligvis er bundet sammen via en naturlig disulfidbinding.

EKSEMPEL 3

CTLA4- reseptor

For å rekonstruere DNA som koder for aminosyresekvensen tilsvarende det full-lengde humane CTLA4-genet, ble cDNA som kodet for aminosyrene som svarte til et fragment av de transmembrane og cytoplasmatiske områdene til CTLA4, klonet ved hjelp av PCR og så koblet sammen med cDNA som koder for aminosyrer tilsvarende et fragment fra CTLA4Ig som svarte til onkostatin M-signalpeptidet, tilkoblet den N-terminale del av CTLA4. Fremgangsmåter for PCR og cellekultur og transfeksjoner var som beskrevet ovenfor i eksempel 1 ved bruk av COS-celler og DEAE-dekstrantransfeksjon.

Fordi ekspresjon av CTLA4-reseptorproteinet i humane lymfoide celler ikke tidligere var rapportert, var det nødvendig å lokalisere en kilde for CTLA4-mRNA. PCR-cDNA revers transkribert fra totalt cellulært RNA fra H38-celler, som beskrevet ovenfor, ble benyttet for kloning ved hjelp av PCR. For dette formål, ble oligonukleotidet, GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTAGTG (SEQ ID NO: 11), (som kodet for de første 11 aminosyrene i den antatte kodende sekvensen) benyttet som en forover-"primer", og TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAAATAAGGCTG (SEQ ID NO: 12) (homolog til de siste 8 aminosyrene i CTLA4 og som inneholder et Xbal-sete) som revers "primer". Templatet var igjen et cDNA syntetisert fra 1 /ig RNA fra H38-celler. Produkter av PCR-reaksjonen ble spaltet med restriksjonsendonukleasene Ncol og Xbal, og det resulterende 316 bp-produktet ble gelopp-renset. Et 340 bp-HindHI/NcoI-fragment fra CTLAIg-fusjonen beskrevet ovenfor, ble også gelopprenset, og begge restriksjonsfragmentene ble bundet sammen inn i Hindlll/Xbal-spaltet CDM8 for å lage

OMCTLA.

Den resulterende konstruksjon tilsvarte full-lengde CTLA4 (SEQ ID Nos: 13 og 14) og onkostatin M-signalpeptidet. Konstruksjonen er vist i fig. 3 og ble betegnet OMCTLA4. Sekvensen til CTLA4 vist i fig. 3, avviker fra den antatte humane CTLA4-DNA-sekvensen (Dariavach et al., supra) med en baseendring, slik at den tidligere rapporterte alanin i aminosyreposisjon 111 i aminosyresekvensen som er vist, koder for en treonin. Denne treonin er del av et nylig identifisert N-koblet glykosyleirngssete som kan være viktig for vellykket ekspresjon av fusjonsproteinet.

Sammenkoblingsprodukterble transformert inn i MC1061/p3-E. coli-celler, og kolonier ble undersøkt med tanke på de riktige plasmidene. Sekvenser fra de resulterende konstruksjonene, ble bekreftet ved DNA-sekvensanalyse.

EKSEMPEL 4

Karakterisering av CTLA4Ig

For å karakterisere CTLA4Ig-konstruksjonene, ble flere isolater, CD28Ig, B7Ig og CD5Ig, fremstilt som beskrevet ovenfor og transfektert inn i COS-celler som beskrevet i eksemplene 2 og 3, og ble testet ved FACSR-analyse for binding av B7Ig. I tillegg til de ovenfor nevnte konstruksjonene, ble CDM8-plasmider som inneholdt cDNA'er som koder for CD7 som beskrevet av Aruffo og Seed, (EMBO Jour. 6:3313-3316 (1987)), herved inntatt som referanse, også benyttet.

mAbs

Gnager-monoklonale antistoffer (mAbs) 9,3 (anti-CD28) og G19-4 (anti-CD3), G3-7 (anti-CD7), BB-1 (anti-B7-antigen) og rotte-mAb 187,1 (anti-muse-K-kjede), er blitt beskrevet tidligere (Ledbetter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 94:1384-1388 (1987); Ledbetter et al., Blood 75:1531 (1990); Yokochi et al., supra) og ble renset fra ascites før bruk. Hybridomene som fremstilte mAb OKT8, ble oppnåd fra ATCC, Rockville, MD, og mAb ble også renset fra ascites før bruk. mAb 4G9 (anti-CD19) ble gitt av Dr. E. Engleman, Standford University, Palo Alto, CA). Renset human-muse-chimer mAb L6 (som har human CT1 Fc-del) var en gave fra Dr. P. Fell og M. Gayle (Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA).

Immunfarging og FACSR- analyse

Før farging ble COS- eller COH-celler fjernet fra deres dyrkningsflasker ved inkubering i PBS som inneholdt 10 mM EDTA. Cellene ble først inkubert med mAbs eller Ig-fusjons-proteiner ved 10 jig/ml i DMEM, som inneholdt 10% FBS i 1-2 timer ved 4°C. Celler ble så vasket, og inkubert for ytterligere 0,5-2 timer ved 4°C med FITC-konjugert geite-anti-muse-immunoglobulin eller med FITC-konjugert geite-anti-human-IgCy-serum (begge fra Tago, Burlingame, CA). Når binding av både mAbs og Ig-fusjonsproteinene ble målt i det samme eksperimentet, ble FITC-konjugerte anti-muse og anti-menneske annet trinn reagenser blandet sammen før anvendelse. Fluorescens i et total på 10.000 celler ble så analysert ved hjelp av FACSR.

Perifer blodlymfocyttisolering og stimulering

Perifere blodlymfocytter (PBL'er) ble isolert ved sentrifugering gjennom Lymphocyte Separation Medium (Litton Bionetics, Kensington, MD). Alloreaktive T-celler ble isolert ved stimulering med PBL i en primær blandet lymfocyttreaksjon (MLR). PBL ble dyrket ved 106/ml bestrålte (5000 rad) T51LCL. EBV-transformerte lymfoblastoide cellelinjer (LCL), PM (Bristol-Myers Squibb Co.) og T51 (Bristol-Myers Squibb Co.) ble vedlikeholdt i RPMI, supplert med 10% FBS. Etter 6 dager ble alloreaktive "blåster"-celler kryopreservert. En annen MLR ble utført ved å dyrke tinte alloreaktive blåster sammen med friskt bestrålte T51 LCL i nærvær og fravær av mAbs og Ig-fusjonsproteiner. Celler ble dyrket i 96 brønns flatskåler (4 x 104 alloreaktive blåster og 1 x 104 bestrålte T51 LCL celler/brønn, i et volum på 0,2 ml) i RPMI som inneholdt 10% FBS. Cellulær proliferasjon i kvadruplikate (fire paralleller) kulturer ble målt ved opptak av [3H]-tymidin i løpet av de siste 6 timene i en 2-3 dagers kultur.

PHA-aktiverte T-celler ble fremstilt ved å dyrke PBUene med 1 /ig/ml PHA (Wellcome, Charlotte, NC) i 5 dager, og 1 dag i medium som manglet PHA. Levedyktige celler ble samlet ved sedimentering gjennom lymfocytt-separeringsmedium før bruk. Celler ble stimulert med mAbs eller transfekterte med CHO-celler i 4-6 timer ved 37°C, samlet ved hjelp av sentrifugering og benyttet for å fremstille RNA.

CD4+-T-celler ble isolert fra PBL'er ved å adskille PBUene fra friske donorer i T-og ikke-T-celler ved bruk av saue-erytrocytt-rosett-teknikk, og videre adskille T-celler ved reaksjon med CD4+-celler, som beskrevet av Damle et al., J. Immunol. 139:1501 (1987), herved inntatt som referanse.

B-celler ble også renset fra perifert blod ved utsåing som beskrevet av Wysocki og Sato, Proe. Nati. Acad. Sei. 75:2844 (1978), herved inntatt som referanse, ved bruk av anti-CD19-mAb-4G9. For å måle Th-stimulert Ig-produksjon, ble 106 CD4+-T-celler blandet med 106 CD19+-B-celler i 1 ml RPMI som inneholdt 10% FBS. Etter dyrking i 6 dager ved 37°C, ble produksjonen av human IgM målt i kultursupernatantene ved bruk av solid fase-ELISA som beskrevet av Volkman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:2528 (1981), herved inntatt som referanse. I korthet ble 96-brønns flatbunnede mikrotiter-ELISA-skåler (Corning, Corning, NY) dekket med 200 /il/brønn natriumkarbonatbuffer (pH 9,6), som inneholdt 10 /tg/ml affinitetsrenset geite-anti-human IgG eller IgM-antistoff (Tago, Burlingame, CA), inkubert over natt ved 4°C, og så vasket med PBS, og brønnene ble videre blokkert med 2% BSA i PBS (BSA-PBS). Prøver som skal måles, ble tilsatt i passende fortynning til disse brønnene og inkubert med 200 /il/brønn med 1:1000 fortynning av pepperrotperoksydase (HRP)-konjugert F(ab')2-fraksjon av affinitetsrenset geite-anti-human IgG eller IgM-antistoff (Tago). Skålene ble så vasket og 100 /il/brønn med o-fenylen-diamin- (Sigman Chemical Co., St. Louis, MO) løsning (0,6 mg/ml i citrat-fosfatbuffer med pH 5,5 og 0,045% hydrogenperoksyd). Fargeutvikling ble stoppet med 2 N svovelsyre. Absorbsjon ved 490 nm ble målt med en automatisert ELISA-skålleser. Eksperimentelle og kontrollprøver ble kjørt i triplikat, og absorbsjonsverdiene ble sammenlignet med de som ble oppnådd med kjente IgG eller IgM-standarder, målt samtidig med supernatantprøvene for å gi standardkurven som benyttes for måling av konsentrasjoner av lg i kultur-supematanten. Resultatene ble uttrykt som ng/ml lg + SEM av enten triplikat-eller kvadruplikat-kulturer.

Immunpresipiterin<g>sanalvse og SDS- PAGE

Celler ble overflatemerket med 1251 og gjenstand for immunpresipitasjonsanalyse. I korthet ble PHA-aktiverte T-celler overflatemerket med 1251 ved bruk av laktoperoskydase og H202 som beskrevet av Vitetta et al., J. Exp. Med. 134:242 (1971), herved inntatt som referanse. SDS-PAGE-kromatografi ble utført på lineære akrylamidgradientgeler med konsentrasjonsgeler med 5% akrylamid. Gelene ble farget med Coomassie blå, avfarget og fotografert eller tørket, og pålagt røntgenfilm (Kodak XAR-5).

Bindingsmetoder

B7Ig ble merket med 1251 til spesifikk aktivitet på omtrent 2 x 106 cpm/pmol. 96-brønns plastikkskåler ble dekket i 16-24 timer med en løsning som inneholdt CTLA4Ig (0,5 ug i et volum på 0,05 ml 10 mM Tris, pH 8). Brønner ble blokkert med bindingsbuffer

(DMEM som inneholdt 50 mM BES (Sigma Chemical CO.), pH 6,8, 0,1% BAS og 10% FCS) før tilsetting av en løsning (0,09 ml) som inneholdt 1251 B7Ig (omtrent 5 x 105 cpm) i nærvær eller fravær av konkurrent. Etter inkubasjon i 2-3 timer ved 23°C, ble brønnene vasket en gang med bindingsbuffer, og fire ganger med PBS. Bundet radioaktivitet ble så løseliggjort ved tilsetting av 0,5 N NaOH, og målt ved hjelp av gammatelling.

Binding til B7Ig

Den funksjonelle aktivitet til OMCTLA4-konstruksjonen som kodet for det komplette humane CTLA4-DNA-genet, er vist i eksperimentet som er vist i fig. 4. COS-celler ble transfektert med ekspresjonsplasmidene CD7, OMCD28 og OMCTLA4 som beskrevet ovenfor. 48 timer etter transfeksjon, ble cellene samlet og inkubert med kun medium (ingen tilsetting) eller med mAbs 9,3, B7Ig, CD5Ig eller G3-7. Celler ble så vasket, og binding påvist ved hjelp av en blanding av FITC-konjugert geite-anti-muse-Ig og FITC-konjugert geite-anti-human-Ig annen trinns reagenser. Transfekterte celler ble undersøkt for ekspresjon av passende celleoverflatemarkører ved hjelp av indirekte immunfarging og fluorescens, som ble målt ved bruk av FACSR-analyse som beskrevet ovenfor.

Som vist i fig. 4, bandt mAb 9,3 til CD28-transfekterte COS-celler, men ikke til CTLA4-transfekterte celler. I motsetning, bandt B7Ig-fusjonsproteinet (men ikke kontroll-CD5Ig-fusjonsproteinet) til både CD28- og CTLA4-transfekterte celler. CD7-transfekterte COS-celler bandt hverken til mAb 9,3 eller til noen av fusjonsproteinene. Dette viser at CD28 og CTLA4 begge binder B-celleaktiveringsantigenet, B7. Videre bandt ikke mAb 9,3 påvisbart CTLA4.

Binding av CTLA4I<g> til B7- positive CHO- celler

For å karakterisere videre binding av CTLA4Ig og B7, ble bindingsaktiviteten til renset CTLA4Ig på B7+-CHO-celler og på en lymfoblastoid cellelinje (PM LCL), målt i eksperimentet vist i fig. 5. Forøkede transfekterte CHO-cellelinjer og PM LCL ble inkubert med medium utelukkende (ingen tilsetting) eller en tilsvarende konsentrasjon av human IgCyl-inneholdende proteiner (10 /lg/ml) av CD5Ig, CD28Ig eller CTLA4Ig. Binding ble påvist ved hjelp av FACSR etter tilsetting av FITC-konjugert geite-anti-human-Ig annen trinns reagenser. En total på 10.000 fargede celler ble analysert ved hjelp av FACSR.

Som vist i fig. 5, bandt CD28Ig til B7+-CHO-celler, men ikke til PM LCL, en cellelinje som uttrykker relativt små mengder av B7-antigenet (Linsley et al., supra, 1990). CTLA4Ig bandt sterkere til begge cellelinjene enn det CD28Ig gjorde, hvilket antydet at det bandt med høyere affinitet. Hverken CD28Ig eller CTLA4Ig bandt til CD28+-celler.

Bindingsaffinitet til CTLA4Ig og B71g

Den tilsynelatende affinitet i reaksjonen mellom CTLA4Ig og B7Ig ble så målt ved bruk av en fast-fasekonkurransebindingsmetode. 96-brønns plastikkskåler ble dekket med CTLA4Ig som beskrevet ovenfor. B7Ig ble radioaktivt merket med 1251 (5 x 105 cpm, 2 x 106 cpm/pmol), og så tilsatt til en konsentrasjon på 4 nM i nærvær av de indiserte konsentrasjonene (se fig. 6) av umerket chimer mAb L6, mAb 9,3, mAb BB-1 eller B7Ig. Skålbundet radioaktivitet ble bestemt og uttrykt som prosent radioaktivitet bundet til brønner behandlet med konkurrent (28.300 cpm). Hvert punkt representerer gjennomsnittet av duplikate bestemmelser; replikatene varierte vanligvis fra gjennomsnittet ved

< 20%. Konsentrasjoner ble beregnet basert på Mr på 75.000 pr. bindingssete for mAbs og 51.000 pr. bindingssete for B7Ig.

Som vist i fig. 6, konkurrerte kun mAb BB-1 og ikke-merket B7Ig i nevneverdig grad med 125I-B7Ig-binding (halv-maksimale virkninger ved henholdsvis omtrent 22 nM og omtrent 175 nM). Hverken chimert mAb L6 eller mAb 9,3 konkurrerte effektivt i de konsentrasjonene som ble testet. I andre eksprerimenter, var konsentrasjonen av mAb 9,3 tilstrekkelige til å hemme binding av 125I-B7Ig til udødeliggjorte CD28Ig eller til celle-overflateuttrykt CD28 i > 90%.

Når konkurranseresultatene fra fig. 6 ble plottet i en Scatchard-presentasjon, ble en dissosiasjonskonstant, Kd, på omtrent 12 nM beregnet for bidning av 125I-B7 til udødelig-gjorte CTLA4Ig (fig. 7). Denne verdi er omtrent 20 ganger lavere enn den tidligere bestemte Kd for binding mellom 125I-B7Ig og CD28 (omtrent 200 nM) (Linsley et al.,

(1991), supra), hvilket viser at CTLA4 er en høyere affinitetsreseptor for B7-antigenet enn CD28-reseptoren.

For å identifisere molekyl(ene) på lymfoblastoide celler som bandt CTLA4Ig (fig. 7) , ble 1251-overflatemerkede celler analysert ved hjelp av immunpresipitasjonsanalyse (fig. 8) . B7+-CHO og PM LCL-celler ble overflatemerkedet med 1251, og ekstrahert med en ikke-ionisk detergent løsning som beskrevet ovenfor. Prøver på ekstrakter som inneholdt omtrent 1,5 x 107 cpm i et volum på 0,1 ml, ble analysert ved hjelp av immunpresipitering som beskrevet ovenfor uten tilsetting, eller med 2 fig hver av CD28Ig, CTLA4Ig eller CD5Ig. Vaskede immunbunnfall ble så analysert ved hjelp av SDS-PAGE (10-20% akrylamid-gradient) under reduserende betingelser. Gelen ble så tørket og autoradiografert. Den venstre side av fig. 8 viser et autoradiogram som ble oppnådd etter 1 dags eksponering. Den høyre delen av fig. 8 viser et autoradiogram av samme gelen etter 10 dagers eksponering. Autoradiogrammet i centerpanelet i fig. 8 ble også eksponert i 10 dager. Posisjonene for molekylvektstandard er også vist i denne fig.

Som vist i fig. 8, ble et diffust vandrende (Mr omtrent 50.000-75.000; senter ved omtrent 60.000) radiaktivt merket protein immunpresipitert ved hjelp av CTLA4Ig, men ikke med CD28Ig eller CD5Ig. Dette molekyl vandret sammen med B7 immunpresipitert fra B7+-celler med CTLA4Ig, og meget svakere, med CD28Ig. Disse funnene indikerer at CTLA4Ig binder et enkelt protein på lymfoblastoide celler som har samme størrelse som B7-antigenet.

Hemming av immunsvarene in vitro ved hjelp av CTLA4I<g>

Hemming av celledeling

Tidligere studier har vist at anti-CD28 mAb 9,3, og anti-B7 mAb BB-1, hemmer celledeling av alloantigenspesifikke Th-celler, så vel som immunoglobulin utskilt av alloantigen-presenterende B-celler (Damle et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 78:5096 (1981); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 16:1289 (1986)). Fordi CTLA4 er en høyaffinitetsreseptor for B7-antigenet som vist herved, ble løselig CTLA4Ig undersøkt for dets evne til å hemme disse svarene. Virkningene til CTLA4Ig på T-celledeling ble undersøkt i eksperimentet vist i fig. 9.

Primære blandede lymfocyttreaksjon- (MLR) blåster ble stimulert med bestrålte T51-lymfoblastoide celler (LC) i fravær av eller med ulike konsentrasjoner av gnager-mAb 9,3-Fab-rfagmenter, eller B7Ig, CD28Ig eller CTLA4Ig-immunoglobulin-Cr-fusjons-proteiner. Cellulær celledeling ble målt ved [3H]-tymidininnbygging etter 4 dager og er uttrykt som prosent innbygging i ubehandlede kulturer (21.000 cpm). Fig. 9 viser gjennomsnittet av kvadruplikate bestemmelser (SEM < 10%).

Som vist i fig. 9, hemmet CTLA4Ig MLR-reaksjonen på en doseavhengig måte med maksimum på > 90% med halv-maksimal effekt ved omtrent 30 ng/ml (omtrent 0,8 nM). Fab-fragmentet til mAb 9,3, som tidligere var vist å være en mer potent hemmer av MLR enn hel mAb 9,3 (Damle et al., J. Immunol. 140:1753-1761 (1988)), hemmet også MLR, men i høyere konsentrasjoner (omtrent 800 ng/ml eller omtrent 30 nM for halvmaksimal effekt). B7Ig og CD28Ig hemmet ikke i nevneverdig grad MLR selv ved høyere konsentrasjoner. I et annet eksperiment, overkom tilsettingen av B7Ig sammen med CTLA4I& delvis hemmingen av MLR ved hjelp av CTLA4Ig, hvilket antydet at hemmingen skyldtes spesifikt reaksjonene med B7-antigen.

Hemming av immunoglobulinsekresion

Effektene til CTLA4Ig på hjelper-T-celle- (Th) stimulert immunoglobulinsekresjon ble også undersøkt (fig. 10). CD4+-T-celler ble blandet med allogene CD19+-B-celler uten eller med de antydede immunoglobulinmolekylene som beskrevet ovenfor. Gnager-mAbs-OKT8 9,3 og BB-1 ble tilsatt i 20 /ig/ml, og Ig-fusjonsproteiner ved 10 /Ag/ml. Etter 6 dagers kultur, ble konsentrasjonene til human IgM (SEM < 5%) i kultursupernatantene bestemt ved hjelp av enzymimmunoassay (ELISA) som beskrevet ovenfor. IgM-produksjon ved B-celler dyrket i fravær av CD4+-T-celler, var 11 ng/ml.

Som vist i fig. 10, stimulerte CD4+-T-celler IgM-produksjonen til allogene CD19+-B-celler (i fravær av CD4+-T-celler, var IgM-nivåene redusert med 93%). mAbs 9,3 og BB-1 hemmet signifikant Th-stimulert IgM-produksjon (henholdsvis 63% og 65% hemming). CTLA4Ig var endog mer effektiv som hemmer (89% hemming) enn det disse mAbs var. Hemming ved kontroll-Ig-molekyler, mAb OKT8 og CD5Ig, var mye mindre (< 30% hemming). Ingen av disse molekylene hemmet i nevneverdig grad Ig-produksjon målt i nærværet av Staphylococcal aureus-enterotoksin B. Lignende resultater ble oppnådd med CD4+-T-celler og B-celler som stammet fra andre donorer. Disse resultatene antyder at hemmingen av CTLA4Ig er spesifikk.

Resultatene ovenfor viser også at CTLA4 og CD28-reseptorene er funksjonelt så vel som strukturelt beslektet. Som CD28, er CTLA4 også en reseptor for B-celle-aktiveringsantigenet, B7. CTLA4Ig bandt 125I-B7 med en affinitetskonstant, Kd, på omtrent 12 nM, en verdi som er 20 ganger høyere enn affiniteten mellom CD28 og B7Ig (omtrent 200 nM). Således kan CTLA4 og CD28 bli antatt å være henholdsvis høy- og lav-affinitetsreseptorer for samme ligand, B7-antigenet.

Den tilsynelatende affinitet mellom CD28 og B7 ligner den affinitet som er rapportert for binding av løselig alloantigen til T-cellereseptoren til en gnager-T-celle-hybridom (omtrent 100 nM; Schnek et al., Cell 56:47 (1989)), og er høyere enn reaksjonene mellom CD2 og LFA3 (Recny et al., J. Biol. Chem. 265:8542 (1990)), eller CD4 og MHC-klasse-H-molekyler (Clayton et al., Nature 339:548 (1989)). Den tilsynelatende affinitets-konstanten, Kd, mellom CTLA4 og B7 er enda høyere, og kan sammenlignes på gunstig måte med høyere affinitets-mAbs (Kd 2-10.000 nM; Alzari et al., Ann. Rev. Immuno. 6:555

(1988) ). Kd mellom CTLA4 og B7 er lik eller større enn Kd-verdiene til integrin-reseptorene og deres ligander (10-2000 nM; Hautanen et al., J. Biol. Chem. 264:1437-1442

(1989) ; Di Minno et al., Blood 61:140-148 (1983); Thiagarajan og Kelley, J. Biol. Chem. 263:035-3038 (1988)). Affiniteten i reaksjonen mellom CTLA4 og B7 er således blant de høyest hittil rapporterte for lymfoide adhesjonssystemer.

Disse resultatene viser den første ekspresjon av et funksjonelt proteinprodukt av CTLA4-transkripter. CTLA4Ig, en fusjonskonstruksjon som inneholder det ekstracellulære område til CTLA4, koblet til et IgCyl-område, danner en disulfidbundet dimer med Mr på omtrent 50.000 subenheter (fig. 1). Fordi ingen interkjededisulfider kunne på forhånd antas å dannes i Ig-delen til denne fusjon, synes det sannsynlig at cysteiner fra CTLA4 er innblandet i dannelse av disulfidbinding. Det analoge CD28Ig-fusjonsprotein (Linsley et al., supra, 1991) inneholder også interkjededisulfidbro(er). Disse resultatene antyder at CTLA4-reseptoren, liksom CD28 (Hansen et al., Immunogenetics 10:247-260 (1980)), eksisterer på T-celleoverflaten som en disulfidbundet homodimer. Skjønt CD28 og CTLA4 er sterke homologe proteiner, er de immunologisk forskjellige, fordi anti-CD28 mAb 9,3, gjenkjenner ikke CTLA4 (fig. 4 og 5).

Det er ikke kjent hvorvidt CTLA4 kan aktivere T-celler ved en signalreaksjonsvei analog til CD28. De cytoplasmatiske områdene til gnager- og human-CTLA4 er identiske (Dariavach et al., supra 1988), hvilket antyder at dette område har viktige funksjonelle egenskaper. De cytoplasmatiske områdene til CD28 og CTLA4 deler også homologi, skjønt det er ikke klart om dette er tilstrekkelig til å gi lignende signalegenskaper til de to molekylene.

CTLA4Ig er en kraftig hemmer av in vitro-lymfocyttfunksjoner som krever T-celle og B-cellesamarbeid (fig. 9 og 10). Disse funnene, sammen med tidligere studier, antyder den fundamentale viktighet når det gjelder reaksjoner mellom B7-antigen og dets mot-reseptorer, CD28 og/eller CTLA4, når det gjelder å regulere både T- og B-lymfocyttsvar. CTLA4Ig kunne være en nyttig forbindelse for fremtidige undersøkelser over rollen til disse reaksjonene under immunsvarene. CTLA4Ig er en kraftigere hemmer av in vitro-lymfocyttsvar enn enten mAb BB-1 eller mAb 9,3 (fig. 9 og 10). Den større potensen til CTLA4Ig sammenlignet med mAb BB-1, skyldes sannsynligvis forskjellen i affiniteter for B7 mellom disse molekylene (fig. 6). CTLA4Ig er også mer potent enn mAb 9,3, sannsynligvis fordi, ulikt mAb, har det ikke også direkte stimulerende virkninger på T-celledeling (June et al., Immunology Today 11:211 (1989)) som kan motvirke dets hemmende effekter. De immunundertrykkende virkningene til CTLA4Ig in vitro, antyder at fremtidige undersøkelser er påkrevet med tanke på mulige terapeutiske virkninger til dette molekylet for behandling av autoimminsykdommer som omfatter sykelig T-celleaktivering eller Ig-produksjon.

Claims (44)

1. Oppløselig CTLA4 molekyl, karakterisert ved at det omfatter den ekstracellulære domenen av CTLA4, eller fragment eller derivat derav, som binder et B7 antigen uttrykt på aktiverte B celler.

2. Oppløselig CTLA4 molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter 125 aminosyrer vist i SEKV ID NR: 14 begynnende med alanin i posisjon 1 og som avsluttes med asparaginsyre i posisjon 125 av aminosyresekvensen til den ekstracellulære domene av CTLA4 proteinet.

3. Oppløselig CTLA4 molekyl ifølge krav 2, karakterisert ved at det binder et B7 antigen uttrykt på aktiverte B-celler, omfattende 187 aminosyrer vist i SEKV ID NR: 14 begynnende med alanin i posisjon 1 og som avsluttes med asparagin i posisjon 187.

4. Oppløselig CTLA4 molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det er koblet til en ikke-CTLA4 proteinsekvens.

5. Oppløselig CTLA4 molekylprodukt ifølge krav 4, karakterisert ved at ikke-CTLA4 molekylet minst er en del av et immunoglobulinmolekyl.

6. Oppløselig CTLA4 molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det blir kodet av nukleinsyremolekylet betegnet ATTC nr. 68629.

7. Oppløselig CTLA4 molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det oppløselige CTLA4 molekylet er et CTLA4Ig fusjonsprotein som binder B7 antigenet, idet nevnte protein har en første aminosyresekven bestående av den ekstracellulære domenen av CTLA4 og en andre aminosyresekvens bestående av hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av et humant immunoglobulinmolekyl.

8. CTLA4Ig fusjonsprotein ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte protein har (a) en første aminosyresekvens begynnende med alanin i aminosyreposisjon 1 og som avsluttes med asparaginsyre i amiosyreposisjon 125 til SEKV ID NR: 13 som representerer den ekstracellulære domenen av CTLA4, og (b) en andre aminosyresekvens bestående av hengsel, CH2 og CH3 regioner av et humant immunoglobulinmolekyl.

9. Oppløselig CTLA4Ig molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det oppløselige CTLA4 molekylet er et CD28IG/CTLA4Ig fusjonsproteinhybrid som binder B7 antigenet, idet nevnte fusjonshybrid omfatter en første aminosyresekvens som tilsvarer en del av den ekstracellulære domenen av CD28 reseptor fusjonert til en andre aminosyresekvens som tilsvarer en del av den ekstracellulære domenen av CTLA4 reseptoren og en tredje aminosyresekvens som tilsvarer hengsel, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin.

10. Fusjonsproteinhybrid ifølge krav 9, karakterisert ved at den er et CTLA4 derivat, hvori den første aminosyresekvensen tilsvarer en del av den ekstracellulære domenen til CD28 reseptoren og den andre aminosyresekvensen tilsvarer aminosyrene 94-125 av den ekstracellulære domenen til CTLA4.

11. Fusjonsproteinhybrid ifølge krav 10, karakterisert ved at den første aminosyresekvensen tilsvarer aminosyrene 1-94 av den ekstracellulære domenen av CD28 reseptoren og den andre aminosyresekvensen tilsvarer aminosyrene 94-125 av den ekstracellulære domenen av CTLA4.

12. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter hvilke som helst av sammensetningene i kravene 1,2,3,4,6,7 eller 9, og en akseptabel farmasøytisk bærer.

13. Anvendelse av hvilket som helst av sammensetningene ifølge kravene 1,2, 3,4, 6, 7 eller 9, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning.

14. Anvendelse ifølge krav 13, hvori den farmasøytiske sammensetningene er for behandling av immunsykdommer, behandling av cancer, regulering av T-celle-proliferasjon, behandling av en viral infeksjon og/eller regulering av cellemedierte immunresponser hvori a) immunsyksommer er en autoimmun sykdom, allograft avstøtning, kroniske allergiske reaksjoner, transplantatavstøtning eller graft versus host sykdom, b) den virale infeksjonen er en HIV infeksjon eller HTLV1 infeksjon.

15. Anvendelse ifølge krav 14, hvori immunresponsen er regulert ved blokkering av B7 interaksjonen med lymfocytter.

16. Anvendelse av det oppløselige CTLA4 molekylet ifølge krav 1, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling immunsystemsykdommer mediert av T-celleinteraksjoner med B7 positive celler, hvori proteinet er a) et fusjonsprotein reaktivt med B7 antigen med en første aminosyresekvens som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresider som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin Cyl, b) et fusjonsprotein reaktivt med B7 antigen som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regionene av humant immunoglobulin Cyl, c) et hybrid fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigen som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav I, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin Cyl, eller d) kodet av en DNA sekvens med ATCC nr. 68629.

17. Anvendelse av det oppløselige CTLA4 molekylet ifølge krav 1, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, idet det oppløselige CTLA4 molekylet er nyttig for regulering av CTLA4 positive T-celle interaksjoner med B7 positive celler, hvor liganden er a) et oppløselig CTLA4 molekyl ifølge krav 2, b) et fusjonsprotein som inneholder minst en del av den ekstracellulære domenen av CTLA4, c) et fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigenet som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin Cyl, d) et fragment eller derivat av et fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigenet som har en første aminosyresekvens som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunglobulin Cyl, e) et fragment eller derivat av et fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigenet som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin Cyl, f) et fragment eller derivat av et fusjonsprotein som koder for en DNA sekvens med ATTC nr. 68629, eller g) et hybrid fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigenet som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin Cyl.

18. Anvendelse av minst et monoklonalt antistoff som er spesifikt reaktivt med fusjonsproteinet ifølge krav 7 eller 9, som omfatter en aktiv bindende region som er reaktiv med den ekstracellulære domenen av en CTLA4 reseptor for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av autoimmunitet, transplantasjon, infeksiøse sykdommer eller neoplasi.

19. Isolert nukleinsyremolekyl, karakterisert ved at det koder for CTLA4 ifølge krav 1,2 eller 3.

20. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et cDNA som har sekvensen ifølge SEKV ID NR: 13.

21. cDNA ifølge krav 20, karakterisert ved at det er vist i SEKV ID NR: 13 begynnende med guanin i posisjon 1 og som avsluttes med cytosin i posisjon 375.

22. Plasmid, karakterisert ved at det omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.

23. Vertsvektorsystem, karakterisert ved at det omfatter et plasmid ifølge krav 22 i en egnet vertscelle.

24. Vertsvektorsystem ifølge krav 23, karakterisert ved at den egnede vertscellen er en bakteriell celle eller en eukaryotisk celle.

25. Fremgangsmåte for fremstilling av et oppløselig CTLA4 molekyl, karakterisert ved at den omfatter dyrking av vertsvektorsystemet ifølge krav 23, for å produsere det oppløselige CTLA4 molekylet i verten og isolering av oppløselig CTLA4 molekyl som dermed blir produsert.

26. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det gjenkjenner og binder den ekstracellulære domenen av CTLA4 hvori nevnte binding forhindrer binding av CTLA4 til B7 antigenet.

27. Monoklonalt antostoff ifølge krav 26, karakterisert ved at den ekstracellulære domenen av CTLA4 er innenfor et CTLA4 fusjonsprotein omfattende en aminosyresekvens som omfatter et fragment av den ekstracellulære domenen av CTLA4 som blokkerer T-celleproliferasjonen, begynnende med alanin i aminosyreposisjon 1 og som avsluttes med asparaginsyre i aminosyreposisjon 125 ifølge SEKV ID NR: 14 og som representerer den ekstracellulære domenen av CTLA4.

28. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter hvilke som helst av kravene 26-27 og en akseptabel farmasøytisk bærer.

29. Anvendelse av hvilke som helst av sammensetningene ifølge kravene 26-27, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning.

30. Anvendelse ifølge krav 29, hvori den farmasøytiske sammensetningen er for. behandling av immunsykdommer, og behandling av cancer, regulering av T-celle proliferasjon, behandling av en viral infeksjon og/eller regulering av celle-medierte immunresponser hvori a) immunsykdommen er en autoimmun sykdom, allograft avstøtning, kroniske allergiske reaksjoner, transplantatavstøtning eller graft versus host syksom, og b) den virale infeksjonen er en HIV infeksjon eller HTLV1 infeksjon.

31. Anvendelse ifølge krav 30, hvori immunresponsen er regulert ved blokkering av B7 interaksjonen med lymfocytter.

32. Monoklonalt antistoff ifølge krav 26, karakterisert ved at det monoklonale antistoffet a) omfatter en aktiv bindende region som er reaktiv med den ekstracellulære domenen av CTLA4 reseptoren, og b) er spesifikk reaktivt med et fusjonsprotein som er reaktivt med B7 antigenet som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regionene av humant immunoglobulin Cyl.

33. Monoklonalt antistoff ifølge krav 26, karakterisert ved at det omfatter a) en aktiv bindende region som er reaktiv med den ekstracellulære domenen av CTLA4 reseptoren, og b) er reaktiv med et hybrid fusjonsprotein reaktivt med B7 antigenet som har en første aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 ifølge krav 1, omfattende aminosyreresidiet Thr 111 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidier som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin Cyl.

34. Anvendelse av det monoklonale antistoffet reaktivt med CTLA4 ifølge krav 26, eller et fragment derav, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning.

35. Anvendelse av minst et monoklonalt antistoff ifølge krav 26, som er spesifikt reaktivt med et CTLA4 fusjonsprotein, idet nevnte antistoff omfatter en aktiv bindende region som er reaktiv med den ekstracellulære domenen av CTLA4, omfattende en aminosyresekvens fra omtrent posisjon 1 til omtrent posisjon 125 og aminosyreresidiet treonin i posisjon 111, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av autoimmunitet, transplantasjon, infeksiøse sykdommer eller neoplasi.

36. Anvendelse av et monoklonalt antistoff, Fab eller F(ab').sub.2 fragmenter reaktive med CTLA4, for fremstilling en farmasøytisk sammensetning for å inhibere interaksjonen av CTLA4 positive T-celler og B7 positive B-celler og dermed regulere CTLA4 positive T-celleinteraksjoner med B7 positive B-celler.

37. Fremgangsmåte for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning nyttig for behandling av immunsystemforstyrrelser mediert av T-celleinteraksjoner med B7 positive celler, karakterisert ved at den omfatter sammenblanding av et protein ifølge kravene 1,2, 3,4, 7, 8, 9,26 eller 27 med en farmasøytisk akseptabel bærer.

38. In vitro fremgangsmåte for regulering av funksjonelle CTLA4 positive T-celle-interaksjoner med B7 positive celler, karakterisert ved at den omfatter kontakt med B7 positive celler med et ligand for B7 antigen, i en mengde som er effektiv for å interferere med reaksjonen av endogent B7 antigen med CTLA4.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 38, karakterisert ved at nevnte ligand er et monoklonalt antistoff reaktivt med B7 antigen.

40. Fremgangsmåte ifølge krav 39, karakterisert ved at nevnte antistoff er anti-BBl monoklonalt antistoff.

41. Anvendelse av en ligand for CTLA4, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for regulering av CTLA4 positive T-celleinteraksjoner med andre celler.

42. Anvendelse ifølge krav 41, hvori nevnte ligand er B7 antigen eller et B7 fusjonsprotein.

43. Anvendelse ifølge krav 42, hvori nevnte ligand er B7Ig et fusjonsprotein omfattende en aminosyresekvens som tilsvarer den ekstracellulære domenen av B7 og hengselsregion, CH2 og CH3 regioner av human immunoglobulin Cyl.

44. Anvendelse av en ligand for B7 antigenet, i en mengde som er effektiv for å interferere med reaksjonen av endogent B7 antigen med CTLA4, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning hvori nevnte B7 ligand er a) et fusjonsprotein som inneholder en del av den ekstracellulære domenen av CTLA4, idet delen binder B7, b) et CTLA4Ig fusjonsprotein som inneholder en første aminosyresekvens inneholdende aminosyreresidiene fra posisjon 1 til posisjon 125 av aminosyresekvensen som tilsvarer den ekstracellulære domenen av CTLA4 og en andre aminosyresekvens inneholdende aminosyresekvens residier tilsvarende hengselsregioner, CH2 og CH3 regioner av humant immunoglobulin, c) et CD28Ig/CTLA4Ig fusjonsprotein hybrid inneholdende en første aminosyre sekvens tilsvarende en del av den ekstracellulære domenen av CD28 reseptoren, idet delen binder B7, fusjonert til en annen aminosyre sekvens tilsvarende en del av den ekstracellulære domenen av CTLA4 reseptoren, idet delen binder B7, og en tredje aminosyre sekvens som tilsvarer hengselsregionen, CH2 og CH3 regionene av humant immunoglobulin, eller d) et oppløselig CTLA4 molekyl.