CN1198646C - 抗体与人b7.1和b7.2之间独特结合相互作用的鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异于人B7.1抗原(CD80)、能抑制B7.1与CD28受体结合、不能抑制B7.1与CTLA-4受体结合的抗体的鉴定。尽管存在第二个活化配体B7.2(CD86)，但其中两种抗体，16C10和7C10明显抑制IL-2的产生。用这些抗体阻断CD28与B7.1(CD80)之间的主要活化信号，而允许CTLA-4与B7.1和/或B7.2的未减弱或一致的相互作用代表了对阳性共刺激的拮抗作用与对阴性信号传递的兴奋作用并存。这些抗体可被用作特异性的免疫抑制剂，例如用于治疗自身免疫病和预防器官移植排斥反应。

Description

抗体与人B7.1和B7.2之间 独特结合相互作用的鉴定

                      发明领域

本发明涉及特异于B7.1抗原(CD80)的单克隆抗体的鉴定和应用。本发明更具体地涉及能抑制人B7.1抗原与CD28受体结合，但不能抑制B7.1与CTLA-4受体结合的单克隆抗体或其灵长化(primatized)形式的鉴定和应用。因此，本发明涉及识别B7.1抗原上除CTLA-4受体结合位点外的特异性位点的单克隆抗体或其灵长化形式的鉴定和应用。

本发明还涉及识别人B7.1抗原上的特异性位点并能抑制IL-2产生的单克隆抗体或其灵长化形式。

本发明还涉及含有特异于B7.1抗原的单克隆或灵长化抗体的药物组合物，及其作为免疫抑制剂的用途，所述免疫抑制剂通过调节B7：CD28途径，可治疗例如自身免疫病和预防器官排斥。

                         发明背景

长期以来，人们已经意识到免疫学，血液学和肿瘤学之间存在临床交叉。由血液学或肿瘤学专家治疗的很多疾病在其病理生理学上既具有自身免疫的成分又具有免疫缺损的成分，这使得血液学专家广泛应用免疫抑制药物疗法，而肿瘤学专家则寻求能增强对肿瘤的内源性免疫力的免疫学辅助物。迄今为止，这些干预一般由非特异性方式的免疫抑制和免疫刺激组成。除这些干预的效力有限外，其非特异性所致的毒性也限制了它们全面的成功，因此，已经在寻求其它的策略。

阐明数目快速增加的细胞表面分子的功能作用为免疫学与临床血液学和肿瘤学的一体化作出了巨大贡献。在免疫和造血系统的细胞中已鉴定出将近200个细胞表面抗原(Schlossman SF，Boumsell L，Gilks JM，Harlan T，Kishimoto，C Morimoto C，Ritz J.，Shaw S，SilVersteinRL，Springer TA，Tedder TF，Todd RF：CD抗原(1993)，血液83：879，1994)。这些抗原代表的是受谱系限制的和更广泛分布的分子，其中所述分子参与多个过程，包括细胞识别，粘着，增殖的诱导和维持，细胞因子分泌，效应物功能，甚至细胞死亡。

对这些分子功能属性的认识促进了操纵免疫应答的新尝试。尽管参与细胞粘着和抗原特异性识别的分子以前曾被评价为治疗性免疫学干预的靶，但最近人们着力研究的是被称为共刺激分子的细胞表面分子亚组(Bretscher P：“21年后，淋巴细胞活化的双-信号模型”，今日免疫学，13：73(1992)；Jenkins MK，Johnson JG：“参与T细胞共刺激的分子”，免疫学最新看法，5：351(1993)；Geppert T，Davis L.Gur H.WacholtzM.Lipsky P：“参与T细胞活化的佐细胞信号”，免疫学评论，117：5(1990)；Weaver CT，Unanue ER：“抗原呈递细胞的共刺激功能”，今日免疫学，11：49(1990)；Stennam RM，Young JW：“抗原呈递细胞产生的信号”，免疫学最新看法，3：361(1991))。共刺激分子不会引发但能产生和扩大抗原特异性T细胞应答和效应物功能(Bretscher P：“21年后，淋巴细胞活化的双-信号模型”，今日免疫学，13：73(1992)；Jenkins MK，JohnsonJG：“参与T细胞共刺激的分子”，免疫学最新看法，5：351(1993)；GeppertT。Davis L.Gur H.Wacholtz M.Lipsky P：“参与T细胞活化的佐细胞信号”，免疫学评论，117：5(1990)；Weaver CT，Unanue ER：“抗原呈递细胞的共刺激功能”，今日免疫学，11：49(1990)；Stennam RM，YoungJW：“抗原呈递细胞产生的信号”，免疫学最新看法，3：361(1991)；JuneCH，Bluestone JA，Linsley PS，Thompson CD：“CD28受体在T细胞活化中的作用”，今日免疫学，15：321(1994))。

最近，不同的研究小组研究了一个被称为B7：CD28的特异性共刺激途径，因为该途径在B和T细胞活化中作用显著(June CH，Bluestone JA，Linsley PS，Thompson CD：“CD28受体在T细胞活化中的作用”，今日免疫学，15：321(1994)；June CH，Ledbetter JA：“CD28受体在针对抗原的T细胞应答过程中的作用”，免疫学年评，11：191(1993)；SchwartzRH：“T淋巴细胞的共刺激：CD28，CTLA-4和B7/BB1在白细胞介素-2的产生和免疫疗法中的作用”，细胞71：1065-1068(1992)；Jenkins MK，Taylor PS，Norton SD，Urdahl KB：“CD28传递参与人T细胞产生抗原特异性IL-2的共刺激信号”，免疫学杂志，147：2461-2466(1991)).由于4年前就发现了这种配体：受体途径，因此，已积累的大量证据表明B7：CD28相互作用代表测定免疫反应性与无反应性中的一个重要时机(June CH，Bluestone JA，Linsley PS，Thompson CD：“CD28受体在T细胞活化中的作用”，今日免疫学，15：321(1994)；June CH，LedbetterJA：“CD28受体在针对抗原的T细胞应答过程中的作用”，免疫学年评，11：191(1993)；Schwartz RH：“T淋巴细胞的共刺激：CD28，CTLA-4和B7/BB1在白细胞介素-2的产生和免疫疗法中的作用”，细胞71：1065-1068(1992)；Cohen J：“有目的地打击不必要的免疫应答”(新闻；评论)科学，257：751(1992)；Cohen J：“新蛋白质，即T细胞的‘共刺激物’抢出风头”(新闻；评论)科学，262：844(1993))。

具体地说，已报道人B7抗原，即人B7.1(CD80)和B7.2(CD86)在T细胞活化中起着共刺激作用，例见Gimmi CD，Freeman，GJ，Gribben JG，Sugita K，Freedman AS，Morimoto C，Nadler LM：“B细胞表面抗原B7提供诱导T细胞增殖和分泌白细胞介素2的共刺激信号”Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：6575-6579(1991)。

1.B7.1和B7.2在T细胞活化中的共刺激作用

成功免疫应答的具体运作取决于T细胞和抗原呈递细胞之间一系列特异性的相互作用。尽管在MHC II类分子的上下文中，此过程必要的第一步取决于抗原与T细胞受体的结合(Lane，P.J.L.，F.M.McConnell，G.L.Schieven，E.A.Clark和J.A.Ledbetter(1990)，“II类分子在人B细胞活化中的作用”，免疫学杂志，144：3684-3692)，但仅有这种相互作用不足以诱导对给定抗原作出持续反应所必需的所有情况(Schwartz，R.H.(1990)，“T淋巴细胞克隆无反应性的细胞培养模型”，科学，248：1349；Jenkins，M.K.(1992)，“细胞分裂在诱导克隆无反应性中的作用”，今日免疫学，13：69；Azuma，M.，M.Cayabyab，D.Buck，J.H.Phillips和L.L.Lanier(1992)，“CD28参与由人天然杀伤性白血病细胞系介导的MHC-非限制性细胞毒性”，免疫学杂志，149：1115-1123；Azuma，M.，M.Cayabyab，D.Buck，J.H.Phillips和L.L.Lanier(1992)，“CD28与B7的相互作用共同刺激初次同种异体增殖性应答和由小的静息T淋巴细胞介导的细胞毒性”，实验医学杂志，175：353-360；S.D.Norton，L.Zuckerman，K.B.Urdahl，R.Shefner，J.Miller和M.K.Jenkins(1992)，“CD28的配体B7通过为T细胞提供共刺激信号以增强IL-2产生”，免疫学杂志，149：1556-1561；R.H.Schwartz：“T淋巴细胞的共刺激：CD28，CTLA-4和B7/BB1在白细胞介素-2的产生和免疫疗法中的作用”，细胞71：1065-1068(1992))。

其它一些共刺激分子的参与是必要的(Norton，S.D.，L.Zuckerman，K.B.Urdahl，R.Shefner，J.Miller和M.K.Jenkins(1992)，“CD28的配体B7通过为T细胞提供共刺激信号增强IL-2产生”，免疫学杂志，149：1556-1561)。在T细胞上表达的同二聚体CD28和CTLA-4(June CH，J.A.Ledbetter，P.S.Linsley和C.B.Thompson(1990)：“CD28受体在T细胞活化中的作用”，今日免疫学，11：211-216；Linsley，P.S.，W.Brady，M.Urnes，L.S.Grosmaire，N.K.Damle和J.A.Ledbetter(1991)，“CTLA-4是B细胞活化抗原B7的第二受体”，实验医学杂志，174：561)，与抗原呈递细胞上表达的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)是维持免疫应答所必需的主要共刺激分子对(Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits和L.L.Lanier(1993)，“B7/BB1在活化的T淋巴细胞上的功能性表达”，实验医学杂志，177：845-850；Freeman，G.J.，A.S.Freedman，J.M.Segil，G.Lee，J.F.Whitman和LM.Nadler(1989)，“B7，在活化的和致瘤性B细胞上具有独特表达的Ig超家族新成员”，免疫学杂志，143：2714-2722；Hathcock，K.S.，G.Laslo，H.B.Dickler，J.Bradshaw，P.Linsley和R.J.Hodes(1993)，“共刺激T细胞活化的CTLA-4配体的鉴定”，科学，262：905-911；Hart，D.N.J.，G.C.Starling，V.L.Calder和N.S.Fernando(1993)，“B7/BB-1是人树状细胞上由活化诱导的白细胞分化抗原”，免疫学，79：616-620)。在体外可以表明这些共刺激信号的缺乏导致失败的T细胞活化途径和对特异性抗原产生非反应性或无反应性(例见Harding，F.A.，J.G.McArthur，J.A.Gross，D.M.Raulet和J.P.Allison(1992)，“CD28介导的信号传递共刺激鼠T细胞并防止在T细胞克隆中诱导无反应性”，自然，356：607-609；Gimmi，C.D.，G.J.Freeman，J.G.Gribben，G.Gray和L.M.Nadler(1993)，“缺乏B7共刺激时抗原呈递诱导人T细胞克隆无反应性”，Proc.Natl.Acad.Sci，90：6586-6590；Tan，P.，C.Anasefti，J.A.Hansen，J.Melrose，M.Brunvand，J.Bradshaw，J.A.Ledbetter和P.S.Linsley(1993)，“通过阻断CD28与其天然配体B7/BB1的相互作用在人T淋巴细胞中诱导同种抗原-特异性低反应性”，实验医学杂志，177：165-173)。体内耐受性的获得构成了免疫抑制和器官移植排斥的活体疗法以及治疗自身免疫病的机理.给实验模型施用CTLA-4Ig之后能达到上述目的(Lenschow，D.J.Y.Zeng，R.J.Thistlethwaite，A.Montag，W.Brady，M.G.Gibson，P.S.Linsley和J.A.Bluestone(1992)，“由CTLA-4Ig诱导的异种胰岛移植物的长期存活”，科学，257：789-795)。

B7.1和B7.2分子能与CD28或CTLA-4结合，虽然B7.1与CD28结合的kd为200Nm，而与CTLA-4结合的亲合力要高20倍(Linsley，P.S.，E.A.Clark和J.A.Ledbetter(1990)，“T细胞抗原CD28通过与活化抗原B7/BB-1相互作用介导与B细胞的粘着”，Proc.Natl.Acad.Sci，87：5031-5035；Linsley等(1993)，“CD28受体在针对抗原的T细胞应答过程中的作用”，免疫学年评，11：191-192；Linsley等(1993)，“B7/BB-1导致的CD28的参与诱导CD28合成的瞬时下调和对CD28所传递信号的延长的无反应性”，免疫学杂志，150：3151-3169)。B7.1在活化的B细胞和由干扰素诱导的单核细胞上表达，但不在静息B细胞上表达(Freeman，G.J.，G.S.Gray，C.D.Gimmi，D.B.Lomarrd，L-J.Zhou，M.White，J.D.Fingeroth，J.G.Gribben和LM.Nadler(1991)，“人B淋巴细胞活化抗原B7的鼠同系物的结构，表达和T细胞共刺激活性”，实验医学杂志，174：625-631)。另一方面，B7.2以很低的水平在静息单核细胞，树状细胞和B细胞上组成型表达，在活化的T细胞，NK细胞和B淋巴细胞上其表达有所增强(Azuma，M.D.Ito，H.Yagita，K.Okumura，J.H.Phillips，L.L.Lanier和C.Somoza，1993，“B70抗原是CTLA-4和CD28的第二配体”，自然，366：76-79)。尽管B7.1和B7.2可在相同的细胞类型上表达，但它们以不同的动力学在B细胞中表达(Lenschow，D.J.，G.H.Su，L.A.Zuckerman，N.Nabavi，C.L.Jellis，G.S.Gray，J.Miller和J.A.Bluestone(1993)，“CTLA-4其它配体的表达和功能重要性”，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，90：11054-11058；Boussiotis，V.A.，G.J.Freeman，J.G.Gribben，J.Daley，G.Gray和L.M.Nadler(1993)，“活化的人B淋巴细胞表达三个共刺激T细胞活化的CTLA-4反受体”，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，90：11059-11063)。在RNA水平上的进一步分析阐明B7.2mRNA组成型表达，而B7.1mRNA在活化后4小时才能检测到，并且直到刺激后24小时才可检测到最初低水平的B7.1蛋白(Boussiotis，V.A.，G.J.Freeman，J.G.Gribben，J.Daley，G.Gray和L.M.Nadler(1993)，“活化的人B淋巴细胞表达三个共刺激T细胞活化的CTLA-4反受体”，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，90：11059-11063)。因此，CTLA-4/CD28反受体可在B细胞活化后的不同时间表达。

最近，已阐明第二个与T细胞相关的共同受体CTLA-4明显起负调节物的作用以阻止脱离控制的免疫系统和使之无效(Krummel M，Allison J：“CD28和CTLA-4对T细胞对刺激的反应具有相反的作用”，实验医学杂志，182：459-466(1995))。CTLA-4受体在下调免疫应答时起着重要作用，这一点已在CTLA-4剔除小鼠中得以证实。出生时不具备表达CTLA-4基因的能力的剔除小鼠在3-4周内即死于严重的淋巴增生性疾病(Tivol EA，Borriello G，Schweitzer AN，Lynch WP，Bluestone JA，Sharpe AH：“CTLA-4的缺乏导致大量淋巴增生和致命的多器官组织破坏，这表明CTLA-4重要的负调节作用”，免疫力，3：541-547(1995))。据认为CTLA-4通过与诱导细胞凋亡相关联的信号传递机制起作用(Gribben JG，Freeman GJ，Boussiotis VA，Rennert P，Jellis CL，Greenfield E，Barber M，Restivo JR.VA，Ke X，Gray GS，Nadler LM：“CTLA-4介导人T细胞的抗原特异性细胞凋亡”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)92：811-815(1995))，通过至今尚未限定的配体引发与受体特异性位点的结合。在体外已阐明以多种方式阻断依赖于B7.1/B7.2的共刺激信号会导致T细胞活化途径失效，并对特异性抗原产生非反应性(Lederman S，Chess L，Yellin MJ：“识别人T淋巴细胞表面糖蛋白的鼠单克隆抗体(5c8)，含有所述抗体的组合物”，美国专利5,474,771(1995-12-12)；Linsley PS，Ledbetter JA，Damle NK，Brady W：“嵌合的CTLA4受体及其使用方法”，美国专利5,434,131(1995-7-18)；Harding，1992；Gimmi CD，Freeman GJ，Bribben JG，Gray G，Nadler LM：“缺乏B7共刺激时由抗原呈递诱导人T细胞克隆无反应性”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90：6586-6590(1993)；Tan P，Anasetti C，Hansen JA，MelroseJ，Brunvand M，Bradshaw J，Ledbetter JA，Linsley PS：“通过阻断CD28与其天然配体B7/BB1的相互作用在人T淋巴细胞中诱导同种抗原-特异性低反应性”，实验医学杂志，177：165-173(1993))。体内耐受，无反应性或抗原特异性T细胞被除尽的获得构成了免疫抑制和器官移植排斥的活体疗法或对自身免疫病进行可能的治疗的机理。

B7.1和B7.2的差异时间表达说明这两个分子与CTLA-4和/或CD28的相互作用给T细胞传递了不同但相关的信号(LaSalle，J.M.，P.J.Tolentino，G.J.Freeman，L.M.Nadler和D.A.Hafler(1992)，“CD28和T细胞抗原受体信号传导响应超抗原刺激以协调白细胞介素2基因表达”，实验医学杂志，176：177-186；Vandenberghe，P.，G.J.Freeman，L.M.Nadler，M.C.Fletcher，M.Kamoun，L.A.Turka，J.A.Ledbetter，C.B.Thompson和C.H.June，(1992)，“抗体和B7/BB1-介导的CD28受体的连接诱导人T细胞中的酪氨酸磷酸化”，实验医学杂志，175：951-960)。目前仍不知道T细胞上的CTLA-4和CD28的确切的信号传递功能(Janeway，C.A.，Jr.和K.Bottomly，(1994)，“淋巴细胞反应的信号和迹象”，细胞，76：275-285)。然而，一套受体可以为T细胞活化提供最初的刺激物，另外，持续的信号能够进一步地展开途径和进行克隆扩增(Linsley，P.S.，J.L.Greene，P.Tan，J.Bradshaw，J.A.Ledbetter，C.Anasetti和N.K.Damle，(1992)，“CTLA-4与CD28在活化的T淋巴细胞上的共表达和功能协作”，实验医学杂志，176：1595-1604)。最新的资料支持由Jenkins和Schwartz提出的两-信号假说(Schwartz，R.H.，(1990)，“T淋巴细胞克隆无反应性的细胞培养模型”，科学，248：1349；Jenkins，M.K.，(1992)，“细胞分裂在诱导克隆无反应性中的作用”，今日免疫学，13：69)，TCR和共刺激信号都是T细胞扩展，淋巴因子分泌和效应物功能全面展开所必需的(Greenan，V.和G.Kroemer，(1993)，“细胞免疫耐受的多个路径”，今日免疫学，14：573)。传递第二信号的失败导致T细胞不能分泌IL-2并使得细胞对抗原呈无反应性。

结构上，B7.1和B7.2都含有胞外免疫球蛋白超家族V和C-样区域，疏水跨膜区和胞质尾(Freeman，G.J.，J.G.Gribben，V.A.Boussiotis，J.W.Ng，V.Restivo，Jr.，L.A.Lombard，G.S.Gray和L.M.Nadler，(1993)，“B7.2的克隆：共刺激人T细胞增殖的CTLA-4反受体”，科学，262：909)。B7.1和B7.2都是高度糖基化的。B7.1是44-54KD的糖蛋白，该糖蛋白由223个氨基酸的胞外区域，23个氨基酸的跨膜区域和61个氨基酸的胞质尾组成。B7.1含有3个潜在的蛋白激酶磷酸化位点(Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits和L.L.Lanier，(1993)，“B7/BB1在活化的T淋巴细胞上的功能性表达”，实验医学杂志，177：845-850)。B7.2是306个氨基酸的膜糖蛋白，它由220个氨基酸的胞外区域，23个氨基酸的疏水跨膜区域和60个氨基酸的胞质尾组成(Freeman，G.J.，A.S.Freedman，J.M.Segil，G.Lee，J.F.Whitman和LM.Nadler(1989)，“B7，在活化的和致瘤性的B细胞上具有独特表达的Ig超家族新成员”，免疫学杂志，143：2714-2722)。尽管B7.1和B7.2基因都位于相同的染色体区域(Freeman，G.J.，D.B.Lombard，C.D.Gimmi，S.A.Brod，L Lee，J.C.Laning，D.A.Hafler，M.E.Dorf，G.S.Gray，H.Reiser，C.H.June，C.B.Thompson和L.M.Nadler，(1992)，“CTLA-4和CD28mRNA在活化后的大多数T细胞上共表达”，免疫学杂志，149：3795-3801；Schwartz，R.H.，(1992)，“淋巴细胞的共刺激：CD28，CTLA-4和B7/BB1的作用”，于Selvakumar，A.，B.K.Mohanraj，R.L.Eddy，T.B.Shows，P.C.White，C.Perrin，和B.Dupont(1992)，“编码B淋巴细胞活化抗原B7的人基因的基因组构成和染色体定位”，免疫遗传学，36：175-181)，这些抗原不共享高水平的同源性，B7.1和B7.2之间的全部同源性为26％，鼠B7.1和人B7.1之间的全部同源性为27％(Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits和L.L.Lanier，(1993)，“B7/BB1在活化的T淋巴细胞上的功能性表达”，实验医学杂志，177：845-850；Freeman，G.J.，A.S.Freedman，J.M.Segil，G.Lee，J.F.Whitman和LM.Nadler(1989)，“B7，在活化的和致瘤性的B细胞上具有独特表达的Ig超家族新成员”，免疫学杂志，143：2714-2722)。尽管人B7.1，人B7.2和鼠B7.1序列的排列表明具有长同源性的序列段很少，但已知所有这三个分子都与人CTLA-4和CD28结合，因此，这三个分子很可能享有共同的，或密切同源的区域，该区域或者是邻接的，或者是构象的。所述区域可构成B7.1和B7.2分子与它们的反受体的结合位点。针对这些表位产生的抗体可有效地抑制B7与T细胞上的其反受体的相互作用。另外，与B7.1和B7.2分子上的此区域交叉反应的抗体比分别针对B7.1或B7.2的抗体可能更具有实际可行的好处。

2.阻断B7/CD28相互作用

阻断B7/CD28相互作用可以诱导特异性的免疫抑制，所述免疫抑制具有产生长期的抗原特异性治疗效果的潜能。暂时阻断这种相互作用的抗体或药剂可成为具有产生长期的抗原特异性治疗效果潜能的，有用的，特异性的和安全的临床免疫抑制剂。

如通过在体外抑制IL-2的产生所测定的，已表明B7.1或B7.2的抗体可阻断T细胞活化(DeBoer，M.，P.Parren，J.Dove，F.Ossendorp，G.van der Horst和J.Reeder(1992)，“新的抗B7单克隆抗体的功能性鉴定”，欧洲免疫学杂志，22：3071-3075；Azuma，M.，H.Yssel，J.H.Phillips，H.Spits和L.L.Lanier，(1993)，“B7/BB1在活化的T淋巴细胞上的功能性表达”，实验医学杂志，177：845-850)。然而，不同的抗体显示出不同的免疫抑制效力，这可以反映出它们的亲合性或表位特异性。对此现象的可能的解释是一些抗体仅能阻断B7与CD28的结合，却在活化的T细胞中经由CTLA-4受体促进了细胞凋亡或一些其它形式的负信号传递。实际上，一些针对B7.1或B7.2的抗体通过与CTLA-4结合区域交叉反应可阻碍CTLA-4的活性，CTLA-4Ig融合蛋白和抗CD28Fab显示出对IL-2产生的下调具有类似的作用。

体内施用可溶性的CTLA-4Ig融合蛋白已表明可抑制小鼠体内依赖于T细胞的抗体应答(Linsley，P.S.，J.L.Greene，P.Tan，J.Bradshaw，J.A.Ledbetter，C.Anasetti和N.K.Damle(1992)，“CTLA-4和CD28在活化的T淋巴细胞上的共表达和功能性合作”，实验医学杂志，176：1595-1604；Lin，H.，S.F.Builing，P.S.Linsley，R.O.Wei，C.D.Thompson和L.A.Turka(1993)，“由CTLA-4-Ig加上供体特异性输血诱导的对与主要组织相容性复合物错配的心脏同种移植物的长期接受”，实验医学杂志，178：1801)，另外，较大的剂量还能抑制对第二次免疫的反应，这表明了该方法在治疗抗体介导的自身免疫病中的可行性。另外，在小鼠中，CTLA-4Ig能通过直接抑制T细胞与B7.1/B7.2抗原呈递细胞的相互作用来防止胰岛细胞排斥(Lenschow，D.J.，G.H.Su，L.A.Zuckerman，N.Nabavi，C.L.Jellis，G.S.Gray，J.Miller和J.A.Bluestone(1993)，“CTLA-4其它配体的表达和功能重要性”，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：11054-11058)。此时，获得长期的供体特异性的耐受性。

3.用于选择抗体的重组噬菌体展示技术

迄今为止，尚未报道过与B7.1和B7.2发生交叉反应的单克隆抗体。另外，尚未报道过特异于B7.1或B7.2，也识别抗原上仅限于与共活化受体CD28结合的特异性位点的单克隆抗体。或者，尚未报道过特异于B7.1或B7.2，也识别抗原上除CTLA-4受体结合位点外的特异性位点的单克隆抗体。如上文所讨论，这种抗体作为免疫抑制剂可能是很合适的。

由于相对于传统方法而言，噬菌体展示技术可评估更大百分比的免疫所有组成成分，因此开始以此技术取代传统方法以分离免疫应答过程中产生的抗体。这部分是由于PEG融合失效，染色体的不稳定，和大量组织培养物及与异源杂交瘤产生相关的筛选。与之形成对照的是：噬菌体展示技术依靠可能捕获到免疫球蛋白基因的全部组成成分的分子技术，所述基因与针对给定抗原的反应有关。

此技术由Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，7978-7982(1991)描述。实质上，免疫球蛋白重链基因被PCR扩增，并以产生重链融合蛋白的形式克隆至含有编码丝状噬菌体M13的次要外被蛋白的基因的载体中。装配时将重链融合蛋白与轻链基因一起掺入M13噬菌体颗粒中。每个重组噬菌体的基因组中含有在其表面展示的不同抗体Fab分子的基因。在这些文库中，可克隆和展示超过10⁶个不同抗体。在包被有抗原的微升孔中淘选噬菌体文库，洗下非特异性的噬菌体，洗脱与抗原结合的噬菌体。分离得自抗原特异性克隆的基因组，切下基因III使抗体可表达为可溶性Fab形式供进一步鉴定。一旦将单个Fab选择为有潜力的候选治疗剂，可容易地将它转变为完整的抗体。以前描述的用于将Fab序列转变为完整抗体的表达系统是IDEC哺乳动物表达载体NEOSPLA，此载体含有人γ1或γ4恒定区基因。用NEOSPLA载体转染CHO细胞，扩增后，可得到据报道可提供很高的表达水平(＞30pg/细胞/天)的此载体系统。

4.灵长化的抗体

Newman，(1992)，生物技术，10，1455-1460公开了另一种产生重组抗体的高度有效的方法，更具体地，该技术导致含有猴可变区和人恒定区序列的灵长化抗体的产生，将此参考文献的全文引入作为参考。另外，此技术也描述于1995年1月25日提交的共同转让的美国申请08/379,072中，该申请是1992年7月10日提交的美国流水号07/912,292的继续申请，07/912,292是1992年3月23日提交的美国流水号07/856,281的部分继续申请，07/856,281是1991年7月25日提交的美国流水号07/735,064的部分继续申请。08/379,072及其母申请全文引入作为参考。

此技术修饰了抗体以使它们在施用于人的过程中不会被当作抗原排斥。此技术依赖于用人抗原或受体免疫cynomolgus猴。开发此技术可产生针对人细胞表面抗原的高亲合力的单克隆抗体。

在1995年6月7日提交的共同转让的美国申请08/487,550(全文列入本文作为参考)中也描述了通过筛选使用经B7.1和/或B7.2免疫的猴的B淋巴细胞得到的噬菌体展示文库或猴异源杂交瘤来鉴定针对人B7.1和B7.2的猕猴抗体。更具体地，08/487,550提供了4个单克隆抗体：7B6，16C10，7C10和20C9，所述抗体可抑制B7：CD28途径，从而作为有效的免疫抑制剂起作用。

据报道以这些共转让申请中所述方式产生的抗体可显示人效应物功能，具有降低的免疫原性和长的血清半寿期。该技术依据的事实是尽管cynomolgus猴在系统发育上类似于人，但它们仍然将很多人蛋白质识别为外源蛋白质，因此会发动免疫应答。另外，由于cynomolgus猴在系统发育上与人接近，这些猴产生的抗体与人产生的抗体具有高水平的氨基酸同源性。实际上，对猕猴免疫球蛋白轻链和重链可变区基因进行测序后，发现各个基因家族的序列与其人对应物85-98％同源(Newman等，(1992)，文献同上)。以此方式产生的第一个抗体抗-CD4抗体与人免疫球蛋白构架区域的共有序列91-92％同源(Newman等，生物技术，10：1458-1460(1992)。

在以前的文献中描述了特异于人B7抗原的单克隆抗体。例如，Weyl等，人类免疫学，31(4)，271-276(1991)中描述了使用天然和突变的抗原变体对针对HLA-B-27的人单克隆抗体进行表位作图。Toubert等，临床实验免疫学，82(1)，16-20，(1990)也描述了与35-KD细菌外膜蛋白反应的HLA-B27单克隆抗体的表位作图。Valle等，免疫学，69(4)，531-535(1990)也描述了识别活化的B细胞和HTLV-1转化的T细胞上表达的B7抗原的IgG1亚类单克隆抗体。另外，Toubert等，免疫学杂志，141(7)，2503-9(1988)描述了使用区域内重组体对HLA-B27和HLA-B7抗原进行表位作图，所述重组体是通过在大肠杆菌中制备这两个等位基因之间的杂合基因而构建的。

一些研究者认为B7抗原的高表达与自身免疫病相关，例如，Ionesco-Tirgoviste等，Med.Interre，24(1)，11-17，(1986)报道了1型胰岛素依赖型糖尿病中B7抗原的表达有所增加。另外，据报道在得自银屑病患者的真皮树状细胞上表达了B7抗原(Nestle等，J.Clin.Invest.，94(1)，202-209(1994))。

另外，文献中还报道了使用经亲和纯化的可溶性HLA-B7抑制抗-HLA-B7同种反应性CTL(Zavazava等，移植，51(4)，838-42，(1991))。另外，还报道了B7受体可溶性配体CTLA-4-Ig在动物模型中阻断B7活性的用途(例见Lenschow等，科学，257，789，7955(1992))，和能抑制B7的B7.1-Ig融合蛋白。

这些文献中提供了鉴定单克隆抗体的证据，所述抗体能识别仅限于与CD28受体结合的B7.1抗原上的特异性位点。另外，本文提供了鉴定抗体的证据，所述抗体能识别B7.1抗原上除CTLA-4受体结合位点外的位点。因此，本文提供的证据支持人B7.1(CD80)共刺激抗原上独特抗原结合位点的存在。通过抗-B7.1 PRIMATIZED^抗体鉴定所述位点，提供的证据进一步证实与B7.1抗原上相互作用位点的结合局限于与共活化受体CD28结合。

                    发明概述和目的

本发明的一个目的是鉴定特异于人B7.1抗原的新抗体。更具体地，本发明的目的是鉴定特异于人B7.1抗原并能抑制B7.1与CD28受体结合的抗体。本发明的另一目的是鉴定特异于人B7.1抗原且不能抑制B7.1与CTLA-4受体结合的抗体。因此，本发明的目的是鉴定识别B7.1抗原上特异性位点的抗体，其中被识别的位点仅限于与CD28受体结合，而不是与CTLA-4受体结合的位点。

本发明的另一目的是鉴定特异于人B7.1抗原，但不能识别人B7.2抗原的抗体。

本发明的另一目的是鉴定能识别人B7.1抗原上的特异性位点，抑制IL-2产生和T细胞增殖并能用作有效的免疫抑制剂的单克隆抗体及其灵长化的形式。更具体地，本发明的目的是鉴定特异于B7.1并能抑制IL-2产生的抗体。

本发明的目的是提供能抑制供体脾细胞培养物中由抗原驱动的应答，如抗原特异性IgG应答，IL-2产生和细胞增殖的单克隆抗体及其灵长化的形式。

本发明的另一特殊目的是鉴定具有有利特性，即亲和性，免疫抑制活性，并可用作治疗剂的特异于人B7.1抗原的特定单克隆抗体及其灵长化的形式。更具体地，这些抗体及其灵长化的形式可用作例如免疫抑制剂，即阻断由抗原驱动的免疫应答以治疗自身免疫病，如银屑病，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)，1型糖尿病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，变态反应，炎性胆汁病，并预防器官排斥。

本发明的另一目的是提供药物组合物，该组合物含有一种或多种特异于人B7.1抗原的单克隆抗体及其灵长化的形式，还含有药物可接受的载体或赋形剂。这些组合物可用作例如免疫抑制剂以治疗自身免疫病，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)和系统性红斑狼疮(SLE)，阻断由抗原驱动的免疫应答，并预防移植物受体的器官排斥。

本发明的另一目的是提供新的治疗方法，所述方法是施用治疗有效量的一种或多种或灵长化的与人B7.1抗原特异性结合的单克隆抗体。这种治疗方法可用于治疗通过抑制B7：CD28途径可以治疗的疾病，如自身免疫病，包括特发性血小板减少性紫癜(ITP)，系统性红斑狼疮(SLE)，1型糖尿病，银屑病，类风湿性关节炎，多发性硬化，再生障碍性贫血，所述方法还可预防移植受试者的排斥。

本发明的另一目的是提供转染子，如CHO细胞，它至少表达特异于人B7.1抗原的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。

                             定义

定义下列术语以便更清楚地理解本发明。

清除型抗体-杀死活化的B细胞或其它抗原呈递细胞的抗体。

非清除型抗体-阻断B7和T细胞活化配体CD28和CTLA-4的共刺激作用的抗体，因此它使抗原呈递细胞无反应性，但并不消除该细胞。

灵长化抗体-为重组抗体，经改造含有猴抗体，具体为cynomolgus猴抗体的重链可变区和轻链可变区，它含有人恒定区序列，优选含有人免疫球蛋白γ1或γ4恒定区(或PE变体)。这种抗体的制备描述于Newman等，(1992)，“用于人类疾病的免疫疗法的重组抗体的灵长化：针对人CDH的猕猴/人嵌合抗体”，生物技术，10：1458-1460；和共同转让的美国申请08/379,072中，这两篇文献的全文都列入本文作为参考。据报道这些抗体表现出与人抗体高水平的同源性，即85-98％，显示出人效应物功能，具有降低的免疫原性，对人抗原具有高亲合性。

B7抗原-本申请中的B7抗原包括例如人B7，B7.1和B7.2抗原，这些抗原与CD28和/或CTLA-4结合。这些抗原在T细胞活化中具有共刺激作用。这些B7抗原都含有胞外免疫球蛋白超家族V和C-样区域，疏水的跨膜区和胞质尾(例见Freeman等，科学，262：909(1993))，并且是高度糖基化的。

抗-B7抗体-以足够的亲合力与人B7抗原，如人B7.1和/或B7.2抗原特异性结合以阻断B7：CD28相互作用从而诱导免疫抑制的抗体，优选为猴单克隆抗体或其灵长化形式。

                         附图简述

图1图示了pMS载体，该载体可用于筛选针对丝状噬菌体表面展示的B7产生的重组免疫球蛋白文库，所述载体上含有基于猕猴免疫球蛋白序列的引物。

图2图示了用于表达本发明特异于人B7.1抗原的灵长化抗体的NEOSOLA表达载体。

图3a图示了7C10轻链的灵长化形式的氨基酸和核酸序列。

图3b图示了7C10重链的灵长化形式的氨基酸和核酸序列。

图4a图示了7B6轻链的灵长化形式的氨基酸和核酸序列。

图4b图示了7B6重链的灵长化形式的氨基酸和核酸序列。

图5a图示了16C10灵长化轻链的氨基酸和核酸序列。

图5b图示了16C10灵长化重链的氨基酸和核酸序列。

图6图示了P16C10不能阻断CTLA-4Ig-生物素与被B7.1转染的CHO细胞的结合。

图7图示了CTLA-4Ig不能阻断P16C10-生物素与被B7.1转染的CHO细胞的结合。

图8图示了BB-1完全阻断了CTLA-4Ig-生物素与被B7.1转染的CHO细胞的结合，还图示了BB-1不能显著影响P16C10-生物素与被B7.1转染的CHO细胞的结合。

图9图示了CTLA-4Ig-生物素被除P16C10以外的所有B7.1抑制剂有效阻断。

图10图示了P16C10能阻断CD28/B7-1Ig结合的相互作用。所示数据是得自4次独立实验的平均值。

                     发明详述

如上所述，本发明涉及鉴定特异于人B7.1抗原，能抑制人B7.1与CD28受体结合，但不能抑制B7.1与CTLA-4受体结合的单克隆抗体或其灵长化形式。用经鉴定的抗体封闭CD28和B7.1(CD80)之间主要的活化位点，而允许对阳性共刺激的拮抗作用与对阴性信号传递的兴奋作用并存，这是干预复发形式的自身免疫病的有用的治疗方法。通过阻断T细胞刺激性细胞因子IL-2的产生可限定所鉴定抗体的功能活性。尽管存在第二驱动配体B7.2，但鉴定出的抗体表现出可阻断50％以上IL-2产生，这表明存在另一种作用机制，该机制不是典型的文献中限定的其它抗B7.1抗体所观察到的作用。

本文所述的共同待审的美国申请流水号08/487,550中描述了特异性结合人B7.1和/或人B7.2抗原的新的猴单克隆抗体，以及由此衍生的灵长化抗体的制备。这些抗体对人B7.1和/或人B7.2具有高亲和性，因此可用作抑制B7：CD86途径的免疫抑制剂。

优选通过筛选噬菌体展示文库或通过使用经B7(如人B7.1和/或人B7.2)免疫过的猴的B淋巴细胞制备猴异源杂交瘤来实现猴单克隆抗体的制备。

如上所述，产生抗B7抗体的第一种方法涉及重组噬菌体展示技术，上述文献中一般性地描述了该技术。

实质上，这包括合成针对丝状噬菌体表面展示的B7抗原的重组免疫球蛋白文库，和选择出可分泌对B7.1和/或B7.2抗原具有高亲和性的抗体的噬菌体。如上述文献所述，优选选择与人B7.1和B7.2都可结合的抗体。为了实现这一方法学，本发明人制备了独特的猴文库，该文库降低了重组的可能性并改善了稳定性。下文将详细描述的载体pMS示于图1。

实质上，为了采用噬菌体展示与猕猴文库一起使用，此载体含有特异性引物以用于PCR扩增猴免疫球蛋白基因。这些引物基于开发灵长化技术和含有人序列的数据库时所得的猕猴序列。

适当的引物描述于共同转让的08/379,072中，该文献被列入本文作为参考。

第二种方法涉及针对人B7抗原，优选针对人B7.1和B7.2抗原免疫猴，即猕猴。上述文献中讨论了用猕猴产生单克隆抗体的内在优点。具体地说，这种猴，即cynomolgus猴可被免疫以抗人抗原或受体。另外，根据Newman等，生物技术，10，1455-1460(1992)和Newman等于1995年1月25日提交的共同转让的美国流水号08/379,072的方法学可将所得抗体用于制备灵长化抗体，上述两篇文献的全文列入本文作为参考。

得自cynomolgus猴的抗体的显著优点是这些猴可将很多人蛋白质识别为外源蛋白质，从而形成抗体，一些抗体对所需人抗原，如人表面蛋白和细胞受体具有高亲和性。另外，由于它们在系统发育上与人接近，所得抗体表现出与人体内产生的抗体具有高水平的氨基酸同源性。如上所述，对猕猴免疫球蛋白轻链和重链可变区基因进行测序之后，可发现各个基因家族的序列与其人对应物85-88％同源(Newman等，(1992)，文献同上)。

实质上，给cynomolgus猕猴施用人B7抗原，如人B7.1和/或人B7.2抗原，从中分离B细胞，如从动物体内取淋巴结活检，然后使用聚乙二醇(PEG)将B淋巴细胞与KH6/B5(小鼠×人)异源骨髓瘤细胞融合。鉴定可分泌与人B7抗原，如人B7.1和/或人B7.2抗原结合的抗体的异源杂交瘤。

与B7.1和B7.2都能结合的抗体是合乎需要的，因为这种抗体可用于抑制B7.1和B7.2，以及B7与其反受体即人CTLA-4和CD28的相互作用。针对这些表位的抗体可抑制人B7.1和人B7.2与其位于T细胞上的反受体的相互作用，这可以提供协同作用。

然而，仅与人B7抗原之一，B7.1抗原或B7.2抗原结合的抗体也是很合乎需要的，因为这些分子共同参与T细胞活化，克隆扩增，淋巴因子(IL-2)分泌和对抗原的反应。假定人B7.1和B7.2都与人CTLA-4和CD28结合，可能至少存在一个共用或同源的区域(可能是共享的构象表位或表位)，针对该区域可产生猕猴抗体。

本发明涉及使用经致敏可产生特定抗体的动物。可用于此方法的动物包括但不限于下列：小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠，猴，猪，山羊和兔。

在共同拥有的共待审美国专利申请流水号08/488,376中公开了使用SCID小鼠产生人抗体的优选方法。

本发明人决定使用重组的可溶性B7.1抗原免疫猕猴以抗人B.1抗原，所述抗原在CHO细胞中产生，并通过使用L307.4-琼脂糖凝胶亲和柱的亲和层析得以纯化。然而，对人B7抗原，人B7.1抗原或人B7.2抗原的特定来源并无苛求，只要它的纯度足以导致针对特别施用的B7抗原和其它B7抗原的特异性抗体反应即可。

人B7抗原，人B7.1抗原(也称为CD80)和人B7.2抗原(也称为CD86)基因已被克隆并测序，因此通过重组方法易于制备。

优选施用可溶形式的人B7抗原，人B7.1抗原和/或人B7.2抗原，例如通过表达除去跨膜区和胞质区，而只留下胞外部分，即胞外超家族V和C-样区域的B7，B7.1或B7.2基因(例见Grumet等，人类免疫学，40(3)，p228-234，1994，该文献教导了可溶形式的人B7的表达，其全文列入本文作为参考)。

在导致抗原特异性抗体产生的条件下，用B7，B7.1和/或B7.2抗原，优选用其可溶形式免疫猕猴。优选可溶形式的人B7，B7.1或B7.2抗原与佐剂联合使用，所述佐剂如完全弗氏佐剂(CFA)，明矾，皂苷或其它已知佐剂，以及它们的联合。一般需要重复免疫几个月，如通过重复注射。例如，施用可溶性的B7.1抗原与佐剂，在3至4个月内进行加强免疫，结果产生的血清中含有与人B7.1抗原结合的抗体。

免疫后，通过例如从经免疫的动物体内取淋巴结活检以收集B细胞，然后使用聚乙二醇将B淋巴细胞与KH6/B5(小鼠×人)异源骨髓瘤细胞融合。制备这种异源骨髓瘤的方法是已知的，例见Newman等人于1995年1月25日提交的美国流水号08/379,072(列入本文参考文献)。

鉴定可分泌与人B7抗原，B7.1和/或B7.2结合的抗体的异源杂交瘤。通过已知技术可实现这一目的，例如，通过ELISA或使用酶或放射性核苷酸标记的人B7，B7.1和/或B7.2抗原的放射性免疫测定法可测定该杂交瘤。

然后将分泌抗体的细胞系亚克隆至单克隆状态，所述抗体对人B7，B7.1和/或B7.2抗原具有所需的特异性。

在本发明中，本发明人筛选纯化的抗体与ELISA试验中被可溶性B7.1抗原包被的培养板，抗原阳性的B细胞和在其细胞表面表达人B7.1抗原的CHO转染瘤结合的能力。另外，筛选抗体阻断B细胞/T细胞相互作用的能力，所述能力由IL-2产生和混合淋巴细胞反应(MLR)中氚化胸苷的摄取测定，使用¹²⁵I-放射性标记的可溶性B7.1(SB7.1)检测B7结合。

而且，检测了来自猕猴的亲和纯化的抗体对表达B7.1/Ig融合蛋白的CHO转染子以及对产生人B7.2抗原的CHO细胞的反应性。这些结果表明B7.1免疫血清与B7.2转染瘤结合。可使用可溶性的B7.2-Ig试剂证实抗体与B7.2抗原的结合。如实施例所讨论的，这可通过从CHO转染瘤中产生和纯化足够量B7.2-Ig以制备B7.2-Ig-琼脂糖亲和柱来完成。与B7.2交叉反应的那些抗体将与B7.2-Ig-琼脂糖柱结合。

接着基本上如Newman等(1992). 文献同上和Newman等人于1995年1月25日提出的美国专利流水号379,072所述，用表达特异性地与人B7抗原、B7.1抗原和/或B7.2抗原结合的抗体的细胞系克隆用于制备灵长化抗体的可变区序列，其中这两篇文献被本文引作参考。这基本上需要从中提取RNA，转变为cDNA和通过使用Ig特定引物的PCR的扩增。适宜的引物描述在Newman等，1992，文献同上和美国流水号379,072中(尤其参见美国流水号379,072的图1)。

接着将克隆的猴的可变基因插入到包含人重链和轻链恒定区基因的表达载体中。这优选通过使用IDEC公司称为NEOSPLA的专利表达载体来进行。该载体示于图2中，包含巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化系列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、人免疫球蛋白k或λ恒定区、二氢叶酸还原酶基因、人免疫球蛋白γ1或γ4 PE恒定区和前导序列。通过掺入猴可变区基因，在CHO细胞中转染，接着在含G418培养基中选择以及氨甲喋呤扩增，发现该载体导致极高水平的灵长化抗体的表达。

例如，以前已公开了这种表达系统产生具有高的针对CD4和其它人细胞表面受体的亲和力(Kd≤10^-10M)的灵长化抗体。而且，发现抗体显示与初始猴抗体相同的亲和性、特异性和功能活性。该载体系统基本上公开在被本文引作参考的共同转让的美国专利流水号379,072以及全文也被本文引作参考的1993年11月3日提出的美国流水号08/149,099中。该系统提供高的表达水平，即＞30pg/细胞/天。

如下文所讨论的，本发明人选择了四种最重要的特异性与B7.1抗原结合的代表性的猴单克隆抗体。这些猴单克隆抗体在本文被称为7B6、16C10、7C10和20C9。

如下文更详细地讨论，通过测定在用于T细胞结合的T细胞结合实验的混合淋巴细胞反应中的IL-2的产生以及氚化胸苷的摄取评价这些抗体阻断B细胞/T细胞相互作用的能力，在存在PHA刺激物下，将人浅黄色层的外周血淋巴细胞培养3-6天。使用¹²⁵I-放射性标记的可溶性B7.1放射性分析B7的结合。如通过减少的IL-2的产生和减少的混合淋巴细胞培养物的增殖所证实的，观察到的结果表明所有这些抗体高亲和性地与B7.1抗原结合并有效地阻断B细胞/T细胞相互作用。

这些特定的猴单克隆抗体的特性总结如下：

1.Scatchard分析表明与B7-Ig包被的平板结合的猴抗体的表观亲和常数(Kd)大约为：

a：7C10： 6.2×10^-9M

b：16C10：8.1×10^-9M

c：7B6：  10.7×10^-9M

d：20C9： 16.8×10^-9M

2.在混合淋巴细胞反应试验(MLR)中体外检测抗体。如下面IC₅₀值所示，MLR表明所有4种抗-B7.1抗体不同程度地抑制IL-2的产生：

a：7B6：   5.0ug/M

b：16C10： ＜0.1ug/M

c：20C9：  20.ug/M

d：7C10：  5.0ug/M

3.检测猴抗-B7.1抗体与人外周血淋巴细胞(PBL)中的B7的结合能力。FACS分析表明所有4种猴的抗体检测为阳性。

4.通过FACS分析检测猴抗体16C10、7B6、7C10和20C9的C1q结合。结果表明在与B7.1CHO转染细胞一起保温后，7C10猴Ig具有强的人C1q结合。16C10为阳性，而20C9和7B6猴抗体为阴性。

5.为了选择用于途径-毒性研究的动物模型，用来自不同种类的动物血检测猴抗体。证实猴抗-B7.1抗体与人，黑猩猩发生交叉反应。

基于这些特性，显然三种猴单克隆抗体，16C10、7C10和20C9拥有最有利的特性，16C10和7C10在某种程度上优于20C9。

使用上文以及共同转让的美国流水号08/379,072描述的技术，本发明人克隆了7C10、7B6和16C10的可变区，提供了灵长化形式的7C10轻链、7C10重链、7B6轻链、7B6重链、16C10轻链和16C10重链的氨基酸和核酸序列。可在图3a和3b、4a和4b、5a和5b中找到这些氨基酸和核酸序列。可在08/379,072中知晓人γ1、γ4恒定区的DNA和氨基酸序列。

如上文所讨论的，使用基本上描述在共同转让的08/379,072和08/149,099中并由图2所示的NEOSPLA表达载体表达这些灵长化抗体，其中这两篇申请被本文引作参考。

如前面所提到的，本发明灵长化抗体优选包含人免疫球蛋白γ1或γ4恒定区，优选γ4在两个位置发生突变以产生γ4 PE。γ4 PE突变体包含两个突变，被导入以除去残余的FCR结合的CH2区中的谷氨酸以及打算增强重链二硫键相互作用稳定性的绞链区的脯氨酸置换(参见Alegre等，免疫学杂志，148，3461-3468(1992)；和Angel等，分子免疫学，30,105-158，(1993)，它们均被本文引作参考)。

本发明的灵长化抗体是否包含γ1、γ4或γ4 PE恒定区极大地取决于特定的疾病靶。优选产生和检测针对特定疾病靶的清除和非清除灵长化IgG1和IgG4抗体。

本发明的猴单克隆抗体具有所述结合和功能特性，因此这些抗-B7.1单克隆抗体和其灵长化的形式应非常适宜作为用于阻断B7：CD28相互作用从而提供免疫抑制的治疗剂。尤其是，已知其具有对B7.1抗原的高亲和性和阻断B细胞/T细胞相互作用的能力(由混合淋巴细胞培养物中的IL2产生和氚化的胸苷的摄取表示)以及有效抑制供体脾细胞培养物中抗原驱动应答的能力(表现为降低的抗原特异性IgG应答、IL-2的严生)，这些猴单克隆抗体和其灵长化形式应起着调节B7：CD28途径的有效的免疫抑制剂的作用。这对于治疗其中免疫抑制为治疗所希望的以抑制不希望的抗原特异性IgG应答的许多疾病，例如自身免疫病是非常重要的，并且还对于预防器官排异作用和移植物抗宿主疾病也是非常重要的。本发明的抗体基本上可用于治疗其中B7：CD28途径的抑制是治疗所希望的任何疾病。

本发明的抗B7.1抗体的主要治疗适应症包括例如自身免疫病，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)、系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病、多发性硬化、再生障碍性贫血、银屑病、变态反应、炎性胆汁病和类风湿性关节炎。

本发明抗-B7.1抗体的其它重要的治疗适应症为用于预防器官移植和骨髓移植(BMT)期间的移植物抗宿主疾病(GVHD)。本发明的抗体可被用来诱导宿主对供体特异性同种抗原的耐受性并从而便于移植和降低移植物排斥的发生率。在同种心脏移植的小鼠模型中已表明CTLA4-Ig的静脉内给药可导致免疫抑制或甚至诱导对同种抗原的耐受性(Lin等，实验医学杂志178：1801，1993；Torka等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 89：11102，1992)。预期本发明的灵长化抗-B7.1抗体将显示类似或更大的活性。

可通过在功能性生物分析中用于鉴定的亲和层析以及大小排阻层析的结合来纯化以上述方法或通过等同的方法制备的抗体。这些分析包括确定特异性和结合亲和性以及与表达同型，例如ADCC相关的效应物功能或补体固定。这些抗体可被用作针对许多人类疾病的被动或主动治疗剂，包括B细胞淋巴瘤、传染病，包括病毒疾病，如HIV/AIDS、自身免疫和炎性疾病以及移植。抗体可以其天然形式或作为抗体/螯合剂、抗体/药物或抗体/毒素复合物的一部分来使用。另外，全抗体或抗体片段(Fab₂、Fab、Fv)可被用作用于抗独特型反应的主动免疫治疗中的显象剂或用作可能的疫苗或免疫原。

可通过本领域普通技术人员熟知的标准技术确定可用于产生治疗效果的抗体的量。通常通过标准方法以药物可接受的缓冲液来提供抗体，并可通过任何所需途径给药。由于本文要求的抗体的功效和人对其的耐受性，为了与人的各种疾病或疾病状态抗争，可以重复施用这些抗体。

本发明的抗-B7.1抗体(或其片段)可用于诱导免疫抑制，即诱导人或动物免疫系统的抑制。本发明因此涉及一种通过给人或其它动物施用有效无毒量的本发明的这种抗体来在需要它的人或其它动物中预防或治疗性地诱导免疫抑制的方法。

本发明化合物诱导免疫抑制的能力已在用于此目的的标准试验中得以证实，例如混合淋巴细胞反应试验或测定由胸苷摄取测得的T细胞增殖抑制试验。

本发明的抗体可用于诱导免疫抑制的事实表明它们应可用于治疗或预防对移植器官或组织(例如肾、心脏、肺、骨髓、皮肤、角膜等)的抗性或排斥作用；治疗或预防自身免疫、炎性、增殖和增殖过度疾病以及表现在皮肤的免疫介导的疾病(例如类风湿性关节炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮、Hashimotos甲状腺炎、多发性硬化、重症肌无力、I型糖尿病，眼色素层炎、肾病综合症、银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎和其它湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔癣、天疱疮、大疱天疱疮、表皮松解性大疱、荨麻疹、血管水肿、脉管炎、红斑、皮肤嗜曙红细胞增多、簇状脱发等)；可逆性气管阻塞疾病、肠炎和过敏反应(例如炎性胆汁病、腹腔疾病、直肠炎、嗜曙红细胞增多胃肠炎、肥大细胞病、节段性回肠炎和结肠溃疡)、与食物有关的过敏反应(例如偏头痛、鼻炎和湿疹)以及其它类型的过敏反应。

本领域技术人员能通过常规实验确定用于诱导免疫抑制目的的抗体的有效无毒量将是多少。然而，有效剂量通常为约0.05-100mg/kg体重/天的范围。

本发明的抗体(或其片段)还应可用于治疗哺乳动物肿瘤。更具体地说，它们应可用于降低肿瘤大小、抑制肿瘤生长和/或延长荷瘤的动物的存活时间。因此，本发明还涉及一种通过对这些人或动物给予有效无毒量的抗体来治疗人或动物肿瘤的方法。本领域技术人员能通过常规实验确定用于治疗致癌肿瘤目的的抗-B7抗体的有效无毒量将是多少。然而，有效剂量通常被预计为约0.05-100mg/kg体重/天的范围。

根据前述的治疗方法，可以足以在治疗或预防水平上产生这种效果的量给人或动物施用本发明的抗体。可以根据已知技术通过将本发明的抗体与常规的药物可接受的载体或赋形剂混合而制备的常规剂型对这些人或动物给予本发明的抗体。本领域技术人员将认识到药物可接受的载体或赋形剂的形式或特性由将与其混合的活性成分的量、给药途径以及其它熟知的可变因素来决定。

本发明抗体(或其片段)的给药途径可为口服、胃肠外、通过吸入或局部途径。本文使用的术语胃肠外包括静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。通常优选皮下和肌肉内形式的胃肠外给药。

采用本发明化合物以预防或治疗性地诱导免疫抑制或治疗性地治疗致癌肿瘤的每日胃肠外和口服剂量通常为约0.05-100mg/kg体重/天的范围，但优选0.5-10mg/kg体重/天。

还可通过吸入给予本发明的抗体。经“吸入”指鼻内和口吸入给药。可通过常规技术制备用于这种给药的适宜剂型，如气雾剂或定量吸入剂。将采用的本发明化合物的优选剂量通常为约10-100mg/体重/天的范围内。

还可局部给予本发明的抗体。经局部给药指非全身性地给药，包括将本发明的抗体化合物(或其片段)经外部施用于表皮、颊腔和将该抗体滴入耳、眼睛和鼻中，并且其中它不大量进入血流中。经全身给药指口服、静脉内、腹膜内和肌肉内给药。当然用于治疗或预防效果所需的抗体量将随选择的抗体、治疗疾病的性质和严重性以及进行治疗的动物而变化，并最终取决于医生的决定。本发明抗体的适宜的局部剂量通常为约1-100mg/体重/天的范围内。

制剂

虽然可单独给予抗体或其片段，但可优选以药物制剂的形式提供。对于局部给药，活性成分可包括制剂的0.001％-10％(w/w)，如1％-2％(重量计)，虽然它可包括多达制剂的10％(w/w)，但优选不超过5％(w/w)，较优选为0.1％-1％(w/w)。

本发明的局部制剂包含活性成分和一种或多种可接受的载体和任选任何其它的治疗成分。载体必须是在与其它制剂成分相容的意义来讲为可接受的并对其赋形剂无害。

适宜于局部给药的制剂包括适宜于透皮到达需要治疗的部位的液体或半液体制剂，如搽剂、洗剂、乳油、软膏或糊剂以及适宜于施用于眼、耳或鼻的滴剂。

根据本发明的滴剂可包含无菌水性或油状溶液剂或悬浮剂，并可通过将活性成分溶解在杀菌和/或杀真菌剂和/或任何其它适宜的防腐剂的适宜水溶液中来制备，优选包括表面活性剂。可接着将产生的溶液通过过滤澄清，转移至适宜的容器中，该容器接着被密封，通过高压灭菌杀菌或在90-100℃下保持半小时。另外，溶液可通过过滤除菌并通过无菌技术转移至容器中。适宜于包含在滴剂中的杀细菌和杀真菌剂的实例为硝酸汞苯或乙酸汞苯(0.002％)、苄扎氯铵(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。用于制备油状溶液剂的适宜的溶剂包括甘油、稀释的乙醇和丙二醇。

根据本发明的洗剂包括适宜于施用至皮肤或眼睛的那些。眼洗剂可含有任选包含杀菌剂的无菌水溶液，并可通过与制备滴剂类似的方法来制备。施用于皮肤的洗剂或搽剂还可包括促进皮肤干燥或冷却的物质，如醇或丙酮，和/或保湿剂，如甘油或油，如蓖麻油或花生油。

根据本发明的乳油、软膏或糊剂为用于外部施用的活性成分的半固体制剂。它们可在适宜机器的辅助下，通过将磨得很细的或粉状的活性成分单独或其水溶液、含水或不含水液体的悬浮液与油脂或非油脂基质混合来制备。基质可包含烃，如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；胶浆；天然来源的油，如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸，如硬脂酸或油酸以及醇，如丙二醇或聚乙二醇。制剂可掺入任何适宜的表面活性剂，如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可包含悬浮剂，如天然树胶、纤维素衍生物或无机矿物质，如蛟状硅胶和其它成分，如羊毛脂。

也可将本发明的抗-B7.1抗体或其片段与调节B7：CD28途径的其它物质结合施用。这些物质包括例如细胞因子，如IL-7、IL-10、CTLA4-Ig、可溶性CTLA-4和抗-CD28抗体和其片段。而且，本发明的抗体可与其它免疫抑制剂一起施用。这些免疫抑制剂包括小分子，如环孢菌素A(CSA)和FK506；单克隆抗体，如抗肿瘤坏死因子a(抗-TNFa)、抗-CD54、抗-CD11、抗-CD11a以及抗-IL-1；和其它可溶性受体，如rTNFa和rIL-1。

本领域技术人员将理解本发明抗体或其片段的单剂的最佳量和间隔

将由治疗疾病的性质和程度，给药的形式、途径和部位以及治疗的具体的动物来决定，并且这些的最佳值可通过常规技术确定。本领域技术人员还将理解治疗的最佳过程，即在指定的天数里每天提供的本发明的抗体或其片段的剂量数，可由本领域技术人员使用常规的治疗确定试验方法来确定。

无需进一步的详细描述，认为本领域技术人员可利用前面的描述来最大程度地使用本发明。因此，下面的制剂被认为仅仅是为说明的具体实例，决不限制本发明的范围。

胶囊剂组合物

通过用50mg粉末形式的本发明的抗体或其片段，100mg乳糖，32mg滑石和8mg硬脂酸镁填充标准的两片硬胶囊来制备胶囊剂形式的本发明的药物组合物。

注射用胃肠外组合物

通过将1.5％(重量计)的本发明的抗体或其片段在10％(体积计)的丙二醇和水中搅拌来制备为适宜于注射给药形式的本发明的药物组合物。将溶液过滤除菌。

    软膏组合物

    本发明的抗体或其片段      1.0g

    白软石蜡                  100.0g

将本发明的抗体或其片段分散在少量体积的赋形剂中以产生光滑均匀的产物。接着将分散液填入金属软管中。

局部乳油组合物

    本发明的抗体或其片段      1.0g

    Polawax GP 200            20.0g

    无水羊毛脂                2.0g

    白蜂蜡                    2.5g

    羟基苯甲酸甲酯            0.1g

    加蒸馏水至                100.0g

60℃下，将polawax、蜂蜡和羊毛脂一起加热。加入羟基苯甲酸甲酯溶液并使用高速搅拌实现均化。接着让温度降至50℃。然后加入本发明的抗体或其片段，充分分散，低速搅拌下让组合物冷却。

局部洗剂组合物

    本发明的抗体或其片段      1.0g

    脱水山梨糖醇一月桂酸酯    0.6g

    多乙氧基醚20              0.6g

    十六硬脂基醇              1.2g

    甘油                      6.0g

    羟基苯甲酸甲酯           0.2g

    加纯化水B.P.至100-00ml。(B.P.＝英国药典)

75℃下，将羟基苯甲酸甲酯和甘油溶解在70ml水中。75℃下，将脱水山梨糖醇一月桂酸酯、多乙氧基醚20、十六硬脂基醇一起熔化，并加至水溶液中。均化产生的乳状液，连续搅拌下让其冷却，以在剩余水中的悬浮液的形式加入本发明的抗体或其片段。搅拌整个悬浮液直至均化。

眼滴剂组合物

    本发明的抗体或其片段     0.5g

    羟基苯甲酸甲酯           0.01g

    加纯化水B.P.至100-00ml。

75℃下，将羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯溶解在70ml纯化水中，并让产生的溶液冷却。接着加入本发明的抗体或其片段，将溶液经膜滤器(0.022um孔径)过滤除菌，无菌分装至适宜的无菌容器中。

用于吸入给药的组合物

对于15-20ml容量的气雾剂容器：将10mg本发明的抗体或其片段与0.2-0.5％润滑剂，如多乙氧基醚85或油酸混合，并将该混合物分散在在推进剂如氟里昂中，优选在(1，2二氯四氟乙烷)与二氟氯甲烷的混合物中，并放入用于鼻内或口吸入给药的合适的气雾剂容器中。

用于吸入给药的组合物

对于15-20ml容量的气雾剂容器：将10mg本发明的抗体或其片段溶解在乙醇中(6-8ml)，加入0.1-0.2％的润滑剂，如多乙氧基醚85或油酸；并将该混合物分散在推进剂如氟里昂中，优选在(1，2二氯四氟乙烷)与二氟氯甲烷的混合物中，并放入用于鼻内或口吸入给药的合适的气雾剂容器中。

本发明的抗体和药物组合物尤其可用于胃肠外给药，即皮下、肌肉内或静脉内。用于胃肠外给药的组合物通常包含溶解在可接受载体，优选含水载体中的本发明的抗体或其片段或其混合物的溶液。可采用各种含水载体，例如水、缓冲水溶液、0.4％盐溶液、0.3％甘氨酸溶液等。这些溶液为无菌的并通常不含颗粒物。可通过常规熟知的灭菌技术将这些溶液灭菌。组合物可包含近似于生理条件所需的药物可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂等。该药物制剂中的本发明的抗体或其片段的浓度可广泛地变化，即从小于约0.5％，通常等于或小于约1％至15％或20％(重量计)，并将根据所选择的特定的给药方式主要基于液体的体积、粘度等来进行选择。

因此，用于肌肉内注射的本发明的药物组合物可被制备成包含1Ml无菌的缓冲水溶液和50mg本发明的抗体或其片段。类似地，用于静脉内输注的本发明的药物组合物可被制备成包含250ml无菌Ringer溶液和150mg本发明的抗体或其片段。用于制备胃肠外给药的组合物的有效方法对于本领域技术人员来讲是熟知或显然易见的，其被更详细地描述在例如Remington’s药物科学，第15版，Mack出版公司，Easton，Pennsylvania，其被本文引作参考。

本发明的抗体(或其片段)可被冷冻干燥以用于储存，并在使用前重新配制。该技术已表明对常规的免疫球蛋白有效，可采用本领域熟知的冷冻干燥以及重新配制技术。

取决于预期的结果，可将本发明的药物组合物用于预防和/或治疗性治疗中。在治疗性应用中，对已患有疾病的病人施用足以治疗或至少部分抑制疾病和其并发症的量的组合物。在预防性的应用中，对未处于疾病状态的病人施用含有本发明抗体或其混合物的组合物以增强病人的抵抗力。

可使用治疗医生选择的剂量水平和方式进行药物组合物的一次或多次给药。在任何情况下，本发明的药物组合物应提供足以有效治疗病人的量的改变的抗体(或其片段)。

还应注意到本发明的抗体可被用于将可用于与抗体相同的治疗中的肽或非肽化合物(模拟物)的设计和合成中。参见例如Saragovi等科学，253，792-795(1991)。

为了进一步说明本发明，提供下面的实施例。这些实施例不打算或被认为是对本发明的进一步的限定。

实施例1

丝状噬菌体表面展示的重组免疫球蛋白文库首次由McCafferty等，自然，348：552-554，1990和Barbas等Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 88：7978-7982，1991描述。使用该技术，已从免疫人重组文库分离了高亲和性的抗体(Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 589：10164-10168，1992)。虽然所采用的噬菌体展示的情况基本上与由Barbas，1991，文献同上描述的类似，但通过置换用于猴文库的特有的载体以降低重组的可能性和增强稳定性改进了该技术。图1中的载体pMS包含一个用于多顺反子重链和轻链猴DNA的有效转录和转译的lac启动子/操纵子。该载体包含两个不同的前导序列，对于轻链的ompA(Movva等，生物化学杂志，255：27-29，(1980))和对于重链Fd的pel B(lei，细菌学杂志，4379-109：4383(1987))。两个前导序列被转译成控制重链和轻链克隆产物分泌至周质空间的疏水性的信号肽。在周质的氧化环境中，两条链折叠并形成二硫键以产生稳定的Fab片段。我们从噬菌粒bluescript得到载体的主要成分(Stratagene，La Jolla，CA)。它包含将氨苄青霉素抗性(羧苄青霉素)传给含有pMS DNA的细菌的β-内酰胺酶基因。我们还从bluescript中获得多拷贝质粒ColEl的复制起点和丝状噬菌体f1的复制起点。噬菌体f1的复制起点(所称的基因内区段)提供引发单链pMS DNA的合成、引发粘粒的形成以及通过病毒酶终止RNA合成的信号。pMS DNA链复制和装配至噬菌体颗粒中需要必须由辅助噬菌体提供的病毒蛋白。由于它也含有编码卡那霉素抗性的基因，因此，我们使用特别适宜于它的辅助噬菌体VCSM13。可通过向培养基中加入卡那霉素和羧苄青霉素来选择被VCSM13和pMS感染的细菌。细菌将最终产生含有pMS或VCSM13基因组的丝状噬菌体颗粒。辅助噬菌体的包装不如pMS有效，产生主要包含重组pMS噬菌体的混合噬菌体群。噬菌体的末端选取各末端特异性的小包被蛋白。这里尤为感兴趣的是在噬菌体一个末端以3-5个拷贝存在的基因III产物。基因III产物为406个氨基酸残基并为借助于F菌毛的噬菌体感染大肠杆菌所需要。将重链的开始两个区，可变区和CHl区在羧基末端与基因III蛋白一半融合。受pel B前导序列的控制，该重组菌毛蛋白被分泌到周质中，在被掺入到噬菌体外壳之前，菌毛蛋白在此处积累并与轻链形成二硫键。而且，另一个载体包含被改造位于基因III下游的FLAG序列。FLAG为在Fd蛋白的羧基末端表达的8个氨基酸肽。我们使用市场上可购得的单克隆抗FLAG M2通过ELISA来纯化和检测噬菌体Fab(Brizzard，生物技术，16(4)：730-731，(1994))。

在构建载体pMS后，我们使用对照抗体基因检测了其产生噬菌体结合Fab的能力。我们将抗破伤风类毒素抗体(从Carlos Barbas博士获得)克隆至pMS中并转化XLI-blue。我们用VCSM共转染我们的细胞，产生展示抗破伤风类毒素抗体的噬菌体。我们进行有效的实验，其中抗破伤风类毒素噬菌体与形成珠状不相关抗体的噬菌体以1∶100,000混合。我们通过将50ul混合噬菌体加至被抗原(破伤风类毒素)包被的聚苯乙烯孔中进行了三轮淘选。洗去未粘附的噬菌体，将粘附的噬菌体用酸洗脱。洗脱的噬菌体被用来感染XLI-Blue细菌的新鲜的等份试样并加入辅助噬菌体。过夜扩增后，制备噬菌体并再次在被抗原包被的平板上淘选。三轮淘选后，我们能表明我们已成功地富集了抗破伤风类毒素噬菌体。该方法的成功还取决于制备可溶性的用于表征最后淘选产物的Fab的能力。这通过使用限制酶NheI从pMS DNA中切除基因III并接着重新连接来实现。在切除基因III后，在噬菌体表面不再出现Fab，但在周质空间中积累。从表达可溶性Fab的细菌制备溶菌产物并使用ELISA检测抗原特异性。检测到了高水平的可溶性Fab。

为了使噬菌体展示技术适用于猕猴文库，我们开发了用于PCR扩增猕猴免疫球蛋白基因的特异性引物。这些是基于我们开发PRIMATIXED^抗体技术(参见被本文引作参考的08/379,072)和含有人序列的数据库(Kabat等，(1991)，“免疫感兴趣的蛋白的序列”US Dept.of Healthand Human Services，国立卫生研究院)时获得的猕猴序列。

我们开发了三组覆盖猕猴所有组成成分扩增的引物。我们第一组引物被设计用于重链VH和CHl(Fd)区的扩增。它由一个3’CHl区引物和6个结合在框架1区中的5’VH族特异性引物组成。我们第二组用于扩增整个λ链的引物包括许多λ链亚组。它由一个3’引物和3个结合在VL框架1区中的5’简并引物组成。我们第三组引物被设计用于k链亚组的扩增。它由一个3’引物和5个VK框架1引物组成。使用每一组引物，优化PCR参数以从各引物对获得足够强的信号以致可获得用于文库克隆的足够的材料。使用这些优化的PCR条件，我们最近在pMS载体中制备了猕猴重组文库。从作为免疫球蛋白RNA来源的CD4免疫猕猴获取骨髓活组织。文库包含约10⁶个成员，并正在抗原包被的孔中用特异性结合剂淘选。

实施例2

B7/CTLA-4试剂的制备

我们制备了许多用于免疫猕猴、进行体外结合和功能性分析，筛选异源杂交瘤和淘选噬菌体文库目的的试剂。表1列出了每一种试剂和其预期目的。在B7.1的情况下，从SB细胞中提取RNA，使用逆转录酶转变成cDNA。使用B7.1特异性引物将第一链cDNA进行PCR扩增并克隆至IDEC’S NEOSPLA哺乳动物表达载体中。用B7.1 NEOSPLA DNA转染CHO细胞，确定表达膜相关B7.1的克隆。类似地产生B7.1融合蛋白，不同之处是将PCR扩增的B7.1基因克隆至含有人CH2和CH3免疫球蛋白基因的NEOSPLA盒载体中。用B7.1/Ig NEOSPLA DNA转化CHO细胞，扩增分泌B7.1/Ig融合蛋白的稳定的克隆。通常，以相同方式产生B7.2和CTLA4试剂，不同之处是对于B7.2，从已用抗Ig和IL-4刺激24小时的人脾细胞中分离RNA，对于CTLA4构建物，基因来源为PHA活化的人T细胞。

表1

试剂	目的	CHO表达
			可溶性B7.1B7.1转染子B7.1/Ig融合蛋白B7.2转染子B7.2/Ig融合蛋白CTLA4转染子CTLA4/Ig	免疫，免疫测定筛选，ELISA抑制研究，淘选筛选，ELISA抑制研究，淘选抑制研究抑制研究	是是是是将完成将完成将完成

这些试剂和B7.1(L3074)(Becton Dickinson，1994)和B7.2(Fun-1等，血液，84，1402-1407，(1994))的单克隆抗体以及特异性的开发以检测猕猴Fab片段的纯化的山羊和兔抗血清的获得有助于鉴定具有所需性质的抗体。

实施例3

噬菌体展示文库的产生

从B7.1和B7.2免疫猕猴产生重组噬菌体展示文库。在免疫7-12天后，进行淋巴结和骨髓活组织检查以收集富含RNA的B细胞和浆细胞。使用Chomczynski分析生物化学，162(1)，156-159，(1987)描述的方法从淋巴细胞中分离RNA。使用寡dT引物和逆转录酶将RNA转化为cDNA。将第一链cDNA分成等份试样，使用数组前面描述的k、λ和重链Fd区引物和Pfu聚合酶(Stratagene，San Diego)或Taq聚合酶(Promega，Madison)进行PCR扩增。收集重链PCR扩增产物，用Xho Vspe I限制酶切割并克隆至载体pMS中。随后，收集轻链PCR产物，用Sac I/XbaI限制酶切割，并克隆以产生重组文库。将XLI-Blue大肠杆菌用文库DNA转化并用VCSM13超感染以产生噬菌体展示抗体。在用B7.1或B7.2抗原包被的聚苯乙烯孔中将文库淘选四轮。分析来自每轮淘选的噬菌体克隆。分离pMS载体DNA，切除基因III。产生可溶性的Fab片段，用ELISA检测与B7.1和B7.2的结合。

实施例4

噬菌体Fab片段的表征

确定猕猴噬菌体Fab片段的阻断B7.1-Ig和B7.2-Ig与CTLA-4-Ig或CTLA-4转染细胞结合的特异性和能力。还确定了在对用于免疫的B7种类的4轮淘选中的第一次淘选后噬菌体片段的交叉反应性以选择高亲和性的片段。通过感染并在大肠杆菌的24小时发酵培养基中培养扩增从对B7.1或B7.2抗原包被表面的4轮淘选确定的Fab片段。将片段通过与抗FLAG亲和柱结合的Kodak FLAG纯化。通过基于ELISA的定向结合修饰的Scatchrd分析(Katoh等，化学与生物工程杂志，76：451-454，(1993))，使用羊抗猕猴Fab抗体或与辣根氧化物酶结合的抗FLAG MAb检测纯化的噬菌体Fab的亲和性。抗猕猴Fab试剂将被吸附来抗人重链恒定区Ig以除去融合与B7-Ig的交叉反应。在测定与B7.1-Ig或B7.2-Ig包被平板的直接结合后，计算各片段的Kd值。

实施例5

噬菌体Fab片段阻断CTLA-4/B7结合

在最低浓度下最有效地阻断B7-Ig结合的Fab片段被选择作为前导代表。通过¹²⁵I-B7-Ig与CTLA-4-Ig或CTLA-4转染细胞的结合竞争来进行选择。另外的选择标准包括如通过抑制效应细胞中的3H-胸苷的摄取和使用IL-2分析试剂盒对IL-2产生进行直接分析而测得的混合淋巴细胞反应(MLR)的阻断(Azuma等，实验医学杂志，177：845-850；Azuma等，自然，301：76-79，(1993))。在抑制MLR和CTLA-4结合的测定中最有效的三或四种代表物被选择用于克隆至转染到CHO细胞中并表达嵌合猴/人抗体的上述哺乳动物表达载体中。

实施例6

猴异源杂交瘤的产生

从其血清被检测为B7.1和/或B7.2阳性的存活免疫动物中产生分泌单克隆抗体的猴异源杂交瘤。从对一种或两种抗原为阳性的动物中获取淋巴结活组织。杂交瘤产生的方法类似于已建立的用于产生猴抗CD4抗体的方法(Newman，1992(Id))。麻醉下切下具有高血清效价的猕猴的腹股沟淋巴结部分。从组织中洗出淋巴细胞并使用聚乙二醇(PEG)与KH6/B5异源骨髓瘤细胞融合(Carrol等，免疫方法杂志，89：61-72(1986))。在H.A.T.培养基中选择杂交瘤并通过在96孔平板中重复亚克隆进行稳定。

筛选B7.1抗原特异性的猕猴单克隆抗体的对B7.2的交叉反应性。使用¹²⁵I-B7-Ig结合测定来确定猕猴抗B7抗体对B7/CTLA-4结合的阻断。通过3H-胸苷摄取以及直接测定L-2产生确定的MLR抑制被用来选择三种代表物。在重复所有功能性实验时，两种代表物被用于II期研究中并在CHO细胞中表达。为了开发用于体内药物学的动物模型的目的，在几种动物种类的细胞中检测抗B7抗体。动物模型的建立就使得能进行临床前研究以用于选择的临床适应症。

实施例7

如上文所讨论的，使用上面的异源杂交瘤方法，确定4种主要的猴抗B7.1抗体：16C10、7B6、7C10和20C9。这些抗体被表征如下：

Dcatchard分析表明，猴抗体结合B7-Ig包被平板的表观亲和常数大约为：

a：7C10：   6.2×10^-9M

b：16C10：  8.1×10^-9M

c：7B6：    10.7×10^-9M

d：20C9：  16.8×10^-9M

在混合淋巴细胞反应试验(MLR)中体外测定抗体。MLR表明所有4种抗B7.1抗体不同程度地抑制IL-2的产生：

a：7B6：    5.0ug/ML

b：16C10：  0.1ug/ML

c：20C9：   2.0ug/ML

d：7C10：   5.08ug/ML

检测猴抗B7.1抗体与人外周血淋巴细胞(PBL)中的B7结合的能力。FACS分析表明所有4种猴抗体检测为阳性。通过FACS分析检测猴抗体16C10、7B6、7C10和20C9的Clq结合。结果表明在与B7.1CHO转染的细胞一起保温后，7C10猴Ig具有强的人Clq结合。16C10也为阳性，而20C9和7B6猴抗体为阴性。

实施例8

使用引作参考的共同转让的美国流水号08/379,072的灵长化抗体方法，并使用图2所示的NEOSPLA载体系统，克隆7C10，7B6和16C10的重链和轻链可变区，使用NEOSPLA载体系统在CHO细胞中合成它的灵长化形式。灵长化的7C10轻链和重链、7B6轻链和重链以及16C10轻链和重链的氨基酸和核酸序列分别示于图3a、3b、4a、4b、5a、5b。

实施例9

CTLA-4的非交叉反应性和B7.1中的PRIMATIZED^抗体结合位点的证明实验

在使用生物素化的CTLA-4Ig(图6)的竞争性结合分析中，未标记的灵长化16C10(即P16C10)不能阻断CTLA-4Ig与B7.1转染的CHO细胞的结合。可以看出在这些条件下未标记的CTLA-4Ig和未标记的B7.1有效地竞争。

在使用生物素化的P16C10的第二个实验中，可作出相同的结论。在图7所示的实验中，P16C10-生物素的结合被未标记的P16C10和B7.1Ig所抑制，但不被CTLA-4Ig抑制。虽然据报道CTLA-4Ig亲和性高4-10倍(Kd＝0.4nM；Morton等，免疫学杂志156：1047-1054(1996))，甚至在CTLA-4Ig浓度超过100倍时仍没有P16C10结合的明显抑制。

当在实验中它取代P16C10时，使用灵长化的抗体7C10(P7C10)获得类似的结果(数据未提供)。

实施例10

在存在CTLA-4Ig存在下L307.4和BB-1小鼠抗体与B7 CHO细胞结合的能力的比较

为了确定小鼠抗体结合位点是否与CTLA-4结合位点重叠，研究了CTLA-4Ig存在下L307.4和BB-1小鼠抗B7抗体的结合。进行使用P16C10-生物素、L307.4-生物素和CTLA-4Ig-生物素的竞争测定实验以确保亲和性的不同不妨碍竞争性结合的检测。结果示于图8和9中。

图8的结果证实了早期的研究，即小鼠抗体BB-1不与P16C10竞争。这些结果还表明存在约50％的与L307.4的交叉反应性。图8的结果证实BB-1和L307.4相互竞争并且BB-1完全阻断CTLA-4Ig-生物素与B7.1转染的细胞的结合。BB-1不显著地影响P16C10与B7.1阳性CHO细胞的结合。

图9所示的结果表明当在结合实验中使用CTLA-4Ig-生物素时竞争大于50％。图9表明CTLA-4Ig-生物素被除P16C10外的所有B7.1抑制剂有效地阻断，因此P16C10识别一个独特的结合决定子，其在产生阴性信号中允许正常CTLA-4配体结合。早期的功能性研究(数据未显示)表明在同种异体MLR中L307.4阻断IL-2产生的减弱的能力，这与它可能干扰CTLA-4阴性信号的假设一致。不清楚文献中报道的其它小鼠抗体中有多数种产生CTLA-4结合的完全抑制；然而，这在确定B7.1和B7.2特异性抗体的真正功能机理中非常重要。

这些结果证实了在使用B7-Ig与P16C10生物素竞争与B7.1转染CHO细胞的结合的早期研究。研究还证实了CTLA-4Ig不抑制P16C10的早期观察。这些结果清楚地表明灵长类抗体对独立于CTLA-4结合位点的主要与CD28相互作用的唯一的B7.1表位是特异性的。由于它可阻断B7.1与CD28受体结合而仍允许CTLA-4的阴性信号功能不被抑制地产生，因此，这种类型的相互作用将提供好处。无论是Th1或Th2表型的优势，被发现的这种相互作用可能导致整个T细胞活化应答的下调。

当在实验中使用P7C10取代P16C10时，获得类似的结果(数据未提供)。

实施例11

证明P16C10与CD28受体结合和阻断B7.1与CD28受体相互作用能力的实验

通过用¹²⁵I标记B7.1Ig，接着竞争性地与CD28阳性未活化的外周血T淋巴细胞结合进行确定是否P16C10结合B7.1可阻断B7.1与CD28的相互作用的实验。如通过用未标记的B7.1Ig的抑制所证实的，示于图10的结果表明标记的B7.1Ig特异性地与T细胞结合。结果还表明CTLA-4Ig、抗CD28和P16C10均能阻断这种相互作用。结果进一步证实P16C10阻断CD28/B7相互作用的结合，IC₅₀＜1ug/mL。

在没有膜相关的CTLA-4被表达的条件下获得上面的结果(Linsley等，实验医学杂志173：721-730(1991))并通过抗CD28抗体阻断而证实。

当在实验中使用P7C10取代P16C10时，获得类似的结果(数据未提供)。

由于其可能较低的抗原性和人效应功能，预期这些灵长化抗体将极适宜于作为治疗剂。事实上，最近已表明灵长化的16C10显示人Clq结合。

本领域技术人员通过常规实验将认识到或能确定本文描述的本发明具体实施方案的许多等同物。这些等同物被权利要求书所包括。

Claims (24)

1.特异性结合人CD80抗原并且抑制CD80抗原与CD28结合，但不抑制CD80与CTLA-4结合的单克隆抗体或其片段，

它与包含选自下组的轻链和重链可变区的抗体竞争与人CD80抗原的结合：

分别具有图3a和3b所示的氨基酸序列的单克隆猴抗体7C10的轻链和重链可变区，和

分别具有图5a和5b所示的氨基酸序列的单克隆猴抗体16C10的轻链和重链可变区。

2.权利要求1的单克隆抗体或其片段，该抗体包含：

分别具有图3a和3b所示的氨基酸序列的单克隆猴抗体7C10的轻链和重链可变区；和

猴或人抗体的轻链和重链恒定区。

3.权利要求1的单克隆抗体或其片段，该抗体包含：

分别具有图5a和5b所示的氨基酸序列的单克隆猴抗体16C10的轻链和重链可变区；和

猴或人抗体的轻链和重链恒定区。

4.权利要求2或权利要求3的单克隆抗体，它包含选自人γ1恒定区、人γ4恒定区和人γ4 PE恒定区的人重链恒定区。

5.权利要求1-3的任一项的单克隆抗体片段，该片段选自Fab、Fab₂和Fv。

6.权利要求1-3的任一项的单克隆抗体或其片段，它在体外抑制T淋巴细胞产生IL-2。

7.权利要求6的单克隆抗体或其片段，其中当以至少10μg/ml的浓度存在时，所述抗体在体外抑制T淋巴细胞产生IL-2。

8.权利要求1-3的任一项的单克隆抗体或其片段在制备用于预防或治疗可以经通过CD80/CD28途径抑制T细胞和B细胞之间的相互作用而导致的免疫抑制而治疗的疾病或紊乱的药物中的用途。

9.权利要求8的用途，其中所述疾病或紊乱选自自身免疫病、移植物抗宿主疾病、移植器官或组织的排斥、增殖和增殖过度疾病、变态反应、表现在皮肤的免疫介导的疾病、可逆性气管阻塞疾病、传染病、炎性疾病和B细胞淋巴瘤。

10.权利要求9的用途，其中所述药物用于预防或治疗移植物抗宿主疾病或移植器官或组织的排斥，其中移植物或移植器官或组织选自肾、心脏、肺、骨髓、皮肤和角膜。

11.权利要求9的用途，其中所述药物用于预防或治疗自身免疫或炎性疾病或紊乱。

12.权利要求9的用途，其中所述疾病或紊乱选自类风湿性关节炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化、重症肌无力、再生障碍性贫血、I型糖尿病、特发性血小板减少性紫癜、眼色素层炎、肾病综合症、银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、湿疹性皮炎、扁平苔癣、天疱疮、大疱天疱疮、表皮松解性大疱、荨麻疹、血管水肿、脉管炎、红斑、皮肤嗜曙红细胞增多、簇状脱发、偏头痛、湿疹、鼻炎、腹腔疾病、直肠炎、嗜曙红细胞增多胃肠炎、肥大细胞病、节段性回肠炎和溃疡性结肠炎。

13.权利要求9的用途，其中所述疾病或紊乱选自特发性血小板减少性紫癜，系统性红斑狼疮，1型糖尿病，多发性硬化、再生障碍性贫血、银屑病、变态反应、炎性肠病和类风湿性关节炎。

14.权利要求9的用途，其中所述药物用于治疗HIV感染。

15.权利要求8的用途，其中所述药物进一步包含重组蛋白质或小分子免疫抑制剂或调节B7:CD28途径的小分子，或与重组蛋白质或小分子免疫抑制剂或调节B7:CD28途径的小分子联合施用。

16.权利要求15的用途，其中所述免疫抑制剂选自环孢菌素A、FK506、TNF-α的可溶性受体、IL-1的可溶性受体、抗-TNF-α抗体、抗-CD54抗体、抗-CD11抗体和抗-CD11a抗体。

17.权利要求15的用途，其中调节B7:CD28途径的试剂选自IL-7、IL-10、CTLA4-Ig融合蛋白、可溶性CTLA-4和抗-CD28抗体及其CD28结合片段。

18.一种适于预防或治疗可以经抑制CD80与CD28结合而导致的免疫抑制而预防或治疗的疾病或紊乱的药物组合物，该组合物包含预防或治疗有效量的权利要求1-3的任一项的单克隆抗体或其片段和药物可接受载体。

19.权利要求18的药物组合物，其中所述疾病或紊乱选自自身免疫病、移植物抗宿主疾病、移植器官或组织的排斥、增殖和增殖过度疾病、变态反应、表现在皮肤的免疫介导的疾病、可逆性气管阻塞疾病、传染病、炎性疾病和B细胞淋巴瘤。

20.权利要求19的药物组合物，其中所述疾病或紊乱是移植物抗宿主疾病或移植器官或组织的排斥，其中移植物或移植器官或组织选自肾、心脏、肺、骨髓、皮肤和角膜。

21.权利要求19的药物组合物，其中所述疾病或紊乱是自身免疫或炎性疾病或紊乱。

22.权利要求19的药物组合物，其中所述疾病或紊乱选自类风湿性关节炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化、重症肌无力、再生障碍性贫血、I型糖尿病、特发性血小板减少性紫癜、眼色素层炎、肾病综合症、银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、湿疹性皮炎、扁平苔癣、天疱疮、大疱天疱疮、表皮松解性大疱、荨麻疹、血管水肿、脉管炎、红斑、皮肤嗜曙红细胞增多、簇状脱发、偏头痛、湿疹、鼻炎、腹腔疾病、直肠炎、嗜曙红细胞增多胃肠炎、肥大细胞病、节段性回肠炎和溃疡性结肠炎。

23.权利要求19的药物组合物，其中所述自身免疫病或炎性疾病或紊乱选自特发性血小板减少性紫癜，系统性红斑狼疮，1型糖尿病，多发性硬化、再生障碍性贫血、银屑病、变态反应、炎性肠病和类风湿性关节炎。

24.权利要求19的药物组合物，其中所述疾病或紊乱与HIV感染相关。

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