CN106177931B - 免疫检测点双阻断ctl高效率杀伤细胞制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了免疫检测点阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1）：采集外周血单状核细胞；步骤2）：将上述分离的单状核细胞通过贴壁法进行DC和T的分离；步骤3）：将贴壁的DC细胞加入含GM‑CSF、IL‑4的无血清培养制备成DC疫苗；步骤4）：将悬浮的T细胞加入CD3和IL‑2进行T细胞培养和扩增；步骤5）：在扩增的T细胞内加入负载抗原的DC细胞制备成CTL，同时加入PD‑1及CTLA‑4抗体制备成Dual‑block CTL效应细胞制剂。本发明提供了一种通过阻断肿瘤特异性CTL细胞表面的抑制性分子，有效调控“免疫刹车”效应并减缓“T耗竭”，从而大幅提高CTL效应细胞的肿瘤杀伤效应的新技术和新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗新技术及新制剂，特别涉及一种新型、临床型、肿瘤特异性免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂及其制备方法。
背景技术
细胞免疫治疗经历了LAK、DC-CIK、CTL及TIL的历程，虽杀伤效率逐步提高，临床试验获得了较好的临床疗效，但客观有效率低仍是目前临床亟待解决的主要问题。高效率肿瘤杀伤的技术关键在于，如何打破肿瘤免疫耐受、提高T细胞制剂的肿瘤特异性识别功能、强化效应T细胞的体内杀伤效率、以及降低临床副反应等核心问题。
近年来，免疫检测点阻断成为细胞免疫治疗的研究热点。研究发现T细胞活化过程中释放大量INF-γ，导致细胞表面的PD-1分子表达升高；而大多实体肿瘤细胞表面存在其配体PD-L1的高表达，二者结合后会启动T细胞的抑制性信号通路，导致T细胞“耗竭”和无能。CTLA-4在T细胞活化的早期表达升高，其配体B7-1（CD80）和B7-2（CD86）表达于DC表面，CTLA-4表达升高将与T细胞表面的CD28共刺激分子竞争性结合B7分子，发挥“免疫刹车”效应，导致T细胞“耗竭”和无能。有动物实验研究证实，应用抗体阻断T细胞表面的PD-1或CTLA-4，能够有效促进T细胞的杀伤功能。同时有临床试验证实，人体应用抗PD-1、抗PD-L1、或抗CTLA-4抗体，能有效抑制肿瘤生长，部分病人肿瘤明显缩小或消失。
本专利旨在发明一种新型、临床型、肿瘤特异性免疫检测点双阻断CTL（Dual-block CTL）的制备技术和杀伤细胞制剂，在打破肿瘤免疫耐受基础上，大幅提高细胞免疫治疗的客观有效率。主要方法是，外周血获取DC和T细胞并体外扩增；通过肿瘤抗原负载DC制备成治疗型DC疫苗；T细胞扩增第7天加入DC疫苗活化，同时加入抗PD-1及CTLA-4抗体实施PD-1和CTLA-4双阻断，第10-15天收获免疫检测点双阻断CTL（Dual-block CTL）效应细胞制剂。
经体外体内杀伤实验证实，Dual-block CTL的肿瘤特异性杀伤效率显著高于现有DC-CIK及CTL技术，并具有临床应用的安全性和可靠性。
发明内容
本发明的主要目的是解决目前细胞免疫治疗临床应用中，由于肿瘤微环境引起的肿瘤杀伤效率低、临床客观有效率低等问题，通过本发明的技术方法，可以显著提高肿瘤的杀伤效率及临床客观有效率。
本发明提供了一种新型、临床型、肿瘤特异性免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂及其制备方法。其中，DC细胞和T细胞可采用脐血造血干细胞来源或肿瘤病人自体外周血来源。
Dual-block CTL制备及主要实验步骤：
1、肿瘤特异性抗原选择：多种肿瘤抗原均适用于本专利涉及的效应细胞如：①、手术切除的新鲜肿瘤组织：离体30分钟内液氮冻存，网搓法或酶消化法制备单细胞悬液，冻融法制备抗原蛋白，定量后-20℃保存备用；②、活检获得的新鲜肿瘤组织标本：网搓法或酶消化法制备单细胞悬液，冻融法制备抗原蛋白，定量后-20℃保存备用；③、胸腹水离心获得的肿瘤细胞：过滤获得单细胞悬液，冻融法制备抗原蛋白，定量后-20℃保存备用。
2、单状核细胞采集：静脉抽取或血液成分分离机（COBE®Spectra™）采集肿瘤病人外周血单状核细胞（或采集脐血造血干细胞，制备同种异体DC用）100ml，常规抗凝，4℃环境送达GMP样实验室。
3、单状核细胞分离：所采集单状核细胞移入50ml离心管，1500rpm×10分钟离心。收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清，4℃冷藏备用。收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，加速减速设定最小值。一次性吸管吸取中间白膜层，收集单状核细胞。分别取15ml单状核细胞移入含30ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心洗3次（1500rpm离心8分钟、1250rpm离心8分钟、1000rpm离心8分钟）弃上清收获单状核细胞。
4、DC及T细胞分离：将单状核细胞移入含AIM-V（GIBCO）培养基的培养瓶中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟取出，吸取悬浮T细胞移入新培养瓶另行扩增培养；粘附于瓶底的细胞即为DC细胞（脐血造血干细胞来源DC，需应用体外定向诱导及扩增技术获取）。
5、DC扩增及疫苗制备：贴壁的DC细胞中加入AIM-V培养基20ml（含GM-CSF为1000IU/ml，IL-4为600IU/ml），置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养，第3天补液，第5天加入肿瘤特异性抗原50ug/ml，第7天获得肿瘤特异性DC疫苗（数量级：4-5×108）。按1-2×107/冻存管，分装3-4管于梯度降温冻存盒-80℃冻存，治疗型DC疫苗备用。
6、T细胞制备：取培养瓶，加入含CD3单抗的AIM-V培养基（CD3单抗浓度为500ng/ml）20ml，移入1-2×107悬浮T细胞，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中扩增培养，次日补充50%的IL-2培养基（IL-2浓度为500IU/ml），后每3天补充IL-2培养基40%以上。第10-15天收获单纯扩增的T细胞备用。
7、DC-CIK制备：取培养瓶，加入含IFN-γ的AIM-V培养基20ml（IFN-γ浓度为1000IU/ml），移入1-2×107悬浮T细胞，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养24小时；次日，补充50%含有CD3单抗和IL-2的培养基（CD3单抗浓度为500ng/ml、IL-2浓度为500IU/ml）；后每3天补充IL-2培养基40%以上。第7天DC疫苗收获后，按DC：T =1：20的比例加入DC疫苗共培养，每3天据情补充IL-2培养基，每次补充40％以上。第10-14天收获DC-CIK效应细胞。
8、肿瘤特异性CTL效应细胞制备：取培养瓶，加入含CD3单抗的AIM-V培养基（CD3单抗浓度为500ng/ml）20ml，移入1-2×107悬浮T细胞，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中扩增培养，次日补充50%的IL-2培养基（IL-2浓度为500IU/ml），后每3天补充IL-2培养基40%以上。第7天DC疫苗收获后，按DC：T =1：20的比例加入DC疫苗共培养，每3天据情补充IL-2培养基，培养10-14天收获腺癌特异性CTL效应细胞。
9、肿瘤特异性Dual-block CTL效应细胞制备：取培养瓶，加入含CD3单抗的AIM-V培养基（CD3单抗浓度为500ng/ml）20ml，移入1-2×107悬浮T细胞，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中扩增培养，次日补充50%的IL-2培养基（IL-2浓度为200IU/ml），后每3天补充IL-2培养基40%以上。第7天DC疫苗收获后，按DC：T =1：20的比例加入DC疫苗共培养。第8天加入PD-1单抗5ug/ml和CTLA-4单抗10ug/ml培养48小时，第10天收获肿瘤特异性Dual-block CTL效应细胞。
10、临床型Dual-block CTL细胞制剂的制备：上述Dual-block CTL效应细胞移入50ml离心管，1500rpm×10分钟离心，弃上清；生理盐水1000rpm离心8分钟离心洗3次，祛除细胞碎片。收集细胞，加入静脉用生理盐水吹打混匀，制备单细胞悬液。移入200ml静脉用生理盐水瓶（含人血白蛋白2.0g，IL-2 20万单位），细胞数量控制在1-3×109/100ml，制备成临床型Dual-block CTL细胞制剂，4℃环境保存备用。
本发明的主要研究内容：T细胞活化早期出现CTLA-4表达增高，活化后PD-1表达显著增高，并在活化的CTL持续高表达。PD-1的配体PD-L1及CTLA-4的配体CD80和CD86在大多肿瘤细胞表面均出现高表达。活化的T细胞进入肿瘤微环境后，CTLA-4与其配体B7分子（CD80，CD86）结合，将会启动“免疫刹车”效应，导致T细胞无能；PD-1与其配体PD-L1结合，将会启动T细胞的抑制性信号通路，导致“T细胞耗竭”。因而，免疫检测点阻断治疗，可阻断抑制性信号通路，实现“免疫刹车”机制的可调控，促进“免疫释放”，增强T细胞的杀伤效率。
与已有DC-CIK及肿瘤特异性CTL技术相比，本发明具有显著的积极效果：体外杀伤实验表明，免疫检测点双阻断CTL的杀伤效率明显高于DC-CIK和CTL对照组，同时其IL-2及INF-γ的分泌量也明显高于对照组。动物实验表明，免疫检测点双阻断CTL的抑瘤率显著高于DC-CIK和CTL对照组。因而，本发明所制备的免疫检测点双阻断CTL效应细胞制剂，能有效调控“免疫刹车”效应，并减缓“T细胞耗竭”，从而大幅提高效应细胞的肿瘤杀伤效应及临床客观有效率。
附图说明
图1为激活后T细胞不同时间段PD-1、CTLA-4的表达量折线图；
图2为配体PD-L1在结直肠腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌的流式表达图；
图3为配体CD80、CD86在乳腺癌的流式表达图；
图4为双阻断CTL组的体外杀伤实验效果明显高于对照组柱状图；
图5为双阻断CTL组IL-2的分泌量明显高于对照组柱状图；
图6为双阻断CTL组INF-γ的分泌量明显高于对照组柱状图；
图7为预防性抑瘤实验中，双阻断CTL对肿瘤生长的抑制率明显高于对照组的折线图；
图8为治疗性抑瘤实验中，双阻断CTL对肿瘤的杀伤效率明显高于对照组的折线图。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
本实例1用PD-1和CTLA-4抗体阻断CTL制剂的抑制信号，制备成高效率的双删CTL制剂，同时检测了肿瘤细胞表面PD-1的配体PD-L1以及CTLA-4的配体B7-1和2（CD80、CD86）的表达特征，具体步骤如下：
1）单状核细胞的获取：
静脉抽取或血液成分分离机采集肿瘤病人外周血单状核细胞（或采集脐血造血干细胞，制备同种异体DC）100ml，离心收集全血细胞，移入淋巴细胞分离液，水平转头离心2000rpm×15分钟，吸取中间白膜层，收集单状核细胞。
2）DC和T细胞分选：
上述收集的单状核细胞移入含无血清培养基的培养瓶中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育60分钟取出，粘附于瓶底的DC细胞另行培养，制备DC疫苗。吸取悬浮T细胞移入新培养瓶进行培养。
3）DC扩增和疫苗制备：
上述贴壁的DC中加入AIM-V培养基20ml（含GM-CSF为1000IU/ml，IL-4为600IU/ml），置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养；第3天补液，第5天加入特异性肿瘤抗原50ug/ml，第7天收获特异性DC疫苗（数量级：4-5×108）。
4）T细胞培养和扩增：
取T细胞培养瓶，加入含CD3单抗的AIM-V培养基（CD3单抗浓度为500ng/ml）20ml，移入1-2×107的上述悬浮T细胞，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中扩增培养，次日补充50%的IL-2培养基（IL-2浓度为500IU/ml），后每3天补充IL-2培养基40%以上，进行扩增培养。
5）T细胞活化及CTL制备：
第7天DC疫苗收获后，按DC：T =1：20的比例加入DC疫苗，与T细胞共培养（T细胞活化），进行抗原特异性CTL制备，每3天补充IL-2培养基，培养10-15天收获腺癌特异性CTL效应细胞。对活化后CTL制剂中PD-1及CTLA-4表达情况进行流式细胞检测。结果显示第7天活化后，PD-1表达显著升高，第9天达到72.4%，并持续维持在高水平。在活化后10小时，CTLA-4表达即早期出现快速升高到43.7%，随后下降并维持在相对较高水平（见附图1）。
6）Dual-block CTL制备：
第7天DC疫苗收获后，按DC：T =1：20的比例加入DC疫苗，与T细胞共培养（T细胞活化），进行抗原特异性CTL制备；同时于第8天加入抗人PD-1单抗5ug/ml，及抗人CTLA-4单抗10ug/ml，进行免疫监测点阻断，每3天补充IL-2培养基，培养10-15天收获腺癌特异性Dual-block CTL效应细胞。
7）腺癌细胞的配体表达：
选取腺癌细胞株3个：结肠腺癌细胞株（LS-174T）、乳腺癌细胞株（MDA-SB435S）及肺腺癌细胞株（NCI-H1650）。分别培养扩增，应用抗人PD-L1抗体或抗人CD80、CD86抗体染色后，行流式细胞检测分析。结果显示：三个腺癌细胞均为PD-L1高表达：结肠腺癌LS-174T、乳腺癌MDA-SB435S及非小细胞肺腺癌NCI-H1650的PD-L1表达率分别为34.6%、83.85%及64.7%（见附图2）。乳腺癌细胞（MDA-SB435S）CD80及CD86表达分别为47.42%及67.47%（见附图3）。
实施例2
本实例2是应用Dual-block CTL效应细胞制剂，对靶细胞（乳腺癌）进行实验室杀伤实验研究（in vitro）和动物试验研究（in vivo），同时，与DC-CIK及抗原特异性CTL效应细胞进行对照研究，验证Dual-block CTL在杀伤效率上的优势。
1、in vitro杀伤实验研究：
1）效应细胞：Dual-block CTL（实验组）、T细胞（对照1）、DC-CIK（对照2）、CTL（对照3）。
2）靶细胞：乳腺癌细胞株（MDA-SB435S）。
3）实验分组： Dual-block CTL（实验组）、T细胞（对照1）、DC-CIK（对照2）、CTL（对照3）、NS（阴性对照）。
4）in vitro杀伤及细胞因子分泌实验：
应用细胞毒性分析，于96孔板接种MDA-SB435S靶细胞，分别加入效应细胞Dual-block CTL、CTL、DC-CIK、T及NS，每组3孔，共培养2天后吸出上清备用；加入20ul/孔CCK-8试剂，培养3小时后，酶标仪450mn波长检测，测量各孔OD值并记录。结果显示：效应细胞对肿瘤细胞的杀伤效率显著高于NS对照组，其中Dual-block CTL的杀伤效率明显高于CTL（P<0.005），并显著高于DC-CIK（P<0.001; 见附图4）。
上述所采集的效应细胞/靶细胞培养上清，分别应用ELISA试剂进行INF-γ及IL-2含量检测，测量其OD值并记录。结果显示Dual-block CTL上清中IL-2分泌量明显高于CTL（P<0.05）及DC-CIK（P<0.01; 见附图5）；INF-γ分泌量明显高于CTL（P<0.005）及DC-CIK（P<0.05; 见附图6）。
2、in vivo杀伤实验研究：
1）预防性抑瘤实验（Prophylactic assay）：
采用NOD/SCID鼠，人外周血单状核细胞1×107尾静脉注射，实现裸鼠的人体免疫重建。重建4周后，尾静脉分别注射1×107效应细胞：Dual-block CTL（实验组）、CTL（对照1）、DC-CIK（对照2）、T（对照3）、及NS（阴性对照），每组5只。效应细胞注射后2天，皮下接种人乳腺癌细胞（MDA-SB435S）1×107造模。观察肿瘤生长并测量记录。结果显示：Dual-blockCTL对乳癌生长的抑制率明显高于CTL（P<0.05）和DC-CIK（P<0.05；见附图7）。
2）治疗性抑瘤实验（Therapeutic assay）：
采用NOD/SCID鼠，人外周血单状核细胞1×107尾静脉注射，实现裸鼠的人体免疫重建。重建4周后，皮下接种人乳腺癌细胞（MDA-SB435S）1×107造模。造模后10-15天肿瘤结节生长至0.5cm3时，尾静脉分别注射1×107效应细胞：Dual-block CTL（实验组）、CTL（对照1）、DC-CIK（对照2）、T（对照3）、及NS（阴性对照），每组5只。观察肿瘤生长情况并记录。结果显示：Dual-block CTL的肿瘤抑制率显著高于CTL（P<0.05）和DC-CIK（P<0.05；见附图8）。
Claims (6)
1.免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）单状核细胞的获取；
（2）DC和T细胞的分选；
（3）DC扩增和疫苗的制备；
（4）T细胞培养和扩增，具体包括：取细胞培养瓶，加入含CD3单抗500ng/ml的无血清培养基AIM-V，将分选获得的T细胞加入培养瓶，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中过夜，次日半量补充含500IU/ml IL-2的AIM-V培养基（IL-2培养基），后每3天补充IL-2培养基40%以上，进行扩增培养；
（5）T细胞活化和Dual-block CTL制备，具体包括：第7天DC疫苗收获后，按DC:T=1:20的比例将DC疫苗加入T细胞培养瓶中共培养，使T细胞活化并制备成肿瘤特异性CTL效应细胞；第8天加入抗人PD-1单抗3-15ug/ml及抗人CTLA-4单抗3-15ug/ml，进行效应细胞免疫检测点双阻断，每3天补充IL-2培养基，培养10-15天收获肿瘤特异性Dual-block CTL效应细胞制剂，流式检测Dual-block CTL表面PD-1及CTLA-4的表达持续低水平；所述效应细胞选自T细胞来源的各种CTL、TIL、NK、CIK、以及各种T细胞亚型等细胞。
2.根据权利要求1所述的免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）具体包括：静脉抽取或血液成分分离机采集肿瘤病人外周血单状核细胞或脐血造血干细胞100ml，离心收集全血细胞，移入淋巴细胞分离液，水平转头离心2000rpm×15分钟，吸取中间白膜层，加入生理盐水吹打混匀，1500r/min离心5分钟，弃上清，洗3遍，收集的细胞为单状核细胞。
3.根据权利要求1所述的免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）具体包括：将收集的单状核细胞移入含无血清培养基的培养瓶中，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟取出，粘附于瓶底的DC细胞另行培养，制备DC疫苗；吸取悬浮T细胞移入新培养瓶另行培养。
4.根据权利要求1所述的免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）具体包括：上述贴壁的DC细胞中加入含GM-CSF为1000IU/ml和IL-4为600IU/ml的AIM-V培养基20ml，置于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中扩增培养；第3天补液，第5天加入特异性肿瘤抗原50ug/ml，第7天收获特异性DC疫苗。
5.根据权利要求4所述的免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述肿瘤抗原选自病人自体肿瘤抗原、各种抗原肽、融合肿瘤细胞抗原、凋亡肿瘤细胞抗原、衰老肿瘤细胞抗原、各种重组蛋白、肿瘤DNA、肿瘤RNA。
6.根据权利要求1-5任一项所述的免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，其特征在于，IL-2培养基中加入10U/ml的IL-15。
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211209 Address after: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, No. 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang, Hebei Patentee after: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 2F, building 1, Hongchang Science Park, No. 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang City, Hebei Province Patentee before: HEBEI NONGFOYU BIOLOGY TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, No. 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang, Hebei Patentee after: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, No. 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang, Hebei Patentee before: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. |
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| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231016 Address after: Room 2024, Hebei Publishing Media Creative Center, No. 19 Yuanboyuan Street, Zhengding District, China (Hebei) Free Trade Pilot Zone, Shijiazhuang City, Hebei Province, 050899 Patentee after: Yuetenong biotechnology Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, No. 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang, Hebei Patentee before: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231115 Address after: Room 2024, Hebei Publishing Media Creative Center, No. 19 Yuanboyuan Street, Zhengding District, China (Hebei) Free Trade Pilot Zone, Shijiazhuang City, Hebei Province, 050899 Patentee after: Yuetenong biotechnology Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, No. 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang, Hebei Patentee before: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |