CN110511906A - 一种细胞组合物在癌细胞smmc-7721上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞组合物，以及该细胞组合物在癌细胞SMMC‑7721及肝癌上的应用。具体涉及γδT细胞和NK细胞共培养细胞系及PD‑1/PD‑L1单抗和/或双特异性抗体，且细胞组合物中的γδT细胞和NK细胞通过共培养方式获得，先刺激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞和NK细胞，后通过活化扩增培养，扩增出具有数量大、扩增倍数高、细胞毒性强等特点的γδT细胞和NK细胞复合细胞物，扩增培养后的γδT‑NK细胞与PD‑1/PD‑L1单抗和/或双特异性抗体混合形成细胞组合物，组合物SMMC‑7721杀伤作用强。且该组合物制备方法提高细胞培养效率，大幅度降低培养成本，也降低了培养技术难度，简化了在临床中治疗过程，也降低了治疗成本，简化了治疗手段。

Description

一种细胞组合物在癌细胞SMMC-7721上的应用

技术领域：

本发明涉及一种细胞组合物，组合物包括免疫治疗细胞和抗体，具体涉及γδT细胞 和NK细胞共培养细胞系及PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体，使用该组合物在癌细胞SMMC-7721上的应用。

背景技术：

肝脏恶性肿瘤可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮 或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤， 与原发性肝癌相比较较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤 侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。

根据肝癌的不同阶段酌情进行个体化综合治疗，是提高疗效的关键；现有的治疗方法 包括手术、肝动脉结扎、肝动脉化疗栓塞、射频、冷冻、激光、微波以及化疗和放射治疗等方法。生物治疗，中医中药治疗肝癌也多有应用。

1.手术治疗：手术是治疗肝癌的首选，也是最有效的方法。手术方法有：根治性肝切 除，姑息性肝切除等。对不能切除的肝癌可根据具体情况，采用术中肝动脉结扎、肝动脉化疗栓塞、射频、冷冻、激光、微波等治疗有一定的疗效。原发性肝癌也是行肝移植手术 的指征之一。

2.化学药物治疗：经剖腹探查发现癌肿不能切除，或作为肿瘤姑息切除的后续治疗者， 可采用肝动脉和(或)门静脉置泵(皮下埋藏灌注装置)作区域化疗栓塞；对估计手术不 能切除者，也可行放射介入治疗，经股动脉作选择性插管至肝动脉，注入栓塞剂(常用如碘化油)和抗癌药行化疗栓塞，部分患者可因此获得手术切除的机会。

3.放射治疗：对一般情况较好，肝功能尚好，不伴有肝硬化，无黄疸、腹水、无脾功能亢进和食管静脉曲张，癌肿较局限，尚无远处转移而又不适于手术切除或手术后复发者，可采用放射为主的综合治疗。

4.生物治疗：常用的有免疫核糖核酸、干扰素、白细胞介素-2、胸腺肽等，可与化疗联合应用。

5.中医中药治疗：采取辨证施治、攻补兼施的方法，常与其他疗法配合应用。以提高 机体抗病力，改善全身状况和症状，减轻化疗、放疗不良反应。

而现有的细胞免疫治疗成为目前最具有前景的肿瘤治疗方式之一，通过体外扩增或改 造后回输到病人体内达到杀伤肿瘤细胞的目的或者通过活化机体免疫系统，增强肿瘤患者 自身免疫功能从而抵抗肿瘤或其他疾病。

γδT细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，它的杀伤性较强，但肿瘤干细胞杀伤不如NK细胞。因此，它主要用于杀伤癌细胞与协助DC细 胞识别发现癌细胞抗原，然后将这些抗原进行杀伤或是传递给其他细胞。

γδT细胞作用还体现在：①γδT细胞能够与多种免疫细胞发生作用，参加抗肿瘤免疫应答。②γδT细胞能够在肿瘤发生的早期阶段迅速引起有效的抗肿瘤免疫应答。③ γδT细胞在抗肿瘤免疫过程中具有重要的保护作用。④γδT能够利用细胞毒效应杀伤 肿瘤细胞，防止肿瘤的发生发展。⑤γδT细胞能够分泌相关因子，这些因子能够放大肿 瘤信号。⑥γδT细胞能分泌穿孔素，诱导肿瘤细胞凋亡。

由于γδT细胞在外周血中的含量极低，大大限制了γδT细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。目前从外周血单个核细胞扩增γδT细胞，扩增倍数低，细胞纯度及细胞 量不高。扩增出的γδT细胞很难满足临床需求，即使通过优化各种诱导条件及扩增方法 扩增出的单一γδT细胞在相应的免疫性疾病和肿瘤疾病上有所应用，但是应用后并未达 到人们理想中的效果。

NK细胞占人外周血淋巴细胞的5-15％。NK细胞在抗病毒感染和抗肿瘤的早期免疫反应 中发挥着重要的免疫监视功能，NK细胞不需要识别肿瘤特异性抗原，便可直接、快速的发 挥细胞毒活性。特别重要的是NK细胞能够有效地清除机体内的肿瘤干细胞样细胞，抑制 肿瘤的生长和转移。

PD-1是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员，以PD-1为靶点的免疫调节在 抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等方面具有重要意义。

在现有的技术研究中FDA已经批准PD-1/PD-L1抗体用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺 癌、肾细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、头颈癌、膀胱癌、默克尔细胞癌以及携带微卫星不稳定性高(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)的实体瘤。且在一些实体瘤中体现出有效的 作用。

在现有的研究中，大多采用单一的免疫细胞或杀伤性细胞进行细胞治疗或者在临床治 疗中采用联合治疗的方式，在现有技术中，采用联合治疗需要花费更高的费用，为病患带 来更多经济压力。

因此，发明一种细胞组合物，组合物具体包括γδT细胞和NK细胞共培养细胞系及PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体，使用该组合物在癌细胞SMMC-7721上的应用，为肝 癌患者治疗的带来希望。

发明内容

针对上述所述问题，本发明提出了一种细胞组合物，组合物具体包括γδT细胞和NK 细胞共培养细胞系及PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体，使用该组合物在癌细胞SMMC-7721上的应用。且组合物中的γδT细胞和NK细胞通过共培养方式获得，先通过刺 激诱导单个核细胞扩增为γδT细胞和NK细胞，后通过活化扩增培养，扩增出具有数量大、 扩增倍数高、细胞毒性强等特点的γδT细胞和NK细胞复合细胞物，扩增培养后的γδT-NK 细胞同PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体复合形成一种细胞组合物，其具有非常好的临 床应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

所述细胞组合物包括：γδT细胞、NK细胞及其PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体。

所述细胞组合物的制备方法包括以下步骤：

(1)γδT细胞和NK细胞的复合细胞物的获得；

(2)步骤1中的复合细胞物与PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体混合获得细胞组合物。

其中细胞组合物中γδT细胞：NK细胞比例为0.5-20：10。

其中细胞组合物中PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体含量为10-1000μg/ml细胞组合 物。

其中上述γδT细胞和NK细胞的复合细胞物的获得方法如下：

(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；

(2)γδT-NK细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500～3000U/mL IL-2 的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mL anti-human CD3Ab、10～500ng/mLanti-human CD28Ab、10～200ng/mL IL-15、10～200ng/mL IL-21、500～3000U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(3)培养2～3天，在培养瓶或培养袋中增补2mL无血清混合培养基和IL2细胞因子使 得最终浓度与原始浓度相同，然后培养箱中培养4天；

(4)培养4天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将培养瓶或培养袋中的细胞分别转至T25细胞培养瓶中，再然后，更换5mL EX培养基进行扩增培养， 依次加入无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21；

(5)培养3-4天后，在T25细胞培养瓶中增补5mL无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21、1-100μM的唑来膦酸，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为20mL；

(6)培养3-5天后，检测NK及γδT细胞比例及细胞总数。

优选的，唑来膦酸浓度为5μM、anti-human CD3Ab浓度为50ng/mL、anti-humanCD28Ab 浓度为50ng/mL、IL-15浓度为50ng/mL、IL-21浓度为50ng/mL、IL-2浓度为1000U/mL。

在一个实施方案中也可以使用其他磷酸抗原代替唑来膦酸，包括异戊烯焦磷酸酯(IPP),(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸酯(HMB-PP),焦磷酸乙酯(EPP)，焦磷酸法呢酯(FPP),二甲基烯丙基磷酸酯(DMAP),二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP),乙基-腺苷三磷酸酯(EPPPA)，牦牛儿焦磷酸酯(GPP),牦牛儿牦牛儿焦磷酸酯(GGPP),异戊烯-腺苷焦磷酸酯(IPPPA),磷酸一乙酯(MEP),焦磷酸一乙酯(MEPP)等含有氮的双磷酸酯。

优选的，在一个实施案例中混合培养基中含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640的比 例为50vt％，X-vivo15培养基的比例为50vt％。

上述所述单个核细胞是通过肝素抗凝无菌一次性采血管静脉穿刺采集外周血后，通过 Ficoll密度梯度离心获得或者通过单采机采集的单个核细胞；或者来自于脐带血、骨髓和 iPSCs诱导分化得到的单个核细胞。

所述细胞因子组合中所用白介素-15的浓度优选为120-350ng/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-21的浓度优选为100-380ng/ml。

所述细胞因子组合中所用白介素-2的浓度优选为1000-1800U/ml。

复合细胞物与PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体在无菌条件下混合，将抗体加入复 合细胞物中，并通过常规方法混匀细胞组合物。

上述细胞组合物在抗肿瘤治疗上的应用。

本发明所用原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

由于采用上述的技术方案，本发明的有益效果是：(1)共培养诱导扩增的γδT-NK细 胞同PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体混合后的细胞组合物对SMMC-7721杀伤作用强。(2)本发明提供了一种细胞组合物及其该细胞组合物的制备方法和应用；制备方法操作简 单，在其制备过程中可大量诱导扩增出γδT细胞和NK细胞复合细胞物；(3)共同诱导培养条件下细胞可相互促进刺激生长和扩增，且共培养出的γδT-NK细胞毒性/活性强；(4)一次性共培养出两种具有类似性质的抗肿瘤免疫细胞，提高细胞培养效率，相较于独立培养各种免疫细胞而言可大幅度降低培养成本，也降低了培养技术难度，简化了在临床治疗过程。

附图说明：

图1为扩增培养γδT-NK细胞总生长曲线、γδT细胞生长曲线、NK细胞生长曲线。

图2为扩增培养γδT-NK细胞、γδT细胞、NK细胞在第6天、第12天和第18天的 扩增倍数。

图3为γδT细胞、NK细胞、γδT-NK细胞、PD-1抗体、细胞组合物(PD-1抗体)对SMMC-7721细胞的杀伤活性检测。

图4为γδT细胞、NK细胞、γδT-NK细胞、PD-L1抗体、细胞组合物(PD-L1抗体) 对SMMC-7721细胞的杀伤活性检测。

图5为γδT细胞、NK细胞、γδT-NK细胞、PD-1/PD-L1特异性双抗、细胞组合物 (PD-1/PD-L1特异性双抗)对SMMC-7721细胞的杀伤活性检测。

图6为细胞组合物对人肝癌癌细胞SMMC-7721移植瘤的抑制作用。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。应理 解，所描述的实施例是本发明一部分实施例，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制 本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本 发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合 具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1γδT-NK细胞的获得

γδT-NK细胞的获得从外周血中分离单个核细胞(PBMCs)并扩增γδT-NK细胞：

(1)使用前30分钟开启生物安全柜；

(2)使用前从冰箱中取出D-PBS，室温放置30分钟；

(3)将30ml外周血液样品(肝素抗凝)转移到两个无菌50ml离心管，每管15ml，然后向每管加入22.5ml无菌D-PBS，反复颠倒离心管，充分混匀；

(4)另取两个50ml无菌离心管，分别加入15ml Ficoll-Paque Plus溶液，然后分别缓慢的加入24ml步骤3中稀释后的血液(由步骤3中两个无菌管中吸取)，形成分层，20℃，400×g,离心30分钟；

(5)将步骤4中的两个50ml离心管放入生物安全柜，然后使用10ml吸管吸掉15ml血清层，装入一个新的无菌50ml离心管中，56℃灭活30分钟待用(用于配制混合培养基)；

(6)吸取每一个50ml离心管中的白细胞层(PBMCs)，转入一个新的50ml无菌离心管；

(7)向步骤6装有PBMCs细胞悬液的离心管中加入其3倍体积的无菌PBS，并用无菌移 液管混匀，20℃，400×g，离心10分钟；

(8)弃上清，加入50ml无菌PBS，缓慢重悬PBMC；

(9)20℃，400×g，离心10分钟；

(10)加入5ml 50vt％含步骤5自体血清的RMPI1640+50vt％X-vivo15的混合培养基， 混匀，取10μl用于计数；

(11)由步骤10中取一半量的外周血单个核细胞(PBMCs),加入一定体积含有50μM的 唑来膦酸和1000U/mL IL-2的混合培养基调整细胞浓度至1×10⁶cells/ml，使用T-175培 养瓶培养细胞；

(12)混合培养基体外刺激4天后加入含有200ng/mL anti-human CD3Ab、150ng/mLanti-human CD28Ab、100ng/mL IL-15、100ng/mL IL-21、500U/mL IL-2的混合培养基进 行半量换液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(13)培养2天，在培养瓶中增补2mL无血清混合培养基和IL2细胞因子使得最终浓度 与原始浓度相同，然后培养箱中培养4天；

(14)培养3-4天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将培养瓶中的细胞分别转至T25细胞培养瓶中，再然后，更换5mLEX培养基进行扩增培养，依次加 入无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21，使得IL2细胞因子、IL-15、IL-21 最终浓度与原始浓度相同；

(15)培养3-4天后，在T25细胞培养瓶中增补5mL无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21、50μM的唑来膦酸，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为20mL；

(16)培养3-5天后，检测NK及γδT细胞比例及细胞总数。

在培养第0、4、6、9、12、16、18天统计细胞数细胞数，制作细胞生长曲线，如图1 所示，接种3000万细胞，扩增18天，细胞总数可达约420亿，完全满足临床应用需要。 统计第0天、第6天、第12天和第18天，计算γδT细胞、NK细胞、γδT-NK细胞扩 增倍数，如图2所示。

实施例2细胞组合物对SMMC-7721细胞的杀伤活性

使用5μM的CFSE对SMMC-7721细胞染色，将NK细胞、γδT细胞、γδT-NK细胞 复合物、细胞组合物(200μg/mlPD-1)与SMMC-7721细胞按照20:1的比例，以及PD-1、PBS 组与SMMC-7721细胞按照200μg/ml细胞液进行试验，37℃孵育4h和8h后，加入1μg/ml 的PI染料，CFSE+PI双阳性的细胞为死亡细胞，如图3所示，细胞组合物能显著地增强对 癌细胞的杀伤活性，在几乎100％的杀伤SMMC-7721细胞。

实施例3细胞组合物对SMMC-7721细胞的杀伤活性

使用5μM的CFSE对SMMC-7721细胞染色，将NK细胞、γδT细胞、γδT-NK细胞 复合物、细胞组合物(200μg/mlPD-L1)与SMMC-7721细胞按照20:1的比例，以及PD-L1、 PBS组与SMMC-7721细胞按照200μg/ml细胞液进行试验，37℃孵育4h和8h后，加入1 μg/ml的PI染料，CFSE+PI双阳性的细胞为死亡细胞，如图4所示，细胞组合物能显著 地增强对癌细胞的杀伤活性，几乎100％的杀伤SMMC-7721细胞。

实施例4细胞组合物对SMMC-7721细胞的杀伤活性

使用5μM的CFSE对SMMC-7721细胞染色，将NK细胞、γδT细胞、γδT-NK细胞复合物、细胞组合物(200μg/mlPD-1/PD-L1)与SMMC-7721细胞按照20:1的比例，以及PD-1/PD-L1、PBS组与SMMC-7721细胞按照200μg/ml细胞液进行试验，37℃孵育4h和8h后，加入1μg/ml 的PI染料，CFSE+PI双阳性的细胞为死亡细胞，如图5所示，细胞组合物能显著地增强对癌 细胞的杀伤活性，几乎100％的杀伤SMMC-7721细胞。

实施例5细胞组合物显著抑制人肝癌癌细胞SMMC-7721移植瘤的生长

将5×10⁶个SMMC-7721细胞接种在BALB/c nude小鼠有后肢上，待肿瘤长到100mm³时，将小鼠分为四组，分别通过尾静脉注射PBS、NK细胞、γδT细胞、γδT-NK细胞复合 物、细胞组合物(200μg/mlPD-1/PD-L1)，每周注射一次，共注射四次，观测肿瘤生长情况， 如图6所示，细胞组合物能显著增强对SMMC-7721细胞移植瘤的生长的抑制作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员 应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明 的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化 和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等 效物界定。

Claims (6)

1.一种细胞组合物，其特征在于：包括免疫细胞和抗体。

2.根据权利要求1所述细胞组合物，其特征在于：免疫细胞为γδT细胞和NK细胞共培养细胞系，抗体为PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体。

3.根据权利要求2所述细胞组合物，其特征在于：细胞组合物的制备方法如下：

(1)γδT细胞和NK细胞的复合细胞物的获得；

(2)步骤1中的复合细胞物与抗体混合获得细胞组合物。

4.根据权利要求2所述细胞组合物，其特征在于：细胞组合物中γδT细胞：NK细胞比例为0.5-20：10；细胞组合物中PD-1/PD-L1单抗和/或双特异性抗体含量为10-1000μg/ml细胞组合物。

5.一种细胞组合物的应用，其特征在于：细胞组合物应用于癌细胞SMMC-7721以及肝癌上，

所述组合物为权利要求1或权利要求2所述的细胞组合物中的一种。

6.根据权利要求3所述细胞组合物，其特征在于：γδT细胞和NK细胞的复合细胞物的获得方法如下：

(1)单个核细胞的制备：分离单个核细胞，用含体积百分比50％-100％的含10vt％FBS或自体血清的RMPI 1640和0％-50％X-vivo15的混合培养基重悬细胞，接种在培养瓶或培养袋中培养；

(2)γδT-NK细胞的诱导：加入含浓度为1-100μM的唑来膦酸和500～3000U/mL IL-2的混合培养基体外刺激4天后加入含有10～500ng/mL anti-human CD3Ab、10～500ng/mLanti-human CD28Ab、10～200ng/mL IL-15、10～200ng/mL IL-21、500～3000U/mL IL-2的混合培养基进行半量换液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(3)培养2～3天，在培养瓶或培养袋中增补2mL无血清混合培养基和IL2细胞因子使得最终浓度与原始浓度相同，然后培养箱中培养4天；

(4)培养4天后，对细胞进行500g速度离心，离心5min后弃上清，然后将培养瓶或培养袋中的细胞分别转至T25细胞培养瓶中，再然后，更换5mL EX培养基进行扩增培养，依次加入无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21；

(5)培养3-4天后，在T25细胞培养瓶中增补5mL无血清EX培养基、IL2细胞因子、IL-15、IL-21、1-100μM的唑来膦酸，使得最终浓度与原始浓度一致，总体积为20mL；

(6)培养3-5天后，检测NK及γδT细胞比例及细胞总数。