CN116490607A - 肿瘤浸润淋巴细胞培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种用于扩增TIL细胞的培养组合物，包含IL‑2、IL‑7、IL‑15和免疫检查点抗体或其抗原结合片段，所述免疫检查点抗体包括选自PD‑1抗体、CTLA‑4抗体、LAG‑3抗体、TIM‑3抗体、TIGIT抗体和BTLA抗体中的任一种或多种；还涉及一种TIL细胞扩增培养基、制备TIL细胞群的方法和一种药物组合物。所述培养组合物大幅下调IL‑2的用量的同时保证细胞增殖和活力，在回输患者后去除IL‑2治疗以减少副作用；并且在扩增过程中不使用饲养细胞，减少外源污染和简化生产工艺，降低生产成本，缩短生产时间。
Description
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞培养基及其应用。
肿瘤免疫治疗领域的进展使这种治疗进入了现代癌症治疗的主流。近年来，已开发出多种激发并提升抗肿瘤免疫的策略并在不同临床研究中进行了评估。针对恶性肿瘤的免疫治疗近年已取得令人瞩目的临床疗效，主要包括有免疫检查点(如CTLA4、PD1/PDL1)单抗治疗、嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗，TCR-T治疗等。其中CAR-T细胞治疗在血液肿瘤免疫上取得了非常显著的疗效，但是在实体瘤免疫治疗上，CAR-T、TCR-T和/或免疫检查点抑制剂疗法都在不同程度上面临着瓶颈。
1998年美国国立癌症研究所(NCI)外科分部(Surgery Branch)报道了首例肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)用于治疗病人的案例。针对TIL的广泛研究表明从黑色素瘤的病人的肿瘤组织内能够分离获得具有抗肿瘤活性的细胞。近些年发现，对过继性转移治疗(ACT)来说体积大、难以治愈的肿瘤尤其是实体肿瘤而言，TIL具有非常显著地疗效。美国Iovance Therapeutics公司目前已有多项TIL细胞药物进入到临床II期或关键性(pivotal)III期阶段，其适应症包括黑色素瘤、宫颈癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌和肉瘤。其中LN145在2019年从FDA获得适应症为宫颈癌指征的快速通道(fast track designation)并被认定为治疗化疗期间或之后进展的晚期宫颈癌突破性疗法。
TIL用于肿瘤免疫治疗需要较大量的细胞，这对于TIL细胞扩增在技术上和工艺的控制上提出了较大的挑战。过去的通常做法是采用基于IL-2的初步扩增(pre-Rapid Expansion Procedure，pre-REP)后随后进行“快速扩增过程”(REP)。REP能够在14天时间内进一步将TIL细胞扩增1000倍，该过程需 要大量过量的经过辐射的来源于多个供体的同种异体PBMC(也称为单个核细胞，MNC)作为饲养细胞(feeder cell)以及抗CD3抗体(OKT3)和高剂量IL-2。经过REP过程的TIL在黑色素瘤患者免疫抑制治疗后能够成功地对之实现免疫过继性治疗(ACT)。WO2018182817A1和WO2019190579A1公开了一种TIL的生产方法，在前述TIL扩增培养方法的基础上提供了一种改进的、适合商业大规模生产并符合药品法规规定的TIL培养方法，能够生产获得1011数量级的TIL，并缩短了培养的时长。但在该培养方法仍然需要多供体来源的同种异体辐射的PBMC细胞作为饲养细胞。饲养细胞的使用仍然存在着潜在的污染风险，并且生产级别饲养细胞的制备也增加了整个TIL制备过程的复杂程度。并且该方法中仍然使用了较高浓度的IL-2(6000IU/mL、3000IU/mL)，在后续的回输中可能存在细胞耗竭的风险。
因此，本领域亟需更安全高效的TIL细胞体外扩增体系。
发明内容
本发明针对现有技术现状，通过优化培养基组分，开发了更安全高效的TIL细胞体外扩增体系，提高了临床使用范围。
本发明一方面提供一种用于扩增TIL细胞的培养组合物，包含IL-2、IL-7、IL-15和免疫检查点抗体或其抗原结合片段，优选地，所述免疫检查点抗体包括PD-1抗体。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物还包括IL-21、IL-12、GM-CSF、和提升记忆T细胞比例的小分子中的任一种、两种、三种或四种。优选地，所述培养组合物还包括IL-21和IL-12，或IL-21、IL-12和GM-CSF，或GM-CSF和提升记忆T细胞比例的小分子。优选地，所述提升记忆T细胞比例的小分子是TWS119。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抗体包括选自PD-1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、TIM3抗体、TIGIT抗体和BTLA抗体中的任一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物还包括选自CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、OX40抗体、GITR抗体、ICOS抗体、CD206抗体 和CD40抗体中的任一种或多种。优选地，所述培养组合物还包括选自CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、GITR抗体中的任一种、两种、三种或四种。例如，所述培养组合物还包括(1)CD3抗体和CD28抗体，或(2)CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体和GITR抗体。
在一个或多个实施方案中，所述CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、OX40抗体、GITR抗体、ICOS抗体、CD206抗体和CD40抗体为激活型抗体。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物还包括自体血小板或异体血小板。
在一个或多个实施方案中，所述各抗体是单克隆抗体(mAb)。
在一个或多个实施方案中，所述一种或多种抗体与基质偶联。在一个或多个实施方案中，所述基质是固体基质，例如微球、孔板、平皿、细胞培养瓶或细胞培养袋。优选地，所述微球是磁珠。优选地，所述偶联和通过共价键或非共价键偶联。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、IL-21、IL-12、CD3抗体、CD28抗体和GM-CSF。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、IL-21、IL-12、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体和GITR抗体。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、CD3抗体和CD28抗体。优选地，所述CD3抗体和CD28抗体与基质偶联。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、IL-21、IL-12、CD3抗体、CD28抗体和GM-CSF。优选地，所述CD3抗体和CD28抗体与基质偶联。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、CD3抗体、CD28抗体和CD137抗体。优选地，所述CD3抗体、CD137抗体和CD28抗体与基质偶联。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、GITR抗体、CD3抗体、CD28抗体、TWS119和CD137抗体。优选地，所述CD3抗体、CD137抗体和CD28抗体与基质偶联。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、 PD-1抗体、TIGIT抗体、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体和GM-CSF。优选地，所述CD3抗体、CD137抗体和CD28抗体与基质偶联。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、LAG3抗体、IL-21、IL-12、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体和GITR抗体。优选地，所述CD3抗体、CD137抗体和CD28抗体与基质偶联。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、TIGIT抗体、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、CD40抗体、OX-40抗体和自体血小板。优选地，所述CD3抗体、CD137抗体和CD28抗体与基质偶联。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、CTLA-4抗体、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、GITR抗体、GM-CSF、TWS119和异体血小板。优选地，所述CD3抗体和CD28抗体与基质偶联。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中IL-2的浓度为200-6000IU/mL，例如200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000IU/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中IL-2的浓度为200-950、200-850、200-750、200-650、200-550、200-500IU/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中IL-7的浓度为5-100ng/mL，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中IL-7的浓度为5-65、5-55、5-45、5-35、5-25、5-15ng/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中IL-15的浓度为5-100ng/mL，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中IL-15的浓度为5-65、5-55、5-45、5-35、5-25、5-15、10-50ng/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中PD-1抗体的浓度为1-100μg/mL，例如1、2、3、5、7、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中PD-1 抗体的浓度为1-65、1-55、1-45、1-35、1-25、1-15、1-8、1-6、1-4、1-3μg/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中IL-21的浓度为5-100ng/mL，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中IL-21的浓度为5-65、5-55、5-45、5-35、5-25、5-15ng/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中IL-12的浓度为5-100ng/mL，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中IL-12的浓度为5-65、10-55、10-45、10-35、10-25、15-25、10-15ng/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中CD3抗体的浓度为0.5-10μg/mL，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中CD3抗体的浓度为0.5-9.5、0.5-8.5、0.5-7.5、0.5-6.5、0.5-5.5、0.5-3、1.5-4.5、2.5-3.5μg/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中CD28抗体的浓度为0.5-10μg/mL，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中CD28抗体的浓度为0.5-9.5、0.5-8.5、0.5-7.5、0.5-6.5、0.5-5.5、0.5-1、1.5-4.5、2.5-3.5μg/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中CD137抗体的浓度为1-100μg/mL，例如1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中CD137抗体的浓度为1-95、1-85、1-75、1-65、1-55、1-45、1-35、1-25、1-15、1-9、1.5-8、2-7、2.5-6、2.5-5、3-5μg/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中GITR抗体的浓度为1-100μg/mL，例如1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中GITR抗体的浓度为1-95、1-85、1-75、1-65、1-55、1-45、1-35、1-25、1-15、1-9、1.5-8、2-7、2.5-6、3-5、2-3μg/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中GM-CSF的浓度为200- 5000U/mL，例如200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000U/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中GM-CSF的浓度为200-1500、200-1200、200-950、200-850、200-750、200-650、200-550、200-500U/mL。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中TWS119的浓度为1-500μM，例如1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500μM，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中TWS119的浓度为1-250、2-150、3-95、4-85、5-75、6-65、7-55、8-45、9-35、10-25、10-15μM。
在一个或多个上述实施方案中，培养组合物中自体血小板或异体血小板的浓度为0.5×10
8/mL-1.0×10
9/mL，例如0.5×10
8、1.0×10
8、1.5×10
8、2.0×10
8、2.5×10
8、3.0×10
8、3.5×10
8、4.0×10
8、4.5×10
8、5.0×10
8、5.5×10
8、6.0×10
8、6.5×10
8、7.0×10
8、7.5×10
8、8.0×10
8、8.5×10
8、9.0×10
8、9.5×10
8、1.0×10
9/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，培养组合物中自体血小板或异体血小板的浓度为0.5×10
8-9.5×10
8、0.5×10
8-7.5×10
8、0.5×10
8-5.5×10
8、1.0×10
8-5.5×10
8、1.0×10
8-5.0×10
8、1.0×10
8-4.5×10
8、1.0×10
8-4.0×10
8、1.0×10
8-3.5×10
8、1.5×10
8-3.0×10
8、1.5×10
8-2.5×10
8/mL。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:3-100μg/mL的PD-1抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、和3-100μg/mL的PD-1抗体，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:3-50μg/mL的PD-1抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、和3-50μg/mL的PD-1抗体，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2: 10ng/mL的IL-7:10ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、和3μg/mL的PD-1抗体，或这些组分的等比浓缩物。
在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、和1-100μg/mL的PD-1抗体，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:3-50μg/mL的PD-1抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、和3-50μg/mL的PD-1抗体，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:5ng/mL的IL-7:10ng/mL的IL-15:1μg/mL的PD-1抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、5ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、和1μg/mL的PD-1抗体，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:3-100μg/mL的PD-1抗体:5-100ng/mL的IL-21:5-100ng/mL的IL-12:1-10μg/mL的CD3抗体:1-10μg/mL的CD28抗体:200-5000U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、1-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体和200-5000U/mL的GM-CSF，或所述组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:3-50μg/mL的PD-1抗体:5-50ng/mL的IL-21:5-50ng/mL的IL-12:1-5μg/mL的CD3抗体:1-5μg/mL的 CD28抗体:200-1000U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、3-50μg/mL的PD-1抗体、5-50ng/mL的IL-21、5-50ng/mL的IL-12、1-5μg/mL的CD3抗体、1-5μg/mL的CD28抗体和200-1000U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200IU/mL的IL-2:10ng/mL的IL-7:10ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:10ng/mL的IL-21:20ng/mL的IL-12:3μg/mL的CD3抗体:3μg/mL的CD28抗体:500U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、10ng/mL的IL-21、20ng/mL的IL-12、3μg/mL的CD3抗体、3μg/mL的CD28抗体和500U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:3-100μg/mL的PD-1抗体:5-100ng/mL的IL-21:5-100ng/mL的IL-12:1-10μg/mL的CD3抗体:0.5-10μg/mL的CD28抗体:200-5000U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、1-10μg/mL的CD3抗体、0.5-10μg/mL的CD28抗体和200-5000U/mL的GM-CSF，或所述组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:3-50μg/mL的PD-1抗体:5-50ng/mL的IL-21:5-50ng/mL的IL-12:1-5μg/mL的CD3抗体:0.5-5μg/mL的CD28抗体:200-1000U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、3-50μg/mL的PD-1抗体、5-50ng/mL的IL-21、5-50ng/mL的IL-12、1-5μg/mL的CD3抗体、0.5-5μg/mL的CD28抗体和200-1000U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200IU/mL的IL-2:50ng/mL的IL-7:50ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:10ng/mL的IL-21:10ng/mL的IL-12:3μg/mL的CD3抗体:0.5μg/mL的CD28抗体:500U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200IU/mL的IL-2、50ng/mL的IL-7、50ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、10ng/mL的IL-21、10ng/mL的IL-12、3μg/mL的CD3抗体、0.5μg/mL的CD28抗体和500U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:3-100μg/mL的PD-1抗体:5-100ng/mL的IL-21:5-100ng/mL的IL-12:1-10μg/mL的CD3抗体:1-10μg/mL的CD28抗体:1-100μg/mL的CD137抗体:1-100μg/mL的GITR抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、1-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:3-50μg/mL的PD-1抗体:5-50ng/mL的IL-21:5-50ng/mL的IL-12:1-5μg/mL的CD3抗体:1-5μg/mL的CD28抗体:1-5μg/mL的CD137抗体:1-5μg/mL的GITR抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、3-50μg/mL的PD-1抗体、5-50ng/mL的IL-21、5-50ng/mL的IL-12、1-5μg/mL的CD3抗体、1-5μg/mL的CD28抗体、1-5μg/mL的CD137抗体和1-5μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：400IU/mL的IL-2:10ng/mL的IL-7:10ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:10ng/mL的IL-21:20ng/mL的IL-12:3μg/mL的CD3抗体:3μg/mL的CD28抗体:3μg/mL的CD137抗体:3μg/mL的GITR抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：400IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、 3μg/mL的PD-1抗体、10ng/mL的IL-21、20ng/mL的IL-12、3μg/mL的CD3抗体、3μg/mL的CD28抗体、3μg/mL的CD137抗体和3μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:5-100ng/mL的IL-21:5-100ng/mL的IL-12:0.5-10μg/mL的CD3抗体:1-10μg/mL的CD28抗体:1-100μg/mL的CD137抗体:1-100μg/mL的GITR抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、0.5-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:5-50ng/mL的IL-21:5-50ng/mL的IL-12:0.5-5μg/mL的CD3抗体:1-5μg/mL的CD28抗体:1-5μg/mL的CD137抗体:1-5μg/mL的GITR抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、5-50ng/mL的IL-21、5-50ng/mL的IL-12、0.5-5μg/mL的CD3抗体、1-5μg/mL的CD28抗体、1-5μg/mL的CD137抗体和1-5μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：400IU/mL的IL-2:30ng/mL的IL-7:30ng/mL的IL-15:1μg/mL的PD-1抗体:10ng/mL的IL-21:15ng/mL的IL-12:0.5μg/mL的CD3抗体:1μg/mL的CD28抗体:2.5μg/mL的CD137抗体:3μg/mL的GITR抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：400IU/mL的IL-2、30ng/mL的IL-7、30ng/mL的IL-15、1μg/mL的PD-1抗体、10ng/mL的IL-21、15ng/mL的IL-12、0.5μg/mL的CD3抗体、1μg/mL的CD28抗体、2.5μg/mL的CD137抗体和3μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分： 200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:3-100μg/mL的PD-1抗体:1-10μg/mL的CD3抗体:1-10μg/mL的CD28抗体:1-100μg/mL的CD137抗体:1-100μg/mL的GITR抗体:200-5000U/mL的GM-CSF:1-500μM的TWS119。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、1-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体、1-100μg/mL的GITR抗体、200-5000U/mL的GM-CSF和1-500μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:3-50μg/mL的PD-1抗体:1-5μg/mL的CD3抗体:1-5μg/mL的CD28抗体:1-5μg/mL的CD137抗体:1-5μg/mL的GITR抗体:200-500U/mL的GM-CSF:1-100μM的TWS119。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、3-50μg/mL的PD-1抗体、1-5μg/mL的CD3抗体、1-5μg/mL的CD28抗体、1-5μg/mL的CD137抗体、1-5μg/mL的GITR抗体、200-500U/mL的GM-CSF和1-100μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：300IU/mL的IL-2:10ng/mL的IL-7:10ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:3μg/mL的CD3抗体:3μg/mL的CD28抗体:3μg/mL的CD137抗体:3μg/mL的GITR抗体:200U/mL的GM-CSF:10μM的TWS119。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：300IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、3μg/mL的CD3抗体、3μg/mL的CD28抗体、3μg/mL的CD137抗体、3μg/mL的GITR抗体、200U/mL的GM-CSF和10μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：300IU/mL的IL-2:40ng/mL的IL-7:40ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:1μg/mL的CD3抗体:1μg/mL的CD28抗体:5μg/mL的CD137抗体:2μg/mL的GITR抗体:200U/mL的GM-CSF:10μM的TWS119。在一个或多个实施方案中，所述培 养组合物包含组分：300IU/mL的IL-2、40ng/mL的IL-7、40ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、1μg/mL的CD3抗体、1μg/mL的CD28抗体、5μg/mL的CD137抗体、2μg/mL的GITR抗体、200U/mL的GM-CSF和10μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:200-5000U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:200-1000U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体和200-1000U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:5ng/mL的IL-7:10ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD3抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD28抗体:500U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、5ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、3μg/mL的CD3抗体、0.5μg/mL的CD28抗体和500U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:5-100ng/mL的IL-21:5-100ng/mL的IL-12:0.5- 10μg/mL的CD3抗体:0.5-10μg/mL的CD28抗体:200-5000U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:5-50ng/mL的IL-21:5-50ng/mL的IL-12:0.5-5μg/mL的CD3抗体:0.5-5μg/mL的CD28抗体:200-1000U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、5-50ng/mL的IL-21、5-50ng/mL的IL-12、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体和200-1000U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:5ng/mL的IL-7:10ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:10ng/mL的IL-21:10ng/mL的IL-12:3μg/mL的CD3抗体:0.5μg/mL的CD28抗体:500U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、5ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、10ng/mL的IL-21、10ng/mL的IL-12、3μg/mL的CD3抗体、0.5μg/mL的CD28抗体和500U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体和偶联于基质的CD137抗体，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL- 2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体和偶联于基质的CD137抗体，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:50ng/mL的IL-7:30ng/mL的IL-15:1μg/mL的PD-1抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD3抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD28抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD137抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、50ng/mL的IL-7、30ng/mL的IL-15、1μg/mL的PD-1抗体、偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD3抗体、偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD28抗体和偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD137抗体，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-100μg/mL的GITR抗体：1-500μM的TWS119。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-100μg/mL的GITR抗体和1-500μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-5μg/mL的GITR抗体﹕1-100μM的TWS119。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-5μg/mL的GITR抗体和1- 100μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：300IU/mL的IL-2:10ng/mL的IL-7:25ng/mL的IL-15:2μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:3μg/mL的GITR抗体﹕10μM的TWS119。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：300IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、25ng/mL的IL-15、2μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、3μg/mL的GITR抗体和10μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-100μg/mL的TIGIT抗体﹕200-5000U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-100μg/mL的TIGIT抗体和200-5000U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-5μg/mL的TIGIT抗体﹕200-500U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-5μg/mL的TIGIT抗体和200-500U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:7ng/mL的IL-7:50ng/mL的IL-15:2μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:2.5μg/mL的 TIGIT抗体﹕500U/mL的GM-CSF。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、7ng/mL的IL-7、50ng/mL的IL-15、2μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、2.5μg/mL的TIGIT抗体和500U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的LAG-3抗体:5-100ng/mL的IL-21:5-100ng/mL的IL-12:0.5-10μg/mL的CD3抗体:0.5-10μg/mL的CD28抗体:1-100μg/mL的CD137抗体:1-100μg/mL的GITR抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的LAG-3抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、0.5-10μg/mL的CD3抗体、0.5-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的LAG-3抗体:5-50ng/mL的IL-21:5-50ng/mL的IL-12:0.5-5μg/mL的CD3抗体:0.5-5μg/mL的CD28抗体:1-5μg/mL的CD137抗体:1-5μg/mL的GITR抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的LAG-3抗体、5-50ng/mL的IL-21、5-50ng/mL的IL-12、0.5-5μg/mL的CD3抗体、0.5-5μg/mL的CD28抗体、1-5μg/mL的CD137抗体和1-5μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：400IU/mL的IL-2:30ng/mL的IL-7:30ng/mL的IL-15:3μg/mL的LAG-3抗体:10ng/mL的IL-21:15ng/mL的IL-12:0.5μg/mL的CD3抗体:1μg/mL的CD28抗体:2.5μg/mL的CD137抗体:3μg/mL的GITR抗体。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：400IU/mL的IL-2、30ng/mL的IL-7、30ng/mL的IL-15、3μg/mL的LAG-3抗体、10ng/mL的IL-21、15ng/mL的IL-12、0.5 μg/mL的CD3抗体、1μg/mL的CD28抗体、2.5μg/mL的CD137抗体和3μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-100μg/mL的TIGIT抗体:1-100μg/mL的CD40抗体:1-100μg/mL的OX-40抗体﹕1×10
8-5×10
8/mL的自体血小板。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-100μg/mL的TIGIT抗体、1-100μg/mL的CD40抗体、1-100μg/mL的OX-40抗体和1×10
8-5×10
8/mL的自体血小板，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-50μg/mL的TIGIT抗体:1-50μg/mL的CD40抗体:1-50μg/mL的OX-40抗体：1×10
8-3×10
8/mL的自体血小板。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-50μg/mL的TIGIT抗体、1-50μg/mL的CD40抗体、1-50μg/mL的OX-40抗体和1×10
8-3×10
8/mL的自体血小板，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:5ng/mL的IL-7:25ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD3抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD28抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD137抗体:2.5μg/mL的TIGIT抗体:2μg/mL的CD40抗体:3μg/mL的OX-40抗体：3×10
8/mL的自体血小板。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、5ng/mL的IL-7、25ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的 CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、2.5μg/mL的TIGIT抗体、2μg/mL的CD40抗体、3μg/mL的OX-40抗体和3×10
8/mL的自体血小板，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:1-100μg/mL的CTLA-4抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:1-100μg/mL的CD137抗体:1-100μg/mL的GITR抗体：200-5000U/mL的GM-CSF﹕1×10
8-5×10
8/mL的异体血小板。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、1-100μg/mL的CTLA-4抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体、1-100μg/mL的GITR抗体、200-5000U/mL的GM-CSF和1×10
8-5×10
8/mL的异体血小板，或这些组分的等比浓缩物。
优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:1-50μg/mL的CTLA-4抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:1-50μg/mL的CD137抗体:1-50μg/mL的GITR抗体：200-500U/mL的GM-CSF﹕1×10
8-3×10
8/mL的异体血小板。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、1-50μg/mL的CTLA-4抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、1-50μg/mL的CD137抗体、1-50μg/mL的GITR抗体、200-500U/mL的GM-CSF和1×10
8-3×10
8/mL的异体血小板，或这些组分的等比浓缩物。
更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：300IU/mL的IL-2:10ng/mL的IL-7:30ng/mL的IL-15:1μg/mL的PD-1抗体:2μg/mL的CTLA-4抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:5μg/mL的CD137抗体:2μg/mL的GITR抗体：200U/mL的GM-CSF﹕1×10
8/mL的异体血小板。在一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含组分：300IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、30ng/mL的IL-15、1μg/mL的PD-1抗体、2 μg/mL的CTLA-4抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、5μg/mL的CD137抗体、2μg/mL的GITR抗体、200U/mL的GM-CSF和1×10
8/mL的异体血小板，或这些组分的等比浓缩物。
本发明还提供一种TIL细胞扩增培养基，包含本文所述的扩增TIL细胞的培养组合物、血清和/或血小板，以及基础培养基。
在一个或多个实施方案中，基础培养基选自AIM-V、X-VIVO、DMEM、RPMI1640、OpTmizer
TM、FUJIFILM Irvin MHM-C。
在一个或多个实施方案中，血清选自人AB血清、对象自体血清或动物源血清。
在一个或多个实施方案中，血清的浓度为1-10％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，或上述数值的任意两个之间的范围。优选地，血清的浓度为1.5-9.5％、2.5-8.5％、3.5-7.5％、4.5-6.5％。
在一个或多个实施方案中，所述血小板的密度为0.5×10
8/mL-3×10
8/mL，例如0.5×10
8/mL、1×10
8/mL、1.5×10
8/mL、2×10
8/mL、2.5×10
8/mL、3×10
8/mL。
在一个或多个实施方案中，血小板为对象自体血液来源的血小板或异体血液来源的血小板。
在一个或多个实施方案中，所述培养基还包括抗生素。优选地，所述抗生素选自青霉素和链霉素中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，培养基中青霉素的浓度为10-1000IU/mL，20-800IU/mL，50-100IU/mL。
在一个或多个实施方案中，培养基中青霉素的浓度为10-1000IU/mL，20-800IU/mL，50-100IU/mL。
本发明还提供一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的种子细胞培养基，其包括以下的组分：细胞培养成分、细胞因子和免疫检查点抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞因子包括IL-2，所述免疫检查点包括：PD-1、LAG-3、TIGIT和/或CTLA-4，所述细胞培养成分为血清培养基或无血清培养基。
在一个或多个实施方案中，所述IL-2的浓度为约3000IU/mL以下。
在一个或多个实施方案中，所述IL-2的浓度为约2000IU/mL-约3000IU/mL。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子包括IL-7。
在一个或多个实施方案中，所述IL-7的浓度为约200-约1000U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子包括IL-15。
在一个或多个实施方案中，所述IL-15的浓度为约200-约500U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子包括肿瘤坏死因子TNF。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子包括TNFα。
在一个或多个实施方案中，所述TNFα的浓度为约10-约100pg/mL。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子包括集落刺激因子。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子包括GM-CSF、G-CSF和/或M-CSF。
在一个或多个实施方案中，所述GM-CSF的浓度为约200-约5000U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述G-CSF的浓度为约300U/mL-约1000U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述M-CSF的浓度为约300U/mL-约800U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子包括干扰素。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子包括IFN-γ、IFN-α和/或IFN-β。
在一个或多个实施方案中，所述IFN-γ的浓度为约10-约1000ng/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IFN-γ的浓度为约300-约1000U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IFN-α的浓度为约500U/mL-约1000U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IFN-β的浓度为约200U/mL-约500U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述细胞因子还包括：IL-4、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-9、IL-18、IL-12、IL-21和/或IL-10。
在一个或多个实施方案中，所述IL-4的浓度为约200-约500U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IL-1α的浓度为约200-约500U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IL-1β的浓度为约200-约500U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IL-6的浓度为约200-约500U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IL-9的浓度为约200-约500U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IL-18的浓度为约200-约500U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IL-12的浓度为约200-约1000U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IL-21的浓度为约200-约500U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述IL-10的浓度为约200-约500U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段为人PD-1抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段为所述PD-1抗体或其抗原结合片段的，所述PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约1-约100μg/mL。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段为人LAG-3抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段为LAG-3抗体或其抗原结合片段，所述LAG-3抗体或其抗原结合片段的浓度为约3-约10μg/mL。
在一个或多个实施方案中，所述TIGIT抗体或其抗原结合片段为人TIGIT抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段为TIGIT抗体或其抗原结合片段，所述TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约1-约25μg/mL。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段为人CTLA-4抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段为CTLA-4抗体或其抗原结合片段，所述CTLA-4抗体或其抗原结合片段的浓度为约1-约100μg/mL。
在一个或多个实施方案中，所述的种子细胞培养基还包括共刺激受体抗体或其抗原结合片段，其中所述共刺激受体或其抗原结合片段包括：CD40抗体或其抗原结合片段、OX-40抗体或其抗原结合片段、CD137抗体或其抗原结合片段和/或CD28抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段包括CD137抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述CD137抗体或其抗原结合片段为人CD137抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述CD137抗体或其抗原结合片段的浓度为约1-约100μg/mL。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段包括CD28抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述CD28抗体或其抗原结合片段为人CD28抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述CD28抗体或其抗原结合片段的浓度为约1-约10μg/mL。
在一个或多个实施方案中，所述CD40抗体或其抗原结合片段为人CD40抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述CD40抗体或其抗原结合片段的浓度为约5-约10μg/mL。
在一个或多个实施方案中，所述OX-40抗体或其抗原结合片段为人OX-40抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述OX-40抗体或其抗原结合片段的浓度为约3-约10μg/mL。
在一个或多个实施方案中，所述血清培养基包括血清。
在一个或多个实施方案中，所述血清包括人AB血清。
在一个或多个实施方案中，所述血清的浓度为约1-约10％(v/v)。
在一个或多个实施方案中，所述血清培养基包括AIM-V培养基。
在一个或多个实施方案中，所述无血清培养基包括X-VIVO培养基。
在一个或多个实施方案中，所述细胞培养成分包括抗生素。
在一个或多个实施方案中，所述细胞培养成分包括青霉素-链霉素混合液PS。
在一个或多个实施方案中，所述青霉素-链霉素混合液PS的浓度为约1-约200U/mL。
在一个或多个实施方案中，所述的种子细胞培养基还包括M2型巨噬细胞抑制剂，所述M2型巨噬细胞抑制剂包括RRx001和/或CNI-1493。
在一个或多个实施方案中，所述M2型巨噬细胞抑制剂的浓度为约0.1-约100μM。
在一个或多个实施方案中，所述的种子细胞培养基还包括调控T细胞(Treg)抑制剂，所述调控T细胞抑制剂包括CAL-101、达沙替尼(dasatinib)、伊马替尼(imatinib)和/或帕比司他(Panobinostat)。
在一个或多个实施方案中，所述调控T细胞抑制剂的浓度为约0.1-约100μM。
在一个或多个实施方案中，所述的种子细胞培养基还包括骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)抑制剂，所述骨髓来源的抑制性细胞抑制剂包括AG490、地西他滨(decitabine)、舒尼替尼和/或BBI608。
在一个或多个实施方案中，所述骨髓来源的抑制性细胞抑制剂的浓度为约0.1-约100μg/mL。
在一个或多个实施方案中，所述的种子细胞培养基还包括T细胞激活剂，所述T细胞激活剂包括LYC-55716、GNE-1858和/或亚甲基蓝。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞激活剂的浓度为约1-约10μM。
在一个或多个实施方案中，所述的种子细胞培养基还包括T细胞分化抑制剂，所述T细胞分化抑制剂包括TWS119。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞分化抑制剂的浓度为约1-约10μM。
另一方面，本申请提供了本申请所述的种子细胞培养基培养获得的肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞或其细胞群。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包括本申请所述的肿瘤浸润淋 巴细胞的种子细胞或其细胞群和药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了所述的肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞或其细胞群和本申请所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述癌症选自下组：黑色素瘤、胶质瘤、胃癌、肺癌、胃肠道间质瘤、肠癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜间质肉瘤、盆腔低分化腺癌和胆管癌。
另一方面，本申请提供了一种所述的种子细胞培养基在扩增肿瘤浸润淋巴细胞中的应用。
另一方面，本申请提供了一种培养肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞的方法，其包括以下的步骤：在本申请所述的种子细胞培养基中培养分离的肿瘤浸润淋巴细胞。
另一方面，本申请提供了一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其包括以下的步骤，在本申请所述的种子细胞培养基中培养分离的肿瘤浸润淋巴细胞，获得所述肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞。
在一个或多个实施方案中，所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞来源于选自下组的样本：有需要的受试者的腹水、手术切除原发灶样本、同时性和异时性手术切除转移灶样本、穿刺样本和体液。
在一个或多个实施方案中，所述体液包括血液、组织液、淋巴液和/或体腔积液。
在一个或多个实施方案中，所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞来源于选自下组的肿瘤：黑色素瘤、胶质瘤、胃癌、肺癌、胃肠道间质瘤、肠癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜间质肉瘤、盆腔低分化腺癌和胆管癌。
在一个或多个实施方案中，所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞来自被切割的肿瘤组织，所述被切割的肿瘤组织的直径为约1mm-约10mm。
在一个或多个实施方案中，所述培养的时间为约3-20天。
在一个或多个实施方案中，所述培养的温度为约30-42℃。
本发明还提供本文所述的用于扩增TIL细胞的培养组合物在制备扩增TIL细胞的培养基或含有TIL细胞的药物中的应用。在一个或多个实施方案中， 所述药物用于治疗癌症。
在一个或多个实施方案中，所述癌症选自：胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤。
本发明还提供本文所述的用于扩增TIL细胞的培养基在制备含有TIL细胞的药物中的应用。在一个或多个实施方案中，所述药物用于治疗癌症。
在一个或多个实施方案中，所述癌症选自：胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤。
本发明还提供扩增TIL细胞群的方法，包括用本文所述的培养基孵育TIL细胞群。
在一个或多个实施方案中，所述孵育持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天。
在一个或多个实施方案中，所述孵育持续至多20天、至多15天、至多14天、至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天。
本发明还提供一种制备TIL细胞群的方法，包括：
(1)用TIL种子细胞培养基孵育含肿瘤细胞的组织，获得第一TIL细胞群，
(2)用本文所述的培养基孵育第一TIL细胞群，获得第二TIL细胞群。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤组织获自癌症对象。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤组织经预处理。在一个或多个实施方案中，所述预处理包括碎片化和/或解离肿瘤组织。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤组织通过机械切割的方式形成碎片化的组织块。
在一个或多个实施方案中，所述碎片化的组织块的大小为2×2×2mm
3、3×3×3mm
3、4×4×4mm
3、5×5×5mm
3或6×6×6mm
3。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育持续至多20天、至多15天、至多14天、至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)的孵育持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)的孵育持续至多20天、至多15天、至多14天、至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中所述第一TIL细胞群启始的接种密度为2.0×10
5/cm
2～5.0×10
5/cm
2，优选地，为2.5×10
5/cm
2～4.5×10
5/cm
2，更优选地，为2.5×10
5/cm
2～3.0×10
5/cm
2。
在一个或多个实施方案中，含肿瘤细胞的组织是患有胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤等癌症的对象的肿瘤组织或体液。
在一个或多个实施方案中，所述体液包括血液、胸积液、组织液、淋巴液和/或腹水。
在一个或多个实施方案中，所述TIL种子细胞培养基如前文所述，参考PCT/CN2021/096585记载的内容，其通过引用全文被纳入本申请。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)所述孵育的温度为30-42℃，优选地，为37℃。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)所述孵育的温度为30-42℃，优选地，为37℃。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)和步骤(2)所述孵育的CO
2浓度为5％。
本发明还提供一种制备TIL细胞群的方法，包括：
(1)用TIL种子细胞培养基孵育含肿瘤细胞的组织，获得第一TIL细胞群，
(2)将(1)中所述第一TIL细胞群接触前述培养组合物中的与基质偶联的抗体中的任一种或几种，获得第二TIL细胞群，
(3)将(2)中所述第二TIL细胞群转移至含有前述培养组合物中除与基质偶联的抗体以外的组分中的任一种或多种的培养基中培养，获得第三TIL细胞群。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤组织获自癌症对象。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤组织为通过手术或活检获取的肿瘤组织。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤组织经预处理。在一个或多个实施方案中，所述预处理包括碎片化和/或解离肿瘤组织。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤组织通过机械切割的方式形成碎片化的组织块。
在一个或多个实施方案中，所述碎片化的组织块的大小为2×2×2mm
3、3×3×3mm
3、4×4×4mm
3、5×5×5mm
3或6×6×6mm
3。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的TIL种子细胞培养基为前述TIL种子细胞培养基。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)所述孵育的温度为30-42℃，优选地，为37℃。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)所述孵育的CO
2浓度为5％。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天。
在一个或多个实施方案中，步骤(1)的孵育持续至多20天、至多15天、至多14天、至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至 多8天、至多7天、至多6天、至多5天。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中所述与基质偶联的抗体包括CD3抗体、CD28抗体和CD137抗体中的任一种或几种；优选地，包括CD3抗体和CD28抗体；更优选地，包括CD3抗体、CD28抗体和CD137抗体。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中所述基质为多孔板、细胞培养皿或细胞培养袋。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中所述偶联为共价偶联或非共价偶联。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中所述接触为将步骤(1)所述第一TIL细胞群同与基质偶联的抗体一起孵育；优选地，所述孵育的温度为30-42℃，优选地，为37℃。优选地，所述孵育的CO
2浓度为5％。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中，所述孵育在含有前述培养组合物中除与基质偶联的抗体以外的组分中的任一种或多种的培养基中进行。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中所述接触持续1-3天。优选地，持续2-3天。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中所述第一TIL细胞群的密度为1.0×10
5/mL～1.0×10
6/mL；优选地，为2.0×10
5/mL～1.0×10
6/mL；更优选地，为2.5×10
5/mL～3.5×10
6/mL。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)的培养持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)的培养持续至多20天、至多15天、至多14天、至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)所述培养的温度为30-42℃，优选地，为37℃。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)所述培养的CO
2浓度为5％。
本发明还提供一种TIL细胞群，其由本文任一实施方案所述的方法获得。
本发明还提供由本文任一实施方案所述的方法获得的TIL细胞群在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述癌症选自：胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤。
本发明还提供一种药物组合物，包括前述由本文任一实施方案所述的方法获得的TIL细胞群，以及药学上可接受的辅料。
在一个或多个实施方案中，所述药物组合物包括由本文任一实施方案所述的方法获得的TIL细胞群和羟氯喹。优选地，所述药物组合物还包括化疗药物。更优选地，所述化疗药物为环磷酰胺。
本发明还提供一种细胞冻存制剂，包括前述由本文任一实施方案所述的方法获得的TIL细胞群和冻存液。
在一个或多个实施方案中，所述冻存液为细胞冻存液或组织冻存液。
在一个或多个实施方案中，所述冻存液为无血清冻存液，如BioLife Solutions的CryoStor CS10冻存液。
本发明还提供一种治疗实体肿瘤的方法，包括：
(1)获得实体瘤患者的肿瘤组织，用前述制备TIL细胞群的方法制备得到TIL细胞；
(2)对实体瘤患者进行预处理；
(3)对经过预处理的实体瘤患者用(1)中的TIL细胞进行回输。
在一个或多个实施方案中，所述治疗实体瘤的方法还可以包括：
(4)进行疗效评估。
在一个或多个实施方案中，所述实体瘤包括胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)所述预处理包括对所述实体瘤患者 施用化疗药物和羟氯喹。在一个或多个实施方案中，所述化疗药物为环磷酰胺。
在一个或多个实施方案中，所述环磷酰胺的施用剂量为5-50mg/kg/天。优选地，为20-50mg/kg/天。更优选地，为20-25mg/kg/天。
在一个或多个实施方案中，所述羟氯喹的施用剂量为400mg/天-800mg/天。优选地，为500mg/天-800mg/天。更优选地，为600mg/天-800mg/天。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)所述预处理在TIL细胞回输前第6天-回输前第3天中的任意1天、2天或3天进行。优选地，所述预处理在TIL细胞回输前第5天、第4天和第3天进行。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)所述预处理包括：在TIL细胞回输前第5天对所述实体瘤患者通过口服施用400-800mg羟氯喹和通过静脉注射施用5-50mg/kg环磷酰胺，在回输前第4天和第3天分别对所述实体瘤患者通过静脉注射施用5-50mg/kg环磷酰胺。
在一个或多个实施方案中，所述环磷酰胺通过静脉注射或口服施用。
在一个或多个实施方案中，所述羟氯喹通过静脉注射或口服施用。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中所述(1)中的TIL细胞存在于本文前述细胞冻存制剂中。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中所述自体回输的TIL细胞的数量为1.0×10
10-1.2×10
11个TIL细胞。优选地，为2.0×10
10-8.0×10
10个TIL细胞。更优选地，为2.0×10
10-5.0×10
10个TIL细胞。进一步更优选地，为2.0×10
10-4.0×10
10个TIL细胞。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中所述自体回输的TIL细胞的数量为1.0×10
10个TIL细胞、1.5×10
10个TIL细胞、2.0×10
10个TIL细胞、2.5×10
10个TIL细胞、3.0×10
10个TIL细胞、3.5×10
10个TIL细胞、4.0×10
10个TIL细胞、4.5×10
10个TIL细胞、5.0×10
10个TIL细胞、5.5×10
10个TIL细胞、6.0×10
10个TIL细胞、6.5×10
10个TIL细胞、7.0×10
10个TIL细胞、7.5×10
10个TIL细胞、8.0×10
10个TIL细胞、8.5×10
10个TIL细胞、9.0×10
10个TIL细胞、9.5×10
10个TIL细胞、1.0×10
11个TIL细胞、1.2×10
10个TIL细胞。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中所述回输的TIL细胞的细胞制剂的细胞密度为1.0×10
8/mL～2.0×10
8/mL。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中所述回输的TIL细胞的细胞制剂的体积为200mL-600mL。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中所述自体回输通过静脉注射进行。
在一个或多个实施方案中，步骤(4)中所述疗效评估包括肿瘤影像学评估和肿瘤标志物表达水平评估。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤影像学评估通过CT和/或MRI进行。优选地，所述肿瘤影像学评估标准为RECIST v1.1。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤标志物表达水平通过免疫组化、血液指标检测和/或高通量测序检测进行。
发明优势：
1)本发明使用组分优化的扩增培养基，包括引入IL-2以外更多其他的细胞因子和激活型抗体，在体外培养过程中能够有效地重新激活在肿瘤微环境中受到抑制的TIL细胞；
2)大幅下调IL-2的用量的同时保证细胞增殖和活力，减少潜在的细胞耗竭的风险，同时通过优化的体外培养工艺大幅度降低了所培养的TIL细胞对IL-2的依赖程度；
3)本发明的TIL细胞培养基和TIL细胞培养方法所培养获得的TIL由于对IL-2的依赖程度大幅降低，在临床患者回输前的预处理中能够去除常规治疗方案中所必需的化疗药物氟达拉滨，所用的化疗药物环磷酰胺的用量与目前常规用量相比也大幅降低，并且与常规的TIL回输后大剂量注射IL-2相比，在回输后无需进行IL-2注射即可在人体内高效稳健增殖，且无高等级不良事件，在产生显著和积极的疗效的同时极大降低了临床副作用；同时对于部分体征状况较差的无法耐受高剂量IL-2治疗的晚期实体瘤患者也能够使用本发明培养法制备的TIL细胞进行自体回输治疗，即本发明的TIL细胞培养基和TIL细胞培养方法所制备的TIL细胞能够覆盖更多潜在的实体瘤患者；
4)本发明的TIL细胞在扩增过程中不使用饲养细胞(例如外源同种异体 PBMC或其他细胞)，在减少外源污染的同时大幅度简化了生产工艺，降低了生产成本，缩短生产时间。使用本发明培养基制备TIL细胞可在不使用饲养细胞的情况下快速获得10
10-10
11细胞。
图1：组织样本T001来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图2：组织样本T002来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图3：组织样本T003来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图4：组织样本T004来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图5：组织样本T005来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图6：组织样本T006来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图7：组织样本T007来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图8：组织样本T008来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图9：组织样本T009来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图10：组织样本T010来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图11：组织样本T011来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图12：组织样本T012来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图13：组织样本T013来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图14：组织样本T014来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图15：组织样本T015来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图16：组织样本T016来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图17：组织样本T017来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果图。
图18：T001来源的TIL对靶细胞HGC27的RTCA杀伤效果图。
图19：T002来源的TIL对靶细胞A375的RTCA杀伤效果图。
图20：T003来源的TIL对靶细胞HeLa的RTCA杀伤效果图。
图21：T005来源的TIL对靶细胞HGC27的RTCA杀伤效果图。
图22：T004来源的TIL对靶细胞HGC27的RTCA杀伤效果图。
图23：T006来源的TIL对同源肿瘤类器官的杀伤效果图。
图24：T001来源的TIL对HGC27衍生的CDX肿瘤组织小鼠模型的杀 伤效果。
图25：T002来源的TIL对A375衍生的肿瘤组织CDX小鼠模型的杀伤效果。
图26：T008来源TIL对同源配对的PDX肿瘤组织小鼠模型的杀伤效果图。
图27：T007来源的TIL对同源配对的PDX肿瘤组织小鼠模型的体内肿瘤趋向性效果图。
图28：T009患者在TIL细胞回输治疗后不同时间点的影像学评估结果。
图29：T009患者从回输前到回输后近120天时间段外周血中白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量的变化趋势曲线图。
图30：T009患者从回输前到回输后20天时间段外周血中白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量的变化趋势曲线图。
图31：T009患者外周血中回输的TIL细胞的TCR克隆型频率与淋巴细胞总数随时间变化的叠加趋势。
为了减少TIL细胞培养中的外源污染和简化生产工艺，降低生产成本，缩短生产时间，发明人开发了用于从肿瘤组织中制备TIL细胞的扩增(REP)培养基以及制备或扩增TIL细胞的方法。使用这些培养基处理TIL细胞即使不使用饲养细胞也可快速扩增获得10
10-10
11以上细胞。
术语定义
在本申请中，术语“干扰素”通常是指抑制病毒复制和细胞增殖并调节免疫应答的具有高度种特异性的蛋白家族。典型的合适的干扰素包括但不限于：重组干扰素α-2b，重组干扰素α-2a，重组干扰素α-2C，干扰素α-n1，共有α干扰素，或干扰素α-n3。
在本申请中，术语“集落刺激因子”通常是指一类分泌型的糖蛋白，其与造血干细胞表面上的受体蛋白结合，从而激活细胞内信号传导途径，其可导致细胞增殖并分化成特定类型的血细胞(通常是白细胞，对于红细胞形成，参见促红细胞生成素)。它们可以人工合成并外源性施用。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。抗原中由抗体特异性地识别和结合的部分是称作如上文所述的“表位”。如上文所述，抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其并非必须包含两者。Fd片段例如具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、恒定轻链(CL)和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab’)2片段，具有由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(3)具有两个VH和CH1结构域的Fd片段；(4)具有抗体单臂的VL和VH结构域的Fv片段，(5)dAb片段(Ward等人,“Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted From Escherichia coli,”Nature 341:544-546(1989)，其以引用的方式整体并入本文)，其具有VH结构域；(6)分离的互补决定区(CDR)，和(7)单链Fv(scFv)，例如源于scFV-文库。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由独立基因编码，但其可通过合成连接子使用重组方法接合，合成连接子使得其被制备为其中VL和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白链(称为单链Fv(scFv))(可参见例如Huston等人,“Protein Engineering of Antibody Binding Sites:Recovery of Specific Activity in an Anti-Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。这些抗体片段使用所属领域的技术人员已知的常规技术获得，且以与完整抗体相同的方式评估所述片段的功能。本申请中，术语“抗原结合片段”还包括与抗原，特别是细胞表面受体分子抗原特异性结合的配体。配体通常是可以以高亲和力及特异性方式与受体蛋白(例如所述抗原)结合以引发功能反应的多肽或化合物。例如，所述配体可以包括CD40的配体CD40L，CD137的配体CD137L，CD28的配体CD80和/或OX-40的配体OX-40L。
在本申请中，术语“免疫检查点”通常是指CD4+和CD8+T细胞的细胞表面上的一组分子。这些分子可以有效地用作下调调节或抑制抗肿瘤免疫应答的“制动器”。可以通过抑制DNA、RNA或蛋白质水平来抑制这些抑制性分子。
在本申请中，术语“激活型抗体”通常是指针对免疫细胞如T细胞表面受体如TCR和/或共刺激受体的抗体，这些抗体通过与TCR和/或共刺激受体相结合，能够开启这些受体下游的激活信号通路，使所述免疫细胞的活化和增殖水平显著提升。
在本申请中，术语“共刺激受体”通常是指在免疫细胞，如T细胞表面表达的激活免疫应答反应所依赖的一类受体。共刺激受体在抗原呈递细胞存在且已提供第一信号的前提下，通过与其相应的激活型抗体、配体或抗原结合片段相结合后打开共刺激信号，进而完全激活免疫效应细胞。共刺激受体介导的信号通路的激活通常对于免疫应答的有效发生起着关键作用。常见的共刺激受体包括但不限于CD28、CD40、CD137和OX-40。
在本申请中，术语“肿瘤坏死因子TNF”通常是指TNF蛋白，并且不是TNF配体的超家族。人TNFα的Genbank登录号为NP_000585.2。术语“TNFα”涵盖TNFα的前体形式、前TNFα(pro-TNFα)、全长TNFα、以及由细胞内过程产生的任何形式的TNFα。该术语还涵盖TNFα的天然存在的和非天然存在的变体，例如剪接变体、等位基因变体、和同种型。TNFα能结合两个受体，TNFR1(1型TNF受体；CD120a；p55/60)和TNFR2(2型TNF受体；CD120b；p75/80)。TNFα起促炎性细胞因子的作用，例如在神经炎症中起作用。
在本申请中，术语“肿瘤浸润淋巴细胞”通常是指从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞。免疫组织化学染色显示，肿瘤浸润淋巴细胞可以包括CD3+T细胞、CD20+、CD79α+B细胞、浆细胞和CD56+NK细胞；也可以包括T细胞、少量的B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。所述肿瘤浸润淋巴细胞可以通过直接的细胞毒性T淋巴细胞和分泌细胞因子产生高效、特异性强的抗肿瘤杀伤效应。在本申请中，所述肿瘤浸润淋巴细胞可以包括单核白血球细胞，所述单核白血球细胞离开血流并迁移至一肿瘤。所述肿瘤浸润淋巴细胞可以为选自于由T细胞、B细胞、自然杀手细胞、自然杀手T细胞所组成的群组。
在本申请中，术语“种子细胞”通常是指使用包括本申请的培养基在内的任何合适的培养基从肿瘤组织中培养出来的肿瘤浸润淋巴细胞。这些细胞 即可以作为后续进一步扩大培养的起始细胞群，也可以作为终端用途的细胞群，比如用于对受试者个体进行回输治疗的细胞群。所述种子细胞可以从肿瘤组织中经过任何不同的培养时长获得，所述种子细胞的培养时长可以根据所述种子细胞的后续用途来确定，而不局限于特定的培养时长。
在本申请中，术语“IL-15”通常是指充当T细胞(特别是肠上皮内淋巴细胞(IEL))和自然杀伤(NK)细胞的有效生长、存活和活化因子的促炎细胞因子，也可称为“IL-15抗原”和“白细胞介素15”。已在多种炎性疾患，包括CD、类风湿性关节炎(RA)和牛皮癣中证实了IL-15的表达增加(Malamut等人，2010)。IL-15被认为是CD免疫病理的中心调控因子和RCD中淋巴瘤形成的非冗余驱动因子。
在本申请中，术语“IL-2”通常是指从正常外周血淋巴细胞产生并以低浓度存在于体内的淋巴因子衍生出的蛋白质。最初，Morgan等(1976)Science193：1007-1008描述了IL-2，起初称为T细胞生长因子，因为它能够诱导刺激的T淋巴细胞增殖。该术语也包括IL-2的表达后修饰的蛋白质，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。
在本申请中，术语“IL-7”通常是指一种由IL-7基因编码的蛋白质。IL-7是骨髓和胸腺中的基质细胞分泌的造血生长因子。它可以由角质形成细胞，树突状细胞，肝细胞，神经元和上皮细胞产生。IL-7可以涉及对T细胞和B细胞的作用。
在本申请中，术语“PD-1”通常是指属于CD28家族的免疫抑制性受体。PD-1主要在之前活化的T细胞上体内表达，并结合两种配体，PD-1和PD-2。完整hPD-1序列可见于GenBank登录号U64863。
在本申请中，术语“LYC-55716”通常是指一种RORγ激活剂。其CAS编号为2055536-64-4。
在本申请中，术语“GNE-1858”通常是指一种HPK1抑制剂，其CAS编号为T11438。
在本申请中，术语“TWS119”通常是指一种GSK-3抑制剂，其CAS编号为601514-19-6。
在本申请中，术语“RRX-001”通常是指一种具有放射增敏活性的表观 遗传调节剂。所述RRX-001可下调CD47/SIRPα轴并使肿瘤微环境中的TAM和其他免疫抑制细胞重新极化为免疫刺激表型。其CAS编号为925206-65-1。
在本申请中，术语“CNI-1493”通常是指一种可以阻止炎性细胞因子(包括TNF)产生的化合物，其CAS编号为164301-51-3。
本文中，术语“诱导TIL”是指从动物肿瘤中分离出TIL细胞的过程。将TIL细胞体外扩增到一定数量后，可以输回到动物体内，达到控制肿瘤生长、转移的效果。
本发明适合从任何肿瘤组织中分离TIL，包括开放性手术或微创手术获得的肿瘤组织。示例性肿瘤组织例如胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤等癌症的肿瘤组织。
发明详述
本发明提供扩增TIL细胞的培养组合物和培养基。所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15和免疫检查点抗体或其抗原结合片段。在一些方案中，所述培养组合物还包括IL-21、IL-12、GM-CSF、和提升记忆T细胞比例的小分子中的任一种、两种、三种或四种。所述提升记忆T细胞比例的小分子包括但不限于TWS119。
所述免疫检查点抗体选自PD-1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、TIM3抗体、TIGIT抗体和BTLA抗体中的任一种或多种。
所述培养组合物还可以包括CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、OX40抗体、GITR抗体、ICOS、CD206抗体和CD40抗体中的任一种或多种。优选地，所述培养组合物还包括CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、GITR抗体中的任一种、两种、三种或四种。本文培养组合物或培养基中的抗体可以分散或固定的形式存在。例如，上述一种或多种抗体可以与基质(例如固体基质)偶联。在某一示例性实施方案中，所述固体基质是微球，例如磁珠。在某一示例性实施方案中，所述固体基质是细胞培养用板材，例如孔板、平皿、细胞培养瓶或细胞培养袋。
本文中，免疫检查点抗体是针对免疫细胞中调节自身免疫功能的蛋白分子的抗体。
本文中，如本领域所知，天然的完整抗体是四聚体，包含两条相同重链多肽和两条相同轻链多肽。各重链包含至少四个结构域：氨基末端的可变结构域VH、恒定结构域CH1、恒定结构域CH2和羧基末端的恒定结构域CH3。各轻链包含两个结构域：氨基末端的可变结构域VL和羧基末端恒定结构域CL。各可变域包含三个“互补决定区”：CDR1、CDR2和CDR3，和四个“框架”区：FR1、FR2、FR3和FR4。“抗原结合片段”表示抗体中可与靶抗原特异性结合的片段。抗体或其抗原结合片段包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段、Fv片段、二硫键结合的Fv片段、单链抗体(scFv)、分离的CDR或CDR组、多肽-Fc融合体、单域抗体、骆驼抗体、掩蔽抗体、小模块免疫药物、双功能抗体、纳米抗体、Humabody抗体。
在具体实施方案中，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、IL-21、IL-12、CD3抗体、CD28抗体和GM-CSF。或者，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、IL-21、IL-12、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体和GITR抗体。或者，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、GITR抗体、GM-CSF和TWS119。
本发明的TIL细胞扩增培养基包含本文所述的扩增TIL细胞的培养组合物、血清和/或血小板，以及基础培养基。本文所述培养组合物或培养基还可包括抗生素。优选地，所述抗生素选自青霉素和链霉素中的一种或多种。
在本文培养组合物或培养基中，IL-2的浓度为200-6000IU/mL，例如200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000IU/mL，或上述数值的任意两个之间的范围；IL-7的浓度为5-100ng/mL，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/mL，或上述数值的任意两个之间的范围；IL-15的浓度为5-100ng/mL，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/mL，或上述数值的任意两个之间的范围；PD-1抗体的浓度为1-100μg/mL，例如1、2、3、5、7、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，或上述 数值的任意两个之间的范围；IL-21的浓度为5-100ng/mL，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/mL，或上述数值的任意两个之间的范围；IL-12的浓度为5-100ng/mL，例如5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ng/mL，或上述数值的任意两个之间的范围；CD3抗体的浓度为0.5-10μg/mL，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/mL，或上述数值的任意两个之间的范围；CD28抗体的浓度为0.5-10μg/mL，例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/mL，或上述数值的任意两个之间的范围；CD137抗体的浓度为1-100μg/mL，例如1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，或上述数值的任意两个之间的范围；培养组合物中GITR抗体的浓度为1-100μg/mL，例如1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg/mL，或上述数值的任意两个之间的范围；培养组合物中GM-CSF的浓度为200-5000U/mL，例如200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000U/mL，或上述数值的任意两个之间的范围；TWS119的浓度为1-500μM，例如1、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500μM，或上述数值的任意两个之间的范围。
在具体实施方案方案中，本文所述培养组合物或培养基包含：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、和3-100μg/mL的PD-1抗体。优选地，所述培养组合物或培养基包含200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、和3-50μg/mL的PD-1抗体。更优选地，所述培养组合物或培养基包含500IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、和3μg/mL的PD-1抗体。所述培养基还含有人AB血清、PS双抗和OpTmizer
TM。
在另一具体实施方案中，本文所述培养组合物或培养基包含：200-6000IU的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体。优选地，所述培养组合物或培养基包含：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:3-50μg/mL的PD-1抗体。更优选地，所述培养组合物或培养基包含：500IU/mL的IL-2:5ng/mL的IL-7:10ng/mL的IL-15:1μg/mL的PD-1抗体。所述培养基还含有人AB血清、PS双抗和 OpTmizer
TM。
在另一具体实施方案中，所述培养组合物或培养基包含：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、1-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体和200-5000U/mL的GM-CSF。优选地，所述培养组合物或培养基包含200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、3-50μg/mL的PD-1抗体、5-50ng/mL的IL-21、5-50ng/mL的IL-12、1-5μg/mL的CD3抗体、1-5μg/mL的CD28抗体和200-1000U/mL的GM-CSF。更优选地，所述培养组合物或培养基包含200IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、10ng/mL的IL-21、20ng/mL的IL-12、3μg/mL的CD3抗体、3μg/mL的CD28抗体和500U/mL的GM-CSF。所述培养基还含有人AB血清、PS双抗和AIM-V。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物或培养基包含：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:3-100μg/mL的PD-1抗体:5-100ng/mL的IL-21:5-100ng/mL的IL-12:1-10μg/mL的CD3抗体:0.5-10μg/mL的CD28抗体:200-5000U/mL的GM-CSF。优选地，所述培养组合物或培养基包含：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:3-50μg/mL的PD-1抗体:5-50ng/mL的IL-21:5-50ng/mL的IL-12:1-5μg/mL的CD3抗体:0.5-5μg/mL的CD28抗体:200-1000U/mL的GM-CSF。更优选地，所述培养组合物或培养基包含：200IU/mL的IL-2:50ng/mL的IL-7:50ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:10ng/mL的IL-21:10ng/mL的IL-12:3μg/mL的CD3抗体:0.5μg/mL的CD28抗体:500U/mL的GM-CSF。所述培养基还含有人AB血清、PS双抗和AIM-V。
在另一具体实施方案中，所述培养组合物或培养基包含：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、1-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体。优选地，所述培养组合物或培养基包含200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、3-50μg/mL的PD-1抗体、5- 50ng/mL的IL-21、5-50ng/mL的IL-12、1-5μg/mL的CD3抗体、1-5μg/mL的CD28抗体、1-5μg/mL的CD137抗体和1-5μg/mL的GITR抗体。更优选地，所述培养组合物或培养基包含400IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、10ng/mL的IL-21、20ng/mL的IL-12、3μg/mL的CD3抗体、3μg/mL的CD28抗体、3μg/mL的CD137抗体和3μg/mL的GITR抗体。所述培养基还含有自体血小板、PS双抗和X-VIVO。
在另一具体实施方案中，所述培养组合物或培养基包含：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:5-100ng/mL的IL-21:5-100ng/mL的IL-12:0.5-10μg/mL的CD3抗体:1-10μg/mL的CD28抗体:1-100μg/mL的CD137抗体:1-100μg/mL的GITR抗体。优选地，所述培养组合物或培养基包含200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:5-50ng/mL的IL-21:5-50ng/mL的IL-12:0.5-5μg/mL的CD3抗体:1-5μg/mL的CD28抗体:1-5μg/mL的CD137抗体:1-5μg/mL的GITR抗体。更优选地，所述培养组合物或培养基包含：400IU/mL的IL-2:30ng/mL的IL-7:30ng/mL的IL-15:1μg/mL的PD-1抗体:10ng/mL的IL-21:15ng/mL的IL-12:0.5μg/mL的CD3抗体:1μg/mL的CD28抗体:2.5μg/mL的CD137抗体:3μg/mL的GITR抗体。所述培养基还含有自体血小板、PS双抗和X-VIVO。
在其他具体实施方案中，所述培养组合物或培养基包含：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、1-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体、1-100μg/mL的GITR抗体、200-5000U/mL的GM-CSF和1-500μM的TWS119。优选地，所述培养组合物或培养基包含200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、3-50μg/mL的PD-1抗体、1-5μg/mL的CD3抗体、1-5μg/mL的CD28抗体、1-5μg/mL的CD137抗体、1-5μg/mL的GITR抗体、200-500U/mL的GM-CSF和1-100μM的TWS119。更优选地，所述培养组合物或培养基包含300IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、3μg/mL的CD3抗体、3μg/mL的CD28抗体、3μg/mL的CD137抗体、3μg/mL的GITR抗体、200U/mL的 GM-CSF和10μM的TWS119；或者更优选地，所述培养组合物或培养基：300IU/mL的IL-2:40ng/mL的IL-7:40ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:1μg/mL的CD3抗体:1μg/mL的CD28抗体:5μg/mL的CD137抗体:2μg/mL的GITR抗体:200U/mL的GM-CSF:10μM的TWS119。所述培养基还含有异体血小板、PS双抗和MHM-C。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:200-5000U/mL的GM-CSF。优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:200-1000U/mL的GM-CSF。更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:5ng/mL的IL-7:10ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD3抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD28抗体:500U/mL的GM-CSF。
在另一具体实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。优选地，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体和200-1000U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。更优选地，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、5ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、3μg/mL的CD3抗体、0.5μg/mL的CD28抗体和500U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:5-100ng/mL的IL-21:5-100ng/mL的IL-12:0.5-10μg/mL的CD3抗体:0.5-10μg/mL的CD28抗体:200-5000U/mL的GM-CSF。 优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:5-50ng/mL的IL-21:5-50ng/mL的IL-12:0.5-5μg/mL的CD3抗体:0.5-5μg/mL的CD28抗体:200-1000U/mL的GM-CSF。更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:5ng/mL的IL-7:10ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:10ng/mL的IL-21:10ng/mL的IL-12:3μg/mL的CD3抗体:0.5μg/mL的CD28抗体:500U/mL的GM-CSF。
在另一具体实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。优选地，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、5-50ng/mL的IL-21、5-50ng/mL的IL-12、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体和200-1000U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。更优选地，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、5ng/mL的IL-7、10ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、10ng/mL的IL-21、10ng/mL的IL-12、3μg/mL的CD3抗体、0.5μg/mL的CD28抗体和500U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体。优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体。更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:50ng/mL的IL-7:30ng/mL的IL-15:1μg/mL的PD-1抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD3抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD28抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD137抗体。
在另一具体具体实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体和偶联于基质的CD137抗体，或这些组分的等比浓缩物。优选地，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体和偶联于基质的CD137抗体，或这些组分的等比浓缩物。更优选地，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、50ng/mL的IL-7、30ng/mL的IL-15、1μg/mL的PD-1抗体、偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD3抗体、偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD28抗体和偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD137抗体，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-100μg/mL的GITR抗体：1-500μM的TWS119。优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-5μg/mL的GITR抗体﹕1-100μM的TWS119。更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：300IU/mL的IL-2:10ng/mL的IL-7:25ng/mL的IL-15:2μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:3μg/mL的GITR抗体﹕10μM的TWS119。
在另一具体实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-100μg/mL的GITR抗体和1-500μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物。优选地，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-5μg/mL 的GITR抗体和1-100μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物。更优选地，所述培养组合物包含组分：300IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、25ng/mL的IL-15、2μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、3μg/mL的GITR抗体和10μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-100μg/mL的TIGIT抗体﹕200-5000U/mL的GM-CSF。优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-5μg/mL的TIGIT抗体﹕200-500U/mL的GM-CSF。更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:7ng/mL的IL-7:50ng/mL的IL-15:2μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:2.5μg/mL的TIGIT抗体﹕500U/mL的GM-CSF。
在另一具体实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-100μg/mL的TIGIT抗体和200-5000U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。优选地，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-5μg/mL的TIGIT抗体和200-500U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。更优选地，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、7ng/mL的IL-7、50ng/mL的IL-15、2μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、2.5μg/mL的TIGIT抗体和500U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的LAG-3抗体:5-100ng/mL的IL-21:5-100ng/mL的IL-12:0.5-10μg/mL的CD3抗体:0.5-10μg/mL的CD28抗体:1-100μg/mL的CD137抗体:1-100μg/mL的GITR抗体。优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的LAG-3抗体:5-50ng/mL的IL-21:5-50ng/mL的IL-12:0.5-5μg/mL的CD3抗体:0.5-5μg/mL的CD28抗体:1-5μg/mL的CD137抗体:1-5μg/mL的GITR抗体。更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：400IU/mL的IL-2:30ng/mL的IL-7:30ng/mL的IL-15:3μg/mL的LAG-3抗体:10ng/mL的IL-21:15ng/mL的IL-12:0.5μg/mL的CD3抗体:1μg/mL的CD28抗体:2.5μg/mL的CD137抗体:3μg/mL的GITR抗体。
在另一具体实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的LAG-3抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、0.5-10μg/mL的CD3抗体、0.5-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。优选地，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的LAG-3抗体、5-50ng/mL的IL-21、5-50ng/mL的IL-12、0.5-5μg/mL的CD3抗体、0.5-5μg/mL的CD28抗体、1-5μg/mL的CD137抗体和1-5μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。更优选地，所述培养组合物包含组分：400IU/mL的IL-2、30ng/mL的IL-7、30ng/mL的IL-15、3μg/mL的LAG-3抗体、10ng/mL的IL-21、15ng/mL的IL-12、0.5μg/mL的CD3抗体、1μg/mL的CD28抗体、2.5μg/mL的CD137抗体和3μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-100μg/mL的TIGIT抗体:1-100μg/mL的CD40 抗体:1-100μg/mL的OX-40抗体﹕1×10
8-5×10
8/mL的自体血小板。优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:偶联于基质的CD137抗体:1-50μg/mL的TIGIT抗体:1-50μg/mL的CD40抗体:1-50μg/mL的OX-40抗体：1×10
8-3×10
8/mL的自体血小板。更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：500IU/mL的IL-2:5ng/mL的IL-7:25ng/mL的IL-15:3μg/mL的PD-1抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD3抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD28抗体:偶联于细胞培养皿或细胞培养袋的CD137抗体:2.5μg/mL的TIGIT抗体:2μg/mL的CD40抗体:3μg/mL的OX-40抗体：3×10
8/mL的自体血小板。
在另一具体实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-100μg/mL的TIGIT抗体、1-100μg/mL的CD40抗体、1-100μg/mL的OX-40抗体和1×10
8-5×10
8/mL的自体血小板，或这些组分的等比浓缩物。优选地，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-50μg/mL的TIGIT抗体、1-50μg/mL的CD40抗体、1-50μg/mL的OX-40抗体和1×10
8-3×10
8/mL的自体血小板，或这些组分的等比浓缩物。更优选地，所述培养组合物包含组分：500IU/mL的IL-2、5ng/mL的IL-7、25ng/mL的IL-15、3μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、2.5μg/mL的TIGIT抗体、2μg/mL的CD40抗体、3μg/mL的OX-40抗体和3×10
8/mL的自体血小板，或这些组分的等比浓缩物。
在另一个或多个实施方案中，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-6000IU/mL的IL-2:5-100ng/mL的IL-7:5-100ng/mL的IL-15:1-100μg/mL的PD-1抗体:1-100μg/mL的CTLA-4抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:1-100μg/mL的CD137抗体:1-100μg/mL的 GITR抗体：200-5000U/mL的GM-CSF﹕1×10
8-5×10
8/mL的异体血小板。优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：200-500IU/mL的IL-2:5-50ng/mL的IL-7:5-50ng/mL的IL-15:1-50μg/mL的PD-1抗体:1-50μg/mL的CTLA-4抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:1-50μg/mL的CD137抗体:1-50μg/mL的GITR抗体：200-500U/mL的GM-CSF﹕1×10
8-3×10
8/mL的异体血小板。更优选地，所述培养组合物包含如下比例的各组分：300IU/mL的IL-2:10ng/mL的IL-7:30ng/mL的IL-15:1μg/mL的PD-1抗体:2μg/mL的CTLA-4抗体:偶联于基质的CD3抗体:偶联于基质的CD28抗体:5μg/mL的CD137抗体:2μg/mL的GITR抗体：200U/mL的GM-CSF﹕1×10
8/mL的异体血小板。
在另一具体实施方案中，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、1-100μg/mL的CTLA-4抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体、1-100μg/mL的GITR抗体、200-5000U/mL的GM-CSF和1×10
8-5×10
8/mL的异体血小板，或这些组分的等比浓缩物。优选地，所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、1-50μg/mL的CTLA-4抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、1-50μg/mL的CD137抗体、1-50μg/mL的GITR抗体、200-500U/mL的GM-CSF和1×10
8-3×10
8/mL的异体血小板，或这些组分的等比浓缩物。更优选地，所述培养组合物包含组分：300IU/mL的IL-2、10ng/mL的IL-7、30ng/mL的IL-15、1μg/mL的PD-1抗体、2μg/mL的CTLA-4抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、5μg/mL的CD137抗体、2μg/mL的GITR抗体、200U/mL的GM-CSF和1×10
8/mL的异体血小板，或这些组分的等比浓缩物。
本文所述抗体可以是来自任何物种的抗体或重组抗体，优选单克隆抗体。这些抗体本领域周知，例如PD-1抗体百泽安、PD-1抗体信迪利、PD-1抗体特瑞普利、PD-1抗体艾瑞卡、CD3抗体ab86883、CD28抗体MAB342、GITR抗体如CN103951753B中SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105所示、 CD137抗体如CN111182919A中SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。这些专利文献或公开通过引用全文纳入本申请。。
在上述诱导组合物或培养基中，CD3抗体与CD28抗体浓度比为3:1至1:6之间、2:1至1:5之间、1:1至1:4之间。在上述扩增组合物或培养基中，CD3抗体与CD28抗体浓度比为3:1至1:6之间、2:1至1:5之间、1:1至1:4之间；CD3抗体与CD137抗体浓度比为3:1至1:6之间、2:1至1:5之间、1:1至1:4之间。
本文所述血清可以是本领域已知可用于动物细胞(例如TIL细胞)培养的任何血清，例如人AB血清、对象自体血清或动物源血清。血清的浓度为1-10％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，或上述数值的任意两个之间的范围。
本文所述血小板可以是对象血液来源的血小板或异体血液来源的血小板。血小板的密度为0.5×10
8/mL-3×10
8/mL，例如0.5×10
8/mL、1×10
8/mL、1.5×10
8/mL、2×10
8/mL、2.5×10
8/mL、3×10
8/mL，或上述数值的任意两个之间的范围。
本文所述“基础培养基”是本领域已知的任何可用于TIL细胞培养的培养基，包括但不限于AIM-V、X-VIVO、DMEM、RPMI1640、OpTmizer、MHM-C。这些培养基的组分和含量本领域周知，其来源如实施例中所述。
本文方法中所用的TIL种子细胞培养基可以是本领域已知的任何可从肿瘤组织中诱导TIL细胞爬出的培养基。示例性的TIL种子细胞培养基如PCT/CN2021/096585中所述，其通过引用全文纳入本文。
例如，本文所述TIL种子细胞培养基包括：细胞培养成分、细胞因子和免疫检查点抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞因子包括IL-2，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段包括PD-1抗体或其抗原结合片段，所述细胞培养成分为血清培养基或无血清培养基。所述IL-2的浓度为约3000IU/mL以下或约200IU/mL以下。一方面，本申请提供了一种肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞培养基，其包括以下的组分：细胞培养成分、细胞因子和免疫检查点抗体或其抗原结合片段，其中所述细胞因子包括IL-2，所述免疫检查点包括：PD-1、LAG-3、TIGIT和/或CTLA-4，所述细胞培养成分为血清培养基或无血清 培养基。
在本申请中，所述细胞因子可以为人源的细胞因子。
在本申请中，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段可以为人源化和/或全人源的抗体或其抗原结合片段。
例如，所述IL-2的浓度可以为约3000IU/mL以下(例如，可以为约2900IU/mL以下、约2800IU/mL以下、约2700IU/mL以下、约2600IU/mL以下、约2500IU/mL以下、约2400IU/mL以下、约2300IU/mL以下、约2200IU/mL以下、约2100IU/mL以下、约2000IU/mL以下、约1900IU/mL以下、约1800IU/mL以下、约1700IU/mL以下、约1600IU/mL以下、约1500IU/mL以下、约1400IU/mL以下、约1300IU/mL以下、约1100IU/mL以下、约1100IU/mL以下、约1000IU/mL以下、约900IU/mL以下、约800IU/mL以下、约700IU/mL以下、约600IU/mL以下、约500IU/mL以下、约400IU/mL以下、约300IU/mL以下或更低)。例如，所述IL-2的浓度可以为约2000IU/mL以下、可以为约2500IU/mL以下或者，可以为约3000IU/mL以下。
例如，所述细胞因子可以包括IL-7。
例如，所述IL-7的浓度可以为约5-约100ng/mL(例如，可以为约5-约95ng/mL、约5-约90ng/mL、约5-约85ng/mL、约5-约80ng/mL、约5-约75ng/mL、约5-约70ng/mL、约5-约65ng/mL、约5-约60ng/mL、约5-约55ng/mL、约5-约50ng/mL、约5-约45ng/mL、约5-约40ng/mL、约5-约35ng/mL、约5-约30ng/mL、约5-约25ng/mL、约5-约20ng/mL或约5-约10ng/mL)。例如，所述IL-7的浓度可以为约200-约1000U/mL(例如，可以为至少约200U/mL、至少约500U/mL、或者至少约1000U/mL)。在本申请中，所述IL-7的浓度可以为约200-1000IU/mL。例如可以为至少约200IU/mL、至少约500IU/mL或者至少约1000IU/mL。
例如，所述细胞因子可以包括IL-15。
例如，所述IL-15的浓度可以为约5-约100ng/mL(例如，可以为约5-约95ng/mL、约5-约90ng/mL、约5-约85ng/mL、约5-约80ng/mL、约5-约75ng/mL、约5-约70ng/mL、约5-约65ng/mL、约5-约60ng/mL、约5-约 55ng/mL、约5-约50ng/mL、约5-约45ng/mL、约5-约40ng/mL、约5-约35ng/mL、约5-约30ng/mL、约5-约25ng/mL、约5-约20ng/mL或约5-约10ng/mL)。例如，所述IL-15的浓度可以为约200-约500U/mL(例如，可以为至少约200U/mL、至少约250U/mL、至少约300U/mL、或者至少约500U/mL)。在本申请中，所述IL-15的浓度可以为200-500IU/mL。例如可以为至少约200IU/mL、至少约250IU/mL、至少约300IU/mL或者至少约500IU/mL。
例如，所述细胞因子可以包括肿瘤坏死因子TNF。
例如，所述细胞因子可以包括TNFα。
例如，所述TNFα的浓度可以为约10-约100pg/mL(例如，可以为约10-约95pg/mL、约10-约90pg/mL、约10-约80pg/mL、约10-约70pg/mL、约10-约60pg/mL、约10-约50pg/mL、约10-约40pg/mL、约15-约40pg/mL、约10-约25pg/mL、约15-约25pg/mL、约10-约30pg/mL、约10-约20pg/mL或者约10-约15pg/mL)。在本申请中，所述TNF-α的浓度可以为约10-100pg/mL。例如，可以为约10-100pg/mL、约15-100pg/mL、约20-100pg/mL或约25-100pg/mL。例如，可以为至少约10pg/mL、至少约15pg/mL、至少约20pg/mL或者至少约25pg/mL。
例如，所述细胞因子可以包括集落刺激因子。
例如，所述细胞因子可以包括GM-CSF、G-CSF和/或M-CSF。
例如，所述GM-CSF的浓度可以为约200-约5000U/mL(例如，可以为约200-约800U/mL、约200-约500U/mL、约300-约5000U/mL、约500-约5000U/mL、约1000-约5000U/mL、约1500-约5000U/mL、约2000-约5000U/mL、约2500-约5000U/mL、约3000-约5000U/mL、约3500-约5000U/mL、约4000-约5000U/mL或约45000-约5000U/mL)。例如，可以为约200-约1000U/mL、可以为约200-约800U/mL、可以为约200-约500U/mL。例如，可以为至少约200U/mL、至少约500U/mL或者至少约800U/mL。
例如，所述G-CSF的浓度可以为约300U/mL-约1000U/mL。例如，所述G-CSF的浓度可以为约500-1000U/mL。例如，可以为至少约500U/mL或者至少约1000U/mL。
例如，所述M-CSF的浓度可以为约300U/mL-约800U/mL。例如，所述M-CSF的浓度可以为约300U/mL-约500U/mL。例如，可以为至少约300U/mL、至少约500U/mL或者至少约800U/mL。
例如，所述细胞因子可以包括干扰素。
例如，所述细胞因子可以包括IFN-γ、IFN-α和/或IFN-β。
例如，所述IFN-γ的浓度可以为约10-约1000ng/mL(例如，可以为约15-约1000ng/mL、约20-约1000ng/mL、约30-约1000ng/mL、约40-约1000ng/mL、约50-约1000ng/mL、约60-约1000ng/mL、约70-约1000ng/mL、约80-约1000ng/mL、约90-约1000ng/mL、约100-约1000ng/mL、约200-约1000ng/mL、约300-约1000ng/mL、约400-约1000ng/mL、约500-约1000ng/mL、约600-约1000ng/mL、约700-约1000ng/mL、约800-约1000ng/mL或约900-约1000ng/mL)。例如，所述IFN-γ的浓度可以为约10-约1000ng/mL。例如，所述IFN-γ的浓度可以为约300-约1000ng/mL、约300-约800ng/mL、或约300-约500ng/mL。例如，可以为至少约300ng/mL、至少约500ng/mL、至少约800ng/mL或者至少约1000ng/mL。
例如，所述IFN-α的浓度可以为约500U/mL-约1000U/mL。例如，可以为至少约500ng/mL。
例如，所述IFN-β的浓度可以为约200U/mL-约500U/mL。例如，所述IFN-β的浓度可以为约250-约500ng/mL。例如，可以为至少约200ng/mL、至少约250ng/mL或者至少约500ng/mL。
例如，所述细胞因子还可以包括IL-4、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-9、IL-18、IL-12、IL-21和/或IL-10。
例如，所述IL-4的浓度可以为约200-约500U/mL。例如可以为至少约200IU/mL或者至少约500IU/mL。
例如，所述IL-1α的浓度可以为约200-约500U/mL。例如可以为至少约200IU/mL或者至少约500IU/mL。
例如，所述IL-1β的浓度可以为约200-约500U/mL。例如可以为至少约200IU/mL或者至少约500IU/mL。
例如，所述IL-6的浓度可以为约200-约500U/mL。例如可以为至少约 200IU/mL或者至少约500IU/mL。
例如，所述IL-9的浓度可以为约200-约500U/mL。例如可以为至少约200IU/mL或者至少约500IU/mL。
例如，所述IL-18的浓度可以为约200-约500U/mL。例如可以为至少约200IU/mL或者至少约500IU/mL。
例如，所述IL-12的浓度可以为约200-约1000U/mL。例如，所述IL-12的浓度可以为约200-约1000U/mL、约200-约500U/mL或约300-约1000U/mL。例如可以为至少约200IU/mL、至少约250IU/mL、至少约300IU/mL或者至少约500IU/mL。
例如，所述IL-21的浓度可以为约200-约500U/mL。例如，所述IL-21的浓度可以为约250-约1000U/mL。例如可以为至少约200IU/mL、至少约250IU/mL或者至少约500IU/mL。
例如，所述IL-10的浓度可以为约200-约500U/mL。例如可以为至少约200IU/mL、至少约250IU/mL、至少约300IU/mL或者至少约500IU/mL。
例如，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段可以为PD-1抗体或其抗原结合片段。
例如，所述PD-1抗体或其抗原结合片段可以为人PD-1抗体或其抗原结合片段。
例如，所述PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度可以为约1-约100μg/mL(例如，可以为约3-约100μg/mL、可以为约5-约100μg/mL、可以为约10-约100μg/mL、可以为约15-约100μg/mL、约16-约100μg/mL、约17-约100μg/mL、约18-约100μg/mL、约19-约100μg/mL、约20-约100μg/mL、约25-约100μg/mL、约30-约100μg/mL、约36-约100μg/mL、约40-约100μg/mL、约45-约100μg/mL、约50-约100μg/mL、约55-约100μg/mL、约60-约100μg/mL、约65-约100μg/mL、约70-约100μg/mL、约80-约100μg/mL或约90-约100μg/mL)。在本申请中，所述PD-1mAb的浓度可以为约3-100μg/mL。例如，可以为至少约3μg/mL、至少约5μg/mL、至少约10μg/mL、至少约15μg/mL、至少约20μg/mL、至少约25μg/mL、至少约36μg/mL、至少约50μg/mL或者至少约100μg/mL。
例如，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段可以为人LAG-3抗体或其抗原结合片段。
例如，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段可以为LAG-3抗体或其抗原结合片段，所述LAG-3抗体或其抗原结合片段的浓度为约3-约10μg/mL。例如，可以为约5-约10μg/mL。例如，可以为至少约3μg/mL、至少约5μg/mL或者至少约10μg/mL。
例如，所述TIGIT抗体或其抗原结合片段可以为人TIGIT抗体或其抗原结合片段。
例如，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段可以为TIGIT抗体或其抗原结合片段，所述TIGIT抗体或其抗原结合片段的浓度为约1-约25μg/mL。在本申请中，所述TIGIT mAb的浓度可以为约2.5-20μg/mL。例如，可以为约5-20μg/mL。例如，可以为至少约2.5μg/mL、至少约5μg/mL或者至少约20μg/mL。
例如，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段可以为人CTLA-4抗体或其抗原结合片段。
例如，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段可以为CTLA-4抗体或其抗原结合片段，所述CTLA-4抗体或其抗原结合片段的浓度为约1-约100μg/mL。在本申请中，所述CTLA-4mAb的浓度可以为约3-50μg/mL、约5-50μg/mL或者约10-50μg/mL。例如，可以为至少约3μg/mL、至少约5μg/mL、至少约10μg/mL或者至少约50μg/mL。
在本申请中，所述的种子细胞培养基还可以包括共刺激受体抗体或其抗原结合片段，其中所述共刺激受体免疫检查点抗体或其抗原结合片段可以包括：CD40抗体或其抗原结合片段、OX-40抗体或其抗原结合片段、CD137抗体或其抗原结合片段、和/或CD28抗体或其抗原结合片段。
例如，所述共刺激抗体或其抗原结合片段可以包括CD137抗体或其抗原结合片段。
例如，所述CD137抗体或其抗原结合片段可以为人CD137抗体或其抗原结合片段。
例如，所述CD137抗体或其抗原结合片段的浓度可以为约1-约100μ g/mL(例如，可以为约2-约100μg/mL、约3-约100μg/mL、约3-约20μg/mL、约4-约100μg/mL、约5-约100μg/mL、约6-约100μg/mL、约7-约100μg/mL、约8-约100μg/mL、约9-约100μg/mL、约10-约100μg/mL、约12-约100μg/mL、约20-约100μg/mL、约10-约90μg/mL、约10-约80μg/mL、约10-约70μg/mL、约10-约50μg/mL、约10-约20μg/mL或者约3-约12μg/mL)。在本申请中，所述CD137mAb的浓度可以为约3-20μg/mL。例如，可以为至少约3μg/mL、至少约5μg/mL、至少约10μg/mL、至少约12μg/mL或者至少约20μg/mL。
例如，所述共刺激抗体或其抗原结合片段可以包括OX40抗体或其抗原结合片段。
例如，所述OX-40抗体或其抗原结合片段可以为人OX-40抗体或其抗原结合片段。
例如，所述OX-40抗体或其抗原结合片段的浓度可以为约3-约10μg/mL。在本申请中，所述OX-40mAb的浓度可以为约5-10μg/mL。例如，可以为至少约3μg/mL、至少约5μg/mL或者至少约10μg/mL。
例如，所述共刺激抗体或其抗原结合片段可以包括CD28抗体或其抗原结合片段。
例如，所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段可以包括CD28抗体或其抗原结合片段。
例如，所述CD28抗体或其抗原结合片段可以为人CD28抗体或其抗原结合片段。
例如，所述CD28抗体或其抗原结合片段的浓度可以为约1-约10μg/mL。(例如，可以为约2-约10μg/mL、约3-约10μg/mL、约3-约5μg/mL、约4-约10μg/mL、约5-约10μg/mL、约6-约10μg/mL、约7-约10μg/mL或约8-约10μg/mL)。在本申请中，所述CD28mAb的浓度可以为约3-10μg/mL。例如，可以为至少约3μg/mL、至少约5μg/mL或者至少约10μg/mL。
例如，所述共刺激抗体或其抗原结合片段可以包括CD40抗体或其抗原结合片段。
例如，所述CD40抗体或其抗原结合片段可以为人CD40抗体或其抗原 结合片段。
例如，所述CD40抗体或其抗原结合片段的浓度可以为约5-约10μg/mL。在本申请中，所述CD40mAb的浓度可以为约6-10μg/mL或约5-8μg/mL。例如，可以为至少约5μg/mL。
例如，所述血清培养基可以包括血清。
例如，所述血清可以包括人AB血清。
例如，所述血清的浓度可以为约1-约10％(v/v)(例如，可以为约1.5-约10％、约2-约10％、约3-约10％、约4-约10％、约5-约10％、约1-约9％、约1-约8％、约1-约7％或约1-约6％)。
例如，所述血清培养基可以包括AIM-V培养基。
例如，所述无血清培养基可以包括X-VIVO培养基或者CTS
TMOpTmizer
TM培养基。
例如，所述细胞培养成分可以包括抗生素。
例如，所述细胞培养成分可以包括青霉素-链霉素混合液PS。
例如，所述青霉素-链霉素混合液PS的浓度可以为约1-约200U/mL(例如，可以为约1-约5U/mL、约1-约10U/mL、约1-约20U/mL、约1-约30U/mL、约1-约40U/mL、约1-约50U/mL、约1-约60U/mL、约1-约70U/mL、约1-约80U/mL、约1-约90U/mL、约1-约100U/mL、约1-约120U/mL、约1-约140U/mL、约1-约160U/mL、约1-约180U/mL或者约1-约200U/mL)。例如，所述青霉素-链霉素混合液PS的浓度可以为约100U/mL。
例如，所述的种子细胞培养基还可以包括M2型巨噬细胞抑制剂，所述M2型巨噬细胞抑制剂可以包括RRx001和/或CNI-1493。
例如，所述M2型巨噬细胞抑制剂的浓度可以为约0.1-约100μM(例如，可以为约0.5-约100μM、约1-约100μM、约2-约100μM、约2.5-约100μM、约3-约100μM、约2-约3μM、约5-约100μM、约10-约100μM、约20-约100μM、约0.1-约90μM、约0.5-约90μM、约1-约90μM、约5-约90μM、约0.1-约80μM)。
例如，所述的种子细胞培养基还可以包括调控T细胞(Treg)抑制剂，所述调控T细胞抑制剂可以包括CAL-101、达沙替尼(dasatinib)、伊马替尼 (imatinib)和/或帕比司他(Panobinostat)。
例如，所述调控T细胞抑制剂的浓度可以为约0.1-约100μM(例如，可以为约0.5-约100μM、约1-约100μM、约5-约100μM、约10-约100μM、约20-约100μM、约0.1-约90μM、约0.5-约90μM、约1-约90μM、约5-约90μM、约0.1-约80μM)。例如，所述调控T细胞抑制剂的浓度可以为约1-约5μM、约1-约3μM、可以为约1.5-约5μM、可以为约2-约5μM、可以为约2.5-约5μM或者可以为约3-约5μM。
例如，所述的种子细胞培养基还可以包括骨髓来源的抑制性细胞抑制剂，所述骨髓来源的抑制性细胞抑制剂可以包括AG490、地西他滨(decitabine)、舒尼替尼和/或BBI608。
例如，所述骨髓来源的抑制性细胞抑制剂的浓度可以为约0.1-约100μg/mL(例如，可以为约0.5-约100μg/mL、约1-约100μg/mL、约2-约100μg/mL、约5-约100μg/mL、约6-约100μg/mL、约7-约100μg/mL、约8-约100μg/mL、约9-约100μg/mL、约10-约100μg/mL、约20-约100μg/mL、约10-约90μg/mL、约10-约80μg/mL、约10-约70μg/mL或约10-约50μg/mL)。例如，所述骨髓来源的抑制性细胞抑制剂的浓度可以为约1-约3μg/mL，或者可以为约1.5-约3μg/mL。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括所述调控T细胞(Treg)抑制剂、所述骨髓来源的抑制性细胞抑制剂和所述M2型巨噬细胞抑制剂中的至少一种、至少两种和至少三种。
在本申请中，所述的种子细胞培养基还可以包括T细胞激活剂，所述T细胞激活剂可以包括LYC-55716、GNE-1858和/或亚甲基蓝。
例如，所述T细胞激活剂的浓度可以为约1-约10μM。例如，可以为约1-约9μM、约1-约8μM、约1-约7μM、约1-约6μM、约2-约10μM、约3-约10μM、约4-约10μM或约5-约10μM。
在本申请中，所述的种子细胞培养基还可以包括T细胞分化抑制剂，所述T细胞分化抑制剂可以包括TWS119。
例如，所述T细胞分化抑制剂的浓度可以为约1-约10μM。例如，可以为约1-约9μM、约1-约8μM、约1-约7μM、约1-约6μM、约2-约10μ M、约3-约10μM、约4-约10μM或约5-约10μM。
在本申请中，所述RRX-001的浓度可以为约0.1-约100μM。例如，可以为至少约3μM。
在本申请中，所述Sunitinib的浓度可以为约1.5-约3μM。例如，可以为至少约1.5μM或者至少约3μM。
在本申请中，所述CNI-1493的浓度可以为约2-约3μM。例如，可以为至少约2μM、至少约2.5μM或者至少约3μM。
在本申请中，所述Imatinib的浓度可以为约2-约5μM。例如，可以为至少约2μM或者至少约5μM。
在本申请中，所述CAL-101的浓度可以为约1.5-约5μM。例如，可以为至少约1.5μM或者至少约5μM。
在本申请中，所述Dasatinib的浓度可以为约2-约3μM。例如，可以为至少约2μM、至少约2.5μM或者至少约3μM。
在本申请中，所述LYC-55716的浓度可以为约1-约10μM。例如，可以为至少约1μM或者至少约10μM。
在本申请中，所述GNE-1858的浓度可以为约4-约5nM。例如，可以为至少约4nM、至少约4.5nM或者至少约5nM。
在本申请中，所述亚甲基蓝的浓度可以为约1-约2μM。例如，可以为至少约1μM、至少约1.5μM或者至少约2μM。
在本申请中，所述TWS119的浓度可以为约1-约10μM。例如，可以为至少约1μM、至少约5μM或者至少约10μM。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-7、PD-1抗体或其抗原结合片段、TNFα、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约1000U/mL IL-7、至少约100μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约10pg/mL TNFα、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-9、IL-15、PD-1 抗体或其抗原结合片段、CTLA-4抗体或其抗原结合片段、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约2000U/mL IL-2、至少约500U/mL IL-9、至少约500U/mL IL-15、至少约50μg/mL CTLA-4抗体或其抗原结合片段、至少约50μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约3％人血清、无血清培养基AIM-V和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-7、G-CSF、PD-1抗体或其抗原结合片段、TNFα、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约2000U/mL IL-2、至少约500U/mL IL-7、至少约1000U/mLG-CSF、至少约36μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约20pg/mL TNFα、至少约3％人血清、无血清培养基AIM-V和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-12、IL-21、GM-CSF、LAG3抗体或其抗原结合片段、CTLA-4抗体或其抗原结合片段、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-12、至少约500U/mL IL-21、至少约800U/mL GM-CSF、至少约10μg/mL LAG-3抗体或其抗原结合片段、至少约10μg/mL CTLA-4抗体或其抗原结合片段、至少约5％人血清、无血清培养基CTSTMOpTmizerTM和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-1β、IL-2、IL-6、IL-21、IFN-γ、TIGIT抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、TNFα、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约500U/mL IL-1β、至少约2500U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-6、至少约200U/mL IL-21、至少约1000U/mL IFN-γ、至少约20μg/mL TIGIT抗体或其抗原结合片段、至少约50μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约25pg/mL TNFα、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-1α、IL-2、IL-9、IL-18、IFN-α、IFN-β、LAG-3抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、TNFα、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约500U/mL IL-1α、至少约2000U/mL IL-2、至少约500U/mL IL-9、至少约200U/mL IL-18、至少约500U/mL IFN-α、至少约500U/mL IFN-β、至少约5μg/mL LAG-3抗体或其抗原结合片段、至少约25μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约25pg/mL TNFα、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-4、IL-10、IL-21、CD137抗体或其抗原结合片段、LAG-3抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、TNFα、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-4、至少约200U/mL IL-10、至少约250U/mL IL-21、至少约10μg/mL CD137抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL LAG-3抗体或其抗原结合片段、至少约20μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约10pg/mL TNFα、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和1 00U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-6、IL-12、IL-21、CD137抗体或其抗原结合片段、CD28抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、TNFα、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约500U/mL IL-6、至少约500U/mL IL-12、至少约200U/mL IL-21、至少约20μg/mL CD137抗体或其抗原结合片段、至少约10μg/mL CD28抗体或其抗原结合片段、至少约10μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约10pg/mL TNFα、至少约3％人血清、无血清培养基CTSTMOpTmizerTM和100U/mL 青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-1β、IL-2、IL-7、IL-21、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、LAG-3抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、TNFα、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约200U/mL IL-1β、至少约3000U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-7、至少约200U/mL IL-21、至少约500U/mL G-CSF、至少约500U/mL GM-CSF、至少约1000U/mL IFN-γ、至少约5μg/mL LAG-3抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约15pg/mL TNFα、至少约5％人血清、无血清培养基CTSTMOpTmizerTM和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、M-CSF、IFN-β、IFN-γ、TIGIT抗体或其抗原结合片段、CTLA-4抗体或其抗原结合片段、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约2500U/mL IL-2、至少约500U/mL IL-4、至少约500U/mL IL-12、至少约500U/mL GM-CSF、至少约300U/mL M-CSF、至少约200U/mL IFN-β、至少约800U/mL IFN-γ、至少约5μg/mL TIGIT抗体或其抗原结合片段、至少约10μg/mL CTLA-4抗体或其抗原结合片段、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、CD137抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、TNFα人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-7、至少约200U/mL IL-15、至少约800U/mL GM-CSF、至少约10μg/mL CD137抗体或其抗原结合片段、至少约20μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约20pg/mL TNFα、至少约5％人血清、无血清培养基X- VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-4、IL-10、IL-10、G-CSF、M-CSF、CD137抗体或其抗原结合片段、CD28抗体或其抗原结合片段、OX-40抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约2500U/mL IL-2、至少约500U/mL IL-4、至少约500U/mL IL-10、至少约250U/mL IL-10、至少约500U/mL G-CSF、至少约300U/mLM-CSF、至少约5μg/mL CD137抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL CD28抗体或其抗原结合片段、至少约10μg/mL OX-40抗体或其抗原结合片段、至少约10μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约5％人血清、无血清培养基AIM-V和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-7、IL-21、IFN-α、IFN-γ、CD137抗体或其抗原结合片段、CD28抗体或其抗原结合片段、OX-40抗体或其抗原结合片段、至少约LAG-3抗体或其抗原结合片段、CTLA-4抗体或其抗原结合片段、TNFα、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-7、至少约500U/mL IL-21、至少约500U/mL IFN-α、至少约800U/mL IFN-γ、至少约5μg/mL CD137抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL CD28抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL OX-40抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL LAG-3抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL CTLA-4抗体或其抗原结合片段、至少约10pg/mL TNFα、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-7、IL-15、IFN-β、IFN-γ、CD137抗体或其抗原结合片段、CD40抗体或其抗原结合片段、OX-40抗体或其抗原结合片段、TIGIT抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约500U/mL IL-7、至少约500U/mL IL-15、至少约250U/mL IFN-β、至少约1000U/mL IFN-γ、至少约5μg/mL CD137抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL CD40抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL OX-40抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL TIGIT抗体或其抗原结合片段、至少约15μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IFN-γ、CD137抗体或其抗原结合片段、CD28抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、TNFα、至少约5％人血清、无血清培养基CTSTMOpTmizerTM和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-7、至少约200U/mL IL-15、至少约500U/mL GM-CSF、至少约1000U/mL IFN-γ、至少约3μg/mL CD137抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL CD28抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约10pg/mL TNFα、至少约5％人血清、无血清培养基CTSTMOpTmizerTM和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-7、IL-12、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CD28抗体或其抗原结合片段、CD40抗体或其抗原结合片段、TIGIT抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、TNFα、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-7、至少约300U/mL IL-12、至少约300U/mL G-CSF、至少约200U/mL GM-CSF、至少约500U/mL IFN-α、至少约500U/mL IFN-γ、至少约3μg/mL CD28抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL CD40抗体或其抗原结合片段、至少约2.5μg/mL TIGIT抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约10pg/mL TNFα、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-7、PD-1抗体或其抗原结合片段、RRx-001、CAL-101、人血清、无血清培养基CTSTMOpTmizerTM和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约1000U/mL IL-7、至少约50μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约3μM RRx-001、至少约1.5μM CAL-101、至少约5％人血清、无血清培养基CTSTMOpTmizerTM和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-10、IL-18、LAG-3抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、Sunitinib、Imatinib、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约2500U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-10、至少约200U/mLIL-18、至少约10μg/mL LAG-3抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约3μM Sunitinib、至少约5μM Imatinib、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-1β、IL-6、GM-CSF、M-CSF、CNI-1493、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-1β、至少约500U/mL IL-6、至少约500U/mL GM-CSF、至少约500U/mL M-CSF、至少约5μM CNI-1493、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-9、IL-10、IL-21、GM-CSF、OX40抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、Sunitinib、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约2000U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-9、至少约200U/mL IL-10、至少约500U/mL IL-21、至少约500U/mL GM-CSF、至少约5μg/mL OX40抗体或其抗原结合片段、至少约36μ g/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约1.5μM Sunitinib、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-6、IL-12、CD28抗体或其抗原结合片段、OX-40抗体或其抗原结合片段、CTLA-4抗体或其抗原结合片段、TNFα、Imatinib、人血清、无血清培养基CTSTMOpTmizerTM和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约2500U/mL IL-2、至少约500U/mL IL-6、至少约1000U/mL IL-12、至少约10μg/mL CD28抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL OX-40抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL CTLA-4抗体或其抗原结合片段、至少约15pg/mL TNFα、至少约5μM Imatinib、至少约5％人血清、无血清培养基CTSTMOpTmizerTM和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-7、IL-15、CD137抗体或其抗原结合片段、CD28抗体或其抗原结合片段、LAG-3抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、Dasatinib、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约200U/mL IL-7、至少约300U/mL IL-15、至少约12μg/mL CD137抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL CD28抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL LAG-3抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约3μM Dasatinib、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-6、IL-12、G-CSF、M-CSF、IFN-β、IFN-γ、CTLA-4抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、Dasatinib、LYC-55716、GNE-1858、人血清、无血清培养基X-VIVO 15和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约3000U/mL IL-2、至少约500U/mL IL-6、至少约500U/mL IL-12、至少约1000U/mL G-CSF、至少约500U/mL M-CSF、至少约500U/mL IFN-β、至少约800U/mL IFN-γ、至少 约3μg/mL CTLA-4抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、至少约2.5μM Dasatinib、至少约10μM LYC-55716、至少约4.5nM GNE-1858、至少约5％人血清、无血清培养基X-VIVO 15和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-1α、IL-9、GM-CSF、CD137抗体或其抗原结合片段、CD28抗体或其抗原结合片段、LAG-3抗体或其抗原结合片段、TIGIT抗体或其抗原结合片段、CNI-1493、亚甲基蓝、TWS119、人血清、无血清培养基AIM-V和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括至少约2500U/mL IL-2、至少约500U/mL IL-1α、至少约500U/mL IL-9、至少约800U/mL GM-CSF、至少约3μg/mL CD137抗体或其抗原结合片段、至少约3μg/mL CD28抗体或其抗原结合片段、至少约5μg/mL LAG-3抗体或其抗原结合片段、至少约2.5μg/mL TIGIT抗体或其抗原结合片段、至少约2.5μM CNI-1493、至少约1μM亚甲基蓝、至少约5μM TWS119、至少约5％人血清、无血清培养基AIM-V和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
在本申请中，所述的种子细胞培养基可以包括IL-2、IL-1α、IL-12、IL-21、G-CSF、M-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、CD28抗体或其抗原结合片段、CD40抗体或其抗原结合片段、LAG-3抗体或其抗原结合片段、PD-1抗体或其抗原结合片段、CNI-1493、Dasatinib、GNE-1858、亚甲基蓝、人血清、无血清培养基AIM-V和青霉素-链霉素混合液PS双抗。
例如，所述的种子细胞培养基可以包括约3000U/mL IL-2、约200U/mL IL-1α、约500U/mL IL-12、约500U/mL IL-21、约300U/mL G-CSF、约800U/mL M-CSF、约500U/mL IFN-α、约300U/mL IFN-β、约300U/mL IFN-γ、约3μg/mL CD28抗体或其抗原结合片段、约5μg/mL CD40抗体或其抗原结合片段、约5μg/mL LAG-3抗体或其抗原结合片段、约3μg/mL PD-1抗体或其抗原结合片段、约3μM CNI-1493、约2μM Dasatinib、约5nM GNE-1858、约1.5μM亚甲基蓝、约5％人血清、无血清培养基AIM-V和100U/mL青霉素-链霉素混合液PS双抗。
另一方面，本申请提供了本申请所述的种子细胞培养基培养获得的肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞或其细胞群。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包括本申请所述的肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞或其细胞群和药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了所述的肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞或其细胞群和本申请所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
本申请所述种子细胞培养基可以适用于扩增源自不同种类的癌症的肿瘤浸润淋巴细胞。本申请所述的种子细胞培养基对于癌症种类具有广谱性和普适性。在某些情况下，所述种子细胞培养基可以适用于培养源自不同种类的癌症的肿瘤浸润淋巴细胞，可以适用于获得源自不同种类的癌症的肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞或其细胞群。在某些情况下，本申请所述的种子细胞培养基和/或本申请所述的药物组合物可以用于制备治疗癌症的药物。在本申请中，所述癌症可以包括：宫颈癌(例如，可以包括复发的宫颈癌)、卵巢癌、盆腔低分化腺癌、肠癌(例如，可以包括发生了转移，例如肝转移的肠癌)、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌和/或子宫内膜间质肉瘤。例如，所述癌症可以选自下组：黑色素瘤、胶质瘤、胃癌、肺癌、胃肠道间质瘤、肠癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜间质肉瘤、盆腔低分化腺和胆管癌。
另一方面，本申请提供了一种所述的种子细胞培养基在扩增肿瘤浸润淋巴细胞中的应用。
另一方面，本申请提供了一种培养肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞的方法，其包括以下的步骤：在本申请所述的种子细胞培养基中培养分离的肿瘤浸润淋巴细胞。
另一方面，本申请提供了一种扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其包括以下的步骤，在本申请所述的种子细胞培养基中培养分离的肿瘤浸润淋巴细胞，获得所述肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞。
例如，所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞可以来源于选自下组的样本：有需要的受试者的腹水、手术切除原发灶样本、同时性和异时性手术切除转移灶样本、穿刺样本和体液。
例如，所述体液可以包括血液、组织液、淋巴液和/或体腔积液。例如， 所述体液可以包括腹腔积液(例如可以为胃癌患者的腹腔积液、或者乳腺癌患者的腹腔积液)和/或胸腔积液(例如可以为子宫内膜间质肉瘤患者的胸腔积液)。
例如，所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞可以来源于选自下组的肿瘤：黑色素瘤、胶质瘤、胃癌、肺癌、胃肠道间质瘤、肠癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜间质肉瘤、盆腔低分化腺癌和胆管癌例如，所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞可以来源于选自下组的癌症的肿瘤组织：宫颈癌(例如，可以包括复发的宫颈癌)、卵巢癌、盆腔低分化腺癌、肠癌(例如，可以包括发生了转移，例如肝转移的肠癌)、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌和/或子宫内膜间质肉瘤。
例如，所述分离的肿瘤浸润淋巴细胞可以来自肿瘤组织被切割后的组织块，所述肿瘤组织被切割后的组织块的直径为约1mm-约10mm，例如，可以是约2mm-约10mm、约3mm-约10mm、约4mm-约10mm、约5mm-约10mm、约6mm-约10mm、约7mm-约10mm或者约8mm-约10mm。
例如，所述培养的时间可以为约3-20天。例如，所述培养时间可以为约3-15天，例如，可以为约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天或者约20天。
例如，所述培养的温度可以为约30-42℃。例如，可以为至少约30℃、至少约31℃、至少约32℃、至少约33℃、至少约34℃、至少约35℃、至少约36℃、至少约37℃、至少约38℃、至少约39℃、至少约40℃、至少约40℃或者至少约42℃。
例如，所述培养的CO2浓度为约1％-10％，例如，可以为至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％或者至少约10％。
在本申请中，使用本申请所述的种子细胞培养基，可以显著提高肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞的细胞活性(例如，可以显著提高肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞的细胞总数，例如，可以使肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞的数量达到至少约108数量级；例如，可以显著提高肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞 的细胞活率，例如，可以使肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞的细胞活率达到至少约85％；例如，可以显著提高肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞分泌细胞因子(例如IFN-γ)的数量)。在本申请中，使用本申请所述的种子细胞培养基，可以显著提高肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞中CD3+细胞的比例。
在本申请中，使用本申请所述的种子细胞培养基，可以显著提高肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞的在回输至供体受试者(例如肿瘤患者)后部分回输产品TIL的TCR克隆的频率在供体受试者外周血中有显著的大幅提升，并且供体受试者外周血的TCR组库与TIL回输产品的TCR组库的相似度也显著升高，并能长时间保持不变。此外，供体受试者在进行了经本申请所述的种子细胞培养基培养的TIL细胞的自体回输后，其体内的淋巴细胞能够产生较为活跃的增殖。
所述TIL种子细胞培养基的细胞因子还可具有如下特征：所述细胞因子包括IL-7；所述IL-7的浓度例如为约5-约100ng/mL。所述细胞因子包括IL-15；所述IL-15的浓度例如为约5-约100ng/mL。所述细胞因子包括肿瘤坏死因子TNF，例如TNFα；所述TNFα的浓度例如为约10-约100pg/mL。所述细胞因子包括集落刺激因子，例如GM-CSF；所述GM-CSF的浓度例如为约200-约5000U/mL。所述细胞因子包括干扰素，例如IFN-γ；所述IFN-γ的浓度例如为约10-约1000ng/mL。所述细胞因子还包括选自下组的白细胞介素：IL-4、IL-12、IL-21和IL-10。
所述TIL种子细胞培养基的免疫检查点抗体还可具有如下特征：所述PD-1抗体或其抗原结合片段为人PD-1抗体或其抗原结合片段；所述PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度例如为约10-约100μg/mL。所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段包括CD137抗体或其抗原结合片段，例如人CD137抗体或其抗原结合片段；所述CD137抗体或其抗原结合片段的浓度例如为约1-约100μg/mL。所述免疫检查点抗体或其抗原结合片段包括CD28抗体或其抗原结合片段，例如人CD28抗体或其抗原结合片段；所述CD28抗体或其抗原结合片段的浓度例如为约1-约10μg/mL。
所述TIL种子细胞培养基的细胞培养成分还可具有如下特征：血清培养基包括血清，例如人AB血清；所述血清的浓度例如为约1-约10％(v/v)。 所述血清培养基包括AIM-V培养基。所述无血清培养基包括X-VIVO培养基和MHM-C培养基。
所述TIL种子细胞培养基的细胞培养成分还可具有如下特征：无血清培养基包括血小板，例如对象自体血液来源的血小板或异体血液来源的血小板；所述血小板的密度例如为约0.5x10
8/mL-约3x10
8/mL。所述无血清培养基包括X-VIVO培养基和MHM-C培养基。
所述TIL种子细胞培养基还可包括M2型巨噬细胞抑制剂，所述M2型巨噬细胞抑制剂可包括RRx001和/或CNI-1493。所述M2型巨噬细胞抑制剂的浓度为约0.1-约100μM。所述TIL种子细胞培养基还可包括调控T细胞(Treg)抑制剂，所述调控T细胞抑制剂包括CAL-101、达沙替尼(dasatinib)、伊马替尼(imatinib)和/或帕比司他(Panobinostat)。所述调控T细胞抑制剂的浓度为约0.1-约100μM。所述TIL种子细胞培养基还可包括骨髓来源的抑制性细胞抑制剂，所述骨髓来源的抑制性细胞抑制剂包括AG490、地西他滨(decitabine)、舒尼替尼和/或BBI608。所述骨髓来源的抑制性细胞抑制剂的浓度为约0.1-约100μg/mL。
本发明还提供本文所述的用于扩增TIL细胞的培养组合物在制备扩增TIL细胞的培养基或含有TIL细胞的药物中的应用。本发明还提供本文所述的用于扩增TIL细胞的培养基在制备含有TIL细胞的药物中的应用。这些药物用于治疗与从中获得TIL细胞的肿瘤组织相关的癌症。
本发明还提供扩增TIL细胞群的方法，包括用含有本文所述的TIL细胞培养组合物的培养基孵育TIL细胞群。所述孵育持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天；和/或所述孵育持续至多20天、至多15天、至多14天、至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天。所述孵育的条件本领域周知，例如约30-42℃、约1％-10％的CO
2。
本发明还提供一种制备TIL细胞群的方法一，包括：
(1)用TIL种子细胞培养基孵育肿瘤组织，获得第一TIL细胞群，
(2)用本文所述的培养基孵育第一TIL细胞群，获得第二TIL细胞群。
本发明还提供一种制备TIL细胞群的方法二，包括：
(1)用TIL种子细胞培养基孵育含肿瘤细胞的组织，获得第一TIL细胞群，
(2)将(1)中所述第一TIL细胞群接触前述培养组合物中的与基质偶联的抗体中的任一种或几种，获得第二TIL细胞群，
(3)将(2)中所述第二TIL细胞群转移至含有前述培养组合物中除与基质偶联的抗体以外的组分中的任一种或多种的培养基中培养，获得第三TIL细胞群。
所述方法一和方法二的所述第二TIL细胞群具有10
10-10
11以上TIL细胞。通常，所述肿瘤组织需经预处理，包括洗涤、碎片化和/或解离肿瘤组织。所述碎片化和/或解离肿瘤组织的方法可以为机械切割的方式或酶消化。所述肿瘤组织通机械切割的方式形成的碎片化的组织块的大小可以为任何常规的便于后续培养和进一步处理的大小，任选地，为2×2×2mm
3、3×3×3mm
3、4×4×4mm
3、5×5×5mm
3或6×6×6mm
3。
为了诱导TIL细胞，所述方法一和方法二的步骤(1)的孵育持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天；和/或，步骤(1)的孵育持续至多20天、至多15天、至多14天、至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天。为了扩增足够数量的TIL细胞，所述方法一的步骤(2)的孵育持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天；和/或，所述方法一的步骤(2)的孵育持续至多20天、至多15天、至多14天、至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天。所述孵育的条件本领域周知，例如约30-42℃、约1％-10％的CO
2。
所述方法二的步骤(2)中，所述与基质偶联的抗体包括选自CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、CD40抗体、OX-40抗体和GITR抗体中的任一种或几种。优选地，包括选自CD3抗体、CD28抗体和CD137抗体中的任一种或几种。所述基质包括选自多孔板、细胞培养皿、细胞培养袋和磁珠中的任 一种或多种。所述偶联为共价偶联或非共价偶联，使上述抗体能够固定在基质上即可。例如，所述基质可以为细胞培养皿或细胞培养袋，所述偶联可以通过将含有上述抗体的母液对细胞培养器皿或细胞培养袋的底部或内壁进行孵育来包被，经过包被预处理后，形成附着于培养器皿底部的固定在基质上的抗体。优选地，上述抗体为激活型抗体。
所述方法二的步骤(2)中，所述接触优选地为所述方法二步骤(1)所述第一TIL细胞群同与基质偶联的抗体一起孵育，所述孵育的温度为30-42℃，优选地，为37℃。优选地，所述孵育的CO
2浓度为5％。所述孵育优选地为在含有前述培养组合物中除与基质偶联的抗体以外的组分中的任一种或多种的培养基中进行。任选地，所述含有前述培养组合物中除与基质偶联的抗体以外的组分中的任一种或多种的培养基包括以下组分组合中的任一种或几种：1)IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体；2)IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、IL-21、IL-12和GM-CSF；3)IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、GITR抗体和TWS119；4)IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、TIGIT抗体和GM-CSF；5)IL-2、IL-7、IL-15、LAG3抗体、IL-21、IL-12和GITR抗体；6)IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、TIGIT抗体、CD40抗体、OX-40抗体和自体血小板；7)IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、CTLA-4抗体、CD137抗体、GITR抗体、GM-CSF、TWS119和异体血小板。所述接触持续1-3天，例如持续1天、持续2天、持续3天。
方法二的步骤(2)中，所述第一TIL细胞群的密度为1.0×10
5/mL～1.0×10
6/mL；优选地，为2.0×10
5/mL～1.0×10
6/mL；更优选地，为2.5×10
5/mL～3.5×10
6/mL。任选地，为1.0×10
5/mL、2.0×10
5/mL、2.5×10
5/mL、3.0×10
5/mL、3.5×10
5/mL、4.0×10
5/mL、4.5×10
5/mL、5.0×10
5/mL、5.5×10
5/mL、6.0×10
5/mL、6.5×10
5/mL、7.0×10
5/mL、7.5×10
5/mL、8.0×10
5/mL、8.5×10
5/mL、9.0×10
5/mL、9.5×10
5/mL或10×10
6/mL。
所述方法二的步骤(3)中，所述培养持续至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天；或，持续至多20天、至多15天、至多14天、至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、 至多6天、至多5天。所述培养的温度为30-42℃，优选地，为37℃。所述培养的CO
2浓度为5％。
所述方法一和方法二的步骤(1)中，所述TIL种子细胞培养基可以是前述TIL种子细胞培养基中的任一种。任选地，所述TIL种子细胞培养基可以包括以下组分的组合中的任一种：1)IL-2、IL-6、IL-21、IFN-γ、TIGIT抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；2)IL-2、IL-4、IL-10、IL-21、CD137抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；3)IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、CD137抗体、CD28抗体、PD-1抗体、血清、双抗和基础培养基；4)IL-1β、IL-2、IL-7、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、LAG3抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；5)IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、M-CSF、IFN-β、IFN-γ、TIGIT抗体、CTLA-4抗体、血清、双抗和基础培养基；6)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、CD137抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；7)IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、G-CSF、M-CSF、CD28抗体、OX-40抗体、PD-1抗体、血清、双抗和基础培养基；8)IL-2、IL-7、IL-15、IFN-γ、CD137抗体、CD40抗体、OX-40抗体、TIGIT抗体、PD-1抗体、血清、双抗和基础培养基；9)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IFN-γ、CD137抗体、CD28抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；10)IL-2、IL-7、IL-12、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CD28抗体、CD40抗体、TIGIT抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；11)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、PD-1抗体、RRx-001、CAL-101、血清、双抗和基础培养基；12)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、M-CSF、PD-1抗体、CNI-1493、血清、双抗和基础培养基；13)IL-2、IL-7、IL-15、CD137抗体、CD28抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、达沙替尼、血清、双抗和基础培养基；14)IL-2、IL-6、IL-12、G-CSF、M-CSF、IFN-β、IFN-γ、CTLA-4抗体、PD-1抗体、达沙替尼、LYC-55716、GENE-1858、血清、双抗和基础培养基；15)IL-1α、IL-2、IL-9、IL-15、GM-CSF、CD137抗体、CD28抗体、LAG3抗体、TIGIT抗体、CNI-1493、血清、双抗和基础培养基；16)IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、G-CSF、M-CSF、IFN-γ、CD28抗体、CD40抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、CNI-1493、达沙替尼、GNE-1858、血清、双抗和基础培养基。优 选地，所述TIL种子细胞培养基可以包括以下组分的组合中的任一种：1)IL-2、IL-6、IL-21、IFN-γ、TIGIT抗体、PD-1抗体、TNF-α、人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；2)IL-2、IL-4、IL-10、IL-21、CD137抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、TNF-α、人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；3)IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、CD137抗体、CD28抗体、PD-1抗体、人AB血清、PS双抗和CTS
TMOpTmizer
TM；4)IL-1β、IL-2、IL-7、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、LAG3抗体、PD-1抗体、TNF-α、人AB血清、PS双抗和CTS
TMOpTmizer
TM；5)IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、M-CSF、IFN-β、IFN-γ、TIGIT抗体、CTLA-4抗体和人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；6)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、CD137抗体、PD-1抗体、TNF-α、人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；7)IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、G-CSF、M-CSF、CD28抗体、OX-40抗体、PD-1抗体、人AB血清、PS双抗和AIM-V培养基；8)IL-2、IL-7、IL-15、IFN-γ、CD137抗体、CD40抗体、OX-40抗体、TIGIT抗体、PD-1抗体、人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；9)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IFN-γ、CD137抗体、CD28抗体、PD-1抗体、TNF-α、人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；10)IL-2、IL-7、IL-12、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CD28抗体、CD40抗体、TIGIT抗体、PD-1抗体、TNF-α、人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；11)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、PD-1抗体、RRx-001、CAL-101、人AB血清、PS双抗和CTS
TMOpTmizer
TM；12)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、M-CSF、PD-1抗体、CNI-1493、人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；13)IL-2、IL-7、IL-15、CD137抗体、CD28抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、达沙替尼、人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；14)IL-2、IL-6、IL-12、G-CSF、M-CSF、IFN-β、IFN-γ、CTLA-4抗体、PD-1抗体、达沙替尼、LYC-55716、GENE-1858、人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；15)IL-1α、IL-2、IL-9、IL-15、GM-CSF、CD137抗体、CD28抗体、LAG3抗体、TIGIT抗体、CNI-1493、人AB血清、PS双抗和X-VIVO 15培养基；16)IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、G-CSF、M-CSF、IFN-γ、CD28抗体、CD40抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、CNI-1493、达沙替尼、GNE-1858、人AB血清、PS双抗 和AIM-V培养基。
由本发明方法制备得到的TIL细胞群可用于制备用于治疗癌症的药物。因此，本发明还包括含有本文任一实施方案所述的方法获得的TIL细胞群，以及药学上可接受的辅料的药物组合物。本文中，药学上可接受的辅料是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体、稀释剂和/或赋形剂，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂和防腐剂。更具体而言，合适的药学上可接受的辅料可以是本领域常用于TIL细胞回输(例如静脉输注)的辅料。
通常，药物组合物中含有治疗有效量的TIL细胞。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。
本发明还提供一种细胞冻存制剂，包括前述由本文任一实施方案所述的方法获得的TIL细胞群和冻存液。
本文中的冻存液可以是组织冻存液或细胞冻存液，能够使本发明的TIL细胞在低温条件下，如在干冰冻存或液氮冻存的条件下保持活力。优选地，所述冻存液可以是无血清冻存液，在所述细胞冻存制剂从低温复苏后无需去除即可直接对个体进行回输而对个体无明显毒副作用。
本发明还包括一种细胞疗法，包括利用本文所述方法制备TIL细胞，和给对象施用所述TIL细胞。例如，施用的TIL细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。另外，TIL细胞介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
实施例1：配制培养基
使用如下的组分制备TIL种子细胞培养基。
GITR抗体由金斯瑞合成(序列来自CN103951753B中SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105)。
按表1-表3配制不同TIL细胞培养基。基础培养基按中按比例加入血清和双抗后可以放置于4℃储存不超过1个月。使用前培养基先从4℃取出，放置于37℃水浴预热，然后在使用前加入其他组分(各类白细胞介素、集落刺激因子、干扰素、TNF-α、各类抗体及其他分子)至工作浓度后用于TIL细胞培养。表3中“包被”所对应的组分(CD3 mAb、CD28 mAb和CD137 mAb)不以溶液组分的形式存在于培养基中，而是在细胞培养开始前将含有这些组分的母液对细胞培养器皿，如多孔板、平皿或细胞培养袋的底部或内 壁进行孵育，经过包被预处理后，形成附着于培养器皿底部的固定在基质上的组分。所述包被预处理的方式可以为本领域内所公知的常规蛋白包被操作。例如，一种具体处理方式为，将待包被组分CD3 mAb、CD28 mAb和/或CD137 mAb用PBS配制成包被母液，其中所包含的每种组分的浓度均为5μg/mL，将包被母液加入到上述细胞培养器皿中，保证细胞培养器皿的底部或内壁被包被母液完全覆盖后，4℃孵育过夜，然后弃去包被母液，PBS洗涤5遍后待用。表3中的自体血小板的血液来源为患者自身血液，异体血小板的血液来源为健康成年人血液，血小板的制备根据CN105107233B公开的制备方法进行，此处通过引用全文纳入本申请。以下培养基中所用到的部分细胞因子的质量-活性换算关系为IL-7：1mg＝1.21×10
7U；IL-15：1mg＝1.14×10
7U；IL-12：1mg＝1.02×10
7U；IL-21：1mg＝1.07×10
7U
表1，TIL细胞培养基1-9
表2，TIL细胞培养基10-18
表3，TIL细胞培养基19-24
实施例2：患者实体肿瘤样本处理与TIL细胞培养
1)配制含有终浓度100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和50μg/mL庆大霉素的生理盐水待用；
2)在二级生物安全柜中无菌环境下将获得的新鲜分离的肿瘤患者的肿瘤组织样本置于已加入30mL步骤1)配制的生理盐水的10cm培养皿中洗涤，再转移至新的加入30mL步骤1)配制的生理盐水的10cm皿中洗涤，共重复洗3次；
3)用无菌手术刀片剔除脂肪组织与坏死组织，将肿瘤组织切割成为直径3×3×3mm
3的小块，取2个G-REX100培养罐(购自Wilsonwolf)，每个G-REX100培养罐中放置42块随机选取的肿瘤组织块，培养罐中加入实施例1所制备的TIL培养基中的一种作为种子细胞培养基；多余的肿瘤组织块用CryoStor10(购自BioLifeSolutions)冻存液通过程序降温仪液氮冻存；
4)3)中含有肿瘤组织块的G-REX100培养罐中加入1L种子细胞培养基后，对肿瘤组织块37℃5％CO
2进行培养，每隔4天移除一半体积的旧种子细 胞培养基，补加一半体积的新鲜种子细胞培养基，第11-15天离心收获TIL种子细胞后统计细胞总数与活率；
5)a:对于所有组分均为培养基溶液组分的扩大培养基(对应表2-表3中编号18和22的培养基)，向G-REX500M培养罐(购自Wilsonwolf)中加入5L预热好的扩大培养基，将步骤4)获得的种子细胞按照2.0×10
5/cm
2～5.0×10
5/cm
2的接种密度接种，37℃5％CO
2进行培养，每隔4天进行细胞计数后，移除一半体积的旧扩大培养基，补加一半体积的新鲜扩大培养基，待每个G-REX500M罐中的细胞总数达到1.0×10
10后，按1﹕2比例进行分瓶，每瓶补加新鲜扩大培养基至5L后继续培养。在扩大培养基中前后总共培养12-15天后收获细胞，获得TIL产品细胞；
b:对于部分组分如前所述采取事先包被处理的扩大培养基(对应于表2-表3中编号17、19、20、21、23、24的培养基)，取4)中收获的种子细胞，用含有除包被组分外的所有其他相应溶液中组分的扩大培养基重悬至1.0×10
5/mL～1.0×10
6/mL，加入到经过包被组分包被预处理的细胞培养器皿中，37℃5％CO
2激活2-3天，然后将激活后的细胞离心收集，接种至加入有已事先预热的扩大培养基的G-REX500M培养罐中，G-REX500M培养罐中的扩大培养基同为含有除包被组分外的所有其他相应溶液中组分的扩大培养基。每个G-REX500M中扩大培养基体积为5L。激活后的种子细胞按照2.0×10
5/cm
2～5.0×10
5/cm
2的接种密度接种，37℃5％CO
2进行培养，每隔4天进行细胞计数后，移除一半体积的旧扩大培养基，补加一半体积的新鲜扩大培养基，待每个G-REX500M罐中的细胞总数达到1.0×10
10后，按1﹕2比例进行分瓶，每瓶补加新鲜扩大培养基至5L后继续培养。在G-REX500M培养罐的扩大培养基中前后总共培养10-12天后收获细胞，获得TIL产品细胞；
6)取5)中收获的流式细胞仪检测收获的产品细胞的表型，并用HTRF IFN-γ检测试剂盒(Cisbio Human IFN gamma kit货号：62HIFNGPET)根据说明书记载的方法检测IFN-γ分泌水平。
以下表4所示为肿瘤组织样本编号、癌种、培养过程中所使用的种子细胞培养基和扩大培养基对应于表1-表3中的编号、每个组织样本种子细胞培养基和扩大培养基各自的培养时长以及G-REX500M细胞接种密度；表5所 示为步骤5)b中，相应肿瘤组织样本的包被器皿类型、包被激活重悬细胞密度和包被激活时长。
表4，TIL细胞来源组织样本信息及使用培养基对应编号
表5，部分样本TIL种子细胞包被刺激条件
245mm细胞培养皿购自Corning(Cat.431111)，细胞培养袋购自Takara(CultiLife
TM 215 Culture Bag,Cat.FU0005)。上述TIL产品细胞的制备全过程均在GMP级生产车间中按照相关法规要求进行。收获细胞后离心，D-PBS洗涤，重悬于生理盐水，经过质控检测(CD3+比例、CD4+及CD8+比例、IFN-γ分泌水平、无菌、内毒素、渗透压等)各项指标符合《中华人民共和国药典》要求或国内外已上市免疫细胞治疗产品的相对应一般标准后放行。
结果如表6及图1-图17所示。表6所示为使用本发明的培养基和培养方法从表4中各组织样本中培养获得的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的种子细胞数、 产品细胞数，产品细胞活率、产品细胞表型和产品细胞的IFN-γ分泌水平。图1-图17分别对应编号为T001、T002、T003、T004、T005、T006、T007、T008、T009、T010、T011、T012、T013、T014、T015、T016、T017的组织样本来源的TIL产品细胞的流式细胞表型分析结果。
表6，不同来源组织TIL细胞培养结果
表6的结果显示，使用本申请各组种子细胞培养基进行培养的实体瘤组织在12天收货时均能获得达到至少10
8左右的细胞总数，从部分肿瘤样本更能获得总数高达超过2×10
8和超过3×10
8的TIL种子细胞，如T002、T010和T013。各组种子细胞经过本申请的各组不同的扩大培养基培养后，在最终24天左右收获时均能获得10
10-10
11数量级的TIL产品细胞，其中绝大部分都在10
11数量以上。所有组别所收获的TIL产品细胞的成活率均较高，除极个别样本外绝大部分都超过90％，并且部分接近99％，如T005、T008和T013，并且经检测各组TIL产品细胞的IFN-γ分泌量也都处于较高的水平，说明用本申请的培养基和培养方法所获得的所有TIL产品细胞都处于较高的活化状态。图1-图17显示，所有组别TIL产品细胞均为高纯度淋巴 细胞，其CD45
+细胞占比均为100％或接近100％。所有TIL产品细胞中，CD3
+细胞占比最低为接近80％(79.25％)，切绝大部分组别TIL产品细胞中CD3
+细胞占比都超过90％，部分组别接近100％(如T006、T013、T002、T015)。全部组别样本TIL产品细胞中，大部分组别的CD3
+细胞群中CD8
+T细胞占比接近或超过50％，相对CD4
+T细胞具有绝对优势，如图3、4、5、6、8、10、13、14、15、16、17所示；部分组别的CD8
+T细胞和CD4
+T细胞占比接近1﹕1，如图2、9所示。以上结果表明，使用本申请各组种子细胞培养基和扩大培养基组合从不同肿瘤组织样本中培养获得TIL产品细胞具有优异的表型。
实施例3：T001来源的TIL对靶细胞的杀伤效果
选取胃癌细胞系HGC27(均购买于Merck Cat.94042256)作为靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2制备得到的T001组织来源的TIL产品细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μLDMEM或1640培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：HGC27细胞按每孔10
4个细胞/50μL铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养19h至细胞指数(Cell Index)接近1.0后，暂停step 2，加入效应细胞，每孔50μL，以TIL细胞活率比例分别按效靶比2﹕1、4﹕1和8﹕1添加效应细胞数量，开始step 3，继续共培养超过50h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图18所示，当效靶比为2﹕1时，与肿瘤细胞对照组相比，T001来源的TIL细胞已经表现出明显的对肿瘤细胞HGC27的杀伤效果。随着效靶比的提升，TIL细胞对HGC27的杀伤效果也明显提升。
实施例4：T002来源的TIL对靶细胞的杀伤效果
选取黑色素瘤细胞系A375(均购买于ATCC)作为靶细胞，应用艾森公 司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2制备得到的T002组织来源的TIL产品细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μLDMEM或1640培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：靶细胞A375按每孔10
4个细胞/50μL铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养20h至细胞指数(Cell Index)为1.5时，暂停step 2，加入效应细胞，每孔50μL，以TIL细胞活率比例分别按效靶比2﹕1、4﹕1和8﹕1添加效应细胞数量，开始step 3，继续共培养超过50h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图19所示，当效靶比为2﹕1时，与肿瘤细胞对照组相比，T002来源的TIL细胞已经表现出明显的对肿瘤细胞A375的杀伤效果。随着效靶比的提升，TIL细胞对A375的杀伤效果也明显提升。
实施例5：T003来源的TIL对靶细胞的杀伤效果
选取宫颈癌细胞系HeLa(均购买于ATCC)作为靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2制备得到的T003组织来源的TIL产品细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μL DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：靶细胞HeLa按每孔10
4个细胞/50μL铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养20h至细胞指数(Cell Index)为1.0时，暂停step 2，加入效应细胞，每孔50μL，以TIL细胞活率比例分别按效靶比2﹕1、4﹕1和8﹕1添加效应细胞数量，开始step 3，继续共培养超过50h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图20所示，当效靶比为2﹕1时，与肿瘤细胞对照组相比，T003 来源的TIL细胞已经表现出明显的对肿瘤细胞HeLa的杀伤效果。随着效靶比的提升，TIL细胞对HeLa的杀伤效果也明显提升。
实施例6：T005来源的TIL对靶细胞的杀伤效果
选取胃癌细胞系HGC27(均购买于Merck Cat.94042256)作为靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2制备得到的T005组织来源的TIL产品细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μL DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：靶细胞HGC27按每孔10
4个细胞/50μL铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养21h至细胞指数(Cell Index)为1.0左右时，暂停step 2，加入效应细胞，每孔50μL，以TIL细胞活率比例分别按效靶比2﹕1、4﹕1和8﹕1添加效应细胞数量，开始step 3，继续共培养超过50h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图21所示，当效靶比为2﹕1时，与肿瘤细胞对照组相比，T005来源的TIL细胞已经表现出较强的对肿瘤细胞HGC27的杀伤效果。并且随着效靶比的提升，TIL细胞对HGC27的杀伤效果未见进一步明显提升，表明低效靶比下T005来源的TIL细胞对靶细胞HGC27的杀伤效果即已经达到上限。
实施例7：T004来源的TIL对靶细胞的杀伤效果
选取胃癌细胞系HGC27(均购买于Merck Cat.94042256)作为靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2制备得到的T004组织来源的TIL产品细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μL DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：靶细胞HGC27按每孔10
4个细胞/50μL铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养 细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养21h至细胞指数(Cell Index)为1.5左右时，暂停step 2，加入效应细胞，每孔50μL，以TIL细胞活率比例分别按效靶比2﹕1、4﹕1和8﹕1添加效应细胞数量，开始step 3，继续共培养超过80h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图22所示，当效靶比为2﹕1时，与肿瘤细胞对照组相比，T004来源的TIL细胞对肿瘤细胞HGC27表现出一定的杀伤效果。随着效靶比的提升，TIL细胞对HGC27的杀伤效果也呈现出逐步的明显提升。
实施例8：TIL细胞对同源肿瘤类器官的杀伤效果
取实施例2中新鲜的T006肿瘤组织，按照已公开文献(Chiara M Cattaneo,Krijn K Dijkstra,Lorenzo F Fanchi,Sander Kelderman,Sovann Kaing,Nienke van Rooij,Stieneke van den Brink,Ton N Schumacher,Emile E Voest.Tumor organoid-T-cell coculture systems Nat Protoc.2020Jan；15(1):15-39.，该文献通过引用全文纳入本申请)第10页记载的方法对肿瘤组织进行处理后进行类器官(Patient-derived organoid，PDO)培养，培养所用试剂盒仪器均参照该公开文献的记载进行购买。取培养成功并传代2-3次的PDO按以下流程进行同源TIL细胞(T006TIL产品细胞)与PDO共培养和杀伤实验：
第1天：
1.取培养好的T006PDO体系，弃掉PDO培基，用适量预热后的分散酶(2mg/mL溶于PBS)处理PDO，用枪轻吹PDO，将PDO放置于37℃5-15min；避免出现单细胞；
2.将PDO转移到离心管中，每1mL分散酶加入100μL EDTA(0.5M)，补充PBS至10mL，离心；
3.用2mL PDO培养基将PDO转移到12孔板中，加入10μM Y-27632(购自MCE Cat.HY10071)避免失巢凋亡，37℃5％CO
2培养24小时；
第2天：
1.在PDO中加入200ng/mL的IFNγ过夜处理以增强抗原呈递；
2.将96孔平板上包被5μg/mL CD28mAb的PBS(每孔50μL)，4℃孵育 24小时；
3.在24孔G-REX中铺1×10
7个TIL细胞，加入150U/mL IL-2和20μg/mL PD1mAb过夜处理；
第3天：
1.从12孔板上收集PDO。将类器官和培养基的悬浮液转移到15毫升试管中。将总体积分成两个等分:1/11的总体积用于分离成单个细胞并进行计数，10/11的总体积用于实验；
2.将1/11酶解成单细胞。将PDO重悬于500μL TrypLE中，37℃孵育5-15分钟。每隔几分钟检查器官是否游离。当它们分解成单个细胞时就停止终止，记数；
3.用PBS清洗10/11 PDO 2次，将培养液中添加的IFN-γ清除；
4.在TIL细胞培养基(表1中8号培养基)中以1×10
5个/mL单细胞重悬类器官。加入PD-1mAb至浓度为40μg/mL和Y-27632至浓度为20μM；
5.收集TIL细胞，800g离心3min，用表1的8号培养基重悬；调整密度到5×10
5/mL；
6.将细胞数量均等分成2组，加入到96孔板中：
组1：100μL PDO+100μL 8号培养基；
组2：100μL PDO+100μL含有5×10
4TIL细胞的8号培养基；
组1和组2每组各做3个平行副孔。37℃培养48小时后，取各副孔中的TIL与PDO混合悬液酶消化为单细胞悬液，用肠癌细胞标志物EpCAM的流式抗体染肿瘤细胞，用染料试剂盒Zombie NIR
TM Fixable Viability Kit(购自Biolegend)染色区分死细胞与活细胞，染色后流式细胞仪检测。
结果如图23所示。**:p<0.01。在与同源的TIL细胞共培养48小时后，PDO+TIL组的EpCAM
+肿瘤细胞成活率与PDO+TIL培养基组相比显著减少。表明与T006肿瘤组织衍生培养获得的类器官能够被其同源配对的TIL细胞有效杀伤。
实施例9：T001组织样本来源TIL产品细胞对小鼠的细胞系来源肿瘤移
植物(Cell line-derived xenograft，CDX)肿瘤组织的杀伤效果
实验动物
选用免疫缺陷B-NDG小鼠(购自百奥赛图)作为CDX模型构建实验动物。
实验设计和分组：如下表7所示
表7，小鼠给药方案及分组
TIL细胞为实施例2制备的来源于组织样本T001的TIL产品细胞，尾静脉注射给药前将细胞离心重悬于PBS，制成细胞密度为2×10
7/mL PBS细胞悬液。
动物饲养
采购所需用量的B-NDG小鼠后，饲养于SPF级实验动物房，适应期7-10天。
环境：小鼠将被安置于动物房的透明树脂塑料笼中。鼠笼垫料为经高压灭菌的木屑和玉米芯垫料，定期更换。动物房间配备高效空气过滤器，温度将保持在20-26℃(68-79°F)之间，相对湿度为40-70％。持续观测并记录温度和湿度。照明条件为每天12小时日光灯照射和12小时无照明。
食物和饮水：实验用小鼠可无限量获取专用鼠粮(经辐照消毒，上海斯莱克实验动物责任有限公司，中国)，可无障碍在任何时间接近灭菌的洁净饮水。
肿瘤细胞接种
每只小鼠在右侧皮下接种HGC-27肿瘤细胞(按每只小鼠2×10
6细胞接种)，接种于0.1mL含有50％基质的培养基中，以促进肿瘤的生长。
动物分组及给药
待肿瘤体积达到～50mm
3左右时，将12只动物按肿瘤体积进行随机分组， n＝6，确保所有组在基线上具有可比性。分组当天记为P0。实验期间每周3次测定动物体重和肿瘤体积，每日进行观察动物的临床症状。肿瘤体积用mm
3表示，公式为:V＝0.5×a×b
2，其中a和b分别为肿瘤的长径和短径。
结果
实验结果如图24所示。组间肿瘤体积大小差异通过非配对双尾t检验进行统计学分析。*：p<0.05；**:p<0.01。图24结果表明，截止到给药后第23天，与注射PBS对照组荷瘤小鼠相比，TIL细胞给药组的小鼠肿瘤体积增长受到了非常显著的抑制，显示出T001来源的TIL产品细胞对胃癌肿瘤在体内具有非常明显的杀伤效果。
实施例10：T002组织样本来源TIL产品细胞对小鼠CDX肿瘤组织的杀
伤效果
实验动物
选用免疫缺陷B-NDG小鼠(购自百奥赛图)作为CDX模型构建实验动物。
实验设计和分组：如下表8所示
表8，小鼠给药方案及分组
TIL细胞为实施例2制备的来源于组织样本T002的TIL产品细胞，尾静脉注射给药前将细胞离心重悬于PBS，制成细胞密度为2×10
7/mL PBS细胞悬液。
肿瘤细胞接种
每只小鼠在右侧皮下接种黑色素瘤细胞A375(按每只小鼠2×10
6细胞接种)，接种于0.1mL含有50％基质的培养基中，以促进肿瘤的生长。
动物饲养、动物分组及给药与实施例9相同，
结果
实验结果如图25所示。组间肿瘤体积大小差异通过非配对双尾t检验进行统计学分析。*：p<0.05；**:p<0.01。图25结果表明，截止到给药后第22天，与注射PBS对照组荷瘤小鼠相比，TIL细胞给药组的小鼠肿瘤体积增长受到了非常显著的抑制，显示出T002来源的TIL产品细胞对黑色素瘤在体内具有非常明显的杀伤效果。
实施例11：T008组织样本来源TIL产品细胞对同源配对的病人来源肿瘤
移植物(Patient-derived xenograft，PDX)肿瘤组织的杀伤效果
实验动物
选用免疫缺陷B-NDG小鼠(购自百奥赛图)作为PDX模型构建实验动物。
实验设计和分组：如下表9所示
表9，小鼠给药方案及分组
TIL细胞为实施例2制备的来源于组织样本T008的TIL产品细胞，尾静脉注射给药前将细胞离心重悬于PBS，制成细胞密度为1×10
8/mL PBS细胞悬液。
动物饲养
采购所需用量的B-NDG小鼠后，饲养于SPF级实验动物房，适应期7-10天。
环境：小鼠将被安置于动物房的透明树脂塑料笼中。鼠笼垫料为经高压灭菌的木屑和玉米芯垫料，定期更换。动物房间配备高效空气过滤器，温度将保持在20-26℃(68-79°F)之间，相对湿度为40-70％。持续观测并记录温度和湿度。照明条件为每天12小时日光灯照射和12小时无照明。
食物和饮水：实验用小鼠可无限量获取专用鼠粮(经辐照消毒，上海斯莱克实验动物责任有限公司，中国)，可无障碍在任何时间接近灭菌的洁净饮水。
PDX模型的构建
1)患者肿瘤组织样本处理：取T008肿瘤组织一部分，无菌条件下剔除坏死部分组织、脂肪组织、结缔组织等，冲洗干净后用手术刀分割成若干5×5×5mm
3组织块，置于含肿瘤样本运输保存液UW中，准备用瘤块接种B-NDG小鼠；
2)肿瘤组织样本接种：取若干B-NDG小鼠，小鼠肩胛部备皮后用小鼠皮下肿瘤接种固定器固定小鼠，碘伏消毒，利多卡因局麻后用PDX模型瘤块接种套管针将1)中瘤块接种至右侧腹股沟部。接种当天记为P0，每周量瘤2次，肿瘤体积计算公式为:V＝0.5×a×b
2，其中a和b分别为肿瘤的长径和短径；
3)PDX组织传代：观察各接种小鼠肿瘤组织生长情况，等到有肿瘤组织体积长到超过300mm
3后，麻醉小鼠，取出瘤块，无菌条件下手术刀切割成5×5×5mm
3组织块后重复步骤2)，接种到新的小鼠右侧腹股沟部，等待PDX肿瘤的下一代生长；
4)重复步骤3)，继续传代2-3代后，取部分小鼠体内PDX组织进行组织切片病理分析，确定PDX组织仍然为人源组织(而非鼠源组织)后，按表9的实验计划中使用的小鼠数量的1.5倍继续用PDX组织接种小鼠(即PDX组织块接种24只鼠)，观察小鼠成瘤情况，每周量瘤2次，等待成瘤。
动物分组及给药
等PDX接种小鼠的肿瘤体积达到～50mm
3左右时，从24只动物中选取16只肿瘤体积合适的动物，按肿瘤体积进行随机分组，n＝8，确保所有组在基线上具有可比性。分组当天记为D0，按表9方案进行给药。实验期间每周3次测定动物体重和肿瘤体积，每日进行观察动物的临床症状。肿瘤体积用mm
3表示，肿瘤测量公式同上述。
结果
实验结果如图26所示。组间肿瘤体积大小差异通过非配对双尾t检验进 行统计学分析。*：p<0.05；**:p<0.01。图26结果表明，截止到给药后第40天，与注射PBS对照组荷瘤小鼠相比，TIL细胞给药组的小鼠肿瘤体积增长受到了非常显著的抑制，显示出T008来源的TIL产品细胞对与其来源患者相同的肿瘤PDX组织在体内具有非常明显的杀伤效果。
实施例12：T007组织样本来源TIL产品在同源配对的PDX小鼠体内的
肿瘤趋向性检测
1、从患者外周血PBMC分离制备T细胞
利用Ficoll分离法从T007组织样本对应的患者20mL的外周血中中分离获得外周血单核细胞(PBMCs)。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤。收获的T细胞用含200IU/mL IL-2、5％人AB血清的X-VIVO15重悬后，置于预先包被有CD3mAb和CD28mAb的细胞培养皿中，37℃、5％CO
2细胞培养箱活化3天，将细胞悬液转出至新的培养皿中培养，每隔1-2天更换新鲜培养基，直至培养获得至少1.0×10
8T细胞，后续实验待用。
2、制备整合表达荧光素酶的T细胞和TIL细胞
从吉凯基因购买表达荧光素酶基因的慢病毒颗粒，货号LVCON101。按以下步骤用表达荧光素酶的慢病毒转导1中制备的T007患者的外周血来源的T细胞(使用细胞数量：1×10
8)及实施例2中制备的T007肿瘤组织样本来源的TIL产品细胞(使用细胞数量：1×10
8)，具体步骤如下：
第一步：感染前准备，从冰箱取出病毒，冰上融化，将病毒用无FBS的DMEM稀释10倍。
第二步：感染操作，将T细胞和TIL细胞800g离心3min，细胞沉淀用无血清X-VIVO 15基础培养基重悬后，根据细胞MOI及病毒滴度，加入相应的病毒量，计算公式：病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度。按MOI值＝50感染外周血T细胞和TIL细胞，感染8-12h后补加人AB血清至终浓度5％v/v和终浓度至200IU/mL IL-2，继续培养24-48h。
第三步：细胞培养和传代，中途可以对细胞进行补液，保持细胞活性。
第四步：感染效果确认，感染后72h，取少量细胞加到96孔板中的一个孔中，同时加入20微升荧光素酶的底物荧光素加盐稀释液，通过小动物活体成像仪观测荧光情况。
结果显示T细胞和TIL细胞均能明显检测到荧光值，表明表达荧光素酶的慢病毒已经成功转导T007的T细胞和TIL细胞，分别记为T-Luc细胞和TIL-Luc细胞。
3、PDX模型的构建
参照实施例11中“PDX模型的构建”部分记载的方法，取部分T007肿瘤组织，构建基于免疫缺陷B-NDG小鼠的T007肿瘤组织的PDX模型，稳定传代2-3代病理检测确认仍然为人源而非鼠源PDX组织后准备根据实验需求对B-NDG鼠进行瘤块移植接种，瘤块接种部位为小鼠右侧腹股沟。
4、TIL细胞体内肿瘤趋向性检测
实验设计和分组如下表10所示：
表10，小鼠给药方案及分组
将2中制备的T-Luc细胞和TIL-Luc细胞离心，细胞沉淀用PBS重悬制成密度为1×10
8/mL的细胞悬液，对3组T007PDX荷瘤小鼠按表10的实验方案进行给药。给药后1天(D1)和10天(D10)分别对3组小鼠通过注射荧光素酶底物荧光素反应后再在小动物活体成像观测仪上进行活体荧光成像，观察T-Luc细胞和TIL-Luc细胞在荷瘤小鼠体内的分布情况。
结果如图27所示。图27显示，在尾静脉回输后1天，外周血来源的T细胞和TIL细胞经过血液循环后均在肺部有明显的富集。在回输10天后，荧光活体成像显示，T细胞和TIL细胞均有趋向肿瘤的趋势，但与外周血来源的T细胞相比，TIL细胞趋向肿瘤的趋势更加明显。
实施例13：TIL临床回输与体内TIL细胞增殖
为了验证本申请的培养方法所获得的TIL在临床上的安全性与有效性，开展了针对实体肿瘤的TIL回输治疗临床试验。本项临床试验已获得上海市第十人民医院伦理委员会批准通过，具体参见http://www.chictr.org.cn/，注册号：ChiCTR2100044705；或参见www.clinicaltrials.gov，注册号为NCT04766320。另外本项试验还与上海交通大学医学院附属同仁医院和苏州大学附属第二医院开展合作，www.clinicaltrials.gov注册号分别为NCT04967833和NCT04943913。
研究方案
1、受试者纳入、排除标准和分配入组方法
纳入标准：
1)18岁≤年龄≤75岁；
2)经病理诊断为恶性肿瘤原发/复发/转移的患者；
3)预期寿命>3个月；
4)Karnofsky≥60％或ECOG评分0—2分；
5)受试者目前经标准治疗失败，或无标准治疗方案；
6)受试者必须具有适用于穿刺或切除活组织的肿瘤区域或恶性积液可分离出TILs；
7)至少有1个可评估的肿瘤病灶；
8)白细胞计数≥2.5×10^9/L，中性粒细胞绝对计数≥1.5×10^9/L，血小板计数≥100x 10^9；血红蛋白≥90g/L；
9)血清肌酐清除率为50mL/min或更高；肌酐≤1.5×ULN；ALT(谷丙转氨酶)/AST(谷草转氨酶)＜正常组的3倍，有肝转移者＜正常组的5倍；总胆红素≤1.5×ULN；
10)活化部分凝血活酶时间(APTT)≤1.5×ULN；国际标准化比值(INR)≤1.5×ULN；
11)足够的静脉通道，无手术或穿刺术绝对或相对禁忌证；
12)具有生育潜力的受试者必须愿意在知情同意时开始实施经批准的高效避孕方法，并在淋巴清除方案完成后1年内持续实施；
13)任何针对恶性肿瘤的治疗方法，包括放疗、化疗及生物制剂，必须在取得TILs的28天前停止；
14)有足够的理解能力和自愿签署知情同意书；
15)具有良好的依从性，能够坚持研究访问计划和其他协议要求。
排除标准：
1)需要使用糖皮质激素治疗，每天剂量大于15毫克的泼尼松(或相当剂量的激素)；
2)自身免疫性疾病需要免疫抑制治疗；
3)血清肌酐>1.5×ULN；血清谷草转氨酶(SGOT)>5倍正常值上限；总胆红素>1.5×ULN；
4)第1秒用力呼气容积(FEV1)的<2L，肺一氧化碳弥散量(DLCO)(校正)＜40％
5)显著的心血管异常的下列任何一个定义：纽约心脏协会(NYHA)分级III或IV级充血性心脏衰竭，临床上显著的低血压，临床无法控制的高血压，不能控制的症状性冠状动脉疾病，或射血分数＜35％；严重的心脏节律或传导异常，如需要临床干预的室性心律失常、II-III度房室传导阻滞等；
6)患者有人类免疫缺陷病毒(HIV)感染或HIV抗体检；
测阳性，活动性乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染(HBsAg阳性和/或抗-HCV阳性)，梅毒感染或梅毒螺旋体抗体阳性；
7)严重的躯体或精神疾病；
8)血培养阳性或感染的影像学证据；
9)1个月内或正在接受其他药物，或其他的生物、化疗或放射治疗；
10)有由于和细胞治疗相似的化学或生物组成的化合物的过敏反应史；
11)曾接受免疫治疗并出现irAE等级≥3级；
12)既往抗肿瘤治疗的不良反应尚未恢复到CTCAE5.0版本等级评价≤1级(脱发等研究者判断无安全风险的毒性除外)；
13)妊娠期或哺乳期女性；
14)研究者认为受试者存在其他严重的系统性疾病史，或其他原因不适合参加本临床研究。
2、疗效评定标准
主要疗效指标：
1)客观缓解率(ORR)；
2)疾病控制率(DCR)；
3)缓解持续时间(DOR)；
4)无进展生存期(PFS)；
5)总生存期(OS)。
次要疗效指标：
1)临床疗效评价：完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病控制(SD)、疾病进展(PD)等；
2)治疗前后的生活质量变化。
疗效定义为研究者可以观察到的ORR，其按照RECIST1.1的标准。
3、不良事件的记录以及处理措施
3.1不良事件的定义
不良事件(AE)：自受试者签署知情同意书并入选试验开始，至最后一次医学随访之间出现的不良医学事件，可以表现为症状体征、疾病或实验室检查异常，但并不一定与治疗或试验药物有因果关系。
新的状况或原有状况的恶化视为AE。入选研究前原有的，并且在研究期间没有恶化的稳定慢性疾病，例如关节炎不视为AE。异常实验室检查结果、临床症状或体征经由研究者判断具有临床意义则视为AE。
严重不良事件(SAE)：指试验过程中出现的满足以下情形中一条或多条的不良事件：(1)导致死亡；(2)危及生命，指严重病人即刻存在死亡的风险，并非是指假设将来发展严重时可能出现死亡；(3)导致住院或住院时间延长；(4)永久或显著的功能丧失；(5)致畸、致出生缺陷；(6)其他重要医学事件。
3.2、不良事件严重程度判定标准
研究过程中发生的所有不良事件严重程度根据NCI-CTCAE 5.0版进行评价，分为1至5级：
1级：轻度；无症状或轻微；仅为临床或诊断所见；无需治疗。
2级：中度；需要较小、局部或非侵入性治疗；与年龄相当的工具性日常生活活动受限。
3级：严重或医学上有重要意义但不会立即危及生命；导致住院或者延长住院时间；致残；个人日常生活活动受限。
4级：危及生命；需要紧急治疗。
5级：与AE相关的死亡。
4、回输前预处理
在进行TIL细胞回输前，患者接受淋巴细胞预处理方案(羟氯喹600-800mg×1天，环磷酰胺20-25mg/kg/d×3天)，预处理方案使用的药物、剂量、天数(给药频次)，研究者会根据患者的实际情况进行判断调整。
定义回输当天为第0天。TIL细胞回输前，研究者需对患者进行如下化疗预处理(预处理后患者会出现白细胞减少，需要注意预防感染，如避免病房不必要的人员流动，患者佩戴口罩等)：
-5天静脉注射环磷酰胺(Cy)20-25mg/kg+口服羟氯喹(HCQ)600-800mg
-4天静脉注射环磷酰胺20-25mg/kg
-3天静脉注射环磷酰胺20-25mg/kg
-2、-1天患者休息
0天进行TIL细胞回输。
5、TIL细胞回输及疗效评估
在前述4回输前预处理完成后的第0天对患者进行回输，每位患者均进行单次回输，一次回输剂量为2×10
10-5×10
10个TIL细胞，回输的细胞制剂的细胞密度为1.0×10
8/mL～2.0×10
8/mL，回输的细胞制剂的体积为200mL-600mL。患者在第0天进行TIL细胞回输，回输后不施用任何细胞因子。回输后患者需要在院观察5-8天，观测并记录回输后患者的状况。在患者知情同意的前提下不同时间点抽取患者外周血检测PBMC的组成及变化，回输后1-3个月影像学进行效果评估。
6、TIL临床回输结果
目前为止共入组16例受试者。如下所示的表11记载了经过临床疗效评 估的其中11例患者的基本情况(评估时间在回输后1-3个月内不等)：
表11，肿瘤患者TIL细胞临床回输综合信息
16例受试者中，不良事件包括有1级寒战5例(31.3％)，1级发热7例(43.8％)，2级发热6例(37.5％)，所有症状均随时间延长而消失。除此以外未观察到其他不良事件。
T017患者经过影像学评估显示为肿瘤明显缩小，判定为部分缓解(PR)。对该名患者在TIL细胞回输前后的分别抽取外周血，检测部分肿瘤标志物的水平，对比结果如下表12所示。
表12，T017患者TIL细胞回输前后部分肿瘤标志物数值对比
表12的结果显示，T017患者在回输前，上述几项肿瘤标志物中除甲胎蛋白和CA199在正常范围外，其余各项均远超正常范围。在TIL回输后30天再次检测该名患者外周血中上述肿瘤标志物，可以发现超标的几项中除人附睾蛋白4略高于正常范围外，其余均已回归到或维持在正常范围。
图28显示了T009患者在TIL细胞回输后的影像学评估结果。核磁成像结果显示，回输前的肿瘤病灶大小约3cm。与回输前相比，该名患者在TIL回输后6周时肿瘤病灶即已明显缩小(当时判定为部分缓解，PR)。回输10周后，肿瘤通过影像学已无法检测到，根据RECIST 1.1指针标准判定为完全缓解(CR)。
患者在回输前至回输后120天的时间内在多个不同的时间点均进行了采血和血常规检测。在T009患者知情同意的前提下，对该名患者在TIL回输当天回输前(D0)及回输后第2、7、11、13、17、24、29、31、43、49、53和59天(D2、D7、D11、D13、D17、D24、D29、D31、D43、D49、D53和D59)抽取的外周血通过Ficoll密度梯度离心法从中分离获得PBMC后，使用Trizol(Life Technologies)裂解细胞，对细胞裂解液抽提RNA，进行TCRβ链CDR3区的RNA测序(TCR-seq，杭州艾沐蒽生物科技有限公司)，同时也对用于给患者临床回输的T009TIL产品细胞进行TCRβ链CDR3区的TCR-seq，获得不同时间点外周血PBMC以及回输的TIL产品细胞的TCRβ链CDR3文库。通过将通过TCR-seq获得的D0、D2、D7、D11、D13、D17、D24、D29、D31、D43、D49、D53、D59的TCRβ链CDR3文库分别与TIL产品细胞的TCRβ链CDR3文库进行比较后，找到的交集部分TCR即为TIL回输前后不同时间点(D2、D7、D11、D13、D17、D24、D29、D31、D43、D49、D53和D59)患者外周血中回输的TIL细胞的克隆型对应的TCR。
图29显示了患者从回输前到回输后近120天时间段外周血中白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数量的变化趋势曲线图。图30为图29中从回输前到回输后20天为止的局部放大图。从图29和30可以看出在回输前预处理后到回输当天(D0)，上述三类细胞的绝对计数均出现了明显下降。从D0开始，白细胞、中性粒细胞两大类的绝对计数仍然持续下降，至D10左右白细胞和中性粒细胞均降至最低水平，与文献报道一致(M E Gershwin,E J Goetzl,A D Steinberg Cyclophosphamide:use in practice Ann Intern Med.1974Apr；80(4):531-40)。但淋巴细胞计数从D0往后开始出现了明显的上升，且这一上升趋势在D0往后约一周时间尤为明显，与白细胞、中性粒细胞两大类细胞绝对计数的下降趋势形成鲜明对比，表明在TIL细胞回输后，淋巴细胞在体内有明显的增殖。
图31显示了患者外周血中回输的TIL细胞的TCR克隆型频率与淋巴细胞总数随时间变化的叠加趋势。图31中可以明显观察到，回输当天，回输TIL的TCR克隆型频率瞬时达到最高峰，随后下降到低点，接下来又持续上升，并且这一上升趋势与淋巴细胞总数上升的趋势到回输后30天为止均高度吻合，表明患者外周血中淋巴细胞数量在回输后的显著上升与回输的TIL的TCR克隆型的增殖高度相关。
结合图29、30和31的结果，可以说明本发明的TIL产品细胞在患者经过低剂量的环磷酰胺+羟氯喹预处理之后进行回输，能够在人体内积极有效地增殖。
对比例
采用中国专利申请CN110785486A说明书142页实施例19所记载方法中的过程2A(即文中自称的Gen2制造方法)结合CN110785486A说明书177页实施例27所公开的在pre-REP培养阶段(即对应于本申请种子细胞培养阶段)中添加IL-2、IL-15和IL-21的技术方案，从实施例2表4中的T004、T009、T013和T014组织样本中制备TIL产品细胞，采用的制备方法为CN110785486A说明书实施例19和27以及其他所有相关联的实施例所记载的方法，方法来源的CN110785486A通过引用全文纳入本申请。参照的TIL制备方法中的所需的饲养细胞来自于健康人的PBMC。
将通过CN110785486A记载的制备方法(以下称为“对比方法”)和本发明制备方法(以下称为“本方法”)所制得的最终的TIL产品细胞分别进行以下指标检测和比较：
1)细胞计数和成活率；
2)CD45
+细胞占全部细胞的比例；
3)CD3
+细胞占CD45
+细胞的比例；
4)CD4
+细胞和CD8
+细胞占CD3
+细胞的比例；
5)记忆T细胞占CD3
+细胞的比例；
6)IFN-γ分泌水平；
7)T细胞耗竭水平；
8)调节性T细胞(Treg)占CD3
+细胞的比例。
记忆T细胞比例、耗竭T细胞和激活T细胞通过流式细胞仪进行检测，具体地，Tcm通过检测CD45RO
+CCR7
+细胞确定；Tem通过检测CD45RO
+CCR7
-细胞确定；耗竭T细胞通过检测Lag3
+细胞确定；IFN-γ分泌水平检测同本申请实施例2记载的方法；Treg通过检测CD4
+CD25
+Foxp3
+细胞确定。
结果如下表13所示：
表13，对比方法与本方法制备的TIL产品细胞指标比较
表13中的结果显示，通过对比方法培养获得的TIL产品细胞在细胞数量、成活率、CD45
+细胞比例和CD3
+/CD45
+比例几项指标上与本方法培养的TIL产品细胞比较接近。两种方法培养的TIL产品细胞中的CD8
+细胞占CD3
+细胞的比例接近，对比方法培养的TIL细胞中CD4
+细胞比例相对更高，而本方 法培养的TIL细胞中有部分细胞为CD4
-CD8
-CD3
+T细胞，即双阴性T细胞。两种方法培养的TIL细胞的记忆性T细胞表型中Tcm占T细胞总数的比例最高均在10％左右，两种TIL细胞的IFN-γ分泌水平也相对接近。但与对比方法培养的TIL细胞相比，本发明方法在4个组织样本中培养的TIL产品细胞在耗竭性T细胞和Treg占比上均明显更低，显示出本方法培养的TIL细胞在体内外活化、增殖和杀伤性能上具有更大的潜在优势。
以上详细描述了本申请的实施方式，但是，本申请并不限于上述实施方式中的具体细节，在本申请的技术构思范围内，可以对本申请的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本申请的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本申请对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本申请的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本申请的思想，其同样应当视为本申请所公开的内容。
Claims (12)
- 一种用于扩增TIL细胞的培养组合物，其特征在于，所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15和免疫检查点抗体或其抗原结合片段，优选地，所述免疫检查点抗体包括选自PD-1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、TIGIT抗体和BTLA抗体中的任一种或多种，优选地，所述培养组合物还包括IL-21、IL-12、GM-CSF、和提升记忆T细胞比例的小分子中的任一种、两种、三种或四种，优选地，所述培养组合物还包括选自CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、OX40抗体、GITR抗体、ICOS抗体、CD206抗体和CD40抗体中的任一种或多种，优选地，所述CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、OX40抗体、GITR抗体、ICOS抗体、CD206抗体和CD40抗体为激活型抗体，优选地，所述培养组合物还包括自体血小板或异体血小板。
- 如权利要求1所述的培养组合物，其特征在于，所述一种或多种抗体与基质偶联，和/或所述基质是固体基质，所述固体基质包括选自微球、孔板、平皿、细胞培养瓶和细胞培养袋中的任一种或多种，和/或所述提升记忆T细胞比例的小分子是TWS119，和/或所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、IL-21、IL-12、CD3抗体、CD28抗体和GM-CSF，和/或所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、IL-21、IL-12、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体和GITR抗体，和/或所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、CD3抗体和CD28抗体，优选地，所述CD3抗体和CD28抗体与基质偶联，和/或所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、IL-21、IL-12、CD3抗体、CD28抗体和GM-CSF，优选地，所述CD3抗体和CD28抗体与基质偶联，和/或所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、CD3抗体、CD28抗体和CD137抗体，优选地，所述CD3抗体、CD137抗体和CD28抗体与基质偶联，和/或所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、GITR抗体、CD3抗体、CD28抗体、TWS119和CD137抗体，优选地，所述CD3抗体、CD137抗体和CD28抗体与基质偶联，和/或所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、TIGIT抗体、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体和GM-CSF，优选地，所述CD3抗体、CD137抗体和CD28抗体与基质偶联，和/或所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、LAG3抗体、IL-21、IL-12、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体和GITR抗体，优选地，所述CD3抗体、CD137抗体和CD28抗体与基质偶联，和/或所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、TIGIT抗体、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、CD40抗体、OX-40抗体和自体血小板，优选地，所述CD3抗体、CD137抗体和CD28抗体与基质偶联，和/或所述培养组合物包含IL-2、IL-7、IL-15、PD-1抗体、CTLA-4抗体、CD3抗体、CD28抗体、CD137抗体、GITR抗体、GM-CSF、TWS119和异体血小板，优选地，所述CD3抗体和CD28抗体与基质偶联。
- 如权利要求1所述的培养组合物，其特征在于，所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、和3-100μg/mL的PD-1抗体，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、和1-100μg/mL的PD-1抗体，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、1-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体和200-5000U/mL的GM-CSF，或所述组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、1-10μg/mL的CD3抗体、0.5-10μg/mL的CD28抗体和200-5000U/mL的GM-CSF，或所述组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、1-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、0.5-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、3-100μg/mL的PD-1抗体、1-10μg/mL的CD3抗体、1-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体、1-100μg/mL的GITR抗体、200-5000U/mL的GM-CSF和1-500μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-500IU/mL的IL-2、5-50ng/mL的IL-7、5-50ng/mL的IL-15、1-50μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体和200-1000U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、 5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体和偶联于基质的CD137抗体，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-100μg/mL的GITR抗体和1-500μM的TWS119，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-100μg/mL的TIGIT抗体和200-5000U/mL的GM-CSF，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的LAG-3抗体、5-100ng/mL的IL-21、5-100ng/mL的IL-12、0.5-10μg/mL的CD3抗体、0.5-10μg/mL的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体和1-100μg/mL的GITR抗体，或这些组分的等比浓缩物；所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、偶联于基质的CD137抗体、1-100μg/mL的TIGIT抗体、1-100μg/mL的CD40抗体、1-100μg/mL的OX-40抗体和1×10 8-5×10 8/mL的自体血小板，或这些组分的等比浓缩物；或所述培养组合物包含组分：200-6000IU/mL的IL-2、5-100ng/mL的IL-7、5-100ng/mL的IL-15、1-100μg/mL的PD-1抗体、1-100μg/mL的CTLA-4抗体、偶联于基质的CD3抗体、偶联于基质的CD28抗体、1-100μg/mL的CD137抗体、1-100μg/mL的GITR抗体、200-5000U/mL的GM-CSF和1×10 8-5×10 8/mL的异体血小板，或这些组分的等比浓缩物。
- 一种TIL细胞扩增培养基，其特征在于，其包含血清和/或血小板、基础培养基，以及权利要求1-3中任一项所述的扩增TIL细胞的培养组合物，优选地，所述培养组合物具有选自以下的一个或多个特征：所述基础培养基选自AIM-V、X-VIVO、DMEM、RPMI1640、OpTmizer TM、FUJIFILM Irvin MHM-C，所述血清选自人AB血清、对象自体血清或动物源血清，血清的浓度为1-10％，所述血小板为异体血小板或对象自体血小板，所述血小板密度为0.5×10 8-1.0×10 9/mLIL-2的浓度为200-6000IU/mL，IL-7的浓度为5-100ng/mL，IL-15的浓度为5-100ng/mL，PD-1抗体的浓度为1-100μg/mL，IL-21的浓度为5-100ng/mL，IL-12的浓度为5-100ng/mL，CD3抗体的浓度为0.5-10μg/mL，CD28抗体的浓度为0.5-10μg/mL，CD137抗体的浓度为1-100μg/mL，GITR抗体的浓度为1-100μg/mL，GM-CSF的浓度为200-5000U/mL，TWS119的浓度为1-500μM。
- 权利要求1-3中任一项所述的培养组合物或权利要求4所述的培养基在制备含有TIL细胞的药物中的应用，优选地，所述药物用于治疗癌症，更优选地，所述癌症选自以下的一种或多种：胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤。
- 一种扩增TIL细胞群的方法，其特征在于，其包括用权利要求4所述的培养基孵育TIL细胞群，优选地，所述孵育持续至少5天，和/或，所述孵育持续至多20天。
- 一种制备TIL细胞群的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用TIL种子细胞培养基孵育含肿瘤细胞的组织，获得第一TIL细胞群，(2)用权利要求4所述的培养基孵育第一TIL细胞群，获得第二TIL细胞群，优选地，所述方法具有选自以下的一个或多个特征：a)所述肿瘤组织经预处理，优选地，所述预处理包括碎片化和/或解离肿瘤组织，b)所述含肿瘤细胞的组织是癌症对象的肿瘤组织或体液，c)步骤(1)中所述TIL种子细胞培养基包括以下组分的组合中的任一种：1)IL-2、IL-6、IL-21、IFN-γ、TIGIT抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；2)IL-2、IL-4、IL-10、IL-21、CD137抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；3)IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、CD137抗体、CD28抗体、PD-1抗体、血清、双抗和基础培养基；4)IL-1β、IL-2、IL-7、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、LAG3抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；5)IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、M-CSF、IFN-β、IFN-γ、TIGIT抗体、CTLA-4抗体、血清、双抗和基础培养基；6)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、CD137抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；7)IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、G-CSF、M-CSF、CD28抗体、OX-40抗体、PD-1抗体、血清、双抗和基础培养基；8)IL-2、IL-7、IL-15、IFN-γ、CD137抗体、CD40抗体、OX-40抗体、TIGIT抗体、PD-1抗体、血清、双抗和基础培养基；9)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IFN-γ、CD137抗体、CD28抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；10)IL-2、IL-7、IL-12、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CD28抗体、CD40抗体、TIGIT抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；11)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、PD-1抗体、RRx-001、CAL-101、血清、双抗和基础培养基；12)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、M-CSF、PD-1抗体、CNI-1493、血清、双抗 和基础培养基；13)IL-2、IL-7、IL-15、CD137抗体、CD28抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、达沙替尼、血清、双抗和基础培养基；14)IL-2、IL-6、IL-12、G-CSF、M-CSF、IFN-β、IFN-γ、CTLA-4抗体、PD-1抗体、达沙替尼、LYC-55716、GENE-1858、血清、双抗和基础培养基；15)IL-1α、IL-2、IL-9、IL-15、GM-CSF、CD137抗体、CD28抗体、LAG3抗体、TIGIT抗体、CNI-1493、血清、双抗和基础培养基；16)IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、G-CSF、M-CSF、IFN-γ、CD28抗体、CD40抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、CNI-1493、达沙替尼、GNE-1858、血清、双抗和基础培养基，d)步骤(1)的孵育持续至少5天，e)步骤(1)的孵育持续至多20天，f)步骤(1)的孵育的温度为30-42℃，优选地，为37℃，g)步骤(1)的孵育的CO 2浓度为5％，h)步骤(2)的孵育持续至少5天，i)步骤(2)的孵育持续至多20天，j)步骤(2)的孵育的温度为30-42℃，优选地，为37℃，k)步骤(2)的孵育的CO 2浓度为5％，l)所述含肿瘤细胞的组织是患有胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤等癌症的对象的肿瘤组织或体液。
- 一种制备TIL细胞群的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用TIL种子细胞培养基孵育含肿瘤细胞的组织，获得第一TIL细胞群，(2)将(1)中所述第一TIL细胞群接触权利要求1-3中任一项所述培养组合物中的与基质偶联的抗体中的任一种或几种，获得第二TIL细胞群，(3)将(2)中所述第二TIL细胞群转移至含有权利要求1-3中任一项培养组合物中除与基质偶联的抗体以外的组分中的任一种或多种的培养基中培养，获得第三TIL细胞群，优选地，所述方法具有选自以下的一个或多个特征：a)所述肿瘤组织经预处理，优选地，所述预处理包括碎片化和/或解离肿瘤组织，b)所述含肿瘤细胞的组织是癌症对象的肿瘤组织或体液，c)步骤(1)中所述TIL种子细胞培养基包括以下组分的组合中的任一种：1)IL-2、IL-6、IL-21、IFN-γ、TIGIT抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；2)IL-2、IL-4、IL-10、IL-21、CD137抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；3)IL-2、IL-7、IL-12、IL-21、CD137抗体、CD28抗体、PD-1抗体、血清、双抗和基础培养基；4)IL-1β、IL-2、IL-7、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、LAG3抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；5)IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、M-CSF、IFN-β、IFN-γ、TIGIT抗体、CTLA-4抗体、血清、双抗和基础培养基；6)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、CD137抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；7)IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、G-CSF、M-CSF、CD28抗体、OX-40抗体、PD-1抗体、血清、双抗和基础培养基；8)IL-2、IL-7、IL-15、IFN-γ、CD137抗体、CD40抗体、OX-40抗体、TIGIT抗体、PD-1抗体、血清、双抗和基础培养基；9)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IFN-γ、CD137抗体、CD28抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；10)IL-2、IL-7、IL-12、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、CD28抗体、CD40抗体、TIGIT抗体、PD-1抗体、TNF-α、血清、双抗和基础培养基；11)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、PD-1抗体、RRx-001、CAL-101、血清、双抗和基础培养基；12)IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、M-CSF、PD-1抗体、CNI-1493、血清、双抗和基础培养基；13)IL-2、IL-7、IL-15、CD137抗体、CD28抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、达沙替尼、血清、双抗和基础培养基；14)IL-2、IL-6、IL-12、G-CSF、M-CSF、IFN-β、IFN-γ、CTLA-4抗体、PD-1抗体、达沙替尼、LYC-55716、GENE-1858、血清、双抗和基础培养基；15)IL-1α、IL-2、IL-9、IL-15、GM-CSF、CD137抗体、CD28抗体、LAG3抗体、TIGIT抗体、CNI-1493、血清、双抗和基础培养基；16)IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、G-CSF、M-CSF、IFN-γ、CD28抗体、CD40抗体、LAG3抗体、PD-1抗体、 CNI-1493、达沙替尼、GNE-1858、血清、双抗和基础培养基，d)步骤(1)中孵育持续至少5天，e)步骤(1)中孵育持续至多20天，f)步骤(1)的孵育的温度为30-42℃，优选地，为37℃，g)步骤(1)的孵育的CO 2浓度为5％，h)步骤(2)中所述基质为多孔板、细胞培养皿或细胞培养袋，i)步骤(2)中所述偶联为共价偶联或非共价偶联，j)步骤(2)中所述与基质偶联的抗体包括CD3抗体、CD28抗体和CD137抗体中的任一种或几种；优选地，包括CD3抗体和CD28抗体；更优选地，包括CD3抗体、CD28抗体和CD137抗体，k)步骤(2)中所述接触为将步骤(1)所述第一TIL细胞群同与基质偶联的抗体一起孵育；优选地，所述孵育的温度为30-42℃，优选地，为37℃；优选地，所述孵育的CO 2浓度为5％，l)步骤(2)中，所述孵育在含有前述培养组合物中除与基质偶联的抗体以外的组分中的任一种或多种的培养基中进行，m)步骤(2)中所述第一TIL细胞群的密度为1.0×10 5/mL～1.0×10 6/mL；优选地，为2.0×10 5/mL～1.0×10 6/mL；更优选地，为2.5×10 5/mL～3.5×10 6/mL，n)步骤(2)中所述接触持续1-3天；优选地，持续2-3天，o)步骤(3)中孵育持续至少5天，p)步骤(3)中孵育持续至多20天，q)步骤(3)的孵育的温度为30-42℃，优选地，为37℃，r)步骤(3)的孵育的CO 2浓度为5％，s)所述含肿瘤细胞的组织是患有胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤等癌症的对象的肿瘤组织或体液。
- 由权利要求6-8中任一项所述的方法获得的TIL细胞群。
- 权利要求9所述的TIL细胞群在制备用于治疗癌症的药物中的用途，优选地，所述癌症选自以下的一种或多种：胃癌、甲状腺肿瘤、胆囊癌、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、结直肠癌、脑胶质瘤、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肾癌、骨肉瘤。
- 一种药物组合物，包括权利要求9所述TIL细胞群，以及药学上可接受的辅料。
- 一种细胞冻存制剂，包括权利要求9所述的TIL细胞群和冻存液；优选地，所述冻存液为细胞冻存液或组织冻存液；优选地，所述冻存液为无血清冻存液。
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