CN111246860A - 用于癌症治疗的组合免疫治疗和细胞因子控制治疗 - Google Patents

用于癌症治疗的组合免疫治疗和细胞因子控制治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN111246860A
CN111246860A CN201880068359.9A CN201880068359A CN111246860A CN 111246860 A CN111246860 A CN 111246860A CN 201880068359 A CN201880068359 A CN 201880068359A CN 111246860 A CN111246860 A CN 111246860A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
apoptotic
another embodiment
car
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880068359.9A
Other languages
English (en)
Inventor
S·诺维克
D·梅沃拉克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Enlivex Therapeutics Ltd
Original Assignee
Enlivex Therapeutics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Enlivex Therapeutics Ltd filed Critical Enlivex Therapeutics Ltd
Publication of CN111246860A publication Critical patent/CN111246860A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464419—Receptors for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/04—Immunosuppressors, e.g. cyclosporin, tacrolimus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明揭示的组合物及其使用方法包括用于在接受CAR T细胞治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率的那些组合物和方法、治疗癌症或肿瘤的方法、减少肿瘤负荷的方法、降低癌症或肿瘤的大小或生长速度的方法以及延长罹患癌症或肿瘤的对象的存活的方法，其中给所述对象施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物。所述组合物及其使用方法可以提高CAR T细胞癌症治疗的功效。本发明还揭示了用于在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的对象中降低或抑制细胞因子产生的组合物及其使用方法。在某些情况下，所述组合物可以包括另外的化疗剂或免疫调节剂。

Description

用于癌症治疗的组合免疫治疗和细胞因子控制治疗
相关领域
本文揭示用于在正在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或减少细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的组合物及其方法。此外，本文揭示了在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的对象中降低或抑制细胞因子产生的组合物及其方法。此外，本文揭示的组合物可用于在对象中治疗、预防癌症或肿瘤、抑制癌症或肿瘤的生长或降低其发病率。组合物可用于增加患有癌症或肿瘤的对象的存活。所使用的组合物可以单独施用或与其它化学治疗组合施用。本文揭示的方法包括那些包括单独施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物的方法或包括与CAR T细胞治疗组合施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物的方法。
发明背景
虽然癌症的标准治疗是手术、化疗和放疗，但目前正在开发和测试改良的方法，例如靶向免疫治疗。一种有前途的技术使用过继细胞转移(ACT)，其中对免疫细胞进行修饰以识别和攻击其肿瘤。ACT的一个实例是当患者自身或供体的细胞毒性T细胞经过工程改造后表达靶向在肿瘤细胞表面表达的肿瘤特异性抗原的嵌合抗原受体(CAR T细胞)。这些CAR T细胞然后仅对表达所述肿瘤特异性抗原的细胞具有细胞毒性。临床实验表明，CAR T细胞治疗在控制晚期急性淋巴细胞白血病(ALL)和淋巴瘤等方面具有巨大潜力。
然而，一些接受CAR T细胞治疗和其它免疫治疗的患者会遇到危险的、有时甚至危及生命的副作用，称为细胞因子释放综合征(CRS)，其中注入的活化T细胞产生全身性炎症反应，其中细胞因子迅速大量释放到血液中，导致危险的低血压、高热和寒战。
在严重的CRS病例中，患者经历细胞因子风暴(又称细胞因子级联反应或高细胞因子血症)，其中存在细胞因子和具有细胞因子水平高度升高的白细胞与之间的正反馈环。这可能导致潜在的威胁生命的并发症，包括心脏功能障碍、成人呼吸窘迫综合征、神经系统毒性、肾和/或肝衰竭、肺水肿和弥散性血管内凝血。
例如，在最近的一项I期临床实验中，六名被施用了与T细胞上CD28受体结合的单克隆抗体TGN1412的患者表现出严重的细胞因子风暴和多器官衰竭。尽管事实上TGN1412的剂量比动物安全剂量低500倍，但还是发生了这种情况(St.Clair EW:The calm after thecytokine storm:Lessons from the TGN1412 trial.J Clin Invest 118:1344-1347,2008)。
迄今为止，正在对皮质类固醇、生物治疗如抗IL6治疗和抗炎药进行评估，以控制在施用CAR T细胞治疗的患者中的细胞因子释放综合征。但是，类固醇可能会影响CAR T细胞的活性和/或增殖并使患者处于败血症和机会性感染的危险中。抗炎药可能无法有效控制细胞因子释放综合征或细胞因子风暴，因为细胞因子风暴包括大量细胞因子，而为患者输注抗炎药物的能力有限。需要新的策略以控制细胞因子释放综合征，尤其是细胞因子风暴，以实现CAR T细胞治疗的潜力。
在其它感染性和非感染性刺激之后，细胞因子风暴也是一个问题。在细胞因子风暴中，许多促炎细胞因子如白介素-1(IL-1)、IL-6、γ-干扰素(γ-IFN)和肿瘤坏死因子-α(TNFα)被释放，导致低血压、出血，最终导致多器官衰竭。在1918年的H1N1流感大流行以及最近的禽流感H5N1感染中，免疫系统健康的年轻人的相对高死亡率归因于细胞因子风暴。也已知这种综合征发生在严重急性呼吸道综合征(SARS)、Epstein-Barr病毒相关噬血细胞淋巴组织细胞增生、革兰氏阴性败血症、疟疾和许多其它传染病包括Ebola病毒感染的晚期或末期病例中。
细胞因子风暴也可能源于非传染性原因，例如急性胰腺炎、严重烧伤或创伤或者急性呼吸窘迫综合征。因此，需要新的策略来控制细胞因子释放综合征，尤其是细胞因子风暴。
癌症是一种异常状态，其中一或多个细胞群的失控增殖干扰正常生物学功能。增殖性变化通常伴随着细胞性质的其它变化，包括逆转至较低分化程度、发育较原始的状态。癌症的体外相关性称为细胞转化。转化的细胞通常显示以下几种或全部特性：球形形态，表达胎儿抗原，生长因子非依赖性，缺乏接触抑制，锚定非依赖性和生长至高密度。
如肺癌和皮肤癌等恶性疾病致死性的主要原因是转移性扩散。在许多情况下，不可能预防转移性疾病的发作，因为癌症通常在诊断时就已经转移了，即使在此阶段之前诊断出癌症的情况下，也不可能将最终可能产生转移的原发病变组织通过外科手术完全切除或破坏。由于转移病灶小和/或原发病灶中没有可以可靠地预测其存在的可靠标记物，因此转移性疾病在早期阶段不可能诊断。这些病灶由于难以接近、浸染和/或定位不佳，因此可能难以或不可能通过消融方法治疗。当前选择用于治疗某些转移性恶性病的化疗/放疗通常无效或次优，且具有与特别有害和/或可能致命的副作用相关的明显缺点。
免疫治疗性癌症治疗方法如涉及抗原呈递细胞(APC)疫苗接种的那些方法，对于治疗难以接近、散播性、微小的、复发和/或定位不良的癌灶可能是最佳有效的。一种有前途的免疫治疗途径涉及使用专职APC如树突细胞(DC)以引发全身性抗癌免疫性。
树突细胞是哺乳动物免疫系统中产生和呈递抗原的细胞，其可加工抗原材料并将其呈递在免疫系统T细胞的细胞表面，从而可以使T细胞对新抗原和回忆抗原敏感。DC是最有效的抗原产生细胞，在先天免疫和适应性免疫系统之间充当信使。DC细胞可用于通过产生攻击和裂解肿瘤的效应细胞而引发特异性抗肿瘤免疫性。
凋亡细胞是生理细胞死亡的一种途径，最常通过凋亡发生，其引发一系列的分子稳态机制，包括识别、免疫反应和清除过程。此外，凋亡细胞是能直接和间接诱导对树突细胞和巨噬细胞的免疫耐受的免疫调节细胞。已经示出凋亡细胞调节树突细胞和巨噬细胞并使其具有致耐受性和抑制促炎活性如促炎细胞因子的分泌和共刺激分子的表达。
目前仍需求用于治疗、预防、抑制对象中癌症或肿瘤的生长或降低其发生率的组合物和方法。下文描述的凋亡细胞制剂、组合物及其应用通过提供可用于治疗、预防对象中癌症或肿瘤、抑制对象中癌症或肿瘤的生长或降低其发生率的早期凋亡细胞群而解决这一需求。此外，本文所述的使用方法解决了增加罹患癌症和肿瘤的对象的存活的需求，包括增加癌症或肿瘤缓解的需求。
发明概述
本文揭示的一方面是治疗、预防对象的癌症或肿瘤、抑制对象的癌症或肿瘤的生长、延缓疾病进展、降低肿瘤负荷或降低对象的癌症或肿瘤的发生率或其任何组合的方法，包括给所述对象施用包含早期凋亡细胞群的组合物的步骤，其中与未施用所述早期凋亡细胞群的对象相比，所述方法治疗、预防所述对象的癌症或肿瘤、抑制所述对象的癌症或肿瘤的生长、延缓疾病进展、降低肿瘤负荷或降低所述对象的癌症或肿瘤的发生率或其任意组合。
在一个相关方面，所述癌症或肿瘤的大小或生长速度或其组合被降低。在另一个相关方面，所述对象的存活增加。
在一个相关方面，所述早期凋亡细胞群包含富含单个核的细胞群，或者稳定超过24小时的凋亡细胞群，或者无细胞聚集的凋亡群，或者在凋亡诱导后经辐照的凋亡群，或其任意组合。在另一个相关方面，所述早期凋亡细胞群包含合并的早期凋亡细胞群。
在一个相关方面，所述对象是人类对象。
在一个相关方面，所述癌症或肿瘤包含实体瘤或非实体瘤。在另一个相关方面，所述非实体癌或肿瘤包含造血系统恶性肿瘤，血细胞癌，白血病，骨髓增生异常综合征，淋巴瘤，多发性骨髓瘤(浆细胞骨髓瘤)，急性淋巴细胞白血病，急性骨髓性白血病，慢性髓性白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤或浆细胞白血病。在另一个相关方面，所述实体瘤包含肉瘤或癌(carcinoma)，纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨性肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，Ewing瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌或肿瘤，乳腺癌或肿瘤，卵巢癌或肿瘤，前列腺癌或肿瘤，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管原癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，Wilm's肿瘤，子宫颈癌或肿瘤，子宫癌或肿瘤，睾丸癌或肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，神经鞘瘤，脑膜瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤。在另一个相关方面，所述肿瘤或癌症包含肿瘤或癌症的转移。
在一个相关方面，所述施用包含单次输注所述早期凋亡细胞群。在另一个相关方面，所述施用包含多次输注所述凋亡细胞群。在另一个相关方面，所述方法还包括给所述对象施用另外的免疫治疗、化疗剂或免疫调节剂或其任何组合。在另一个相关方面，在施用所述早期凋亡细胞之前、同时或之后，施用所述另外的免疫治疗、化疗剂或免疫调节剂。在另一个相关方面，所述免疫治疗包含施用CAR T细胞。在另一个相关方面，所述免疫调节剂包含抗体或其功能片段。在另一个相关方面，所述抗体或其功能片段包含利妥昔单抗(RtX)抗体或其功能片段。
在一个相关方面，与施用CAR T细胞但未施用早期凋亡细胞的对象相比，所述方法提高了所述CAR T细胞的功效。
在一个相关方面，所述方法包含一线治疗。
在一个相关方面，所述方法包含辅助治疗。
在一个相关方面，所述方法减少最小残留疾病，增加缓解，增加缓解持续时间，降低肿瘤复发率，防止所述肿瘤或所述癌症的转移，或降低所述肿瘤或所述癌症的转移率，或其任何组合。
一方面，本文公开了单个核凋亡细胞群，其包含早期凋亡状态的单个核细胞，其中所述单个核凋亡细胞群包含：百分比降低的非静止非凋亡活细胞，细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞，或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。
在一个相关方面，所述百分比降低的非静止非凋亡活细胞少于10％。在另一个相关方面，所述单个核凋亡细胞群包含非存活的非凋亡细胞。
在一个相关方面，所述单个核细胞群选自：淋巴细胞，单核细胞，树突细胞和自然杀伤细胞。
在一个相关方面，在产生早期凋亡细胞后，辐照所述单个核凋亡细胞群。在另一个相关方面，辐照包含γ辐照或UV辐照。在另一个相关方面，与未辐照的凋亡细胞群相比，所述辐照的细胞群包含降低百分比的非静止非凋亡细胞/群。
一方面，本文公开了一种药物组合物，其包含单个核凋亡细胞群以及药学上可接受的赋形剂，所述单个核凋亡细胞群包含早期凋亡状态的单个核细胞，其中所述单个核凋亡细胞群包含：百分比降低的非静止非凋亡活细胞，细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞，或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。
一方面，本文公开了一种产生单个核凋亡细胞群的方法，所述单个核凋亡细胞群包含百分比降低的非静止非凋亡活细胞，细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞，或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合，所述方法包括以下步骤，
获得外周血的富含单个核的细胞群；
在包含抗凝剂的冷冻培养基中冷冻所述富含单个核的细胞群；
解冻所述富含单个核的细胞群；
将所述富含单个核的细胞群在凋亡诱导保温培养基中保温，所述培养基包含终浓度为约10-100μg/mL的甲泼尼龙和抗凝剂；
将所述凋亡细胞群重悬于施用培养基中；及
使所述富含单个核的细胞群失活，其中所述失活发生在步骤(e)之后；
其中所述方法产生这样的单个核凋亡细胞群，其包含百分比降低的非静止非凋亡细胞，细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞，或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。
在一个相关方面，所述失活步骤包含在所述单个核凋亡细胞制备物中降低非静止非凋亡细胞的百分比，抑制任何活的非凋亡细胞的细胞活化，或降低任何活的非凋亡细胞的增殖，或其任何组合。在另一个相关方面，所述非静止非凋亡细胞的百分比降低至约10％。在另一个相关方面，所述非静止非凋亡细胞的百分比降低至约0％。
在一个相关方面，富含单个核的细胞群选自淋巴细胞，单核细胞，树突细胞和自然杀伤细胞。
在一个相关方面，所述保温大约2-12小时。
在一个相关方面，失活所述富含单个核的细胞群的步骤(f)包括抑制或消除免疫应答，抑制或消除细胞的交叉反应性，或降低或消除T细胞受体活性，其中所述细胞群包含百分比降低的活的非凋亡细胞，抑制任何活的非凋亡细胞的细胞活化，或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。在另一个相关方面，所述失活步骤(f)包含辐照在步骤(e)中产生的富含单个核的凋亡细胞群。在另一个相关方面，所述辐照包含γ辐照或UV辐照。在另一个相关方面，所述辐照包含约25-50个格雷单位(Grey unit，Gy)。
附图简述
本文公开的主题在说明书最后部份特别指出并明确要求保护。然而，当结合附图阅读时，通过参考以下详细描述，可以最好地理解本文公开的关于组织和操作方法的组合物和方法，以及其目的、特征和优点。
图1A-1B.示意图显示标准CAR T细胞治疗(图1A)以及使用患者自身细胞(自体)(图1B)产生凋亡细胞或凋亡细胞上清液在患者中安全有效的CAR T细胞癌症治疗方法的实施方案。
图2.示意图显示患者中安全有效的CAR T细胞癌症治疗方法的实施方案，其使用供体细胞产生凋亡细胞或凋亡细胞上清液。
图3.流程图示出早期凋亡细胞群的制备方法的一个实施方案中的步骤，其中在该方法中包括抗凝剂。
图4A–4J.凋亡细胞防止LPS诱导的细胞因子风暴体外模型中的细胞因子风暴-在癌症环境中的巨噬细胞活化综合征的无菌模型。图4A显示在以巨噬细胞/单核细胞:Apocell比率为1:8和1:16在两个时间段(6小时和24小时)施用Apocell后，在癌症存在下，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的IL-10水平的降低。图4B显示在以巨噬细胞/单核细胞:Apocell比率为1:8和1:16在两个时间段(6小时和24小时)施用Apocell后，在癌症和CAR-19存在下，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的IL-6水平的降低。图4C显示在以巨噬细胞/单核细胞:Apocell比率为1:8和1:16在两个时间段(6小时和24小时)施用Apocell后，在癌症和CAR-19存在下，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的MIP-1α水平的降低。图4D显示在以巨噬细胞/单核细胞:Apocell比率为1:8和1:16在两个时间段(6小时和24小时)施用Apocell后，在癌症和CAR-19存在下，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的IL-8水平的降低。图4E显示在以巨噬细胞/单核细胞:Apocell比率为1:8和1:16在两个时间段(6小时和24小时)施用Apocell后，在癌症和CAR-19存在下，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的TNF-α水平的降低。图94显示在以巨噬细胞/单核细胞:Apocell比率为1:4、1:8、1:16、1:32和1:64在24小时施用Apocell后，在癌症和CAR-19存在下，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的MIP-1β水平的降低。图94显示在以巨噬细胞/单核细胞:Apocell比率为1:4、1:8、1:16、1:32和1:64在24小时施用Apocell后，在癌症和CAR-19存在下，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的MCP-1水平的降低。图94显示在以巨噬细胞/单核细胞:Apocell比率为1:8和1:16在两个时间段(6小时和24小时)施用Apocell后，在癌症和CAR-19存在下，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的IL-9水平的降低。图4I显示在以巨噬细胞/单核细胞:Apocell比率为1:4、1:8、1:16、1:32和1:64在24小时施用Apocell后，在癌症和CAR-19存在下，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的IL-2R水平的增加。图4J显示凋亡细胞不下调IL-2从细胞的释放。在24小时期间使用增加剂量的凋亡细胞(n＝3)，在癌症和CAR-19存在下，将凋亡细胞与巨噬细胞/单核细胞保温。空条(仅概述)-每孔2.5×106凋亡细胞；黑色-每孔5×106凋亡细胞；灰色-每孔10×106凋亡细胞。
图5.T细胞转导的验证，示出转导的T4+CAR-T细胞的抗CD124分析的流式细胞术分析结果。
图6.T4+CAR T细胞降低SKOV3-luc卵巢腺癌细胞的增殖。条形图显示了细胞毒性测定的结果，其中单层SKOV3-luc细胞通过非转导T细胞或T4+CAR-T细胞培养。
图7.凋亡细胞不废除T4+CAR-T细胞抗肿瘤活性。结果基于细胞毒性测定，其中在载体(Hartmann溶液)或凋亡细胞(Apocell)或凋亡细胞上清液(ApoSup)或凋亡细胞与单核细胞/巨噬细胞共培养的上清液(ApoMon Sup)存在下，将单层SKOV3-luc细胞与未转导的T细胞或与T4+CAR-T细胞一起培养。
图8.在细胞毒性期间高水平分泌的Il-6被凋亡细胞下调。在此显示的结果证实SKOV3-luc与人单核细胞/巨噬细胞共培养的作用，暴露于凋亡细胞(Apocell)或Apocell上清液(ApoSup)或凋亡细胞与单核细胞/巨噬细胞共培养物(ApoMon Sup)。
图9.在CAR-T细胞治疗期间暴露于LPS之后凋亡细胞或凋亡细胞上清液或凋亡细胞与单核细胞共培养物的作用.当将脂多糖(LPS)添加到细胞毒性测定中时，记录到IL-6分泌极高。结果表明，暴露于凋亡细胞(Apocell)或凋亡细胞上清液(ApoSup)或凋亡细胞与单核细胞/巨噬细胞共培养的上清液(ApoMon Sup)均下调了IL-6，其中IL-6降低至可接受的水平。
图10.在模拟CAR-T细胞临床治疗的CAR T细胞治疗期间暴露于LPS之后凋亡细胞或凋亡细胞上清液或凋亡细胞与单核细胞共培养物的作用.当将脂多糖(LPS)添加到细胞毒性测定中时，记录到IL-6分泌极高。结果表明暴露于凋亡细胞(Apocell)或凋亡细胞上清液(ApoSup)或凋亡细胞与单核细胞/巨噬细胞共培养的上清液(ApoMon Sup)均下调了IL-6，其中IL-6降低至可接受的水平。
图11A-11B.剔除(culling)时小鼠的体重和肿瘤大小。图11A示出了在实验时间段内的体重变化。蓝色-对照，未给予4.5×106SKOV3-luc细胞。红色-0.5×106SKOV3-luc细胞。绿色-1.0×106SKOV3-luc细胞。紫色-4.5×106SKOV3-luc细胞。图11B显示注射后39天，接受4.5×106SKOV3-luc细胞的小鼠的典型SKOV3-luc肿瘤。
图12.SKOV3-luc肿瘤生长.示出通过生物发光成像(BLI)成像的携带SKOV3-luc肿瘤的小鼠，显示了对照(PBS)和接种0.5×106、1×106和4.5×106SKOV3-luc细胞之间的差异。
图13A-13D.SKOV3-luc肿瘤负荷.体内SKOV3-luc肿瘤的生物发光(BLI)定量(见图12)。按照制造商的指示实施了600光子计数截止。图13A，用0.5×106SKOV3-luc接种的小鼠。图13B，用1×106SKOV3-luc接种的小鼠。图13C，用4.5×106SKOV3-luc接种的小鼠。图13D，平均SKOV3-luc肿瘤生长。
图14.对Raji Burkett淋巴瘤细胞的细胞毒性校准。将Raji细胞以各种细胞密度铺板，离心前立即进行细胞裂解。结果显示Raji细胞数(x轴)与在492nm处的吸光度(y轴)。相对于未裂解的对应物，所有细胞数均显示出显著的读数。
图15.添加早期凋亡细胞不影响CAR T细胞抗肿瘤活性。E/T比率显示CD19+CAR T细胞与HeLa细胞比率。存活率是针对CD19+肿瘤细胞。实心圆CD19+Hela；空心三角CD19+Hela+未致敏的T细胞(
Figure BDA0002458147110000061
T cell)；实心三角CD19+Hela+CAR T-CD19；空心圆CD19+Hela+CAR T-CD19+凋亡细胞。
图16.在凋亡细胞存在和不存在下，Raji Burkett淋巴瘤细胞中的细胞因子分析(GM-CSF).条形图表示在加入如下细胞后，在单核细胞和LPS存在下保温的Raji细胞培养上清液中发现的细胞因子GM-CSF的浓度测量值(pg/ml)：未致敏的T细胞(Raji+未致敏的T细胞)，CD19+CAR T细胞(Raji+CAR T)，CAR T细胞:Apocell比率为1:8的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)(Raji+CAR T+ApoCell 1:8)，CAR T细胞:Apocell比率为1:32的CD19+CART细胞和凋亡细胞(ApoCell)(Raji+CAR T+ApoCell1:32)和CAR T细胞:Apocell比率为1:64的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)(Raji+CAR T+ApoCell 1:64)。
图17.在凋亡细胞存在和不存在下，Raji Burkett淋巴瘤细胞中的细胞因子分析(TNF-α)。条形图表示在加入如下细胞后，在单核细胞和LPS存在下保温的Raji细胞培养上清液中发现的细胞因子TNF-α(TNF-a)的浓度测量值(pg/ml)：未致敏的T细胞(Raji+未致敏的T)，CD19+CAR T细胞(Raji+CAR T)，CAR T细胞:Apocell比率为1:8的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)(Raji+CAR T+ApoCell 1:8)，CAR T细胞:Apocell比率为1:32的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)(Raji+CAR T+ApoCell1:32)，和CAR T细胞:Apocell比率为1:64的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)(Raji+CAR T+ApoCell 1:64)。
图18A和18B.实验方案.图18A示出分析凋亡细胞对CAR T细胞治疗的影响的实验方案。在第1天，SCID小鼠用Raji癌细胞注射，随后在第6天施用CAR T-CD19细胞(CAR T细胞治疗)和凋亡细胞。图18B显示CAR T细胞治疗没有被共施用Apocell负面影响。存活曲线：SCID小鼠用CD19+Raji细胞注射，添加或不添加早期凋亡细胞。
图19A、19B和19C.在实体肿瘤体内模型中，促炎性细胞因子从肿瘤增加释放。图19A显示了从BALB/c和SCID小鼠的腹膜中存在的实体瘤释放的IL-6的轻微增加，其中在HeLa CAR-CD-19CAR T细胞存在时，IL-6释放显著增加。同样，图19B显示从BALB/c和SCID小鼠腹膜中存在的实体瘤释放的IP-10的轻微增加，其中在HeLa CAR-CD-19CAR T细胞存在时，IP-10释放显著增加，图19C显示，在HeLa CAR-CD-19CAR T细胞的存在时，甚至TNF-α释放也令人惊讶地增加了。
图20A和20B.测试在ApoCell存在或不存在下CD19-CAR-T细胞在HeLaCD19(白血病)的IP模型中的功效.HeLa-CD19–蓝色；HeLaCD19+模拟–绿色；HeLaCD19+CAR-T–紫色；和HeLaCD19+CAR-T+ApoCell–橙色。图20A使用0.5×106CAR-T阳性细胞。图20B使用2.2×106CAR-T阳性细胞。
图21.体内弥漫性肿瘤SCID小鼠模型的存活曲线。曲线显示与未施用凋亡细胞(无APO；点划线····)的小鼠相比，施用早期凋亡细胞(APO；粗虚线----)延长了存活，其中对照SCID小鼠显示100％存活(实线______)。
图22A-22D.凋亡细胞输注增加白血病小鼠寿命并增加获得完全缓解的小鼠数。队列:无白血病(对照-条纹图案)；白血病+早期凋亡细胞(斑点图案)；仅白血病(实心灰色)。总共n＝51(p<0.001)图22A.凋亡细胞输注增加了白血病诱导后存活至预期寿命的小鼠的百分比。图22B.凋亡细胞输注增加了白血病诱导后存活至预期寿命的12％的小鼠的百分比。图22C.凋亡细胞输注增加了白血病诱导后存活至预期寿命的30％的小鼠的百分比。图22D.凋亡细胞输注增加了在白血病诱导后存活至预期寿命的100％并完全缓解的小鼠的百分比。
图23A-23E.凋亡细胞输注增加白血病小鼠寿命、增加获得完全缓解的小鼠数以及增强抗CD20单克隆抗体(mAb)治疗效果。队列：仅白血病(实心灰色)；白血病+早期凋亡细胞(条纹图案)；白血病+抗CD20 mAb(方格)；白血病+抗CD20+早期凋亡细胞(斑点)。总共n＝28(p<0.002)。图23A显示在用Raji细胞诱导白血病之后存活至预期寿命的小鼠百分比(％)。图23B.凋亡细胞输注增加了白血病诱导后存活至比预期寿命长24％的小鼠百分比。图23C.凋亡细胞输注增加了白血病诱导后存活长于预期寿命直至59％的小鼠百分比，并增强了抗CD20 mAb对白血病小鼠寿命的作用。图23D.凋亡细胞输注增加了白血病诱导后存活长于预期寿命直至76％的小鼠百分比，并增强了抗CD20 mAb对白血病小鼠寿命的作用。图23E.凋亡细胞输注增加了获得完全缓解的小鼠百分比。
图24.接受ApoCell的具有Raji白血病/淋巴瘤的SCID-Bg小鼠的Kaplan-Meier存活图(RPMI组，n＝15；Raji组，n＝23；Raji+ApoCell组，n＝24)RPMI(对照)–黑色；仅Raji–橙色；Raji+ApoCell–蓝色。
图25A-25C.Kaplan-Meier存活图.图25A示出来自如下研究的数据，其中雌性7周龄SCID-Bg小鼠(ENVIGO,Jerusalem,Israel)每只小鼠用0.1×106Raji细胞静脉内注射(每组n＝10，3组)。小鼠接受静脉内3剂(第5、8、11天)30×106ApoCell。(RPMI-浅蓝色；Raji-橙色；Raji+ApoCell–深蓝色)。图25B示出来自如下研究的数据，其中雌性7周龄SCID-Bg小鼠(ENVIGO,Jerusalem,Israel)每只小鼠用0.1×106Raji细胞静脉内注射(每组n＝10，3组)。小鼠接受静脉内3剂(第5、8、11天)30×106ApoCell。(RPMI-黑色；Raji-橙色；Raji+ApoCell–深蓝色)。图25C示出来自如下研究的数据，其中雌性8-9周龄SCID-Bg小鼠(ENVIGO,Jerusalem,Israel)每只小鼠用0.1×106Raji细胞静脉内注射(每组n＝10，2组)。小鼠接受静脉内3剂(第5、8、12天)30×106ApoCell。(Raji-橙色；Raji+ApoCell–深蓝色)。
图26.接受RtX和ApoCell的具有Raji白血病/淋巴瘤的SCID-Bg小鼠的Kaplan-Meier存活图(Raji单独–橙色；Raji+ApoCell–蓝色；Raji+RtX 2mg–绿色；Raji+RtX 2mg+ApoCell–黄色；Raji+RtX 5mg–紫色；Raji+RtX 5mg+ApoCell–灰色)。
图27.接受rtx和ApoCell的具有Raji白血病/淋巴瘤的SCID-Bg小鼠的Kaplan-Meier存活图。(Raji单独–橙色；Raji+ApoCell–蓝色；Raji+RtX 2mg–绿色；Raji+RtX 2mg+ApoCell–黄色)。
图28.合并的ApoCell制备物的作用。图28示出来自多个个体供体(蓝色)的凋亡细胞制备物单次注射对存活的明显作用(p<0.01)。示出的图是在GvHD小鼠模型中的Kaplan-Meier存活曲线，该模型用单剂照射的来自多个个体供体的合并的凋亡细胞制备物治疗。
图29.合并的ApoCell制备物的作用。图29示出来自多个个体供体(蓝色)的凋亡细胞制备物单次注射对两个比较组的体重损失百分比的明显作用(p＜0.01)。
图30.单供体与合并的ApoCell制备物的比较。图30示出使用诱导的GvHD的小鼠模型施用单剂单供体和多供体凋亡细胞制备物+/-辐照在％存活方面的比较。
图31A-31B.效力测试.图31A-31B示出效力测试结果，显示在与凋亡细胞相互作用之后树突细胞(DC)成熟的抑制，由HLA-DR表达测量。图31A.新鲜终产品A(t0)的HLADR平均荧光。图31B.在2-8℃24小时后终产品A的HLA DR平均荧光。
图32A-32B.效力测试.图32A-32B示出效力测试结果，所述结果显示在与凋亡细胞相互作用之后树突细胞(DC)成熟的抑制，由CD86表达测量。图32A.新鲜终产品A(t0)的CD86平均荧光。图32B.在2-8℃24小时后终产品A的CD86平均荧光。
发明详述
在下面的详细描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本文公开的方法的透彻理解。但是，本领域技术人员将理解，可以在没有这些具体细节的情况下实施这些方法。在其它情况下，未详细描述熟知的方法、程序和组件，以免模糊本文公开的方法。
众所周知，免疫细胞的遗传修饰是针对癌症的免疫细胞治疗的一种策略。这些免疫细胞治疗基于操纵和给有需要的对象施用自体或同种异体免疫细胞。基于免疫细胞的治疗包括自然杀伤细胞治疗，树突细胞治疗和T细胞免疫治疗，包括那些利用未致敏T细胞、效应T细胞也称为T辅助细胞、细胞毒性T细胞和调节T细胞(Tregs)的治疗。
在一些实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的免疫细胞的组合物。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏的T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏的CD4+T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏的T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏的CD8+T细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是树突细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的T细胞是调节T细胞(Treg)。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的T细胞是遗传修饰的T细胞受体(TCR)细胞。
在一些实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的免疫细胞和凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的免疫细胞和来自凋亡细胞的上清液的组合物。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是T细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是调节T淋巴细胞(Treg细胞)。
在一些实施方案中，本文公开了在CAR T细胞癌症治疗期间维持或提高表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)的增殖率的方法，所述方法包括以下步骤：给所述对象施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物，其中与正在进行CAR T细胞癌症治疗但未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的对象相比，所述增殖率在所述对象中得以维持或增加。
在一个相关实施方案中，所述方法不降低或抑制所述CAR T细胞癌症治疗的功效。在一个相关实施方案中，所述方法改善了所述CAR T细胞癌症治疗的功效。在另一个相关实施方案中，与未施用所述凋亡细胞或凋亡细胞上清液的对象相比，所述对象中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率被抑制或降低。
在一些实施方案中，CRS自发发生。在另一个实施方案中，CRS响应于LPS而发生。在另一个实施方案中，CRS响应于IFN-γ而发生。
在一些实施方案中，本文公开了一种提高嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)癌症治疗的功效的方法，所述方法包括施用CAR T细胞和选自以下的额外药剂的步骤：凋亡细胞，凋亡细胞上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任意组合，其中与正在进行CAR T细胞癌症治疗但未施用所述额外药剂的对象相比，所述CAR T细胞在所述对象中的功效增加。在一个相关实施方案中，至少一种促炎细胞因子的产生水平与接受了CAR T细胞癌症治疗但未施用包含所述药剂的组合物的对象中所述促炎细胞因子的水平相比是降低的。在另一个相关实施方案中，所述促炎细胞因子包含IL-6。
在一个相关实施方案中，当施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液时，与正在进行CAR T细胞癌症治疗但未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的对象相比，所述方法增加了对象中IL-2的水平。在另一个实施方案中，当施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液时，与正在进行CAR T细胞癌症治疗但未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的对象相比，所述方法维持了所述对象中IL-2的水平。在另一个实施方案中，当施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液时，与正在进行CAR T细胞癌症治疗但未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的对象相比，所述方法维持或增加所述对象中IL-2的水平。在另一个相关实施方案中，与未施用所述额外药剂的对象相比，在所述对象中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生被抑制或降低。
在一个相关实施方案中，CAR T细胞和所述额外药剂或其任何组合包含在单个组合物中。在另一个相关实施方案中，所述CAR T细胞和所述额外药剂或其任何组合包含在至少两个组合物中。
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗、预防、抑制对象的癌症或肿瘤、减少对象的癌症或肿瘤的发生率、改善或减轻对象的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)及额外药剂的步骤，所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡细胞上清液或CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合，其中与施用CAR T细胞但未施用所述额外药剂的对象相比，所述方法治疗、预防、抑制、降低所述对象的癌症或肿瘤的发病率，改善或减轻其癌症或肿瘤。
在一个相关实施方案中，与施用CAR T细胞但未施用所述额外药剂的对象相比，所述方法在治疗、预防、抑制所述对象中所述癌症或所述肿瘤、降低所述对象中所述癌症或所述肿瘤的发病率、改善或减轻所述癌症或所述肿瘤方面具有提高的功效。
在另一个相关实施方案中，至少一种促炎细胞因子的产生水平与施用所述CAR T细胞但未施用包含所述药剂的组合物的对象中所述促炎细胞因子的水平相比是降低的。在另一个相关实施方案中，所述促炎细胞因子包含IL-6。在另一个相关实施方案中，所述额外药剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液，与施用所述CAR T细胞但未施用所述凋亡细胞或凋亡细胞上清液的对象相比，所述方法增加了所述对象中IL-2的水平。在另一个相关实施方案中，所述CAR T细胞和所述额外药剂或其任何组合包含在单一组合物中。在另一个相关实施方案中，所述CAR T细胞和所述额外药剂或其任何组合包含在至少两个组合物中。
在一个相关实施方案中，在施用所述CAR T细胞之前、同时或之后施用所述额外药剂。在另一个相关实施方案中，所述凋亡细胞包含早期凋亡状态的凋亡细胞。在另一个相关实施方案中，所述凋亡细胞对于所述对象是自体的，或是合并的第三方供体细胞。
在一个相关实施方案中，所述凋亡细胞上清液通过包括以下步骤的方法获得：(a)提供凋亡细胞，(b)培养步骤(a)的细胞，和(c)从细胞中分离上清液。在另一个相关实施方案中，所述凋亡细胞上清液是凋亡细胞-白细胞上清液，且所述方法还包括以下步骤：(d)提供白细胞，(e)任选地，洗涤所述凋亡细胞和白细胞，(f)共培养所述凋亡细胞和白细胞，其中步骤(d)-(f)代替步骤(b)。在另一个相关实施方案中，提供的白细胞选自吞噬细胞、巨噬细胞、树突细胞、单核细胞、B细胞、T细胞和NK细胞。因此，在一些实施方案中，凋亡细胞上清液包含通过培养凋亡细胞与巨噬细胞而产生的上清液，其中所述巨噬细胞摄取所述凋亡细胞，以及使用由这种共培养产生的上清液。在一些实施方案中，凋亡细胞上清液包含通过培养凋亡细胞产生的上清液，其中所述上清液是由所述凋亡细胞分泌的材料产生的。
在一些实施方案中，本文公开了包含早期凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，本文公开了包含早期凋亡细胞组合额外药剂的组合物。在一些实施方案中，所述额外药剂可以是CAR T细胞。在一些实施方案中，所述额外药剂可以是抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含利妥昔单抗或其功能片段。
在一些实施方案中，早期凋亡细胞的组合物包含单个核凋亡细胞群，所述单个核凋亡细胞群包含早期凋亡状态的单核细胞，其中所述单核凋亡细胞群包含：百分比降低的非静止非凋亡活细胞，细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞，或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。
在一些实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的T细胞和凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的T细胞和凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的T细胞是遗传修饰的T细胞受体(TCR)细胞。
在一些实施方案中，本文公开了包含CAR T细胞和凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的T细胞受体细胞(TCR)和凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，本文公开了包含CAR T细胞和凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的T细胞受体细胞(TCR)和凋亡细胞上清液的组合物。
在某些实施方案中，遗传修饰的免疫细胞和凋亡细胞或凋亡细胞上清液包含在单个组合物中。在其它实施方案中，遗传修饰的免疫细胞和凋亡细胞或凋亡细胞上清液包含在单独的组合物中。
在一些实施方案中，本公开提供了包含处于早期凋亡状态的合并的单个核凋亡细胞制备物，其中所述合并的单个核凋亡细胞制备物包含合并的各个单个核细胞群，其中所述合并的单个核凋亡细胞制备物包含百分比降低的活的非凋亡细胞，细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞，或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。在另一个实施方案中，所述合并的单个核凋亡细胞已被辐照。在另一个实施方案中，本公开提供了合并的单个核凋亡细胞制备物，其在一些实施方案中使用得自献血血液的白细胞级分(WBC)。通常，这种WBC级分在血库中被丢弃或用于研究。
在一些实施方案中，本文公开的细胞群是失活的。在另一个实施方案中，失活包含辐照。在另一个实施方案中，失活包含T细胞受体失活。在另一个实施方案中，失活包含T细胞受体编辑。在另一个实施方案中，失活包含抑制或消除所述制备物的免疫应答。在另一个实施方案中，失活包含抑制或消除所述制备物中包含的多个个体细胞群之间的交叉反应性。在其它实施方案中，失活包含降低或消除所述制备物中包含的多个个体细胞群之间的T细胞受体活性。在另一个实施方案中，失活的细胞制备物包含百分比降低的活的非凋亡细胞、细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞、或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。
在另一个实施方案中，与非辐照的细胞制备物相比，失活的细胞群包含数量减少的非静止非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群包含50％的活的非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群包含40％的活的非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群包含30％的活的非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群包含20％的活的非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群包含100％的活的非凋亡细胞。在一些实施方案中，失活的细胞群包含0％的活的非凋亡细胞。
在一些实施方案中，本文公开了一种制备失活的早期凋亡细胞群的方法。在一些实施方案中，本文公开了一种产生单个核凋亡细胞群的方法，所述单个核凋亡细胞群包含百分比降低的非静止非凋亡活细胞，细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞，或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合，所述方法包括以下步骤，
获得富含单个核的外周血细胞群；
将所述富含单个核的细胞群在包含抗凝剂的冷冻培养基中冷冻；
解冻所述富含单个核的细胞群；
将所述富含单个核的细胞群在凋亡诱导保温培养基中保温，所述培养基包含终浓度为约10-100μg/mL的甲泼尼龙和抗凝剂；
将所述凋亡细胞群重悬于施用培养基中；及
使所述富含单个核的细胞群失活，其中所述失活在诱导后发生；
其中所述方法产生这样的单个核凋亡细胞群，其包含百分比降低的非静止非凋亡细胞，细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞，或增殖降低的任何活的非凋亡细胞，或其任何组合。
在另一个实施方案中，所述辐照包含γ辐照或UV辐照。在又一个实施方案中，与未辐照的细胞制备物相比，辐照的制备物具有数量减少的非静止非凋亡细胞。
在另一个实施方案中，所述合并的单个核凋亡细胞已经经历了T细胞受体失活。在另一个实施方案中，所述合并的单个核凋亡细胞已经过T细胞受体编辑。
在一些实施方案中，就接受者而言，合并的血液包含来自HLA匹配或HLA不匹配来源的第三方血液。
在一些实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的免疫细胞例如但不限于CAR T细胞及额外药剂的组合物，所述额外药剂选自凋亡细胞、凋亡细胞上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合。
在一些实施方案中，本公开提供了制备包含合并的单个核凋亡细胞制备物的药物组合物的方法，所述合并的单个核凋亡细胞制备物包含合并的处于早期凋亡状态的各个单个核细胞群，其中所述组合物包含百分比降低的活的非凋亡细胞、具有细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞的制备物、或具有增殖降低的任何活的非凋亡细胞的制备物，或其任何组合。在另一个实施方案中，所述方法提供了一种包含合并的单个核凋亡细胞制备物的药物组合物，所述合并的单个核凋亡细胞制备物包含合并的处于早期凋亡状态的各个单个核细胞群，其中所述组合物包含百分比降低的非静止非凋亡细胞。
在一些实施方案中，本文公开了一种治疗、预防对象的癌症或肿瘤、抑制对象的癌症或肿瘤的生长、降低其发病率或其任何组合的方法，所述方法包括给所述对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法治疗、预防所述对象的癌症或肿瘤、抑制所述对象的癌症或肿瘤的生长、降低其发病率或其任何组合。在一些实施方案中，所述方法包括治疗、预防对象中的癌症或肿瘤、抑制对象中癌症或肿瘤的生长，延缓疾病进展，降低肿瘤负荷或降低对象中癌症或肿瘤的发生率或其任何组合，所述方法包括给所述对象施用包含早期凋亡细胞群的组合物的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括给所述对象施用其它免疫治疗、化疗剂或免疫调节剂或其任何组合治疗。在一些实施方案中，在施用所述早期凋亡细胞之前、同时或之后，施用所述其它免疫治疗、化疗剂或免疫调节剂。
在一些实施方案中，本文公开了一种提高患有癌症或肿瘤的对象的存活的方法，包括给所述对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法增加了所述对象的存活。在一些实施方案中，所述方法进一步包括给所述对象施用其它免疫治疗、化疗剂或免疫调节剂或其任何组合。在一些实施方案中，在施用所述早期凋亡细胞之前、同时或之后施用所述其它免疫治疗、化疗剂或免疫调节剂。
在一些实施方案中，本文公开了降低对象中癌症或肿瘤的大小或降低其生长速度或其组合的方法，包括给所述对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法降低癌症或肿瘤的大小或降低其生长速度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括给所述对象施用其它免疫治疗、化疗剂或免疫调节剂或其任何组合。在一些实施方案中，在施用所述早期凋亡细胞之前、同时或之后施用所述其它免疫治疗、化疗剂或免疫调节剂。
在一些实施方案中，施用包含凋亡细胞的组合物不影响CAR T细胞治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发病率、改善、降低肿瘤负荷或减轻癌症或肿瘤的功效。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞的组合物降低CAR T细胞治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发病率、改善、降低肿瘤负荷或减轻癌症或肿瘤的功效不超过大约5％。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞的组合物降低CAR T细胞治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发病率、改善、降低肿瘤负荷或减轻癌症或肿瘤的功效不超过大约10％。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞的组合物降低CAR T细胞治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发病率、改善、降低肿瘤负荷或减轻癌症或肿瘤的功效不超过大约15％。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞的组合物降低CAR T细胞治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发病率、改善、降低肿瘤负荷或减轻癌症或肿瘤的功效不超过大约20％。
在一些实施方案中，施用凋亡细胞提高CAR T细胞的功效。在一些实施方案中，施用凋亡细胞使CAR T细胞的功效提高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45或至少50％。
在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞上清液的组合物降低CAR T细胞治疗、预防、抑制所述癌症或所述肿瘤、降低所述癌症或所述肿瘤的发生率、改善或减轻所述癌症或所述肿瘤的功效不超过大约5％。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞上清液的组合物降低CAR T细胞治疗、预防、抑制所述癌症或所述肿瘤、降低所述癌症或所述肿瘤的发生率、改善或减轻所述癌症或所述肿瘤的功效不超过大约10％。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞上清液的组合物降低CAR T细胞治疗、预防、抑制所述癌症或所述肿瘤、降低所述癌症或所述肿瘤的发生率、改善或减轻所述癌症或所述肿瘤的功效不超过大约15％。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞上清液的组合物降低CAR T细胞治疗、预防、抑制所述癌症或所述肿瘤、降低所述癌症或所述肿瘤的发生率、改善或减轻所述癌症或所述肿瘤的功效不超过大约20％。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞上清液的组合物不影响CART细胞治疗、预防、抑制所述癌症或所述肿瘤、降低所述癌症或所述肿瘤的发生率、改善或减轻所述癌症或所述肿瘤的功效。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞上清液的组合物不降低CAR T细胞治疗、预防、抑制所述癌症或所述肿瘤、降低所述癌症或所述肿瘤的发生率、改善或减轻所述癌症或所述肿瘤的功效。
在一些实施方案中，本文公开了在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法。在另一个实施方案中，本文公开的方法在经历CAR T细胞癌症治疗的对象中减少或预防细胞因子产生，从而抑制或减少对象中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，本文公开的在经历CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括给所述经历癌症治疗的对象施用包含凋亡细胞的组合物的步骤。在又一个实施方案中，本文公开的在经历CAR T细胞癌症治疗的对象中减少或抑制细胞因子产生的方法包括给经历癌症治疗的对象施用包含凋亡细胞的组合物的步骤。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞的组合物不影响CAR T细胞治疗的功效。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞或凋亡上清液的组合物不会降低CAR T细胞治疗的功效。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物不会使CAR T细胞治疗的功效降低超过大约5％。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物不会使CAR T细胞治疗的功效降低超过大约10％。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物不会使CAR T细胞治疗的功效降低超过大约15％。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物不会使CAR T细胞治疗的功效降低超过大约20％。
在一些实施方案中，本文公开了在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴攻击的对象中减少或抑制细胞因子产生的方法，包括施用本文所述的凋亡细胞上清液或包含所述凋亡细胞上清液的组合物的步骤。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液包含凋亡细胞-吞噬细胞上清液。
在一些实施方案中，本文公开的在经历CAR T细胞癌症治疗的对象中减少或抑制细胞因子产生的方法包括给经历癌症治疗的对象施用包含凋亡细胞上清液的组合物的步骤。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞上清液的组合物不影响CAR T细胞治疗的功效。在另一个实施方案中，施用包含凋亡细胞上清液的组合物不降低CAR T细胞治疗的功效。
在一些实施方案中，在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)癌症治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括以下步骤：给所述对象施用包含凋亡细胞或凋亡上清液的组合物。在另一个实施方案中，在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)癌症治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法减少或抑制对象中至少一种促炎细胞因子的产生。
在另一个实施方案中，本公开提供了在需要的对象中使用如本文所述的包含处于早期凋亡状态的单个核细胞的合并的单个核凋亡细胞制备物治疗、预防、改善、抑制免疫疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、细胞因子释放综合征(CRS)、细胞因子风暴或不育症或减少其发生率的方法。在另一个实施方案中，本文公开了合并的单个核凋亡细胞制备物，其中在某些实施方案中使用这种细胞制备物不需要匹配的供体和受体，例如通过HLA分型。
遗传修饰的免疫细胞
众所周知，免疫细胞的遗传修饰是针对癌症的免疫细胞治疗的一种策略。这些免疫细胞治疗基于对有需要对象的自体或同种异体免疫细胞的操纵和施用。基于免疫细胞的治疗包括自然杀伤细胞治疗、树突细胞治疗和T细胞免疫治疗包括利用未致敏T细胞、效应T细胞(也称为T辅助细胞)、细胞毒性T细胞和调节T细胞(Treg)的那些治疗。
在一个实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的免疫细胞的组合物。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏的T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏的CD4+T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏的CD8+T细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是树突细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的T细胞是调节T细胞(Treg)。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的T细胞是遗传修饰的T细胞受体(TCR)细胞。
在一个实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的免疫细胞和额外药剂的组合物，所述额外药剂选自凋亡细胞、凋亡细胞上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合。在另一个实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的免疫细胞、凋亡细胞和额外药剂的组合物，所述额外药剂选自CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合。在另一个实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的免疫细胞、凋亡细胞上清液和额外药剂的组合物，所述额外药剂选自CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合。
在一个实施方案中，所述免疫细胞是细胞毒性的。在另一个实施方案中，用于遗传修饰的细胞毒性细胞可得自对象的骨髓(自体)或供体骨髓(同种异体)。在其它情况下，所述细胞得自干细胞。例如，细胞毒性细胞可以衍生自人多能干细胞如人胚胎干细胞或人诱导的多能T细胞。在诱导的多能干细胞(IPSC)的情况下，可使用来自为其提供了遗传修饰的细胞毒性细胞的对象的体细胞获得这种多能T细胞。在一个实施方案中，可以通过静脉穿刺、通过单采血液分离术(apheresis)、通过白细胞动员及随后进行单采血液分离术或静脉穿刺或通过骨髓抽吸来收获细胞，从而从对象或供体获得免疫细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞如T细胞是通过体内存在特定因子而产生和扩展的。在另一个实施方案中，体内细胞因子影响T细胞的产生和维持。在另一个实施方案中，影响体内T辅助细胞的产生和维持的细胞因子包含IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-21、IL-23、IL-25、IL-33和TGFβ。在另一个实施方案中，通过体内细胞因子诱导从未致敏T细胞产生Treg细胞。在另一个实施方案中，TGF-β和/或IL-2在分化未致敏T细胞成为Treg细胞中起作用。
在另一个实施方案中，选自IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-21、IL-23、IL-25、IL-33和TGFβ的细胞因子的存在可以维持或增加、或者维持和增加体内T细胞的增殖速度。在另一个实施方案中，细胞因子IL-2和/或TGFβ的存在可以维持或增加、或者维持和增加体内T细胞的增殖速度。在另一个实施方案中，选自IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-21、IL-23、IL-25、IL-33和TGFβ的细胞因子的存在维持或增加、或者维持和增加体内CAR T细胞的增殖速度。在另一个实施方案中，细胞因子IL-2和/或TGFβ的存在维持或增加、或者维持和增加体内CAR T细胞的增殖速度。在另一个实施方案中，选自IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-21、IL-23、IL-25、IL-33和TGFβ的细胞因子的存在维持或增加、或者维持和增加体内TCRT细胞的增殖速度。在另一个实施方案中，细胞因子IL-2和/或TGFβ的存在维持或增加、或者维持和增加体内TCR T细胞的增殖速度。在另一个实施方案中，选自IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-21、IL-23、IL-25、IL-33和TGFβ的细胞因子的存在维持或增加、或者维持和增加体内T-reg细胞的增殖速度。在另一个实施方案中，细胞因子IL-2和/或TGFβ的存在维持或增加、或者维持和增加体内T-reg细胞的增殖速度。
在一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白或BACH2编码蛋白表达或形式的T细胞被维持延长的时间和或具有增加的增殖速度或二者。在另一个实施方案中，所述改变的表达增加STAT5B多肽的表达。在另一个实施方案中，所述改变的表达增加BACH2多肽的表达。
在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。
在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过1年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过2年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过3年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过4年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过5年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过10年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过20年。
在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过1年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过2年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过3年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过4年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过5年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过10年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过20年。
在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过1年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过2年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过3年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过4年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过5年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过10年。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过20年。
在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过1年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过2年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过3年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过4年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过5年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过10年。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的T细胞在体内维持或增加其增殖速度超过20年。
在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的CAR T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的CAR T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的CAR T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的CAR T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。
在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的TCR T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的TCR T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的TCR T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的TCR T细胞在体内维持延长的时间或具有增加的增殖速度。
在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白表达的Treg细胞在体内维持或增加其增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白表达的Treg细胞在体内维持或增加其增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的STAT5B编码蛋白形式的Treg细胞在体内维持或增加其增殖速度。在另一个实施方案中，具有改变的BACH2编码蛋白形式的Treg细胞在体内维持或增加其增殖速度。
在一个实施方案中，本文公开了维持或提高遗传修饰的免疫细胞的增殖速度的方法，其中所述方法包括施用凋亡细胞或凋亡上清液的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了提高遗传修饰的免疫细胞的功效的方法，其中所述方法包括以下步骤：施用包含凋亡细胞、凋亡上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗-胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合的额外药剂。在另一个实施方案中，本文揭示的用于治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法施用遗传修饰的免疫细胞和额外药剂，其中所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合。
表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)是一种抗原靶向受体，由与细胞外肿瘤结合部分融合的细胞内T细胞信号转导结构域组成，最常见的是来自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)。CAR直接识别细胞表面抗原，而不依赖于MHC介导的呈递，从而允许在所有患者中使用特异于任何给定抗原的单一受体构建体。最初的CAR将抗原识别结构域融合于T细胞受体(TCR)复合物的CD3ζ活性链。虽然这些第一代CAR在体外诱导T细胞效应子功能，但很大程度上却受限于在体内不良的抗肿瘤功效。随后的CAR迭代包括与CD3ζ串联的次级共刺激信号，包括CD28的细胞内结构域或各种TNF受体家族分子例如4-1BB(CD137)和OX40(CD134)。此外，第三代受体除了CD3ζ之外包括两个共刺激信号，最通常来自CD28和4-1BB。第二代和第三代CAR显著改良了抗肿瘤功效，在某些情况下诱导晚期癌症患者的完全缓解。
在一些实施方案中，CAR T细胞是包含抗原受体的免疫应答细胞，当其受体结合其抗原时被激活。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第一代CAR T细胞。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第二代CAR T细胞。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第三代CAR T细胞。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第四代CAR T细胞。在一些实施方案中，每一代CAR T细胞都比前几代CAR T细胞更有效。
在一些实施方案中，第一代CAR具有一个信号转导结构域，通常是CD3 TCRζ链的胞质信号转导结构域。
在另一个实施方案中，本文公开的CAR T细胞是第二代CAR T细胞。在另一个实施方案中，本文公开的CAR T细胞包含三重嵌合受体(TPCR)。在一些实施方案中，本文公开的CAR T细胞包含一种或多种以共刺激非依赖性方式激活未致敏T细胞的信号转导部分。在另一个实施方案中，CAR T细胞还编码肿瘤坏死因子受体家族的一个或多个成员，在一些实施方案中，其是CD27、4-1BB(CD137)或OX40(CD134)或其组合。
第三代CAR T细胞试图利用2个共刺激结构域的信号转导潜力：在一些实施方案中，CD28结构域及随后的4-1BB或OX-40信号转导结构域。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞进一步编码共刺激信号转导结构域，在一个实施方案中其为CD28。在另一个实施方案中，信号转导结构域是CD3ζ链、CD97、GDI 1a-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、CDS、OX40、4-1BB、CD28信号转导结构域或其组合。
在一些实施方案中，端粒长度和复制能力与过继转移的T细胞系的植入效率和抗肿瘤功效相关。在一些实施方案中，CD28刺激维持T细胞中的端粒长度。
在一些实施方案中，可以通过导入额外基因进一步增强CAR修饰的T细胞效力，所述基因包括编码增殖性细胞因子(即IL-12)或共刺激配体(即4-1BBL)的基因，从而产生“armored”第四代CAR修饰的T细胞。在一些实施方案中，“armored CAR T细胞”是被保护免受抑制性肿瘤微环境影响的CAR T细胞。在另一个实施方案中，“armored”CAR技术结合了可溶性信号转导蛋白的局部分泌，以在肿瘤微环境内放大免疫应答，目的是使全身性副作用最小化。在一些实施方案中，信号转导蛋白信号是IL-12，其可以刺激T细胞活化和募集。在一些实施方案中，“armored”CAR技术特别用于实体瘤适应症中，其中微环境和有效的免疫抑制机制具有使得建立强大的抗肿瘤应答更具挑战性的潜力。
在一些实施方案中，CAR T细胞被遗传修饰为编码参与防止凋亡、肿瘤微环境重塑、诱导稳态增殖和促进定向T细胞归巢的趋化因子受体的分子。
在另一个实施方案中，使用细胞因子转基因的表达、与小分子抑制剂的组合治疗或单克隆抗体以增强在本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞治疗。在另一个实施方案中，旨在改善CAR T细胞治疗的其它策略包括使用双重CAR和趋化因子受体以更特异性靶向肿瘤细胞的策略被认为是本文公开的CAR T细胞和CAR T细胞治疗的一部分。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法中的CAR T细胞包含第二个结合结构域，其可以导致抑制或放大信号，以增加CAR T细胞对癌细胞相对正常细胞的特异性。例如，可以对CAR T细胞进行工程化，由此其在一种靶蛋白的存在下被触发，但是如果存在另一种蛋白，则被抑制。或者，也可以对其进行工程化，由此需要两个靶蛋白以最大化激活。相对于正常组织，这些方法可以增加CAR对肿瘤的特异性。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞编码基于抗体的外部受体结构和胞质结构域，其编码由基于免疫受体酪氨酸的活化基序组成的信号转导模块。
在一些实施方案中，CAR T细胞进一步编码结合具有免疫抑制活性的多肽的单链可变片段(scFv)。在另一个实施方案中，具有免疫抑制活性的多肽是CD47、PD-1、CTLA-4或其组合。
在一些实施方案中，CAR T细胞进一步编码结合具有免疫刺激活性的多肽的单链可变片段(scFv)。在另一个实施方案中，具有免疫刺激活性的多肽是CD28、OX-40、4-1BB或其组合。在另一个实施方案中，CAR T细胞进一步编码CD40配体(CD40L)，其在一些实施方案中增强抗原的免疫刺激活性。
在一些实施方案中，免疫细胞是细胞毒性的。在另一个实施方案中，用于遗传修饰的细胞毒性细胞可以得自对象或供体的骨髓。在其它情况下，所述细胞得自干细胞。例如，细胞毒性细胞可以衍生自人多能干细胞，例如人胚胎干细胞或人诱导的多能T细胞。在诱导的多能干细胞(IPSC)的情况下，可使用为其提供了遗传修饰的细胞毒性细胞的对象的体细胞获得这种多能T细胞。在一些实施方案中，可以通过静脉穿刺、单采血液分离术、白细胞动员及随后的单采血液分离术或静脉穿刺术或通过骨髓抽吸收获细胞而从对象或供体获得免疫细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括从对象获得免疫细胞，并遗传修饰免疫细胞以表达嵌合抗原受体。在另一个实施方案中，本文公开的方法包括从对象获得免疫细胞，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体，并与凋亡细胞群组合，导致所述对象中细胞因子的产生减少，但相对于表达CAR的免疫细胞但未施用凋亡细胞群而言，细胞毒性基本上未受影响(图1A-1B和图2)。在另一个实施方案中，本文公开的方法包括从对象获得免疫细胞，对所述免疫细胞进行遗传修饰以表达嵌合抗原受体，并与凋亡细胞上清液或包含所述上清液的组合物组合，导致所述对象中细胞因子的产生减少，但相对于表达CAR的免疫细胞但未施用凋亡细胞上清液而言，细胞毒性基本上未受影响。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞群或凋亡细胞上清液并不降低表达嵌合抗原受体的免疫细胞的功效。
在一个实施方案中，本文公开的是免疫细胞，在一些实施方案中是CAR T细胞，其中T细胞是对象是自体的。在另一个实施方案中，CAR T细胞是对象是异源的。在一些实施方案中，CAR T细胞是同种异体的。在一些实施方案中，CAR T细胞是通用同种异体CAR T细胞。在另一个实施方案中，T细胞可以是自体的、同种异体的或在体外衍生自工程化的祖细胞或干细胞。
在另一个实施方案中，本文所述的CAR T细胞和凋亡细胞均衍生自同一来源。在另一个实施方案中，本文所述的CAR T细胞和凋亡细胞均衍生自所述对象(图1)。在另一个实施方案中，本文所述的CAR T细胞和凋亡细胞衍生自不同来源。在又一个实施方案中，CAR T细胞是自体的，本文所述的凋亡细胞是同种异体的(图2)。本领域技术人员将理解，类似地，凋亡细胞上清液可以从与所述CAR T细胞相同来源的细胞制备，在一个实施方案中可以是自体细胞，或者凋亡细胞上清液可以从衍生自与CAR T细胞来源不同的来源的细胞制备。
本领域技术人员将理解，术语“异源”可以涵盖衍生自不同生物体的组织、细胞、核酸分子或多肽。在一些实施方案中，异源蛋白质是最初克隆自或衍生自与受体不同的T细胞类型或不同物种的蛋白质，通常不存在于细胞或得自细胞的样品中。
因此，本文公开的一个实施方案涉及包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞毒性免疫细胞(例如NK细胞或T细胞)，由此所述细胞保持其细胞毒性功能。在另一个实施方案中，嵌合抗原受体对于T细胞是外源的。在另一个实施方案中，CAR是重组表达的。在另一个实施方案中，CAR从载体表达。
在一些实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是未致敏的CD4+T细胞。在另一个实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是未致敏的CD8+T细胞。在另一个实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是效应T细胞。在另一个实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是调节T细胞(Treg)。在另一个实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是细胞毒性T细胞。
用于遗传修饰的免疫细胞例如T细胞的来源已经在文献中充分描述，参见例如Themelli et al.(2015)New Cell Sources for T Cell Engineering and AdoptiveImmunotherapy.Cell Stem Cell 16:357-366；Han et al.(2013)Journal ofHematology&Oncology 6:47-53；Wilkie et al.(2010)J Bio Chem 285(33):25538-25544及van der Stegen et al.(2013)J.Immunol 191:4589-4598。CAR T细胞可从商业来源订购，如购自Creative Biolabs(NY USA)，该公司可为嵌合抗原受体(CAR)提供定制构建和生产服务，还提供预制的CAR构建体原种，其可以诱导保护性免疫，由重组腺病毒疫苗编码。定制CAR T细胞也可以得自Promab Biotechnologies(CA USA)，该公司可以提供专门设计的CAR T细胞。
T-细胞受体(TCR)细胞
在一个实施方案中，本文公开的组合物和方法除了CAR T细胞之外或代替CAR T细胞，利用设计(designer)T细胞受体(TCR)细胞。TCR是介导T细胞抗原特异性活化的多亚基跨膜复合物。TCR由两条不同的多肽链组成。通过识别靶细胞例如肿瘤或癌细胞上的抗原表位，TCR赋予T细胞抗原特异性。与存在于肿瘤或癌细胞上的抗原接触后，T细胞增殖并获得表型和功能以使其消除所述癌细胞或肿瘤细胞。
在一个实施方案中，TCR T细胞治疗包含将特异于感兴趣蛋白质的表位的T细胞受体(TCR)导入T细胞。在另一个实施方案中，感兴趣的蛋白质是肿瘤相关抗原。在另一个实施方案中，遗传工程化的TCR识别由肿瘤细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)以及T细胞活化结构域呈递的肿瘤抗原表位。在另一个实施方案中，T细胞受体识别抗原，而与其细胞内或膜定位无关。在另一个实施方案中，TCR识别在细胞内表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞。在一个实施方案中，TCR识别内部抗原。在另一个实施方案中，TCR识别血管生成因子。在另一个实施方案中，血管生成因子是参与新血管形成的分子。各种遗传修饰的T细胞受体及其产生方法为本领域已知。
在一个实施方案中，TCR T细胞治疗用于治疗、预防、抑制、改善癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发生率或减轻癌症或肿瘤。在一个实施方案中，TCR T细胞治疗用于治疗、预防、抑制、改善晚期转移性疾病、降低晚期转移性疾病的发生率或者减轻晚期转移性疾病，所述晚期转移性疾病包括血液肿瘤(淋巴瘤和白血病)及实体瘤(难治性黑素瘤，肉瘤)。在一个实施方案中，本文公开的组合物和方法中使用的TCR T细胞治疗治疗在Sadelain etal.,(Cancer Discov.2013Apr；3(4):388–398)中表1列出的恶性肿瘤。
在另一个实施方案中，T细胞受体被遗传修饰为结合NY-ESO-1表位，TCR工程化的T细胞是抗NY-ESO-1。在另一个实施方案中，T细胞受体被遗传修饰为结合HPV-16E6表位，TCR工程化的T细胞是抗HPV-16E6。在另一个实施方案中，T细胞受体被遗传修饰为结合HPV-16E7表位，TCR工程化的T细胞是抗HPV-16E7。在另一个实施方案中，T细胞受体被遗传修饰为结合MAGE A3/A6表位，TCR工程化的T细胞是抗MAGE A3/A6。在另一个实施方案中，T细胞受体被遗传修饰为结合MAGE A3表位，TCR工程化的T细胞是抗MAGE A3。在另一个实施方案中，T细胞受体被遗传修饰为结合SSX2表位，TCR工程化的T细胞是抗SSX2。在另一个实施方案中，T细胞受体被遗传修饰为结合本文公开的靶抗原。使用本领域熟知的工具，技术人员将意识到可以对T细胞受体进行遗传修饰以结合在癌症或肿瘤细胞上呈递的靶抗原，其中TCR工程化的T细胞包含抗肿瘤或抗癌细胞。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括从对象获得免疫细胞，对免疫细胞进行遗传修饰以表达重组T细胞受体(TCR)。在另一个实施方案中，本文公开的方法包括从对象获得免疫细胞，对免疫细胞进行遗传修饰以表达重组TCR并与额外药剂组合，其中所述额外药剂包含凋亡细胞群、凋亡细胞上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂，或其任意组合。
在一个实施方案中，用于产生TCR T细胞的T细胞是未致敏的CD4+T细胞。在另一个实施方案中，用于产生TCR T细胞的T细胞是未致敏的CD8+T细胞。在另一个实施方案中，用于产生TCR T细胞的T细胞是效应T细胞。在另一个实施方案中，用于产生TCR T细胞的T细胞是调节T细胞(Treg)。在另一个实施方案中，用于产生TCR T细胞的T细胞是细胞毒性T细胞。
TCR T细胞在文献中已经充分描述，见例如Sharpe and Mount(2015)ibid.；Essand M,Loskog ASI(2013)Genetically engineered T cells for the treatment ofcancer(Review).J Intern Med 273:166–181及Kershaw et al.(2014)Clinicalapplication of genetically modified T cells in cancer therapy.Clinical&Translational Immunology 3:1-7。
靶向抗原
在一些实施方案中，CAR通过针对抗原的抗体或抗体片段与抗原的表位结合。在另一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体是多克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体片段是单链可变片段(scFv)。
在一个实施方案中，TCR通过遗传修饰的T细胞受体与抗原表位结合。
在另一个实施方案中，本文公开的组合物的CAR T细胞结合肿瘤相关抗原(TAA)。在另一个实施方案中，所述肿瘤相关抗原是：粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)或多态性上皮粘蛋白(PEM)，在早期肿瘤中突变的Arginine-rich(Armet)，热休克蛋白60(HSP60)，钙连蛋白(CANX)，亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖的)2，次甲基四氢叶酸环水解酶(MTHFD2)，成纤维细胞活化蛋白(FAP)，基质金属肽酶(MMP6)，B黑色素瘤抗原1(BAGE-1)，N-乙酰葡糖氨基转移酶V的异常转录物(GnTV)，Q5H943，癌胚抗原(CEA)，Pmel，激肽释放酶4，乳腺珠蛋白(mammaglobin)-1，MART-1，GPR143-OA1，前列腺特异性抗原(PSA)，TRP1，酪氨酸酶，FGP-5，NEU原癌基因，Aft，MMP-2，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，端粒酶相关蛋白-2，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，Uroplakin II或蛋白酶3。
在另一个实施方案中，在如白血病中想要破坏B细胞的情况下，CAR结合CD19或CD20以靶向B细胞。CD19是一种B细胞谱系特异性表面受体，其在从原B细胞至早期浆细胞的广泛表达使其成为B细胞恶性肿瘤免疫治疗的引人注目的靶位。在另一个实施方案中，CAR结合ROR1、CD22或GD2。在另一个实施方案中，CAR结合NY-ESO-1。在另一个实施方案中，CAR结合MAGE家族蛋白。在另一个实施方案中，CAR结合间皮素。在另一个实施方案中，CAR结合c-erbB2。在另一个实施方案中，CAR结合肿瘤特异性的突变抗原，例如BRAFV600E突变和BCR-ABL易位。在另一个实施方案中，CAR结合肿瘤特异性的病毒抗原，例如HD中的EBV，宫颈癌中的HPV和Merkel癌中的多瘤病毒。在另一个实施方案中，CAR T细胞结合Her2/neu。在另一个实施方案中，CAR T细胞结合EGFRvIII。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)T细胞结合CD19抗原。在另一个实施方案中，CAR结合CD22抗原。在另一个实施方案中，CAR结合α叶酸受体。在另一个实施方案中，CAR结合CAIX。在另一个实施方案中，CAR结合CD20。在另一个实施方案中，CAR结合CD23。在另一个实施方案中，CAR结合CD24。在另一个实施方案中，CAR结合CD30。在另一个实施方案中，CAR结合CD33。在另一个实施方案中，CAR结合CD38。在另一个实施方案中，CAR结合CD44v6。在另一个实施方案中，CAR结合CD44v7/8。在另一个实施方案中，CAR结合CD123。在另一个实施方案中，CAR结合CD171。在另一个实施方案中，CAR结合癌胚抗原(CEA)。在另一个实施方案中，CAR结合EGFRvIII。在另一个实施方案中，CAR结合EGP-2。在另一个实施方案中，CAR结合EGP-40。在另一个实施方案中，CAR结合EphA2。在另一个实施方案中，CAR结合Erb-B2。在另一个实施方案中，CAR结合Erb-B 2,3,4。在另一个实施方案中，CAR结合Erb-B3/4。在另一个实施方案中，CAR结合FBP。在另一个实施方案中，CAR结合胎儿乙酰胆碱受体。在另一个实施方案中，CAR结合GD2。在另一个实施方案中，CAR结合GD3。在另一个实施方案中，CAR结合HER2。在另一个实施方案中，CAR结合HMW-MAA。在另一个实施方案中，CAR结合IL-11Rα。在另一个实施方案中，CAR结合IL-13Rα1。在另一个实施方案中，CAR结合KDR。在另一个实施方案中，CAR结合κ轻链。在另一个实施方案中，CAR结合Lewis Y。在另一个实施方案中，CAR结合L1细胞粘附分子。在另一个实施方案中，CAR结合MAGE-A1。在另一个实施方案中，CAR结合间皮素。在另一个实施方案中，CAR结合CMV感染的细胞。在另一个实施方案中，CAR结合MUC1。在另一个实施方案中，CAR结合MUC16。在另一个实施方案中，CAR结合NKG2D配体。在另一个实施方案中，CAR结合NY-ESO-1(氨基酸157-165)。在另一个实施方案中，CAR结合癌胚抗原(h5T4)。在另一个实施方案中，CAR结合PSCA。在另一个实施方案中，CAR结合PSMA。在另一个实施方案中，CAR结合ROR1。在另一个实施方案中，CAR结合TAG-72。在另一个实施方案中，CAR结合VEGF-R2或其它VEGF受体。在另一个实施方案中，CAR结合B7-H6。在另一个实施方案中，CAR结合CA9。在另一个实施方案中，CAR结合αvβ6整联蛋白。在另一个实施方案中，CAR结合8H9。在另一个实施方案中，CAR结合NCAM。在另一个实施方案中，CAR结合胎儿乙酰胆碱受体。
在另一个实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)T细胞靶向CD19抗原，且对患有B细胞恶性肿瘤、ALL、滤泡性淋巴瘤、CLL和淋巴瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CART细胞靶向CD22抗原，且对患有B细胞恶性肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向α叶酸受体或叶酸受体α，且对患有卵巢癌或上皮癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CAIX或G250/CAIX，且对患有肾细胞癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CD20，且对患有淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和缓慢进展B细胞淋巴瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CD23，且对患有CLL的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CD24，且对患有胰腺腺癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CD30，且对患有淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CART细胞靶向CD33，且对患有AML的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CD38，且对患有非霍奇金淋巴瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CD44v6，且对患有几种恶性肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CD44v7/8，且对患有宫颈癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CD123，且对患有骨髓恶性肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CEA，且对患有结肠直肠癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向EGFRvIII，且对患有成胶质细胞瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向EGP-2，且对患有多发性恶性肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向EGP-40，且对患有结肠直肠癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向EphA2，且对患有成胶质细胞瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向Erb-B2或ErbB3/4，且对患有乳腺癌和其它疾病、前列腺癌、结肠癌、各种肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向Erb-B 2,3,4，且对患有乳腺癌和其它疾病的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向FBP，且对患有卵巢癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向胎儿乙酰胆碱受体，且对患有横纹肌肉瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向GD2，且对患有神经母细胞瘤、黑素瘤或尤因氏肉瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向GD3，且对患有黑素瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向HER2，且对患有髓母细胞瘤、胰腺腺癌、成胶质细胞瘤、骨肉瘤或卵巢癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向HMW-MAA，且对患有黑素瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向IL-11Rα，且对患有骨肉瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向IL-13Rα1，且对患有胶质瘤、胶质母细胞瘤或髓母细胞瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向IL-13受体α2，且对患有几种恶性肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向KDR，且通过靶向肿瘤新脉管系统对患有肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向κ轻链，且对患有B细胞恶性肿瘤(B-NHL，CLL)的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向LewisY，且对患有各种癌或上皮来源的肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向L1细胞粘附分子，且对患有神经母细胞瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向MAGE-A1或HLA-A1 MAGE A1，且对患有黑素瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向间皮素，且对患有间皮瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CMV感染的细胞，且对患有CMV的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向MUC1，且对患有乳腺癌或卵巢癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向MUC16，且对患有卵巢癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向NKG2D配体，且对患有骨髓瘤、卵巢癌和其它肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向NY-ESO-1(157-165)或HLA-A2 NY-ESO-1，并且对患有多发性骨髓瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向癌胚抗原(h5T4)，且对患有各种肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向PSCA，且对患有前列腺癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向PSMA，且对患有前列腺癌/肿瘤血管的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向ROR1，且对患有B-CLL和套细胞淋巴瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向TAG-72，且对患有腺癌或胃肠道癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CART细胞靶向VEGF-R2或其它VEGF受体，且通过靶向肿瘤新脉管系统对患有肿瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CA9，且对患有肾细胞癌的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向CD171，且对患有肾神经母细胞瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向NCAM，且对患有神经母细胞瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR T细胞靶向胎儿乙酰胆碱受体，且对患有横纹肌肉瘤的对象具有治疗作用。在另一个实施方案中，CAR结合Sadelain et al.(CancerDiscov.2013Apr；3(4):388–398)中表1列出的靶抗原之一，所述文章在此全文并入作参考。在另一个实施方案中，CAR T细胞结合碳水化合物或糖脂结构。
在一个实施方案中，CAR T细胞结合血管生成因子，从而靶向肿瘤脉管系统。在一些实施方案中，血管生成因子是VEGFR2。在另一个实施方案中，血管生成因子是内皮因子。在另一个实施方案中，本文公开的血管生成因子是血管生成素(Angiogenin)，血管形成素-1(Angiopoietin-1)，Del-1，成纤维细胞生长因子，酸性(aFGF)和碱性(bFGF)，卵泡抑素，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)，白介素8(IL-8)，瘦素，肝素结合细胞因子，胎盘生长因子，血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)，多效蛋白(PTN)，颗粒蛋白前体(progranulin)，增殖蛋白，转化生长因子-α(TGF-α)，转化生长因子-β(TGF-β)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，血管内皮生长因子(VEGF)/血管通透性因子(VPF)。在另一个实施方案中，血管生成因子是血管生成蛋白。在一些实施方案中，生长因子是血管生成蛋白。在一些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的血管生成蛋白是成纤维细胞生长因子(FGF)，VEGF，VEGFR和Neuropilin 1(NRP-1)，血管形成素1(Ang1)和Tie2，血小板衍生生长因子(PDGF；BB-同二聚体)和PDGFR，转化生长因子-β(TGF-β)，内皮因子和TGF-β受体，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)，整合蛋白αVβ3、αVβ5和α5β1，VE-钙粘蛋白和CD31，ephrin，纤溶酶原激活物，纤溶酶原激活物抑制物-1，一氧化氮合酶(NOS)和COX-2，AC133，或Id1/Id3。在一些实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的血管生成蛋白是血管形成素，在一些实施方案中，其是血管形成素1、血管形成素3、血管形成素4或血管形成素6。在一些实施方案中，内皮因子也称作CD105、EDG、HHT1、ORW或ORW1。在一些实施方案中，内皮因子是TGFβ共受体。
在另一个实施方案中，CAR T细胞结合与感染原相关抗原。在一些实施方案中，感染原是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在一些实施方案中，所述结核分枝杆菌相关抗原是：抗原85B，脂蛋白IpqH，推定的ATP依赖性解旋酶，未鉴定的蛋白Rv0476/MTO4941前体或未鉴定的蛋白Rv1334/MT1376前体。
在另一个实施方案中，CAR T细胞结合抗体。在一些实施方案中，CAR T细胞是“抗体偶联的T细胞受体”(ACTR)。根据这个实施方案，CAR T细胞是通用CAR T细胞。在另一个实施方案中，具有抗体受体的CAR T细胞在施用所述抗体之前、之后或同时施用，然后与所述抗体结合，使T细胞紧邻肿瘤或癌症。在另一个实施方案中，所述抗体针对肿瘤细胞抗原。在另一个实施方案中，所述抗体针对CD20。在另一个实施方案中，所述抗体是利妥昔单抗。
在另一个实施方案中，所述抗体是曲妥珠单抗(赫赛汀；Genentech)：针对ERBB2的人源化IgG1。在另一个实施方案中，所述抗体是贝伐单抗(Avastin；Genentech/Roche)：针对VEGF的人源化IgG1。在另一个实施方案中，所述抗体是西妥昔单抗(Erbitux；Bristol-Myers Squibb)：针对EGFR的嵌合人-鼠IgG1。在另一个实施方案中，所述抗体是帕尼单抗(Vectibix；Amgen)：针对EGFR的人IgG2。在另一个实施方案中，所述抗体是伊匹单抗(Yervoy；Bristol-Myers Squibb)：针对CTLA4的IgG1。
在另一个实施方案中，所述抗体是阿仑珠单抗(Campath；Genzyme)：针对CD52的人源化IgG1。在另一个实施方案中，所述抗体是奥法木单抗(Arzerra；Genmab)：针对CD20的人IgG1。在另一个实施方案中，所述抗体是吉妥珠单抗(Gemtuzumab ozogamicin)(Mylotarg；Wyeth)：针对CD33的人源化IgG4。在另一个实施方案中，所述抗体是本妥昔单抗(Adcetris；Seattle Genetics)：针对CD30的嵌合IgG1。在另一个实施方案中，所述抗体是90Y标记的替伊莫单抗(Zevalin；IDEC Pharmaceuticals)：针对CD20的鼠IgG1。在另一个实施方案中，所述抗体是131I标记的托西莫单抗(Bexxar；GlaxoSmithKline)：针对CD20的鼠IgG2。
在另一个实施方案中，所述抗体是雷莫芦单抗，其针对血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)。在另一个实施方案中，所述抗体是雷莫芦单抗(Cyramza Injection，Eli Lillyand Company)，博纳吐单抗(BLINCYTO，Amgen Inc.)，派姆单抗(KEYTRUDA，Merck Sharp&Dohme Corp.)，阿托珠单抗(GAZYVA，Genentech，Inc.；先前称作GA101)，帕妥珠单抗注射液(PERJETA，Genentech，Inc.)或地诺单抗(Xgeva，Amgen Inc.)。在另一个实施方案中，所述抗体是巴利昔单抗(Simulect；Novartis)。在另一个实施方案中，抗体是达克珠单抗(Zenapax；Roche)。
在另一个实施方案中，与CAR T细胞偶联的抗体针对本文描述和/或本领域已知的肿瘤或癌症抗原或其片段。在另一个实施方案中，与CAR T细胞偶联的抗体针对与肿瘤相关抗原。在另一个实施方案中，与CAR T细胞偶联的抗体针对作为血管生成因子的肿瘤相关抗原或其片段。
在另一个实施方案中，与CAR T细胞偶联的抗体针对本文所述和/或本领域已知的肿瘤或癌症抗原或其片段。
在一些实施方案中，本文描述的抗体可以与本文所述组合物例如但不限于包含CAR-T细胞或早期凋亡细胞或其任何组合的组合物组合使用。
细胞因子风暴和细胞因子释放综合征
在一个实施方案中，本文公开的方法包括提供免疫细胞如NK细胞、树突细胞、TCRT细胞或包含工程化嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)及至少额外药剂以降低对象中可能发生的毒性细胞因子释放或“细胞因子释放综合征(CRS)”或“重度细胞因子释放综合征(sCRS)”或者“细胞因子风暴”。在另一个实施方案中，CRS、sCRS或细胞因子风暴是施用所述免疫细胞的结果。在另一个实施方案中，CRS、sCRS或细胞因子风暴与免疫细胞无关的刺激、状况或综合征的结果(参见下文)。在另一个实施方案中，细胞因子风暴、细胞因子级联或超高细胞因子血症是更严重形式的细胞因子释放综合征。
在一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或包含所述凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞上清液或包含所述上清液的组合物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含CTLA-4阻断剂。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，以及CTLA-4阻断剂。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，以及α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含碲基化合物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，以及碲基化合物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含免疫调节剂。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，以及免疫调节剂。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含Treg细胞。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，以及Treg细胞。
本领域技术人员将理解，降低毒性细胞因子释放或毒性细胞因子水平包括降低或抑制对象中毒性细胞因子水平的产生，或抑制或降低对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，在CRS或细胞因子风暴期间毒性细胞因子水平降低。在另一个实施方案中，降低或抑制毒性细胞因子水平的产生包括治疗CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，降低或抑制毒性细胞因子水平的产生包括预防CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，降低或抑制毒性细胞因子水平的产生包括减轻CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，降低或抑制毒性细胞因子水平的产生包括改善CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，毒性细胞因子包含促炎细胞因子。在另一个实施方案中，促炎细胞因子包含IL-6。在另一个实施方案中，促炎细胞因子包含IL-1β。在另一个实施方案中，促炎细胞因子包含TNF-α。在另一个实施方案中，促炎细胞因子包含IL-6、IL-1β或TNF-α，或其任何组合。
在一个实施方案中，细胞因子释放综合征的特征在于几种炎性细胞因子的水平升高和对象中的不良身体反应，如低血压、高热和寒战。在另一个实施方案中，炎性细胞因子包含IL-6、IL-1β和TNF-α。在另一个实施方案中，CRS的特征在于IL-6、IL-1β或TNF-α或其任何组合的水平升高。在另一个实施方案中，CRS的特征在于IL-8或IL-13或其任何组合的水平升高。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征在于TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、GM-CSF、IL-5、fracktalkine或其组合或其子集的水平升高。在另一个实施方案中，IL-6包含CRS或细胞因子风暴的标记物。
在另一个实施方案中，人和小鼠中CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子可包含下表1和2中所列的细胞因子的任何组合。
表1：人和/或小鼠CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子表
Figure BDA0002458147110000271
Figure BDA0002458147110000281
在一些实施方案中，表1中的细胞因子Flt-3L、Fractalkine、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-2Rα、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12和IL-13被认为在CRS或细胞因子风暴中有重大意义。在另一个实施方案中，表1中的IFN-α、IFN-β、IL-1和IL-1Rα在CRS或细胞因子风暴中看起来是重要的。在另一个实施方案中，M-CSF具有未知的重要性。在另一个实施方案中，表1中列出的任何细胞因子或其组合可用作CRS或细胞因子风暴的标志物。
表2：人和/或小鼠CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子表
Figure BDA0002458147110000282
在一个实施方案中，表2中的IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和TNF-α被认为在CRS或细胞因子风暴中具有重要意义。在另一个实施方案中，表2中的IL-27、MCP-3、PGE2、RANTES、TGF-β、TNF-αR1和MIG在CRS或细胞因子风暴中似乎是重要的。在另一个实施方案中，IL-23和IL-25具有未知的重要性。在另一个实施方案中，表2中列出的任何细胞因子或其组合可用作CRS或细胞因子风暴的标志物。在另一个实施方案中，小鼠细胞因子IL-10、IL-1β、IL-2、IP-10、IL-4、IL-5、IL-6、IFNα、IL-9、IL-13、IFN-γ、IL-12p70、GM-CSF、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、IL-17A、IL-15/IL-15R和IL-7在CRS或细胞因子风暴中似乎是重要的。
本领域技术人员将理解，术语“细胞因子”可涵盖细胞因子(例如干扰素γ(IFN-γ)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，肿瘤坏死因子α)，趋化因子(例如MIP1α，MIP1β，RANTES)和其它可溶的炎症介质，例如活性氧和一氧化氮。
在一个实施方案中，特定细胞因子的释放增加，无论是有意义的、重要的还是具有未知的重要性，并不先验地意味着该特定细胞因子是细胞因子风暴的一部分。在一个实施方案中，至少一种细胞因子的增加不是细胞因子风暴或CRS的结果。在另一个实施方案中，CAR T细胞可以是水平升高的特定细胞因子或细胞因子组的来源。
在另一个实施方案中，细胞因子释放综合征的特征在于以下症状中的任何或全部：发烧有或无寒颤，不适，疲劳，厌食，肌痛，关节痛，恶心，呕吐，头痛，皮疹，恶心，呕吐，腹泻，呼吸急促，低氧血症，心血管性心动过速，脉压宽，低血压，心输出量增加(早期)，潜在心输出量降低(后期)，D-二聚体升高，低纤维蛋白原性血症伴或不伴有出血，氮血症肝转氨酶升高，高胆红素血症，头痛，精神状态改变，意识错乱，谵妄，唤词困难或空洞型失语，幻觉，震颤，辨距不良(dymetria)，步态改变，癫痫。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征在于IL-2释放和淋巴增殖。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征在于由CAR T细胞释放的细胞因子增加。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征在于由CAR T细胞以外的细胞释放的细胞因子增加。
在另一个实施方案中，细胞因子风暴导致潜在的危及生命的并发症，包括心脏功能障碍，成人呼吸窘迫综合征，神经系统毒性，肾和/或肝衰竭以及弥散性血管内凝血。
本领域技术人员意识到细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的特征估计在触发CRS或细胞因子风暴后几天至几周发生。在一个实施方案中，CAR T细胞是CRS或细胞因子风暴的触发物。在另一个实施方案中，CRS或细胞因子风暴的触发物不是CAR T细胞。
在一个实施方案中，作为细胞因子风暴指征的细胞因子水平或浓度的测量可以表示为：细胞因子水平或浓度的增加倍数，增加百分比，净增加或变化率。在另一个实施方案中，高于某个水平或浓度的绝对细胞因子水平或浓度可以是对象正在经历或将要经历细胞因子风暴的指征。在另一个实施方案中，在一定水平或浓度的绝对细胞因子水平或浓度，例如在未进行CAR-T细胞治疗的对照对象中正常发现的水平或浓度，可以是抑制或降低进行CAR T细胞的对象中细胞因子风暴发生的方法的指征。
技术人员意识到，术语“细胞因子水平”可涵盖测量的浓度、测量的倍数变化、测量的百分比(％)变化或测量的速率变化。此外，测量血液、唾液、血清、尿液和血浆中细胞因子的方法是本领域熟知的。
在一个实施方案中，尽管认识到细胞因子风暴与一些炎性细胞因子的升高有关，但是IL-6水平可以用作细胞因子风暴的常用测量值和/或细胞因子风暴治疗效力的常用测量值。技术人员意识到，其它细胞因子也可以用作细胞因子风暴的标志物，例如TNF-α、IB-1α、IL-8、IL-13或INF-γ。此外，本领域熟知测量细胞因子的测定方法。技术人员意识到，影响细胞因子风暴的方法可以类似地影响细胞因子释放综合征。
在一个实施方案中，本文公开了一种在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的对象中降低或抑制细胞因子产生的方法。在另一个实施方案中，本文公开了一种在易遭受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的对象中降低或抑制细胞因子产生的方法。在另一个实施方案中，本文公开的方法在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的对象中降低或抑制细胞因子产生，其中表1和/或表2中所列的任何细胞因子或细胞因子组的产生被降低或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-6的产生被降低或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-β1的产生被降低或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-8的产生被降低或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-13的产生被降低或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子TNF-α的产生被降低或抑制。在另一个实施方案中，细胞因子IL-6的产生、IL-1β的产生或TNF-α的产生或其任何组合被降低或抑制。
在一个实施方案中，对细胞因子释放综合征进行分级。在另一个实施方案中，等级1描述了这样的细胞因子释放综合征，其中症状不危及生命且仅需要对症治疗，例如发烧、恶心、乏力、头痛、肌痛、不适。在另一个实施方案中，等级2的症状需要并响应中度干预，例如对于低血压的供氧、液体或血管加压药。在另一个实施方案中，等级3的症状需要并响应积极干预。在另一个实施方案中，等级4的症状是危及生命的症状，需要呼吸机且患者表现出器官毒性。
在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征在于IL-6和干扰素γ释放。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征在于表1和表2中列出的任何细胞因子或其组合的释放。在另一个实施方案中，细胞因子风暴的特征在于本领域已知的任何细胞因子或其组合的释放。
在一个实施方案中，症状发作在输注开始后数分钟至数小时开始。在另一个实施方案中，症状与细胞因子水平峰值一致。
在一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴发生率的方法，包括施用凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物。在另一个实施方案中，所述凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可以辅助CAR T细胞治疗。在另一个实施方案中，所述凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可有助于抑制或降低CRS或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，所述凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可有助于治疗CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，所述凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可有助于预防CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，所述凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可有助于改善CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，所述凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可有助于减轻CRS或细胞因子风暴。
在一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗及施用了凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法，包括施用额外药剂。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以辅助CAR T细胞治疗。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助抑制或降低CRS或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助治疗CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助预防CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助改善CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助减轻CRS或细胞因子风暴。
在一个实施方案中，一种在经历CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括施用额外药剂。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以辅助CAR T细胞治疗。在一个实施方案中，一种在经历TCR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括施用额外药剂。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以辅助TCR T细胞治疗。在一个实施方案中，一种在经历的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括施用额外药剂。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助。在一个实施方案中，一种在经历NK细胞治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括施用额外药剂。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以辅助NK细胞治疗。
在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助抑制或降低CRS或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助治疗CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助预防CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助改善CRS或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，所述额外药剂可以帮助减轻CRS或细胞因子风暴。
在一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或包含所述凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞上清液或包含所述上清液的组合物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含CTLA-4阻断剂。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，以及CTLA-4阻断剂。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，以及α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含碲基化合物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，以及碲基化合物。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含免疫调节剂。在另一个实施方案中，降低有害细胞因子释放的额外药剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，以及免疫调节剂。
在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用CAR T细胞与一种或多种CTLA-4阻断剂例如伊匹单抗的联合治疗。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用包含凋亡细胞、CAR T细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的联合治疗。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用TCR T细胞与一种或多种CTLA-4阻断剂例如伊匹单抗的联合治疗。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用包含凋亡细胞、TCR T细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的联合治疗。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用树突细胞与一种或多种CTLA-4阻断剂例如伊匹单抗的联合治疗。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用包含凋亡细胞、树突细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的联合治疗。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用NK细胞与一种或多种CTLA-4阻断剂例如伊匹单抗的联合治疗。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用包含凋亡细胞、NK细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的联合治疗。
在另一个实施方案中，CTLA-4是帮助维持自身耐受性的T细胞活化的强力抑制剂。在另一个实施方案中，施用抗CTLA-4阻断剂(在另一个实施方案中其是抗体)产生T细胞活化的净效应。
在另一个实施方案中，可以通过如本文公开的组合物和方法来治疗、预防、抑制、改善、降低发病率或减轻的由CAR T细胞、TCR T细胞、树突细胞或NK细胞施用导致的其它毒性包含B细胞发育不全或肿瘤溶解综合征(TLS)。
在一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴发生率的方法不影响CAR T细胞治疗的功效。在另一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低CRS或细胞因子风暴发生率的方法使CAR T细胞治疗的功效降低超过约5％。在另一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低CRS或细胞因子风暴发生率的方法使CAR T细胞治疗的功效降低超过约10％。在另一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低CRS或细胞因子风暴发生率的方法使CAR T细胞治疗的功效降低超过约15％。在另一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低CRS或细胞因子风暴发生率的方法使CAR T细胞治疗的功效降低超过约20％。在另一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低CRS或细胞因子风暴发生率的方法使CAR T细胞治疗的功效增加超过约5％。在另一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低CRS或细胞因子风暴发生率的方法使CAR T细胞治疗的功效增加超过约10％。在另一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低CRS或细胞因子风暴发生率的方法使CAR T细胞治疗的功效增加超过约15％。在另一个实施方案中，一种在接受CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低CRS或细胞因子风暴发生率的方法使CAR T细胞治疗的功效增加超过约20％。
量化细胞毒性的任何适当方法可用于确定经修饰为表达CAR的免疫细胞中的活性是否基本保持不变。例如，可以使用基于细胞培养的测定法如在实施例中描述的细胞毒性测定法量化细胞毒性。细胞毒性测定可以采用优先染色死细胞DNA的染料。在其它情况下，可以使用测量细胞群中活细胞和死细胞相对数量的荧光和发光测定。对于这种测定，蛋白酶活性作为细胞存活和细胞毒性的标记，标记的细胞可渗透肽产生的荧光信号与样品中的活细胞数量成比例。例如，细胞毒性测定可以在流式细胞仪分析中使用7-AAD。用于各种细胞毒性测定的试剂盒可商购自制造商如Promega、Abcam和Life Technologies。
在另一个实施方案中，细胞毒性的测量可以是定性的。在另一个实施方案中，细胞毒性的测量可以是定量的。在另一个实施方案中，细胞毒性的测量可以与细胞毒性细胞因子表达的变化相关。在另一个实施方案中，可以通过存活曲线和骨髓和肝脏中的肿瘤负荷来确定细胞毒性的测量。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括可用于克服同种异基因供体细胞排斥的其它步骤。在一个实施方案中，所述方法在施用CAR T细胞之前包括全部或部分淋巴去除的步骤，在一个实施方案中，所述CAR T细胞是同种异基因CAR T细胞。在另一个实施方案中，调节淋巴去除，从而使宿主抗移植物反应延迟一段时间，以足以使所述同种异体T细胞攻击其所针对的肿瘤，但是其程度不足以要求通过骨髓移植拯救宿主免疫系统。在另一个实施方案中，延缓同种异基因T细胞从淋巴结流出的药剂，如2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1,3-二醇(FTY720)、5-[4-苯基-5-(三氟甲基)噻吩-2-基]-3-[3-(三氟甲基)苯基-1]1,2,4-恶二唑(SEW2871)、3-(2-(-己基苯基氨基)-2-氧代乙氨基)丙酸(W123)、磷酸2-铵基-4-(2-氯-4-(3-苯氧基苯硫基)苯基)-2-(羟甲基)丁酯(2-ammonio-4-(2-chloro-4-(3-phenoxyphenylthio)phenyl)-2-(hydroxymethyl)but-yl hydrogenphosphate)(KRP-203磷酸)或本领域已知其它药剂，可以用作本文公开的组合物和方法的一部分，以允许使用具有功效但不引发宿主抗移植物病的同种异基因CAR T细胞。在一个实施方案中，使同种异基因T细胞的MHC表达沉默，以减少同种异基因细胞的排斥。在另一个实施方案中，凋亡细胞防止同种异基因细胞的排斥。
与CAR T细胞治疗相关的细胞因子释放
在一个实施方案中，在施用免疫治疗例如CAR T细胞治疗后几天至2周之间发生细胞因子释放。在一个实施方案中，低血压和其它症状随着细胞因子释放后发生，即从几天到几周。因此，在一个实施方案中，在免疫治疗的同时给对象施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液以作为预防。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-3天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后7天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后10天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后14天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-14天给对象施用凋亡细胞或上清液。
在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-3小时给对象施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗7小时后给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后10小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后14小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-14小时给对象施用凋亡细胞或上清液。
在另一个实施方案中，在免疫治疗之前给对象施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液用作预防。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前1天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗之前2-3天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前7天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前10天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前14天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗之前2-14天给对象施用凋亡细胞或上清液。
在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前2-3小时给对象施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前7小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前10小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前14小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前2-14小时给对象施用凋亡细胞或上清液。
在另一个实施方案中，一旦发生细胞因子释放综合征，可以治疗性地施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在一个实施方案中，一旦检测到导致或证实开始细胞因子释放综合征的细胞因子释放，施用凋亡细胞或上清液。在一个实施方案中，凋亡细胞或上清液可终止细胞因子水平增高或细胞因子释放综合征，并避免其后遗症。
在另一个实施方案中，凋亡细胞或凋亡细胞上清液可以在多个时间点治疗性施用。在另一个实施方案中，至少在本文所述的两个时间点施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，至少在本文所述的三个时间点施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，在CRS或细胞因子风暴之前及一旦发生细胞因子释放综合征及其任何组合时施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。
在一个实施方案中，表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗和凋亡细胞治疗或上清液一起施用。在另一个实施方案中，在施用凋亡细胞治疗或上清液之后施用CAR T细胞治疗。在另一个实施方案中，在凋亡细胞治疗或上清液之前施用CAR T细胞治疗。根据这一方面及在一个实施方案中，在CAR T细胞治疗后约2-3周施用凋亡细胞治疗或上清液。在另一个实施方案中，在CAR T细胞治疗后约6-7周施用凋亡细胞治疗或上清液。在另一个实施方案中，在CAR T细胞治疗后约9周施用凋亡细胞治疗或上清液。在另一个实施方案中，直至在CAR T细胞治疗后数月施用凋亡细胞治疗。
因此，在一个实施方案中，在免疫治疗的同时给对象施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液用于预防。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-3天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后7天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后10天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后14天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-14天给对象施用凋亡细胞或上清液。
在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-3小时给对象施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后7小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后10小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后14小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-14小时给对象施用凋亡细胞或上清液。
在另一个实施方案中，在免疫治疗之前给对象施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液作为预防。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前1天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前2-3天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前7天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前10天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前14天给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前2-14天给对象施用凋亡细胞或上清液。
在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前2-3小时给对象施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前7小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前10小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前14小时给对象施用凋亡细胞或上清液。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前2-14小时给对象施用凋亡细胞或上清液。
在另一个实施方案中，一旦发生细胞因子释放综合征，可以治疗性地施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在一个实施方案中，一旦检测到导致或证实开始细胞因子释放综合征的细胞因子释放，可以施用凋亡细胞或上清液。在一个实施方案中，凋亡细胞或上清液可终止细胞因子水平增高或细胞因子释放综合征，并避免其后遗症。
在另一个实施方案中，凋亡细胞或凋亡细胞上清液可以在多个时间点治疗性施用。在另一个实施方案中，至少在本文所述的两个时间点施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，至少在本文所述的三个时间点施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，在CRS或细胞因子风暴之前和一旦发生细胞因子释放综合征及其任何组合时施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。
在一个实施方案中，表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗和凋亡细胞治疗或上清液一起施用。在另一个实施方案中，在凋亡细胞治疗或上清液之后施用CAR T细胞治疗。在另一个实施方案中，在凋亡细胞治疗或上清液之前施用CAR T细胞治疗。根据这一方面及在一个实施方案中，在CAR T细胞治疗后约2-3周施用凋亡细胞治疗或上清液。在另一个实施方案中，在CAR T细胞治疗后约6-7周施用凋亡细胞治疗或上清液。在另一个实施方案中，在CAR T细胞治疗后约9周施用凋亡细胞治疗或上清液。在另一个实施方案中，直至在CAR T细胞治疗后数月施用凋亡细胞治疗。
在其它实施方案中，在免疫治疗同时给对象施用额外药剂作为预防。在一个实施方案中，所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡细胞上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物、免疫调节化合物，或其任何组合。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-3天给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后7天给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后10天给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后14天给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-14天给对象施用所述额外药剂。
在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-3小时给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后7小时给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后10小时给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后14小时给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗后2-14小时给对象施用所述额外药剂。
在另一个实施方案中，在免疫治疗之前给对象施用所述额外药剂作为预防。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前1天给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前2-3天给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前7天给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前10天给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前14天给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前2-14天给对象施用所述额外药剂。
在另一个实施方案中，在施用免疫治疗之前2-3小时给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前7小时给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前10小时给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前14小时给对象施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在施用免疫治疗前2-14小时给对象施用所述额外药剂。
在另一个实施方案中，一旦发生细胞因子释放综合征，治疗性施用所述额外药剂。在一个实施方案中，一旦检测到导致或证实开始细胞因子释放综合征的细胞因子释放，施用所述额外药剂。在一个实施方案中，所述额外药剂可以终止细胞因子水平增高或细胞因子释放综合征，并避免其后遗症。
在另一个实施方案中，在多个时间点治疗性地施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，至少在本文所述的两个时间点施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，至少在本文所述的三个时间点施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在CRS或细胞因子风暴之前、和一旦发生细胞因子释放综合征及其任何组合时施用所述额外药剂。
在一个实施方案中，表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗和所述额外药剂一起施用。在另一个实施方案中，CAR T细胞治疗与所述额外药剂施用。在另一个实施方案中，CAR T细胞治疗在所述额外药剂之前施用。根据这一方面及在一个实施方案中，在CAR T细胞治疗后约2-3周施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在CAR T细胞治疗后约6-7周施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，在CAR T细胞治疗后约9周施用所述额外药剂。在另一个实施方案中，直至在CAR T细胞治疗后数月施用所述额外药剂。
在一个实施方案中，CAR T细胞对于对象是异源的。在一个实施方案中，CAR T细胞衍生自一个或多个供体。在一个实施方案中，CAR T细胞衍生自一或多个骨髓供体。在另一个实施方案中，CAR T细胞衍生自一个或多个血库捐赠。在一个实施方案中，供体是匹配的供体。在一个实施方案中，CAR T细胞是通用的同种异基因CAR T细胞。在另一个实施方案中，CAR T细胞是同基因CAR T细胞。在另一个实施方案中，CAR T细胞来自不匹配的第三方供体。在另一个实施方案中，CAR T细胞来自合并的第三方供体T细胞。在一个实施方案中，供体是骨髓供体。在另一个实施方案中，供体是血库供体。在一个实施方案中，本文公开的组合物和方法的CAR T细胞包含一种或多种MHC非限制性的定向肿瘤的嵌合受体。在一个实施方案中，可以根据本领域已知的方案工程化或施用非自体T细胞以预防或最小化自身免疫反应，例如在美国专利申请号20130156794中所述，所述专利申请以其全文并入本文作参考。
在另一个实施方案中，CAR T细胞对于对象是自体的。在一个实施方案中，使用患者自己的细胞。在这个实施方案中，如果使用患者自己的细胞，则在凋亡细胞治疗后施用CAR T细胞治疗。
在一个实施方案中，凋亡细胞对于对象是异源的。在一个实施方案中，凋亡细胞衍生自一个或多个供体。在一个实施方案中，凋亡细胞衍生自一个或多个骨髓供体。在另一个实施方案中，凋亡细胞衍生自一或多个血库捐赠。在一个实施方案中，供体是匹配的供体。在另一个实施方案中，凋亡细胞来自不匹配的第三方供体。在一个实施方案中，凋亡细胞是通用的同种异基因凋亡细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞来自同基因供体。在另一个实施方案中，凋亡细胞来自合并的第三方供体细胞。在一个实施方案中，供体是骨髓供体。在另一个实施方案中，供体是血库供体。在另一个实施方案中，凋亡细胞对于对象是自体的。在这个实施方案中，使用患者自己的细胞。
根据一些实施方案，将本文公开的治疗性单个核富集的细胞制备物或凋亡细胞上清液全身性地施用给对象。在另一个实施方案中，通过静脉内途径施用。或者，可以通过各种其它途径包括但不限于肠胃外、腹膜内、关节内、肌内和皮下途径，将治疗性单个核富集细胞或上清液施用给对象。
根据一些实施方案，将本文公开的治疗性单个核富集细胞制备物或额外药剂全身性施用给对象。在另一个实施方案中，通过静脉内途径施用。或者，可以通过各种其它途径包括但不限于肠胃外、腹膜内、关节内、肌内和皮下途径将治疗性单个核富集细胞或额外药剂施用给对象。
在一个实施方案中，以局部而不是全身方式施用所述制备物，例如通过将制备物直接注射到患者身体的特定区域。在另一个实施方案中，特定区域包含肿瘤或癌症。
在另一个实施方案中，将治疗性单个核富集细胞或上清液悬浮于合适的生理缓冲液中施用给对象，所述生理缓冲液例如但不限于盐水溶液、PBS、HBSS等。另外，悬浮介质还可包含有助于维持细胞存活的补充剂。在另一个实施方案中，将额外药剂悬浮于合适的生理缓冲液中施用给对象，所述生理缓冲液例如但不限于盐水溶液、PBS、HBSS等。
根据一些实施方案，静脉内施用药物组合物。根据另一个实施方案，所述药物组合物以单剂量施用。根据另一个实施方案，药物组合物以多剂量施用。根据另一个实施方案，药物组合物以两次剂量施用。根据另一个实施方案，药物组合物以三次剂量施用。根据另一个实施方案，药物组合物以四次剂量施用。根据另一个实施方案，药物组合物以五次或更多次剂量施用。根据一些实施方案，所述药物组合物配制为用于静脉内注射。
在一个实施方案中，为对象提供修饰的表达CAR的免疫细胞的任何适当方法均可用于本文所述方法。在一个实施方案中，为对象提供细胞的方法包括造血细胞移植(HCT)、将供体来源的NK细胞输注给癌症患者或其组合。
在另一个实施方案中，本文公开了在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征或细胞因子风暴发生率的方法，包括给所述对象施用包含凋亡细胞的组合物的步骤。
在另一个实施方案中，本文公开了一种在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征或细胞因子风暴发生率的方法，包括给所述对象施用凋亡细胞上清液例如凋亡细胞吞噬细胞上清液的步骤。
在另一个实施方案中，本文公开了一种在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征或细胞因子风暴发生率的方法，包括给所述对象施用至少一种额外药剂的步骤。
在某些实施方案中，CAR T细胞治疗包括施用本文公开的组合物，所述组合物包含CAR T细胞和凋亡细胞或凋亡细胞上清液，或本文公开的另外的额外药剂或其组合。在另一个实施方案中，CAR T细胞治疗包括施用本文公开的包含CAR T细胞的组合物和包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物，或本文公开的一种额外药剂或其组合。
与非CAR T细胞应用相关的细胞因子释放
在一个实施方案中，本文公开了一种在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴侵害的对象中降低或抑制细胞因子产生的方法，包括给所述对象施用包含凋亡细胞或凋亡上清液的组合物的步骤，其中所述施用降低或抑制所述对象中的细胞因子产生。在另一个实施方案中，将所述细胞因子产生的降低或抑制与经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴侵害的但未施用凋亡细胞或凋亡上清液的对象进行比较。在另一个实施方案中，降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制促炎细胞因子产生。在另一个实施方案中，降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制至少一种促炎细胞因子的产生。在另一个实施方案中，降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制至少细胞因子IL-6的产生。在另一个实施方案中，降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制至少细胞因子IL-1β的产生。在另一个实施方案中，降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制至少细胞因子TNF-α的产生。在另一个实施方案中，与经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴侵害但未施用凋亡细胞或凋亡上清液的对象相比，本文公开的降低或抑制细胞因子产生的方法导致所述对象中降低或抑制细胞因子IL-6、IL-1β或TNF-α的产生或其任何组合。
癌症或肿瘤也可以影响细胞因子包括促炎细胞因子的绝对水平。对象中肿瘤负荷的水平可以影响细胞因子特别是促炎细胞因子的水平。本领域技术人员将理解，短语“降低或抑制”或其语法变化用于可涵盖细胞因子产生的倍数降低或抑制，或者细胞因子产生的净降低或抑制，或百分比(％)降低或抑制，或可涵盖细胞因子产生的降低或抑制的变化率。
在另一个实施方案中，本文公开了降低或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴侵害的对象的细胞因子产生的方法，包括给所述对象施用凋亡细胞或包含凋亡细胞的组合物的步骤。
在另一个实施方案中，本文公开了降低或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴侵害的对象的细胞因子产生的方法，包括给所述对象施用凋亡细胞上清液，例如凋亡细胞吞噬细胞上清液，或包含所述上清液的组合物。
在另一个实施方案中，本文公开了降低或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴侵害的对象的细胞因子产生的方法，包括给所述对象施用凋亡细胞上清液(如选自如下的额外药剂：凋亡细胞，凋亡细胞上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合)或包含所述上清液的组合物的步骤。
在一个实施方案中，感染导致对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。在一个实施方案中，所述感染是流感感染。在一个实施方案中，所述流感感染是H1N1。在另一个实施方案中，流感感染是H5N1禽流感。在另一个实施方案中，感染是严重急性呼吸综合征(SARS)。在另一个实施方案中，所述对象患有Epstein-Barr病毒相关噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。在另一个实施方案中，感染是败血症。在一实施方案中，败血症为革兰氏阴性败血症。在另一个实施方案中，感染是疟疾。在另一个实施方案中，感染是埃博拉病毒感染。在另一个实施方案中，感染是天花病毒。在另一个实施方案中，感染是全身性革兰氏阴性细菌感染。在另一个实施方案中，感染是Jarisch-Herxheimer综合征。
在一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。在另一个实施方案中，HLH是散发性HLH。在另一个实施方案中，HLH是巨噬细胞活化综合征(MAS)。在另一个实施方案中，对象中导致细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是MAS。
在一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是慢性关节炎。在另一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是全身性幼年特发性关节炎(sJIA)，也称为Still’s病。
在一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是Cryopyrin相关周期性综合征(CAPS)。在另一个实施方案中，CAPS包含家族性寒冷性自身炎症综合征(FCAS)，也称为家族性冷荨麻疹(FCU)。在另一个实施方案中，CAPS包含Muckle-Well综合征(MWS)。在另一个实施方案中，CAPS包含慢性婴儿神经性皮肤和关节(CINCA)综合征。在另一个实施方案中，CAPS包含FCAS、FCU、MWS或CINCA综合征，或其任何组合。在另一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是FCAS。在另一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是FCU。在另一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是MWS。在另一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是CINCA综合征。在另一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是FCAS、FCU、MWS或CINCA综合征，或其任何组合。
在另一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是cryopyrinopathy，其包含在NLRP3基因(也称为CIASI基因)中的遗传性或新生功能突变。
在一个实施方案中，对象中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是遗传性自身炎症紊乱。
在一个实施方案中，炎性细胞因子释放的触发剂是脂多糖(LPS)、革兰氏阳性毒素、真菌毒素、糖基磷脂酰肌醇(GPI)或RIG-1基因表达的调节。
在另一个实施方案中，经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的对象没有传染病。在一个实施方案中，对象患有急性胰腺炎。在另一个实施方案中，对象患有组织损伤，在一个实施方案中是严重烧伤或创伤。在另一个实施方案中，对象患有急性呼吸窘迫综合征。在另一个实施方案中，对象患有继发于药物使用的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，对象患有继发于吸入毒素的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。
在另一个实施方案中，对象患有继发于接受免疫治疗的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴，在一个实施方案中所述免疫治疗是用超激动性CD28特异性单克隆抗体(CD28SA)的免疫治疗。在一个实施方案中，CD28SA是TGN1412。在另一个实施方案中，免疫治疗是CAR T细胞治疗。
在另一个实施方案中，凋亡细胞或上清液或CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合，可用于控制因施用药物组合物导致的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。在一个实施方案中，药物组合物是奥沙利铂、阿糖胞苷、来那度胺或其组合。
在另一个实施方案中，凋亡细胞或上清液或CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合，可用于控制因施用抗体导致的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体是多克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是利妥昔单抗。在另一个实施方案中，抗体是Orthoclone OKT3(莫罗单抗-CD3)。在另一个实施方案中，抗体是阿仑珠单抗、托妥单抗(tosituzumab)、CP-870,893、LO-CD2a/BTI-322或TGN1412。
在另一个实施方案中，控制炎症细胞因子产生可能有益的疾病的例子包括癌症，过敏，任何类型感染，中毒性休克综合征，败血症，任何类型自身免疫性疾病，关节炎，克罗恩病，狼疮，牛皮癣，或特征是在对象中导致有害影响的毒性细胞因子释放的任何其它疾病。
α-1-抗胰蛋白酶(AAT)
α-1-抗胰蛋白酶(AAT)是一种循环的52kDa糖蛋白，主要由肝脏产生。AAT主要被称为丝氨酸蛋白酶抑制剂，由基因SERPINA1编码。AAT抑制中性粒细胞弹性蛋白酶，在循环AAT中遗传性缺陷导致肺组织恶化和肝脏疾病。在炎症期间，健康个体的血清AAT浓度增加两倍。
AAT水平与一些炎症疾病的严重程度之间存在负相关性。例如，在患有HIV感染、糖尿病、丙型肝炎感染引起的慢性肝病和一些类型的血管炎的患者中，AAT的水平或活性降低。
越来越多的证据表明，人血清衍生的α-1-抗胰蛋白酶(AAT)降低促炎细胞因子的产生，诱导抗炎细胞因子及干扰树突细胞的成熟。
的确，在人外周血单个核细胞(PBMC)中加入AAT抑制LPS诱导的TNF-α和IL-1β释放，但增加IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)和IL-10产生。
AAT降低体外IL-1β介导的胰岛毒性，AAT单一治疗延长胰岛同种异体移植物存活，促进小鼠抗原特异性免疫耐受，及延迟非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的糖尿病进展。在实验模型中，AAT示出可抑制LPS诱导的急性肺损伤。最近，在急性心肌缺血-再灌注损伤小鼠模型中，AAT示出可以减少梗塞面积和心衰的严重程度。
使用临床级人AAT(hAAT)的单一治疗可降低循环的促炎细胞因子，减轻移植物抗宿主病(GvHD)严重程度，及延长在实验性同种异体骨髓移植后的动物存活(Tawara etal.,Proc Natl Acad Sci U S A.2012Jan 10；109(2):564-9，并入本文作参考)。AAT治疗降低同种异体反应性T效应细胞的扩展，但增强T调节T细胞(Treg)的恢复，因此改变了供体T效应物与T调节细胞的比例，有利于减少病理过程。在体外，AAT抑制LPS诱导的促炎细胞因子如TNF-α和IL-1β的体外分泌，增强抗炎细胞因子IL-10的产生，及削弱宿主树突细胞中NF-κB转位。并入本文作参考的Marcondes,Blood.2014(Oct 30；124(18):2881-91示出，用AAT治疗不仅改善了GvHD，而且保持甚至可能增强了移植物抗白血病(GVL)作用。
在一个实施方案中，本文公开了包含表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物。在另一个实施方案中，CAR T细胞和α-1-抗胰蛋白酶(AAT)在单独的组合物中。在另一个实施方案中，AAT包含全长AAT或其功能片段。在另一个实施方案中，AA包含全长AAT的类似物或其功能片段。在另一个实施方案中，包含AAT的组合物还包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液。
在另一个实施方案中，本文公开了一种治疗、预防、抑制、降低对象中癌症或肿瘤的发生率、改善或减轻对象中癌症或肿瘤的方法，包括给所述对象施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物的步骤。在另一个实施方案中，所述方法进一步包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液。
在另一个实施方案中，本文公开了一种在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征或细胞因子风暴发生率的方法，包括给所述对象施用包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物的步骤。在另一个实施方案中，一种在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中治疗细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括给所述对象施用包含α-1抗胰蛋白酶(AAT)的组合物的步骤。在另一个实施方案中，在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括给所述对象施用包含α-1抗胰蛋白酶(AAT)的组合物的步骤。在另一个实施方案中，在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中改善细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括给所述对象施用包含α-1抗胰蛋白酶(AAT)的组合物的步骤。在另一个实施方案中，在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中减轻细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括给所述对象施用包含α-1抗胰蛋白酶(AAT)的组合物的步骤。
在另一个实施方案中，本文公开了在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴侵害的对象中降低或抑制细胞因子产生的方法，包括给所述对象施用包含α-1抗胰蛋白酶(AAT)的组合物的步骤。
在一个实施方案中，单独施用AAT以控制细胞因子释放。在另一个实施方案中，施用AAT和凋亡细胞或其组合物或凋亡细胞上清液或其组合物以控制细胞因子释放。
免疫调节剂
技术人员意识到，免疫调节剂可涵盖细胞外介质、受体、细胞内信号传导途径介质、翻译和转录的调节物以及免疫细胞。在一个实施方案中，本文公开的额外药剂是本领域已知的免疫调节剂。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用免疫调节剂降低至少一种细胞因子的水平。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用免疫调节剂降低或抑制CRS或细胞因子风暴。在一些实施方案中，在本文公开的方法中使用免疫调节剂治疗、预防肿瘤或癌症、抑制肿瘤或癌症的生长、延缓疾病进展、降低肿瘤负荷或降低肿瘤或癌症的发生率或其任何组合。在一些实施方案中，免疫调节剂与本文公开的另一种组合物组合使用，所述组合物例如但不限于包含早期凋亡细胞或包含CAR T细胞的组合物。
在一个实施方案中，一种免疫调节剂包含阻断、抑制或降低细胞因子或趋化因子释放的化合物。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含阻断、抑制或降低IL-21或IL-23的释放或其组合的化合物。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含趋化因子受体5(CCR5)受体拮抗剂类别的抗逆转录病毒药物，例如maraviroc。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含抗DNAM-1抗体。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含选自包含硫酸肝素、ATP和尿酸或其任何组合的损伤/病原体相关分子(DAMP/PAMP)。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含结合唾液酸的Ig样凝集素(Siglecs)。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含耐受性的细胞介质，例如调节性CD4+CD25+T细胞(Treg)或非变体自然杀伤T细胞(iNK T细胞)。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含树突细胞。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含单核细胞。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含巨噬细胞。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含选自包含鲁索替尼(ruxolitinib)和托法替尼(tofacitinib)的JAK2或JAK3抑制剂。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含脾酪氨酸激酶(Syk)的抑制剂，例如福他替尼(fostamatinib)。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含组蛋白脱乙酰基酶抑制剂伏立诺他(vorinostat)乙酰化STAT3。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含neddylation抑制剂，例如MLN4924。在另一个实施方案中，免疫调节包含含miR-142拮抗剂。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含胞苷的化学类似物，例如阿扎胞苷。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，例如伏立诺他。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含组蛋白甲基化抑制剂。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含抗体。在另一个实施方案中，抗体是利妥昔单抗(RtX)
碲基化合物
碲是在人体中发现的微量元素。多种碲化合物具有免疫调节特性，并已在各种临床前和临床研究中示出有益作用。一个特别有效的含碲化合物家族在例如在美国专利号4,752,614、4,761,490、4,764,461和4,929,739中公开。例如，这个含碲化合物家族的免疫调节性质在美国专利号4,962,207、5,093,135、5,102,908和5,213,899中描述，这些专利均以其全部内容并入作参考。
一种有希望的化合物是三氯(二氧乙烯-O,O')碲酸铵，其在本文和本领域中也称为AS101。作为上文讨论的含碲化合物家族的代表实例，AS101表现出抗病毒作用(Nat.Immun.Cell Growth Regul.7(3):163-8,1988；AIDS Res Hum Retroviruses.8(5):613-23,1992)和杀肿瘤活性(Nature 330(6144):173-6,1987；J.Clin.Oncol.13(9):2342-53,1995；J.Immunol.161(7):3536-42,1998)。此外，AS101的特征在于低毒性。
在一个实施方案中，包含含碲免疫调节化合物的组合物可用于本文公开的方法中，其中碲基化合物刺激先天性和后天性免疫应答臂。例如，已经示出AS101在小鼠(J.Natl.Cancer Inst.88(18)：1276-84，1996)和人(Nat.Immun.Cell Growth Regul.9(3):182-90,1990；Immunology 70(4):473-7,1990；J.Natl.Cancer Inst.88(18):1276-84,1996)中是强力的干扰素(IFN)激活物。
在另一个实施方案中，碲基化合物诱导一系列细胞因子如IL-1α、IL-6和TNF-α的分泌。
在另一个实施方案中，碲基化合物包含本领域已知的具有免疫调节性质的碲基化合物。在另一个实施方案中，碲基化合物包含三氯(二氧乙烯-O,O')碲酸铵。
在一个实施方案中，碲基化合物抑制至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，碲基化合物降低至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，碲基化合物抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴。
在一个实施方案中，本文公开了包含表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和碲基化合物的组合物。在另一个实施方案中，CAR T细胞和碲基化合物在单独的组合物中。在另一个实施方案中，AAT包含全长AAT或其功能片段。在另一个实施方案中，AA包含全长AAT的类似物或其功能片段。
在另一个实施方案中，本文公开了一种在对象中治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，包括给所述对象施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和包含碲基化合物的组合物。
在另一个实施方案中，本文公开了一种在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征或细胞因子风暴发生率的方法，包括给所述对象施用包含碲基化合物的组合物的步骤。在另一个实施方案中，一种在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中治疗细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括给所述对象施用包含碲基化合物的组合物的步骤。在另一个实施方案中，在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括给所述对象施用包含碲基化合物的组合物的步骤。在另一个实施方案中，一种在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中改善细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括给所述对象施用包含碲基化合物的组合物的步骤。在另一个实施方案中，一种在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)治疗的对象中减轻细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括给所述对象施用包含碲基化合物的组合物的步骤。
在另一个实施方案中，本文公开了在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴侵害的对象中降低或抑制细胞因子产生的方法，包括给所述对象施用包含碲基化合物的组合物的步骤。
在一个实施方案中，单独施用碲基化合物以控制细胞因子释放。在另一个实施方案中，施用碲基化合物和凋亡细胞或其组合物或者凋亡细胞上清液或其组合物，以控制细胞因子释放。
树突细胞
在一个实施方案中，树突细胞(DC)是哺乳动物免疫系统的抗原产生和呈递细胞，其处理抗原材料并将其在细胞表面呈递给免疫系统的T细胞，从而能够使T细胞对新抗原和回忆抗原敏化。在另一个实施方案中，DC是最强力的抗原产生细胞，在先天和适应性免疫系统之间作为信使。在一个实施方案中，DC细胞可用于通过产生攻击和裂解肿瘤的效应细胞来引发特异性抗肿瘤免疫性。
树突细胞存在于与外部环境接触的那些组织中，例如皮肤(在此是一种特化树突细胞类型，称为朗格汉斯细胞)以及鼻、肺、胃和肠的内壁。在血液中也发现其未成熟状态。一旦激活，其迁移到淋巴结，在此与T细胞和B细胞相互作用，从而启动并塑造适应性免疫反应。在某些发育阶段，其生长出分支状的突起，因此称细胞为树突细胞。可以对树突细胞进行工程化以表达特定肿瘤抗原。
T细胞活化所需的三个信号是：(i)自身MHC分子中同源抗原的呈递；(ii)通过膜结合受体-配体对的共刺激；及(iii)指导后续免疫反应极化的可溶因子。树突细胞(DC)能够提供T细胞活化所需的所有三个信号，使其成为出色的癌症疫苗平台。
因此，在一个实施方案中，本文公开了一种包含树突细胞和额外药剂的组合物，其中所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合。
在另一个实施方案中，本文公开了一种在对象中治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，包括给所述对象施用树突细胞和包含额外药剂的组合物的步骤，其中所述药剂包含凋亡细胞、凋亡细胞上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂、或其任何组合。
遗传修饰
在一些实施方案中，可以使用RNA、DNA、重组病毒或其组合来完成对T细胞、树突细胞和/或凋亡细胞的遗传修饰。在一些实施方案中，衍生自γ逆转录病毒或慢病毒的载体用于本文公开的组合物和方法中。在另一个实施方案中，这些载体可以整合到宿主基因组中，转基因潜在永久性表达及具有低固有免疫原性。在另一个实施方案中，整合到宿主基因组中和/或具有低固有免疫原性的另一种载体可以用于本文公开的组合物和方法中。在另一个实施方案中，非病毒载体介导的睡美人(sleeping beauty)转座子系统用于将CAR和其它基因插入T细胞。在另一个实施方案中，“自杀基因”被整合到T细胞中，其中促凋亡基因的表达在应答全身性递送药物的可诱导启动子的控制下。
在一些实施方案中，遗传修饰可以是瞬时的。在另一个实施方案中，遗传修饰可以利用信使RNA(mRNA)。在另一个实施方案中，可以多次将大量细胞输注到瞬时工程化的T细胞中，如mRNA转染的T细胞。在另一个实施方案中，使用体外转录的mRNA的基于RNA的淋巴细胞胞电穿孔介导了蛋白质的瞬时表达约一周，并消除了整合病毒载体的风险。在另一个实施方案中，mRNA转导的树突细胞或mRNA电穿孔的T和NK淋巴细胞。
已经证明，遗传修饰的T细胞可以在过继转移后持续十多年而没有副作用，表明遗传修饰人T细胞从根本上是安全的。
在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法中遗传修饰可以是本领域已知的任何方法。
凋亡细胞
用于本文公开的组合物和方法的凋亡细胞(“ApoCells”)的产生已在WO2014/087408中描述，其以全部内容并入本文作参考，并在下面实施例1中简要描述。在另一个实施方案中，以本领域已知的任何方式产生用于本文公开的组合物和方法中的凋亡细胞。在另一个实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的凋亡细胞对于接受治疗的对象是自体的。在另一个实施方案中，用于本文公开的组合物和方法中的凋亡细胞对于接受治疗的对象是同种异体的。在另一个实施方案中，包含凋亡细胞的组合物包含如本文公开的或本领域已知的凋亡细胞。
本领域技术人员将理解，术语“自体”可以涵盖供体和受体是同一人的组织、细胞、核酸分子或多肽。
本领域技术人员将理解，术语“同种异体”可以涵盖衍生自相同物种的不同个体的组织、细胞、核酸分子或多肽。在一些实施方案中，同种异体供体细胞与受体在遗传上是不同的。
在一些实施方案中，通过白细胞分离术获得根据本文公开的产生方法的单个核富集细胞组合物。本领域技术人员将理解，术语“白细胞分离术”可以涵盖其中将白细胞与供体血液分离的血液成分部分清除过程。在一些实施方案中，供体的血液经历白细胞分离术，因此根据本文公开的产生方法获得单个核富集的细胞组合物。要注意的是，如本领域已知的，在白细胞分离术中需要使用至少一种抗凝剂以防止收集的细胞凝结。
在一些实施方案中，白细胞分离术程序被设置为允许根据本文公开的生产方法收集单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，通过白细胞分离术获得的细胞收集物包含至少65％，在其他实施方案中，至少70％或至少80％的单个核细胞，如本文所公开。在一些实施方案中，与在本文公开的生产方法中获得单个核富集的细胞组合物平行收集来自细胞供体的血浆。在一些实施方案中，与根据本文公开的生产方法获得单个核富集的细胞组合物平行收集来自细胞供体的约300-600ml血浆。在一些实施方案中，与根据本文公开的生产方法获得单个核富集的细胞组合物平行收集的血浆用作冷冻和/或保温培养基的一部分。获得用于本文公开的组合物和方法中的凋亡细胞富集群的其他详细方法可见于WO2014/087408，其以全文并入本文参考。
在一些实施方案中，用于本文公开的方法的早期凋亡细胞包含至少85％的单个核细胞。在进一步的实施方案中，用于本文公开的方法的早期凋亡细胞包含至少85％的单个核细胞，90％的单个核细胞或超过90％的单个核细胞。在一些实施方案中，用于本文公开的方法的早期凋亡细胞包含至少90％的单个核细胞。在一些实施方案中，用于本文公开的方法的早期凋亡细胞包含至少95％的单个核细胞。
应注意，在一些实施方案中，尽管在细胞收集时单个核富集的细胞制备物包含至少65％、优选至少70％、最优选至少80％的单个核细胞，但在用于本文公开的方法的早期凋亡细胞的生产方法之后，最终药物群包含至少85％、优选至少90％、最优选至少95％的单个核细胞。
在某些实施方案中，用于产生用于本文公开的方法中的早期凋亡细胞的组合物的单个核富集的细胞制备物在细胞收集时包含至少50％的单个核细胞。在某些实施方案中，本文公开了用于产生药物群的方法，其中所述方法包括从供体的外周血获得单个核富集的细胞制备物，所述单个核富集的细胞制备物包含至少50％的单个核细胞。在某些实施方案中，本文公开了用于产生药物群的方法，其中该方法包括冷冻包含至少50％的单个核细胞的单个核富集的细胞制备物。
在一些实施方案中，所述细胞制备物包含至少85％的单个核细胞，其中所述制备物中至少40％的细胞处于早期凋亡状态，其中所述制备物中至少85％的细胞是活细胞。在一些实施方案中，所述凋亡细胞制备物包含不超过15％的CD15high表达细胞。
本领域技术人员理解，术语“早期凋亡状态”可以涵盖显示凋亡早期迹象而没有凋亡后期迹象的细胞。细胞凋亡的早期迹象的例子包括磷脂酰丝氨酸(PS)的暴露和线粒体膜电位的丧失。晚期事件的例子包括碘化丙啶(PI)进入细胞和最终DNA切割。为证明细胞处于“早期凋亡”状态，在一些实施方案中，使用通过膜联蛋白-V的PS暴露检测和PI染色，被膜联蛋白V染色而不被PI染色的细胞被认为是“早期凋亡细胞”。在另一个实施方案中，被膜联蛋白-V FITC和PI二者染色的细胞被认为是“晚期凋亡细胞”。在另一个实施方案中，既不被膜联蛋白-V也不被PI染色的细胞被认为是非凋亡活细胞。
本领域技术人员理解，在一些实施方案中，术语“早期凋亡细胞”，“凋亡细胞”和“ApoCell”及其语法变体可以互换使用，具有所有相同的性质和含义。本领域技术人员理解，在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法包含早期凋亡细胞。
在一些实施方案中，凋亡细胞包含处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中至少90％的所述细胞处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中至少80％的所述细胞处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中至少70％的所述细胞处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中至少60％的所述细胞处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中至少50％的所述细胞处于早期凋亡状态的细胞。
在一些实施方案中，包含凋亡细胞的组合物进一步包含抗凝剂。
在一些实施方案中，早期凋亡细胞是稳定的。本领域技术人员理解，在一些实施方案中，稳定性涵盖随时间保持早期凋亡细胞特征，例如，在约2-8℃储存时保持早期凋亡细胞特征。在一些实施方案中，稳定性包含在冷冻温度例如0℃或低于0℃的温度储存时保持早期凋亡细胞特征。
在一些实施方案中，根据用于本文公开的方法中的早期凋亡细胞的生产方法获得的单个核富集的细胞群在冷冻培养基中冷冻。在一些实施方案中，冷冻是逐渐的。在一些实施方案中，收集后，将细胞保持在室温直至冷冻。在一些实施方案中，在收集细胞之后并且在冷冻之前，细胞制备物在洗涤培养基中经历至少一个洗涤步骤。
如本文所用，术语“获得细胞”和“细胞收集”可以互换使用。在一些实施方案中，细胞制备物的细胞在收集的3-6小时内冷冻。在一些实施方案中，细胞制备物在直至细胞收集的6小时内冷冻。在一些实施方案中，细胞制备物的细胞在收集的1、2、3、4、5、6、7、8小时内冷冻。在其他实施方案中，细胞制备物的细胞在收集的8、12、24、48、72小时内冷冻。在其他实施方案中，收集后，将细胞保持在2-8℃直到冷冻。
在一些实施方案中，生产早期凋亡细胞群的冷冻包括：将细胞制备物在约-18℃至-25℃冷冻，随后将细胞制备物在约-80℃冷冻，最后将细胞制备物在液氮中冷冻直至解冻。在一些实施方案中，生产早期凋亡细胞群的冷冻包括：将细胞制备物在约-18℃至-25℃冷冻至少2小时，将细胞制备物在约-80℃冷冻至少2小时，最后将细胞制备物在液氮中冷冻直至解冻。在一些实施方案中，在解冻之前，将细胞在液氮中保持至少8、10或12小时。在一些实施方案中，将细胞制备物的细胞保持在液氮中直至解冻并与凋亡诱导保温培养基保温。在一些实施方案中，将细胞制备物的细胞保持在液氮中直到造血干细胞移植当天。在非限制性实例中，从细胞收集和冷冻到制备最终细胞群的时间可以在1-50天之间，或者在6-30天之间。在替代实施方案中，细胞制备物可以在液氮中保持更长时间，例如至少几个月。
在一些实施方案中，生产早期凋亡细胞群的冷冻包括将细胞制备物在约-18℃至-25℃冷冻至少0.5、1、2、4小时。在一些实施方案中，生产早期凋亡细胞群的冷冻包括将细胞制备物在约-18℃至-25℃冷冻约2小时。在一些实施方案中，生产早期凋亡细胞群的冷冻包括在约-80℃冷冻细胞制备物至少0.5、1、2、4、12小时。
在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物可以保持冷冻至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、20个月。在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物可以保持冷冻至少0.5、1、2、3、4、5年。在某些实施方案中，单个核富集的细胞组合物可以保持冷冻至少20个月。
在一些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物冷冻至少8、10、12、18、24小时。在某些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物冷冻至少8小时。在一些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物冷冻至少约10小时。在一些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物冷冻至少约12小时。在一些实施方案中，将单个核富集的细胞组合物冷冻约12小时。在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物的总冷冻时间(在约-18℃至-25℃，在约-80℃和在液氮中)为至少8、10、12、18、24小时。
在一些实施方案中，冷冻至少部分诱导单个核富集的细胞组合物的细胞的早期凋亡状态。在一些实施方案中，冷冻培养基包含RPMI 1640培养基，其包含L-谷氨酰胺、Hepes、Hes、二甲基亚砜(DMSO)和血浆。在一些实施方案中，冷冻培养基中的血浆是捐赠单个核富集的细胞群的供体的自体血浆。在一些实施方案中，冷冻培养基包含RPMI1640培养基，其包含2mM L-谷氨酰胺、10mM Hepes、5％Hes、10％二甲基亚砜和20％v/v血浆。
在一些实施方案中，冷冻培养基包含抗凝剂。在某些实施方案中，在早期凋亡细胞群产生期间使用的至少一些培养基，包括冷冻培养基、保温培养基和洗涤培养基，包含抗凝剂。在某些实施方案中，在早期凋亡细胞群的产生过程中使用的包含抗凝剂的所有培养基都包含相同浓度的抗凝剂。在一些实施方案中，不将抗凝剂添加到细胞群的最终悬浮培养基中。
在一些实施方案中，至少向冷冻培养基中添加抗凝剂改善细胞制备物的收率。在其他实施方案中，在高甘油三酯水平存在下，向冷冻培养基中添加抗凝剂改善细胞制备物的收率。如本文所用，细胞制备物收率的改善涉及以下至少一项的改善：冷冻细胞中活细胞的百分比、活细胞中早期状态凋亡细胞的百分比及其组合。
在一些实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少24小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定24小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过24小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少36小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少36小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过36小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少72小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定72小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过72小时。
本领域技术人员理解，术语“稳定”涵盖保持PS阳性(磷脂酰丝氨酸阳性)而仅具有很小百分比的PI阳性(碘化丙锭阳性)的凋亡细胞。PI阳性细胞提供膜稳定性的指示，其中PI阳性细胞允许进入细胞，表明膜较不稳定。在一些实施方案中，稳定的早期凋亡细胞保持在早期凋亡至少24小时、至少36小时、至少48小时或至少72小时。在另一个实施方案中，稳定的早期凋亡细胞保持在早期凋亡24小时、36小时、48小时或72小时。在另一个实施方案中，稳定的早期凋亡细胞保持在早期凋亡超过24小时、超过36小时、超过48小时或超过72小时。在另一个实施方案中，稳定的早期凋亡细胞在延长的时间段内保持其状态。
在一些实施方案中，凋亡细胞群不含细胞聚集体。在一些实施方案中，凋亡细胞群不含大的细胞聚集体。在一些实施方案中，与在从供体以细胞收集(白细胞分离术)以外的步骤中不添加抗凝剂的情况下制备的凋亡细胞群相比，凋亡细胞群具有数量减少的细胞聚集体。在一些实施方案中，凋亡细胞群或其组合物包含抗凝剂。
在一些实施方案中，凋亡细胞不含细胞聚集体，其中所述凋亡细胞获自患有高血液甘油三酯的对象。在一些实施方案中，对象的血液甘油三酯水平高于150mg/dL。在一些实施方案中，凋亡细胞群不含细胞聚集体，其中所述凋亡细胞群从得自具有正常血液甘油三酯的对象的细胞制备。在一些实施方案中，对象的血液甘油三酯水平等于或低于150mg/dL。在一些实施方案中，细胞聚集体在凋亡细胞生产方法期间产生细胞损失。
本领域技术人员理解，术语“聚集体”或“细胞聚集体”可涵盖在低剪切力或静止状态下血细胞的可逆团块。在生产凋亡细胞的保温步骤中可以目视观察细胞聚集体。细胞聚集可以通过本领域已知的任何方法来测量，例如通过在光学显微镜下对样品进行视觉成像或使用流式细胞仪。
在一些实施方案中，抗凝剂选自包含肝素、柠檬酸葡萄糖(ACD)配方A及其组合的组中。在一些实施方案中，抗凝剂选自由肝素、柠檬酸葡萄糖(ACD)配方A及其组合组成的组中。
在制备早期凋亡细胞群及其组合物的方法的一些实施方案中，将抗凝剂添加到在制备细胞群期间使用的至少一种培养基中。在一些实施方案中，在细胞群制备期间使用的至少一种培养基选自：冷冻培养基、洗涤培养基、凋亡诱导保温培养基及其任何组合。
在一些实施方案中，抗凝剂选自：肝素、ACD配方A及其组合。注意到也可以使用本领域已知的其它抗凝剂，例如但不限于磺达肝素、比伐卢定和阿加曲班。
在一些实施方案中，在细胞群的制备期间使用的至少一种培养基含有5％的ACD配方A溶液，所述溶液包含10U/ml肝素。在一些实施方案中，不将抗凝剂添加到细胞群的最终悬浮培养基中。如本文所用，术语“最终悬浮培养基”和“施用培养基”可互换使用，具有所有相同的性质和含义。
在一些实施方案中，在细胞群制备期间使用的至少一种培养基包含浓度为0.1-2.5U/ml的肝素。在一些实施方案中，在细胞群制备期间使用的至少一种培养基包含浓度为1％-15％v/v的ACD配方A。在一些实施方案中，冷冻培养基包含抗凝剂。在一些实施方案中，保温培养基包含抗凝剂。在一些实施方案中，冷冻培养基和保温培养基均包含抗凝剂。在一些实施方案中，抗凝剂选自：肝素、ACD配方A及其组合。
在一些实施方案中，冷冻培养基中肝素浓度为0.1-2.5U/ml。在一些实施方案中，冷冻培养基中ACD配方A浓度为1％-15％v/v。在一些实施方案中，保温培养基中肝素浓度为0.1-2.5U/ml。在一些实施方案中，保温培养基中ACD配方A浓度为1％-15％v/v。在一些实施方案中，抗凝剂是柠檬酸葡萄糖(ACD)配方A的溶液。在一些实施方案中，添加到在细胞群制备期间使用的至少一种培养基中的抗凝剂是含有浓度为10U/ml的肝素的ACD配方A。
在一些实施方案中，用于产生早期凋亡细胞群的凋亡诱导保温培养基包含抗凝剂。在一些实施方案中，用于产生早期凋亡细胞群的冷冻培养基和凋亡诱导保温培养基均包含抗凝剂。不希望受到任何理论或机制的束缚，无论细胞收集方案如何，为了在不同细胞组合物中维持高且稳定的细胞收率，在一些实施方案中，添加抗凝剂包括在生产凋亡细胞群过程中将抗凝剂添加到冷冻培养基和凋亡诱导保温培养基中。在一些实施方案中，组合物中高且稳定的细胞收率包括至少30％、优选至少40％、通常至少50％的最初细胞群的细胞用于诱导凋亡的细胞收率。
在一些实施方案中，冷冻培养基和保温培养基均包含抗凝剂。在一些实施方案中，无论细胞收集条件例如但不限于时机和/或在细胞收集过程中添加的抗凝剂类型如何，在保温培养基和冷冻培养基中添加抗凝剂均导致在不同细胞群制备物之间的高且稳定的细胞收率。在一些实施方案中，无论在白细胞分离术期间添加抗凝剂的时间和/或类型如何，向保温培养基和冷冻培养基两者中添加抗凝剂均导致细胞制备物的高且稳定的收率。在一些实施方案中，在高甘油三酯水平的存在下生产细胞制备物导致在不同制备物之间低和/或不稳定的细胞收率。在一些实施方案中，由高甘油三酯水平的供体的血液生成细胞制备物导致细胞制备物的低和/或不稳定的细胞收率。在一些实施方案中，术语“高甘油三酯水平”是指高于相同性别和年龄的健康对象的正常水平的甘油三酯水平。在一些实施方案中，术语“高甘油三酯水平”是指高于约1.7毫摩尔/升的甘油三酯水平。如本文所用，高且稳定的收率是指细胞群中的细胞收率，其足够高以使得能够制备当施用给对象时表现出治疗效力的剂量。在一些实施方案中，治疗效力是指在对象中治疗、预防或改善免疫疾病、自身免疫疾病或炎性疾病的能力。在一些实施方案中，高且稳定的细胞收率是细胞群中的细胞除以最初冷冻的细胞为至少30％、可能至少40％、通常至少50％的细胞收率。
在一些实施方案中，如果从具有高甘油三酯水平的供体获得细胞制备物，则该供体将采取选自以下的至少一种措施：在捐赠前服用降甘油三酯药物，例如但不限于：他汀类药物和/或苯扎贝特，在捐赠前禁食至少8、10、12小时，在捐赠前至少24、48、72小时吃适当饮食以降低血液甘油三酯水平，以及其任何组合。
在一些实施方案中，细胞群中的细胞收率涉及组合物细胞数除以经历凋亡诱导的细胞的初始数目。如本文所用，术语“诱导早期凋亡状态”和“诱导凋亡”可以互换使用。
在一些实施方案中，在冷冻和解冻之后，将单个核富集的细胞组合物在保温培养基中保温。在一些实施方案中，在解冻和保温之间存在至少一个洗涤步骤。如本文所用，术语“保温培养基”和“凋亡诱导保温培养基”可互换使用。在一些实施方案中，保温培养基包含补加了L-谷氨酰胺、Hepes、甲泼尼龙和血浆的RPMI 1640培养基。在一些实施方案中，洗涤培养基包含2mM L-谷氨酰胺、10mM Hepes和10％v/v血浆。在一些实施方案中，保温培养基中的血浆源自衍生了细胞制备物的细胞的相同供体。在一些实施方案中，在保温当天将血浆添加到保温培养基中。在一些实施方案中，在37℃和5％CO2下进行保温。
在一些实施方案中，保温培养基包含甲泼尼龙。在一些实施方案中，保温培养基内的甲泼尼龙进一步诱导单个核富集的细胞组合物中的细胞进入早期凋亡状态。在一些实施方案中，通过在甲泼尼龙存在下冷冻和保温，单个核富集的细胞组合物中的细胞被诱导进入早期凋亡状态。在一些实施方案中，早期凋亡细胞群的产生有利地诱导早期凋亡状态，而基本上不诱导坏死，其中在制备后，细胞在所述早期凋亡状态保持稳定约24小时。
在一些实施方案中，保温培养基包含浓度大约10-100μg/ml的甲泼尼龙。在一些实施方案中，保温培养基包含浓度大约40-60μg/ml或者大约45-55μg/ml的甲泼尼龙。在一些实施方案中，保温培养基包含浓度为50μg/ml的甲泼尼龙。
在一些实施方案中，保温大约2-12小时，可能4-8小时，典型大约5-7小时。在一些实施方案中，保温大约6小时。在一些实施方案中，保温至少6小时。在优选的实施方案中，保温6小时。
在一些实施方案中，保温培养基包含抗凝剂。在一些实施方案中，将抗凝剂添加到保温培养基中提高了细胞制备物的收率。在一些实施方案中，保温培养基中的抗凝剂的浓度与冷冻培养基中的浓度相同。在一些实施方案中，保温培养基包含选自肝素、ACD配方A及其组合的抗凝剂。在一些实施方案中，在保温培养基中使用的抗凝剂是含有浓度为10U/ml的肝素的ACD配方A。
在一些实施方案中，保温培养基包含肝素。在一些实施方案中，保温培养基中肝素浓度在0.1-2.5U/ml之间。在一些实施方案中，保温培养基中肝素浓度在0.1-2.5U/ml之间，可能在0.3-0.7U/ml之间，典型为大约0.5U/ml。在某些实施方案中，保温培养基中肝素浓度为大约0.5U/ml。
在一些实施方案中，保温培养基包含ACD配方A。在一些实施方案中，保温培养基中ACD配方A浓度在1％-15％v/v之间。在一些实施方案中，保温培养基中ACD配方A浓度在1％-15％v/v之间、可能在4％-7％v/v之间、典型为大约5％v/v。在一些实施方案中，保温培养基中ACD配方A浓度为大约5％v/v。
在一些实施方案中，改善细胞制备物的收率包括制备物的早期凋亡活细胞数除以制备该制备物的冷冻细胞数的改善。
在一些实施方案中，将抗凝剂添加到冷冻培养基中有助于在不同的药物群制备物之间的高且稳定的收率。在优选的实施方案中，至少将抗凝剂添加到冷冻培养基和保温培养基中导致不同的药物组合物制备物之间的高且稳定的收率，而无论所使用的细胞收集方案如何。
在一些实施方案中，冷冻培养基包含选自以下的抗凝剂：肝素、ACD配方A及其组合。在一些实施方案中，在冷冻培养基中使用的抗凝剂是含有浓度为10U/ml的肝素的ACD配方A。在一些实施方案中，冷冻培养基包含5％v/v的ACD配方A溶液，其包含浓度为10U/ml的肝素。
在一些实施方案中，冷冻培养基包含肝素。在一些实施方案中，冷冻培养基中肝素浓度在0.1-2.5U/ml之间。在一些实施方案中，冷冻培养基中肝素浓度在0.1-2.5U/ml之间，可能在0.3-0.7U/ml之间，典型为大约0.5U/ml。在某些实施方案中，冷冻培养基中肝素浓度为大约0.5U/ml。
在一些实施方案中，冷冻培养基包含ACD配方A。在一些实施方案中，冷冻培养基中ACD配方A浓度在1％-15％v/v之间。在一些实施方案中，冷冻培养基中ACD配方A浓度在1％-15％v/v之间、可能在4％-7％v/v之间、典型为大约5％v/v。在一些实施方案中，冷冻培养基中ACD配方A浓度为大约5％v/v。
在一些实施方案中，向保温培养基和/或冷冻培养基中添加抗凝剂导致细胞群内高且稳定的细胞收率，无论供体血液中甘油三酯水平如何。在一些实施方案中，当从具有正常或高甘油三酸酯水平的供体的血液中获得时，将抗凝剂添加至保温培养基和/或冷冻培养基导致本发明组合物中高且稳定的细胞收率。在一些实施方案中，至少将抗凝剂添加到保温培养基中，无论供体血液中甘油三酯的水平如何，都在本发明组合物中产生高且稳定的细胞收率。在一些实施方案中，将抗凝剂添加到冷冻培养基和保温培养基中导致组合物内的高且稳定的细胞收率，无论供体血液中甘油三酯水平如何。
在一些实施方案中，冷冻培养基和/或保温培养基和/或洗涤培养基包含浓度为至少0.1U/ml、可能至少0.3U/ml、典型至少0.5U/ml的肝素。在一些实施方案中，冷冻培养基和/或保温培养基和/或洗涤培养基包含浓度为至少1％v/v、可能至少3％v/v、典型至少5％v/v的ACD配方A。
在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物在细胞收集之后和在重悬在冷冻培养基中和冷冻之前经历至少一个洗涤步骤。在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物在冷冻和解冻后经历至少一个洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤步骤包括将单个核富集的细胞组合物离心，然后提取上清液并将其重悬于洗涤培养基中。
在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物在早期凋亡细胞群产生的每个阶段之间经历至少一个洗涤步骤。在一些实施方案中，在早期凋亡细胞群的整个生产过程中，在洗涤步骤期间将抗凝剂添加到洗涤培养基中。在一些实施方案中，在保温后，单个核富集的细胞组合物经历至少一个洗涤步骤。在一些实施方案中，在使用PBS保温后，单个核富集的细胞组合物经历至少一个洗涤步骤。在一些实施方案中，在将细胞制备物重悬在施用培养基中之前，不将抗凝剂添加到最终的洗涤步骤中。在一些实施方案中，在将细胞制备物重悬在施用培养基中之前，不将抗凝剂添加到用于最终洗涤步骤的PBS中。在某些实施方案中，不将抗凝剂添加到施用培养基中。
在一些实施方案中，保温期间细胞浓度为大约5×106细胞/ml。
在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物在冷冻、解冻和保温后悬浮在施用培养基中，从而产生药物群。在一些实施方案中，施用培养基包含合适的生理缓冲液。合适的生理缓冲液的非限制性例子是：盐水溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)，Hank平衡盐溶液(HBSS)等。在一些实施方案中，施用培养基包含PBS。在一些实施方案中，施用培养基包含有助于维持细胞存活的补充剂。在一些实施方案中，在施用前过滤单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在施用之前，使用至少200μm的滤器过滤单个核富集的细胞组合物。
在一些实施方案中，单个核富集的细胞群重悬于施用培养基中，由此所得的细胞制备物的终体积在100-1000ml之间，可能在200-800ml之间，典型在300-600ml之间。
在一些实施方案中，细胞收集是指获得单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在早期凋亡细胞群产生期间进行的洗涤步骤在洗涤培养基中进行。在一些实施方案中，在洗涤培养基中进行洗涤步骤直至产生早期凋亡细胞群的保温步骤。在一些实施方案中，洗涤培养基包含补充有L-谷氨酰胺和Hepes的RPMI 1640培养基。在一些实施方案中，洗涤培养基包含补充有2mM L-谷氨酰胺和10mM Hepes的RPMI 1640培养基。
在一些实施方案中，洗涤培养基包含抗凝剂。在一些实施方案中，洗涤培养基包含选自以下的抗凝剂：肝素、ACD配方A及其组合。在一些实施方案中，抗凝剂在洗涤培养基中的浓度与在冷冻培养基中的浓度相同。在一些实施方案中，抗凝剂在洗涤培养基中的浓度与在保温培养基中的浓度相同。在一些实施方案中，洗涤培养基中使用的抗凝剂是ACD配方A，其含有浓度为10U/ml的肝素。
在一些实施方案中，洗涤培养基包含肝素。在一些实施方案中，洗涤培养基中肝素浓度在0.1-2.5U/ml之间。在一些实施方案中，洗涤培养基中肝素浓度在0.1-2.5U/ml之间，可能在0.3-0.7U/ml之间，典型为大约0.5U/ml。在某些实施方案中，洗涤培养基中肝素浓度为大约0.5U/ml。
在一些实施方案中，洗涤培养基包含ACD配方A。在一些实施方案中，洗涤培养基中ACD配方A浓度在1％-15％v/v之间。在一些实施方案中，洗涤培养基中ACD配方A浓度在1％-15％v/v之间，可能在4％-7％v/v之间，典型在大约5％v/v。在一些实施方案中，洗涤培养基中ACD配方A浓度为大约5％v/v。
在一些实施方案中，在预期给对象施用所述细胞群之前若干小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物在约33℃-39℃解冻。在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物解冻大约30-240秒，优选40-180秒，最优选50-120秒。
在一些实施方案中，在预期施用所述细胞群之前至少10小时，或者预期施用细胞群之前至少20、30、40或50小时，解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在预期施用所述细胞群之前至少15-24小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在预期施用所述细胞群之前至少约24小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在预期施用所述细胞群之前20小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在预期施用所述细胞群之前30小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，在预期施用所述细胞群之前至少24小时解冻单个核富集的细胞组合物。在一些实施方案中，单个核富集的细胞组合物在解冻之前和/或之后在洗涤培养基中经历至少一个洗涤步骤。
在一些实施方案中，组合物还包含甲泼尼龙。在一些实施方案中，甲泼尼龙的浓度不超过30μg/ml。
在一些实施方案中，凋亡细胞以高剂量使用。在一些实施方案中，凋亡细胞以高浓度使用。在一些实施方案中，使用人凋亡多形核中性粒细胞(PMN)。在一些实施方案中，使用一组细胞，其中50％是凋亡细胞。在一些实施方案中，通过May-Giemsa染色的细胞制备物验证凋亡细胞。在一些实施方案中，通过台盼蓝排除法评估细胞的存活。在一些实施方案中，通过膜联蛋白V/碘化丙啶染色并通过FACS检测来证实细胞的凋亡和坏死状态。
在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞不包含坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于1％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于2％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于3％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于4％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于5％的坏死细胞。
在一些实施方案中，施用剂量约为140×106-210×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为10-100×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为20×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为30×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为40×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为50×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为60×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为60×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为70×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为80×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为90×106凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为1-15×107凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为10×107凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量约为15×107凋亡细胞。
在一些实施方案中，施用剂量为10×106凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为10×107凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为10×108凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为10×109凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为10×1010凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为10×1011凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为10×1012凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为10×105凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为10×104凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为10×103凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为10×102凋亡细胞。
在一些实施方案中，施用高剂量凋亡细胞。在一些实施方案中，施用剂量为35×106凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为210×106凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为70×106凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为140×106凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用剂量为35-210×106凋亡细胞。
在一些实施方案中，施用单剂凋亡细胞。在一些实施方案中，施用多剂凋亡细胞。在一些实施方案中，施用2剂凋亡细胞。在一些实施方案中，施用3剂凋亡细胞。在一些实施方案中，施用4剂凋亡细胞。在一些实施方案中，施用5剂凋亡细胞。在一些实施方案中，施用6剂凋亡细胞。在一些实施方案中，施用7剂凋亡细胞。在一些实施方案中，施用8剂凋亡细胞。在一些实施方案中，施用9剂凋亡细胞。在一些实施方案中，施用多于9剂的凋亡细胞。在一些实施方案中，施用多剂凋亡细胞。
在一些实施方案中，凋亡细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉内、皮下、结节内、肿瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接向胸腺施用。
在一些实施方案中，凋亡细胞从得自对象的细胞制备，所述对象不同于将接受所述凋亡细胞的对象。在一些实施方案中，本文公开的方法包括在克服同种异基因供体细胞排斥中有用的附加步骤，包括美国专利申请20130156794中描述的一个或多个步骤，所述申请以其全文并入本文参考。在一些实施方案中，所述方法包括在施用凋亡细胞之前进行全部或部分淋巴耗竭的步骤，所述凋亡细胞在一些实施方案中是同种异基因凋亡细胞。在一些实施方案中，调节淋巴耗竭以使其延迟宿主抗移植物反应一段足够时间以允许同种异基因凋亡细胞控制细胞因子释放。在一些实施方案中，该方法包括施用延迟同种异基因凋亡T细胞从淋巴结流出的药剂的步骤，如2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1,3-二醇(FTY720)，5-[4-苯基-5-(三氟甲基)噻吩-2-基]-3-[3-(三氟甲基)苯基-1]1,2,4-噁二唑(SEW2871)，3-(2-(-己基苯基氨基)-2-氧乙氨基)丙酸(W123)，磷酸2-铵基-4-(2-氯-4-(3-苯氧基苯硫基)苯基)-2-(羟甲基)丁酯(KRP-203磷酸)或者本领域已知的其它物质，可以用作本文公开的组合物和方法的一部分，以使得可以使用具有功效并且缺乏移植物抗宿主疾病的引发能力的同种异基因凋亡细胞。在另一个实施方案中，使同种异基因凋亡T细胞的MHC表达沉默以减少同种异基因细胞的排斥。
在一些实施方案中，方法包括产生单个核凋亡细胞群，其包含百分比减少的非静止非凋亡活细胞；任何活的非凋亡细胞的细胞活化被抑制；或者任何活的非凋亡细胞的增殖降低；或其任何组合，所述方法包括以下步骤，获得外周血的单个核富集的细胞群；在包含抗凝剂的冷冻培养基中冷冻所述单个核富集的细胞群；解冻所述单个核富集的细胞群；在凋亡诱导保温培养基中保温所述单个核富集的细胞群，所述培养基包含终浓度约10-100μg/mL的甲泼尼龙和抗凝剂；将所述凋亡细胞群重悬于施用培养基中；失活所述单个核富集的细胞群，其中所述失活发生在凋亡诱导之后，其中所述方法产生单个核凋亡细胞群，其包含百分比减少的非静止非凋亡细胞；任何活的非凋亡细胞的细胞活化被抑制；或者任何活的非凋亡细胞的增殖降低；或其任何组合。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：在将凋亡细胞群施用同一对象(自体ApoCells)之前，辐照来自对象的凋亡细胞群。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：在将凋亡细胞群施用给受体(同种异基因ApoCells)之前，辐照来自对象的凋亡细胞。
在一些实施方案中，以减少凋亡细胞群内残余活细胞的增殖和/或活化的方式辐照细胞。在一些实施方案中，以降低群中活的非凋亡细胞的百分比的方式辐照细胞。在一些实施方案中，灭活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至低于该群的50％。在一些实施方案中，灭活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至低于该群的40％。在一些实施方案中，灭活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至低于该群的30％。在一些实施方案中，灭活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至低于该群的20％。在一些实施方案中，灭活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至低于该群的10％。在一些实施方案中，灭活的早期凋亡细胞群中活的非凋亡细胞的百分比降低至该群的0％。
在另一个实施方案中，被辐照的凋亡细胞保留其所有早期凋亡、免疫调节、稳定性性质。在另一个实施方案中，辐照步骤使用UV辐射。在另一个实施方案中，辐射步骤使用伽马辐射。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含降低百分比的活的非凋亡细胞，包含在凋亡细胞制备物内存在的任何活的非凋亡细胞的细胞活化被抑制的制备物，或包含在凋亡细胞制备物内存在的任何活的非凋亡细胞的增殖降低的制备物，或其任何组合。
在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不增加死细胞群(PI+)。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约1％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约2％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约3％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约4％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约5％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约6％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约7％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约8％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约9％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约10％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约15％。在一些实施方案中，与未辐照的凋亡细胞相比，凋亡细胞的辐照不会使死细胞群(PI+)增加超过约20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。
在一些实施方案中，包含降低的或不存在活的非凋亡细胞部分的细胞群可以在一个实施方案中提供不具有任何活/存活细胞的单个核早期凋亡细胞群。在一些实施方案中，包含降低的或不存在活的非凋亡细胞部分的细胞群可以在一个实施方案中提供在受体中不引起GVHD的单个核凋亡细胞群。
在一些实施方案中，使用经辐照的凋亡细胞消除使用凋亡细胞群(包括一小部分活细胞)可导致的移植物抗白血病作用，表明本文实施例显示的作用(见实施例8)是由凋亡细胞引起的，而不是由凋亡细胞群体内存在的具有细胞活性的活细胞增殖群体引起的。
在另一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：在给受体施用之前，辐照自供体WBC衍生的凋亡细胞。在一些实施方案中，以避免凋亡细胞群内残留的存活细胞增殖和/或活化的方式辐照细胞。在另一个实施方案中，被辐照的凋亡细胞保留其所有早期凋亡、免疫调节、稳定性性质。在另一个实施方案中，幅射步骤使用UV辐射。在另一个实施方案中，辐射步骤使用伽马辐射。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含降低百分比的活的非凋亡细胞，包含在凋亡细胞制备物内存在的任何活的非凋亡细胞的细胞活化被抑制的制备物，或包含在凋亡细胞制备物内存在的任何活的非凋亡细胞的增殖降低的制备物，或其任何组合。
在一些实施方案中，凋亡细胞包含合并的单个核凋亡细胞制备物。在一些实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物包含处于早期凋亡状态的单个核细胞，其中所述合并的单个核凋亡细胞包含降低百分比的活的非凋亡细胞，具有任何活的非凋亡细胞的细胞活化被抑制的制备物，或具有任何活的非凋亡细胞的增殖降低的制备物，或其任何组合。在另一个实施方案中，已经辐照合并的单个核凋亡细胞。在另一个实施方案中，本文公开了一种合并的单个核凋亡细胞制备物，其在一些实施方案中源自得自献血的白细胞级分(WBC)。
在一些实施方案中，辐照凋亡细胞制备物。在另一个实施方案中，所述辐照包含γ辐照或UV辐照。在另一个实施方案中，与未辐照的凋亡细胞制备物相比，辐照的制备物具有降低数目的非凋亡细胞。在另一个实施方案中，与未辐照的凋亡细胞制备物相比，辐照的制备物具有降低数目的增殖细胞。在另一个实施方案中，与未辐照的凋亡细胞群相比，辐照的制备物具有降低数目的潜在免疫活性细胞。
在一些实施方案中，合并的血液包含供体和受体之间不匹配的第三方血液。
本领域技术人员理解，术语“合并”可以涵盖从多个供体收集的血液，这些血液被制备并且可能被存储以供以后使用。然后可以处理该合并的血液集合以产生合并的单个核凋亡细胞制备物。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物确保可容易获得的单个核凋亡细胞的供应。在另一个实施方案中，在即将诱导凋亡的保温步骤之前合并细胞。在另一个实施方案中，在保温步骤之后，在重悬步骤中合并细胞。在另一个实施方案中，在即将辐照步骤之前合并细胞。在另一个实施方案中，在辐照步骤之后合并细胞。在另一个实施方案中，在制备方法中的任何步骤合并细胞。
在一些实施方案中，合并的凋亡细胞制备物衍生自存在于约2至25单位血液中的细胞。在另一个实施方案中，所述合并的凋亡细胞制备物包含存在于约2-5、2-10、2-15、2-20、5-10、5-15、5-20、5-25、10-15、10-20、10-25、6-13或6-25单位血液中的细胞。在另一个实施方案中，所述合并的凋亡细胞制备物包含存在于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25单位血液中的细胞。所需的血液单位数还取决于从血液回收WBC的效率。例如，低效率WBC回收将导致需要更多单位，而高效率WBC回收将导致所需单位更少。在一些实施方案中，每单位是一袋血。在另一个实施方案中，合并的凋亡细胞制备物包含存在于至少25单位血液、至少50单位血液或至少100单位血液中的细胞。
在一些实施方案中，血液单位包含来自献血的白细胞(WBC)级分。在另一个实施方案中，捐赠可以来自血液中心或血库。在另一个实施方案中，捐赠可以来自在制备合并的凋亡细胞制备物时在医院集合的捐赠者。在另一个实施方案中，包含来自多个供体的WBC的血液单位被保存并维持在独立的血库中，该血库被创建用于本文所公开的组合物及其方法的目的。在另一个实施方案中，出于本文公开的组合物和其方法的目的而开发的血库能够从多个供体提供包含WBC的血液单位并包含白细胞分离术单位。
在一些实施方案中，合并的WBC的单位不受HLA匹配的限制。因此，所得合并的凋亡细胞制备物包含不受HLA匹配限制的细胞群。因此，在某些实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物包含同种异基因细胞。
来自不受HLA匹配限制的合并的WBC的合并的单个核凋亡细胞制备物的优点是WBC的可容易获得的来源和降低的获得WBC的成本。
在一些实施方案中，合并的血液包含来自多个供体的血液，其不依赖于HLA匹配。在另一个实施方案中，合并的血液包含来自多个供体的血液，其中已经考虑了与受体的HLA匹配。例如，其中1个HLA等位基因、2个HLA等位基因、3个HLA等位基因、4个HLA等位基因、5个HLA等位基因、6个HLA等位基因或7个HLA等位基因已在供体和受体之间匹配。在另一个实施方案中，多个供体是部分匹配的，例如一些供体已经是HLA匹配的，其中1个HLA等位基因、2个HLA等位基因、3个HLA等位基因、4个HLA等位基因、5个HLA等位基因、6个HLA等位基因或7个HLA等位基因在一些供体和受体之间匹配。每种可能性包含如本文公开的一个实施方案。
在某些实施方案中，在下述的诱导凋亡步骤(实施例1)之后，一些活的非凋亡细胞(抗凋亡)可以保留。在一些实施方案中，在辐照步骤之前观察到这些活的非凋亡细胞的存在。这些活的非凋亡细胞可能能够增殖或被活化。在一些实施方案中，源自多个供体的合并的单个核凋亡细胞制备物可以针对宿主被活化，针对彼此被活化或两者都有。
在一些实施方案中，与未辐照的细胞制备物相比，本文公开的辐照的细胞制备物具有被抑制的细胞活化和降低的增殖。在另一个实施方案中，辐照包含γ辐照或UV辐照。在另一个实施方案中，与未辐照的细胞制备物相比，辐照的细胞制备物具有降低数目的非凋亡细胞。在另一个实施方案中，辐照包含约15格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约20格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约25格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约30格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约35格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约40格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约45格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约50格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约55格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约60格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含约65格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，辐照包含高达2500Gy。在另一个实施方案中，辐照的合并的凋亡细胞制备物与非辐照合并的凋亡细胞制备物保持相同或相似的凋亡谱、稳定性和功效。
在一些实施方案中，本文公开的合并的单个核凋亡细胞制备物稳定直至24小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定至少24小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定超过24小时。在另一个实施方案中，本文公开的合并的单个核凋亡细胞制备物稳定直至36小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定至少36小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定超过36小时。在另一个实施方案中，本文公开的合并的单个核凋亡细胞制备物稳定直至48小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定至少48小时。在另一个实施方案中，合并的单个核凋亡细胞制备物稳定超过48小时。
在一些实施方案中，包含辐照步骤的产生合并的细胞制备物的方法保留了在衍生自单个匹配供体的凋亡制备物(其中细胞制备物可能不包括辐照步骤)中观察到的早期凋亡、免疫调节和稳定性性质。在另一个实施方案中，本文公开的合并的单个核凋亡细胞制备物不引起移植物抗宿主病(GVHD)应答。
辐照细胞制备物在本领域被认为是安全的。辐照程序目前常规用于捐献血液以防止对WBC的反应。
在另一个实施方案中，本文公开的合并的单个核凋亡细胞制备物中凋亡细胞的百分比接近100％，从而减少了细胞制备物中活的非凋亡细胞的分数。在一些实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少40％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少50％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少60％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少70％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少80％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少90％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少99％。因此，在一个实施方案中，包含减少的或不存在活的非凋亡细胞部分的细胞制备物可以提供在受体中不引起GVHD的合并的单个核凋亡细胞制备物。每种可能性代表本文公开的一个实施方案。
可选地，在另一个实施方案中，例如通过靶向沉淀，通过特异性去除活细胞群来降低活的非凋亡WBC的百分比。在另一个实施方案中，可以使用与磷脂酰丝氨酸结合的磁珠来降低活的非凋亡细胞的百分比。在另一个实施方案中，可以使用结合非凋亡细胞而不是凋亡细胞的细胞表面上的标记的磁珠来降低活的非凋亡细胞的百分比。在另一个实施方案中，可以使用结合凋亡细胞而不是非凋亡细胞的细胞表面上的标记的磁珠来选择凋亡细胞用于进一步制备。在又一个实施方案中，通过使用超声降低活的非凋亡WBC的百分比。
在一个实施方案中，凋亡细胞来自合并的第三方供体。
在一些实施方案中，合并的细胞制备物包含至少一种选自以下的细胞类型：淋巴细胞、单核细胞和天然杀伤细胞。在另一个实施方案中，合并的细胞制备物包含富集的单个核细胞群。在一些实施方案中，合并的单个核是单个核富集的细胞制备物，包含选自以下的细胞类型：淋巴细胞、单核细胞和天然杀伤细胞。在另一个实施方案中，单个核富集的细胞制备物包含不超过15％、或者不超过10％、典型地不超过5％的多形核白细胞，也称为粒细胞(即嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。在另一个实施方案中，合并的单个核细胞制备物不含粒细胞。
在另一个实施方案中，合并的单个核富集的细胞制备物包含不超过15％、或者不超过10％、典型地不超过5％的CD15high表达细胞。在一些实施方案中，合并的凋亡细胞制备物包含少于15％的CD15高表达细胞。
在一些实施方案中，本文公开的合并的单个核富集的细胞制备物包含至少80％的单个核细胞，至少85％的单个核细胞，或者至少90％的单个核细胞或至少95％的单个核细胞，其中每种可能性是本文公开的一个单独的实施方案。根据一些实施方案，本文公开的合并的单个核富集的细胞制备物包含至少85％的单个核细胞。
在另一个实施方案中，具有至少80％的单个核细胞最终合并百分比的任何合并的细胞制备物被认为是本文公开的合并的单个核富集的细胞制备物。因此，将具有增加的多形核细胞(PMN)的细胞制备物与具有高单个核细胞的细胞制备物合并，所得“合并”具有至少80％的单个核细胞，包含本文所公开的制备物。根据一些实施方案，单个核细胞包含淋巴细胞和单核细胞。
本领域技术人员理解术语“单个核细胞”可以涵盖具有一个单裂核的白细胞。在另一个实施方案中，本文公开的合并的凋亡细胞制备物包含少于5％的多形核白细胞。
在一些实施方案中，凋亡细胞是T细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞衍生自与CAR T细胞相同的合并的第三方供体T细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞衍生自CAR T细胞群。
令人惊讶地，凋亡细胞单独或组合降低与细胞因子风暴相关的细胞因子的产生，所述细胞因子包括但不限于IL-6和干扰素-γ(IFN-γ)，同时保持CAR T细胞治疗的效力(实施例2)。在一个实施方案中，凋亡细胞影响巨噬细胞中细胞因子表达水平。在另一个实施方案中，凋亡细胞降低巨噬细胞中细胞因子表达水平。在一个实施方案中，凋亡细胞压制巨噬细胞中细胞因子表达水平。在一个实施方案中，凋亡细胞抑制巨噬细胞中细胞因子表达水平。在一个实施方案中，凋亡细胞保持IFN-γ水平以匹配或近似匹配CAR T细胞施用前存在的水平。在另一个实施方案中，凋亡细胞影响巨噬细胞中细胞因子表达水平，但不影响CAR T细胞中细胞因子表达水平。在另一个实施方案中，凋亡细胞影响DC中细胞因子表达水平，但不影响CAR T细胞中细胞因子表达水平。因此，预料不到的是凋亡细胞可用于保持CART细胞治疗的效力。
在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子表达水平的作用导致CRS的降低。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子表达水平的作用导致严重CRS的降低。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子表达水平的作用导致CRS的压制。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子表达水平的作用导致严重CRS的压制。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子表达水平的作用导致CRS的抑制。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子表达水平的作用导致严重CRS的抑制。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子表达水平的作用导致预防CRS。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞、DC或其组合中细胞因子表达水平的作用导致预防严重CRS。
在另一个实施方案中，凋亡细胞触发T细胞死亡，但不是通过细胞因子表达水平的变化。
在另一个实施方案中，凋亡细胞拮抗巨噬细胞和树突细胞启动分泌细胞因子，否则其会放大细胞因子风暴。在另一个实施方案中，凋亡细胞增加抑制炎症应答和/或防止细胞因子过度释放的Treg。
在一些实施方案中，施用凋亡细胞抑制一种或多种促炎细胞因子。在一些实施方案中，促炎细胞因子包含IL-1β、IL-6、TNF-α或IFN-γ，或其任何组合。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞促进一种或多种抗炎细胞因子的分泌。在一些实施方案中，抗炎细胞因子包含TGF-β、IL10或PGE2或其任何组合。
在另一个实施方案中，施用凋亡细胞抑制暴露于TLR配体后的树突细胞成熟。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞产生潜在的致耐受性树突细胞，其在一些实施方案中能够迁移，并且在一些实施方案中，迁移是由于CCR7所致。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞引发各种信号传导事件，在一个实施方案中，其是TAM受体信号传导(Tyro3，Axl和Mer)，其在一些实施方案中抑制抗原呈递细胞中的炎症。
在一些实施方案中，Tyro-3、Axl和Mer构成受体酪氨酸激酶(RTK)的TAM家族，其特征在于激酶结构域和粘附分子样胞外结构域内的保守序列。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞激活通过MerTK的信号传导。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途径，在一些实施方案中，其负调节NF-κB。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞负调节炎性小体(inflammasome)，在一个实施方案中其导致抑制促炎细胞因子分泌、DC成熟或其组合。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上调抗炎基因如Nr4a、Thbs1或其组合的表达。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞诱导高水平AMP，在一些实施方案中，AMP以Pannexin1依赖性方式积累。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞抑制炎症。
在一些实施方案中，如本文所述，使用早期凋亡细胞的方法包括与抗体联合使用早期凋亡细胞或其组合物。在一些实施方案中，抗体针对肿瘤细胞抗原。在另一个实施方案中，抗体针对CD20。在另一个实施方案中，抗体是利妥昔单抗(Rtx)。
在一些实施方案中，早期凋亡细胞和抗体包含在同一组合物中。在一些实施方案中，早期凋亡细胞和抗体包含在不同组合物中。在一些实施方案中，早期凋亡细胞和抗体或其组合物的组合的施用同时进行。在一些实施方案中，早期凋亡细胞和抗体或其组合物的组合的施用包括在抗体之前施用凋亡细胞或其组合物。在一些实施方案中，早期凋亡细胞和抗体或其组合物的组合的施用包括在施用抗体之后施用凋亡细胞或其组合物。
在另一个实施方案中，抗体是曲妥珠单抗(赫赛汀；Genentech):针对ERBB2的人源化IgG1。在另一个实施方案中，抗体是贝伐单抗(Avastin；Genentech/Roche):针对VEGF的人源化IgG1。在另一个实施方案中，抗体是西妥昔单抗(Erbitux；Bristol-Myers Squibb):针对EGFR的嵌合人-鼠IgG1。在另一个实施方案中，抗体是帕尼单抗(Vectibix；Amgen):针对EGFR的人IgG2。在另一个实施方案中，抗体是伊匹单抗(Yervoy；Bristol-MyersSquibb):针对CTLA4的IgG1。
在另一个实施方案中，抗体是阿仑珠单抗(Campath；Genzyme):针对CD52的人源化IgG1。在另一个实施方案中，抗体是奥法木单抗(Arzerra；Genmab):针对CD20的人IgG1。在另一个实施方案中，抗体是吉妥珠单抗(Mylotarg；Wyeth):针对CD33的人源化IgG4。在另一个实施方案中，抗体是本妥昔单抗(Adcetris；Seattle Genetics):针对CD30的嵌合IgG1。在另一个实施方案中，抗体是90Y-标记的替伊莫单抗(Zevalin；IDEC Pharmaceuticals):针对CD20的鼠IgG1。在另一个实施方案中，抗体是131I-标记的托西莫单抗(Bexxar；GlaxoSmithKline):针对CD20的鼠IgG2。
在另一个实施方案中，抗体是雷莫芦单抗，其针对血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)。在另一个实施方案，抗体是雷莫芦单抗(Cyramza Injection,Eli Lilly andCompany)、博纳吐单抗(BLINCYTO,Amgen Inc.)、派姆单抗(KEYTRUDA,Merck Sharp&DohmeCorp.)、阿托珠单抗(GAZYVA,Genentech,Inc.；先前已知为GA101)、帕妥珠单抗注射液(PERJETA,Genentech,Inc.)或地诺单抗(Xgeva,Amgen Inc.)。在另一个实施方案中，抗体是巴利昔单抗(Simulect；Novartis)。在另一个实施方案中，抗体是达克珠单抗(Zenapax；Roche)。
在另一个实施方案中，与凋亡细胞联合施用的抗体针对本文描述和/或本领域已知的肿瘤或癌症抗原或其片段。在另一个实施方案中，所述抗体针对肿瘤相关抗原。在另一个实施方案中，所述抗体针对作为血管生成因子的肿瘤相关抗原或其片段。
在一些实施方案中，本文描述的抗体可以与本文描述的组合物例如但不限于包含早期凋亡细胞的组合物联合使用。
凋亡细胞上清液(ApoSup和ApoSup Mon)
在一些实施方案中，用于本文公开的方法和治疗中的组合物包括如本文公开的凋亡细胞上清液。
在一些实施方案中，凋亡细胞上清液得自如下方法，所述方法包括步骤a)提供凋亡细胞，b)培养步骤a)的凋亡细胞和c)从细胞分离上清液。
在一些实施方案中，用于制备如本文公开的凋亡细胞上清液的凋亡细胞对于接受治疗的对象是自体的。在另一个实施方案中，用于制备本文公开的凋亡细胞上清液的凋亡细胞与接受治疗的对象是同种异基因的。
从其获得凋亡细胞上清液的“凋亡细胞”可以是选自对象的任何细胞类型的细胞，或经过本领域技术人员已知的诱导凋亡方法的任何市售细胞系。诱导凋亡的方法可以是低氧、臭氧、热、辐射、化学物、渗透压、pH变化、X射线辐照、γ射线辐照、UV辐照、血清剥夺、皮质激素或其组合，或本文所述的或本领域已知的任何其它方法。在另一个实施方案中，诱导凋亡的方法产生处于早期凋亡状态的凋亡细胞。
在一些实施方案中，凋亡细胞是白细胞。
在一个实施方案中，所述凋亡白细胞衍生自外周血单个核细胞(PBMC)。在另一个实施方案中，所述白细胞来自合并的第三方供体。在另一个实施方案中，所述白细胞是同种异基因的。
根据一些实施方案，通过选择非粘附性白细胞并使它们经历凋亡诱导，然后在培养基中进行细胞培养步骤来提供凋亡细胞。用于制备凋亡细胞-吞噬细胞上清液的“白细胞”可以来源于免疫系统和/或造血系统的有核细胞的任何谱系或亚谱系，包括但不限于树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、造血干细胞、骨髓细胞、天然杀伤细胞等。根据应用和目的、所需的白细胞谱系等，根据各种常用方法中的任何一种，可以以各种合适方式中的任何一种从各种合适的解剖学区室中的任何一种中衍生或获得白细胞。在一些实施方案中，源白细胞(source leukocyte)是原代白细胞。在另一个实施方案中，源白细胞是原代外周血白细胞。
原代淋巴细胞和单核细胞可以方便地衍生自外周血。外周血白细胞包括70-95％的淋巴细胞和5-25％的单核细胞。
从血液中获得特定类型的源白细胞的方法是常规操作。获得源淋巴细胞和/或单核细胞可以例如通过在抗凝剂例如肝素或柠檬酸盐存在下采集血液来实现。然后将采集的血液在Ficoll垫上离心，以在梯度界面处分离淋巴细胞和单核细胞，以及在沉淀中分离中性粒细胞和红细胞。
可以通过标准免疫磁选择或免疫荧光流式细胞术技术根据其特定表面标记将白细胞彼此分离，或者通过离心淘析分离。例如，可以选择单核细胞作为CD14+级分，选择T淋巴细胞作为CD3+级分，选择B淋巴细胞作为CD19+级分，选择巨噬细胞作为CD206+级分。
淋巴细胞和单核细胞可以通过使这些细胞经历基质粘附条件，例如通过在组织培养物处理的培养受体(recipient)中进行静态培养，这导致单核细胞而不是淋巴细胞的选择性粘附到细胞粘附基质，从而彼此分离。
白细胞也可以得自外周血单个核细胞(PBMC)，PBMC可以如本文所述分离。
本领域普通技术人员具有必要的专业知识，以合适地培养原代白细胞，以产生所需量的如本文所公开的培养的源白细胞，并且在本领域的文献中可获得用于实践此类培养方法的充足指导。
本领域普通技术人员进一步具有必要的专业知识，以建立、购买或以其它方式获得合适的已建立的白细胞细胞系，从其衍生凋亡白细胞。合适的白细胞细胞系可得自商业供应商，例如American Tissue Type Collection(ATCC)。对于本领域技术人员显而易见的是，不应通过会显著干扰其产生凋亡白细胞的能力的技术获得源白细胞。
在另一个实施方案中，凋亡细胞可以是凋亡淋巴细胞。可以通过用血清剥夺、皮质类固醇或辐照处理原代淋巴细胞来诱导淋巴细胞如原代淋巴细胞的凋亡。在另一个实施方案中，通过用皮质类固醇处理诱导原代淋巴细胞的凋亡是通过用地塞米松处理原代淋巴细胞来实现的。在另一个实施方案中，地塞米松的浓度为约1微摩尔。在另一个实施方案中，通过用γ辐照处理原代淋巴细胞来实现通过辐照诱导原代淋巴细胞的凋亡。在另一个实施方案中，使用约66rad的剂量。这种处理导致产生适于与吞噬细胞的共培养步骤的凋亡淋巴细胞。
在另一个实施方案中，凋亡细胞可以是凋亡单核细胞，例如原代单核细胞。为产生凋亡单核细胞，在血清剥夺的条件下使单核细胞经受基材/表面粘附的体外条件。这种处理导致产生适于与吞噬细胞的共培养步骤的非促炎性凋亡单核细胞。
在其它实施方案中，凋亡细胞可以是本文所述的任何凋亡细胞，包括同种异基因凋亡细胞、第三方凋亡细胞和凋亡细胞库。
在其它实施方案中，凋亡细胞上清液可以通过凋亡细胞与其它细胞共培养而获得。
因此，在一些实施方案中，凋亡细胞上清液是由如下方法获得的凋亡细胞上清液，所述方法包括步骤a)提供凋亡细胞，b)提供其它细胞，c)任选地洗涤来自步骤a)和b)的细胞，d)共培养步骤a)和b)的细胞，以及任选地e)将上清液与细胞分离。
在一些实施方案中，与凋亡细胞共培养的其它细胞是白细胞。
因此，在一些实施方案中，凋亡细胞上清液是由如下方法获得的凋亡细胞-白细胞上清液，所述方法包括步骤a)提供凋亡细胞，b)提供白细胞,c)任选地洗涤步骤a)和b)的细胞，d)共培养步骤a)和b)的细胞，以及任选地e)将上清液与细胞分离。
在一些实施方案中，白细胞可以是吞噬细胞如巨噬细胞、单核细胞或树突细胞。
在一些实施方案中，白细胞可以是B细胞、T细胞或天然杀伤细胞(NK细胞)。
因此，在一些实施方案中，用于本文公开的方法和治疗中的组合物包括如WO2014/106666中所述的凋亡细胞-吞噬细胞上清液，该申请以其全文并入本文参考。在另一个实施方案中，以本领域已知的任何方式产生用于本文公开的组合物和方法中的凋亡细胞-吞噬细胞上清液。
在一些实施方案中，凋亡细胞-吞噬细胞上清液得自吞噬细胞与凋亡细胞的共培养。
在一些实施方案中，凋亡细胞-吞噬细胞上清液得自如下方法，所述方法包括步骤a)提供吞噬细胞,b)提供凋亡细胞,c)任选地洗涤步骤a)和b)的细胞，d)共培养步骤a)和b)的细胞，以及任选地e)将上清液与细胞分离。
术语“吞噬细胞”表示通过摄入(吞噬)有害外来颗粒、细菌以及死亡或垂死细胞来保护机体的细胞。吞噬细胞包括例如称为嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和肥大T细胞的细胞，优选树突细胞和单核细胞/巨噬细胞。吞噬细胞可以是树突细胞(CD4+HLA-DR+Lineage-BDCA1/BDCA3+)、巨噬细胞(CD14+CD206+HLA-DR+)或衍生自单核细胞(CD14+)。区分这些不同吞噬细胞的技术是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，单核细胞得自塑料粘附步骤。所述单核细胞可以用标记CD14+与B细胞和T细胞区分，而不想要的B细胞表达CD19+，T细胞表达CD3+。在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导成熟后，获得的巨噬细胞在一些实施方案中对于标记CD14+、CD206+、HLA-DR+是阳性的。
在一个实施方案中，所述吞噬细胞衍生自外周血单个核细胞(PBMC)。
吞噬细胞可以通过本领域已知的用于获得吞噬细胞的任何方法来提供。在一些实施方案中，吞噬细胞例如巨噬细胞或树突细胞可直接从对象分离或通过成熟步骤衍生自前体细胞。
在一些实施方案中，巨噬细胞可直接从对象的腹膜腔分离并在完全RRPMI培养基中培养。巨噬细胞也可以从脾中分离。
吞噬细胞也可以从外周血单核细胞获得。在所述实例中，通过向细胞培养基中添加但不限于巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，单核细胞在培养时分化为单核细胞衍生的巨噬细胞。
例如，吞噬细胞可以源自外周血单个核细胞(PBMC)。例如，PBMC可以通过Ficoll梯度离心从个体的细胞分离袋(cytapheresis bag)中分离，并在细胞粘附步骤中于完全RPMI培养基(10％FBS，1％青霉素/链霉素)中铺板90分钟。通过塑料粘附步骤去除非贴壁T细胞，并在补充有重组人M-CSF的完全RPMI环境中培养贴壁T细胞。培养期后，获得单核细胞衍生的巨噬细胞。
可以通过细胞粘附步骤选择吞噬细胞。所述“细胞粘附步骤”是指通过使得培养的细胞粘附至表面即细胞粘附表面(例如具有合适类型尼龙或塑料的组织培养皿、基质、囊或袋)的培养条件选择吞噬细胞或可以成熟为吞噬细胞的细胞。本领域技术人员将理解，术语“细胞粘附表面”可以涵盖亲水性的和带负电荷的，并且可以以本领域中已知的各种方式获得。在另一个实施方案中，通过使用例如电晕放电或气体等离子来改性聚苯乙烯表面。这些方法产生高能氧离子，它们接枝到表面的聚苯乙烯链上，使表面变得亲水并带负电。设计用于促进细胞粘附的培养受体可从各种商业供应商处获得(例如Corning,Perkin-Elmer,Fisher Scientific,Evergreen Scientific,Nunc等)。
B细胞、T细胞和NK细胞可以通过本领域已知的用于获得此类细胞的任何方法来提供。在一些实施方案中，B细胞、T细胞或NK细胞可直接从对象中分离或通过成熟步骤衍生自前体细胞。在另一个实施方案中，B细胞、T细胞或NK细胞可以来自B细胞系、T细胞系或NK细胞系。本领域普通技术人员具有必要专业知识来建立、购买或以其它方式获得合适的已建立的B细胞系、T细胞系和NK细胞系。合适的细胞系可以从商业供应商获得，例如AmericanTissue Type Collection(ATCC)。
在一个实施方案中，所述凋亡细胞和所述白细胞如吞噬细胞、B细胞、T细胞或NK细胞在共培养步骤d)之前单独培养。
吞噬细胞的细胞成熟发生在细胞培养过程中，例如由于向培养基中添加了成熟因子。在一个实施方案中，所述成熟因子是M-CSF，其可以例如用于获得单核细胞衍生的巨噬细胞。
用于成熟或选择吞噬细胞的培养步骤可能需要数小时至数天。在另一个实施方案中，在合适培养基中培养所述未成熟吞噬细胞2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58小时。
吞噬细胞的培养基是本领域技术人员已知的，可以是例如但不限于RPMI、DMEM、X-vivo和Ultraculture milieus。
在一个实施方案中，凋亡细胞和吞噬细胞的共培养发生在生理溶液中。
在这种“共培养”之前，可以将细胞进行洗涤步骤。在一些实施方案中，在共培养步骤之前洗涤白细胞(例如吞噬细胞)和凋亡细胞。在另一个实施方案中，细胞用PBS洗涤。
在所述共培养期间，白细胞(例如吞噬细胞如巨噬细胞、单核细胞或吞噬细胞，或B细胞、T细胞或NK细胞)和凋亡细胞可以以10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的比例混合，或以(白血细胞:凋亡细胞)1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10的比例混合。在一个实例中，白细胞与凋亡细胞的比例为1:5。
细胞的共培养可以持续数小时至数天。在一些实施方案中，将所述凋亡细胞培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40，42、44、46、48、50、52小时。本领域技术人员可以通过测量抗炎化合物的存在，白细胞的存活量和迄今尚未消除的凋亡细胞的量来评估共培养的最佳时间。由于凋亡细胞的消失，吞噬细胞消除凋亡细胞是可以用光学显微镜观察到的。
在一些实施方案中，凋亡细胞的培养，例如与白细胞(例如吞噬细胞如巨噬细胞、单核细胞或吞噬细胞，或B细胞、T细胞或NK细胞)的共培养，发生在培养基和/或与施用例如注射到对象兼容的生理溶液中。
本领域技术人员理解“生理溶液”可以涵盖在培养时间内不导致白细胞死亡的溶液。在一些实施方案中，生理溶液在2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52小时内不导致死亡。在其它实施方案中，为48小时或30小时。
在一些实施方案中，将白细胞(例如吞噬细胞如巨噬细胞、单核细胞或吞噬细胞，或B细胞，T细胞或NK细胞)和凋亡细胞在生理溶液中保温至少30分钟。该培养时间允许吞噬作用起始和细胞因子及其它有益物质的分泌。
在一个实施方案中，这种生理溶液不抑制白细胞衍生巨噬细胞对凋亡白细胞的消除。
在培养或共培养步骤结束时，任选地将上清液与培养的凋亡细胞或共培养的细胞分离。从细胞分离上清液的技术是本领域已知的。例如，可以收集和/或过滤和/或离心上清液以消除细胞和碎片。例如，可以将所述上清液在室温以3000rpm离心15分钟以使其与细胞分离。
上清液在使用之前可以例如通过辐照而“灭活”。因此，用于制备凋亡细胞上清液的方法可以包括任选的额外辐照步骤f)。可以将所述“辐照”步骤视为一种消毒方法，其使用X射线辐照(25-45Gy)以足够比率杀死微生物，如同常规灭活血液制品所进行的。
辐照上清液在本领域被认为是安全的。辐照程序目前常规用于捐献的血液以防止对WBC反应。
在一个实施方案中，凋亡细胞上清液配制成适合施用给对象的药物组合物，如本文详细描述。
在一些实施方案中，终产品在+4℃储存。在另一个实施方案中，终产品在接下来48小时内使用。
在一些实施方案中，可以冻干凋亡细胞上清液例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液或包含所述上清液的药物组合物，例如用于-80℃储存。
在一个特定的实施方案中，如WO 2014/106666的实施例1中所述，可以使用胸腺细胞作为凋亡细胞来制备凋亡细胞-吞噬细胞上清液。分离后，辐照胸腺细胞(例如用35X-Gray辐照)并在完全DMEM培养基中培养例如6小时以发生凋亡。平行地，从腹膜腔分离巨噬细胞，洗涤并在完全RPMI(10％FBS，Peni-Strepto，EAA，Hepes，NaP和2-巯基乙醇)中培养。然后洗涤巨噬细胞和凋亡细胞并在无酚X-vivo培养基中以1/5巨噬细胞/凋亡细胞比率共培养另外48小时。然后，收集上清液，离心去除残渣，然后冷冻或冻干保存。可以通过FACS对F4/80阳性染色来确认巨噬细胞富集。可以通过膜联蛋白-V和7AAD排阻阳性染色经FACS确认凋亡。
在一个实施方案中，与得自分开培养的巨噬细胞或凋亡细胞获得的上清液相比，所述凋亡细胞上清液在活性和潜伏形式TGF-β方面都富含TGF-β水平。在一个实施方案中，与单独培养的巨噬细胞相比，IL-10水平也增加，并且与单独培养的凋亡细胞相比，显著增加。在另一个实施方案中，炎性细胞因子例如IL-6不可检测，并且IL-1β和TNF不可检测或者水平非常低。
在一个实施方案中，与来自单独培养的巨噬细胞的上清液或来自单独培养的凋亡细胞的上清液相比，所述凋亡细胞上清液具有增加水平的IL-1ra、TIMP-1、CXCL1/KC和CCL2/JE/MCP1，除TGF-β和IL-10之外，其可能参与上清液控制炎症的致耐受作用。
在另一个具体实施方案中，如WO 2014/106666的实施例3中所述，人凋亡细胞-吞噬细胞上清液可以由与凋亡PBMC培养的来自外周血单个核细胞(PBMC)的巨噬细胞共培养而制得。因此，通过例如Ficoll梯度离心从健康志愿者的细胞分离袋(cytapheresis bag)中分离PBMC。然后将PBMC在完全RPMI培养基(10％FBS，1％青霉素/链霉素)中铺板90分钟。然后取出非贴壁T细胞并使用例如35Gy剂量的X射线辐照使其凋亡，并在完全RPMI环境中培养4天(包括在培养的前48小时后进行细胞洗涤)，以使凋亡发生。平行地，将贴壁T细胞在补加50μg/mL重组人M-CSF的完全RPMI环境中培养4天，包括在最初的48小时后进行细胞洗涤。在4天培养期结束时，将单核细胞衍生的巨噬细胞和凋亡细胞洗涤并在X-vivo培养基中以一个巨噬细胞与5个凋亡细胞比率再一起培养48小时。然后收集来自后一培养的上清液，离心以消除细胞和碎片，并可以冷冻或冻干保存和随后使用。
在一个实施方案中，如WO 2014/106666中所述，人凋亡细胞-吞噬细胞上清液可以在6天内从外周血单个核细胞(PBMC)获得。在培养中加入M-CSF，需要四天获得PBMC衍生的巨噬细胞，PBMC衍生的巨噬细胞与凋亡细胞共培养则再需要2天，这对应于在第0天分离出非贴壁PBMC。
在一个实施方案中，如WO 2014/106666中所述，可以独立于PBMC的供体或来源(血细胞分离或血沉棕黄层)获得标准化的人凋亡细胞-吞噬细胞上清液。塑料粘附步骤足以获得大量富集的单核细胞起始群(粘附在塑料培养皿上后20％至93％CD14+细胞)。另外，这种贴壁T细胞显示B和T细胞的存在非常低(1.0％CD19+B细胞和12.8％CD3+T细胞)。在M-CSF存在下培养贴壁T细胞4天后，单核细胞衍生巨噬细胞的比例从0.1％CD14+CD206+HLA-DR+巨噬细胞显著增加到77.7％。此时，可以将单核细胞衍生的巨噬细胞与凋亡非贴壁PBMC(如膜联蛋白V染色和7AAD排阻法所示为47.6％是凋亡的)共培养以在48小时内产生凋亡细胞-吞噬细胞上清液。
在一个实施方案中，所收集的凋亡细胞-吞噬细胞上清液比单独的单核细胞衍生的巨噬细胞或在炎性条件下(+LPS)处理的单核细胞衍生的巨噬细胞的培养上清液中含有显著更多的潜伏TGF，并且仅含痕量或低水平的炎性细胞因子如IL-1β或TNF。
在一些实施方案中，包含凋亡细胞上清液的组合物还包含抗凝剂。在一些实施方案中，抗凝剂选自：肝素，柠檬酸葡萄糖(ACD)配方A及其组合。
在另一个实施方案中，在制备凋亡细胞的过程中添加抗凝剂。在另一个实施方案中，添加的抗凝剂选自包含ACD和肝素或其任何组合的组中。在另一个实施方案中，ACD浓度为1％。在另一个实施方案中，ACD浓度为2％。在另一个实施方案中，ACD浓度为3％。在另一个实施方案中，ACD浓度为4％。在另一个实施方案中，ACD浓度为5％。在另一个实施方案中，ACD浓度为6％。在另一个实施方案中，ACD浓度为7％。在另一个实施方案中，ACD浓度为8％。在另一个实施方案中，ACD浓度为9％。在另一个实施方案中，ACD浓度为10％。在另一个实施方案中，ACD浓度为约1-10％。在另一个实施方案中，ACD浓度为约2-8％。在另一个实施方案中，ACD浓度为约3-7％。在另一个实施方案中，ACD浓度为约1-5％。在另一个实施方案中，ACD浓度为约5-10％。在另一个实施方案中，肝素终浓度为0.5U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为约0.1U/ml-1.0U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为约0.2U/ml-0.9U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为约0.3U/ml-0.7U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为约0.1U/ml-0.5U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为约0.5U/ml-1.0U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为约0.01U/ml-1.0U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为0.1U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为0.2U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为0.3U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为0.4U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为0.5U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为0.6U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为0.7U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为0.8U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为0.9U/ml。在另一个实施方案中，肝素终浓度为1.0U/ml。在另一个实施方案中，ACD浓度为5％以及肝素终浓度为0.5U/ml。
在一些实施方案中，包含凋亡细胞上清液的组合物还包含甲泼尼龙。在一些实施方案中，甲泼尼龙的浓度不超过30μg/ml。
在一些实施方案中，组合物可以以凋亡细胞上清液总剂量或等份的形式使用，所述凋亡细胞上清液衍生自通过细胞分离术获得的约14×109CD45+细胞的共培养物，相当于每千克体重约2亿个细胞(对于70kg对象)。在一个实施方案中，这样的总剂量以衍生自每千克体重约1亿个细胞的上清液单位剂量施用，和/或以每周间隔的单位剂量施用。在另一个实施方案中，根据该实施方案的合适总剂量包括衍生自每千克体重约1000万至约40亿个细胞的上清液的总剂量。在另一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约4000万至约10亿个细胞。在又一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约8000万至约5亿个细胞。在又一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约1.6亿至约2.5亿个细胞。根据该实施方案的合适单位剂量包括衍生自每千克体重约400万至约4亿个细胞的上清液的单位剂量。在另一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约800万至约2亿个细胞。在另一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约1600万至约1亿个细胞。在又一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约3200万至约5000万个细胞。
在另一个实施方案中，施用衍生自约10×106个凋亡细胞共培养物的凋亡细胞上清液的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自10×107个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自10×108个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自10×109个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自10×1010个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自10×1011个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自10×1012个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自10×105个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自10×104个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自10×103个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自10×102个凋亡细胞的剂量。
在一些实施方案中，施用衍生自35×106个凋亡细胞的凋亡细胞上清液的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自210×106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自70×106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自140×106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用衍生自35-210×106个凋亡细胞的剂量。
在一些实施方案中，凋亡细胞上清液或包含所述凋亡细胞上清液的组合物可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉内、皮下、结节内、肿瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接给予胸腺，如本文中详细讨论的。
令人惊讶地，凋亡细胞上清液例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液降低与细胞因子风暴相关的细胞因子如IL-6的产生。另一种细胞因子IL-2尽管由DC和巨噬细胞少量分泌，但其不参与细胞因子释放综合征。然而，其是CAR-T细胞存活和增殖必需的，并且大部分由这些T细胞产生。出乎意料的是，凋亡细胞上清液例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液不降低IL-2水平到足以对CAR T细胞的存活产生负面影响。
在一些实施方案中，凋亡细胞上清液例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液影响巨噬细胞和DC中细胞因子表达水平，但不影响T细胞自身中的细胞因子表达水平。因此出乎意料的是，凋亡细胞上清液可用于增强CAR T细胞治疗或树突细胞治疗。
在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液触发T细胞死亡，但不是通过细胞因子表达水平的改变来触发。
在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液拮抗巨噬细胞和树突细胞启动分泌细胞因子，否则其将放大细胞因子风暴。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液增加Treg，其抑制炎症应答和/或防止细胞因子过度释放。
在一些实施方案中，施用凋亡细胞上清液例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液抑制一种或多种促炎细胞因子。在一些实施方案中，促炎细胞因子包含IL-1β、IL-6、TNF-α或IFN-γ，或其任何组合。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液促进一种或多种抗炎性细胞因子的分泌。在一些实施方案中，抗炎性细胞因子包含TGF-β、IL10或PGE2或其任何组合。
在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液例如凋亡细胞吞噬细胞上清液抑制暴露于TLR配体后的树突细胞成熟。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液产生潜在的致耐受性树突细胞，其在一些实施方案中能够迁移，在一些实施方案中，迁移是由于CCR7所致。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液引发各种信号传导事件，在一个实施方案中是TAM受体信号传导(Tyro3、Axl和Mer)，其在一些实施方案中抑制抗原呈递细胞中的炎症。在一些实施方案中，Tyro-3、Axl和Mer构成受体酪氨酸激酶(RTK)的TAM家族，其特征在于激酶结构域和粘附分子样胞外结构域内的保守序列。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液激活通过MerTK的信号传导。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途径，在一些实施方案中，其负调节NF-κB。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液负调节炎性小体，在一个实施方案中其导致抑制促炎细胞因子分泌、DC成熟或其组合。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液上调抗炎基因例如Nr4a、Thbs1或其组合的表达。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液诱导高水平AMP，在一些实施方案中，AMP以Pannexin1依赖性方式积累。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液抑制炎症。
组合物
如本文所用，术语“组合物”和“药物组合物”在一些实施方案中可以互换使用，具有所有相同性质和含义。在一些实施方案中，本文公开了用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物。
在另一个实施方案中，本文公开的药物组合物用于维持或增加遗传修饰的免疫细胞的增殖速度。在另一个实施方案中，用于维持或增加遗传修饰的免疫细胞的增殖速度的方法进一步包括降低或抑制细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生。在另一个实施方案中，本文公开了用于增加遗传修饰的免疫细胞治疗的功效的药物组合物。在另一个实施方案中，用于增加免疫细胞治疗功效的方法中使用的组合物还包括降低或抑制CRS或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，本文公开了用于治疗、预防、抑制对象的癌症或肿瘤、降低对象中癌症或肿瘤的发生率、改善或减轻对象中癌症或肿瘤的方法的组合物。在另一个实施方案中，用于治疗、预防对象的癌症或肿瘤、降低对象中癌症或肿瘤的发生率、改善或减轻对象中癌症或肿瘤的方法中的组合物进一步包括降低或抑制CRS或细胞因子风暴的发生率。
在另一个实施方案中，药物组合物包含遗传修饰的免疫细胞或其遗传修饰的受体。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含T细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体CAR T细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体TCR T细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含细胞毒性T淋巴细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含树突细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含天然杀伤细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的受体包含遗传修饰的T细胞受体。
在另一个实施方案中，药物组合物包含早期凋亡细胞群。在另一个实施方案中，药物组合物包含凋亡上清液。
在另一个实施方案中，用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物包含在药学可接受赋形剂中的有效量的本文所述的遗传修饰的免疫细胞或其遗传修饰的受体。在另一个实施方案中，用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物包含有效量的本文所述的CAR T细胞和药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物包含有效量的本文所述的TCR T细胞和药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物包含有效量的本文所述的细胞毒性T细胞和药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物包含有效量的本文所述的遗传修饰的树突细胞和药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物包含有效量的本文所述的遗传修饰的天然杀伤细胞和药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗本文所述的状况或疾病的药物组合物包含有效量的本文所述的遗传修饰的T细胞受体和药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗如本文所述的状况或疾病的药物组合物包含在药学可接受赋形剂中的有效量的如本文所述的早期凋亡细胞群。在又一个实施方案中，用于治疗如本文所述的状况或疾病的药物组合物包含在药学可接受赋形剂中的有效量的如本文所述的凋亡上清液。
在另一个实施方案中，本文所述的状况或疾病是肿瘤或癌症。在另一个实施方案中，本文公开了一种组合物，其包含与本文所述的感兴趣蛋白质或肽结合的遗传修饰的免疫细胞或其受体，例如CAR T细胞。在另一个实施方案中，本文公开了一种组合物，其包含识别并结合本文所述的感兴趣蛋白质或肽的遗传修饰的免疫细胞或其受体，例如TCR T细胞。在另一个实施方案中，感兴趣的蛋白质或肽包含肿瘤抗原或其片段。
在另一个实施方案中，本文公开的并用于本文公开的方法中的组合物包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液，以及药学可接受赋形剂。在一些实施方案中，包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物用于本文公开的方法中，例如用于治疗、预防对象中的癌症或肿瘤、抑制对象中的癌症或肿瘤的生长、延缓疾病进展、降低肿瘤负荷或降低对象中癌症或肿瘤的发生率或其任何组合。
在另一个实施方案中，包含有效量的遗传修饰的免疫细胞或其遗传修饰的受体的组合物可以是包含凋亡细胞群或凋亡细胞上清液的相同组合物。在另一个实施方案中，包含有效量的CAR T细胞或TCR T细胞或细胞毒性T细胞或遗传修饰的树突细胞或遗传修饰的天然杀伤细胞的组合物可以是包含凋亡细胞群或凋亡细胞上清液的相同组合物。在另一个实施方案中，包含有效量的遗传修饰的T细胞受体的组合物可以是包含凋亡细胞群或凋亡细胞上清液的相同组合物。在另一个实施方案中，包含有效量的选自包含CAR T细胞、TCR T细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤细胞或树突细胞的组中的遗传修饰的免疫细胞的组合物不是包含凋亡细胞群或凋亡细胞上清液的相同组合物。在另一个实施方案中，组合物包含表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和凋亡细胞或凋亡细胞上清液，以及药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中，组合物包含表达遗传修饰的T细胞受体的T细胞(TCR T细胞)和凋亡细胞或凋亡细胞上清液，以及药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中，包含有效量的遗传修饰的T细胞受体的组合物不是包含凋亡细胞群或凋亡细胞上清液的相同组合物。
在另一个实施方案中，组合物中包含的凋亡细胞包含处于早期凋亡状态的凋亡细胞。在另一个实施方案中，组合物中包含的凋亡细胞是合并的第三方供体细胞。在另一个实施方案中，从早期凋亡细胞收集本文公开的组合物中包含的凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，从合并的第三方供体细胞中收集本文公开的组合物中包含的凋亡细胞上清液。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞的组合物还包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞和凋亡细胞的组合物进一步包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞和凋亡细胞上清液的组合物还包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如TCR T细胞的组合物还包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如TCR T细胞和凋亡细胞的组合物进一步包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如TCR T细胞和凋亡细胞上清液的组合物还包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如树突细胞的组合物还包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如树突细胞和凋亡细胞的组合物进一步包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如树突细胞和凋亡细胞上清液的组合物还包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如NK细胞的组合物还包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如NK细胞和凋亡细胞的组合物进一步包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如NK细胞和凋亡细胞上清液的组合物还包含另外的药物组合物用于预防、抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的患者中的细胞因子释放。
在一个实施方案中，另外的药物组合物包含CTLA-4阻断剂，在一个实施方案中其是伊匹单抗。在另一个实施方案中，另外的药物组合物包含如本文公开的α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一个实施方案中，另外的药物组合物包含如本文公开的碲基化合物。在另一个实施方案中，另外的药物组合物包含如本文公开的免疫调节剂。在另一个实施方案中，另外的药物组合物包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节化合物或其任何组合。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞或凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种的药物组合物包含单一组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞如CAR T细胞的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞或凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种或其任意组合的药物组合物包含多个组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是CART细胞)、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合的每一种包含在不同组合物中。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是CAR T细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种或其任意组合的药物组合物包含多个组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是CAR T细胞)、CTLA-4阻断剂、或α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合存在于遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞组合物中，以及凋亡细胞或凋亡细胞上清液包含在不同的组合物中。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞例如TCR T细胞的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞或凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种的药物组合物包含单一组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞如TCR T细胞的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞或凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种或其任意组合的药物组合物包含多个组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是TCRT细胞)、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合的每一种包含在不同组合物中。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是TCR T细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种或其任意组合的药物组合物包含多个组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是TCR T细胞)、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合存在于遗传修饰的免疫细胞例如TCR T细胞组合物中，以及凋亡细胞或凋亡细胞上清液包含在不同组合物中。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞如树突细胞的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞或凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种的药物组合物包含单一组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞如树突细胞的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞或凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种或其任意组合的药物组合物包含多个组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是树突细胞)、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合的每一种包含在不同组合物中。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是树突细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种或其任意组合的药物组合物包含多个组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是树突细胞)、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合存在于遗传修饰的免疫细胞例如树突细胞组合物中，以及凋亡细胞或凋亡细胞上清液包含在不同组合物中。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞如NK细胞的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞或凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种的药物组合物包含单一组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞如NK细胞的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞或凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种或其任一组合的药物组合物包含多个组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是NK细胞)、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂或其任一组合的每一种包含在不同组合物中。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是NK细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、凋亡细胞、凋亡细胞上清液、碲基化合物或免疫调节剂中的任一种或其任一组合的药物组合物包含多个组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是NK细胞)、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任一组合存在于遗传修饰的免疫细胞例如NK细胞组合物中，以及凋亡细胞或凋亡细胞上清液包含在不同组合物中。
在一些实施方案中，组合物包含凋亡细胞和额外药剂。在一些实施方案中，组合物包含凋亡细胞和抗体或其功能片段。在一些实施方案中，组合物包含凋亡细胞和RtX抗体或其功能片段。在一些实施方案中，凋亡细胞和抗体或其功能片段可包含在分开的组合物中。在一些实施方案中，凋亡细胞和抗体或其功能片段可包含在相同组合物中。
本领域技术人员理解，“药物组合物”可以涵盖本文所述的一种或多种活性成分与其它化学成分如生理学上合适的载体和赋形剂的制备物。药物组合物的目的是促进向生物体施用化合物。
在一些实施方案中，本文公开了用于治疗、预防癌症或肿瘤、抑制癌症或肿瘤的生长或降低癌症或肿瘤的发生率的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于增加患有癌症或肿瘤的对象的存活的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于减小肿瘤或癌症的大小或降低癌症或肿瘤的生长速度的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于减少患有癌症或肿瘤的对象中的肿瘤负荷的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于延迟患有癌症或肿瘤的对象的疾病进展的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于降低患有癌症或肿瘤的对象中癌症或肿瘤的发生率的药物组合物。在一些实施方案中，本文公开了用于减少患有癌症或肿瘤的对象中癌症或肿瘤的大小和/或生长速度的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物包含本文所述的早期凋亡细胞群。在一些实施方案中，药物组合物包含如本文所述的早期凋亡细胞群和药学上可接受的赋形剂。
技术人员理解，短语“生理学上可接受的载体”，“药学上可接受的载体”，“生理学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的赋形剂”可以互换使用，可以涵盖载体、赋形剂或稀释剂，其不会对生物体造成明显刺激，也不会消除所施用活性成分的生物学活性和特性。
本领域技术人员理解“赋形剂”可以涵盖添加到药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。在一些实施方案中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
配制和施用药物的技术参见"Remington’s Pharmaceutical Sciences,"MackPublishing Co.,Easton,PA,最新版本，其并入本文参考。
在一些实施方案中，组合物同时施用。在一个替代实施方案中，组合物在不同时间施用。在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的免疫细胞或其受体之前施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在CAR-T细胞输注之前施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在细胞毒性T细胞输注之前施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在天然杀伤细胞输注之前施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在树突细胞输注之前施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的T细胞受体之前施用包含凋亡细胞的组合物。
在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的免疫细胞或其受体之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在CAR-T细胞输注之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在细胞毒性T细胞输注之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在天然杀伤细胞输注之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在树突细胞输注之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的T细胞受体之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的免疫细胞或其受体之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的免疫细胞或其受体之前约24小时施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在CAR T细胞或细胞毒性T细胞或天然杀伤细胞或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注之前约24小时施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在CAR T细胞或细胞毒性T细胞或天然杀伤细胞或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注之前约24小时施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在一些实施方案中，组合物同时施用。在一个替代实施方案中，组合物在不同时间施用。在另一个实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之前施用包含凋亡细胞的组合物。
在另一个实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之前约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之前约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在另一个实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其功能片段的组合物之前约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在抗体或其功能片段或包含抗体或其功能片段的组合物之前约2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在另一个实施方案中，在输注抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后约24小时施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在施用抗体或其片段或包含抗体或其片段的组合物之后约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在另一个实施方案中，在抗体或其片段或包含抗体或其功能片段的组合物之后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在抗体或其功能片段或包含抗体或功能片段的组合物之后约2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在一些实施方案中，不依赖CAR T细胞，施用包含凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，包含凋亡细胞的组合物与额外药剂联合施用。在一些实施方案中，额外药剂是抗体。
在一些实施方案中，本文公开的组合物是治疗性组合物。在一些实施方案中，本文公开的组合物具有治疗功效。
在一些实施方案中，本文公开的组合物被施用一次。在另一个实施方案中，组合物被施用两次。在另一个实施方案中，组合物被施用3次。在另一个实施方案中，组合物被施用四次。在另一个实施方案中，组合物被施用至少四次。在另一个实施方案中，组合物被施用超过四次。
在一些实施方案中，本文公开的CAR T细胞被施用一次。在另一个实施方案中，CART细胞被施用两次。在另一个实施方案中，CAR T细胞被施用3次。在另一个实施方案中，CART细胞被施用四次。在另一个实施方案中，CAR T细胞被施用至少四次。在另一个实施方案中，组合物被施用超过四次。
在一些实施方案中，本文公开的组合物是治疗性组合物。在另一个实施方案中，本文公开的组合物具有治疗功效。
在一些实施方案中，本文公开了组合物，其与包含单独CAR T细胞的组合物相比，提供降低的炎性细胞因子或趋化因子释放，但是与包含单独CAR T细胞的组合物相比具有可比的细胞毒性。
配制品
本文公开的包含早期凋亡细胞群的药物组合物可以方便地以无菌液体制备物的形式提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳剂、分散液或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制备物通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。
无菌注射溶液可以通过将本文所述的早期凋亡细胞群掺入所需量的合适溶剂而制备并用于实施本文公开的方法，如果希望，其与各种量的其它成分一起掺入。这种组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。组合物也可以冻干。组合物可包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、矫味剂、颜色等，这取决于施用途径和所需的制剂。可以参考标准教科书例如“REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE”，第17版，1985(并入本文参考)以制备合适制备物，无需进行过多实验。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。可以通过使用延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本文的公开内容，所使用的任何运载体、稀释剂或添加剂必须与遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞相容。
本文所述的组合物或制剂可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。本文公开的组合物的所需等渗性可以使用氯化钠或其它药学上可接受物质例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来实现。氯化钠可以是优选特别用于含钠离子的缓冲液。
如果需要，可以使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度保持在选定水平。甲基纤维素可以是优选的，因为它可以容易且经济地获得并且易于使用。
其它合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度将取决于选择的物质。重要的是要使用能够达到所选粘度的用量。显然，合适的载体和其它添加剂的选择将取决于确切的施用途径和特定剂型例如液体剂型的性质(例如是否将组合物配制成溶液、悬浮液、凝胶剂或其它液体形式，例如定时释放形式或液体填充形式)。
本领域技术人员将认识到，应将组合物或制剂的组分选择为化学惰性的，并且不会影响用于本文公开的方法的本文所述的早期凋亡细胞群的存活或功效。从本公开和本文引用的文献，对于熟悉化学和制药学原理的技术人员而言，这不会带来任何问题，或者通过参考标准教科书或通过简单实验(不涉及过度实验)可以容易地避免这些问题。
关于本文公开的遗传修饰的免疫应答细胞的治疗用途的一个考虑是达到最佳效果所需的细胞数量。对于所治疗的对象，要施用的细胞数量会变化。在一些实施方案中，104-1010之间、105-109之间或106-108之间的本文公开的遗传修饰的免疫应答细胞被施用给人对象。更有效的细胞可以以更少数量施用。在一些实施例中，至少约1×108、2×108、3×108、4×108和5×l08本文公开的遗传修饰的免疫应答细胞被施用给人对象。可以根据每个对象的个体因素，包括他们的身体尺寸、年龄、性别、体重和特定对象的状况来精确确定有效剂量。本领域技术人员从本公开和本领域知识中可以容易地确定剂量。
本领域技术人员可以容易地确定组合物中的细胞和任选的添加剂、运载体和/或载体的量，并以本文公开的方法施用。通常，任何添加剂(除活性细胞和/或药剂以外)的存在量为磷酸盐缓冲盐水中的0.001％-50％(重量)溶液，并且活性成分以微克至毫克级别存在，例如约0.0001-约5wt％。在另一个实施方案中，约0.0001-约1wt％。在另一个实施方案中，约0.0001-约0.05wt％或约0.001-约20wt％。在另一个实施方案中，约0.01-约10wt％。在另一个实施方案中，为约0.05-约5wt％。当然，对于要施用给动物或人的任何组合物，以及对于任何特定的施用方法，因此优选确定：毒性，例如通过在合适的动物模型例如啮齿动物如小鼠中确定致死剂量(LD)和LD50；以及组合物的剂量，其中组分的浓度和施用组合物的时机，它们引起合适应答。根据本领域技术人员的知识、本公开和本文引用的文献，这种确定不需要过度实验。并且，可以确定连续施用的时间而无需过多实验。
核酸序列、载体、细胞
在一些实施方案中，本文公开了编码本文所述的用于本文所公开的组合物和方法中的嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列。
在另一个实施方案中，本文公开了包含编码如本文所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的载体。
在一些实施方案中，本文公开了编码本文所述的用于本文所公开的组合物和方法的遗传修饰的T细胞受体(TCR)的分离的核酸序列。在另一个实施方案中，本文公开了包含编码本文所述的遗传修饰的T细胞受体(TCR)的核酸序列的载体。
免疫应答细胞(例如T细胞、CTL细胞、NK细胞)的遗传修饰可以通过用重组DNA构建体转导基本上均质的细胞组合物来完成。在一些实施方案中，逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒)用于将DNA构建体引入细胞。例如，可以将编码结合抗原(例如肿瘤抗原，或其变体或其片段)的受体的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中并且可以从其内源启动子、从逆转录病毒长末端重复序列或从特异于感兴趣的靶细胞类型的启动子驱动表达。也可以使用非病毒载体。
也可以采用非病毒方法在细胞中表达蛋白质。例如，可以通过如下方法将核酸分子导入细胞，所述方法为在脂转染存在下施用核酸(Feigner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono et al.,Neuroscience Letters 17:259,1990；Brigham et al,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger et al,Methods inEnzymology 101:512,1983)、无唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸缀合(Wu et al.,Journalof Biological Chemistry 263:14621,1988；Wu et al.,Journal of BiologicalChemistry 264:16985,1989)或通过在手术条件下显微注射(Wolff et al.,Science 247:1465,1990)。其它非病毒基因转移手段包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的体外转染。脂质体也可以潜在地有利于将DNA递送到细胞中。将正常基因移植进对象的受影响组织中也可以通过将正常核酸转移到离体可培养的细胞类型(例如自体或异源原代细胞或其后代)中来完成，之后所述细胞(或其后代)被注射进靶组织或全身注射。重组受体也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶，兆核酸酶或TALE核酸酶)衍生或获得。瞬时表达可通过RNA电穿孔获得。用于多核苷酸治疗方法的cDNA表达可以从任何合适启动子(例如人巨细胞病毒(CMV)，猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)指导，并由任何合适的哺乳动物调节元件或内含子(例如延伸因子la增强子/启动子/内含子结构)调节。例如，如果需要，已知优先在特定细胞类型中指导基因表达的增强子可以用于指导核酸的表达。所使用的增强子可以包括但不限于被表征为组织或细胞特异性增强子的那些。或者，如果基因组克隆用作治疗性构建体，则可以通过同源调控序列或，如果需要，通过衍生自异源(包括上述任何启动子或调控元件)的调控序列来介导调控。
在另一个实施方案中，本文公开的是包含载体的细胞，该载体包含编码本文公开的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。
使用方法
在一个实施方案中，本文公开了治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，包括施用本文公开的组合物的步骤。
在一些实施方案中，本文公开了在对象中治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，包括施用包含凋亡细胞的组合物的步骤。在一些实施方案中，本文公开了在对象中治疗、预防癌症或肿瘤、抑制癌症或肿瘤的生长、延缓疾病进展、降低肿瘤负荷或降低癌症或肿瘤的发生率、或其任何组合的方法。在一些实施方案中，本文公开的方法降低肿瘤或癌症的大小和/或生长速度。在一些实施方案中，本文公开的方法增加患有肿瘤或癌症的对象的存活。在一些实施方案中，凋亡细胞或其组合物的使用增加了遗传修饰的免疫细胞治疗的功效，例如但不限于CAR T细胞治疗。
在另一个实施方案中，本文公开了治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，包括施用遗传修饰的免疫细胞和包含额外药剂的组合物的步骤，其中所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合，其中与施用所述遗传修饰的免疫细胞但未施用所述额外药剂的对象相比，所述方法在所述对象中治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞包含遗传修饰的T细胞、细胞毒性T细胞、Treg细胞、效应T细胞、辅助T细胞、NK细胞或树突细胞。
在另一个实施方案中，本文公开了治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，包括施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和包含额外药剂的组合物的步骤，其中所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合，其中与施用所述遗传修饰的免疫细胞但未施用所述额外药剂的对象相比，所述方法在所述对象中治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤。
在另一个实施方案中，本文公开了治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，包括施用遗传修饰的T细胞受体细胞(TCR T细胞)和包含额外药剂的组合物，其中所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合，其中与施用所述遗传修饰的免疫细胞但未施用所述额外药剂的对象相比，所述方法在所述对象中治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤。
在另一个实施方案中，施用凋亡细胞或凋亡上清液或其组合物不降低所述施用表达嵌合抗原受体的T细胞治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤的功效。在另一个实施方案中，施用额外药剂不降低所述施用表达嵌合抗原受体的T细胞治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤的功效，所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合或其组合物。
在另一个实施方案中，施用凋亡细胞或凋亡上清液或其组合物增加所述施用表达嵌合抗原受体的T细胞治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤的功效。在另一个实施方案中，施用额外药剂增加所述施用表达嵌合抗原受体的T细胞治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、减少癌症或肿瘤的发生、改善或减轻癌症或肿瘤的功效，所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合或其组合物。
在一个实施方案中，提高遗传修饰的免疫细胞癌症治疗的功效的方法包括施用所述遗传修饰的免疫细胞和额外药剂，所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合或其组合物，其中与未施用所述额外药剂的对象相比，功效增加。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏CD4+T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏CD8+T细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞是树突细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)。在另一个实施方案中，遗传修饰的T细胞是调节T细胞(Treg)。在另一个实施方案中，遗传修饰的T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的T细胞是遗传修饰的T细胞受体细胞(TCR T细胞)。在另一个实施方案中，提高CAR T细胞癌症治疗的功效的方法包括施用所述遗传修饰的免疫细胞和额外药剂，所述额外药剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物、碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合或其组合物，其中与未施用所述额外药剂的对象相比，功效增加。
在另一个实施方案中，本文所述的方法降低至少一种促炎细胞因子的产生水平(与接受免疫癌症治疗但未施用额外药剂的对象中的所述促炎细胞因子的水平相比)。在另一个实施方案中，本文的方法在经历遗传修饰的免疫细胞癌症治疗但未施用额外药剂的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率。
在另一个实施方案中，本文公开的方法降低IL-6。
在另一个实施方案中，本文的方法增加至少一种细胞因子的产生(与接受免疫癌症治疗但未施用额外药剂的对象中的所述细胞因子水平相比)。在一些实施方案中，所述额外药剂是凋亡细胞。在其它实施方案中，所述额外药剂是凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，本文公开的方法增加IL-2。
本领域技术人员将理解，如本文所使用的关于细胞因子的术语“产生”可涵盖细胞因子的表达以及细胞因子从细胞的分泌。在一实施方案中，细胞因子产生的增加导致细胞因子从细胞的分泌增加。在另一个实施方案中，细胞因子产生的减少导致细胞因子从细胞的分泌减少。在另一个实施方案中，本文公开的方法减少至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法减少IL-6的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法增加至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法增加IL-2的分泌。
在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是肿瘤细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是T细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是免疫细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是巨噬细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是B细胞淋巴细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是肥大细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是内皮细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是成纤维细胞。在另一个实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是基质细胞。本领域技术人员能认识到细胞因子水平在细胞因子分泌细胞中根据细胞周围环境可以增加或降低。
在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂增加至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂维持至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂不降低至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂增加IL-2的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂增加IL-2R的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂维持IL-2的分泌水平。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂维持IL-2R的分泌水平。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂不降低IL-2R的分泌水平。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂维持或增加IL-2的分泌水平。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂维持或增加IL-2R的分泌水平。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂不降低IL-2R的分泌水平。
在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的额外药剂减少IL-6的分泌。在另一个实施方案中，本文公开的方法中使用的额外药剂维持、增加或不减少IL-2的分泌水平，同时减少IL-6的分泌。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用的额外药剂维持、增加或不减少IL-2R的分泌水平，同时减少IL-6的分泌。
在一个实施方案中，本文公开的增加CAR T细胞癌症治疗的功效的方法包括降低所述对象中IL-6的水平，所述方法包括施用CAR T细胞和额外药剂，所述额外药剂包含凋亡细胞，凋亡细胞的上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合或其组合物，其中与未施用所述额外药剂的对象相比，功效增加。在另一个实施方案中，本文公开的增加CAR T细胞癌症治疗的功效的方法包括增加所述对象中IL-2的水平，所述方法包括施用CAR T细胞和额外药剂，所述额外药剂包含凋亡细胞，凋亡细胞的上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合或其组合物，其中与未施用所述额外药剂的对象相比，功效增加。在另一个实施方案中，本文公开的增加CAR T细胞癌症治疗的功效的方法包括增加所述CART细胞的增殖，所述方法包括施用CAR T细胞和额外药剂，所述额外药剂包含凋亡细胞，凋亡细胞的上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合或其组合物，其中与未施用所述额外药剂的对象相比，所述CAR T细胞的功效和增殖增加。
在一个实施方案中，增加CAR T细胞癌症治疗的方法功效减少或抑制对象中细胞因子产生，所述方法包括施用包含CAR T细胞的组合物和CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合或其组合物的步骤。在另一个实施方案中，在对象中治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法也降低或抑制对象中细胞因子产生，所述方法包括施用包含CAR T细胞的组合物和CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合或其组合物的步骤。
在另一个实施方案中，本文公开了治疗经历CAR T细胞癌症治疗的对象中的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法。
在另一个实施方案中，在对象中治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法降低或抑制对象中细胞因子产生，所述方法包括施用包含CAR T细胞的组合物和CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合或其组合物的步骤。
在另一个实施方案中，本文公开了治疗对象中的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了预防对象中的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了抑制对象中的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了降低对象中的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了改善对象中的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了减轻对象中的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。
在一个实施方案中，本文公开了在免疫治疗期间维持或增加遗传修饰的免疫细胞的增殖速度的方法，该方法包括在免疫治疗期间施用包含凋亡细胞或凋亡上清液的组合物的步骤。在另一个实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞包含T细胞、未致敏T细胞、未致敏CD4+T细胞、未致敏CD8+T细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)、调节T细胞(Treg)、嵌合抗原受体(CAR)T细胞或遗传修饰的T细胞受体(TCR)细胞。在另一个实施方案中，本文公开了在免疫治疗期间维持或增加CAR T细胞的增殖速度的方法，该方法包括在免疫治疗期间施用包含凋亡细胞或凋亡上清液的组合物的步骤。
在另一个实施方案中，维持或增加遗传修饰的免疫细胞的增殖速度的方法不降低或抑制免疫治疗的功效。例如，在另一个实施方案中，维持或增加CAR T细胞的增殖速度的方法不降低或抑制CAR T细胞癌症治疗的功效。在另一个实施方案中，维持或增加遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞的增殖速度的方法减少或抑制对象中细胞因子产生。
在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用本文公开的凋亡细胞或凋亡上清液以及一种或多种CTLA-4阻断剂例如伊匹单抗的联合治疗。在一个实施方案中，CTLA-4是有助于维持自身耐受性的T细胞激活的强抑制剂。在一个实施方案中，施用抗CTLA-4阻断剂(在另一实施方案中其是抗体)产生T细胞激活的净效应。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法利用包含凋亡细胞、CAR T细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的联合治疗。
在一些情况下，相对于未修饰的氨基酸序列，本文公开的多肽以及用于本文所公开的方法的多肽包含至少一个保守氨基酸取代。在其它情况下，多肽包含非保守氨基酸取代。在这种情况下，具有这种修饰的多肽相对于缺乏这种氨基酸取代的多肽表现出增加的稳定性或更长的半衰期。
在一些实施方案中，“治疗”包含治疗性治疗，“预防”包含预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目的是如上所述预防或减轻靶向的病理状况或失调。因此，在一些实施方案中，治疗可包括直接影响或治愈、压制、抑制、防止、减轻疾病、失调或状况的严重程度，延缓其发作，减轻与其相关的症状，或其组合。因此，在一些实施方案中，“治疗”、“改善”和“减轻”尤其是指延迟进展，加快缓解，诱导缓解，增加缓解，加快恢复，增加替代治疗的疗效或降低对替代治疗的抵抗，或其组合。在一些实施方案中，“预防”尤其是指延迟症状发作，预防疾病复发，减少复发的次数或频率，增加症状发作之间的潜伏期，或其组合。在一些实施方案中，“压制”或“抑制”尤其是指减轻症状的严重性，减少急性发作的严重性，减少症状的数量，减少疾病相关症状的发生率，减少症状的潜伏期，改善症状，减少继发症状，减少继发感染，延长患者存活，或其组合。
本领域技术人员理解，术语“抗原识别受体”可以涵盖能够应答抗原结合而激活免疫细胞(例如T细胞)的受体。示例性的抗原识别受体可以是天然或内源性T细胞受体或其中肿瘤抗原结合结构域与能够激活免疫细胞(例如T细胞)的细胞内信号传导结构域融合的嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，本文描述的方法增加患有癌症或肿瘤的对象的存活，并且包括给所述对象施用早期凋亡细胞群，其中所述方法增加对象的存活。
本领域技术人员理解，术语“疾病”可涵盖损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况或失调。疾病的例子包括赘生物或细胞的病原体感染。
本领域技术人员理解，术语“有效量”可以涵盖足以具有治疗效果的量。在一些实施方案中，“有效量”是足以阻止、改善或抑制赘生物的持续增殖、生长或转移(例如侵袭或迁移)的量。
本领域技术人员理解，术语“赘生物(neoplasia)”可涵盖以细胞或组织的病理性增生及其随后向其它组织或器官迁移或侵袭为特征的疾病。赘生物生长通常是不受控制的和进行性的，并且在不会引起正常细胞增殖或导致正常细胞增殖停止的条件下发生。赘生物可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自以下的器官：膀胱，骨骼，大脑，乳房，软骨，神经胶质，食道，输卵管，胆囊，心脏，肠，肾，肝，肺，淋巴结，神经组织，卵巢，胰腺，前列腺，骨骼肌，皮肤，脊髓，脾，胃，睾丸，胸腺，甲状腺，气管，泌尿生殖道，输尿管，尿道，子宫和阴道，或其组织或细胞类型。赘生物包括癌症，例如肉瘤、癌或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。
本领域技术人员理解，术语“病原体”可以涵盖能导致疾病的病毒、细菌、真菌、寄生物或原生动物。
本领域技术人员理解，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”可涵盖与正常细胞或非IS瘤性细胞相比在肿瘤细胞上独特或差异表达的抗原(例如多肽)。关于本文公开的组合物和方法，肿瘤抗原包括由肿瘤表达的能够经由抗原识别受体(例如CD19、MUCI)激活或诱导免疫应答或者能够通过受体-配体结合(例如CD47，PD-L1/L2，B7.1/2)抑制免疫应答的任何多肽。
本领域技术人员理解术语“病毒抗原”可以涵盖由病毒表达的能诱导免疫应答的多肽。
术语“包含”旨在具有美国专利法中赋予它们的广义含义，并且可以意味着“包括”等。类似地，术语“由...组成”和“基本上由...组成”具有美国专利法赋予它们的含义。本文所公开的组合物和方法包含活性成分或特定步骤，由活性成分或特定步骤组成，或基本上由活性成分或特定步骤组成。
本领域技术人员将理解，术语“治疗”可涵盖试图改变被治疗的个体或细胞的疾病过程的临床干预，并且可用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，减轻症状，减轻疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展的速度，改善或减轻疾病状态，和缓解或改善预后。通过预防疾病或失调的进展，治疗可以防止在患病或诊断的对象中或怀疑患有该失调的对象中由于失调引起的恶化，而且治疗可以在有患失调风险或怀疑患有失调的对象中预防该失调的发作或该失调的症状。
本领域技术人员将理解，术语“对象”可以涵盖脊椎动物，在一些实施方案中涵盖哺乳动物，并且在一些实施方案中涵盖人类。在一些实施方案中，对象还可以指家畜例如牛、绵羊、马、猫、狗以及实验动物例如小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠等。
在一些实施方案中，本文公开了CAR T细胞，其中所述CAR针对感兴趣的肽。在一些实施方案中，CAR结合至感兴趣的肽。在另一个实施方案中，CAR靶向感兴趣的肽。在另一个实施方案中，CAR活化感兴趣的肽。在另一个实施方案中，CAR是感兴趣的肽的配体。在另一个实施方案中，感兴趣的肽是CAR的配体。这些实施方案中的每一个都被认为是本文公开的一部分。
在一些实施方案中，本文公开的免疫细胞不是T细胞。在另一个实施方案中，本文公开的免疫细胞不是NK细胞。在另一个实施方案中，本文公开的免疫细胞不是CTL。在另一个实施方案中，本文公开的免疫细胞不是调节T细胞。在另一个实施方案中，免疫细胞不是人胚胎干细胞。在另一个实施方案中，免疫细胞不是可以分化淋巴样细胞的多能干细胞。
一种免疫治疗的方法涉及对患者自身的免疫细胞进行工程化以产生可以识别并攻击其肿瘤的遗传修饰的免疫细胞。如本文所述，收集免疫细胞并进行遗传修饰，例如在其细胞表面产生嵌合抗原受体(CAR)，这将使免疫细胞(例如T细胞)识别肿瘤或癌细胞上的特定蛋白质抗原。然后将扩展的遗传修饰的免疫细胞群例如CAR T细胞群给患者施用。在一些实施方案中，所施用的细胞在患者体内增殖并识别和杀死在其表面上具有所述抗原的癌细胞和肿瘤细胞。在另一个实施方案中，所施用的细胞在患者体内增殖并识别和杀死肿瘤相关抗原，这导致癌细胞和肿瘤细胞死亡。
在一些实施方案中，本文公开了在经历CAR T细胞癌症治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率的方法，以及在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的对象中降低或抑制细胞因子产生的方法，所述方法包括施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了在经历CAR T细胞癌症治疗的对象中治疗细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法。在另一个实施方案中，本文公开了在经历CAR T细胞癌症治疗的对象中预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法。在另一个实施方案中，本文公开了在经历CAR T细胞癌症治疗的对象中减轻细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法。在另一个实施方案中，本文公开了在经历CAR T细胞癌症治疗的对象中改善细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞或凋亡上清液或其组合物不会降低CAR T细胞治疗的功效。
在一些实施方案中，本文公开了在经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)癌症治疗的对象中抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法，其中所述方法包括给所述对象施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物或其组合物的步骤。在另一个实施方案中，抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率是通过测量经历表达嵌合抗原受体的T细胞癌症治疗并被施用凋亡细胞或凋亡上清液的对象中的细胞因子水平来确定的。在另一个实施方案中，将测得的细胞因子水平与未经历CAR T细胞癌症治疗的对象中的细胞因子水平进行比较。在另一个实施方案中，将测得的细胞因子水平与未被施用凋亡细胞或凋亡上清液的对象中的细胞因子水平进行比较。在又一个实施方案中，将测得的细胞因子水平与对照对象进行比较。
在另一个实施方案中，与经历CAR T细胞癌症治疗并且未被施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液或其组合物的对象相比，所述对象中的促炎细胞因子的水平降低。在另一个实施方案中，与经历CAR T细胞癌症治疗并且未被施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液或其组合物的对象相比，本文公开的方法降低或抑制至少一种促炎细胞因子的产生水平。
在另一个实施方案中，本文公开的方法可以进一步包括施用额外药剂。或者，本文公开的方法可以包括施用额外药剂而不是凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在又一个实施方案中，额外药剂可以是增强或改善CAR T细胞癌症治疗的那些化合物或组合物或其任何组合。在又一个实施方案中，增强或改善CAR T细胞癌症治疗的额外药剂包括CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其功能片段或其类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合。在另一个实施方案中，额外药剂包括凋亡细胞或凋亡上清液。在另一个实施方案中，本文所述的额外药剂的施用是在所述CAR T细胞癌症治疗之前、同时或之后进行。
在一些实施方案中，IL-6受体拮抗剂(在一个实施方案中其为托珠单抗)与本文公开的组合物和方法一起使用。
在一些实施方案中，过继转移的T细胞在淋巴细胞减少的宿主中移植并更有效地扩展。因此，在一些实施方案中，在转移CAR T细胞或其它修饰的免疫细胞之前，对对象进行淋巴耗竭。在另一个实施方案中，接受CAR T细胞的对象被给予T细胞支持性细胞因子。
在一些实施方案中，T细胞是效应T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是未致敏T细胞。在另一个实施例中，T单元是中枢记忆(TCM)T细胞。在另一个实施方案中，T细胞是Th17细胞。在另一个实施方案中，T细胞是T干记忆细胞。在另一个实施方案中，T细胞具有高复制能力。在另一个实施方案中，T细胞扩展发生在患者中。在另一个实施方案中，少量细胞可以转移至患者。在另一个实施方案中，T细胞扩展在体外发生。在另一个实施方案中，可以多次将大量细胞转移至患者，可以将细胞和/或上清液多次转移至患者，或其组合。
在一些实施方案中，CAR T细胞的优点在于，因为它们对细胞表面分子具有特异性，所以它们克服了MHC限制的TCR识别的限制并且避免了通过抗原呈递或人白细胞抗原表达的损伤的肿瘤逃逸。
在一些实施方案中，本文公开了一种降低对象肿瘤负荷的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。
在一些实施方案中，降低肿瘤负荷包含降低对象中肿瘤细胞数。在另一个实施方案中，降低肿瘤负荷包含降低对象的肿瘤大小。在另一个实施方案中，降低肿瘤负荷包含根除对象中的肿瘤。
在另一个实施方案中，本文公开了诱导对象中肿瘤细胞死亡的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。在另一个实施方案中，诱导对象中肿瘤细胞死亡的方法包括施用免疫细胞，例如NK细胞或包含工程化的嵌合抗原受体的T细胞，以及至少一种额外药剂以降低对象中的毒性细胞因子释放或“细胞因子释放综合征”(CRS)或“严重细胞因子释放综合征”(sCRS)或“细胞因子风暴”。
在另一个实施方案中，本文公开了增加或延长患有赘生物的对象的存活的方法，包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。在另一个实施方案中，增加或延长对象存活的方法包括施用免疫细胞，例如NK细胞或包含工程化的嵌合抗原受体的T细胞，以及至少一种额外药剂以降低对象中的毒性细胞因子释放或“细胞因子释放综合征”(CRS)或“严重细胞因子释放综合征”(sCRS)或“细胞因子风暴”。
在另一个实施方案中，本文公开了增加或延长患有赘生物的对象的存活的方法，包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。
在一些实施方案中，本文公开了一种延迟对象的癌症进展的方法，包括给所述对象施用本文所述的任何组合物或组合物组合的步骤。在一些实施方案中，本文公开了一种延迟对象中白血病或淋巴瘤进展的方法，包括给所述对象施用本文所述的任何组合物或组合物组合的步骤。在一些实施方案中，本文公开了增加、延长(extending)或延长(prolonging)患有癌症或肿瘤的对象的存活的方法，包括给所述对象施用本文所述的任何组合物或组合物组合的步骤。在一些实施方案中，本文公开了增加、延长或延长患有白血病或淋巴瘤的对象的存活的方法，包括给所述对象施用本文所述的任何组合物或组合物组合。在一些实施方案中，本文公开了降低对象中肿瘤细胞负荷的方法，包括给所述对象施用本文所述的任何组合物或组合物组合。在一些实施方案中，肝脏和骨髓的肿瘤负荷降低。
在另一个实施方案中，本文公开了一种预防对象的赘生物的方法，所述方法包括给所述对象施用本文所述的任何组合物或组合物组合的步骤。在一些实施方案中，赘生物选自血液癌症、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌或其组合。
在另一个实施方案中，本文公开了一种在有需要的对象中治疗血液癌症的方法，包括给所述对象施用本文所述的任何组合物的步骤。在一些实施方案中，血液癌症选自B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。
在一些实施方案中，施用包含施用包含CAR T细胞的组合物。在一些实施方案中，施用包含施用包含早期凋亡细胞的组合物。在一些实施方案中，施用包含施用包含得自早期凋亡细胞的上清液的组合物。在一些实施方案中，施用包含施用本文所述的组合物的组合。在一些实施方案中，施用包含施用在相同或不同组合物中的CAR T细胞和凋亡细胞。在一些实施方案中，施用包含施用CAR T细胞组合本文所述的额外药剂。在一些实施方案中，施用包含施用在相同或不同组合物中的凋亡细胞和抗体或其片段。
在一些实施方案中，联合治疗提供协同作用。在一些实施方案中，与单独使用CART细胞相比，使用早期凋亡细胞组合CAR T细胞的方法增加CAR T细胞功效。在一些实施方案中，与单独使用CAR T细胞相比，使用早期凋亡细胞组合CAR T细胞的方法延长患有癌症或肿瘤的对象的存活时间。在一些实施方案中，与单独使用CAR T细胞相比，使用早期凋亡细胞组合CAR T细胞的方法延长患有淋巴瘤或白血病的对象的存活时间。
在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞组合抗体或其片段的方法延迟癌症的发作或肿瘤的出现。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞组合抗体或其片段的方法延迟癌症的进展。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞组合抗体或其片段的方法延迟肿瘤生长。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞组合抗体或其片段的方法延长患有癌症或肿瘤的对象的存活时间。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞组合抗体或其片段的方法延长患有淋巴瘤或白血病的对象的存活时间。
在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，包含施用早期凋亡细胞组合包含RtX的抗体或其片段的使用方法延迟癌症的发作或肿瘤的出现。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞组合包含RtX的抗体或其片段的方法延迟癌症的进展。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞组合包含RtX的抗体或其片段的方法延迟肿瘤的生长。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞组合包含RtX的抗体或其片段的方法延长患有癌症或肿瘤的对象的存活时间。在一些实施方案中，与单独使用凋亡细胞或抗体相比，使用早期凋亡细胞组合包含RtX的抗体或其片段的方法延长患有淋巴瘤或白血病的对象的存活时间。
在一些实施方案中，本文所述的使用方法降低了肿瘤负荷。本领域技术人员将理解，术语“肿瘤负荷”可以指体内癌细胞的数量、肿瘤的大小或癌症的量。术语“肿瘤负荷”可以与具有所有相同含义和质量的术语“肿瘤负担”互换使用。在一些实施方案中，与未施用凋亡细胞的对象相比，包括施用早期凋亡细胞的使用方法降低对象中癌细胞的数量，降低对象中肿瘤的大小，或降低对象体内癌症的量，或其任何组合。在一些实施方案中，与未施用凋亡细胞或未施用抗体或其组合的对象相比，包括施用早期凋亡细胞组合抗体或其片段的使用方法降低对象中癌细胞的数量，降低对象中肿瘤的大小，或降低对象体内癌症的量，或其任何组合。在一些实施方案中，与未施用凋亡细胞、RtX抗体或其组合的对象相比，包括施用早期凋亡细胞组合RtX抗体或其片段的使用方法降低对象中癌细胞的数量，降低对象中肿瘤的大小或降低对象体内癌症的量，或其任何组合。
在一些实施方案中，如本文所公开的，在经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或者易于细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的对象中降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制细胞因子产生。在另一个实施方案中，所述方法降低或抑制促炎细胞因子产生。在另一个实施方案中，所述方法降低或抑制至少一种促炎细胞因子。在其中对象正在接受CAR T细胞癌症治疗的另一个实施方案中，所述方法不降低CAR T细胞治疗的功效。
本文提供的方法包括以有效实现所期望效果的量施用本文公开的T细胞、NK细胞或CTL细胞，无论是减轻现有状况还是预防复发。对于治疗，施用量是有效产生所期望效果的量。有效量可以一次施用或一系列施用提供。有效量可以推注或连续灌注提供。
本领域技术人员将认识到“有效量”(或“治疗有效量”)可涵盖足以在治疗时产生有益或期望的临床结果的量。有效量可以以一剂或多剂施用给对象。就治疗而言，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减慢疾病进展或以其它方式减少疾病病理后果的量。有效量通常由医师根据具体情况确定并且在本领域技术人员的能力范围内。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常要考虑几个因素。这些因素包括对象的年龄、性别和体重、所治疗的状况、状况的严重程度以及所施用的抗原结合片段的形式和有效浓度。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括施用包含在单一组合物中包含的遗传修饰的细胞以及额外药剂或其组合的组合物。在另一个实施方案中，方法包括施用包含在单一组合物中包含的CAR T细胞和额外药剂或其组合的组合物。在另一个实施方案中，方法包括施用包含在单一组合物中包含的TCR T细胞和额外药剂或其组合的组合物。
在一个实施方案中，本文公开的方法包括施用包含在至少两个组合物中包含的遗传修饰的细胞以及额外药剂或其组合的组合物。在另一个实施方案中，方法包括施用包含在至少两个组合物中包含的CAR T细胞和额外药剂或其组合的组合物。在另一个实施方案中，方法包括施用包含在至少两个组合物中包含的TCR T细胞和额外药剂或其组合的组合物。
对于使用抗原特异性T细胞(例如CAR T细胞)的过继免疫治疗，通常输注的细胞剂量范围为106-1010(例如109)。在将遗传修饰的细胞施用给宿主并随后分化后，诱导特异性针对特定抗原的T细胞。T细胞的“诱导”可以包括例如通过缺失或无反应性使抗原特异性T细胞失活。失活对于建立或重建例如自身免疫性失调的耐受性特别有用。修饰的细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉内、皮下、结节内、肿瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接向至胸腺。在一些实施方案中，T细胞不是腹膜内施用的。在一些实施方案中，T细胞是肿瘤内施用的。
包含本文公开的遗传修饰的免疫应答细胞(例如T细胞、N细胞、CTL细胞或它们的祖细胞)的组合物可以被全身性或直接提供给对象以治疗赘生物、病原体感染或传染病。在一些实施方案中，将本文公开的细胞直接注射到感兴趣的器官(例如受赘生物影响的器官)中。或者，例如通过向循环系统(例如肿瘤脉管系统)施用，将包含遗传修饰的免疫应答细胞的组合物间接提供给感兴趣的器官。可以在施用细胞之前、期间或之后提供扩增和分化物质以增加体外或体内T细胞、NK细胞或CTL细胞的产生。
如上所述，在本文公开的方法中，可以在施用遗传修饰的免疫细胞之前、同时或之后提供包含额外药剂的组合物。在一个实施方案中，在本文公开的方法中，遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞在本文公开的额外药剂之前施用。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中，遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞与本文公开的额外药剂同时施用。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中，在施用额外药剂之后施用遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞。
在一个实施方案中，本文公开的方法施用包含本文公开的凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，本文公开的方法施用包含本文公开的凋亡细胞上清液的组合物。
修饰的细胞可以在任何生理上可接受的载体中施用，通常血管内施用，尽管它们也可以被引入骨骼或其它方便部位，在这些部位细胞可以找到合适的再生和分化部位(例如胸腺)。通常，施用至少1×105个细胞，最终达到1×1010或更多。本文公开的遗传修饰的免疫应答细胞可以包含纯化的细胞群。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法例如荧光激活细胞分选(FACS)容易地确定细胞群中遗传修饰的免疫应答细胞的百分比。在一些实施方案中，包含遗传修饰的免疫应答细胞的细胞群的纯度范围为约50％-约55％，约55％-约60％和约65％-约70％。在其它实施方案中，纯度为约70％-约75％，约75％-约80％，约80％-约85％。在进一步的实施方案中，纯度为约85％-约90％，约90％-约95％和约95％-约100％。剂量可以由本领域技术人员容易地调节(例如纯度降低可能需要剂量增加)。可以通过注射、导管等引入细胞。如果需要，也可以包括因子，包括但不限于白介素例如IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL7、IL12、ILIS、IL21以及其它白介素，集落刺激因子例如G-CSF、M-CSF和GM-CSF，干扰素例如γ-干扰素和促红细胞生成素。
组合物包括药物组合物，其包含遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞和药学可接受的载体。施用可以是自体的或异体的。例如，可以从一个对象获得免疫应答细胞或祖细胞，并施用给相同对象或不同的相容对象。本文公开的外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如体内、离体或体外衍生的)可通过局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用本文公开的治疗组合物(例如包含遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制为单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
在另一个实施方案中，本文公开的是产生包含本文公开的CAR T细胞或其它免疫细胞和凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物的方法，该方法包括在所述T细胞或免疫细胞中引入编码与感兴趣抗原结合的CAR的核酸序列。在一个替代实施方案中，包含本文公开的CAR T细胞或其它免疫细胞的组合物与包含凋亡细胞或凋亡上清液的组合物是分开的。
在一个实施方案中，本文公开了一种治疗、预防、抑制恶性肿瘤、降低恶性肿瘤的发病率、改善或减轻恶性肿瘤的方法，包括施用包含表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T-细胞)和凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物的步骤。
本领域技术人员将理解，由遗传修饰的免疫细胞例如CAR修饰的T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可以是主动免疫应答或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可以是过继免疫治疗的一部分，其中CAR修饰的T细胞诱导对CAR中抗原结合部分具有特异性的免疫应答。
本领域技术人员将理解，免疫治疗可涵盖使用免疫效应细胞和分子靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标记具有特异性的抗体。抗体单独可以作为治疗的效应物，或者其可以募集其它细胞来实际实现细胞杀伤。抗体也可以与药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合而仅用作靶向剂。或者，效应物可以是携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子直接或间接与肿瘤细胞靶相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于治疗、预防本领域已知的任何血液肿瘤、抑制本领域已知的任何血液肿瘤的生长或降低其发病率。在一些实施方案中，本文所公开的早期凋亡细胞及其组合物可以用于治疗、预防本领域已知的任何弥漫性癌症、抑制本领域已知的任何弥漫性癌症的生长或降低其发病率，例如但不限于弥漫性乳腺癌，其中在乳腺中未形成实体瘤。在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于延长本领域已知的任何血液学肿瘤的存活时间。在一些实施方案中，本文所公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于延长本领域已知的任何弥漫性癌症的存活时间，例如但不限于弥漫性乳腺癌，其中乳腺中未形成实体瘤。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于增加患有本领域已知的任何血液学肿瘤的对象的存活。在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于增加患有本领域已知的任何弥漫性癌症的对象的存活，例如但不限于弥漫性乳腺癌，其中在乳腺中未形成实体瘤。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于降低本领域已知的任何血液学肿瘤的生长速度。在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于降低本领域已知的任何弥漫性癌症的生长速度，例如但不限于弥漫性乳腺癌，其中在乳腺中未形成实体瘤。
在一些实施方案中，被治疗的肿瘤或癌症包含肿瘤或癌症的转移。在一些实施方案中，本文的使用方法防止或降低肿瘤或癌症的转移。在一些实施方案中，本文的使用方法抑制转移的生长或降低转移的发生率。
在一些实施方案中，对象是人对象。在一些实施方案中，对象是儿童。在一些实施方案中，对象是成人。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括施用包含单个核富集的细胞群的早期凋亡细胞群，如上所详述。在一些实施方案中，本文公开的方法包括施用包含稳定细胞群的早期凋亡细胞群，其中所述细胞群稳定超过24小时。上面已经详细描述了稳定的早期凋亡细胞群。在一些实施方案中，本文公开的方法包括施用早期凋亡细胞群，所述早期凋亡细胞群包含没有细胞聚集体的细胞群。没有聚集体的早期凋亡细胞群及其制备方法已在上文详细描述。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括给需要的对象施用自体早期凋亡细胞群。在一些实施方案中，本文公开的方法包括给需要的对象施用同种异基因(allogeneic)早期凋亡细胞群。
在一些实施方案中，早期凋亡细胞群或其组合物的施用方法包括施用所述凋亡细胞群或其组合物的单次输注。在一些实施方案中，可以施用单次输注给预先确定患有癌症或肿瘤风险的对象作为预防。在一些实施方案中，可以定期施用单次输注给患有癌症或肿瘤的对象作为对象治疗性治疗的一部分。在一些实施方案中，可以施用单次输注给患有癌症或肿瘤的对象作为预防，以预防转移癌，降低其风险或延迟其出现。
在一些实施方案中，施用早期凋亡细胞群或其组合物的方法包括施用所述凋亡细胞群或其组合物的多次输注。在一些实施方案中，可以施用多次输注给预先确定患有癌症或肿瘤风险的对象作为预防。在一些实施方案中，可以定期施用多次输注给患有癌症或肿瘤的对象作为对象治疗性治疗的一部分。在一些实施方案中，可以施用多次输注给患有癌症或肿瘤的对象作为预防，以预防转移癌，降低其风险或延迟其出现。
在一些实施方案中，多次输注包括至少两次输注。在一些实施方案中，多次输注包括2次输注。在一些实施方案中，多次输注包括2次以上输注。在一些实施方案中，多次输注包括至少3次输注。在一些实施方案中，多次输注包括3次输注。在一些实施方案中，多次输注包括3次以上输注。在一些实施方案中，多次输注包括至少4次输注。在一些实施方案中，多次输注包括4次输注。在一些实施方案中，多次输注包括4次以上输注。在一些实施方案中，多次输注包括至少5次输注。在一些实施方案中，多次输注包括5次输注。在一些实施方案中，多次输注包括5次以上输注。在一些实施方案中，多次输注包括至少6次输注。在一些实施方案中，多次输注包括6次输注。在一些实施方案中，多次输注包括6次以上输注。在一些实施方案中，多次输注包括至少7次输注。在一些实施方案中，多次输注包括7次输注。在一些实施方案中，多次输注包括7次以上输注。在一些实施方案中，多次输注包括至少8次输注。在一些实施方案中，多次输注包括8次输注。在一些实施方案中，多次输注包括8次以上输注。在一些实施方案中，多次输注包括至少9次输注。在一些实施方案中，多次输注包括9次输注。在一些实施方案中，多次输注包括9次以上输注。在一些实施方案中，多次输注包括至少10次输注。在一些实施方案中，多次输注包括10次输注。在一些实施方案中，多次输注包括10次以上输注。
在一些实施方案中，多次输注包括较少量的早期凋亡细胞，其中施用的细胞总剂量是输注的总和。
在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注。在一些实施方案中，在若干天的时间内施用多次输注。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中在输注之间间隔至少12小时。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中在输注之间间隔至少24小时。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中输注之间间隔至少一天。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中在输注之间间隔至少两天。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中输注之间间隔至少三天。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中在输注之间间隔至少四天。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中输注之间间隔至少五天。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中在输注之间间隔至少六天。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中输注之间间隔至少七天。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中在输注之间间隔至少一周。在一些实施方案中，在若干小时的时间内施用多次输注，其中在输注之间间隔至少两周。
在一些实施方案中，在多次输注中的细胞量基本上彼此相等。在一些实施方案中，在多次输注中的细胞量彼此不同。
在一些实施方案中，本文所述方法进一步包括给所述对象施用额外的化疗剂或免疫调节剂。
在一些实施方案中，额外的化疗剂或免疫调节剂与早期凋亡细胞同时或基本同时施用。在一些实施方案中，额外的化疗剂或免疫调节剂与早期凋亡细胞包含在相同组合物中。在一些实施方案中，额外的化疗剂或免疫调节剂与早期凋亡细胞包含在不同的组合物中。
在一些实施方案中，额外的化疗剂或免疫调节剂在施用早期凋亡细胞之前施用。在一些实施方案中，额外的化疗剂或免疫调节剂在施用早期凋亡细胞之后施用。
在一些实施方案中，化疗剂包含烷基化剂，氮芥(nitrogen mustard)，亚硝基脲，四嗪，氮丙啶，顺铂及其衍生物，非经典烷基化剂，氮芥(mechlorethamine)，环磷酰胺，美法仑，苯丁酸氮芥，异环磷酰胺，白消安，N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)，卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，司莫司汀(MeCCNU)，福莫司汀，链脲霉素，达卡巴嗪，米托唑胺，替莫唑胺，噻替派，丝裂霉素，地吖醌(AZQ)，顺铂，卡铂，奥沙利铂，丙卡巴肼，六甲三聚氰胺，抗代谢物，抗叶酸剂，甲氨蝶呤，培美曲塞，氟嘧啶，氟尿嘧啶，卡培他滨，脱氧核苷类似物，阿糖胞苷，吉西他滨，地西他滨，阿扎胞苷，氟达拉滨，奈拉滨，克拉屈滨，氯法拉滨和喷司他丁，硫嘌呤，硫鸟嘌呤，巯嘌呤，抗微管剂，长春花生物碱，紫杉烷类，长春新碱，长春碱，半合成长春花生物碱，长春瑞滨，长春地辛，长春氟宁，紫杉醇，多西紫杉醇，鬼臼毒素，依托泊苷，替尼泊苷，拓扑异构酶抑制剂，伊立替康，托泊替康，喜树碱，依托泊苷，多柔比星，米托蒽醌，替尼泊苷，催化抑制剂，新生霉素，美巴龙，阿柔比星，细胞毒性抗生素，蒽环类，博来霉素，丝裂霉素C，米托蒽醌，放线菌素，多柔比星，柔红霉素，表柔比星，伊达比星，蒽环类，吡柔比星，阿柔比星，米托蒽醌，博来霉素，丝裂霉素，靶向治疗，单克隆抗体，裸单克隆抗体，缀合的单克隆抗体，化学标记的抗体，双特异性单克隆抗体，或其任何组合。
在一些实施方案中，免疫调节剂包含抗体或其功能片段。在一些实施方案中，抗体或其功能片段包含单克隆抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。
在一些实施方案中，本文公开的是本文公开的任何多肽或肽结构域的活性片段。技术人员将理解，术语“片段”可涵盖至少5、10、13或15个氨基酸。在其它实施方案中，片段是至少20个连续氨基酸。本文公开的片段可以通过本领域技术人员已知的方法产生或者可以由正常的蛋白质加工产生(例如从新生多肽中去除生物活性不需要的氨基酸，或者通过可变mRNA剪接或可变蛋白质加工事件而去除氨基酸)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛的意义上可互换使用，具体是指多克隆抗体、单克隆抗体或其保留抗体的结合活性的任何片段。在某些实施方案中，本文公开的方法包括使用嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在一些实施方案中，术语“抗体”是指能够与本文所述的期望的靶特异性相互作用例如与吞噬细胞结合的完整分子及其功能性片段如Fab、F(ab')2和Fv。在一些实施方案中，抗体片段包含：
(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，其可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生一条完整轻链和一条重链的一部分来产生；
(2)Fab'，抗体分子的片段，其可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体，然后还原得到一条完整轻链和重链的一部分而获得；每个抗体分子获得两个Fab'片段；
(3)(Fab')2，可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体而无需随后还原而获得的抗体片段；F(ab')2是通过两个二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体；
(4)Fv，基因工程片段，含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区；和
(5)单链抗体(“SCA”)，一种含有轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，所述可变区通过合适的多肽接头连接作为遗传融合的单链分子。
制备这些片段的方法是本领域已知的(参见例如Harlow and Lane,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988,并入本文参考)。
在一些实施方案中，抗体片段可以通过蛋白水解抗体或者通过在大肠杆菌或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞培养物或其它蛋白质表达系统)中表达编码片段的DNA而制备。
在一些实施方案中，抗体片段可以通过常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶酶促切割抗体来产生，以提供表示为F(ab')2的5S片段。可以使用硫醇还原剂以及任选地用对于二硫键裂解产生的巯基的封闭基团进一步裂解该片段，以产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段。这些方法的描述例如参见Goldenberg,美国专利号4,036,945和4,331,647及其中的参考文献，这些专利全文引入本文参考。也参见Porter,R.R.,Biochem.J.,73:119-126,1959。也可以使用裂解抗体的其它方法，例如分离重链以形成单价轻链片段，进一步裂解片段或其它酶学、化学和遗传学技术，只要片段结合被完整抗体识别的抗原即可。
Fv片段包含VH和VL链的缔合。缔合可以是非共价的，如Inbar et al.,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 69:2659-62,1972所述。或者，可变链可以通过分子间二硫键连接或者通过化学物如戊二醛交联。优选地，Fv片段包含由肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建结构基因而制备，所述结构基因包含由寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列。所述结构基因插入表达载体中，随后该表达载体被导入宿主细胞如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成单一多肽链，其用接头肽桥连两个V结构域。产生sFv的方法描述于例如Whitlow and Filpula,Methods,2:97-105,1991；Bird et al.,Science 242:423-426,1988；Pack et al.,Bio/Technology 11:1271-77,1993和Ladner et al.,U.S.Pat.No.4,946,778,其全文引入本文参考。
抗体片段的另一种形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码感兴趣抗体的CDR的基因来获得。例如，通过使用聚合酶链反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备此类基因。参见例如Larrick and Fry,Methods,2:106-10,1991。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或片段可包含抗体的“人源化形式”。在一些实施方案中，术语“抗体的人源化形式”是指非人(例如鼠)抗体，其是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab，Fab'，F(ab')2或抗体的其它抗原结合亚序列)的嵌合分子。人源化抗体包括具有所需的特异性、亲和性和能力的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成受体的互补决定区(CDR)的残基被非人类种类(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应非人残基置换。人源化抗体还可包含在受体抗体或输入的CDR或构架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体包含至少一个可变结构域、典型地两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区域相应于非人免疫球蛋白的那些而全部或基本上全部的FR区域是人免疫球蛋白共有序列的那些。最佳地，人源化抗体还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature,332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的。通常，人源化抗体具有从非人源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。人源化可以基本上按照Winter和同事的方法进行[Jones et al.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988)]，通过用啮齿动物CDR或CDR序列代替人抗体的相应序列进行。因此，这样的人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
人抗体也可以用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库[Hoogenboomand Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole et al.和Boerner et al.的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)及Boerner etal.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。类似地，人单克隆抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物例如小鼠中而制备，所述转基因动物中的内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全失活。在攻击时，观察到人抗体产生，其在所有方面包括基因重排、组装和抗体库方面均非常类似于在人中见到的。这种方法描述于例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016以及以下的科学出版物：Marks etal.,Bio/Technology 10,779-783(1992)；Lonberg et al.,Nature 368 856-859(1994)；Morrison,Nature 368 812-13(1994)；Fishwild et al.,Nature Biotechnology 14,845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14,826(1996)；Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13 65-93(1995)。
在一些实施方案中，免疫调节剂包含抗CD20单克隆抗体。在一些实施方案中，抗CD20单克隆抗体是利妥昔单抗。利妥昔单抗市售可得，由Biogen和Genentech USA,Inc.共同销售，名称为
Figure BDA0002458147110000911
在一些实施方案中，本文公开的方法包含一线治疗。
技术人员将理解，术语“一线治疗”可以涵盖针对疾病的第一治疗。其通常是一组标准治疗的一部分，例如手术随后化疗和放疗。当一线治疗单独使用时，其是公认的最佳治疗。如果其不能治愈疾病或引起严重副作用，则可以添加或替代使用其它治疗。也称为诱导治疗，主要治疗(primary therapy)和主要治疗(primary treatment)。
在一些实施方案中，本文公开的方法包含辅助治疗。
本领域技术人员将理解，术语“辅助治疗”可以涵盖除主要或初始治疗之外所给予的治疗。在一些实施方案中，辅助治疗可以包含在进一步治疗的准备中在主要治疗之前给予的额外的癌症治疗。在一些实施方案中，辅助治疗可以包含在主要治疗之后给予的额外的癌症治疗以降低癌症复发的风险。辅助治疗可包括化疗、放疗、激素治疗、靶向治疗或生物治疗。
在一些实施方案中，本文公开的方法减少最小残留疾病，增加缓解，增加缓解持续时间，降低肿瘤复发率，减小所述肿瘤的大小，降低所述肿瘤或所述癌症的生长速度，防止所述肿瘤或所述癌症的转移，或降低所述肿瘤或所述癌症的转移率，或其任何组合。
本领域技术人员将理解，术语“最小残留疾病”可涵盖当患者无疾病症状或迹象时在治疗期间或治疗后留在患者体内的少量癌细胞。
另外，术语“缓解”可涵盖癌症的迹象和症状的减少或消失，尽管癌症可能仍在体内。在一些实施方案中，缓解可以包含部分缓解，其中一些但不是全部癌症迹象和症状已经消失。在一些实施方案中，缓解包含完全缓解，其中癌症的所有迹象和症状都消失，尽管癌症仍可能在体内。在一些实施方案中，本文公开的方法可以包含缓解诱导治疗，其中用早期凋亡细胞或其组合物的初始治疗降低癌症的迹象或症状或使它们消失。
本领域技术人员将理解，术语“复发”可涵盖在一段时间的改善后疾病的重现或疾病的迹象和症状的重现。在一些实施方案中，本文使用的方法导致无复发存活，其中无复发存活涵盖癌症的主要治疗结束后患者存活而没有该癌症的任何迹象或症状的时间长度。
技术人员将理解，术语“转移”涵盖癌细胞从它们最初形成的位置到身体另一部分的扩散。在转移中，癌细胞会脱离原始(原发性)肿瘤，通过血液或淋巴系统传播，并在身体的其它器官或组织中形成新肿瘤。在一些实施方案中，新的转移性肿瘤是与原发性肿瘤相同类型的癌症。例如，如果乳腺癌扩散到肺，则肺中的癌细胞是乳腺癌细胞，而不是肺癌细胞。
恶性肿瘤
在一些实施方案中，CAR T细胞用于治疗、预防、抑制癌症或肿瘤、降低癌症或肿瘤的发病率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法中，其中所述方法包括施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)的步骤。如本文所公开，这些方法可以进一步包括施用额外药剂以努力抑制或减少CRS或细胞因子风暴的发生。
在一些实施方案中，本文公开的方法增加对象的存活。在一些实施方案中，本文公开了增加或延长患有弥漫性癌症的对象的存活的方法，包括给所述对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法增加对象的存活。
在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，B细胞恶性肿瘤是白血病。在另一个实施方案中，B细胞恶性肿瘤是急性淋巴母细胞白血病(ALL)。在另一个实施方案中，B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病。
在一些实施方案中，癌症是白血病。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，淋巴瘤是大B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，本文描述的方法降低癌症或肿瘤的大小或降低其生长速度，包括给所述对象施用早期凋亡细胞群，其中所述方法降低癌症或肿瘤的大小或生长速度。在一些实施方案中，本文公开了降低弥漫性癌症的生长速度的方法，包括给所述对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法降低癌症的生长速度。在一些实施方案中，本文公开了降低实体癌或肿瘤的大小或降低其生长速度的方法，包括给对象施用早期凋亡细胞群的步骤，其中所述方法降低实体癌或肿瘤的大小或降低其生长速度。
在一些实施方案中，癌症可包含实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤包含通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的(不是癌症)或恶性的(癌症)。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名。实体瘤的例子是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血液癌症)通常不会形成实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤包含肉瘤或癌。
在一些实施方案中，实体瘤是由除血液、骨髓或淋巴细胞以外的机体组织细胞的异常生长形成的赘生物(细胞的新生长)或病变(解剖结构的损伤或生理功能的破坏)。在一些实施方案中，实体瘤由异常细胞团组成，该异常细胞团可源于不同组织类型例如肝、结肠、乳房或肺并且最初在其细胞起源的器官中生长。但是，此类癌症可能会在疾病晚期通过转移性肿瘤生长扩散到其它器官。
在一些实施方案中，实体瘤的实例包含肉瘤、癌和淋巴瘤。在一些实施方案中，实体瘤包含肉瘤或癌。在一些实施方案中，实体瘤是腹膜内肿瘤。
在一些实施方案中，实体瘤包含但不限于肺癌，乳腺癌，卵巢癌，胃癌，食道癌，宫颈癌，头颈癌，膀胱癌，肝癌和皮肤癌。在一些实施方案中，实体瘤包含纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨性肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮肉瘤，Ewing’s瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌或肿瘤，乳腺癌或肿瘤，卵巢癌或肿瘤，前列腺癌或肿瘤，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管原癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，Wilm’s肿瘤，宫颈癌或肿瘤，子宫癌或肿瘤，睾丸癌或肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，神经鞘瘤，脑膜瘤，黑色素瘤，成神经细胞瘤或视网膜母细胞瘤。
在一些实施方案中，实体瘤包含肾上腺皮质肿瘤(腺瘤和癌)，癌，结肠直肠癌，硬纤维肿瘤，纤维组织增生性小圆形细胞肿瘤，内分泌肿瘤，Ewing肉瘤，生殖细胞肿瘤，肝母细胞瘤，肝细胞癌，黑素瘤，神经母细胞瘤，骨肉瘤，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，横纹肌肉瘤以外的软组织肉瘤和Wilms肿瘤。在一些实施方案中，实体瘤是乳腺肿瘤。在另一个实施方案中，实体瘤是前列腺癌。在另一个实施方案中，实体瘤是结肠癌。在一些实施方案中，所述肿瘤是脑肿瘤。在另一个实施方案中，所述肿瘤是胰腺肿瘤。在另一个实施方案中，所述肿瘤是结直肠肿瘤。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞或其组合物具有针对癌症或肿瘤的治疗和/或预防功效，所述癌症或肿瘤例如是肉瘤和癌(例如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨性肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，Ewing’s肿瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎肉癌，Wilm’s肿瘤，宫颈癌，子宫癌，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，神经鞘瘤，脑膜瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可以用于治疗、预防本领域已知的任何实体瘤、抑制本领域已知的任何实体瘤的生长或降低其发生率。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于增加患有本文公开的或本领域已知的任何实体瘤的对象的存活。
在一些实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物可用于降低本文公开的或本领域已知的任何实体瘤的大小或降低其生长速度。
在一些实施方案中，癌症可以是弥漫性癌症，其中所述癌症广泛扩散；不被局限(localized)或限制(confined)。在一些实施方案中，弥漫性癌症可包含非实体瘤。弥漫性癌症的例子包括白血病。白血病包含始于血液形成组织例如骨髓并导致大量异常血细胞生成和进入血流的癌症。
在一些实施方案中，弥漫性癌症包含B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，弥漫性癌症包含白血病。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，淋巴瘤是大B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，弥漫性癌症或肿瘤包含血液学肿瘤。在一些实施方案中，血液学肿瘤是影响血液、骨髓和淋巴结的癌症类型。血液学肿瘤可来自两种主要血细胞谱系任一：髓样和淋巴样细胞系。髓样细胞系通常产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞，而淋巴样细胞系产生B、T、NK和浆细胞。淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤)、淋巴细胞白血病和骨髓瘤均来自淋巴样细胞系，而急性和慢性髓性白血病(AML，CML)、骨髓增生异常综合征和骨髓增生性疾病在起源上是髓样的。
在一些实施方案中，非实体(弥漫性)癌症或肿瘤包含造血系统恶性肿瘤，血细胞癌，白血病，骨髓增生异常综合征，淋巴瘤，多发性骨髓瘤(浆细胞骨髓瘤)，急性淋巴母细胞白血病，急性髓细胞性白血病，慢性髓细胞性白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤或浆细胞白血病。
在另一个实施方案中，本文公开的早期凋亡细胞及其组合物具有针对弥漫性癌症的治疗和/或预防功效，所述弥漫性癌症例如但不限于白血病(例如急性白血病，急性淋巴细胞性白血病，急性粒细胞性白血病，急性成髓细胞白血病，急性早幼粒细胞性白血病，急性髓单核细胞性白血病，急性单核细胞白血病，急性红白血病，慢性白血病，慢性粒细胞白血病，慢性淋巴细胞性白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤(霍奇金氏病，非霍奇金氏病)，Waldenstrom巨球蛋白血症，重链疾病。
如本文所公开的组合物和方法可以用于治疗、预防、抑制、改善、减轻本领域已知的任何血液学肿瘤或降低其发病率。
本领域技术人员将理解，在某些实施方案中，术语“包含”的使用可以被术语“基本上由...组成”或“由...组成”代替。本领域技术人员将理解，术语“包含”旨在表示该系统包括所列举的要素，但不排除其它可能是可选的要素。例如，包含早期凋亡细胞但不限于该细胞群的组合物。此外，术语“基本上由……组成”可以涵盖一种方法，该方法包括所列举的要素，例如基本上由早期凋亡细胞组成的组合物，但不排除可能对该方法的执行具有实质性显著影响的其它要素。因此，这样的组合物仍然可以包括药学上可接受的赋形剂，其不包含在治疗癌症中的必需活性。此外，“由...组成”涵盖排除多于痕量的其它要素。因此，由早期凋亡细胞组成的这种组合物将不包括多于痕量的如本文所公开的其它要素。
在一些实施方案中，本文公开的方法可以表示为本文所述的组合物用于本文所述的各种治疗和预防目的的用途，或替代地，本文所述的组合物在制备药物或治疗组合物或用于本文所述的各种治疗和预防目的的组合物中的用途。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法包含各种组分或步骤。然而，在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法基本上由各种组分或步骤组成，其中可以包括其它组分或步骤。在另一个实施方案中，本文公开的组合物和方法由各种组分或步骤组成。
在一些实施方案中，术语“包含”可以涵盖包括本领域已知的影响组合物功效的组合物的其它组分。在一些实施方案中，术语“基本上由……组成”包含一种组合物，其具有表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和凋亡细胞或任何凋亡细胞上清液。然而，可以包括不直接参与组合物的用途的其它组分。在一些实施方案中，术语“由……组成”涵盖一种组合物，其具有在本文所述的任何形式或实施方案中的本文所述的表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和凋亡细胞或凋亡细胞上清液。
本领域技术人员将理解，术语“约”可涵盖与所指示数字或数字范围的0.0001-5％之间的偏差。此外，其可以涵盖与所指示数字或数字范围的1-10％的偏差。此外，其可以涵盖与所指示数字或数字范围最多25％的偏差。
本领域技术人员将理解，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一种物质”或“至少一种物质”可以包括多种物质，包括其混合物。
在整个本申请中，本文公开的各种实施方案可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不灵活限制。因此，应该认为范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围从1到6的描述应视为已明确公开了从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3至6等的子范围，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度均适用这点。
每当在本文指出数值范围时，其意图是包括在所指出的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语在第一指示数字和第二指示数字之间的“范围”以及从第一指示数字到第二指示数字的“范围”在本文中可互换使用，并且旨在包括第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有小数和整数。
提供以下实施例是为了更充分说明本文公开的实施方案。其不应被认为是限制本文的宽范围。
实施例
实施例1：凋亡细胞产生
目的:产生早期凋亡细胞
方法:制备早期凋亡细胞群的方法在国际公开WO 2014/087408和美国申请公开US2015/0275175-A1中详细记录，参见例如实施例之前的方法部分“早期凋亡细胞群制备”和“凋亡细胞的产生”(段落[0223]至[0288]以及实施例11、12、13和14，其全文引入本文)。
图1所示的流程图提供了在产生早期凋亡细胞群的过程中使用的步骤的一个实施方案的概述，其中抗凝剂包括在融化和诱导凋亡步骤中。如在国际公开号WO2014/087408的实施例14和美国申请公开号US US-2015-0275175-A1中详细描述的，制备了早期凋亡细胞群，其中在冷冻时、或者在保温时、或者在冷冻时和在保温时添加了抗凝剂。所用的抗凝剂是柠檬酸右旋糖，NIH配方A(ACD配方A)中补充了10U/ml肝素至终浓度为总体积5％ACD和0.5U/ml肝素。
简而言之：收集细胞，然后通过在冷冻培养基中添加5％抗凝剂柠檬酸右旋糖配方A和10U/ml肝素(ACDhep)进行冷冻。融化，在含有5％ACDhep的凋亡诱导培养基中保温，在封闭系统中进行最终产品制备。
在每个实验中进行凋亡和存活分析、效能测定和细胞群表征。为了建立早期凋亡细胞产品的生产一致性，将初始批次的凋亡细胞的终产品(FP)储存在2-8℃并在t0，t24h，t48h和t72h进行检查。在每个点进行凋亡分析，短效测定(申请人CD14+冷冻细胞)，台盼蓝测量和细胞群表征。对FP进行细胞计数测试以评估在储存和凋亡以及存活分析过程中的平均细胞损失。
上述方法部分和国际公开WO 2014/087408的实施例11及美国专利公开US-2015-0275175-A1提供了在不存在抗凝剂时制备凋亡细胞群的其它实施方案的细节，其全文引入本文。
制备辐照的凋亡细胞的方法：使用类似的方法制备失活的凋亡细胞群，其中单个核早期凋亡细胞群包含降低百分比的非静止非凋亡细胞，或具有任何活的非凋亡细胞的细胞激活被抑制的细胞群，或具有任何活的非凋亡细胞的增殖降低的细胞群，或其任何组合。
简而言之，通过白细胞分离程序从健康的合格供体收集单个核富集的细胞级分。血液分离完成后，洗涤细胞并用包含5％抗凝剂柠檬酸右旋糖溶液-配方A(ACD-A)和0.5U/ml肝素的冷冻培养基重悬。然后将细胞逐渐冷冻并转移至液氮中长期保存。
为了制备辐照的ApoCells，将冻存的细胞融化，洗涤并重悬于凋亡诱导培养基，该培养基包含5％ACD-A、0.5U/ml肝素钠和50μg/ml甲泼尼龙。然后将细胞在5％CO2中于37℃保温6小时。保温结束后，使用细胞处理系统(Fresenius Kabi，德国)将细胞收集、洗涤并重悬于Hartmann溶液中。制造完成后，在放疗单元Hadassah Ein Kerem中使用g相机以4000cGy对ApoCell进行辐照。使用膜联蛋白V和PI(MBL，MA，USA)染色(分别≥40％和≤15％)经流式细胞仪确定ApoCell的凋亡和存活。使用FCS Express软件分析结果。这种辐照的APOcell群被认为包括早期凋亡细胞，其中存在的任何活细胞均具有被抑制的细胞活性和降低的增殖能力或没有增殖能力。在某些情况下，Apocell群没有活的非凋亡细胞。结果：
表3示出在冷冻和保温(凋亡诱导)中包含抗凝剂而生产并且储存在2-8℃的FP的稳定性。
表3:细胞计数*-用MICROS 60血液学分析仪进行
FP时间点 细胞浓度(×10<sup>6</sup>个细胞\ml) ％细胞损失
t0 20.8 NA
t24h 20.0 -3.85
t48h 20.0 -3.85
t72h 19.7 -5.3
*结果代表6个实验。
当在诱导培养基中不包括抗凝剂而制备细胞时，细胞稳定24小时但之后不稳定。使用抗凝剂出人意料地使凋亡细胞群的稳定性延长至少72小时，见表3所示。
表4：台盼蓝测量
FP时间点 台盼蓝阳性细胞(％)
t0 3.0
t24h 5.9
t48h 5.2
t72h 6.5
表4的结果表明FP的存活至少72小时保持高水平。
表5：凋亡分析-(AnPI染色)，使用用流式细胞术进行
Figure BDA0002458147110000961
表5的结果表明，在细胞制备后至少72小时的延长时间段内，凋亡细胞相对于坏死细胞的百分比得以维持，早期凋亡细胞的百分比也是如此。
在冷冻时和诱导凋亡期间均包括抗凝剂导致稳定的早期凋亡细胞的高收率最一致(早期凋亡细胞的平均收率为61.3±2.6％比48.4±5.0％,其中100％收率是基于冷冻时的细胞数)。这一高收率在2-8℃储存24小时后仍得以保持。
接下来在冷冻时或者融化时或者冷冻和融化时包括抗凝剂之间进行了比较，其中测量了回收率(％)以及稳定性。所有群体的凋亡保温混合物中均包含抗凝剂。表6列出了这些研究的结果。
表6：从收集的细胞制备的终产品(FP)的收率和稳定性比较，在冷冻(F)和融化(Tha)期间添加(+)或不添加(–)抗凝剂
Figure BDA0002458147110000971
对在添加和不添加抗凝剂的情况下制备的早期凋亡细胞群(细胞批次)进行的额外群分析比较显示出这些结果的一致性。
表7：使用和不使用抗凝剂制备的批次之间的细胞群分析比较
Figure BDA0002458147110000972
Figure BDA0002458147110000981
在存在或不存在抗凝剂时终产品细胞的百分比(收率).与以上表3所示结果相似，表6中的数据表明与不使用抗凝剂的冷冻细胞相比，由在抗凝剂存在下冷冻的细胞制造的早期凋亡细胞对新鲜终产品(FP t0)的平均收率具有有益效果。有益效果可以在仅冷冻时使用抗凝剂时(61.3±2.6％比48.4±5.0％)，或者在冷冻和融化时均使用抗凝剂时(56.5±5.2％比48.4±5.0％)可见。当仅在融化时使用抗凝剂时，有益效果不太明显(44.0±8.5％比48.4±5.0％)。这些是非高甘油三酯样品。
抗凝剂对聚集的作用.在这3个非高甘油三酯样品或21个其它样品中均未观察到细胞聚集(数据未显示)。但是，在41个其它没有使用抗凝剂制备的非高甘油三酯样品中(数据未显示)，有10个(24.4％)有轻度聚集，而5个(12.2％)有重度聚集。因此，抗凝剂完全避免细胞聚集。
抗凝剂对稳定性的作用.使用或不使用抗凝剂制造的新鲜FP在2-8℃储存24小时以确定在制造过程中添加ACDhep是否会损害FP的稳定性。储存24小时后对细胞取样并计算细胞计数表示的收率。与表3所示的延长时间(长达72小时)的结果相似，表6显示仅在冷冻时(59.8±2.1％比47.5±4.7％)使用或者在冷冻和融化时(56.4±5.3％比47.5±4.7％)均使用抗凝剂，均保持并观察到有益效果。当仅在融化时添加抗凝剂时，有益效果不太明显(42.4±6.1％比47.5±4.7％)。这些都是非高甘油三酯样品。这些结果表明，在所有处理中，FP储存24小时后细胞损失最少，对在冷冻和融化过程中均用抗凝剂处理的细胞具有显著优势。仅在冷冻期间用抗凝剂处理的细胞的平均损失为2.3±3.2％，而不使用抗凝剂为1.9±3.3％，仅在融化时使用抗凝剂为3.0±4.7％，而不使用抗凝剂为1.9±3.3％，当细胞用ACDhep冷冻和融化时用抗凝剂处理的平均细胞损失为0.2±0.4％，不使用抗凝剂时为1.9±3.3％。综上所述，抗凝剂对收率的有益效果保持至少24小时。
表8示出FP的代表性细胞群的特征。
表8：在冷冻(F)和融化(Tha)过程中添加(+)或不添加(–)抗凝剂从收集的细胞制备的新鲜(t0)FP的细胞群的特征*
Figure BDA0002458147110000991
*凋亡诱导用含有抗凝剂的培养基针对所有批次进行。
表8的结果示出在冷冻和融化时使用或不使用抗凝剂制备的终产品(FP)的细胞特征。对批次取样，对单个核标记物染色，并通过流式细胞仪分析确定每个样品中的细胞分布并检查抗凝剂的添加是否影响细胞群。如表7所示，在冷冻或融化时使用或不用抗凝剂制备的细胞群中没有检测到显著差异。处理之间新鲜FP中的平均T细胞群(CD3+细胞)为62.3±1.2％，而冷冻前为62.9±1.1％；处理之间的平均B细胞群(CD19+细胞)为8.3±2.5％，而冷冻前为3.1±0.8％；处理之间的平均天然杀伤细胞群(CD56+细胞)为9.5±0.7％，而冷冻前为12.9±0.5％；处理之间的平均单核细胞群(CD14+细胞)为13.8±0.5％，而冷冻前为17.5±0.3％；以及新鲜FP中的平均粒细胞群(CD15+细胞)为0.0％，而冷冻时为0.35±0.2％。
还检测了早期凋亡细胞群的效能。
表9：在冷冻(F)和融化(Tha)过程中添加(+)或不添加(–)抗凝剂从细胞制备的新鲜(t0)FP的效能分析
Figure BDA0002458147110000992
表9中给出的结果来自效能测定，该测定用于确定每种终产品在用(LPS)刺激后增强未成熟树突细胞(iDC)的致耐受状态的能力。通过评估在与早期凋亡细胞群相互作用和导致LPS上调的不同处理后，iDC上的共刺激分子HLA-DR和CD86表达的下调来确定致耐受作用。分析在DCsign+细胞上进行。结果代表在与早期凋亡细胞群相互作用后以及加入LPS后相对于LPS诱导的成熟的成熟延迟百分比。实验测试了使用或不使用抗凝剂制备的新鲜FP(t0)的效能。表9中给出的结果表明，使用或不使用抗凝剂制备的凋亡细胞以剂量依赖方式增强了两种共刺激标记的耐受作用。
本文产生的早期凋亡细胞来自非高甘油三酯样品。即使在供体血浆中甘油三酯含量高的情况下，也能产生一致的稳定早期凋亡细胞的高收率(例如参见国际公开号WO2014/087408的实施例12和13和美国申请公开号US-2015-0275175-A1)。注意，未将抗凝剂添加到用于配制最终早期凋亡细胞输注剂量的PBS培养基中。
总结
本研究的目的是产生稳定高收率的早期凋亡细胞群。使用抗凝剂的合理性是在甘油三酯高的患者中首先观察到聚集体，而后在相当一部分其它患者中观察到。这里关注的是美国专利US 6,489,311中的公开内容，即使用抗凝剂阻止细胞凋亡。
简言之，当添加抗凝剂时，终产品中收集细胞数显著提高了至少10-20％(收率)，而同时对细胞的组成、存活、稳定性和凋亡性质的影响最小。在这项研究中，收率增加高达13％，这代表在受控条件下收率增加26.8％，而在实际GMP条件下达33％，然后可以在单次收集中产生更高的细胞数增加。这个效果至关重要，因为它可以避免来自供体的第二次血液采血。
这个效果是令人惊讶的，因为预期的影响被预期为轻度聚集的解离。据推测，用抗凝剂解冻细胞会减少聚集体的数量。这些聚集体的形成最终会导致大量细胞损失。洗涤后立即收集且在没有抗凝剂的情况下冷冻的细胞显示在融化时形成聚集体。此外，在没有抗凝剂的情况下冷冻并重新悬浮于含有抗凝剂的培养基中的细胞中也检测到高水平的聚集体。在用均含有抗凝剂的培养基冷冻和重悬的细胞中未观察到聚集体。综上所述，可以得出结论，在冷冻和凋亡诱导过程中添加抗凝剂非常重要，并且看起来未负面影响对细胞群诱导早期凋亡。
为了稳定性目的，例如在2-8℃储存24小时后，进一步测试了早期凋亡细胞的回收率，在此期间，无论制造条件如何，平均细胞损失为3-4.7％，使用含有抗凝剂的培养基进行冷冻和融化的细胞获得了有利结果(FP储存24小时后细胞损失为0.2±0.4％)，提示添加抗凝剂在冷冻和融化过程中至关重要，但一旦最终配制，则早期凋亡细胞群是稳定的。延长的时间点研究表明这种稳定性至少为72小时。
在冷冻和/或融化阶段添加抗凝剂不会显著影响FP产品的凋亡和存活以及细胞组成。对各种特征测得的值相似，表明ACDhep不会改变早期凋亡细胞特征并且终产品符合≥40％凋亡细胞的接受标准。
用于测试凋亡细胞效能的测定基于未成熟树突细胞(iDC)，其特征在于诸如吞噬作用、抗原呈递和细胞因子产生等功能。
HLA-DR(II类MHC)膜分子和共刺激分子CD86被选择用作标记以检测抗原呈递细胞(APC)的致耐受作用。使用流式细胞术，在用LPS刺激后，以及在使用或不使用抗凝剂制备并经LPS刺激的早期凋亡细胞群存在下，测量了iDC上HLA-DR和CD86表达的变化。早期凋亡细胞群以1:2、1:4和1:8的iDC:早期凋亡细胞群的上升比率提供给DC。如表6所示，早期凋亡细胞群以剂量依赖性方式增强刺激的DC的致耐受作用，对于在冷冻和凋亡诱导时均使用抗凝剂制备的早期凋亡细胞群，其结果稍好。
综上所述，得出结论，在冷冻和凋亡培养基中均添加抗凝剂对于提高细胞回收率和避免由于聚集而造成的大量细胞损失以及在许多情况下避免来自供体的第二轮血液分离非常重要。结果表明，所有细胞均符合经过验证的FP的接受标准，表明添加抗凝剂不会损害FP。
实施例2：在体外细胞因子风暴模型中凋亡细胞对细胞因子释放的作用
目的:在巨噬细胞激活综合征的LPS无菌模型中诱导的细胞因子风暴中测试凋亡细胞对细胞因子风暴标记(细胞因子IL-6、IL-10、MIP-1α、IL-8、TNF-α、MIP-1β、MCP-1和IL-9)水平的作用。
方法：
细胞系和培养试剂
人淋巴瘤细胞系Raji(eCACC，UK，登录号85011429)，人宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC，USA，编号：CCL-2)和HeLa-CD19(ProMab，USA，目录号PM-Hela-CD19)在补加10％FBS(Gibco，ThermoFisher Scietific，South America，目录号12657-029)、2mM GlutaMAX(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA，目录号35050-038)和100U/ml青霉素+100U/ml链霉素(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA，目录号15140-122)的RPMI1640(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA，目录号31870-025)(此后称为“完全培养基”)中培养。在标准培养过程中，还向HeLa-CD19培养基中添加1μg/ml嘌呤霉素(Sigma-Aldrich，USA，目录号P9620)作为选择性抗生素。
所有细胞在亚铺满条件下保持。Raji细胞保持在0.3×106-2×106细胞/ml浓度范围内。HeLa和HeLa-CD19细胞在容器充满至90％铺满时传代。
原代单核细胞分离自献血的血沉棕黄层中(Sheba Medical Center,Israel)。首先外周血单个核细胞(PBMC)在Ficoll密度梯度(Ficoll-Paque PLUS,GE Healthcare,UK,目录号17-1440-03)上分离。离心后(800x g,2-8℃,20min.刹车0)，将含有PBMC的中间相转移到新试管中并用补加2mM L-谷氨酰胺(Lonza,Switzerland,目录号BE17-605E)和10mMHepes(Lonza,Switzerland,目录号BE17-737B)的RPMI-1640(Lonza,Switzerland,目录号BE12-918F)(以下称为洗涤培养基)洗涤，离心(650x g,2-8℃,10min.)。沉淀的细胞重悬于“洗涤培养基”中至浓度为15×106细胞/ml。细胞作为0.9ml液滴接种在35-mm平板(Corning,USA,目录号430165)的中央。将平板在加湿培养箱(37℃,5％CO2)中保温1.5h，使单核细胞粘附，然后用预热的PBS(Lonza,Switzerland,目录号BE17-516F)洗涤3次，除去其它细胞类型。洗涤后，将细胞在补加10％FBS(Gibco，ThermoFisher Scietific，SouthAmerica，目录号12657-029)、2mM GlutaMAX(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA，目录号35050-038)和100U/ml青霉素+100U/ml链霉素(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA，目录号15140-122)的2ml RPMI1640(Gibco,ThermoFisher Scientific,USA,目录号31870-025)(称为完全培养基)中培养。
所有细胞系均在和37℃和含有5％CO2的加湿温箱中培养。
简而言之，根据制造商指导，靶细胞(HeLa或HeLa-CD19)单独培养或者与单核细胞一起培养。在靶细胞粘附于平板(6h过夜)后，将培养物暴露于y×106ApoCells细胞1小时，之后用RPMI洗4-5次洗涤这些细胞。在光学显微镜下肉眼证实除去ApoCells细胞。向共培养物中加入10ng/ml LPS(Sigma-Aldrich,USA,目录号L4391)并保温1小时。保温后，通过用RPMI洗涤3-5次除去LPS。以指定的E/T比率加入活CD19-CAR T细胞或者未致敏T细胞，保温4小时。为收集培养基，将平板在250x g、2-25℃(Centrifuge 5810R,Eppendorf,Germany)离心4分钟以沉降细胞。每孔50μl上清液培养基转移到新的平底96孔微平板孔(Corning,USA,目录号3596)并向每孔加入50μl CytoTox 96试剂。平板在室温黑暗下保温30分钟，之后通过每孔加入50μl终止溶液终止反应。用Infinite F50(Tecan,Switzerland)在492nm读取吸光度，用Magellan F50软件捕获。用Microsoft Excel 2010进行数据分析和图形生成。
在用凋亡细胞保温或用来自凋亡细胞的上清液保温后，用Liminex技术进行细胞因子释放分析。
结果:图4A至4H显示在巨噬细胞激活综合征体外模型中被LPS诱导的细胞因子风暴标记物IL-10、IL-6、MIP-1α、IL-8、TNF-α、MIP-1β、MCP-1和IL-9水平显著降低。施用ApoCells至巨噬细胞:Apocell比率1:8导致释放进培养基中的IL-10、IL-6、MIP-1α、IL-8、TNF-α、MIP-1β、MCP-1和IL-9水平显著降低(图4A，4B，4C，4D，4E，4F，4G，4H)，施用ApoCells至巨噬细胞:ApoCell比率1:16实际上抑制或近乎抑制这一模型中细胞因子IL-10、IL-6、MIP-1α、IL-8、TNF-α、MIP-1β、MCP-1和IL-9的释放。
加入凋亡细胞导致巨噬细胞激活中诱导的至少20种促炎细胞因子和趋化因子的抑制，这些结果的一个样品示于图4A-4H。促炎细胞因子和趋化因子释放的共同机制是NF-κB抑制。
促炎细胞因子和趋化因子释放的抑制似乎是特异性的，因为在相似条件下对细胞因子IL-2R(IL-2受体)水平的检查显示，释放的IL-2R水平不受促性细胞因子相同方式的影响(图4I)。以1:4和1:8的比率添加凋亡细胞增加了IL-2R的释放。此外，图4J显示凋亡细胞在24小时时间内对IL-2的释放没有影响。IL-2受体的活化被认为在免疫系统的关键功能包括耐受性中具有重要作用。
结论:在存在癌症和CAR-19的巨噬细胞激活综合征的细胞因子风暴模型中添加早期凋亡细胞导致显著降低甚至令人惊讶地阻止促炎细胞因子例如IL-10、IL-6、MIP-1α、IL-8、TNF-α、MIP-1β、MCP-1和IL-9，同时增加或不影响细胞因子IL-2R水平。因此，这里的结果表明，尽管通过与凋亡细胞一起保温降低了促炎细胞因子，但是与早期凋亡细胞的保温没有以相同方式影响IL-2和IL-2R。因此，T细胞相关细胞因子不受CAR T细胞治疗+凋亡细胞的影响，而先天免疫细胞因子，例如从单核细胞、巨噬细胞和树突细胞释放的那些细胞因子被影响。
实施例3:对CAR-T细胞功效无负面作用的凋亡细胞对细胞因子风暴的作用
目的:测试凋亡细胞或者衍生自凋亡细胞的上清液对细胞因子风暴标记物细胞因子和CAR T细胞对肿瘤细胞功效的作用
方法:
T4+CAR T-细胞
使用据报道在小鼠中诱导细胞因子风暴的实体瘤模型(van der Stegen et al.,2013，同上)。在此模型中，T细胞用靶向一些ErbB二聚体的嵌合抗原受体(CAR)工程化(T4+CAR-T细胞)，这些二聚体在特定实体瘤例如头颈部肿瘤和卵巢癌中通常高度上调。使用CD3微珠从分离自外周血的PBMC中分离T细胞。构建含有所述嵌合T4+受体的载体并将其转导至分离的T细胞中，产生T4+CAR T细胞。对于本文进行的实验，T4+CAR T细胞购自CreativeBiolabs(NY USA)或Promab Biotechnologies(CA USA)。图5示出流式细胞术曲线，其使用抗CD124单克隆抗体验证了4αβ嵌合受体在T4+CAR T细胞的表面表达(Wilkie et al.,同上)。另外，进行PCR程序并验证了载体在转导的T细胞中的存在。
SKOV3-luc细胞
SKOV3-luc卵巢腺癌组织培养细胞购自Cell BioLabs(cat.#AKR-232)。SKOV3-luc高表达ErbB受体，是T4+CAR-T细胞的靶(van der Stegen等，2013，同上)。这些细胞已被进一步操作以组成性表达萤火虫萤光素酶基因，从而可以追踪体外细胞增殖以及体内肿瘤生长和衰退。
凋亡细胞
如实施例1所述制备凋亡细胞。
凋亡细胞上清液
在12孔板中每孔接种八(8)百万个凋亡细胞。24小时后，将细胞离心(290g，4摄氏度，10分钟)。收集上清液并等份在-80度冷冻直至使用。使用不同数量的细胞制备上清液。一些等份含有浓缩的上清液。
单核细胞分离
从得自健康合格供体的外周血/血沉棕黄层使用Ficoll(GE Healthcare,UnitedKingdome)分离PBMC。在RPMI1640(Gibco，Thermo Fisher Scientific，MA，USA)中使细胞达到15×106细胞/ml的浓度，并以0.9ml液滴接种在35mm平板中央(Corning，NY，USA)。然后将平板在37℃于5％CO2中保温1小时。保温结束时，将细胞用PBS(Biological Industries，Beit Haemek，Israel)洗涤3次，使用光学显微镜测定粘附力。然后将细胞与完全培养基(RPMI1640+10％热灭活FBS+1％Glutamax+1％PenStrep，均来自Gibco)保温。
还使用单核细胞分离的另外方法，其中通过密度梯度离心从肝素化外周血中分离人单个核细胞。然后通过磁珠分离(Miltenyi Biotec.,Auburn，CA，USA)阳性选择单核细胞作为CD14+级分，通过阳性选择B细胞作为CD22+级分，并通过阴性选择T细胞作为CD14-CD22-级分，将分离的单个核细胞分为单核细胞、B细胞和T细胞群。单核细胞的纯度大于95％。
对于巨噬细胞分化，在粘附结束时将细胞用PBS洗涤3次，然后与RPMI1640+1％Glutamax+1％PenStrep和10％热灭活人AB血清(Sigma，MO，USA)保温。将细胞在37℃和5％保温7-9天，在第3天和第6天更换培养基。经光学显微镜通过形态学确定分化。
来自apo+单核细胞的上清液
CD14+单核细胞与上述制备的凋亡细胞以1:16的比率培养24小时。单核细胞数是：在12孔板中每孔50万个细胞，凋亡细胞数是在12孔板中每孔800万个细胞。保温24小时后，离心细胞(290g，4摄氏度，10分钟)。收集上清液并等份在-80度冷冻直至使用。可以以不同比率的单核细胞:凋亡细胞和/或使用其它细胞来源如巨噬细胞和树突细胞进行类似程序。
体外培养条件
通过将SKOV3-luc癌细胞与凋亡细胞或凋亡上清液保温1小时，然后与T4+CAR T细胞(+/-单核细胞-巨噬细胞)共培养48小时来进行初始实验。
为了模拟体内条件，用200nM(123.4ng/ml)佛波醇肉豆蔻乙酸酯(PMA)分化1×105THP-1细胞/ml(HTCC USA)或单核细胞或巨噬细胞或树突细胞72小时，然后在没有PMA的完全培养基中再培养24小时。接下来，将癌细胞或肿瘤细胞–例如SKOV3-luc细胞以5×105SKOV3-luc细胞/孔的量铺板在24孔板中分化的THP-1细胞上。在初步培养癌细胞或肿瘤细胞之后，将4×105-8×105凋亡细胞(ApoCell)加入培养物中1-3h以诱导免疫耐受环境。对于每种细胞类型，将优化癌细胞与ApoCell的比率。洗涤后，用10ng/ml LPS处理共培养物，然后添加1×106T4+CAR T细胞(或通过效应物/靶(E/T)比率图确定的数量)。肿瘤细胞和T4+CAR T细胞的比率会变化，以便针对每种肿瘤或癌细胞类型生成效应物/靶(E/T)比率图。
为了测定SKOV3癌细胞细胞毒性，在48小时保温期之后制备裂解物并测定萤光素酶活性。进行其它实验，测定其它癌细胞类型的癌症或肿瘤细胞细胞毒性并在48小时保温时间内间隔进行。或者，使用Promega的CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega,cat#G1780)。
裂解物制备
通过用PBS洗涤SKOV3-luc单层以去除任何残留血清并添加70μl CCLR裂解缓冲液×1/孔(24孔板)来制备SKOV3-luc细胞裂解物。通过对孔底进行物理刮除，进一步提高脱落。涡旋15秒后，将裂解物在4℃以12,000g离心2分钟。收集上清液并储存在-80℃。
体外荧光素酶活性
为了检测培养的SKOV3-luc细胞中的荧光素酶活性，使用荧光素酶测定系统(Promega，cat.#E1501)。使用QuantiLum重组荧光素酶(Promega，cat.#E170A)，用荧光光度计读数器(Core Facility,Faculty of Medicine,Ein Kerem,Hebrew University ofJerusalem)对该试剂盒进行校准。612ag-61.2μg(10-20-10-9摩尔)用于确定检测范围并遵循制造商的指导。简而言之，将20μl体积的每个rLuciferase量放置在黑色96孔板(Nunc)的孔中。每个数量一式三份进行。将100μl LAR(来自Luciferase Assay System kit的荧光素底物)添加到每个孔中并在暴露10秒后立即读取。
为了读取荧光素酶活性，将裂解物在冰上解冻并将20μl样品置于黑色96孔板(Nunc)中。每个样品一式两份读取。加入100μl LAR，每2.5分钟读取暴露10秒钟的发光共25分钟，接下来10分钟每40秒读取。
细胞因子分析
进行IL-2、IL-2受体(IL-2R)、IL-6、IL-1α、IL-4、IL-2、TNF-α的初始测定。为测定IL-2、IL-2受体(IL-2R)、IL-6、IL-1α、IL-4、IL-2、TNF-α及其它细胞因子的细胞因子释放降低，收集上清液并用Luminex MagPix读数器和ELISA测定检查选择的细胞因子。
结果：
SKOV3-luc生长
使用荧光素酶活性作为指标追踪SKOV3-luc生长，以确定在将来实验中的靶SKOV3-luc细胞数。将3.8×104-3.8×105SKOV3-luc细胞/孔铺板于24孔板(Corning)中，每天监测荧光素酶活性3天。铺板后两天，铺板1.9×105个细胞/孔或更高的细胞数达到铺满并呈现由荧光素酶活性指示的生长饱和(图6)。注意在铺板后三天，3.8×104-1.1×105SKOV3-luc细胞/孔仍处于线性或指数生长期(图6，橙色，青绿色和紫色)。阴性对照(无LAR底物的3.8×105SKOV3-luc细胞)仅显示背景水平读数，表明来自SKOV3-luc细胞的生物发光读数是荧光素酶活性产生的。
T4+CAR-T细胞抗SKOV3-luc肿瘤细胞的活性的验证
为证实T4+CAR-T细胞活性，将SKOV3-luc单层暴露于1,000,000(1百万)个T4+CAR-T细胞或1,000,000(1百万)个未转导的T细胞。保温24小时后，与未转导的T细胞对照相比，T4+CAR-T细胞使SKOV3-luc增殖降低了30％(图7)，表明T4+CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
单独T4+CAR-T细胞抗SKOV3-luc肿瘤细胞的活性与暴露于凋亡细胞后的活性进行比较
测试凋亡细胞(ApoCell)和凋亡细胞上清液(ApoSup和ApoMon Sup)以确定它们是否干扰T4+CAR-T细胞的抗肿瘤活性。将SKOV3-luc肿瘤细胞与凋亡细胞保温1小时，然后添加T4+CAR-T细胞(500,000，五十万个)或T4+非转导T细胞(500,000，五十万个)(T4+CAR-T细胞与凋亡细胞比率为1:2)。然后将肿瘤细胞/凋亡细胞/T4+CAR T细胞共培养48小时。将对照SKOV3-luc肿瘤细胞与T4+CAR-T细胞和Hartman溶液(凋亡细胞的运载体)共培养48小时，但不添加凋亡细胞。
结果显示在保温48小时后，T4+CAR-T细胞抗肿瘤活性优于与未转导T细胞的保温。用凋亡细胞或凋亡细胞上清液进行类似保温。出人意料的是，暴露于或未暴露于凋亡细胞或凋亡细胞上清液，T4+CAR T细胞抗肿瘤活性均相当。(图8)
凋亡细胞对由CAR-T治疗引起的细胞因子风暴的改善、降低或抑制
接下来检查凋亡细胞降低细胞因子风暴的作用。IL-6是在细胞因子风暴中释放的原型促炎细胞因子(Lee DW et al.(2014)Blood 124(2):188-195)，通常用作细胞因子风暴应答的标记。
建立培养物以模拟体内CAR T细胞治疗环境。在人单核细胞-巨噬细胞和T4+CAR T细胞的存在下培养SKOV3-luc肿瘤细胞。在培养基中测得的II-6浓度约为500-600pg/ml。IL-6的这种浓度代表细胞因子风暴。
出乎意料的是，在肿瘤细胞先前已与凋亡细胞保温1小时(T4+CAR-T细胞与凋亡细胞比率为1:2)的SKOV3-luc肿瘤细胞、人单核细胞-巨噬细胞、T4+CAR-T细胞的培养基中测量的IL-6水平大幅下降。类似地，在肿瘤细胞先前已与凋亡细胞上清液保温1小时的SKOV3-luc肿瘤细胞、人单核细胞-巨噬细胞、T4+CAR-T细胞的培养基中测量的IL-6水平也大幅降低。IL-6浓度的这种降低代表细胞因子风暴的减少(图9)。
结论是，出乎意料地，凋亡细胞和凋亡上清液没有消除CAR-T细胞对肿瘤细胞增殖的作用，而同时其下调了促炎细胞因子如被描述为导致发病的主要细胞因子的IL-6。
使用更大范围细胞因子的分析
为进一步评估对可能更大范围和水平的细胞因子的作用，所述细胞因子在实验过程中没有产生但是在人细胞因子风暴期间在临床环境中确实出现，将LPS(10ng/ml)添加到上述的SKOV3-luc培养条件中。添加LPS预期指数增加细胞因子风暴水平。如所预期，添加LPS增加细胞因子风暴效应，结果IL-6水平增加至约30,000pg/ml。已知在细胞因子风暴期间高水平表达的其它细胞因子显示升高的水平，例如：TNF-α(250-300pg/ml)，IL-10(200-300pg/ml)，IL1-α(40-50pg/ml)和IL-18(4-5pg/ml)。如图10所示，即使在细胞因子风暴的指数状态下，暴露于凋亡细胞也将IL-6水平大幅降低至临床所见的几乎正常水平，而在CART细胞实验程序中并不总是如此。这一作用在其它促炎细胞因子TNF-α、IL-10、IL1-α、IL-1β和IL-18中是类似的，它们显示20-9％的降低。当使用凋亡细胞上清液代替凋亡细胞时发现类似结果。
凋亡细胞对IL-2和IL-2R的作用
在将SKOV3-luc细胞与T4+CAR T细胞保温后，测量培养上清液中的IL-2浓度为1084pg/ml。出人意料的是，当将SKOC3-luc细胞首先与凋亡细胞保温，然后与T4+CAR T细胞保温时，IL-2的浓度增加到1190pg/ml。类似地，SKOV3-luc细胞与T4+CAR T细胞保温后，培养上清液中测量的IL-2R浓度为3817pg/ml。令人惊讶地，当先将SKOC3-luc细胞与凋亡细胞保温，然后与T4+CAR T细胞保温时，IL-2R的浓度增加至4580pg/ml。在单独SKOV3-luc中，IL-2的浓度为3.2pg/ml，加入凋亡细胞后，其浓度为10.6pg/ml。在单独SKOV3-luc中，IL-2R的浓度为26.3pg/ml，加入凋亡细胞后，其浓度为24.7pg/ml。
结论
已经记录了CAR-T细胞治疗在大量患者中引起细胞因子风暴。这些结果表明，凋亡细胞和凋亡细胞上清液出人意料地减少了细胞因子风暴细胞因子标记，而不影响CAR-T细胞抗肿瘤细胞的功效。而且，看起来凋亡细胞增加了细胞因子IL-2，其可以通过维持或增加CAR T细胞增殖来延长CAR T细胞治疗的持续时间。
实施例4：凋亡细胞治疗防止施用CAR T细胞治疗的小鼠中的细胞因子风暴
目的：在实体瘤模型(SKOV3卵巢腺癌)中测试凋亡细胞或凋亡细胞上清液的体内作用，以确定T4+CAR T细胞功效和细胞因子风暴标记细胞因子的水平。
材料和方法
体外研究
体外方法，包括制备、培养和分析结果以及与使用识别ErbB靶抗原的T4+CAR T细胞(在本文称为“T4+CAR T细胞”)有关的方法，SKOV3-luc细胞，凋亡细胞，凋亡上清液，单核细胞，巨噬细胞和各种测定方法均在上文实施例1中已描述。本实施例使用相同方法。
体内研究
小鼠
从Harlan(以色列)购买了7-8周龄SCID-beige小鼠和NSGS小鼠并保存在SharettInstitute的SPF动物设施中。
通过在PBS中经腹膜内或者在200ml Matrigel(BD Biosciences)中经皮下给SCIDbiege小鼠或NSGS小鼠接种SKOV3-luc肿瘤细胞(1×106或2×106)。在注射后约14-18天，通过生物发光成像(BLI)确认肿瘤植入，并且在T细胞施用之前将小鼠分为具有相似信号强度的组。
小鼠在施用T4+CAR T细胞之前24小时或在施用T4+CAR T细胞同时(10-30×106T4+CAR T细胞)接受30×106个凋亡细胞。肿瘤生长通过生物发光成像(BLI)进行追踪，循环细胞因子水平通过Luminex确定。
体内萤光素酶测定
每周通过萤火虫萤光素酶活性监测肿瘤生长。简言之，腹膜内注射3mg D-萤光素(E1605，Promega，USA)/小鼠(100μl的30mg/ml D-萤光素)到异氟烷麻醉的小鼠中，注射后10分钟使用IVIS Imaging System和Live Image图像捕获软件(均来自美国Perkin Elmer)获取腹部图像。
通过在D-萤光素注射“自动”选项5分钟后对接受0.5×106SKOV3-luc细胞/小鼠的小鼠成像，为每个图像时段选择图像采集参数。捕获参数设置为使用24x镜头，分4档，F/光圈1.2和2-4分钟曝光。使用Live Image软件进行数据分析和量化并使用Microsoft的Excel程序生成图形。
体内细胞毒性
为评估T细胞的体内毒性，从小鼠收集器官，福尔马林固定，进行组织病理学分析。
细胞因子分析
如制造商所述，使用Luminex MagPix读数器和/或ELISA试剂盒，细胞计数珠阵列(Th1/Th2/Th17；BD Biosciences)分析上清液和血清。例如，分析可以针对促炎细胞因子，在一种情况下为IL-6，尽管在一些实施方案中，本文中可以分析表1和表2中所列或本领域已知的任何细胞因子。
结果
在体内校准SKOV3-luc肿瘤
将0.5×106、1×106或4.5×106SKOV3-luc细胞经腹膜内注射进SCID beige小鼠，每周进行生物发光成像(BLI)以跟踪肿瘤生长，如方法中所述(数据未示出)。
小鼠临床评分
小鼠在最初4周内未显示临床症状。但是，在注射SKOV3-luc后28天，接受高剂量(4.5×106；紫色线)的小鼠开始稳步丧失体重(图11A)，小鼠的整体外观恶化，表现为嗜睡、异常步态和全身活动丧失。该组在第39天被淘汰，并进行腹部尸检以暴露肿瘤外观和大小(图11B)。SKOV3-luc肿瘤大，坚实，血管化，并显示出发白发亮的颜色。一个大肿瘤占据腹腔尾部或延髓部在注射侧(左)。该肿瘤大约占腹腔的25-75％，明显压迫并干扰肠道。在腹腔内的各个位置也观察到较小病灶。肿瘤被包含在腹腔内，在任何小鼠的身体任何其它部位均未观察到其它肿瘤。接受低剂量(0.5×106)或中等剂量(1×106)SKOV3-luc的小鼠在注射SKOV3-luc后40天停止增重并开始稳步丧失体重。在注射SKOV3-luc 50天后终止实验。
SKOV3-luc肿瘤动力学
注射PBS以作为SKOV3-luc细胞对照，在整个实验中这些小鼠没有表现出任何萤光素酶活性(图12，左侧)。肿瘤检测和生长是剂量依赖的。较低剂量(0.5×106SKOV3-luc细胞)在注射后25天开始显示肿瘤(4/5动物)，中等剂量(1×106)注射在注射后18天显示肿瘤(4/5动物)，而较高剂量(4.5×106)在3/5动物中，最早在注射后11天就检测到肿瘤，到第18天，所有动物均显示出良好建立的肿瘤(图12和图13A-13D)。
CAR T-细胞治疗诱导细胞因子释放综合征
给三组无肿瘤小鼠以及具有肿瘤的小鼠施用增加剂量的T4+CAR T细胞(3×106、10×106或30×106)(腹膜内或直接至肿瘤)。在最高剂量下，无肿瘤小鼠和具有肿瘤的小鼠在24小时内表现出抑制行为(subdued behavior)、竖毛和行动减少，伴随着体重迅速减轻，随后在48小时内死亡。在给予最高剂量的CAR T细胞的小鼠血样中至少可检测到人干扰素-γ和小鼠IL-6。接受针对不同肿瘤抗原的高剂量CAR T细胞的动物未表现出体重减轻或行为改变。
施用凋亡细胞抑制或降低CAR T细胞治疗诱导的细胞因子释放综合征的发生
一组被给予最高剂量CAR T细胞的小鼠同时被施用2.10×108/kg凋亡细胞，先前已证实这个剂量是安全有效的剂量。接受人CAR T+凋亡细胞的小鼠具有显著降低的小鼠IL-6水平，较低的体重减轻和降低的死亡率。
实施例5：组合免疫治疗对体外弥漫性肿瘤模型的作用
目的:在癌症广泛分布且未局限(localized)或限制(confined)的弥漫性肿瘤模型中，测试凋亡细胞或凋亡细胞衍生的上清液的作用，以确定CAR T细胞对癌细胞的功效以及细胞因子风暴标记细胞因子的水平。
方法：
CD19+T4+CAR T-细胞(“CD19+CAR T-细胞”)
CD19特异性CAR-T细胞购自ProMab(Lot#012916)。所述T细胞对于CAR呈30％阳性(根据制造商FACS数据-Fab染色)。简言之，在AimV+5％热灭活FBS中解冻细胞，离心(300g，5分钟，室温)，重悬于Aim V。在实验的第6天，每只小鼠静脉内注射20×106个细胞(70％膜联蛋白PI阴性，其中30％CAR阳性)。
表达CD19的重组HeLa细胞用作在其细胞表面也表达CD19的对照细胞类型。
CD123+CAR T-细胞
T4+CAR T细胞还用靶向CD123表位的CAR工程化(本文称为“CD123+CAR T细胞”)
Raji细胞,表达CD19的HeLa细胞和表达CD123的白血病细胞
Raji细胞购自ECACC(目录号:85011429)，并在完全培养基(补加10％H.I.FBS，1％Glutamax,1％青霉素/链霉素的RPMI-1640)中常规培养，保持在3×105–3×106细胞/ml的浓度。在实验第1天，每只小鼠静脉内注射0.1×106个细胞。
类似地，在实验室中产生表达CD19的HeLa细胞并用作CD19+CAR T细胞的靶。表达CD123的白血病细胞将用作CD123+CAR T细胞的靶。此外，原代癌细胞被用作CAR T细胞的靶。
用现有技术中已知的方法制备表达CD19的HeLa细胞。如现有技术公知那样培养细胞。
CD123是膜生物标记和血液系统恶性肿瘤的治疗靶。如本领域已知的那样培养表达CD123的白血病细胞，例如白血病母细胞和白血病干细胞。
凋亡细胞、凋亡细胞上清液和单核细胞分离如实施例1所述制备。所产生的早期凋亡细胞是至少50％膜联蛋白V阳性和小于5％PI阳性细胞。
巨噬细胞通过粘附从CD14阳性细胞产生。
树突细胞是CD14衍生的在IL4和GMCSF存在下生长。
流式细胞术.使用下述抗体：hCD19-PE(eBiosciences,目录号12-0198-42)；mIgG1-PE(eBiosciences,目录号12-0198-42)；hCD3-FITC(eBiosciences,目录号11-0037-42)；mIgG2a-FITC(eBiosciences,目录号11-4724-82)。使用FACS Calibur,BD进行采集。
未致敏T细胞.未致敏T细胞使用磁珠(BD)从血沉棕黄层分离，并在90％人AB血清和10％DMSO中冻存。解冻和注射与CAR-T细胞相同。
体外培养条件
细胞系和培养试剂
人淋巴瘤细胞系Raji(eCACC，UK，登录号85011429)，人宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC，USA，编号：CCL-2)和HeLa-CD19(ProMab，USA，目录号PM-Hela-CD19)在补加10％FBS(Gibco，ThermoFisher Scietific，South America，目录号12657-029)、2mM GlutaMAX(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA,目录号35050-038)和100U/ml青霉素+100U/ml链霉素(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA，目录号15140-122)的RPMI 1640(Gibco，美国ThermoFisher Scientific，目录号31870-025)(此后称为“完全培养基”)中培养。在标准培养过程中，还向HeLa-CD19培养基中添加1μg/ml嘌呤霉素(Sigma-Aldrich，USA，目录号P9620)作为选择性抗生素。
所有细胞在亚铺满条件下保持。Raji细胞保持在0.3×106-2×106细胞/ml浓度范围内。HeLa和HeLa-CD19细胞在容器充满至90％铺满时传代。
原代单核细胞分离自献血的血沉棕黄层(Sheba Medical Center,Israel)。首先，在Ficoll密度梯度(Ficoll-Paque PLUS,GE Healthcare,UK,目录号17-1440-03)上分离外周血单个核细胞(PBMC)。离心后(800x g,2-8℃,20min.刹车0)，将含有PBMC的中间相转移到新试管中并用补加2mM L-谷氨酰胺(Lonza,Switzerland,目录号BE17-605E)和10mMHepes(Lonza,Switzerland,目录号BE17-737B)的RPMI-1640(Lonza,Switzerland,目录号BE12-918F)(以下称为洗涤培养基)洗涤，离心(650x g,2-8℃,10min.)。沉淀的细胞重悬于“洗涤培养基”中至浓度为15×106细胞/ml。细胞以0.9ml液滴接种在35-mm平板(Corning,USA,目录号430165)的中央。将平板在加湿培养箱(37℃,5％CO2)中保温1.5h，使单核细胞粘附，然后用预热的PBS(Lonza,Switzerland,目录号BE17-516F)洗涤3次，除去其它细胞类型。洗涤后，将细胞在补加10％FBS(Gibco，ThermoFisher Scietific，South America，目录号12657-029)、2mM GlutaMAX(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA,目录号35050-038)和100U/ml青霉素+100U/ml链霉素(Gibco，ThermoFisher Scientific，USA，目录号15140-122)的2ml RPMI 1640(Gibco,ThermoFisher Scientific,USA,目录号31870-025)(称为完全培养基)中培养。
所有细胞系均在37℃和含有5％CO2的加湿温箱中培养。
CD19-CAR T细胞(ProMab,USA,目录号FMC63)在AIM-V培养基中或冷冻输送。用于体外实验的冻存的CAR T细胞在实验当天在35-38℃水浴中解冻，立即浸入预热的补加5％FBS(Gibco,South America,目录号12657-029)的AIM V培养基(Gibco,ThermoFisherScientific,USA,目录号12055-091)中。离心细胞(300x g,室温,5min.)并重悬于预热的AIM V培养基中而除去DMSO。CD19-CAR+细胞群的浓度和存活力通过用FACSCalibur流式细胞仪(BD,USA)读取经抗FLAG(BioLegend,USA,目录号637310)染色及膜联蛋白V和PI染色(MEBCYTO Apoptosis kit,MBL,USA,目录号4700)而确定。
对于未致敏T细胞分离，在Hadassah Medical Center(Ein Kerem Campus,Jerusalem,Israel)根据Leaukapheresis Unit的SOP使用Cobe Spectra TM采血仪(GambroBCT,USA)从知情同意的合格供体中收集的白细胞分离级分中提取PBMC，或者从加样在Ficoll密度梯度上并在800x g 2-8℃离心20分钟的血沉棕黄层(Sheba Medical Center,Israel)提取PBMC。根据制造商指导用MagniSort Human CD3 Positive Selection Kit(eBioscience,USA,目录号8802-6830-74)从阳性级分分离T细胞。T细胞冻存在含有20％FBS(Gibco,ThermoFisher Scietific,South America,目录号12657-029)和5％DMSO(CryoSure-DMSO,WAK-Chemie Medical GmbH,Germany,目录号WAK-DMSO-70)的“完全培养基”(如上定义)中，在实验当天与CD19-CAR T细胞平行解冻。
LDH细胞毒性测定
乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的细胞溶质酶，其以相关联方式由经历裂解的细胞释放。因此，培养基中的LDH水平可用于定量细胞毒性活性。CytoTox 96非放射性细胞毒性测定(Promega,USA,目录号G1780)是用于定量培养基中LDH水平的比色测定法。将过量的四唑盐底物(碘硝基-四唑紫，INT)引入培养基中，LDH将该底物转化为红色的甲月替(formazan)产物。形成的红色的量与裂解的细胞数成正比。
简言之，根据制造商指导，靶细胞(HeLa或HeLa-CD19)单独培养或者与单核细胞一起培养。在靶细胞粘附于平板(6h过夜)后，将培养物暴露于y×106ApoCells细胞1小时，之后用RPMI洗涤4-5次洗脱这些细胞。在光学显微镜下肉眼证实除去ApoCells细胞。向共培养物中加入10ng/ml LPS(Sigma-Aldrich,USA,目录号L4391)并保温1小时。保温后，通过用RPMI洗涤3-5次除去LPS。以指定的E/T比率加入活CD19-CAR T细胞或者未致敏T细胞并保温4小时。为收集培养基，将平板在250x g,2-25℃离心4min(Centrifuge 5810R,Eppendorf,Germany)以沉降细胞。每孔50μl上清液培养基转移到新的平底96孔微滴板孔(Corning,USA,目录号3596)并向每孔加入50μl CytoTox 96试剂。平板在室温黑暗中保温30分钟，之后通过每孔加入50μl终止溶液终止反应。用Infinite F50(Tecan,Switzerland)在492nm读取吸光度并用Magellan F50软件捕获。用Microsoft Excel 2010进行数据分析和图形生成。
流式细胞术细胞毒性测定
HeLa-CD19(靶)和HeLa(对照)细胞用5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE,LifeTechnologies,USA,目录号C1157)预染色，混合在一起，铺板于新鲜平板或者填充分离的原代单核细胞的平板上。在靶细胞粘附于平板(6h过夜)后，将培养物暴露于y×106ApoCells细胞1小时。平板用RPMI洗涤3-5次，肉眼证实重悬的ApoCells细胞被洗掉。向共培养物中加入10ng/ml LPS并保温1小时，之后通过用RPMI洗涤3-5次除去LPS。然后如所示以特异的E/T比率向共培养物中加入活CD19-CAR T细胞并保温4小时。保温后，通过加入胰蛋白酶-EDTA(Biological Industries,Israel,目录号03-052-1B)并在37℃保温4分钟而收获细胞。为终止酶活性，添加了2-4倍体积的“完全培养基”。收集细胞，以200x g在室温离心5分钟，重悬于100μl RPMI(Gibco,ThermoFisher Scientific,USA,目录号15140-122)。首先针对抗CD19染色(eBioscience,USA,目录号12-0198-42)，在黑暗中于室温保温30分钟。离心(290xg，1分钟，2-8℃)并重悬于300μl RPMI后，将细胞针对抗7AAD(eBioscience,USA,目录号00-6993-50)进行染色。对7ADD阴性细胞(活细胞)进行门控分析，计算活靶细胞(HeLa-CD19)和活对照细胞(HeLa)。通过将活靶细胞百分比除以活对照细胞百分比来计算存活百分比。为校正起始细胞数和自发靶细胞死亡的差异，将存活百分比除以靶细胞百分比与不含效应细胞(CD19-CAR T细胞)培养的对照细胞百分比的比值。最后，细胞毒性百分比通过从100％减去校正的存活百分比而确定2。
通过将Raji癌细胞与CD19+CAR T细胞(+/-单核细胞-巨噬细胞)保温48小时来进行初始实验，以确定CD19+CAR T细胞与靶Raji癌细胞的最佳比率，在96孔板中从5×104Raji细胞/孔开始。基于结果构建效应物/靶(E/T)比率平板。
通过将Raji癌细胞与凋亡细胞或凋亡上清液一起保温1小时，然后与CD19+CAR T细胞(+/-单核细胞-巨噬细胞)共培养48小时，进行组合免疫治疗实验。
为模拟体内条件，用200nM(123.4ng/ml)乙酸佛波醇肉豆蔻酸酯(PMA)将1×105THP-1细胞/ml分化72小时，然后将其在不含PMA的完全培养基中培养另外24小时。接下来，将Raji癌细胞以5×105Raji细胞/孔铺板于24孔板中的分化THP-1细胞上。
在最初培养Raji癌细胞之后，将4×105-8×105凋亡细胞(ApoCell)加入培养物中1-3h以诱导免疫耐受环境。对于每种细胞类型，优化癌细胞与ApoCell的比例。洗涤后，基于E/T比率图用预定数目的CD19+CAR-T细胞处理共培养物。在一些实验中，在添加CD19+CAR T细胞之前，将10ng/ml LPS添加到培养基中。在其它实验中，在添加CD19+CAR T细胞之前，将干扰素γ(IFN-γ)添加到培养基中。添加LPS或IFN-γ预期指数增加细胞因子风暴水平。
为测定Raji癌细胞细胞毒性，在48小时保温期之后，制备裂解物并测定存活力。在48小时保温期内间隔进行另外的实验，测定Raji细胞细胞毒性。或者，使用Promega的CytoTox 96非放射性细胞毒性测定法(Promega,目录号G1780)。
用表达CD19的HeLa细胞和CD19+CAR T细胞进行类似实验。
用表达CD123的白血病细胞和CD123+CAR T细胞进行类似实验。
细胞因子分析
初始细胞因子测定检查培养物上清液中MIP1a、IL-4、IL-2、IL-2R、IL-6、IL8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、INF-γ、GMCSF、TNF-α的水平。
额外的细胞因子测定检查细胞因子IL-10、IL-1β、IL-2、IP-10、IL-4、IL-5、IL-6、IFNα、IL-9、IL-13、IFN-γ、IL-12p70、GM-CSF、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、IL-17A、IL-15/IL-15R或IL-7或其任意组合的水平。
建立培养物以模拟体内CAR T细胞治疗环境。Raji Burkett淋巴瘤细胞在不添加或添加凋亡细胞时在人单核细胞-巨噬细胞、LPS和CD19+CAR T细胞存在下培养。
Raji细胞在单核细胞和LPS存在下保温，随后添加未致敏T细胞(Raji+未致敏T)、CD19+CAR T细胞(Raji+CAR T)、CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)，CAR T细胞:ApoCells比率为1:8(Raji+CAR T+ApoCell 1:8)，CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)比率为1:32的CAR T细胞:ApoCells(Raji+CAR T+ApoCell 1:32)，以及CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)比率为1:64的CAR T细胞:ApoCells(Raji+CAR T+ApoCell 1:64)。根据GM-CSF和TNF-α(TNF-a)进行浓度测量。
为测定IL-6、IL-8和IL-13以及其它细胞因子的细胞因子释放降低，收集上清液并使用Luminex MagPix读数器和ELISA测定检查选择的细胞因子。细胞因子(小鼠或人的)可以通过Luminex技术使用MAPIX系统分析仪(Mereck Millipore)和MILIPLEX分析软件(Merek Millipore)评估。通过Quantikine ELISA(R&D systems)评估了小鼠IL-6Rα、MIG(CXCL9)和TGF-β1。
组织分析
使用流式细胞术和免疫组织化学评估骨髓和肝脏。处死后，收集肝和骨髓用于组织病理学分析。在室温下将组织在4％福尔马林中固定48小时，然后送至希伯来大学的动物设施进行加工。在加工之前将骨脱钙。石蜡切片用苏木精和曙红以及CD19染色。
IFN-γ作用
IFN-γ作用通过STAT1磷酸化和生物学产物进行评估。
结果：
校准用于细胞毒性测定的细胞数
为确定体外模型中使用的Raji细胞数，评估了细胞毒性测定的灵敏性限度。将5×104-20×104Raji细胞/孔一式四份铺在96孔板中。对一组一式四份进行裂解以与仍完全存活的细胞进行比较。裂解是瞬时的，在离心之前立即添加裂解液以模拟部分细胞细胞毒性。确实，所有细胞数量均显示出远高于活细胞的读数，其中5×104细胞数产生最大相对读数(图14；数据外推)。因此，除非实验设计另有要求，否则后续实验将使用此细胞数作为默认值。
验证CD19+CAR-T细胞抗Raji Burkett淋巴瘤细胞的活性
为证实CD19+CAR T细胞活性，将Raji癌细胞的单层暴露于1,000,000(1百万)个CD19+CAR T细胞或1,000,000(1百万)个未转导的T细胞。保温24小时后，CD19+CAR T细胞降低Raji癌细胞增殖，显示出CD19+CAR T细胞的抗肿瘤活性。
单独CD19+CAR-T细胞对Raji Burkett淋巴瘤细胞的活性与暴露于凋亡细胞后的活性进行比较
测试凋亡细胞(ApoCell)和凋亡细胞上清液(ApoSup和ApoMon Sup)以确定它们是否干扰CD19+CAR-T细胞抗肿瘤活性。将Raji Burkett淋巴瘤细胞与凋亡细胞保温一小时，然后添加CD19+CAR-T细胞(500,000，五十万个)或CD19+非转导T细胞(500,000，五十万个)(CD19+CAR-T细胞与凋亡细胞比例为1:2)。然后将肿瘤细胞/凋亡细胞/CD19+CAR T细胞共培养48小时。将对照Raji Burkett淋巴瘤细胞与CD19+CAR-T细胞和Hartman溶液(凋亡细胞的运载体)共培养48小时，但不添加凋亡细胞。
结果显示，保温48h后，CD19+CAR-T细胞抗肿瘤活性优于与未转导的T细胞保温。用凋亡细胞上清液进行类似保温。令人惊讶地，暴露或未暴露于凋亡细胞或凋亡细胞上清液，CD19+CAR T细胞抗肿瘤活性是相当的。
在体外观察到，在存在或不存在凋亡细胞时，对于CAR T的相当的E/T比率结果而言，凋亡细胞对CAR修饰的T细胞抗CD19没有负面影响。
验证CD19+CAR-T细胞抗HeLa白血病细胞的活性
HeLa细胞是表达CD19的特异细胞，这使其对CAR CD19+T细胞活性敏感。此外，与非粘附细胞系Raji细胞相反，HeLa细胞是粘附的。
为证实CD19+CAR T细胞活性，将单层HeLa癌细胞暴露于1,000,000(1百万)个CD19+CAR T细胞或1,000,000(1百万)个未转导的T细胞。保温24小时后，CD19+CAR T细胞降低HeLa癌细胞增殖，显示出CD19+CAR T细胞的抗肿瘤活性(图15CD19++RPMI和CD19++CAR T-19细胞)。
比较单独CD19+CAR-T细胞抗CD19+HeLa细胞的活性与暴露于凋亡细胞后的活性
测试凋亡细胞(ApoCell)以确定它们是否干扰CD19+CAR-T细胞抗肿瘤活性。将HeLa细胞与凋亡细胞保温一小时，然后添加CD19+CAR-T细胞(500,000，五十万个)或CD19+非转导T细胞(未致敏T细胞，500,000，五十万个)(CD19+CAR-T细胞与凋亡细胞比例为1:2)。然后将肿瘤细胞/凋亡细胞/CD19+CAR T细胞共培养48小时。将对照HeLa细胞与CD19+CAR-T细胞和RPMI(凋亡细胞的运载体)共培养48小时，但不添加凋亡细胞。CD19+CAR-T细胞:HeLa细胞比率(E/T比率)范围为5-20(图15)。
图15显示，保温48小时后，CD19+CAR-T细胞抗肿瘤活性优于与未转导的T细胞(未致敏细胞)或单独缓冲液保温。用凋亡细胞进行类似保温。令人惊讶地，在暴露或未暴露于凋亡细胞的情况下，CD19+CAR T细胞抗肿瘤活性是相当的。使用凋亡细胞上清液进行类似实验。图15显示在添加或不添加ApoCell的情况下，CAR T-CD19治疗具有相同的体外细胞毒性作用。
在存在或不存在凋亡细胞的情况下，在相当的E/T比下，未观察到凋亡细胞对CAR修饰的T细胞抗CD19+HeLa细胞的负面作用。
因此，添加或不添加早期凋亡细胞时，观察到相同的CD19+CAR T细胞的体外细胞毒性作用。
凋亡细胞对CAR-T治疗引起的细胞因子风暴的缓解、降低或抑制作用
在添加CD19+CAR T细胞之前和之后测量培养基中的细胞因子IL-8和IL-13，显示出与细胞因子风暴相一致的浓度。添加凋亡细胞或凋亡细胞上清液显示出培养基中IL-8和IL-13浓度的降低。
使用更大范围细胞因子分析
为进一步评估对可能更大范围和水平的细胞因子的作用，所述细胞因子在实验过程中没有产生但是在人细胞因子风暴期间在临床环境中确实出现，在癌症和CAR-19存在下将LPS(10ng/ml)添加到上述的Raji细胞培养条件中。添加LPS预期指数增加细胞因子风暴水平。暴露于凋亡细胞大幅降低细胞因子水平。图16和图17中显示的结果表明，尽管添加CD19+CAR T细胞大大增加培养基中GM-CSF和TNF-α的细胞因子浓度(pg/ml)，但在凋亡细胞存在下GM-CSF和TNF-α均显著降低。细胞因子浓度的减少相对于CAR T细胞与凋亡细胞的凋亡细胞比例是剂量依赖性的。
结论：
凋亡细胞可以下调与CAR T细胞临床程序有关的细胞因子风暴的细胞因子标记。明显地，凋亡细胞未显示出对CAR T细胞的肿瘤活性的影响。凋亡细胞减少了源自先天免疫的促炎细胞因子并且抑制IFN-γ的作用而不损害IFN-γ水平和CAR-T细胞毒性。
实施例6：凋亡细胞治疗防止施用Car T细胞治疗的弥漫性癌症体内模型中的细胞因子风暴
目的:在弥漫性肿瘤模型中测试凋亡细胞或凋亡细胞衍生的上清液的体内作用，以确定CAR T细胞对癌细胞的功效以及细胞因子风暴标记细胞因子的水平。
材料和方法
体外研究
见体外研究的实施例5中所述方法。
细胞和细胞培养
Raji Burkitt淋巴瘤细胞(Sigma-Aldrich，目录号85011429)根据制造商指导进行培养。CD19+CAR T细胞、细胞培养物、凋亡细胞、凋亡细胞上清液、单核细胞分离和体外测量均如以上实施例所述。所产生的早期凋亡细胞是至少50％膜联蛋白V阳性和低于5％PI阳性细胞。
体内研究
小鼠
7-8周龄SCID beige小鼠购自Envigo(先前已知为Harlan)。按照机构IACUC指南，将小鼠饲养在无SPF的动物设施中。在实验过程中，每天监测小鼠，每周称重3次。处死显示后肢麻痹的小鼠。处死后，收集骨髓和肝脏用于FACS分析和组织学加工，并将血清在-80℃冷冻以用于细胞因子谱分析。
体内实验
将SCID beige小鼠(C.B-17/IcrHsd-Prkdc-SCID-Lyst-bg,Harlan,Israel)置于在耶路撒冷希伯来大学Authority for Animal Facilities(AAF)(Ein Kerem Campus,Israel)的SPF条件下，按照Association for Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care(AAALAC)的要求饲养。这项研究得到了希伯来大学动物实验伦理委员会的批准，并尽可能减少了动物的痛苦。
(图18A)对于扩散肿瘤模型，给7-8周龄雌性SCID beige小鼠每只小鼠静脉内注射悬浮于200μl RPMI(Gibco,,ThermoFisher Scientific,USA,目录号15140-122)中的1×105Raji细胞(第1天)。在第6天，给相关组小鼠每只小鼠静脉内接种在200μl Hartmann溶液(Lactated Ringer’s Injection,Teva Medical,Israel,目录号AWN2324)中的30×106的ApoCells细胞。在第6天，给相关组小鼠每只小鼠静脉内接种在200μl AIM V中的10×106活CD19-CAR T细胞或未致敏T细胞。对照小鼠在每种治疗中接受等体积RPMI。
每周2次检查小鼠临床表现并称重，在发生后肢麻痹时处死小鼠。由耶路撒冷希伯来大学的Animal Facility Unit制备骨和肝脏的病理学样品，针对人CD20(Cell Marque,USA,clone L26,目录号120M-84)染色以检测Raji细胞，针对人CD3(Cell SignalingTechnology,USA,目录号85061)染色以检测人T细胞。
在某些实验中，在添加CD19+CAR T细胞之前将LPS施用给动物对象。在其它实验中，在添加CD19+CAR T之前施用干扰素γ(IFN-γ)。添加LPS或IFN-γ预期指数增加细胞因子风暴水平。
细胞因子测定检查如下细胞因子的水平，所述细胞因子包括但不限于IL-10、IL-1β、IL-2、IP-10、IL-4、IL-5、IL-6、IFNα、IL-9、IL-13、IFN-γ、IL-12p70、GM-CSF、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、IL-17A、IL-15/IL-15R或IL-7，或其任意组合。细胞因子(小鼠或人的)用MAPIX系统分析仪(Mereck Millipore)和MILIPLEX分析软件(Merek Millipore)用Luminex技术评估。小鼠IL-6Rα、MIG(CXCL9)和TGF-β1用Quantikine ELISA(R&D systems)评估。
组织分析
使用流式细胞术和免疫组织化学评估骨髓和肝脏。处死后，收集肝和骨髓用于组织病理学分析。在室温将组织在4％福尔马林中固定48小时，然后送至希伯来大学的动物设施进行加工。在加工之前将骨脱钙。石蜡切片用苏木精和曙红以及CD19染色。
IFN-γ作用
IFN-γ作用经STAT1磷酸化和生物学产品评估。
结果
CAR T细胞治疗诱导细胞因子释放综合征
三组无肿瘤小鼠以及具有肿瘤的小鼠被施用(腹膜内或直接进入肿瘤)增加剂量的CD19+CAR T细胞(3×106，10×106或30×106)。在最高剂量，无肿瘤小鼠和患有肿瘤的小鼠在24小时内表现出抑制行为、竖毛和行动减少，伴随着体重迅速减轻，随后在48小时内死亡。在给予最高剂量的CD19+CAR T细胞的小鼠血样中可检测到人干扰素-γ和小鼠IL-6、IL-8和IL-13。接受高剂量的针对不同肿瘤抗原的CD19+CAR T细胞的动物未表现出体重减轻或行为改变。
施用凋亡细胞抑制或降低由CAR T细胞治疗诱导的细胞因子释放综合征的发生
被给予最高剂量的CD19+CAR T细胞的一组小鼠同时被施用2.10×108/kg凋亡细胞，这先前已被证明是安全有效剂量。接受人CD19+CAR T+凋亡细胞的小鼠具有显著降低的至少一种小鼠促炎细胞因子水平，更低的体重减轻，和降低的死亡率。
施用凋亡细胞组合CAR T细胞施用不影响CAR T细胞抗肿瘤活性
图18B示出注射CD19+Raji细胞但未施用CD19+CAR T细胞的SCID小鼠的预期死亡为18-21天。接受CD19+CAR T细胞的小鼠中有40％存活到至少第30天(图18点划线和双点划线)。幸存者的百分比不依赖于凋亡细胞的添加(图18)。在第30天处死存活小鼠。
结论:存活率相当，凋亡的细胞对体内CAR修饰的T细胞抗CD19没有负面作用。
证实了促炎细胞因子包括IL-6、IP-10、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β的显著下调(p<0.01)。IFN-γ没有被下调，但是其对巨噬细胞和树突细胞的作用在磷酸化STAT1水平和IFN-γ诱导的CXCL10和CXCL9表达方面均被抑制。
结论：
凋亡细胞减少源自先天免疫的促炎细胞因子并抑制IFN-γ作用而不损害IFN-γ水平和CAR-T细胞毒性。
实施例7：凋亡细胞治疗防止在施用CAR T细胞治疗的实体瘤癌症体内模型中的细胞因子风暴
目的:在实体瘤模型中测试凋亡细胞或凋亡细胞衍生的上清液的体内作用，以确定CAR T细胞对癌细胞的功效以及细胞因子风暴标记细胞因子的水平。
材料和方法
体外研究
细胞和细胞培养
使用了CD19+CAR T细胞，含有TMCD28的第二代CAR-T-CD19细胞，细胞培养物、凋亡细胞、凋亡细胞上清液、单核细胞分离和体外测量如以上实施例2、4和6所述。如实施例1详述，产生的早期凋亡细胞是至少50％膜联蛋白V阳性和小于5％PI阳性的细胞。
体内研究
小鼠
7-8周龄SCID-beige小鼠和NSGS小鼠购自Harlan(Israel)并保持在SharettInstitute的SPF动物设施中。
SCID beige小鼠或NSGS小鼠用表达CD19的HeLa细胞接种，该细胞可以粘附于腹膜，以形成实体腹膜内肿瘤。在施用T细胞之前将小鼠分组。
静脉内接种后6天，给小鼠施用10×106CD19+CAR T细胞，在第5天用和不用凋亡细胞(ApoCell)预处理(conditioning)。接受预处理的小鼠施用5×106或30×106ApoCell。每周检查一次肿瘤，每周监测循环细胞因子水平并通过Luminex系统测定。使用Luminex技术评估了25种小鼠细胞因子和32种人类细胞因子。实验终止后，杀死小鼠并检查器官(骨髓，肝和脾)(通过FACS和免疫组织化学)中肿瘤存在/大小。
细胞因子测定检查细胞因子水平，包括但不限于GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、MIP-1α、TNFα、MIP-1β、IFNα和IP-10。细胞因子(小鼠或人的)使用MAPIX系统分析仪(Mereck Millipore)和MILIPLEX分析软件(Merek Millipore)经Luminex技术评估。小鼠IL-6Rα、MIG(CXCL9)和TGF-β1用Quantikine ELISA(R&D systems)评估。
组织分析
骨髓和肝用流式细胞术和免疫组织化学评估。
IFN-γ作用
IFN-γ作用通过STAT1磷酸化和生物学产物评估。
结果
CAR T-细胞治疗诱导细胞因子释放综合征
三组无肿瘤的小鼠以及具有肿瘤的小鼠被施用(腹膜内或直接进入肿瘤)增加剂量的CD19+CAR T细胞(3×106，10×106或30×106)。在最高剂量，无肿瘤小鼠和患有肿瘤的小鼠在24小时内表现出抑制行为、竖毛和行动减少，伴随体重迅速减轻，随后在48小时内死亡。
图19A-19C图形显示甚至在存在CAR T细胞之前，IL-6、IP-10水平增加和令人惊讶地甚至从肿瘤释放的TNF-α细胞因子水平增加。图19A-19C显示，即使不进行CAR T细胞治疗，癌细胞的存在也会使IL-6，IP-10和TNF-α出人意外地增加。在CAR T细胞治疗(Hela-CART细胞CD-19)的存在下，细胞因子的释放显著增加。这些结果表明，肿瘤本身释放促炎细胞因子。
为评估添加早期凋亡细胞的益处，在三个实验中测量细胞因子GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、MIP-1α、TNFα、MIP-1β、IFNα和IP-10，其中结果显示巨噬细胞相关的细胞因子在ApoCell施用时下调，而T细胞相关细胞因子水平未显著改变(表10)。
表10:来自含有表达CD19的Hela细胞实体瘤的腹膜内体内模型的细胞因子水平，+/-CAR T细胞CD19治疗和+/-ApoCell
Pg/ml 肿瘤Car或Apo之前 肿瘤+CAR之后 肿瘤、CAR+ApoCell之后
GM-CSF 4±2 88±10 12±4
IFNY 4±1 5±8 5±21
IL-1β 8±3 14±6 16±8
IL-10 76±13 222±44 36±22
IL-12p70 5±1 188±22 12±11
IL-13 6±2 8±1 8±4
IL-15 4±2 6±2 8±2
IL-2 4±2 26±2 29±2
IL-4 1±2 16±4 18±6
IL-6 24±6 820±56 74±12
MIP-1α 8±5 99±13 18±8
TNFα 6±2 760±33 17±15
MIP-1β 7±1 144±21 21±10
IFNα 74±12 68±26 71±14
IP-10 8±4 188±33 21±16
表10显示在施用CAR T细胞+/-ApoCells后24小时测量的细胞因子。CAR T细胞治疗所产生的细胞毒性升高了包括GM-CSF、IL-10、IL-12p70、IL-6、MIP-1α、TNFα、MIP-1β和IP-10在内的细胞因子，在ApoCells存在下所述细胞因子水平被显著下调(p＜0.05-0.0001)。这些细胞因子主要与巨噬细胞相关。相反，与T细胞相关的细胞因子如IL-2、IL-4、IL-13和IL15的水平未显著改变。
图19A-C和表10的结果说明在癌症和CAR的背景下CRS具有多种成分：可以分泌细胞因子的肿瘤；对肿瘤、CAR和其它因子应答的先天免疫；以及分泌细胞因子的CAR T细胞，导致死亡，影响先天免疫。ApoCell与先天免疫(主要是巨噬细胞、单核细胞和树突细胞)相互作用，下调这些巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的应答，而不与T细胞或CAR T细胞相互作用。
接受高剂量的针对有不同肿瘤抗原的CD19+CAR T细胞的动物不显示体重减轻或行为改变。
施用凋亡细胞抑制或降低CAR T细胞冶疗诱导的细胞因子释放综合征的发生
施用最高剂量的CD19+CAR T细胞的一组小鼠同时施用2.10×108/kg凋亡细胞，这先前已被证明是安全有效剂量。凋亡细胞对具有抗CD19特异性的CAR修饰的T细胞没有体外或体内负面作用。在体外在凋亡细胞存在/不存在时，CAR T细胞的E/T比相当，体内存活曲线相当(数据未示出)。
接受人CD19+CAR T+凋亡细胞的小鼠具有显著降低的至少一种小鼠促炎细胞因子水平、更低的体重减轻和降低的死亡率。
在存在或不存在凋亡细胞时在相当的CAR T的E/T比结果以及体内相当的存活曲线时，在体内未见凋亡细胞对CAR修饰的T细胞抗CD19的负面作用。
包括IL-6、IP-10、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β在内的促炎细胞因子的显著下调(p＜0.01)被记载(数据未显示)。IFN-γ未被下调，但是其对巨噬细胞和树突细胞的作用在磷酸化STAT1水平和IFN-γ诱导的CXCL10和CXCL9表达两个方面均被抑制(数据未示出)。
结论：
CRS从多种因素演变而来，包括肿瘤生物学、与单核细胞/巨噬细胞/树突细胞相互作用以及作为对CAR T细胞作用和扩增的应答。凋亡细胞降低源自先天免疫的促炎细胞因子并抑制IFN-γ对单核细胞/巨噬细胞/树突细胞的作用而不损害IFN-γ水平或CAR-T细胞毒性。因此，凋亡细胞降低源自先天免疫的促炎细胞因子并抑制IFN-γ作用而不损害IFN-γ水平和CAR-T细胞毒性。这些结果支持在使用CAR-T细胞治疗的临床研究中安全使用ApoCells预防CRS。
实施例8：凋亡细胞下调细胞因子释放综合征(CRS)和增加CAR-T细胞功效
目的:在更长的时间内测试早期凋亡细胞对细胞因子和CAR T细胞细胞毒性的作用。证实CD19-CAR T细胞的体内功效。证实早期凋亡细胞和CD19-CAR T细胞的协同作用。
方法：表达CD19的HeLa细胞(ProMab)单独使用，或者与人类巨噬细胞共保温后用于小鼠的体外和腹膜内实验。Raji被用于体内白血病诱导。LPS和IFN-γ用于触发其它细胞因子释放。第二代携带CD28的CD19特异性CAR修饰的细胞(ProMab或使用retronectin制造方案或聚凝胺(polybrene)制造方案生产)用于抗携带CD19细胞的抗肿瘤作用。在体内(7-AAD流式细胞术)和体外(存活曲线；骨髓和肝脏中的肿瘤负荷，流式细胞术和免疫组化)检查细胞毒性测定。CRS自发发生或者应答LPS和IFN-γ而发生。小鼠IL-10、IL-1β、IL-2、IP-10、IL-4、IL-5、IL-6、IFN-α、IL-9、IL-13、IFN-γ、IL-12p70、GM-CSF、TNF-α、MIP-1a、MIP-1β、IL-17A、IL-15/IL-15R、IL-7和32种人类细胞因子被评估(Luminex technology,MAPIXsystem；MILLIPLEX Analyst,Merck Millipore)。小鼠Mouse IL-6Ra、MIG(CXCL9)和TGF-β1被评估(Quantikine ELISA,R&D systems)。IFN-γ作用被评估(STAT1磷酸化，生物学产物)。人巨噬细胞和树突细胞从单核细胞产生。早期凋亡细胞通常如上述实施例1所述产生；≥40％细胞是膜联蛋白V阳性；≤15％是PI阳性。
小鼠：在实验第1天和第2天腹膜内(i.p)给SCID-Bg小鼠(雌性，7-8周龄)注射2个连续剂量的0.25×106HeLa-CD19细胞。在第9天，小鼠接受腹膜内剂量10×1064000-rad(cGy)辐照的ApoCell(使用细胞处理系统)，接下来第二天接受腹膜内剂量10×106CAR-T细胞群，其包含0.5×106的CAR-T阳性细胞或2.2×106的CAR-T阳性细胞。作为对照，小鼠接受10×106个活化单个核细胞或模拟(Mock)-T细胞。按照机构IACUC准则，将小鼠饲养在SPF动物设施中。每周两次称重小鼠，每天监测临床体征和腹膜炎。终点定义为严重腹膜炎，表现为腹部肿大和紧张、嗜睡、行动减少或呼吸努力增加。生存分析根据Kaplan-Meier方法进行。
结果：包括IL-6、IP-10、TNF-α、MIP-1a、MIP-1β在内的促炎细胞因子显著下调(p<0.01)(数据未显示)。IFN-g没有下调，但是其对巨噬细胞和树突细胞的作用在磷酸化的STAT1水平被抑制(数据未显示)。巨噬细胞中IFN-γ诱导的CXCL10和CXCL9表达降低(数据未显示)。
在使用0.5×106个CAR-T阳性细胞的实验中，在第17天和第21天每组处死2只小鼠。用HeLa-CD19处理的小鼠表现出腹膜炎，表现为腹膜中血液蓄积，脾肿大和肿瘤病灶(数据未显示)。用对照MNC处理的小鼠腹膜中血液少一点，肿瘤病灶也少一些。用CAR-T或CAR-T和ApoCell处理的小鼠没有腹膜炎迹象。该观察结果与图20A中显示的生存曲线相关。
在使用2.2×106个CAR-T阳性细胞的实验中，观察到的作用模式与减少了4倍的CAR T细胞所观察到的相同(图20B)。CAR-T治疗延长了具有腹膜HeLa-CD19小鼠的存活(p＝0.0002)。这个实验中的作用更为显著，可能是由于输注的CAR T细胞数更高(2.2比0.5×106CAR-T阳性细胞)。即使具有更显著和延长的作用，早期凋亡细胞也具有协同作用和延长存活(p＝0.0032)。在体外存在/不存在凋亡细胞是，CAR T的E/T比值是相当的。令人惊讶地，与单独的CAR治疗相比，在凋亡细胞的存在下给予的CAR T细胞治疗改善了小鼠的存活，显著且可再现地增加了至少12天(p＜0.0032，图20A和20B)。
结论：CAR-T细胞治疗延长了具有腹膜HeLa-CD19细胞的小鼠的存活。与单独CAR-T细胞治疗相比，在CAR-T前一天施用辐照的早期凋亡细胞具有协同作用并且延长小鼠存活10天以上(p<0.044，long-rank检验)。
辐照的凋亡细胞输注在治疗SCID小鼠中携带CD19的Hela细胞中对CD19特异性CART细胞具有明显协同作用。在该实施例中，观察到与实施例5和6中呈现的结果相似的结果。与实施例5和6相比，通过在本实施例中使用经辐照的凋亡细胞，消除了“移植物抗白血病作用”的可能性。因此，这种令人惊讶的协同作用似乎是通过所提供的辐照的凋亡细胞介导的。
CRS从多种因素演化而来，包括肿瘤生物学、与单核细胞/巨噬细胞/树突细胞相互作用以及作为对CAR T细胞作用和扩增的应答。凋亡细胞降低源自先天免疫的促炎细胞因子并抑制IFN-γ对单核细胞/巨噬细胞/树突细胞的作用，而不损害IFN-γ水平或CAR-T细胞毒性，并且CAR-T细胞功效显著增加。出乎意料的，用辐照的凋亡细胞进行治疗补充了CAR-T细胞治疗，有效地扩展了CAR-T细胞治疗的抗癌作用。
实施例9:凋亡细胞治疗在非实体瘤模型上的作用
目的：在癌症广泛分布且未局限(localized)或限制(confined)的非实体瘤模型中测试凋亡细胞的作用，以确定在癌症中凋亡细胞对存活的功效。
方法：
Raji细胞
Raji细胞购自ECACC(目录号：85011429)并在完全培养基(补加10％H.I.FBS、1％Glutamax、1％青霉素/链霉素的RPMI-1640)中常规培养，并保持3×105–3×106细胞/ml的浓度。
凋亡细胞如实施例1所述制备。所产生的早期凋亡细胞是至少50％膜联蛋白V阳性的和小于5％PI阳性的细胞。
非实体(弥漫性)肿瘤模型
在实验第1天，SCID小鼠接受105Raji细胞的单次静脉内注射。对照组SCID小鼠接受盐水溶液的单次静脉内注射。(测试了3个队列；用Raji在2个队列中引入白血病，1个队列保持为对照)。
实体瘤模型
在实验第1天，SCID小鼠接受105Raji细胞的单次腹膜内注射，其中对照组接受盐水溶液的单次腹膜内注射。
凋亡细胞治疗
在初步研究中，小鼠在输注Raji细胞后6天接受早期凋亡细胞的输注。在后面的研究中，来自上述白血病队列之一的小鼠在输注Raji细胞后6天接受3次早期凋亡细胞(30×106细胞)的输注。
结果
SCID小鼠没有T细胞，因此不经治疗没有能力从白血病中恢复。
令人惊讶地，在初步研究中及如图21所示，与不接受凋亡细胞输注(NO APO)的小鼠相比，在输注Raji后6天输注凋亡细胞(APO)显著延长用CD19+Raji注射的SCID中的无肿瘤死亡。
在白血病(NO APO)队列中，接受Raji细胞的小鼠中有70％在其寿命期内存活，而接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠中有94％(总共n＝51只动物，p<0.001)。如预期，100％的对照小鼠在其预期寿命期内存活(图22A)。在白血病队列中，接受Raji细胞但未接受凋亡细胞的小鼠中有9％的存活时间比其预期寿命长达12％，而接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠则有47％(图22B)。接受Raji细胞但未接受凋亡细胞的小鼠均无法存活至预期寿命的30％以上，而接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠则有41％(图22C)。接受Raji细胞但未接受凋亡细胞的小鼠均未达到完全缓解，而接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠中有10％完全缓解(图22D)。
结论：
施用凋亡细胞输注维持并增加了白血病小鼠的寿命，其中在一些情况下，施用早期凋亡细胞的小鼠达到了完全缓解(图2和3A-3D)。
实施例10:组合凋亡细胞和抗CD20 mAb治疗对弥漫性肿瘤模型的作用
目的：测试施用早期凋亡细胞和抗CD20 mAb的组合对弥散性(非实体)肿瘤模型的作用，其中癌症广泛分布且未局限(localized)或限制(confined)，以确定这种组合治疗对存活的功效。
Raji细胞、凋亡细胞、非实体(弥漫性)肿瘤模型、实体瘤模型和凋亡细胞治疗如以上实施例1和9所述。
抗-CD20 mAb
可商业获得的CD20 mAb得自Roche。
抗CD20 mAb治疗
小鼠接受5mg抗CD20 mAb静脉内输注。
组合凋亡细胞和抗CD20 mAb治疗
从Raji细胞施用后第6天开始，小鼠接受3次各30×106凋亡细胞的静脉内输注。另外，小鼠接受5mg抗CD20 mAb的静脉内输注。
结果
100％的接受Raji细胞、Raji细胞+抗CD20 mAb和Raji细胞+抗CD20+凋亡细胞的小鼠在白血病小鼠预期寿命内存活，相比之下接受Raji细胞和凋亡细胞的小鼠有86％存活(总共n＝28只动物，p<0.0002)(图23A)。接受Raji细胞的小鼠没有存活超过预期寿命24％，相比之下同时接受Raji细胞+凋亡细胞的小鼠有29％，而接受Raji细胞+抗CD20mAb或Raji细胞+抗CD20+凋亡细胞的小鼠是100％(图23B)。接受Raji细胞的小鼠没有存活超过预期寿命59％的，相比之下同时接受Raji细胞+凋亡细胞的小鼠有29％，接受Raji细胞+抗CD20mAb的小鼠有57％，接受Raji细胞+抗CD20+凋亡细胞的小鼠是100％(图23C)。接受Raji细胞的小鼠没有存活超过预期寿命76％的，相比之下同时接受Raji细胞+凋亡细胞的小鼠有29％，接受Raji细胞+抗CD20 mAb的小鼠有14％，接受Raji细胞+抗CD20+凋亡细胞的小鼠有85％(图23D)。接受Raji细胞或Raji细胞+抗CD20 mAb的小鼠均没有存活超过小鼠预期寿命100％的，而接受Raji细胞+凋亡细胞或Raji细胞+抗CD20+凋亡细胞的小鼠有29％(图23E)。
结论：
凋亡细胞输注增加白血病小鼠的寿命，增加达到完全缓解的小鼠数，及增强抗CD20mAb治疗作用(图23A-23E)。
实施例11:ApoCell(早期凋亡细胞)对白血病/淋巴瘤的作用
目的：这里提出的工作具有三个主要目标：(1)从疾病发作、进展和随后死亡方面评估ApoCell在白血病-淋巴瘤小鼠模型中的作用；(2)评估ApoCell治疗后白血病-淋巴瘤小鼠模型中的肿瘤细胞分布；(3)评估ApoCell和利妥昔单抗(RtX)在治疗SCID-Bg小鼠白血病-淋巴瘤中可能的协同作用。作为实现这些目标的工作的一部分，测量了ApoCell施用后白血病小鼠的存活。同样，在用ApoCell治疗后测量肿瘤细胞的分布。
方法：
小鼠.给7周龄雌性SCID-Bg小鼠(ENVIGO,Jerusalem,Israel)静脉内注射0.1×106Raji细胞/小鼠。在实验第5、8和11天小鼠静脉内接受3剂30×106ApoCell。对于组合治疗，在ApoCell施用后1.5小时，小鼠接受1剂(第8天)RtX(2或5mg/kg；Mabthera,Roche,Basel,Switzerland)。
每天跟踪小鼠，每周称重两次。终点定义为死亡或因以下任何一种症状的发展而处死：截瘫(下肢麻痹)、小鼠起始体重损失20％、嗜睡、行动减少或呼吸努力增加。
根据Kaplan-Meier方法进行存活率分析。按照机构动物护理和使用委员会(IACUC)指南，将小鼠饲养在无特定病原体(SPF)的动物设施中。
Raji细胞系.这种人Burkitt's淋巴瘤细胞系购自European Collection ofAuthenticated Cell Cultures(ECACC,目录号：85011429)，在完全培养基(补加10％热灭活FBS、1％glutamax、1％青霉素/链霉素的RPMI-1640)中常规培养。
ApoCell.基本上如实施例1所述。简言之，通过白细胞分离术从健康合格供体收集单个核富集的细胞级分。血液分离完成后，将细胞洗涤并重悬于冷冻培养基中，所述冷冻培养基由PlasmaLyte A pH7.4、5％人血清白蛋白、10％二甲亚砜(DMSO)、5％抗凝柠檬酸葡萄糖溶液配方A(ACD-A)和0.5U/毫升肝素组成。然后将细胞逐渐冷冻并转移至液氮中进行长期保存。
为制备ApoCell，将冷冻保存的细胞解冻，洗涤并重悬于凋亡诱导培养基，其由补加2mM L-谷氨酰胺和10mM Hepes、10％自体血浆、5％ACD-A、0.5U\ml肝素钠和50μg/ml甲泼尼龙的RPMI 1640组成。然后将细胞在5％CO2中于37℃保温6小时。保温结束时，使用细胞加工系统收集细胞、洗涤并重悬于Hartmann溶液中。将ApoCell在290g于2-8℃离心10分钟，然后重悬于Hartmann溶液中用于注射。使用膜联蛋白V和碘化丙啶(PI,Medical&BiologicalLaboratories,Nagoya,Japan)用FCS Express软件确定ApoCell的凋亡和存活力。
流式细胞术.从处死小鼠收集小鼠脾、肝和骨髓(如上定义的临床症状恶化之后)并通过流式细胞术(FACSCalibur,BD,Franklin Lakes,NJ,USA)分析Raji肿瘤(抗CD20)的存在。
结果：
部分A:ApoCell延迟白血病小鼠的疾病发作和随后死亡
图24是Kaplan-Meier生存图，代表3个单独实验(RPMI组，n＝15；Raji组，n＝23；Raji+ApoCell组，n＝24)。在每个实验中，雌性SCID-Bg小鼠(7-8周龄)静脉内注射0.1×106Raji细胞，对照组注射RPMI。随后，在第5、8和11天通过静脉内施用(IV)给小鼠施用三剂30×106ApoCell。每天跟踪小鼠，每周称重两次。终点被定义为死亡或由于以下任何一种症状的发展而处死：截瘫(下肢麻痹)，损失小鼠初始体重20％、嗜睡、行动减少或呼吸努力增加。实验细节在表11中给出。可见到ApoCell的显著有益效果(p＝0.002,Log-rank(Mantel-Cox)检验)。
表11：图A plot实验细节
Figure BDA0002458147110001221
DFS＝无病生存
各个研究的数据示于图25A-25C。
如上所示，在施用Raji细胞后用3剂ApoCell治疗的小鼠比未治疗小鼠具有更慢的疾病进展，死亡显著更晚(p＝0.0020)。
用ApoCell治疗的白血病小鼠比未治疗的对照小鼠的症状发作明显延迟，表现出更慢的疾病进展，并且更晚死亡。令人感兴趣的是，约有10％的施用Raji细胞和ApoCell的小鼠在这种白血病/淋巴瘤模型中没有出现任何预期的症状特征，并且保持健康直到实验终止(第53或60天)。
ApoCell降低白血病小鼠中的肿瘤负荷
如上所述在临床症状恶化后处死后，收集感兴趣的器官进行分析，即肝、脾和骨髓。通过流式细胞术分析这些靶器官的细胞中是否存在人类肿瘤细胞(Raji细胞是CD20阳性的)。
以下数据(表12)描述了来自上述3个实验的处死小鼠靶器官中平均细胞群百分比；每个实验中的个体小鼠的值可见于下表13-18。
表12:在脾、骨髓和肝中肿瘤群的平均百分比(流式细胞术)
Figure BDA0002458147110001222
Figure BDA0002458147110001231
体内实验011
在骨髓、脾和肝中的CD20+细胞的FACS分析：
当在第60天处死时接受3剂ApoCell的一只小鼠是健康的。
收集肝、脾和骨髓细胞并通过流式细胞术(FACSCalibur,BD)分析人CD20-FITC(Biolegend,目录号302206)；mIgG1-FITC(Biolegend,目录号400110)的存在。
体内实验019
在骨髓、脾和肝中肿瘤细胞的FACS分析：
从在如方法中定义的临床恶化后处死的小鼠收集小鼠脾、肝和骨髓细胞并用流式细胞术(FACSCalibur,BD)分析人CD20(FITC)的存在。
脾、骨髓和肝的分析结果在下表13-15中示出。
表13：脾
Figure BDA0002458147110001232
表14：骨髓
Figure BDA0002458147110001241
表15：肝
Figure BDA0002458147110001242
体内实验023
通过流式细胞术确定的CD20肿瘤细胞在脾、骨髓和肝中的表达(％)。从(按照方法定义的临床恶化后)处死的小鼠收集小鼠脾、肝和骨髓并通过流式细胞术(FACSCalibur，BD)分析人CD20(FITC)的存在。下表16-18给出了各小鼠的脾、骨髓和肝的结果。
表16：脾
Figure BDA0002458147110001251
表17：骨髓
Figure BDA0002458147110001252
Figure BDA0002458147110001261
表18:肝
Figure BDA0002458147110001262
Figure BDA0002458147110001271
初步结论：结论是小鼠器官中的肿瘤分布与在生存图中可见的有益效果相关，并且在治疗小鼠的骨髓和肝中显著降低。
部分B:ApoCell和利妥昔单抗(RtX)在白血病/淋巴瘤治疗中的协同作用
接下来，通过在两个实验中评估RtX和ApoCell对白血病小鼠的组合作用，检查ApoCell治疗是否与白血病/淋巴瘤的其它常规治疗具有协同作用。
目的：测量在RtX和ApoCell施用后白血病小鼠的存活率，及检测白血病小鼠骨髓、肝和脾中的肿瘤细胞。
方法：以下工作是对组合治疗实验(ApoCell和rtx)中获得的结果的代表性描述。简言之，雌性SCID-Beige小鼠静脉内注射0.1×106Raji细胞(所有组中n＝7)。在第5、8和12天，小鼠静脉内接受三剂30×106ApoCell。在第8天，注射ApoCell后1.5小时，小鼠接受2或5mg/kg RtX的单次IV剂量。每天跟踪小鼠并每周称重两次。终点定义为死亡或因以下一种或多种症状的发展而处死：截瘫(下肢麻痹)，起始体重损失20％，嗜睡，行动减少或呼吸努力增加。
结果：
如图26所示，ApoCell具有有益的作用，证实了图24中显示的结果。单独的Rituxan(RtX)在2mg和5mg剂量均优于ApoCell，但是ApoCell和Rituxan的组合在2mg(p＝0.104)和5mg剂量均具有协同作用，尽管在5mg中观察到的协同作用没有达到统计学显著。小鼠器官中的肿瘤分布与有益效果相关(表19)。
表19：存活分布的统计学分析(Log-rank(Mantel-Cox)检验)
Figure BDA0002458147110001272
Figure BDA0002458147110001281
实验结束-第57天
在实验结束时有一只小鼠(Raji+RtX 2mg/kg+ApoCell)被声明是无病的。
在另外实验中测量了在1个2mg RtX剂量中的协同作用。如该实验清楚显示(图27)，ApoCell和RtX的协同作用再次被验证为显著(p＝0.01)。
如表20所示，脾未由肿瘤细胞填充(0.1-0.3代表背景染色)并用作对照。相反，骨髓和肝是肿瘤靶。通过ApoCell和RtX分别治疗后，骨髓和肝中的肿瘤数量减少(使用CD20标记测量的Rajji细胞)，当两者组合给予时获益增加；对于Raji+rtx(2mg/Kg)+ApoCell，p＝0.0034(**)；对于Raji+rtx(5mg/Kg)+ApoCell，p＝0.0031(**)(T-检验test)。如预期，RtX显著降低了白血病小鼠靶器官中的肿瘤负但。令人感兴趣的是，单独使用ApoCell治疗可以将这些器官中的肿瘤细胞降低到与传统RtX治疗相当的水平。
表20:在脾、骨髓和肝中的平均肿瘤细胞群(流式细胞术)
Figure BDA0002458147110001282
结论：总之，生存图(图24，图26和图27)清楚地证明了ApoCell和Rtx的有益效果以及ApoCell和RtX组合的协同作用。值得注意的是，当常规RtX治疗组合ApoCell时，无论RtX剂量如何，存活时间均显著增加，表明两种治疗的强协同作用。一项支持性临床观察是骨髓和肝中肿瘤细胞群减少(表12)。
令人惊讶的是，ApoCell制备物对白血病小鼠模型中的疾病进展和存活具有明显有益作用，而与任何其它治疗无关。在Kaplan-Meier分析中，10–20％的小鼠存活时间延长(图24，图26和图27)，并且肝和骨髓中的肿瘤细胞负荷降低。此外，将ApoCell和RtX组合施用时，具有明显的协同作用，进一步延迟了疾病发作和进展，并提高了存活。
实施例12:在GVHD白血病/淋巴瘤模型中使用合并的凋亡细胞制备物
在以下初步工作中，检查了相同输注在GvHD白血病/淋巴瘤模型中的作用。检查了经辐照的多供体单次凋亡细胞输注(合并的单个核辐照的凋亡细胞制备物)在预防经历骨髓移植(BMT)的小鼠中的急性GvHD的安全性和有效性。在此模型中，BMT拯救了受辐照的小鼠(80-100％)。
关于移植物抗白血病(GvL)作用可能丧失的问题出现在每一个潜在避免高级别aGVHD的成功治疗中，因为发现这种作用与GVHD的严重程度相关。
方法
按照以上实施例1制备凋亡细胞，不同之处是在当前实验中，同时从4个供体进行制备。在由4个供体制备后，将细胞制备物在最后一步(辐照之前)组合，紧接着进行辐照，并在辐照之后立即注射。辐照为25Gy。
结果
图28和29所示的两个图示出来自多个体供体的凋亡细胞的单次注射(虚线)对存活率和体重减轻的明显作用(p<0.01)。图28是在用单剂量的来自多个体供体的辐照的凋亡细胞治疗的GvHD小鼠模型中的Kaplan-Meier存活曲线，其中存活率显著改善。图29是两个进行比较的组的体重减轻百分比，其跟随图28的发现并与之相关。
总之，单次输注多供体辐照凋亡细胞成功且显著改善GvHD小鼠模型的预期寿命。
实施例13:来自多个个体供体的凋亡细胞的稳定性标准
本研究目的是为来自多个个体供体的凋亡细胞建立稳定性标准，并与未辐照的HLA匹配的凋亡细胞进行比较研究(Mevorach et al.(2014)Biology of Blood andMarrow Transplantation 20(1):58-65；Mevorach et al.(2015)Biology of Blood andMarrow Transplantation 21(2):S339-S340)。
在2-8℃储存8、24、48和60小时并在每个时间点取样后，评估凋亡细胞终产品制备物的细胞数、存活力、凋亡表型和效力。凋亡细胞终产品批次按照标准操作程序(SOP)(实施例1；实施例5)和批次记录(BR；即特定制造程序)进行制备。为了进行效力评估，测试早期凋亡细胞制备物终产品批次的样品对于脂多糖(LPS)诱导的未成熟树突细胞(时间点0-24h)或单核细胞(时间点0-6)上MHC-II表达的上调的抑制，并根据SOP进行并记录在BR中。这一系列的测试在分别源自多个个体供体和单个供体的制备物中的合并和非合并产品上进行。
另外，记录CD3(T细胞)、CD19(B细胞)、CD14(单核细胞)、CD15high(粒细胞)和CD56(NK细胞)的流式细胞术分析。这些研究的目的是证实小范围结果的一致性。初步结果与目标一致，未注意到SOP的偏差，未报告技术问题。但是，需要进一步研究以总结有效治疗的范围和稳定性。初步结果显示在所有这些参数中的等价性。另外，单个供体研究显示了在至少48小时期间的稳定性(参见实施例1)。
实施例14:多个供体的辐照的凋亡细胞作为急性移植物抗宿主病的预防剂的安全性和有效性
目的:一项1/2a期、多中心、开放(open-label)研究，评估单剂施用来自多个非匹配供体的辐照的凋亡细胞用于预防人白细胞抗原匹配的、相关的和不相关的患者血液系统恶性肿瘤中的移植物抗宿主病的安全性、耐受性和初步功效，所述患者经历同种异基因HLA匹配的造血干细胞移植。
主要目的：确定多个供体辐照的凋亡细胞治疗的安全性和耐受性。
次要目的：确定来自多个个体供体的辐照的凋亡细胞作为对计划进行造血干细胞移植(HSCT)的患有血液系统恶性肿瘤的患者的急性GVHD(aGVHD)的预防措施的功效。对于本研究的目的，HSCT可以是骨髓移植(BMT)或外周血干细胞移植(PBSCT)。
治疗适应症：人白细胞抗原(HLA)匹配的、相关的和不相关的患者的血液系统恶性肿瘤中的移植后移植物抗宿主病(GVHD)。
研究设计:这是一项开放研究，多中心、1/2a期研究，患者被诊断患有血液系统恶性肿瘤，计划从HLA匹配的相关或不相关供体接受HSCT(骨髓移植或外周血干细胞移植)，采用完全清髓或降低强度的清髓调理方案。
在接受患者签署知情同意书、供体筛选期并在开始调理方案之前收集细胞后，分配合格的受体患者(通过预防性治疗和相关与非相关移植供体按1:1比例分层)在HSCT移植前12-36小时接受如下静脉内注射(IV)：
研究臂(Investigational Arm):单剂在磷酸盐缓冲液(PBS)中的来自多个个体供体的140×106±20％细胞/kg(辐照的早期凋亡细胞/kg体重)。
所有患者还用机构护理标准(SOC)免疫抑制方案治疗：环孢菌素/甲氨蝶呤或他克莫司/甲氨蝶呤用于完全清髓，霉酚酸酯/环孢菌素或霉酚酸酯/他克林用于降低强度的清髓。患者将按照医学指示住院。
对于次要疗效终点，患者将进行180天随访，对于主要安全性和第三功效终点，将进行1年随访。参加本研究的患者的就诊次数与患者在其条件下的常规就诊次数相当。对于供体，在筛查期间进行研究特定出诊用于采血程序。
由于这些患者有许多潜在的医学状况并且可能经历与aGVHD相容的症状，因此尽管存在来自用凋亡细胞预防GvHD的先前1-2a期研究的基础数据，但可能很难绝对确定毒性是否与凋亡细胞有关(Mevorach et al.(2014)Biology of Blood and MarrowTransplantation 20(1):58-65)Single Infusion of Donor Mononuclear EarlyApoptotic Cells as Prophylaxis for Graft-versus-Host Disease in MyeloablativeHLA-Matched Allogeneic Bone Marrow Transplantation:A Phase I/IIa ClinicalTrial.BBMT 20(1)58-65)。
数据安全监视委员会(DSMB)将按照DSMB章程中的规定开会，包括在计划的临时分析时(180天)，前提是之前没有安全隐患。
研究程序：
本研究包括筛选、治疗和随访期。
1.筛选期(第-60天到第-2天)
潜在的接受患者将在进行任何与研究相关的程序之前签署知情同意书。批准之前的标准评估由移植中心在筛选期为供体进行，通常包括：人口统计学数据、病史、HLA匹配状态验证(无需匹配)、体检、身高和体重、生命体征、妊娠测试(所有女性)、血液学、血液化学、传染病筛查、ECG和尿液分析。
接受者(研究患者)在筛查期间接受以下评估：人口统计学数据、病史、Karnofsky体力状态、HLA匹配验证、体检、身高和体重、生命体征、妊娠测试(所有女性)、ECG、肺功能测试、血液学、血液化学、凝血指标、传染病筛查和尿液分析。
在初步筛选评估之后，如果接受者合格参加研究，则受体患者将在预处理方案(conditioning regimen)的第一天接受单次IV输注140×106±20％细胞/kg的多供体凋亡细胞。预处理方案在计划在研究第-1天进行的凋亡细胞输注的前一天或当天完成。
凋亡细胞剂量针对每一受体患者计算并据此确定假定的血液分离术收集数目和供体数目。
对于外周干细胞移植供体：在第-6至第-1天之间，供体每天接受一次或多次G-CSF注射以动员祖细胞，在第0天进行血液分离术以生成用于移植的供体造血干细胞。用于骨髓移植的造血干细胞的制备由经培训的医院工作人员按照中心的标准操作进行。用于HSCT的造血干细胞在施用前不进行操作或T细胞耗竭。
对于骨髓移植供体：根据中心标准实践收集和制备骨髓，并且不进行其它操作
2.治疗日(第-1天)
在第-1天(HSCT之前12-36小时)，合格患者接受单次IV输注140×106±20％细胞/kg的多个个体供体辐照的早期凋亡细胞。输注期间每小时监测一次生命体征，此后的前24小时每4小时监测一次。输注后立即评估与治疗相关的AE。
在第0天，患者根据当地机构指南进行造血干细胞移植。
3.短期随访期(第0天到第180天)
患者将接受随访至研究第180天，以评估主要终点安全性和耐受性以及次要和第三终点：aGVHD II-IV级的累积发生率(基于Przepiorka等人的“改良的Glucksberg”共识)，任何级别和高级别aGVHD的累积发生率，即II-IV级aGVHD发生的时间；对GVHD的任何系统性治疗以及cGVHD的发展。
短期随访在住院进行移植期间(通常至少为第-1至+14天或更多)每天进行，出院后的前7周每周一次；第+7、+14、+21、+28、+35、+42天，然后在第60、100、140和180天。随访窗口在每周一次(前7周)为±5天，在直至180天随后随访期间每两周或更多次随访的随访窗口为±5天。
在第1、3、7、+7、+28、+42、60、100、140和180天获得血样并检查其移植、免疫恢复、血浆和血清生物标记的记录(“Michigan”)和细胞亚群。
4.长期随访期(第181天至第365天/1年)
HSCT后患者将被随访一年，以获得更长期次要终点：非复发死亡率和总生存期(OS)、复发率、无白血病生存期(LFS)和慢性GVHD。至少要进行两次长期随访，最后一次是在HSCT之后的12±1个月。
研究持续时间：对于每个参与患者，研究持续时间将长达14个月，如下：
筛选长达60天(2个月)
治疗1天
随访365天(12个月)，包括
短期:180天
长期+180天
研究人群：按照中心标准实践，本研究中将包括总共25名被诊断为患有血液系统恶性肿瘤计划进行HSCT(骨髓移植或外周血干细胞移植)的患者，至少15名不相关供体，采用清髓或降低强度预处理方案，这项研究将与历史对照进行比较。
包括/排除标准：
受体患者排除标准
1.患者，年龄>18，合格接受针对以下恶性肿瘤的同种异基因HSCT：
急性髓样或未分化或双表型白血病，完全缓解(任何缓解)或更高，但骨髓中形态学有<5％胚细胞(blast)。
完全缓解的急性髓样白血病(AML)，如果是从骨髓增生异常综合征(MDS)演变而来的(应在诊断急性髓样白血病之前至少3个月有记录诊断为MDS)。或从真性红细胞增多症或原发性血小板增多症演变而来。
完全缓解(任何缓解)的急性淋巴母细胞性白血病(ALL)，骨髓中形态学有<5％胚细胞。
慢性期或加速期慢性髓样白血病(CML)
骨髓增生异常综合征–难治性血细胞减少症伴多谱系发育不良(RCMD)、RA(难治性贫血)、RA伴有环形铁幼粒红细胞(RARS；所有<5％胚细胞)，胚细胞过多RA(RAEB；5％至20％胚细胞)
移植供体和受体患者必须在HLAA、B、C、DQ和DR基因座上至少具有8/8HLA匹配并且没有抗原或等位基因错配。然而，用于凋亡细胞形成的白细胞的供体不限于HLA匹配。
筛选访问时的行为状态得分至少为70％(Karnofsky用于成人，Lansky用于<16岁的受体)。
在开始预处理的4周内，成年人的心脏左心室射血分数≥40％；如果先前有蒽环类药物暴露或有心脏病史，则需要进行MUGA扫描或心脏ECHO。
肺功能测试，预测的DLCO1、FEV1(用力呼气量)和FVC(用力肺活量)≥60％。
在室内空气下氧饱和度至少90％。
患者必须具有如下定义的合适器官功能：
AST(SGOT)/ALT(SGPT)<3x正常上限(ULN)。
血清肌酐<2.0mg/dL(成人，>16y)或<0.8(1-2y)，<1(3-4y)，<1.2(5-9y)，<1.6(10-13y)，和1.8(14-15y)。
血清胆红素<3mg/dL，除非是由于Gilbert's病或溶血
参加研究的签署的书面知情同意书，由患者或监护人(未成年人)签署。
遵守研究要求的能力
对于4周的持续时间(从第-1天起)，男性和女性必须同意：
如果有BMT相关限制，则使用可接受的节育方法或在第一个月或更长时
Figure BDA0002458147110001321
间手术不育
不管是否有生育能力，妊娠测试均为阴性
受体患者排除标准
在包括标准中未规定的所有合格进行HSCT的疾病。
在筛选访视的30天内参加了一项介入性研究实验。
具有进行性或控制不良的恶性肿瘤。
如果BMT计划包括T细胞耗竭的同种异体移植。
如果BMT计划包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)或阿仑珠单抗作为免疫抑制方案或高剂量环磷酰胺治疗的一部分以预防移植后GVHD。
在筛选访视的两周内，有包括败血症，低氧血症性肺炎，持续性菌血症或脑膜炎在内的不受控制的感染。
当前已知的活动性急性或慢性HBV或HCV感染。
已知的人免疫缺陷病毒(HIV)感染。
患有严重或有症状的限制性或阻塞性肺病或需要呼吸机支持的呼吸衰竭的患者。
患有其它可能会影响研究参与的并发的严重和/或不受控制的医疗状况的患者(即活动性感染，失控的糖尿病，失控的高血压，充血性心力衰竭，不稳定型心绞痛，室性心律失常，活动性缺血性心脏病，心肌梗塞六个月内，慢性肝或肾病，活动性上消化道溃疡)。
任何可能干扰对研究产品效果的评估的慢性或急性状况。
任何形式的物质滥用(包括药物滥用或酒精滥用)，精神紊乱或根据研究者意见的任何易干扰研究进行的慢性状况。
器官同种异体移植或者有干细胞移植(仅同种异基因)史。
有生育能力的妇女的母乳喂养。
在研究期间可能不依从或不合作的患者。
研究产品路线和剂型
在HSCT之前12-36小时以静脉内输注140×106±20％细胞/kg的辐照的多供体凋亡细胞产品施用凋亡细胞。
凋亡细胞是一种由多个体供体的凋亡细胞组成的基于细胞的治疗剂。该产品含有液体悬浮液形式的同种异基因供体单个核富集的细胞，其中至少40％为早期凋亡细胞。悬浮液是根据GMP规定从多个体供体用PBS溶液制备并且应保存在2-80℃直至输注。终产品在不透明的转移包装中总体积为300-600mL，制备后用25Gy辐照。研究性产品应在完成制造过程后的48小时内给患者施用。
安全性结果/功效终点/结果指标
主要:
安全性和耐受性终点包括移植的时间和体检以确定不良事件，第180天和第360天(1年)的伴随用药和安全性实验室。此外，预期辐照的合并的凋亡细胞制备物将显示缺乏体外和体内细胞增殖以及缺乏体内活化。这样的显示将合并的凋亡细胞制备物鉴定为可安全使用。
次要：
在第180天，基于(Rowlings et al.1997,IBMTR Severity Index for gradingacute graft-versus-host disease:retrospective comparison with Glucksberggrade.Br J Haematol.1997Jun；97(4):855-64))使用“改良的Glucksberg”共识确定II-IV级aGVHD的累积发生率
1年非复发死亡率和总生存率(OS)
1年复发发生率
1年无白血病生存率(LFS)
前180天内的aGVHD最高级别
III-IV级aGVHD的累积发生率
在180天和360天(1年)根据(Jagasia et al.,2015)的慢性GVHD发生率
在第20天至第180天用于治疗aGvHD的任何“全身性治疗”，包括皮质类固醇(是否使用和累积剂量)
第+28、100、180和360天(1年)与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞有关的免疫重建和功能
在第180天和1年内的主要感染率(包括肺部浸润、CMV重新激活和任何其它需要住院的感染)
第三/探索性的：
住院天数占总风险天数或存活和离开医院的总天数的百分比。或直到移植后首次出院的总住院天数。
器官特异性GVHD
第180天的T reg,CD4 Tcon,CD8,NK和B细胞水平
统计学分析:
将研究结果与具有相似基线特征的个体的历史对照进行比较。
描述性统计将用于总结结果指标和基线特征。在此分析中，将提供所有可用数据，而不会对任何丢失的数据进行估算。对象将提供可用的数据，直至退出或研究完成或死亡。描述性统计数据(例如平均值，中位数，标准差，最小值和最大值)将用于汇总连续变量。安全性分析包括接受凋亡细胞输注的所有对象。还接受HSCT的对象将包括在功效分析中。由于这项研究本质上是探索性的，因此计划进行ad hoc分析。
样品大小考虑
总共将包括25名患者，至少15名匹配的无关患者将入选。凋亡细胞(活性提供给所有根据GVHD预防方案分层的以及相关或不相关的移植供体)。
群分析定义
所有功效分析将在意向性治疗(ITT)人群中进行并与适当的历史对照进行比较。安全性人群定义为接受研究药物剂量的所有患者。
统计学方法
将根据情况使用频率和百分比或中位数(范围)来描述患者、疾病和移植物特征。
安全性分析
描述性统计数据将用于总结安全性结果，重点是在研究治疗输注和HSCT程序(24-30小时窗口)之间报告的AE。DSMB审查不会引起研究行为的改变，包括样本量调整。这样，由于过渡分析的结果，不需要对整个I类错误进行罚分调整。
次要终点分析
使用在aGVHD之前死亡的累积发病率估算器作为竞争事件来描述II-IV级aGVHD。
使用复发累积发生率作为TRM的竞争事件、死亡作为所有其它的竞争事件，描述中性粒细胞和血小板恢复，III-IV级aGVHD，慢性GVHD，感染，复发以及移植相关死亡率。整体生存率和无白血病生存率将使用Kaplan-Meier估算器进行描述。分别使用Mann-Whitney U检验和卡方检验通过频率和百分比来描述前180天内aGVHD的最高等级和180天内对类固醇的需求。使用中位数和范围Mann-Whitney检验在每个时间点描述每个细胞亚群和TREG的免疫恢复。
实施例15:在GVHD白血病/淋巴瘤模型中合并的凋亡细胞制备物与单供体凋亡细胞制备物的比较
目的:将从单供体获得的人早期凋亡细胞对GvHD鼠模型中GvHD严重性的有益临床效果与从多个体供体获得的人早期凋亡细胞对GvHD鼠模型中GvHD严重性的临床效果(如果有)进行比较，其中多个体供体代表HLA不匹配的异源供体。
上面的实施例12显示了从多个体供体合并的辐照的凋亡细胞的有益效果。图28和图29所示的结果令人惊讶，因为本领域技术人员可能认识到，多种来源的不匹配细胞可能增加细胞抗原性的多样性，因此可以会预期临床效果会大大降低。出乎意料的是，合并的不匹配早期凋亡细胞也降低了早期凋亡细胞对降低GvHD严重性及因此延长直至死亡的天数的已知有益效果(图28)，据信这是由于合并的多个不匹配源细胞的增加的抗原性。
另一个目的是了解使用辐照的早期凋亡细胞和非辐照的凋亡细胞之间的区别。
本领域技术人员将理解，不匹配的辐照的细胞保持其抗原性谱，被APC机制识别以及因此被其所输注宿主的T细胞识别。因此，在合并异源不匹配细胞群时关注的问题包括合并的各群体之间的交叉反应性，合并的群体的混合细胞淋巴反应，或者在合并的群体之间的可能减少或消除细胞的T细胞免疫反应，或其任何组合。
方法
小鼠模型:在不匹配GVHD模型中，雌性7-9周龄BALB/c小鼠(H-2d)用作受体，雌性8-9周龄C57BL/6小鼠(H-2b)用作供体。在骨髓和脾细胞移植前24小时以850cGy对受体进行全身辐照。供体骨髓细胞用于骨髓重建。用RPMI 1640从股骨和胫骨提取骨髓细胞。裂解红细胞，然后洗涤细胞并用PBS重悬。使用台盼蓝染料排除法评估存活力(>90％存活力)。供体脾细胞用于诱导GVHD。取出脾，匀浆，获得单细胞悬液。裂解红细胞，用PBS重悬脾细胞。至少90％活细胞用台盼蓝染料评估。
早期凋亡细胞：类似于实施例1，从来自健康供体的单个核富集的细胞级分血液分离术产生凋亡细胞。简而言之：
通过白细胞分离术从健康合格供体获得单个核细胞(MNC)富集级分。除400-600ml自体血浆外，还通过Spectra
Figure BDA0002458147110001351
血液分离系统从12升血液中收集细胞。来自供体的富集的单个核细胞级分的估计收率预期约为1.2-1.5×1010个细胞。在进行白细胞分离术之前，对供体进行测试并确认对以下病毒载体呈阴性：
1.人免疫缺陷病毒(HIV)，1型和2型；
2.乙型肝炎病毒(HBV)；
3.丙型肝炎病毒(HCV)；
4.巨细胞病毒(CMV)；
5.梅毒螺旋体(Treponema pallidum(syphilis))；
6.人亲T淋巴细胞病毒(HTLV)，I型和II型。
收集细胞后，细胞用RPMI洗涤并如下冷冻。冷冻配制物组成如下：用于注射的PlasmaLyte A pH7.4、10％DMSO、5％人血清白蛋白和接种有10U/ml肝素的5％抗凝剂柠檬酸葡萄糖溶液。
冷冻培养基在袋子中制备，冷冻程序是在封闭系统中在cGMP条件下进行。
白细胞分离术完成后，将富集的MNC级分用PlasmaLyte A洗涤并用冰冷的冷冻培养基重悬至50-65×106细胞/ml的浓度。然后将细胞转移到冷冻袋中，将袋子转移到预冷的铝盒中，然后将盒立即转移到-18℃至-25℃保持2小时。
2小时后，将盒子转移到-80℃再保持2小时，然后在液氮中长期储存(>-135℃)。
自体血浆分成50g等份。血浆等份转移至-80℃保持2小时，然后在-18℃至-25℃长期储存。
为诱导凋亡，将细胞解冻并用预热的RPMI1640洗涤，所述RPMI1640含有10mMHepes缓冲液、2mM L-谷氨酰胺和接种有10U/ml肝素的5％抗凝柠檬酸葡萄糖溶液。上清液提取后，将细胞以终浓度为5×106/ml重悬于RPMI 1640中，该RPMI 1640中补加10mMHepes、2mM L-谷氨酰胺并添加10％自体血浆和50μg/ml甲泼尼龙和用10U/ml肝素接种的5％抗凝柠檬酸葡萄糖溶液。然后将细胞转移到细胞培养袋中，并在37℃和5％CO2的加湿培养箱中保温6小时以稳定凋亡。
保温后收获细胞，用PBS洗涤，重悬于PBS中。
早期凋亡细胞产品是由一个单个供体或组合的10个不同个体供体产生的，在组合这种情况下，在即将辐照前组合细胞。由于可能在多供体产品的组分之间发生干扰，例如在活的非凋亡细胞之间，因此将早期凋亡细胞产品细分并在施用前用2500cGy辐照待体内测试的早期凋亡细胞样品(样品F)，并在2-8℃保存直至施用。下文实施例6的表3给出了早期凋亡细胞产品的膜联蛋白V阳性/碘化丙啶阴性比率和细胞表面标记的细节，证实施用给小鼠的凋亡细胞的一致性得以维持。终产品在2-8℃稳定48小时。
在移植当天，小鼠根据如下实验设计接受5×106骨髓细胞、3×106脾细胞和30×106单供体或多供体早期凋亡细胞产品：
辐照对照
重建对照-辐照+骨髓移植(BM)
GVHD对照-辐照+骨髓和脾细胞移植
单供体，辐照的-辐照+骨髓和脾细胞移植+来自单供体的辐照的早期凋亡细胞产品
单供体，未辐照的-辐照+骨髓和脾细胞移植+来自单供体的未辐照的早期凋亡细胞产品
多供体，辐照的-辐照+骨髓和脾细胞移植+来自多供体的辐照的早期凋亡细胞产品
多供体，未辐照的-辐照+骨髓和脾细胞移植+来自多个体供体的未辐照的早期凋亡细胞产品
监测-标记移植的小鼠并监测存活。在实验的前两周，每两天评估一次体重，然后每天评估一次。确定从初始体重减轻35％作为主要终点，处死小鼠并相应更新存活曲线。体重结果与实施例12图29中观察到的结果相当。
GVHD的严重程度用已知的评分系统评估(Cooke KR,et al.An experimentalmodel of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrowtransplantation.I.The roles of minor Hantigens and endotoxin.Blood.1996；8:3230–3239)，其包括5种临床参数：体重减轻、姿势(驼背)、活动、毛皮质地和皮肤完整性。对小鼠进行评估并针对每个标准从0到2分级。通过对五个临床评分的总和，产生临床指标值(指标数随GVHD的严重性而增加)。
结果
图30以图形方式显示了不同小鼠群的存活百分比。仅接受辐照的对照小鼠在第8-12天之间死亡(n＝13)，这与从未接受骨髓重建的小鼠预期的相同。大多数GVHD对照小鼠(接受骨髓和脾)在第6-27天之间死亡。一只小鼠没有死亡(n＝18)。在骨髓重建对照组(BM)中，七只小鼠中有三只在第6-8天之间死亡。在其余小鼠中，骨髓被供体骨髓重建，小鼠存活(>50天)。
单供体、未辐照的小鼠在第15-36天之间死亡。因此，如前所示，单供体、未辐照的早期凋亡细胞具有有益效果并且存活时间延长(p＜0.01)。
单供体、辐照的小鼠在第7-35天之间死亡，一只小鼠保持无病生存(>50天)。这表明单供体辐照的凋亡细胞也提供了针对GVHD的有益作用。因此，辐照不会损害早期凋亡细胞的免疫调节作用。与GVHD对照相比，所有这些均对GVHD鼠模型的存活产生了有益作用(p＜0.01)。
与GVHD对照相比，未辐照的多供体治疗未提供有益作用(n＝11)。存活模式与GVHD对照相似并且小鼠在第6-28天之间死亡(p＝NS-不显著)。令人惊奇地并且与未辐照的凋亡细胞相反，与GVHD对照相比，辐照的多个体供体凋亡细胞(治疗F)(n＝10)具有与单供体治疗相似的有益作用。GVHD症状出现显著较晚，小鼠在第18-34天之间死亡(p＜0.01)。
辐照的多个体供体(n＝10)、辐照的单供体(n＝10)和未辐照的单供体治疗(n＝10)具有相似的存活模式，在这三个治疗组之间未观察到存活作用的显著差异。
实验显示凋亡细胞输注在GVHD诱导的小鼠中有明确作用。辐照的多个体供体以及辐照的和非辐照的单供体凋亡细胞治疗有显著延长存活的作用。
多供体治疗在未辐照时未延长小鼠存活，但是在施用小鼠之前辐照凋亡细胞改善结果并且治疗具有与单供体治疗相近的存活模式。
如上所述，图30显示，与以下(1)-(3)相比，得自多个不匹配供体的未辐照的凋亡细胞对于降低GvHD和死亡率(％存活)具有显著更低的正面临床效果：(1)得自单个不匹配供体的未辐照的凋亡细胞；(2)得自单个不匹配供体的辐照的凋亡细胞；和(3)得自多个不匹配供体的辐照的凋亡细胞。此外，所有三种(未辐照的早期凋亡细胞，单供体；辐照的早期凋亡细胞，单供体；和辐照的早期凋亡细胞，多个体供体)具有相似效果。
这个数据令人惊讶，因为预期得自多个体供体的未辐照的凋亡细胞的抗原性与得自多个体供体的辐照的凋亡细胞的抗原性相似，为什么不是两者都具有相似的与移植的骨髓的敌对性抗原反应，以及为什么不是两者都能降低GvHD和死亡率？
如果抗原性在这里是主要问题，则可以预期看到得自单供体的未辐照的凋亡细胞与得自单供体的辐照的凋亡细胞的临床效果之间的差异。但是，数据没有显示这种差异。
一种可能性是由多个体供体制备的未辐照的合并的凋亡细胞制备物缺乏功效是由于存在于合并的制备物中的各个单个核细胞群之间的交叉相互作用所致。这些相互作用似乎不直接归因于对宿主的抗原性，因为辐照的细胞保持其抗原性，但功效与未辐照的细胞显著不同。因此，似乎在接受辐照的合并的早期凋亡细胞制备物中的交叉相互作用被意外地消除，并且宿主对细胞施用应答良好。
如所示，辐照的合并的供体具有与未辐照的单供体基本上相同的效果。
实施例16:辐照对最终凋亡细胞产品的作用
凋亡细胞因其固有的免疫调节和抗炎特性而越来越多地用于新型治疗策略。早期凋亡细胞制备物可含多达20-40％的活细胞(通过缺少PS暴露和无PI接纳而测量；膜联蛋白V阴性和碘化丙啶阴性)，其中一些在转输后可能会凋亡，但有一些会保持存活。在从匹配供体进行骨髓移植的情况下，活细胞并不代表临床问题，因为受体已经在实际移植中接受了更多的活细胞。但是，在第三方转输的情况下(或第四方或更多方，如合并的单个核凋亡细胞制备物所代表的)，使用包括活细胞的凋亡细胞群可能会引入第二种GvHD诱导剂。此外，迄今为止尚未评估辐照对早期凋亡细胞的免疫调节潜力的影响。本领域技术人员可能考虑对早期凋亡细胞群的额外辐照可以导致细胞进入后期的凋亡或坏死。由于这在临床应用方面似乎是一个特别相关的问题，因此下面介绍的实验旨在解决这一问题，至少一个目标是改善功能性凋亡细胞的生物安全性。
因此，目的是促进凋亡细胞在许多适应症中的临床应用，其中凋亡细胞的效力可依赖于旁观者效应而不是移植细胞的植入。
目的：检查辐照对早期凋亡细胞的作用，其中辐照在诱导凋亡之后发生。
方法(简述):基本如实施例5所述收集细胞和制备早期凋亡细胞。
3个独立的早期凋亡细胞批次在不同日期制备(集合404-1、0044-1和0043-1)。
每个终产品分成3组：
未处理
2500rad
4000rad.
辐照后，立即(t0)测试早期凋亡细胞的细胞计数、膜联蛋白V阳性-PI阴性染色、细胞表面标记(％不同细胞类型细胞群)和效力(树突细胞(DC))。在t0检查后，早期凋亡细胞在2-8℃保存24小时，第2天用相同测试组检查(t24h)(细胞计数、膜联蛋白V阳性-PI阴性染色和细胞表面标记和效力)。
先前开发了一种释放后效力测定，该测定评估了供体单个核早期凋亡细胞(Earlyapoptotic Cells1)诱导耐受的能力(Mevorach et al,BBMT 2014，同上)。该测定基于使用流式细胞术评估在暴露于LPS后iDC膜上MHC II类分子(HLA-DR)和共刺激分子(CD86)的表达。如先前和反复所示，致耐受性DC可在与凋亡细胞相互作用时产生(Verbovetsky etal.,J Exp Med 2002,Krispin et al.,Blood 2006)，以及LPS处理的DC的成熟抑制(抑制DR和CD86表达)以剂量依赖性方式发生。
在早期凋亡细胞临床研究的1/2a期，对每个早期凋亡细胞批次进行了释放后效力测定(总体结果n＝13)以评估每个批次诱导耐受的能力(结果示于图1，Mevorach et al.(2014)Biology of Blood and Marrow Transplantation 20(1):58-65)。
从收集自未知且不相关健康供体的新鲜血沉棕黄层中的每个早期凋亡细胞批次产生DC并以不同比例(分别为1:2、1:4和1:8的DC:早期凋亡细胞)与早期凋亡细胞组合。与早期凋亡细胞保温并暴露于LPS后，根据在DC:早期凋亡细胞的一种或多种比率下HLA DR或CD86的DC膜表达的下调确定效力。在所有13个测定中，早期凋亡细胞均表现出剂量依赖性方式的致耐受性作用，这在大多数DC:早期凋亡细胞比例的制备物中以及针对这两种标记物均观察到。
单核细胞获得的未成熟DC(iDC)从健康供体的外周血PBMC中产生并在1％自体血浆、G-CSF和IL-4存在下培养。然后将iDC与凋亡细胞以1:2、1:4和1:8的比例预保温2小时，这些凋亡细胞可以是新鲜制备的终产品也可以是在2-8℃保存24小时的终产品。为确定储存是否影响凋亡细胞的效力能力，同时检查了两种终产品。保温后，将LPS加入指定孔中，再放置24小时。保温结束时，收集iDCS，洗涤并用DC-sign和HLA-DR或CD86染色以确定表达变化。使用流式细胞仪分析细胞并使用FCS-express软件从DC-sign阳性细胞门控进行分析以确保仅在DC上进行分析。
图31A和31B以及图32A和32B显示与非辐照单供体细胞相比，辐照的合并的凋亡细胞的效力测试。
结果：
单供体制备物
表21示出非辐照和辐照的凋亡细胞的比较结果；在24小时平均细胞损失(％)；在0小时和24小时膜联蛋白阳性(+)碘化丙啶(PI)阴性(-)％(％早期凋亡细胞)；在0小时和24小时膜联蛋白阳性(+)碘化丙啶(PI)阳性(+)％(％晚期凋亡细胞)；在0小时和24小时细胞表面抗原CD3(T细胞)、CD19(B细胞)、CD56(NK细胞)、CD14(单核细胞)和CD15high(粒细胞)的存在。
表21:
Figure BDA0002458147110001401
表21中的结果表明，未辐照的凋亡细胞和辐照的凋亡细胞具有相当的早期凋亡细胞(第2和3行)和晚期(第4和5行)凋亡细胞百分比。因此，在这种高水平的γ辐照之前，25Gy或40Gy辐照不会加速诱导的凋亡或坏死过程。此外，就细胞类型而言，辐照的细胞群与对照非辐照群之间具有一致性。
图31A-31B(HLA-DR表达)和图32A-32B(CD86表达)中显示的效力测定结果表明，当与未辐照的凋亡细胞相比时，新鲜的(图31A，图32A)和储存24小时的(图31B和图32B)辐照的凋亡细胞的免疫调节能力没有变化。
在图31A-31B和图32A-32B中，暴露于成熟剂LPS后，HLA-DR和CD86表达均明显上调。在来自单个供体或辐照的合并供体的新鲜制备的凋亡细胞的存在下，观察到这两种共刺激标记物的显著的(p<0.01)剂量依赖性下调。另外，在2-8℃储存24小时的凋亡细胞存在的情况下，这两种标记物均保持剂量依赖性下调，这表明储存24小时后的终产品稳定性和效力。
对树突细胞的作用,为测试凋亡细胞的免疫调节能力，使用了释放后效力测定(Mevorach et al.,(2014)BBMT,同上)。在树突细胞的免疫调节测定中未观察到变化。(数据未示出)
对混合淋巴细胞反应(MLR)的作用为进一步测试免疫调节作用，建立了标准化的MLR测定法。在这里，刺激细胞和应答细胞即MLR的共培养产生强而可靠的增殖。在将未辐照的凋亡细胞添加到MLR后，淋巴细胞增殖显著降低了5倍以上，清楚表明细胞的增殖抑制作用。辐照的凋亡细胞介导的MLR中淋巴细胞增殖的抑制作用是完全相当的。(数据未示出)
下一步是在完全不匹配小鼠模型中体内评估辐照和未辐照的凋亡细胞。如图28和29所示，辐照和未辐照的早期凋亡细胞制备物在体内具有相当的有益效果。
单供体制备物：
结论是25Gy或40Gy辐照不会显著加速凋亡细胞群的凋亡或诱导坏死。显著的是，这些细胞群在体外和体内均保持凋亡细胞的免疫调节作用。
多供体制备物：
接下来，进行实验以验证用单供体、第三方制备物所观察到的现象对于多个第三方供体也是正确的。出乎意料的是，当使用合并的个体供体凋亡细胞制备物时，单个不匹配供体的有益效果丧失(图30)。这不是由于GvHD所致，因为每个供体分别的有益效果是保持的(未显示测试结果)。一种可能性是，由于个体供体细胞之间的相互作用使得早期凋亡细胞制备物的有益效果丧失。进一步检查了是否可以通过γ辐照避免不同供体的这种可能的相互作用。
如图30所示，单供体的有益效果在γ辐照后完全恢复，其中辐照的多供体制备物和单供体制备物(辐照的或非辐照的)具有相似的存活模式。
结论：
这里首次显示出，令人惊讶地，在使用多供体第三方凋亡细胞的制备物时，辐照(以及可能导致T细胞受体抑制的任何方法)不仅避免了T细胞的不希望的增殖和活化，而且也带来了免疫调节的有益效果。
尽管本文中已例证和描述了本文所公开的一些特征，但是本领域普通技术人员现在可以想到许多修改、替代、改变和等价物。因此应理解，所附权利要求书旨在涵盖落入本文所公开的真实精神内的所有此类修改和改变。

Claims (39)

1.一种治疗、预防对象中的癌症或肿瘤、抑制对象中癌症或肿瘤的生长、延缓对象中癌症或肿瘤的疾病进展、降低对象中癌症或肿瘤的肿瘤负荷、或降低对象中癌症或肿瘤的发生率或其任意组合的方法，包括给所述对象施用包含早期凋亡细胞群的组合物的步骤，其中与未施用所述早期凋亡细胞群的对象相比，所述方法治疗、预防所述对象中的癌症或肿瘤、抑制所述对象中癌症或肿瘤的生长、延缓所述对象中癌症或肿瘤的疾病进展、降低所述对象中癌症或肿瘤的肿瘤负荷、或降低所述对象中癌症或肿瘤的发生率，或其任意组合。
2.权利要求1的方法，其中所述癌症或肿瘤的大小或生长速度或其组合被降低。
3.权利要求1的方法，其中所述对象的存活增加。
4.权利要求1的方法，其中所述早期凋亡细胞群包含：
a.单个核富集的细胞群；或者
b.稳定超过24小时的凋亡群；或者
c.没有细胞聚集体的凋亡群；或者
d.单个核凋亡细胞群，其包含减少的非静止非凋亡细胞、细胞活化被抑制的任意活的非凋亡细胞、或者增殖降低的任意活的非凋亡细胞，或其任意组合；
及其任意组合。
5.权利要求1的方法，其中所述早期凋亡细胞群包含合并的早期凋亡细胞群。
6.权利要求1的方法，其中所述对象是人。
7.权利要求1的方法，其中所述癌症或肿瘤包含实体瘤或非实体瘤。
8.权利要求7的方法，其中所述非实体癌或肿瘤包含造血系统恶性肿瘤，血细胞癌，白血病，骨髓增生异常综合征，淋巴瘤，多发性骨髓瘤(浆细胞骨髓瘤)，急性淋巴母细胞性白血病，急性髓性白血病，慢性髓性白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤或浆细胞白血病。
9.权利要求7的方法，其中所述实体瘤包含肉瘤或癌，纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨性肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，Ewing’s瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，胰腺癌或肿瘤，乳腺癌或肿瘤，卵巢癌或肿瘤，前列腺癌或肿瘤，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管原癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，Wilm’s肿瘤，子宫颈癌或肿瘤，子宫癌或肿瘤，睾丸癌或肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，神经鞘瘤，脑膜瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤。
10.权利要求1的方法，其中所述肿瘤或癌症包含肿瘤或癌症的转移。
11.权利要求1的方法，其中所述施用包含单次输注所述早期凋亡细胞群。
12.权利要求1的方法，其中所述施用包含多次输注所述凋亡细胞群。
13.权利要求1的方法，进一步包含给所述对象施用额外的免疫治疗、化疗剂或免疫调节剂或其任意组合。
14.权利要求13的方法，其中所述额外的免疫治疗、化疗剂或免疫调节剂在施用所述早期凋亡细胞之前、同时或之后施用。
15.权利要求13的方法，其中所述免疫治疗包含施用CART细胞。
16.权利要求15的方法，其中与施用了CART细胞但未施用早期凋亡细胞的对象相比，所述方法增加所述CART细胞的功效。
17.权利要求13的方法，其中所述免疫调节剂包含抗体或其功能片段。
18.权利要求17的方法，其中所述抗体或其功能片段包含利妥昔单抗(RtX)抗体或其功能片段。
19.权利要求1的方法，其中所述方法包含一线治疗。
20.权利要求1的方法，其中所述方法包含辅助治疗。
21.权利要求1的方法，其中所述方法减少最小残留疾病，增加缓解，增加缓解持续时间，降低肿瘤复发率，防止所述肿瘤或所述癌症的转移，或降低所述肿瘤或所述癌症的转移率，或其任意组合。
22.包含处于早期凋亡状态的单个核细胞的单个核凋亡细胞群，其中所述单个核凋亡细胞群包含：
(a)百分比降低的非静止的非凋亡的活细胞；
(b)细胞活化被抑制的任意活的非凋亡细胞；或者
(c)增殖降低的任意活的非凋亡细胞；
或其任意组合。
23.权利要求22的细胞群，其中所述百分比降低的非静止的非凋亡的活细胞少于10％。
24.权利要求22的细胞群，其中所述单个核凋亡细胞群不包含活的非凋亡细胞。
25.权利要求22的细胞群，其中所述单个核细胞群选自：淋巴细胞，单核细胞，树突细胞和自然杀伤细胞。
26.权利要求22的细胞群，其中所述单个核凋亡细胞群在早期凋亡细胞产生之后被辐照。
27.权利要求26的细胞群，其中所述辐照包含γ辐照或UV辐照。
28.权利要求26的细胞群，其中与未辐照的凋亡细胞群相比，所述经辐照的细胞群的每个群的非静止非凋亡细胞百分比降低。
29.一种药物组合物，其包含权利要求22的群和药学上可接受的赋形剂。
30.一种产生单个核凋亡细胞群的方法，所述细胞群包含百分比降低的非静止非凋亡活细胞；细胞活化被抑制的任意活的非凋亡细胞；或增殖减少的任意活的非凋亡细胞；或其任意组合，所述方法包括以下步骤，
(a)获得单个核富集的外周血细胞群；
(b)将所述单个核富集的细胞群在包含抗凝剂的冷冻培养基中冷冻；
(c)解冻所述单个核富集的细胞群；
(d)将所述单个核富集的细胞群在包含终浓度约10-100μg/mL的甲泼尼龙和抗凝剂的凋亡诱导保温培养基中保温；
(e)将所述凋亡细胞群重悬于施用培养基中；及
(f)使所述单个核富集的细胞群失活，其中所述失活发生在步骤(e)之后，
其中所述方法产生这样的单个核凋亡细胞群，其包含百分比降低的非静止非凋亡细胞、细胞活化被抑制的任意活的非凋亡细胞、或增殖降低的任意活的非凋亡细胞、或其任意组合。
31.权利要求30的方法，其中所述失活步骤包括在所述单个核凋亡细胞制备物中降低非静止非凋亡细胞的百分比、抑制任何活的非凋亡细胞的细胞活化、或降低任何活的非凋亡细胞的增殖、或其任意组合。
32.权利要求31的方法，其中所述非静止非凋亡细胞的百分比降低至大约10％。
33.权利要求31的方法，其中所述非静止非凋亡细胞的百分比降低至大约0％。
34.权利要求30的方法，其中所述单个核富集的细胞群选自淋巴细胞、单核细胞、树突细胞和自然杀伤细胞。
35.权利要求30的方法，其中所述保温大约2-12小时。
36.权利要求30的方法，其中所述步骤(f)使所述单个核富集的细胞群失活包括抑制或消除免疫应答、抑制或消除细胞的交叉反应性、或降低或消除T细胞受体活性，并且其中所述细胞群包含百分比降低的活的非凋亡细胞、细胞活化被抑制的任何活的非凋亡细胞、或增殖降低的任何活的非凋亡细胞、或其任意组合。
37.权利要求30的方法，其中所述步骤(f)失活包括辐照步骤(e)中产生的单个核富集的凋亡细胞群。
38.权利要求37的方法，其中所述辐照包含γ辐照或UV辐照。
39.权利要求37的方法，其中所述辐照包含大约25-50格雷单位(Gy)。
CN201880068359.9A 2015-02-18 2018-08-20 用于癌症治疗的组合免疫治疗和细胞因子控制治疗 Pending CN111246860A (zh)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562117752P 2015-02-18 2015-02-18
US201562127218P 2015-03-02 2015-03-02
US201562148227P 2015-04-16 2015-04-16
US201562150305P 2015-04-21 2015-04-21
US201562159365P 2015-05-11 2015-05-11
US201662296622P 2016-02-18 2016-02-18
US201662370741P 2016-08-04 2016-08-04
US201762516714P 2017-06-08 2017-06-08
US15/685,086 US11000548B2 (en) 2015-02-18 2017-08-24 Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US15/685,086 2017-08-24
PCT/IL2018/050916 WO2019038758A1 (en) 2015-02-18 2018-08-20 ASSOCIATION OF IMMUNOTHERAPY AND CYTOKINE CONTROL THERAPY FOR THE TREATMENT OF CANCER

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111246860A true CN111246860A (zh) 2020-06-05

Family

ID=75439597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880068359.9A Pending CN111246860A (zh) 2015-02-18 2018-08-20 用于癌症治疗的组合免疫治疗和细胞因子控制治疗

Country Status (9)

Country Link
US (3) US11000548B2 (zh)
EP (1) EP3672604A4 (zh)
JP (2) JP2020531515A (zh)
KR (2) KR20200046065A (zh)
CN (1) CN111246860A (zh)
AU (1) AU2018320262A1 (zh)
CA (1) CA3073300A1 (zh)
IL (2) IL272740A (zh)
WO (2) WO2019038758A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110996972A (zh) * 2017-06-08 2020-04-10 恩立夫克治疗有限责任公司 用于癌症治疗的治疗性凋亡细胞
CN112669992A (zh) * 2020-12-30 2021-04-16 中国人民解放军总医院 单倍体造血干细胞移植atg个体化用药量的计算方法
CN114121142A (zh) * 2021-09-02 2022-03-01 四川大学华西医院 一种新型基因修饰增强型ny-eso-1特异型tcr-t模型构建方法及应用

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11596652B2 (en) 2015-02-18 2023-03-07 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Early apoptotic cells for use in treating sepsis
US11000548B2 (en) 2015-02-18 2021-05-11 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
AU2016221305B2 (en) 2015-02-18 2021-05-27 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
CN114729314A (zh) * 2015-02-18 2022-07-08 伊利威克斯疗法罗德有限公司 用于癌症治疗的组合癌症疗法和细胞因子控制疗法
US11497767B2 (en) 2015-02-18 2022-11-15 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11318163B2 (en) 2015-02-18 2022-05-03 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11304976B2 (en) 2015-02-18 2022-04-19 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
CN107708811B (zh) 2015-04-21 2021-04-30 恩立夫克治疗有限责任公司 治疗性汇集的血液凋亡细胞制剂与其用途
CA3014885A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 Enlivex Therapeutics Ltd. Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US20210171910A1 (en) * 2018-08-27 2021-06-10 Figene, Llc Chimeric antigen receptor fibroblast cells for treatment of cancer
EP3866815B1 (en) * 2018-10-19 2024-05-01 Regents Of The University Of Minnesota Transplant tolerance induction with carbodiimide treated tolerizing vaccine
CA3116296A1 (en) * 2018-11-19 2020-05-28 Enlivex Therapeutics Ltd Early apoptotic cells for use treating sepsis
AU2020208472A1 (en) * 2019-01-17 2021-08-26 Figene, Llc Fibroblasts and microvesicles thereof for reduction of toxicity associated with cancer immunotherapy
GB201901187D0 (en) * 2019-01-29 2019-03-20 Autolus Ltd Treatment of neurotoxicity and/or cytokine release syndrome
KR102347797B1 (ko) * 2020-03-03 2022-01-07 한국과학기술원 대식세포 세포 표면 항원 및 이의 다양한 용도
WO2021202305A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-07 Olatec Therapeutics Llc Method for preventing or treating lung infection and lung inflammation
WO2022049572A1 (en) * 2020-09-01 2022-03-10 The National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd. Immune system restoration by cell therapy
WO2023203561A1 (en) * 2022-04-19 2023-10-26 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Apoptotic cell - check point inhibitor combination therapy

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030036505A1 (en) * 2000-09-25 2003-02-20 Human Genome Sciences, Inc. Signal transduction pathway component polynucleotides, polypeptides, antibodies and methods based thereon
WO2006000787A2 (en) * 2004-06-23 2006-01-05 University Court Of The University Of Edinburgh Antibodies against bacterial antigens and their use in the generation of immune responses against apoptotic cells
CN1761757A (zh) * 2003-01-07 2006-04-19 香港大学 用血管抑制素协同加强腺伴随病毒介导的b7.1免疫接种以根除扩散的肝转移性肿瘤
WO2015089495A2 (en) * 2013-12-13 2015-06-18 Angiogenex, Inc. Compositions and methods for treating, preventing and diagnosing cancer and other proliferative disorders
CN105102612A (zh) * 2012-12-06 2015-11-25 恩立夫克治疗有限责任公司 治疗性凋亡细胞制剂、其制备方法以及其用途
WO2016132366A1 (en) * 2015-02-18 2016-08-25 Enlivex Therapeutics Ltd. Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
WO2016170541A1 (en) * 2015-04-21 2016-10-27 Enlivex Therapeutics Ltd. Therapeutic pooled blood apoptotic cell preparations and uses thereof
WO2017141243A1 (en) * 2016-02-18 2017-08-24 Enlivex Therapeutics Ltd. Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment

Family Cites Families (148)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPS6412935A (en) 1987-07-02 1989-01-17 Mitsubishi Electric Corp Constant-speed travel device for vehicle
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
WO1993019163A1 (en) 1992-03-18 1993-09-30 Yeda Research And Development Co, Ltd. Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
US6479258B1 (en) 1995-12-07 2002-11-12 Diversa Corporation Non-stochastic generation of genetic vaccines
DE19736691A1 (de) 1997-08-22 1999-02-25 Michael Prof Dr Med Giesing Verfahren zur Charakterisierung und Identifizierung disseminierter und metastasierter Krebszellen
US6969609B1 (en) 1998-12-09 2005-11-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Serivces Recombinant vector expressing multiple costimulatory molecules and uses thereof
WO1999042564A2 (en) * 1998-02-20 1999-08-26 The Rockefeller University Apoptotic cell-mediated antigen presentation to dendritic cells
US7521197B2 (en) 1998-06-05 2009-04-21 Alexis Biotech Limited Method for producing cytotoxic T-cells
US6962702B2 (en) 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
US20010033839A1 (en) 1999-10-04 2001-10-25 Emilio Barbera-Guillem Vaccine and immunotherapy for solid nonlymphoid tumor and related immune dysregulation
GB9823897D0 (en) 1998-11-02 1998-12-30 Imp College Innovations Ltd Immunotherapeutic methods and molecules
IL127142A0 (en) 1998-11-19 1999-09-22 Yeda Res & Dev Immune cells having predefined biological specificity
US7534866B2 (en) 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US7829064B2 (en) 1999-05-10 2010-11-09 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods
US8383081B2 (en) 1999-05-10 2013-02-26 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use
US7550143B2 (en) 2005-04-06 2009-06-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US8119101B2 (en) 1999-05-10 2012-02-21 The Ohio State University Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use
US7842458B2 (en) 1999-08-12 2010-11-30 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 58P1D12 useful in treatment and detection of cancer
US20040214783A1 (en) 2002-05-08 2004-10-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
US6436703B1 (en) 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
CA2309424A1 (en) * 2000-05-25 2001-11-25 Vasogen Ireland Limited Apoptotic entities for use in treatment of neurodegenerative and other neurological disorders
CA2309518A1 (en) 2000-05-25 2001-11-25 Vasogen Ireland Limited Apoptotic entities for use in treatment of t-cell-mediated and inflammatory disorders
AU6541801A (en) 2000-06-22 2002-01-02 Idec Pharma Corp Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
AUPR011700A0 (en) 2000-09-14 2000-10-05 Austin Research Institute, The Composition comprising immunogenic virus sized particles (VSP)
US7491534B2 (en) 2000-12-22 2009-02-17 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Methods for altering cell fate to generate T-cells specific for an antigen of interest
US20050202098A1 (en) * 2001-01-31 2005-09-15 Tolaren Disease therapy using dying or dead cells
US7811575B2 (en) 2001-04-10 2010-10-12 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 158P3D2 useful in treatment and detection of cancer
US7927597B2 (en) 2001-04-10 2011-04-19 Agensys, Inc. Methods to inhibit cell growth
US20020193569A1 (en) 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
GB0123379D0 (en) 2001-09-28 2001-11-21 Lorantis Ltd Modulators
CA2463672A1 (en) 2001-10-15 2003-04-24 Immunomedics, Inc. Direct targeting binding proteins
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US7591994B2 (en) 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
EP1487879B1 (en) 2002-03-01 2012-12-26 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
CA2478012C (en) 2002-03-01 2012-06-19 Immunomedics, Inc. Internalizing anti-cd74 antibodies and methods of use
CA2477780A1 (en) 2002-03-05 2003-09-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of enhancing immune induction involving mda-7
US7993626B2 (en) 2007-01-11 2011-08-09 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
WO2004016733A2 (en) 2002-08-16 2004-02-26 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
WO2004039412A2 (en) 2002-10-29 2004-05-13 Engene, Inc. Compositions for cancer treatment
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
US7638270B2 (en) 2003-01-24 2009-12-29 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 254P1D6B useful in treatment and detection of cancer
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
US20050008618A1 (en) 2003-02-27 2005-01-13 Howard Kaufman Composition for delivering an agent to a target cell and uses thereof
US20050084913A1 (en) 2003-04-22 2005-04-21 Maxygen, Inc. Novel tumor-associated antigens
CA2522994C (en) 2003-04-30 2012-09-25 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 109p1d4 useful in treatment and detection of cancer
ATE541052T1 (de) 2003-05-30 2012-01-15 Agensys Inc Varianten des prostata-stammzellen-antigens (psca) und teilsequenzen davon
CA2528727A1 (en) 2003-06-10 2004-12-16 The University Of Melbourne Immunomodulating compositions, uses therefor and processes for their production
WO2005014618A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
WO2005019429A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
US8003613B2 (en) 2003-11-17 2011-08-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for inducing apoptosis
US20070298051A1 (en) 2003-11-19 2007-12-27 Beth Israel Deaconess Medical Center Adjuvants Of Immune Response
CA2554735A1 (en) 2004-01-30 2005-08-11 Peplin Biolipids Pty Ltd Therapeutic and carrier molecules
CN1980658A (zh) 2004-05-27 2007-06-13 沃泰克斯药物股份有限公司 治疗自身炎性疾病的ice抑制剂
US7674456B2 (en) 2004-06-14 2010-03-09 Charles Wiseman Breast cancer cell lines and uses thereof
US20090162315A1 (en) 2004-06-29 2009-06-25 Terman David S Enterotoxin gene cluster (egc) superantigens to treat malignant disease
CA2576500A1 (en) 2004-08-16 2006-03-02 Agensys, Inc. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 58p1d12 useful in treatment and detection of cancer
CA2580642C (en) 2004-09-17 2014-09-02 Biomas, Ltd. Novel tellurium compounds and their use as immunomodulators
EP1824877A1 (en) 2004-11-19 2007-08-29 Agensys, Inc. Nucleic acids corresponding proteins entitled 158p3d2 useful in treatment and detection of cancer
EP1819731A4 (en) 2004-12-08 2013-02-13 Immunomedics Inc METHOD AND COMPOSITION FOR IMMUNOTHERAPY AND FOR THE DETECTION OF INFLAMMATORY AND DYSEGRATIVE IMMUNE DISEASES, INFECTION DISEASES, PATHOLOGICAL ANGIOGENESIS AND CANCER
EP1752471B9 (en) 2005-01-05 2009-04-15 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Synthetic immunoglobulin domains with binding properties engineered in regions of the molecule different from the complementarity determining regions
DE102005013846A1 (de) 2005-03-24 2006-10-05 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
JP5011277B2 (ja) 2005-04-06 2012-08-29 アイビーシー・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ホモダイマー、ホモテトラマーまたはダイマーのダイマーのからなる安定に連結された複合体を発生させるための方法および使用
JP2008539751A (ja) 2005-05-10 2008-11-20 アヴァリス・アーベー 新規組成物およびその使用
WO2006135454A1 (en) 2005-06-08 2006-12-21 Saint Vincent Medical Center, A California Corporation Novel cancer cell lines and uses thereof
CA2607056C (en) 2005-10-19 2015-11-24 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
JP2009542666A (ja) 2006-06-30 2009-12-03 シェーリング コーポレイション Ｐ５３活性を増加させる置換ピペリジンおよびその使用
US20080081791A1 (en) 2006-07-06 2008-04-03 Weida Huang Methods of using combinations of siRNAs for treating a disease or a disorder, and for enhancing siRNA efficacy in RNAi
GB0622399D0 (en) 2006-11-10 2006-12-20 Avaris Ab Novel compositions and uses thereof
PL2126054T3 (pl) 2007-01-31 2017-01-31 Yeda Research And Development Company Limited Przekierowane, genetycznie modyfikowane regulatorowe komórki T i ich zastosowanie w hamowaniu choroby autoimmunologicznej i zapalnej
AU2008247368B2 (en) 2007-05-06 2013-10-10 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Methods for treating and preventing GI syndrome and Graft versus Host disease
AU2008283802A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Polypeptide-nucleic acid conjugate for immunoprophylaxis or immunotherapy for neoplastic or infectious disorders
WO2009033161A1 (en) 2007-09-07 2009-03-12 The John Hopkins University Adenosine receptor agonists and antagonists to modulate t cell responses
US10736848B2 (en) 2007-10-12 2020-08-11 Massachusetts Institute Of Technology Vaccine nanotechnology
US20090192114A1 (en) 2007-12-21 2009-07-30 Dmitriy Ovcharenko miR-10 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention
EP2234641B1 (en) 2008-01-03 2015-08-19 Genmab A/S Monoclonal antibodies against cd32b
US9272029B2 (en) 2009-03-26 2016-03-01 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Interferon lambada-antibody complexes
US20110183870A1 (en) 2008-08-28 2011-07-28 Yuanlong Pan Gene expression profiles associated with lean phenotype and uses thereof
US8734795B2 (en) 2008-10-31 2014-05-27 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof
AU2009325878B2 (en) 2008-12-08 2014-01-16 Compugen Ltd. TMEM154 polypeptides and polynucleotides, and uses thereof as a drug target for producing drugs and biologics
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
EP2201954A1 (en) 2008-12-18 2010-06-30 Aposcience AG Pharmaceutical preparation
DK3903829T3 (da) 2009-02-13 2023-06-26 Immunomedics Inc Immunkonjugater med en intracellulær spaltelig binding
US8506954B2 (en) 2009-12-01 2013-08-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Tumor vaccination in combination with hematopoietic cell transplantation for cancer therapy
WO2011088226A2 (en) 2010-01-13 2011-07-21 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings Detection of gastrointestinal disorders
JP5808349B2 (ja) 2010-03-01 2015-11-10 カリス ライフ サイエンシズ スウィッツァーランド ホールディングスゲーエムベーハー セラノーシスのためのバイオマーカー
IL300733A (en) 2010-03-05 2023-04-01 Univ Johns Hopkins Compositions and methods for antibodies and fusion proteins targeting immune modulation
EP2545077B1 (en) 2010-03-10 2018-10-31 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-met
GB201004551D0 (en) 2010-03-19 2010-05-05 Immatics Biotechnologies Gmbh NOvel immunotherapy against several tumors including gastrointestinal and gastric cancer
US20130101590A1 (en) 2010-04-09 2013-04-25 Heather A. Arnett Btnl9 proteins, nucleic acids, and antibodies and uses thereof
WO2011139629A2 (en) 2010-04-26 2011-11-10 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof
EP2566954B2 (en) 2010-05-04 2022-11-02 Yeda Research and Development Co. Ltd. Immunotherapy using redirected allogeneic cells
EP2387999A1 (en) 2010-05-21 2011-11-23 CureVac GmbH Histidine-containing solution for transfection and/or injection of nucleic acids and uses thereof
CA3051311A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
US20140148350A1 (en) 2010-08-18 2014-05-29 David Spetzler Circulating biomarkers for disease
US9226958B2 (en) 2010-10-01 2016-01-05 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Use of Listeria vaccine vectors to reverse vaccine unresponsiveness in parasitically infected individuals
US20120201746A1 (en) 2010-12-22 2012-08-09 Abbott Laboratories Half immunoglobulin binding proteins and uses thereof
US20120196762A1 (en) 2011-01-27 2012-08-02 Paradis Norman A Method and apparatus for discovery, development and clinical application of multiplex assays based on patterns of cellular response
US20150025812A1 (en) 2011-01-27 2015-01-22 Norman A. Paradis Method and apparatus for discovery, development and clinical application of multiplex assays based on patterns of cellular response
RU2636029C2 (ru) 2011-02-01 2017-11-17 Генмаб А/С Человеческие антитела и конъюгаты антитело-препарат против cd74
EP2678448A4 (en) 2011-02-22 2014-10-01 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings S A R L CIRCULATING BIOMARKERS
US8889616B2 (en) 2011-02-24 2014-11-18 Oncothyreon Inc. MUC1 based glycolipopeptide vaccine with adjuvant
AU2012240135B2 (en) 2011-04-08 2016-09-08 Baylor College Of Medicine Reversing the effects of the tumor microenvironment using chimeric cytokine receptors
JP2014519340A (ja) 2011-06-16 2014-08-14 カリス ライフ サイエンシズ ルクセンブルク ホールディングス エス．アー．エール．エル． バイオマーカー組成物および方法
AU2012294458A1 (en) 2011-08-08 2014-02-27 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Biomarker compositions and methods
BR112014003477B1 (pt) 2011-08-17 2021-11-03 Globeimmune, Inc. Composição imunoterapêutica de muc1 de levedura
JP6138813B2 (ja) 2011-11-28 2017-05-31 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ 抗ｐｄ−ｌ１抗体及びその使用
WO2013105089A2 (en) 2012-01-09 2013-07-18 Yada Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory peptides and use thereof
CN104159600B (zh) 2012-01-26 2018-04-10 Ibc药品公司 用抗体靶向干扰素‑λ来有效增强抗肿瘤和抗病毒活性
MX366864B (es) 2012-02-27 2019-07-26 Amunix Operating Inc Composiciones de conjugados de xten y métodos para realizarlas.
EP2825886A4 (en) 2012-03-14 2015-11-18 Stephen Marx MEANS AND METHODS FOR THE DIAGNOSIS AND THERAPEUTICS OF DISEASES
US10130714B2 (en) 2012-04-14 2018-11-20 Academia Sinica Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity
US20130280220A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
NZ622452A (en) 2012-06-21 2017-10-27 Compugen Ltd Lsr antibodies, and uses thereof for treatment of cancer
FI4019041T3 (fi) 2012-07-13 2023-04-03 Univ Pennsylvania Car:ien antitumoraalisen aktiivisuuden toksisuuden hallinta
US9682143B2 (en) 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
EP2885002A4 (en) 2012-08-14 2016-04-20 Ibc Pharmaceuticals Inc BISPECIFIC ANTIBODIES REDIRECTED AGAINST T CELLS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
BR112015009138A2 (pt) 2012-10-23 2020-10-20 Caris Life Sciences Switzerland Holdings, S.A.R.L. métodos para caracterizar um câncer
EP2914263A4 (en) 2012-11-02 2016-04-27 Pharmacyclics Inc ADJUVANT THERAPY WITH TEC FAMILY KINASE INHIBITOR
JP2015536952A (ja) 2012-11-05 2015-12-24 プロナイ セラピューティクス インコーポレイテッド オリゴヌクレオチド癌療法の投薬および実施
EP2922818B1 (en) 2012-11-24 2018-09-05 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
US20150301058A1 (en) 2012-11-26 2015-10-22 Caris Science, Inc. Biomarker compositions and methods
WO2014106666A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Disease therapy using a tolerogenic pharmaceutical preparation
US20160007893A1 (en) 2013-02-06 2016-01-14 Loxbridge Research Llp Systems and methods for early disease detection and real-time disease monitoring
CA2904369A1 (en) 2013-03-07 2014-09-12 Baylor College Of Medicine Targeting cd138 in cancer
US20160024175A1 (en) 2013-03-10 2016-01-28 Baylor College Of Medicine Chemotherapy-resistant immune cells
WO2014153114A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to modify cells for therapeutic objectives
CA2906528A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Gemmus Pharma Inc. Beraprost isomer as an agent for the treatment of viral infection
KR102200278B1 (ko) 2013-03-15 2021-01-07 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아 무혈청 현탁 세포 배양 시스템에서 재조합 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위한 확대가능한 제작 방법
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
JP6361039B2 (ja) 2013-04-03 2018-07-25 アイビーシー ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド 疾患に対する免疫反応を誘導するための併用療法
EP3470423B1 (en) 2013-04-17 2021-10-06 Baylor College of Medicine Immunosuppressive tgf-beta signal converter
US20160090638A1 (en) 2013-05-17 2016-03-31 National Health Research Institutes Methods of prognostically classifying and treating glandular cancers
WO2014193999A2 (en) 2013-05-28 2014-12-04 Caris Science, Inc. Biomarker methods and compositions
DK3004329T3 (da) 2013-06-05 2020-05-18 Bellicum Pharmaceuticals Inc Fremgangsmåder til induktion af delvis apoptose under anvendelse af caspasepolypeptider
KR20210115051A (ko) 2013-06-10 2021-09-24 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 종양 세포에 의한 면역 억제를 감소시키기 위한 방법 및 조성물
EP3021853A1 (en) 2013-07-18 2016-05-25 Baylor College Of Medicine Method of enhancing potency of immune cells
EP3102561B1 (de) 2014-02-07 2017-12-13 Sika Technology AG Amin für emissionsarme epoxidharz-produkte
US11000548B2 (en) 2015-02-18 2021-05-11 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11497767B2 (en) 2015-02-18 2022-11-15 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11596652B2 (en) 2015-02-18 2023-03-07 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Early apoptotic cells for use in treating sepsis
US11318163B2 (en) 2015-02-18 2022-05-03 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11304976B2 (en) 2015-02-18 2022-04-19 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
AU2018282127B2 (en) 2017-06-08 2023-11-16 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Therapeutic apoptotic cells for cancer therapy

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030036505A1 (en) * 2000-09-25 2003-02-20 Human Genome Sciences, Inc. Signal transduction pathway component polynucleotides, polypeptides, antibodies and methods based thereon
CN1761757A (zh) * 2003-01-07 2006-04-19 香港大学 用血管抑制素协同加强腺伴随病毒介导的b7.1免疫接种以根除扩散的肝转移性肿瘤
WO2006000787A2 (en) * 2004-06-23 2006-01-05 University Court Of The University Of Edinburgh Antibodies against bacterial antigens and their use in the generation of immune responses against apoptotic cells
CN105102612A (zh) * 2012-12-06 2015-11-25 恩立夫克治疗有限责任公司 治疗性凋亡细胞制剂、其制备方法以及其用途
WO2015089495A2 (en) * 2013-12-13 2015-06-18 Angiogenex, Inc. Compositions and methods for treating, preventing and diagnosing cancer and other proliferative disorders
WO2016132366A1 (en) * 2015-02-18 2016-08-25 Enlivex Therapeutics Ltd. Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
WO2016170541A1 (en) * 2015-04-21 2016-10-27 Enlivex Therapeutics Ltd. Therapeutic pooled blood apoptotic cell preparations and uses thereof
CN107708811A (zh) * 2015-04-21 2018-02-16 恩立夫克治疗有限责任公司 治疗性汇集的血液凋亡细胞制剂与其用途
WO2017141243A1 (en) * 2016-02-18 2017-08-24 Enlivex Therapeutics Ltd. Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
CN109069539A (zh) * 2016-02-18 2018-12-21 恩立夫克治疗有限责任公司 用于癌症治疗的联合免疫疗法和细胞因子控制疗法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙朝文;张广钰;赵辰;成怀福;钟漓;戴凌;: "凋亡大肠癌CT26细胞对小鼠血清免疫因子水平以及免疫细胞增殖、活性的影响" *
齐伟;徐扬;邱实;: "细胞凋亡与肿瘤微环境作用的研究进展" *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110996972A (zh) * 2017-06-08 2020-04-10 恩立夫克治疗有限责任公司 用于癌症治疗的治疗性凋亡细胞
CN112669992A (zh) * 2020-12-30 2021-04-16 中国人民解放军总医院 单倍体造血干细胞移植atg个体化用药量的计算方法
CN112669992B (zh) * 2020-12-30 2024-06-11 中国人民解放军总医院 单倍体造血干细胞移植atg个体化用药量的计算方法
CN114121142A (zh) * 2021-09-02 2022-03-01 四川大学华西医院 一种新型基因修饰增强型ny-eso-1特异型tcr-t模型构建方法及应用
CN114121142B (zh) * 2021-09-02 2023-10-31 四川大学华西医院 一种新型基因修饰增强型ny-eso-1特异型tcr-t模型构建方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20170360836A1 (en) 2017-12-21
WO2019038758A1 (en) 2019-02-28
US20210228633A1 (en) 2021-07-29
KR20200046065A (ko) 2020-05-06
EP3672604A1 (en) 2020-07-01
IL272740A (en) 2020-04-30
WO2021053667A3 (en) 2021-04-29
US11000548B2 (en) 2021-05-11
KR20220068240A (ko) 2022-05-25
US11717539B2 (en) 2023-08-08
WO2021053667A2 (en) 2021-03-25
CA3073300A1 (en) 2019-02-28
US20210106617A9 (en) 2021-04-15
JP2020531515A (ja) 2020-11-05
IL290695A (en) 2022-04-01
US20200009191A1 (en) 2020-01-09
AU2018320262A1 (en) 2020-03-12
JP2022548523A (ja) 2022-11-21
EP3672604A4 (en) 2021-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11717539B2 (en) Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11318163B2 (en) Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11730761B2 (en) Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US20220133799A1 (en) Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11497767B2 (en) Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11596652B2 (en) Early apoptotic cells for use in treating sepsis
US11951126B2 (en) Therapeutic apoptotic cells for cancer therapy
EP4031655A2 (en) Combination cancer therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
JP7334249B2 (ja) 敗血症の治療に使用するための初期アポトーシス細胞
CN114729314A (zh) 用于癌症治疗的组合癌症疗法和细胞因子控制疗法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination