CN114121142A - 一种新型基因修饰增强型ny-eso-1特异型tcr-t模型构建方法及应用 - Google Patents
一种新型基因修饰增强型ny-eso-1特异型tcr-t模型构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种新型基因修饰增强型NY‑ESO‑1特异性TCR‑T模型构建方法及应用，涉及生物技术领域。该新型基因修饰增强型NY‑ESO‑1特异型TCR‑T模型构建方法，包括如下步骤：1.重组表达载体pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Puro‑TCR(NY‑ESO‑1)‑CCL19‑IL‑2的构建；2.建立对增强型TCR‑T特异性、增强功能定量定性评价及对肿瘤的杀伤活性的多维质量控制评价体系：包括(1)增强型TCR‑T特异性检验；(2)增强型TCR‑T产生CCL19的定量检测；(3)增强型TCR‑T产生IL2的定量检测；(4)增强型TCR‑T趋化迁移检测；(5)增强型TCR‑T增殖活性检测；(6)增强型TCR‑T抗肿瘤效率检测。本发明还提供了本发明的T细胞在用于制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法及应用。
背景技术
过继性免疫细胞转移(AIT)疗法是通过激活、修复、改构、甚至重建患者抗肿瘤免疫细胞反应进行肿瘤治疗的方法，天然具有精准治疗的特征。近年来，AIT疗法在肿瘤治疗中的应用取得令人瞩目的进展，例如，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在血液系统肿瘤治疗中取得巨大进展。
另一种基因编辑过继性T细胞治疗技术是TCR-T技术，这种方法是通过基因编辑的方法引入具有对肿瘤抗原特异性识别能力的TCR，从而增强T细胞对癌细胞的免疫效应。不同T细胞所携带的TCR受体具有多样性，为实施针对不同肿瘤变异信息的精准医学治疗提供了足够的广度。而且，免疫细胞来源于患者自体，作为一种“活的药物”，具有自主性与自我适应能力，能有效缩短开发时间。TCR-T有望成为肿瘤精准医疗的一个重要突破口。
尽管TCR-T在一些恶性肿瘤的治疗中取得了进展，但对大部分实体瘤的治疗仍面临诸多问题，如实体瘤浸润不佳，体内存活时间短等使其难以发挥疗效。有研究显示，将趋化因子CCL19引入CAR-T的设计能够大幅度提高CAR-T对实体瘤的浸润，同时能够诱导宿主本身T细胞和DC细胞向肿瘤的趋化富集，从而显著提高对实体瘤的免疫疗效。如今，在CAR的设计中添加细胞因子或趋化因子或其受体来增加T细胞等免疫细胞在肿瘤中的浸润已成为新一代CAR-T设计思路的趋势。
此外，IL-2具有较广泛的免疫激活作用，如促进T细胞增殖，激活巨噬单核细胞，增强NK细胞活性等，在LAK疗法中是必要的诱导剂，作为免疫佐剂的应用也取得了较好的效果。
尽管这些细胞因子具有良好的促进免疫疗效的作用，但外部添加所需剂量大，长期使用可能导致毒副反应，尤其是IL2容易造成T细胞的耗竭等副作用。
通过多基因协同表达的载体将多种细胞因子引入细胞，构建持续自表达细胞因子的T细胞成为可以克服外加细胞因子的替代方法。现有的多基因共载体构建策略如融合蛋白、mRNA剪切策略等受限于载体容纳能力，一般只能实现两个基因的共表达；IRES可以连接多个基因使其在同一个启动子驱动下共表达，但IRES连接的基因前后表达不平衡，为解决这一问题，2A连接肽越来越受到关注，比如运用2A连接肽可以将Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四个基因串联到一个慢病毒载体上，成功实现多能干细胞iPSCs的诱导转化。
但2A连接肽在实际应用中也存在问题。由于其独特的“剪切”机制,导致最终分别得到一个融合有2A肽尾巴的上游蛋白和一个N端带有一个脯氨酸的下游蛋白,额外增加的2A肽结构可能会对目的蛋白的功能造成一定的影响，此外，不同2A肽序列造成的“剪切”效率各有不同。因此，基于这些方法向TCR-T中引入多细胞因子、趋化因子的效率和功能性可能产生较大差异。随着向过继性T细胞引入不同因子或其组合来达到增强对实体瘤治疗的趋势愈广，建立固定的定性定量，功能性的评价体系来更好的对这类T细胞进行质量控制也是制备这类T细胞方法必不可少的一部分。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法及应用，在NY-ESO-1特异性TCR-T的设计中引入CCL19和IL2,增加这些T细胞的肿瘤浸润和体内活性，同时，建立对该T细胞增强功能的定性定量评价体系。本发明还提供了本发明的T细胞在用于制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法及应用，包括如下步骤：1.重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL2的构建；2.增强型TCR-T特异性检验；3.增强型TCR-T产生CCL19的定量检测；4.增强型TCR-T产生IL2的定量检测；5.增强型TCR-T趋化迁移检测；6.增强型TCR-T增殖活性检测；7.增强型TCR-T抗肿瘤效率检测。
优选的，所述T细胞包含编码特异性识别NY-ESO-1的TCRα链和β链，编码能够表达趋化因子CCL19,以及编码能够表达人白细胞介素2(即IL2)的核酸片段，在本发明的其中又一个方面，所述编码TCRα链，β链，CCL19，IL2的核酸进一步包括接头序列P2A的核酸序列。
优选的，所述包含编码最终序列结构为TCRα-P2A-TCRβ-P2A-CCL19-P2A-IL2的核酸；所述核酸具有序列为SEQILNO：1的核苷酸序列。
优选的，所述增强型NY-ESO-1特异型TCR-T的增强作用具体体现为：持续自分泌CCL19，增强对血液免疫细胞的趋化迁移能力；持续自分泌IL2,增强自身增殖活性；对肿瘤细胞的杀伤能力增强。
优选的，构建增强型NY-ESO-1特异型TCR-T定性定量评价体系具体体现为：(1)NY-ESO-1抗原特异性激活反应评价；(2)共表达因子CCL19和IL-2的定量评价；(3)增强型NY-ESO-1特异型TCR-T的增殖活性定性评价；(4)趋化迁移能力的定性评价；(5)增强型NY-ESO-1特异型TCR-T的抗肿瘤效率评价。
所述新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T通过特异性识别表达或在细胞表面呈递NY-ESO-1抗原的细胞，包括表达NY-ESO-1的肿瘤细胞，从而发挥细胞毒性作用和分泌淋巴因子产生抗肿瘤作用，可将含有本发明的T细胞试剂通过皮下、皮内、肌肉内、静脉内注射的方式返回患者体内。因此可作为药物或药物组合的活性成分应用于预防或者治疗肿瘤，尤其是实体瘤治疗，具体地，包括黑素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、滑膜细胞肉瘤和骨肉瘤。优选的，包含本发明的T细胞药物可用于治疗黑色素瘤和卵巢癌。
(三)有益效果
本发明提供了一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法及应用。具备以下有益效果：
1、本发明提供的的增强型TCR-T相较普通TCR-T具有更强的趋化迁移能力、增殖活性和肿瘤杀伤能力。
2、本发明建立与T细胞制备一体的定性定量评价体系使附加细胞因子趋化因子的增强型TCR-T制备更为可控可靠。
附图说明
图1为本发明提供的重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2的插入片段的结构示意图；
图2为本发明提供的重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2的插入片段的编码碱基序列；
图3为本发明的增强型TCR-T特异性激活的流式细胞仪检测结果图；
图4为本发明的增强型TCR-T趋化迁移检测结果图；
图5为本发明的增强型TCR-T增殖活性检测结果图；
图6为本发明的增强型TCR-T的抗肿瘤效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2的构建：
pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2的插入片段包括编码特异性识别NY-ESO-1的TCRα链，β链，表达CCL19和IL-2的核酸片段，之间通过P2A序列连接，如图1所示，插入片段的核酸序列如图2所示。
构建过程包括：在所述TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2插入片段的两端加入XbaI和BamHI限制性酶切位点序列。将该核酸片段与慢病毒骨架载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro用限制性内切酶XbaI和BamHI进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶过夜连接。转换大肠杆菌感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定，得到重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2。
实施例2：
增强型TCR-T特异性检验：
将T2细胞作为抗原负载细胞，用两种NY-ESO-1多肽(各20ug/ml)负载孵育3h,PBS洗三次，洗去游离多肽。
将增强型TCR-T细胞密度调整1X105/ml，与1X105/ml的T2共培养2h后，加入10ug/ml的Breiflid A孵育过夜，以未负载多肽的T2细胞作为阴性对照。之后进行后续IFN-γ流式检测，流式分析CD3+T细胞中，CD3+IFN-γ+阳性细胞比例。
图3是经过pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2重组载体感染的T细胞(2-19-TCR-T)经NY-ESO-1抗原刺激的流式结果。
检测结果表明，经T2负载NY-ESO-1抗原刺激，2-19-TCR-T免疫反应增强相比对照更为显著，表明其具有抗原特异性。
实施例3：
增强型TCR-T产生CCL19的定量检测：
分别取TCR-T和2-19-TCR-T培养上清，于零下20摄氏度保存待测。
标准品加样，母液浓度480pg/ml的标准样品，用样品稀释液对半稀释得到一系列浓度分别为480,240,10,60,30,0pg/ml的标准溶液备用。
设置标准品孔和样品孔，标准孔各加不同浓度的标准品50ul。
分别设空白孔，待测样品孔，在酶标板待测样品孔中加样品稀释液40ul，然后加待测样品10ul,加样于孔底部，轻轻晃动混匀。
每孔加入酶标试剂100ul,空白孔除外。
加封板膜封板后37℃温育60min。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用。
揭掉封板膜后弃液，用稀释后的洗涤液洗5次，每次静置30s-2min，后拍干。
每孔加入试剂A 50ul,B 50ul，轻轻震荡混匀，37℃显色15min。
每孔加终止试剂50ul,终止反应。
以空白孔调零，450nm测定各孔OD值。测定在加终止液后15min内进行。
获得标准曲线为y＝0.0048x+0.0572,R2＝0.9998。经计算1X106个感染效率60％的2-19TCRT，其CCL19产量为30.31667pg/ml，5X106T细胞则为151.58335pg/ml。
实施例4：
增强型TCR-T产生IL-2的定量检测
分别取TCR-T和2-19-TCR-T培养上清，于-20℃保存待测。
标准品加样，母液浓度480pg/ml的标准样品，用样品稀释液对半稀释得到一系列浓度分别为1000,500,250,125,62.5,31.25,15.6,0pg/ml的标准溶液备用。
设置标准品孔和样品孔，标准孔各家不同浓度的标准品50ul。
分别设空白孔，待测样品孔，在酶标板待测样品孔中加样品稀释液40ul，然后加待测样品10ul,加样于孔底部，轻轻晃动混匀。
每孔加入酶标试剂100ul,空白孔除外。
加封板膜封板后37℃温育60min。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用。
揭掉封板膜后弃液，用稀释后的洗涤液洗5次，每次静置30s-2min，后拍干。
每孔加入试剂A 50ul,B 50ul，轻轻震荡混匀，37℃显色15min。
每孔加终止试剂50ul,终止反应。
以空白孔调零，450nm测定各孔OD值。测定在加终止液后15min内进行。
获得标准曲线为y＝0.0003x+0.0576,R2＝0.9993。扣除TCR-T产生的IL2的基础数值，经计算1X106个感染效率～60％的2-19TCR-T，其CCL19产量为33.31481pg/ml，5X106T细胞则为151.58335pg/ml。
实施例5：
增强型TCR-T趋化迁移检测
采用3um膜孔径的Tranwell小室作为进行实验的载体，事先用CD3抗体激活T细胞和经pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)感染的TCRT细胞以及经pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL2感染的2-19-TCRT细胞，3天后进行如下分组操作加入相应的细胞或培养基、抗体。
a)对照组：Transwell上层：抗CD3抗体激活的T细胞，Transwell下层：培养基；
b)TCR-T组：Transwell上层：抗CD3抗体激活的T细胞，Transwell下层：激活的TCRT；
c)2-19-TCR-T组：Transwell上层：抗CD3抗体激活的T细胞，Transwell下层：激活的2-19-TCR-T；
d)2-19-TCR-T+抗CCR7抗体组：Transwell上层：TCR-T+抗CCR7抗体，Transwell下层：激活的2-19-TCR-T。
其中，Transwell上层加入的细胞密度均为4X106/ml，体积为100ul，且不含IL-2，下层加入的细胞总数为5×104个，体积为600ul，且不含IL-2，每组3个平行。
共培养5h后，取下层细胞进行计数。
细胞迁移率％＝(下层细胞总数-50000)/400000×100％
结果如图4所示：
本发明提供的同时表达NY-ESO-1TCR，CCL19和IL-2的T细胞通过CCL19-CCR7轴作用发挥趋化迁移的作用，且较仅表达NY-ESO-1TCR的T细胞对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞表现出增强的。
实施例6:
增强型TCR-T增殖活性检测
在96孔板中预先包被1ug/ml的抗CD3抗体,按照5X103/孔的密度接种经pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)感染的TCR-T，经pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2感染的2-19-TCR-T以及加入2-19-TCR-T同时加入IL-2抗体。保持每孔100ul的液体体积，每组5个平行孔。
用不含IL-2的X-VIVO培养基培养，每3天换一次液。
在第4天、7天、10天每孔中加入10ul的CCK8试剂，于37℃孵育1h后，在酶标仪上测定450nm的吸光度值。
以第4天TCRT组为对照组，未接种细胞只有培养基的孔为空白，计算细胞活性百分比：
细胞活性％＝(实验组OD450-空白OD450)/(对照组OD450-空白OD450)×100％。
图5是TCR-T与2-19-TCR-T以及同时加入抗IL-2抗体的2-19-TCR-T在第4天，7天，10天的细胞活性结果。结果表明，IL-2-CCL19TCR-T与TCR-T相比，增殖活性更为明显，这可能是通过自分泌IL-2激活IL2R下游通路，在长时间培养中体现促进增殖优势。
实施例7：
增强型TCR-T抗肿瘤效率检测
以稳定表达NY-ESO-1及HLAA2的人黑色素瘤细胞系A375作为靶细胞，分别用慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL2感染的T细胞作为效应细胞，将靶细胞按照密度1X105个/ml接种到96孔板中，以效靶比0.5:1，1:1，5:1，10:1的比例共培养于96孔中,37℃孵育4-6h,将悬浮细胞连同培养基一起弃去，每孔中补充100ul培养基，并加入CCK8试剂10ul,按照CCK8说明进行后续操作，在酶标仪上测定450nm的吸光度值作为衡量每孔中细胞活力的指标，该值越小，则反映该孔抗肿瘤效率越高。
结果如图6所示：本发明提供的同时表达NY-ESO-1TCR，CCL19和IL-2的T细胞较仅表达NY-ESO-1TCR的T细胞对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞具有显著增强的杀伤作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1.重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL2的构建；2.增强型TCR-T特异性检验；3.增强型TCR-T产生CCL19的定量检测；4.增强型TCR-T产生IL2的定量检测；5.增强型TCR-T趋化迁移检测；6.增强型TCR-T增殖活性检测；7.增强型TCR-T抗肿瘤效率检测。
2.根据权利要求1所述的一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法，其特征在于:所述重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2的构建方法为：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2的插入片段包括编码特异性识别NY-ESO-1的TCRα链，β链，表达CCL19和IL-2的核酸片段，之间通过P2A序列连接；
构建过程包括：在所述TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2插入片段的两端加入XbaI和BamHI限制性酶切位点序列，将该核酸片段与慢病毒骨架载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro用限制性内切酶XbaI和BamHI进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶过夜连接，转换大肠杆菌感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定，得到重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2。
3.根据权利要求1所述的一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法，其特征在于，所述增强型TCR-T特异性检验的方法为：将T2细胞作为抗原负载细胞，用两种NY-ESO-1多肽(各20ug/ml)负载孵育3h,PBS洗三次，洗去游离多肽；
将增强型TCRT细胞密度调整1X105/ml，与1X105/ml的T2共培养2h后，加入10ug/ml的BreiflidA孵育过夜，以未负载多肽的T2细胞作为阴性对照，之后进行后续IFN-γ流式检测，流式分析CD3+细胞中，CD3+IFN-γ+阳性比例。
4.根据权利要求1所述的一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法，其特征在于，所述增强型TCR-T产生CCL19的定量检测方法为：分别取TCRT和2-19-TCRT培养上清，于零下20摄氏度保存待测，标准品加样，母液浓度480pg/ml的标准样品，用样品稀释液对半稀释得到一系列浓度分别为480,240,10,60,30,0pg/ml的标准溶液备用；
设置标准品孔和样品孔，标准孔各加不同浓度的标准品50ul，分别设空白空，待测样品孔，在酶标板待测样品孔中加样品稀释液40ul，然后加待测样品10ul,加样于孔底部，轻轻晃动混匀；
每孔加入酶标试剂100ul,空白孔除外，加封板膜封板后37℃温育60min，将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用；
揭掉封板膜后弃液，用稀释后的洗涤液洗5次，每次静置30s-2min，后拍干，每孔加入试剂A50ul,B50ul，轻轻震荡混匀，37℃显色15min；
每孔加终止试剂50ul,终止反应，以空白孔调零，450nm测定各孔OD值，测定在加终止液后15min内进行，获得标准曲线为y＝0.0048x+0.0572,R2＝0.9998。
5.根据权利要求1所述的一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法，其特征在于，所述增强型TCR-T产生IL-2的定量检测方法为：分别取TCR-T和2-19-TCR-T培养上清，于零下20摄氏度保存待测；
标准品加样：母液浓度480pg/ml的标准样品，用样品稀释液对半稀释得到一系列浓度分别为1000,500,250,125,62.5,31.25,15.6,0pg/ml的标准溶液备用；
设置标准品孔和样品孔，标准孔各家不同浓度的标准品50ul，分别设空白孔，待测样品孔，在酶标宝板待测样品孔中加样品稀释液40ul，然后加待测样品10ul,加样与孔底部，轻轻晃动混匀，每孔加入酶标试剂100ul,空白孔除外，加封板膜封板后37℃温育60min，将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后备用；
揭掉封板膜后弃液，用稀释后的洗涤液洗5次，每次静置30s-2min，后拍干，每孔加入试剂A50ul,B50ul，轻轻震荡混匀，37℃显色15min，每孔加终止试剂50ul,终止反应，以空白孔调零，450nm测定各孔OD值，测定在加终止液后15min内进行，获得标准曲线为y＝0.0003x+0.0576,R2＝0.9993。
6.根据权利要求1所述的一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法，其特征在于，所述增强型TCR-T趋化迁移检测方法为：采用3um膜孔径的Tranwell小室作为进行实验的载体，事先用CD3抗体激活T细胞和经pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)感染的TCR-T细胞以及经pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2感染的2-19-TCR-T细胞，3天后进行如下分组操作加入相应的细胞或培养基、抗体：
a)对照组：Transwell上层：抗CD3抗体激活的T细胞，Transwell下层：培养基；
b)TCR-T组：Transwell上层：抗CD3抗体激活的T细胞，Transwell下层：激活的TCRT；
c)2-19-TCR-T组：Transwell上层：抗CD3抗体激活的T细胞，Transwell下层：激活的2-19-TCR-T；
d)2-19-TCR-T+抗CCR7抗体组：Transwell上层：TCR-T+抗CCR7抗体，Transwell下层：激活的2-19-TCR-T；
其中，Transwell上层加入的细胞密度均为4X106/ml，体积为100ul，且不含IL-2，下层加入的细胞总数为5×104个，体积为600ul，且不含IL-2，每组3个平行；共培养5h后，取下层细胞进行计数:细胞迁移率％＝(下层细胞总数-50000)/400000×100％。
7.根据权利要求1所述的一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法，其特征在于：所述增强型TCR-T增殖活性检测方法为：在96孔板中预先包被1ug/ml的抗CD3抗体,按照5X103/孔的密度接种经pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)感染的TCR-T，经pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2感染的2-19-TCRT以及加入2-19-TCR-T同时加入抗IL-2抗体，保持每孔100ul的液体体积，每组5个平行孔，用不含IL2的X-VIVO培养基培养，每3天换一次液，在第4天、7天、10天每孔中加入10ul的CCK8试剂，于37℃孵育1h后，在酶标仪上测定450nm的吸光度值，以第4天TCR-T组为对照组，未接种细胞只有培养基的孔为空白，计算细胞活性百分比：细胞活性％＝(实验组OD450-空白OD450)/(对照组OD450-空白OD450)×100％。
8.根据权利要求1所述的一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T模型构建方法，其特征在于：所述增强型TCR-T抗肿瘤效率检测方法为：以稳定表达NY-ESO-1及HLAA2的人黑色素瘤细胞系A375作为靶细胞，分别用慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TCR(NY-ESO-1)-CCL19-IL-2感染的T细胞作为效应细胞，将靶细胞按照密度1X105个/ml接种到96孔板中，以效靶比0.5:1，1:1，5:1，10:1的比例共培养于96孔中,37℃孵育4-6h,将悬浮细胞连同培养基一起弃去，每孔中补充100ul培养基，并加入CCK8试剂10ul,按照CCK8说明进行后续操作，在酶标仪上测定450nm的吸光度值作为衡量每孔中细胞活力的指标，该值越小，则反映该孔抗肿瘤效率越高。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的一种新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T的应用，其特征在于，所述新型基因修饰增强型NY-ESO-1特异型TCR-T应用于实体瘤治疗。
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