KR102200278B1 - 무혈청 현탁 세포 배양 시스템에서 재조합 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위한 확대가능한 제작 방법 - Google Patents

무혈청 현탁 세포 배양 시스템에서 재조합 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위한 확대가능한 제작 방법 Download PDF

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Abstract

인간 유전자 요법에 기대되는 요건을 충족시키는데 필요한 규모로 고도로 정제된 rLV 벡터 제형을 제조하는 방법이 제공된다.

Description

무혈청 현탁 세포 배양 시스템에서 재조합 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위한 확대가능한 제작 방법 {SCALABLE MANUFACTURING PROCESS TO PRODUCE RECOMBINANT LENTIVIRAL VECTORS IN SERUM-FREE SUSPENSION CELL CULTURE SYSTEM}
관련 출원 정보
본 출원은 2013년 3월 15일에 출원된 일련 출원 번호 61/787,818의 우선권을 주장하며, 이 출원은 그 전체가 참조로서 명백히 통합된다.
발명의 분야
본 발명은 분자 생물학 및 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 임상 사용을 위해 의학적으로 유익한 생성물을 인코딩하는 전이 유전자를 포함하는, 바이러스 벡터, 바람직하게는, 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스 벡터의 대규모 생산을 위한 개선된 방법을 제공한다.
도입
여러 공개문 및 특허 문헌이 본 발명이 속하는 분야의 상태를 기술하기 위해 명세서 전반에 걸쳐 인용되어 있다. 이들 인용문헌 각각은 그 전체가 기재된 것처럼 참조로서 본원에 통합된다.
재조합 렌티바이러스 (Lentivirus)-기재 (rLenti) 벡터는 여러 심각한 인간 질환에 대한 연구 유전자 전달 생성물로서 개발되고 널리 사용되어 왔다. 렌티바이러스 벡터는 줄기 세포를 포함하는, 복제 및 비-복제 세포 둘 모두를 감염시키는 이들의 능력으로 인해 형질도입에 있어서 매우 생산적인 것으로 입증되었다.
HIV-1 기반, VSVG 슈도-형 렌티바이러스 벡터를 사용한 많은 임상 시험이 전세계에서 개시되었으며, 많은 유망되는 임상적 이점이 관찰되었다. 그러나, 이 시점에서 본 분야의 심각한 문제점은 후기의 임상 연구에 필요하게 될 충분한 정량의 rLenti를 제조하기 위한 방법론이 결여되어 있다는 점이다. 연구 및 임상 시험 데이타에 의해 rLenti벡터가 유전자 질환 예컨대, 원발성 면역결핍을 위한 인간 유전자 요법(Fischer 및 동료)은 물론 암에 대한 면역요법 (June 및 동료)을 위한 유망한 유전자 전달 비히클인 것으로 입증되었다.
그러나, 후속 단계의 임상 적용을 지지하기 위한 제작 용량 및 시험 생성물 특질 요건을 충족시키는 대량의 rLenti 벡터의 cGMP 제작에 적합한 확대가능한 생성 및 정제 방법을 개발할 중대한 필요성이 본 분야에 존재한다. 예를 들어, 백혈병 치료를 위한 페이스 I에서의 매우 유망한 한 프로그램에 있어서, 현재 이용가능한 방법과 비교하여 적어도 100배 더 큰 제작 용량이 페이스 III 연구 및 초기 스테이지 허가된 상품 출시에 필요할 것으로 예상된다. 따라서, 본 유전자 요법 벡터의 생산을 확대하는 방법이 긴급하게 필요하다.
개요
본 발명에 따르면, 확대가능한 무혈청 현탁 세포 배양액에서 고역가 rLenti 벡터를 생성하고, 확대가능한 산업 표준 칼럼 크로마토그래프 기법을 이용하여 벡터를 정제하기 위한 방법이 제공된다. 본 방법에 따라 생성된 rLV 입자를 포함하는 rLV 벡터 포뮬레이션이 제조될 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체에 선택적으로 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 바이러스 벡터 정제를 위한 방법은 a) 무혈청 현탁 배양액으로부터 전이 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 수확하는 단계; b) 여과를 통해 단계 a)의 수확물을 정화하는 단계; c) 단계 b)로부터의 여과물을 수확하고 상기 여과물을 뉴클레아제 분해에 선택적으로 노출시켜 DNA/RNA 불순물을 제거하는 단계; d) 단계 c)의 여과물을 PEG-조절된 친화 또는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 상기 바이러스 벡터를 분리하는 단계; e) 단계 d)로부터 수득된 바이러스 벡터를 접선유동여과를 통해 추가로 정제하여 부피를 감소시키고 완충제 교환하는 단계; f) 단계 e)의 여과물을 크기 배제 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 상기 바이러스 벡터를 추가로 정제하는 단계; g) 단계 f)의 벡터를 접선유동여과로 처리하여 최종 벡터 역가를 수득하는 단계; h) 단계 g)로부터 수득된 벡터 용액을 필터를 통해 여과하는 단계; 및 i) 상기 정제된 바이러스 벡터를 수집하는 단계를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 바이러스 벡터 정제 방법은 a) 무혈청 현탁 배양액으로부터 전이 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 수확하는 단계; b) 단계 a)의 수확물을 여과를 통해 정화하는 단계; c) 단계 b)의 정화된 현탁액을 접선유동여과로 처리하여 부피를 감소시키고 완충제 교환하는 단계; d) 단계 c)로부터의 여과물을 수확하고 상기 여과물을 뉴클레아제 분해에 선택적으로 노출시켜 DNA/RNA 불순물을 제거하는 단계; e) 단계 d)의 여과물을 PEG-조절된 친화 또는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 상기 바이러스 벡터를 분리하는 단계; f) 단계 e)로부터 수득된 바이러스 벡터를 크기 배제 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 상기 바이러스 벡터를 추가로 정제하는 단계; g) 단계 f)의 벡터를 접선유동여과로 처리하여 최종 벡터 역가를 수득하는 단계; h) 단계 g)로부터 수득된 벡터 용액을 필터를 통해 여과하는 단계; 및 i) 상기 정제된 바이러스 벡터를 수집하는 단계를 포함한다.
추가의 구체예에서, 바이러스 벡터 정제 방법은 a) 무혈청 현탁 배양액으로부터 전이 유전자를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 수확하는 단계; b) 단계 a)의 수확물을 여과를 통해 정화하는 단계; c) 단계 b)의 정화된 현탁액을 접선유동여과로 처리하여 부피를 감소시키고 완충제 교환하는 단계; d) 단계 c)로부터 여과물을 수확하고 상기 여과물을 뉴클레아제 분해에 선택적으로 노출시켜 DNA/RNA 불순물을 제거하는 단계; e) 단계 d)의 여과물을 PEG-조절된 친화 또는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 상기 바이러스 벡터를 분리하는 단계; f) 단계 e)로부터 수득된 바이러스 벡터를 접선유도여과로 추가로 정제하여 부피를 감소시키고 완충제 교환하는 단계; g) 단계 f)의 여과물을 크기 배제 칼럼 크로마토그래피로 처리하여 상기 바이러스 벡터를 추가로 정제하는 단계; h) 단계 g)의 벡터를 접선유동여과로 처리하여 최종 벡터 역가를 수득하는 단계; i) 단계 h)로부터 수득된 벡터 용액을 필터를 통해 여과하는 단계; 및 j) 상기 정제된 바이러스 벡터를 수집하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 렌티바이러스 벡터 (rLV)에 적용가능하다. 특정 구체예에서, rLV 벡터는 재조합 렌티바이러스 벡터 (rLV)를 포함하며, 이는 HIV-1, HIV-2, HIV-1/HIV-2 슈도타입, HIV-1/SIV, FIV, 염소 관절염 뇌염 바이러스 (CAEV), 말전염성 빈혈증 바이러스 (equine infectious anemia virus), 소 면역결핍 바이러스, HIV 및 이들의 슈도형, 또는 소수포구내염 바이러스 G-슈도형 렌티바이러스 (VSVG 슈도형) 벡터이다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 전이 유전자를 포함한다. 특정 구체예에서, 전이 유전자는 siRNA, 안티센스 분자, 및 miRNA, 리보자임 및 shRNA로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산을 엔코딩한다. 추가적인 특정 구체예에서, 전이 유전자는 유전자 생성물 (단백질 또는 폴리펩티드)를 엔코딩한다.
특정 양태에서, 유전자 생성물 (단백질 또는 폴리펩티드)은 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬 (GH), 파라티로이드 호르몬 (PTH), 성장 호르몬 방출 인자 (GRF), 여포 자극 호르몬 (FSH), 황체형성 호르몬 (LH), 인간 융모성 성선자극 호르몬 (hCG), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 안지오포이에틴, 안지오스타틴, 과립구집락자극인자 (GCSF), 에리트로포이에틴 (EPO), 연결 조직 성장 인자 (CTGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 α (TGFα), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II (IGF-I 및 IGF-II), TGFβ, 액티빈, 인히빈, 골 형성 단백질 (BMP), 신경 성장 인자 (NGF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 and NT4/5, 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 신경아교세포계 유래 신경영양 인자 (GDNF), 뉴투린, 아그린, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자 (HGF), 에프린스, 노긴, 소닉 헤지호그 또는 티로신 히드록실라제이다. 추가적인 특정 양태에서, 유전자 생성물 (단백질 또는 폴리펩티드)은 트롬보포이에틴 (TPO), 인터류킨 (IL1 내지 IL-17), 단핵구 화학주성인자 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 집락자극인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, G 단백질-결합된 수용체 (GPCRs), CCR5, 및 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자이다.
추가의 특정 양태에서, 유전자 생성물 (단백질 또는 폴리펩티드)는 카르바모일 신세타제 I, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노숙시네이트 신세타제, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세트아세테이트 히드롤라제, 페닐알라닌 히드록실라제, 알파-1 안티트립신, 글루코스-6-포스파타제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 인자 V, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-신타제, 분지쇄 케토산 데카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-coA 데히드로게나제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 무타제, 글루타릴 CoA 데히드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카르복실라제, 망막색소상피-특이적 65 kDa 단백질 (RPE65), H-단백질, T-단백질, 낭포성 섬유증 막횡단 조절인자 (CFTR) 서열, 또는 디스트로핀 cDNA 서열로 구성된 군으로부터 선택된, 선천성 대사 이상을 교정하는데 유용한 단백질을 엔코딩하는 핵산이다. 여전히 추가적인 특정 양태에서, 유전자 생성물 (단백질 또는 폴리펩티드)은 팩터(Factor) VIII 또는 팩터 IX이다.
여전히 추가의 특정 양태에서, 전이 유전자는 종양 관련 항원 (TAA)을 엔코딩한다. 여전히 추가의 특정 양태에서, 전이 유전자는 CAIX, CD19, CD20, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44v7/8, CEA, EGF-RIII (표피 성장 인자 수용체 변이 3) EGP-2, erb-B2, erb-B2, 3, 4, FBP, 태아 아세티콜린 수용체, GD2, Her2/neu, IL-13R-a2, KDR, k-경쇄, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, NKG2D, 태아성암 항원 (h5T4), PSCA, PSMA, mAb IgE 표적화된 TAA, TAG-72 또는 VEGF-R2 중의 임의의 것의 유전자 생성물을 엔코딩한다.
본 발명에 따른 바이러스 벡터는 세포에 의해 생성될수 있다. 특정 구체예에서, 재조합 바이러스 벡터는 포유동물 세포에 의해 생성된다. 특정 양태에서, 재조합 바이러스 벡터는 HEK 293T (ATCC); HEK293F (Life Technologies); HEK293(ATCC); 293S (ATCC), BHK (ATCC), BHK-21 (ATCC), CHO (ATCC), CHO/dhFr- (ATCC)1, 또는 CHO K1 (ATCC) 세포에 의해 생성된다.
본 발명에 따른 재조합 바이러스 벡터를 생성하는 세포는 전형적으로 성장 배지의 현탁액에서 성장한다. 세포에 대한 성장 배지는 무혈청 세포 성장 배지를 포함한다. 특정 양태에서, 무혈청 성장 배지는 FreeStyleTM293 (GibcoR, Life Technologies), DMEM/F12 (GibcoR, Life Technologies), SFM4Transfx-293 (HyCloneTM, ThermoScientific), CDM4HEK293 (HyCloneTM, ThermoScientific), StemPro-34SFM (GibcoR, Life Technologies), FreeStyle F17 (GibcoR, Life Technologies), 293SFM II (GibcoR, Life Technologies), 또는 CD293 (GibcoR, Life Technologies), 또는 이들의 조합물이다.
뉴클레아제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 또는 이들의 조합물이다. 추가적인 특정 구체예에서, 뉴클레아제는 데옥시리보뉴클레아제, 리보뉴클레아제, 또는 이들의 조합물이다. 추가의 특정 구체예에서, 뉴클레아제는 벤조나제 또는 DN아제이다.
다양한 수지 또는 크로마토그래피 기질 (매질)이 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 친화 또는 이온 교환 수지 또는 기질 (매질)가 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피는 음이온 또는 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 강 또는 약 음이온 교환, 또는 강 또는 약 양이온 교환을 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 칼럼 크로마토그래피와 관련된 추가적인 결합, 세척 및/또는 용리 단계를 포함한다. 이러한 결합, 세척 및/또는 용리 단계는 1회 또는 다수회 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 회)로 수행될 수 있다. 다양한 구체예에서, 방법은 전 단계의 여과물을 결합액 (바이러스의 칼럼의 수지 또는 매질로의 결합을 위한)으로 조절하고/거나 여과물을 친화 또는 이온 교환 칼럼과 접촉시켜 바이러스 벡터를 친화 또는 이온 교환 칼럼에 결합시키고/거나 결합된 바이러스 벡터를 세척액 (용액은 선택적으로, PEG 또는 PEG 및 염을 포함)으로 세척하여 불순물을 제거하고/거나 친화 또는 이온 교환 칼럼으로부터의 바이러스 벡터를 용리액으로 용리시키는 것을 포함한다.
특정 양태에서, 결합액은 약 0% 내지 10% 중량/부피, 또는 약 0% 내지 5% 중량/부피, 또는 약 0% 내지 2% 중량/부피의 양의 PEG를 포함한다. 추가적인 특정 양태에서, 결합액은 약 2,000 kDa 내지 약 40,000 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함한다.
특정 양태에서, 세척액은 약 1% 내지 10% 중량/부피, 또는 약 1% 내지 5% 중량/부피, 또는 약 1% 내지 2% 중량/부피의 양의 PEG를 포함한다. 추가적인 특정 양태에서, 세척액은 약 2,000 kDa 내지 약 40,000 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함한다.
특정 양태에서, 용리액은 약 0% 내지 20% 중량/부피의 양의 PEG를 포함한다. 추가적인 특정 양태에서, 용리액은 약 2,000 kDa 내지 약 40,000 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함한다.
본 발명의 방법에서, 결합액, 세척액 및/또는 용리액은 하나 이상의 염을 선택적으로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 결합액, 세척액 및/또는 용리액은 약 20mM 내지 약 1,000mM (1M)의 양의 하나 이상의 염을 포함한다. 비제한적 염은 소듐 클로라이드 및/또는 포타슘 클로라이드를 포함한다.
추가적인 구체예에서, 바이러스 벡터 정제를 위한 방법은 하나 이상의 여과 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 여과는 약 0.20-0.5 um의 포어 직경을 갖는 필터를 통해 이루어진다. 특정 양태에서, 여과는 0.20 um 포어 직경 필터, 0.22 um 포어 직경 필터, 또는 0.45 um 포어 직경 필터를 통해 이루어진다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 높은 역가의 정제된 바이러스 벡터 예를 들어, 1 x 105 감염유발 단위 (IU)/ml 이하의 바이러스 벡터, 대략 1 x 109 감염유발 단위 (IU)/ml의 바이러스 벡터를 생성할 수 있다. 특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 대략 5 x 105 감염유발 단위 (IU)/ml으로 생성되거나, 바이러스 벡터는 대략 6 x 106 감염유발 단위 (IU)/ml로 생성되거나, 바이러스 벡터는 대략 3 x 108 감염유발 단위 (IU)/ml로 생성된다.
도 1a-1d. 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 예시적 정제 방법의 흐름도.
도 2. 무혈청 현탁 배양액에서 적응 HEK 293T 세포 성장의 특성 분석. A: CD293 무혈청 배지에서 적응된 세포 군집을 묘사하는 광학 현미경 이미지이며, 세포 응집은 관찰되지 않음. B: 스피너 플라스크를 사용한 세포 배양 조건의 최적화. 8% CO2 및 분당 130 회전의 조건하에서, 세포를 4일 동안 ml 당 약 3E+06 세포로 배양시킬 수 있다. C. 세포 성장율은 약 20시간의 배증 시간과 일치한다.
도 3. 무혈청 현탁 배양액에서 PEI 형질감염된 HEK 293 T 세포에서 eGFP 발현을 묘사하는 형광 현미경 이미지. 패널 A, B, C 및 D는 다양한 무혈청 배양 배지의 세포이다. eGFP 파지티브 세포는 패널 D에서만 검출된다.
도 4. 무혈청 현탁 배양에서 PEI 형질감염된 HEK 293 T 세포에서 eGFP 발현을 묘사하는 형광 현미경 이미지. PEI 25,000 kDa로 형질감염된 패널 A; PEI MAX (40,000 kDa)로 형질감염된 B; PEI pro로 형질감염된 패널 C. PEI Max는 가장 높은 형질감염 효율을 유도하였다.
도 5. 무혈청 현탁 배양에서 HEK 293 T의 PEI 형질감염 효율 (a) 및 HEK 293 세포의 렌티바이러스 벡터 형질도입을 묘사하는 형광 현미경 이미지. PEI MAX (40,000 kDa)로 최적화된 조건을 이용하여 형질감염된 패널 A; 패널 B는 렌티벡터 형질도입 (사용된 50 ul 수확된 상청액)을 보여준다.
도 6. DEAE 칼럼 크로마토그래피 및 PEG 조절된 DEAE 칼럼 크로마토그래피로부터의 렌티벡터 회수의 분석. 상단 패널은 칼럼 크로마토그래피 분획으로부터의 샘플의 eGFP 발현을 설명한다. A: 크로마토그래피는 PEG 조절을 함유하지 않는다; B, C 및 D는 4% PEG (4K); 4% PEG (6K) 및 8% PEG (4K)를 사용한 추가적인 세척 단계를 함유한다. 100 ul의 각 분획물을 사용하여 HEK293 세포를 형질도입시키고, eGFP 파지티브 세포는 형광 현미경 및 FACS (아래 패널)를 사용하여 검출하였다. 거의 100% 렌티벡터가 용리 분획에서 검출되었다.
도 7. UV 280 nm 흡수를 이용한 렌티벡터 용리의 분석. 30 ml 정화된 렌티벡터 수확물을 16ml DEAE 세파로스 FF 칼럼에 로딩하였다. PEG 조절 (패널 B, C, D) 또는 PEG 조절 부재 (A)의 렌티벡터를 정제하였다. UV 280 nm 흡수를 이용하여 벡터 용리 피크를 통합시키고, 피크 영역을 5배로부터 거의 20배로 저하시켰다. 흥미롭게도 UV280/UV260의 UV 흡수비가 UV280 도미넌트 (패널 A)로부터 UV260 도미넌트 (패널 B, C 및 D)로 변화됨이 주지되었으며, 이는 향상된 벡터 순도를 나타낸다.
도 8. 칼럼 크로마토그래피로부터 용리된 렌티벡터의 순도의 SDS-PAGE 분석. 각 샘플의 10㎕를 4-12% NuePage Bis-Tris 겔에 로딩하고, 전기영동 후 은 염색하였다. 용리 A는 PEG 조절 부재의 칼럼 크로마토그래피로부터의 렌티벡터 용리의 샘플이며; 용리 B, C 및 D는 각각 4% 4K PEG; 4% 6K PEG 및 8% 4K PEG를 사용한 PEG-조절된 칼럼 크로마토그래피로부터의 용리 분획이다. 렌티벡터 회수는 이들 용리된 샘플 모두에 대해 고도로 필적가능한 반면, 단백질 불순물은 PEG-조절된 분획에서 현저하게 감소되었다.
도 9. r렌티벡터 생산성의 FACS 분석. eGFP를 발현하는 재조합 렌티벡터는 12 웰-플레이트 (1.5 ml 세포 배양) 또는 스피너 플라스크 (40ml 세포 배양)로부터 무혈청 현탁 세포 배양에서 최적화된 형질감염 방법을 이용하여 생성되었다. 벡터 수율은 FACS 분석을 이용하여 결정되었다. 밀리리터 당 6E+06 이하의 형질도입 단위 (TU)의 벡터 생산성이 12 웰 플레이트 및 스피너 세포 배양 둘 모두로부터 관찰되었다.
재조합 렌티바이러스 벡터는 조사에서 형질감염 방법을 이용하여 전형적으로 생성된다. rLV 비리온을 생성시키기 위한 당해 분야에 공지된 여러 방법이 있다: 예를 들어, 벡터 및 rLV 헬퍼 서열을 이용한 형질감염 (예를 들어, 문헌 [Merten et al 2011] 참조). 그러나, 임상 적용 특히, 임상 적용의 후기 스테이지를 위한 rLenti 벡터를 제작할 경우, 적절한 제작 능력을 보장하도록 확대될 수 있는 무혈청 현탁 생성 시스템을 이용하고 제작된 벡터의 탁월한 안정성 프로파일을 보장하는 벡터를 제작하는 것이 매우 바람직하다.
확대가능한 무혈청 세포 배양 시스템에서 높은 역가의 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위한 형질감염-기반 생산 방법이 본원에 기재되어 있다. 부착 성장에 적당한 것으로서 입수가능한 시중의 공급처로부터의 세포는 성공적으로 무혈청 세포 배양 배지로 적응되었다. 본 발명자들은 무혈청 현탁 세포 배양을 지지하도록 요구된 5개 초과의 상이한 세포 배양 배지를 평가하였으나, 적응 후 신속한 성장 속도를 가지며 비응집성의 건강한 세포 성장을 지지하는 단지 하나의 배지만 확인되었다. 적응된 세포를 수 개월 동안 무혈청 현탁 배양 조건에서 배양하고, 리서치 셀 뱅크 (research cell bank)를 개발하였다.
렌티바이러스는 엔벨로프 바이러스이며, 핵산을 세포 내로 전달하기 위해 사용된 기타 바이러스 예컨대, 아데노-관련 바이러스 (AAV)와 바이러스 구조 및 생활사에 있어서 현저하게 상이하다. 렌티바이러스는 RNA의 2개 복사체, 핵 캡시드 (NC), 캡시드 (CA), 막 결합 매트릭스 (MA), 엔벨로프(envelope) 단백질 예컨대, 표면 글리코단백질 및 막횡단 단백질 및 효소 예컨대, 인테그라제 (IN), 프로테아제 (PR), 역전사효소 (RT) 및 액세서리 단백질 (예를 들어, Nef, Vif, Vpu, Vpr)로 구성된다. 렌티바이러스는 바이러스의 표면 글리코단백질을 세포 상의 수용체에 결합시켜 세포를 감염시킨다. 이어서 바이러스의 엔벨로프의 막과 세포가 융합되어 바이러스가 세포 내로 유입되게 한다. 유입 후, 바이러스 RNA의 언코팅 및 역전사가 발생하며, 이는 통합전 복합체의 형성으로 이어지며, 이러한 복합체는 이중 가닥 DNA, RT, IN, Vpr (또는 HIV-2 중 Vpx) NC, 및 MA의 일부 복사체를 함유한다 (Suzuki and Craigie 2007, Depienne et al., 2000, Bukrinsky et al., 1993 and Miller et al., 1997). 프로바이러스가 핵 엔벨로프로 유입되면, 바이러스 DNA는 세포 게놈내에 통합된다. 전사 및 번역의 정상적인 세포 기능에 이어서 구조 바이러스 단백질과 바이러스 RNA의 어셈블리 및 후속 바이러스 발아가 뒤따른다.
렌티바이러스는 핵산의 세포 내로의 전달에 부분적으로 바람직한데, 그 이유는 이들이 핵 엔벨로프를 통해 핵을 활성적으로 유입시킴으로써 비-분화 세포를 감염시킬 수 있기 때문이다. 반대로, 다른 레트로바이러스는 비-분화 세포의 핵 엔벨로프로 유입될 수 없다는 점 때문에 감염을 위한 세포 분화가 요구된다.
"렌티바이러스"는 소 렌티바이러스 군, 말 렌티바이러스 군, 고양이 렌티바이러스 군, 양 염소 렌티바이러스 군 및 영장류 렌티바이러스 군의 구성원을 포함한다. 본 발명의 방법 및 용도에 적합한 렌티바이러스의 예는 비제한적으로, HIV 및 이들의 슈도형 예컨대, HIV-1, HIV-2, HIV-1/HIV-2 슈도형, HIV-1/SIV, FIV, 염소 관절염 뇌염 바이러스 (CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스, 소 면역결핍 바이러스 및 소수포구내염 바이러스 G-슈도형 렌티바이러스 (VSVG 슈도형)를 포함한다.
유전자 요법을 위한 렌티바이러스 벡터의 개발은 문헌 [Klimatcheva et al., 1999, Frontiers in Bioscience 4: 481-496]에서 검토되었다. 유전자 요법에 적합한 렌티바이러스 벡터의 설계 및 사용은 예를 들어, 2001년 3월 27일 교부된 미국 특허 번호 6,207,455, 및 2000년 12월 26일 교부된 미국 특허 번호 6,165,782에 기술되어 있다. 추가적인 시스템은 문헌 [Merten et al. (2011)]에 기술되어 있다.
용어 "gag 다단백질", "pol 다단백질" 및 "env 다단백질"은 전형적으로 단일 전구체 "다단백질"로서 발현되는 레트로바이러스 gag, pol 및 env 유전자에 의해 엔코딩된 다중 단백질을 지칭한다. 예를 들어, HIV gag는 다른 단백질 중 p17, p24, p9 및 p6를 엔코딩한다. HIV pol은 다른 단백질 중 프로테아제 (PR), 역전사효소 (RT) 및 인테그라제 (IN)를 엔코딩한다. HIV env는 다른 단백질 중 Vpu, gp120 및 gp41을 엔코딩한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "다단백질"은 gag, pol and env 다단백질 모두 또는 임의의 일부를 포함해야 한다.
용어 "Vpx" 및 "Vpr"는 각각, 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로서 통합된 WO 96/07741에 기술된 렌티바이러스 Vpx 및 Vpr 단백질을 지칭한다. 이들 용어는 또한, p6과 결합할 수 있는 능력을 보유하는 Vpr 및 Vpx의 단편, 변이체, 호몰로그 및 변이를 지칭한다.
용어 "융합 단백질"은 함께 연결된 2개 이상의 단백질을 포함하는 분자를 지칭한다. 전형적으로, 융합 단백질은 2개 이상의 단백질 서열을 포함하는 아미노산 서열이다.
"벡터"는 적절한 조절 요소와 결합되는 경우 복제할 수 있으며 세포 간에 전이 유전자 서열을 전달할 수 있는 유전자 요소 예컨대, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 크로모솜, 바이러스, 비리온, 등을 의미한다. 따라서, 이 용어는 클로닝 및 발현 비히클은 물론 바이러스 벡터를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 서열 예컨대, 벡터의 수식어는 물론 바이러스의 수식어인 용어 "재조합"은 조성물이 일반적으로 자연에서 발생하지 않는 방식으로 조작 (즉, 유전자조작)되었음을 의미한다.
"재조합 렌티바이러스 벡터" 또는 "rLV"는 렌티바이러스의 선형의 이중-가닥 핵산 게놈을 포함하는 유전자 요소이다. 렌티바이러스의 선형의 이중-가닥 핵산 게놈은 예를 들어, 이종 핵산 작제물의 부가 또는 삽입에 의해 유전자 변경되었다.
"재조합 바이러스"는 예를 들어, 이종 핵산 작제물의 입자로의 부가 또는 삽입에 의해 유전자 변경된 바이러스를 의미한다. 재조합 바이러스는 이들이 자연적으로 존재할 때는 감염성 바이러스를 포함하지 않는다.
"LV 비리온"은 완전 바이러스 입자 예컨대, rLV 엔벨로프와 결합된 야생형 (wt) LV 바이러스 입자를 의미한다. "rLV 비리온"은 선형의 이중-가닥 LV 핵산 게놈 및 rLV 엔벨로프와 결합된 관심대상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rLV 바이러스 입자와 같은 완전 바이러스 입자를 의미한다. 본 발명의 방법 및 용도에 적합한 rLV의 예는 비제한적으로, HIV 및 이들의 슈도형 예컨대, HIV-1, HIV-2, HIV-1/HIV-2 슈도형, HIV-1/SIV, FIV, 염소 관절염 뇌염 바이러스 (CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스, 소 면역결핍 바이러스 및 소수포구내염 바이러스 G-슈도형 렌티바이러스 (VSVG 슈도형)을 포함한다.
용어 "재조합 rLV 비리온", "rLV 벡터 입자" 및 "전입자 (full particle)"는 관심대상의 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 전이 유전자 및 rLV 막 엔벨로프를 포함하는 감염성의 복제-결함 바이러스로서 본원에서 규정된다. rLV 분자 특징을 기술한 검토내용은 Dropulic (2011)에 제공된다. 본원에 제시된 바와 같이, "재조합 rLV 비리온"은 자연에서 존재하는 경우 감염성 LV를 포함하지 않는다.
용어 "숙주 세포"는 rLV 헬퍼 작제물, rLV 벡터 플라스미드, 액세서리 작용 벡터, 또는 기타 전이 DNA의 수령체로 사용될 수 있거나 사용되었던 예를 들어, 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 의미한다. 본 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭한다. 단일 부모 세포의 자손이 자연적, 우연적 또는 유도 돌연변이로 인해 원래 부모와 형태 또는 게놈에 있어서 반드시 완전하게 동일하거나 전체적으로 DNA 상보적일 필요는 없음이 이해된다.
액세서리 작용 벡터는 액세서리 또는 헬퍼 기능을 제공하는 서열을 포함하는 핵산을 일반적으로 지칭한다. 액세서리 작용 벡터는 숙주 세포로 형질감염될 수 있으며, 벡터는 숙주 세포에서/숙주 세포에 의해 rLV 벡터 비리온 생성을 지지하는 기능을 하는 단백질(들)을 제공하거나 엔코딩할 수 있다. 액세서리 작용 벡터는 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 에피솜의 형태 또는 숙주 세포의 게놈에 통합된 형태로 존재할 수 있다.
용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 핵산 (예를 들어, DNA)의 흡수를 지칭하는데 이용되며, 외인성 핵산 (예를 들어, DNA)가 세포 막 내부로 도입되는 경우 세포는 "형질감염"되었다. 많은 형질감염 기법이 일반적으로 당해분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Graham et al. (1973) Virology, 52 :456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197] 참조. 이러한 기법은 적합한 숙주 세포에 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 도입시키는데 이용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "세포주"는 시험관내에서 연속 또는 연장된 성장 및 분열을 할 수 있는 세포 군집을 지칭한다. 종종, 세포주는 단일 전구 세포로부터 유래된 클로날 군집이다. 자발적 또는 유도된 변화가 이러한 클로날 군집의 저장 또는 전달 동안 핵형에서 발생할 수 있음은 당해 분야에 추가로 공지되어 있다. 따라서, 언급된 세포주로부터 유래된 세포는 조상 세포 또는 배양물과 정확하게 동일할 수 없으며, 언급된 세포주는 이러한 변이를 포함한다.
본 발명의 방법에 따른 현탁액에서 무혈청 성장에 적합한 세포 및 세포주는 포유동물 세포를 포함한다. 예시적인 비제한적 예로는 예를 들어, HEK 293T (ATCC); HEK 293F (Life Technologies); HEK293(ATCC); 293S (ATCC), BHK (ATCC), BHK-21 (ATCC) , CHO (ATCC), CHO/dhFr- (ATCC)1, 및 CHO K1 (ATCC) 세포를 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 무혈청 세포 성장 배지는 시중에서 입수가능하거나 제조될 수 있다. 비제한적인 예시적 무혈청 성장 배지는 예를 들어, FreeStyleTM293 (GibcoR, Life Technologies), DMEM/F12 (GibcoR, Life Technologies), SFM4Transfx-293 (HyCloneTM, ThermoScientific), CDM4HEK293 (HyCloneTM, ThermoScientific), StemPro-34SFM (GibcoR, Life Technologies), FreeStyle F17 (GibcoR, Life Technologies), 293SFM II (GibcoR, Life Technologies), 및 CD293 (GibcoR, Life Technologies) 배지를 포함한다.
본 발명의 방법에서, 처리 또는 방법 단계는 핵산 불순물의 양을 저하시키거나 감소시키기 위해 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 뉴클레아제는 수화된 재조합 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터의 제조물에서 핵산 불순물의 양을 저하시키거나 감소시키기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제, 예컨대, 벤조나제, 엑소뉴클레아제, 또는 이들의 조합물이다. 특정 구체예에서, 뉴클레아제는 데옥시리보뉴클레아제, 리보뉴클레아제, 또는 이들의 조합물이다. 특정 구체예에서, 뉴클레아제는 DN아제이다.
본 발명의 방법에서, 하나 이상의 칼럼 크로마토그래피 단계가 수행된다. 다양한 기질이 칼럼 크로마토그래피에 대한 수지 또는 매질 (고정 상)로서 적합하다. 이러한 수지 또는 매질 (고정 상)은 전하 기재 (이온 교반) 또는 친화 수지 또는 매질을 포함한다.
특정 구체예에서, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피는 음이온 (강 또는 약) 교환 칼럼 크로마토그래피, 또는 양이온 (강 또는 약) 교환 칼럼 크로마토그래피이다. 더욱 특정 구체예에서, 이온 교환 칼럼은 4차화된 폴리에틸렌이민 기재 수지 또는 매질; 또는 4차 아민 기재 수지 또는 매질이다. 더욱 더 특정 구체예에서, 이온 교환 칼럼은 폴리에틸렌이민 기재 수지; 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기재 수지; 또는 디에틸아미노프로필 기재 수지이다.
특정 구체예에서, 친화 칼럼은 설포프로필 기재 수지 또는 매질, 또는 카르복시메틸 기재 수지 또는 매질이다. 추가의 특정 구체예에서, 친화 칼럼은 다작용성 크로마토그래피 수지 또는 매질; 금속 킬레이트 친화 수지 또는 매질; 헤파린 기재 수지 또는 매질, 또는 그룹 특이적 친화 수지 또는 매질이다.
본 발명의 방법에서 칼럼 크로마토그래피에 적합한 추가적인 수지 또는 매질은 히드록시아파타이트 ((Ca5(PO4)3OH)2) 기재 수지 또는 매질; 멀티모드 약 양이온 교환 수지 또는 매질; N-벤질-n-메틸에탄올아민 기재 수지 또는 매질; 또는 옥틸아민 기재 수지 또는 매질을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 결합액, 세척액 및 용리액과 같은 용액이 사용된다. 이러한 용어는 편의를 위해 크로마토그래피의 맥락하에서 용액의 목적을 나타내기 위해 사용된다.
이러한 용액은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 성분을 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 용액은 또한, 선택적으로 염과 같은 성분을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 용액은 선택적으로 완충제 (트리스- 또는 포스페이트-완충된)와 같은 성분을 선택적으로 포함할 수 있다. 게다가, 이러한 용액은 킬레이트제와 같은 성분 예를 들어, EDTA를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 결합액 중 PEG의 양은 약 0% 내지 10% 중량/부피, 또는 약 0% 내지 5% 중량/부피, 또는 약 0% 내지 2% 중량/부피이다. 특정 구체예에서, 세척액 중 PEG의 양은 약 1% 내지 10% 중량/부피, 또는 약 1% 내지 5% 중량/부피, 또는 약 1% 내지 2% 중량/부피이다. 특정 구체예에서, 용리액 중 PEG의 양은 약 0% 내지 20% 중량/부피이다.
특정 구체예에서, 결합액, 세척액 또는 용리액 중 PEG는 약 2,000 kDa 내지 약 40,000 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 특정 구체예에서, 결합액, 세척액 또는 용리액 중 PEG는 약 2,000 kDa 내지 약 10,000 kDa의 분자량을 갖는다.
특정 구체예에서, 염은 소듐 클로라이드 (NaCl), 포타슘 클로라이드 (KCl), 또는 칼슘 클로라이드를 포함하거나 이들로 구성된다. 특정 구체예에서, 결합액, 세척액 또는 용리액 중 염의 양은 약 20 mM 내지 약 1 M이다. 더욱 특정 구체예에서, 결합액 중 염의 양은 약 20 mM 내지 약 200 mM (예컨대, 약 100 mM)이다. 더욱 특정 구체예에서, 세척액 중 염의 양은 약 20 mM 내지 약 200 mM (예컨대, 100 mM)이다. 더욱 특정 구체예에서, 용리액 중 염의 양은 약 200 mM 내지 약 1 M (예컨대, 200mM, 250mM, 300mM, 350mM, 400mM, 450mM, 또는 500mM) 또는 약 500-1,000 mM, 또는 600-800 mM이다.
본 발명의 방법에서, 필터가 사용될 수 있다. 필터는 다양한 기공 크기 직경일 수 있다. 기공 크기 직경은 수치 값으로 편리하게 나타낼 수 있다. 예시적인 기공 크기는 약 0.20-0.5 um (미크론)의 범위이다. 추가적인 예시적 기공 크기는 약 0.20 um (미크론) 내지 약 0.22 um (미크론)의 범위이거나, 더욱 특히 약 0.22um (미크론)이다. 추가의 예시적 기공 크기는 약 0.22 um (미크론) 내지 약 0.30 um (미크론), 또는 약 0.30 um (미크론) 내지 약 0.45 um (미크론) 기공 직경의 범위이거나, 더욱 특히 약 0.45um (미크론)이다.
본 발명의 방법은 대규모 생산 동안 rLV 역가의 증가를 제공하는데, rLV 비리온의 정제된 스톡 내에 함유된 rLV 벡터 입자 또는 비리온의 손실을 최소화시키면서 rLV 비리온의 정제된 스톡 내에 함유된 rLV 벡터 관련 불순물 (예를 들어, rLV 결합된 핵산 불순물)을 저하, 감소 또는 제거한다. 불순물은 단백질, 핵산(DNA, RNA), 찌꺼기, 및 존재할 수 있는 rLV 벡터 입자 또는 비리온과 구별되는 기타 물질을 포함한다. 본 발명의 방법은 rLV 벡터 입자/비리온의 양은 증가시키면서 불순물을 저하, 감소 또는 제거하는 역할을 한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 대략 5 x 105 감염유발 단위 (IU)/ml, 또는 그 초과로 생성된 바이러스 벡터를 발생시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 대략 6 x 106 감염유발 단위 (IU)/ml, 또는 그 초과로 생성된 바이러스 벡터를 발생시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 대략 3 x 108 감염유발 단위 (IU)/ml로 생성된 바이러스 벡터를 발생시킨다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약" 또는 "대략"은 정량 또는 단위 측정에 대한 언급에서 사용될 경우, 나타낸 수치 값에 대해 허용되는 통계학적 편차 범위를 지칭한다. 전형적으로, 범위는 나타낸 수치 값의 약 +/- 10%, 또는 +/-5%이다.
본원에 기재된 바와 같은, 재조합 (바이러스) 벡터는 핵산, 예컨대, 전이 유전자를 포함할 수 있다. "핵산" 서열은 DNA 또는 RNA 서열을 지칭한다. 본 용어는 DNA 또는 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체 예컨대, 비제한적으로, 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실-, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘우오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신 (oxybutoxosine), 슈도우라실, 퀘우오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 부라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀘우오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노퓨린를 포함하는 서열을 포함한다.
"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "엔코딩"하는 서열은 적합한 조절 서열의 조정하에 위치하는 경우 생체내에서 전사되고 (DNA의 경우) 폴리펩티드로 번역 (mRNA의 경우)되는 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단의 개시 코돈 및 3' (카르복시) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 수 있다.
용어 DNA "조정 서열"은 프로모터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 전사 종결 서열, 업스트림 조절 도메인, 복제 오리진, 내부 리보솜 유입 부위 ("IRES"), 인핸서 및 기타 등등을 종합적으로 지칭하며, 이는 수령체 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 위해 종합적으로 제공된다. 선택된 코딩 서열이 적합한 숙주 세포에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한, 이들 조정 서열 모두가 항상 존재해야 하는 것은 아니다.
용어 "프로모터"는 이의 통상적인 의미로 본원에 사용되는 것으로서, DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 지칭하며, 여기에서 조절 서열은 RNA 폴리머라제와 결합하여 다운스트림 (3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된다. 전사 프로모터는 "유도성 프로모터" (여기에서, 프로모터에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 분석물질, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도됨), "억제성 프로모터" (여기에서, 프로모터에 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 분석물질, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도됨), 및 "항시성 프로모터"를 포함할 수 있다.
"작동적으로 연결된"은 기술된 바와 같은 구성요소가 이들의 일반적인 기능을 수행하도록 형성된 요소의 배열을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 조정 서열은 코딩 서열의 발현에 영향을 끼칠 수 있다. 조정 서열은 이들이 코딩 서열의 발현을 유도하는 기능을 수행하는 한 코딩 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 비번역되었으나 전사된 중간 (intervening) 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있으며, 프로모터 서열은 코딩 서열에 여전히 "작동적으로 연결"된 것으로 간주될 수 있다.
본 출원에 걸쳐 특정 핵산 분자에서 뉴클레오티드 서열의 상대적 위치를 기술하기 위한 목적으로, 예컨대, 특정 뉴클레오티드 서열이 또 다른 서열에 비해 "업스트림", "다운스트림", "3'" 또는 "5'"에 위치하는 것으로 기술된 경우, 이는 당해 분야에서 통상적인 것으로서 언급되는 DNA 분자의 "센스" 또는 코딩" 가닥에서의 서열의 위치인 것으로 이해되어야 한다.
용어 "이종"은 코딩 서열 및 조정 서열과 같은 핵산 서열에 관한 것이기 때문에, 보통 함께 연합되지 않고/거나 특정 세포와 보통 회합되지 않는 서열을 의미한다. 따라서, 핵산 작제물 또는 벡터의 "이종" 영역은 자연에서 다른 분자와 회합된 상태로 발견되지 않은 또 다른 핵산 분자 내의 또는 또 다른 핵산 분자에 부착된 세그먼트이다. 예를 들어, 핵산 작제물의 이종 영역은 자연에서 코딩 서열과 회합된 상태로 발견되지 않는 서열의 측면에 위치한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종 코딩 서열의 또 다른 예는, 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 (예를 들어, 천연 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열) 작제물이다. 유사하게, 세포에 보통 존재하지 않는 작제물로 형질환된 세포는 본 발명의 목적에 있어서 이종으로 간주될 것이다. 대립 변이 또는 자연 발생 돌연변이 사건은 본원에 사용된 바와 같은 이종 DNA를 발생시키지 못한다.
일 구체예에서 "치료학적 분자"는 세포 또는 대상체에서 단백질의 부재 또는 결함으로부터 초래된 증상을 완화시키거나 감소시킬 수 있는 펩티드 또는 단백질이다. 대안적으로, 전이 유전자에 의해 엔코딩된 "치료학적" 펩티드 또는 단백질은 대상체에 이익을 주는 예를 들어, 유전자 결함을 교정하거나, 유전자 (발현 또는 기능) 결핍을 교정하거나 항-암 효과를 부여하는 것이다. 따라서, 이종 핵산을 포함하는 전이 유전자는 많은 유용한 생성물을 엔코딩할 수 있다. 이들은 예를 들어, siRNA, 안티센스 분자 및 miRNA를 포함할 수 있다.
전이 유전자는 비제한적으로, 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬 (GH), 파라티로이드 호르몬 (PTH), 성장 호르몬 방출 인자 (GRF), 여포 자극 호르몬 (FSH), 황체형성 호르몬 (LH), 인간 융모성 성선자극 호르몬 (hCG), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 안지오포이에틴, 안지오스타틴, 과립구집락자극인자 (GCSF), 에리트로포이에틴 (EPO), 연결 조직 성장 인자 (CTGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 α (TGFβ), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II (IGF-I 및 IGF-II), TGFβ, 액티빈, 인히빈을 포함하는 형질전환 성장 인자 α 슈퍼패밀리 중 어느 하나, 또는 골 형성 단백질 (BMP) BMP 1-15 중 어느 하나, 성장 인자의 헤레글루인(heregluin)/뉴레굴린(neuregulin)/ARIA/네우(neu) 분화 인자 (NDF) 패밀리 중 어느 하나, 신경 성장 인자 (NGF), 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT4/5, 섬신경영양 인자 (CNTF), 신경아교세포계 유래 신경영양 인자 (GDNF), 뉴투린, 아그린, 세마포린(semaphorin)/콜랍신(collapsin) 패밀리 중 어느 하나, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자 (HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 히드록실라제를 포함하는 호르몬 및 성장 및 분화 인자를 엔코딩할 수 있다.
기타 유용한 전이 유전자 생성물은 비제한적으로, 사이토킨 및 림포킨 예컨대, 트롬보포이에틴 (TPO), 인터류킨 (IL) IL-1 내지 IL-17, 단핵구 화학주성인자 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드를 포함하는 면역 시스템을 조절하는 단백질을 포함한다. 면역계에 의해 생성된 유전자 생성물은 또한 본 발명에 유용하다. 이들은 비제한적으로, 면역글로불린 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체 단일 사슬 T 세포 수용체 (예를 들어, Kalos et al 2011; Porter et al 2011), G 단백질-결합된 수용체 (GPCR) 예컨대, CCR5, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자, 및 유전자 조작된 면역글로불린 및 MHC 분자를 포함한다. 유용한 유전자 생성물은 또한, 조절 단백질 예컨대, 상보적 조절 단백질, 막 보조인자 단백질 (MCP), 부식 촉발 인자 (DAF), CR1, CF2 및 CD59를 포함한다.
기타 유용한 유전자 생성물은 선천성 대사 이상을 교정할 수 있는 것들을 포함한다. 이러한 전이 유전자는 예를 들어, 카르바모일 신세타제 I, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노숙시네이트 신세타제, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세트아세테이트 히드롤라제, 페닐알라닌 히드록실라제, 알파-1 안티트립신, 글루코스-6-포스파타제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 혈액 응고 인자 예컨대, 팩터 V, 팩터 VIIa, 팩터 VIII, 팩터 IX, 팩터 X, 팩터 XIII, 또는 단백질 C, 시스타티온 베타-신타제, 분지쇄 케토산 데카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-coA 데히드로게나제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 무타제, 글루타릴 CoA 데히드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카르복실라제, H-단백질, T-단백질, 낭포성 섬유증 막횡단 조절인자 (CFTR) 서열, 및 디스트로핀 cDNA 서열을 엔코딩할 수 있다.
추가의 유용한 유전자 생성물은 결함, 결핍 또는 손실 기능 또는 활성을 제공할 수 있는 것들 예를 들어, 항체, 망막색소상피-특이적 65 kDa 단백질 (RPE65), 에리트로포이에틴, LDL 수용체, 리포단백질 리파제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, β-글로빈, β-글로빈, 스펙트린, β-안티트립신, 아데노신 데아미나제 (ADA), 금속 수송체 (ATP7A 또는 ATP7), 설파미다제, 리소좀 축적 병 관련 효소 (ARSA), 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, β-25 글루코세레브로시다제, 스핑고마이엘리나제, 리소좀 헥소사미니다제, 분지쇄 케토산 데히드로게나제, 호르몬, 성장 인자 (예를 들어, 인슐린-유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경영양 인자 -3 및 -4, 뇌-유래 신경영양 인자, 아교세포 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 α 및 β, 등), 사이토킨 (예를 들어, α-인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨 12, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, 림포톡신, 등), 자살 유전자 생성물 (예를 들어, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소, 시토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나제, 종양 괴사 인자, 등), 약물 내성 단백질 (예를 들어, 암 치료에 사용된 약물에 대한 내성을 제공하는 단백질), 종양 억제 단백질 (예를 들어, p53, Rb, Wt-1, NF1, 폰 힙펠-린도우 (VHL), 선종성 결장폴립증 (APC)), 면역조절 특성을 갖는 펩티드, 면역허용원성 또는 면역원성 펩티드 또는 단백질 트레지토프(Tregitope), 또는 hCDR1, 인슐린, 글루코키나제, 구아닐레이트 시클라제 2D (LCA-GUCY2D), Rab 에스코트 단백질 1 (범맥락막위축), LCA 5 (LCA-레베르실린(Lebercilin)), 오르니틴 케토산 아미노트랜스퍼라제 (우곡상 위축), 레티노쉬신(Retinoschisin) 1 (X-연결된 망막층간분리(Retinoschisis)), USH1C (아셔 증후군 1C), X-연결된 색소성 망막염 GTP아제 (XLRP), MERTK (RP의 AR 형: 색소성 망막염), DFNB1 (코넥신 26 난청), ACHM 2, 3 및 4 (색맹), PKD-1 또는 PKD-2 (다낭 신장병), TPP1, CLN2, 리소좀 축적 병의 원인이되는 유전자 결핍 (예를 들어, 설파타제, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 트랜스퍼라제, 카텝신 A, GM2-AP, NPC1, VPC2, 스핑고리피드 활성인자 단백질, 등), 게놈 편집을 위한 하나 이상의 아연 핑커 뉴클레아제, 또는 게놈 편집을 위한 복구 주형으로서 사용된 도너 서열을 포함한다.
전이 유전자는 또한, 종양 관련 항원 (TAA)을 엔코딩할 수 있다. 비제한적인 TAA는 하기를 포함한다: 종양-관련 고환-특이적 항원 (예를 들어, MAGE, BAGE, 및 GAGE), 멜라닌세포 분화 항원 (예를 들어, 티로시나제, Melan-A/MART-1), CDK4, MUM-1, 베타-카테닌, gp100/pmel 17, TRP-1, TRP-2, MITF, MITF-A 및 MITF-M (King, et al. (1999). Am J Pathol 155:731). 종양에 의해 발현된 TAA의 추가적인 비제한적 예는 멜라노마 GP75, 아넥신 I, 아넥신 II, 아데노신 데아미나제-결합 단백질 (ADAbp), PGP 9.5 (Rode, et al. (1985). Histopathology 9:147), 결장직장 관련 항원 (CRC)--C017-1A/GA733, Ab2 BR3E4, CI17-1A/GA733, Hsp70 (Chen, et al. (2002). Immunol Lett 84:81), Hsp90, Hsp96, Hsp105, Hsp110, HSPPC-96 (Caudill, M. M. and Z. Li (2001). Expert Opin Biol Ther 1:539), 스트레스 단백질 gp96 (Heike et al. (2000). Int J Can 86:489), gp96-관련 세포 펩티드, G250, 디펩티딜 펩티다제 IV (DPPIV), 맘마글로빈 (Tanaka, et al. (2003). Surgery 133:74), 티로글로불린, STn (Morse, M. A. (2000). Curr Opin Mol Ther 2:453), 암종배아 항원 (CEA), 암종배아 항원 (CEA) 에피토프 CAP-1, 암종배아 항원 (CEA) 에피토프 CAP-2, etv6, aml1, 전립선 특이적 항원 (PSA), PSA 에피토프 PSA-1, PSA-2, PSA-3 (Correale, et al. (1998). J Immunol 161:3186), Ad5-PSA, 부갑상샘-호르몬-관련 단백질 (PTH-rP), EGFR (Plunkett, et al. (2001). J Mammary Gland Biol Neoplasia 6:467), PLU1 (Plunkett, et al. (2001). J Mammary Gland Biol Neoplasia 6:467), 태아성암 항원-미숙 라미닌 수용체 (OFA-iLR), MN/CA IX (CA9) (Shimizu et al., (2003). Oncol. Rep. Sep-Oct; 10:1307), HP59, 시토크롬 옥시다제 1, sp100, msa (Devine, et al. (1991). Cancer Res 51:5826), Ran GTP아제 활성화 단백질, Rab-GAP (Rab GTP아제-활성화) 단백질, PARIS-1 (Zhou, et al. (2002). Biochem Biophys Res Commun 290:830), T-세포 수용체/CD3-제타 사슬, cTAGE-1, SCP-1, 글리코리피드 항원-GM2, GD2 또는 GD3, GM3 (Bada, et al. (2002). Hum Exp Toxicol 21:263), 푸코실GM1, 글리코단백질 (뮤신) 항원-Tn, 시알릴-Tn (Lundin, et al. (1999). Oncology 57:70), TF 및 뮤신-1 (Mukherjee, et al. (2003). J Immunother 26:47), CA125 (MUC-16) (Reinartz, et al. (2003). Cancer Res 63:3234), MAGE 패밀리 항원, GAGE-1,2, BAGE, RAGE, LAGE-1 (Eichmuller, et al. (2003). Int J Cancer 104:482) (Chen, et al. (1998). Proc Natl Acad Sci USA 95:6919), GnT-V (Murata, et al. (2001). Dis Colon Rectum 44:A2-A4), MUM-1 (Kawakami, et al. (1996). Keio J Med 45:100), EP-CAM/KSA (Ullenhag, et al. (2003). Clin Cancer Res 9:2447), CDK4, MUC 패밀리 항원, HER2/neu, ErbB-2/neu, p21ras, RCAS1, α-태아단백질, E-카드헤린, α-카테닌, β-카테닌 및 γ-카테닌, NeuGeGM3 (Carr, et al. (2003). J Clin Oncol 21:1015), Fos 관련 항원 (Luo, et al. (2003). Proc Natl Acad Sci USA 100:8850), 시클로필린 B (Tamura, et al. (2001). Jpn J Cancer Res 92:762), RCAS1, S2 (Koga, et al. (2003). Tissue Antigens 61:136), L10a (Koga, et al. (2003). 상기 참조), L10a, 텔로머라제 rt 펩티드 (Wang, et al. (2001). Oncogene 20:7699), cdc27, 포드린, p120ctn, PRAME, GA733/EoCam (Ross, et al. (1986). Biochem Biophys Res Commun 135:297), NY-BR-1, NY-BR-2 NY-BR-3, NY-BR-4 NY-BR-5, NY-BR-6 NY-BR-7 (Jager, et al. (2001). Cancer Res 61:2055), NY-ESO-1, L19H1, MAZ (Daheron, et al. (1998). Leukemia 12:326), PINCH (Greiner, et al. (2000). Exp Hematol 28:1413), PRAME (Ikeda, et al. (1997). Immunity 6:199), Prp1p/Zer1p, WT1 (Oka, et al. (2002). Curr Cancer Drug Targets 2:45), 선종성 결장폴립증 단백질 (APC), PHF3, LAGE-1, SART3 (Miyagi, et al. (2001). Clin Cancer Res 7:3950), SCP-1 (Jager, et al. (2002). Cancer Immun 2:5), SSX-1, SSX-2, SSX-4, TAG-72 (Buchsbaum, et al. (1999). Clin Cancer Res 5(10 Suppl): 3048s-3055s), TRAG-3 (Chen, et al. (2002). Lung Cancer 38:101), MBTAA (Basu, et al. (2003). Int J Cancer 105:377), Smad 종양 항원, lmp-1, HPV-16 E7, c-erbB-2, EBV-엔코딩된 핵 항원 (EBNA)-1, 단순 포진 티미딘 키나제 (HSVtk), XAGE-1의 대안적으로 스플라이싱된 아이소형 (L552S; Wang, (2001). Oncogene 20:7699), TGF 베타 RII 프레임 쉬프트 돌연변이 (Saeterdal, et al. (2001). Proc Natl Acad Sci USA 98:13255), BAX 프레임 쉬프트 돌연변이 (Saeterdal, et al. (2001). Proc Natl Acad Sci USA 98:13255)를 포함한다.
전이 유전자는 추가적으로, 유전자 생성물 예컨대, CAIX, CD19, CD20, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44v7/8, CEA, EGF-RIII (표피 성장 인자 수용체 변이 3) EGP-2, erb-B2, erb-B2, 3, 4, FBP, 태아 아세티콜린 수용체, GD2, Her2/neu, IL-13R-a2, KDR, k-경쇄, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, NKG2D, 태아성암 항원 (h5T4), PSCA, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), 전립선산 포스파타제 (PAP), 전립선 상피-유래된 Ets 전사 인자 (PDEF), mAb IgE 표적화된 TAA, TAG-72 및 VEGF-R2를 엔코딩할 수 있다.
대안적으로, 전이 유전자는 예를 들어, siRNA, 안티센스 분자, 및 miRNA를 포함할 수 있다. 임상적으로 유용한 렌티바이러스 벡터는 또한, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) (Levine et al 2006) 및 기타 중요한 인간 병원체에 대해 유도된 안티센스 유전자를 발현할 수 있다. rLV 및 관련 벡터의 이러한 및 기타 유용한 적용은 날디니 (Naldini (2011))에 의해 최근 고찰되고 인용되었다.
rLV 벡터에 포함될 수 있는 안티센스 유전자는 하기의 발현을 억제할 수 있다: 헌팅턴 (HTT) 유전자, 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증 관련 유전자 (예를 들어, 아트로핀 1, ATN1); 척수구근 근 위축증에서 X 크로모솜 상의 안드로겐 수용체, 인간 아탁신-1, -2, -3, 및 -7, Cav2.1 P/Q 전압-의존성 칼슘 채널 ((CACNA1A)에 의해 엔코딩됨), TATA-결합 단백질, 아탁신(Ataxin) 8 반대 가닥 (또한, ATXN80S로도 공지됨), 척수소뇌성 실조증에서 세린/트레오닌-단백질 포스파타제 2A 55 kDa 조절 서브유닛 B 베타 아이소형 (타입 1, 2, 3, 6, 7, 8, 12 17), 취약성 X 증후군에서 FMR1 (취약성 X 정신 지체 1), 취약성 X-관련 진전/운동실조 증후군에서 FMR1 (취약성 X 정신 지체 1), FMR1 (취약성 X 정신 지체 2) 또는 취약성 XE 정신 지체에서 AF4/FMR2 패밀리 멤버 2; 근긴장성 이영양증에서 미오토닌-단백질 키나제 (MT-PK); 프리이드라이히 운동실조에서 프라탁신; 근위축성 측삭 경화증에서 슈퍼옥시드 디스무타제 1 (SOD1) 유전자의 변이체; 파킨슨병 및/또는 알츠하이머병의 발병기전과 관련된 유전자; 아포리포단백질 B (APOB) 및 프로단백질 전환효소 섭틸리신/켁신 타입 9 (PCSK9), 하이퍼콜로에스테르올레미아; HIV 감염에서 HIV Tat, 전사 유전자의 인간 면역결핍 바이러스 트랜스작용 인자; HIV 감염에서 HIV TAR, HIV TAR, 인간 면역결핍 바이러스 트랜스작용 인자 반응 요소 유전자; HIV 감염에서 C-C 케모킨 수용체 (CCR5); RSV 감염에서 라우스 육종 바이러스 (RSV) 뉴클레오캡시드 단백질, C 형 간염 바이러스 감염에서 간-특이적 마이크로RNA (miR-122); p53, 급성 신장 손상 또는 지연된 이식 기능 신장 이식물 또는 신장 손상 급성 신부전; 진행성 재발 또는 전이성 고형 악성 종양에서 단백질 키나제 N3 (PKN3); LMP2, 또한, 프로테아좀 서브유닛 베타-형 9 (PSMB 9)로도 공지된 LMP2, 전이성 멜라노마; LMP7 (또한, 프로테아좀 서브유닛 베타-형 8 (PSMB 8)로도 공지됨), 전이성 멜라노마; MECL1 (또한, 프로테아좀 서브유닛 베타-형 10 (PSMB 10)로도 공지됨), 전이성 멜라노마; 고형 종양에서 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 고형 종양에서 키네신 스핀들 단백질, 만성 골수성 백혈병에서 아폽토시스 억제인자 B-세포 CLL/림프종 (BCL-2); 고형 종양에서 리보뉴클레오티드 환원효소환원효소 M2 (RRM2); 고형 종양에서 푸린 (Furin); 간 종양에서 폴로-유사 키나제 1 (PLK1), C 형 간염 감염에서 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 1 (DGAT1), 가족성 선종성 용종증에서 베타-카테닌; 베타2 아드레날린성 수용체, 녹내장; 당뇨병성 망막부종 (DME) 또는 노인성 황반 변성에서 DAN 손상-유도성 전사 4 단백질로서 또한 공지된 RTP801/Redd1; 노인성 황반 변성 또는 맥락막 혈관신생에서 혈관 내피 성장 인자 수용체 I (VEGFR1), 비동맥형 허혈성 시신경증에서 카스파제 2; 선천성 손발톱 비대증에서 케라틴 6A N17K 돌연변이체 단백질; 인플루엔자 감염에서 인플루엔자 A 바이러스 게놈/유전자 서열; SARS 감염에서 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 코로나바이러스 게놈/유전자 서열; 호흡기 세포융합 바이러스 감염에서 호흡기 세포융합 바이러스 게놈/유전자 서열; 에볼라 감염에서 에볼라 필로바이러스 게놈/유전자 서열; B형 및 C형 간염 감염에서 B형 및 C형 간염 바이러스 게놈/유전자 서열; HSV 감염에서 단순 포진 바이러스 (HSV) 게놈/유전자 서열, 콕사키바이러스 B3 감염에서 콕사키바이러스 B3 게놈/유전자 서열; 원발성 근긴장이상에서 유전자의 병원성 대립 유전자 침묵 (대립 유전자-특이적 침묵) 유사 토르신 A (TOR1A), 이식에서 특이성인 pan-클래스 I 및 HLA-대립 유전자; 상염색체성의 우세하게 유전된 색소성 망막염 (adRP)에서 돌연변이체 로돕신 유전자 (RHO); 또는 임의의 상기 유전자 또는 서열의 전사에 결합하는 억제 핵산.
뉴클레오티드 서열에 대해 언급되는 경우, "분리된"은 지시된 분자가 동일한 유형의 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재하에 존재함을 의미한다. 따라서, "특정 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산 분자"는 대상 폴리펩티드를 엔코딩하지 않는 다른 핵산 분자가 실질적으로 존재하지 않는 핵산 분자를 지칭하나; 이러한 분자는 조성물의 기본 특징에 해로운 영향을 끼치지 않는 일부 추가적인 염기 또는 모이어티를 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 평가에 이용될 수 있으나, 적합한 방법 및 재료가 본원에 기술되어 있다.
본원에 기재된 모든 출원, 공개, 특허 및 기타 참고문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 기준이 될 것이다.
본원에 기술된 특징 모두는 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 각각의 특징은 동일하거나, 등가이거나 유사한 목적을 수행하는 대안적 특징에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 기재된 특징 (예를 들어, 재조합 벡터 (예를 들어, rLV) 벡터, 또는 재조합 바이러스 입자는 등가 또는 유사 특징을 갖는 부류의 예이다.
본원에 사용된 바와 같은, 단수는 문맥상 달리 명백히 지적하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 복수의 이러한 폴리뉴클레오티드들을 포함하며, "벡터"에 대한 언급은 복수의 이러한 벡터들을 포함하며, "바이러스" 또는 "입자"에 대한 언급은 복수의 이러한 비리온들/입자들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥상 달리 명백하게 지적하지 않는 한, 이러한 범위 내의 정수, 및 범위 내의 정수 또는 값의 소수를 포함한다. 따라서, 설명하자면, 적어도 1-10% 동일성에 대한 언급은 1%, 2%, 3%,4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%는 물론 1.1%, 1.2%, 1.3% 1.4%, 1.5%, 등, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 등 및 기타를 포함한다.
초과 또는 미만과 함께 수에 대한 언급은 각각 대상 숫자의 임의의 초과 또는 미만을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 40,000 미만에 대한 언급은 39,999, 39,998, 39,997, 등 숫자 일 (1)까지의 낮은 모든 수를 포함하며; 100 미만은 99, 98, 97, 등 숫자 일 (1)까지의 낮은 모든 수를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, 모든 수치 값 또는 범위는 문맥에서 달리 명백하게 지적하지 않는 한, 이러한 범위 내의 값 및 정수의 소수 및 이러한 범위 내의 정수의 소수를 포함한다. 따라서, 설명하자면, 수치 범위 예컨대, 2,000-40,000에 대한 언급은 2,000; 3,000; 4,000; 5,000, 6,000, 등은 물론 2,100; 3,100; 4,100; 5,100; 6,100; 등 및 기타를 포함한다. 따라서, 20-100의 범위에 대한 언급은 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 등 100 이하 (100 포함)는 물론 21.1, 21.2, 21.3, 21.4, 21.5, 등, 22.1, 22.2, 22.3, 22.4, 22.5, 등 및 기타를 포함한다.
일련의 범위에 대한 언급은 일련의 범위 내의 상이한 범위의 경계 값을 조합시킨 범위를 포함한다. 따라서, 설명하자면, 20-100 또는 100-1,000 (예를 들어, 20 mM-100mM; 또는 100mM-1M)의 일련의 범위에 대한 언급은 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 등을 포함한다.
본 발명은 많은 구체예 및 양태를 기술하기 위해 긍정의 언어를 이용하여 일반적으로 기술되었다. 또한, 본 발명은 특히, 특정 대상 예컨대, 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜 또는 절차가 전체적으로 또는 부분적으로 배제되는 구체예를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구체예 또는 양태에서, 재료 및/또는 방법 단계가 배제된다. 따라서, 본 발명은 본 발명이 무엇을 포함하지 않는지에 대해 본원에서 일반적으로 표현되지 않았지만, 그럼에도 불구하고, 본 발명에 명확하게 배제되지 않은 양태가 본원에 기재된 것이다.
본 발명의 많은 구체예가 기술되어 있다. 그렇지만, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서, 당업자는 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 수행하여 이를 다양한 용도 및 조건에 맞출 수 있다. 따라서, 하기 실시예는 설명을 위한 것이며 청구된 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
렌티바이러스 벡터는 부착 세포 배양 시스템에서 칼슘 포스페이트 침전법을 이용한 형질감염 방법에 의해 전형적으로 생성된다 (3, 4). 그러나, 임상 적용 특히, 후기 스테이지의 임상 적용을 위한 렌티벡터의 제작시, 확대되어 정량의 벡터 생산을 보장하고 제작된 벡터의 안전성 프로파일을 향상시킬 수 있는 무혈청 현탁 생산 시스템에서 벡터를 제작하는 것이 중요하다.
현재 이용가능한 렌티벡터 생산 시스템의 현존하는 한계를 극복하기 위해, 고역가의 렌티벡터를 생산하는 확대가능한 무혈청 현탁 세포 배양 시스템이 본원에 기술된다. 이러한 새로운 확대가능한 생산 시스템에서 제 1 단계는 무혈청 조건하에 배양될 수 있으며 고수준의 렌티벡터를 생산하는 세포주의 개발에 있다. 본 발명자들은, HEK293T 세포의 무혈청 현탁 배양으로의 적응이 용이할 것이라는 가설을 세웠는데, 이들 세포가 현재 바이러스 벡터를 생산하는데 널리 사용되기 때문이다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 본 발명자들은 단계식 적응 프로토콜를 설계하였으며, 수개의 시중에서 입수가능한 무혈청 세포 배양 배지 및 이들 배지에서 건장하게 성장할 수 있는 HEK 293T 세포의 능력을 총체적으로 평가하였다. 한 배지 (CD293)가 적응 후 빠른 성장 속도로 비-응집된 건강한 세포 성장을 지지하는데 있어서 평가된 모든 다른 것을 능가하는 것으로 밝혀졌다 (도 2, 패널 A). 최적화된 세포 배양 조건은 높은 세포 밀도 및 일관된 세포 성장을 지지한다 (도 2, 패널 B 및 C). 적응된 세포를 수개월 동안 무혈청 현탁 배양 조건하에 배양하고 조사 세포 뱅크를 개발하였다.
렌티바이러스 벡터는 표적 세포로의 2 내지 5개 플라스미드의 칼슘 포스페이트 침전 공동-형질감염에 의해 생성되었다. 최신 세대의 다중플라스미드 생산 시스템 (활성화 시스템에서 자가)이 복제 컴피턴트 렌티바이러스를 생성할 위험성이 낮은 렌티벡터를 생성하는데 있어서 다재 다능한 것으로 입증되었으나, 칼슘 공동-침전은 대규모 제작에 대한 한계가 있다. 40년 이상 전에 개발된 DNA의 칼슘 포스페이트 공동-침전 (5)은 조사 규모의 부착 세포 배양에 대해서는 양호하게 작용한다. 그러나, 무혈청 현탁 세포 배양에서는 충분한 수준의 형질감염을 제공하지 못하였으며, 확대하기 매우 어렵다.
폴리에틸렌이민 (PEI)은 시중에서 입수가능하며, 새로 적응된 HEK 293T 세포로의 플라스미드 DNA의 유효한 도입에 대해 평가하였다 (6). 초기 실험은 무혈청 세포 배양에 대해 선택된 배지가 형질감염 시약으로서 PEI를 사용하여 임의의 형질감염을 지지하지 못함을 드러냈으며, 이어서 PEI를 사용하여 세포의 형질감염을 지지할 무혈청 배지를 동정하고자 노력을 기울였다. 한 특정 배지 타입이 지지된 형질 감염을 스크리닝하였으나 (도 3, 패널 D), 이 배지는 장기간 세포 배양에서 세포의 현탁 성장을 지지하지 못하였다 (데이타 미도시됨). 따라서, 본 발명자들은 무혈청 현탁액에서 렌티벡터를 생성하기 위한 2 단계 시스템을 설계하고 개발하였다: 먼저, 세포를 무혈청 조건의 현탁액에서 건장하고 신속한 성장을 지지하는 배지에서 성장시켰다. 두 번째로, 세포 배양 배지를 PEI 기반 형질감염을 지지하는 제 2 배지 유형으로 대체하거나 이들과 혼합하였다. PEI 형질감염 효율을 최적화시키고자 하는 노력에서, 다양한 시중의 공급자로부터의 수개의 수송 형태 (deferent form)의 PEI 분자를 평가하였다. 저분자량 선형 PEI 예컨대, 25-kDa 선형 PEI가 여러 경우의 생물학적 생성물 제작에 이용되어 왔으나 (6), 본 발명자들은 분지된 PEI가 분자당 다중 작용기의 이용가능성으로 인해 다중 플라스미드 형질감염에 대한 더욱 우수한 전달 효율을 나타낼 수 있을 거라는 가설을 세웠다. 평가된 다양한 PEI 분자 중, 작은 분지된 PEI, PEI MAX (40,000 kDa, Polyscience .com)가 확인된 배지에서 적응 HEK 293T 세포의 가장 높은 형질감염 효율을 유도하였다 (도 4). PEI MAX를 이용하여 형질감염 조건을 최적화시킬 경우, 본 발명자들은 거의 백퍼센트의 세포 형질감염을 달성하였다 (도 5 패널 A). 본 발명자들의 예비 반-정량적 데이타는 렌티바이러스 벡터가 본 생산 방법으로 ml 당 약 1 x 106 형질도입 단위 수준으로 생성됨을 나타냈다. 우리가 아는 한, 본 발명자들은 본 실험실에서 쇄신된 기법이 무혈청 현탁 세포 배양 시스템에서 첫 번째의 진정으로 확대가능한 렌티벡터 생산 방법을 나타내는 것으로 여긴다.
벡터 특이적 생산성을 개선시키기 위한 추가의 노력을 기울였다. 변수 예컨대, 형질감염에서의 세포 밀도, 형질감염에 사용된 총 DNA 양, DNA/PEI 복합체 제조 방법, 벡터 수확 시간을 평가하였다. 적응 HEK 293 T 세포를 3E+06/ml의 밀도로 CD293 배지 (4 mM 글루타민으로 보완됨)에서 배양하였다; 세포 배양 배지를 원심분리 및 재-현탁에 의해 또는 접선유동여과 기법을 사용하여 SFM4Transfx-293 (4 mM 글루타민으로 보완됨) (HyCloneTM, ThermoScientific)으로 교환하고, 세포 밀도를 ml 당 1.5E+06 세포로 조절하고 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 스피너 플라스크 세포 배양을 위해, 130 RPM/min 및 8% CO2를 이용하였다. 총 12 ug의 DNA를 사용하여 1.5E+06 세포를 형질감염시키고, 4개 플라스미드의 DNA 몰 비는 1:1:1:1이었다. 폴리에틸렌이민"MAX" (Polysciences.com)를, 1 mg/ml의 농도로 Tris 완충된 용액을 이용하여 제조하고, pH를 7.15로 조절하였다. DNA의 혼합물을 1:1의 질량비로 PEI 용액에 첨가하고, 용액을 완만하게 혼합하고 추가로 짧게 인큐베이션시키고; 혼합된 DNA/PEI 칵테일을 5 mM Tris 용액 (pH7.15)을 사용하여 추가로 희석하고; 희석된 DNA/PEI 용액의 최종 부피는 형질감염될 세포 배양물의 배지의 1/15이다. 이어서, DNA/PEI 용액을 1/15의 부피 할당량으로 현탁 세포 배양액에 첨가하고, 이어서 세포 배양 배지를 형질감염 48 시간, 72 시간 및 96 시간 후에 수확하였다. 이어서, HEK 293 세포를 수확한 세포 배양 수확물로 형질도입시키고, FACS를 사용하여 eGFP 발현에 대해 분석하였다. 더 높은 벡터 생산이 관찰되었으며, 6E+06 TU/ml 초과로 플레이트 및 스피너 플라스크, 더욱 확대가능한 세포 배양 플랫폼에서 생성시켰다.
칼럼 크로마토그래피 기법은 대규모 생물학적 물질을 정제하는데 산업적으로 널리 이용된다. 렌티벡터는 현재 벡터를 침전시키는 원심분리 기법 (3) 또는 입자를 분리하는 칼럼 크로마토그래피 기법 (6)에 의해 정제된다. 칼럼 크로마토그래피 기반 공정은 전통적인 원심분리 기법을 이용할 경우의 제작에서 규모 문제를 해결할 수 있으나, 고순도의 렌티벡터를 분리하는 것은 여전히 도전으로 남아있다. 전형적인 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피에서, 수확된 렌티벡터를 칼럼 상에 로딩하고, 저농도의 염 (예컨대, 100 mM NaCl)으로 세척하고, 이어서 벡터를 높은 염 완충제 (650 mM NaCl 내지 1M NaCl)로 용리시켰다 (6). 많은 세포 단백질을 이러한 유형의 크로마토그래피 절차 (도 8, 레인 2)를 사용하여 공동-용리시켰다 (도 8, 레인 2). 본 발명자들은 아데노-관련 바이러스 벡터의 정제를 위한 PEG-조절된 칼럼 크로마토그래피 절차에 대해 보고하였으며 (7), PEG-조절된 크로마토그래피로부터 단리된 rAAV 벡터의 순도는 현저하게 증가되었다. 본 발명자들은 PEG-조절된 크로마토그래피가 또한 세포 단백질로부터의 렌티벡터의 분리에 적용되어 벡터 순도를 증가시킬 거라는 가설을 세웠는데, 이러한 분리는, 사용된 수지가 크기 배제 수지가 아님에도 불구하고 분자 크기를 기반으로 하기 때문이다.
PEG-조절된 칼럼 크로마토그래피 절차는 DEAE 세파로스 신속 유동 수지를 사용하여 개발되었다. 렌티바이러스 벡터가 이러한 절차를 통해 eGFP 발현 세포의 FACS 분석을 기반으로 하여 95% 초과의 형질도입 단위로 회수되는 반면 (도 5), 벡터 순도는 전통적인 칼럼 크로마토그래피를 이용한 순도보다 20배 증가 되었다 (도 6 및 7). 본 발명자들은 약 음이온 교환 수지를 사용하여 렌티벡터에 대한 PEG-조절된 정제 프로토콜을 개발하는 동안, 본 발명자들은 이러한 프로토콜 근간의 원리가, 벡터가 수지에 결합하는 한 친화 수지, 강 및 약 음이온 교환, 강 및 양 양이온 교환 및 기타 수지를 포함한 임의의 칼럼 크로마토그래피 수지에 적용될 것으로 여겼다. 획기적인 PEG 조절된 칼럼 크로마토그래피를 기반으로 하여, 완전히 확대가능한 정제 공정을 설계하고 개발하였다. 본원에 기술된 절차의 흐름 차트가 도 1에 제공되어 있다.
상기 기술된 기법은 충분히 확대가능한 공정이며, 이는 출현하는 흥미로운 임상 적용을 지지하는데 필요한 높은 정량의 r렌티 벡터를 충분한 정량으로 제작가능하게 할 것이다. 놀랍게도, 방법 및 생성된 rLV 조성물은 현재 이용가능한 렌티바이러스 벡터 제작 용량을 뛰어 넘으며, 조사 생성물 특질 요건을 충족시킨다.

Claims (48)

  1. 재조합 렌티-바이러스(rLV) 벡터 정제 방법으로서,
    a) 무혈청 현탁 배양액으로부터 전이 유전자(transgene)를 포함하는 상기 rLV 벡터를 수확하는 단계;
    b) 단계 a)의 수확물을 여과를 통해 정화시키는 단계;
    c) 단계 b)로부터의 여과물을 수확하는 단계;
    d) 단계 c)의 여과물을 PEG-조절된(modulated) 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피로 처리함으로써, 상기 rLV 벡터를 분리하는 단계;
    e) 부피를 감소시키고 완충제를 교환하기 위해, 단계 d)로부터 수득된 rLV 벡터를 접선유동여과를 통해 추가로 정제하는 단계;
    f) 상기 rLV 벡터를 추가로 정제하기 위해, 단계 e)의 여과물을 크기 배제 칼럼 크로마토그래피로 처리하는 단계;
    g) 단계 f)의 rLV 벡터를 접선유동여과로 처리함으로써, 최종 rLV 벡터 역가를 수득하는 단계;
    h) 단계 g)로부터 수득된 rLV 벡터 용액을 필터를 통해 여과하는 단계; 및
    i) 상기 정제된 rLV 벡터를 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 재조합 렌티-바이러스(rLV) 벡터 정제 방법으로서,
    a) 무혈청 현탁 배양액으로부터 전이 유전자를 포함하는 상기 rLV 벡터를 수확하는 단계;
    b) 단계 a)의 수확물을 여과를 통해 정화시키는 단계;
    c) 부피를 감소시키고 완충제를 교환하기 위해, 단계 b)의 정화된 현탁액을 접선유동여과로 처리하는 단계;
    d) 단계 c)로부터의 여과물을 수확하는 단계;
    e) 단계 d)의 여과물을 PEG-조절된 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피로 처리함으로써, 상기 rLV 벡터를 분리하는 단계;
    f) 상기 rLV 벡터를 추가로 정제하기 위해, 단계 e)로부터 수득된 rLV 벡터를 크기 배제 칼럼 크로마토그래피로 처리하는 단계;
    g) 단계 f)의 rLV 벡터를 접선유동여과로 처리함으로써, 최종 rLV 벡터 역가를 수득하는 단계;
    h) 단계 g)로부터 수득된 rLV 벡터 용액을 필터를 통해 여과하는 단계; 및
    i) 상기 정제된 rLV 벡터를 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 재조합 렌티-바이러스(rLV) 벡터 정제 방법으로서,
    a) 무혈청 현탁 배양액으로부터 전이 유전자를 포함하는 상기 rLV 벡터를 수확하는 단계;
    b) 단계 a)의 수확물을 여과를 통해 정화시키는 단계;
    c) 부피를 감소시키고 완충제를 교환하기 위해, 단계 b)의 정화된 현탁액을 접선유동여과로 처리하는 단계;
    d) 단계 c)로부터의 여과물을 수확하는 단계;
    e) 단계 d)의 여과물을 PEG-조절된 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피로 처리함으로써, 상기 rLV 벡터를 분리하는 단계;
    f) 부피를 감소시키고 완충제를 교환하기 위해, 단계 e)로부터 수득된 rLV 벡터를 접선유동여과를 통해 추가로 정제하는 단계;
    g) 상기 rLV 벡터를 추가로 정제하기 위해, 단계 f)의 여과물을 크기 배제 칼럼 크로마토그래피로 처리하는 단계;
    h) 단계 g)의 rLV 벡터를 접선유동여과로 처리함으로써, 최종 rLV 벡터 역가를 수득하는 단계;
    i) 단계 h)로부터 수득된 rLV 벡터 용액을 필터를 통해 여과하는 단계; 및
    j) 상기 정제된 rLV 벡터를 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 rLV 벡터가 HIV-1, HIV-2, HIV-1/HIV-2 슈도형, HIV-1/SIV, FIV, 염소 관절염 뇌염 바이러스 (CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스, 소 면역결핍 바이러스, HIV 및 이들의 슈도형으로부터 선택된 재조합 렌티바이러스 벡터 (rLV), 또는 소수포성 구내염 바이러스 G-슈도형 렌티바이러스 (VSVG 슈도형) 벡터를 포함하는 방법.
  5. 약제학적으로 허용되는 담체 중에 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 정제된 rLV 입자를 포함하는 rLV 벡터 제형.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자가 siRNA, 안티센스 분자, miRNA, 리보자임 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 핵산을 엔코딩하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자가 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬 (GH), 파라티로이드 호르몬 (PTH), 성장 호르몬 방출 인자 (GRF), 여포 자극 호르몬 (FSH), 황체형성 호르몬 (LH), 인간 융모성 성선자극 호르몬 (hCG), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 안지오포이에틴, 안지오스타틴, 과립구집락자극인자 (GCSF), 에리트로포이에틴 (EPO), 연결 조직 성장 인자 (CTGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF), 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 α (TGFα), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II (IGF-I 및 IGF-II), TGFβ, 액티빈(activin), 인히빈(inhibin), 골 형성 단백질 (BMP), 신경 성장 인자 (NGF), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀(neurotrophin) NT-3 및 NT4/5, 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 신경아교세포계 유래 신경영양 인자 (GDNF), 뉴투린(neurturin), 아그린(agrin), 네트린(netrin)-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자 (HGF), 에프린(ephrin), 노긴(noggin), 소닉 헤지호그(sonic hedgehog) 및 티로신 히드록실라제로 구성된 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 엔코딩하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자가 트롬보포이에틴 (TPO), 인터류킨 (IL1 내지 IL-17), 단핵구 화학주성인자 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 α 및 β, 인터페론 α, β 및 γ, 줄기 세포 인자, flk-2/flt3 리간드, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, G 단백질-결합된 수용체 (GPCR), CCR5, 및 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 구성된 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 엔코딩하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자가 카르바모일 신세타제 I, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 아르기노숙시네이트 신세타제, 아르기노숙시네이트 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세트아세테이트 히드롤라제, 페닐알라닌 히드록실라제, 알파-1 안티트립신, 글루코스-6-포스파타제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 인자 V, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-신타제, 분지쇄 케토산 데카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-coA 데히드로게나제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 무타제, 글루타릴 CoA 데히드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카르복실라제, 망막색소상피-특이적 65 kDa 단백질 (RPE65), H-단백질, T-단백질, 낭포성 섬유증 막횡단 조절인자 (CFTR) 서열, 및 디스트로핀 cDNA 서열로 구성된 군으로부터 선택된 선천성 대사 이상을 교정하는데 유용한 단백질을 엔코딩하는 핵산을 포함하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자가 인자 VIII 및 인자 IX로부터 선택된 유전자 생성물을 엔코딩하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자가 종양 관련 항원 (TAA)을 엔코딩하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 전이 유전자가 CAIX, CD19, CD20, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44v7/8, CEA, EGF-RIII (표피 성장 인자 수용체 변이체 3) EGP-2, erb-B2, erb-B2, 3, 4, FBP, 태아 아세티콜린 수용체, GD2, Her2/neu, IL-13R-a2, KDR, k-경쇄, LeY, L1 세포 부착 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, NKG2D, 태아성암 항원 (h5T4), PSCA, PSMA, mAb IgE 표적화된 TAA, TAG-72 또는 VEGF-R2로 구성된 군으로부터 선택된 유전자 생성물을 엔코딩하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 rLV 벡터가 포유동물 세포에 의해 생성되는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 rLV 벡터가 HEK 293T (미국 기탁 기관 ATCC); HEK293F (Life Technologies); HEK293(미국 기탁 기관 ATCC); 293S (미국 기탁 기관 ATCC), BHK (미국 기탁 기관 ATCC), BHK-21 (미국 기탁 기관 ATCC), CHO (미국 기탁 기관 ATCC), CHO/dhFr-1 (미국 기탁 기관 ATCC), 또는 CHO K1 (미국 기탁 기관 ATCC) 세포에 의해 생성되는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 무혈청 현탁 배양액이 무혈청 세포 성장 배지를 포함하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 무혈청 성장 배지가 FreeStyleTM293 (GibcoR, Life Technologies), DMEM/F12 (GibcoR, Life Technologies), SFM4Transfx-293 (HyCloneTM, ThermoScientific), CDM4HEK293 (HyCloneTM, ThermoScientific), StemPro-34SFM (GibcoR, Life Technologies), FreeStyle F17 (GibcoR, Life Technologies), 293SFM II (GibcoR, Life Technologies), 및 CD293 (GibcoR, Life Technologies)로부터 선택되는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 c) 또는 단계 d)의 수확이 상기 여과물을 뉴클레아제 분해에 노출시켜 DNA/RNA 불순물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 데옥시리보뉴클레아제, 리보뉴클레아제, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
  20. 제 17항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 벤조나제 또는 DNA 분해효소(DNase)를 포함하는 방법.
  21. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피가 강한 또는 약한 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 포함하는 방법.
  22. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환 칼럼이 4차화된 폴리에틸렌이민 기재 수지; 또는 4차 아민 기재 수지를 포함하는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환 칼럼이 폴리에틸렌이민 기재 수지; 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기재 수지; 또는 디에틸아미노프로필 기재 수지를 포함하는 방법.
  24. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온 교환 칼럼이 히드록시아파타이트 ((Ca5(PO4)3OH)2 ) 기재 수지; N-벤질-n-메틸에탄올아민 기재 수지; 또는 옥틸아민 기재 수지를 포함하는 방법.
  25. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-조절된 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피가
    i) 결합액으로 단계 c)의 여과물을 조절하고, 상기 여과물을 음이온 교환 칼럼과 접촉시킴으로써 rLV 벡터를 음이온 교환 칼럼에 결합시키는 단계,
    ii) 결합된 rLV 벡터를, PEG를 포함하는 세척액 또는 PEG와 염을 포함하는 용액으로 세척하여 불순물을 제거하는 단계; 및
    iii) 음이온 교환 칼럼으로부터의 rLV 벡터를 용리액으로 용리시키는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 결합액이 0% 내지 10% 중량/부피, 또는 0% 내지 5% 중량/부피, 또는 0% 내지 2% 중량/부피의 양의 PEG를 포함하는 방법.
  27. 제 25항에 있어서, 상기 결합액이 2,000 kDa 내지 40,000 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는 방법.
  28. 제 25항에 있어서, 상기 세척액이 1% 내지 10% 중량/부피, 또는 1% 내지 5% 중량/부피, 또는 1% 내지 2% 중량/부피의 양의 PEG를 포함하는 방법.
  29. 제 25항에 있어서, 상기 세척액이 2,000 kDa 내지 40,000 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는 방법.
  30. 제 25항에 있어서, 상기 용리액이 0% 내지 20% 중량/부피의 양의 PEG를 포함하는 방법.
  31. 제 25항에 있어서, 상기 용리액이 2,000 kDa 내지 40,000 kDa의 분자량을 갖는 PEG를 포함하는 방법.
  32. 제 25항에 있어서, 상기 결합액, 세척액 또는 용리액이 염을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제 25항에 있어서, 상기 용리액이 500mM 내지 1,000mM의 양의 염을 포함하는 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 상기 염이 소듐 클로라이드 또는 포타슘 클로라이드를 포함하는 방법.
  35. 제 25항에 있어서, 상기 결합액이 PEG를 포함하는 방법.
  36. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 h) 또는 i)의 여과가 0.20-0.5 um의 기공 직경을 갖는 필터를 통해서 이루어지는 방법.
  37. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 g) 또는 단계 h)의 여과가 0.20 um 기공 직경 필터를 통해서 이루어지는 방법.
  38. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 g) 또는 단계 h)의 여과가 0.22 um 기공 직경 필터를 통해서 이루어지는 방법.
  39. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 g) 또는 단계 h)의 여과가 0.45 um 기공 직경 필터를 통해서 이루어지는 방법.
  40. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 rLV 벡터가 5 x 105 감염 단위 (IU)/ml로 생성되는 방법.
  41. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 rLV 벡터가 6 x 106 감염 단위 (IU)/ml로 생성되는 방법.
  42. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 rLV 벡터가 3 x 108 감염 단위 (IU)/ml로 생성되는 방법.
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11000548B2 (en) 2015-02-18 2021-05-11 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11596652B2 (en) 2015-02-18 2023-03-07 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Early apoptotic cells for use in treating sepsis
US11318163B2 (en) 2015-02-18 2022-05-03 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
AU2016221305B2 (en) 2015-02-18 2021-05-27 Enlivex Therapeutics Rdo Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11304976B2 (en) 2015-02-18 2022-04-19 Enlivex Therapeutics Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
US11497767B2 (en) 2015-02-18 2022-11-15 Enlivex Therapeutics R&D Ltd Combination immune therapy and cytokine control therapy for cancer treatment
TWI547782B (zh) * 2015-03-16 2016-09-01 智易科技股份有限公司 可擴充式製程系統與實現該系統的方法
US10857181B2 (en) 2015-04-21 2020-12-08 Enlivex Therapeutics Ltd Therapeutic pooled blood apoptotic cell preparations and uses thereof
PE20240371A1 (es) * 2015-12-01 2024-03-05 Spark Therapeutics Inc Metodos escalables para producir un vector viral adenoasociado (aav) recombinante en un sistema de cultivo celular en suspension sin suero adecuado para uso clinico
CN107043784A (zh) * 2016-02-05 2017-08-15 上海吉凯基因化学技术有限公司 一种慢病毒载体的制备方法
JP6884155B2 (ja) 2016-02-18 2021-06-09 エンリヴェックス セラピューティクス リミテッド 癌治療のための併用免疫療法及びサイトカイン制御療法
CA3019126A1 (en) * 2016-03-30 2017-10-05 Spark Therapeutics, Inc. Cell line for recombinant protein and/or viral vector production
EP3442688A4 (en) 2016-04-12 2019-11-20 Artemis Biosystems, Inc. FILTRATION SYSTEMS FOR INFUSION
CN106497882A (zh) * 2016-10-29 2017-03-15 复旦大学 同时过表达R‑spondin1和Noggin的细胞株及其构建方法和应用
EP3420076B1 (en) 2017-03-06 2024-02-21 Guangzhou Realbenefitspot Pharmaceutical Co., Ltd. Methods of producing and characterizing virus vaccine and virus vaccine composition
WO2018161858A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Guangzhou Realbenefitspot Pharmaceutical Co., Ltd. Methods of producing and characterizing virus vaccine and virus vaccine composition
CN109251939A (zh) * 2017-07-14 2019-01-22 孙搏 Il-17g-197a慢病毒表达载体、其构建方法及慢病毒的包装测定方法
WO2019147036A1 (ko) * 2018-01-24 2019-08-01 주식회사 에스엘바이젠 뇌유래-신경영양인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도
CN111763238B (zh) * 2019-04-02 2022-07-29 普莱柯生物工程股份有限公司 一种蛋白抗原的纯化方法、制备的蛋白抗原及其应用
EP4310495A3 (en) * 2019-04-11 2024-04-24 REGENXBIO Inc. Methods of size exclusion chromatography for the characterization of recombinant adeno-associated virus compositions
CN110054678B (zh) * 2019-05-16 2023-04-18 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 一种膜结合型mFLT3LG蛋白及其应用
CN110894494B (zh) * 2019-11-22 2022-09-27 广西梧州制药（集团）股份有限公司 一种大规模高密度悬浮培养293细胞高产腺病毒的方法
CN110938654A (zh) * 2019-12-11 2020-03-31 和元生物技术（上海）股份有限公司 一种细胞转染试剂及其应用
CN113122501B (zh) * 2019-12-30 2023-06-16 重庆精准生物技术有限公司 适合大规模临床级病毒载体制备的培养基及其应用
US20230304037A1 (en) * 2020-08-13 2023-09-28 Tmunity Therapeutics Inc. Methods for producing clinical-grade lentiviral vector
CN112746076B (zh) * 2020-12-28 2023-05-12 中吉智药(南京)生物技术有限公司 一种密码子优化的col7a1基因及慢病毒和应用
EP4273236A1 (en) * 2020-12-29 2023-11-08 Jiangsu Genscript Probio Biotech Co., Ltd. Hek293t cell strain having high dispersibility and screening method therefor
CN117916383A (zh) * 2021-07-19 2024-04-19 2赛文缇生物公司 载体制备方法
CN113980916A (zh) * 2021-09-27 2022-01-28 湖南丰晖生物科技有限公司 一种慢病毒的纯化方法
WO2023061409A1 (zh) * 2021-10-12 2023-04-20 江苏金斯瑞蓬勃生物科技有限公司 适应无血清悬浮培养的hek293细胞株及其应用
CN114990077A (zh) * 2022-08-01 2022-09-02 深圳市先康达生命科学有限公司 一种慢病毒包装与纯化方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070269856A1 (en) 2002-04-30 2007-11-22 Oncolytics Biotech Inc. Viral Purification Methods
WO2011086509A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 Vascular Biogenics Ltd. Methods of producing adenovirus vectors and viral preparations generated thereby

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869445A (en) * 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US20030157070A1 (en) * 1994-12-30 2003-08-21 Jolly Douglas J. High efficiency ex vivo transduction of cells by high titer recombinant retroviral preparations
US6544769B1 (en) * 1996-12-13 2003-04-08 Schering Corporation Compostions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations
US6207455B1 (en) 1997-05-01 2001-03-27 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US7575924B2 (en) * 2000-11-13 2009-08-18 Research Development Foundation Methods and compositions relating to improved lentiviral vectors and their applications
WO2003039459A2 (en) * 2001-11-05 2003-05-15 Genvec, Inc. Viral vector production methods and compositions
AU2003272868A1 (en) * 2003-10-15 2005-04-27 Agtc Gene Technology Company Ltd. Method for large-scale production, isolation, purification and the uses of multi-type recombinant adeno-associated virus vectors
BRPI0612720B1 (pt) * 2005-07-06 2016-02-10 Ge Healthcare Bio Sciences Ab método de preparação de uma matriz de separação
EP2012122A1 (en) * 2007-07-06 2009-01-07 Medigene AG Mutated parvovirus structural proteins as vaccines
CN102296078B (zh) * 2007-05-31 2013-07-10 厦门大学 可用于艾滋病治疗的rna干扰靶点
DK3192874T3 (da) * 2008-06-18 2019-12-16 Oxford Biomedica Ltd Virusoprensning
SG194372A1 (en) * 2008-09-24 2013-11-29 Medimmune Llc Methods for cultivating cells, propagating and purifying viruses
SI3067417T1 (sl) * 2009-06-16 2018-11-30 Genzyme Corporation Izboljšani postopki čiščenja vektorjev rekombinantnega AAV
WO2011097447A2 (en) * 2010-02-04 2011-08-11 Neurologix, Inc. Production of recombinant virus

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070269856A1 (en) 2002-04-30 2007-11-22 Oncolytics Biotech Inc. Viral Purification Methods
WO2011086509A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 Vascular Biogenics Ltd. Methods of producing adenovirus vectors and viral preparations generated thereby

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. VIROL. METHODS. 2011, vol. 173, no. 1, pages 99-107.

Also Published As

Publication number Publication date
EP2970920A1 (en) 2016-01-20
ZA201506478B (en) 2021-09-29
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RU2709678C2 (ru) 2019-12-19
JP6480910B6 (ja) 2019-04-03

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