JP6480910B6 - 無血清懸濁培養物系で組み換えレンチウイルスベクターを産生するための拡張可能な生産プロセス - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／７８７，８１８号に対する優先権を主張し、この内容は参照により全体として本明細書に明示的に組み込まれる。

本発明は、分子生物学および遺伝子治療の分野に関連する。より具体的には、本発明は、臨床利用用の医学的に有益な産物をコードする導入遺伝子を含んでなるウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを大量生産するための改良プロセスを提供する。
はじめに

本発明に関連する技術の現状を記述する目的で、いくつかの出版物と特許資料が本明細書の全体を通じて引用されている。これら引用の各々は、参照することによりその全体が本明細書の一部をなすものと見なされる。

組み換えレンチウイルスをベースにした（ｒレンチ）ベクターは、多くの重大なヒトの疾患のための研究用遺伝子導入製品として開発され、広範に利用されてきた。レンチウイルスベクターは、幹細胞などの複製細胞および非複製細胞の双方に感染能を有するため、形質導入の観点から非常に生産性が高いことがわかっている。

多くの臨床試験が、ＨＩＶ−１をベースにしたＶＳＶＧ偽型レンチウイルスベクターを用いて世界中で実施され、非常に有望な臨床効果が観察されている。しかしながら、現時点の本分野における重大な問題は、先進的な臨床研究に必要となる十分量のｒレンチを作成する手法がないことである。研究および臨床治験のデータにより、ｒレンチベクター（ｒＬｅｎｔｉｖｅｃｔｏｒ）は、原発性免疫不全（Ｆｉｓｃｈｅｒら）等の遺伝疾患に対するヒト遺伝子治療、ならびにがん免疫療法（Ｊｕｎｅら）のための有望な遺伝子送達担体であることが示されている。

しかしながら、臨床応用の後期段階を支援するための製造能力と治験薬の品質要件を満たす大量のｒレンチベクターのｃＧＭＰ製造に適した拡張可能な生産および精製の方法を開発することは、本分野において決定的に必要なことである。例えば、ある非常に有望な白血病治療の第Ｉ相のブログラムでは、現在利用可能な方法よりも少なくとも１００倍高い生産能力が、第ＩＩＩ相試験および初期の認可製品の上市に必要となると見込まれている。従って、この遺伝子治療ベクターの生産規模をスケールアップする方法が早急に必要である。

本発明に従い、拡張可能な無血清懸濁細胞培養での高力価のｒレンチベクターの産生、および拡張可能な産業標準カラムクロマトグラフィー技法を用いた該ベクターの精製のための方法が提供される。本方法に準拠して産生されるｒＬＶ粒子を含んでなるｒＬＶベクター製剤を作成することが可能であり、随意にこれを薬学的に許容される担体に包含することもできる。

ある実施形態においては、ウイルスベクター精製の方法は以下の工程を含む。ａ）導入遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターを、無血清懸濁培養物から採取する工程、ｂ）ステップａの採取物をろ過で澄明化する工程、ｃ）テップｂのろ液を採取し、随意でＤＮＡ／ＲＮＡ不純物除去のために前記ろ液をヌクレアーゼ消化に付す工程、ｄ）ステップｃのろ液をＰＥＧ変調アフィニティまたはイオン交換カラムクロマトグラフィーに付すことによって前記ウイルスベクターを単離する工程、ｅ）ステップｄで得られたウイルスベクターをタンジェンシャルフローろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）で更に精製し、容積および緩衝液交換を減らす工程、ｆ）ステップｅのろ液をサイズ排除カラムクロマトグラフィーに付し、前記ウイルスベクターを更に精製する工程、ｇ）ステップｆのベクターをタンジェンシャルフローろ過に付し、最終ベクター力価を得る工程、ｈ）ステップｇで得たベクター溶液をフィルタでろ過する工程、及びｉ）前記の精製済ウイルスベクターを回収する。

別の実施形態においては、ウイルスベクター精製の方法は以下の工程を含む。ａ）導入遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターを無血清懸濁培養物から採取する工程、ｂ）ステップａの採取物をろ過で澄明化する工程、ｃ）ステップｂの澄明化した懸濁液をタンジェンシャルフローろ過に付し、容積及び緩衝液交換を減らす工程、ｄ）ステップｃのろ液を採取し、随意でＤＮＡ／ＲＮＡ不純物除去のために前記ろ液をヌクレアーゼ消化に付す工程、ｅ）ステップｄのろ液をＰＥＧ変調アフィニティまたはイオン交換カラムクロマトグラフィーに付すことによって前記ウイルスベクターを単離する工程、ｆ）ステップｅで得られたウイルスベクターをサイズ排除カラムクロマトグラフィーに付し、前記ウイルスベクターを更に精製する工程、ｇ）ステップｆのベクターをタンジェンシャルフローろ過に付し、最終ベクター力価を得る、ｈ）ステップｇで得たベクター溶液をフィルタでろ過する工程、及びｉ）前記の精製済ウイルスベクターを回収する工程。

また別の実施形態においては、ウイルスベクター精製の方法は以下のステップを含む。ａ）導入遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターを無血清懸濁培養物から採取する工程、ｂ）ステップａの採取物をろ過で澄明化する工程、ｃ）ステップｂの澄明化した懸濁液をタンジェンシャルフローろ過に付し、容積及び緩衝液交換を減らす工程、ｄ）ステップｃのろ液を採取し、随意でＤＮＡ／ＲＮＡ不純物除去のために前記ろ液をヌクレアーゼ消化に付す工程、ｅ）ステップｄのろ液をＰＥＧ変調アフィニティまたはイオン交換カラムクロマトグラフィーに付すことによって前記ウイルスベクターを単離する工程、ｆ）ステップｅで得られたウイルスベクターをタンジェンシャルフローろ過で更に精製し、容積および緩衝液交換を減らす工程、ｇ）ステップｆのろ液をサイズ排除カラムクロマトグラフィーに付し、前記ウイルスベクターを更に精製する工程、ｈ）ステップｇのベクターをタンジェンシャルフローろ過に付し、最終ベクター力価を得る工程、ｉ）ステップｈのベクター溶液をフィルタでろ過する工程、及びｊ）前記の精製済ウイルスベクターを回収する工程。

本発明の方法は、レンチウイルスベクター（ｒＬＶ）に応用可能である。特定の実施形態においては、組み換えレンチウイルスベクター（ｒＬＶ）を含んでなるｒＬＶは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２偽型、ＨＩＶ−１／ＳＩＶ、ＦＩＶ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ＨＩＶおよびその偽型、または水疱性口内炎ウイルスＧ偽型レンチウイルス（ＶＳＶＧ偽型）ベクターである。

本発明のウイルスベクターは導入遺伝子を含む。特定の実施形態においては、導入遺伝子は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、およびｓｈＲＮＡを含む群から選択された核酸をコードしている。他の特定の実施形態では、導入遺伝子は遺伝子産物（タンパク質またはポリペプチド）をコードしている。

ある特定の形態においては、遺伝子産物（タンパク質またはポリペプチド）は、インシュリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、アンギオスタチン、果粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、またはチロシンヒドロキシラーゼである。他の特定の形態においては、遺伝子産物（タンパク質またはポリペプチド）は、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン類（ＩＬ１からＩＬ１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）、ＣＣＲ５、およびクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子である。

さらに別の特定の実施形態においては、遺伝子産物（タンパク質またはポリペプチド）は、骨内の代謝エラー修正に役立つタンパク質をコードした核酸であり、該タンパク質は、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酸加水分解酵素、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオニンベータシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インシュリン、ベータグルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ６５ｋＤａ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＲＰＥ６５）、Ｈタンパク質、Ｔタンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ； ＣＦＴＲ）配列、またはジストロフィンｃＤＮＡ配列から成る群から選択される。さらに別の特定の形態においては、遺伝子産物（タンパク質またはポリペプチド）は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子である。

また別の特定の形態では、導入遺伝子は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする。さらに別の特定の形態では、導入遺伝子は、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＥＡ、ＥＧＦ−ＲＩＩＩ（上皮細胞増殖因子受容体変異型３）ＥＧＰ−２、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ２、３、４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ｋ−軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、がん胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ｍＡｂ ＩｇＥ標的ＴＡＡ、ＴＡＧ−７２またはＶＥＧＦ−Ｒ２のいずれかの遺伝子産物をコードする。

本発明のウイルスベクターは、細胞によって産生される可能性がある。特定の実施形態においては、組み換えウイルスベクターは哺乳類細胞により産生される。特定の形態においては、組み換えウイルスベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）、ＨＥＫ２９３Ｆ（ライフテクノロジーズ）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ）、２９３Ｓ（ＡＴＣＣ）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ）、ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ−（ＡＴＣＣ）ｌ、またはＣＨＯ Ｋ１（ＡＴＣＣ）細胞により産生される。

本発明の組み換えウイルスベクターを産生する細胞は、通常は増殖培地中懸濁状態で増殖される。細胞用の増殖培地には、無血清細胞増殖培地がある。特定の形態においては、無血清増殖培地は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM２９３（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ−２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ^TM、サーモ・サイエンティフィック）、ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ^TM、サーモ・サイエンティフィック）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）、２９３ＳＦＭ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）、またはＣＤ２９３（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）、もしくはこれらの組み合わせである。

本発明の方法において、ヌクレアーゼを用いることができる。特定の実施形態においては、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせである。他の特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせである。他の特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ベンゾナーゼまたはＤＮａｓｅである。

本発明の方法においては、種々の樹脂またはクロマトグラフィー基材（媒体）も利用できる。特定の実施形態においては、アフィニティまたはイオン交換樹脂もしくは基材（媒体）が利用できる。特定の形態においては、イオン交換カラムクロマトグラフィーは、陰イオンまたは陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、強もしくは弱陰イオン交換、または強もしくは弱陽イオン交換を含んでなる。

本発明の方法は、カラムクロマトグラフィーに関連する結合、洗浄および／または溶出の段階をさらに含む。そのような結合、洗浄および／または溶出の段階は、１回または複数回（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回）実施することができる。種々の実施形態では、前段階のろ液を調整して結合溶液とすること（ウイルスをカラムの樹脂または媒体に結合させるため）、および／または該ろ液をアフィニティまたはイオン交換カラムに接触させることによってウイルスベクターを該アフィニティまたはイオン交換カラムに結合させること、および／または不純物を除去するために結合したウイルスベクターを洗浄溶液で洗浄すること（該洗浄液は随意にＰＥＧまたはＰＥＧと塩を含んでよい］、および／または溶出液を用いて前記アフィニティまたはイオン交換カラムからウイルスベクターを溶出させることが、方法に含まれる。

特定の形態では、結合溶液は、約０％から１０％重量／容積、または約０％から５％重量／容積、または約０％から２％重量／容積の量のＰＥＧを含む。他の特定の形態では、結合溶液は、分子量約２，０００ｋＤａから約４０，０００ｋＤａのＰＥＧを含む。

特定の形態では、洗浄溶液は、約１％から１０％重量／容積、または約１％から５％重量／容積、または約１％から２％重量／容積の量のＰＥＧを含む。他の特定の形態では、洗浄溶液は、分子量約２，０００ｋＤａから約４０，０００ｋＤａのＰＥＧを含む。

特定の形態では、溶出液は、約０％から１０％重量／容積の量のＰＥＧを含む。他の特定の形態では、溶出液は、分子量約２，０００ｋＤａから約４０，０００ ｋＤａのＰＥＧを含む。

本発明の方法においては、結合溶液、洗浄溶液、および／または溶出液は、随意に１種以上の塩類を含むことができる。特定の実施形態では、結合溶液、洗浄溶液、および／または溶出液は、約２０ｍＭから約１，０００ｍＭ（１Ｍ）の量の１種以上の塩類を含む。本発明の範囲を限定しない（非限定的な）塩類には、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムが含まれる。

他の実施形態では、ウイルスベクター精製の方法は、１段階以上のろ過段階を含む。特定の形態では、ろ過は、孔径約０．２０−０．５ｕｍのフィルタを用いて行われる。特定の形態では、ろ過は、孔径０．２０ｕｍのフィルタ、孔径０．２２ｕｍのフィルタ、または孔径０．４５ｕｍのフィルタを用いて行われる。

ここで開示する通り、本発明の方法は、高力価の精製ウイルスベクターを産生することができ、例えばその力価は１ｘ１０⁵感染単位（ＩＵ）／ｍｌから最大約１ｘ１０⁹感染単位（ＩＵ）／ｍｌである。特定の実施形態では、約５ｘ１０⁵感染単位（ＩＵ）／ｍｌでウイルスベクターが産生されるか、約６ｘ１０⁶感染単位（ＩＵ）／ｍｌでウイルスベクターが産生されるか、または約３ｘ１０⁸感染単位（ＩＵ）／ｍｌでウイルスベクターが産生される。

本発明のレンチウイルスベクターの精製の典型的方法のフローチャートである。 本発明のレンチウイルスベクターの精製の典型的方法のフローチャートである。 本発明のレンチウイルスベクターの精製の典型的方法のフローチャートである。 本発明のレンチウイルスベクターの精製の典型的方法のフローチャートである。

図２Ａ〜Ｃは適応したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の無血清懸濁培養物における増殖特性を示す。
ＣＤ２９３無血清培地に適応した細胞集団を示す光学顕微鏡像。細胞凝集は観察されない。 スピナーフラスコを用いた細胞培養条件の最適化を示す。ＣＯ２濃度８％、１３０回転／分の条件下で、細胞は４日間、約３ｘ１０⁶細胞／ｍｌで培養することができる。 細胞増殖速度は、約２０時間の倍加時間と一致する。

無血清懸濁培養物中のＰＥＩ導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのｅＧＥＰ発現を示す蛍光顕微鏡像。パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、異なる無血清培地中の細胞である。ｅＧＦＰ陽性細胞はパネルＤでのみ検出される。

無血清懸濁培養物中のＰＥＩ導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのｅＧＥＰ発現を示す蛍光顕微鏡像。パネルＡ−ＰＥＩ２５，０００ｋＤａを用いてトランスフェクション、パネルＢ−ＰＥＩ ＭＡＸ（４０，０００ｋＤａ）を用いてトランスフェクション、パネルＣ−ＰＥＩ ｐｒｏを用いてトランスフェクション。ＰＥＩ ＭＡＸが最も高い導入効率を示した。

無血清懸濁培養物（Ａ）におけるＨＥＫ２９３ＴのＰＥＩ導入効率、およびＨＥＫ２９３細胞のレンチウイルスベクター形質導入を示す蛍光顕微鏡像。パネルＡ−最適条件でＰＥＩ ＭＡＸ（４０，０００ｋＤａ）を用いてトランスフェクション、パネルＢはレンチベクター形質導入を示す（採取上清５０ｕｌを使用）。

ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーおよびＰＥＧ変調ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーからのレンチベクター回収率の分析。上段パネルは、カラムクロマトグラフィー画分からのサンプルのｅＧＥＰ発現を図示する。Ａ：クロマトグラフィーはＰＥＧ変調を含まない。Ｂ、ＣおよびＤでは、それぞれ４％ＰＥＧ（４Ｋ）、４％ＰＥＧ（６Ｋ）および８％ＰＥＧ（４Ｋ）を用いた洗浄ステップが追加されている。各画分の１００ｕｌをＨＥＫ２９３細胞の形質導入に用い、ｅＧＦＰ陽性細胞は蛍光顕微鏡とＦＡＣＳを用いて検出された（下段パネル）。レンチベクターのほぼ１００％が溶出画分で検出された。

ＵＶ２８０ｎｍの吸収を用いたレンチベクター溶出の分析。澄明化したレンチベクター採取物３０ｍｌを１６ｍｌのＤＥＡＥセファロースＦＦカラムにロードした。レンチベクターはＰＥＧ変調有り（パネルＢ、ＣおよびＤ）またはＰＥＧ変調無し（Ａ）で精製された。ベクター溶出ピークはＵＶ２８０ｎｍの吸収を用いて積分され、ピーク面積は５倍からおよそ２０倍に減少した。ＵＶ２８０／ＵＶ２６０のＵＶ吸収比がＵＶ２８０優位（パネルＡ）からＵＶ２６０優位（パネルＢ、ＣおよびＤ）に変化したことは興味深いが、これはベクター純度の改善を示している。

カラムクロマトグラフィーから溶出させたレンチベクターの純度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。各サンプル１０ｕｌを４〜１２％ＮｕｅＰａｇｅ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにロードし、電気泳動後に銀染色した。溶出ＡはＰＥＧ変調なしのカラムクロマトグラフィーからのレンチベクター溶出サンプルである。溶出Ｂ、ＣおよびＤはそれぞれ、４％ ４Ｋ ＰＥＧ、４％ ６Ｋ ＰＥＧおよび８％ ４Ｋ ＰＥＧを用いたＰＥＧ変調カラムクロマトグラフィーからの溶出画分である。レンチベクターの回収率はこれらすべての溶出サンプルでかなり同等であるが、タンパク質不純物はＰＥＧ変調した画分で有意に減少する。

ｒレンチベクター産生能のＦＡＣＳ分析。ｅＧＦＰを発現する組み換えレンチベクターは、１２穴プレート（１．５ｍｌ細胞培養）またはスピナーフラスコ（４０ｍｌ細胞培養）からの無血清懸濁培養物における最適トランスフェクション法を用いて産生された。ベクター収量はＦＡＣＳ分析で決定した。１ｍｌあたり最高６ｘ１０⁶形質導入単位（ＴＵ）のベクター産生能が、１２穴プレートおよびスピナーフラスコ培養でともに観察された。

組み換えレンチウイルスベクターは、研究では通常、トランスフェクション法を用いて産生される。ｒＬＶビリオン産生にはいくつかの方法が当該技術分野で知られており、例えば、ベクターとｒＬＶヘルパー配列を用いたトランスフェクションが挙げられる（例えばＭｅｒｔｅｎら２０１１を参照）。しかしながら、臨床応用、特に臨床応用の後期用にｒレンチベクターを製造する際は、十分な製造能を確保するために規模を拡張できる無血清懸濁産生システムを用いてベクターを製造し、製造されたベクターのより高い安全性を担保することが大変好ましい。

本明細書で開示されるのは、拡張可能な無血清細胞培養システムで高力価のレンチウイルスベクターを産生する、トランスフェクションベースの産生法である。付着性増殖に適応された市販の細胞は、無血清細胞培地に適応させることができた。我々は無血清懸濁細胞培養に使用できるとされている細胞培養培地を５種以上評価したが、適応後凝集していない健全な細胞増殖が、速い細胞増殖速度で得られる培地は１種類しか同定できなかった。適応した細胞を無血清懸濁培養条件で数か月間培養し、研究用細胞バンクが構築された。

レンチウイルスはエンベロープウイルスであり、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のような核酸の細胞送達に使用される他のウイルスとは、ウイルス構造とライフサイクルの点で著しく異なる。レンチウイルスは、２コピーのＲＮＡ、核カプシド（ＮＣ）、カプシド（ＣＡ）、膜結合マトリックス（ＭＡ）、表面糖タンパク質および膜貫通タンパク質などのエンベロープタンパク質、インテグラーゼ（ＩＮ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）などの酵素、およびアクセサリータンパク質（例えばＮｅｆ、Ｖｉｆ、Ｖｐｕ、Ｖｐｒ）から構成される。レンチウイルスは、ウイルスの表面糖タンパク質が細胞上の受容体に結合することにより細胞に感染する。その後、ウイルスのエンベロープの膜と細胞の膜とが融合し、ウイルスが細胞内に侵入することが可能となる。侵入後、ウイルスＲＮＡの脱殻と逆転写が起こり、続いて二重鎖ＤＮＡ、ＲＴ、ＩＮ、Ｖｐｒ（またはＨＩＶ−２のＶｐｘ） ＮＣ、および数コピーのＭＡが含まれる、組み込み前複合体が形成される（ＳｕｚｕｋｉおよびＣｒａｉｇｉｅ ２００７、Ｄｅｐｉｅｎｎｅら２０００、Ｂｕｋｒｉｎｓｋｙら１９９３およびＭｉｌｌｅｒら１９９７）。プロウイルスが核エンベロープに入ると、ウイルスＤＮＡは細胞ゲノムに統合される。通常の細胞の転写および翻訳の働きに続いて、ウイルスの構造タンパク質とウイルスＲＮＡとのアセンブリが起こり、その後ウイルスが出芽する。

レンチウイルスは、核エンベロープを通じて能動的に細胞核に侵入することによって非分離細胞に感染できることからも、核酸の細胞内送達に適している。対照的に、他のレトロウイルスは、非分裂細胞の核エンベロープに入ることができないので、感染には細胞分裂を要する。

「レンチウイルス」には、ウシレンチウイルス群、ウマレンチウイルス群、ネコレンチウイルス群、ヒツジ・ヤギレンチウイルス群、および霊長類レンチウイルス群のメンバーが含まれる。本発明の方法と使用に適したレンチウイルスの例には、ＨＩＶおよびその偽型（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２偽型、ＨＩＶ−１／ＳＩＶ等）、ＦＩＶ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス、ウシ免疫不全ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルスＧ偽型レンチウイルス（ＶＳＶＧ偽型）があるが、これらに限定されない。

遺伝子治療用レンチウイルスベクターの開発は、Ｋｌｉｍａｔｃｈｅｖａら（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４： ４８１−４９６， １９９９）に概説されている。遺伝子治療に適したレンチウイルスベクターの設計と使用は、例えば米国特許第６２０７４５５号（２００１年３月２７日発行）および同第６１６５７８２号（２０００年１２月２６日発行）に記載されている。他のシステムがＭｅｒｔｅｎら（２０１１）により開示されている。

「ｇａｇポリタンパク質」、「ｐｏｌポリタンパク質」、および「ｅｎｖポリタンパク質」という用語は、レトロウイルスのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子によりコードされる複数のタンパク質を指し、通常それらのタンパク質は単一の前駆体「ポリタンパク質」として発現される。例えば、ＨＩＶ ｇａｇは、数あるタンパク質のなかで特に、ｐ１７、ｐ２４、ｐ９およびｐ６をコードする。ＨＩＶ ｐｏｌは、数あるタンパク質のなかで特に、プロテアーゼ（ＰＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする。ＨＩＶ ｅｎｖは、数あるタンパク質のなかで特に、Ｖｐｕ、ｇｐ１２０およびｇｐ４１をコードする。ここで使用されるように、「ポリタンパク質」という用語は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖポリタンパク質の全体または任意の一部を含むものとする。

「Ｖｐｘ」および「Ｖｐｒ」という用語は、それぞれレンチウイルスのＶｐｘタンパク質とレンチウイルスのＶｐｒタンパク質を指し、これらのタンパク質は、例えばＷＯ９６／０７７４１で述べられており、該出願は参照することによりその全体が本明細書に含まれる。これら用語はまた、ｐ６と会合する能力を保持したＶｐｒおよびＶｐｘの断片、突然変異体、相同体、および変異体も指す。

「融合タンパク質」という用語は、互いに連結された２以上のタンパク質を含んでなる分子を指す。典型的には、融合タンパク質は、２以上のタンパク質配列を含んでなるアミノ酸配列である。

「ベクター」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等の、適切な制御要素と結びついた場合に複製能を有し、かつ細胞間で遺伝子配列を移動できる遺伝子要素を意味する。従って、本用語には、クローニング用および発現用の運搬体、ならびにウイルスベクターが含まれる。

本明細書において用いられているように、ベクター等の配列の修飾語として、ならびにウイルスの修飾語としての「組み換え」という用語は、組成物が自然界では一般に生じない様態で操作されている（すなわち改変されている）ことを意味する。

「組み換えレンチウイルスベクター」または「ｒＬＶ」は、レンチウイルスの直線状の二本鎖核酸ゲノムを含んでなる遺伝子要素である。該「レンチウイルスの直線状の二本鎖核酸ゲノム」は、例えば異種核酸構築物の付加または挿入によって遺伝子改変されている。

「組み換えウイルス」とは、例えば粒子中に異種核酸構築物を付加または挿入することによって遺伝子改変されたウイルスを意味する。組み換えウイルスには、自然界に存在する感染性ウィルスは含まれない。

「ＬＶビリオン」は、ｒＬＶエンベロープに関連する野生型（ｗｔ）ＬＶウイルス粒子の様な完全なウイルス粒子を指す。「ｒＬＶビリオン」とは、直線状の二本鎖ＬＶ核酸ゲノムとｒＬＶエンベロープに関連する関心の異種ヌクレオチド配列とを含んでなるｒＬＶウイルス粒子の様な完全なウイルス粒子を指す。本発明の方法と使用に適したｒＬＶの例には、ＨＩＶおよびその偽型（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２偽型、ＨＩＶ−１／ＳＩＶ等）、ＦＩＶ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス、ウシ免疫不全ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルスＧ偽型レンチウイルス（ＶＳＶＧ偽型））が含まれるが、これに限定されない。

「組み換えｒＬＶビリオン」、「ｒＬＶベクター粒子」および「完全粒子」は、ここではｒＬＶ膜エンベロープと対象の異種ヌクレオチド配列を含んでなる導入遺伝子を含んだ感染性の複製欠損ウイルスとして定義される。ｒＬＶの分子特長に関する概説が、Ｄｒｏｐｕｌｉｃ（２０１１）により提供されている。ここでに記載の通り、感染性ＬＶは自然界に存在するので、「組み換えｒＬＶビリオン」には含まれない。

「宿主細胞」という用語は、例えば微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞であって、ｒＬＶヘルパー構築物、ｒＬＶベクタープラスミド、補助機能ベクター、またはその他のトランスファーＤＮＡの受領体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）として利用可能、または利用された細胞を指す。本用語は、形質導入された原細胞の子孫を含む。従って、ここで用いる「宿主細胞」は、一般的に外来ＤＮＡ配列を導入された細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的または意図的な突然変異のために、形態、あるいはゲノムまたは全ＤＮＡの相補体が必ずしも原親細胞と完全に同一ではない可能性があることがわかっている。

補助機能ベクターは、一般には補助またはヘルパー機能を提供する配列を含む核酸を指す。補助機能ベクターは宿主細胞に導入することができ、該ベクターは宿主細胞内での、または該細胞によるｒＬＶベクタービリオンの産生を補助する機能を果たすタンパク質を提供またはコードすることができる。補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、またはエピソームの形態をとる場合、あるいは宿主細胞ゲノムに統合されている場合がある。

「トランスフェクション（形質導入）」という用語は、ある細胞による異種核酸（例えばＤＮＡ）の取り込みを指すために用いられ、外来核酸（例えばＤＮＡ）が細胞膜の内側に導入された場合に、細胞は「形質導入された」という。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野で一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６） Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら （１９８１） Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。これらの技術は、適切な宿主細胞内に１以上の外来ＤＮＡ部分を導入するために利用できる。

ここで使用される様に、「細胞株」という用語は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で連続的または長期的に増殖および分裂する能力を有する細胞の集団を指す。多くの場合、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。さらに、その様なクローン集団の保存または移動中に核型の変化が自然発生または誘発されることが、当該技術分野で知られている。従って、言及された細胞株に由来する細胞はその祖先細胞または培養物と厳密に同一ではない可能性があり、言及された細胞株はその様な変異体を含む。

本発明の方法に準拠する懸濁状態での無血清増殖に適した細胞および細胞株は、哺乳類細胞を含む。細胞の非限定的な例には、例えばＨＥＫ ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）、ＨＥＫ２９３Ｆ（ライフテクノロジーズ）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ）、２９３Ｓ（ＡＴＣＣ）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ）、ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ−（ＡＴＣＣ）ｌ、およびＣＨＯ Ｋ１（ＡＴＣＣ）の細胞が含まれる。

本発明の方法で使用する無血清細胞増殖培地は、市販されている、または作成可能である。無血清増殖培地の非限定的な例には、例えばＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^TM２９３（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ−２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ^TM、サーモサイエンティフィック）、ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅ^TM、サーモサイエンティフィック），ＳｔｅｍＰｒｏ−３４ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ），２９３ＳＦＭ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）、および ＣＤ２９３（Ｇｉｂｃｏ^R、ライフテクノロジーズ）の培地が含まれる。

本発明の方法では、核酸不純物の量を低減または減少させる処理または方法の段階を使用することができる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼが、採取した組み換えウイルスベクターまたはその調製物中の核酸不純物量を低減または減少させるために使用される。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ベンゾナーゼなどのエンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、ヌクレアーゼはＤＮａｓｅである。

本発明の方法では、１段階以上のカラムクロマトグラフィーが実施される。種々の物質が、カラムクロマトグラフィー用の樹脂または媒体（固定相）に適している。その様な樹脂または媒体（固定相）には、電荷に基づく（イオン交換）またはアフィニティ樹脂もしくは媒体が含まれる。

特定の実施形態では、イオン交換カラムクロマトグラフィーは、陰イオン（強または弱）交換カラムクロマトグラフィー、または陽イオン（強または弱）交換カラムクロマトグラフィーである。より具体的な実施形態では、イオン交換カラムは、四級化ポリエチレンイミンに基づく樹脂または媒体、あるいは四級アミンに基づく樹脂または媒体である。さらに具体的な実施形態では、イオン交換カラムは、ポリエチレンイミンに基づく樹脂、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）に基づく樹脂、またはジエチルアミノプロピルに基づく樹脂である。

特定の実施形態では、アフィニティカラムは、スルホプロピルに基づく樹脂または媒体、あるいはカルボキシルメチルに基づく樹脂または媒体である。別の実施形態では、アフィニティカラムは、多機能クロマトグラフィー樹脂または媒体、金属キレートアフィニティ樹脂または媒体、ヘパリンに基づく樹脂または媒体、あるいは群特異的アフィニティ樹脂または媒体である。

本発明の方法においてカラムクロマトグラフィーに適した他の樹脂または媒体には、ヒドロキシアパタイト（（Ｃａ₅（ＰＯ₄）₃ＯＨ）₂）に基づく樹脂または媒体、多モード弱陽イオン交換樹脂または媒体、Ｎ−ベンジル−ｎ−メチルエタノールアミンに基づく樹脂または媒体、あるいはオクチルアミンに基づく樹脂または媒体が含まれる。

本発明の方法では、結合溶液、洗浄溶液および溶出溶液などの溶液を使用する。これらの用語は、各溶液のクロマトグラフィーでの目的を示すのに便利であるため利用される。

そうした溶液には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の様な成分を随意に含めることができる。そうした溶液には、塩の様な成分を随意に含めることもできる。また、そうした溶液には、緩衝剤（トリスまたはリン酸緩衝の）の様な成分を随意に含めることもできる。さらに、そうした溶液には、例えばＥＤＴＡ等のキレート剤の様な成分を含めることもできる。

特定の実施形態では、結合溶液中のＰＥＧ量は、約０％から１０％重量／容積、または約０％から５％重量／容積、または約０％から２％重量／容積である。特定の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧ量は、約１％から１０％重量／容積、または約１％から５％重量／容積、または約１％から２％重量／容積である。特定の実施形態では、溶出溶液中のＰＥＧ量は、約０％から２０％重量／容積である。

特定の実施形態では、結合溶液、洗浄溶液または溶出溶液中のＰＥＧは、約２，０００ｋＤａから約４０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の特定の実施形態では、結合溶液、洗浄溶液または溶出溶液中のＰＥＧは、約２，０００ｋＤａから約１０，０００ｋＤａの分子量を有する。

特定の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、または塩化カルシウムを含んでなる、またはこれらのいずれかからなる。特定の実施形態では、結合溶液、洗浄溶液、または溶出溶液中の塩の量は、約２０ｍＭから約１Ｍである。より具体的な実施形態では、結合溶液中の塩の量は、約２０ｍＭから約２００ｍＭ（例えば約１００ｍＭ）である。より具体的な実施形態では、洗浄溶液中の塩の量は、約２０ｍＭから約２００ｍＭ（例えば約１００ｍＭ）である。より具体的な実施形態では、溶出溶液中の塩の量は、約２０ ｍＭから約１Ｍ（例えば約２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、または５００ｍＭ）、または約５００〜１，０００ｍＭ、もしくは６００〜８００ｍＭである。

本発明の方法では、フィルターを使用してよい。フィルターは、様々な孔径のものであってよい。孔径は便宜上、数値で表現できる。孔径の例は、約０．２０〜０．５ ｕｍ（ミクロン）の範囲である。他の孔径の例は、約０．２０ ｕｍ（ミクロン）から０．２２ ｕｍ（ミクロン）の範囲、またはより特定すれば約０．２２ ｕｍ（ミクロン）である。また別の孔径の例は、約０．２２ ｕｍ（ミクロン）から約０．３０ ｕｍ（ミクロン）、または約０．３０ ｕｍ（ミクロン）から約０．４５ ｕｍ（ミクロン）の範囲、またはより特定すれば約０．４５ ｕｍ（ミクロン）である。

本発明の方法は、ｒＬＶビリオンの精製済ストック内に含まれるｒＬＶベクターに関連する不純物（例えばｒＬＶ関連核酸不純物）を、該ストックに含まれるｒＬＶベクター粒子またはビリオンの損失を最小限にしつつ、低減、減少または排除しながら、大量産生中にｒＬＶの力価を高める。不純物には、タンパク質、核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）、破片、および存在する可能性のあるｒＬＶベクター粒子またはビリオンとは異なる他の物質が含まれる。発明の方法は、不純物を低減、減少、または排除しつつｒＬＶベクター粒子／ビリオンの量を増加させるのに役立つ。

特定の実施形態では、本発明の方法により、約５ｘ１０⁵感染単位（ＩＵ）／ｍｌ以上で産生されたウイルスベクターが得られる。特定の実施形態では、本発明の方法により、約６ｘ１０⁶感染単位（ＩＵ）／ｍｌ以上で産生されたウイルスベクターが得られる。特定の実施形態では、本発明の方法により、約３ｘ１０⁸感染単位（ＩＵ）／ｍｌで産生されたウイルスベクターが得られる。

ここで用いる様に、量または単位の測定値について使用される「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、表示された数値に許容される統計的偏差の範囲を指す。通常その範囲は、表示された数値の約＋／−１０％、または＋／−５％である。

ここで開示する様に、組み換え（ウイルス）ベクターは、導入遺伝子の様な核酸を含むことがある。「核酸」配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を指す。本用語は、以下に挙げるＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列をカバーするが、それらに限定はされるものではない。４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシルメチルアミノメチルウラシル−、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケウオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキソ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキソ酢酸、シュードウラシル、ケウオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。

「コード配列」、または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列の管理下に置かれた場合に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で転写（ＤＮＡの場合）およびポリペプチドに翻訳（ＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端にある開始コドンと３’（カルボキシ）末端にある翻訳終止コドンにより決定される。転写停止配列が、コード配列の３’末端側に位置する可能性がある。

ＤＮＡ「制御配列」という用語は、受領細胞で集合的にコード配列の複製、転写、および翻訳を規定する、プロモーター配列、ポリアデニル化信号、転写停止配列、上流制御ドメイン、複製開始点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー等を集合的に指す。選択されたコード配列が適切な宿主細胞で複製、転写、および翻訳可能である限り、これら制御配列のすべてが必ずしも存在する必要はない。

「プロモーター」という用語は、ここでは通常の意味で使用され、ＲＮＡポリメラーゼに結合して下流（３’−方向）のコード配列の転写を開始できる遺伝子に由来するＤＮＡ制御配列を含んでなるヌクレオチド領域を指す。転写プロモーターは、「誘導性プロモーター」（作動可能な様にプロモーターに連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、被分析物、補因子、制御タンパク質等により誘導される）、「抑制性プロモーター」（作動可能な様にプロモーターに連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、被分析物、補因子、制御タンパク質等により誘導される）、および「構成的プロモーター」を包含することができる。

「作動可能な様に連結された」とは、記載の構成要素がそれらの通常の機能を発揮するように構成された要素の配置を指す。従って、作動可能な様にコード配列に連結された制御配列は、コード配列の発現を生じさせることができる。制御配列とコード配列とは、該制御配列が該コード配列の発現を導くよう機能する限り、隣接している必要はない。従って、例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在してよく、このような場合も該プロモーター配列は該コード配列に「作動可能な様に連結」されているとみなすことができる。

本出願全体を通して、ある特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対的位置を記述する目的で、ある特定のヌクレオチド配列が他の配列に対して「上流」、「下流」、「３’」または「５’」にあると記述する場合等は、当該技術分野の慣
例と同様、言及されているＤＮＡ分子の「センス」または「コード」鎖中の該配列の位置であると解すること。

コード配列および制御配列の様な核酸配列と関連して用いられる「異種」という用語は、通常は互いに結合されていない、および／または通常はある特定の細胞と関連していない配列を意味する。従って、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、自然界では他方の分子と関連して存在しない別の核酸分子内の、またはそれに結合した核酸の断片である。例えば、核酸構築物の異種領域は、自然界ではそのコード配列と関連して存在しない配列が両側に隣接したコード配列を含むこともある。別の異種コード配列の例は、そのコード配列自体が自然界に存在しない構築物である（例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、その細胞中に通常は存在しない構築物を用いて形質転換された細胞は、本発明の目的には異種とみなす。対立遺伝子変異または自然発生する突然変異事象は、ここで用いる様な異種ＤＮＡを生じさせない。

ある実施形態における「治療的分子」とは、あるタンパク質が細胞または被験体で不在または異常であることに起因する症状を緩和または低減する可能性があるペプチドまたはタンパク質である。あるいは、導入遺伝子によってコードされた「治療的」ペプチドまたはタンパク質は、例えば遺伝子異常を修正する、遺伝子の（発現または機能的）欠損を修正する、または抗がん作用等、被験体に有益な効果を与えるものである。従って、異種核酸を含んでなる導入遺伝子は、多くの有用な産物がコードされ得る。これらには、例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、およびｍｉＲＮＡが含まれる。

導入遺伝子は、以下に挙げるホルモンおよび成長・分化因子をコードできるが、これらに限定されない：インシュリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、アンギオスタチン、果粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α （ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換成長因子βスーパーファミリーのいずれか１つ（ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、または骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ １〜１５のいずれかを含む）、ｈｅｒｅｇｌｕｉｎ／ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの成長因子のいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンファミリーのいずれか１つ、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグおよびチロシンヒドロキシラーゼ。

他の有用な導入遺伝子産物には、以下の様なサイトカインおよびリンフォカインのような免疫系を制御するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）類ＩＬ１からＩＬ１７、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、βおよびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド。免疫系が産生する遺伝子産物も本発明において有用である。これらには、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体（例えば、Ｋａｌｏｓら２０１１、Ｐｏｒｔｅｒら２０１１）、ＣＣＲ５の様なＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子、ならびに改変された免疫グロブリンおよびＭＨＣ分子が含まれるが、これらに限定されない。有用な遺伝子産物には、補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、分解促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２およびＣＤ５９などの制御タンパク質も含まれる。

その他の有用な遺伝子産物には、代謝の先天的欠陥を修正できるものが含まれる。そのような導入遺伝子は、例えば、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酸加水分解酵素、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、血液凝固因子（第Ｖ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、またはプロテインＣ等）、シスタチオニンベータシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インシュリン、ベータグルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈタンパク質、Ｔタンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配列をコードできる。

さらにその他の有用な遺伝子産物には、機能または活性の異常、不足、または欠損に役立つものがあり、例えば以下のものが挙げられる。網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、エリスロポエチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属輸送体（ＡＴＰ７ＡまたはＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症に関与する酵素（ＡＲＳＡ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分枝鎖ケト酸脱水素酵素、ホルモン、成長因子（例えば、インシュリン様成長因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮成長因子、神経成長因子、神経栄養因子３および４、脳由来神経栄養因子、グリア細胞由来成長因子、形質転換成長因子αおよびβ等）、サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、自殺遺伝子産物（例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、腫瘍壊死因子等）、薬剤耐性タンパク質（例えば、がん治療で使用される薬剤に対する抵抗性を付与するもの）、腫瘍抑制タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１、ＮＦ１、フォン・ヒッペル・リンドウ（Ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ； ＶＨＬ）、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ））、免疫調節性を有するペプチド、寛容原性または免疫原性のペプチドあるいはタンパク質Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅｓ（制御性Ｔ細胞エピトープ）、またはｈＣＤＲ１、インシュリン、グルコキナーゼ、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＬＣＡ−ＧＵＣＹ２Ｄ）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（先天性脈絡膜欠如）、ＬＣＡ５（ＬＣＡ−レベルシリン）、オルニチンケト酸アミノ基転移酵素（脳回転状萎縮症）、レチノスキシン１（Ｘ連鎖性網膜分離症）、ＵＳＨ１Ｃ（アッシャー症候群１Ｃ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ（ＸＬＲＰ）、ＭＥＲＴＫ（ＲＰのＡＲ型：網膜色素変性症）、ＤＦＮＢ１（コネキシン２６難聴）、ＡＣＨＭ２、３および４（色覚異常）、ＰＫＤ−１またはＰＫＤ−２（多発性嚢胞腎）、ＴＰＰ１、ＣＬＮ２、リソソーム蓄積症の原因となる遺伝子欠損（例えば、スルファターゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸トランスフェラーゼ、カテプシンＡ、ＧＭ２−ＡＰ、ＮＰＣ１、ＶＰＣ２、スフィンゴ脂質活性化因子タンパク質等）、ゲノムエディティングに用いられる一つあるいは複数のジンク・フィンガーヌクレアーゼ、あるいはゲノムエディティングで修復テンプレートとして用いられるドナー配列。

導入遺伝子はまた、腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）もコードすることができる。非限定的なＴＡＡは以下のものを含む。腫瘍関連精巣特異的抗原（例えば、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、およびＧＡＧＥ）、メラノサイト分化抗原（例えば、チロシナーゼ、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１）、ＣＤＫ４、ＭＵＭ−１、ベータカテニン、ｇｐ１００／ｐｍｅｌ １７、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＩＴＦ、ＭＩＴＦ−ＡおよびＭＩＴＦ−Ｍ（Ｋｉｎｇら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５５：７３１， １９９９）。腫瘍により発現されるＴＡＡの他の非限定的な例には、メラノーマＧＰ７５、アネキシンＩ、アネキシンＩＩ、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＰＧＰ９．５（Ｒｏｄｅら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ９：１４７， １９８５）、大腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、Ａｂ２ ＢＲ３Ｅ４、ＣＩ１７−１Ａ／ＧＡ７３３、Ｈｓｐ７０（Ｃｈｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８４：８１， ２００２）、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ９６、Ｈｓｐ１０５、Ｈｓｐ１１０、ＨＳＰＰＣ−９６（Ｃａｕｄｉｌｌ， Ｍ． Ｍ．とＺ． Ｌｉ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １：５３９， ２００１）、ストレスタンパク質ｇｐ９６（Ｈｅｉｋｅら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎ ８６：４８９， ２０００）、ｇｐ９６関連細胞ペプチド、Ｇ２５０、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、マンマグロビン （Ｔａｎａｋａら、Ｓｕｒｇｅｒｙ １３３：７４， ２００３）、チログロブリン、ＳＴｎ（Ｍｏｒｓｅ， Ｍ． Ａ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２：４５３， ２０００）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）エピトープＣＡＰ−１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）エピトープＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＡエピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、ＰＳＡ−３（Ｃｏｒｒｅａｌｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：３１８６， １９９８）、Ａｄ５−ＰＳＡ、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨ−ｒＰ）、ＥＧＦＲ（Ｐｌｕｎｋｅｔｔら、Ｊ Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ６：４６７， ２００１）、ＰＬＵ１（Ｐｌｕｎｋｅｔｔら、Ｊ Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ６：４６７， ２００１）、がん胎児性抗原未熟ラミニン受容体（ＯＦＡ−ｉＬＲ）、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ（ＣＡ９）（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｏｎｃｏｌ． Ｒｅｐ． Ｓｅｐ−Ｏｃｔ； １０：１３０７， ２００３）、ＨＰ５９、チトクロームオキシダーゼ１、ｓｐ１００、ｍｓａ（Ｄｅｖｉｎｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５１：５８２６， １９９１）、Ｒａｎ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、Ｒａｂ−ＧＡＰ（Ｒａｂ ＧＴＰアーゼ活性化）タンパク質、ＰＡＲＩＳ−１（Ｚｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９０：８３０， ２００２）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、ｃＴＡＧＥ−１、ＳＣＰ−１、糖脂質抗原−ＧＭ２、ＧＤ２またはＧＤ３、ＧＭ３（Ｂａｄａら、Ｈｕｍ Ｅｘｐ Ｔｏｘｉｃｏｌ ２１：２６３， ２００２）、フコシルＧＭ１、糖タンパク質（ムチン）抗原−Ｔｎ、シアリル−Ｔｎ（Ｌｕｎｄｉｎら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ５７：７０， １９９９）、ＴＦおよびムチン−１（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２６：４７， ２００３）、ＣＡ１２５（ＭＵＣ−１６）（Ｒｅｉｎａｒｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：３２３４， ２００３）、ＭＡＧＥファミリー抗原、ＧＡＧＥ−１、２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１（Ｅｉｃｈｍｕｌｌｅｒら、 Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０４：４８２， ２００３）（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：６９１９， １９９８）、ＧｎＴ−Ｖ（Ｍｕｒａｔａら、Ｄｉｓ Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ４４：Ａ２−Ａ４， ２００１）、ＭＵＭ−１（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｋｅｉｏ Ｊ Ｍｅｄ ４５：１００， １９９６）、ＥＰ−ＣＡＭ／ＫＳＡ（Ｕｌｌｅｎｈａｇら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９：２４４７， ２００３）、ＣＤＫ４、ＭＵＣファミリー抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、ＮｅｕＧｃＧＭ３（Ｃａｒｒら、 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２１：１０１５， ２００３）、Ｆｏｓ関連抗原（Ｌｕｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：８８５０， ２００３）、シクロフィリンＢ（Ｔａｍｕｒａら、Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９２：７６２， ２００１）、ＲＣＡＳ１、Ｓ２（Ｋｏｇａら、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ６１：１３６， ２００３）、Ｌ１０ａ（Ｋｏｇａら、上記参照，２００３）、Ｌ１０ａ、テロメアーゼｒｔペプチド（Ｗａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：７６９９， ２００１）、ｃｄｃ２７、フォドリン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＧＡ７３３／ＥｏＣａｍ（Ｒｏｓｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３５：２９７， １９８６）、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＢＲ−２、ＮＹ−ＢＲ−３、ＮＹ−ＢＲ−４ 、ＮＹ−ＢＲ−５、ＮＹ−ＢＲ−６、ＮＹ−ＢＲ−７（Ｊａｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１：２０５５， ２００１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｌ１９Ｈ１、ＭＡＺ（Ｄａｈｅｒｏｎら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２：３２６， １９９８）、ＰＩＮＣＨ（Ｇｒｅｉｎｅｒら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２８：１４１３， ２０００）、ＰＲＡＭＥ（Ｉｋｅｄａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：１９９， １９９７）、Ｐｒｐ１ｐ／Ｚｅｒ１ｐ、ＷＴ１（Ｏｋａら、Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２：４５， ２００２）、大腸腺腫様ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、ＰＨＦ３、ＬＡＧＥ−１、ＳＡＲＴ３（Ｍｉｙａｇｉら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７：３９５０， ２００１）、ＳＣＰ−１（Ｊａｇｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ ２：５， ２００２）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２、 ＳＳＸ−４、ＴＡＧ−７２（Ｂｕｃｈｓｂａｕｍら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５（１０ Ｓｕｐｐｌ）： ３０４８ｓ−３０５５ｓ， １９９９）、ＴＲＡＧ−３（Ｃｈｅｎら、Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ３８：１０１， ２００２）、ＭＢＴＡＡ（Ｂａｓｕら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０５：３７７， ２００３）、Ｓｍａｄ腫瘍抗原、ｌｍｐ−１、ＨＰＶ−１６ Ｅ７、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ＥＢＶ由来核抗原（ＥＢＮＡ）−１、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、ＸＡＧＥ−１の選択的スプライシングアイソフォーム（Ｌ５５２Ｓ； Ｗａｎｇ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：７６９９， ２００１）、ＴＧＦ ベータＲＩＩ フレームシフト変異（Ｓａｅｔｅｒｄａｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：１３２５５， ２００１）、ＢＡＸ フレームシフト変異（Ｓａｅｔｅｒｄａｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：１３２５５， ２００１）が含まれる。

導入遺伝子はさらに、以下に挙げる遺伝子産物をコードできる：ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＥＡ、ＥＧＦ−ＲＩＩＩ（上皮細胞成長因子受容体変異体３）ＥＧＰ−２、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ２、３、４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ｋ−軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、がん胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺上皮由来Ｅｔｓ転写因子（ＰＤＥＦ）、ｍＡｂ ＩｇＥ標的ＴＡＡ、ＴＡＧ−７２、およびＶＥＧＦ−Ｒ２。

あるいは、導入遺伝子は、例えばｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、およびｍｉＲＮＡを含むことができる。臨床的に有用なレンチウイルスベクターはまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｌｅｖｉｎｅら２００６）および他の重要なヒト病原体に対するアンチセンス遺伝子を発現してもよい。ｒＬＶと関連ベクターのこれらおよびその他有用な応用については、最近Ｎａｌｄｉｎｉ（２０１１）によって概説および引用されている。

ｒＬＶベクターに含むことができるアンチセンス遺伝子は、以下の発現を阻害することが可能である。ハンチンチン（ＨＴＴ）遺伝子、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症関連遺伝子（例えば、アトロフィン１、ＡＴＮ１）；球脊髄性筋萎縮症のＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトアタキシン−１、−２、−３、および−７、Ｃａ_v２．１ Ｐ／Ｑ 電位依存性カルシウムチャンネルは（ＣＡＣＮＡ１Ａ）によりコードされる、ＴＡＴＡ結合タンパク質、アタキシン８逆ストランド（ＡＴＸＮ８ＯＳとしても知られる）、脊髄小脳失調におけるセリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼ２Ａ ５５ ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（タイプ１、２、３、６、７、８、１２、１７）、脆弱性Ｘ症候群におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱性Ｘ関連性振戦／運動失調症候群におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、脆弱性ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞２）またはＡＦ４／ＦＭＲ２ ファミリーメンバー２；筋強直性ジストロフィーにおけるミオトニンタンパク質キナーゼ（ＭＴ−ＰＫ）；フリードライヒ運動失調症におけるフラタキシン；筋萎縮性側索硬化症におけるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子；パーキンソン病および／またはアルツハイマー病の発病に関連する遺伝子；アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）および前駆タンパク質変換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、高コレステロール血症；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＨＩＶ転写トランス活性化因子遺伝子、ＨＩＶ Ｔａｔ；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染におけるＨＩＶトランス活性化因子応答エレメント遺伝子、ＨＩＶ ＴＡＲ；ＨＩＶ感染におけるＣ−Ｃ ケモカイン受容体（ＣＣＲ５）；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）感染におけるＲＳＶ ヌクレオカプシドタンパク質、Ｃ型肝炎ウイルス感染における肝臓特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２２）； ｐ５３、急性腎臓損傷または移植腎機能発現遅延または腎損傷急性腎不全；進行再発性または転移性固形悪性腫瘍におけるタンパク質キナーゼＮ３（ＰＫＮ３）；ＬＭＰ２、プロテアソームサブユニットベータ−９型（ＰＳＭＢ ９）としても知られるＬＭＰ２、転移性メラノーマ；プロテアソームサブユニットベータ−８型（ＰＳＭＢ ８）としても知られるＬＭＰ７、転移性メラノーマ；プロテアソームサブユニットベータ−１０型（ＰＳＭＢ １０）としても知られるＭＥＣＬ１、転移性メラノーマ；固形腫瘍における血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；固形腫瘍におけるキネシン紡錘タンパク質、慢性骨髄性白血病におけるアポトーシス抑制Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫（ＢＣＬ−２）；固形腫瘍におけるリボヌクレオチド還元酵素Ｍ２（ＲＲＭ２）； 固形腫瘍におけるフーリン；肝腫瘍におけるｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、Ｃ型肝炎感染におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＤＧＡＴ１）、家族性腺腫性ポリポーシスにおけるベータカテニン；ベータ２アドレナリン受容体；糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）または加齢性黄斑変性におけるＤＮＡ損傷誘導性転写物４タンパク質としても知られるＲＴＰ８０１／Ｒｅｄｄ１；加齢性黄斑変性または脈絡膜血管新生における血管内皮成長因子受容体Ｉ（ＶＥＧＦＲ１）、非動脈炎性虚血性視神経症におけるカスパーゼ２；先天性爪肥厚症におけるケラチン６Ａ Ｎ１７Ｋ変異型タンパク質；インフルエンザ感染におけるＡ型インフルエンザウイルスゲノム／遺伝子配列；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）感染におけるＳＡＲＳコロナウイルスゲノム／遺伝子配列；呼吸器合胞体ウイルス感染における呼吸器抱合体ウイルスゲノム／遺伝子配列；エボラ感染におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列；Ｂ型およびＣ型肝炎感染におけるＢ型およびＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染におけるＨＳＶゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウイルスＢ３感染におけるコクサッキーウイルスＢ３ゲノム／遺伝子配列；原発性筋失調症におけるトルシンＡ（ＴＯＲ１Ａ）の様な遺伝子の病原性対立遺伝子のサイレンシング（対立遺伝子特異的サイレンシング）、移植手術における汎クラスＩおよびＨＬＡ対立遺伝子特異的；常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）における変異型ロドプシン遺伝子（ＲＨＯ）；または前記の遺伝子または配列のいずれかの転写物に結合する抑制的核酸。

ヌクレオチド配列に言及する際の「単離された」とは、指示した分子が同種の他の生物学的高分子が実質的に存在しない状態で存在することを意味する。従って、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸」は、目的のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指す。しかしながら、該分子は、組成物の基本特性に有害な影響を与えない他の塩基または成分を含んでよい。

別途定義しない限り、ここで使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。ここで記述したものに類似または等価な方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適した方法と材料についてここに記述する。

ここに開示される全ての出願、出版物、特許、および他の参照物、ＧｅｎＢａｎｋ引用およびＡＴＣＣ引用は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。相反する場合には、定義を含めて、本明細書が優先する。

ここで開示される全ての特性は、どの様な組み合わせで組み合わせてもよい。明細書で開示された個々の特性は、同じ、同等または類似の目的を果たす代替的特性で置換してよい。従って、別途明示的に記述しない限り、開示された特性（例えば組み換えベクター（例えばｒＬＶ）ベクター、または組み換えウイルス粒子）は、同等または類似の特性の属の一例である。

ここで用いられる様に、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないと明らかでない限り、複数形の指示対象を含む。従って、例えば、「ポリヌクレオチド（ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」を参照する際には、複数のその様なポリヌクレオチドが含まれ、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」を参照する際には、複数のその様なベクターが含まれ、「ウイルス（ａ ｖｉｒｕｓ）」または「粒子（ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」を参照する際には、複数のその様なビリオン／粒子が含まれる。

ここで用いられる様に、すべての数値または数値範囲は、文脈からそうでないと明らかでない限り、その様な範囲内の整数および範囲内の小数値または整数値を含む。従って、例を挙げると、少なくとも１〜１０％の同一性とは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、ならびに１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％等、 ２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％等を含む。

ある数を上回る（より大きい）または下回る数を参照する際には、それぞれ参照される数を上回る、または下回る数はすべて含まれる。従って、例えば、４０，０００を下回る（未満）との言及には、３９，９９９、３９，９９８、３９，９９７等、１に至るまでのすべての数が含まれる。また１００を下回る（未満）の場合は、９９、９８、９７等、１に至るまでのすべての数が含まれる。

ここで用いられる様に、すべての数値または数値範囲は、文脈からそうでないと明らかでない限り、その様な範囲内の整数および範囲内の小数値または整数値を含む。従って、例を挙げると、２，０００〜４０，０００の様な数値範囲への言及には、２，０００、３，０００、４， ０００、５，０００、６，０００等、ならびに２，１００、３，１００、４，１００、５，１００、６，１００等が含まれる。従って２０〜１００の範囲については、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０等、１００を含めて１００まで、ならびに２１．１、２１．２、２１．３、２１．４、２１．５等、２２．１、２２．２、２２．３、２２．４、２２．５等が含まれる。

連続した複数の範囲のシリーズに言及する際には、そのシリーズ内の異なる範囲の境界値を結合した範囲を含む。従って、例を示すと、２０〜１００または１００〜１，０００（例えば２０ｍＭ〜１００ｍＭまたは１００ｍＭ〜１Ｍ）の連続した範囲に言及する場合は、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００等が含まれる。

本発明は、多くの実施形態および態様の記述に一般的に肯定的文体を用いて、ここに開示される。本発明は、物質または材料、方法のステップと条件、プロトコル、または手順等、特定の対象の全部または一部が除外された実施形態を特に含む。例えば、本発明のある実施形態または態様では、材料および／または方法のステップが除外されている。従って、本発明は、一般的に本発明が含まないものはここでは表示されないが、本発明で明示的に除外されていない態様は、前記にかかわらずここに開示されるものとする。

本発明の多くの実施形態が記載されている。しかしながら、当業者は、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件に適応させるために、本発明に種々の変更および修飾を行うことができる。従って、下記の例は説明を目的とするもので、請求する発明の範囲を限定するものではない。

実施例１
レンチウイルスベクターは、通常、接着細胞培養システムにおいてリン酸カルシウム沈殿法を用いるトランスフェクション法によって産生される（３，４）。しかしながら、臨床応用用にレンチベクターを製造する場合、特に臨床応用の後期では、ベクター産生量を確保するためにスケールアップが可能で、製造されたベクターの安全特性を高めることができる無血清懸濁生産システムでベクターを製造することが重要である。

現在利用可能なレンチベクター生産システムに存在する制限を克服するために、高力価のレンチベクターを産生する、拡張可能な無血清懸濁細胞培養システムをここに開示する。この新しい拡張可能な生産システムの第一段階は、無血清条件で培養可能で、高レベルのレンチベクターを産生する細胞株の開発である。ＨＥＫ２３９Ｔ細胞は、現在ウイルスベクターの産生に広く利用されているので、該細胞を無血清懸濁培養物に適応させることは実施可能であるはずだと我々は仮定した。この目的を達成するため、我々は段階的適応プロトコルをデザインし、市販の無血清培地数種と、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞がこれらの培地で活発に増殖する能力を系統的に評価した。ある培地（ＣＤ２９３）が、適応後に凝集していない健全な細胞を速い増殖速度で増殖させる点で、他の検体全てを凌駕することがわかった（図２、パネルＡ）。最適化された細胞培養条件は、高細胞密度と安定した細胞増殖を支持する（図２、パネルＢおよびＣ）。適応された細胞を無血清懸濁培養条件で数ヶ月間培養し、研究細胞バンクを設立した。

レンチウイルスベクターは、リン酸カルシウム沈殿共トランスフェクションによって標的細胞に２から５のプラスミドを導入することにより産生されてきた。最新世代の多プラスミド産生システム（活性化システムにおけるそれ）は、複製能を有するレンチウイルスを生ずるリスクが低いレンチベクターの産生において万能であることが示されているが、カルシウム共沈殿は大規模製造における制約となる。ＤＮＡのリン酸カルシウム共沈殿は、４０年以上前に開発されたが（５）、研究規模の接着細胞培養に対しては良好に機能する。しかしながら、この方法では無血清懸濁細胞培養において効率的なトランスフェクションが得られず、またスケールアップが非常に困難である。

ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、市販されており、新たに適応されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞への効率的なプラスミドＤＮＡの導入について試験された（６）。初期実験では、無血清細胞培養用に選択された培地では、ＰＥＩをトランスフェクション試薬として用いた形質導入が全く得られないことが明らかになり、ＰＥＩを用いた細胞のトランスフェクションを支持することができる無血清培地の特定に作業が向けられた。スクリーニングしたある特定の培地タイプはトランスフェクションを支持したが（図３パネルＤ）、この培地は長期細胞培養での細胞の懸濁増殖を支持しなかった（データは非表示）。そのため我々は、無血清懸濁条件でレンチベクターを生産するための２段階システムをデザイン・開発した。まず初めに、無血清条件下懸濁状態で活発かつ迅速な増殖を支持する培地中で細胞を増殖させる。次いで、細胞培養培地を、ＰＥＩを用いたトランスフェクションを支持する第２の培地タイプに交換するか、またはそれと混合する。ＰＥＩトランスフェクション効率を最適化するために、異なる販売業者から得た数種のＰＥＩ分子を評価した。２５−ｋＤａ直鎖ＰＥＩの様な低分子量直鎖ＰＥＩは、数種の生物学的製剤の製造に使用されてきた（６）が、我々は、分枝ＰＥＩは１分子につき複数の官能基が利用可能なので、多プラスミドトランスフェクションでより高い送達効率を示す可能性があると仮定した。評価した種々のＰＥＩの中で、低分子の分枝ＰＥＩであるＰＥＩ ＭＡＸ （４０，０００ ｋＤａ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）が、特定された培地中で適応したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の最も高いトランスフェクション効率を与えた（図４）。ＰＥＩ ＭＡＸを使いトランスフェクション条件を最適化することで、我々はほぼ１００パーセントの細胞のトランスフェクションを達成した（図５パネルＡ）。我々の予備的半定量データは、現行の産生法で１ｍｌあたり１ｘ１０⁶形質導入単位の水準でレンチウイルスベクターが産生されたことを示した。我々の知り得る限り、我々の研究室で発明された方法は、無血清懸濁細胞培養システムにおける最初の真に拡張可能なレンチベクター生産方法であることを信じている。

ベクター特異的な生産性改良のため、更なる試みがなされた。トランスフェクション時の細胞密度、トランスフェクションに用いる総ＤＮＡ量、ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体の調製法、ベクター採取時期などのパラメータを評価した。適応したＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を、ＣＤ２９３培地（４ ｍＭグルタミン添加）で３Ｅ＋０６個／ｍｌの密度に培養した。細胞培養培地を、遠心分離と再懸濁、またはタンジェンシャルフローろ過技術のいずれかを用いてＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ−２９３（４ ｍＭグルタミン添加）（ＨｙＣｌｏｎｅ^TM、サーモサイエンティフィック）に交換し、細胞密度を１．５Ｅ＋０６細胞／ｍｌに調整し、培養器で培養した。スピナーフラスコ細胞培養には、１３０ ＲＰＭ／分および ８％ ＣＯ₂を用いた。計１２ ｕｇのＤＮＡを１．５Ｅ＋０６細胞のトランスフェクションに使用し、４つのプラスミドのＤＮＡモル比は１：１：１：１であった。ポリエチレンイミン「ＭＡＸ」（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ）を、Ｔｒｉｓ緩衝溶液を用いて濃度１ ｍｇ／ｍｌで調製し、ｐＨを７．１５に調整した。ＤＮＡ混合物をＰＥＩ溶液に重量比１：１で添加し、溶液を穏やかに撹拌し、短時間培養した。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合液をｐＨ ７．１５の５ ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝溶液でさらに希釈した。希釈後のＤＮＡ／ＰＥＩ溶液の終容積は、トランスフェクションを行う細胞培養物の１／１５である。そしてＤＮＡ／ＰＥＩ溶液を、１／１５の容積比で懸濁細胞培養物に添加し、トランスフェクションの４８時間後、７２時間後および９６時間後に細胞培養培地を採取した。採取した細胞培養採取物でＨＥＫ ２９３細胞に形質導入し、ＦＡＣＳを用いてｅＧＦＰの発現を分析した。プレートおよび、より拡張可能な細胞培養プラットフォームであるスピナーフラスコで６Ｅ＋０６ ＴＵ／ｍｌを超える、高いベクター産生が観察された。

カラムクロマトグラフィー技術は、大規模な生物学的材料の精製に工業的に広く利用される。レンチベクターは現在、遠心分離技術を用いてベクターを沈殿するか（３）、もしくはカラムクロマトグラフィー技術を用いた粒子の単離（６）のいずれかで精製される。カラムクロマトグラフィーに基づくプロセスは、古典的な遠心分離技術を用いた場合の製造上の規模の問題に対処するが、しかしながら、高純度のレンチベクターを単離するには、いまだ課題が残っている。典型的な陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにおいては、採取されたレンチベクターをカラムにロードし、低濃度の塩（１００ｍＭ ＮａＣｌ等）で洗浄し、ベクターを高塩濃度の緩衝液（６５０ｍＭ ＮａＣｌから１Ｍ ＮａＣｌ）で溶出した（６）。このタイプのクロマトグラフィー手法を用いると、多くの細胞タンパク質が共溶出した（図８、レーン２）。我々は、アデノ随伴ウイルスベクターの精製のためのＰＥＧ変調カラムクロマトグラフィー手法（７）を報告し、ＰＥＧ変調クロマトグラフィーから単離したｒＡＡＶベクターの純度は有意に改善された。我々は、ＰＥＧ変調クロマトグラフィーは、使用する樹脂はサイズ排除樹脂ではないものの、その分離は分子のサイズに基づくため、細胞タンパク質からレンチベクターを分離し、ベクターの純度を高めるためにも応用できるはずであると仮定した。

ＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂を用いて、ＰＥＧ変調クロマトグラフィーの手法を開発した。ｅＧＦＰ発現細胞のＦＡＣＳ分析に基づくと、この手法でレンチウイルスベクターは９５ ％以上の形質転換単位で回収され（図５）、ベクター純度は、古典的カラムクロマトグラフィーを用いた純度よりも２０倍改善された（図６および７）。我々はレンチベクター用ＰＥＧ変調精製プロトコルの開発に弱陰イオン交換樹脂を使用したが、我々は、本手法の背後にある原理は、ベクターが樹脂に結合する限り、アフィニティ樹脂、強および弱陰イオン交換樹脂、強および弱陽イオン交換樹脂、その他樹脂などのあらゆるカラムクロマトグラフィー樹脂に当てはまるはずであると信じている。革新的なＰＥＧ変調カラムクロマトグラフィーに基づき、完全な拡張可能精製プロセスがデザイン・開発された。ここで記述した手法のフローチャートを図１に示す。

上記の技法は、新たに出現している興奮に満ちた臨床応用の支援に必要な大量のｒＬｅｎｔｉを十分量製造することを可能にすることができる、十分に拡張可能なプロセスである。驚くことに、これらの方法および産生されたｒＬＶ組成物は、レンチウイルスベクターに現在利用可能な製造能力を凌ぎ、治験用製品の品質要件を満足する。

Claims (42)

1. 大規模な組み換えレンチウイルスベクター精製の方法であって、
   ａ）導入遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターを無血清懸濁培養物から採取する工程と、
   ｂ）工程ａの採取物をろ過により澄明化する工程と、
   ｃ）工程ｂのろ液を採取し、随意でＤＮＡ／ＲＮＡ不純物を除去するために前記ろ液をヌクレアーゼ消化に曝す工程と、
   ｄ）工程ｃのろ液を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付すことによって、前記組み換えレンチウイルスベクターを単離する工程と、
   ｅ）工程ｄで得られた前記組み換えレンチウイルスベクターをタンジェンシャルフローろ過により更に精製し、容積および交換緩衝液を減少させる工程と、
   ｆ）工程ｅのろ液をサイズ排除カラムクロマトグラフィーに付し、前記組み換えレンチウイルスベクターを更に精製する工程と、
   ｇ）工程ｆの前記組み換えレンチウイルスベクターをタンジェンシャルフローろ過に付すことによって、最終ベクター力価を得る工程と、
   ｈ）工程ｇで得られた組み換えレンチウイルスベクター溶液を０．２から０．５ｕｍの孔径を有するフィルタでろ過する工程と、
   ｉ）前記精製組み換えレンチウイルスベクターを回収する工程と、
   を含んでなる、方法。
2. 大規模な組み換えレンチウイルスベクター精製の方法であって、
   ａ）導入遺伝子を含んでなる組み換えレンチウイルスベクターを無血清懸濁培養物から採取する工程と、
   ｂ）工程ａの採取物をろ過により澄明化する工程と、
   ｃ）工程ｂの澄明化した懸濁液をタンジェンシャルフローろ過に付し、容積及び交換緩衝液を減少させる工程と、
   ｄ）工程ｃのろ液を採取し、随意でＤＮＡ／ＲＮＡ不純物を除去するために前記ろ液をヌクレアーゼ消化に曝す工程と、
   ｅ）工程ｄのろ液を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付すことによって、前記組み換えレンチウイルスベクターを単離する工程と、
   ｆ）工程ｅで得られたウイルスベクターをサイズ排除カラムクロマトグラフィーに付し、前記組み換えレンチウイルスベクターを更に精製する工程と、
   ｇ）工程ｆの組み換えレンチウイルスベクターをタンジェンシャルフローろ過に付すことによって、最終ベクター力価を得る工程と、
   ｈ）工程ｇで得られた組み換えレンチウイルスベクター溶液を０．２から０．５ｕｍの孔径を有するフィルタでろ過する工程と、
   ｉ）前記精製組み換えレンチウイルスベクターを回収する工程と、
   を含んでなる、方法。
3. 大規模な組み換えレンチウイルスベクター精製の方法であって、
   ａ）導入遺伝子を含んでなる組み換えレンチウイルスベクターを無血清懸濁培養物から採取する工程と、
   ｂ）工程ａの採取物をろ過により澄明化する工程と、
   ｃ）工程ｂの澄明化した懸濁液をタンジェンシャルフローろ過に付し、容積を減少させ、緩衝液を交換する工程と、
   ｄ）工程ｃのろ液を採取し、随意でＤＮＡ／ＲＮＡ不純物を除去するために前記ろ液をヌクレアーゼ消化に曝す工程と、
   ｅ）工程ｄのろ液を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付すことによって、前記組み換えレンチウイルスベクターを単離する工程と、
   ｆ）工程ｅで得られた組み換えレンチウイルスベクターをタンジェンシャルフローろ過により更に精製し、容積および交換緩衝液を減少させる工程と、
   ｇ）工程ｆで得られたろ液をサイズ排除カラムクロマトグラフィーに付し、前記組み換えレンチウイルスベクターを更に精製する工程と、
   ｈ）工程ｇの組み換えレンチウイルスベクターをタンジェンシャルフローろ過に付すことによって、最終ベクター力価を得る工程と、
   ｉ）工程ｈで得られた組み換えレンチウイルスベクター溶液を０．２から０．５ｕｍの孔径を有するフィルタでろ過する工程と、
   ｊ）前記精製組み換えレンチウイルスベクターを回収する工程と、
   を含んでなる、方法。
4. 前記組み換えレンチウイルスベクターが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２偽型、ＨＩＶ−１／ＳＩＶ、ＦＩＶ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ＨＩＶおよびその偽型から選択される組み換えレンチウイルスベクター（ｒＬＶ）、または水疱性口内炎ウイルスＧ偽型レンチウィルス（ＶＳＶＧ偽型）ベクターから選択される組み換えレンチウイルスベクターを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記導入遺伝子が、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、およびｓｈＲＮＡを含んでなる群から選択される核酸をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記導入遺伝子が、インシュリン、グルカゴン、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポイエチン、アンギオスタチン、果粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子α （ＴＧＦα）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ−３およびＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、ネトリン−１およびネトリン−２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、およびチロシンヒドロキシラーゼで構成される群から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記導入遺伝子が、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン類（ＩＬ１からＩＬ１７）、単球走化性タンパク質、白血病阻止因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ、インターフェロンα、β、およびγ、幹細胞因子、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）、ＣＣＲ５、ならびにクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子で構成される群から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記導入遺伝子が、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノコハク酸シンセターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸加水分解酵素、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ１アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオニンベータシンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インシュリン、ベータグルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、Ｈタンパク質、Ｔタンパク質、嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、およびジストロフィンｃＤＮＡ配列で構成される群から選択される、骨内の代謝エラーの修正に有用なタンパク質をコードする核酸を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記導入遺伝子が、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記導入遺伝子が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記導入遺伝子が、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＥＡ、ＥＧＦ−ＲＩＩＩ（上皮成長因子受容体変異型３）ＥＧＰ−２、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−Ｂ２、３、４、ＦＢＰ、胎児アセチルコリン受容体、ＧＤ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ｋ−軽鎖、ＬｅＹ、Ｌ１細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、メソテリン、ＭＵＣ１、ＮＫＧ２Ｄ、がん胎児抗原（ｈ５Ｔ４）、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ｍＡｂ ＩｇＥ標的ＴＡＡ、ＴＡＧ−７２、またはＶＥＧＦ−Ｒ２で構成される群から選択される遺伝子産物をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記組み換えレンチウィルスベクターが哺乳類細胞により産生される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記組み換えレンチウィルスベクターが、ＨＥＫ ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）、ＨＥＫ２９３Ｆ（ライフテクノロジーズ）、ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ）、２９３Ｓ（ＡＴＣＣ）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ）、ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ）、ＣＨＯ／ｄｈＦｒ−（ＡＴＣＣ）ｌ、またはＣＨＯ Ｋ１（ＡＴＣＣ）の細胞により産生される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記無血清懸濁培養物が無血清細胞増殖培地を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記無血清増殖培地が、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）、ＳＦＭ４Ｔｒａｎｓｆｘ−２９３（ＨｙＣｌｏｎｅTM、サーモサイエンティフィック）、ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３（ＨｙＣｌｏｎｅTM、サーモサイエンティフィック）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４ＳＦＭ（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）、２９３ＳＦＭ ＩＩ（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）、およびＣＤ２９３（ＧｉｂｃｏR、ライフテクノロジーズ）から選択される請求項１６に記載の方法。
16. 前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記ヌクレアーゼが、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記ヌクレアーゼが、ベンゾナーゼ（商標）またはＤＮａｓｅを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが、強または弱陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記陰イオン交換カラムが、四級化ポリエチレンイミン系樹脂、または四級アミン系樹脂を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記陰イオン交換カラムが、ポリエチレンイミン系樹脂、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）系樹脂、またはジエチルアミノプロピル系樹脂を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記陰イオン交換カラムが、ヒドロキシアパタイト（（Ｃａ5（ＰＯ4）3ＯＨ）2）系樹脂、Ｎ−ベンジル−ｎ−メチルエタノールアミン系樹脂、またはオクチルアミン系樹脂を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが、
    ｉ）ステップｃのろ液を、ＰＥＧを随意に含んでなる結合溶液に調整し、前記ろ液を前記陰イオン交換カラムに接触させることによって前記組み換えレンチウイルスベクターを前記陰イオン交換カラムに結合させる工程と、
    ｉｉ）不純物を除去するために、ＰＥＧを含んでなる洗浄溶液、またはＰＥＧと塩を含んでなる溶液で、結合した前記組み換えレンチウイルスベクターを洗浄する工程と、
    ｉｉｉ）溶出溶液を用いて、前記陰イオン交換カラムから前記組み換えレンチウイルスベクターを溶出させる工程と、
    を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記結合溶液が、０％から１０％重量／容積、または０％から５％重量／容積、または０％から２％重量／容積の量のＰＥＧを含んでなる請求項２３に記載の方法。
25. 前記結合溶液が、２，０００ｋＤａから４０，０００ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含んでなる請求項２３に記載の方法。
26. 前記洗浄溶液が、１％から１０％重量／容積、または１％から５％重量／容積、または１％から２％重量／容積の量のＰＥＧを含んでなる請求項２３に記載の方法。
27. 前記洗浄溶液が、２，０００ｋＤａから４０，０００ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含んでなる請求項２３に記載の方法。
28. 前記溶出溶液が、０％から２０％重量／容積の量のＰＥＧを含んでなる請求項２３に記載の方法。
29. 前記溶出溶液が、２，０００ｋＤａから４０，０００ｋＤａの分子量を有するＰＥＧを含んでなる請求項２３に記載の方法。
30. 前記結合溶液、洗浄溶液、または溶出溶液が塩をさらに含んでなる、請求項２３ないし２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記溶出溶液が、５００ｍＭから１，０００ｍＭの量の塩を含んでなる、請求項２３ないし２９のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記塩が、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含んでなる、請求項３０または３１に記載の方法。
33. 工程ｈのろ過が孔径０．２０μｍのフィルタを用いて行われる、請求項１または２に記載の方法。
34. 工程ｈのろ過が孔径０．２２μｍのフィルタを用いて行われる、請求項１または２に記載の方法。
35. 工程ｈのろ過が孔径０．４５μｍのフィルタを用いて行われる、請求項１または２に記載の方法。
36. 前記組み換えレンチウイルスベクターが１×１０⁵〜１×１０⁹感染単位（ＩＵ）／ｍｌで産生される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記組み換えレンチウイルスベクターが６×１０⁶＋／−１０％感染単位（ＩＵ）／ｍｌで産生される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記組み換えレンチウイルスベクターが３×１０⁸＋／−１０％感染単位（ＩＵ）／ｍｌで産生される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
39. 請求項１ないし４８のいずれか１項に記載の精製方法を実行する工程を含む、組み換えレンチウイルスベクターの生産方法。
40. 工程ｉのろ過が孔径０．２０μｍのフィルタを用いて行われる、請求項３に記載の方法。
41. 工程ｉのろ過が孔径０．２２μｍのフィルタを用いて行われる、請求項３に記載の方法。
42. 工程ｉのろ過が孔径０．４５μｍのフィルタを用いて行われる、請求項３に記載の方法。