CN109251939A - Il-17g-197a慢病毒表达载体、其构建方法及慢病毒的包装测定方法 - Google Patents

Il-17g-197a慢病毒表达载体、其构建方法及慢病毒的包装测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于表达载体技术领域，具体涉及一种IL‑17G‑197A慢病毒表达载体、其构建方法及慢病毒的包装测定方法，所述表达载体是将IL‑17G‑197A插入慢病毒载体pL6‑TO‑V5‑GIM构建而成，利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，可以高水平的表达效应分子，在转基因IL‑17G‑197A研究及市场化过程中具有潜在、广泛应用前景。

Description

IL-17 G-197A慢病毒表达载体、其构建方法及慢病毒的包装 测定方法
技术领域
本发明属于表达载体技术领域，具体涉及一种IL-17 G-197A慢病毒表达载体、其构建方法及慢病毒的包装测定方法。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
肝移植(LT)被认为是治疗终末期肝病(ESLD)的唯一有效治疗方法。ESLD的日益流行导致更多的患者在肝移植中进行肝移植，从而增加了对可移植的移植物的需求。然而，随着ESLD患者和供体肝移植之间的差异越来越大，可能导致20％-30％的患者因器官供应有限而死亡和疾病进展。因此，确保在每个潜在的接受者中获得成功是极其重要的。
肝移植后的预后良好，主要归功于免疫抑制药物的临床应用。然而，由于个体差异对免疫抑制反应造成的免疫抑制不足或过度免疫抑制，导致免疫排斥、移植物功能障碍和肝移植后的感染。为了平衡免疫抑制效果和副作用，建议采用个性化的免疫抑制疗法，作为提高肝移植成功率的有效策略。目前，环孢霉素(CNIs)，如环孢霉素和tacrolimus是常见的基本免疫抑制剂，具有狭窄的治疗窗口的特点，容易产生副作用和个体差异。CNIs的临床应用在治疗药物监测(TDM)的指导下，不幸的是，TDM是根据血液浓度对药物剂量进行被动调整的，它有一些缺点，如滞后性和局限性。
CNIs通过对活化T细胞(NFAT)的核因子进行免疫抑制作用。NFAT可以调节各种细胞因子的表达，并影响接受者的免疫状况，这可能与CNIs的不同功效有关。众所周知，T辅助细胞(Th)可以分泌各种细胞因子，而免疫调节的不平衡在免疫排斥反应中扮演着关键的角色。白介素17(IL-17)是由Th17细胞分泌的，与许多自身免疫性疾病有关，包括风湿性关节炎(RA)、炎症性肠病和哮喘。先前的研究表明，受调节的IL-17与肾移植后的早期排斥有关，可能是排斥的早期监测指标。值得注意的是，一些报告聚焦于IL-17的单核苷酸多态性(SNP)，并证明了SNP rs2275913(G-197A)与RA、溃疡性结肠炎和急性抗宿主病(GVHD)的进展有关。很少有研究rs2275913(G-197A)对环孢霉素的作用及其机制的影响进行了研究。
有研究回顾接受肝移植的患者，并对其与环孢霉素的代谢和接受者的结果进行了评估。并探讨IL-17对孕烷X受体(PXR)表达的影响，以及其目标基因细胞色素P450(CYP)3A4和CYP3A5，进一步了解环孢霉素代谢中IL-17多态性的机制。
白细胞介素17(interleukin 17，ILl7)属IL-17家族，是一种主要由活化的CD4+Thl7细胞和中性粒细胞分泌产生的前炎症细胞因子，是炎症反应的早期启动因子。同时IL-17是Thl7细胞的主要效应因子，是一种强效的致炎细胞因子，可以激活T细胞，刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子如IL-6、IL-8、粒细胞.巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和化学增活素及细胞黏附分子l(cellular adhesion molecule1,CAM-1)，从而导致炎症的产生。IL-17通常以同源二聚体的形式存在，分子量为15kDa。IL-17是一条由155个氨基酸组成的多肽，C端相对保守，有一个折叠的半胱氨酸结，N端为可变区，氨基酸序列差异很大，由19～23个残基组成，主要与信号转导有关，与松鼠猴属疱疹病毒的一个开放阅读窗(HSVl3)序列具有72％的同源性。IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(IL-25)和IL-17F是IL-17的6个家族成员。其中，IL-17A和IL-17F基因定位于6p12，有50％的同源性，而IL-17B、C、D仅有16％～30％的同源性。IL-17A和IL-17F不仅在结构上很相似，而且在调控、信号通路方面也很相似。既往研究结果显自身免疫性疾病中患者血清中IL-17水平明显升高，如多发性硬化(MS)、哮喘、类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮和同种异体移植排斥反应等，而且在炎症性肠病、HP感染、乙肝病毒感染和病因不明的前列腺炎等与肿瘤相关的炎症疾病中IL-17的表达也显著升高。
发明内容
本发明主要提供了一种IL-17 G-197A慢病毒表达载体、其构建方法及慢病毒的包装测定方法，将IL-17 G-197A基因与慢病毒载体结合，利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，可以高水平的表达效应分子。其技术方案如下：
一种IL-17 G-197A慢病毒表达载体，所述表达载体是将IL-17 G-197A插入慢病毒载体pL6-TO-V5-GIM构建而成。
优选的，慢病毒载体pL6-TO-V5-GIM通过BamHI和NheI酶切获得。
优选的，IL-17 G-197A的扩增模板基因为NR1I2基因，扩增引物为QPCR引物，其正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示。
一种IL-17 G-197A慢病毒表达载体的构建方法，具体的为，制备IL-17 G-197A基因片段PCR反应体系，进行PCR扩增，然后用PCR产物酶切并回收纯化，得目的基因片段，将目的基因与骨架载体pL6-TO-V5-GIM连接，然后转染至感受态细菌DH5α内，抽提制粒即得IL-17 G-197A慢病毒表达载体。
优选的，具体方法为：
(1)制备IL-17 G-197A基因片段PCR反应体系：共计50μL，
各组分反应体系如下：
其中，QPCR-F序列如SEQ ID NO:1所示，QPCR-R序列如SEQ ID NO:2所示；
(2)进行PCR扩增，扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃30S，55℃45S，30个循环；68℃3min，68℃10min，1个循环；
(3)PCR产物酶切并回收纯化：水浴37℃2小时，酶切后割胶回收纯化，得目的基因片段；
(4)骨架载体制备：共计50μL，各组分反应体系如下：
(5)目的基因片段与骨架载体连接：共计10μL，各组分反应体系如下：
将反应体系放置恒温仪上进行连接反应，连接条件：16℃,过夜连接；
(6)转染：将连接产物转化感受态细菌DH5α，涂板过夜培养，从平板上随机挑选完全落单的菌落，用菌检PCR方法检测，挑取阳性克隆测序炎症。
(7)抽提制粒。
一种IL-17 G-197A慢病毒的包装方法，包括以下步骤：
(1)取处于对数生长期的293T细胞，用0.05-0.25％胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜；
(2)第二天确认细胞状态，并在转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；
(3)质粒混合：取9μg Packaging Mix和3μg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，混匀；
(4)Lipo稀释：取36μl lipofectamine2000加入另外的1.5ml Opti-MEM中，混匀，室温放置5min；
(5)质粒脂质体复合物制备：将步骤(3)与步骤(4)所得的溶液混匀；
(6)转染：将3ml质粒脂质体复合物加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃、5％CO2的培养箱中孵育6个小时后，更换完全培养液DMEM+10％FBS；
(7)病毒液收集：48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45um的滤器过滤；
(8)浓缩：将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1ml DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用。
一种IL-17 G-197A慢病毒毒液滴度的测定方法，包括以下步骤：
1)将293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含有8ug/ml polybrene和10％FBS的细胞培养基；
2)细胞胰酶消化计数后，按照每孔2×105细胞接种于24孔板，同时加入IL-17 G-197A慢病毒1μL，0.1μL，0.01μL，放置于CO2培养箱，48h后流式细胞仪检测荧光比率，并计算病毒滴度。
采用上述方案，本发明具有以下优点：
IL-17 G-197A为IL-17的197位点中G碱基突变成A碱基的基因序列所表达的细胞因子，将这一基因与慢病毒载体连接，该体系下病毒包装率高，通过病毒载体与质粒共转染法进行细胞转染，细胞转染率大大提高。
附图说明
图1为含有IL-17 G-197A慢病毒表达载体的原件示意图；
图2为病毒载体转染实验24小时后，在荧光显微镜下同一视野的荧光(a)和可见光(b)的结果图；
图3为病毒侵染靶细胞筛选后同一视野的荧光(a)和可见光(b)的结果图。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。
以下试验中所涉及到的部分试剂为：包装质粒Packaging Mix(诺百公司)；293T细胞(诺百公司)；0.05％Trypsin(25200-072,IVGN)；DMEM(SH30023.01B,HyClone/Thermo)，FBS(S1810-500,Biowest南美血源)；lipofectamine 2000(11668-019,IVGN)；Opti-MEM(31985,GIBCO)；
1.IL-17 G-197A慢病毒表达载体的构建
(1)制备IL-17 G-197A基因片段PCR反应体系：共计50μL，
各组分反应体系如下：
其中，QPCR-F序列如SEQ ID NO:1所示，QPCR-R序列如SEQ ID NO:2所示，NR1I2基因模板为IL-17 G-197A基因。50μL的PCR反应体系中，10×Buffer优选值为5μL，MgSO4(50mM)优选值为1.0μL，dNTP(10mM)优选值为1.5μL，引物F(10μM)优选值为1.5μL，引物R(10μM)优选值为1.5μL，NR1I2基因模板10ng，其优选值为1.0μL，platimum Taq Polymerase 1U优选值为1.0μL，ddH2O其优选值为37.5μL。
(2)进行PCR扩增，扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃30S，55℃45S，30个循环；68℃3min，68℃10min，1个循环；
(3)PCR产物酶切并回收纯化：水浴37℃2小时，酶切后割胶回收纯化，得目的基因片段；
(4)骨架载体制备：共计50μL，各组分反应体系如下：
其中，慢病毒载体为pL6-TO-V5-GIM；
(5)目的基因片段与骨架载体连接：共计10μL，各组分反应体系如下：
将反应体系放置恒温仪上进行连接反应，连接条件：16℃,过夜连接；图1为含有IL-17 G-197A慢病毒表达载体的原件示意图；
(6)转染：将连接产物转化感受态细菌DH5α，涂板过夜培养，从平板上随机挑选完全落单的菌落，用菌检PCR方法检测，挑取阳性克隆测序炎症。
(7)抽提制粒。
2.IL-17 G-197A慢病毒的包装
(1)取处于对数生长期的293T细胞，用0.05-0.25％胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜；
(2)第二天确认细胞状态，并在转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；
(3)质粒混合：取9μg Packaging Mix和3μg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，混匀；
(4)Lipo稀释：取36μl lipofectamine2000加入另外的1.5ml Opti-MEM中，混匀，室温放置5min；
(5)质粒脂质体复合物制备：将步骤(3)与步骤(4)所得的溶液混匀；
(6)转染：将3ml质粒脂质体复合物加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃、5％CO2的培养箱中孵育6个小时后，更换完全培养液DMEM+10％FBS；图2为病毒载体转染实验24小时后，在荧光显微镜下同一视野的荧光(a)和可见光(b)的结果图；
(7)病毒液收集：48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45um的滤器过滤；
(8)浓缩：将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1ml DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用。
3.IL-17 G-197A慢病毒毒液滴度测定
(1)将293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含8ug/ml polybrene和10％FBS的细胞培养基。
(2)细胞胰酶消化计数后，按照每孔2×105细胞接种于24孔板，同时加入病毒1μL，0.1μL，0.01μL。放置于CO2培养箱，48hr后流式细胞仪检测荧光比率，并计算病毒滴度；图3为病毒侵染靶细胞筛选后同一视野的荧光(a)和可见光(b)的结果图，由图3可知，病毒侵染靶细胞的侵染率高。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 孙搏
<120> IL-17 G-197A慢病毒表达载体及其构建方法
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtacactgtg aggacacaga gtc 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcatccttca catgtcatga cattg 25

Claims (7)

1.一种IL-17 G-197A慢病毒表达载体，其特征在于：所述表达载体是将IL-17 G-197A插入慢病毒载体pL6-TO-V5-GIM构建而成。
2.根据权利要求1所述的IL-17 G-197A慢病毒表达载体，其特征在于：慢病毒载体pL6-TO-V5-GIM通过BamHI和NheI酶切获得。
3.根据权利要求1所述的IL-17 G-197A慢病毒表达载体，其特征在于：IL-17 G-197A的扩增模板基因为NR1I2基因，扩增引物为QPCR引物，其正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示。
4.一种权利要求1所述IL-17 G-197A慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：方法为，制备IL-17 G-197A基因片段PCR反应体系，进行PCR扩增，然后用PCR产物酶切并回收纯化，得目的基因片段，将目的基因与骨架载体pL6-TO-V5-GIM连接，然后转染至感受态细菌DH5α内，抽提制粒即得IL-17 G-197A慢病毒表达载体。
5.根据权利要求4所述IL-17 G-197A慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：具体方法为：
(1)制备IL-17 G-197A基因片段PCR反应体系：共计50μL，各组分反应体系如下：
其中，QPCR-F序列如SEQ ID NO:1所示，QPCR-R序列如SEQ ID NO:2所示；
(2)进行PCR扩增，扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃30S，55℃45S，30个循环；68℃3min，68℃10min，1个循环；
(3)PCR产物酶切并回收纯化：水浴37℃2小时，酶切后割胶回收纯化，得目的基因片段；
(4)骨架载体制备：共计50μL，各组分反应体系如下：
(5)目的基因片段与骨架载体连接：共计10μL，各组分反应体系如下：
将反应体系放置恒温仪上进行连接反应，连接条件：16℃,过夜连接；
(6)转染：将连接产物转化感受态细菌DH5α，涂板过夜培养，从平板上随机挑选完全落单的菌落，用菌检PCR方法检测，挑取阳性克隆测序炎症。
(7)抽提制粒。
6.一种IL-17 G-197A慢病毒的包装方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取处于对数生长期的293T细胞，用0.05-0.25％胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜；
(2)第二天确认细胞状态，并在转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；
(3)质粒混合：取9μg Packaging Mix和3μg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，混匀；
(4)Lipo稀释：取36μl lipofectamine2000加入另外的1.5ml Opti-MEM中，混匀，室温放置5min；
(5)质粒脂质体复合物制备：将步骤(3)与步骤(4)所得的溶液混匀；
(6)转染：将3ml质粒脂质体复合物加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃、5％CO2的培养箱中孵育6个小时后，更换完全培养液DMEM+10％FBS；
(7)病毒液收集：48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45um的滤器过滤；
(8)浓缩：将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于1ml DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用。
7.一种IL-17 G-197A慢病毒毒液滴度的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为含有8ug/ml polybrene和10％FBS的细胞培养基；
2)细胞胰酶消化计数后，按照每孔2×105细胞接种于24孔板，同时加入IL-17 G-197A慢病毒1μL，0.1μL，0.01μL，放置于CO2培养箱，48h后流式细胞仪检测荧光比率，并计算病毒滴度。
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