CN111647614B - 一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种产犬α‑干扰素的重组菌的构建方法及其应用。本发明实施例还提供一种犬α‑干扰素的制备方法，其包括以下步骤：将所述的构建方法得到的产α‑干扰素的重组菌进行发酵培养，得到发酵产物，从发酵产物中制得α‑干扰素。本发明实施例中，表达犬α‑干扰素的重组菌株，首先目的基因合成时，将其31位的碱基由C变为T，这样后期翻译的氨基酸就由精氨酸转换为半胱氨酸，同时在3’端设计加入了半胱氨酸序列，半胱氨酸作用为可形成二硫键，改变蛋白空间构象，促进目的蛋白的可溶性表达。

Description

一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法及其应用
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种产犬α-干扰素蛋白的重 组菌的构建方法及其应用。
背景技术
干扰素(IFN)是一类非常重要的细胞因子，它可以抵抗病毒感染，抑制 肿瘤生长和调节机体免疫功能的作用。IFN蛋白家族基于它们的基因序列、 染色体定位和受体特异性分为三型：I型包括IFN-α，-β，-ε，-ω，-κ等亚型； II型干扰素由单基因家族IFN-γ构成，又称为免疫干扰素；Ⅲ型是一种新发现 的细胞因子，称为IFN-λ。其中IFN-α的抗病毒活性最强，α干扰素(IFN-α) 分子的不同亚型由165～172个氨基酸组成，分子量约在19kDa左右。
目前，犬干扰素IFN-α、IFN-β、IFN-γ亚型均已有基因序列报道， 并在原核或真核表达系统中实现重组表达，表达产物具有抗病毒活性。但是， 现有技术中，重组犬α干扰素的表达率低、表达量低以及比活性低的问题。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法及其应 用，以解决现有技术中重组犬α干扰素的表达率低、比活性低问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法，包括将犬α-干扰素基因的上 游端连接酰基载体蛋白基因，下游端连接麦芽糖结合蛋白基因形成含犬α-干 扰素基因融合基因，将所述融合基因导入大肠杆菌，得到所述产犬α-干扰素 的重组菌。
优选的，所述犬α-干扰素基因为如下a1)或a2)或a3)：
a1)如SEQ ID NO：1所示的序列；
a2)严格条件下与a1)限定的DNA分子杂交且编码所述α-干扰素的DNA 分子；
a3)与a1)或a2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述α -干扰素的DNA分子。
优选的，所述犬α-干扰素基因通过重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP 导入所述大肠杆菌；
所述重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP为将所述融合基因的DNA分 子替换XhoI和Nde I酶切位点之间的小片段得到的载体。
优选的，所述重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP构建过程为：
将所述α-干扰素基因DNA分子替换pET30a(+)载体Xho I和Nde I酶切 位点之间的小片段得到重组表达载体pET-CaIFN-α；
将所述酰基载体蛋白基因DNA分子插入到所述重组表达载体pET-CaIFN- α的XhoI酶切位点处得到重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α；
将麦芽糖结合蛋白基因DNA分子插入到所述重组表达载体 pET-ACP-CaIFN-α的Nde I酶切位点处得到重组表达载体 pET-ACP-CaIFN-α-MBP。
优选的，所述大肠杆菌为DH5α。
如下(1)或(2)所述生物材料：
(1)权利要求1-5任一所述方法构建得到的产犬α-干扰素的重组菌；
(2)权利要求2所述的犬α-干扰素基因；以及
含有所述犬α-干扰素基因的表达盒、重组载体和重组菌，也属于本发明 实施例保护的范围。
所述的生物材料在制备犬α-干扰素中的应用，也属于本发明实施例保护 的范围。
本发明实施例还提供一种犬α-干扰素的制备方法，其包括以下步骤：将 所述的构建方法得到的产α-干扰素的重组菌进行发酵培养，得到发酵产物， 从发酵产物中制得α-干扰素。
优选的，所述发酵培养的方法包括以下步骤：将权利要求1-5任一所述的 方法构建得到的产α-干扰素的重组菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB培 养基中，于37℃振荡培养至OD600达到0.6～1.0，加IPTG至终浓度为 1mmol/L诱导培养5h。
优选的，所述LB培养基中，添加质量分数为0.6％的甘氨酸。
本发明实施例的犬α-干扰素的重组菌BL21(DE3)/pETCaIFN-α，该重组 菌pET-ACP-CaIFN-α-MBP为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，于2019年 11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No.18944。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例中，表达犬α-干扰素的重组菌株，首先目的基因合成时，将 其31位的碱基由C变为T，这样后期翻译的氨基酸就由精氨酸转换为半胱氨 酸，同时在3’端设计加入了半胱氨酸序列，半胱氨酸作用为可形成二硫键， 改变蛋白空间构象，促进目的蛋白的可溶性表达。
本发明实施例利用分子克隆技术构建pET-ACP-CaIFN-α-MBP融合表达载 体，其中ACP为酰基载体蛋白为大肠杆菌基因组中的一个酸性短肽，由77个 氨基酸组成的小分子肽链，它第37位的丝氨酸残基与它的辅基(磷酸泛酰巯 基乙胺)上的磷酸基团相连，其辅基另一端的－SH基又与脂酰基通过硫脂键 相连从而使ACP携带上脂酰基。大肠杆菌ACP可促进蛋白质的溶解性，其 具备酸性蛋白融合标签的几个关键特性，如分子小、酸度大和细菌内源性。
MBP标签不仅可以促进蛋白质的溶解性，促溶范围广、效率高、易于纯 化，并且与目的蛋白分离后，目的蛋白很容易恢复其天然构象，可增加目的 蛋白的稳定性。在菌株发酵过程中，在培养基中添加了甘氨酸，其作用一方 面可以提高目的蛋白表达量，另一方面可以促进蛋白以可溶形式表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将 对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见 地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在 不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附 图。
图1为本发明实施例提供的重组表达载体pET-CaIFN-α双酶切图，其中， M：DL5000marker，1:酶切片段，2：水对照；
图2为本发明实施例提供的重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α的PCR产物 电泳图，其中，M：DL1500marker，1：ACP-CaIFN-αDNA片段的PCR产物， 2：水对照；
图3为本发明实施例提供的重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP的 PCR产物电泳图，其中，M：DL2000marker；1：ACP-CaIFN-α-MBP片段的 PCR产物；2：水对照；
图4为本发明实施例提供的α-干扰素目的蛋白的电泳图，其中，M：蛋 白Marker；1～6：分别为第1代、第1代、第15代、第20代、第25代和第 30代pET-ACP-CaIFN-α-MBP重组菌；7：未诱导表达菌体；
图5为本发明实施例的96孔细胞培养板加样示意图；
图6为本发明实施例的不同处理方法构建的重组表达载体的蛋白表达量 的SDS-PAGE电泳检测图，其中，泳道1：D1重组菌株；泳道2：D2重组菌 株；泳道3：D3重组菌株；泳道4：D4重组菌株、泳道5：pET-ACP-CaIFN- α-MBP重组菌株培养发酵过程培养基中未添加0.6％的甘氨酸；泳道6：pET- ACP-CaIFN-α-MBP重组株；M:蛋白Marker。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可 由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描 述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，比酶活力定义：每毫克蛋白所具有的酶活力单位 (U/mg)。
本发明实施例中，大肠杆菌DH5α购于北京索莱宝科技有限公司。
本发明实施例中，pET30a(+)购于购于北京索莱宝科技有限公司。
实施例1、重组表达载体pET-CaIFN-α的构建
1、α-干扰素基因合成与改造
(1)参照犬α-干扰素基因序列(Genbank登录号：NP_001006655.1)，将 α-干扰素基因序列的31位的碱基由C变为T，并在5’端加上NdeI酶切位点 CATATG，3’端加上入(TGT)，并加上XhoI酶切位点CTCGAG，送至北京 诺赛基因组研究中心有限公司进行全基因合成。改造后的α-干扰素的基因序 列如SEQ ID NO：1所示。改造后的α-干扰素的氨基酸序列如SEQ IDNO：2 所示。
(2)设计犬α-干扰素的基因引物：根据上述犬α-干扰素基因序列设计引 物，上游引物5’端引入NdeI酶切位点CATATG，下游引物3’端引入XhoI酶 切位点CTCGAG，表1生物引物序列下：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所 示。
表1
序号 引物名称 核苷酸序列(5’-3’)
SEQ ID NO：3 MF1 GTTCATATGATGTGCTACCTGGCGGACA
SEQ ID NO：4 MR1 AGCCTCGAGCGTTTTACGACGACGGATACG
2、重组表达载体pET-CaIFN-α的构建
(1)犬α-干扰素的基因酶切：用限制性内切酶Nde I和Xho I对合成的犬α- 干扰素干扰素基因PCR产物进行双酶切，酶切体系(20μl)：犬α-干扰素基因 1μl，Nde I 1μl，Xho I1μl，10×Buffer 2μl，ddH2O 15μl，在冰上操作，混合 后于37℃酶切2h。酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒进行胶 回收并纯化。
(2)载体酶切：选用载体pET30a(+)，用限制性内切酶Nde I和Xho I对载 体pET30a(+)双酶切，酶切体系(20μl)：pET30a(+)1μl，Nde I 1μl，Xho I 1μl，10×Buffer 2μl，ddH2O 15μl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。
(3)犬α-干扰素基因与载体pET30a(+)的连接：将犬α-干扰素基因酶切产 物和载体pET30a(+)酶切产物用T4连接酶进行连接，连接体系(10μl)： 10×Buffer 1μl，pET30a(+)酶切产物2μl，犬α-干扰素基因酶切产物2μl，T4 DNA ligase 1μL，ddH2O 4μl，在冰上操作，混合后于16℃连接过夜。
(4)转化：取10μl连接产物加入到含100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞 的离心管中，混匀后冰浴30min，转到42℃恒温水浴热击90s，取出后立即冰 浴2min，向每个离心管中加入LB液体培养基500μl，于37℃，200r/min培 养1h，取100μl涂布含有卡那霉素的平板，37℃倒置培养过夜14h。
(5)质粒提取：挑取平板上的单菌落，接种到含有卡那霉素的LB液体培 养基，于37℃，200r/min培养12h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒， 用Nde I与Xho I双酶切重组质粒，经琼脂糖电泳出现约5kb的pET30a(+)载 体条带和500bp的外源片段，大小与预期完全符合，将酶切鉴定正确的质粒 送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，结果与预期序列一致，该重组载 体命名为pET-CaIFN-α，酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果见图1所示。
实施例2、重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α
(1)ACP基因合成：参照ACP基因序列(GenBank登录号： NC_000913,1151614..1151845nt)，在ACP的3’端引入TEV蛋白酶识别位点(GAAAATCTTTACTTTCAAGGAGGA)和两个甘氨酸(GGAGGA)，并在两端 加上XhoI酶切位点CTCGAG，进行ACP基因合成。ACP基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO：5所示。表2为合成ACP引物序列，如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。
表2
Figure BDA0002351454090000071
(2)ACP基因酶切：用限制性内切酶Xho I对合成的ACP基因进行酶 切，酶切体系(20μl)：ACP基因1μl，Xho I 1μl，10×Buffer 2μl，ddH2O 16μl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。
(3)重组质粒pET-CaIFN-α酶切：用限制性内切酶Xho I对pET-CaIFN-α 质粒进行酶切，酶切体系(20μl)：pET-CaIFN-α质粒1μl，Xho I 1μl， 10×Buffer 2μl，ddH2O 16μl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。
(4)连接：ACP基因酶切产物和载体pET-CaIFN-α质粒的Xho I酶切回 收产物在T4连接酶的作用下16℃连接过夜，连接体系(10μl)：10×Buffer 1μl，ACP基因酶切产物2μl，pET-CaIFN-α酶切产物2μl，T4 DNA ligase 1μL，ddH2O 4μl。
(5)转化：将10μl连接产物加入到含100μl大肠杆菌DH5α感受态细 胞的离心管中，放置冰上30min，转到42℃恒温水浴热击90s，取出后立即冰 浴2min，向每个离心管中加入LB液体培养基500μl，于37℃，200r/min培 养1h，取100μl涂布含有卡那霉素的平板，37℃倒置培养14h。
(6)质粒提取：挑取平板上的单菌落，接种到含有卡那霉素的LB液体 培养基，于37℃，200r/min培养12h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质 粒，命名为pET-ACP-CaIFN-α。
(7)鉴定：以pET-ACP-CaIFN-α为模板，以ACP上游引物(ACPF1)、犬 α-干扰素下游引物(MF1)进行PCR扩增。PCR体系(50μl)：DNA模板2μl，ACPF1 2μl，MF2 2μl，PCR Mix 9μl，ddH2O 35μl。PCR条件：94℃预变性 2min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃ 延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，ACP-CaIFN-α片段约为754bp，琼脂糖凝结电泳结果见图2。
实施例3、重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP构建
(1)MBP基因合成参照pAB-MBPTM序列，在5’端引入Factor Xa特异 性识别位点(ATTGAAGGAAGA)，并在两端加上NdeI酶切位点CATATG， 同时合成MBP基因引物序列如下表3。SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所 示。
表3
Figure BDA0002351454090000081
(2)MBP基因酶切：用限制性内切酶NdeI对合成的MBP基因酶切，酶 切体系(20μl)：MBP基因1μl，NdeI 1μl，10×Buffer 2μl，ddH2O 16μl，在 冰上操作，混合后于37℃酶切2h。
(3)重组质粒pET-ACP-CaIFN-α酶切：用限制性内切酶NdeI对pET-ACP -CaIFN-α质粒双酶切，酶切体系(20μl)：pET-ACP-CaIFN-α质粒1μl，NdeI 1μl，10×Buffer 2μl，ddH2O16μl，在冰上操作，混合后于37℃酶切2h。
(4)连接：将MBP基因和重组载体pET-ACP-CaIFN-α质粒酶切产物用 T4连接酶进行连接，连接体系(10μl)：10×Buffer 1μl，pET-ACP-CaIFN-α 酶切产物2μl，MBP基因酶切产物2μl，T4 DNA连接酶1μL，ddH2O 4 μl，在冰上操作，混合后于16℃连接过夜。
(5)转化：取10μl连接产物加入到含100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受 态细胞的离心管中，混匀后冰浴30min，转到42℃恒温水浴热击90s，取出 后立即冰浴2min，向每个离心管中加入LB液体培养基500μl，于37℃，200 r/min培养1h，取100μl涂布含有卡那霉素的平板，37℃倒置培养过夜14h。
(6)质粒提取：挑取平板上的单菌落，接种到含有卡那霉素的LB液体 培养基，于37℃，200r/min培养12h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质 粒，命名为重组载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP。
(7)鉴定：以pET-ACP-CaIFN-α-MBP为模板，以ACP上游引物(ACPF1) 和MBP下游引物(MBP R2)进行PCR扩增。PCR体系(50μl)：DNA模板2 μl，ACPF1 2μl，MBP R2 2μl，PCR Mix9μl，ddH2O 35μl。PCR条件：94℃ 预变性2min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最 后72℃延伸10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，ACP-CaIFN-α-MBP 片段约为1854bp，琼脂糖凝结电泳的结果见图3所示。
该重组菌pET-ACP-CaIFN-α-MBP为埃希氏菌属(Escherichia)、大肠杆 菌种(coli)，于2019年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所，保藏编号为CGMCCNo.18944。
实施例4、重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP蛋白表达
1、重组菌的诱导表达pET-ACP-CaIFN-α-MBP质粒转化BL21(DE3)， 挑取单个菌落，接种至适量的含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，培养基按 比例添加0.6％的甘氨酸，于37℃振荡培养至OD600达到0.6～1.0，加IPTG至 终浓度为1mmol/L，继续培养5h。培养结束后，8000r/min离心10分钟收集 菌体，进行SDS-PAGE检测，同时设置对照组如下：D1-D4菌株的构建方法 参照实施例1中重组表达载体pET-CaIFN-α的构建方法。
其中，D1重组菌株：未作突变、3’端未引入半胱甘酸的CaIFN-α与载体 pET30a(+)连接的构建的表达菌株pET-CaIFN-α；D2重组菌株：未作突变、3’ 端引入了半胱甘酸的CaIFN-α与载体pET30a(+)连接的构建的表达菌株 pET-CaIFN-α2；D3重组菌株31位的碱基由C变为T突变、3’端引入了半胱 甘酸，同时在CaIFN-α上游引入ACP标签表达菌株pET-ACP-CaIFN-α2；D4 重组菌株31位的碱基由C变为T突变、3’端引入了半胱甘酸，同时在CaIFN-α下游引入MBP标签表达菌株pET-CaIFN-α2-MBP。
如图6所示的SDS-PAGE电泳检测图，第5和6泳道目的蛋白得表达量 最高，其中，以第6泳道表达量最高，其是pET-ACP-CaIFN-α-MBP在发酵 过程中培养基中添加了0.6％的甘氨酸。
2、重组蛋白的纯化
(1)将诱导表达后的菌液8000r/min离心10min收集菌体，经PBS缓冲 液洗涤后重悬，低温超声破碎菌体30min，超声3s，间隔3s，于4℃条件 下，10000r/min离心30min，收集上清，经0.22μm膜过滤。
(2)用TEV蛋白酶对重组蛋白进行酶切，将TEV蛋白酶与重组蛋白以 1:10(w/w)的比例混合，25℃酶切8h，加入上样缓冲液终止反应。
(3)镍柱纯化用平衡缓冲液预先平衡镍柱，将上述重组蛋白以0.5 ml/min的速度上样到柱子中，用不同浓度梯度的咪唑缓冲液由低浓度到 高浓(10mM、25mM、50mM、100mM、250mM、500mM)进行洗脱，收 集洗脱下的纯化蛋白。
(4)用蛋白酶Factor Xa对重组蛋白进行酶切将蛋白酶Factor Xa与上 述纯化蛋白以1:50(w/w)的比例混合，25℃酶切5h，加入上样缓冲液终止 反应。
(5)层析柱纯化用平衡缓冲液预先平衡麦芽糖层析柱，将纯化蛋白以 0.3ml/min的速度加入层析柱中，用平衡缓冲液洗脱蛋白，用含5mM麦芽糖 的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用紫外检测仪在280nm波长下进行检测，收集 目标洗脱峰。
3、重组蛋白的western-blot分析：上述重组蛋白SDS-PAGE电泳后，经 100V，70min转至PVDF膜，TBST洗膜2次，1％BSA封闭液37℃封闭1.5h 后TBST洗膜3次，兔源干扰素单克隆抗体作为一抗，加入1:1000稀释液， 4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后加入1:4000稀释的山羊抗兔IgG-HRP二抗， TBS洗膜3次后用DAB显色试剂盒检测，诱导后重组菌体中的重组蛋白为犬 α-干扰素。
4、重组蛋白的检验：
4.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
4.2内毒素含量检测：按现行《中国兽药典》进行检验，内毒素含量≤ 10EU/ml。
4.3蛋白含量检测：采用紫外分光光度计法，测定蛋白含量≥ 3.8mg/ml。
实施例5、α-干扰素的生物学活性测定
1、供试干扰素制品稀释：在无菌条件下，将制备的干扰素制品按标示量 溶解后，用测定培养液稀释至每1ml含1000IU，在96孔细胞培养板中作4倍 系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度作4孔。
2、对照品参考干扰素制品的稀释：在无菌条件下，将参考干扰素制品按标 示量溶解后，用测定培养液稀释至每1ml含1000IU，在96孔细胞培养板中作 4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度作2孔。
3、测定方法：MDCK细胞在培养基中贴壁生长，每周一、三、五传3次， 1：5传代，用完全培养基生长。取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗2次后 消化和收集细胞，用完全培养液配制成每毫升含有2.5×105～3.5×105个细胞的 细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2孵育 4～6h，将稀释完成的待测干扰素制品和对照品参考干扰素制品溶液移入接种 MDCK细胞的培养板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2孵育24h，弃去细胞培养板中的上清液，将保存的水泡性口炎病毒(VSV，-70℃保存)用攻毒培 养液稀释至1000TCID50/ml，每孔100μl，于37℃、5％CO2孵育24h(镜检供 试干扰素制品溶液50％病变点在IU/ml)，然后弃去细胞培养板中的上清液， 每孔加入染色液室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水 分。
96孔细胞培养板加样示意图，如图5所示，注:A1～A10：对照品参考干 扰素制品，B1～B10为A1～A10的重复；C1～C10：供试干扰素制品，D1～D10、E1～E10、F1～F10为C1～C10的重复；A11～E11；MDCK细胞对照孔； A12～E12：VSV病毒对照孔。
4、染色结果观察：将置温箱24h培养物倒置于显微镜下观察，首先观察 细胞对照孔和病毒对照孔中的细胞出现75～100％的明显病变，正常细胞对照 孔中的细胞全部生长良好无病变时，则表明本次实验对照系统合格，否则弃 去重做。
当干扰素保护空CPE不再进展，即可观察结果，将上述细胞板盖打开， 弃去各孔内。液体于消毒液中，家结晶紫染色1～2滴/孔，3～5分钟后用细水 流冲洗孔内残余染色液，干燥后即可记录结果：++++表示全部细胞病变； +++表示75％细胞病变；++表示50％细胞病变；+表示25％细胞病变。按 Reed-Muench法计算干扰素的抗病毒活性≥1.0×108U/mg。
5、比活性：比活性为蛋白质含量与生物学活性之比，比活性≥1.0×108 IU/mg。
6、蛋白纯度测定：重组蛋白SDS-PAGE电泳后，使用Image Lab软件分 析蛋白纯度≥95％。
实施例6、α-干扰素目的蛋白表达的稳定性
用Western-blot血清学方法检测1、10、15、20、25、30代诱导表达后转 基因微生物菌种中蛋白表达情况，检测的6代菌均能鉴定到目的蛋白，而且 每代菌蛋白表达与原始菌株表达图谱一致，表达量相当，稳定性好，检测结 果如图4所示。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是 显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均 属于本发明要求保护的范围。
Figure BDA0002351454090000131
Figure BDA0002351454090000141
Figure BDA0002351454090000151
Figure BDA0002351454090000161
序列表
<110> 北京宝易生物技术有限公司，烟台市宝盈生物技术有限公司
<120> 一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法及其应用
<130> GG19691744A
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 498
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgtgctacc tggcggacac ccacggtcag tgtaactggc gtgttctgac cctgctgggt 60
cagatgcgtc gtctgtctgc tggttcttgc gaccacttca ccaacgactt cgctttcccg 120
aatgaactgt tcgacggtga gcgtctgcag gaagctcagg ctctgtctgt tgttcacgtt 180
atgacccaga aagttttcca cctgttctgc ccggacacct cttctgctcc gtggaacatg 240
accctgctgg atgaactgtg ctctggtctg tctgaacagc tggacgacct ggaagcttgc 300
ccgctgcagg aagctggtca ggctgaaacc ccgctgatgc acgaagactc taccctgcgt 360
acctacttcc agcgtatctc tctggacctg caggaccgta accactctcc gtgcgcttgg 420
gaaatggttc gtgctgaaat cggtcgttct tacttctctt ctaccatcct gcaggaacgt 480
atccgtcgtc gtaaaacg 498
<210> 2
<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Cys Tyr Leu Ala Asp Thr His Gly Gln Cys Asn Trp Arg Val Leu
1 5 10 15
Thr Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His
20 25 30
Phe Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Asn Glu Leu Phe Asp Gly Glu Arg
35 40 45
Leu Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys
50 55 60
Val Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met
65 70 75 80
Thr Leu Leu Asp Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp
85 90 95
Leu Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Gln Ala Glu Thr Pro Leu
100 105 110
Met His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu
115 120 125
Asp Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Gly Arg Ser Tyr Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg
145 150 155 160
Ile Arg Arg Arg Lys Thr
165
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gttcatatga tgtgctacct ggcggaca 28
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agcctcgagc gttttacgac gacggatacg 30
<210> 5
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atgagcacta tcgaagaacg cgttaagaaa attatcggcg aacagctggg cgttaagcag 60
gaagaagtta ccaacaatgc ttctttcgtt gaagacctgg gcgcggattc tcttgacacc 120
gttgagctgg taatggctct ggaagaagag tttgatactg agattccgga cgaagaagct 180
gagaaaatca ccaccgttca ggctgccatt gattacatca acggccacca ggaaaatctt 240
tactttcaag gagga 255
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
taactcgaga tgagcactat cgaagaacgc g 31
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gcgctcgagc ctccttgaaa gtaaagattt tcctggtggc cga 43
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gatcatatga ttgaaggaag atggccgaag aaggt 35
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gatcatatgg agtctgcgcg tgtttcaggg cttcat 36

Claims (9)

1.一种产犬α-干扰素的重组菌的构建方法，包括将犬α-干扰素基因的上游端连接酰基载体蛋白基因，下游端连接麦芽糖结合蛋白基因形成含犬α-干扰素基因融合基因，将所述融合基因导入大肠杆菌，得到所述产犬α-干扰素的重组菌；所述犬α-干扰素基因为如SEQID NO：1所示的序列。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
所述犬α-干扰素基因通过重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP导入所述大肠杆菌；
所述重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP为将所述融合基因的DNA分子替换Xho I和Nde I酶切位点之间的小片段得到的载体。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，
所述重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP构建过程为：
将所述α-干扰素基因DNA分子替换pET30a(+)载体Xho I和Nde I酶切位点之间的小片段得到重组表达载体pET-CaIFN-α；
将所述酰基载体蛋白基因DNA分子插入到所述重组表达载体pET-CaIFN-α的Xho I酶切位点处得到重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α；
将麦芽糖结合蛋白基因DNA分子插入到所述重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α的Nde I酶切位点处得到重组表达载体pET-ACP-CaIFN-α-MBP。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
所述大肠杆菌为DH5α。
5.权利要求1-4任一所述方法构建得到的产犬α-干扰素的重组菌。
6.权利要求5所述的重组菌在制备犬α-干扰素中的应用。
7.一种犬α-干扰素的制备方法，其包括以下步骤：将权利要求1-4任一所述的构建方法得到的产α-干扰素的重组菌进行发酵培养，得到发酵产物，从发酵产物中制得α-干扰素。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的方法包括以下步骤：将权利要求1-4任一所述的方法构建得到的产α-干扰素的重组菌接种至含有50 μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养至OD600达到0.6～1.0，加IPTG至终浓度为1mmol/L诱导培养5h。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述LB培养基中，添加质量分数为0.6%的甘氨酸。
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