具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1、CaIFN-α-SETD2融合基因的设计与合成
1、根据GenBank已公布的犬α-干扰素基因序列(Genbank:NP_001006655.1)和犬SETD2基因序列(Genbank:XP_864158.1),将两个基因以linker GGGGSGGGGS(GGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGC)串联,参照大肠杆菌偏爱性进行密码子优化,并在5'端和3'端分别加入NdeI酶切位点CATATG和XhoI酶切位点CTCGAG,人工合成编码CaIFN-α-SETD2的融合基因。合成CaIFN-α-SETD2的融合基因序列如SEQ ID NO.2所示。CaIFN-α-SETD2的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、pET-CaIFN-α-SETD2融合表达载体的构建
(1)目的基因酶切:用限制性内切酶Nde I和Xho I对合成的CaIFN-α-SETD2基因双酶切,酶切体系(20μl):干扰素基因1μl,Nde I 1μl,Xho I 1μl,10×Buffer 2μl,ddH2O 15μl,在冰上操作,混合后于37℃酶切2h。酶切片段经琼脂糖凝胶电泳分离,用胶回收试剂盒进行回收并纯化。
(2)载体酶切:选用载体pET30a(+),用限制性内切酶Nde I和Xho I对载体pET30a(+)双酶切,酶切体系(20μl):pET30a(+)1μl,Nde I 1μl,Xho I 1μl,10×Buffer 2μl,ddH2O 15μl,在冰上操作,混合后于37℃酶切2h。
(3)目的基因与载体的连接:将CaIFN-α-SETD2基因酶切产物和载体pET30a(+)酶切产物用T4连接酶进行连接,连接体系(10μl):10×Buffer 1μl,pET30a(+)酶切产物2μl,干扰素基因酶切产物2μl,T4 DNA连接酶1μl,ddH2O 4μl,在冰上操作,混合后于16℃连接过夜。
(4)转化:取10μl连接产物加入到含100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中,混匀后冰浴30min,转到42℃恒温水浴热击90s,取出后立即冰浴2min,向每个离心管中加入LB液体培养基500μl,于37℃,200r/min培养1h,取100μl涂布含有卡那霉素的平板,37℃倒置培养过夜14h。
(5)质粒提取:挑取平板上的单菌落,接种到含有卡那霉素的LB液体培养基,于37℃,200r/min培养12h,按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒,用Nde I与Xho I双酶切重组质粒,经琼脂糖电泳出现约5kb的pET30a(+)载体条带和3717bp的外源片段,大小与预期完全符合,电泳结果见图1。重组质粒命名为pET-CaIFN-α-SETD2。
3、发酵培养:pET-CaIFN-α-SETD2质粒转化BL21(DE3),挑取单个菌落,接种至适量的含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中,37℃,200r/min振荡培养过夜;菌液按培养基量的2%接种于灭菌发酵罐中,37℃通气培养,控制发酵罐搅拌速度500~700r/min、溶氧为60~90%,pH值7.0;待菌体生长至对数生长中期,加入终浓度为1mmol/L的IPTG,37℃下诱导5h。
4、菌体破碎
培养结束后,离心收集菌体沉淀,用PBS洗涤2次,制成10%的PBS悬液,在2~8℃下用高压匀浆机破碎细菌,破碎后的菌液,以8000r/min离心15分钟,收集包涵体。
5、重组蛋白的纯化
用含2M尿素的缓冲液洗涤包涵体,磁力搅拌器洗涤30分钟,4℃条件下,8000r/min离心10分钟,去上清后重复洗涤一次。加入8mol/L尿素溶解洗涤包涵体,于冰浴中超声清洗30分钟,8000r/min离心20分钟去沉淀,取上清即为包涵体溶解液,溶液4℃过夜,将溶液在超滤复性设备上进行复性,按5~10体积换液,复性结束后,经8000r/min,离心去沉淀,收集上清液就是所需蛋白溶液,将蛋白液以0.3ml/min的速度加入层析柱中,用pH 7.0磷酸盐缓冲液以1ml/min的速度进行线性梯度洗脱,用紫外检测仪在280nm波长下进行检测,收集目标洗脱峰,0.22μm的滤膜过滤除菌。采用紫外分光光度计法,测定蛋白含量≥3.8mg/ml。
6、重组蛋白的western-blot鉴定
上述重组蛋白SDS-PAGE电泳后,经100V,70min转至PVDF膜,TBST洗膜2次,1%BSA封闭液37℃封闭1.5h后TBST洗膜3次,兔源干扰素单克隆抗体作为一抗,加入1:1000稀释液,4℃孵育过夜,TBST洗膜3次后加入1:4000稀释的山羊抗兔IgG-HRP二抗,TBS洗膜3次后用DAB显色试剂盒检测,诱导后重组菌体中的重组蛋白大小为137kd,与CaIFN-α-SETD2融合蛋白大小一致,如图2所示。
实施例2、长效重组犬干扰素制品的制备
本实施例中用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH值7.0)稀释实施例1制备得到的CaIFN-α-SETD2融合蛋白,按总体积1:10比例加入稳定剂,同时加入甲基纤维素,充分搅拌,使每毫升成品中CaIFN-α-SETD2融合蛋白含量不低于0.01mg,每毫升成品中甲基纤维素含量为0.5mg。
试验实施例1、rCaIFN-α-SETD2长效重组犬干扰素制品生物学活性测定
1、rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品稀释
在无菌条件下,将制备的rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品用测定培养液稀释至每1ml含1000IU,在96孔细胞培养板中作4倍系列稀释,共10个稀释度,每个稀释度作4孔。
2、对照品参考干扰素制品的稀释
在无菌条件下,将参考干扰素制品按标示量溶解后,用测定培养液稀释至每1ml含1000IU,在96孔细胞培养板中作4倍系列稀释,共10个稀释度,每个稀释度作2孔。
3、测定方法MDCK细胞在培养基中贴壁生长,每周一、三、五传3次,1:5传代,用完全培养基生长。取培养的细胞弃去培养液,用PBS洗2次后消化和收集细胞,用完全培养液配制成每毫升含有2.5×105~3.5×105个细胞的细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中,如图3所示,注:A1~A10:对照品参考干扰素制品,B1~B10为A1~A10的重复;C1~C10:供试干扰素制品,D1~D10、E1~E10、F1~F10为C1~C10的重复;A11~E11;MDCK细胞对照孔;A12~E12:VSV病毒对照孔。每孔100μl,于37℃、5% CO2孵育4~6h,将稀释完成的待测干扰素制品和对照品参考干扰素制品溶液移入接种MDCK细胞的培养板中,每孔100μl,于37℃、5% CO2孵育24h,弃去细胞培养板中的上清液,将保存的水泡性口炎病毒(VSV,-70℃保存)用攻毒培养液稀释至1000TCID 50/ml,每孔100μl,于37℃、5%CO2孵育24h(镜检供试干扰素制品溶液50%病变点在IU/ml),然后弃去细胞培养板中的上清液,每孔加入染色液室温放置30min后,用流水小心冲去染色液,并吸干残留水分。
4、染色结果观察
将置温箱24h培养物倒置于显微镜下观察,首先观察细胞对照孔和病毒对照孔中的细胞出现75~100%的明显病变,正常细胞对照孔中的细胞全部生长良好无病变时,则表明本次实验对照系统合格,否则弃去重做。
当干扰素保护空CPE不再进展,即可观察结果,将上述细胞板盖打开,弃去各孔内液体于消毒液中,加结晶紫染色1~2滴/孔,3~5分钟后用细水流冲洗孔内残余染色液,干燥后即可记录结果:++++表示全部细胞病变;+++表示75%细胞病变;++表示50%细胞病变;+表示25%细胞病变。按Reed-Muench法计算干扰素的抗病毒活性。
试验实施例2、rCaIFN-α-SETD2制品在犬体内半衰期测定
将本发明实施例1制备的rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品和未融合SETD2的rCaIFN-α制品同时进行半衰期检测,选用50~60日龄健康易感比格犬10只,随机分为2组,每组5只,分别肌肉注射rCaIFN-α-SETD2和rCaIFN-α制品,注射剂量均按每kg体重10万单位,每日一次,连用3日,于最后一次注射后1h、2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、96h采血,应用HPLC测定血液中重组干扰素的浓度,如表1所示,血清中干扰素浓度测定结果(ng/ml)。
表1
注:表中体现干扰素浓度均为5只犬的算术平均值。
如图4所示,试验结果表明本发明制备的rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品在犬血液中的浓度显著高于同期注射的rCaIFN-α制品,而且rCaIFN-α-SETD2在体内的半衰期显著延长。
试验实施例3、rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品在预防犬病毒性疾病中应用
参照试验实施例2的rCaIFN-α-SETD2在犬体内的半衰期情况,将本发明制备的rCaIFN-α-SETD2融合蛋白制品和未融合SETD2的rCaIFN-α制品同时进行犬病毒性疾病的预防,再次验证了rCaIFN-α-SETD2融合表达后半衰期显著延长,并能很好的防治犬病毒性疾病,具体试验如下:
1、犬细小病毒病预防试验
选用50~60日龄健康易感比格犬30只,分为3组,每组10只,第1组和第2组为干扰素预防组,分别肌肉注射rCaIFN-α和rCaIFN-α-SETD2制品,注射剂量均按每kg体重10万单位,每日一次,连用3日,第3组为攻毒对照组(未预防),于最后一次干扰素预防注射后4h和48h各组取5只犬进行攻毒试验,分别以CPV/BJ/19株(106.0TCID50/ml)攻毒,每只口服病毒液3.0ml,各组同条件下隔离饲养,观察临床症状,按照肠炎型犬细小病毒病症状评分标准进行评分,如表2所示,肠炎型犬细小病毒病症状评分表。
结果rCaIFN-α-SETD2融合蛋白注射组犬4h攻毒时,5只犬犬细小病毒平均评分为0.8分;48h攻毒时,5只犬犬细小病毒平均评分为2.8分;rCaIFN-α注射组犬4h攻毒时,5只犬犬细小病毒平均评分为1.2分;48h攻毒时,5只犬犬细小病毒平均评分为4.4分;而攻毒对照组5只犬评分分别为4.6和4.4分。试验结果见表3所示,防治肠炎型犬细小病毒病。
试验结果表明本发明的rCaIFN-α-SETD2融合蛋白对犬细小病毒具有更好的抵御作用,同时rCaIFN-α-SETD2在体内的半衰期显著延长。
表2
表3
注:“/”表示未进行此项。
2、犬瘟热病毒病预防试验
选用50~60日龄健康易感比格犬30只,分为3组,每组10只,第1组和第2组为干扰素预防组,分别肌肉注射rCaIFN-α和本发明实施例1制备的rCaIFN-α-SETD2制品,注射剂量均按每kg体重10万单位,每日一次,连用3日,第3组为攻毒对照组(未预防),于最后一次干扰素预防注射后4h和48h各组取5只犬进行攻毒试验,分别以犬瘟热强毒CDV/BJ/14株攻毒,每只滴鼻接种2.0ml、同时肌肉注射2.0ml(含100ID50),各组同条件下隔离饲养,观察临床症状,按照犬瘟热病毒强毒攻毒症状评分标准进行评分,如表4所示,犬瘟热病毒强毒攻毒犬症状评分表。
结果rCaIFN-α-SETD2注射组犬4h攻毒时,5只犬瘟热病毒平均评分为0.4分;48h攻毒时,5只犬犬瘟热病毒平均评分为2.6分;rCaIFN-α注射组犬4h攻毒时,5只犬瘟热病毒平均评分为0.6分;48h攻毒时,5只犬瘟热病毒平均评分为4.6分;而攻毒对照组5只犬评分分别为4.6和4.8分。
试验结果表明本发明的rCaIFN-α-SETD2对犬瘟热病毒具有更好的抵御作用,同时rCaIFN-α-SETD2在体内的半衰期显著延长,如表5所示,防治犬瘟热病毒病。
表4
表5
注:“/”表示未进行此项。
3、犬副流感病毒病预防试验
选用50~60日龄健康易感比格犬30只,分为3组,每组10只,第1组和第2组为干扰素预防组,分别肌肉注射基因重组犬rCaIFN-α和本发明实施例1制备的rCaIFN-α-SETD2制品,注射剂量均按每kg体重使用10万单位,每日一次,连用3日,第3组为攻毒对照组(未预防),于最后一次干扰素预防注射后4h和48h各组取5只犬进行攻毒试验,分别以CPIV/QD/16株攻毒,每只滴鼻接种1.0ml、同时气管注射3.0ml(含100ID50),各组同条件下隔离饲养,观察临床症状,按照犬副流感强毒攻毒症状评分标准进行评分,如表6所示,犬副流感强毒攻毒犬症状评分表。
结果rCaIFN-α-SETD2注射组犬4h攻毒时,5只犬副流感病毒平均评分为0.8分;48h攻毒时,5只犬副流感病毒平均评分为2.8分;rCaIFN-α注射组犬4h攻毒时,5只犬副流感病毒平均评分为1.0分;48h攻毒时,5只犬副流感病毒平均评分为4.6;而攻毒对照组5只犬评分分别为4.8和4.6分。
试验结果表明本发明的重组rCaIFN-α-SETD2对犬副流感病毒具有更好的抵御作用,同时rCaIFN-α-SETD2在体内的半衰期显著延长,如表7所示,防治犬副流感病毒病。
表6
表7
注:“/”表示未进行此项。
4、犬腺病毒2型预防试验
选用50~60日龄健康易感比格犬30只,分为3组,每组10只,第1组和第2组为干扰素预防组,肌肉注射基因重组犬rCaIFN-α和本发明实施例1制备的rCaIFN-α-SETD2制品,注射剂量均按每kg体重使用10万单位,每日一次,连用3日,第3组为攻毒对照组(未预防),分别于最后一次干扰素预防注射后4h和48h各组取5只犬进行攻毒试验,分别以CAV2/BJ/13株攻毒,每只滴鼻接种2.0ml、同时肌肉注射2.0ml(含100ID50),各组同条件下隔离饲养,观察临床症状,按照犬腺病毒2型强毒攻毒症状评分标准进行评分,如表8所示,犬腺病毒2型强毒攻毒犬症状评分表。
结果rCaIFN-α-SETD2注射组犬4h攻毒时,5只犬腺病毒2型平均评分为0.6分;48h攻毒时,5只犬腺病毒2型平均评分为2.6分;rCaIFN-α注射组犬4h攻毒时,5只犬腺病毒2型平均评分为0.8分;48h攻毒时,5只犬腺病毒2型平均评分为4.4分;而攻毒对照组5只犬评分均为4.6分。
试验结果表明本发明的重组rCaIFN-α-SETD2对犬腺病毒2型具有更好的抵御作用,同时rCaIFN-α-SETD2在体内的半衰期显著延长,如表9所示,本发明的重组蛋白对防治犬腺病毒2型的抵御作用。
表8
表9
注:“/”表示未进行此项。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110>北京宝易生物技术有限公司,烟台市宝盈生物技术有限公司,北京义农生物科技有限公司
<120>一种长效重组犬干扰素制品及制备方法和应用
<130> GG20803822A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1238
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 00
<400> 1
Met Cys Tyr Leu Ala Asp Thr His Gly Gln Cys Asn Trp Arg Val Leu
1 5 10 15
Thr Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly Ser Cys Asp His
20 25 30
Phe Thr Asn Asp Phe Ala Phe Pro Asn Glu Leu Phe Asp Gly Glu Arg
35 40 45
Leu Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys
50 55 60
Val Phe His Leu Phe Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met
65 70 75 80
Thr Leu Leu Asp Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp
85 90 95
Leu Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Gln Ala Glu Thr Pro Leu
100 105 110
Met His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu
115 120 125
Asp Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Gly Arg Ser Tyr Phe Ser Ser Thr Ile Leu Gln Glu Arg
145 150 155 160
Ile Arg Arg Arg Lys Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Lys Arg Met Gln Cys Glu Cys Thr Pro Leu Ser Lys Asp Glu Arg Ala
180 185 190
Gln Gly Glu Ile Ala Cys Gly Glu Asp Cys Leu Asn Arg Leu Leu Met
195 200 205
Ile Glu Cys Ser Ser Arg Cys Pro Asn Gly Asp Tyr Cys Ser Asn Arg
210 215 220
Arg Phe Gln Arg Lys Gln His Ala Asp Val Glu Val Ile Leu Thr Glu
225 230 235 240
Lys Lys Gly Trp Gly Leu Arg Ala Ala Lys Asp Leu Pro Ser Asn Thr
245 250 255
Phe Val Leu Glu Tyr Cys Gly Glu Val Leu Asp His Lys Glu Phe Lys
260 265 270
Ala Arg Val Lys Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Asn Ile His Tyr Tyr Phe
275 280 285
Met Ala Leu Lys Asn Asp Glu Ile Ile Asp Ala Thr Gln Lys Gly Asn
290 295 300
Cys Ser Arg Phe Met Asn His Ser Cys Glu Pro Asn Cys Glu Thr Gln
305 310 315 320
Lys Trp Thr Val Asn Gly Gln Leu Arg Val Gly Phe Phe Thr Thr Lys
325 330 335
Leu Val Pro Ser Gly Ser Glu Leu Thr Phe Asp Tyr Gln Phe Gln Arg
340 345 350
Tyr Gly Lys Glu Ala Gln Lys Cys Phe Cys Gly Ser Ala Asn Cys Arg
355 360 365
Gly Tyr Leu Gly Gly Glu Asn Arg Val Ser Ile Arg Ala Ala Gly Gly
370 375 380
Lys Met Lys Lys Glu Arg Ser Arg Lys Lys Asp Ser Val Asp Gly Glu
385 390 395 400
Leu Glu Ala Leu Met Glu Asn Gly Glu Gly Leu Ser Asp Lys Asn Gln
405 410 415
Val Leu Ser Leu Ser Arg Leu Met Val Arg Ile Glu Thr Leu Glu Gln
420 425 430
Lys Leu Thr Cys Leu Glu Leu Ile Gln Asn Thr His Ser Gln Ser Cys
435 440 445
Leu Lys Ser Phe Leu Glu Arg His Gly Leu Ser Leu Leu Trp Ile Trp
450 455 460
Met Ala Glu Leu Gly Asp Gly Arg Glu Ser Asn Gln Lys Leu Gln Glu
465 470 475 480
Glu Ile Ile Lys Thr Leu Glu His Leu Pro Ile Pro Thr Lys Asn Met
485 490 495
Leu Glu Glu Ser Lys Val Leu Pro Ile Ile Gln Arg Trp Ser Gln Thr
500 505 510
Lys Thr Ala Ile Pro Gln Leu Ser Glu Gly Asp Gly Tyr Ser Ser Glu
515 520 525
Asn Thr Ser Arg Ala His Thr Pro Leu Asn Thr Pro Asp Pro Ser Thr
530 535 540
Lys Leu Ser Thr Glu Ala Asp Thr Asp Thr Pro Lys Lys Leu Met Phe
545 550 555 560
Arg Arg Leu Lys Ile Ile Ser Glu Asn Ser Met Asp Ser Ala Ile Ser
565 570 575
Asp Ala Thr Ser Glu Leu Glu Gly Lys Asp Gly Lys Glu Asp Leu Asp
580 585 590
Gln Leu Glu Asn Val Pro Ile Glu Glu Glu Glu Glu Leu Gln Ser Gln
595 600 605
Gln Leu Leu Thr Gln Gln Leu Pro Glu Ser Lys Val Glu Ser Glu Ile
610 615 620
Thr Val Glu Ala Ser Lys Leu Pro Thr Thr Glu Pro Glu Ala Asp Thr
625 630 635 640
Glu Ile Glu Pro Lys Glu Gly Asn Gly Thr Lys Leu Glu Glu Thr Ile
645 650 655
Ala Glu Glu Thr Pro Ser Gln Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Asp Val
660 665 670
Glu Ser Glu Arg Ser Gln Glu Gln Pro Asp Lys Thr Val Asp Ile Ser
675 680 685
Asp Leu Ala Thr Lys Leu Leu Asp Ser Trp Lys Asp Leu Lys Glu Val
690 695 700
Tyr Arg Ile Pro Lys Lys Ser Gln Thr Glu Lys Glu Asn Thr Ile Thr
705 710 715 720
Glu Arg Gly Arg Asp Ala Val Gly Phe Arg Asp Gln Thr Ala Ala Pro
725 730 735
Lys Thr Pro Asn Arg Ser Arg Glu Arg Asp Pro Asp Lys Gln Thr Gln
740 745 750
Asn Lys Glu Lys Arg Lys Arg Arg Gly Ser Leu Ser Pro Pro Ser Ser
755 760 765
Ala Tyr Glu Arg Gly Thr Lys Arg Pro Asp Asp Arg Tyr Asp Thr Pro
770 775 780
Thr Ser Lys Lys Lys Val Arg Ile Lys Asp Arg Asn Lys Leu Ser Thr
785 790 795 800
Glu Glu Arg Arg Lys Leu Phe Glu Gln Glu Val Ala Gln Arg Glu Ala
805 810 815
Gln Lys Gln Gln Gln Gln Met Gln Thr Leu Gly Met Thr Ser Pro Leu
820 825 830
Pro Tyr Asp Ser Leu Gly Tyr Asn Ala Pro His His Pro Phe Ala Gly
835 840 845
Tyr Pro Pro Gly Tyr Pro Met Gln Ala Tyr Val Asp Pro Ser Asn Pro
850 855 860
Asn Ala Gly Lys Val Leu Leu Pro Thr Pro Ser Met Asp Pro Val Cys
865 870 875 880
Ser Pro Ala Pro Tyr Asp His Ser Gln Pro Leu Val Gly His Ser Thr
885 890 895
Glu Pro Leu Ala Ala Pro Pro Pro Val Pro Val Val Pro His Val Ala
900 905 910
Ala Pro Val Glu Val Ser Ser Ser Gln Tyr Val Ala Gln Asn Asp Gly
915 920 925
Val Val His Gln Asp Ser Ser Val Thr Val Leu Pro Val Pro Ala Pro
930 935 940
Gly Pro Val Gln Gly Gln Asn Tyr Gly Val Trp Asp Ser Asn Gln Gln
945 950 955 960
Ser Val Ser Val Gln Gln Gln Tyr Ser Pro Ala Gln Ser Gln Ala Thr
965 970 975
Ile Tyr Tyr Gln Gly Gln Thr Cys Pro Thr Val Tyr Gly Val Thr Ser
980 985 990
Pro Tyr Ser Gln Thr Thr Pro Pro Ile Val Gln Ser Tyr Ala Gln Pro
995 1000 1005
Ser Leu Gln Tyr Ile Gln Gly Gln Gln Ile Phe Thr Ala His Pro
1010 1015 1020
Gln Gly Val Val Val Gln Pro Ala Thr Ala Val Thr Thr Ile Val
1025 1030 1035
Ala Pro Gly Gln Pro Gln Pro Leu Gln Pro Pro Glu Met Val Val
1040 1045 1050
Thr Asn Asn Leu Leu Asp Leu Pro Pro Pro Ser Pro Pro Lys Pro
1055 1060 1065
Lys Thr Ile Val Leu Pro Pro Asn Trp Lys Thr Ala Arg Asp Pro
1070 1075 1080
Glu Gly Lys Ile Tyr Tyr Tyr His Val Ile Thr Arg Gln Thr Gln
1085 1090 1095
Trp Asp Pro Pro Thr Trp Glu Ser Pro Gly Asp Asp Ala Ser Leu
1100 1105 1110
Glu His Glu Ala Glu Met Asp Leu Gly Thr Pro Thr Tyr Asp Glu
1115 1120 1125
Asn Pro Met Lys Thr Ser Lys Lys Pro Lys Thr Ala Glu Ala Asp
1130 1135 1140
Thr Ser Ser Glu Leu Ala Lys Lys Ser Lys Glu Val Phe Arg Lys
1145 1150 1155
Glu Met Ser Gln Phe Ile Val Gln Cys Leu Asn Pro Tyr Arg Lys
1160 1165 1170
Pro Asp Cys Lys Val Gly Arg Ile Thr Thr Thr Glu Asp Phe Lys
1175 1180 1185
His Leu Ala Arg Lys Leu Thr His Gly Val Met Asn Lys Glu Leu
1190 1195 1200
Lys Tyr Cys Lys Asn Pro Glu Asp Leu Glu Cys Asn Glu Asn Val
1205 1210 1215
Lys His Lys Thr Lys Glu Tyr Ile Lys Lys Tyr Met Gln Lys Phe
1220 1225 1230
Gly Ala Val Tyr Lys
1235
<210> 2
<211> 3717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 00
<400> 2
atgtgctacc tggcggacac ccacggtcag tgtaactggc gtgttctgac cctgctgggt 60
cagatgcgtc gtctgtctgc tggttcttgc gaccacttca ccaacgactt cgctttcccg 120
aatgaactgt tcgacggtga gcgtctgcag gaagctcagg ctctgtctgt tgttcacgtt 180
atgacccaga aagttttcca cctgttctgc ccggacacct cttctgctcc gtggaacatg 240
accctgctgg atgaactgtg ctctggtctg tctgaacagc tggacgacct ggaagcttgc 300
ccgctgcagg aagctggtca ggctgaaacc ccgctgatgc acgaagactc taccctgcgt 360
acctacttcc agcgtatctc tctggacctg caggaccgta accactctcc gtgcgcttgg 420
gaaatggttc gtgctgaaat cggtcgttct tacttctctt ctaccatcct gcaggaacgt 480
atccgtcgtc gtaaaacggg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcat gaaacgtatg 540
cagtgcgaat gcaccccgct gtctaaagac gaacgtgctc agggtgaaat cgcttgcggt 600
gaagactgcc tgaaccgtct gctgatgatc gaatgctctt ctcgttgccc gaacggtgac 660
tactgctcta accgtcgttt ccagcgtaaa cagcacgctg acgttgaagt tatcctgacc 720
gaaaaaaaag gttggggtct gcgtgctgct aaagacctgc cgtctaacac cttcgttctg 780
gaatactgcg gtgaagttct ggaccacaaa gaattcaaag ctcgtgttaa agaatacgct 840
cgtaacaaaa acatccacta ctacttcatg gctctgaaaa acgacgaaat catcgacgct 900
acccagaaag gtaactgctc tcgtttcatg aaccactctt gcgaaccgaa ctgcgaaacc 960
cagaaatgga ccgttaacgg tcagctgcgt gttggtttct tcaccaccaa actggttccg 1020
tctggttctg aactgacctt cgactaccag ttccagcgtt acggtaaaga agctcagaaa 1080
tgcttctgcg gttctgctaa ctgccgtggt tacctgggtg gtgaaaaccg tgtttctatc 1140
cgtgctgctg gtggtaaaat gaaaaaagaa cgttctcgta aaaaagactc tgttgacggt 1200
gaactggaag ctctgatgga aaacggtgaa ggtctgtctg acaaaaacca ggttctgtct 1260
ctgtctcgtc tgatggttcg tatcgaaacc ctggaacaga aactgacctg cctggaactg 1320
atccagaaca cccactctca gtcttgcctg aaatctttcc tggaacgtca cggtctgtct 1380
ctgctgtgga tctggatggc tgaactgggt gacggtcgtg aatctaacca gaaactgcag 1440
gaagaaatca tcaaaaccct ggaacacctg ccgatcccga ccaaaaacat gctggaagaa 1500
tctaaagttc tgccgatcat ccagcgttgg tctcagacca aaaccgctat cccgcagctg 1560
tctgaaggtg acggttactc ttctgaaaac acctctcgtg ctcacacccc gctgaacacc 1620
ccggacccgt ctaccaaact gtctaccgaa gctgacaccg acaccccgaa aaaactgatg 1680
ttccgtcgtc tgaaaatcat ctctgaaaac tctatggact ctgctatctc tgacgctacc 1740
tctgaactgg aaggtaaaga cggtaaagaa gacctggacc agctggaaaa cgttccgatc 1800
gaagaagaag aagaactgca gtctcagcag ctgctgaccc agcagctgcc ggaatctaaa 1860
gttgaatctg aaatcaccgt tgaagcttct aaactgccga ccaccgaacc ggaagctgac 1920
accgaaatcg aaccgaaaga aggtaacggt accaaactgg aagaaaccat cgctgaagaa 1980
accccgtctc aggacgaaga agaaggtgtt tctgacgttg aatctgaacg ttctcaggaa 2040
cagccggaca aaaccgttga catctctgac ctggctacca aactgctgga ctcttggaaa 2100
gacctgaaag aagtttaccg tatcccgaaa aaatctcaga ccgaaaaaga aaacaccatc 2160
accgaacgtg gtcgtgacgc tgttggtttc cgtgaccaga ccgctgctcc gaaaaccccg 2220
aaccgttctc gtgaacgtga cccggacaaa cagacccaga acaaagaaaa acgtaaacgt 2280
cgtggttctc tgtctccgcc gtcttctgct tacgaacgtg gtaccaaacg tccggacgac 2340
cgttacgaca ccccgacctc taaaaaaaaa gttcgtatca aagaccgtaa caaactgtct 2400
accgaagaac gtcgtaaact gttcgaacag gaagttgctc agcgtgaagc tcagaaacag 2460
cagcagcaga tgcagaccct gggtatgacc tctccgctgc cgtacgactc tctgggttac 2520
aacgctccgc accacccgtt cgctggttac ccgccgggtt acccgatgca ggcttacgtt 2580
gacccgtcta acccgaacgc tggtaaagtt ctgctgccga ccccgtctat ggacccggtt 2640
tgctctccgg ctccgtacga ccactctcag ccgctggttg gtcactctac cgaaccgctg 2700
gctgctccgc cgccggttcc ggttgttccg cacgttgctg ctccggttga agtttcttct 2760
tctcagtacg ttgctcagaa cgacggtgtt gttcaccagg actcttctgt taccgttctg 2820
ccggttccgg ctccgggtcc ggttcagggt cagaactacg gtgtttggga ctctaaccag 2880
cagtctgttt ctgttcagca gcagtactct ccggctcagt ctcaggctac catctactac 2940
cagggtcaga cctgcccgac cgtttacggt gttacctctc cgtactctca gaccaccccg 3000
ccgatcgttc agtcttacgc tcagccgtct ctgcagtaca tccagggtca gcagatcttc 3060
accgctcacc cgcagggtgt tgttgttcag ccggctaccg ctgttaccac catcgttgct 3120
ccgggtcagc cgcagccgct gcagccgccg gaaatggttg ttaccaacaa cctgctggac 3180
ctgccgccgc cgtctccgcc gaaaccgaaa accatcgttc tgccgccgaa ctggaaaacc 3240
gctcgtgacc cggaaggtaa aatctactac taccacgtta tcacccgtca gacccagtgg 3300
gacccgccga cctgggaatc tccgggtgac gacgcttctc tggaacacga agctgaaatg 3360
gacctgggta ccccgaccta cgacgaaaac ccgatgaaaa cctctaaaaa accgaaaacc 3420
gctgaagctg acacctcttc tgaactggct aaaaaatcta aagaagtttt ccgtaaagaa 3480
atgtctcagt tcatcgttca gtgcctgaac ccgtaccgta aaccggactg caaagttggt 3540
cgtatcacca ccaccgaaga cttcaaacac ctggctcgta aactgaccca cggtgttatg 3600
aacaaagaac tgaaatactg caaaaacccg gaagacctgg aatgcaacga aaacgttaaa 3660
cacaaaacca aagaatacat caaaaaatac atgcagaaat tcggtgctgt ttacaaa 3717
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 00
<400> 3
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 30