CN110885379A - 一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物基因工程领域，该重组融合蛋白由犬干扰素α突变体与蓖麻毒素B链蛋白经柔性linker连接而形成，柔性linker为(Gly4Ser)3连接肽。本发明的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白的制备方法，包括：步骤一、CaIFNα突变表达载体构建；步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；步骤三、重组CaIFNα‑Mut/RTB融合蛋白表达；步骤四、纯化与复性。该重组融合蛋白在制备抗病毒药物中的应用。该重组融合蛋白比普通犬干扰素α半衰期长、生物学活性高，延长了半衰期，提高了生物活性，降低了干扰素制剂成本，具有开发成广谱抗病毒药物和兽医临床应用的潜力和价值。

Description

一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
干扰素(Interferon，IFN)，一种由生物细胞产生的具有多种功能的糖蛋白，具有广谱的抗病毒作用，是宿主防御病原侵入的主要防线。干扰素本身不能直接杀灭病毒，而是通过诱导宿主细胞合成抗病毒蛋白，增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活性，调节宿主免疫功能，发挥其抗病毒作用。根据产生干扰素的来源不同、理化性质不同、生物活性不同以及识别受体不同，IFN分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。其中，Ⅰ型IFN抗病毒活性较强。Ⅰ型IFN还可分为IFN-α、IFN-β和IFN-ω。目前兽医临床使用的犬干扰素均为IFN-α。但是，干扰素在临床中存在半衰期段、体内易降解、慢性病毒感染等难题，限制了干扰素的临床应用。
蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)由RTA和RTB两个肽链以二硫键共价连接。其中RTB由262个氨基酸组成。RTB单独存在时没有毒性。目前认为RTB主要有两个功能：1、帮助RTA转运至细胞质内，抑制蛋白质合成；2、RTB增强机体免疫反应。
目前，将犬IFN-α突变体与蓖麻毒素B链蛋白组成融合蛋白来提高融合蛋白抗病毒活性及延长融合蛋白半衰期的研究还未见报道。
发明内容
本发明提供一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白，该重组融合蛋白由犬干扰素α突变体与蓖麻毒素B链蛋白经柔性linker连接而形成。
作为优选的实施方式，所述犬干扰素α突变体的制备过程如下：设计定点突变引物，以重组质粒pUC57-CaIFNα/RTB为模板，将犬干扰素α序列中第34位酪氨酸突变为天冬氨酸，第67位氨基酸脯氨酸突变为亮氨酸，第121位氨基酸精氨酸突变为酪氨酸，将突变后的序列命名为CaIFNα-Mut/RTB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
作为优选的实施方式，所述定点突变引物的序列如下：
SiteⅠ
Sense：5’-TTATACCGACGATTTTGCATT-3’；
Anti-sense：5’-GGAATGCAAAATCGTCGGTATA-3’；
SiteⅡ
Sense：5’-GTGTTTCATCTGATTTGTCC-3’；
Anti-sense：5’-TATCCGGACAAATCAGATGAAAC-3’；
SiteⅢ
Sense：5’-TGCGCACCCGTTTTCAGCGCATTAG-3’；
Anti-sense：5’-TAATGCGCTGAAAACGGGTGCGCAG-3’。
作为优选的实施方式，所述柔性linker为(Gly4Ser)3连接肽。
本发明的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一、CaIFNα突变表达载体构建；
步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；
步骤三、重组CaIFNα-Mut/RTB融合蛋白表达；
步骤四、纯化与复性。
作为优选的实施方式，步骤一具体包括以下步骤：
设计定点突变引物，以重组质粒pUC57-CaIFNα/RTB为模板，将犬干扰素α序列中第34位酪氨酸突变为天冬氨酸，第67位氨基酸脯氨酸突变为亮氨酸，第121位氨基酸精氨酸突变为酪氨酸，将突变后的序列命名为CaIFNα-Mut/RTB，将CaIFNα-Mut/RTB连接至pMD18T载体，将测序正确的产物命名为：pMD18T-CaIFNα-Mut/RTB质粒，作为CaIFNα突变表达载体。
作为优选的实施方式，步骤二具体包括以下步骤：
分别对测序正确的pMD18T-CaIFNα-Mut/RTB质粒和pET28a载体进行双酶切，反应体系及条件见下表，将双酶切产物进行胶回收；利用T4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件见下表；
试剂名称 用量
T4 DNA Ligase 1μL
10×T4 DNA Ligase Bμffer 4μL
回收的CaIFNα目的片段 4μL
回收的pET28A载体片段 1μL
反应条件 16℃过夜
将上述连接产物转化至Trans10感受态细胞；转化后涂布至终浓度为100μg/mLKan+抗性的LB固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行PCR；将PCR鉴定正确的阳性质粒进行测序分析。
作为优选的实施方式，步骤三具体包括以下步骤：
将测序正确的阳性菌BL21(DE3)/PET28a-CaIFNα-Mut/RTB按1:100v/v的比例接种于5mL含浓度为100μg/mL Kan的LB培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500mL同样的LB培养基中，并补加Kan至终浓度为100μg/mL，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6；诱导组添加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀。
作为优选的实施方式，步骤四具体包括以下步骤：
(1)离子交换层析
使用蛋白纯化A液平衡Q柱，将rCaIFNα/RTB包涵体溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/L以进行下一步金属鳌合层析；
(2)金属鳌合层析
使用蛋白纯化B液对装载Ni2+ Chelating Sepharose进行平衡；将离子交换层析纯化的rCaIFNα-Mut/RTB溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化B液和蛋白纯化C液进行混合，分别使用终浓度为50mmol/L与250mmol/L的咪唑对chelatingSepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液；将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％SDS-PAGE分析；
(3)rCaIFNα/RTB蛋白复性
将经两步纯化的rCaIFNα-Mut/RTB蛋白溶液使用蛋白复性A液进行稀释，稀释至rCaIFNα-Mut/RTB浓度为0.1mg/mL，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性B液；调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与B液进液速度保持一致；蛋白复性过程于4℃进行，整个流程进行48-72h；蛋白复性B液流尽后，通入蛋白复性C液去除复性过程中残留的蔗糖及甘油成分，并将rCaIFNα-Mut/RTB蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1-1.5mg/mL，得到重组CaIFNα-Mut/RTB融合蛋白。
本发明的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白在制备抗病毒药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白，由犬干扰素α突变体与蓖麻毒素B链蛋白经柔性linker连接而形成，其中，柔性linker选用(Gly4Ser)3连接肽。本发明的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白比普通犬干扰素α半衰期长、生物学活性高，延长了半衰期，提高了生物活性，降低了干扰素制剂的制备成本，具有开发成广谱抗病毒药物和兽医临床应用的巨大潜力和价值。
附图说明
图1为给药组犬细小病毒排毒结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1重组CaIFNα-Mut/RTB融合蛋白的制备
1、CaIFNα突变表达载体构建
合成CaIFNα-linker-RTB目的基因，犬干扰素α下游加入(G4S)3linker序列，加入蓖麻毒素B链序列，并在目的基因两端分别加入NdeI与XhoI限制性酶切位点。合成后的目的基因核苷酸序列连接至pUC57载体，并将该质粒命名为pUC57-CaIFNα/RTB。
设计定点突变引物，其序列如下：
SiteⅠ
Sense：5’-TTATACCGACGATTTTGCATT-3’；
Anti-sense：5’-GGAATGCAAAATCGTCGGTATA-3’；
SiteⅡ
Sense：5’-GTGTTTCATCTGATTTGTCC-3’；
Anti-sense：5’-TATCCGGACAAATCAGATGAAAC-3’；
SiteⅢ
Sense：5’-TGCGCACCCGTTTTCAGCGCATTAG-3’；
Anti-sense：5’-TAATGCGCTGAAAACGGGTGCGCAG-3’。
以重组质粒pUC57-CaIFNα/RTB为模板，将犬干扰素α序列中第34位酪氨酸突变为天冬氨酸，第67位氨基酸脯氨酸突变为亮氨酸，第121位氨基酸酪氨酸突变为精氨酸，以增强犬干扰素α/RTB融合蛋白的稳定性与抗病毒活性，并将突变后的序列命名为CaIFNα-Mut/RTB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。将突变后的CaIFNα-Mut/RTB连接至pMD18T载体，将测序正确的产物命名为：pMD18T-CaIFNα-Mut/RTB质粒，作为CaIFNα突变表达载体，以便下游基因工程操作。
2、大肠杆菌重组表达载体构建
分别对上述测序正确的pMD18T-CaIFNα-Mut/RTB质粒和pET28a载体进行双酶切，反应体系及条件如表1所示，将双酶切产物进行胶回收。利用T4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件如表1所示。
表1
Figure BDA0002323871010000051
Figure BDA0002323871010000061
将上述连接产物转化至Trans10感受态细胞。转化后涂布至终浓度为100μg/mLKan+抗性的LB固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行PCR。将PCR鉴定正确的阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序分析。
3、重组CaIFNα-Mut/RTB融合蛋白表达
将上述测序正确的阳性菌BL21(DE3)/PET28a-CaIFNα-Mut/RTB按1:100v/v的比例接种于5mL含浓度为100μg/mL Kan的LB培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500mL同样的LB培养基中，并补加Kan至终浓度为100μg/mL，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6；诱导组添加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀。
4、融合蛋白纯化与复性
使用两步纯化法将菌体沉淀rCaIFNα-Mut/RTB进行纯化。其纯化方法以先进行离子交换层析、后进行金属鳌合层析的顺序进行，具体操作步骤如下：
(1)离子交换层析：使用蛋白纯化A液(50mmol/L PB，8mol/L Urea，pH 6.0)平衡Q柱，将rCaIFNα/RTB包涵体以蛋白纯化A液变性溶解并将溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/L以进行下一步金属鳌合层析。
(2)金属鳌合层析：使用蛋白纯化B液(50mmol/L PB，8mol/L Urea，0.5mol/L NaClpH 6.0)对装载Ni2+ Chelating Sepharose进行平衡。将离子交换层析纯化的rCaIFNα-Mut/RTB溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化C液和蛋白纯化C液(50mmol/LTris，8mol/L Urea，0.5mol/L NaCl，500mmol/L Imidazole，pH 8.5)进行混合，分别使用终浓度为50mmol/L与250mmol/L的咪唑对chelating Sepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液。将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％SDS-PAGE分析。
(3)rCaIFNα/RTB蛋白复性：将经两步纯化的rCaIFNα-Mut/RTB蛋白溶液使用蛋白复性A液(50mmol/L Tris，8mol/L Urea，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，5mmol/L DTT，pH8.5)进行稀释，稀释至rCaIFNα-Mut/RTB浓度为0.1mg/mL，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性B液(50mmol/L Tris，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，pH 8.5)。调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与B液进液速度保持一致。蛋白复性过程于4℃进行，整个流程进行48-72h，以满足对尿素的彻底去除以及rCaIFNα-Mut/RTB蛋白的缓慢而充分的折叠。蛋白复性B液流尽后，通入蛋白复性C液(50mmol/L Tris，pH 8.5)去除复性过程中残留的蔗糖及甘油等成分，并将rCaIFNα-Mut/RTB蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1-1.5mg/mL，得到重组CaIFNα-Mut/RTB融合蛋白。
实施例2重组CaIFNα-Mut/RTB融合蛋白的抗病毒检测
1、犬细小病毒攻毒感染
选取18只比格犬，攻毒前禁食，口服犬细小病毒液TCID50＝107。每日9点和15点定点检测犬体温、食欲、腹泻和精神状态等，本次试验中采用的模型成功标准为：精神萎靡、体温升高、呕吐、拒食、腹泻、粪便恶臭并带有粘液，并出现“番茄汁”样血便，CPV胶体金试纸检测为强阳性。符合以上条件的患犬，认定模型制备成功。正常组与模型对照组于攻毒前12h皮下给予生理盐水，给药组将于攻毒前12h将1000万IU rCaIFNα-Mut/RTB皮下给予犬颈背部。
表2：rCaIFNα/RTB犬细小病毒病治疗动物分组情况
动物分组 动物数 组别 给药方式 给药
1 6 正常组 皮下注射 生理盐水
2 6 病毒模型组 皮下注射 生理盐水
3 6 给药组 皮下注射 1000万IU rCaIFNα-Mut/RTB
3、抗病毒检测
使用胶体金试纸检测犬细小病毒排毒，经皮下注射rCaIFNα-Mut/RTB后进行犬细小病毒攻毒，发现给药组受试动物成功抵御107TCID50细小病毒攻毒，7天代谢过程中未发现排毒，无特异性临床症状，证明rCaIFNα-Mut/RTB成功干扰犬细小病毒病发病，预防率为100％，给药组部分排毒结果如图1所示，图中，1为攻毒前排毒结果；2-8为攻毒后第一天至第7天排毒结果；9为病毒对照第一天排毒结果以作为阳性对照展示。
本发明公开了一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 吉林医药学院
<120> 一种犬干扰素突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1389
<212> DNA
<213> 突变体(mutant)
<400> 1
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgtgccatc tgccggatac ccacggtctg cgtaattggc gtgttctgac cctgctgggc 120
cagatgcgcc gtctcagcgc cggtagttgt gatcattata ccgacgattt tgcattcccg 180
aaagaactgt ttgtaggtca gcgcctgcaa gaagcccagg ccctgagcgt ggttcatgtg 240
atgacccaga aagtgtttca tctgatttgt ccggatacca gcagcgcacc gtggaatatg 300
accctgctgg aagaactgtg cagtggcctg agcgaacagc tggatgatct ggaagcatgc 360
ccgctgcaag aagcgggcct ggccgaaacc ccgctgatgc atgaagatag caccctgcgc 420
acccgttttc agcgcattag cctgcgtctg caagatcgta atcatagccc gtgtgcctgg 480
gaaatggtgc gtgcagaaat tggtcgcagc tttttcagta gtaccattct gcaagaacgt 540
attcgtcgtc gcaaaggtgg cggcggtagt ggcggcggtg gcagcggtgg tggtggttca 600
gcagatgttt gcatggaccc tgaaccgatt gttcgcattg ttggtcgcaa tggcctgtgc 660
gtggatgtgc gcgatggtcg ttttcataat ggtaatgcca ttcagctgtg gccgtgtaaa 720
agcaataccg atgcaaatca gctgtggacc ctgaaacgtg ataataccat tcgtagcaat 780
ggcaaatgcc tgaccaccta tggctatagt ccgggtgttt atgtgatgat ctatgattgt 840
aataccgcag ccaccgatgc cacccgctgg cagatttggg ataatggtac aattattaac 900
ccgcgcagta gtctggtgct ggcagcaacc agcggatata gtggtacaac cctggacgtt 960
cagaccaata tctatgccgt taggcagggt tggctgccga ccaataatac ccagccgttt 1020
gttaccacca ttgttggtct gtatggcatg tgtctgcaag ccaatagtgg taaagtgtgg 1080
ctggttgatt gtaccagcga aaaagccgaa cagctatccg ccctgtatgc cgatgctagc 1140
attcgcccgc agcagaatcg cgataattgc ctgaccacag atgccaatat taagggcacc 1200
gttgttaaaa ttctgagctg cggcccggcc agtagcggcc aacgttggat gtttaaaaat 1260
gatggcacca ttctgaatct gtataatggc ctggttacct gtgtgcgtcg cagcgatccg 1320
agcagtctga aacagattat tgttcatccg gttcatggca atctgaatca gatttggtta 1380
ccgctgttt 1389
<210> 2
<211> 463
<212> PRT
<213> 突变体(mutant)
<400> 2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Cys His Leu Pro Asp Thr His Gly Leu Arg Asn
20 25 30
Trp Arg Val Leu Thr Leu Leu Gly Gln Met Arg Arg Leu Ser Ala Gly
35 40 45
Ser Cys Asp His Tyr Thr Asp Asp Phe Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe
50 55 60
Val Gly Gln Arg Leu Gln Glu Ala Gln Ala Leu Ser Val Val His Val
65 70 75 80
Met Thr Gln Lys Val Phe His Leu Ile Cys Pro Asp Thr Ser Ser Ala
85 90 95
Pro Trp Asn Met Thr Leu Leu Glu Glu Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu
100 105 110
Gln Leu Asp Asp Leu Glu Ala Cys Pro Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala
115 120 125
Glu Thr Pro Leu Met His Glu Asp Ser Thr Leu Arg Thr Arg Phe Gln
130 135 140
Arg Ile Ser Leu Arg Leu Gln Asp Arg Asn His Ser Pro Cys Ala Trp
145 150 155 160
Glu Met Val Arg Ala Glu Ile Gly Arg Ser Phe Phe Ser Ser Thr Ile
165 170 175
Leu Gln Glu Arg Ile Arg Arg Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp Val Cys Met Asp Pro Glu
195 200 205
Pro Ile Val Arg Ile Val Gly Arg Asn Gly Leu Cys Val Asp Val Arg
210 215 220
Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn Ala Ile Gln Leu Trp Pro Cys Lys
225 230 235 240
Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu Trp Thr Leu Lys Arg Asp Asn Thr
245 250 255
Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser Pro Gly
260 265 270
Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys Asn Thr Ala Ala Thr Asp Ala Thr
275 280 285
Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn Gly Thr Ile Ile Asn Pro Arg Ser Ser
290 295 300
Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Val
305 310 315 320
Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val Arg Gln Gly Trp Leu Pro Thr Asn Asn
325 330 335
Thr Gln Pro Phe Val Thr Thr Ile Val Gly Leu Tyr Gly Met Cys Leu
340 345 350
Gln Ala Asn Ser Gly Lys Val Trp Leu Val Asp Cys Thr Ser Glu Lys
355 360 365
Ala Glu Gln Leu Ser Ala Leu Tyr Ala Asp Ala Ser Ile Arg Pro Gln
370 375 380
Gln Asn Arg Asp Asn Cys Leu Thr Thr Asp Ala Asn Ile Lys Gly Thr
385 390 395 400
Val Val Lys Ile Leu Ser Cys Gly Pro Ala Ser Ser Gly Gln Arg Trp
405 410 415
Met Phe Lys Asn Asp Gly Thr Ile Leu Asn Leu Tyr Asn Gly Leu Val
420 425 430
Thr Cys Val Arg Arg Ser Asp Pro Ser Ser Leu Lys Gln Ile Ile Val
435 440 445
His Pro Val His Gly Asn Leu Asn Gln Ile Trp Leu Pro Leu Phe
450 455 460

Claims (10)

1.一种犬干扰素突变体重组融合蛋白，其特征在于，该重组融合蛋白由犬干扰素α突变体与蓖麻毒素B链蛋白经柔性linker连接而形成。
2.根据权利要求1所述的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白，其特征在于，所述犬干扰素α突变体的制备过程如下：设计定点突变引物，以重组质粒pUC57-CaIFNα/RTB为模板，将犬干扰素α序列中第34位酪氨酸突变为天冬氨酸，第67位氨基酸脯氨酸突变为亮氨酸，第121位氨基酸精氨酸突变为酪氨酸，将突变后的序列命名为CaIFNα-Mut/RTB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求2所述的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白，其特征在于，所述定点突变引物的序列如下：
SiteⅠ
Sense：5’-TTATACCGACGATTTTGCATT-3’；
Anti-sense：5’-GGAATGCAAAATCGTCGGTATA-3’；
SiteⅡ
Sense：5’-GTGTTTCATCTGATTTGTCC-3’；
Anti-sense：5’-TATCCGGACAAATCAGATGAAAC-3’；
SiteⅢ
Sense：5’-TGCGCACCCGTTTTCAGCGCATTAG-3’；
Anti-sense：5’-TAATGCGCTGAAAACGGGTGCGCAG-3’。
4.根据权利要求1所述的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白，其特征在于，所述柔性linker为(Gly4Ser)3连接肽。
5.如权利要求1至4中任意一项所述的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、CaIFNα突变表达载体构建；
步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；
步骤三、重组CaIFNα-Mut/RTB融合蛋白表达；
步骤四、纯化与复性。
6.根据权利要求5所述的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤一具体包括以下步骤：
设计定点突变引物，以重组质粒pUC57-CaIFNα/RTB为模板，将犬干扰素α序列中第34位酪氨酸突变为天冬氨酸，第67位氨基酸脯氨酸突变为亮氨酸，第121位氨基酸精氨酸突变为酪氨酸，将突变后的序列命名为CaIFNα-Mut/RTB，将CaIFNα-Mut/RTB连接至pMD18T载体，将测序正确的产物命名为：pMD18T-CaIFNα-Mut/RTB质粒，作为CaIFNα突变表达载体。
7.根据权利要求6所述的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤二具体包括以下步骤：
分别对测序正确的pMD18T-CaIFNα-Mut/RTB质粒和pET28a载体进行双酶切，反应体系及条件见下表，将双酶切产物进行胶回收；利用T4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件见下表；
试剂名称 用量 T4 DNA Ligase 1μL 10×T4 DNA Ligase Bμffer 4μL 回收的CaIFNα目的片段 4μL 回收的pET28A载体片段 1μL 反应条件 16℃过夜
将上述连接产物转化至Trans10感受态细胞；转化后涂布至终浓度为100μg/mLKan+抗性的LB固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行PCR；将PCR鉴定正确的阳性质粒进行测序分析。
8.根据权利要求7所述的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤三具体包括以下步骤：
将测序正确的阳性菌BL21(DE3)/PET28a-CaIFNα-Mut/RTB按1:100v/v的比例接种于5mL含浓度为100μg/mL Kan的LB培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500mL同样的LB培养基中，并补加Kan至终浓度为100μg/mL，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6；诱导组添加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀。
9.根据权利要求8所述的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤四具体包括以下步骤：
(1)离子交换层析
使用蛋白纯化A液平衡Q柱，将rCaIFNα/RTB包涵体溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/L以进行下一步金属鳌合层析；
(2)金属鳌合层析
使用蛋白纯化B液对装载Ni2+Chelating Sepharose进行平衡；将离子交换层析纯化的rCaIFNα-Mut/RTB溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化B液和蛋白纯化C液进行混合，分别使用终浓度为50mmol/L与250mmol/L的咪唑对chelating Sepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液；将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％SDS-PAGE分析；
(3)rCaIFNα/RTB蛋白复性
将经两步纯化的rCaIFNα-Mut/RTB蛋白溶液使用蛋白复性A液进行稀释，稀释至rCaIFNα-Mut/RTB浓度为0.1mg/mL，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性B液；调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与B液进液速度保持一致；蛋白复性过程于4℃进行，整个流程进行48-72h；蛋白复性B液流尽后，通入蛋白复性C液去除复性过程中残留的蔗糖及甘油成分，并将rCaIFNα-Mut/RTB蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1-1.5mg/mL，得到重组CaIFNα-Mut/RTB融合蛋白。
10.如权利要求1至4中任意一项所述的一种犬干扰素突变体重组融合蛋白在制备抗病毒药物中的应用。
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