具体实施方式
除非特殊定义,本文描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。例如:“PEG”和“聚乙二醇”具有相同的含义;“干扰素α”、“IFN-α”及“α干扰素”含义也相同。
除非特殊指明,本文所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法,可以一般的按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用时根据制造商或供应商提供的说明书进行。
本发明MIFNCys72蛋白的类似物可以通过氨基酸功能等效分子的取代、添加或缺失来获得,如在本技术领域公知,用性质类似的一个或多个氨基酸残基取代原序列内相应的氨基酸残基改变原蛋白质序列,形成沉默改变。
本发明中聚乙二醇衍生物的聚乙二醇部分,如本领域技术人员公知,可以具有直链或分支结构。是一种巯基反应PEG化试剂,能够和半胱氨酸残基的巯基发生反应。本发明尝试用分子量约20000道尔顿的PEG对α干扰素突变体进行修饰,可获得PEG-干扰素的衍生物。资料显示:PEG化蛋白的半衰期随着PEG分子量的增大有不同程度延长。本发明实施例中用20000道尔顿的PEG具体产物PEG-干扰素衍生物的制作纯化方法及药效、药代试验。
在优选的实施例中,PEG化试剂是Nektar Therapeutics提供的mPEG-MAL[也写作PEG-MAL(20KD)],文中mPEG-MAL有时也一般性的简写为PEG-MAL或PEG。
本发明中MIFN工程菌由北京三元基因工程有限公司提供。
下面实施例将进一步解释本发明。
实施例1 MIFNCys72的基因构建和扩增
采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM),以重叠延伸的手段进行定点突变。定点突变技术已经比较成熟,程序比较固定。可以根据具体试验调整的是引物的位置长度和PCR的反应条件,在实际操作中可以有多种组合,都可以达到定点突变的目的,均涵盖在本发明的保护范围之内。本实施例所列为优选方案。
设计两对引物,上游引物P1为T7promoter primer(gactcactatagggagaccacaacggt),P3序列为taccaaatgctcttctgctg;下游引物P2为T7 terminator primer(tttagaggccccaaggggttatgc),P4序列为gcagaagagcatttggtagag。突变位点包含在P3和P4之中。
提取MIFN的质粒作为模板,首轮PCR包括两个反应体系:反应体系1引物为P1、P4,扩增突变位点及其上游的DNA序列;反应体系2引物为P2、P3,扩增突变位点及其下游的DNA序列。反应条件为94℃5min,然后94℃ 30s,57℃ 30s,72℃2min共30个循环。图1表示两轮PCR产物的琼脂糖电泳图谱。
第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析,选择720bp左右的DNA片段,用Nde I/EcoR I双酶切,电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例2 MIFNCys72重组质粒的构建、转化和鉴定
在重组质粒的构建和转化中,双酶往往可以有多种选择,连接反应的条件也可以有所变化,都可以完成重组质粒的构建;本实施例中宿主细胞选择了实验室常用的BL21(DE3),并不排斥用其他宿主进行转化。本着科学、方便和快捷的原则,本实施例所列重组质粒的构建、转化和鉴定方案为优选方案。
将pET-23b质粒载体用Nde I/EcoR I双酶切,经琼脂糖电泳回收并和实施例1最后回收的目的DNA片段连接。连接反应条件为:10×T4 DNA Ligase buffer7~8μl、T4 DNA Ligase 1μl、目的片段1~2μl、载体3μl,16℃过夜连接。
制备BL21(DE3)感受态细胞,转化上述连接产物,涂布氨苄平板,37℃过夜培养。
挑取单菌落作为模板,用本发明实施例1中涉及的引物P1、P2进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖电泳(电泳图谱如图2所示),阳性克隆应在720bp左右出现特意条带。取阳性克隆小量培养,提取质粒用Nde I/EcoR I双酶切,分别在3kb左右和500bp左右出现特异的条带(琼脂糖电泳图谱如图3所示),与预计情况相符,初步说明重组质粒构建成功。为了进一步确认其序列,以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定。
实施例3 MIFNCys72的表达和纯化
将实施例2中的得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主,诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的MIFNCys5约占菌体总蛋白的30~50%,主要以包涵体形式存在。
粗纯:将发酵收集的菌体以TE溶解,超声破菌后收集包涵体,然后用6~8mol/L的Gu·HCl或尿素溶解,室温搅拌或4℃过夜。4℃离心取上清,即为粗纯的MIFNCys72。
精纯:依次采用了DEAE阴离子交换层析和铜离子亲和层析两步纯化工艺。具体步骤如下:复性液离心取上清,于A液(25mM Tris-HCl,pH8.0)透析过夜。透析液离心去沉淀后,上样到已充分平衡的DEAE Sepharose FF阴离子交换层析柱,用B液(含0.3~0.5mol/L NaCl的A液)洗脱,收集洗脱峰组分;将DEAE Sepharose FF离子交换层析的洗脱峰组分上样到平衡好的Chelating Sepharose FF亲和层析柱,用C液(0.2M甘氨酸+0.3M NaCl,pH3.0)洗脱,收集洗脱峰组分。洗脱峰组分上样到平衡好的Chelating柱,用D液(0.2M甘氨酸+0.3M NaCl,pH3.0)洗脱,收集洗脱峰组分。经以上纯化流程后,最后得到的MIFNCys72纯度在90%以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。
实施例4 MIFNCys72的PEG偶联
本发明干扰素α突变体可以和各种分子量的PEG偶联,在优选实施例中,PEG为mPEG-MAL,平均分子量约为20KD。
1)MIFNCys72的浓缩
以上干扰素α突变体可以用DEAE Sepharose FF层析柱进行浓缩。具体方法如下:将实施例3中纯化的蛋白样品以10~80mmol/L Tris-HCl pH7.5~8.5溶液稀释2倍或以上,上样到DEAE层析柱,然后用20mmol/L PB缓冲液(pH7.6)+300mmol/L NaCl的洗脱得到目的蛋白的浓缩液。
2)MIFNCys72与mPEG-MAL的偶联
MIFNCys72与mPEG-MAL(20KD)偶联反应,其单PEG衍生物写作:mPEG(20KD)-MIFNCys72。
偶联反应步骤具体如下:取本实施例步骤1适量体积的浓缩液,调整蛋白浓度到8~12mg/ml,将纯化的蛋白与mPEG-MAL按摩尔比1/10~1/5混合,轻轻摇动使粉末溶解后于4℃反应过夜,即反应时间超过10小时,SDS-PAGE检测反应的偶联程度(图5-6所示)
实施例5 干扰素α突变体衍生物的纯化
采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对修饰产物进行纯化具体条件如下:采用25mmol pH8.0 Tris缓冲体系将反应液稀释20~30倍后,以流速为3~4ml/min上样于平衡过的DEAE柱,待基线平衡后,用含NaCl浓度为80mM的25mM pH8.0 Tris洗脱液洗脱得到目的蛋白的洗脱峰。最后得到的重组蛋白纯度都在95%以上(SDS-PAGE图谱如图7-8所示)。
实施例6 通过WISH-VSV系统测定α干扰素、突变体及突变体聚乙二醇衍生物的体外抗病毒活性
采用细胞病变抑制法通过WISH-VSV系统测定干扰素的体外抗病毒活性,是本技术领域公知的方法,具体参照2005版《中华人民共和国药典》三部附录XC“干扰素的生物活性测定”。
本实施例测定了3种干扰素(或衍生物)的体外抗病毒活性,具体包括:
1种α干扰素:MIFN;
1种α干扰素的突变体:MIFNCys72(本发明实施例3制备);
还有1种聚乙二醇衍生物:mPEG(20KD)-MIFNCys72(本发明实施例5制备)。
其体外抗病毒活性测定结果见下述表1
表1:MIFN、MIFNCys72、和mPEG(20KD)-MIFNCys72的体外抗病毒活性
名称 |
比活性(IU/mg) |
活性保留(%) |
MIFN |
5.71±0.16×108 |
- |
MIFNCys72 |
4.45±0.27×108 |
77.93% |
mPEG(20KD)-MIFNCys72 |
3.68±0.62×107 |
8.27% |
实施例7 大鼠药代动力学研究
通过本实施例表2所示的药代动力学研究方案测定了2种干扰素(或衍生物)的体外抗病毒活性,具体包括:
1种α干扰素的突变体:MIFNCys72(本发明实施例3制备);
1种聚乙二醇衍生物:mPEG(20KD)-MIFNCys72(本发明实施例5制备)。
表2:药代动力学研究方案
大鼠 |
6只 |
6只 |
给药途径 |
皮下 |
皮下 |
给药方式 |
单次 |
单次 |
给药剂量 |
3.3MIU |
5.4MIU |
取血时间点 |
0,0.33,0.67,1,1.5,2,4,8,12,24 |
0,0.5,1,2,4,6,8,12,24,36,48,72,96,120,144,168 |
测定方法 |
WISH/VSV |
WISH/VSV |
在上述试验方案中,从大鼠尾源静脉收集血样,然后离心分离收集血清,用CPE法(WISH/VSV系统)检测血清样品中干扰素含量。
表3:MIFNCys72及其PEG衍生物的药代动力学参数表
PK参数 |
MIFNm73 |
mono-PEG-MIFNm73 |
t1/2Ka(h) |
0.19 |
4.98 |
t1/2Ke(h) |
1.55 |
13.10 |
Tpeak(h) |
0.67 |
11.24 |
Cpeak(IU/ml) |
303.32 |
1180.97 |
AUC(IU·h/ml) |
943.15 |
41380.98 |
CL |
6340.0 |
133.78 |
经Kinetica软件拟合发现MIFNCys72及其PEG衍生物在Wister大鼠体内的代谢规律符合一级吸收的一房室模型。PEG化可显著改善MIFNCys72的药代动力学性质,与MIFNCys72相比,mPEG-MIFNCys72的吸收半衰期、达峰时间、消除半衰期显著延长;药时曲线下面积显著增加;清除率显著降低。可见,PEG化可以延长MIFNCys72的体内平均存留时间,降低清除率。
至此,已经对本发明进行了较为充分的描述。优选的实施例只能阐述而不限制本发明,对于本领域的技术人员来说,实现本发明的方法和手段可以变化和改进,均应涵盖在本发明的保护范围之内。
附序列表
序列表1:干扰素α突变体的氨基酸序列
<110>北京三元基因工程有限公司
<120>α干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物
<130>-
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>166
<212>PRT
<213>北京三元基因工程有限公司
<400>1
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Cys Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
165
SEQUENCE LISTING
<110>北京三元基因工程有限公司北京毕艾欧科技发展有限责任公司
<120>α干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物
<130>-
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>166
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Ile
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Cys Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Val Asp Ser Ile Leu Val Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp
165
<210>2
<211>507
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atgtgtgacc tgccgcagac ccactctctg ggttctcgtc gtaccctgat cctgctggct 60
cagatgcgtc gtatctctcc gttctcttgc ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg 120
caggaagagt tcgacggtaa ccagttccag aaagctcagg ctatctctgt tctgcacgaa 180
atgatccagc agaccttcaa cctgttctct accaaatgct cttctgctgc ttgggacgaa 240
tctctgctgg aaaaattcta caccgaactg taccagcagc tgaacgacct ggaagcatgc 300
gttatccagg aagttggtgt tgaagaaacc ccgctgatga acgttgactc tatcctggct 360
gttaaaaaat acttccagcg tatcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctctccgtgt 420
gcttgggaag ttgttcgtgc tgaaatcatg cgttctttct ctctgtctac caacctgcag 480
gaacgtctgc gtcgtaaaga ctaatag 507