CN101113982A - 体外筛选胰高血糖素样肽-1受体的多肽类激动剂的方法 - Google Patents

Abstract

胰高血糖素样肽－1受体(GLP－1受体)是当今公认的、最重要的抗糖尿病药物作用靶点之一。本发明涉及胰高血糖素样肽－1受体的多肽类激动剂的体外筛选方法及筛选得到的多肽。本发明公开了一种体外筛选胰高血糖素样肽－1受体的多肽类激动剂的方法，该筛选方法以重组的GLP－1受体蛋白的膜外N端片段(N－GLP－1R)为靶点，利用其体外结合能力，并结合噬菌体展示技术和Phage－ELISA技术而建立。本发明还公开了用该方法筛选获得的多肽序列。本发明公开的筛选方法简便、快捷，适合体外高通量筛选GLP－1受体多肽类激动剂，为开发治疗糖尿病的多肽类药物提供了新的方法和思路，节省了筛选时间，降低了开发成本。

Description

体外筛选胰高血糖素样肽-1受体的多肽类激动剂的方法

技术领域

本发明涉及多肽类药物体外筛选方法，尤其涉及胰高血糖素样肽-1受体的多肽类激动剂的体外筛选方法及筛选得到的多肽。

背景技术

目前筛选胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1受体)的激动剂的方法是将GLP-1受体的基因与报告基因共转染到细胞内，并将GLP-1受体表达在细胞表面，针对激动剂进行筛选。

中科院上海药物研究所的王明伟研究员等利用稳定共转染GLP-1受体和一个cAMP报告因子的细胞系，从化合物文库中近5万化合物中进行了筛选，发现了两个候选环丁烷结构：S4P和Boc5，能在细胞培养和小鼠活体模型上模拟胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的活性。其中Boc5注射或口服给药后成功降低了小鼠的摄食量。在II型糖尿病小鼠模型中，每日注射Boc5可以防止体重增长，降低糖化血红蛋白(血糖长期控制指标)。因此研究人员认为Boc5可能代表了一类全新的、无需注射的小分子，可用于治疗糖尿病、肥胖症及相关代谢性疾病。(Chen D，Liao J，Li N，Zhou C，Liu Q，Wang G Zhang R，Zhang S，Lin L，Chen K，Xie x，Nan F，Young AA，WangMW.A nonpeptidic agonist of glucagon-like peptide 1 receptors with efficacy in diabetic db/db mice.Proc Natl Acad Sci U S A.2007 Jan 16；104(3)：943-8.Epub 2007 Jan 9.)

重庆工商大学的殷菲等利用GLP-1受体和报告基因建立稳定的GLP-1受体激动剂筛选模型，从天然药物中筛选活性成分，并在PC12细胞中验证GLP-1受体激动剂的功能及作用机制。经过筛选、鉴定表明京尼平苷是一种新的GLP-1受体激动剂，能够通过MAPK信号通路诱导PC12细胞分化，对抗过氧化氢诱导的PC12细胞氧化损伤，提高神经细胞活力。因此京尼平苷具有与GLP-1受体激动剂类似的神经营养和神经保护功能。(殷菲，邓小红，景佳佳，郑旭煦，刘建辉.胰高血糖素样肽1受体激动的高通量筛选及作用机制研究.中国药学杂志，2007，42(1)，24-27.)

南开大学生命科学学院的陈家琪等用大鼠胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)基因，转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的CHO细胞，成功地构建了基于G蛋白偶联受体信号传导途径的CHO/EGFP/GLP-1R检测细胞系。该细胞系能功能性表达GLP-1R并且能通过cAMP偶联的EGFP报告基因的表达，来评价GLP-1R激动剂的活性。利用该细胞系进一步对5种GLP-1与金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)不同形式连接的融合蛋白进行了体外活性验证。结果表明，利用CHO/EGFP/GLP-1R细胞系，能够对GLP-1及其类似物的体外活性进行定性和定量的分析，为筛选和开发长效GLP-1类似物奠定了方法学基础。(陈家琪，高智慧，朱元元，杨文博，白钢.胰高血糖素样肽-1受体激动剂功能性报告基因分析系统的构建.南开大学学报(自然科学版)，2007，40(1)，92-98.)

发明内容

本发明的目的是提供一种新的体外筛选胰高血糖素样肽-1受体的多肽类激动剂的方法及筛选得到的多肽。

本发明的发明构思如下：

有文献报道，可利用基因工程制备的重组GLP-1受体的膜外N端片段来研究其与GLP-1、exendin-4的结合。竞争性实验表明GLP-1、exendin-4与重组的GLP-1受体膜外N端片段保持正常的亲和力。有人利用中国仓鼠卵巢细胞分别表达大鼠肺中GLP-1受体的cDNA和胰岛中GLP-1受体的cDNA，并进行药理学研究，其结果无显著性差异。因此，本发明以重组的GLP-1受体蛋白的膜外N端片段(N-GLP-1R)为靶点，利用其体外结合能力，并结合噬菌体展示技术和Phage-ELISA技术，建立了简便、快捷的体外高通量筛选GLP-1受体多肽类激动剂的方法，即筛选潜在的糖尿病药物的方法。

本发明一方面公开了一种体外筛选胰高血糖素样肽-1受体的多肽类激动剂的方法，包括下列步骤：

1、采用噬菌体展示技术构建待选GLP-1受体的多肽类激动剂的噬菌体展示文库；

2、先将N-GLP-1R包被在微孔反应板上，再将噬菌体展示文库加入微孔与包被的

N-GLP-1R相互作用，而后将与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体从微孔反应板上洗下，获得与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体；

3、将筛选得到的噬菌体感染宿主细胞，培养获得克隆，扩增后抽提噬菌体载体进行测序，获得与N-GLP-1R有特异性结合的多肽序列。

本发明中，待选GLP-1受体的多肽类激动剂的噬菌体展示文库可以是随机序列的多肽噬菌体展示文库如PH.D.^TM-7、PH.D.^TM-12和PH.D.^TM-C7C(New England Biolabs，Inc.，USA)，也可以是现有的多肽突变体的噬菌体展示文库，例如现有的GLP-1受体的配体如GLP-1、Exendin-4的突变体噬菌体展示文库。获得多肽噬菌体展示文库的方法可以有多种，如从New England Biolabs(NEB，USA)公司购买，或按报道(沈琼，宋聿文，韩威，丁艳丽，龚毅，袁勤生，BLyS改组噬菌体文库的构建及初步筛选，微生物学杂志，2006，26(5)，49-52)建立多肽突变体噬菌体展示文库等。

较佳的，上述步骤2后还包括与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体的富集，即把与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体从微孔反应板上洗下后，再培养扩增，而后将扩增获得的噬菌体库再次加入包被了N-GLP-1R的微孔进行反应，重复上述步骤2-3次，与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体，从待选GLP-1受体的多肽类激动剂的噬菌体展示文库中得到了富集。

较佳的，步骤3获得克隆后还包括用Phage-ELISA鉴定获得的克隆与N-GLP-1R的结合活性，筛选结合活性高的多肽序列。

本发明的实施例针对Exendin-4的突变体噬菌体展示文库来筛选GLP-1受体的多肽类激动剂。根据本发明的指导，并结合现有技术，所属技术领域的技术人员还可以利用其它多肽噬菌体展示文库，采用本发明的方法来实现GLP-1受体的多肽类激动剂的筛选。

本发明另一方面公开了经上述方法筛得的胰高血糖素样肽-1受体结合多肽，该多肽具有GLP-1R结合活性，该多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：7、8、10、11、12之一。其中SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10-12与N-GLP-1R的亲和力超过Exendin-4。

除了本发明实施例公开的噬菌体展示方法外，根据本发明公开的序列，上述多肽还可以由常规化学合成制备获得。也可将编码上述多肽的基因克隆入载体，利用原核或真核表达系统进行表达和纯化，通过常规的基因工程方法制得。

本发明第三方面，公开了将上述多肽用作制备胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1受体)激动剂的用途。本发明的实施例表明，作为exendin-4的突变体，本发明公开的多肽均可与N-GLP-1R特异结合，因此可用于制备胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1受体)激动剂。

本发明第四方面，公开了将上述多肽应用于制备抗糖尿病药物的用途。

本发明所说的抗糖尿病药物可以是一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂，参考Exendin-4的用法，也可以是对多肽进行化学修饰如聚乙二醇修饰的衍生物。药学上可接受的载体载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的多肽作为exendin-4的突变体，参考Exendin-4的用法，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。例如每天约100微克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

本发明建立的筛选方法与目前方法相比的优势及将产生的影响：

1、不需要进行共转染及培养细胞，更简便快捷。利用包被在微孔反应板(如96孔板)上的N-GLP-1R对展示在噬菌体表面上的多肽进行筛选并验证，一天之内即可完成，且只要有足够的96孔板，理论上筛选的样品数目没有限制。

2、只需一次制备足够量的N-GLP-1R，即可满足作为筛选靶点的需要。不需要对用作筛选的细胞不断进行传代，培养和诱导表达。

3、利用噬菌体展示技术将待选多肽类激动剂的基因型与表型联系起来，将筛选得到的噬菌体感染宿主细胞后，抽提噬菌体载体进行测序，可得到与N-GLP-1R有特异性结合的多肽序列。目前的方法多是针对非肽类激动剂进行筛选，必须对筛选得到的样品进行进一步的结构分析。

4、非肽类激动剂易在体外发生氧化、聚合等反应，改变自身的结构。王明伟研究员等筛选得到的小分子激动剂S4P和Boc5，是在无意之中使得原化合物发生了氧化和二聚化反应，形成了环丁烷结构，从而能够激活GLP-1受体。而发生这一意外之前，对化合物库中的五万多种小分子进行的筛选并无理想的结果，说明这种筛选非肽类激动剂的方法效率较低，成本较高。

5、以N-GLP-1R为靶点，既可以对随机序列的多肽噬菌体展示文库进行筛选，又可以对现有的多肽激动剂如GLP-1、Exendin-4的突变体噬菌体展示文库进行筛选，筛选到新的GLP-1受体多肽类激动剂的几率更大。

6、本发明还提供了与GLP-1受体亲和力比Exendin-4更高的多肽。

7、多肽类激动剂与GLP-1受体的作用机理较为明确，能在短时间内刺激胰岛细胞分泌胰岛素，达到降血糖的效果。而且GLP-1、Exendin-4等多肽类激动剂还不会造成低血糖的后果。因此GLP-1受体的多肽类激动剂作为治疗糖尿病的药物潜力巨大。本发明所建立的体外高通量筛选方法，为开发治疗糖尿病的多肽类药物提供了新的方法和思路，节省了筛选时间，降低了开发成本。

附图说明

图1：用于GLP-1受体N端片段表达的重组质粒pET28a(+)-N-GLP-1R

图2：N-GLP-1R的表达、复性和纯化。1道：诱导前；2道：诱导后8.5h；3道：变性蛋白；4道：复性蛋白；5-6道：收集穿出液；7道：分子量Marker。

图3：N-GLP-1R复性蛋白的Western Dotblotting实验。点1：N-GLP-1R蛋白；点2：融合蛋白Trx-His-Tag-exendin-4；点3：诱导前的菌体破碎样品。

图4：N-GLP-1R的HPLC纯化

图5：N-GLP-1R和exendin-4的化学交联。1道：阴性对照；2道：化学交联结果；3道：分子量marker。箭头所示就是化学交联反应后产生的新条带。

图6：对转化出的重组克隆进行酶切鉴定。1道：阳性对照；2-14道：重组克隆质粒的酶切结果；15道：DNAMarker。

图7：ELISA实验验证筛选方法。Phage-ELISA实验1、2和3是三次相互独立的实验；突变体A4：结合活性比突变前明显变高；突变体A8：结合活性比突变前没有明显变化；突变体A9：结合活性比突变前明显变低。

图8：exendin-4和突变体A4的结合能力曲线。图中结果代表三次相互独立实验中的一次。

图9：突变体A14、A29和A46的ELISA实验。Phage-ELISA实验1、2和3是三次相互独立的实验。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配制。

实施例1 GLP-1受体N端片段的表达、纯化及体外结合能力验证

1实验材料

1.1菌株和质粒

大肠杆菌DH5α(Novagen，USA)用以克隆质粒，大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen，USA)表达的宿主菌。pET28a(+)质粒购自Novagen公司。

1.2工具酶和试剂盒

反转录酶、限制性内切酶BamHI、Nco I、T4 DNA ligase、Taq DNA聚合酶和RNase购自Takara。Mini-DNA Fragment Rapid Purification Kit和Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit均购自北京博大泰克公司。RNA Extraction Kit，反转录反应试剂盒购自上海生工生物技术有限公司。

1.3抗体

His-tag抗体购自Novagen公司，HRP标记的羊抗鼠二抗购自北京博大泰克。

1.4实验用药品和试剂

丙烯酰胺、N，N’-亚甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED等试剂均购自Sigma公司，纯度为电泳级；异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、咪唑、β-巯基乙醇、Tris、甘氨酸、SDS、Tricine、葡萄糖、BSA标准品、琼脂糖、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽均购自上海捷倍思公司，为Ultra Pure；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)购自OXOID LTD.；考马斯亮蓝购自AMRECO公司。EDC、NHS、MES购自国药集团化学试剂有限公司。

甲醇、乙醇、丙三醇、冰乙酸、Na₂HPO₄、K₂HPO₄、KH₂PO₄、MgCl₂、CaCl₂、NaCl、KCl、HCl、NaOH、NiSO₄、EDTA、聚乙二醇10000均为分析纯级国产试剂。

1.5实验用溶液

1、液氮

2、50×TAE：(2M Tris-acetate，50mM EDTA，pH 8.0)

3、20×PBS：(2.74M NaCl，54mM KCl，0.2M Na₂HPO₄，36mM KH₂PO₄，pH 7.4)

4、1.5mol/L Tris·HCl，pH 8.8，0.5mol/L Tris·HCl，pH 6.8(4℃存放)

5、10％SDS，10％Aps(过硫酸铵)，TEMED

6、30％丙烯酰胺(Acr)/N，N/-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)

7、2×蛋白电泳loading buffer：(20％(v/v)Glycerol，4％(m/v)SDS，0.2％(m/v)Bromophenol blue，0.1M Tris-Cl(pH6.8)，2％(v/v)β-mercaptoethanol)

8、5×SDS-PAGE buffer：(1 25mM Tris，0.96M Glycine，0.5％(m/v)SDS)

9、10×Buffer、dNTP、ddH2O(用于PCR)

10、DNA电泳Marker

11、10×核酸loading buffer

12、无水乙醇、70％乙醇

13、包涵体变性溶液：(6M GdmHCl，0.5MTris，1mm EDTA，100mM DTT)

14、包涵体复性溶液：(100mM Tris，pH8.5，500mM L-Arg，1mMGSH，5mM GSSG)

15、NTA-0：(Tris 2.42g，NaCl 29.25g，Glycerol 100ml，定容至1L，pH7.9)

16、NTA-1000：(200ml NTA-0+13.2g咪唑)

2实验方法

2.1 N-GLP-1R的表达载体构建

根据NCBI数据库中大鼠肺组织来源的GLP-1受体mRNA序列(GenBank Accession No.S75952)设计引物Primer1和2。提取SD大鼠肺组织中总RNA的步骤按RNA Extraction Kit的说明进行。由英骏生物技术有限公司合成PCR引物Primer1和2，引物的序列如下：Primer1：5′ATCCATGGGCCATCATCATCATCATCACGCCGGCCCCCGCCCCCAGGGT 3′(SEQ ID NO：1)；Primer2：5′GGATCCTTAGTACAGCGACAGGAGCTGTTC 3′(SEQ IDNO：2)。

反转录按以下步骤进行：1、18.0μl总RNA和1.0μl 10mM primer 2混合入预先用0.1％DEPC处理过的1.5ml离心管中；2、70℃加热5min，立即冰上放置5min，10,000rpm离心2min后，取上清液；3、上清液中加入6.0μl 10mM dNTP，4.0μlAMV反转录酶，10.0μl5×buffer和11.0μl ddH₂O，混匀。50℃下培养1h后置于冰上。

以得到的反转录反应的产物为模板，Primer1和2为引物进行PCR。用纯化试剂盒纯化后，即得到N-GLP-1R的基因片段。将BamHI和NcoI酶切的pET28a(+)及N-GLP-1R的基因片段进行纯化并14℃连接过夜，得到重组载体pET28a(+)-N-GLP-1R。将重组载体转入大肠杆菌DH5α，涂布在含卡那霉素的LB平板上。挑选单菌落通过PCR和DNA测序进行鉴定，并将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)。

2.2 N-GLP-1R在大肠杆菌中的表达

取活化的种子以2％接种量接入到含100m12×YT培养基(含100μg/ml卡那霉素)的250ml摇瓶中，37℃，220rpm培养至OD₆₀₀值为0.8-0.9时加入0.5mmol/L异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，每隔一定时间取样一次。以SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定表达结果。

2.3 N-GLP-1R包涵体的变复性和纯化

将表达宿主菌诱导后的培养液400ml在4℃，4,000rpm离心20min收集菌体。菌体用40ml0.5mol/L，pH 8.3的Tris-HCl缓冲液重悬。悬浮细胞经超声波破壁(功率400w，每次工作4s，间隔4s，工作125次)后4℃，10,000rpm离心10min收集沉淀。

在沉淀中加入10ml包涵体变性溶液(6M GdmHCl，0.5M Tris，1mM EDTA，100mMDTT)，搅匀后常温溶解1.5h，用盐酸调至pH 4.0后10,000rpm离心25min。取离心后的上清装入3500Da透析袋，在200ml 4M GdmHCl，pH3.0中透析16-18h，透析两次。将透析后的产物20,000rpm离心15min，取上清液分管冻存。

在150ml复性溶液(100mM Tris，pH 8.5，500mM L-Arg，1mMGSH，5mM GSSG)中缓缓加入2ml变性蛋白溶液，每过6h再加入另外2ml变性蛋白溶液，至全部加完，400rpm搅拌。将复性溶液20,000rpm离心30min后，上清用500ml NTA-0溶液(Tris 2.42g，NaCl 29.25g，Glycerol 100ml，定容至1L，pH 7.2)进行稀释。

将稀释后的上清液上样至NTA-0缓冲液预平衡的Ni²⁺亲和层析柱(16*100mm，Amersham Pharmacia Biotech，Sweden)。上样流速4ml/min，然后以50-600mM咪唑线性梯度洗脱30min。将含有目标蛋白的洗脱液放入透析袋，在1000倍体积的透析缓冲液(50mMTris-HCl，100mM NaCl，pH 7.2)中4℃透析过夜。4℃，10000rpm离心15min，收集上清。复性蛋白浓度由Bradford法测定，Western Dot Blotting鉴定的步骤按所报道的进行(Yin X，Wei D，Yi L，Tao X，Ma Y.Expression and purification of exendin-4，a GLP-1 receptor agonist，in Escherichiacoli[J].Protein Expres and Purif，2005，41：259-265.)。

2.4 N-GLP-1R复性蛋白的HPLC纯化

采用HPLC 1100 series(Agilent，USA)和XDB-C18柱(9.4×250mm，Agilent，USA)进行进一步纯化。流动相中含有0.1％的三氟乙酸，乙腈的梯度为5％-90％线性梯度，在1.5ml/min流速下进行50min。在280nm出峰的穿出液都用12％SDS-PAGE检验。纯化得到的样品送入冻干机(ALPHA 2-4LSC，Christ，German)冻干，-20℃保存。

2.5 N-GLP-1R复性蛋白和重组exendin-4的化学交联(Cross-linking)实验

实验中得到的N-GLP-1R复性蛋白可以通过化学交联的方法检测其与配体重组exendin-4(按文献Yin X，Wei D，Yi L，Tao X，Ma Y.Expression and purification of exendin-4，aGLP-1 receptor agonist，in Escherichia coli[J].Protein Expres and Purif，2005，41：259-265公开的方法制得)之间的亲和作用。

化学交联反应体系如下：

0.2mg/ml exendin-4               20μl

0.2mg/ml N-GLP-1R复性蛋白        20μl

0.5M MES缓冲液                   4μl

100mM EDC                        0.9μl

100mM NHS             0.9μl

25℃水浴中反应15min后再向反应体系中加入0.9μl 100mM EDC和0.9μl 100mM NHS，使终浓度达到4mM。25℃水浴继续反应30min后，加入0.15M β-巯基乙醇终止反应。反应产物用12％SDS-PAGE进行分析。

3结果与讨论

3.1 N-GLP-1R表达载体的构建

GLP-1受体在大鼠肺部组织中能够高表达。所表达的GLP-1受体与人胰岛细胞中表达的几乎完全相同，仅有的一个碱基替换发生在977位，导致第五跨膜区323位的缬氨酸变成了异亮氨酸。利用中国仓鼠卵巢细胞分别表达大鼠肺中GLP-1受体的cDNA和人胰岛中GLP-1受体的cDNA，并进行药理学研究，其结果没有显著差异。因此，大鼠肺中GLP-1受体的cDNA可以用来表达N-GLP-1R，并进行相关研究。

根据Genbank数据库中大鼠肺部组织中GLP-1受体的mRNA序列(GenBank AccessionNo.S75952)设计引物，两端加上酶切位点BamHI和NcoI及His-tag和终止子密码子(图1)。通过RT-PCR得到编码GLP-1受体N端125个氨基酸的N-GLP-1R基因片段，SEQ ID NO：3的后125个氨基酸即GLP-1受体N端的125个氨基酸。

SEQ ID NO：3

9

MGHHHHHH AGPRPQGATV SLSETVQKWR EYRHQCQRFL TEAPLLATGL

49 FCNRTFDDYA CWPDGPPGSF VNVSCPWYLP WASSVLQGHV YRFCTAEGIW

99 LHKDNSSLPW RDLSECEESK QGERNSPEEQ LLSLY

3.2 N-GLP-1R的表达及纯化

在37℃下，在SB培养基(蛋白胨30 g/L，酵母粉20g/L，MOPS 10g/L)中培养到OD₆₀₀＝0.9时，加入终浓度0.5mM的IPTG诱导后8.5h，表达量达到最大，占菌体总蛋白的30％(图3，2道)。电泳图中蛋白条带的分子量与理论分子量14.6KDa一致。

由于N-GLP-1R以包涵体的形式存在，必须进行变复性，才能得到正确折叠的目的蛋白。包涵体用6M GdmHCl在强还原条件下变性溶解。复性过程中，必须要让复性溶液中的变性蛋白的浓度始终维持在低水平，因此本实验采用脉冲式加样方法，即每隔6h在150ml复性溶液中加入2ml的变性蛋白并保持搅拌，共36h。复性完成后溶液需要用500ml NTA-0溶液进行稀释，然后过柱纯化。

脉冲式的复性过程使得复性蛋白最终可以在较高的浓度下得到复性，同时避免聚合体的形成。有报道称L-arginine可以通过额外的亲水作用稳定蛋白的正常结构(RudolphR，FischerMattes S.Process for the Activitation of T-PA or ING after Genetic Expression in Prokaryotes[P].UnitedStates Patent：5,453,363，1995.Timasheff S N，Arakawa T.A Practical Approach，in：Protein Structure[M].Oxford：Oxford University Press，1997.349-364.)，并减少非折叠蛋白或折叠中间体的聚合(DeBernardez C E，Schwarz E，Rudolph R.Inhibition of aggregation side reactions during in vitro protein folding[J]Methods Enzymol，1999，309：217-236.)。氧化/还原谷胱甘肽系统可以使发生错误配对的二硫键得以迅速重排，这一点对于蛋白质的正确折叠非常重要(Rudolph R，Bohm G，Lilie H，Jaenicke R.A Practical Approach，in：Protein Function[M].Oxford：Oxford University Press，1997.57-99.)。

利用Ni²⁺亲和层析柱，采用梯度洗脱的方式纯化。N-GLP-1R复性蛋白在150mM咪唑时被洗脱下来。12％SDS-PAGE分析纯化结果(图2，5-6道)，纯化后的融合蛋白的纯度可以达到90％以上。

利用Western Dot Blotting验证N-GLP-1R的表达。融合蛋白Trx-His-Tag-exendin-4(参考文献(Yin X，Wei D，Yi L，Tao X，Ma Y.Expression and purification of exendin-4，a GLP-1 receptor agonist，in Escherichia coli[J].Protein Expres and Purif，2005，41：259-265.制得)为阳性对照，诱导前的菌体破碎样品为阴性对照。结果如图3所示，说明纯化得到的蛋白带有His-tag标签，为诱导表达的N-GLP-1R蛋白。

3.3 N-GLP-1R的HPLC纯化

为了得到高纯度的N-GLP-1R复性蛋白，使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对样品进行进一步的纯化。结果如图4所示，图中只有1个主要的峰，保留时间为24.467min。各洗脱收集液经12％SDS-PAGE检测，结果显示，保留时间为24.467min的峰是目标蛋白峰。

经过对N-GLP-1R纯化过程中的各阶段样品进行浓度测定和电泳照相分析，得到N-GLP-1R的收率为32.14％(表1)。

表1 N-GLP-1R的纯化

破菌上清a(mg)b	包涵体(mg)c	纯化后的N-GLP-1R(mg)b	收率(％)d
				119.13	51.05	16.41	32.14

^a破菌上清是400ml培养液中收集的E.coli BL21(DE3)菌体超声破碎得到的；

^b目标蛋白的浓度由Brandford方法测得；

^c包涵体的量是由蛋白电泳照片上各泳道蛋白条带的密度扫描结果和破菌上清的量得到的；

^d收率是N-GLP-1R的得率。

3.4 N-GLP-1R的体外结合能力验证

N-GLP-1R与exendin-4经化学交联反应后，通过SDS-PAGE检测，发现有一条新条带，分子量大小与N-GLP-1R和exendin-4的分子量之和相符(图5)。阴性对照使用的是变性的N-GLP-1R，实验前在50℃下，50mM DTT和2％SDS中处理10min。在阴性对照中则没有新的条带产生。这个结果表明N-GLP-1R对exendin-4具有特异性的亲和力。

实施例2 Exendin-4突变体的噬菌体展示文库的构建及筛选

1实验材料

1.1菌株、质粒和工具酶

大肠杆菌XL1-Blue(Novagen，USA)用来作为噬菌体展示载体的宿主菌。噬菌体载体pfUSE5(按G.P.Smith，J.K.Scott.Libraries of peptides and proteins displayed on filamentousphage，Methods in Enzymology，Volume 217，1993，228-257文献制得)用来展示多肽。辅助噬菌体VCSM 13购自Strategene公司(Lajolla，CA，USA)。限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自Takara。

1.2实验用药品和试剂

异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、Tris、葡萄糖、BSA标准品、琼脂糖均购自上海捷倍思公司，为Ultra Pure；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(YeastExtract)购自OXOID LTD.。

乙醇、丙三醇、Tween-20、MgCl₂、NaCl、HCl、NaOH、浓硫酸均为分析纯级国产试剂。

1.3抗体和显色底物

小鼠抗M13-HRP单克隆抗体和显色底物tetramethylbenzidine (TMB)购自PhamaciaBiotech公司。

.1.4试剂盒

Mini-DNA Fragment Rapid Purification Kit和Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit均购自北京博大泰克公司。

1.5培养基及溶液配制

表2培养基与缓冲液

名  称	成  份	备注
			SB培养基		用于大肠杆菌XL1-Blue的培养
胰蛋白胨酵母抽提物MOPSAgar	30g/L20g/L10g/L15g/L	不含琼脂的培养基即为相应液体培养基
			顶层琼脂		用于测定噬菌体滴度
蛋白胨酵母提取物NaCl	10g/L5g/L5g/L

MgCl2·6H2OAgar	1g/L7g/L
			GYT		用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存
蛋白胨酵母提取物	0.25％0.125％	用于电转化感受态细胞的制备
			甘油	10％
0.2M HCl-Glycine		HCl调pH至2.2
			GlycineBSA	0.2M1mg/ml	用于噬菌体的洗脱
中和Buffer		PH 8.0
			Tris-HCl	1M	用于洗脱后噬菌体的中和
PBST
			Tween-20	0.5％	用PBS配制
PBSM
			脱脂奶粉	5％	用PBS配制

2实验方法

2.1 Exendin-4突变体基因的获得

引入随机突变的几种方法中以错配PCR这一方法最为简单有效，最高的碱基突变率可以达到2.8％。利用这种方法，可使得到的大部分exendin-4突变株中的碱基突变为2～3个，符合最理想的诱变结果中，目标基因内有1.5～5个碱基发生碱基突变的要求。

由英骏生物技术有限公司合成PCR引物Primer1和2，引物的序列如下：

Primer1：5’ATGGCCCAGCCGGCCCATGGCGAAGGCACCTTTACC 3’(SEQ ID NO：

4)

Primer2：5’GGCCCCCGAGGCCGCTTGGTGGTGGTGCACCGCT3’(SEQ ID NO：5)

错配PCR共进行两轮PCR。在第一轮PCR中，以重组质粒pET32a(+)-exendin-4(参考文献(Yin X，Wei D，Yi L，Tao X，Ma Y.Expression and purification of exendin-4，a GLP-1receptor agonist，in Escherichia coli[J].Protein Expres and Purif,2005，41：259-265.制得)为模板，引物Primer1和2为上下游引物，在常规PCR反应体系的基础上，加入了5mmol/L MgCl₂，0.5mmol/L MnCl₂，1mmol/L dTTP和1mmol/L dCTP，共30个循环。在第二轮PCR反应中，以第一轮PCR产物作为模板，其他条件不变。

2.2噬菌体展示载体的构建

1、将上述纯化后的PCR产物和抽提的噬菌体载体pfUSE5进行如下酶切反应。

用Sfi I单酶切：

pfUSE5/PCR产物             20μl

10×M buffer                   3μl

Sfi I                          1μl

无菌水                         6μl

30μl反应体系50℃反应4小时。

2、将酶切后的pfUSE5以及PCR产物进行纯化并连接，10μl反应体系如下：

10×Buffer                     5μl

酶切后的pfUSE5                 2μl

酶切后的PCR产物                3μl

T4 DNA ligase                  1μl

14℃反应过夜

连接后得到重组噬菌体载体pFUSE5-Ex4。

2.3电穿孔感受态细胞的制备

1、在M9平板上挑E.coli XL1-Blue单克隆接种至50ml SB培养基(含100μg/ml Tet)中，37℃培养过夜；

2、次日转接至1L SB培养基(含1％glucose，50μg/ml Amp，100μg/ml Tet)，37℃培养至OD₆₀₀＝0.35-0.40；

3、将培养物置于冰浴中冷去20min，培养液倒入预冷的离心管中，2,500rpm 4℃离心15min，弃上清，用500ml预冷的ddH₂O悬浮细胞；

4、2,500rpm 4℃离心20min，弃上清，用250ml预冷的10％甘油悬浮细胞；

5、2,500rpm 4℃离心20min，弃上清，用10ml预冷的10％甘油悬浮细胞；

6、2,500rpm 4℃离心20min，弃上清，加1ml预冷的GYT悬浮细胞；

7、取出部分稀释100倍测OD₆₀₀(1.0 OD₆₀₀＝2.5×10¹⁰个细胞/ml)；

8、用预冷的GYT稀释至3×10¹⁰个细胞/ml，分装100μl/管，-80℃保存。

2.4电穿孔转化

1、将感受态细胞及重组噬菌体载体混合，在冰浴中放置1min，加入预冷的0.2cm电击小杯中，放入电击仪；

2、设置电击参数：电脉冲25μF，电压2.5 kV，电阻200Ω，经行电击；

3、然后立即加入1ml预冷的SB培养基，将细菌转移至玻璃管中，37℃ 250rpm培养1h；

4、取10ml培养液用SB培养基作系列稀释，分别涂布于SB平板上(含1％glucose，100μg/ml Tet，50μg/ml Amp)，用于计算转化率；

5、其余转化液涂布于数个SB平板(含1％glucose，100μg/ml Tet，50μg/ml Amp)，37℃培养过夜。

2.5噬菌体的大量扩增及库的保存

1、过夜培养的转化平板上加入适量SB培养基，刮取平板上的所有菌体，转接于250mlSB培养基(含1％glucose，100μg/ml Tet，50μg/ml Amp)中；

2、37℃培养至对数生长期，加入辅助噬菌体VCSM13(1×10¹²/ml)1ml，加入IPTG，使终浓度为0.5mM，室温静置30min；

3、加入新鲜的250ml SB培养基(含1％glucose，100μg/ml Tet，50μg/mlAmp)；

4、30℃培养2h后再加入卡那霉素(终浓度70μg/ml)，30℃培养过夜；

5、次日收集菌体上清，加入PEG及NaCl(终浓度为4％PEG+3％NaCl)，沉淀噬菌体；

6、冰浴放置0.5h，8,000rpm 4℃离心30min，沉淀用PBS充分溶解，加入甘油至终浓度10％，分装后-80℃保存。

2.6噬菌体滴度的测定

1、挑E.coli XL1-Blue单克隆至5ml SB培养基(含1％glucose，100μg/ml Tet，50μg/mlAmp)中，摇至OD₆₀₀为0.5左右；

2、融化顶层琼脂，置50℃水浴保温；

3、将SB平板(含1％glucose，100μg/ml Tet，50μg/ml Amp)放置于37℃培养箱中预热；

4、取4支1.5ml离心管，分别标记，用SB对样品进行10倍倍比稀释。扩增后的噬菌体稀释10⁸-10¹¹倍，未经扩增淘洗得到的噬菌体稀释10¹-10⁴。为避免交叉污染，每次更换枪头；

5、取200μl培养至对数生长期的E.coli XL1-Blue菌液放入5ml离心管中，然后分别加入10μl稀释好的噬菌体样品，室温静置5min；

6、在每个离心管中加入约3ml顶层琼脂，迅速混匀倾于SB平板，旋转平板使顶层琼脂铺匀。放凉后，置37℃培养箱倒置培养过夜。

7、次日对噬菌斑计数以测定噬菌体的梯度。

2.7生物富集(Biopanning)

1、N-GLP-1R(25μg/ml)300μl包被96孔板的微孔，4℃过夜；

2、弃去包被液，水洗数次后加入PBSM，37℃封闭1h；

3、弃去封闭液，水洗数次后拍干，加入噬菌体文库300μl，37℃温育2小时；

4、弃掉未结合的噬菌体并拍干，依次用ddH₂O、PBST(0.3％Tween-20)、PBS和ddH₂O各洗涤数次(自第二轮起将TBST中的Tween-20含量提高至0.5％)；

5、加入300μl 0.2M HCl-Glycine进行特异性洗脱，缓摇8分钟后吸入一离心管中，迅速加入18μl 1M Tris-HCl(pH 8.0)进行中和，即得到洗脱的噬菌体；

6、将洗脱的噬菌体取出5μl用于噬菌体滴度的测定，其余加入1ml处于对数生长期的E.coli XL1-Blue，室温静置30min；

7、将菌液涂布于数块SB平板(含1％glucose，100μg/ml Tet，50μg/ml Amp)，37℃培养过夜；

8、次日收集平板上的菌体，转接于100ml SB培养基(含1％glucose，100μg/ml Tet，50μg/mlAmp)，37℃培养至对数生长期，加入辅助噬菌体VCSM13(1×10¹²/ml)1ml，室温静置30min；

9、加入IPTG，使终浓度为0.5mM，加入新鲜的250ml SB培养基(含1％glucose，100μg/mlTet，50μg/ml Amp)；

10、30℃培养2h后再加入卡那霉素(终浓度70μg/ml)，30℃培养过夜；

11、次日收集菌体上清，加入PEG及NaCl粉末(终浓度为4％PEG+3％NaCl)，沉淀噬菌体；

12、冰浴放置0.5h，8,000rpm 4℃离心30min，沉淀用PBS充分溶解；

13、加入20％PEG/15％NaCl使得终浓度为4％PEG+3％NaCl，再次沉淀噬菌体；冰浴放置0.5h，8,000rpm 4℃离心30min，弃上清，再次离心5min，以甩下管壁上液体，最后将离下的残余液体吸弃，用1ml PBS悬浮沉淀；

14、10,000rpm离心1min以沉淀不溶物，转移上清至一新管中，此即扩增后纯化的噬菌体；

15、噬菌体扩增后重复上述步骤，进行下一轮淘洗，共三轮。

2.8 Phage-ELISA检测和筛选

1、N-GLP-1R(25μg/ml)50μl包被96孔板的微孔，4℃过夜；

2、弃包被液，水洗数次后加入PBSM，37℃封闭1h以上；

3、弃封闭液，用PBST(0.5％Tween-20)洗板6次，每次拍干；

4、加入50μl单克隆噬菌体上清(1×10¹²/ml)，37℃温育3h以上；

5、弃噬菌体液，PBST洗板25次，每次拍干；

6、将HRP标记的小鼠抗M13噬菌体抗体(用封闭液1∶1000稀释)50μl加入到各个孔中，37℃温育1h；

7、甩掉抗体，用PBST洗板25次，每次拍干；

8、加入TMB显色底物显色，以2M H₂SO₄终止反应，测OD₄₅₀。

3实验结果与讨论

3.1 Exendin-4突变体展示文库的构建

易错PCR产物用Sfi I酶切消化(DNA 5μg，Sfi I 50U)，50℃充分反应4h，凝胶电泳回收目的片段。载体pfUSE5也经过相同的步骤酶切纯化。调整外源与载体的连接比例为3∶1，其中载体片段的投入量约100ng。T4连接酶16℃连接过夜，连接产物稀释20倍后每1μl加入40μl E.coli XL1-Blue电转感受态细胞进行电转化，稀释涂布记数。涂布大量平板获得exendin-4突变体文库，库容量为1×10⁷。随机挑选13个克隆，经过Sfi I酶切鉴定(如图6)及PCR鉴定，其中10个克隆都含有大小为150bp左右的外源片断。

刮取平板上的所有过夜培养克隆，转接入SB液体培养基(含1％glucose，100μg/ml四环素，50μg/ml氨苄青霉素)中，经IPTG诱导后，加入辅助噬菌体VCSM13和卡那霉素扩增噬菌体库，所有的噬菌体颗粒用PEG/NaCl沉淀两次后，用PBS溶解并加入10％甘油，-70℃冻存。

3.2 Exendin-4突变体展示文库的筛选

3.2.1生物富集(Biopanning)

上述构建的exendin-4突变体噬菌体展示文库经过系列稀释后，感染E.coli XL1-Blue，计算出噬菌体库的滴度为1.0×10¹²pfu。每轮biopanning输入的噬菌体约1.0×10¹²，噬菌体库加入96孔板与包被的N-GLP-1R相互作用，经PBST和PBS数次洗涤除去非特异性结合的噬菌体颗粒，用盐酸将与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体洗下来，立即用Tris-HCl中和，然后感染处于对数生长期的E.coli XL1-Blue，涂布SB平板(含1％glucose，100μg/ml四环素，50μg/ml氨苄青霉素)，次日刮取菌体转接于SB液体培养基(含1％glucose，100μg/ml四环素，50μg/ml氨苄青霉素)中，加入辅助噬菌体VCSM13，IPTG和卡那霉素大量扩增噬菌体。培养过夜后收集上清，PEG/NaCl沉淀噬菌体，PBS溶解，计算噬菌体梯度后，进行下一轮的Biopanning。经过三轮的panning，与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体从exendin-4突变体噬菌体展示文库中得到了富集。三轮富集后，输出的噬菌体数由10⁵增加到10⁷，富集比率(输出噬菌体数/输入噬菌体数)由10^-7上升至10^-5，见表3。

表3噬菌体展示文库筛选中的噬菌体富集

富集轮数	输出噬菌体数(Loadedphages)(pfu)	输入噬菌体数(Elutedphages)(pfu)	噬菌体富集比例(Phagerecovery(％))
				123	1×10121×10121×1012	1×1051×1061×107	10-710-610-5

3.2.2 Phage-ELISA实验验证筛选方法

从第三轮洗脱下的噬菌体中，随机挑选10个分隔良好的克隆，分别在3ml新鲜的E.coliXL1-Blue菌液中扩增。将扩增的噬菌体用PEG/NaCl纯化后，通过ELISA鉴定各个克隆与N-GLP-1R的结合活性，以展示有未突变exendin-4的噬菌体为阳性对照，辅助噬菌体VCSM13为阴性对照(表4)。

表4 Phage-ELISA实验验证筛选方法数据

	阳对	A1	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8	A9	A10	阴对
													样品	0.455	0.447	0.552	0.607	0.667	0.256	0.562	0.565	0.428	0.248	0.315	0.151
复孔	0.455	0.431	0.568	0.577	0.669	0.236	0.47	0.567	0.424	0.218	0.328	0.137

从以上的实验数据可以看到，根据挑选的单克隆与阳性对照，即未突变的exendin-4相比，与N-GLP-1R的结合活性可以分为三种类型：结合活性比突变前明显变高的(A4)；结合活性比突变前没有明显变化的(A8)；结合活性比突变前明显变低的(A9)。将A4、A8和A9再次进行扩增，取扩增后的噬菌体与阳性对照和阴性对照进行三次相互独立的ELISA实验。结果如图7所示。

对A4、A8和A9进行测序，与测序结果相应的氨基酸序列如表5所示。表中突变过的氨基酸序列用粗体和斜体来表示。突变体A4的序列中发生了四个点突变，其中三个造成了14、19和21位三个氨基酸的变化，第四个则造成了第27位的氨基酸残基变成了终止子。突变体A8的两个突变发生在第8位和第17位，造成了两个氨基酸的变化。由于突变体A9的第一个碱基发生了移码突变，导致其氨基酸序列与exendin-4完全不同，并在第22位氨基酸残基处突变成了终止子。

表5突变体A4、A8和A9的测序结果

名称	氨基酸序列
		Exendin-4	HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEWLKNGG PS SGA PPPS(SEQ ID NO：6)
突变体A4	HGEGT FTSDL SKQVE EEAER PFIEWL(SEQ ID NO：7)
		突变体A8	HGEGT FTGDL SKQME EDAVR LFIEWLKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID NO：8)
突变体A9	MAKAP YQRSE QTDGR RSGAS VY(SEQID NO：9)

Thornton and Gorenstein发现GLP-1的三维结构中有一段α螺旋区，其中第13和第22个氨基酸在这段螺旋区的同一个表面，这一点对GLP-1和GLP-1受体的结合非常重要(Neidigh JW，Fesinmeyer RM，Prickett KS，Andersen NH.Exendin-4 and glucagon like-peptide-1：NMRstructural comparisons in the solution and micelle-associated states[J].Biochemistry，2001，40：13188-13200)。由于GLP-1和exendin-4在氨基酸序列和三维结构上的相似性，exendin-4的第14、19和21位三个氨基酸可能直接参与了exendin-4和GLP-1受体的结合，或者处于exendin-4和GLP-1受体的结合位点附近。因此突变体A4中第14、19和21位氨基酸的突变所导致的exendin-4螺旋区的紧密程度变化以及亲水、疏水氨基酸暴露给GLP-1受体的氨基酸残基的不同，很可能是突变体A4与N-GLP-1R的结合活性明显变高的原因，尽管没有在C段的13个对与GLP-1受体结合有贡献的氨基酸。

在exendin-4的N端第8位的氨基酸已经被证明在与GLP-1受体的结合当中没什么贡献(De Maturana RL，Willshaw A，Kuntzsch A，Rudolph R，Donnelly D.The isolated N-terminal domain of theglucagon-like peptide-1(GLP-1)receptor binds exendin peptides with much higher affinity than GLP-1[J].JBiol Chem，2003，278：10195-10200)，因此突变体A8的N端第8位氨基酸变化不会对其与N-GLP-1R的结合活性有影响。因为第16位的氨基酸对维持整个螺旋区的结构有作用，并作为第二段螺旋区的N-cap结构起保护作用，因此在第16位氨基酸保护下的第17位氨基酸的变化也不会对其与N-GLP-1R的结合活性有影响。所以突变体A8与N-GLP-1R的结合活性没有产生明显的变化。

突变体A9的结合能力远远低于阳性对照，仅高于阴相对照，这与它的序列和exendin-4完全不同，且只有21个氨基酸的测序结果相符。

为了进一步分析突变体A4与N-GLP-1R的结合活性，将阳性对照和突变体A4的单克隆用50ml SB(含1％glucose，100μg/ml四环素，50μg/ml氨苄青霉素)进行大量扩增噬菌体，实验方法同前。培养过夜后收集上清，PEG/NaCl沉淀噬菌体，PBS溶解，调整噬菌体滴度为10¹²后，分别稀释50，80，10²，10³，10⁴和10⁵倍。每份样品都用Phage-ELISA实验检测与N-GLP-1R的结合活性。结果如图8所示。

结果显示，随着噬菌体滴度的增加，exendin-4、突变体A4与N-GLP-1R的结合活性都随之提高。这说明展示了野生型exendin-4与突变体A4的噬菌体都可以和N-GLP-1R进行特异性的结合。除了最低的10⁷滴度(由于信号太弱，看不出区别)，突变体A4与N-GLP-1R的结合活性都明显高于exendin-4与N-GLP-1R的结合活性。

3.2.3进一步筛选exendin-4突变体噬菌体展示文库

从第三轮洗脱下的噬菌体中，再随机挑选分隔良好的克隆，分别在新鲜的E.coliXL1-Blue菌液中扩增。将扩增的噬菌体用PEG/NaCL纯化后，通过ELISA鉴定各个克隆与N-GLP-1R的结合活性，以带有未突变exendin-4的噬菌体为阳性对照，辅助噬菌体VCSM13为阴性对照。结果又发现三个突变体A14、A29和A46，与N-GLP-1R的结合活性明显比exendin-4与N-GLP-1R的结合活性高(图9)。

与这三个突变体测序结果相应的氨基酸序列如表6所示。表中突变过的氨基酸序列用粗体和斜体来表示。突变体A14的序列中发生了三个点突变，分别造成了16、31和33位三个氨基酸的变化。突变体A29由于在第11位氨基酸发生了移码突变导致其后13个氨基酸序列与野生型的exendin-4完全不同，并在第23位氨基酸残基处突变成了终止子。突变体A46的序列中发生了七个点突变，分别造成了15、16、19、21、24、26和27位七个氨基酸的变化。

表6突变体A14、A29和A46的测序结果

名称	氨基酸序列
		Exendin-4	HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEWLKNGG PSSGA PPPS(SEQ ID NO：6)
突变体A14	HGEGT  FTSDL  SKQME  VEAVR  LFIEWLKNGG QSNGA PPPS(SEQ ID NO：10)
		突变体A29	HGEGT FTSDL IQTDG RRSGA SAY(SEQ IDNO：11)
突变体A46	HGEGT FTSDL SKQMG GEAAR QFIVWQRNGG PSSGA PPPS(SEQ ID NO：12)

突变体A14与N-GLP-1R的结合活性远高于阳性对照。Exendin-4的C端有一个Trp-cage结构，主要起到稳定exendin-4的C端的作用，第31和33位的氨基酸都被包围在这个结构之内，不会参与到与GLP-1受体的结合中去。因此第16位氨基酸的变化是影响突变体A14与N-GLP-1R的结合活性的因素。

Exendin-4的第16位氨基酸对维持整个α螺旋区的结构起保护作用，可以降低螺旋区域的熵值，增加稳定性。而突变体A14中第16位氨基酸从一个亲水性的氨基酸E突变成了疏水性的氨基酸V，由于氨基酸V在空间上柔性更大，允许突变体的α螺旋区在与受体片段的结合过程中能够调整角度，使同一α螺旋面上的疏水氨基酸更好的排列，并参与和受体片段的结合。这是突变体A4与N-GLP-1R的结合活性明显变高的原因。

在exendin-4的N端前8位的氨基酸已经被证明在与GLP-1受体的结合当中没什么贡献，因此突变体A29与N-GLP-1R的结合活性主要依靠其后15个氨基酸进行，而这15个氨基酸中只有2个氨基酸与突变前相同。如表2.5所示，这说明突变体A29在与GLP-1受体结合中起作用的是一段全新的序列，这段全新的序列将提供更多的GLP-1受体与激动剂结合的信息，并为寻找GLP-1受体的新的多肽类激动剂提供了依据和思路。

突变体A46序列中发生了七个点突变，第15、16位氨基酸都从亲水性的氨基酸E突变成了疏水性的氨基酸，由于疏水相互作用，氨基酸的残基将更倾向于多肽的内部，使得exendin-4的整个螺旋区结构更加稳定，这是促使突变体A46与N-GLP-1R的结合活性明显变高的因素。突变体A46中第19和21位氨基酸的突变所导致的exendin-4螺旋区的紧密程度变化以及暴露给GLP-1受体的氨基酸残基的不同，也会影响突变体A46与N-GLP-1R的结合活性发生变化。但正如24、26和27位氨基酸发生的变化一样，还没有进一步的证据证明这些变化能给突变体A46与N-GLP-1R的结合活性，带来正面的因素或是负面的因素。但是可以肯定的是，这些所有氨基酸的变化的结果是使突变体A46与N-GLP-1R的结合活性明显升高了。

序列表

<110>华东理工大学

<120>体外筛选胰高血糖素样肽-1受体的多肽类激动剂的方法

<130>070607

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>49

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>1

atccatgggc catcatcatc atcatcacgc cggcccccgc ccccagggt                  49

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>2

ggatccttag tacagcgaca ggagctgttc                                       30

<210>3

<211>133

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus

<400>3

Met Gly His His His His His His Ala Gly Pro Arg Pro Gln Gly Ala

1               5                   10                  15

Thr Val Ser Leu Ser Glu Thr Val Gln Lys Trp Arg Glu Tyr Arg His

            20                  25                  30

Gln Cys Gln Arg Phe Leu Thr Glu Ala Pro Leu Leu Ala Thr Gly Leu

        35                  40                  45

Phe Cys Asn Arg Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Cys Trp Pro Asp Gly Pro

    50                  55                  60

Pro Gly Ser Phe Val Asn Val Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Ala

65                  70                  75                  80

Ser Ser Val Leu Gln Gly His Val Tyr Arg Phe Cys Thr Ala Glu Gly

                85                  90                  95

Ile Trp Leu His Lys Asp Asn Ser Ser Leu Pro Trp Arg Asp Leu Ser

            100                 105                 110

Glu Cys Glu Glu Ser Lys Gln Gly Glu Arg Asn Ser Pro Glu Glu Gln

        115                 120                 125

Leu Leu Ser Leu Tyr

    130

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>4

atggcccagc cggcccatgg cgaaggcacc tttacc                                36

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>5

ggcccccgag gccgcttggt ggtggtgcac cgct                                  34

<210>6

<211>39

<212>PRT

<213>Heloderma suspectum

<400>6

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1               5                   10                  15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

             20                 25                  30

 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

         35

<210>7

<211>26

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>Exendin-4的突变体

<400>7

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Val Glu Glu

1               5                   10                  15

Glu Ala Glu Arg Pro Phe Ile Glu Trp Leu

            20                  25

<210>8

<211>39

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>Exendin-4的突变体

<400>8

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Gly Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1               5                   10                  15

Asp Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

        35

<210>9

<211>22

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>Exendin-4的突变体

<400>9

Met Ala Lys Ala Pro Tyr Gln Arg Ser Glu Gln Thr Asp Gly Arg Arg

1               5                   10                  15

Ser Gly Ala Ser Val Tyr

            20

<210>10

<211>39

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>Exendin-4的突变体

<400>10

His Gly Glu 6ly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Val

1               5                   10                  15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Gln Ser

            20                  25                  30

Asn Gly Ala Pro Pro Pro Ser

        35

<210>11

<211>23

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>Exendin-4的突变体

<400>11

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ile Gln Thr Asp Gly Arg

1               5                   10                  15

Arg Ser Gly Ala Ser Ala Tyr

            20

<210>12

<211>39

<212>PRT

<213>artificial sequence

<220>

<223>Exendin-4的突变体

<400>12

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Gly Gly

1               5                   10                  15

Glu Ala Ala Arg Gln Phe Ile Val Trp Gln Arg Asn Gly Gly Pro Ser

            20                  25                  30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

        35

Claims (8)

1.一种体外筛选胰高血糖素样肽-1受体的多肽类激动剂的方法，包括下列步骤：

a)采用噬菌体展示技术构建待选GLP-1受体的多肽类激动剂的噬菌体展示文库；

b)先将N-GLP-1R包被在微孔反应板上，再将噬菌体展示文库加入微孔与包被的N-GLP-1R相互作用，而后将与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体从微孔反应板上洗下，获得与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体；

c)将筛选得到的噬菌体感染宿主细胞，培养获得克隆，扩增后抽提噬菌体载体进行测序，获得与N-GLP-1R有特异性结合的多肽序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待选GLP-1受体的多肽类激动剂的噬菌体展示文库选自随机序列的多肽噬菌体展示文库或GLP-1受体的配体突变体噬菌体展示文库。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述GLP-1受体的配体突变体噬菌体展示文库选自GLP-1的突变体噬菌体展示文库或Exendin-4的突变体噬菌体展示文库。

4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤b后还包括与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体的富集，即将与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体从微孔反应板上洗下后，再培养扩增，而后将扩增获得的噬菌体库再次加入包被了N-GLP-1R的微孔进行反应，重复上述步骤2-3次，与N-GLP-1R特异性结合的噬菌体从待选GLP-1受体的多肽类激动剂的噬菌体展示文库中得到了富集。

5.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤c获得克隆后还包括用Phage-ELISA鉴定获得的克隆与N-GLP-1R的结合活性，筛选结合活性高的多肽序列。

6.一种胰高血糖素样肽-1受体结合多肽，由权利要求2所述方法筛选获得，其特征在于，它具有GLP-1R结合活性，它的氨基酸序列选自SEQ ID NO：7、8、10、11、12之一。

7.权利要求6所述多肽在制备胰高血糖素样肽-1受体激动剂上的用途。

8.权利要求6所述多肽应用于制备抗糖尿病药物。

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