JP2020073537A

JP2020073537A - 自己免疫疾患の処置のために調節性ｔ細胞を選択的に活性化させる改変ｉｌ−２変異体

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Publication number: JP2020073537A
Application number: JP2019235716A
Authority: JP
Inventors: グレーブジェフリー; Greve Jeffrey
Original assignee: Delinia Inc
Current assignee: Delinia Inc
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-05-14
Anticipated expiration: 2035-08-10
Also published as: EP3180020A1; IL250059B; US10035836B1; PL3180020T3; ES2807260T3; JP6640834B2; EA201790371A1; KR20170035910A; PL3482766T3; HK1243001A1; CN113234138A; CA2955006A1; SI3180020T1; ZA201700381B; CN107106654A; EP3482766B1; EA034925B1; EP3482766A1; MX2017000833A; HUE043038T2

Abstract

【課題】調節性Ｔ細胞に対する選択的アゴニスト活性と、さらなるアミノ酸置換であって、循環半減期を、ＩＬ−２選択的アゴニスト単独と比較して延長する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との化学的コンジュゲーションを可能とするアミノ酸置換とを伴う新規のＩＬ−２タンパク質を提供する。【解決手段】特定の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、および置換Ｎ８８Ｒ、Ｃ１２５Ｓ、若しくはＤ１０９Ｃを含有し、並びにＴ細胞を活性化させる能力を有するＩＬ−２選択的アゴニスト変異体タンパク質。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本願は、２０１４年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／０７０，０１６号への優先権の利益を主張し、その内容は、本明細書中に参考として援用される。

本発明の背景
免疫系は、自己と非自己とを区別することが可能でなければならない。自己／非自己の区別ができないと、免疫系は、体内の細胞および組織を破壊し、その結果として、自己免疫疾患を引き起こす。調節性Ｔ細胞は、免疫系の活性化を能動的に抑制し、病理学的な自己反応性の発生を妨げ、その帰結としての自己免疫疾患を防止する。自己免疫疾患を処置するために、調節性Ｔ細胞を選択的に活性化させる薬物および方法を開発することは、精力的な研究の対象であるが、本発明が開発されるまでは、大部分が不成功に終わっている。

調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）とは、他の免疫細胞の活性を抑制する、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のクラスである。Ｔｒｅｇは、免疫系ホメオスタシスにとって重要であり、自己抗原に対する寛容性を維持し、外来抗原に対する免疫応答をモジュレートするのに主要な役割を果たす。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む、複数の自己免疫疾患および炎症性疾患は、Ｔｒｅｇ細胞数が不足している、またはＴｒｅｇ機能が欠損していることが示されている。その帰結として、Ｔｒｅｇ細胞の数および／または機能を高める療法の開発が、大きな関心の的となっている。

探索されている、自己免疫疾患のための１つの処置手法は、ｅｘｖｉｖｏで増やした自家Ｔｒｅｇ細胞の移植である（Ｔａｎｇ，Ｑ．ら、２０１３年、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．、３巻：１〜１５頁）。この手法は、疾患の動物モデルの処置およびいくつかの早期段階ヒト臨床試験において有望であることが示されているが、患者自身のＴ細胞を用いた個別化処置を必要とし、侵襲性であり、技法的に複雑である。別の手法は、低用量インターロイキン２（ＩＬ−２）による処置である。Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ２ＲＡサブユニット（ＣＤ２５）、ＩＬ２ＲＢサブユニット（ＣＤ１２２）、およびＩＬ２ＲＧサブユニット（ＣＤ１３２）から構成される高親和性ＩＬ−２受容体のＩＬ２Ｒαβγを構成的に高レベルで発現することを特徴とし、Ｔｒｅｇ細胞の増殖は、ＩＬ−２に依存することが示されている（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．ら、２０１０年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３３巻：１５３〜６５頁）。慢性ＧＶＨＤ患者（Ｋｏｒｅｔｈ，Ｊ．ら、２０１１年、ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．、３６５巻：２０５５〜６６頁）およびＨＣＶ関連自己免疫性血管炎患者（Ｓａａｄｏｕｎ，Ｄ．ら、２０１１年、ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．、３６５巻：２０６７〜７７頁）に対する、低用量ＩＬ−２処置についての臨床試験は、Ｔｒｅｇレベルの上昇および臨床的有効性の証を示している。他の複数の自己免疫疾患および炎症性疾患におけるＩＬ−２の有効性について探索する新たな臨床試験が緒についている。

これらの試験で使用されている、ＩＬ−２の組換え形態である、プロロイキン（ＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡにより市販されている）は、高毒性と関連している。プロロイキンは、転移性黒色腫および転移性腎臓がんの処置について承認されているが、その副作用が非常に重度であるので、その使用が推奨されるのは、集中治療へのアクセスを伴う院内環境に限られる（ウェブアドレス：ｗｗｗ．ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ．ｃｏｍ／ａｓｓｅｔｓ／ｐｄｆ／ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ．ｐｄｆ）。より近年になってＴｒｅｇ細胞についての特徴付けがなされるまでは、ＩＬ−２は、Ｔ細胞および他の免疫細胞を活性化させて、がん細胞を消失させる、免疫系の刺激因子であると考えられていた。Ｔｒｅｇ細胞は、それらによるＩＬ２Ｒαβγの発現に起因して、他の多くの免疫細胞型に比べより低濃度のＩＬ−２に応答するため、自己免疫疾患におけるＩＬ−２についての臨床試験では、Ｔｒｅｇ細胞をターゲティングする目的で、低用量のＩＬ−２が採用されている（ＫｌａｔｚｍａｎｎＤ、２０１５年、ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．、１５巻：２８３〜９４頁）。しかし、これらの低用量であってもなお、安全性および忍容性の問題が結果として生じており、使用される処置では、長期的な処置コースまたは間欠的な５日間にわたる処置コースにおいて、毎日の皮下注射が採用されている。したがって、Ｔｒｅｇ細胞の数および機能を強化し、Ｔｒｅｇ細胞をＩＬ−２より特異的にターゲティングし、より安全であり、かつ、より忍容可能であり、投与頻度が少ない、自己免疫疾患の治療が必要とされている。

ＩＬ−２ベースの治療の治療指数を改善するための１つの手法は、他の免疫細胞と比べて、Ｔｒｅｇ細胞に対して選択的な、ＩＬ−２の変異体を使用することである。ＩＬ−２受容体は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好酸球、および単球を含む、異なる様々な免疫細胞型上で発現し、この広範な発現パターンは、免疫系および全身性の高毒性に対するその多面的影響に寄与している可能性が高い。ＩＬ−２受容体は、（１）シグナル伝達しない低親和性受容体である、ＩＬ２ＲＡ；（２）偏在的に、従来型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｓ）上、ＮＫ細胞上、好酸球上、および単球上で発現する、ＩＬ２ＲＢおよびＩＬ２ＲＧから構成される中親和性受容体（ＩＬ２Ｒβγ）；ならびに（３）活性化Ｔ細胞上で一過性に発現し、Ｔｒｅｇ細胞上で構成的に発現する、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、およびＩＬ２ＲＧから構成される高親和性受容体（ＩＬ２Ｒαβγ）の３つの形態で存在する。ＩＬ２Ｒβγと比べて、ＩＬ２Ｒαβγに対して選択的なＩＬ−２変異体が開発されている（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ．ら、２０００年、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻：１１９７〜２０２頁；Ｃａｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、２００２年、ＣｕｒｒＰｈａｒｍＤｅｓ．、８巻：２１７１〜８３頁）。これらの変異体は、ＩＬ２ＲＢに対するそれらの親和性を低減する、アミノ酸置換を有する。ＩＬ−２の、ＩＬ２ＲＧに対する親和性は、検出不能であるため、これらの変異体では、その帰結として、ＩＬ２Ｒβγ受容体複合体に対する親和性が低減されており、ＩＬ２Ｒβγ発現細胞を活性化させる能力も低減されているが、ＩＬ２ＲＡに結合する能力およびＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体に結合し、これを活性化させる能力は保持されている。ＩＬ２Ｒβγ発現ＮＫ細胞は、毒性の主要な寄与因子であるという仮説に基づき、これらの変異体のうちの１つである、ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ（Ｂａｙ５０−４７９８）が、免疫系刺激因子としての、ＩＬ−２の低毒性のバージョンとして、臨床において調べられた。Ｂａｙ５０−４７９８は、ＮＫ細胞と比べて、活性化Ｔ細胞の増殖を選択的に刺激することが示され、がん患者（Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｋ．ら、２００７年、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１３巻：３３１２〜９頁）およびＨＩＶ患者（Ｄａｖｅｙ，Ｒ．Ｔ．ら、２００８年、ＪＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．、２８巻：８９〜１００頁）についてのフェーズＩ／ＩＩ臨床試験において評価された。これらの臨床試験は、Ｂａｙ５０−４７９８が、プロロイキンよりはるかに安全であり、より忍容可能であることを示し、また、Ｂａｙ５０−４７９８が、Ｔｒｅｇ細胞の中で豊富な細胞集団であるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のレベルを上昇させることも示した。これらの試験に後続する、この分野における研究により、Ｔｒｅｇ細胞の固有性がさらに完全に確立され、Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ２Ｒαβγを選択的に発現することが裏付けられた（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．ら、２０１０年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３３巻：１５３〜６５頁において総説されている）。この新たな研究に基づき、今では、ＩＬ２Ｒαβγ選択的アゴニストは、Ｔｒｅｇ細胞に対して選択的であるはずであると理解することができる。

ＩＬ−２ベースの治療の治療指数を改善するための第２の手法は、分子の薬物動態を最適化して、Ｔｒｅｇ細胞を最大限に刺激することである。ＩＬ−２の作用についての初期研究により、ｉｎｖｉｔｒｏにおける、ＩＬ−２による、ヒトＴ細胞増殖の刺激は、有効濃度のＩＬ−２への最低限５〜６時間にわたる曝露を必要とすることが裏付けられた（Ｃａｎｔｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．ら、１９８４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４巻：１３１２〜１３１６頁）。ヒト患者へと投与される場合、ＩＬ−２の血漿半減期は、静脈内投与では８５分間であり、皮下投与では３．３時間と極めて短い（Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，Ｇ．Ｉ．ら、１９９８年、ＢｒＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ．、４６巻：５〜１０頁）。その短い半減期のために、循環ＩＬ−２を、Ｔ細胞増殖を刺激するのに必要なレベルまたはこれを上回るレベルで、必要な持続時間にわたり維持することは、Ｔｒｅｇ細胞に対するＥＣ５０を有意に上回るピークＩＬ−２レベルを結果としてもたらす高用量を必要とするか、または高頻度の投与を必要とする（図１）。これらの高ＩＬ−２ピークレベルは、ＩＬ２Ｒβγ受容体を活性化させる可能性があり、他の意図されない作用または有害作用を及ぼす可能性がある。ＩＬ−２より循環半減期が長いＩＬ−２類似体は、ＩＬ−２より低用量、低ピークレベルで、指定された期間にわたり、標的薬物濃度を達成しうる。したがって、このようなＩＬ−２類似体では、Ｔｒｅｇ細胞を有効に刺激するのに、ＩＬ−２より低用量または低頻度の投与が必要とされる。また、ＩＬ−２薬の低頻度の皮下投与も、患者に対する忍容性が大きい。これらの特徴を伴う治療剤は、臨床における、薬理学的有効性の改善、毒性の低減、および患者による治療の遵守の改善を意味する。

治療用タンパク質の半減期を延ばす１つの手法は、治療用タンパク質を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非免疫原性水溶性ポリマーとコンジュゲートすることである。タンパク質の、ＰＥＧ分子への化学的コンジュゲーション（ＰＥＧ化）は、タンパク質の有効流体力学半径を増大させることにより循環半減期を延長し、これによって、タンパク質コンジュゲートが腎臓により血液から濾過される速度を低減する。ＩＬ−２およびＩＬ−２の選択的アゴニストは、およそ１５，０００ダルトン（１５ｋＤａ）という、比較的小型のタンパク質であり、腎クリアランスが急速である。ＰＥＧ分子の循環半減期は、ＰＥＧの分子量に比例して延長される（Ｙａｍａｏｋａ，Ｔ．ら、１９９４年、ＪＰｈａｒｍＳｃｉ．、８３巻：６０１〜６頁）。
ＰＥＧ化された治療用タンパク質の産生および製造の成功に影響を与える、多数の因子が存在する。第１に、ＰＥＧ化タンパク質は、ＰＥＧ分子とタンパク質との化学的コンジュゲーションにより調製されるため、ＰＥＧ化に関与するさらなる製造ステップのために、タンパク質は、効率的に製造しうることが重要である。第２に、ＰＥＧ部分を、特定のアミノ酸残基を介して、タンパク質に効率的にコンジュゲートするべきであり、これは均質な生成物を高収率でもたらす。第３に、タンパク質上のＰＥＧ化部位は、タンパク質の治療活性に対する干渉が最小限となるように選ぶべきである。タンパク質の治療活性に対する干渉は、ＰＥＧの、タンパク質の活性部位へのコンジュゲーションに起因する場合もあり、ＰＥＧによる活性部位に対する立体障害に起因する場合もあろう。例として述べると、ＰＥＧ分子を、ＩＬ−２の第一級アミンにコンジュゲートした結果として、ＩＬ−２分子１つ当たり１つ〜４つの間のＰＥＧポリマーを含有するタンパク質分子種の異種混合物がもたらされた、ＰＥＧ化されたＩＬ−２の一形態がかつて報告された（Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．ら、１９８７年、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．、８４巻：１４８７〜９１頁；Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．ら、１９８８年、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．、１５巻；２６３号：１５０６４〜７０１９８８頁）が、この形態は、ＩＬ−２と比べて、４〜６分の１の生物学的活性の低減を呈した（Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ａ．、２０００年、ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ．、２９３巻：２４８〜５９頁）。ＩＬ−２選択的アゴニストは、Ｔｒｅｇ細胞上の３つの受容体サブユニットの複合体に結合し、これらを活性化させなければならないため、ＩＬ−２上の適切なコンジュゲーション部位は、生物活性を最適にするために、注意深く選ばなければならない。

Ｔａｎｇ，Ｑ．ら、２０１３年、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．、３巻：１〜１５頁Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．ら、２０１０年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３３巻：１５３〜６５頁Ｋｏｒｅｔｈ，Ｊ．ら、２０１１年、ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．、３６５巻：２０５５〜６６頁Ｓａａｄｏｕｎ，Ｄ．ら、２０１１年、ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．、３６５巻：２０６７〜７７頁ＫｌａｔｚｍａｎｎＤ、２０１５年、ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．、１５巻：２８３〜９４頁Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ．ら、２０００年、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻：１１９７〜２０２頁Ｃａｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、２００２年、ＣｕｒｒＰｈａｒｍＤｅｓ．、８巻：２１７１〜８３頁Ｍａｒｇｏｌｉｎ，Ｋ．ら、２００７年、ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１３巻：３３１２〜９頁Ｄａｖｅｙ，Ｒ．Ｔ．ら、２００８年、ＪＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓ．、２８巻：８９〜１００頁Ｃａｎｔｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．ら、１９８４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４巻：１３１２〜１３１６頁Ｋｉｒｃｈｎｅｒ，Ｇ．Ｉ．ら、１９９８年、ＢｒＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌ．、４６巻：５〜１０頁Ｙａｍａｏｋａ，Ｔ．ら、１９９４年、ＪＰｈａｒｍＳｃｉ．、８３巻：６０１〜６頁Ｋａｔｒｅ，Ｎ．Ｖ．ら、１９８７年、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．、８４巻：１４８７〜９１頁Ｋｎａｕｆ，Ｍ．Ｊ．ら、１９８８年、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．、１５巻；２６３号：１５０６４〜７０１９８８頁Ｃｈｅｎ，Ｓ．Ａ．、２０００年、ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ．、２９３巻：２４８〜５９頁

本発明は、ＩＬ−２配列内の特定の位置における単一のアミノ酸置換を伴うＩＬ−２の変異体であって、Ｔｒｅｇ細胞を活性化させるＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲートの能力を保持しながら、ＰＥＧ分子の安定的で特異的な化学的コンジュゲーションを可能とする変異体に関する。ＰＥＧコンジュゲーション部位として規定される、これらの指定されたアミノ酸位置は、ＰＥＧ分子の、ＩＬ−２変異体へのコンジュゲーションから生じるＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲートが、ＩＬ２Ｒαβγ受容体に結合し、これを活性化させるその能力の減弱を、最小限とするように選ばれる。本発明はまた、前述のＩＬ−２変異体上のＰＥＧコンジュゲーション部位を伴うＩＬ−２変異体であって、ＩＬ２Ｒαβγ受容体に対して選択的であり、その帰結として、Ｔｒｅｇ細胞に対する選択性が大きいＩＬ−２変異体にも関する。

化学的に活性化させたＰＥＧであって、タンパク質へのコンジュゲーションのための、多数の異なる、化学的に反応性の基を伴い、第一級アミンを含有するアミノ酸残基またはチオール基へのコンジュゲーションを可能とするＰＥＧが開発されている。これらのうちで、システイン残基上に固有に存在するチオール基は、ＰＥＧの、タンパク質への、最も選択的なコンジュゲーションを可能とし、マレイミド反応性基またはヨードアセトアミド反応性基を伴うＰＥＧは、遊離システインのチオールと極めて選択的に反応する。細胞外タンパク質内の大半のシステイン残基は、タンパク質のコンフォメーションを安定化させるジスルフィド結合に関与するが、少数の遊離（不対合）システイン残基は通例、タンパク質の内部に埋もれている（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｔ．ら、１９９９年、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．、１９９９年、１２巻：５３５〜４８頁）。タンパク質内の遊離システイン残基へのＰＥＧコンジュゲーションは、天然の露出された遊離システイン残基、または新規の遊離システイン残基の導入を必要とする。新規の遊離システインの、タンパク質への工学的導入は、導入された新規のシステインが、他のシステインと共に、不適切な鎖内ジスルフィド結合を形成し、これによりタンパク質のミスフォールディングを引き起こしうる、または他の分子と共に鎖間ジスルフィド結合を形成し、これによりタンパク質の凝集を引き起こすしうる危険性を伴う。システイン残基を突然変異させたＩＬ−２変異体は、ジスルフィド結合の誤対合に起因して、活性の実質的な低減を呈しうる（Ｗａｎｇ，Ａ．ら、１９８４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２２４巻：１４３１〜３頁）。本明細書では、本発明は、新規の遊離システイン残基の、ＩＬ−２変異体タンパク質への工学的導入であって、適正なタンパク質フォールディングに適合性であり、チオール反応性ＰＥＧの部位特異的コンジュゲーションを可能とし、Ｔｒｅｇ上のＩＬ２Ｒαβγに結合し、これを活性化させる能力を保持するＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲートを結果としてもたらす工学的導入に焦点を絞る。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、置換Ｄ１０９Ｃを含有し、かつＴ細胞を活性化させる能力を有するＩＬ−２変異体タンパク質。
（項目２）
配列番号１に対して９８％超の配列同一性を有する、項目１に記載のタンパク質。
（項目３）
１０９位におけるシステインに連結されたポリエチレングリコール部分を有し、該ポリエチレングリコール部分の分子量が、５〜４０ｋＤａの間である、項目１に記載のタンパク質。
（項目４）
ＩＬ−２タンパク質が、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６Ｌ、およびＱ１２６Ｆからなる群から選択される置換のうちの少なくとも１つを含有する、項目１に記載のＩＬ−２変異体タンパク質。
（項目５）
置換Ｃ１２５Ｓをさらに含む、項目４に記載のＩＬ−２変異体タンパク質。
（項目６）
前記ＩＬ−２タンパク質の配列が、置換Ｎ８８Ｒおよび置換Ｃ１２５Ｓを含有する、項目３に記載のＩＬ−２変異体タンパク質。
（項目７）
配列番号１に対して９８％の配列同一性を有する、項目６に記載のＩＬ−２変異体タンパク質。
（項目８）
項目４に記載のＰＥＧ化タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目９）
配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性、Ｄ１０９Ｃの置換を有し、Ｔ細胞を活性化させる能力を有するヒトＩＬ−２変異体タンパク質の循環半減期を延長する方法であって、ポリエチレングリコール部分を、１０９位におけるシステイン残基に連結するステップを含み、該ポリエチレングリコール部分が、該タンパク質の循環半減期を、該ポリエチレングリコール部分を伴わない同じタンパク質と比較して延長するのに十分な長さである方法。
（項目１０）
前記タンパク質が、配列番号１に対して９８％超の配列同一性を有する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記タンパク質が、１０９位におけるシステインに連結された、分子量が５ｋＤａ〜４０ｋＤａの間であるポリエチレングリコール部分を有する、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記タンパク質が、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６Ｌ、およびＱ１２６Ｆからなる群から選択される置換のうちの少なくとも１つを含有する、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記タンパク質が、置換Ｃ１２５Ｓをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記タンパク質が、置換Ｎ８８Ｒおよび置換Ｃ１２５Ｓを含有する、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記タンパク質が、配列番号１に対して９８％の配列同一性を有する、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
医薬組成物を、ヒト調節性Ｔ細胞濃度を刺激するのに十分な治療有効用量で投与する、項目９に記載の方法。

図１は、ＩＬ−２または半減期を延長したＩＬ−２−ＰＥＧタンパク質の単回投与の後における、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を刺激するのに必要な、循環半減期、ピーク薬物レベル、生物学的有効濃度と持続時間との間の関係についての概略的例示を示す。破線は、皮下注射に続く、ＩＬ−２の、時間経過にわたる血中レベルを表し、実線は、ＩＬ２−ＰＥＧコンジュゲートの、時間経過にわたる血中レベルを表す。水平方向の点線は、それぞれ、ＩＬ２Ｒαβγを発現する細胞を活性化させるのに必要な濃度（ＥＣ５０値）およびＩＬ２Ｒβγを発現する細胞を活性化させるのに必要な濃度（ＥＣ５０値）を指し示す。双方向の矢印は、細胞の増殖を刺激するのに必要なＥＣ５０での、ＩＬ−２への曝露の持続時間（５〜６時間）を指し示す。

図２は、ＰＥＧまたは他の非免疫原性ポリマーのコンジュゲーションのための接合部位を決定するための戦略を表す。高親和性ＩＬ−２受容体の３つのサブユニットと複合させたＩＬ−２が描示される。溶媒へと露出され、ＩＬ−２受容体サブユニットと相互作用しないＩＬ−２の表面アミノ酸残基は、ＰＥＧポリマーを接合させるための候補アミノ酸残基であり、これらを丸で囲む。

図３は、ＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒαβγ複合体の３Ｄ結晶構造であって、ＰＥＧまたは他の非免疫原性ポリマーを接合させるための基準を満たす残基のアミノ酸側鎖を指し示す３Ｄ結晶構造を示す。表示の残基は、Ｔ３Ｃ、Ｓ６Ｃ、Ｋ８Ｃ、Ｋ４８Ｃ、Ｋ４９Ｃ、Ｔ５１Ｃ、Ｋ９７Ｃ、Ｇ９８Ｃ、Ｆ１０３Ｃ、Ｍ１０４Ｃ、Ｅ１０６Ｃ、およびＤ１０９Ｃである。ＩＬ−２を中央前方、ＩＬ−２ＲΒを左方、ＩＬ−２ＲΓを右方に指し示し、ＩＬ−２ＲΑを、上方かつ後方に指し示す。受容体複合体の、細胞膜に対する相対的な配向を、矢印により指し示す。

図４は、Ｔｒｅｇ細胞について濃縮されたＴ細胞亜集団内における、ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９ＣおよびＰＥＧ化されたＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃによる、ｐＳＴＡＴ５の選択的活性化を示す。ヒトＰＢＭＣを、各プロットの上方に示される試料と共に、３７℃で１０分間にわたりインキュベートし、固定し、透過処理し、抗体で染色し、次いで、フローサイトメトリーにかけた。ＦＡＣＳプロットを、擬似カラー方式で表示する。ＣＤ４＋としてゲーティングした細胞を示すが、細胞には、４つの象限の各々において示される通り、さらにゲーティングした。各象限内の数は、各ゲート内のＣＤ４＋細胞の百分率を指し示す。上象限内の細胞は、Ｔｒｅｇ細胞について濃縮された集団であり、最も高いもので１〜２％のＣＤ２５発現細胞を示す。非処置細胞は、培地単独中でインキュベートし、ＩＬ−２は、４×１０^−９Ｍの濃度で添加し、ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ試料およびＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧ試料は、４×１０^−８Ｍの濃度で添加し、ＰＥＧ処理した試料は、ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧと同じ量のＰＥＧを含有する、モックＰＥＧ化反応物中でインキュベートした。ＩＬ−２は、ＣＤ２５^{ｌｏｗ／−}細胞内およびＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞内のいずれにおいても、大量のＳＴＡＴ５リン酸化を刺激する。ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９ＣおよびＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧのいずれも、定性的かつ定量的に異なる効果を及ぼし、主に１％未満の細胞内および主にＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞内で、ＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激する。

図５は、ＩＬ−２タンパク質およびＩＬ−２選択的アゴニストタンパク質の、ヒトＰＢＭＣ中の７つの異なる免疫細胞型に対する選択性を裏付ける。ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９ＣおよびＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧのいずれも、Ｔｒｅｇに対して、ｗｔＩＬ−２と比較して高度に選択性であり、複数の細胞型において、ＩＬ−２を超える選択性を示す。図５は、ＩＬ−２タンパク質およびＩＬ−２選択的アゴニストタンパク質の、ヒトＰＢＭＣ中の７つの異なる免疫細胞型に対する選択性を裏付ける。ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９ＣおよびＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧのいずれも、Ｔｒｅｇに対して、ｗｔＩＬ−２と比較して高度に選択性であり、複数の細胞型において、ＩＬ−２を超える選択性を示す。

（発明の要旨）
本明細書で記載される本発明は、調節性Ｔ細胞に対する選択的アゴニスト活性と、さらなるアミノ酸置換であって、循環半減期を、ＩＬ−２選択的アゴニスト単独と比較して延長する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との化学的コンジュゲーションを可能とするアミノ酸置換とを伴う新規のＩＬ−２タンパク質である。置換されるアミノ酸位置は、ＩＬ−２−ＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体内の、それらの溶媒への露出と、ポリマーコンジュゲート変異体が、ＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体に結合しこれを活性化させる能力を保持する能力の予測とに基づき選択した。システインアミノ酸残基を、選択されたアミノ酸位置へと導入した、一連の組換えＩＬ−２変異体を構築し、これらの変異体タンパク質を、活性についてスクリーニングした。発現および精製に成功したＩＬ−２変異体は、リフォールディングさせ、マレイミド−ＰＥＧポリマーにコンジュゲートし、次いで、調節性Ｔ細胞に対する選択的アゴニスト活性について調べた。好ましいＩＬ−２選択的アゴニスト変異体であるＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃは、こうして同定された。この新規のタンパク質およびそのＰＥＧコンジュゲートは、患者における調節性Ｔ細胞のレベルおよび活性を、選択的かつ効率的に高め、自己免疫病態を抑制し、したがって、自己免疫疾患を処置するための、安全で有効な治療剤となる。

本発明はまた、配列番号１に対して少なくとも９５％から９８％、さらに１００％までの配列同一性を有し、置換Ｄ１０９Ｃを含有し、Ｔ細胞を活性化させる能力を有するＩＬ−２変異体タンパク質も提供する。本発明のタンパク質は、１０９位におけるシステインに連結されたポリエチレングリコール部分に連結され得る。ポリエチレングリコール部分の分子量は、任意選択で、５〜４０ｋＤａの間である。本発明のＩＬ−２変異体タンパク質は、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｑ１２６Ｌ、およびＱ１２６Ｆからなる群から選択される置換のうちの少なくとも１つを含有しうる。さらに、本発明のＩＬ−２変異体タンパク質は、任意選択で、置換Ｃ１２５Ｓも含みうる。より好ましいのは、ＩＬ−２タンパク質配列が、置換Ｎ８８Ｒおよび置換Ｃ１２５Ｓを含有するＩＬ−２変異体タンパク質である。本発明のタンパク質は、任意選択で、本発明のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物としても提供される。

本発明はさらに、本発明のヒトＩＬ−２変異体タンパク質の循環半減期を延長する方法であって、ポリエチレングリコール部分を、１０９位におけるシステイン残基に連結するステップを含み、ポリエチレングリコール部分が、タンパク質の循環半減期を、ポリエチレングリコール部分を伴わない同じタンパク質と比較して延長するのに十分な長さである方法も提供する。本発明の方法はさらに、ヒト調節性Ｔ細胞レベルを刺激するのに十分な治療有効用量での、タンパク質変異体の投与も提供する。

（発明の詳細な説明）
（導入）
本発明は、ＩＬ−２受容体に対する高親和性、高生物活性、およびＩＬ−２自体と比較した循環半減期の伸長を維持しながら、ＰＥＧポリマーの、ＩＬ−２変異体タンパク質への、特異的で効率的な化学的コンジュゲーションを可能とするアミノ酸置換を含む、新規のＩＬ−２変異体タンパク質である。この変異体タンパク質は、公表されているＩＬ−２−ＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体の結晶構造において溶媒へと露出される、ＩＬ−２配列内の候補アミノ酸の位置を同定し、選択された位置においてシステイン残基を置換した、変異体タンパク質を構築する工程を介して発見された。これらのＩＬ−２変異体を発現させ、精製し、十分な高レベルで産生された変異体タンパク質を、ＰＥＧ−マレイミドとコンジュゲートし、次いで、ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧを、Ｔｒｅｇ細胞に対する生物活性について調べ、活性であることを示した。本発明により規定される分子は、自己免疫病態および炎症性病態を抑制するＴ細胞の小亜集団の産生を刺激する新規の機構により、自己免疫疾患の安全で有効な処置を可能とする。このパラダイム変革的治療剤は、多数の異なる自己免疫疾患を処置することができる可能性がある。

（定義）
野生型タンパク質に由来する変異体に言及する場合、「Ｄ１０９Ｃ」などのアミノ酸置換への言及は、数（１０９）による位置における元の残基であるアスパラギン酸（Ｄ）と、これに続く置換された残基であるシステイン（Ｃ）を指す。

本明細書で使用される「配列番号１に対して少なくともあるパーセント（例えば、９７％）の配列同一性」とは、２つまたはそれ超の核酸またはポリペプチドの配列が同じである程度を指す。目的の配列と、第２の配列との、評価する領域にわたる、例えば、目的の配列の長さにわたるパーセント同一性は、配列アラインメントし、同一性を最大化するように、ギャップの導入を許容しながら、評価する領域内の残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）であって、同一な残基と向かい合う残基の数を決定し、領域内に含まれる目的の配列または第２の配列の残基の総数（いずれか大きい方）で除し、１００を乗じることにより算出することができる。特定のパーセント同一性を達成するのに必要とされる同一な残基の数を算出する場合は、端数を、最も近い整数に四捨五入する（ｒｏｕｎｄｅｄｔｏ）ものとする。パーセント同一性は、様々なコンピュータプログラムを使用することにより計算することができる。例えば、ＢＬＡＳＴ２、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムは、アラインメントを生成し、目的の配列の間のパーセント同一性を提示する。ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬＵＳＡ、８７巻：２２２６４〜２２６８頁、１９９０年）であって、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬＵＳＡ、９０巻：５８７３〜５８７７頁、１９９３年における通りに改変されたアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年）によるＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムへと組み込まれている。比較を目的として、ギャップ処理を施したアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年）において記載されている通り、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを活用する。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを活用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメータを使用することができる。ＰＡＭ２５０行列を使用することもでき、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用することもできる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、ＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により公開されている。これらのプログラムについては、ＵＲＬによるワールドワイドウェブアドレスを「ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ」とするウェブサイトを参照されたい。特許請求の範囲の具体的な実施形態では、ＮＣＢＩにより提供されているデフォルトのパラメータにより、ＢＬＡＳＴ２を使用して、パーセント同一性を計算する。

本発明の「ＩＬ−２選択的アゴニスト」とは、ＩＬ−２αβγ選択的アゴニストである。機能的には、「ＩＬ−２選択的アゴニスト」は、ＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体を、ＩＬ２Ｒβγ受容体複合体と比べて、選択的に活性化させる。「ＩＬ−２選択的アゴニスト」は、野生型ＩＬ−２タンパク質に由来し、配列番号１の野生型ＩＬ−２に対して少なくとも９５％配列同一性を有するものとして構造的に規定され、Ｔｒｅｇ細胞を優先的に活性化させる能力により機能的に規定される。タンパク質はまた、Ｔｒｅｇ内のＩＬ−２受容体によるシグナル伝達であって、ＣＤ４＋ＣＤ２５−／ｌｏｗＴ細胞またはＮＫ細胞と比較した、Ｔｒｅｇ細胞内のリン酸化ＳＴＡＴ５タンパク質のレベルにより測定されるシグナル伝達を選択的に活性化させるその能力により機能的に規定することもでき、ＮＫ細胞と対比した、フィトヘマグルチニンにより刺激されるＴ細胞の選択的活性化により機能的に規定することもできる。

「Ｔｒｅｇ」または「Ｔｒｅｇ細胞」とは、調節性Ｔ細胞を指す。調節性Ｔ細胞とは、他の免疫細胞の活性を抑制するＴ細胞のクラスであり、フローサイトメトリーを使用して、細胞マーカー表現型であるＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋により規定される。ＦＯＸＰ３は、細胞内タンパク質であり、染色のために、細胞の固定と透過処理を必要とすることから、生存するＴｒｅｇを規定するためには、細胞表面表現型である、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−を使用することができる。Ｔｒｅｇはまた、ｔＴｒｅｇ（胸腺由来）およびｐＴｒｅｇ（末梢由来であり、末梢のナイーブＴ細胞から分化させた）など、多様なＴｒｅｇサブクラスも含む。全てのＴｒｅｇは、ＩＬ２Ｒαβγ受容体を発現し、それら自身のＩＬ−２を産生せず、増殖のためにＩＬ−２に依存するが、当業者は、ＩＬ２Ｒαβγ選択的アゴニストが、いずれのクラスも選択的に活性化させることを認識する。

「ＰＥＧ」とは、エチレングリコールの水溶性ポリマーである、ポリ（エチレングリコール）分子である。ＰＥＧ分子を、タンパク質に化学的にコンジュゲートして、それらの循環半減期を延長することができる。ＰＥＧは、異なるサイズで得ることができ、また、化学反応性基により誘導体化して、タンパク質への共有結合性のコンジュゲーションを可能とする、化学的活性化形態でも市販されている。活性化ＰＥＧは、ＮＯＦＡｍｅｒｉｃａ（ＷｈｉｔｅＰｌａｉｎｓ、ＮＹ）およびＣｅｌａｒｅｓＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの市販品供給源から得ることができる。直鎖状ＰＥＧは、重量平均分子量を５，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、２０，０００ダルトン、３０，０００ダルトン、および４０，０００ダルトンとするＰＥＧポリマーなど、多様な分子量で産生されている。また、分枝状ＰＥＧポリマーも開発されている。一般に使用される活性化ＰＥＧポリマーは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（リシン残基およびタンパク質のＮ末端などの第一級アミンへのコンジュゲーションのための）、アルデヒド基（Ｎ末端へのコンジュゲーションのための）、およびマレイミド基またはヨードアセトアミド基（システイン残基など、チオールへのカップリングのための）で誘導体化されたＰＥＧポリマーである。

「ＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲート」とは、ＰＥＧを共有結合でコンジュゲートされたＩＬ−２タンパク質である。ＩＬ−２部分は、野生型ＩＬ−２、Ｃ１２５Ｓ置換を伴うＩＬ−２、ＩＬ２Ｒαβγ受容体に対する選択性を結果としてもたらすＮ８８、Ｄ２０もしくはＱ１２６における置換を伴う前出のタンパク質のうちの１つ、またはＰＥＧ分子の部位特異的コンジュゲーションを可能とするさらなる置換を伴う前出のタンパク質のうちの１つであってよい。

「生物活性」とは、細胞ベースの定量的ｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおける生物学的活性の測定値を指す。

「Ｔｒｅｇ細胞の機能的活性化」とは、Ｔｒｅｇ内におけるＩＬ−２媒介性の応答であると規定される。Ｔｒｅｇ細胞の機能的活性化についてのアッセイリードアウトは、ｐＳＴＡＴ５の刺激、Ｔｒｅｇ細胞の増殖、およびＴｒｅｇエフェクタータンパク質レベルの刺激を含む。

（ＰＥＧコンジュゲーションのための、ＩＬ−２部分のデザインおよび構築）
以下の検討項目を、所望の要件を最もよく満たすＩＬ−２部分をデザインするための指針とした。
（１）チオールが、マレイミド活性化ＰＥＧ試薬およびヨードアセトアミド活性化ＰＥＧ試薬との極めて特異的な反応性を有するので、遊離（不対合）システイン残基を、ＩＬ−２へと工学的導入した。
（２）全ての構築物は、ＩＬ−２内の唯一の不対合システイン残基を除去する置換Ｃ１２５Ｓと、ＩＬ２ＲＢに対する親和性を低減するためＩＬ２Ｒａｂｇに対して選択的である置換Ｎ８８Ｒとを伴う野生型ヒトＩＬ−２のバックグラウンドで作製した。Ｃ１２５は、ＩＬ２ＲＧとの主要な接触点であるＱ１２６に直接隣接する。
（３）さらなる単一のシステイン置換を、ＩＬ−２上の表面への露出部位において作出して、水溶性ＰＥＧとの効率的なコンジュゲーションを可能とした。
（４）またＰＥＧコンジュゲーション部位は、ＩＬ２−ＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体内で溶媒へと露出され（Ｗａｎｇ，Ｘ．ら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、３１０巻：１１５９〜６３頁）、したがって、ＩＬ−２Ｒαβγへの結合およびその活性化を損なう可能性が小さくなるように選んだ。
（５）変異体タンパク質は、発現が良好でなければならず、適正にフォールディングしなければならない。新規の遊離システインの存在は、不適正な分子内ジスルフィド形成およびミスフォールディングを結果としてもたらす場合もあり、他の分子との分子間ジスルフィド架橋を結果としてもたらすことから、凝集をもたらす場合もある。

（一般的方法）
一般に、本発明の変異体ＩＬ−２タンパク質の調製は、本明細書で開示される手順、および認知された組換えＤＮＡ技法であって、例えば、ポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切断、オリゴヌクレオチドの調製、ＤＮＡのライゲーション、ｍＲＮＡの単離、適切な細胞へのＤＮＡの導入、宿主の形質転換またはトランスフェクション、宿主の培養を包含する組換えＤＮＡ技法により遂行することができる。加えて、融合分子は、カオトロピック剤、ならびに周知の電気泳動方法、遠心分離方法、およびクロマトグラフィー方法を使用して、単離および精製することができる。これらの方法に関する開示については、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２版（１９８９年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９年）を参照されたい。

本発明の変異体タンパク質をコードする遺伝子は、所望の融合体をコードするＤＮＡをもたらすのに採用される基本ステップとして、制限酵素による消化およびライゲーションを包含する。ＤＮＡ断片の末端は、ライゲーションの前に、改変を必要とする場合があり、これは、突出を充填することにより遂行することもでき、断片の末端部分を、ヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩＩＩ）により欠失させることにより遂行することもでき、部位指向性突然変異誘発により遂行することもでき、ＰＣＲにより新たな塩基対を付加することにより遂行することもできる。ポリリンカーおよびアダプターを採用して、選択された断片の接続を容易とすることができる。発現構築物は、制限、ライゲーション、およびＥ．ｃｏｌｉの形質転換のラウンドを採用して、段階的にアセンブルすることが典型的である。当技術分野では、発現構築物の構築に適する、多数のクローニングベクター（ｌａｍｂｄａ．ＺＡＰ、Ａｇｉｌｅｎｔ；ｐＥＴ、ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）が公知であり、特定の選び出しは、本発明にそれほど重要ではない。クローニングベクターの選択は、発現構築物を宿主細胞へと導入するために選択される、遺伝子導入系の影響を受ける。各段階の終点において、結果として得られる構築物を、制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーション、およびＰＣＲ解析により解析することができる。

当技術分野で公知の方法により、本発明のＩＬ−２変異体タンパク質をコードする遺伝子へと、特定の突然変異を導入するには、部位指向性突然変異誘発を使用することが典型的である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号；Ｓｔｏｒｉｃｉら、２００１年、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９巻：７７３〜７７６頁；Ｋｒｅｎら、１９９８年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、４巻：２８５〜２９０頁；ならびにＣａｌｉｓｓａｎｏおよびＭａｃｉｎｏ、１９９６年、ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．、４３巻：１５〜１６頁を参照されたい。本発明では、任意の部位指向性突然変異誘発手順を使用することができる。本発明の変異体を調製するのに使用しうる、多くの市販のキットが利用可能である。

本発明に従い、多様なプロモーター（転写開始調節領域）を使用することができる。適切なプロモーターの選択は、提案される発現宿主に依存する。選ばれた宿主において機能的である限りにおいて、異種供給源に由来するプロモーターも使用することができる。

ＩＬ−２タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で、シグナル配列を伴わずに発現させることもでき、タンパク質は、封入体から回収し、活性形態へとリフォールディングさせることができる。このような発現系は、米国特許第７，１０５，６５３Ｂ２号において記載されている。

多様なシグナル配列を使用して、本明細書で記載されるタンパク質の発現を容易とすることができる。シグナル配列は、効率的な分泌のために選択またはデザインされ、また、発現宿主内のプロセシングも使用することができる。哺乳動物細胞には、天然ヒトＩＬ−２シグナル配列、ＴＣＲコード配列と相同なシグナル配列を使用することもでき、マウスＩＬ−２コード配列と相同なシグナル配列を使用することもできる。他の適切なシグナル配列／宿主細胞対は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ内で分泌させるためのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓａｃＢシグナル配列、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓによる分泌のためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α接合因子シグナル配列、またはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酸ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列を含む。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位をコードする配列を介して、タンパク質コード配列へと直接接続することもでき、短いヌクレオチド架橋を介して接続することもできる。

真核生物タンパク質発現系の転写および翻訳を増強するためのエレメントが同定されている。例えば、異種プロモーターの両側１０００ｂｐの位置に、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターを置くことにより、植物細胞内の転写レベルを、１０〜４００倍高めることができる。発現構築物はまた、適切な翻訳開始配列も含むものとする。適正な翻訳の開始のために、コザックコンセンサス配列を含むように、発現構築物を改変することにより、翻訳レベルを１０倍上昇させることができる。

発現カセットを、採用される宿主に適合する、適切なベクターへと接続する。ベクターは、発現させる融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むことが可能でなければならない。適切な宿主細胞は、真核細胞および原核細胞、好ましくは、容易に形質転換することができ、培養培地中で急速な増殖を呈しうる細胞を含む。具体的に、好ましい宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｌｕｓなどの原核細胞、ならびに動物細胞および酵母株、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの真核細胞を含む。哺乳動物細胞、特に、ＨＥＫ、Ｊ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−Ｏ、またはＣＨＯが一般に好ましい。他の適する宿主は、例えば、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞を含む。従来の培養条件を採用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照されたい。次いで、安定に形質転換されたまたはトランスフェクトされた細胞株を選択することができる。また、ｉｎｖｉｔｒｏにおける転写翻訳系も、発現系として採用することができる。

所望のＩＬ−２変異体タンパク質をコードする核酸は、細胞にトランスフェクトするための標準的な技法により、宿主細胞へと導入することができる。「〜にトランスフェクトすること」または「トランスフェクション」という用語は、核酸を、宿主細胞へと導入するための、従来の全ての技法であって、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、ウイルスによる形質導入および／または統合を含む技法を包摂することを意図する。宿主細胞にトランスフェクトするのに適する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、および他の実験室用教科書において見出すことができる。

代替的に、本明細書で記載されるタンパク質の構築の全部または一部のために、合成遺伝子構築を使用することもできる。これは、目的のポリペプチド分子をコードするようにデザインされたポリヌクレオチド分子の、ｉｎｖｉｔｒｏにおける合成を伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎら（Ｔｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４３２巻：１０５０〜１０５４頁）により記載されているマルチプレックスマイクロチップベースの技術、ならびにオリゴヌクレオチドを、光プログラム型マイクロ流体チップ上で合成およびアセンブルする、同様の技術など、多数の技法を活用して実施することができる。

本発明のＩＬ−２変異体タンパク質は、採取された宿主細胞から単離するか、または培養培地から単離する。標準的なタンパク質精製技法を使用して、目的のタンパク質を培地から単離するか、または採取された細胞から単離する。特に、ローラーボトル、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター、または発酵槽を含む、様々な手法に由来する精製技法を使用して、所望のＩＬ−２変異体タンパク質を、大スケールで（すなわち、少なくともミリグラム量で）発現させ、精製することができる。

組換えタンパク質への非天然のアミノ酸の組込みを可能とする、タンパク質発現系が開発されている（Ｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．ら、ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｈｅｍＢｉｏｌ．、２０１３年、Ｓ１３６７−５９３１（１３）０００７１−９）。これらの発現系は、これらの位置における、タンパク質の部位特異的なＰＥＧ化を可能とする化学的反応性を有する、非天然のアミノ酸を組み込みうる。遊離システイン残基の使用に対する代替法として、当業者は、循環半減期を延長する目的で、ＰＥＧまたは他の非免疫原性ポリマーを、ＩＬ−２へと接合させる、同様の目標を達成するのにはまた、本明細書で同定されるＩＬ−２アミノ酸位置を、システインではなく、非天然アミノ酸で置換することもできることを認識する。

当業者はまた、本発明のＩＬ２選択的アゴニスト部分を、他の非免疫原性ポリマーともまたコンジュゲートしうることも認識する。２つのこのようなポリマーは、アミノ酸Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、およびＴによる鎖である、ＸＴＥＮポリマー（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．ら、２００９年、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７巻：１１８６〜９０頁））、ならびにアミノ酸残基Ｐ、Ａ、およびＳによる鎖である、ＰＡＳポリマー（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ，Ｍ．ら、２００７年、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇＤｅｓＳｅｌ．、２０巻：２７３〜８４頁）などの、組換え非免疫原性アミノ酸ポリマーである。

（ＩＬ２選択的アゴニスト部分）
置換Ｎ８８Ｒを伴うＩＬ−２は、ＩＬ２Ｒαβγ受容体に対するＩＬ２選択的アゴニストの例示的な実例である（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ．ら、２０００年、ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻：１１９７〜２０２頁）。ＩＬ２／Ｎ８８Ｒは、ＩＬ２ＲＢ受容体サブユニットおよびＩＬ２Ｒβγ受容体複合体への結合が欠損しているが、ＩＬ２Ｒαβγ受容体複合体に結合し、ＩＬ２Ｒαβγ発現ＰＨＡ活性化Ｔ細胞の増殖を、ｗｔＩＬ−２と同程度に効果的に刺激することが可能であるが、一方で、ＩＬ２Ｒβγ発現ＮＫ細胞の増殖を刺激する能力の、３，０００分の１への低減を示す。同様の活性プロファイルを伴う他のＩＬ２Ｒαβγ選択的アゴニストは、置換Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、およびＤ２０Ｈを伴うＩＬ−２を含み、また、置換Ｑ１２６ＬおよびＱ１２６Ｆ（ＩＬ２ＲＧサブユニットとの接触残基）を伴う他のＩＬ２変異体も、ＩＬ２Ｒαβγ選択的アゴニスト活性を有する（Ｃａｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、２００２年、ＣｕｒｒＰｈａｒｍＤｅｓ．、８巻：２１７１〜８３頁）。当業者ならば、Ｆｃ融合タンパク質が同様の活性を有することを予測して、これらのＩＬ２選択的アゴニスト分子のうちのいずれかで、ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ部分を代用しうることを認識する。前述の突然変異の全ては、ｗｔＩＬ−２、または不対合システイン残基を消失させることにより、ＩＬ−２の安定性を促進する置換である、置換Ｃ１２５Ｓを伴うｗｔＩＬ−２のバックグラウンドで作製することができる。本発明はまた、ＩＬ−２受容体活性化活性に著明な影響を及ぼさずに、産生または安定性を改善する、他の突然変異または切断型と共に使用することもできる。

本発明の変異体は、任意選択で、アミノ酸配列および核酸配列の両方に当てはまる、保存的に置換された変異体を含む。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一なアミノ酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。具体的に、縮重コドンによる置換は、１または複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換した配列を作出することにより達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはいずれも、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが指定されるあらゆる位置において、コードされるポリペプチドを変更せずに、コドンを、記載した対応するコドンのうちのいずれかへと変更することができる。このような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種であるサイレント変異である。ポリペプチドをコードする、本明細書におけるあらゆる核酸配列はまた、核酸の、あらゆる可能なサイレント変異についても記載している。当業者は、核酸内の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧと、通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧとを除く）を、機能的に同一な分子をもたらすように改変しうることを認識する。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が含意される。

アミノ酸配列の保存的置換に関して、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチドに対する、個々の置換、欠失、もしくは付加、またはコードされる配列内の、単一のアミノ酸もしくは少数の百分率のアミノ酸を変更するか、これらに付加するか、もしくはこれらを欠失させるタンパク質配列は、その変更が、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換を生ずる場合、保存的に改変された変異体であることを認識する。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換表が周知である。このような、保存的に改変された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に加えてのものであり、これらを除外するものではない。

以下の群：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
３）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
４）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
５）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）；
６）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；
７）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）；および
８）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
は各々、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する。

ＩＬ−２において忍容される保存的置換の例は、Ｙ、３１Ｆ、Ｔ５１Ｓ、Ｑ５７Ｎ、Ｅ１００Ｄ、およびＴ１１１Ｓを含む。

（バイオアッセイ）
候補タンパク質の生物学的活性を特徴付けるためには、頑健かつ定量的なバイオアッセイが必要である。これらのアッセイは、ＩＬ２受容体の活性化を測定し、Ｔｒｅｇ内の活性化の、下流における機能的帰結を測定し、活性化Ｔｒｅｇの、治療上意味がある転帰および機能を測定するものとする。これらのアッセイは、ＩＬ２ＰＥＧコンジュゲート分子の治療活性および効能を測定するのに使用することができ、また、動物またはヒトにおけるＩＬ２ＰＥＧコンジュゲートの薬力学的特性の測定のためにも使用することができる。１つのアッセイは、リン酸化タンパク質（ｐＳＴＡＴ５）に特異的な抗体によるフローサイトメトリーによって測定される、シグナル伝達タンパク質ＳＴＡＴ５のリン酸化を測定する。ＳＴＡＴ５のリン酸化は、ＩＬ−２シグナル伝達経路における不可欠のステップである。ＳＴＡＴ５は、Ｔｒｅｇの発生に不可欠であり、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞内で発現したＳＴＡＴ５の構成的な活性化形態は、ＩＬ−２の非存在下におけるＴｒｅｇ細胞の産生に十分である（Ｍａｈｍｕｄ，Ｓ．Ａ．ら、２０１３年、ＪＡＫＳＴＡＴ、２巻：ｅ２３１５４頁）。したがって、Ｔｒｅｇ細胞内のリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の測定は、当業者により、これらの細胞内のＩＬ−２の活性化を反映するものとして認知され、適切な曝露時間および曝露条件を所与とした場合における、ＩＬ−２処置の、他の生物学的転帰を予測するものとなる。機能的活性化についての別のアッセイは、ＩＬ−２により刺激されるＴｒｅｇ細胞の増殖を測定する。当業者は、Ｔｒｅｇの増殖を、精製Ｔｒｅｇ細胞へのトリチウム化チミジンの取り込みにより測定することもでき、フローサイトメトリーにより測定される、混合細胞集団内のＴｒｅｇ細胞数の増大、およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋マーカー表現型またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−マーカー表現型の周波数により測定することもでき、Ｋｉ−６７など、増殖に関連する細胞周期タンパク質の、Ｔｒｅｇ細胞内の発現の増大により測定することもでき、Ｔｒｅｇ細胞内の、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）などの生体蛍光色素の、細胞分裂に関連する希釈の、フローサイトメトリーでの測定により測定することもできることを認識する。ＩＬ−２による、Ｔｒｅｇの機能的活性化についての別のアッセイは、Ｔｒｅｇの安定性の増大である。ｐＴｒｅｇ細胞は、不安定であり、Ｔｈ１エフェクターＴ細胞およびＴｈ１７エフェクターＴ細胞へと分化する潜在的可能性を有すると考える者もいる。ＩＬ−２によるＴｒｅｇの活性化は、Ｔｒｅｇを安定化させることが可能であり、この分化を防止しうる（Ｃｈｅｎ，Ｑ．ら、２０１１年、ＪＩｍｍｕｎｏｌ．、１８６巻：６３２９〜３７頁）。ＩＬ−２によるＴｒｅｇの刺激の別の転帰は、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ−１０、ＣＤ３９、およびＣＤ７３など、Ｔｒｅｇの機能的エフェクター分子であって、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性に寄与するエフェクター分子のレベルの刺激である。

（製剤）
本発明の融合タンパク質による医薬組成物は、従来の方法に従う、非経口（特に、静脈内または皮下）送達のために製剤化された組成物として規定される。一般に、医薬製剤は、本発明の融合タンパク質を、食塩水、緩衝食塩水、水中に５％デキストロースなど、薬学的に許容される媒体と組み合わせて含む。製剤はさらに、１または複数の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、生体表面上におけるタンパク質の喪失を防止するアルブミンなども含みうる。当技術分野では、製剤化の方法が周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ、Ｇｅｎｎａｒｏ編、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、増補１９版、１９９５年において開示されている。

例示として述べると、医薬製剤は、本発明の融合タンパク質を含む容器を含むキットとして供給することができる。治療用タンパク質は、単回投与または複数回投与のための注射用溶液の形態で提供することもでき、注射前に再構成される滅菌粉末として提供することもでき、あらかじめ充填されたシリンジとして提供することもできる。このようなキットはさらに、医薬組成物の適応および使用法について書かれた情報も含みうる。なおまた、このような情報は、本発明の融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質に対する過敏性を伴うことが既知の患者においては禁忌であるという言明も含みうる。

本発明のＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲートは、医薬組成物を含む組成物へと組み込むことができる。このような組成物は、タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含むことが典型的である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬の投与に適合する、食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むがこれらに限定されない。また、補充的な活性化合物（例えば、抗生剤）も、組成物へと組み込むことができる。

医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように、製剤化される。本発明のＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲートは、非経口経路を介して投与される医薬組成物である可能性が高い。非経口投与経路の例は、例えば、静脈内経路、皮内経路、および皮下経路を含む。非経口適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素：注射用水、食塩液、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤を含みうる。ｐＨは、一塩基性リン酸ナトリウムおよび／もしくは二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸、または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基により調整することができる（例えば、約７．２〜７．８、例えば、７．５のｐＨへと）。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製の、アンプル、ディスポーザブルのシリンジ、または複数回投与用のバイアル内に封入することができる。

注射への使用に適する医薬組成物は、滅菌水溶液または滅菌水性分散液、および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散液を即席で調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与では、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。いずれの場合にも、組成物は、滅菌組成物であるものとし、容易な注射針通過性が存在する程度の流体であるものとする。組成物は、製造条件下および保管条件下で安定であるものとし、細菌および真菌など、微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する、溶媒の場合もあり、分散媒の場合もある。分散液の場合、要求される粒子サイズの維持は、界面活性剤、例えば、ポリソルベートまたはＴｗｅｅｎ（登録商標）を使用することにより、容易とすることができる。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど、多様な抗菌剤および抗真菌剤により達成することができる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。

滅菌注射用溶液は、活性化合物を、上記で列挙された成分のうちの１つまたは組合せを含む適切な溶媒中に、必要とされる量で、必要に応じて組み込むことに続いて、滅菌濾過を施すことにより調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒と、上記で列挙された成分に由来する、必要とされる他の成分とを含有する、滅菌媒体へと組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分に、さらなる所望の成分を加えた粉末を、あらかじめ滅菌濾過されたその溶液からもたらす、真空乾燥および凍結乾燥である。

一実施形態では、ＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲートは、ＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲートを、体内からの急速な消失に対して保護する担体であって、インプラント送達系およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの担体と共に調製される。生体分解性で生体適合性のポリマーであって、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などのポリマーを使用することができる。このような製剤は、標準的な技法を使用して調製することができる。

医薬組成物は、投与のための指示書と併せて、容器内、パック内、または分注器内に組み入れることができる。

（投与）
本発明のＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲートは、非経口経路により投与することが好ましい。皮下経路は、好ましい経路であるが、また、静脈内投与、筋内投与、および真皮下投与も使用することができる。皮下経路または筋内経路のためには、デポ剤およびデポ製剤を使用することができる。ある特定の疾患には、特化された投与経路を使用することができる。例えば、炎症性眼疾患には、眼内注射を使用することができる。融合タンパク質は、総容量に対して約０．１〜１０ｍｃｇ／ｍｌの濃度で使用しうるが、０．０１ｍｃｇ／ｍｌ〜１００ｍｃｇ／ｍｌの範囲内の濃度も使用することができる。

用量の決定は、当技術分野における技術レベルの範囲内にある。投薬は、処置期間にわたり、毎日または毎週の投薬であるが、別の間欠的な頻度の投薬でもありうる。静脈内投与は、１〜数時間の典型的な時間にわたる、ボーラス注射またはボーラス注入によるものとなる。また、持続放出製剤も、採用することができる。一般に、本発明のＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲートの治療有効量とは、循環Ｔｒｅｇ細胞の臨床的に有意義な変化、疾患組織内に存在するＴｒｅｇ細胞の臨床的に有意義な変化、または疾患症状の臨床的に有意義な変化など、処置される状態の臨床的に有意義な変化をもたらすのに十分な量である。

細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲を処方するときに使用することができる。このような化合物の投与量は、最大半量有効濃度（ＥＣ５０；すなわち、Ｔｒｅｇ細胞の最大半量刺激を達成する、被験化合物の濃度）を含み、毒性をほとんどまたは全く伴わない、循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、採用される剤形および活用される投与経路に応じて、この範囲内で変動しうる。本発明の方法で使用される任意の化合物について、まず、細胞培養アッセイから、治療有効用量を推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物中で決定されるＥＣ５０を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように処方することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量を、より正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、酵素免疫測定アッセイにより測定することができる。

本明細書で規定される通り、ＩＬ−２−ＰＥＧコンジュゲートの治療有効量（すなわち、有効投与量）は、選択されるポリペプチドおよび投与頻度に依存する。例えば、患者の体重１ｋｇ当たりおよそ０．００１〜０．１ｍｇの範囲内の単回投与量を投与することができ、一部の実施形態では、１ｋｇ当たり約０．００５、０．０１、０．０５ｍｇを投与することができる。組成物は、毎日１回〜毎週１回または複数回投与することもでき、毎月１回または複数回投与することもでき、隔日の投与も含む。当業者は、疾患または障害の重症度、処置の既往歴、対象の全般的健康状態および／または年齢、患者において存在するＴｒｅｇ細胞のレベル、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の因子が、対象を効果的に処置するのに必要とされる投与量および投与回数に影響を及ぼしうることを察知する。なおまた、治療有効量の、本発明のＩＬ−２選択的アゴニストＰＥＧコンジュゲートによる対象の処置は、一連の処置となる可能性が高い。

（自己免疫疾患）
本発明の治療から利益を得うる疾患の一部について言及してきた。しかし、自己免疫疾患におけるＴｒｅｇ細胞の役割は、極めて活発な研究領域であり、さらなる疾患が、本発明により処置可能な疾患として同定される可能性が高い。自己免疫疾患とは、免疫系が、ヒト自身のタンパク質、細胞、および組織を攻撃するヒト疾患として定義される。自己免疫疾患についての包括的な列挙および総説は、ＴｈｅＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＤｉｓｅａｓｅｓ（ＲｏｓｅおよびＭａｃｋａｙ、２０１４年、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）において見出すことができる。

本明細書において引用される、全ての刊行物および特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が、参照により、具体的、かつ、個別に組み込まれることが指し示された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。

前出の本発明について、理解の明確さを目的とする例示および例として、ある程度詳細に記載してきたが、本発明の教示に照らして、当業者には、付属の特許請求の範囲の主旨および範囲から逸脱しない限りにおいて、ある特定の変化および改変をこれに施しうることがたやすく明らかとなる。

以下の実施例は、例示としてだけ提示されるものであり、限定として提示されるものではない。当業者は、それほど重要でない様々なパラメータは、本質的に同様の結果をもたらすように、変化または改変しうることを、たやすく認識する。

（１．ＩＬ−２内の候補ＰＥＧ接合部位の予測）
ＰＥＧをＩＬ−２にコンジュゲートするための候補部位を選択するために、溶媒へと露出され、ＩＬ−２の、ＩＬ−２Ｒαβγへの結合に直接的または立体的に干渉しないと考えられるアミノ酸残基を同定した。戦略を、図２に概略的に示す。ＩＬ−２Ｒαβγ受容体の細胞外ドメインと複合したＩＬ−２についての、公表された結晶構造（Ｗａｎｇ，Ｘ．ら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０巻：１１５９〜６３頁；Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら、２００６年、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ、１０３巻：２７８８〜９３頁）を精査することにより、以下の残基：Ｓ６、Ｋ８、Ｋ４８、Ｋ４９、Ｔ５１、Ｅ５２、Ｋ５４、Ｋ９７、Ｇ９８、Ｆ１０３、Ｍ１０４、Ｅ１０６、Ｄ１０９、およびＴ１３３（図３）を同定した。結晶構造中に見ることはできないが、近傍の残基についての情報に基づくと、基準を満たす可能性が高いさらなるアミノ酸残基は、Ａ１、Ｐ２、Ｔ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ９９、Ｅ１００、Ｔ１０１、およびＴ１０２である。この候補のリストに基づき、表示の位置においてシステイン置換を伴う１２の変異体（Ｔ３Ｃ、Ｓ６Ｃ、Ｋ８Ｃ、Ｋ４８Ｃ、Ｋ４９Ｃ、Ｔ５１Ｃ、Ｋ９７Ｃ、Ｇ９８Ｃ、Ｆ１０３Ｃ、Ｍ１０４Ｃ、Ｅ１０６Ｃ、およびＤ１０９Ｃ）を構築し、産生した（表Ｉ）。

（２．ＩＬ２選択的アゴニスト変異体タンパク質の、Ｅ．ｃｏｌｉ内のクローニング、発現、および精製）
ヒトＩＬ−２（配列番号１）のバックグラウンドで施された、置換Ｎ８８ＲおよびＣ１２６Ｓを含有する表１に列挙される置換の各々を伴うタンパク質をコードするｃＤＮＡを、制限部位ＮＣＯＩおよびＢＡＭＨＩをそれぞれ５’端および３’端に組み込むＤＮＡ合成（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により調製し、ｐＵＣ５７にクローニングした。次いで、Ｎｃｏ１部位およびＢＡＭＨ１部位を使用して、ｃＤＮＡインサートを、ｐＥＴ３ｄベクター（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）にクローニングした。構築物を、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞へと形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。形質転換された細胞は、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％のグルコースを含有するＬＢ培地による０．５Ｌの培養物中、３７℃で、０．６〜１．０の間のＡＢＳ２８０まで増殖させた。次いで、ＩＰＴＧを、０．５ｍＭまで添加して、タンパク質の発現を誘導し、誘導の３時間後において、培養物を採取した。

１０，０００×ｇで１０分間にわたる遠心分離により、細胞をペレット化させた。製造元の指示書に従い、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、封入体（ＩＢ）を、細胞ペレットから抽出および精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析のための試料を取り出した。ＩＢは、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の２−メルカプトエタノールを含有する、０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣＬ（ｐＨ８．０）中に８Ｍの塩化グアニジン中、室温で２時間にわたり溶解および変性させた。次いで、タンパク質を、室温で１２時間にわたる、２０倍容量の１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＬ（ｐＨ８．０）／１ｍＭＥＤＴＡに対する透析により、リフォールディングさせた。次いで、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、試料へと、０．１％まで添加し、遠心分離により試料を清明化させて、沈殿物を除去し、０．２ｕＭのフィルターによって濾過し、逆相クロマトグラフィーにより精製した。ＩＬ−２変異体を、Ｖｙｄａｃ２０８ＴＰ５４Ｃ−８カラムへと、０．１％のＴＦＡ中、１ｍｌ／分の流量でロードし、０．１％のＴＦＡ中に０〜７５％のアセトニトリルの勾配で４５分間にわたって溶出させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより画分をスクリーニングしたところ、ＩＬ−２変異体タンパク質は、典型的にはおよそ６０％のアセトニトリルで溶出した。

これらの産生研究の結果を、表Ｉにまとめる。産生のために選択された１２の変異体のうち、７つだけが、逆相クロマトグラフィーの後で、検出可能なＩＬ−２タンパク質ピークをもたらした。これらの７つのタンパク質のうち、５つは、極めて低い収率を呈し、実施されたスケールでは、さらなる研究に不十分な材料をもたらした。残りの２つのタンパク質のうち、最高レベルで産生された方である、Ｄ１０９Ｃ変異体を、ＰＥＧ化し、調べた。これらの結果は、単一の不対合システイン残基を伴う、これらの変異体タンパク質を産生する能力は、ばらつきが大きく、多くは、容易に産生できないことを示す。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主に対する組換えタンパク質の毒性、封入体を形成する能力の欠如、またはリフォールティング効率の低さなど、様々な因子に起因しうるであろう。産生工程を改変すること、または分泌タンパク質として、哺乳動物細胞などの他の発現系においてタンパク質を発現させることにより、他の変異体の一部の生産性が改善する可能性がある。しかし、本発現系では、産生レベルに基づくと、Ｄ１０９Ｃ変異体が、明らかな優位性を呈する。

（３．ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９ＣのＰＥＧ化）
精製されたＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃを、２０ｋＤａのＰＥＧとコンジュゲートして、コンジュゲートの生物活性について調べた。ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃを、０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ６．０）へと透析し、タンパク質濃度は、０．６５５の吸光係数を使用するＯＤ２８０（０．１％のときのＡｂｓ２８０ｎＭ）により決定し、５０倍モル過剰のマレイミド−ＰＥＧ（２０，０００ｇ／Ｍ；ＮＯＦＡｍｅｒｉｃａ、ＷｈｉｔｅＰｌａｉｎｓ、ＮＹ）と、室温で３０分間にわたり反応させた。Ｌ−システインを、マレイミド−ＰＥＧに対する２倍モル過剰まで添加することにより、反応を停止させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、１０ｕｇの反応混合物についての解析は、検出可能な残留未反応ＩＬ−２タンパク質を示さなかった。

（４．ＰＥＧ化されたＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃの、Ｔ細胞に対する活性）
ＰＥＧ化されたＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃの、Ｔ細胞に対する活性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセット内のホスホＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）レベルの刺激を測定することにより決定した。ＩＬ−２の、ＩＬ２ＲＢおよびＩＬ２ＲＧによるヘテロ二量体への結合を介する、ＩＬ−２受容体の活性化は、ＪＡＫ１タンパク質およびＪＡＫ３タンパク質のそれぞれの、ＩＬ２ＲＢ細胞質ドメインおよびＩＬ２ＲＧ細胞質ドメインとの相互作用を促進することから、ＳＴＡＴ５タンパク質（ｐＳＴＡＴ５）のリン酸化を刺激し、次いで、これにより、ＩＬ−２シグナルが、核へと伝達される。ＳＴＡＴ５は、Ｔｒｅｇ細胞の発生に必要であり、ＩＬ−２の非存在下における、ＣＤ４＋Ｔ細胞内の、ＳＴＡＴ５の人工的な活性化でも、Ｔｒｅｇ細胞の産生に十分である（Ｍａｈｍｕｄ，Ｓ．Ａ．ら、２０１３年、ＪＡＫＳＴＡＴ、２巻：ｅ２３１５４頁）。ｐＳＴＡＴ５のレベルは、透過化された細胞内の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、リン酸化ＳＴＡＴ５ペプチドに対する抗体により測定した。Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５を構成的に発現し、ＣＤ２５の発現レベルで上位１％の細胞は、Ｔｒｅｇ細胞について高度に濃縮されている（Ｊａｉｌｗａｌａ，Ｐ．ら、２００９年、ＰＬｏＳＯｎｅ．、２００９、４巻：ｅ６５２７頁；Ｌｏｎｇ，Ｓ．Ａ．ら、２０１０年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５９巻：４０７〜１５頁）。したがって、ＦＡＣＳデータをゲーティングし、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ（ＣＤ２５発現細胞のうちの上位１〜２％）群およびＣＤ２５^{ｌｏｗ／−}群とした。

低温保存されたヒトＰＢＭＣ（ＡｓｔａｒｔｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を、解凍し、１％のヒトＡＢ血清（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を含有するＸ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ、Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）培地中で洗浄し、３７℃で２時間にわたり回復させた。次いで、細胞を、１５×７５ｍｍの試験管内に０．１ｍｌずつ、１ｍｌ当たりの細胞５×１０^６個の濃度で分配した。細胞を、４ｎＭのＩＬ−２、４０ｎＭのＰＥＧ−ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｄ１０９Ｃ、もしくはＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｄ１０９Ｃ、または、３７℃で１０分間にわたりＬ−システインと反応させた、等量のマレイミド−ＰＥＧで処置し、次いで、ＣｙｔｏｆｉｘＦｉｘａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒにより、３７℃で１０分間にわたり固定した。固定された細胞を、ＰｅｒｍＢｕｆｆｅｒＩＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）により、氷上で３０分間にわたり透過処理し、洗浄し、次いで、抗ＣＤ４−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）、抗ＣＤ２５−ＡＦ４８８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、および抗ｐＳＴＡＴ５−ＡＦ５４７抗体（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の混合物により、２０℃で３０分間にわたり染色し、洗浄し、ＬＳＲＩＩｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＦＡＣＳにより解析した。

この実験の結果は、ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９ＣおよびＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧのいずれも、Ｔｒｅｇ細胞について濃縮された、ＣＤ４＋ＣＤ２５^ｈｉｇｈ細胞の小亜集団を、ＩＬ−２と比較して選択的に活性化させることを示した（図２）。ＩＬ−２は、４ｎＭのＩＬ−２でＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの８０％超を活性化させたが、活性化した細胞のうちの高い比率は、ＣＤ２５の発現が低レベルであるか、またはＣＤ２５の発現がみられなかった。これらの結果は、ＰＥＧ化されたＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃが、Ｔｒｅｇを活性化させる選択的能力を保持することを示す。

（５．ヒトＰＢＭＣ中の、ＩＬ２選択的アゴニスト−ＰＥＧコンジュゲートタンパク質の選択性）
ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧの選択性を、より広範な生物学的コンテキストにおいて決定するために、ＳＴＡＴ５活性化を、画分化されていない粗ヒトＰＢＭＣ中の、全ての鍵となる免疫細胞型にわたり測定するアッセイを開発した。ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離により、正常ボランティアから単離した。ＰＢＭＣ１０^６個を、グルコース（Ｌｏｎｚａ）および１０％のＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ）を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地中に懸濁させ、１０^−８Ｍの被験タンパク質と共に３７℃で２０分間にわたり処置した。次いで、細胞を、製造元の指示書に従い、Ｆｏｘｐ３／ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＳｔａｉｎｉｎｇＢｕｆｆｅｒＳｅｔ（ＥＢＩＯ）で処置した。次いで、細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘｂｕｆｆｅｒで固定し、実施例３で記載した通り、ＰｅｒｍＢｕｆｆｅｒＩＩＩで透過処理した。次いで、固定および透過処理された細胞を、１％のＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄し、暗所内、室温で６０分間にわたり、抗体混合物で染色した。次いで、染色された細胞を、１％のＦＢＳ／ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、Ｆｏｒｔｅｓｓａｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。抗体ミックスは、抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤ、＃５６０６５０）、抗ｐＳＴＡＴ５−ＡＦ−４８８（ＢＤ、＃６１２５９８）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（ＢＤ、＃５６０９８９）、抗ＣＤ５６−ＰＥ−ＣＦ５９４（ＢＤ、＃５６２３２８）、抗ＦＯＸＰ３−ＡＦ６４７（ＢＤ、＃５６０８８９）、抗ＣＤ３−Ｖ４５０（ＢＤ、５６０３６６）、および抗ＣＤ８−ＢＶ６５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３０１０４１）からなった。この染色手順は、７つの鍵となる免疫細胞型内の、ｐＳＴＡＴ５レベルのモニタリングを可能とした。

細胞表現型は、以下の通りに規定した：Ｔｒｅｇ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、Ｆｏｘｐ３＋、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ、ＣＤ８−、ＣＤ５６−；活性化ＣＤ４Ｔｅｆｆ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、Ｆｏｘｐ３−、ＣＤ２５^ｈｉｇｈ、ＣＤ８−、ＣＤ５６−；ＣＤ４Ｔｅｆｆ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、Ｆｏｘｐ３−、ＣＤ２５^ｌｏｗ、ＣＤ８−、ＣＤ５６−；ＮＫＴ細胞：ＣＤ３＋、ＣＤ４−、Ｆｏｘｐ３−、ＣＤ２５^ｌｏｗ、ＣＤ８−、ＣＤ５６＋；ＮＫ細胞：ＣＤ３−、ＣＤ４−、Ｆｏｘｐ３−、ＣＤ２５^ｌｏｗ、ＣＤ８−、ＣＤ５６＋；Ｂ細胞：ＣＤ３−、ＣＤ４−、Ｆｏｘｐ３−、ＣＤ２５^ｌｏｗ、ＣＤ８−、ＣＤ５６−。

このアッセイでは、タンパク質を、１０^−８Ｍの濃度で調べた。図５に示される結果は、全ての細胞集団の大部分においてｐＳＴＡＴ５を活性化させたｗｔＩＬ２と比較して、ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９ＣおよびＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧのいずれもが目覚ましい選択性を呈したことを示す。ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧは、Ｔｒｅｇ集団内のｐＳＴＡＴ５シグナルを、ｗｔＩＬ−２によるレベルと本質的に同じレベルで刺激した。さらなる解析（図示しない）は、ｐＳＴＡＴ５＋ＮＫ細胞がＣＤ２５^ｈｉｇｈであることを示したが、ＣＤ２５^ｈｉｇｈは、これもまた免疫調節活性を有するＮＫ細胞亜集団であるＮＫ−ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}細胞（Ｐｏｌｉ，Ａら、２００９年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２６巻（４号）：４５８〜６５頁）の特徴である。これらの結果は、複雑な生物学的環境における、ＩＬ２／Ｎ８８Ｒ／Ｃ１２５Ｓ／Ｄ１０９Ｃ−ＰＥＧの活性およびＴｒｅｇに対する高度な選択性を裏付ける。

Claims

本明細書に記載の発明。