KR20170035910A - 자가면역 질환의 치료를 위한 조절 t 세포를 선택적으로 활성화시키는 변형된 il-2 변이체 - Google Patents

자가면역 질환의 치료를 위한 조절 t 세포를 선택적으로 활성화시키는 변형된 il-2 변이체 Download PDF

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Abstract

본원에 기술된 발명은, IL-2 선택적 아고니스트 단독에 비해 순환 반감기가 증가한, 조절 T 세포에 대한 선택적 아고니스트 활성 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 화학적 공액(conjugation)을 가능하게 하는 추가 아미노산 치환을 갖는 신규한 IL-2 단백질에 관한 것이다. 바람직한 IL-2 선택적 아고니스트 변이체는 IL-2/N88R/C125S/D109C이다.

Description

자가면역 질환의 치료를 위한 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 변형된 IL-2 변이체{MODIFIED IL-2 VARIANTS THAT SELECTIVELY ACTIVATE REGULATORY T CELLS FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES}
관련 출원 상호 참조
본 출원은 2014년 8월 11일자 출원된 미국 가특허출원 제62/070,016호의 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용은 본원에 참고로 인용된다.
면역계는 자기와 비자기를 구별할 수 있어야 한다. 자기/비자기를 구별하지 못하면, 면역계는 신체의 세포와 조직을 파괴하고 그 결과 자가면역 질환을 유발한다. 조절 T 세포는 면역계의 활성화를 능동적으로 억제하여 병적인 자기 반응성을 예방하고 결과적으로 자가면역 질환을 예방한다. 자가면역 질환의 치료를 위한, 조절 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 약물 및 방법의 개발은 집중적 연구 대상이며, 본 발명의 개발 전까지 대체로 성공적이지 못했다.
조절 T 세포(Regulatory T cell; Treg)는 다른 면역 세포의 활성을 억제하는 CD4+CD25+ T 세포의 한 부류이다. Treg는 면역계 항상성에 있어서 중심적이며, 자기 항원에 대한 관용을 유지하고 외래 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 데 있어서 주요된 역할을 한다. 1형 당뇨병(T1D), 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 비롯한 다수의 자가면역 질환 및 염증성 질환이 Treg 세포수 또는 Treg 기능에 결함이 있는 것으로 확인되었다. 그 결과, Treg 세포의 수 및/또는 기능을 부스팅하는 치료법의 개발이 큰 관심의 대상이다.
연구되고 있는 자가면역 질환의 치료 접근법 중 하나는 생체외에서 증식시킨 자가 유래의 Treg 세포를 이식하는 것이다(Tang, Q., et al, 2013, Cold Spring Harb. Perspect. Med., 3:1-15). 이 접근법은 질환의 동물 모델의 치료와 몇몇 초기 인간 임상 시험에서 밝은 전망을 보였지만, 환자 자신의 T 세포를 이용한 개인 맞춤 치료를 요하고, 침습적이며, 기술적으로 복잡하다. 또 다른 접근법은, 저용량 인터루킨-2(IL-2)을 사용한 치료이다. Treg 세포는 특징적으로, 서브유닛 IL-2RA(CD25), IL-2RB(CD122) 및 IL-2RG(CD132)로 이루어진, 고친화성 IL-2 수용체인 IL-2Rαβγ를 높은 항상적 수준으로 발현하며, Treg 세포 성장은 IL-2에 의존적인 것으로 확인되었다(Malek, T. R., et al., 2010, Immunity, 33:153-65). 만성 GVHD 환자(Koreth, J., et al., 2011, N Engl J Med., 365:2055-66) 및 HCV 관련 자가면역성 혈관염 환자(Saadoun, D., et al., 2011, N Engl J Med., 365:2067-77)의 저용량 IL-2 치료의 임상 시험은 Treg 수준의 증가와 임상적 효능의 징후를 입증하였다. 다수의 다른 자가면역 질환 및 염증성 질환에 있어서의 IL-2의 효능을 연구하는 새로운 임상 시험이 시작되었다.
이들 임상 시험에서 사용되는 IL-2의 재조합 형태인 프로루킨(Proleukin)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Prometheus Laboratories에서 시판됨)은 높은 독성과 관련되어 있다. 프로루킨은 전이성 흑색종 및 전이성 신장암의 치료에 대해 승인을 받았지만, 그 부작용이 너무 심각하여, 집중 치료를 할 수 있는 병원 시설에서만 그 사용이 권고되고 있다(웹 주소: http:/www.proleukin.com/assets/pdf/proleukin.pdf). 보다 최근 Treg 세포가 특성화될 때까지, IL-2는 T 세포 및 다른 면역 세포를 활성화시켜 암 세포를 제거하는 면역계 자극인자인 것으로 간주되었다. 자가면역 질환에 있어서의 IL-2의 임상 시험은 Treg 세포를 표적으로 하기 위해 저용량의 IL-2를 이용하였는데, 그 이유는 Treg 세포는 IL-2Rαβγ의 발현으로 인해 다수의 다른 면역 세포 유형보다 더 적은 농도의 IL-2에 반응하기 때문이다(Klatzmann D, 2015, Nat Rev Immunol. 15:283-94). 그러나, 이와 같은 저용량도 안전성 및 내약성 문제를 유발하였고, 이용된 치료법은 장기적 또는 간헐적 5일 치료 과정으로 매일의 피하 주사를 이용하였다. 따라서, Treg 세포 수 및 기능을 강화하고, IL-2보다 Treg 세포를 더 특이적으로 표적화하며, 더 안전하고 더 내약성이 좋고, 더 적은 빈도로 투여되는 자가면역 질환 치료법이 요구되고 있다.
IL-2에 기초한 치료법의 치료 지수를 개선하기 위한 한 가지 접근법은 다른 면역 세포에 비해 Treg 세포에 선택적인 IL-2의 변이체를 이용하는 것이다. IL-2 수용체는 T 세포, NK 세포, 호산구 및 단핵구를 포함한 다종 다양한 면역 세포 유형에서 발현되고, 그 광범위한 발현 패턴은 면역계 및 높은 전신 독성에 대한 다면발현 효과에 기여할 가능성이 있다. IL-2 수용체는 3가지 형태: (1) 신호전달을 하지 않는 저친화성 수용체 IL-2RA; (2) 통상적인 T 세포(Tcon), NK 세포, 호산구 및 단핵구에서 광범위하게 발현되는, IL-2RB 및 IL-2RG로 이루어진 중간 친화성 수용체(IL-2Rαβγ); 및 (3) 활성화된 T 세포에서 일시적으로 발현되고 Treg 세포에서 항상적으로 발현되는, IL-2RA, IL-2RB 및 IL-2RG로 이루어진 고친화성 수용체(IL-2Rαβγ)로 존재한다. IL-2Rβγ에 비해 IL-2Rαβγ에 선택적인 IL-2 변이체가 개발되었다(Shanafelt, A. B., et al., 2000, Nat Biotechnol. 18:1197-202; Cassell, D. J., et al., 2002, Curr Pharm Des., 8:2171-83). 이들 변이체는 IL-2RB에 대한 그들의 친화성을 감소시키는 아미노산 치환을 갖는다. IL-2는 IL-2RG에 대해 검출 불가능한 친화성을 갖기 때문에, 그 결과 이들 변이체는 IL-2Rβγ 수용체 복합체에 대한 친화성 감소 및 IL-2Rβγ 발현 세포를 활성화시키는 능력 감소를 나타내지만, IL-2RA에 결합할 수 있는 능력과 IL-2Rαβγ 수용체 복합체에 결합하고 이를 활성화시키는 능력은 유지한다. 이들 변이체 중 하나인 IL-2/N88R(Bay 50-4798)은, IL-2Rβγ 발현 NK 세포가 독성의 주요 기여인자라는 가설에 기초하여, 면역계 자극인자로서 IL-2의 저독성 버전으로서 임상적으로 테스트되었다. Bay 50-4798은 NK 세포에 비해 활성화된 T 세포의 증식을 선택적으로 자극하는 것으로 확인되었고, 암 환자(Margolin, K., et al., 2007, Clin Cancer Res., 13:3312-9) 및 HIV 환자(Davey, R. T., et al., 2008, J Interferon Cytokine Res., 28:89-100)의 I/II 기 임상 시험에서 평가되었다. 이러한 임상 시험은, Bay 50-4798이 프로루킨보다 훨씬 더 안전하고 내약성이 좋다는 것을 보여주었고, 또한, Treg 세포가 집중되어 있는 세포 집단인 CD4+CD25+ T 세포의 수준을 증가시켰음을 보여주었다. 이러한 임상 시험들에 이어, 당해 기술분야의 연구는 Treg 세포의 실체를 보다 충분히 확립하였고, Treg 세포가 IL-2Rαβγ를 선택적으로 발현한다는 것을 입증하였다(문헌[Malek, T. R., et al., 2010, Immunity, 33:153-65]에서 재검토됨). 이러한 새로운 연구에 기초할 때, 이제는 IL-2Rαβγ 선택적 아고니스트가 Treg 세포에 대해 선택적이어야 한다는 것을 이해할 수 있다.
IL-2에 기초한 치료법의 치료 지수를 개선하기 위한 제2의 접근법은, Treg 세포를 최대한 자극하도록 분자의 약동학적 특성 특성을 최적화하는 것이다. IL-2 작용에 관한 초기의 연구는, 시험관내에서의 인간 T 세포 증식의 IL-2 자극이 유효 농도의 IL-2에 최소 5∼6시간 노출될 것을 요하였음을 입증하였다(Cantrell, D. A., et al., 1984, Science, 224:1312-1316). 인간 환자에게 투여될 때, IL-2는 정맥내 투여에 대해서는 85분, 피하 투여에 대해는 3.3시간의 매우 짧은 혈장 반감기를 갖는다(Kirchncr, G. I., et al., 1998, Br J Clin Pharmacol. 46:5-10). 반감기가 짧기 때문에, 순환 IL-2를, 필요한 지속 시간 동안 T 세포 증식을 자극하는 데 필요한 수준 이상으로 유지하기 위해서는, 피크 IL-2 수준을 Treg 세포에 대한 EC50보다 현저히 높은 수준으로 만드는 고용량이 필요하거나 빈번한 투여가 필요하게 된다(도 1). 이러한 높은 IL-2 피크 수준은 IL-2Rβγ 수용체를 활성화시킬 수 있고 다른 의도하지 않은 작용 또는 부작용을 가질 수 있다. IL-2보다 더 긴 순환 반감기를 갖는 IL-2 유사체는 IL-2보다 더 적은 용량으로 및 더 낮은 피크 수준으로, 지정된 기간 동안 목표 약물 농도를 달성할 수 있다. 따라서, 이러한 IL-2 유사체는, Treg 세포를 효과적으로 자극하는 데 IL-2보다 더 적은 용량 또는 더 적은 빈도의 투여를 필요로 할 것이다. 또한, IL-2 약물의 피하 투여 빈도가 적을수록 환자의 허용성이 더 좋아질 것이다. 이러한 특성들을 갖는 치료제는 임상적으로는 약리학적 효능의 개선, 독성 감소 및 치료에 대한 환자의 순응성 개선으로 해석될 것이다.
치료 단백질의 반감기를 연장시키는 한가지 접근법은 치료 단백질을 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비면역원성 수용성 폴리머와 공액(conjugate)시키는 것이다. 단백질의 PEG 분자로의 화학적 공액(PEG화)는 단백질의 유효 수력 반경(effective hydrodynamic radius)을 증가시킴으로써 단백질 공액체가 신장에 의해 혈액으로부터 여과되는 속도를 감소시키며, 이로써 순환 반감기를 증가시킨다. IL-2 및 IL-2 선택적 아고니스트는 빠른 신장 청소 속도를 갖는 약 15,000 달톤(15 kDa)의 비교적 작은 단백질이다. PEG 분자의 순환 반감기는 PEG의 분자량에 비례하여 증가한다(Yamaoka, T., et al., 1994 J Pharm Sci. 83:601-6).
PEG화 치료 단백질의 성공적인 제조 및 제작에 영향을 미치는 여러 요인이 존재한다. 첫째로, PEG화 단백질이 PEG 분자와 단백질의 화학적 공액에 의해 제조되기 때문에, PEG화와 관련된 추가 제작 단계로 인해 단백질이 효율적으로 제작되는 것이 중요하다. 둘째로, PEG 모이어티는 특정 아미노산 잔기를 통해 단백질에 효율적으로 공액되며, 이로써 높은 수율의 균질한 생성물을 유도해야 한다. 셋째로, 단백질 상의 PEG화 부위는 단백질의 치료적 활성을 최소한으로 간섭하도록 선택되어야 한다. 단백질 치료적 활성에 대한 간섭은 단백질의 활성 부위로의 PEG의 공액으로 인한 것일 수 있거나, 또는 PEG에 의한 활성 부위의 입체 장애로 인한 것일 수 있다. 한 예시로서, PEG화 IL-2의 한 형태는, PEG 분자가 IL-2 상의 1차 아민과 공액되어, IL-2 분자당 1개 내지 4개의 PEG 폴리머를 포함하는 단백질 종의 불균질 혼합물을 야기하고(Katre, N. V. et. al., 1987 Proc Natl Acad Sci U S A. 84:1487-91; Knauf, M. J., et. al., 1988 J Biol Chem. 15;263:15064-701988) IL-2에 비해 4-6 배 감소된 생물학적 활성을 나타내는(Chen, S.A., 2000 J Pharmacol Exp Ther . 293:248-59) 문헌에 이미 보고되었다. IL-2 선택적 아고니스트가 Treg 세포 상의 3개의 수용체 서브유닛의 복합체에 결합하고 이를 활성화시켜야 하기 때문에, IL-2 상의 적절한 공액 부위가 최적의 생물활성을 위해 신중하게 선택되어야 한다.
본 발명은, Treg 세포를 활성화시키는 IL-2-PEG 공액체의 능력을 유지하면서 PEG 분자의 안정하고 특이적인 화학적 공액을 가능하게 하는, IL-2 서열 중 특정 위치에 단일 아미노산 치환을 갖는 IL-2의 변이체에 관한 것이다. PEG 공액 부위로서 정의된 이러한 특정된 아미노산 위치는 PEG 분자의 IL-2 변이체로의 공액으로부터 유도된 IL-2-PEG 공액체가 IL-2Rαβγ 수용체에 결합하고 이를 활성화시키는 능력이 최소한으로 손상되도록 선택된다. 본 발명은 또한, IL-2Rαβγ 수용체에 선택적이며 따라서 Treg 세포에 고선택성인 IL-2 변이체 상에 상기 언급된 PEG 공액 부위를 갖는 IL-2 변이체에 관한 것이다.
화학적으로 활성화된 PEG는 1차 아민을 포함하는 아미노산 잔기에 또는 티올 기에 공액하는 것을 가능하게 하는, 단백질로의 공액을 위한 여러 상이한 화학적 반응성 기와 함께 개발되었다. 이들 중에서, 시스테인 잔기 상에 고유하게 존재하는 티올 기는 PEG의 단백질로의 가장 선택적인 공액을 가능하게 하며, 말레이미드 또는 요오도아세트아미드 반응성 기를 갖는 PEG는 자유 시스테인 티올과 매우 선택적으로 반응한다. 세포외 단백질 중 대부분의 시스테인 잔기는 단백질 입체구조를 안정화하는 이황화 결합에 기여하고, 소수의 자유(쌍을 이루지 않은(unpaired)) 시스테인 잔기는 보통 단백질의 내부에 매립된다(Petersen, M. T., et. al., 1999 Protein Eng. 1999 12:535-48). 단백질 중 자유 시스테인 잔기로의 PEG 공액은 자연 노출된 자유 시스테인 잔기 또는 신규한 자유 시스테인 잔기의 도입을 필요로 한다. 신규한 자유 시스테인의 단백질 내로의 엔지니어링은 도입된 신규한 시스테인이 다른 시스테인과의 부적절한 쇄내 이황화 결합을 형성하여 단백질의 미스폴딩을 야기할 수 있거나, 다른 분자와의 쇄간 이황화 결합을 형성하여 단백질 응집을 야기할 수 있다는 위험을 보유한다. 돌연변이화된 시스테인 잔기를 갖는 IL-2 변이체는 잘못 쌍을 이룬 이황화 결합으로 인해 실질적으로 감소된 활성을 나타낼 수 있다(Wang, A., et al., 1984 Science. 224:1431-3). 본원의 발명은 올바른 단백질 폴딩과 양립할 수 있을, 신규한 자유 시스테인 잔기의 IL-2 변이체 단백질 내로의 엔지니어링에 관한 것으로, 이는 티올 반응성 PEG의 부위 특이적 공액을 가능하게 하고, Treg 상의 IL-2Rαβγ에 결합하고 이를 활성화시키는 능력을 유지하는 IL-2-PEG 공액체를 유도한다.
도 1은 IL-2 또는 증가된 반감기를 갖는 IL-2-PEG 단백질의 단회 투여 후의 순환 반감기, 피크 약물 수준, 생물학적 유효 농도, 및 Treg 세포 증식을 자극하는 데 필요한 지속 시간 사이의 관계를 보여주는 모식도이다. 점선은 피하 주사 후의 IL-2의 시간 경과에 따른 혈액 수치를 나타내고, 실선은 IL-2-PEG 공액체의 시간 경과에 따른 혈액 수치를 나타낸다. 수평 점선은 각각 IL-2Rαβγ 및 IL-2Rβγ를 발현하는 세포를 활성화시키는 데 필요한 농도(EC50 값)를 나타낸다. 양방향 화살표는 세포 증식을 자극하는 데 필요한 EC50에서의 IL-2에 대한 노출 지속 시간(5∼6시간)을 나타낸다.
도 2는 PEG 또는 기타 비면역원성 폴리머 공액을 위한 부착 부위를 결정하는 전략을 나타낸다. IL-2는 고친화성 IL-2 수용체의 3개의 서브유닛을 갖는 복합체로 도시된다. IL-2 수용체 서브유닛과 상호작용하지 않는 용매에 노출된 IL-2 표면 아미노산 잔기는 PEG 폴리머의 부착에 대한 후보 아미노산 잔기이다(원으로 표시됨).
도 3은 IL-2/IL-2Rαβγ 복합체의 3-D 결정 구조를 나타내며, PEG 또는 기타 비면역원성 폴리머를 부착하는 것에 대한 준거(criteria)를 충족시키는 잔기의 아미노산 측쇄를 나타낸다. 나타낸 잔기는 T3C, S6C, K8C, K48C, K49C, T51C, K97C, G98C, F103C, M104C, E106C 및 D109C이다. IL-2는 중앙 전경에, IL-2RΒ는 중앙 좌측에, IL-2RΓ는 중앙 우측에 나타나 있으며, IL-2RΑ는 상단 및 후면에 나타나 있다. 세포막에 대한 수용체 복합체의 배향은 화살표로 나타나 있다.
도 4는 Treg 세포에 대해 집중되어 있는 T 세포 아집단에서 IL-2/N88R/C125S/D109C 및 PEG화 IL-2/N88R/C125S/D109C에 의한 pSTAT5의 선택적 활성화를 나타낸다. 인간 PBMC를 각 플롯의 상단에 표시된 샘플로 37℃에서 10분 동안 항온처리하고, 고정시키고, 투과화하고, 항체로 염색한 후, 유세포 분석으로 처리하였다. FACS 플롯은 의색 모드(pseudocolor mode)로 나타나 있다. CD4+로서 게이팅된 세포가 나타나 있으며, 세포는 각 4사분면에 나타나 있는 바와 같이 추가 게이팅되었다. 각 사분면의 수는 각 게이트의 CD4+ 세포의 백분율을 나타낸다. 상측 사분면의 세포는 가장 높은 1-2%의 CD25 발현 세포로서, Treg 세포가 집중되어 있는 군을 나타낸다. 비처리된 세포는 배지 단독으로 항온처리하고, IL-2는 4x10-9 M의 농도로 첨가하며, IL-2/N88R/C125S/D109C 및 IL-2/N88R/C125S/D109C-PEG 샘플은 4x10-8 M의 농도로 첨가하고, PEG 처리된 샘플은 IL-2/N88R/C125S/D109C-PEG와 동일한 양의 PEG를 함유하는 모의(mock)-PEG화 반응에서 항온처리하였다. IL-2는 CD25low /- 및 CD25high 세포 양쪽에서 대량의 STAT5 인산화를 유발하였다. IL-2/N88R/C125S/D109C 및 IL-2/N88R/C125S/D109C-PEG 둘 모두는 정성적 및 정량적으로 상이한 효과를 가졌고, STAT5 인산화를 주로 1% 미만의 세포에서 및 주로 CD25high 세포에서 유발하였다.
도 5a~도 5b는 인간 PBMC에서 7가지 상이한 면역 세포 유형에 대한 IL-2 및 IL-2 선택적 아고니스트 단백질의 선택성을 입증한다. IL-2/N88R/C125S/D109C 및 IL-2/N88R/C125S/D109C-PEG 둘 모두는 wt IL-2에 비해 Treg에 대해 고선택성이고, 다수의 세포 유형에서 IL-2보다 큰 선택성을 나타내었다.
발명의 내용
본원에 기술된 발명은, IL-2 선택적 아고니스트 단독에 비해 순환 반감기가 증가한, 조절 T 세포에 대한 선택적 아고니스트 활성 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과의 화학적 공액을 가능하게 하는 추가 아미노산 치환을 갖는 신규한 IL-2 단백질에 관한 것이다. 치환된 아미노산 위치는 이의 IL-2-IL-2Rαβγ 수용체 복합체 내의 용매로의 노출 및 IL-2Rαβγ 수용체 복합체에 결합하고 이를 활성화시키는 능력을 유지하기 위한 폴리머-공액된 변이체의 예측된 능력에 기초하여 선택된다. 일련의 재조합 IL-2 변이체는 시스테인 아미노산 잔기가 선택된 아미노산 위치로 도입되어 구성되며 이의 변이체 단백질은 활성에 대해 스크리닝된다. 성공적으로 발현 및 정제된 IL-2 변이체는 재폴딩되고, 말레이미도-PEG 폴리머에 공액된 후, 조절 T 세포에 대한 선택적 아고니스트 활성에 대해 시험된다. 이로써 바람직한 IL-2 선택적 아고니스트 변이체인 IL-2/N88R/C125S/D109C가 동정되었다. 이러한 신규한 단백질 및 이의 PEG 공액체는 선택적으로 및 효율적으로 환자에서의 조절 T 세포의 수준 및 활성을 부스팅하고 자가면역 병리를 억제할 것이며, 따라서 자가면역 질환의 치료에 대해 안전하고 효과적인 치료제가 될 것이다.
본 발명은 또한 서열 번호 1에 대해 95% 이상 내지 98% 및 100%의 서열 동일성을 가지고 치환 D109C를 포함하며 T 세포를 활성화시키는 능력을 갖는 IL-2 변이체 단백질을 제공한다. 본 발명의 단백질은 위치 109의 시스테인에 연결된 폴리에틸렌 글리콜 모이어티에 연결될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 임의로 5 kDa 내지 40 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 본 발명의 IL-2 변이체 단백질은 N88R, N88I, N88G, D20H, Q126L 및 Q126F로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 추가로 본 발명의 IL-2 변이체 단백질은 임의로 치환 C125S을 포함할 수 있다. IL-2 단백질 서열이 치환 N88R 및 치환 C125S을 포함하는 것인 IL-2 변이체 단백질이 보다 바람직하다. 본 발명의 단백질은 임의로 본 발명의 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로 제공된다.
본 발명은 추가로 본 발명의 인간 IL-2 변이체 단백질의 순환 반감기를 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 위치 109의 시스테인 잔기에 연결하는 것으로 포함하고 상기 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 상기 단백질의 순환 반감기를 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 갖지 않는 동일한 단백질에 비해 증가시키기에 충분한 길이를 가진다. 본 발명의 방법은 추가로 인간 조절 T 세포 수준을 자극하기에 충분한 치료 유효량의 단백질 변이체의 투여를 제공한다.
발 명을 실시하기 위한 구체적인 내용
도입
본 발명은, IL-2 자체에 비해 IL-2 수용체에 대한 높은 친화성, 높은 생물활성, 및 연장된 순환 반감기를 유지하면서, PEG 폴리머의 IL-2 변이체 단백질로의 특이적이고 효율적인 화학적 공액을 가능하게 하는 아미노산 치환을 포함하는 신규한 IL-2 변이체 단백질에 관한 것이다. 이 변이체 단백질은, 공개된 IL-2-IL-2Rαβγ 수용체 복합체 결정 구조에서 용매에 노출된 IL-2 서열 중 후보 아미노산 위치를 동정하고, 선택된 위치에서 시스테인 잔기를 치환하여 변이체 단백질을 구성하는 방법에 의해 발견되었다. 이러한 IL-2 변이체를 발현 및 정제하고, 충분히 높은 수준으로 제조된 변이체 단백질을 PEG-말레이미드와 공액시킨 후, IL-2/N88R/D109C-PEG를 Treg 세포에 대한 생물활성에 대해 시험하고 활성인 것으로 나타났다. 본 발명에 의해 정의되는 분자는, 자가면역 및 염증성 병리를 억제하는 T 세포의 작은 아집단의 생성을 자극하는 신규한 메커니즘에 의해 자가면역 질환의 안전하고 효과적인 치료를 가능하게 할 것이다. 이러한 패러다임을 부수는 치료법은 잠재적으로 여러 상이한 자가면역 질환을 치료할 수 있다.
정의
야생형 단백질로부터의 변이체를 의미하는 경우, 아미노산 치환, 예컨대 "D109C"에 대한 언급은 원래의 잔기 아스파르트산(D)과 숫자(109)로 표기된 위치 및 그 후의 치환된 잔기 시스테인(C)을 의미한다.
본원에서 사용될 때 "서열 번호 1에 대한 ∼퍼센트(%)(예를 들어, 97%) 이상의 서열 동일성"이란 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 서열이 동일한 정도를 의미한다. 평가 윈도우, 예를 들어 관심있는 서열의 길이에 대한, 관심있는 서열과 제2의 서열 간의 퍼센트 동일성은, 서열들을 정렬하고, 평가 윈도우 내에서 동일한 잔기에 반하는 잔기(뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 확인하여 동일성을 최대화하기 위한 갭을 도입하고, 윈도우 내에 속하는 관심있는 서열 또는 제2 서열(둘 중 더 긴 것)을 총 잔기수로 나누고, 100을 곱함으로써 산정할 수 있다. 특정 퍼센트 동일성을 얻는 데 필요한 동일한 잔기의 수를 산정할 때, 분수는 가장 가까운 정수로 반올림해야 한다. 퍼센트 동일성은 다양한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 계산할 수 있다. 예를 들어, BLAST2, BLASTN, BLASTP, 갭트(Gapped) BLAST 등의 컴퓨터 프로그램은 관심있는 서열들을 정렬하여 그들 간의 퍼센트 동일성을 제공한다. 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. ScL USA 90:5873-5877, 1993]에서와 같이 변형된 Karlin 및 Altschul의 알고리즘(Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. ScL USA 87:22264-2268, 1990)이 Altschul 등의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)으로 도입된다. 비교 목적으로 갭트 정렬을 얻기 위해서는, Altschul 등의 문헌[Altschul, et al., Necleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 갭트 BLAST를 이용한다. BLAST 및 갭트 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터를 이용할 수 있다. PAM250 또는 BLOSUM62 행렬이 이용될 수 있다. BLAST 분석의 수행을 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 이들 프로그램에 대해, URL 월드 와이드 웹 주소가 "ncbi.nlm.nih.gov"인 웹 사이트를 참고할 수 있다. 특허청구범위의 특정 실시형태에서, 퍼센트 동일성은 NCBI가 제공하는 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST2를 이용하여 계산한다.
본 발명의 "IL-2 선택적 아고니스트"는 IL-2αβγ 선택적 아고니스트이다. 기능적으로 이는 IL-2Rβγ 수용체 복합체에 비해 IL-2αβγ 수용체 복합체를 선택적으로 활성화시킨다. 이것은 서열 번호 1의 야생형 IL-2에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것으로 구조적으로 정의되고 Treg 세포를 우선적으로 활성화시키는 능력에 의해 기능적으로 정의되며, 야생형 IL-2 단백질로부터 유도된다. 이 단백질은 또한, CD4+CD25-/low T 세포 또는 NK 세포에 대비한 Treg 세포에서의 인산화된 STAT5 단백질 수준에 의해, 또는 NK 세포에 대비한 파이토헤마글루티닌 자극 T 세포의 선택적 활성화에 의해 측정되는 바와 같이, Treg에서의 IL-2 수용체 신호전달을 선택적으로 활성화시킬 수 있는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다.
"Treg" 또는 "Treg 세포"는 조절 T 세포를 말한다. 조절 T 세포는 다른 면역 세포의 활성을 억제하는 T 세포의 한 부류이며, 세포 마커 표현형 CD4+CD25+FOXP3+에 의해 유세포 분석을 이용하여 정의된다. FOXP3은 세포내 단백질이고 염색을 위해서는 세포 고정 및 투과화를 필요로 하기 때문에, 살아있는 Treg를 규정하기 위해 세포 표면 표현형 CD4+CD25+CD127-이 이용될 수 있다. Treg는 또한 다양한 Treg 아류, 예컨대 tTreg(흉선 유래) 및 pTreg(말초혈 유래이고 말초의 나이브 T 세포로부터 분화됨)를 포함한다. 모든 Treg가 IL-2Rαβγ 수용체를 발현하고, 그 자신의 IL-2는 생산하지 않으며, 성장을 위해 IL-2에 의존적이고, 당업자는 두 부류가 모두 IL-2Rαβγ 선택적 아고니스트에 의해 선택적으로 활성화된다는 것을 알 것이다.
"PEG"는 에틸렌 글리콜의 수용성 폴리머인 폴리(에틸렌 글리콜) 분자이다. PEG 분자는 단백질에 화학적으로 공액되어 이의 순환 반감기를 증가시킬 수 있다. PEG는 다양한 크기로 얻어질 수 있고, 또한 단백질로의 공유 공액을 가능하게 하는 화학 반응성 기로 유도된 화학적 활성 형태로 구입할 수 있다. 활성 PEG는 NOF America(미국 뉴욕주 화이트 플레인스 소재) 및 Celares GmbH(독일 베를린 소재)와 같은 시판처에서 구할 수 있다. 선형 PEG는 다양한 분자량으로, 예를 들어 5,000 달톤, 10,000 달톤, 20,000 달톤, 30,000 달톤, 및 40,000 달톤의 중량 평균 분자량을 갖는 PEG 폴리머로 제조된다. 분지형 PEG 폴리머가 또한 개발되어 있다. 통상적으로 사용되는 활성화 PEG 폴리머는 (1차 아민, 예컨대 라이신 잔기 및 단백질 N-말단으로의 공액을 위한) N-히드록시숙신이미드 기, (N-말단으로의 공액을 위한) 알데히드 기, 및 (티올, 예컨대 시스테인 잔기로의 커플링을 위한) 말레인이미드 또는 요오도아세트아미드 기로 유도된 것들이다.
"IL-2-PEG 공액체"는 PEG가 공유적으로 공액된 IL-2 단백질이다. IL-2 모이어티는 야생형 IL-2, C125S 치환을 갖는 IL-2, IL-2Rαβγ 수용체에 대한 선택성을 야기하는 N88, D20 또는 Q126에서의 치환을 갖는 상기 단백질 중 어느 것, 또는 PEG 분자의 부위 특이적 공액을 가능하게 하는 추가 치환을 갖는 상기 단백질 중 어느 것일 수 있다.
"생물활성"은 세포 기반의 정량적 시험관내 어세이로 생물학적 활성을 측정하는 것을 말한다.
"Treg 세포의 기능적 활성화"는 Treg에서의 IL-2 매개 반응으로 정의된다. Treg 세포의 기능적 활성화를 위한 어세이 판독은 pSTAT5의 자극, Treg 세포 증식 및 Treg 이펙터 단백질 수준의 자극을 포함한다.
PEG 공액을 위한 IL-2 모이어티의 설계 및 구성
하기 사항들은 원하는 요구조건들을 가장 잘 충족시킬 수 있는 IL-2 모이어티의 설계에 대한 지표가 된다.
(1) 자유(쌍을 이루지 않은) 시스테인 잔기는 티올과 말레이미드- 및 요오도아세트이미드-활성 PEG 시약과의 매우 특이적인 반응성으로 인해 IL-2 내로 엔지니어링된다.
(2) 모든 구성체는 야생형 인간 IL-2의 백그라운드에 IL-2에서 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기만을 제거하기 위한 치환 C125S 및 IL-2RB에 대한 친화성을 감소시켜 IL-2Rabg에 대해 선택적인 치환 N88R으로 이루어진다. C125는 IL-2RG과의 주요 접촉점인 Q126에 바로 인접한다.
(3) 단일 부가적 시스테인 치환은 IL-2의 표면 노출된 부위에 생성되어 수용성 PEG과의 효율적인 공액을 가능하게 한다.
(4) PEG 공액 부위는 또한 IL-2-IL-2Rαβγ 수용체 복합체 내의 용매에 노출되도록 선택되며(Wang, X., et al., 2005 Science. 310:1159-63), 따라서 IL-2Rαβγ의 결합 및 활성화를 저해시킬 가능성이 낮다.
(5) 변이체 단백질은 우수하게 발현되고 올바르게 폴딩되어야 한다. 신규한 자유 시스테인의 존재는 부적절한 분자내 이황화결합 형성 및 미스폴딩을 일으키거나, 또는 다른 분자와 분자간 이황화교를 형성하여 응집을 야기할 수 있다.
일반적 방법
일반적으로, 본 발명의 변이체 IL-2 단백질의 제조는, 본원에 개시된 절차에 의해, 그리고, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 증폭 반응(PCR), 플라스미드 DNA의 준비, 제한 효소를 이용한 DNA의 절단, 올리고뉴클레오티드의 제조, DNA의 결찰, mRNA의 단리, 적절한 세포로의 DNA의 도입, 숙주의 형질전환 또는 형질감염, 숙주의 배양을 포함하는, 알려진 재조합 DNA 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 융합 분자는 카오트로픽제와 잘 알려진 전기영동법, 원심분리법 및 크로마토그래피법을 이용하여 단리하고 정제할 수 있다. 이러한 방법에 관한 개시에 대해서는, 일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed. (1989)]; 및 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)]을 참조할 수 있다.
본 발명의 변이체 단백질을 코딩하는 유전자는, 원하는 융합체를 코딩하는 DNA를 생성하는 데 이용되는 기본 단계로서 제한 효소 분해 및 결찰을 이용한다. DNA 단편의 말단은 결찰 전에 변형을 요할 수 있고, 변형은 돌출부를 채우거나, 단편(들)의 말단부를 뉴클레아제(예를 들어, ExoIII)로 결실시키거나, 부위 특이적 돌연변이를 유발하거나, PCR로 새로운 염기쌍을 부가함으로써 행할 수 있다. 선택된 단편들의 연결을 용이하게 하기 위해 폴리링커 및 어댑터가 이용될 수 있다. 발현 구성체는 일반적으로 제한, 결찰, 및 이. 콜라이(E. coli)의 형질전환의 라운드를 이용하여 단계적으로 어셈블링한다. 발현 구성체를 구성하는 데 적합한 다수의 클로닝 벡터가 당업계에 공지되어 있고(lamda.ZAP, Agilent; pET, EMD Millipore), 구체적인 선택은 본 발명에 있어서 중요하지 않다. 클로닝 벡터의 선택은 숙주 세포로 발현 구성체를 도입하기 위해 선택되는 유전자 전달 시스템에 의해 영향을 받을 수 있다. 각 단계 종료 시, 생성된 구성체를 제한, DNA 서열, 하이브리드화 및 PCR 분석으로 분석할 수 있다.
부위 특이적 돌연변이 유발은 통상적으로, 당업계에 공지된 방법으로 본 발명의 IL-2 변이체 단백질을 코딩하는 유전자로 특이적 돌연변이를 도입하는 데 이용된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171154호; 문헌[Storici et al., 2001, Nature Biotechnology 19:773-776]; 문헌[Kren et al., 1998, Nat. Med. 4:285-290]; 및 문헌[Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43:15-16]를 참조할 수 있다. 임의의 부위 특이적 돌연변이 유발 절차가 본 발명에 이용될 수 있다. 본 발명의 변이체를 제조하는 데 이용될 수 있는, 입수 가능한 상업용 키트가 다수 존재한다.
다양한 프로모터(전사 개시 조절 영역)가 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 적절한 프로모터의 선택은 제안된 발현 숙주에 따라 달라진다. 이종 공급원으로부터의 프로모터는 선택된 숙주에서 기능을 나타내는 한 이용될 수 있다.
IL-2 단백질은 신호 서열 없이 이. 콜라이에서 발현될 수 있고, 단백질은 봉입체로부터 회수되어 활성 형태로 재폴딩된다. 이러한 발현 시스템은 미국 특허 제7,105,653 B2호에 기술되어 있다.
본원에 기재된 단백질의 발현을 촉진하기 위해 다양한 신호 서열이 이용될 수 있다. 신호 서열은 효율적인 분비를 위해 선택되거나 설계되며, 발현 숙주에서의 프로세싱도 이용될 수 있다. 고유한 인간 IL-2 신호 서열인, TCR 코딩 서열에 상동성인 신호 서열 또는 마우스 IL-2 코딩 서열에 상동성인 신호 서열이 포유동물 세포에 이용될 수 있다. 다른 적절한 신호 서열/숙주 세포 쌍으로는 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)에서의 분비를 위한 바실러스 서브틸리스 sacB 신호 서열 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) α-접합 인자 또는 피키아 파스토리스(P. pastoris) 분비를 위한 피키아 파스토리스 산 phoI 포스파타제 신호 서열을 들 수 있다. 신호 서열은 신호 펩티다제 절단 부위를 코딩하는 서열을 통해 단백질 코딩 서열에 직접, 또는 짧은 뉴클레오티드 브릿지를 통해 연결될 수 있다.
진핵생물 단백질 발현 시스템에 대해 전사 및 번역을 증강시키기 위한 요소들이 동정되었다. 예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus; CaMV) 프로모터 1,000 bp를 이종성 프로모터의 어느 한 측에 위치시키면, 식물 세포에서 전사 수준이 10∼400배 증가할 수 있다. 발현 구성체는 또한 적절한 번역 개시 서열을 포함해야 한다. 적절한 번역 개시를 위해 코작(Kozak) 컨센서스 서열을 포함하도록 발현 구성체를 변형시키는 것은 번역 수준을 10배 증가시킬 수 있다.
발현 카세트는 이용되는 숙주와 양립할 수 있는 적절한 벡터에 연결한다. 벡터는 발현시키고자 하는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 받아들일 수 있어야 한다. 적절한 숙주 세포로는 진핵생물 및 원핵생물 세포, 바람직하게는 쉽게 형질전환되어 배양 배지에서 빠른 성장을 나타낼 수 있는 세포를 포함한다. 구체적으로, 바람직한 숙주 세포로는 원핵생물, 예컨대 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스 등과, 진핵생물, 예컨대 동물 세포 및 효모 균주, 예를 들어 에스. 세레비지에를 들 수 있다. 포유동물 세포, 특히 HEK, J558, NSO, SP2-O 또는 CHO가 일반적으로 바람직하다. 다른 적절한 숙주로는, 예를 들어, Sf9와 같은 곤충 세포를 들 수 있다. 종래의 배양 조건이 이용된다. 이와 관련하여 상기 Sambrook의 문헌을 참조할 수 있다. 그 후, 안정한 형질전환 또는 형질감염 세포주를 선택할 수 있다. 시험관 내 전사-번역 시스템도 발현 시스템으로서 이용될 수 있다.
원하는 IL-2 변이체 단백질을 코딩하는 핵산은 세포의 형질감염을 위한 표준 기법으로 숙주 세포로 도입할 수 있다. 용어 "형질감염시키는" 또는 "형질감염"은, 인산칼슘 공침전, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션, 일렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 바이러스 형질도입 및/또는 인테그레이션을 비롯한, 핵산을 숙주 세포로 도입하기 위한 통상적인 모든 기법을 포함하는 것으로 의도된다. 숙주 세포의 적절한 형질감염법은 상기 Sambrook 등의 문헌과 다른 실험실 교본에서 찾아볼 수 있다.
대안으로, 본원에 기재된 단백질 구성의 전부 또는 일부를 위해 합성 유전자 구성을 이용할 수 있다. 이것은, 관심있는 폴리펩티드 분자를 코딩하도록 설계된 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관내 합성을 수반한다. 유전자 합성은 Tian 등의 문헌[Tian, et al., Nature 432:1050-1054]에 기재된 멀티플렉스 마이크로칩 기반의 기법 및 올리고뉴클레오티드를 합성하여 광 프로그래밍 가능한 마이크로유체 칩 상에 어셈블링하는 유사한 기법 등의 다수의 기법을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 IL-2 변이체 단백질은 회수된 숙주 세포로부터 단리하거나 배양 배지로부터 단리한다. 배지로부터 또는 회수된 세포로부터 관심있는 단백질을 단리하기 위해 표준 단백질 정제 기법이 이용된다. 특히, 롤러 병, 스피너 플라스크, 조직 배양 플레이트, 바이오리액터, 또는 퍼멘터를 비롯한 다양한 방법으로부터 대규모로(즉, 밀리그램 이상의 양으로) 원하는 IL-2 변이체 단백질을 발현시키고 정제하기 위해 정제 기법을 이용할 수 있다.
비천연 아미노산의 재조합 단백질로의 도입을 가능하게 하는 단백질 발현 시스템이 개발되어왔다(Kim, C. H., et al. Curr Opin Chem Biol. 2013 S1367-5931 (13)00071-9). 이러한 발현 시스템은 단백질의 부위 특이적 PEG화가 그 위치에서 가능하게 하는 화학 반응성을 갖는 비천연 아미노산을 도입할 수 있다. 자유 시스테인 잔기 이용의 대안으로서, 당업자는 본원에서 동정된 IL-2 아미노산 위치가 또한 순환 반감기를 증가시킬 목적을 위해 IL-2에 PEG 또는 다른 비면역원성 폴리머를 부착하는 유사한 목표를 수행하도록 시스테인 대신 비천연 아미노산으로 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
당업자는 또한, 본 발명의 IL-2 선택적 아고니스트 모이어티가 다른 비면역원성 폴리머와 또한 공액될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 두 폴리머는 재조합 비면역원성 아미노산 폴리머, 예컨대 XTEN 폴리머, A, E, G, P, S, 및 T 아미노산의 사슬(Schellenberger, V., et. al., 2009, Nat Biotechnol. 27:1186-90)), 및 PAS 폴리머, P, A, 및 S 아미노산 잔기의 사슬(Schlapschy, M., et. al., 2007, Protein Eng Des Sel. 20:273-84)이다.
IL-2 선택적 아고니스트 모이어티
치환 N88R을 갖는 IL-2는 IL-2Rαβγ 수용체에 대한 IL-2 선택적 아고니스트의 예시적인 사례이다(Shanafelt, A. B., et al., 2000, Nat Biotechnol. 18: 1197-202). IL-2/N88R은, IL-2RB 수용체 서브유닛 및 IL-2Rβγ 수용체 복합체에 대한 결합에 결함이 있지만, IL-2Rαβγ 수용체 복합체에 결합하여 IL-2Rαβγ 발현 PHA 활성화 T 세포의 증식을 wt IL-2만큼 효과적으로 자극할 수 있는 한편, IL-2Rβγ 발현 NK 세포의 증식을 자극할 수 있는 능력은 3,000배 감소되어 있다. 유사한 활성 프로파일을 갖는 다른 IL-2Rαβγ 선택적 아고니스트는 치환 N88I, N88G 및 D20H를 갖는 IL-2를 포함하며, 치환 Q126L 및 Q126F(IL-2RG 서브유닛과의 접촉 잔기)를 갖는 다른 IL-2 변이체 또한 IL-2Rαβγ 선택적 아고니스트 활성을 보유한다(Cassell, D. J., et al., 2002, Curr Pharm Des., 8:2171-83). 당업자라면, Fc 융합 단백질이 유사한 활성을 가질 것이라고 예측하면서, 이들 IL-2 선택적 아고니스트 분자 중 어느 것으로도 IL-2/N88R 모이어티를 치환할 수 있음을 알 것이다. 상기에 언급한 모든 돌연변이가, wt IL-2의 백그라운드, 또는 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기를 제거함으로써 IL-2 안정성을 촉진하는 치환인 치환 C125S를 갖는 wt IL-2에 이루어질 수 있다. 본 발명은 또한 IL-2 수용체의 활성화 작용을 유의적으로 손상시키지 않으면서 생산성 또는 안정성을 개선하는 다른 돌연변이 또는 절두(truncation)와 함께 이용될 수 있다.
본 발명의 변이체는 경우에 따라, 아미노산 서열과 핵산 서열 둘 다에 적용되는 보존적 치환 변이체를 포함한다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적 변형 변이체란, 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 실질적으로 동일한 서열을 의미한다. 구체적으로, 퇴화 코돈 치환은, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 얻을 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). 유전자 코드의 퇴화로 인해, 기능적으로 동일한 수많은 핵산이 임의의 특정 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 특정되는 모든 위치에서, 그 코돈은, 코딩된 폴리펩티드를 변경하지 않으면서, 기재된 해당 코돈 중 어느 것으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이는 보존적 변형 변이의 한 종류인 침묵 변이이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 그 핵산의 가능한 모든 침묵 변이를 기재한다. 당업자라면, 핵산 내의 각각의 코돈(일반적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG와 일반적으로 트립토판의 유일한 코돈인 TGG는 제외함)을 기능적으로 동일한 분자가 생성되도록 변형시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 명시된 서열 내에 내포되어 있다.
아미노산 서열의 보존적 치환과 관련하여, 당업자는, 코딩된 서열 내의 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경하거나 부가하거나 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가가 보존적으로 변형된 변이체이고, 상기 변경은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시킨다는 것을 알 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환의 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자에 부가된 것으로, 이들을 배제하지는 않는다.
하기 그룹은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌(A), 글리신(G);
2) 세린(S), 트레오닌(T);
3) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);
4) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);
5) 시스테인(C), 메티오닌(M);
6) 아르기닌(R), 리신(K), 히스티딘(H);
7) 이소루신(I), 루신(L), 발린(V); 및
8) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W).
IL-2에서 용인될 수 있는 보존적 치환의 예는 Y, 31F, T51S, Q57N, E100D, 및 T111S를 포함한다.
바이오어세이 (bioassay)
후보 단백질의 생물학적 활성을 특성화하기 위한 견실한 정량적 바이오어세이가 필요하다. 이러한 어세이는 IL-2 수용체의 활성화를 측정하고, Treg에 있어서의 활성화의 다운스트림 기능적 결과를 측정하고, 활성화된 Treg의 치료와 관련된 성과 및 기능을 측정해야 한다. 이러한 어세이는 IL-2 PEG 공액 분자의 치료 활성과 효능을 측정하는 데 이용될 수 있고, 또한 동물 또는 인간에서의 IL-2 PEG 공액체의 약력학적 특성을 측정하는 데 이용될 수 있다. 한 어세이는, 인산화된 단백질(pSTAT5)에 특이적인 항체를 사용한 유세포 분석에 의해 측정되는, 신호 전달 단백질 STAT5의 인산화를 측정한다. STAT5의 인산화는 IL-2 신호 전달 경로에서 필수적 단계이다. STAT5는 Treg 발달에 있어서 중요하고, CD4+CD25+ 세포에서 발현된 STAT5의 항상적 활성화 형태가 IL-2 부재 하에서의 Treg 세포의 생성에 충분하다(Mahmud, S. A., et al., 2013, JAKSTAT 2:e23154). 따라서, 일부 당업자들은, Treg 세포에서의 인산화된 STAT5(pSTAT5)의 측정이 이들 세포에서의 IL-2 활성화를 반영하는 것이며, 적절한 노출 시간 및 조건이 주어진다면, IL-2 처리의 다른 생물학적 결과를 예측하는 것이 됨을 알 것이다. 기능적 활성화에 대한 또 다른 어세이는 IL-2에 의해 자극된 Treg 세포의 증식을 측정한다. 일부 당업자들은 Treg 증식이, 정제된 Treg 세포로의 3중 수소화 티미딘 도입에 의해, CD4+CD25+FOXP3+ 또는 CD4+CD25+CD127- 마커 표현형의 빈도 및 유세포 분석에 의해 측정되는 혼합 세포 집단 내의 Treg 세포수의 증가에 의해, Treg 세포에서의 증식 관련 세포 주기 단백질, 예컨대 Ki-67의 발현 증가에 의해, 또는 Treg 세포에서의 유세포 분석에 의한, 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르(CFSE)와 같은 바이탈 형광 염료의 세포 분열 관련 희석의 측정에 의해 측정할 수 있다는 것을 알 것이다. IL-2에 의한 Treg의 기능적 활성화에 대한 또 다른 어세이는 Treg의 안정성 증가이다. pTreg 세포는 약간 불안정하여, Th1 및 Th17 이펙터 T 세포로 분화할 수 있는 잠재성을 갖는다고 여겨지고 있다. Treg의 IL-2 활성화는 Treg를 안정화시켜 이러한 분화를 방지할 수 있다(Chen, Q., et al., 2011, J Immunol. 186:6329-37). Treg의 IL-2 자극의 또 다른 결과는 Treg의 면역억제 활성에 기여하는 Treg 기능성 이펙터 분자, 예컨대 CTLA4, GITR, LAG3, TIGIT, IL-10, CD39 및 CD73의 수준의 자극이다.
제제
본 발명의 융합 단백질의 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 비경구(특히, 정맥내 또는 피하) 전달용으로 제제화되는 것으로 정의된다. 일반적으로, 약학 제제는 약학적으로 허용되는 비이클, 예컨대 식염수, 완충 식염수, 5% 덱스트로스 수용액 등과 함께 본 발명의 융합 단백질을 포함한다. 제제는 1종 이상의 부형제, 방부제, 가용화제, 완충제, 바이알 표면에서의 단백질 손실을 막기 위한 알부민 등을 추가로 포함할 수 있다. 제제화 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 19th ed., 1995]에 개시되어 있다.
예시로서, 약학 제제는 본 발명의 융합 단백질을 함유하는 용기를 포함하는 키트로서 제공될 수 있다. 치료 단백질은 단회 또는 다회 투여를 위한 주사액의 형태로, 주사 전에 재구성되는 멸균 분말로서, 또는 프리필드 시린지로서 제공될 수 있다. 그러한 키트는 적응증에 대한 서면 정보 및 약학 조성물의 용법을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 그러한 정보는 본 발명의 융합 단백질이 본 발명의 융합 단백질에 대한 알려진 과민성을 갖는 환자에게 금기되어야 한다는 설명을 포함할 수 있다.
본 발명의 IL-2-PEG 공액체는 약학 조성물을 비롯한 조성물에 도입될 수 있다. 그러한 조성물은 일반적으로 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는, 약학적 투여에 적합한, 식염수, 용매, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 보충 활성 화합물(예를 들어, 항생제)도 조성물에 도입될 수 있다.
약학 조성물은 의도된 투여 경로에 적합하도록 제제화된다. 본 발명의 IL-2-PEG 공액체는 비경구 경로를 통해 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로의 예로는, 예를 들어, 정맥내 투여, 피내 투여 및 피하 투여를 포함한다. 비경구 적용을 위한 용액 또는 현탁액은 하기 성분들: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수액, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 황산수소나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 버퍼, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스를 포함할 수 있다. pH는 산 또는 염기, 예컨대 일염기 및/또는 이염기 인산나트륨, 염산 또는 수산화나트륨을 사용하여 (예를 들어, pH 약 7.2∼7.8, 예를 들어 7.5로) 조절할 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 1회용 시린지, 또는 유리 또는 플라스틱제의 다회 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
주사에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액 또는 수분산액과 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위하 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여에 있어서, 적절한 담체는 생리 식염수, 정균수 또는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에 있어서, 조성물은 멸균되어야 하고 주사가 용이한 정도로 유동성이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고 박테리아 및 진균 등의 미생물의 오염 작용을 막도록 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 분산물의 경우 요구되는 입자 크기의 유지는 계면활성제, 예를 들어, 폴리솔베이트 또는 트윈(Tween)을 사용하여 용이하게 할 수 있다. 미생물 작용은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등으로 방지할 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들어, 설탕, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 솔비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다.
멸균 주사액은 적절한 용매 중에 필요량의 활성 화합물을, 상기에 열거한 성분들 중 1종 또는 이의 조합과 함께 도입하고, 그 후 필요에 따라, 여과 멸균을 행하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산매와 상기에 열거한 것 중 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비이클로 활성 화합물을 도입함으로써 제조한다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균 여과한 이의 용액으로부터의 임의의 추가적인 소정의 성분과 함께 활성 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
일 실시형태에서, IL-2-PEG 공액체는, 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출형 제제와 같이, IL-2-PEG 공액체가 체내로부터 빨리 제거되는 것을 막는 담체를 사용하여 제조된다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산 등의 생분해성의 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제제는 표준 기법을 이용하여 제조할 수 있다.
약학 조성물은 투여에 관한 설명서와 함께 용기, 팩, 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
투여
본 발명의 IL-2-PEG 공액체는 비경구 경로에 의해 투여되는 것이 바람직하다. 피하 경로가 바람직한 경로이지만, 정맥내, 근육내, 진피하 투여도 이용될 수 있다. 피하 또는 근육내 투여를 위해서는, 데포 또는 데포 제제가 이용될 수 있다. 특정 질환에 대해 전문화된 투여 경로가 이용될 수 있다. 예를 들어, 염증성 안질환의 경우, 안내 투여가 이용될 수 있다. 융합 단백질은 총 부피의 약 0.1∼10 mcg/ml의 농도로 사용될 수 있지만, 0.01 mcg/ml∼100 mcg/ml 범위의 농도도 이용되어도 좋다.
투여량 결정은 당업계의 통상적인 기술 수준 내이다. 투여는 치료 기간 동안 매일 또는 매주 행하거나 또 다른 간헐적 빈도로 행할 수 있다. 정맥내 투여는 1시간 내지 몇 시간의 통상적인 시간에 걸쳐 볼루스 주사 또는 주입에 의해 이루어진다. 서방출형 제제도 이용될 수 있다. 일반적으로, 치료 유효량의 본 발명의 IL-2-PEG 공액체는 치료되는 상태에 있어서의 임상적으로 유의한 변화, 예컨대 순환 Treg 세포에 있어서의 임상적으로 유의한 변화, 질병 조직 내에 존재하는 Treg 세포에 있어서의 임상적으로 유의한 변화, 또는 질병 증상에 있어서의 임상적으로 유의한 변화를 유발하는 데 충분한 양이다.
세포 배양 어세이 및 동물 연구로부터 얻은 데이터가 인체 사용을 위한 투여량 범위를 정하는 데 이용될 수 있다. 그러한 화합물의 투여량은, 독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않으면서, 최대 유효 농도의 절반(EC50; 즉, Treg 세포의 최대 자극의 절반을 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 일련의 순환 농도 내에 속하는 것이 바람직하다. 투여량은, 상기 범위 내에서, 이용되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에 이용되는 임의의 화합물에 대해, 치료 유효량을 세포 배양 어세이로부터 초기에 추정할 수 있다. 투여량은, 동물 모델에서, 세포 배양으로 측정된 EC50을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 정할 수 있다. 그러한 정보는 인체에 유용한 투여량을 정확히 결정하는 데 이용될 수 있다. 혈장 수치는, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 어세이로 측정할 수 있다.
본원에서 정의된 바와 같이, 치료 유효량의 IL-2-PEG 공액체(즉, 유효 투여량)은 선택된 폴리펩티드 및 투여 빈도에 따라 달라진다. 예를 들어, 환자 체중 1 kg당 약 0.001∼0.1 mg 범위의 단회 투여량이 투여될 수 있으며, 몇몇 실시형태에서는, 약 0.005, 0.01, 0.05 mg/kg이 투여될 수 있다. 조성물은 매일 1회에서부터 매주 1회 이상, 또는 매달 1회 이상 투여될 수 있으며, 격일에 한번도 투여하는 것도 포함된다. 당업자라면 질병 또는 질환의 중증도, 이전 치료, 대상체의 전반적인 건강 및/또는 나이, 환자에게 존재하는 Treg 세포의 수준 및 존재하는 다른 질병을 포함하나 이들에 한정되지 않는 특정한 요인들이 대상체를 효과적으로 치료하는 데 필요한 투여량과 타이밍에 영향을 줄 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 치료 유효량의 본 발명의 IL-2 선택적 아고니스트 PEG 공액체를 사용한 대상체의 치료는 일련의 치료가 될 가능성이 있다.
자가면역 질환
본 발명의 치료법으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환들 중 일부를 언급하였다. 그러나, 자가면역 질환에 있어서의 Treg 세포의 역할은 매우 활발한 연구 분야라서, 본 발명으로 치료할 수 있는 추가적인 질환들이 밝혀질 가능성이 있다. 자가면역 질환은, 면역계가 그 자신의 단백질, 세포 및 조직을 공격하는 인간의 질환으로서 정의된다. 자가면역 질환에 대한 종합적인 리스트와 리뷰는 문헌[The Autoimmune Diseases (Rose and Mackay, 2014, Academic Press)]에서 찾아볼 수 있다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은, 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타낸 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
전술한 발명은 명확한 이해를 위해 실례와 예시로써 어느 정도 상세히 설명되었지만, 당업자라면 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 청구범위의 사상 또는 범위로부터 벗어남이 없이 본 발명에 특정한 변경 및 변형이 이루어질 수 있음을 쉽게 알 것이다.
[ 실시예 ]
하기 실시예는 설명을 위해서만 제공된 것이며 제한을 위한 것으로 제공된 것이 아니다. 당업자는 본질적으로 유사한 결과를 보이기 위해 변경 및 변형될 수 있는 여러가지 중요하지 않은 파라미터를 쉽게 이해할 것이다.
1. IL-2 중 후보 PEG 부착 부위의 예측
PEG를 IL-2에 공액화하기 위한 후보 부위를 선택하기 위해, 용매에 노출되고 IL-2Rαβγ로의 IL-2 결합과 직접적으로 또는 입체적으로 간섭하는 것으로 나타나지 않는 아미노산 잔기를 동정하였다. 이 전략은 도 2에 도식적으로 나타나 있다. IL-2Rαβγ 수용체의 세포외 도메인과의 복합체인 IL-2의 공개된 결정 구조의 검토(Wang, X., et al., 2005, Science 310:1159-63, Stauber, D. J., et al., 2006, Proc Natl Acad Sci 103:2788-93)는 하기 잔기들을 동정하였다: S6, K8, K48, K49, T51, E52, K54, K97, G98, F103, M104, E106, D109, 및 T133(도 3). 결정 구조에서 보이지 않지만 준거를 충족시킬 가능성이 있는 이웃 잔기에 대한 정보에 기초한 추가 아미노산 잔기는, A1, P2, T3, S4, S5, S99, E100, T101, 및 T102이다. 이 후보 목록에 기초하여, 기재된 위치에 시스테인 치환을 갖는 12가지의 변이체(T3C, S6C, K8C, K48C, K49C, T51C, K97C, G98C, F103C, M104C, E106C, 및 D109C)를 구성 및 제조하였다(표 1)
2. 이. 콜라이에서의 IL-2 선택적 아고니스트 변이체 단백질의 클로닝 , 발현 및 정제
치환 N88R 및 C126S을 갖는 인간 IL-2(서열 번호 1)의 백그라운드에 생성된 표 1에 열거된 치환 각각을 갖는 단백질을 코딩하는 cDNA를, DNA 합성(Genescript, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)으로 제조하고, 5' 및 3' 말단에 각각 제한 부위 NCOI 및 BAM HI를 도입하고, pUC57 내로 클로닝하였다. 이후 cDNA 삽입물을 Nco1 및 BAM H1 부위를 이용하여 pET3d 벡터(EMD Millipore, 미국 메사추세츠주 빌레리카) 내로 클로닝하였다. 구성체를 BL21(DE3) 세포 내로 형질전환시키고 암피실린 내성에 대해 선택하였다. 형질전환된 세포를 0.6 내지 1.0의 ABS280로 0.5 L 배양물 중 37℃에서 50 ug/ml 암피실린 및 1% 글루코스를 함유하는 LB 배지에서 성장시켰다. 이후 IPTG를 0.5 mM로 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 유도 후 3시간째에 배양물을 회수하였다.
세포를 10,000xg에서 10분 동안 원심분리로 펠릿화시켰다. 제조업체 설명서에 따라 버그버스터(Bugbuster(EMD Millipore, 미국 메사추세츠주 빌레리카))를 이용하여 세포 펠릿으로부터 봉입체(IB)를 추출 및 정제하고, 샘플을 취하여 SDS-PAGE로 분석하였다. IB를 2시간 동안 실온에서 0.1%(vol/vol) 2-머캅토에탄올를 포함하는 0.1 M Tris/HCL(pH 8.0) 중 8 M 구아니딘 염산으로 용해 및 변성시켰다. 이후 단백질을 실온에서 12시간 동안 20 부피의 10 mM Tris/HCL(pH 8.0)/1 mM EDTA에 대해 투석시켜 재폴딩시켰다. 이후 트리플루오로아세트산(TFA)을 샘플에 0.1%로 첨가하고, 원심분리로 침전물을 제거하여 샘플을 정화하고, 0.2 uM 필터로 여과한 후, 역상 크로마토그래피로 정제하였다. IL-2 변이체를 1 ml/분의 유속으로 0.1% TFA 중 Vydac 208TP54 C-8 컬럼 상에 로딩한 후 0.1% TFA 중 0-75% 아세토니트릴의 45분 구배로 용리시켰다. 분획을 SDS-PAGE로 스크리닝하였고, IL-2 변이체 단백질은 통상적으로 약 60% 아세토니트릴에서 용리되었다.
본 제조 연구의 결과는 하기 표 1에 요약되어 있다. 제조에 대해 선택된 12가지 변이체 중에서 7가지만이 역상 크로마토그래피 후 검출 가능한 IL-2 단백질 피크를 산출하였다. 7가지 단백질 중에 5가지는 매우 적은 산출량을 나타내었고 수행된 규모에서 추가 연구를 위해 불충분한 양을 제조하였다. 남은 2가지 단백질 중에서, 가장 높은 수준으로 제조된 D109C 변이체는 PEG화되어 시험되었다. 이 결과는, 쌍을 이루지 않은 단일 시스테인 잔기를 갖는 이러한 변이체 단백질을 제조하는 능력이 매우 다양하며, 많은 수가 쉽게 제조될 수 없음을 나타내었다. 이는 다양한 요인들, 예컨대 이. 콜라이 숙주에 대한 재조합 단백질의 독성, 봉입체 형성의 불능, 또는 재폴딩의 저효율성으로 인한 것일 수 있다. 제조 공정의 변형, 또는 분비 단백질로서 다른 발현 시스템, 예컨대 포유동물 세포에서 단백질을 발현하는 것은 다른 변이체들 중 일부의 생산성을 개선할 수 있다. 그러나, 이 발현 시스템에서 D109C 변이체는 제조 수준으로부터 확실히 월등한 것으로 나타났다.
이. 콜라이에서의 IL-2 변이체 단백질 제조의 요약
IL-2 선택적 아고니스트 변이체 피크 높이, mAU (280 nM)
- 1
T3C nd
S6C nd
K8C nd
K48C 1
K49C 11
T51C nd
K97C 1
G98C 1
F103C nd
M104C 2
E106C nd
D109C 26
피크 높이는 역상 크로마토그래피 상의 변이체 단백질의 상대적 최종 산출을 나타낸다.
nd= 피크 검출되지 않음
3. IL-2/ N88R / C125S / D109C 의 PEG화
정제된 IL-2/N88R/C125S/D109C를 20 kDa PEG에 공액시켜 공액체의 생물활성을 시험하였다. IL-2/N88R/C125S/D109C를 0.1 M MES(pH 6.0) 내로 투석시키고, 0.655의 흡광 계수를 이용한 OD280(0.1%에서 Abs 280 nM)로 단백질 농도를 측정한 후, 50배 몰 과량의 말레인이미드-PEG(20,000 g/M; NOF America, 미국 뉴욕주 화이트 플레인스)와 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응은 말레이미드-PEG에 대해 2배 몰 과량으로 L-시스테인을 첨가하여 정지시켰다. SDS-PAGE에 의한 10 ug의 반응 혼합물의 분석은 잔여 미반응 IL-2 단백질이 검출되지 않음을 나타내었다.
4. T 세포에 대한 PEG화 IL-2/ N88R / C125S / D109C 의 활성
T 세포에 대한 PEG화 IL-2/N88R/C125S/D109C의 활성을, CD4+ T 세포 아집단에서 포스포-STAT5(pSTAT5) 수준의 자극을 측정함으로써 확인하였다. IL-2RB 및 IL-2RG의 이종이합체로의 IL-2의 결합을 통한 IL-2 수용체의 활성화는, JAK1 및 JAK3 단백질의 IL-2RB 및 IL-2RG 세포질 도메인과의 상호작용을 각각 증진시키고, STAT5 단백질의 인산화(pSTAT5)를 자극하여 이후 핵으로 IL-2 신호를 전달한다. STAT5는 Treg 세포의 발생에 필요하며 CD4+ T 세포에서 STAT5의 인공 활성화는 IL-2의 부재 하에서 Treg 세포의 제조에 충분하다(Mahmud, S. A., et al., 2013, JAKSTAT 2:e23154). pSTAT5의 수준은, 인산화된 STAT5 펩티드에 대한 항체를 사용하여, 투과화된 세포에서 형광 활성 세포 분류(FACS)로 측정하였다. Treg 세포는 CD25를 항상적으로 발현하며, CD25 발현 수준이 상위 1%인 세포들은 Treg 세포에 매우 집중되어 있다(Jailwala, P., et al., 2009, PLoS One. 2009; 4:e6527; Long, S. A., et al., 2010, Diabetes 59:407-15). 따라서, FACS 데이터를CD25high(CD25 발현 세포의 상위 1-2%) 및 CD25low /- 그룹으로 게이팅하였다.
냉동보존된 인간 PBMC(Astarte Biologics, 미국 워싱턴주 시애틀)를 해동시키고, 1% 인간 AB 혈청(Mediatech, 미국 버지니아주 매너사스)을 함유하는 X-VIVO 15(Lonza, 미국 뉴저지 앨런데일) 배지로 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 회복시켰다. 그 후, 세포를 5 x 106개 세포/ml의 농도로, 15 x 75 mm 튜브에 0.1 ml씩 분배하였다. 세포를 4 nM IL-2, 40 nM PEG-IL-2/N88R/D109C 또는 IL-2/N88R/D109C, 또는 L-시스테인과 반응한 동등량의 말레이미도-PEG로 37℃에서 10분 동안 처리한 후, 사이토픽스 픽세이션 버퍼(Cytofix Fixation Buffer)로 37℃에서 10분 동안 고정시켰다. 고정된 세포를 펌 버퍼 III(Perm Buffer III(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)로 얼음 위에서 30분 동안 투과화시키고 세척한 후, 항-CD4-퍼시픽 블루(Pacific Blue)(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산타 클라라), 항-CD25-AF488(eBioscience, 미국 캘리포니아주 샌 디에이고) 및 항-pSTAT5-AF547(BD Biosciences) 항체의 혼합물로 20℃에서 30분 동안 염색하고, 세척한 후, LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences) 상에서 FACS 로 분석하였다.
본 실험의 결과는 IL-2/N88R/C125S/D109C 및 IL-2/N88R/C125S/D109C-PEG 양쪽 모두가 IL-2에 비해 Treg 세포에 대해 집중되어 있는 CD4+CD25high 세포의 소 아집단을 선택적으로 활성화한다는 것을 나타낸다(도 2). IL-2는 4 nM IL-2에서 80%가 넘는 CD4+ T 세포를 활성화시켰으며, 더 높은 비율의 활성화된 세포가 CD25를 낮은 수준으로 발현하거나 발현하지 않았다. 이 결과는 PEG화 IL-2/N88R/C125S/D109C가 Treg를 활성화시키는 선택적인 능력을 유지한다는 것을 나타낸다.
5. 인간 PBMC 에서의 IL-2 선택적 아고니스트 -PEG 공액체 단백질의 선택성
보다 광범위한 생물학적 상황에서의 IL-2/N88R/C125S/D109C-PEG의 선택성을 확인하기 위해, 미정제 비분별 인간 PBMC 중의 주요한 모든 면역 세포 유형에 대하여 STAT5 활성화를 측정하기 위한 어세이를 개발하였다. 정상 상태의 지원자로부터 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 원심분리로 인간 PBMC를 단리하였다. 106개 PBMC를, 글루코스(Lonza) 및 10% FBS(Omega)를 함유하는 X-VIVO15 배지에 현탁시키고, 10-8 M의 테스트 단백질로 37℃에서 20분 동안 처리하였다. 그 후, 제조업체 설명서에 따라 세포를 Foxp3/트랜스크립션 팩터 스테이닝 버퍼 세트(Transcription Factor Staining Buffer Set)(EBIO)로 처리하였다. 계속해서, 실시예 3에 기재된 것과 같이 세포를 사이토픽스 버퍼로 고정시키고 펌 버퍼 III으로 투과화시켰다. 그 후, 고정 및 투과화된 세포를 1% FBS/PBS로 세척하고, 실온의 암소에서 60분 동안 항체 혼합물로 염색하였다. 그 후, 염색된 세포를 1% FBS/PBS로 세척하고, PBS에 재현탁시키고, 포테사(Fortessa) 유세포 분석기(BD Biosciences)로 분석하였다. 항체 혼합물은 항-CD4-PerCP-Cy5.5(BD, #560650), 항-pSTAT5-AF-488(BD, #612598), 항-CD25-PE(BD, #560989), 항-CD56-PE-CF594(BD, #562328), 항-FOXP3-AF647(BD, #560889), 항-CD3-V450(BD, 560366), 및 항-CD8-BV650(Biolegend, #301041)으로 이루어졌다. 이 염색 절차는 7종의 주요 면역 세포 유형에서 pSTAT5 수준의 모니터링을 가능하게 하였다.
세포 표현형은 다음과 같이 정의되었다: Treg 세포: CD3+, CD4+, Foxp3+, CD25high, CD8-, CD56-; 활성 CD4 Teff 세포: CD3+, CD4+, Foxp3-, CD25 high, CD8-, CD56-; CD4 Teff 세포: CD3+, CD4+, Foxp3-, CD25low, CD8-, CD56-; NKT 세포: CD3+, CD4-, Foxp3-, CD25low, CD8-, CD56+; NK 세포: CD3-, CD4-, Foxp3-, CD25low, CD8-, CD56+; B 세포: CD3-, CD4-, Foxp3-, CD25low, CD8-, CD56-.
이 어세이에서는 단백질을 10-8 M의 농도로 테스트하였다. 도 5에 도시된 결과는, IL-2/N88R/C125S/D109C 및 IL-2/N88R/C125S/D109C-PEG 둘 모두가, 모든 세포 집단의 큰 비율에서 pSTAT5를 활성화시킨 wt IL-2에 비해 현저한 선택성을 나타내었음을 보여 주었다. IL-2/N88R/C125S/D109C-PEG는 Treg 집단에서 wt IL-2의 수준에 실질적으로 동일하게 pSTAT5 신호를 자극하였다. 추가 분석(기재하지 않음)은, pSTAT5+ NK 세포가, 역시 면역조절 활성을 갖는 NK 세포 아집단인 NK-CD56bright 세포의 특징인 CD25high였음을 보여 주었다(Poli, A, et al., 2009 Immunology. 126(4):458-65). 이러한 결과들은, 복잡한 생물학적 환경에 있어서의, Treg에 대한 IL-2/N88R/C125S/D109C-PEG의 활성 및 높은 선택성을 입증한다.
서열 목록
Figure pct00001
SEQUENCE LISTING <110> Delinia, Inc. Greve, Jeffrey <120> MODIFIED IL-2 VARIANTS THAT SELECTIVELY ACTIVATE REGULATORY T CELLS FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES <130> 98210-950525 <140> WO PCT/US2015/044462 <141> 2015-08-10 <150> US 62/070,016 <151> 2014-08-11 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic variant IL-2 polynucleotide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is Thr or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is Ser or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is Lys or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa is Asp or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Tyr or Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa is Lys or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49) <223> Xaa is Lys or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51) <223> Xaa is Thr, Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (57)..(57) <223> Xaa is Gln or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> Xaa is Asn, Arg, Ile or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97) <223> Xaa is Lys or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98) <223> Xaa is Gly or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100) <223> Xaa is Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (103)..(103) <223> Xaa is Phe or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104) <223> Xaa is Met or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106) <223> Xaa is Glu and Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa is Asp or Cys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(111) <223> Xaa is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (125)..(125) <223> Xaa is Cys or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (126)..(126) <223> Xaa is Gln, Leu or Phe <400> 2 Ala Pro Xaa Ser Ser Xaa Thr Xaa Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Xaa Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Xaa Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Xaa 35 40 45 Xaa Ala Xaa Glu Leu Lys His Leu Xaa Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Xaa Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Xaa Xaa Ser Xaa Thr Thr Xaa Xaa Cys Xaa Tyr Ala Xaa Glu Xaa Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Xaa Xaa Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130

Claims (16)

  1. 서열 번호 1에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 가지고 치환 D109C를 포함하며 T 세포를 활성화시키는 능력을 갖는 IL-2 변이체 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 1에 대해 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 것인 IL-2 변이체 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 위치 109의 시스테인에 연결된 5 kDa 내지 40 kDa의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 갖는 것인 IL-2 변이체 단백질.
  4. 제1항에 있어서, IL-2 단백질은 N88R, N88I, N88G, D20H, Q126L 및 Q126F로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 중 하나 이상을 포함하는 것인 IL-2 변이체 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 치환 C125S를 더 포함하는 것인 IL-2 변이체 단백질.
  6. 제3항에 있어서, IL-2 단백질 서열은 치환 N88R 및 치환 C125S를 포함하는 것인 IL-2 변이체 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 1에 대해 98%의 서열 동일성을 갖는 것인 IL-2 변이체 단백질.
  8. 제4항의 PEG화 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  9. 서열 번호 1에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 가지고 D109C의 치환 및 T 세포를 활성화시키는 능력을 갖는 인간 IL-2 변이체 단백질의 순환 반감기를 증가시키는 방법으로서, 위치 109의 시스테인 잔기에 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 연결하는 것을 포함하며, 상기 폴리에틸렌 글리콜 모이어티는 상기 단백질의 순환 반감기를 폴리에틸렌 글리콜 모이어티가 없는 동일한 단백질에 비해 증가시키기에 충분한 길이를 갖는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 단백질은 서열 번호 1에 대해 98% 초과의 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 단백질은 위치 109의 시스테인에 연결된 5 kDa 내지 40 kDa의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 갖는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 단백질은 N88R, N88I, N88G, D20H, Q126L 및 Q126F로 이루어진 군으로부터 선택된 치환 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단백질은 치환 C125S를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 단백질은 치환 N88R 및 치환 C125S를 포함하는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 단백질은 서열 번호 1에 대해 98%의 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
  16. 제9항에 있어서, 상기 약학 조성물을 인간 조절 T 세포 농도를 자극하기에 충분한 치료 유효량으로 투여하는 것인 방법.
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