KR20230037612A

KR20230037612A - Il-2 변이체

Info

Publication number: KR20230037612A
Application number: KR1020237004667A
Authority: KR
Inventors: 권병세; 이승현; 임선우; 최진경; 손현태; 이중원; 이한나; 황선희
Original assignee: 주식회사 유틸렉스
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2023-03-16
Also published as: WO2022009123A4; EP4185605A1; JP2023534793A; WO2022009123A1; US20230242607A1; CN115768788A

Abstract

인터류킨(IL)-2 돌연변이 단백질이 제공된다. 본 개시내용은 또한 IL-2 돌연변이 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.

Description

IL-2 변이체

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 2020년 7월 9일에 출원된 미국 출원 제63/050,068호의 우선권을 주장한다. 선행 출원의 개시내용은 본 출원의 개시내용의 일부인 것으로 간주되며, 그 전체 내용이 본 출원에 포함된다.

암은 여전히 세계에서 주요 사망 원인 중 하나이다. 최근 통계에 따르면 세계 인구의 13%가 암으로 사망한다. 국제암연구소(IARC: International Agency for Research on Cancer)의 추산에 따르면, 2012년에 전 세계적으로 1410만 건의 새로운 암 사례와 820만 건의 암 사망이 발생하였다. 2030년까지, 인구 증가와 고령화 및 흡연, 건강에 해로운 식습관 및 신체 활동 부족과 같은 위험 요인에 대한 노출로 인해 세계적 부담은 2,170만 건의 새로운 암 사례와 1,300만 건의 암 사망으로 증가할 것으로 예상된다. 또한, 암 치료를 위한 고통과 의료비는 암 환자와 그 가족 모두의 삶의 질을 저하시키는 원인이 된다.

인터류킨-2(IL-2)는 면역 체계에 작용하여 세포-매개 면역 반응을 생성하는 사이토카인 신호 분자이다. IL-2는 T 세포의 성장 및 분화에 필수적인 역할을 하기 때문에, 암과 같은 질환을 치료하기 위한 면역요법적 접근의 후보가 되었다.

하기를 포함하는 인터류킨(IL)-2 단백질이 제공된다: 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 18. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 6을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 8을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 10을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 12를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 14를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 16을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 18을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기술된 인터류킨-2 단백질 중 임의의 하나는 면역글로불린 Fc 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 SEQ ID NO: 20을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 결합에 의해 인터류킨-2 단백질과 연결된다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 링커 서열에 의해 인터류킨-2 단백질과 연결된다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 면역글로불린 Fc 영역의 카복시-말단과 연결된다.

또한 본원에 기술된 단백질 중 임의의 하나 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다.

또한 하기를 포함하는 핵산이 본원에서 제공된다: IL-2 단백질을 코딩하는 서열로서, 상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 핵산 중 임의의 하나는 면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 19를 포함한다.

일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 3을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 5를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 7을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 9를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 11을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 13을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 15를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 17을 포함한다.

또한 본원에 기술된 핵산 중 임의의 하나를 포함하는 벡터가 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 벡터 중 임의의 하나는 작동적으로 핵산에 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 구성적(constitutive) 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성(inducible) 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.

또한 본원에 기술된 핵산 중 임의의 하나 또는 본원에 기술된 벡터 중 임의의 하나를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다.

또한 본원에 기술된 핵산 중 임의의 하나 또는 본원에 기술된 벡터 중 임의의 하나를 포함하는 세포가 본원에서 제공된다.

또한 본원에 기술된 세포 중 임의의 하나 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다.

또한 하기 단계를 포함하는, IL-2 단백질의 생산 방법이 본원에서 제공된다: (a) IL-2 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 본원에 기술된 세포 중 임의의 하나를 배양하는 단계; 및 (b) 세포 및/또는 배양 배지로부터 IL-2 단백질을 회수하는 단계.

또한 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기술된 약학 조성물 중 임의의 하나를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 암종(carcinoma), 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 백혈병, 평편 세포 암종(squamous cell carcinoma), 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 폐 선암종, 폐의 평편 세포 암종, 복막암, 간세포 암종, 위암, 췌장암, 신경교종(glioma), 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 기타 림프증식성 장애, 또는 다양한 유형의 두경부암이다. 일부 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시형태에서, 암은 결장직장암이다.

일부 실시형태에서, 대상체는 이온화 방사선, 화학요법제, 치료용 항체, 및 면역체크포인트 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 항암 요법을 이전에 투여받았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 갖는 것으로 확인되거나 진단되었다.

또한 대상체에서 기억 CD8+ T 세포를 증가시키는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 대상체에 치료 유효량의 본원에 기술된 약학 조성물 중 임의의 하나를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

또한 대상체에서 CD8+ T 세포를 증가시키는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 대상체에 치료 유효량의 본원에 기술된 약학 조성물 중 임의의 하나를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

또한 대상체의 고형 종양에서 Treg 세포를 감소시키는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기술된 약학 조성물 중 임의의 하나를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

또한 대상체에서 고형 종양의 성장 속도를 감소시키는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기술된 약학 조성물 중 임의의 하나를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

또한 대상체에서 고형 종양의 부피를 감소시키는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기술된 약학 조성물 중 임의의 하나를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

도 1은 IL-2 융합 단백질에 대한 재조합 발현 벡터의 구조를 도시한다.
도 2는 IL-2 Fc 융합 단백질, IL2_V1, IL2_V2, IL2_V3, IL2_V4, 및 IL2_V5을 사용한 SDS-PAGE 결과를 도시한다.
도 3a는 겔 여과 표준을 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 3b는 supMD를 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 3c는 IL2_V1을 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 3d는 IL2_V2를 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 3e는 IL2_V3을 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 3f는 IL2_V4를 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 3g는 IL2_V5를 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 4는 추가의 IL-2 Fc 융합 단백질, IL2_V4, IL2_V4_R38A, IL2_V4_F42A, 및 IL2_V4_R38A_F42A를 사용한 SDS-PAGE 결과를 도시한다.
도 5a는 겔 여과 표준을 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 5b는 IL2_V4_R38A를 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 5c는 IL2_V4_F42A를 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 5d는 IL2_V4_R38A_F42A를 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 도시한다.
도 6a는 IL2 WT에 의한 개체별 종양 성장을 나타내는 그래프이다.
도 6b는 IL2 V4에 의한 개체별 종양 성장을 나타내는 그래프이다.
도 6c는 IL2 V4_R38A에 의한 개체별 종양 성장을 나타내는 그래프이다.
도 6d는 IL2 V4_F42A에 의한 개체별 종양 성장을 나타내는 그래프이다.
도 6e는 IL2 V4_R38A_F42A에 의한 개체별 종양 성장을 나타내는 그래프이다.
도 6f는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A에 의한 그룹별 종양 성장 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 6g는 생체 내 실험에서 종말점에서의 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A에 의한 그룹별 종양 성장을 나타내는 막대 그래프이다.
도 7a는 CD3 및 CD45의 발현을 나타내는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A로의 FACS 분석 결과를 도시한다.
도 7b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A로의 mCD3⁺ T 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스 혈액에서 CD4 및 CD8의 발현을 나타내는 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 8b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스 혈액에서 mCD8+ T 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈액에서 CD62L 및 CD44의 발현을 나타내는 FACS 분석 결과를 나타낸다
도 9b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈액에서 mCD8+ 중심(central) 기억 T 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 9c는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈액에서 mCD8+ 이펙터 T 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈액에서 CD4 및 CD45의 발현을 나타내는 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 10b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈액에서 mCD4+ T 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 11a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈액에서 CD4 및 Foxp3의 발현을 나타내는 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 11b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4 R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4 R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈액에서 Treg 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 12a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4 R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 CD3 및 CD45의 발현을 나타내는 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 12b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 mCD3+ T 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 13a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 CD4 및 CD8의 발현을 나타내는 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 13b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 mCD8+ T 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 14a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 CD62L 및 CD44의 발현을 나타내는 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 14b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 mCD8+ 중심 기억 T 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 14c는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 mCD8+ 이펙터 T 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 15a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 CD4 및 CD45의 발현을 나타내는 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 15b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 mCD4+ T 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 16a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 CD4 및 Foxp3의 발현을 나타내는 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 16b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 Treg 세포의 퍼센트를 나타내는 그래프이다.
도 17a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈액에서 mCD3+ T 세포, mCD8+ T 세포, mCD4+ T 세포, mCD8+ 중심 기억 T 세포, mCD8+ 이펙터 T 세포, 및 Treg 세포의 퍼센트를 나태는 그래프 세트이다.
도 17b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 종양 침윤 림프구에서 mCD3+ T 세포, mCD8+ T 세포, mCD4+ T 세포, mCD8+ 중심 기억 T 세포, mCD8+ 이펙터 T 세포, 및 Treg 세포의 퍼센트를 나태는 그래프 세트이다.
도 18a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 C57BL/6 마우스의 폐 조직의 예시적인 이미지를 도시한다.
도 18b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 C57BL/6 마우스의 폐 조직의 중량을 도시하는 그래프이다.
도 19a는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈청 중의 감마-글루타밀 트랜스펩티다제(GTP: gamma-glutamyl transpeptidase)의 수준을 도시하는 막대 그래프이다.
도 19b는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈청 중의 글루타믹-옥살로아세틱 트랜스아미나제(GOT: glutamic-oxaloacetic transaminase)의 수준을 도시하는 막대 그래프이다.
도 19c는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈청 중의 혈액 요소 질소(BUN: blood urea nitrogen)의 수준을 도시하는 막대 그래프이다.
도 19d는 IL2 WT, IL2 V4, IL2 V4_R38A, IL2 V4_F42A, 및 IL2 V4_R38A_F42A를 처리한 마우스의 혈청 중의 총 빌리루빈(T-BIL: total bilirubin)의 수준을 도시하는 막대 그래프이다.

본 개시내용은 IL-2 단백질의 변이체를 기술하며, 상기 IL-2 변이체는 인간 IL-2 단백질의 돌연변이를 포함한다.

정의:

약 : 용어 "약"은 본원에서 값과 관련하여 사용될 때 참조된 값과 관련하여 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 문맥에 익숙한 당업자는 당해 문맥에서 "약"에 의해 포함되는 관련 변동 정도를 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 참조된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 이하 이내인 값의 범위를 포함할 수 있다.

투여: 본원에 사용된 용어 "투여"는 전형적으로 조성물이거나 조성물에 포함된 제제의 전달을 달성하기 위해 대상체 또는 시스템에 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 당업자는 적절한 상황에서 대상체, 예를 들어 인간에게 투여하기 위해 사용될 수 있는 다양한 경로를 알고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 투여는 안구, 경구, 비경구, 국소 등일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 투여는 기관지(예를 들어, 기관지 점적에 의해), 협측, 진피(예를 들어, 진피에 대한 국소, 피내(intradermal), 피간내(interdermal), 경피 등 중 하나 이상일 수 있거나 이를 포함할 수 있음), 경장(enteral), 동맥-내, 피내(intradermal), 위내, 골수내, 근육내, 비강내, 복강내, 척수강내, 정맥내, 심실내, 특정 기관 내(예를 들어, 간내), 점막, 비강, 구강, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(tracheal)(예를 들어, 기관내 점적에 의해), 질, 유리체 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 단일 용량만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 고정된 수의 용량의 적용을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 간헐적(예를 들어, 시간적으로 분리된 복수의 용량) 및/또는 주기적(예를 들어, 공통 기간에 의해 분리된 개별 용량) 투여인 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투여(예를 들어, 관류)를 포함할 수 있다.

친화도 : 당업계에 공지된 바와 같이, "친화도"는 특정 리간드가 이의 파트너에 결합하는 강도의 척도이다. 친화도는 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화도는 정량 분석에 의해 측정된다. 그러한 일부 실시형태에서, 결합 파트너 농도는 생리학적 조건을 모방하기 위해 리간드 농도를 초과하도록 고정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 결합 파트너 농도 및/또는 리간드 농도는 다양할 수 있다. 그러한 일부 실시형태에서, 친화도는 유사 조건(예를 들어, 농도) 하에서 참조와 비교될 수 있다.

항체 제제 : 본원에서 사용되는 용어 "항체 제제"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 상기 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린 구조 요소를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 예시적인 항체 제제는 비제한적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 당업계에 공지된 바와 같이 인간화, 영장류화, 키메라 등의 하나 이상의 서열 요소를 포함할 수 있다. 많은 실시형태에서, 용어 "항체 제제"는 항체의 구조적 및 기능적 특징을 대안적인 표현으로 활용하기 위한 당업계에 공지되거나 개발된 작제물 또는 형식(format) 중 하나 이상을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 실시형태에서, 본 발명에 따라 이용되는 항체 제제는 비제한적으로 온전한(intact) IgA, IgG, IgE, 또는 IgM 항체; 이중(bi)- 또는 다중(multi)-특이적 항체(예를 들어, Zybodies^®, 등); 항체 단편 예컨대 Fab 단편, Fab’ 단편, F(ab’)2 단편, Fd’ 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 이의 세트; 단일 사슬 Fv; 폴리펩티드-Fc 융합; 단일 도메인 항체(예를 들어, 상어 단일 도메인 항체 예컨대 IgNAR 또는 이의 단편); 낙타 항체; 마스킹된 항체(예를 들어, Probodies^®); 작은 모듈형 면역치료제("SMIPs^TM": Small Modular ImmunoPharmaceuticals); 단일 사슬 또는 탠덤 디아바디(TandAb^®); VHH; Anticalins^®; Nanobodies^® 미니바디; BiTE^®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs^®; Avimers^®; DART; TCR-유사 항체; Adnectins^®; Affilins^®; Trans-bodies^®; Affibodies^®; TrimerX^®; 마이크로단백질; Fynomers^®, Centyrins^®; 및 KAFBITOR^®로부터 선택되는 형식이다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 자연적으로 생성되는 경우 가질 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드[예를 들어, 검출 가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등], 또는 다른 펜던트기[예를 들어, 폴리-에틸렌 글리콜 등]을 함유할 수 있다. 많은 실시형태에서, 항체 제제는 이의 아미노산 서열이 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)으로서 당업자에 의해 인식되는 하나 이상의 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함하며; 일부 실시형태에서 항체 제제는 이의 아미노산 서열이 참조 항체에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR(예를 들어, 적어도 하나의 중쇄 CDR 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDR)을 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 비교하여 서열이 동일하거나 1 내지 5개의 아미노산 치환을 함유한다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 이것이 참조 CDR과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 이것이 참조 CDR과 적어도 96%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가 또는 치환을 갖지만 포함된 CDR이 참조 CDR의 것과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1 내지 5개의 아미노산이 참조된 CDR과 비교하여 결실, 부가, 또는 치환되었지만 포함된 CDR이 참조 CDR과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 치환되었지만 포함된 CDR이 참조 CDR의 것과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1 내지 5개의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가, 또는 치환되었지만 포함된 CDR이 참조 CDR과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 이의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 도메인으로서 당업자에 의해 인식되는 구조 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 면역글로불린-결합 도메인과 상동성 또는 대체로 상동성인 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)의 적어도 일부이거나 이를 포함한다.

항원 : 본원에서 사용되는 용어 "항원"은 항체 제제에 결합하는 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항원은 항체 제제에 결합하고 유기체에서 특정 생리학적 반응을 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 일반적으로, 항원은 예를 들어 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, 중합체(생물학적 중합체[예를 들어, 핵산 및/또는 아미노산 중합체] 및 생물학적 중합체 이외의 중합체[예를 들어, 핵산 또는 아미노산 중합체 이외]) 등과 같은 임의의 화학적 실재물일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 글리칸이거나 이를 포함한다. 당업자는 일반적으로 항원이 단리된 형태 또는 순수한 형태로 제공될 수 있거나, 대안적으로 조(crude) 형태(예를 들어, 다른 물질과 함께, 예를 들어 세포 추출물과 같은 추출물 또는 항원-함유 공급원의 비교적 다른 조 제제)로 제공될 수 있다. 일부 특정한 실시형태에서, 항원은 세포 맥락에서 존재한다(예를 들어, 항원은 세포의 표면에서 발현되거나 세포에서 발현된다). 일부 실시형태에서, 항원은 재조합 항원이다.

항원 결합 도메인 : 본원에 사용된 바와 같이, 표적 모이어티 또는 실재물에 특이적으로 결합하는 항체 제제 또는 이의 일부를 지칭한다. 전형적으로, 항원 결합 도메인과 이의 표적 사이의 상호작용은 비-공유적이다. 일부 실시형태에서, 표적 모이어티 또는 실재물은 예를 들어 탄수화물, 지질, 핵산, 금속, 폴리펩티드 또는 소분자를 포함하는 임의의 화학적 부류일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 폴리펩티드(또는 이의 복합체)이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 융합 폴리펩티드의 일부이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부이다.

~와 연관된(Associated with) : 2개의 사건 또는 실재물은 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것과 상관 관계가 있는 경우 본원에서 사용되는 용어와 같이 서로 "연관"된다. 예를 들어, 특정 실재물(예를 들어, 폴리펩티드, 유전자 서명, 대사산물, 미생물, 등)은 이의 존재, 수준 및/또는 형태가 질환, 장애 또는 상태(예를 들어, 관련 집단)의 발생률 및/또는 감수성과 관련이 있는 경우, 특정 질환, 장애, 또는 상태와 연관되어 있는 것으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 실재물은, 이들이 직접 또는 간접적으로 상호 작용하여 서로 물리적으로 근접한 상태이고/이거나 유지하는 경우 또 다른 것과 물리적으로 "연관"된다. 일부 실시형태에서, 서로 물리적으로 결합된 2개 이상의 실재물은 서로 공유 결합된다; 일부 실시형태에서, 물리적으로 서로 연관된 2개 이상의 실재물은 서로 공유 결합되지 않고 예를 들어 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자성 및 이들의 조합에 의해 비-공유적으로 연관된다.

결합 : 본원에서 사용되는 용어 "결합"은 전형적으로 2개 이상의 실재물 사이의 비공유 연관을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. "직접적인" 결합은 실재물 또는 모이어티 간의 물리적 접촉을 포함한다; 간접적인 결합은 하나 이상의 중간 실재물과의 물리적 접촉을 통한 물리적 상호 작용을 포함한다. 2개 이상의 실재물 사이의 결합은 전형적으로 상호작용하는 실재물 또는 모이어티가 단리로 또는 보다 복잡한 시스템의 맥락에서 연구되는 경우를 포함하여 다양한 맥락 중 임의의 것에서 평가될 수 있다(예를 들어, 담체 실재물과 공유적으로 또는 달리 연관되는 동안 및/또는 생물학적 시스템 또는 세포에서).

암 : 용어 "암", "악성", "신생물", "종양" 및 "암종"은 본원에서 상대적으로 비정상적이고 제어되지 않고/않거나 자율적 성장을 나타내어, 세포 증식의 제어의 심각한 상실을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타내는 세포를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 종양은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성 및/또는 비전이성인 세포이거나 이를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 이의 교시가 특히 관련될 수 있는 특정 암을 구체적으로 확인한다. 일부 실시형태에서, 관련 암은 고형 종양을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관련 암은 혈액 종양을 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 상이한 유형의 암의 예는 예를 들어 백혈병, 림프종(호지킨 및 비-호지킨), 골수종 및 골수증식성 장애를 포함하는 조혈암; 육종, 흑색종, 선종, 고형 조직의 암종, 입, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 간암, 전립선암, 자궁경부암, 방광암, 자궁암 및 자궁내막암과 같은 비뇨생식기암 및 신세포 암종, 골암, 췌장암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 두경부암, 유방암, 위장관암 및 신경계암, 양성 병변 예컨대 유두종 등을 포함한다.

화학요법제 : 본원에서 사용된 "화학요법제"라는 용어는, 예를 들어 구체적으로 바람직하지 않은 세포 증식과 관련된 하나 이상의 질환, 장애 또는 상태를 치료하는데 사용하기 위해 이용 및/또는 권장되는 제제를 포함하여, 하나 이상의 세포사멸촉진제, 세포정지제 및/또는 세포독성제를 지칭하는 당업계에서 이해되는 의미를 갖는다. 다수의 실시형태에서, 화학요법제는 암 치료에 유용하다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 하나 이상의 알킬화제, 하나 이상의 안트라시클라인, 하나 이상의 세포골격 파괴제(예를 들어, 탁산, 메이탄신 및 이의 유사체와 같은 미세소관 표적화제), 하나 이상의 에포틸론, 하나 이상의 히스톤 데아세틸라제 억제제 HDAC), 하나 이상의 토포이소머라제 억제제(예를 들어, 토포이소머라제 I 및/또는 토포이소머라제 II의 억제제), 하나 이상의 키나제 억제제, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 전구체 유사체, 하나 이상의 펩티드 항생제, 하나 이상의 백금-기반 제제, 하나 이상의 레티노이드, 하나 이상의 빈카 알칼로이드 및/또는 다음(즉, 관련 항-증식 활성을 공유하는 것) 중 하나 이상의 하나 이상의 유사체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 특정한 실시형태에서, 화학요법제는 악티노마이신, 올-트랜스 레티노산, 아우리스타틴, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카페시타빈, 시스플라틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 커큐민, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포사이드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시유레아, 이다루비신, 이마티닙, 이리노테칸, 메이탄신 및/또는 이의 유사체(예를 들어 DM1) 메클로레타민, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 메이탄시노이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉시드, 테니포사이드, 티오구아닌, 토포테칸, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈 및 이들의 조합 중 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 항체-약물 접합체의 맥락에서 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체에서 발견되는 것이다: hLLl-독소루비신, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN-38, hLLl-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro-2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLLl- Pro-2-P-Dox, P4/D 10-독소루비신, 젬투주맙 오조가미신, 브렌툭시맙 베도틴, 트라스투주맙 엠탄신, 이노투주맙 오조가미신, 글렘바투모맙 베도틴, SAR3419, SAR566658, BIIB015, BT062, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, 항-PSMA ADC, RG-7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, 보르세투주맙 마포도틴, 및 로보투주맙 메르탄신.

조작된 : 일반적으로 "조작된"이라는 용어는 사람의 손에 의해 조작된 양태를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드 서열이 사람의 손에 의해 조작될 때 폴리펩티드는 "조작된" 것으로 간주된다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 사람의 손에 의해 참조 폴리펩티드 서열에 도입된 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 인간의 손에 의해 하나 이상의 추가 폴리펩티드에 융합(즉, 공유 결합)되어 생체 내에서 자연적으로 발생하지 않는 융합 폴리펩티드를 형성하는 폴리펩티드를 포함한다. 유사하게, 세포나 유기체는 유전 정보가 변경되도록 조작된 경우(예를 들어, 이전에 존재하지 않았던 새로운 유전 물질이 예를 들어 형질전환, 교배, 체세포 혼성화, 형질감염, 형질도입 또는 기타 메커니즘에 의해 도입되었거나, 이전에 존재했던 유전 물질이 예를 들어 치환 또는 결실 돌연변이에 의해, 또는 짝짓기 프로토콜에 의해 변경 또는 제거됨) "조작된" 것으로 간주된다. 통상적인 관행이고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리펩티드 또는 세포의 파생물 및/또는 자손은 전형적으로 실제 조작이 이전 실재물에서 수행되었음에도 불구하고 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.

약학 조성물: 본원에서 사용되는 용어 "약학 조성물"은 활성제가 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되는 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 활성제는 관련 집단에 투여될 때 예정된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 요법으로 투여하기에 적절한 단위 투여량으로 존재한다.

폴리펩티드 . 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 적어도 3개의 아미노산의 중합체를 의미하는 것으로 해당 분야에서 인식된다. 당업자는 용어 "폴리펩티드"가 본원에 인용된 완전한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라, 이러한 완전한 폴리펩티드의 기능적 단편(즉, 적어도 하나의 활성을 유지하는 단편)을 나타내는 폴리펩티드를 포함할 만큼 충분히 일반적인 것으로 의도됨을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 단백질 서열이 일반적으로 활성을 파괴하지 않고 일부 치환을 용인한다는 것을 이해한다. 따라서, 활성을 유지하고 동일한 부류의 다른 폴리펩티드와 적어도 약 30 내지 40%의 전체 서열 동일성, 종종 약 50%, 60%, 70% 또는 80% 초과를 공유하고, 추가로 일반적으로 훨씬 더 높은 동일성을 갖는 적어도 하나의 영역, 종종 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 하나 이상의 고도로 보존된 영역을 포함하며, 일반적으로 적어도 3 내지 4개 및 종종 최대 20개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드는 본원에서 사용된 관련 용어 "폴리펩티드" 내에 포함된다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 모두를 함유할 수 있고 당업계에 공지된 임의의 다양한 아미노산 변형 또는 유사체를 함유할 수 있다. 유용한 변형은 예를 들어 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "펩티드"는 일반적으로 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산, 또는 10개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항체 제제, 항체 단편, 이의 생물학적 활성 부분 및/또는 이의 특성 부분이다.

재조합: 본원에 사용된 바와 같이, 재조합 수단에 의해 설계, 조작, 준비, 발현, 생성, 제조, 및/또는 단리된 폴리펩티드, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드; 재조합의, 조합적 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드; 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 구성요소, 부분, 요소 또는 도메인의 발현을 코딩 및/또는 지시하는 유전자 또는 유전자들, 또는 유전자 구성요소를 발현하도록 형질전환되거나 그렇지 않으면 조작된 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 양, 어류 등)로부터 단리된 폴리펩티드; 및/또는 선택된 핵산 서열 요소를 서로 스플라이싱 또는 결찰, 선택된 서열 요소를 화학적으로 합성하는 것과 관련된 임의의 다른 수단에 의해 준비, 발현, 생성 또는 단리된, 및/또는 그렇지 않으면 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 구성요소, 부분, 요소 또는 도메인의 발현을 코딩 및/또는 지시하는 핵산을 생성하는 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 자연에서 발견된다. 일부 실시형태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 인 실리코에서 설계된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이러한 선택된 서열 요소는 예를 들어, 관심의 공급원 유기체(예를 들어, 인간, 마우스, 등)의 생식세포계열에서와 같은 천연 또는 합성 공급원으로부터의 공지된 서열 요소의 돌연변이 유발(예를 들어, 생체 내 또는 시험관 내)의 결과이다.

특이적 결합 : 본원에서 사용되는 용어 "특이적 결합"은 결합이 일어나는 환경에서 가능한 결합 파트너를 구별하는 능력을 지칭한다. 다른 잠재적인 표적이 존재할 때 하나의 특정 표적과 상호작용하는 결합제는 그것이 상호작용하는 표적에 "특이적으로 결합한다"고 지칭된다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 결합제와 그의 파트너 사이의 결합 정도를 검출하거나 결정함으로써 평가되고; 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 결합제-파트너 복합체의 해리 정도를 검출하거나 결정함으로써 평가되고; 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 그의 파트너와 다른 실재물 사이의 대안적인 상호작용을 경쟁하는 결합제의 능력을 검출하거나 결정함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 농도 범위에 걸쳐 이러한 검출 또는 결정을 수행함으로써 평가된다.

대상체 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유동물(예를 들어, 인간, 일부 실시형태에서는 태아기 인간 형태를 포함함)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 상태를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 상태에 걸리기 쉽다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 상태의 어떠한 증상이나 특징도 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 상태에 대한 감수성 또는 위험의 특징적인 하나 이상의 특징을 가진 이이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여된 개인이다.

치료제 : 본원에서 사용되는 "치료제"라는 어구는 일반적으로 유기체에 투여될 때 원하는 약리학적 효과를 이끌어내는 임의의 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 제제는 적절한 모집단에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 나타내는 경우 치료제로 간주된다. 일부 실시형태에서, 적절한 모집단은 모델 유기체 모집단일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 모집단은 특정 연령군, 성별, 유전적 배경, 기존 임상 상태 등과 같은 다양한 기준에 의해 정의될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 질환, 장애, 및/또는 상태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 완화, 개선, 경감, 억제, 예방, 개시 지연, 중증도 감소, 및/또는 발병률 감소에 사용될 수 있는 물질이다. 일부 실시형태에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 시판될 수 있기 전에 정부 기관의 승인을 받았거나 승인을 받아야 하는 제제이다. 일부 실시형태에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 의료 처방이 필요한 제제이다.

치료 유효량 : 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료 유효량"은 치료 투여 요법에 따라 질환, 장애 및/또는 상태를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 집단에 투여될 때 질환, 장애 및/또는 상태를 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 치료 유효량은 질환, 장애 및/또는 상태의 하나 이상의 증상의 발생률 및/또는 중증도를 감소시키고, 이의 하나 이상의 특징을 안정화시키고/시키거나, 개시를 지연시키는 양이다. 당업자는 "치료 유효량"이라는 용어가 실제로 특정 개체에서 성공적인 치료가 달성될 것을 요구하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 치료 유효량은 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 상당한 수의 대상체에서 특정한 원하는 약리학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "치료 유효량"은 본 발명의 요법의 맥락에서 이를 필요로 하는 개체에게 투여될 때 상기 개체에서 발생하는 암-지지 과정을 차단, 안정화, 약화 또는 역전시키거나, 상기 개체에서 암-지지 과정을 향상 또는 증가시키는 양을 지칭한다. 암 치료의 맥락에서, "치료 유효량"은 암으로 진단된 개체에 투여될 때 개체에서 암의 추가 발달을 예방, 안정화, 억제 또는 감소시키는 양이다. 본원에 기술된 조성물의 특히 바람직한 "치료 유효량"은 (치료적 치료에서) 췌장 암종과 같은 악성 종양의 발달을 역전시키거나 악성 종양의 차도를 달성하거나 연장하는데 도움을 준다. 개체의 암을 치료하기 위해 개체에게 투여되는 치료 유효량은 차도를 촉진하거나 전이를 억제하기 위해 투여되는 치료 유효량과 동일하거나 상이할 수 있다. 대부분의 암 요법과 마찬가지로, 본원에 기술된 치료 방법은 암에 대한 "치유(cure)"로 해석되거나 제한되거나 달리 제한되지 않는다; 오히려 치료 방법은 암을 "치료"하기 위해, 즉 암을 앓는 개체의 건강에 바람직하거나 유익한 변화를 일으키기 위해 기재된 조성물의 사용에 관한 것이다. 이러한 이점은 종양학 분야의 숙련된 의료 제공자에 의해 인식되며 비제한적으로 환자 상태의 안정화, 종양 크기의 감소(종양 퇴행), 필수 기능의 개선(예를 들어, 암 조직 또는 장기의 기능 개선), 추가 전이의 감소 또는 억제, 기회 감염의 감소, 생존률 증가, 통증 감소, 운동 기능 개선, 인지 기능 개선, 에너지 느낌 개선(활력, 불쾌감 감소), 웰빙 느낌 개선, 정상적인 식욕 회복, 건강한 체중 증가 회복, 및 이들의 조합을 포함한다. 또한, 개체에서 특정 종양의 퇴행(예를 들어, 본원에 기술된 치료의 결과로서)은 또한 췌장 선암과 같은 종양 부위로부터 암 세포의 샘플을 취하고(예를 들어, 치료 과정에 걸쳐) 암 세포의 상태를 모니터링하기 위해 대사 및 신호전달 마커의 수준에 대해 암 세포를 시험하여 암 세포가 덜 악성인 표현형으로 회귀하는 것을 분자 수준에서 확인함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용함으로써 유도된 종양 퇴행은 상기 논의된 임의의 혈관신생 촉진 마커의 감소, 본원에 기술된 항-혈관신생 마커의 증가, 암으로 진단된 개체에서 비정상적인 활성을 나타내는 대사 경로, 세포간(intercellular) 신호전달 경로, 세포내(intracellular) 신호전달 경로의 정상화(즉, 암을 앓고 있지 않은 정상적인 개체에서 발견되는 상태로의 변경)의 발견에 의해 표시된다. 당업자는 일부 실시형태에서 치료 유효량이 단일 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효량은 예를 들어 투여 요법의 일부로서 복수의 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있다.

변이체 : 분자, 예를 들어, 핵산, 단백질 또는 소분자의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "변이체"는 참조 분자와 상당한 구조적 동일성을 나타내지만, 예를 들어 참조 실재물과 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 부재 또는 수준에서 참조 분자와 구조적으로 상이한 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 또한 그것의 참조 분자와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 분자가 참조 분자의 "변이체"로 적절히 간주되는지 여부는 참조 분자와의 구조적 동일성 정도에 따라 결정된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 분자는 특정한 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 변이체는 정의 상, 하나 이상의 그러한 특징적인 구조 요소를 공유하지만 참조 분자와 적어도 한 가지 양태에서 다른 별개의 분자이다. 단지 몇 가지 예를 들자면, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고/갖거나 특정 구조 모티프 및/또는 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다; 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 다른 것에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 99%인 전체 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 하나 이상의 생물학적 활성을 공유한다.

벡터 : 본원에서 사용된 바와 같이, 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기에서 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입 시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공법, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 더 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]을 참조하며, 이는 임의의 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.

인터류킨-2(IL-2)

인터류킨-2(IL-2)는 면역 체계의 사이토카인 신호전달 분자이다. IL-2는 백혈구(예를 들어, 백혈구, 림프구)의 활성을 조절하고, 림프구에 의해 발현되는 IL-2 수용체(예를 들어, IL2-RA, IL2-RB)에 결합하여 그 효과를 매개한다. 또한, 면역 반응 동안, 활성화된 항원 특이적 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포가 IL-2의 주요 공급원이며, 이후 CD25⁺ 이펙터 T 세포 및 T_Reg 세포에 의해 소비된다. 또한, IL-2는 단량체, 이량체 및 삼량체 IL-2 수용체를 비롯한 다양한 IL-2 수용체에 결합하여 자극 및 조절 기능을 발휘하는 것으로 나타났다. 일부 T 세포(예를 들어, T_Reg 세포)는 IL2-RA(CD25), IL2-RB (CD 122), 및 공통 사이토카인 수용체 감마 사슬(CD 132) 서브유닛으로 구성된 고-친화도 헤테로삼량체 수용체를 발현한다. 대조적으로, 나이브 CD8 T 세포, CD4/CD8 기억 T 세포, 및 NK 세포는 IL2-RA 서브유닛이 결여된 더 낮은 친화도의 이량체 수용체를 발현한다.

IL-2는 주로 T 세포에 대한 직접적인 영향을 통해 면역 체계, 관용 및 면역의 주요 기능에서 역할을 한다. IL-2는 또한 초기 T 세포가 항원에 의해 자극될 때 T 세포가 이펙터 T 세포와 기억 T 세포로 분화하는 것을 촉진한다. 일부 실시형태에서, IL-2는 2차 림프 기관에서 활성화된 CD4⁺ T 세포에 의해 생성된다. 그런 다음 분비된 IL-2는 IL-2 수용체 서브유닛 CD25(예를 들어, IL-2Rα)를 발현하는 조절 T(T_Reg) 세포에 의해 동일한 부위에서 소비된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응 동안, 활성화된 항원-특이적 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포는 다량의 IL-2를 생산하며, 이는 이어서 CD25⁺ 이펙터 T 세포 및 T_Reg 세포에 의해 소비된다.

IL-2는 2차 림프 기관의 활성화된 T 세포에 의해 생성되는 것으로 나타났으며, 여기서 IL-2는 T_Reg 세포를 비롯한 이들 세포 및 다른 CD25⁺ 세포에 의해 소비된다. 일부 실시형태에서, T_Reg 세포 및 세포독성 림프구 모두를 활성화시키는 IL-2의 능력은 자가면역, 만성 염증 상태 및 이식 거부에서 T_Reg 세포 수만을 증가시키는 저용량 IL-2 면역요법을 사용함으로써 회피될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고용량 IL-2 투여는 전이성 암 치료를 위해 세포독성 림프구 집단을 확장시키는 역할을 할 수 있다. 선택적 IL-2 면역요법을 위한 대안적 접근법은 특정 IL-2-특이적 모노클로날 항체에 결합된 IL-2, 또는 CD25 또는 CD122(예컨대, IL-2Rβ)에 대해 증가된 친화도를 갖는 IL-2 뮤테인과 같은 개선된 IL-2 제형을 사용하는 것이다. 일부 실시형태에서, IL-2에 대한 특이적 돌연변이가 도입되어 IL-2 변이체가 생성되고, 여기서 특이적 돌연변이는 IL2-RA 또는 IL2-RB에 대한 우선적인 결합을 유도하여 특정 면역 세포 서브세트를 자극한다.

단백질

하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단백질이 본원에서 제공된다: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 18. 일부 실시형태에서, 단백질은 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 SEQ ID NO: 6을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 SEQ ID NO: 8을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 SEQ ID NO: 10을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 SEQ ID NO: 12를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 SEQ ID NO: 14를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 SEQ ID NO: 16을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 SEQ ID NO: 18을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 SEQ ID NO: 20을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 결합에 의해 단백질에 연결된다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 링커 서열에 의해 단백질에 연결된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 면역글로불린 Fc 영역의 카복시-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 하나 이상의 도메인(예를 들어, 하나 이상의 기능적 도메인, 예컨대 사이토카인)을 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 단백질은 IL-2 단백질이다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질은 인간 인터류킨-2(IL-2) 단백질이다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질은 가용성 IL-2 단백질이다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질은 단백질 결합제이다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질은 또 다른 항체 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질은 항체 제제에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질은 IL-2 융합 단백질에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2 융합 단백질은 IL-2 단백질 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 Fc 도메인 및 특이적 펩티드 또는 단백질을 함께 융합하는 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 결합에 의해 특정 펩티드 또는 단백질에 연결된다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 링커 서열에 의해 특정 펩티드 또는 단백질에 연결된다. 일부 실시형태에서, 특정 펩티드 또는 단백질은 면역글로불린 Fc 영역의 카복시-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질은 SEQ ID NO: 2를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 18.

하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 인터류킨(IL)-2 단백질이 본원에서 제공된다: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 18. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 4를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 6을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 8을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 10을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 12를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 14를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 16을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 18을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 SEQ ID NO: 20을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 결합에 의해 인간 인터류킨-2 단백질에 연결된다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 링커 서열에 의해 인간 인터류킨-2 단백질에 연결된다. 일부 실시형태에서, 인터류킨-2 단백질은 면역글로불린 Fc 영역의 카복시-말단에 연결된다.

핵산

본원에서 사용되는 "핵산"은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함하는데 사용된다. 예시적인 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 리보핵산(RNA) 및/또는 데옥시리보핵산(DNA)을 포함할 수 있다.

IL-2 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산이 본원에서 제공되며, 여기서 서열은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 17. 일부 실시형태에서, 핵산은 면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 19를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 3을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 5를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 7을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 9를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 11을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 13을 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 15를 포함한다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 17을 포함한다.

SEQ ID NO: 1 - 야생형 인간 IL-2

SEQ ID NO: 2 - 야생형 IL-2(아미노산)

SEQ ID NO: 3 - IL2_V1

SEQ ID NO: 4 - IL2_V1(아미노산)

SEQ ID NO: 5 - IL2_V2

SEQ ID NO: 6 - IL2_V2(아미노산)

SEQ ID NO: 7 - IL2_V3

SEQ ID NO: 8 - IL2_V3(아미노산)

SEQ ID NO: 9 - IL2_V4

SEQ ID NO: 10 - IL2_V4(아미노산)

SEQ ID NO: 11 - IL2_V5

SEQ ID NO: 12 - IL2_V5(아미노산)

SEQ ID NO: 13 -IL2_V4_R38A

SEQ ID NO: 14 - IL2_V4_R38A(아미노산)

SEQ ID NO: 15 - IL2_V4_F42A

SEQ ID NO: 16 - IL2_V4_F42A(아미노산)

SEQ ID NO: 17 - IL2_V4_R38A_F42A

SEQ ID NO: 18 - IL2_V4_R38A_F42A(아미노산)

SEQ ID NO: 19 - Fc(207-230 IMGT 대립유전자 IGHG1*03, 231-457 IMGT 대립유전자 IGHG2*01)

SEQ ID NO: 20 - Fc(207-230 IMGT 대립유전자 IGHG1*03, 231- 457 IMGT 대립유전자 IGHG2*01)(아미노산)

벡터

일부 실시형태에서, 전술된 핵산 작제물은 당업계에 공지된 방법에 의해 발현 벡터 또는 바이러스 벡터 내로 삽입될 수 있고, 핵산 분자는 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 벡터의 비제한적인 예는 플라스미드 벡터, 트랜스포존 벡터, 코스미드 벡터, 및 바이러스 유래 벡터(예를 들어, 임의의 아데노바이러스 유래 벡터(AV), 사이토메갈로바이러스 유래(CMV) 벡터, 원숭이 바이러스 유래(SV40) 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 및 레트로바이러스 벡터)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.

클로닝 및/또는 발현에서의 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 보조하거나, 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입을 개선하기 위해 추가적인 서열이 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 추가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다.

일부 실시형태에서, 핵산 분자는 적절한 세포 내로 도입될 때 본 개시내용의 IL-2 단백질을 발현할 수 있는 벡터 내로 삽입된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 본원에 기술된 임의의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.

또한, 본원에 기술된 임의의 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 본원에 기술된 임의의 핵산 또는 임의의 벡터를 포함한다. 또한 본원에 기술된 임의의 핵산 또는 임의의 벡터를 포함하는 세포가 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 본원에 기술된 임의의 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

또한 IL-2 단백질의 생산 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 (a) IL-2 단백질을 발현하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 본원에 기술된 세포 중 임의의 하나를 배양하는 단계; 및 (b) 세포 및/또는 배양 배지로부터 IL-2 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

치료 적용

일부 실시형태에서, 본원에 기술된 IL-2 단백질 또는 핵산 작제물은 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 IL-2 관련 질환으로 진단된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 IL-2 관련 암으로 진단된다. 일부 실시형태에서, IL-2 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 IL-2 관련 질환으로 진단된 대상체에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 비제한적으로 이온화 방사선, 화학요법제, 치료용 항체, 및 면역체크포인트 억제제를 포함하는 하나 이상의 추가 항암 요법과 함께 투여될 수 있다.

인터류킨-2(IL-2)는 암 세포에 대한 신체의 반응을 수정하는 기능을 하는 사이토카인이며, 여기서 IL-2는 면역 체계의 다양한 구성요소(예를 들어, T 림프구 및 자연 살해(NK: natural killer) 세포)의 생산을 증가시키는데 도움이 된다. 또한, IL-2는 또한 암 치료에 도움이 되는 다른 면역 체계 세포(예를 들어, 림포카인-활성화 살해 세포 및 종양-침윤 림프구)의 기능을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, IL-2는 비제한적으로 신세포(신장) 암, 전이성 흑색종, 및 진행성 비-호지킨 림프종을 포함할 수 있는 암을 치료하는 데 사용된다.

암은 신체에서 비정상적인 세포의 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 광범위한 질환군을 지칭할 수 있다. 조절되지 않은 세포 분열과 성장은 주변 조직을 침범하는 악성 종양의 형성을 초래하고 림프계나 혈류를 통해 신체의 먼 부분으로 전이될 수도 있다. 암 또는 암 조직은 종양을 포함할 수 있다.

대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기술된 임의의 약학 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종, 백혈병, 평편 세포 암종, 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 폐 선암종, 폐의 평편 세포 암종, 복막암, 간세포 암종, 위암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 기타 림프증식성 장애, 또는 다양한 유형의 두경부암이다. 일부 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. 일부 실시형태에서, 암은 결장직장암이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 이온화 방사선, 화학요법제, 치료용 항체, 및 면역체크포인트 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 항암 요법을 이전에 투여받았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 갖는 것으로 확인되거나 진단되었다.

본 개시내용의 방법에 의한 치료에 적합한 암은 비제한적으로 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암 및 전립선암을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 의한 치료를 위한 암은 비제한적으로 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 평편 세포 암종, 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 폐 선암종, 폐의 평편 세포 암종, 복막암, 간세포 암종, 위암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포 암종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 기타 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 배아 종양(윌름스 종양, 간모세포종, 막대모양종양(rhabdoid), 신경모세포종), 생식 세포 종양(난황낭 종양, 미성숙 기형종 및 배아 암종), 암종(간세포 암종 및 폐 편평 세포 암종), 육종(악성 막대모양 종양 및 RMS), 또는 악성 흑색종일 수 있다.

또한 대상체(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 암을 갖는 임의의 대상체)에 치료 유효량의 본원에 기술된 임의의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 기억 CD8+ T 세포를 증가시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 투여 전 기억 CD8+ T 세포의 수준과 비교하여, 기억 CD8+ T 세포에서(예를 들어, 실시예 섹션에서 기술된 바와 같이 측정됨), 약 1% 증가 내지 약 100% 증가, 약 1% 증가 내지 약 80% 증가, 약 1% 증가 내지 약 60% 증가, 약 1% 증가 내지 약 40% 증가, 약 1% 증가 내지 약 20% 증가, 약 1% 증가 내지 약 15% 증가, 약 1% 증가 내지 약 10% 증가, 약 1% 증가 내지 약 5% 증가, 약 5% 증가 내지 약 100% 증가, 약 5% 증가 내지 약 80% 증가, 약 5% 증가 내지 약 60% 증가, 약 5% 증가 내지 약 40% 증가, 약 5% 증가 내지 약 20% 증가, 약 5% 증가 내지 약 15% 증가, 약 5% 증가 내지 약 10% 증가, 약 10% 증가 내지 약 100% 증가, 약 10% 증가 내지 약 80% 증가, 약 10% 증가 내지 약 60% 증가, 약 10% 증가 내지 약 40% 증가, 약 10% 증가 내지 약 20% 증가, 약 10% 증가 내지 약 15% 증가, 약 15% 증가 내지 약 100% 증가, 약 15% 증가 내지 약 80% 증가, 약 15% 증가 내지 약 60% 증가, 약 15% 증가 내지 약 40% 증가, 약 15% 증가 내지 약 20% 증가, 약 20% 증가 내지 약 100% 증가, 약 20% 증가 내지 약 80% 증가, 약 20% 증가 내지 약 60% 증가, 약 20% 증가 내지 약 40% 증가, 약 40% 증가 내지 약 100% 증가, 약 40% 증가 내지 약 80% 증가, 약 40% 증가 내지 약 60% 증가, 약 60% 증가 내지 약 100% 증가, 약 60% 증가 내지 약 80% 증가, 또는 약 *0% 증가 내지 약 100% 증가를 초래한다.

또한 대상체(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 암을 갖는 임의의 대상체)에 치료 유효량의 본원에 기술된 임의의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 CD8+ T 세포를 증가시키는 방법이 본원에서 제공된다.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 투여 전 CD8+ T 세포의 수준과 비교하여, CD8+ T 세포에서(예를 들어, 실시예 섹션에서 기술된 바와 같이 측정됨), 약 1% 증가 내지 약 100% 증가, 약 1% 증가 내지 약 80% 증가, 약 1% 증가 내지 약 60% 증가, 약 1% 증가 내지 약 40% 증가, 약 1% 증가 내지 약 20% 증가, 약 1% 증가 내지 약 15% 증가, 약 1% 증가 내지 약 10% 증가, 약 1% 증가 내지 약 5% 증가, 약 5% 증가 내지 약 100% 증가, 약 5% 증가 내지 약 80% 증가, 약 5% 증가 내지 약 60% 증가, 약 5% 증가 내지 약 40% 증가, 약 5% 증가 내지 약 20% 증가, 약 5% 증가 내지 약 15% 증가, 약 5% 증가 내지 약 10% 증가, 약 10% 증가 내지 약 100% 증가, 약 10% 증가 내지 약 80% 증가, 약 10% 증가 내지 약 60% 증가, 약 10% 증가 내지 약 40% 증가, 약 10% 증가 내지 약 20% 증가, 약 10% 증가 내지 약 15% 증가, 약 15% 증가 내지 약 100% 증가, 약 15% 증가 내지 약 80% 증가, 약 15% 증가 내지 약 60% 증가, 약 15% 증가 내지 약 40% 증가, 약 15% 증가 내지 약 20% 증가, 약 20% 증가 내지 약 100% 증가, 약 20% 증가 내지 약 80% 증가, 약 20% 증가 내지 약 60% 증가, 약 20% 증가 내지 약 40% 증가, 약 40% 증가 내지 약 100% 증가, 약 40% 증가 내지 약 80% 증가, 약 40% 증가 내지 약 60% 증가, 약 60% 증가 내지 약 100% 증가, 약 60% 증가 내지 약 80% 증가, 또는 약 *0% 증가 내지 약 100% 증가를 초래한다.

또한 대상체(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 암을 갖는 임의의 대상체)에 치료 유효량의 본원에 기술된 임의의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 고형 종양에서 Treg 세포를 감소시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 투여 전 고형 종양에서의 Treg 세포의 수준과 비교하여, 대상체의 고형 종양의 Treg 세포의 수준에서 약 1% 감소 내지 약 99% 감소, 약 1% 감소 내지 약 80% 감소, 약 1% 감소 내지 약 60% 감소, 약 1% 감소 내지 약 40% 감소, 약 1% 감소 내지 약 20% 감소, 약 1% 감소 내지 약 15% 감소, 약 1% 감소 내지 약 10% 감소, 약 1% 감소 내지 약 5% 감소, 약 5% 감소 내지 약 99% 감소, 약 5% 감소 내지 약 80% 감소, 약 5% 감소 내지 약 60% 감소, 약 5% 감소 내지 약 40% 감소, 약 5% 감소 내지 약 20% 감소, 약 5% 감소 내지 약 15% 감소, 약 5% 감소 내지 약 10% 감소, 약 10% 감소 내지 약 99% 감소, 약 10% 감소 내지 약 80% 감소, 약 10% 감소 내지 약 60% 감소, 약 10% 감소 내지 약 40% 감소, 약 10% 감소 내지 약 20% 감소, 약 10% 감소 내지 약 15% 감소, 약 15% 감소 내지 약 99% 감소, 약 15% 감소 내지 약 80% 감소, 약 15% 감소 내지 약 60% 감소, 약 15% 감소 내지 약 40% 감소, 약 15% 감소 내지 약 20% 감소, 약 20% 감소 내지 약 99% 감소, 약 20% 감소 내지 약 80% 감소, 약 20% 감소 내지 약 60% 감소, 약 20% 감소 내지 약 40% 감소, 약 40% 감소 내지 약 99% 감소, 약 40% 감소 내지 약 80% 감소, 약 40% 감소 내지 약 60% 감소, 약 60% 감소 내지 약 99% 감소, 약 60% 감소 내지 약 80% 감소, 약 80% 감소 내지 약 99% 감소를 초래한다. 비-제한적인 Treg 세포의 검출 방법이 실시예에 기술되어 있다.

또한 대상체(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 암을 갖는 임의의 대상체)에 치료 유효량의 본원에 기술된 임의의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 고형 종양에서 성장 속도를 감소시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 투여 전 고형 종양의 성장 속도와 비교하여, 대상체의 고형 종양의 성장 속도에서, 약 1% 감소 내지 약 99% 감소, 약 1% 감소 내지 약 80% 감소, 약 1% 감소 내지 약 60% 감소, 약 1% 감소 내지 약 40% 감소, 약 1% 감소 내지 약 20% 감소, 약 1% 감소 내지 약 15% 감소, 약 1% 감소 내지 약 10% 감소, 약 1% 감소 내지 약 5% 감소, 약 5% 감소 내지 약 99% 감소, 약 5% 감소 내지 약 80% 감소, 약 5% 감소 내지 약 60% 감소, 약 5% 감소 내지 약 40% 감소, 약 5% 감소 내지 약 20% 감소, 약 5% 감소 내지 약 15% 감소, 약 5% 감소 내지 약 10% 감소, 약 10% 감소 내지 약 99% 감소, 약 10% 감소 내지 약 80% 감소, 약 10% 감소 내지 약 60% 감소, 약 10% 감소 내지 약 40% 감소, 약 10% 감소 내지 약 20% 감소, 약 10% 감소 내지 약 15% 감소, 약 15% 감소 내지 약 99% 감소, 약 15% 감소 내지 약 80% 감소, 약 15% 감소 내지 약 60% 감소, 약 15% 감소 내지 약 40% 감소, 약 15% 감소 내지 약 20% 감소, 약 20% 감소 내지 약 99% 감소, 약 20% 감소 내지 약 80% 감소, 약 20% 감소 내지 약 60% 감소, 약 20% 감소 내지 약 40% 감소, 약 40% 감소 내지 약 99% 감소, 약 40% 감소 내지 약 80% 감소, 약 40% 감소 내지 약 60% 감소, 약 60% 감소 내지 약 99% 감소, 약 60% 감소 내지 약 80% 감소, 약 80% 감소 내지 약 99% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 고형 종양의 성장 속도는 자기 공명 영상화 또는 컴퓨터 단층촬영을 사용하여 시간 경과에 따른 고형 종양 부피의 다중 평가를 사용하여 결정될 수 있다.

또한 대상체(예를 들어, 본원에 기술된 임의의 암을 갖는 임의의 대상체)에 치료 유효량의 본원에 기술된 임의의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 고형 종양에서 부피를 감소시키는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 투여 전 대상체의 고형 종양의 부피와 비교하여, 대상체의 고형 종양의 부피에서, 약 1% 감소 내지 약 99% 감소, 약 1% 감소 내지 약 80% 감소, 약 1% 감소 내지 약 60% 감소, 약 1% 감소 내지 약 40% 감소, 약 1% 감소 내지 약 20% 감소, 약 1% 감소 내지 약 15% 감소, 약 1% 감소 내지 약 10% 감소, 약 1% 감소 내지 약 5% 감소, 약 5% 감소 내지 약 99% 감소, 약 5% 감소 내지 약 80% 감소, 약 5% 감소 내지 약 60% 감소, 약 5% 감소 내지 약 40% 감소, 약 5% 감소 내지 약 20% 감소, 약 5% 감소 내지 약 15% 감소, 약 5% 감소 내지 약 10% 감소, 약 10% 감소 내지 약 99% 감소, 약 10% 감소 내지 약 80% 감소, 약 10% 감소 내지 약 60% 감소, 약 10% 감소 내지 약 40% 감소, 약 10% 감소 내지 약 20% 감소, 약 10% 감소 내지 약 15% 감소, 약 15% 감소 내지 약 99% 감소, 약 15% 감소 내지 약 80% 감소, 약 15% 감소 내지 약 60% 감소, 약 15% 감소 내지 약 40% 감소, 약 15% 감소 내지 약 20% 감소, 약 20% 감소 내지 약 99% 감소, 약 20% 감소 내지 약 80% 감소, 약 20% 감소 내지 약 60% 감소, 약 20% 감소 내지 약 40% 감소, 약 40% 감소 내지 약 99% 감소, 약 40% 감소 내지 약 80% 감소, 약 40% 감소 내지 약 60% 감소, 약 60% 감소 내지 약 99% 감소, 약 60% 감소 내지 약 80% 감소, 약 80% 감소 내지 약 99% 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 고형 종양의 부피는 자기 공명 영상화 또는 컴퓨터 단층촬영을 사용하여 측정될 수 있다.

실시예

본 개시내용은 청구범위에 기술된 개시내용의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.

실시예 1 - IL-2의 변이체

IL-2 단백질을 IL2-G4S 링커-Fc_pcDNA3.3 플라스미드를 사용하여 생산하였다. 야생형 IL-2 및 IL-2 단백질의 변이체의 서열이 표 1에 나타내었다. 구체적으로, IL-2 단백질은 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.3을 사용하여 EcoRI과 BamHI의 제한 효소 부위에 삽입하여 생산하였다. 인간 IL-2 신호 펩티드(UniPortKB: P60568)를 신호 펩티드(P60568의 1aa 내지 20aa)로 사용하였고, 207aa 내지 230aa IMGT 대립유전자 IGHG1*03, 231aa 내지 457aa IMGT 대립유전자 IGHG2*01을 Fc 영역에 사용하였다. IL-2 단백질을 코딩하는 DNA 플라스미드 지도를 도 1에 나타내었다.

[표 1]

실시예 2 - IL-2 변이체의 분석 및 특성분석

IL-2 변이체를 플라스미드에 삽입하고 Expi293 발현 시스템(Invitrogen)을 사용하여 IL-2 단백질을 생산하는데 사용하였다. 그런 다음 단백질을 AktaPure(GE Healthcare), AktaPrime 정제기(GE Healthcare), 및 MabselectSURE 컬럼(GE Healthcare, Cat#1 1-0034-95)을 사용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 탈염 컬럼(GE Healthcare, Cat#17-1408-01)을 통해 러닝(running)하고 Multiskan GO(Thermo)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 결과는 표 2에 나타내었다.

[표 2]

실시예 3 - SDS-PAGE를 통한 단백질 분석

IL-2 변이체를 LDS 샘플 완충액(Invitrogen, Cat#B0007)에 첨가하였고, 여기서 샘플 환원제(Invitrogen, Cat#B0004)를 환원 조건군에 첨가하고 70℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 준비된 샘플에 SDS 러닝 완충액(Bio-rad, Cat#1610732)을 첨가하고 Mini-PROTEIN TGX Stain-Free Gel(Bio-rad, Cat#456-8096)을 사용하여 샘플을 30분 동안 러닝하였다. 결과를 Chemidoc(Bio-rad)를 사용하여 분석하였다(도 2).

실시예 4 - IL-2 수용체에 대한 친화도 분석

IL-2 수용체, IL2-RA 및 IL2-RB에 대한 IL-2 변이체의 친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)을 사용하여 분석하였다. IL-2 변이체를 2 μg/mL의 농도로 희석한 다음 CM5 칩(GE Healthcare, Cat#BR-1 005-30)에 고정화하였다. 수용체 IL-2RA 또는 IL-2RB(Sino)를 150초의 결합 시간 및 240초의 해리 시간으로 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM의 농도로 주입하였다. Biacore T200(GE Healthcare)을 사용하여 각 IL-2 변이체의 친화도를 측정하고 분석하였으며, 결과를 BIAevaluation 소프트웨어에 의해 1:1 결합 모델로 분석하였다. 결과는 IL2-RB에 대한 IL2_V4의 친화도가 야생형 IL-2의 친화도에 가장 가깝게 유지됨을 나타낸다(표 3, 표 4).

[표 3]

IL2-RA에 대한 친화도

[표 4]

IL2-RB에 대한 친화도

실시예 5 - 크기 배제 크로마토그래피

IL-2 변이체를 HPLC(Agilent Technologies, 1260 인피니티 II LC 시스템) 및 크기 배제 컬럼(Tosoh, TSKgel G3000 SWXL, 7.8 × 300 mm, Part No.0008541, Column No.004E04320E)을 사용하여 분석하였다. PBS pH 7.4를 포함하는 용리액을 HPLC 기기를 작동시키는 동안 이동상에 사용하였다. 겔 여과 표준(BIO-RAD, Cat. #151-1901)을 대조군으로 사용하였다(도 3a 내지 도 3g).

실시예 6 - IL2_V4로부터의 추가 IL-2 변이체

추가 IL-2 변이체를 실시예 1에 기재된 바와 같이 생산하였다. 추가 IL-2 변이체의 서열을 표 5에 나타내었다.

[표 5]

실시예 7 - 추가 IL-2 변이체의 분석 및 특성분석

추가 IL-2 변이체를 플라스미드에 삽입하고 Expi293 발현 시스템(Invitrogen)을 사용하여 IL-2 단백질을 생산하는데 사용하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 단백질을 분석하고 특성분석하였다. 결과를 표 6에 나타내었다.

[표 6]

실시예 8 - SDS-PAGE를 통한 단백질 분석

추가의 IL-2 변이체를 LDS 샘플 완충액(Invitrogen, Cat#B0007)에 첨가하였고, 여기서 샘플 환원제(Invitrogen, Cat#B0004)를 환원 조건군에 첨가하고 70℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 실시예 3에 기술된 바와 같이 준비된 샘플에 SDS 러닝 완충액(Bio-rad, Cat#1610732)을 첨가하고 Mini-PROTEIN TGX Stain-Free Gel(Bio-rad, Cat#456-8096)을 사용하여 샘플을 30분 동안 러닝하였다. 결과를 Chemidoc(Bio-rad)를 사용하여 분석하였다(도 4).

실시예 9 - IL-2 수용체에 대한 친화도 분석

IL-2 수용체, IL2-RA 및 IL2-RB에 대한 추가의 IL-2 변이체의 친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)을 사용하여 분석하였다. IL-2 변이체를 2 μg/mL의 농도로 희석한 다음 CM5 칩(GE Healthcare, Cat#BR-1 005-30)에 고정화하였다. Biacore T200(GE Healthcare)을 사용하여 각 IL-2 변이체의 친화도를 측정하고 분석하였으며, 결과를 실시예 4에 기술된 바와 같이, BIAevaluation 소프트웨어에 의해 1:1 결합 모델로 분석하였다. 결과가 표 7 및 표 8에 제시되어 있다.

[표 7]

IL2-RA에 대한 친화도

[표 8]

IL2-RB에 대한 친화도

실시예 10 - 크기 배제 크로마토그래피

추가의 IL-2 변이체를 HPLC(Agilent Technologies, 1260 인피니티 II LC 시스템) 및 크기 배제 컬럼(Tosoh, TSKgel G3000 SWXL, 7.8 × 300 mm, Part No.0008541, Column No.004E04320E)을 사용하여 분석하였으며, 여기서 실시예 5에 기술된 바와 같이, PBS pH 7.4를 포함하는 용리액을 HPLC 기기를 작동시키는 동안 이동상에 사용하였다. 겔 여과 표준(BIO-RAD, Cat. #151-1901)을 대조군에 대해 사용하였다(도 5a 내지 도 5d).

실시예 11 - 생체 내 마우스 모델에서 IL-2 변이체의 효능 분석

동물 쥐의 대장암 세포주인 MC38 세포를 C57BL/6 마우스(0.5 × 10⁶ 세포/두부)에 피하 주사하고 약 2주 후에 종양이 육안으로 볼 수 있는 크기에 도달하면, 종양의 크기를 TM900 종양 자동-계산기 소프트웨어를 사용하여 측정하였다(도 6a 내지 도 6g).

마우스를 IL2 변이체, IL-2 WT, IL-2 V4, IL-2 V4_R38A, IL-2 V4_F42A 및 IL-2 V4_R38A/F42A로 처리할 5개 군으로 나누었다. IL2 돌연변이 단백질을 종양 접종 2주 후, 총 3회의 주사에 대해 1일차, 5일차 및 10일차에 주사하였다(20 μg/개체).

마지막 주사 후 4일차에 마우스로부터 안와채혈(Retro-orbital blood)로 혈액을 수집하였다. 채혈 시 100 μl의 혈액을 수집하여 50 μl을 5 mL FACS 튜브에 넣고, 30분 간 형광항체를 처리하였다. 1.5 mL의 1× RBC 용해 완충액을 첨가하고 10분 동안 인큐베이션하였다. 원심분리기를 이용하여 2,000 rpm으로 4분간 원심분리한 후, 상등액을 모두 버렸다. 2 mL의 FACS 세척 완충액을 튜브에 첨가하고 2,000 rpm에서 4분 동안 원심분리를 수행하였다. 그런 다음 이 과정을 두 번 더 반복하고 FACS 분석기를 사용하여 샘플을 분석하였다.

마우스 조절 T 세포(T _reg ) 분석

혈액에서 T 세포를 얻기 위해, 1.5 mL 원심분리 튜브에 300 μL의 Ficoll-Paque 배지를 첨가한 Ficoll 분리를 수행하였다. 위의 혈액 샘플을 Ficoll-Paque 배지 용액에 조심스럽게 쌓은 다음, 8,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 림프구를 포함하는 불투명한 흰색 층을 수집하고 5 mL FACS 튜브로 옮기고, 여기에 3 mL의 1x DPBS 완충액을 첨가한 다음 2,000 rpm에서 4분 동안 원심분리하였다. 완충액을 버린 후, 샘플을 실온에서 30분 동안 표면 마커 형광 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 2 mL의 FACS 완충액을 튜브에 첨가하고 2,000 rpm에서 4분 동안 원심분리한 후 완충액을 버렸다. 1 mL의 1× 고정/펌 완충액을 각 튜브에 분취하고 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 3 mL의 1× 펌 완충액을 각 튜브에 첨가하고 4분 동안 2,000 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 버린 후, 100 μL의 1× 펌 완충액과 3 μL의 마우스 항-Foxp3 항체를 튜브에 넣고 실온에서 15분간 반응시켰다. 1× 펌 완충액의 추가를 한 번 더 반복하였다. 이어서, 혈액 내 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 Treg 세포의 백분율을 측정하는 FACS를 사용하여 샘플을 분석하였다(도 7a 내지 7b, 도8a 내지 8b, 도9a 내지 9c, 도10a 내지 10b, 도11a 내지11b, 및 도17a).

종양 수집 및 종양 침윤 림프구(TIL) 분석

종양으로부터의 조직을 수집하고 RPMI1640 배지 및 종양 해리 키트의 효소 혼합물을 함유하는 gentleMACS C 튜브로 옮겼다. GentleMACS 프로그램 37C_h_TDK_1을 1시간 동안 실행한 후, 샘플을 1x DPBS 완충액에 재현탁시키고 세포 현탁액을 50 mL 튜브에 놓인 세포 여과기(메시 크기 70 μm)에 적용하였다. 그런 다음 샘플을 세포 여과기(메쉬 크기 40 μm)에 적용하고 종양 침윤 림프구만 단리될 때까지 상기 단계를 반복하였다. 2,000 rpm에서 4분간 원심분리한 후, 상등액을 버리고 ACK 용해 완충액 5 mL을 첨가하고 실온에서 10분간 인큐베이션하였다. 50 μL의 마우스 혈액을 수집하고 5 mL FACS 튜브로 옮기고 2,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포를 RPMI1640 배지 10 mL에 재현탁시켰다. 그런 다음 혈액 샘플을 Ficoll-Paque 배지 용액에 조심스럽게 쌓은 다음, 2,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 종양 침윤 림프구(TIL)를 함유하는 불투명한 백색 층을 수집하고 50 mL 튜브로 옮겼고, 여기서 20 mL의 1x DPBS 완충액을 첨가한 다음, 2,000 rpm에서 4분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버린 후, 샘플을 실온에서 30분 동안 표면 마커 형광 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 2 mL FACS 완충액을 튜브에 첨가하고 4분 동안 2,000 rpm에서 원심분리하고, 여기서 상등액을 버리고 샘플을 FACS 분석기를 사용하여 분석하였으며, 여기서 종양 침윤 림프구 중의 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 및 Treg 세포의 퍼센트를 측정하였다(도 12a 내지 12b, 도13a 내지 13b, 도14a 내지 14c, 도15a 내지 15b, 도16a 내지 16b, 및 도17b).

마우스 모델에서 독성 분석

폐 부종의 발생은 IL-2 요법과 관련이 있기 때문에, IL2 변이체의 독성을 마우스에서 폐 조직과 혈액을 수집하여 분석하였다. 폐 조직 중량을 측정하고 각 군별로 비교하여 독성을 분석하였다(도 18a 내지 18b). 또한, 마우스로부터 채혈한 혈액을 4℃에서 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 상등액을 FUJI DRI-CHEM NX500i 튜브에 옮겨 알라닌 아미노트랜스퍼라제(GPT), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(GOT), 혈액 요소 질소(BUN) 및 총 빌리루빈(T-BIL) 수치를 측정하였다(도 19a 내지 19d).

SEQUENCE LISTING <110> Eutilex Co., Ltd. <120> IL-2 VARIANTS <130> 47683-0045WO1 <150> 63/050,068 <151> 2020-07-09 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 399 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcgccgacca gctcatctac aaagaagact caacttcaac tggaacatct gctgcttgat 60 ctccaaatga ttctcaacgg tatcaacaat tacaaaaacc caaaattgac cagaatgttg 120 acatttaagt tttacatgcc gaaaaaggca acagagctga agcacttgca gtgtcttgaa 180 gaagagctga aaccacttga agaggttctg aacctggcac agagcaaaaa ttttcacctt 240 aggccgcgcg acctcattag taacattaat gtcattgtgc ttgagctgaa aggttccgag 300 acgactttca tgtgcgagta tgccgacgaa acggcaacaa tagtcgaatt tcttaaccga 360 tggattacgt tttgtcaaag tataataagt acgctcaca 399 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu 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Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Lys Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 gcgccgacca gcagcagcac caaaaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggat 60 ctgcagatga ttctgaacgg cattaacaac tataaaaacc cgaaactgac cgcgatgctg 120 accaaaaaat tttatatgcc gaaaaaagcg accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180 gaagaactga aaccgctgga agaagtgctg aacctggcgc agagcaaaaa ctttcatttc 240 cgcccgcgcg atgtggttag caacattaac gtgtttgtgc tggaactgaa aggcagcgaa 300 accaccttta tgtgcgaata tgcggatgaa accgcgacca ttgtggaatt tctgaaccgc 360 tggattacct tttgccagag cattattagc accctgacc 399 <210> 6 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Lys Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 7 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 gcgccgacca gcagcagcac caaaaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggat 60 ctgcagatga ttctgaacgg cattaacaac tataaaaacc cgaaactgac cgcgatgctg 120 accaaaaaat tttatatgcc gaaaaaagcg accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180 gaagaactga aaccgctgga agaagtgctg aacctggcgc agagcaaaaa ctttcatttc 240 gacccgcgcg atctggttag caacattaac gtgtttgtgc tggaactgaa aggcagcgaa 300 accaccttta tgtgcgaata tgcggatgaa accgcgacca ttgtggaatt tctgaaccgc 360 tggattacct tttgccagag cattattagc accctgacc 399 <210> 8 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 8 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Lys Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Leu Val Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 9 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 9 gcgccgacca gcagcagcac caaaaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggat 60 ctgcagatga ttctgaacgg cattaacaac tataaaaacc cgaaactgac cgcgatgctg 120 accaaaaaat tttatatgcc gaaaaaagcg accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180 gaagaactga aaccgctgga agaagtgctg aacctggcgc agagcaaaaa ctttcatttc 240 gacccgcgcg atgtgattag caacattaac gtgtttgtgc tggaactgaa aggcagcgaa 300 accaccttta tgtgcgaata tgcggatgaa accgcgacca ttgtggaatt tctgaaccgc 360 tggattacct tttgccagag cattattagc accctgacc 399 <210> 10 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 10 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Lys Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Ile Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 11 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 gcgccgacca gcagcagcac caaaaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggat 60 ctgcagatga ttctgaacgg cattaacaac tataaaaacc cgaaactgac cgcgatgctg 120 accaaaaaat tttatatgcc gaaaaaagcg accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180 gaagaactga aaccgctgga agaagtgctg aacctggcgc agagcaaaaa ctttcatttc 240 gacccgcgcg atgtggttag caacattaac gtgattgtgc tggaactgaa aggcagcgaa 300 accaccttta tgtgcgaata tgcggatgaa accgcgacca ttgtggaatt tctgaaccgc 360 tggattacct tttgccagag cattattagc accctgacc 399 <210> 12 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 12 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Lys Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Val Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 13 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 gcgccgacca gcagcagcac caaaaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggat 60 ctgcagatga ttctgaacgg cattaacaac tataaaaacc cgaaactgac cgcgatgctg 120 accttcaaat tttatatgcc gaaaaaagcg accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180 gaagaactga aaccgctgga agaagtgctg aacctggcgc agagcaaaaa ctttcatttc 240 gacccgcgcg atgtgattag caacattaac gtgtttgtgc tggaactgaa aggcagcgaa 300 accaccttta tgtgcgaata tgcggatgaa accgcgacca ttgtggaatt tctgaaccgc 360 tggattacct tttgccagag cattattagc accctgacc 399 <210> 14 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 14 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Ile Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 15 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 gcgccgacca gcagcagcac caaaaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggat 60 ctgcagatga ttctgaacgg cattaacaac tataaaaacc cgaaactgac ccgcatgctg 120 accgcgaaat tttatatgcc gaaaaaagcg accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180 gaagaactga aaccgctgga agaagtgctg aacctggcgc agagcaaaaa ctttcatttt 240 gatccgcgcg atgtgattag caacattaac gtgtttgtgc tggaactgaa aggcagcgaa 300 accaccttta tgtgcgaata tgcggatgaa accgcgacca ttgtggaatt tctgaaccgc 360 tggattacct tttgccagag cattattagc accctgacc 399 <210> 16 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 16 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Ile Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 17 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 gcgccgacca gcagcagcac caaaaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggat 60 ctgcagatga ttctgaacgg cattaacaac tataaaaacc cgaaactgac cgcgatgctg 120 accgcgaaat tttatatgcc gaaaaaagcg accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 180 gaagaactga aaccgctgga agaagtgctg aacctggcgc agagcaaaaa ctttcatttc 240 gacccgcgcg atgtgattag caacattaac gtgtttgtgc tggaactgaa aggcagcgaa 300 accaccttta tgtgcgaata tgcggatgaa accgcgacca ttgtggaatt tctgaaccgc 360 tggattacct tttgccagag cattattagc accctgacc 399 <210> 18 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 18 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Phe 65 70 75 80 Asp Pro Arg Asp Val Ile Ser Asn Ile Asn Val Phe Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 19 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 agcaacacta aagtcgacaa gcgagtagaa ccgaaatcat gcgacaaaac acatacgtgc 60 cctccctgcc cagcaccacc tgtcgcgggc ccctctgttt tcctgtttcc acccaagcca 120 aaggacacat tgatgatttc ccggactcct gaagtcacct gcgtggtagt agatgtatca 180 catgaagatc cagaagtcca gttcaactgg tatgtggacg gagtagaggt acataatgcc 240 aagaccaaac cacgggaaga gcagttcaac agtactttcc gggtagttag cgttttgact 300 gtcgtacacc aagactggct taatggaaaa gaatacaagt gtaaggtaag caacaagggc 360 ctgccggctc cgatagagaa aaccattagc aagacaaagg gccaaccacg cgaaccccag 420 gtatataccc tcccaccgtc ccgcgaggag atgactaaga atcaagtttc tctcacgtgc 480 ttggtaaagg gcttctatcc gagcgatata gccgtggagt gggagtctaa tggtcagccc 540 gaaaacaatt acaaaactac gcctcctatg ctggacagtg atgggagctt ctttctttac 600 agtaagctta ccgtggacaa gtctcggtgg caacaaggaa atgtttttag ttgttctgta 660 atgcatgaag cacttcataa ccattacacc cagaaaagtc tgagcttgtc cccgggaaaa 720 <210> 20 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 20 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 1 5 10 15 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 20 25 30 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 35 40 45 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 50 55 60 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 65 70 75 80 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 85 90 95 Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 100 105 110 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 115 120 125 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 130 135 140 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 145 150 155 160 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 165 170 175 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp 180 185 190 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 195 200 205 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 210 215 220 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 235 240

Claims

SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 인터류킨(IL)-2 단백질.
제1항에 있어서,
상기 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 4를 포함하는, 단백질.
제1항에 있어서,
상기 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 6을 포함하는, 단백질.
제1항에 있어서,
상기 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 8을 포함하는, 단백질.
제1항에 있어서,
상기 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 10을 포함하는, 단백질.
제1항에 있어서,
상기 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 12를 포함하는, 단백질.
제1항에 있어서,
상기 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 14를 포함하는, 단백질.
제1항에 있어서,
상기 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 16을 포함하는, 단백질.
제1항에 있어서,
상기 인터류킨-2 단백질은 SEQ ID NO: 18을 포함하는, 단백질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
면역글로불린 Fc 영역을 추가로 포함하는, 단백질.
제10항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 영역은 SEQ ID NO: 20을 포함하는, 단백질.
제11항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 결합에 의해 인터류킨-2 단백질에 연결되는, 단백질.
제12항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 링커 서열에 의해 인터류킨-2 단백질에 연결되는, 단백질.
제13항에 있어서,
상기 인터류킨-2 단백질은 면역글로불린 Fc 영역의 카복시-말단에 연결되는, 단백질.
인터류킨(IL)-2 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로서,
상기 IL-2 단백질은 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 약학 조성물.
IL-2 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산으로서,
상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산.
제16항에 있어서,
면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
제17항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 영역을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 19를 포함하는, 핵산.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 3을 포함하는, 핵산.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 5를 포함하는, 핵산.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 7을 포함하는, 핵산.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 9를 포함하는, 핵산.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 11을 포함하는, 핵산.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 13을 포함하는, 핵산.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 15를 포함하는, 핵산.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 IL-2 단백질을 코딩하는 서열은 SEQ ID NO: 17을 포함하는, 핵산.
IL-2 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터로서,
상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는, 벡터.
제27항에 있어서,
상기 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함하는, 벡터.
제28항에 있어서,
상기 프로모터는 구성적 프로모터인, 벡터.
제28항에 있어서,
상기 프로모터는 유도성 프로모터인, 벡터.
제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
제31항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
IL-2 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 약학 조성물로서,
상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
IL-2 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 세포로서,
상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포.
세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물로서,
상기 세포는 IL-2 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
하기 단계를 포함하는 IL-2 단백질의 생산 방법:
(a) IL-2 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 IL-2 단백질이 발현하기에 충분한 조건 하의 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, 또는 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계; 및
(b) 세포 및/또는 배양 배지로부터 IL-2 단백질을 회수하는 단계.
대상체에서 암을 치료하기 위한 방법으로서,
상기 방법은 대상체에 치료 유효량의 제15항, 제33항, 또는 제35항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제37항에 있어서,
암은 암종(carcinoma), 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma), 백혈병, 평편 세포 암종(squamous cell carcinoma), 소 세포 폐암, 비-소 세포 폐암, 폐 선암종, 폐의 평편 세포 암종, 복막암, 간세포 암종, 위암, 췌장암, 신경교종(glioma), 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 기타 림프증식성 장애, 또는 다양한 유형의 두경부암인, 방법.
제37항에 있어서,
암은 고형 종양인, 방법.
제37항에 있어서,
암은 결장직장암인, 방법.
제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체는 이온화 방사선, 화학요법제, 치료용 항체, 및 면역체크포인트 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 항암 요법을 이전에 투여받은, 방법.
제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체는 암을 갖는 것으로 확인되거나 진단되는, 방법.
대상체에서 기억 CD8+ T 세포를 증가시키는 방법으로서,
상기 방법은 대상체에 치료 유효량의 제15항, 제33항, 또는 제35항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
대상체에서 CD8+ T 세포를 증가시키는 방법으로서,
상기 방법은 대상체에 치료 유효량의 제15항, 제33항, 또는 제35항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
대상체에서 고형 종양 내 Treg 세포를 감소시키는 방법으로서,
상기 방법은 대상체에 치료 유효량의 제15항, 제33항, 또는 제35항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
대상체에서 고형 종양의 증식 속도를 감소시키는 방법으로서,
상기 방법은 대상체에 치료 유효량의 제15항, 제33항, 또는 제35항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
대상체에서 고형 종양의 부피를 감소시키는 방법으로서,
상기 방법은 대상체에 치료 유효량의 제15항, 제33항, 또는 제35항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.