KR20230060527A - Pd-1 폴리펩티드 변이체 - Google Patents

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Abstract

PD-L1에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인, 및 막관통 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 PD-1 폴리펩티드 변이체가 제공된다. 본 개시내용은 또한, 면역글로불린 Fc 영역, 및 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 PD-1 Fc 융합 단백질을 제공한다.

Description

PD-1 폴리펩티드 변이체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 8일에 출원된 US 63/075,641에 대하여 우선권을 주장하며, 그의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
암은 여전히 세계에서 주요 사망 원인 중 하나이다. 최근 통계에 따르면, 세계 인구의 13%가 암으로 사망한다고 보고되어 있다. 국제 암 연구기관(IARC)의 추산에 따르면, 2012년에 전 세계적으로 1,410만 건의 새로운 암 사례와 820만 건의 암 사망이 발생했다. 2030년까지 인구 증가와 고령화, 흡연, 건강에 해로운 식습관 및 신체 활동부족과 같은 위험 요인에 대한 노출로 인해 전 세계적으로 암 발생 건수는 2,170만 건, 암으로 인한 사망 건수는 1,300만 건으로 증가할 것으로 예상된다. 또한, 암 치료를 위한 통증과 의료비는 암 환자와 그 가족 모두의 삶의 질을 저하시키는 원인이 된다.
프로그램된 세포사 단백질 1(PD-1)은 면역 체계를 하향조절하여 면역 체계 반응을 조절하고 T 세포 염증 활동을 억제하여 자기-내성을 촉진하는 역할을 하는 면역 관문 수용체이다. PD-1은 암에서 과발현되어 T-세포 고갈 증가 및 항종양 반응 감소로 이어지기 때문에, PD-1/PD-L1 억제 경로를 차단하여 T 세포 활성화를 강화하면 암과 같은 질환 치료에 큰 잠재력이 있다.
서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로그램된 세포사 1(PD-1) 폴리펩티드 변이체가 본원에 제공되며, 상기 PD-1 폴리펩티드 변이체는 하기를 포함한다: 프로그램된 세포사 1 리간드(PD-L1)에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인; 및 막관통 도메인 또는 이의 단편. 일부 실시형태에서, 상기 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 97% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4를 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 6을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 8을 포함한다.
본 발명에 사용되는 막관통 도메인은 서열번호 11의 아미노산 잔기 171-191에 상응하는 PD-1의 야생형 막관통 도메인 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 이들 값들에 의해 묶이는 모든 범위 및 하위 범위를 포함하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개의 아미노산 잔기를 포함하는 막관통 도메인의 단편이다. 예를 들어, 막관통 도메인 단편은 적어도 2개의 아미노산 잔기, 적어도 5개의 아미노산 잔기, 또는 적어도 10개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 11의 아미노산 잔기 171-172에 상응하는 2개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 11의 아미노산 잔기 171-173에 상응하는 3개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 11의 아미노산 잔기 171-174에 상응하는 4개의 아미노산 잔기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인은 서열번호 11의 아미노산 잔기 171-175에 상응하는 5개의 아미노산 잔기를 갖는다.
막관통 도메인 또는 이의 단편의 정의에 포함되는 것은 서열번호 11의 아미노산 잔기 171-191에 상응하는 PD-1의 야생형 막관통 도메인에 비해 변형되거나, 부가되거나, 치환될 수 있는 1, 2, 3, 4, 및 5개의 아미노산의 정수 값을 포함하는 1 내지 5개의 아미노산의 부가, 결실, 치환에 의해 변형된 서열번호 11의 아미노산 잔기 171-191에 상응하는 PD-1의 야생형 막관통 도메인의 변이체이다.
서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로그램된 세포사 1(PD-1) 폴리펩티드 변이체가 본원에 제공되며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖는다.
일부 실시형태에서, 폴리펩티드 변이체는 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 변이체는 약 1×10-8 내지 1×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 변이체는 약 1.10×10-9　M, 약 1.037×10-9　M, 또는 약 7.14×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역; 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결된 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 PD-1 Fc 융합 단백질이 본원에 제공되며, PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16, 또는 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역; 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결된 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 PD-1 Fc 융합 단백질이 본원에 제공되며, 상기 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체가 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖는다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역; 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결된 PD-1 폴리펩티드 변이체; 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 연결되는 항-4-1BB 항체에 대한 scFv 를 포함하는 Fc 융합 BsAb(이중특이적 항체)가 본원에 제공되며, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 를 포함하며, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 연결된 서열번호 17 및 18을 포함하는 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역; 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결된 PD-1 폴리펩티드 변이체; 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 연결된 항-4-1BB 항체에 대한 scFv를 포함하는 Fc 융합 BsAb(이중 특이적 항체)가 본원에 제공되며, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖고, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 연결된 서열번호 17 및 18을 포함하는 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16 또는 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 서열번호 22 또는 서열번호 23에 대해 적어도 70% 동일한 아미노산 서열이다.
본 발명의 BsAb 항체는 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 갖거나 효과를 갖지 않는다.
본 발명의 BsAb 항체는 간독성이 감소되거나 없음을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 약 1×10-8 내지 1×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 약 1.10×10-9　M, 약 1.037×10-9　M, 또는 약 7.14×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는다.
또한, PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산이 본원에 제공되며, 여기서 폴리펩티드 변이체는 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 서열을 추가로 포함하며, 여기서 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 서열은 서열번호 9를 포함한다.
또한, 본원에 제공된 핵산 중 임의의 하나를 포함하는 발현 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
또한, 본원에 제공된 PD-1 폴리펩티드 변이체 중 임의의 하나 또는 본원에 제공된 PD-1 융합 단백질 중 임의의 하나; 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
또한, 본원에 제공된 약제학적 조성물 중 임의의 하나를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 질환 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는 대상체의 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 실시형태에서, 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종, 및 전립선암으로부터 선택된다.
도 1은 인간 PD-1 단백질의 아미노산 서열(서열번호 11)을 나타낸다.
도 2는 야생형 PD-1(서열번호 2), PD-l.m7(서열번호 4), PD-l.m8(서열번호 6), 및 euPD-1(서열번호 8)에 대한 서열 정렬을 나타낸다.
도 3은 PD-1 변이체 Fc 융합 단백질에 대한 예시적인 재조합 발현 벡터의 구조를 나타낸다.
도 4는 PD-1 변이체 Fc 융합 단백질, PD-1 Fc 융합 단백질(1), PD-l.m7 Fc 융합 단백질(2), PD-l.m8 Fc 융합 단백질(3), 및 euPD-1 Fc 융합 단백질(4)에 의한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 5A~5E는 겔 여과 표준(도 5A), 야생형 PD-1 Fc 융합 단백질(도 5B), PD-l.m7 Fc 융합 단백질(도 5C), PD-l.m8 Fc 융합 단백질(도 5D), 및 euPD-1 Fc 융합 단백질(도 5E)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 나타낸다.
도 6은 PD-L1 고발현 세포주 MDA-MB-231(인간 유방암 세포) 및 PD-L1 저발현 세포주 MCF-7(인간 유방암 세포) 세포에서의 PD-L1의 발현 수준을 나타낸다.
도 7a는 PD-L1 양성 세포에서의 PD-1 Fc 세포 결합의 FACS 분석을 나타낸다.
도 7b는 PD-L1 음성 세포에서의 PD-1 Fc 세포 결합의 FACS 분석을 나타낸다.
도 8a 및 도 8c는 실시예 7의 분석 방법론을 나타낸다.
도 8b는 항원 PD-L1에 대한 euPD-1 Fc 융합 단백질, 야생형 PD-1 Fc 융합 단백질, 및 티쎈트릭(tecentriq)의 결합을 나타낸다.
도 8d는 항원 PD-L2에 대한 euPD-1 Fc 융합 단백질, 야생형 PD-1 Fc 융합 단백질, 및 티쎈트릭의 결합을 나타낸다.
도 9는 실시예 8에서의 PD-1 / PD-L1 차단 생물검정의 결과의 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예 9에 대한 생체내 효능 연구 대조군을 나타낸다.
도 11a, 도 11b, 도 11c, 및 도 11d는 실시예 9에서의 euPD-1 Fc 및 티쎈트릭에 대한 종양 크기 관찰 결과를 나타낸다.
도 12는 실시예 9에서의 간독성 지수 분석(ALT: 17-77 U/L(도 12a 및 도 12e), AST: 54-298 U/L(도 12b 및 도 12f), BUN: 8-33 mg/dL(도 12c 및 도 12g), T-BIL: 8-33 mg/dL(도 12d 및 도 12h))을 나타낸다.
도 13은 실시예 10에 기재된 euPD-1 및 항-4-1BB 항체를 사용한 Fc 융합 BsAB를 나타낸다.
도 14는 실시예 10에 기재된 euPD-1 및 항-4-1BB 항체를 사용한 Fc 융합 BsAB에 의한 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 15는 실시예 10에 기재된 euPD-1 및 항-4-1BB 항체를 사용한 Fc 융합 BsAB의 겔 여과 표준에 의한 크기 배제 크로마토그래피 그래프를 나타낸다.
도 16은 실시예 10에서의 euPD-1 BsAB 작제물의 SPR 결과를 나타낸다.
도 17a는 실시예 11에서 사용된 항원 결합 분석 방법을 나타낸다.
도 17b는 실시예 11에서의 항원 결합 결과를 나타낸다.
도 18은 실시예 12에서의 4-1BB/PD-1 조합 생물검정의 결과를 나타낸다.
본 개시내용은 PD-1 폴리펩티드의 변이체를 기술하며, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 PD-L1 분자에 대한 친화도를 증가시키는 야생형 PD-1 단백질의 돌연변이를 포함한다.
정의:
약: 용어 "약"은 본원에서 값과 관련하여 사용될 때, 참조된 값과 관련하여 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 문맥에 익숙한 당업자는 그 문맥에서 "약"에 의해 포함되는 관련 변이 정도를 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 이하의 참조된 값 이내인 값의 범위를 포함할 수 있다.
투여: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여"는 전형적으로 조성물이거나 조성물에 포함된 제제의 전달을 달성하기 위해 대상체 또는 시스템에 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 당업자는 적당한 환경에서, 대상체, 예를 들어 인간에게 투여하기 위해 사용될 수 있는 다양한 경로를 알고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 투여는 안구, 경구, 비경구, 국소 등일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 투여는 기관지(예를 들어, 기관지 점적에 의해), 협측, 진피(예를 들어, 진피에 대한 국소, 피부사이, 피내, 경피 등 중 하나 이상이거나, 포함할 수 있음), 경장, 동맥내, 피부사이, 위내, 골수내, 근육내, 비강내, 복강내, 척수강내, 정맥내, 심실내, 특정 기관내(예를 들어, 간내), 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(예를 들어, 기관내 점적에 의해), 질, 유리체 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 단 1회 용량을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 고정된 수의 용량의 적용을 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 간헐적(예를 들어, 시간적으로 분리된 복수의 용량) 및/또는 주기적(예를 들어, 공통 기간에 의해 분리된 개별 용량) 투여인 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투여(예를 들어, 관류)를 수반할 수 있다.
친화도: 당업계에 공지된 바와 같이, "친화도"는 특정 리간드가 그의 파트너에 결합하는 강도의 척도이다. 친화도는 다양한 방식으로 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화도는 정량적 분석으로 측정된다. 일부 상기 실시형태에서, 결합 파트너 농도는 생리학적 조건을 모방하기 위해 과량의 리간드 농도로 고정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 결합 파트너 농도 및/또는 리간드 농도는 다양할 수 있다. 일부 상기 실시형태에서, 친화도는 유사 조건(예를 들어, 농도) 하에서 친화도는 참조와 비교될 수 있다.
항체 제제: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 제제"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린 구조 요소를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 예시적인 항체 제제는 단클론성 항체, 다클론성 항체, 및 이의 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 당업계에 공지된 바와 같이, 인간화, 영장류화, 키메라 등의 하나 이상의 서열 요소를 포함할 수 있다. 많은 실시형태에서, 용어 "항체 제제"는 항체의 구조적 및 기능적 특징을 대안적인 표현으로 활용하기 위한 당업계에 공지되거나 개발된 작제물 또는 형식 중 하나 이상을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 실시형태에서, 본 발명에 따라 이용되는 항체 제제는 온전한 IgA, IgG, IgE, 또는 IgM 항체; 이중- 또는 다중- 특이적 항체(예를 들어, Zybodies®, 등); 항체 단편, 예컨대 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 이의 단리된 CDR 또는 세트; 단일 사슬 Fvs; 폴리펩티드-Fc 융합; 단일 도메인 항체(예를 들어, 샤크 단일 도메인 항체, 예컨대 IgNAR 또는 이의 단편); 카멜로이드 항체; 마스킹된 항체(예를 들어, Probodies®); Small Modular ImmunoPharmaceuticals("SMIPsTM"); 단일 사슬 또는 탠덤 디아바디(TandAb®); VHH; Anticalins®; Nanobodies® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®; Avimers®; DART; TCR-유사 항체; Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; 마이크로단백질; Fynomers®, Centyrins®; 및 KALBITOR®로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는 포맷으로 있다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 자연적으로 생성되는 경우 가질 공유 변형(예를 들어, 글리칸 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 공유 변형(예를 들어, 글리칸 부착, 페이로드[예를 들어, 검출 가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등], 또는 다른 펜던트 그룹[예를 들어, 폴리-에틸렌 글리콜 등]을 함유할 수 있다. 많은 실시형태에서, 항체 제제는 아미노산 서열이 상보성 결정 영역(CDR)으로서 당업자에 의해 인식되는 하나 이상의 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함하며; 일부 실시형태에서, 항체 제제는 그의 아미노산 서열이 참조 항체에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR(예를 들어, 적어도 하나의 중쇄 CDR 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDR)을 포함하는 폴리펩티드이거나, 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 참조 CDR과 비교하여 서열이 동일하거나 1~5개의 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 참조 CDR과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 참조 CDR과 적어도 96%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가 또는 치환된다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하지만, 포함된 CDR은 그렇지 않으면 참조 CDR의 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1~5개의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가 또는 치환된다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하지만, 포함된 CDR은 그렇지 않으면 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 치환된다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하지만, 포함된 CDR은 그렇지 않으면 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1~5개의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가 또는 치환된다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하지만, 포함된 CDR은 그렇지 않으면 참조 CDR과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 그의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 도메인으로서 당업자에 의해 인식되는 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 면역글로불린-결합 도메인과 상동성 또는 대체로 상동성인 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 키메라 항원 수용체(CAR)의 적어도 일부이거나 이를 포함한다.
항원: 용어 "항원"은, 본원에 사용된 바와 같이, 항체 제제에 결합하는 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항원은 항체 제제에 결합하고, 유기체에서 특정 생리학적 반응을 유도할 수 있거나 유도하지 않을 수 있다. 일반적으로, 항원은 예를 들어, 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, 중합체(생물학적 중합체[예를 들어, 핵산 및/또는 아미노산 중합체] 및 생물학적 중합체 이외의 중합체[예를 들어, 핵산 또는 아미노산 중합체 이외] 포함) 등과 같은 임의의 화학적 실체일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 글리칸이거나 글리칸을 포함한다. 당업자는 일반적으로 항원이 단리된 형태 또는 순수한 형태로 제공될 수 있거나, 대안적으로 미정제 형태(예를 들어, 다른 물질과 함께, 예를 들어 세포 추출물과 같은 추출물 또는 항원-함유 공급원의 기타 비교적 미정제인 제제에서)로 제공될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 특정 실시형태에서, 항원은 세포 맥락에서 존재한다(예를 들어, 항원은 세포의 표면에서 발현되거나 세포에서 발현된다). 일부 실시형태에서, 항원은 재조합 항원이다.
항원 결합 도메인: 본원에 사용된 바와 같이, 표적 모이어티 또는 실체에 특이적으로 결합하는 항체 제제 또는 그의 일부를 지칭한다. 전형적으로, 항원 결합 도메인과 그의 표적 사이의 상호작용은 비공유적이다. 일부 실시형태에서, 표적 모이어티 또는 실체는 예를 들어, 탄수화물, 지질, 핵산, 금속, 폴리펩티드, 또는 소분자를 포함하는 임의의 화학적 부류일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 폴리펩티드(또는 그의 복합체)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 융합 폴리펩티드의 일부이다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 키메라 항원 수용체(CAR)의 일부이다.
연관: 2개의 이벤트 또는 실체는 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것과 상관 관계가 있는 경우, 본원에서 사용되는 용어와 같이 서로 "연관"된다. 예를 들어, 특정 실체(예를 들어, 폴리펩티드, 유전자 서명, 대사산물, 미생물 등)는 그의 존재, 수준 및/또는 형태가 (예를 들어, 관련 집단 전체에 걸쳐) 질환, 장애 또는 병태의 발생률 및/또는 감수성과 연관된 경우, 특정 질환, 장애 또는 병태와 연관된 것으로 고려된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 실체는 그들이 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여 서로 물리적으로 근접하고 및/또는 근접하게 유지하는 경우 서로 물리적으로 "연관"된다. 일부 실시형태에서, 서로 물리적으로 연관된 2개 이상의 실체는 서로 공유 결합되며; 일부 실시형태에서, 서로 물리적으로 연관된 2개 이상의 실체는 서로 공유 결합되지 않고, 예를 들어 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자성 및 이들의 조합에 의해 비공유 결합된다.
결합: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "결합"은 전형적으로 2개 이상의 실체 사이의 또는 중의 비공유 결합을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. "직접" 결합은 실체 또는 모이어티 간의 물리적 접촉을 포함하며; 간접 결합은 하나 이상의 중간 실체와의 물리적 접촉을 통한 물리적 상호 작용을 포함한다. 2개 이상의 실체 사이의 결합은 전형적으로 상호작용하는 실체 또는 모이어티가 (예를 들어, 담체 실체와 공유적으로 또는 달리 연관되는 동안 및/또는 생물학적 시스템 또는 세포에서) 단독으로 또는 보다 복잡한 시스템의 맥락에서 연구되는 경우를 포함하여 다양한 맥락 중 임의의 것에서 평가될 수 있다.
암: 본원에 사용된 용어 "암", "악성", "신생물", "종양", 및 "암종"은 본원에서 상대적으로 비정상적이고 제어되지 않고/않거나 자율적인 성장을 나타내어, 세포 증식 조절의 현저한 상실을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타내는 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 종양은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성 및/또는 비전이성인 세포일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 그의 교시가 특히 관련될 수 있는 특정 암을 구체적으로 확인한다. 일부 실시형태에서, 관련 암은 고형 종양을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관련 암은 혈액 종양을 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 상이한 유형의 암의 예는 예를 들어, 백혈병, 림프종(호지킨 및 비호지킨), 골수종 및 골수증식성 장애를 포함하는 조혈암; 육종, 흑색종, 선종, 고형 조직의 암종, 입, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 간암, 비뇨생식기암, 예컨대 전립선암, 자궁경부암, 방광암, 및 자궁내막암, 및 신세포 암종, 골암, 췌장암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 두경부암, 유방암, 위장관암 및 신경계암, 양성 병변, 예컨대 유두종 등을 포함한다.
화학요법제: 용어 "화학요법제"는 본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 구체적으로 바람직하지 않은 세포 증식과 관련된 하나 이상의 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위해 이용되고/되거나 권장되는 제제를 포함하는, 하나 이상의 세포사멸촉진제, 세포정지제 및/또는 세포독성제를 지칭하는 당업계에서 이해되는 의미를 갖는다. 많은 실시형태에서, 화학요법제는 암 치료에 유용하다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 하나 이상의 알킬화제, 하나 이상의 안트라사이클린, 하나 이상의 세포골격 붕괴제(예를 들어, 탁산, 메이탄신 및 그의 유사체와 같은 미세소관 표적화제), 하나 이상의 에포틸론, 하나 이상의 히스톤 탈아세틸화제 억제제 HDAC), 하나 이상의 토포이소머라제 억제제(예를 들어, 토포이소머라제 I 및/또는 토포이소머라제 II의 억제제), 하나 이상의 키나제 억제제, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 전구체 유사체, 하나 이상의 펩티드 항생제, 하나 이상의 백금계 제제, 하나 이상의 레티노이드, 하나 이상의 빈카 알칼로이드, 및/또는 다음 중 하나 이상의 하나 이상의 유사체(즉, 관련 항증식 활성을 공유함)일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 화학요법제는 악티노마이신, 올-트랜스 레티노산, 아우이리스타틴, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카페시타빈, 시스플라틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 커큐민, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포시드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이리노테칸, 메이탄신 및/또는 이들의 유사체(예를 들어 DM1) 메클로레타민, 메르캅토푸린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 메이탄시노이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉시드, 테니포시드, 티오구아닌, 토포테칸, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 및 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 항체-약물 접합체와 관련하여 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 hLLl-독소루비신, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN-38, hLLl-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro-2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLLl-Pro-2-P-Dox, P4/D10-독소루비신, 젬투주맙 오조가미신, 브렌툭시맙 베도틴, 트라스투주맙 엠탄신, 이노투주맙 오조가미신, 글렘바투모맙 베도틴, SAR3419, SAR566658, BIIB015, BT062, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, 항-PSMA ADC, RG-7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, 보세투주맙 마포도틴, 및 로보투주맙 메르탄신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체에서 발견되는 것이다.
조작된: 일반적으로, 용어 "조작된"은 인간의 손에 의해 조작된 양태를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리펩티드 서열이 인간의 손에 의해 조작될 때 "조작된" 것으로 간주된다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 인간의 손에 의해 참조 폴리펩티드 서열에 도입된 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 인간의 손에 의해 하나 이상의 추가 폴리펩티드에 융합(즉, 공유 결합)되어 생체 내에서 자연적으로 발생하지 않는 융합 폴리펩티드를 형성한 폴리펩티드를 포함한다. 유사하게, 세포나 유기체는 유전 정보가 변경되도록 조작된 경우(예를 들어, 이전에 존재하지 않았던 새로운 유전 물질이, 예를 들어 형질전환, 짝짓기, 체세포 혼성화, 형질감염, 변환, 또는 기타 메커니즘에 의해 도입되는 경우, 또는 이전에 존재하는 유전 물질이 예를 들어 치환 또는 결실 돌연변이 또는 짝짓기 프로토콜에 의해 변경 또는 제거되는 경우) "조작되는" 것으로 고려된다. 통상의 관행이고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리펩티드 또는 세포의 유도체 및/또는 자손은 실제 조작이 이전 실체에서 수행되었음에도 불구하고 전형적으로 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.
약제학적 조성물: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 활성제가 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화되는 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인간 또는 동물 대상체에게 투여하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 활성제는 관련 집단에 투여될 때 미리 결정된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 요법으로 투여하기에 적절한 단위 용량으로 존재한다.
약제학적으로 허용 가능한 담체: 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는, 본원에 사용된 바와 같이, 일반적으로 약제학적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 담체, 예컨대 의도된 기능을 수행할 수 있도록 환자 내에서 또는 환자에게 본 발명에 유용한 화합물을 운반하거나 수송하는 데 관여하는, 액체 또는 고체 충전제, 안정화제, 분산제, 현탁제, 희석제, 부형제, 증점제, 용매 또는 캡슐화 물질의 당업계에서 인식되는 의미를 갖는다. 전형적으로, 이러한 작제물은 신체의 한 기관 또는 부분에서 신체의 다른 기관 또는 부분으로 운반되거나 수송된다. 각각의 담체는 본 발명에서 유용한 화합물을 포함하는 제형의 다른 성분과 양립가능하고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 또한, 본 발명 내에서 유용한 화합물의 활성과 양립할 수 있고 환자에게 생리학적으로 허용 가능한 임의의 및 모든 코팅제, 항균제 및 항진균제, 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 본 발명 내에서 유용한 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 실시에 사용되는 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 다른 추가 성분은 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, Pa.)]에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 일반적으로 조성물의 다른 성분과 상용성이 있고, 수혜자에게 유해하지 않고, 생물학적으로나 달리 바람직하지 않은 약제학적 조성물의 제조에 유용하다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 하나 이상의 담체를 포함한다. 실시형태는 국소, 안구, 비경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 설하, 비강 또는 경구 투여를 위한 담체를 포함한다. "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 또한 수성 분산액 및 주사용 멸균 분말 또는 분산액을 제조하기 위한 제제를 포함한다.
약제학적으로 허용 가능한 염: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 일반적으로 당업계에서 인식되는 의미를 가지며, 본원에 제공된 화합물의 유도체를 지칭하며, 여기서 모 화합물은 존재하는 산 또는 염기 모이어티를 그의 염 형태로 전환시킴으로써 변형된다. 약제학적으로 허용 가능한 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 광물 또는 유기산 염; 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염; 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 제공된 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 예를 들어, 무독성 무기산 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 무독성 염을 포함한다. 본원에 제공된 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 통상적인 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 이들 둘의 혼합물에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 조합함으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로, 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 사용될 수 있다. 적합한 염의 목록은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17thed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418 and Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)]에서 찾아볼 수 있으며, 이는 각각 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
부형제: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 일반적으로 당업계에서 인식되는 의미를 가지며, 약제학적 조성물의 제조에 유용한 생리학적으로 적합한 첨가제를 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제의 예는 예를 들어 문헌[Remington Pharmaceutical Science, 16th　Ed]에서 찾아볼 수 있다.
폴리펩티드: 용어 "폴리펩티드"는, 본원에 사용된 바와 같이, 일반적으로 적어도 3개의 아미노산의 중합체의 해당 분야에서 인식되는 의미를 갖는다. 당업자는 용어 "폴리펩티드"가 본원에 인용된 완전한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할 뿐만 아니라, 이러한 완전한 폴리펩티드의 기능적 단편(즉, 적어도 하나의 활성을 보유하는 단편)을 나타내는 폴리펩티드를 포함하도록 충분히 일반적인 것으로 의도됨을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 단백질 서열이 일반적으로 활성을 파괴하지 않고 일부 치환을 용인한다는 것을 이해한다. 따라서, 일반적으로 동일한 부류의 또 다른 폴리펩티드와 함께 활성을 유지하고 적어도 약 30~40% 전체 서열 동일성, 종종 약 50%, 60%, 70%, 또는 80%보다 큰 전체 서열 동일성을 공유하고, 일반적으로 하나 이상의 고도로 보존된 영역에서 90% 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 훨씬 더 높은 동일성의 적어도 하나의 영역을 추가로 포함하고 적어도 3~4개 및 종종 최대 20개 이상 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드는 본원에 사용된 바와 같이 관련 용어 "폴리펩티드"내에 포함된다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 모두를 함유할 수 있고 당업계에 공지된 임의의 다양한 아미노산 변형 또는 유사체를 함유할 수 있다. 유용한 변형은 예를 들어, 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "펩티드"는 일반적으로 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산, 또는 10개 미만의 아미노산의 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항체 제제, 항체 단편, 이의 생물학적 활성 부분 및/또는 이의 특성 부분이다.
재조합체: 본원에 사용된 바와 같이, 재조합체는 재조합 수단에 의해 설계, 조작, 준비, 발현, 생성, 제조 및/또는 단리된 폴리펩티드, 예컨대 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드; 재조합, 조합 인간 폴리펩타이드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드; 유전자 또는 유전자들, 또는 이의 하나 이상의 성분(들), 부분(들), 요소(들), 또는 도메인(들)을 암호화하고/하거나 이의 발현을 지시하는 유전자 성분들에 대해 트랜스제닉이거나, 그렇지 않으면 이들을 발현하도록 조작된, 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 양, 어류 등)로부터 단리된 폴리펩티드; 및/또는 선택된 핵산 서열 요소들을 서로 스플라이싱 또는 결찰하고/하거나, 선택된 서열 요소들을 화학적으로 합성하고/하거나, 그렇지 않으면 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 성분(들), 부분(들), 요소(들), 또는 도메인(들)을 암호화하고/하거나 이의 발현을 지시하는 핵산을 생성하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, 이러한 선택된 서열 요소들 중 하나 이상은 자연에서 발견된다. 일부 실시형태에서, 이러한 선택된 서열 요소들 중 하나 이상은 인 실리코 설계된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이러한 선택된 서열 요소들은 관심 공급원 유기체(예를 들어, 인간, 마우스 등)의 생식계열에서와 같은, 예를 들어 천연 또는 합성 공급원으로부터의 공지된 서열 요소의 (예를 들어, 생체 내 또는 시험관 내) 돌연변이유발로부터 생성된다.
특이적 결합: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 결합이 발생하는 환경에서 가능한 결합 파트너를 구별하는 능력을 지칭한다. 다른 잠재적인 표적이 존재할 때 하나의 특정 표적과 상호작용하는 결합제는 그것이 상호작용하는 표적에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 결합제와 그의 파트너 사이의 회합 정도를 검출하거나 결정함으로써 평가되고; 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 결합제-파트너 복합체의 해리 정도를 검출하거나 결정함으로써 평가되고; 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 그의 파트너와 또다른 실체 사이의 대안적 상호작용을 경쟁하는 결합제의 능력을 검출하거나 결정함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 농도 범위에 걸쳐 이러한 검출 또는 결정을 수행함으로써 평가된다.
대상체: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유동물(예를 들어, 인간, 일부 실시형태에서 태아기 인간 형태를 포함함)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 관련 질환, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징들을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 어떠한 증상이나 특징도 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태에 대한 감수성 또는 위험의 특징적인 하나 이상의 특징을 가진 사람이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여되어온 개체이다.
치료제: 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "치료제"는 일반적으로 유기체에 투여될 때 원하는 약리학적 효과를 이끌어내는 임의의 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 제제는 적절한 모집단에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 나타내는 경우 치료제로 간주된다. 일부 실시형태에서, 적절한 모집단은 모델 유기체 모집단일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 모집단은 특정 연령 그룹, 성별, 유전적 배경, 기존 임상 상태 등과 같은 다양한 기준에 의해 정의될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상들 또는 특징들의 완화, 개선, 경감, 억제, 예방, 개시 지연, 중증도 감소 및/또는 발생률 감소에 사용될 수 있는 물질이다. 일부 실시형태에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 시판되기 전에 정부 기관에 의해 승인되었거나 승인이 요구되는 제제이다. 일부 실시형태에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 의료 처방이 필요한 제제이다.
치료적 유효량: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 치료 투여 요법에 따라 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 집단에 투여될 때 질환, 장애 및/또는 병태를 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 발생률 및/또는 중증도를 감소시키고, 그의 하나 이상의 특징을 안정화시키고/시키거나 개시를 지연시키는 양이다. 당업자는 용어 "치료적 유효량"은 실제로 특정 개체에서 성공적인 치료가 달성될 것을 요구하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 치료적 유효량은 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 상당한 수의 대상체에서 특정한 원하는 약리학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "치료적 유효량"은 본 발명의 요법의 맥락에서 치료를 필요로 하는 개체에게 투여될 때 상기 개체에서 발생하는 암-지지 과정을 차단, 안정화, 약화 또는 역전시키거나, 상기 개체에서 암-억제 과정을 향상시키거나 증가시킬 양을 지칭한다. 암 치료의 맥락에서, "치료적 유효량"은 암으로 진단된 개체에게 투여될 때 개체에서 암의 추가 발달을 예방, 안정화, 억제 또는 감소시킬 양이다. 본원에 기재된 조성물의 특히 바람직한 "치료적 유효량"은 (치료적 치료에서) 췌장 암종과 같은 악성 종양의 발달을 역전시키거나, 악성 종양의 차도를 달성하거나 연장하는 데 도움을 준다. 그 개체의 암을 치료하기 위해 개체에게 투여되는 치료적 유효량은 차도를 촉진하거나 전이를 억제하기 위해 투여되는 치료적 유효량과 동일하거나 상이할 수 있다. 대부분의 암 요법과 마찬가지로, 본원에 기재된 치료 방법은 암에 대한 "치료"로 해석되지 않거나 제한되지 않거나 달리 제한되지 않으며; 오히려 치료 방법은 암을 "치료"하기 위한, 즉 암을 앓는 개체의 건강에 바람직하거나 유익한 변화를 일으키기 위한, 기재된 조성물의 용도에 관한 것이다. 이러한 이점은 종양학 분야의 숙련된 의료 제공자에 의해 인식되며, 환자 병태의 안정화, 종양 크기의 감소(종양 퇴행), 바이탈 기능의 개선(예를 들어, 암 조직 또는 기관의 기능 개선), 추가 전이의 감소 또는 억제, 기회 감염 감소, 생존 가능성 증가, 통증 감소, 운동 기능 개선, 인지 기능 개선, 에너지 느낌 개선(활력, 불쾌감 감소), 웰빙 느낌 개선, 정상 식욕 회복, 건강한 체중 증가 회복 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, (예를 들어, 본원에 기재된 치료의 결과로서) 개체에서 특정 종양의 퇴행은 또한 (예를 들어, 치료 과정에 걸쳐) 췌장 선암과 같은 종양 부위로부터 암 세포의 샘플을 취함으로써, 그리고 암세포의 상태를 모니터링하기 위해 대사 및 신호 마커 수준에 대해 암세포를 테스트하여 분자 수준에서 암세포가 덜 악성인 표현형으로 퇴행하는지 확인함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용함으로써 유도된 종양 퇴행은 상기 논의된 임의의 혈관신생 촉진 마커의 감소, 본원에 기재된 항혈관신생 마커의 증가, 대사 경로의 정상화(즉, 암에 걸리지 않은 정상인에게서 발견되는 상태로의 변경), 세포간 신호전달 경로, 또는 암 진단을 받은 개체에서 비정상적 활성을 나타내는 세포내 신호전달 경로를 발견함으로써 표시될 것이다. 당업자는 일부 실시형태에서, 치료적 유효량이 단일 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 예를 들어, 투여 요법의 일부로서 복수의 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있다.
변이체: 본원에 사용된 바와 같이, 분자, 예를 들어, 핵산, 단백질, 또는 소분자의 문맥에서, 용어 "변이체"는 예를 들어, 참조 실체와 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 부재 또는 수준에서 참조 분자와 유의미한 구조적 동일성을 나타내지만 참조 분자와 구조적으로 상이한 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 또한 그것의 참조 분자와 기능적으로 상이하다. 일반적으로, 특정 분자가 참조 분자의 "변이체"로 적절히 간주되는지 여부는 참조 분자와의 구조적 동일성 정도에 기반하여 결정된다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 분자는 특정한 특징적인 구조적 요소를 갖는다. 변이체는 정의상, 하나 이상의 그러한 특징적인 구조 요소를 공유하지만 참조 분자와 적어도 하나의 양태에서 상이한 별개의 분자이다. 단지 몇 가지 예를 들자면, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고/갖거나 특정 구조 모티프 및/또는 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있으며; 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 다른 것에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 99%인, 참조 폴리펩티드 또는 핵산과의 전체 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 생물학적 활성 중 하나 이상을 공유한다.
벡터: 본원에 사용된 바와 같이, 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는 추가 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다.
또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 추가 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공법, 리포펙션)에 표준 기술이 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 상기 기술들 및 과정들은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 더 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd　ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))]을 참조하며, 이는 본원에 임의의 목적을 위한 참조로 포함된다.
프로그램된 세포사 단백질 1(PD-1)
프로그램된 세포사 단백질 1(PD-1)은 활성화 동안 모든 T 세포에 의해 발현되는 억제 수용체이다. 기존의 T 세포에 의해 발현되는 것 외에도 PD-1은 조절 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 일부 골수 세포 집단에 의해 발현된다. PD-1은 급성 및 만성 감염, 암, 자가면역 및 면역 항상성을 포함한 다양한 생리학적 반응 동안 T 세포 효과기 기능을 조절한다.
또한, PD-1은 종종 항원과의 만남 동안 높고 지속적인 발현 수준을 나타내며, 이는 만성 감염 또는 암의 환경에서 발생할 수 있으며 보호 면역을 제한할 수 있다.
종양 미세환경에서, PD-1과 그의 리간드인 프로그램된 세포사 리간드 1(PD-L1)은 종양 중화 면역 감시를 피함으로써 종양 진행과 생존에 중요한 역할을 수행한다. PD-1 및 PD-L1 억제 경로를 차단하여 T 세포 활성화를 강화하면 광범위한 암 환자의 하위집합에서 유익한 항-종양 반응 및 장기 관해가 나타났다. 따라서, PD-L1과 PD-1의 상호작용을 차단하는 억제제를 사용하면, (예를 들어, T 세포에 대한) PD-1 자극을 방지하여 T 세포 기능 신호 및 면역 세포 반응을 증가시키는 데 도움이 될 수 있다.
일부 실시형태에서, 야생형 PD-1에 대한 특이적 돌연변이를 도입하여 PD-1 폴리펩티드 변이체를 생성하고, 여기서 특이적 돌연변이는 PD-L1에 대한 우선적인 결합을 유도한다. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 가용성 PD-1 단백질이다. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 세포외 도메인 및 막관통 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 막관통 도메인 또는 이의 단편은 본원에서 상기에 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인 및 막관통 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 변이체는 약 1×10-8 내지 1×10-10　M, 바람직하게는 약 1×10-9　내지 1×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 변이체는 약 1.10×10-9　M, 약 1.037×10-9　M, 또는 약 7.14×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "핵산"은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함하는 데 사용된다. 예시적인 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 리보핵산(RNA) 및/또는 데옥시리보핵산(DNA)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 핵산은 PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 서열을 포함하며, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7에 대해 95% 이상(96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
서열번호 1 - 인간 PD-1 야생형(뉴클레오티드 서열)
Figure pct00001
서열번호 2 - 인간 PD-1 야생형(아미노산)
Figure pct00002
서열번호 3 - PD-1 폴리펩티드 변이체 PD-l.m7(뉴클레오티드 서열)
Figure pct00003
서열번호 4 - PD-1 폴리펩티드 변이체 PD-l.m7(아미노산)
Figure pct00004
서열번호 5 - PD-1 폴리펩티드 변이체 PD-l.m8(뉴클레오티드 서열)
Figure pct00005
서열번호 6 - PD-1 폴리펩티드 변이체 PD-l.m8(아미노산)
Figure pct00006
서열번호 7 - PD-1 폴리펩티드 변이체 euPD-1(뉴클레오티드 서열)
Figure pct00007
서열번호 8 - PD-1 폴리펩티드 변이체 euPD-1(아미노산)
Figure pct00008
본원에 기재된 모든 실시형태에서, PD-1 변이체는 클로닝에 사용되는 제한 엔도뉴클레아제의 선택에서 발생하는 추가 잔기를 C-말단에 포함할 수 있다. 클로닝 선택으로부터 발생하는 추가 잔기가 1개, 2개, 3개 또는 4개의 잔기로 제한되고, 디펩티드 첨가, 바람직하게는 알라닌-세린 디펩티드로 제공되는 것이 바람직하다. 예를 들어 PD-1 폴리펩티드 변이체 그 자체로 또는 융합 작제물의 일부로서 사용될 때, euPD-1의 경우, 서열번호 8의 서열과 C-말단 AS 디펩티드가 본 발명에 포함된다. 이러한 서열은 본 발명의 PD-1 폴리펩티드 변이체에 대한 정의된 수준의 아미노산 서열 동일성에 의해 구상되고 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 변이체를 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖는다. 본 발명에는 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 약제학적 조성물을 투여함으로써 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 치료하는 방법이 포함된다.
본 실시형태의 변이체에서, 본 발명의 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 변이체를 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, Q99, L122, A125, A132, 및 R139에 돌연변이를 갖는다. 본 발명에는 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 약제학적 조성물을 투여함으로써 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 치료하는 방법이 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 변이체를 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139에 돌연변이를 갖는다. 본 발명에는 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 약제학적 조성물을 투여함으로써 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 치료하는 방법이 포함된다.
바람직한 돌연변이는 D26E, P34A, V43L, T45A, T59A, V64H, L65V, N66V, Y68H, M70E, N74G, K78T, C93H, Q99R, R114Q, L122Y, A125V, A132I, R139G를 포함한다.
Fc-융합 단백질 및 암호화 뉴클레오티드 서열
본원에 사용된 바와 같이, "Fc-융합 단백질"은 관심 폴리펩티드 또는 단백질에 연결된 IgG의 Fc 도메인으로 구성된 조작된 단백질을 지칭한다. Fc-융합 폴리펩티드 또는 단백질의 예는 단일 펩티드, 세포-표면 수용체 결합시 활성화되는 리간드, 신호전달 분자(예를 들어, 사이토카인), 이량체화시 활성화되는 수용체의 세포외 도메인, 및 단백질 마이크로어레이에서 결합 파트너를 식별하는데 사용되는 bait 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 항원 결합 도메인을 통해 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체 제제로서 작용한다. 일부 실시형태에서, Fc 융합 단백질은 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린 구조 요소를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 포함한다.
Fc는 IgG1 또는 이의 변이체, IgG2 또는 이의 변이체, IgG4 또는 이의 변이체, 뿐만 아니라 인간화 IgG1/2 또는 이의 변이체로부터 선택되는 불변 도메인이다. Fc는 Ig의 Y-자 구조 형성 및 구조 유지를 위한 이량체화, 및 Fc-매개 효과기 기능 및 혈청 반감기 연장에 여러 역할을 한다. 일부 실시형태에서, 모노머 Fc에는 2개의 도메인, 제2 불변 도메인(CH2) 및 제3 불변 도메인(CH3)이 있다. 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 Fc 도메인과 특정 펩티드 또는 단백질을 함께 융합시키는 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 결합에 의해 특정 펩티드 또는 단백질에 연결된다. 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 펩티드 링커 서열에 의해 특정 펩티드 또는 단백질에 연결된다. 일부 실시형태에서, 링커 서열은 (G4S)2(서열번호 19), (G4S)3 링커(서열번호 20), 또는 218 링커(서열번호 21)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 특정 펩티드 또는 단백질은 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결된다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 서열번호 10 또는 서열번호 16 또는 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 PD-1 융합 단백질을 생성하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, PD-1 융합 단백질은 PD-1 폴리펩티드 변이체 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, PD-1 Fc 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 영역, 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결된 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하며, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, PD-1 Fc 융합 단백질은 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시형태에서, PD-1 Fc 융합 단백질은 약 1×10-8 내지 1×10-10　M, 바람직하게는 약 1×10-9　내지 1×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는다. 일부 실시형태에서, PD-1 Fc 융합 단백질은 약 1.10×10-9　M, 약 1.037×10-9　M, 또는 약 7.14×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "핵산"은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함하는 데 사용된다. 예시적인 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 리보핵산(RNA) 및/또는 데옥시리보핵산(DNA)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 핵산 작제물은 면역글로불린 Fc 영역 및 PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인을 암호화하는 서열은 서열번호 9에 대해 95% 이상(예를 들어, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
서열번호 9 - Fc (207-230 IMGT 대립유전자 IGHGl*03, 231- 457 IMGT 대립유전자 IGHG2*01)
Figure pct00009
서열번호 10 - Fc (207-230 IMGT 대립유전자 IGHGl*03, 231- 457 IMGT 대립유전자 IGHG2*01) (아미노산)
Figure pct00010
위에 설명된 바와 같이, 본원에 기재된 모든 실시형태에서, PD-1 변이체는 클로닝에 사용되는 제한 엔도뉴클레아제의 선택에서 발생하는 추가 잔기를 C-말단에 포함할 수 있다. 클로닝 선택으로부터 발생하는 추가 잔기는 디펩티드 첨가, 바람직하게는 알라닌-세린 디펩티드와 함께 1, 2, 3 또는 4개의 잔기로 제한되는 것이 바람직하다. 예를 들어 PD-1 폴리펩티드 변이체 그 자체로 또는 융합 작제물의 일부로서 사용될 때, euPD-1의 경우, 서열번호 8의 서열과 C-말단 AS 디펩티드가 본 발명에 포함된다. 이러한 서열은 본 발명의 PD-1 폴리펩티드 변이체에 대한 정의된 수준의 아미노산 서열 동일성에 의해 구상되고 포함된다. 따라서, 본 실시형태의 융합 작제물에서 클로닝으로부터 발생하는 잔기는 링커 앞에 위치될 수 있다.
또한, PD-1 Fc 융합 단백질이 본 발명에 의해 포함되며, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체의 다중 복제본이 각각 링커에 의해 분리되어 존재한다. 용어 "PD-1 폴리펩티드 변이체의 다중 복제본"은 2, 3, 또는 4개의 PD-1 폴리펩티드 변이체가 존재할 수 있음을 의미하며, 여기서 존재하는 변이체는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 각각의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 분리하는 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, PD-1 폴리펩티드 변이체 사이의 링커는 PD-1 폴리펩티드 변이체와 관심 폴리펩티드 또는 단백질 사이의 링커와 상이할 수 있다.
일부 실시형태에서, PD-1 Fc 융합 단백질에 대한 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖는다. 본 발명에는 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 약제학적 조성물을 투여함으로써 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 치료하는 방법이 포함된다.
본 실시형태의 변이체에서, PD-1 Fc 융합 단백질에 대한 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, Q99, L122, A125, A132, 및 R139에 돌연변이를 갖는다. 본 발명에는 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 약제학적 조성물을 투여함으로써 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 치료하는 방법이 포함된다.
일부 실시형태에서, PD-1 Fc 융합 단백질에 대한 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139에 돌연변이를 갖는다. 본 발명에는 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 본 실시형태의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 약제학적 조성물을 투여함으로써 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 치료하는 방법이 포함된다.
바람직한 돌연변이는 D26E, P34A, V43L, T45A, T59A, V64H, L65V, N66V, Y68H, M70E, N74G, K78T, C93H, Q99R, R114Q, L122Y, A125V, A132I, R139G를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
4-1BB
4-1BB(CD137, TNFRSF9로도 지칭됨)는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 수퍼패밀리에 속하는 수용체이다. 4-1BB는 활성화된 T 림프구에서 일반적으로 발현되고 면역 및 자가면역 질환에 관여하는 보조자극 분자이다(문헌[Kwon et al. PNAS 84: 2896, 1987; Kwon et al. PNAS 86: 1963, 1989]; [Son et al. Journal of Immunological Methods 286 (1-2): 187-201, 2004], 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨). 인간 4-1BB는 255개 아미노산 단백질이며, 세포 표면에서 단량체(30 kDa) 및 이량체(55 kDa) 형태로 발현되며, 4-1BB 리간드로 삼합체화하여 신호전달한다.
또한, 4-1BB는 낮은 수준이지만 Foxp3+　Treg 및 수지상 세포(DC)를 포함하여 많은 세포에서 구성적으로 발현된다. 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-4), 다클론성 활성화제(예를 들어, Con A 및 PHA), 세포 표면 분자(예를 들어, 항-CD3, 항-CD28) 및 Ca2+　유도 및 PKC 활성 촉진제(예를 들어, 이오노마이신, photbol 미리스테이트 아세테이트)와 같은 여러 작용제로의 활성화는 4-1BB의 발현을 더욱 향상시킨다.
뮤린 및 인간 T 세포에 대한 수많은 연구는 4-1BB가 향상된 세포 증식, 생존 및 사이토카인 생산을 촉진한다는 것을 나타낸다. 연구에 따르면 일부 4-1BB 작용제 단클론성 항체는 보조자극 분자 발현을 증가시키고, 세포용해성 T 림프구 반응을 현저하게 향상시켜 예방 및 치료 환경에서 항-종양 효능을 나타낸다. 또한, 4-1BB 단일 요법 및 조합 요법 종양 모델은 내구성 있는 항-종양 보호 T 세포 기억 반응을 확립했다. 4-1BB 작용제는 또한 당업계에 인정된 다양한 자가면역 모델에서 자가면역 반응을 억제하는 것으로 나타났다. 4-1BB의 이러한 이중 활동은 면역 요법 접근법과 연관될 수 있는 자가면역 부작용을 약화시키면서 항-종양 활동을 제공할 가능성을 부여한다.
본원의 일부 실시형태에서, 융합 단백질은 면역글로불린 Fc 영역으로서 항-4-1BB 항체 도메인을 함유할 수 있다. 구체적으로, 항-4-1BB 항체 도메인은 단일 사슬 Fv(scFv)로서 항-4-1BB 항체 도메인(94kvt)을 보유하는 94kvt 클론(WO2018-127787, 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 사용하여 생성될 수 있다. 항-4-1BB 항체에 대한 적합한 scFv의 예로는, VH-218 링커-VL(HLC 218) 및 VL-218 링커-VH(LHC 218)가 있다. 94kvt VH 서열이 서열번호 17에 제시된 반면, 94kvt VL 서열은 서열번호 18에 제시되어 있고, 218 링커는 서열번호 21에 제시되어 있다. 또한, scFv 변이체 94kvt HLC 218은 서열번호 22에 제시되어 있으며, scFv 변이체 94kvt LHC 218은 서열번호 23에 제시되어 있다.
일부 실시형태에서, 단일 사슬 Fv(scFv)로서의 항-4-1BB 항체 도메인(94kvt)은 서열번호 22 또는 서열번호 23과 적어도 70% 동일한 (예를 들어, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 또는 100% 동일한) 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명의 실시형태는 면역글로불린 Fc 영역; 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결된 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 Fc 융합 BsAb(이중 특이적 항체)이며, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 연결된 항-4-1BB 항체에 대한 scFv를 포함하며, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 연결된 서열번호 17 및 18을 포함하는 아미노산 서열에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역; 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결된 PD-1 폴리펩티드 변이체; 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 연결된 항-4-1BB 항체에 대한 scFv를 포함하는 Fc 융합 BsAb(이중 특이적 항체)가 제공되며, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열;을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖고, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 연결된 서열번호 17 및 18을 포함하는 아미노산 서열에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 서열번호 22 또는 서열번호 23과 적어도 70% 동일한 (예를 들어, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 또는 100% 동일한) 아미노산 서열이다.
링커 서열의 예는 (G4S)2(서열번호 19), (G4S)3 링커(서열번호 20), 또는 218 링커(서열번호 21)를 포함한다.
본원에 기재된 이중 특이적 항체는 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대한 증가된 결합 친화도 및 4-1BB에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는다.
본 발명의 BsAb 항체는 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC)을 갖거나 효과를 갖지 않는다.
본 발명의 BsAb 항체는 간독성이 감소되었거나, 간독성이 없음을 나타낸다.
벡터
일부 실시형태에서, 상기 기재된 핵산 작제물은 당업계에 공지된 방법에 의해 발현 벡터 또는 바이러스 벡터에 삽입될 수 있고, 핵산 분자는 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 벡터의 비제한적 예는 플라스미드 벡터, 트랜스포존 벡터, 코스미드 벡터 및 바이러스 유래 벡터(예를 들어, 임의의 아데노바이러스 유래 벡터(AV), 사이토메갈로바이러스 유래(CMV) 벡터, 유인원 바이러스 유래(SV40) 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다.
클로닝 및/또는 발현에서 그들의 기능을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕거나, 폴리뉴클레오티드의 세포로의 도입을 개선하기 위해, 추가 서열이 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 부가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 핵산 분자는 적절한 세포에 도입될 때 본 개시내용의 PD-1 폴리펩티드 변이체 또는 PD-1 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터에 삽입된다.
치료 용도
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 PD-1 폴리펩티드 변이체, PD-1 Fc 융합 단백질, 또는 핵산 작제물은 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 PD-L1 연관 질환으로 진단된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 PD-L1 연관 암으로 진단된다. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체 또는 PD-1 Fc 융합 단백질, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물은 PD-L1 연관 질환으로 진단된 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 이온화 방사선, 화학요법제, 치료용 항체 및 관문 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가적인 항암 요법으로 투여될 수 있다.
PD-1/PD-L1 경로는 내인성 면역 항-종양 활성에 반응하여 종양 세포에 의해 사용되는 적응 면역 저항 메커니즘을 나타낸다. 종양 세포에서 발현된 PD-L1은 활성화된 T 세포의 PD-1 수용체에 결합하여 세포독성 T 세포를 억제한다. 일부 실시형태에서, PD-1 폴리펩티드 변이체는 비소세포 폐암, 폐 선암종, 위암 및 유방암을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 암을 치료하기 위한 PD-L1 억제제로서 사용된다.
암은 신체에서 비정상 세포의 통제되지 않는 성장을 특징으로 하는 광범위한 질환 그룹을 지칭할 수 있다. 조절되지 않은 세포 분열 및 성장은 이웃 조직을 침범하는 악성 종양을 형성하고 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 먼 부분으로 전이될 수도 있다. 암 또는 암 조직은 종양을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법에 의한 치료에 적합한 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 및 전립선암을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 의한 치료를 위한 암은 암종, 림프종(예를 들어, 호지킨 및 비호지킨 림프종), 모세포종, 육종, 및 백혈병을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 암은 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암종, 폐의 편평 세포 암종, 복막암, 간세포 암종, 위암, 췌장암, 신경아교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포 암종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암 또는 자궁암종, 타액암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암종, 백혈병 및 기타 림프증식성 장애 및 다양한 유형의 두경부암을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 암은 배아 종양(윌름스 종양, 간모세포종, 횡문근종, 신경모세포종), 생식 세포 종양(난황낭 종양, 미성숙 기형종 및 배아 암종), 암종(간세포 암종 및 폐 편평 세포 암종), 육종(악성 횡문근 종양 및 RMS), 또는 악성 흑색종일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 및 이중 특이적 항체는 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC) 효과가 관찰되거나, 효과가 관찰되지 않는다는 증가된 이점을 갖는다. 또한, 본 발명의 융합 단백질 및 이중 특이적 항체는 감소된 간독성을 갖거나, 간독성이 없다.
본 설명과 관련하여, 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 달리 표시되지 않는 한, 마치 완전히 설명된 것처럼 모든 목적을 위해 전체적으로 본원에 참조로 명시적으로 포함되며, 그 전체가 본 개시내용의 일부로 간주되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 전술한 설명은 당업자가 동일한 것을 제조하고 사용할 수 있도록 그것을 제조하고 사용하는 방식 및 방법을 제공하며, 이러한 가능은 특히 원 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 청구범위의 주제에 대해 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 "로 이루어진 군으로부터 선택되는," "로부터 선택된" 등의 문구는 특정 물질의 혼합물을 포함한다.
본원에 숫자 한계 또는 범위가 명시된 경우, 평가변수가 포함된다. 또한, 숫자 제한 또는 범위 내의 모든 값과 하위범위는 명시적으로 작성된 것처럼 구체적으로 포함된다.
상기 설명은 당업자가 본 발명을 이루고 사용할 수 있도록 제공되며, 특정 용도 및 그의 요구사항과 관련하여 제공된다. 바람직한 실시형태에 대한 다양한 수정은 당업자에게 명백할 것이며, 본원에서 정의된 일반적인 원리는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다른 실시형태 및 용도에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 제시된 실시형태에 제한되는 것이 아니라 본원에 개시된 원리 및 특징과 일치하는 가장 넓은 범위에 부여되어야 한다.
하기 특정 실시형태에 구애됨 없이, 본 발명은 다음과 같이 예시된다:
(1) 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로그램된 세포사 1(PD-1) 폴리펩티드 변이체로서,
상기 PD-1 폴리펩티드 변이체는:
프로그램된 세포사 1 리간드(PD-Ll)에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인; 및
막관통 도메인 또는 이의 단편
을 포함하는, 프로그램된 세포사 1(PD-1) 폴리펩티드 변이체.
(2) (1)에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 97% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(5) (1)에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4를 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(6) (1)에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 6을 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(7) (1)에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 8을 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(8) (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 막관통 도메인은 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(9) (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 막관통 도메인은 적어도 5개의 아미노산 잔기를 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(10) (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 막관통 도메인은 적어도 10개의 아미노산 잔기를 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(11) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 폴리펩티드 변이체는 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(12) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 폴리펩티드 변이체는 약 1×10-8 내지 1×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(13) (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 폴리펩티드 변이체는 약 1.10×10-9　M, 약 1.037×10-9　M, 또는 약 7.14×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(14) 면역글로불린 Fc 영역; 및
펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결된 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 PD-1 Fc 융합 단백질로서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(15) (14)에 있어서, 여기서 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(16) (14) 또는 (15)에 있어서, 여기서 융합 단백질은 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(17) (14) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 융합 단백질은 약 1×10-8 내지 1×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(18) (14) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 융합 단백질은 약 1.10×10-9　M, 약 1.037×10-9　M, 또는 약 7.14×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(19) (14) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(20) (14) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 펩티드 링커 서열은 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(21) (14) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체의 하나 초과의 복제본이 존재하고, 여기서 상기 복제본은 동일하거나 상이할 수 있고, 펩티드 링커 서열에 의해 연결되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(22) (21)에 있어서, PD-1 폴리펩티드 변이체의 2개의 복제본이 존재하는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(23) (21) 또는 (22)에 있어서, 여기서 펩티드 링커 서열은 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(24) (14) 내지 (23) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 PD-1 Fc 융합 단백질은 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 및 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(25) PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산으로서, 여기서 폴리펩티드 변이체는 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산.
(26) (25)에 있어서,
면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 서열을 추가로 포함하며, 여기서 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 서열은 서열번호 9를 포함하는, 핵산.
(27) (25) 또는 (26) 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
(28) (27)에 있어서, 여기서 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
(29) (1) 내지 (13) 중 어느 하나의 PD-1 폴리펩티드 변이체 또는 (14) 내지 (24) 중 어느 하나의 PD-1 융합 단백질; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체
를 포함하는, 약제학적 조성물.
(30) 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
(29)의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여, 질환 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
(31) (30)에 있어서, 여기서 대상체는 암을 갖는, 방법.
(32) (31)에 있어서, 여기서 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종, 및 전립선암으로부터 선택되는, 방법.
(33) (30) 내지 (32) 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물이 (14) 내지 (24) 중 어느 하나의 PD-1 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC) 효과가 관찰되거나, 효과가 관찰되지 않는, 방법.
(34) (30) 내지 (33) 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물이 (14) 내지 (24) 중 어느 하나의 PD-1 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 간독성이 관찰되거나, 간독성이 관찰되지 않는, 방법.
(35) 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로그램된 세포사 1(PD-1) 폴리펩티드 변이체로서, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖는, 프로그램된 세포사 1(PD-1) 폴리펩티드 변이체.
(36) (35)에 있어서, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, Q99, L122, A125, A132, 및 R139에 돌연변이를 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(37) (35)에 있어서, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139에 돌연변이를 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(38) (35) 내지 (37) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 상기 돌연변이는 D26E, P34A, V43L, T45A, T59A, V64H, L65V, N66V, Y68H, M70E, N74G, K78T, C93H, Q99R, R114Q, L122Y, A125V, A132I, 또는 R139G인, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(39) (35) 내지 (38) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 동일성에 대해 97% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(40) (35) 내지 (39) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 동일성에 대해 98% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(41) (35) 내지 (40) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 폴리펩티드 변이체는 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(42) (35) 내지 (41) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 폴리펩티드 변이체는 약 1×10-8 내지 1×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
(43) 면역글로불린 Fc 영역; 및
펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결된 (35) 내지 (42) 중 어느 하나의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 PD-1 Fc 융합 단백질.
(44) (43)에 있어서, 여기서 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(45) (43) 또는 (44)에 있어서, 여기서 융합 단백질은 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(46) (43) 내지 (45) 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 단백질은 약 1×10-8 내지 1×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(47) (43) 내지 (46) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(48) (43) 내지 (47) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 펩티드 링커 서열은 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(49) (43) 내지 (48) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체의 하나 초과의 복제본이 존재하고, 여기서 상기 복제본은 동일하거나 상이할 수 있고, 펩티드 링커 서열에 의해 연결되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(50) (49)에 있어서, PD-1 폴리펩티드 변이체의 2개의 복제본이 존재하는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(51) (49) 또는 (50)에 있어서, 여기서 펩티드 링커 서열은 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
(52) (35) 내지 (51) 중 어느 하나의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
(53) (52)에 있어서,
면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
(54) (52) 또는 (53)의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
(55) (54)에 있어서, 여기서 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
(56) (35) 내지 (42) 중 어느 하나의 PD-1 폴리펩티드 변이체 또는 (43) 내지 (51) 중 어느 하나의 PD-1 융합 단백질; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체
를 포함하는 약제학적 조성물.
(57) 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
(56)의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여, 질환 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
(58) (57)에 있어서, 여기서 대상체는 암을 갖는, 방법.
(59) (58)에 있어서, 여기서 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종, 및 전립선암으로부터 선택되는, 방법.
(60) (57) 내지 (59) 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물이 (43) 내지 (51) 중 어느 하나의 PD-1 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC) 효과가 관찰되거나, 효과가 관찰되지 않는, 방법.
(61) (57) 내지 (60) 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물이 (43) 내지 (51) 중 어느 하나의 PD-1 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 간독성이 관찰되거나, 간독성이 관찰되지 않는, 방법.
(62) 면역글로불린 Fc 영역;
펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결되는 PD-1 폴리펩티드 변이체로서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체; 및
펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 연결되는 항-4-1BB 항체에 대한 scFv로서, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 연결되는 서열번호 17 및 18을 포함하는 아미노산 서열에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항-4-1BB 항체에 대한 scFv; 를 포함하는 이중 특이적 항체.
(63) (62)에 있어서, 여기서 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이적 항체.
(64) (62) 또는 (63)에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결되는, 이중 특이적 항체.
(65) (62) 내지 (64) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 연결되는, 이중 특이적 항체.
(66) (62) 내지 (65) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 펩티드 링커 서열은 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중 특이적 항체.
(67) (62) 내지 (66) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 서열번호 22 또는 서열번호 23, 또는 서열번호 22 또는 서열번호 23과 적어도 70% 동일한 (예를 들어, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하는, 이중 특이적 항체.
(68) (62) 내지 (67) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 이중 특이적 항체는 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖고, 4-1BB에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는, 이중 특이적 항체.
(69) (62) 내지 (68) 중 어느 하나의 이중 특이적 항체; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
(70) 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
(69)의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여, 질환 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
(71) (70)에 있어서, 여기서 대상체는 암을 갖는, 방법.
(72) (71)에 있어서, 여기서 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종, 및 전립선암으로부터 선택되는, 방법.
(73) (70) 내지 (72) 중 어느 하나에 있어서, 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC) 효과가 관찰되거나, 효과가 관찰되지 않는, 방법.
(74) (70) 내지 (73) 중 어느 하나에 있어서, 감소된 간독성이 관찰되거나, 간독성이 관찰되지 않는, 방법.
(75) 면역글로불린 Fc 영역;
펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결되는 PD-1 폴리펩티드 변이체로서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖는, PD-1 폴리펩티드 변이체; 및
펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 연결되는 항-4-1BB 항체에 대한 scFv로서, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 연결되는 서열번호 17 및 18을 포함하는 아미노산 서열에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항-4-1BB 항체에 대한 scFv;
를 포함하는 이중 특이적 항체.
(76) (75)에 있어서, 여기서 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상(예를 들어, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이적 항체.
(77) (75) 또는 (76)에 있어서, 여기서 PD-1 폴리펩티드 변이체는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결되는, 이중 특이적 항체.
(78) (75) 내지 (77) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 연결되는, 이중 특이적 항체.
(79) (75) 내지 (78) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 펩티드 링커 서열은 서열번호 19, 서열번호 20, 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중 특이적 항체.
(80) (75) 내지 (79) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 서열번호 22 또는 서열번호 23, 또는 서열번호 22 또는 서열번호 23과 적어도 70% 동일한 (예를 들어, 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하는, 이중 특이적 항체.
(81) (75) 내지 (80) 중 어느 하나에 있어서, 여기서 이중 특이적 항체는 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖고, 4-1BB에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는, 이중 특이적 항체.
(82) (75) 내지 (81) 중 어느 하나의 이중 특이적 항체; 및
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
(83) 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
(82)의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여, 질환 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
(84) (83)에 있어서, 여기서 대상체는 암을 갖는, 방법.
(85) (84)에 있어서, 여기서 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종, 및 전립선암으로부터 선택되는, 방법.
(86) (83) 내지 (85) 중 어느 하나에 있어서, 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC) 효과가 관찰되거나, 효과가 관찰되지 않는, 방법.
(87) (83) 내지 (86) 중 어느 하나에 있어서, 감소된 간독성이 관찰되거나, 간독성이 관찰되지 않는, 방법.
실시예
본 개시내용은 청구범위에 기재된 개시내용의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예 1 - PD-1의 변이체
PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 PD-1 Fc 융합 단백질은 PD1- G4S 링커-Fc_pcDNA3.3 플라스미드를 사용하여 생성되었다. 인간 PD-1 단백질의 토폴로지는 표 1에 제시되어 있다. 인간 PD-1 및 PD-1 폴리펩티드 변이체의 서열은 도 1 및 도 2에 제시되어 있다. 또한, 각각의 PD-1 폴리펩티드 변이체에 대한 돌연변이는 표 2에 열거되어 있으며, 여기서 아미노산 잔기 번호는 도 1에 제시된 전장 인간 PD-1 야생형 서열(서열번호 11)과 관련되어 있다. PD-1 폴리펩티드 변이체는 도 1에 제시된 전장 인간 PD-1 야생형 서열(서열번호 11)의 세포외 도메인(24-170) 및 막관통 도메인의 일부(171-172)를 포함하도록 설계되었다. 구체적으로, PD-1 Fc 융합 단백질은 동물 세포 발현 벡터 pcDNA3.3을 사용하여 생성되며, 여기서 제한 효소들 EcoRI 및 BamHI가 제한 효소 부위에 삽입되었다. 인간 PD-1 신호 펩티드(서열 Q15116, 1-23)를 신호 펩티드로 사용하고, 207aa - 230aa IMGT 대립유전자 IGHGl*03, 231aa - 457aa IMGT 대립유전자 IGHG2*01을 Fc 영역으로 사용하였다. PD-1 Fc 융합 단백질을 암호화하는 DNA 작제물이 도 3에 제시되어 있다.
[표 1]
Figure pct00011
[표 2]
Figure pct00012
실시예 2 - PD-1 폴리펩티드 변이체 분석 및 특징화
PD-1 폴리펩티드 변이체를 플라스미드에 삽입하고, Expi293 발현 시스템(Invitrogen)을 사용하여 PD-1 Fc 융합 단백질을 생성하는데 사용하였다. 그런 다음, AktaPure(GE healthcare), 및 FibroPrismA 컬럼(GE healthcare, Cat#17-0618-01)을 사용하여 폴리펩티드 변이체를 정제하였다. 정제된 폴리펩티드 변이체를 탈염 컬럼(GE healthcare, Cat#17-1408-01)에 통과시키고, Multiskan GO(Thermo)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
결과는 표 3에 제시되어 있다.
[표 3]
Figure pct00013
실시예 3 - SDS-PAGE에 의한 PD-1 폴리펩티드 변이체 분석
PD-1 폴리펩티드 변이체를 LDS 샘플 완충액(Invitrogen, Cat#B0007)에 첨가하고, 여기서 샘플 환원제(Invitrogen, Cat#B0004)를 환원 조건군에 첨가하고, 70℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. SDS 러닝 완충액(Bio-rad, Cat#1610732)을 제조된 샘플에 첨가하고, 미니-단백질 TGX 무염색 겔(Bio-rad, Cat#456-8096)을 사용하여 30분 동안 샘플을 러닝시켰다. Chemidoc(Bio-rad)를 사용하여 결과를 분석하였다(도 4).
실시예 4 - PD-L1 분자에 대한 친화도 분석
PD-L1 분자에 대한 PD-1 폴리펩티드 변이체의 친화도는 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 분석하였다. PD-1 폴리펩티드 변이체를 2 μg/mL의 농도로 희석한 다음, CM5 칩(GE Healthcare, Cat#BR-1005-30) 상에 고정했다. PD-L1 분자(Sino, Cat#10084-H08H)를 농도 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 nM에서 150초의 결합 시간 및 240초의 해리 시간으로 주입하였다. Biacore T200(GE healthcare)을 사용하여 각 PD-1 폴리펩티드 변이체의 친화도를 측정하고 분석했다. 결과는 PD-1 폴리펩티드 변이체 euPD-1이 PD-L1에 대해 가장 높은 결합 친화도를 가짐을 보여준다(표 4).
[표 4]
Figure pct00014
실시예 5 - 크게 배제 크로마토그래피
PD-1 폴리펩티드 변이체는 HPLC(Agilent Technologies, 1260 인피니티 II LC 시스템) 및 크기 배제 컬럼(Tosoh, TSKgel G3000 SWXL, 7.8×300 mm, 파트 번호 0008541, 컬럼 번호 004E04320E)을 사용하여 분석하였다. 겔 여과 표준(BIO-RAD, Cat.#l 51-1901)을 대조군으로 사용하였다(도 5a~5e).
실시예 6 - PD-1 융합 단백질 세포 결합 검정
PD-L1 고발현 세포주 MDA-MB-231(인간 유방암 세포) 및 PD-L1 저발현 세포주 MCF-7(인간 유방암 세포) 세포들을 사용하였다. 도 6은 각 세포주에서 PD-L1의 발현 수준을 나타낸다. 도 6으로부터, PD-L1이 MDA-MB-231에서는 높게 발현됨을 확인하였고, MCF7에서는 그렇지 않음을 확인하였다.
1.5×105개 세포를 항체 처리와 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. euPD-1 Fc, PD-1 Fc, 및 티쎈트릭(Genetech, 아테졸리주맙, 항-PD-L1 항체)의 처리 농도는 877.19 nM에서 총 12개 지점으로 2배 연속 희석하였다. FACS 세척 완충액(DPBS 중 0.5% FBS + 0.1% NaN3)으로 1회 세척한 후, 항-hFC-AF488 2차 항체(Jackson ImmunoResearch)를 1 μl/웰로 20분간 처리하였다. 2회 추가 세척 후 FACS 분석을 수행하였다.
FACS 분석 결과, 2차 항체에 의한 배경 신호가 거의 없음을 확인하였다. 도 7a에서, PD-1 Fc는 실험 농도 범위에서 PD-L1 양성 세포에 결합하지 않은 반면, euPD-1 Fc 및 티쎈트릭은 PD-L1 양성 세포에 용량-의존적으로 결합하였다. FACS 분석 결과, 도 7b에서, 3개의 항체 모두 PD-L1 음성 세포에 결합하지 않았다.
실시예 7 - PD-1 융합 단백질 항원 결합 검정
euPD-1 Fc가 항원 PD-L1 또는 PD-L2에 결합하는지 확인하기 위해 항원 결합 분석을 수행하였다.
검정 방법은 도 8a 및 8c에 도시된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, PD-L1 항원 또는 PD-L2 항원을 96-웰 면역플레이트에서 1 μg/ml의 농도로 4℃에서 밤새 코팅한 후, 150 μl의 1x 분석 완충액(Biolegend)을 1시간 동안 처리하여 비-특이적 결합을 차단하였다. euPD-1 Fc, PD-1 Fc, 및 티쎈트릭 각각을 100 μL로 처리하고 2시간 동안 인큐베이션하였다. 항원 PD-L1-코팅 플레이트의 처리 농도는 30 μg/mL에서 3배로 연속 희석하여 총 15개 지점을 만들었으며, 항원 PD-L2 코팅 플레이트에서의 처리 농도는 100 μg/mL에서 총 12개 지점으로 3배 연속 희석하였다. 항-hFc-HRP(Biolegend)를 0.4 μg/mL의 농도로 100 μl로 처리하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, TMB로 발생시키고, 3분 후 황산을 사용하여 반응을 정지시켰다. TMB 처리 후 공정을 제외한 모든 공정에서 세척 완충액을 사용하여 세척을 3회 수행하였고, 항원 코팅 공정을 제외한 모든 공정은 실온에서 수행하였다. 실험 결과, 도 8b에 도시된 바와 같이, 항원 PD-L1에 대한 euPD-1 Fc 및 티쎈트릭의 결합은 용량-의존적 방식으로 확인되었다. 그리고, 도 8d에서, PD-1 Fc만이 항원 PD-L2에 용량-의존적 방식으로 결합하고, euPD-1 Fc 및 티쎈트릭은 결합하지 않았다.
실시예 8 - PD-1 융합 단백질 차단 생물검정
PD-1 및 PD-L1(Bicytogen)의 결합 억제 효과를 확인하기 위해 차단 생물검정을 수행하였다.
사용된 생물검정 제품(Promega, J1250)은 PD-1과 PD-L1의 결합이 억제되는 조건에서 루시퍼라제를 발현한다. 생물검정 및 루시퍼라제 검정은 Promega 프로토콜을 따랐다. 표적 세포를 96웰 백색 플레이트에 4×104개　세포/100 μl/웰로 시딩하였다. 37℃ CO2　인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한 후, 항체 및 효과기 세포를 처리하였다. 항체로는, euPD-1 Fc, PD-1 Fc, 티쎈트릭, 및 키트루다(Keytruda)(Merck, 펨브롤리주맙, 항-PD-1 항체)를 사용하였다. 처리 농도는 217.39 nM에서 2.5배 연속 희석하여, 총 10개 지점을 만들었다. 37℃ CO2　인큐베이터에서 6시간 인큐베이션한 후, 루시페린을 처리하고 루시퍼라제 검정을 수행하였다. 루시퍼라제 검정 결과, 도 9a에 도시된 바와 같이, euPD-1 Fc, 티쎈트릭, 및 키트루다는 용량 의존적으로 억제 효과를 나타냈으며, 도 9b에 도시된 바와 같이, euPD-1 Fc는 PD-1 Fc보다 2.4배 내지 4.9배 이상의 억제 효과를 나타내었다.
실시예 9 - PD-1 융합 단백질 생체 내 효능 연구
euPD-1 Fc의 효능을 검증하기 위해, 생체 내 종양 성장 억제 연구를 수행하였다. 실험은 hPD-1에 녹-인된 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하여 수행하였다.
종양 세포로는, 인간 PD-L1을 발현하는 MC38 세포를 도 10에 도시된 바와 같이 사용하였으며, 개체당 8×106개　종양 세포를 피하 투여하였다. 투여 1주일 후, 종양 크기를 측정하고, 평균과 표준편차가 유사하도록 (즉, 약 100 mm3) 투여 그룹을 배정하였다. 항체들 euPD-1 Fc, PD-1 Fc, 및 티쎈트릭 3개를 정맥내로 주입하였다. 음성 대조군으로는, 부형제 DPBS(Gibco)를 사용하였다. 항체 투여량은 euPD-1 Fc를 기준으로 5 mg/kg 및 2 mg/kg으로 설정하였으며, PD-1 fc 및 티쎈트릭 5 mg/kg의 경우는 분자량을 고려하여 8.77 μM 농도를 사용하였다. 투여는 100 μl에서 수행하였으며, 3일 간격으로 5회 투여하였다. 종양 크기도 3일 또는 4일 간격으로 측정하였으며, 마지막 투여 후 2일까지 종양 크기를 측정하였다. 또한, 실험 종료 당일에 채혈하여 독성을 확인하였고, ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제), AST(아스파테이트 아미노트랜스퍼라제), BUN(혈액 요소 질소), 및 T-BIL(총 빌리루빈)의 농도는 생화학 분석기를 사용하여 확인하였다.
종양의 크기를 관찰한 결과, 도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같이, euPD-1 Fc(8.77 μM) 및 티쎈트릭(8.77 μM) 둘 다 음성 대조군의 투여와 비교하여 종양 성장을 억제하였고; PD-1 Fc(8.77 μM)는 음성 대조군과 유사한 성장을 보였다. 또한, 도 11c 및 도 11d에 도시된 바와 같이, euPD-1 Fc는 저농도(2 mg/kg) 투여군에서 음성 대조군 투여에 비해 종양 크기가 33.9% 감소하였고, 고등급(5 mg/kg) 투여군에서 66.1% 종양 크기 감소가 관찰되었으며, 용량-의존적 억제 효과를 나타낸다.
또한, 간 독성 지수 분석을 수행하여, 도 12에 도시하였다. 간독성 지수 분석의 경우, 도 12에 나타낸 바와 같이, euPD-1 Fc 투여군에서는, 4가지 지표 모두 정상 범위에 있었으며(ALT: 17-77 U/L(도 12a 및 도 12e), AST: 54-298 U/L(도 12b 및 도 12f), BUN: 8-33 mg/dL(도 12c 및 도 12g), T-BIL: 8-33 mg/dL(도 12d 및 도 12h)), 실험 조건 내에서 간독성이 확인되지 않았다.
따라서, 본 발명의 euPD-1 및 IgG1 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 이중 특이적 항체는 간독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 항체는 ADCC 및 CDC 효과가 결여되어 있다.
실시예 10 - PD-1 융합 단백질 euPD-1 BsAb의 설계, 제조 및 특징화
euPD-1 및 항-4-1BB 항체를 사용한 Fc 융합 BsAb는 도 13에 도시된 바와 같이 설계되었다. euPD-1과 Fc를 연결하기 위해 (G4S)2 링커를 사용하였으며, BsAb에 사용되는 Fc 영역에는 IgG1로 변형된 Fc 영역을 사용하였다. (L234A, L235A, K322A, D356E, L358M).
2개의 euPD-1을 연결하는 형태의 BsAb도 설계되었으며; 2개의 euPD-1을 연결하기 위해 (G4S)3 링커를 사용하였으며, euPD-1.2로 칭하였다.
C-말단 측에서, 항-4-1BB 항체는 scFv 형태로 Fc에 결합되었고; 이때 (G4S)2 링커로 연결되었고, 항-4-1BB 항체에 대한 두 종류의 scFv, VH-218 링커-VL(HLC 218) 및 VL-218 링커-VH(LHC 218)를 사용하였다.
표 5 또는 도 13의 작제물이 생성되었다. 또한 상기 언급된 서열이 제공된다.
[표 5]
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
일시적인 형질감염을 Expi293F 세포로 수행하여 euPD-1 BsAb(이중 특이적 항체)를 생성하였으며; 단백질 A 컬럼으로 정제를 수행하였다.
SDS-PAGE 분석 결과, 비환원 조건에서, 1개의 euPD-1을 갖는 euPD-1×94kvt HLC 218 및 euPD-1×94kvt LHC 218은 약 160 kDa로 관찰되었으며; 환원 조건에서는, 약 80 kDa로 관찰되었다. euPD-1 이중 형태인, euPD-1.2×94 kvt HLC 218 및 euPD-1.2×94 kvt LHC 218은 약 250 kDa로 관찰되었으며; 환원 조건에서는, 약 125 kDa로 관찰되었다. 크기 배제 크로마토그래피 분석 결과, 순도 90% 이상의 단일 피크가 관찰되었다(도 15 참조).
실시예 4에 기술된 것과 유사한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석이 뒤따랐다. 구체적으로, 25 μg/ml의 항-인간 Fc 항체를 CM5 칩에 고정화하였다. 25 μg/ml의 항-인간 Fc 항체를 CM5 칩에 고정화하였다. 그 후, 4종의 euPD-1 BsAb를 60초 동안 10 μg/ml 및 10 μl/분의 유속으로 흘려 포집하고, 100, 50, 25, 12.5, 3.25, 3.125, 0 nM의 PD-L1 항원을 사용하여 KD 분석을 수행하였다. 도 16은 euPD-1 BsAb 작제물의 SPR 결과를 보여준다.
실시예 11 - euPD-1 BsAb 작제물을 사용한 항원 결합 검정
euPD-1 BsAb가 항원 PD-L1에 결합하는지 확인하기 위해, 항원 결합 검정을 수행하였다.
검정 방법은 도 17a에 도시된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말해서, PD-L1 항원을 96-웰 면역플레이트에서 1 μg/ml의 농도로 4℃에서 밤새 코팅한 후, 150 μl의 1x 검정 완충액(Biolegend)을 1시간 동안 처리하여 비-특이적 결합을 차단하였다. euPD-1 BsAb는 100μL로 처리한 후 2시간 동안 인큐베이션하였다. 처리 농도는 10 μg/mL에서 총 3개 지점까지 10배 연속 희석하였다. 1 μg/ml 농도의 100 μl의 비오티닐화된 4-1BB를 1시간 동안 처리하였다. 아비딘-HRP(Bioglend)를 프로토콜에 표시된 농도로 100 μl로 30분 동안 처리하였다. TMB로 발색시킨 후 3분 후 황산으로 반응을 정지시켰다. TMB 처리 후 공정을 제외한 모든 공정에서 세척 완충액을 사용하여 세척을 3회 수행하였으며; PD-L1 코팅 공정을 제외한 모든 공정은 실온에서 수행하였다.
실험 결과, 도 17b에 도시된 바와 같이, 항원 PD-L1에 대한 euPD-1 BsAb의 결합이 용량-의존적 방식으로 확인되었다.
실시예 12 - 4-1BB/PD-1 조합 생물검정
PD-1과 PD-L1의 결합 억제 효과 및 4-1BB 활성 효과를 확인하기 위해, 4-1BB/PD-1 조합 생물검정을 수행하였다.
본 실험을 위한 생물검정 제품(Promega, CS1978I10)은 4-1BB 항체 자극에 의해 4-1BB가 활성화됨과 동시에 PD-1/PD-L1 상호작용이 억제되었을 때 루시퍼라제를 발현하는 검정 시스템이다. 생물검정 및 루시퍼라제 검정은 Promega 프로토콜을 따랐다. PD-L1을 발현하는 MDA-MB-231 세포는 96 웰 백색 플레이트에 4×104개 세포/100 μL/웰로 시딩하였다. 37℃ CO2　인큐베이터에서 O/N 인큐베이션한 후, 항체 및 PD1+4-1BB 효과기 세포를 처리하였다. 항체로는, euPD-1×94 kvt HLC 218 및 euPD-1×94 kvt LHC 218을 사용하였다. 처리 농도는 60 ng/ml에서 4배로 연속 희석하여 총 4개 지점을 생성하였다. 37℃ CO2　인큐베이터에서 6시간 인큐베이션한 후, 루시페린을 처리하고, 루시퍼라제 검정을 수행하였다.
도 18에 제시된 바와 같은, 루시퍼라제 검정의 결과로서, euPD-1×94 kvt HLC 218 및 euPD-1×94 kvt LHC 218이 4-1BB를 활성화시키고, PD-1/PD-L1을 용량-의존적 방식으로 억제하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Eutilex Co., Ltd. <120> PD-1 POLYPEPTIDE VARIANTS <130> 538173WO <150> 63/075,641 <151> 2020-09-08 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 447 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tttttggatt ctccagaccg gccttggaac ccgcccacgt ttagccctgc tcttttggta 60 gttacagagg gggacaacgc cacattcacc tgcagcttct ctaatacgtc cgagagcttt 120 gtactgaatt ggtatagaat gagtccatct aatcagacag ataaattggc tgccttccct 180 gaagacagga gtcagccggg tcaggactgc agattccgcg ttacgcaact cccaaatggt 240 cgagactttc atatgtcagt tgttcgggcg aggagaaatg atagcggtac ttacctgtgc 300 ggcgcgatat ctctcgcacc aaaagcacag attaaagagt ctctccgggc tgaactccgc 360 gtgacagaaa ggcgagccga ggtaccaacg gcgcacccat caccgagtcc tagacctgcg 420 ggccaattcc agactttggt tgtcgga 447 <210> 2 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro 1 5 10 15 Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser 20 25 30 Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met 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Ser Val Val Arg Ala Gln Arg 245 250 255 Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys 260 265 270 Ile Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg 275 280 285 Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala 290 295 300 Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser 305 310 315 320 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 325 330 335 Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 340 345 350 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 355 360 365 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 370 375 380 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 385 390 395 400 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 405 410 415 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala 420 425 430 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 435 440 445 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 450 455 460 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 465 470 475 480 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 485 490 495 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 500 505 510 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 515 520 525 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 530 535 540 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 545 550 555 560 Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro 565 570 575 Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp 580 585 590 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu 595 600 605 Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser 610 615 620 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu 625 630 635 640 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Trp Pro 645 650 655 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser 660 665 670 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val 675 680 685 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 690 695 700 Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met 705 710 715 720 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu 725 730 735 Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser 740 745 750 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 755 760 765 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 770 775 780 Ser Phe Lys Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 785 790 795 800 Val Thr Val Ser Ser 805 <210> 16 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc <400> 16 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly 225 <210> 17 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 94kvt VH <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser 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85 90 95 Ala Arg Ser Phe Lys Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 115 120 125 Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile 180 185 190 Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Asp Gly His Ser Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Ile Lys <210> 23 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 94kvt LHC 218 <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln 115 120 125 Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140 Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile 165 170 175 Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg 180 185 190 Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 195 200 205 Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 210 215 220 Phe Lys Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser

Claims (56)

  1. 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로그램된 세포사 1(PD-1) 폴리펩티드 변이체로서,
    상기 PD-1 폴리펩티드 변이체는:
    프로그램된 세포사 1 리간드(PD-Ll)에 특이적으로 결합하는 세포외 도메인; 및
    막관통 도메인 또는 이의 단편
    을 포함하는, 프로그램된 세포사 1(PD-1) 폴리펩티드 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PD-1 폴리펩티드 변이체는 서열번호 4, 서열번호 6, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 변이체는 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 변이체는 약 1×10-8 내지 1×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
  6. 서열번호 11의 잔기 24 내지 172에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로그램된 세포사 1(PD-1) 폴리펩티드 변이체로서, 상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 잔기에 돌연변이를 갖는, 프로그램된 세포사 1(PD-1) 폴리펩티드 변이체.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, Q99, L122, A125, A132, 및 R139에 돌연변이를 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 변이체는 D26, P34, V43, T45, T59, V64, L65, N66, Y68, M70, N74, K78, C93, Q99, R114, L122, A125, A132, 및 R139에 돌연변이를 포함하는, PD-1 폴리펩티드 변이체.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 돌연변이는 D26E, P34A, V43L, T45A, T59A, V64H, L65V, N66V, Y68H, M70E, N74G, K78T, C93H, Q99R, R114Q, L122Y, A125V, A132I, 또는 R139G인, PD-1 폴리펩티드 변이체.
  10. 면역글로불린 Fc 영역; 및
    펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결된 제1항의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 PD-1 Fc 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, PD-1 Fc 융합 단백질.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 PD-1 폴리펩티드 변이체의 2개의 복제본이 존재하고, 여기서 상기 복제본은 동일하거나 상이할 수 있고, 펩티드 링커 서열에 의해 연결되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖는, PD-1 Fc 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 약 1×10-8 내지 1×10-10　M의 PD-L1 분자에 대한 결합 친화도(KD)를 갖는, PD-1 Fc 융합 단백질.
  15. 면역글로불린 Fc 영역; 및
    펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결된 제6항의 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 PD-1 Fc 융합 단백질.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 PD-1 폴리펩티드 변이체의 2개의 복제본이 존재하고, 여기서 상기 복제본은 동일하거나 상이할 수 있고, 펩티드 링커 서열에 의해 연결되는, PD-1 Fc 융합 단백질.
  17. PD-1 폴리펩티드 변이체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산으로서, 여기서 폴리펩티드 변이체는 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산.
  18. 제17항에 있어서,
    면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 서열을 추가로 포함하며, 여기서 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 서열은 서열번호 9를 포함하는, 핵산.
  19. 제17항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 벡터는 바이러스 벡터인, 벡터.
  21. 제1항의 PD-1 폴리펩티드 변이체, 또는 면역글로불린 Fc 영역 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결되는 상기 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 융합 단백질; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체
    를 포함하는, 약제학적 조성물.
  22. 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    제21항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여, 질환 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 대상체는 암을 갖는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종, 및 전립선암으로부터 선택되는, 방법.
  25. 제22항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 상기 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC) 효과가 관찰되거나, 효과가 관찰되지 않는, 방법.
  26. 제22항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 상기 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 간독성이 관찰되거나, 간독성이 관찰되지 않는, 방법.
  27. 제6항의 PD-1 폴리펩티드 변이체, 또는 면역글로불린 Fc 영역 및 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 카르복시-말단에 연결되는 상기 PD-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 융합 단백질; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체
    를 포함하는, 약제학적 조성물.
  28. 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    제27항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여, 질환 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 대상체는 암을 갖는, 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종, 및 전립선암으로부터 선택되는, 방법.
  31. 제28항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 상기 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC) 효과가 관찰되거나, 효과가 관찰되지 않는, 방법.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 상기 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 간독성이 관찰되거나, 간독성이 관찰되지 않는, 방법.
  33. 면역글로불린 Fc 영역;
    펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결되는 제1항의 PD-1 폴리펩티드 변이체; 및
    펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 연결되는 항-4-1BB 항체에 대한 scFv로서, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 연결되는 서열번호 17 및 18을 포함하는 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항-4-1BB 항체에 대한 scFv;
    를 포함하는 이중 특이적 항체.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이적 항체.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 PD-1 폴리펩티드 또는 scFv 또는 둘 다는 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 링커에 의해 면역글로불린 Fc 영역에 연결되는, 이중 특이적 항체.
  36. 제33항에 있어서,
    상기 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 서열번호 22 또는 서열번호 23과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 이중 특이적 항체.
  37. 제33항에 있어서,
    상기 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 서열번호 22 또는 서열번호 23을 포함하는, 이중 특이적 항체.
  38. 제33항에 있어서,
    상기 이중 특이적 항체는 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖고, 4-1BB에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는, 이중 특이적 항체.
  39. 제33항의 이중 특이적 항체; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  40. 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    제39항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여, 질환 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 대상체는 암을 갖는, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종, 및 전립선암으로부터 선택되는, 방법.
  43. 제40항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 상기 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC) 효과가 관찰되거나, 효과가 관찰되지 않는, 방법.
  44. 제40항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 상기 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 간독성이 관찰되거나, 간독성이 관찰되지 않는, 방법.
  45. 면역글로불린 Fc 영역;
    펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결되는 제6항의 PD-1 폴리펩티드 변이체; 및
    펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단에 연결되는 항-4-1BB 항체에 대한 scFv로서, 여기서 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커 서열에 의해 연결되는 서열번호 17 및 18을 포함하는 아미노산 서열에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항-4-1BB 항체에 대한 scFv
    를 포함하는 이중 특이적 항체.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 10 또는 서열번호 16에 대해 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 이중 특이적 항체.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 PD-1 폴리펩티드 또는 scFv 또는 둘 다는 서열번호 19, 서열번호 20 및 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 링커에 의해 면역글로불린 Fc 영역에 연결되는, 이중 특이적 항체.
  48. 제45항에 있어서,
    상기 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 서열번호 22 또는 서열번호 23과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는, 이중 특이적 항체.
  49. 제45항에 있어서,
    상기 항-4-1BB 항체에 대한 scFv는 서열번호 22 또는 서열번호 23을 포함하는, 이중 특이적 항체.
  50. 제45항에 있어서,
    상기 이중 특이적 항체는 야생형 PD-1 폴리펩티드와 비교하여 PD-L1 분자에 대해 증가된 결합 친화도를 갖고, 4-1BB에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는, 이중 특이적 항체.
  51. 제45항의 이중 특이적 항체; 및
    약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  52. 치료를 필요로 하는 대상체의 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서,
    제51항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여, 질환 또는 병태를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 대상체는 암을 갖는, 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 나팔관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발성 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포 암종, 교모세포종, 및 전립선암으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 상기 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성(CDC) 효과가 관찰되거나, 효과가 관찰되지 않는, 방법.
  56. 제54항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 상기 융합 단백질을 포함할 때, 감소된 간독성이 관찰되거나, 간독성이 관찰되지 않는, 방법.
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