ES2910365T3 - Nuevos polipéptidos biespecíficos contra CD137 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión, designado B1, que es capaz de unirse específicamente a CD137; y un segundo dominio de unión, designado B2, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno asociado a células tumorales, en donde el antígeno asociado a células tumorales es 5T4; en donde el dominio de unión B1 comprende CDRL1 correspondiente al SEQ ID NO: 54, CDRL2 correspondiente al SEQ ID NO: 55, y CDRL3 correspondiente al SEQ ID NO: 83, y en donde el dominio de unión B1 comprende CDRH1 correspondiente al SEQ ID NO: 62 o una variante de CDRH1 que tiene solo una mutación de aminoácidos en relación con el SEQ ID NO: 62, CDRH2 correspondiente al SEQ ID NO: 69, y CDRH3 correspondiente al SEQ ID NO: 76; y en donde el dominio de unión B2 comprende CDRL1 correspondiente al SEQ ID NO: 54 o una variante de CDRL1 que tiene solo una mutación de aminoácidos en relación con el SEQ ID NO: 54, CDRL2 correspondiente al SEQ ID NO: 55, y CDRL3 correspondiente al SEQ ID NO: 58, y en donde el dominio de unión B2 comprende CDRH1 correspondiente al SEQ ID NO: 46, CDRH2 correspondiente al SEQ ID NO: 48, y CDRH3 correspondiente al SEQ ID NO: 52.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos polipéptidos biespecíficos contra CD137

Antecedentes

Inmunoterapia del cáncer

El cáncer es una de las principales causas de muerte prematura en el mundo desarrollado. La inmunoterapia del cáncer tiene por objeto provocar una respuesta inmunitaria eficaz contra las células tumorales. Esto se puede lograr mediante, por ejemplo, rompiendo la tolerancia contra el antígeno tumoral, aumentando las respuestas inmunitarias antitumorales y estimulando las respuestas de citoquinas locales en el sitio del tumor. La célula efectora clave de una respuesta inmunitaria antitumoral de larga duración es la célula T efectora activada específica del tumor. La expansión potente de las células T efectoras activadas específicas del tumor puede redirigir la respuesta inmunitaria hacia el tumor. En este contexto, diversos mecanismos inmunosupresores inducidos por el microentorno tumoral suprimen la actividad de las células T efectoras. Varios mediadores inmunosupresores son expresados por las células tumorales. Dichos mediadores inhiben la activación de las células T, ya sea directa o indirectamente al inducir, p. ej., células T reguladoras (Treg) o células supresoras derivadas de mieloide. Delecionar, inhibir, revertir o inactivar dichas células reguladoras pueden proporcionar, por lo tanto, efectos antitumorales y revertir la supresión inmunitaria en el microentorno tumoral. Además, la activación incompleta de células T efectoras, por ejemplo, por células dendríticas puede dar como resultado células T activadas de manera subóptima o anérgicas, dando como resultado una respuesta antitumoral ineficaz. Por el contrario, la inducción adecuada por parte de las células dendríticas puede generar una potente expansión de las células T efectoras activadas, redirigiendo la respuesta inmunitaria hacia el tumor. Adicionalmente, las células citotóxicas naturales (NK) desempeñan un papel importante en la inmunología del tumor al atacar a las células tumorales con expresión de antígeno de leucocitos humanos (HLA) regulado por disminución y al inducir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). La estimulación de las células NK puede, por tanto, reducir el crecimiento del tumor.

Antígenos asociados a tumores

Los antígenos asociados a tumores (TAA) son proteínas de la superficie celular expresadas selectivamente en células tumorales. La expresión asociado a tumores indica que los TAA no son completamente específicos del tumor, sino que más bien están sobreexpresados en el tumor. Se ha descrito y usado un gran número de TAA en diversos fundamentos terapéuticos, incluyendo anticuerpos monoclonales, terapias de redirección de células T con anticuerpos biespecíficos TAA-CD3, inmunocitoquinas y conjugados fármaco y anticuerpo. Algunos TAA bien estudiados incluyen las moléculas de la familia EGFR (HER2, HER3 y EGFR/HER1), VEGFR, EpCAM, CEA, PSA, PSMA, EphA2, gp100, GD2, MUC1, CD20, CD19, CD22 y CD33, resumidas en (Cheever et al., 2009).

5T4 (también denominada glicoproteína trofoblástica, TPBG, M6P1 y Waif1) es un TAA bien definida, originalmente identificada por el Profesor Peter Stern, Universidad de Manchester (Hole y Stern, 1988). Se trata de un antígeno oncofetal expresado en una alta proporción de pacientes en varias neoplasias malignas, incluyendo cánceres de pulmón no microcítico, renal, de páncreas, de próstata, de mama, colorrectal, gástrico, de ovario y de cuello de útero, así como en la leucemia Iinfocítica aguda, y también se ha demostrado que se expresa en células iniciadoras de tumores (Castro et al., 2012; Damelin et al., 2011; Elkord et al., 2009; Southall et al., 1990).

La expresión de 5T4 es selectiva del tumor, sin expresión o con baja expresión en la mayoría de los tejidos normales. En tejido no maligno, 5T4 se expresa principalmente en la placenta (trofoblasto y epitelio amniótico) y en niveles bajos en algunos epitelios especializados (Hole y Stern, 1988), así como en niveles bajos en otros tejidos normales (véase el documento US 2010/0021483). Sin embargo, aunque se han detectado niveles bajos en algunos tejidos sanos, el riesgo de seguridad asociado a esto se considera bajo, ya que los niveles de expresión en el tumor son considerablemente más altos. Esto lo respalda el hecho de que los programas clínicos de fase III, ANYARA y TroVax dirigidos a 5T4 no notificaron toxicidades graves relacionadas con 5T4.

Los datos de Stem et al., demuestran que 5T4 regula la actividad funcional de CXCR4 (Castro et al., 2012; Southgate et al., 2010). Los anticuerpos de unión a 5T4 o la disminución de la expresión de 5T4 dieron como resultado la inhibición de la migración celular mediada por CXCR4. La vía de CXCR4 participa en el crecimiento tumoral y la metástasis. Por lo tanto, al dirigirse a 5T4 de manera inhibidora con CXCR4 probablemente se reduzca el crecimiento y/o la diseminación del tumor.

CD137

CD137 (4-1BB, TNFRSF9) es un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TNFR). Su papel en la inmunoterapia del cáncer ha sido revisado, p. ej., en (Bartkowiak y Curran, 2015). La activación de CD137 depende de la oligomerización del receptor (Rabu et al., 2005; Wyzgol et al., 2009) que se induce mediante la unión a CD137L expresada como un trímero en la superficie celular de las células presentadoras de antígeno (APCs) y otros tipos de células. CD137 se expresa en varias poblaciones celulares, incluyendo células T CD4+ y CD8+activadas, células T reguladoras (Treg), células dendríticas (DC), monocitos, mastocitos, eosinófilos y células endoteliales tumorales. La activación de CD137 desempeña un papel importante en la activación y supervivencia de las células T CD8+ (Lee et al., 2002; Pulle et al., 2006). Sostiene y aumenta las funciones efectoras y respalda preferentemente la producción de citoquinas Th1 (Shuford et al., 1997). En las células T CD4+, la estimulación de CD137 da inicialmente como resultado la activación y posteriormente la muerte celular inducida por activación, lo que se cree que explica por qué los anticuerpos agonistas CD137 han mostrado un efecto terapéutico en la inmunidad del tumor así como en la autoinmunidad (Zhang, JCI, 2007, Sun, Trends Mol Med, 2003). También se ha notificado que CD137 suprime la función Treg o convierte Tregs en células T CD4+ citotóxicas (Akhmetzyanova et al., 2016; So et al., 2008).

CD137 se regula por aumento en las células NK activadas por citoquinas o estimulación de CD16 (FcyRIII) (ref. en Melero, CCR 19 (5)1044-53, 2013). Se ha demostrado que la activación de CD137 aumenta la actividad de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células NK tanto en células murinas como humanas (Kohrt 2012 y 2014 J Clin Invest, revisado por Hout 2012, Oncoimm). Además, CD137 se expresa en APCs, tales como DCs y macrófagos, y la estimulación de CD137 en estos tipos de células puede inducir la activación inmunitaria que puede dar como resultado la inmunidad tumoral.

Se ha demostrado que el anticuerpo CD137 agonista activa las células endoteliales en el entorno del tumor, lo que conlleva a una regulación por aumento de ICAM-1 y VCAM-1 y reclutamiento de células T mejorado (Palazon, Cancer Res, 2011).

Varios estudios han demostrado la inducción de la inmunidad tumoral mediante el tratamiento con mAb CD137 agonista en modelos preclínicos. El modo de acción puede incluir varios tipos de células, con las células T CD8+ siendo una de las principales células efectoras involucradas en la inmunidad tumoral inducida por CD137 (Dubrot et al., 2010; Gauttier et al., 2014; Kim et al., 2001; McMillin et al., 2006; Melero et al., 1997; Miller et al., 2002; Sallin et al., 2014; Taraban et al., 2002; Uno et al., 2006; Vinay y Kwon, 2012; Wilcox et al., 2002). Adicionalmente, sinergiza con varios inmunomoduladores, incluyendo CpG, TRAIL, CD40, OX-40, DR5, PD-1/PD-L1, CTLA-4, Tim-3, IL-2 y IL-12 (Curran et al., 2011; Gray et al., 2008; Guo et al., 2013; Kwong et al., 2013; Lee et al., 2004; Morales-Kastresana et al., 2013; Pan et al., 2002; St Rose et al., 2013; Uno et al., 2006; Wei et al., 2013; Westwood et al., 2010; Westwood et al., 2014a; Westwood et al., 2014b). Un papel importante de CD137 en la inducción y el mantenimiento de la inmunidad tumoral está respaldado además por los hallazgos que indican que las células T infiltrantes de tumor CD137+ son específicas del tumor y protegen eficazmente del crecimiento tumoral (Ye et al., 2014).

Dos anticuerpos CD137 están en desarrollo clínico. Urelumab (BMS-66513) es un anticuerpo lgG4 completamente humano desarrollado por Bristol-Myers Squibb. Diversos estudios de fase I y ll en varias indicaciones están actualmente en curso. Un estudio de Fase II con Urelumab como terapia de segunda línea en el melanoma metastásico finalizó en 2009 debido a la toxicidad hepática (Garber, 2011; Li y Liu, 2013). PF-05082566 un anticuerpo lgG2 completamente humano desarrollado por Pfizer. Se encuentra actualmente en fase I de desarrollo en linfoma y en varios cánceres sólidos y los datos preliminares sugieren que es bien tolerado pero con solo efectos antitumorales moderados.

Se ha observado toxicidad por la activación de CD137 en pacientes, así como en modelos de ratón (Ascierto et al., 2010; Dubrot et al., 2010; Niu et al., 2007). La toxicidad incluye toxicidades cutáneas y toxicidades hepáticas que se manifiestan como un aumento de los niveles de la relación aspartato aminotransferasa/alanina aminotransterasa (ASAT/ALAT) y liberación de citoquinas. Esto sugiere que la toxicidad requiere la preactivación mediada por CD137 de las poblaciones de células inmunitarias (probablemente células T) o depende de los efectos secundarios provocados por la respuesta de antifármacos-anticuerpos (ADA), que potencialmente forman agregados de anticuerpos CD137 que pueden conducir a una mayor reticulación. Las toxicidades observadas en ratones son reversibles y parecen depender de las células TNFa/CD8+ (Ascierto et al., 2010). Los estudios de toxicología en monos mostraron que tanto una dosificación única como repetida de hasta 100 mg/kg una vez por semana durante cuatro semanas era tolerable sin que se detectara toxicidad en la piel o el hígado (Ascierto 2010 Semin Onc).

Los miembros de la familia TNFR dependen de la reticulación del receptor para que se induzca la activación. Dicha reticulación puede ser inducida por el ligando natural expresado en la superficie celular de las células o por un ligando multimerizado recombinante. De manera alternativa, puede inducirse por un anticuerpo que se une al receptor y reticula por su región Fc unida a un receptor Fcy (FcyR). Esta dependencia de reticulación se ha demostrado para varios miembros de TNFR, incluyendo DR5, GITR, CD27 y CD40 (Li y Ravetch, 2011; White et al., 2011; Wilson et al., 2011a; Wilson et al., 2011b; Wyzgol et al., 2009). Un papel importante para el FcyRIIB inhibidor (CD32B) en la activación por anticuerpos de la familia TNFR agonista se demostró en algunos estudios (Li y Ravetch, 2011; White et al., 2011; White et al., 2013) mientras que otros datos sugieren que la activación es inducida por la reticulación de FcyRs inhibidores así como activadores (Li y Ravetch, 2011; Wilson et al., 2011a).

Similar a otros miembros de TNFR, la activación de CD137 es dependiente de la oligomerización del receptor. Los hexámeros de CD137L inducen eficazmente la activación de CD137, mientras que CD137L monomérico o trimérico no lo hace (Rabu et al., 2005; Wyzgol et al., 2009). De este modo, es probable que los anticuerpos agonistas CD137 requieran una reticulación, p. ej., a través de FcyR para que se produzca una activación eficaz in vivo. Sin embargo, a diferencia de otros miembros de TNFR, FcyRII no es crítico para la inducción de inmunidad tumoral por CD137, mientras que FcyRIII altera la inmunidad tumoral (Sallin et al., 20l4; Sanmamed et al., 2015) en estudios con ratón.

La relevancia de la traducción del papel de varios FcyR en la activación de CD137 y otros miembros de la superfamilia de TNFR es incierta, ya que la distribución de FcyR humano, así como la afinidad de diferentes isotipos de lgG a diferentes FcyR difieren entre ratones y humanos.

El documento US 2015/307620 se titula "Linked immunotherapeutic agonists that costimulate multiple pathways". El documento WO 2015/156268 (también publicado como EP-A-3130606) se titula "Immunoactivating antigen-binding molecule" y se refiere a un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio de unión a antígeno específico del cáncer y un dominio de unión a CD137 humano. El documento WO 2014/116846 se titula "Methods and compositions for modulating an immune response". El documento WO 01/56603 se titula "CD40-binding APC-activating molecules". Makkouk et al., 2016 se titula "Rationale for anti-CD137 cancer immunotherapy". Arndt et al., 2013 se titula "Costimulation improves the killing capability of T cells redirected to tumor cells expressing low levels of CD33: description of a novel modular targeting system". Hinner et al., 2015 es un cartel titulado "Costimulatory T cell engagement via a novel bispecific anti-CD137 /anti-HER2 protein". Hinner et al., 2015 es un resumen titulado "Abstract B023: Costimulatory T-cell engagement via a novel bispecific anti-CD137 /anti-HER2 protein based on Anticalin® technology". El documento WO 2016/110584 se titula "Agonistic TNF receptor binding agents". El documento WO 2016/115/274 se titula "Multispecific immunomodulatory antigen-binding constructs". El documento WO 2016/185016 se titula "Novel polypeptides". Vezys et al., 2011 se titula "4-1BB Signaling Synergizes with Programmed Death Ligand 1 Blockade To Augment CD8 T Cell Responses during Chronic Viral Infection". Imura et al., 1997 se titula "OX40 expressed on fresh leukemic cells from adult T-cell leukemia patients mediates cell adhesion to vascular endothelial cells: implication for the possible involvement of OX40 in leukemic cell infiltration". Yamauchi et al., 2005 se titula "The glypican 3 oncofetal protein is a promising diagnostic marker for hepatocellular carcinoma". El documento US 2007/161080 se titulada "Antibodies". El documento WO 2013/041687 se titula "Bispecific binding molecules for 5T4 and CD3". Forsberg et al., 2010 se titula "Naptumomab Estafenatox, an Engineered Antibody-superantigen Fusion Protein With Low Toxicity and Reduced Antigenicity". White et al., 2015 se titula "Conformation of the Human Immunoglobulin G2 Hinge Imparts Superagonistic Properties to Immunostimulatory Anticancer Antibodies". Moraga et al., 2015 se titula "Tuning Cytokine Receptor Signaling by Re-orienting Dimer Geometry with Surrogate Ligands". Cheng et al., 2004 se titula "Individualized Patient Dosing in Phase I Clinical Trials: The Role of Escalation With Overdose Control in PNU-214936".

A pesar de los avances en el desarrollo de inmunoterapias para el tratamiento de varios cánceres en la última década, sigue habiendo una necesidad de agentes nuevos y eficaces.

En consecuencia, la presente invención busca proporcionar terapias mejoradas a base de polipéptidos para el tratamiento del cáncer.

Sumario de la invención

Un primer aspecto de la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión, designado B1, que es capaz de unirse específicamente a CD137, y un segundo dominio de unión, designado B2, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno asociado a células tumorales, en donde el antígeno asociado a células tumorales es 5T4;

en donde el dominio de unión B1 comprende CDRL1 correspondiente al SEQ ID NO: 54, CDRL2 correspondiente al SEQ ID NO: 55, y CDRL3 correspondiente al SEQ ID NO: 83, y

en donde el dominio de unión B1 comprende CDRH1 correspondiente al SEQ ID NO: 62 o una variante de CDRH1 que tiene solo una mutación de aminoácidos en relación con el SEQ ID NO: 62, CDRH2 correspondiente al SEQ ID NO: 69, y CDRH3 correspondiente al SEQ ID NO: 76; y

en donde el dominio de unión B2 comprende CDRL1 correspondiente al SEQ ID NO: 54 o una variante de CDRL1 que tiene solo una mutación de aminoácidos en relación con el SEQ ID NO: 54, CDRL2 correspondiente al SEQ ID NO: 55, y CDRL3 correspondiente al SEQ ID NO: 58, y

en donde el dominio de unión B2 comprende CDRH1 correspondiente al SEQ ID NO: 46, CDRH2 correspondiente al SEQ ID NO: 48, y CDRH3 correspondiente al SEQ ID NO: 52.

Dichos compuestos biespecíficos que comprenden una fracción activadora de inmunidad, es decir, un agonista de CD137 y una fracción que se dirige al tumor, es decir, un aglutinante de 5T4, pueden usarse para establecer una inmunoterapia para el cáncer altamente eficaz y segura.

Varios tipos de moléculas inmunoterapéuticas localizadoras de tumores, tales como inmunocitoquinas y anticuerpos biespecíficos han demostrado una activación inmunitaria beneficiosa y una inhibición del crecimiento tumoral en estudios preclínicos, así como en la clínica (revisado en Kiefer y Neri, 2016).

Para evitar la toxicidad sistémica por los agentes activadores de CD137, y aún obtener una alta eficacia en el área del tumor, los diseños del formato molecular de un agonista de CD137 pueden optimizarse. Por ejemplo, puede obtenerse un buen perfil de eficacia/seguridad mediante un anticuerpo biespecífico TAA-CD137 que requiere reticulación mediante la unión al TAA para que se produzca la activación de CD137. Después, las células T que expresan CD137 preactivadas que residen en el tumor se activarán preferentemente, mientras que las células que expresan CD137 en otros tejidos no lo harán. Esto permitiría la activación enfocada de las células T específicas de tumores relevantes mientras que limita la toxicidad inducida par la activación generalizada de CD137 ("activación" en este contexto siendo una activación inmunitaria neta que da como resultado una respuesta de células T dirigida al tumor, por ejemplo, mediante regulación por disminución de la función supresora de Tregs y/o regulación por aumento de la función de las células T efectoras).

El progreso clínico con las inmunocitoquinas hasta ahora no ha sido impresionante y los efectos secundarios persisten ya que la entidad de unión al tumor solo confiere una localización tumoral limitada, y la mayor parte de la inmunocitoquina termina en otros compartimentos. Los anticuerpos biespecíficos que restringen la actividad al tumor como se describe en esta invención proporcionarían una clara ventaja sobre las inmunocitoquinas ya que son inactivas en ausencia de tumores.

Además, los polipéptidos biespecíficos de la invención proporcionan una ventaja distintiva sobre las anticuerpos biespecíficos que se dirigen a CD3. Las moléculas biespecíficas que se dirigen a CD3 usan células T como células efectoras y son capaces de activar células T independientemente de la unión de TAA. De este modo, no activan células T específicas de tumor en particular. Por lo tanto, no es probable que los efectos antitumorales resultantes generen una inmunidad antitumoral de larga duración. Adicionalmente, aunque CD3 se expresa en todas las células T, la activación sistémica de las células T se asocia a problemas de toxicidad. Por el contrario, los anticuerpos biespecíficos de la invención tienen el potencial de activar selectivamente células T específicas de tumor y generar una inmunidad tumoral de larga duración.

Estructura de polipéptido biespecífico

Un "polipéptido" se usa en el presente documento en su sentido más amplio para hacer referencia a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos u otros peptidomiméticos. El término "polipéptido" incluye por tanto secuencias de péptidos cortos así como polipéptidos y proteínas más largos. Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo tanto los isómeros ópticos D o L como análogos de aminoácidos y peptidomiméticos.

El término "biespecífico" como se usa en el presente documento significa que el polipéptido es capaz de unirse específicamente a al menos dos entidades diana.

El polipéptido es un anticuerpo biespecífico (numerosos ejemplos de los cuales se describen en detalle a continuación).

De este modo, los dominios de unión primero y/o segundo pueden seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Por "un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo", los presentes investigadores incluyeron moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas, así como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos aislados, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o ligeras de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno y derivados de los mismos. Los fragmentos de unión a antígeno y derivados adecuados incluyen fragmentos Fv (p. ej., Fv monocatenario y Fv unido a disulfuro) y fragmentos similares a Fab (p. ej., fragmentos Fab, fragmentos Fab' y fragmentos F(ab)2. Las posibles ventajas de usar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos, son varias. El tamaño más pequeño de los fragmentos puede conducir a propiedades farmacológicas mejoradas, tales como una mejor penetración del tejido sólido. Por otra parte, los fragmentos de unión a antígeno tales como los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv, ScFv y dAb pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli, permitiendo de esta manera la producción fácil de grandes cantidades de dichos fragmentos.

En una realización, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en: fragmentos Fv (tales como un fragmento Fv monocatenario o un fragmento Fv unido a disulfuro), y fragmentos similares a Fab (tales como un fragmento Fab; un fragmento Fab' o un fragmento F(ab)²).

Por ejemplo, el primer dominio de unión (B1) y/o el segundo dominio de unión (B2) pueden comprender o consistir en un fragmento Fab.

Como alternativa, o además, el primer dominio de unión (B1) y/o el segundo dominio de unión (B2) pueden comprender o consistir en un fragmento Fv [tal como un scFv o un Fv con enlace disulfuro). Cuando el dominio de unión es un scFv, las regiones VH y VL en el mismo pueden unirse mediante una secuencia enlazadora, por ejemplo:

GGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 93]

Los expertos en la materia apreciarán que dichos polipéptidos scFv pueden estar glicosilados, por ejemplo N-glicosilados, en uno o más restos de aminoácidos.

La expresión "un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo" también pretende abarcar imitadores de anticuerpos (por ejemplo, estructuras de andamio que no son anticuerpos que tienen un alto grado de estabilidad y que permiten la introducción de variabilidad en ciertas posiciones). Los expertos en la materia de la bioquímica estarán familiarizados con muchas de estas moléculas, como se analiza en Gebauer y Skerra, 2009, Curr Opin Chem Biol 13(3): 245-255. Imitadores de anticuerpos ilustrativos incluyen: aficuerpos (también llamados Trinectinas; Nygren, 2008, FEBS J, 275, 2668-2676); CTLDs (también llamados Tetranectinas; Innovations Pharmac. Technol. (2006), 27­ 30); adnectinas (también llamadas monocuerpos; Meth. Mol. Biol., 352 (2007), 95-109); anticalinas (Drug Discovery Today (2005), 10, 23-33); DARPins (anquirinas; Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582); avímeros (Nat. Biotechnol. (2005), 23, 1556-1561); microcuerpos (f Eb S J, (2007), 274, 86-95); aptámeros peptídicos (Expert. Opin. Biol. Ther. (2005), 5, 783-797); dominios de Kunitz (J. Pharmacol. Exp. Ther. (2006) 318, 803-809); afilinas (Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522); afímeros (Avacta Life Sciences, Wetherby, R.U.).

En el presente documento también se describen receptores de células T quiméricos (también conocidos como receptores de células T quiméricos, inmunorreceptores quiméricos y receptores de antígenos quimérico o CARs) (véase Pule et al., 2003, Cytotherapy 5(3):211-26. Estos son receptores genomanipulados, que injertan una especificidad arbitraria en una célula efectora inmunitaria. Normalmente, estos CARs se usan para injertar la especificidad de un anticuerpo monoclonal en una célula T; con la transferencia de su secuencia codificante facilitada por vectores retrovíricos. La forma más común de tales moléculas es las fusiones que comprenden un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal fusionado con la transmembrana de COD3-zeta y el endodominio. Cuando las células T expresan esta molécula de fusión, reconocen y destruyen las células diana que expresan la especificidad del anticuerpo monoclonal transferido.

Los expertos en la materia apreciarán además que la invención también abarca versiones modificadas de anticuerpos, ya sea que existan ahora o en el futuro, p. ej., modificadas por la unión covalente de polietlenglicol u otro polímero adecuado (véase a continuación).

Los métodos para generar anticuerpos y fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse a través de uno cualquiera de varios métodos que emplean la inducción de la producción in vivo de moléculas de anticuerpo, la identificación sistemática de bibliotecas de inmunoglobulina (Orlandi et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299) o la generación de moléculas de anticuerpos monoclonales por líneas celulares en cultivo. Estos incluyen, aunque no de forma limitativa, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de células B humanas y la técnica de hibridoma del virus de Epstein-Barr [EBV) (Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120).

Los métodos adecuados para la producción de anticuerpos monoclonales también se divulgan en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclona1Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982).

De igual modo, los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse usando métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo o mediante expresión en células de E. coli o de mamífero (p. ej., cultivo de células de ovario de hámster chino u otros sistemas de expresión de proteínas) del ADN que codifica el fragmento. De manera alternativa, pueden obtenerse fragmentos de anticuerpo mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante métodos convencionales.

Los expertos en la técnica apreciarán que para la terapia o el diagnostico en seres humanos, se usan preferentemente anticuerpos humanos o humanizados. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son anticuerpos quiméricos genomanipulados o fragmentos de anticuerpo que tienen preferentemente porciones mínimas derivadas de anticuerpos no humanos. Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos en los que las regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo humano (anticuerpo receptor] se reemplazan por restos de una región determinante de la complementariedad de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tienen la funcionalidad deseada. En algunos casos, los restos de la región marco de Fv del anticuerpo humano se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la región determinante de la complementariedad o secuencias de región marco importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones determinantes de la complementariedad corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas, las regiones marco corresponden a las de una secuencia consenso de humano relevante. Los anticuerpos humanizados incluyen también óptimamente al menos una porción de una región constante de anticuerpo, tal como una región Fc, derivada normalmente de un anticuerpo humano (véanse, por ejemplo, Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596).

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, el anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en este a partir de una fuente que es no humana. Estos restos de aminoácidos no humanos, a menudo denominados restos importados, se toman normalmente de un dominio variable importado. La humanización se puede realizar esencialmente como se describe (véanse, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536I; US 4.816.567) sustituyendo las regiones determinantes de la complementariedad de humano con las correspondientes regiones determinantes de la complementariedad de roedor. En consecuencia, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados pueden ser normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de la región determinante de la complementariedad y posiblemente algunos restos de región marco se sustituyen por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

Los anticuerpos humanos también se pueden identificar usando varias técnicas conocidas en la materia, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos (véanse, por ejemplo, Hoogenboom y Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, En: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág.

77; Boerner et al., 1991. J. Immunol. 147:86-95).

Los expertos en la materia apreciarán que los anticuerpos biespecíficos de la presente invención pueden tener cualquier formato estructural adecuado.

De este modo, en realizaciones ilustrativas de los anticuerpos biespecíficos de la invención:

(a) el dominio de unión B1 y/o el dominio de unión B2 es un anticuerpo de lgG intacta (o, conjuntamente, forman un anticuerpo de lgG intacta);

(b) el dominio de unión B1 y/o el dominio de unión B2 es un fragmento Fv (p. ej., un scFv); y/o

(c) el dominio de unión B1 y/o el dominio de unión B2 es un fragmento Fab.

Los expertos en la técnica apreciarán que el anticuerpo biespecífico puede comprender una región Fc humana, o una variante de dicha región, donde la región es una región de lgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferentemente una región de IgG1 o IgG4.

La genomanipulación de la región Fc de un anticuerpo monoclonal terapéutico o proteína de fusión Fc permite la generación de moléculas que se adapten mejor a la actividad farmacológica requerida de ellas (Strohl, 2009, Curr Opin Biotechnol 20(6):685-91).

(a) Regiones Fc genomanipuladas para una mayor semivida

Un enfoque para mejorar la eficacia de un anticuerpo terapéutico es aumentar su persistencia en suero, permitiendo así mayores niveles en circulación, administración menos frecuente y dosis reducidas.

La semivida de una IgG depende de su unión dependiente de pH al receptor neonatal FcRn. FcRn, que se expresa en la superficie de los linfocitos endoteliales, se une a la lgG de una manera dependiente del pH y la protege de la degradación.

Algunos anticuerpos que se unen selectivamente al FcRn a pH 6,0, pero no a pH 7,4, presentan una semivida más alta en varios modelos animales.

Varias mutaciones ubicadas en la superficie de contacto entre los dominios CH2 y CH3, tales como T250Q/M428L (Hinton et al., 2004, J Biol Chem. 279(8):6213-6) y M252Y/S254T/T256E H433K/N434F (Vaccaro et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23(10): 1283-8), han demostrado aumentar la afinidad de unión a FcRn y la semivida de IgG1 in vivo.

(b) Regiones Fc genomanipuladas para la función efectora alterada

Para garantizar la falta de activación de CD137 en ausencia del antígeno tumoral, la porción Fc del anticuerpo biespecífico debe unirse con una nula afinidad o afinidad muy baja a FcyR, ya que la reticulación mediada por FcyR de un anticuerpo CD137 puede inducir la activación. Por "muy baja afinidad", los presentes investigadores incluyen que la porción Fc presenta una afinidad al menos 10 veces menor a FcyRI, FcgRIl y III en comparación con la lgG1 de tipo silvestre, según lo determinado por la concentración donde se alcanza la mitad de la unión máxima en el análisis citométrico de flujo de células que expresan FcyR (Hezareh et al., 2001, J Virol, 75(24):12161-8) o por ELISA FcyR (Shields et al., 2001, J Biol Chem. 276(9):6591-604).

Otro factor a tener en cuenta es que el compromiso de los FcyR también puede inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP, por sus siglas en inglés) y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés) de células recubiertas con anticuerpos. De este modo, para garantizar la activación de CD137 dependiente del tumor, así como para evitar la disminución de las células T efectoras reactivas al tumor que expresan CD137, el isotipo de un anticuerpo biespecífico TAA-CD137 debe ser preferentemente silencioso.

Los cuatro isotipos de IgG humana se unen a los receptores Fcy de activación (FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIIa), al receptor FcYRIIb inhibidor y al primer componente del complemento (C1q) con diferentes afinidades, produciendo funciones efectoras muy diferentes (Bruhns et al., 2009, Blood. 113(16):3716-25, cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en el presente documento). Las moléculas de lgG1 tienen la mayor afinidad y capacidad para inducir funciones efectoras, mientras que IgG2, IgG3 e IgG4 son menos eficaces (Bruhns, 2012; Hogarth and Pietersz, 2012; Stewart et al., 2014) (Wang 2015 Front Im; Vidarson 2014 Fron Imm). Adicionalmente, ciertas mutaciones en la región Fc de lgG1 reducen drásticamente la afinidad y la función efectora de FcyR mientras retienen la interacción de FcR neonatal (FcRn) (Ju y Jung, 2014; Leabman et al., 2013; Oganesyan et al., 2008; Sazinsky et al., 2008).

Los mutantes de lgG1 más ampliamente usados son N297A solo o en combinación con D265A, así como mutaciones en las posiciones L234 y L235, incluyendo el llamado mutante doble "LALA" L234A/L235A. Otra posición descrita para silenciar aún más la lgG1 por mutación es P329 (véase el documento US 20120251531).

De este modo, la elección de un formato de lgG1 mutado con una función efectora baja pero con una unión retenida con FcRn puede dar lugar a un anticuerpo biespecífico con activación dependiente de 5T4 de CD137, y presentar un perfil de eficacia/seguridad favorable y buenas propiedades de PK.

Ventajosamente, el polipéptido no es capaz de inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por "no es capaz" los presentes investigadores incluyen que la capacidad del polipéptido para inducir ADCC, etc., es al menos 10 veces menor que en comparación con la lgG1 de tipo silvestre según lo mostrado, p. ej., por los ensayos de ADCC o CDC dependientes de monocitos descritos por Hezareh et al. 2001 (supra).

En una realización, la región Fc puede ser una variante de una región Fc de lgG1 humana que comprende una mutación en una o más de las siguientes posiciones:

L234, L235, P239, D265, N297 y/o P329.

Ventajosamente, la alanina puede estar presente en la(s) posición(es) mutada(s).

Opcionalmente, la variante de lgG1 puede ser una variante de una región Fc de lgG1 humana que comprende mutaciones L234A y L235A (es decir, la doble mutante LALA; véase el SEQ ID NO: 86).

Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos biespecíficos de la invención pueden tener varios formatos estructurales diferentes (por ejemplo, véase Chan y Carter, 2016, Nature Reviews Immunology 10, 301-316).

En realizaciones ilustrativas, el anticuerpo biespecífico se selecciona de los grupos que consisten en:

(a) anticuerpos biespecíficos bivalentes, tales como anticuerpos biespecíficos lgG-scFv (por ejemplo, en donde B1 es una lgG intacta y B2 es un scFv unido a B1 en el extremo N de una cadena ligera y/o en el extremo C de una cadena ligera en el extremo N de una cadena pesada y/o en el extremo C de una cadena pesada de la |gG, o viceversa);

(b) anticuerpos biespecíficos monovalentes, tales como un anticuerpo biespecífico DuoBody® (Genmab AS, Copenhague, Dinamarca) o de "botón en ojal" (por ejemplo, un scFv-KIH, scFv-KIH^r, un BiTE-KIH o un BiTE-KIH^r (véase Xu et al., 2015, mAbs 7(1):231-242);

(c) anticuerpos biespecíficos scFv²-Fc (tales como anticuerpos biespecíficos ADAPTIR™ de Aptevo Therapeutics Inc, Seattle, EE. UU.);

(d) anticuerpos biespecíficos BiTE/scFv² ;

(e) anticuerpos biespecíficos DVD-Ig u otros anticuerpos biespecíficos IgG-FAb, FAb-IgG independientemente de la bivalencia o enlazadores/conectores empleados;

(f) anticuerpos biespecíficos basados en DART (por ejemplo, DART²-Fc, DART²-Fc o DART);

(g) anticuerpos biespecíficos DNL-Fab³; y

(h) anticuerpos biespecíficos scFv-HSA-scFv.

Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico puede ser un anticuerpo IgG-scFv (véase la Figura 1). El anticuerpo IgG-scFv (y, de manera específica, el dominio scFv en el mismo) puede estar bien en la orientación VH-VL o bien en VL-VH. En una realización, el scFv puede estabilizarse mediante un enlace S-S entre VH y VL.

En una realización alternativa, el anticuerpo biespecífico puede ser un anticuerpo scFv²-Fc, por ejemplo un dímero en donde cada polipéptido comprende, del extremo N al extremo C, un primer scFv, un dominio bisagra, un dominio Fc y un segundo scFv (véase la Figura 1).

En una realización, el dominio de unión B1 y el dominio de unión B2 se fusionan directamente entre sí.

En una realización alternativa, el dominio de unión B1 y el dominio de unión B2 se unen a través de un enlazador polipeptídico. Por ejemplo, un enlazador polipeptídico puede ser un péptido enlazador corto entre aproximadamente 10 a aproximadamente 25 aminoácidos. El enlazador es habitualmente rico en glicina para la flexibilidad, así como en serina o treonina para conferir solubilidad y puede conectar el extremo N de la VH con el extremo C de la VL o viceversa.

De este modo, el enlazador puede seleccionarse del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 87), SGGGGSGGGGSAP (SEQ ID NO: 88), NFSQP (SEQ ID NO: 89), KRTVA (SEQ ID NO: 90), GGGSGGGG (SEQ ID NO: 91), GGGGSGGGGS, (SEQ ID NO: 92), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 93), THTCPPCPEPKSSDK (SEQ ID NO: 140), GGGS (SEQ ID NO: 141), EAAKEAAKGGGGS (SEQ ID NO: 142), EAAKEAAK (SEQ ID NO: 143), o (SG)m, donde m = 1 a 7.

En una realización adicional, el dominio de unión B1 y el dominio de unión B2 están separados por regiones constantes de inmunoglobulina (tales como una región Fc) en un polipéptido.

El término "aminoácido" como se usa en el presente documento, incluye los veinte aminoácidos codificados genéticamente convencionales y sus estereoisómeros correspondientes en la forma "D" (en comparación con la forma "L" natural), omega-aminoácidos, otros aminoácidos de origen natural, aminoácidos no convencionales (p. ej., aminoácidos a,a-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, etc.) y aminoácidos derivatizados químicamente (véase a continuación).

Cuando se enumera específicamente un aminoácido, tal como "alanina" o "Ala" o "A", el término se refiere tanto a lalanina como a ^D-alanina, salvo que se especifique lo contrario explícitamente. Otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención, siempre que la propiedad funcional deseada sea conservada por el polipéptido. Para los péptidos mostrados, cada resto de aminoácido codificado, cuando sea adecuado, está representado por una sola letra, que corresponde al nombre trivial del aminoácido convencional.

En una realización, los polipéptidos de anticuerpo como se definen en el presente documento comprenden o consisten en ^L-aminoácidos.

Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos de anticuerpo de la invención pueden comprender o consistir en uno o más aminoácidos que se han modificado o derivatizado.

Pueden conseguirse derivados químicos de uno o más aminoácidos mediante la reacción con un grupo funcional lateral. Tales moléculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, las moléculas en las que los grupos amino libres se han derivatizado para formar clorhidratos de amina, grupos p-tolueno-sulfonilo, grupos carboxibenzoxi, grupos tbutiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres e hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados de O-acilo o de O-alquilo. También se incluyen como derivados químicos los péptidos que contienen derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo: la 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; la 3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; la homoserina puede sustituirse por serina y la ornitina por lisina. Los derivados también incluyen péptidos que contienen una o más adiciones o deleciones siempre que se mantenga la actividad requerida. Otras modificaciones incluidas son la amidación, la acilación del terminal amino (p. ej., la acetilación o la amidación con ácido tioglicólico), la carboxilamidación terminal (p. ej., con amoníaco o metilamina), y modificaciones terminales similares.

Como alternativa, o además, uno o más aminoácidos pueden estar glicosilados, tal como glicosilación ligada a N (en la que las fracciones de glicano están unidas a un nitrógeno de las cadenas laterales de asparagina o arginina) y/o la glicosilación ligada a O [en la que las fracciones de glicano están unidas al oxígeno hidroxilo de serina, treonina, tirosina, hidroxilisina o hidroxiprolina). En la técnica son bien conocidos los métodos para la producción de anticuerpos glicosilados (por ejemplo, véase Jefferis, 2009, Nature Reviews Drug Discovery 8:226-234).

Los expertos en la materia apreciarán adicionalmente que los compuestos peptidomiméticos también pueden ser útiles. El término "peptidomimético" se refiere a un compuesto que imita la conformación y los rasgos deseables de un péptido particular como agente terapéutico.

Por ejemplo, el dicho polipéptido incluye no solo moléculas en las que los restos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino también moléculas en las que se invierte el enlace peptídico. Tales peptidomiméticos retroinversos se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, tales como los descritos en Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Este enfoque implica preparar pseudopéptidos que contienen cambios que implican la cadena principal y no la orientación de las cadenas laterales. Los péptidos retroinversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis. De manera alternativa, el dicho polipéptido puede ser un compuesto peptidomimético en donde uno o más restos de aminoácidos están unidos mediante un enlace -y(CH²NH)- en lugar del enlace amida convencional.

En una alternativa adicional, el enlace peptídico se puede dispensar en conjunto siempre que se use una fracción enlazadora adecuada que conserve la separación entre los átomos de carbono de los restos de aminoácidos; puede ser ventajoso para la fracción enlazadora que tenga sustancialmente la misma distribución de cargas y sustancialmente la misma planitud que un enlace peptídico.

Se apreciará también que el dicho polipéptido puede estar bloqueado convenientemente en su extremo N o C de modo que ayude a reducir la susceptibilidad a la digestión exoproteolítica.

Se ha usado también varios aminoácidos no codificados o modificados, tales como D-aminoácidos y N-metil aminoácidos, para modificar péptidos de mamíferos. Adicionalmente, una conformación bioactiva supuesta puede estabilizarse mediante una modificación covalente, tal como una ciclación o mediante la incorporación de lactama u otros tipos de puentes, por ejemplo, véanse Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636 y Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166.

En una realización, el anticuerpo biespecífico de la invención es capaz de inducir inmunidad tumoral. Esto puede analizarse in vitro en ensayos de activación de células T, p. ej., midiendo la producción de IL-2 e IFNy. La activación de células T efectoras indicaría que una respuesta de células T específica de tumor se puede lograr in vivo. Además, una respuesta antitumoral en un modelo in vivo, tal como un modelo de ratón, implicaría que se ha logrado una respuesta inmunitaria al tumor satisfactoria.

De este modo, el anticuerpo biespecífico puede modular la actividad de una célula del sistema inmunitario diana, en donde dicha modulación es un aumento o disminución en la actividad de dicha célula. Dichas células incluyen células T, células dendríticas y células citolíticas naturales.

La célula del sistema inmunitario es normalmente un célula T. De este modo, el anticuerpo puede aumentar la actividad de una célula T efectora CD4+ o CD8+ o puede disminuir la actividad de una célula T reguladora (Treg). En cualquier caso, el efecto neto del anticuerpo será un aumento en la actividad de las células T efectoras, particularmente, células T efectoras CD8+. Los métodos para determinar un cambio en la actividad de las células T efectoras son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, medir un aumento en el nivel de producción de citoquinas de células T (p. ej., IFN-Y o IL-2) o un aumento en la proliferación de células T en presencia del anticuerpo en relación con el nivel de producción de citoquinas de células T y/o la proliferación de células T en presencia de un control. Los ensayos para la proliferación celular y/o la producción de citoquinas son bien conocidos.

Por ejemplo, el anticuerpo puede ser capaz de inducir:

(a) una activación de células T citotóxicas, es decir, células T CD8+;

(b) una activación de células T auxiliares, es decir, células T CD4+;

(c) una activación de células dendríticas;

(d) una activación de células citolíticas naturales; y/o

(e) una reprogramación de Tregs en células T efectoras (véase Akhmetzyanova et al., 2016, J Immunol.

196(1):484-92).

El anticuerpo de la invención o los dominios de unión del mismo también se pueden caracterizar y definir por sus capacidades de unión. Se conocen bien en la técnica ensayos convencionales para evaluar la capacidad de unión de ligandos hacia dianas, incluyendo, por ejemplo, ELISA, transferencias Western, RIA y análisis de citometría de flujo. Las cinéticas de unión (p. ej., la afinidad de unión) del polipéptido también se pueden evaluar mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica, tales como mediante análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR).

Las expresiones "actividad de unión" y "afinidad de unión" tienen por objeto referirse a la tendencia de una molécula de polipéptido a unirse o no a una diana. La afinidad de unión puede cuantificarse determinando la constante de disociación (Kd) para un polipéptido y su diana. Una Kd inferior es indicativa de una mayor afinidad por una diana. De manera similar, la especificidad de unión de un polipéptido a su diana puede definirse en términos de las constantes de disociación (Kd) comparativas del polipéptido para su diana en comparación con la constante de disociación con respecto al polipéptido y otra molécula no diana.

El valor de esta constante de disociación puede determinarse directamente por métodos bien conocidos y puede calcularse incluso para mezclas complejas por métodos tales como, por ejemplo, los establecidos en Caceci et al. (Byte 9:340-362, 1984). Por ejemplo, la Kd puede establecerse usando un ensayo de unión de filtro de nitrocelulosa de doble filtro tal como el desvelado por Wong y Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). Se conocen en la técnica otros ensayos convencionales para evaluar la capacidad de unión de ligandos tales como anticuerpos hacia dianas, incluyendo, por ejemplo, ELISA, transferencias Western, RIA y análisis de citometría de flujo. Las cinéticas de unión (p. ej., la afinidad de unión) del anticuerpo también se pueden evaluar mediante ensayos convencionales conocidos en la técnica, tales como análisis del sistema Biacore™.

Puede realizarse un ensayo de unión competitiva en el que la unión del anticuerpo a la diana se compara con la unión de la diana por otro ligando conocido de esa diana, tal como otro anticuerpo. La concentración a la que se produce un 50 % de inhibición se conoce como Ki. En condiciones ideales, la Ki es equivalente a la Kd. El valor de Ki nunca será menor que la Kd, de manera que la medición de la Ki puede sustituirse convenientemente para proporcionar un límite superior para la Kd.

Las medidas alternativas de afinidad de unión incluyen CE⁵⁰ o CI⁵⁰. En este contexto, CE⁵⁰ indica la concentración a la que un polipéptido alcanza el 50 % de su máxima unión a una cantidad fija de diana. CI⁵⁰ indica la concentración a la que un polipéptido inhibe el 50% de la máxima unión de una cantidad fija de competidor a una cantidad fija de diana. En ambos casos, un nivel más bajo de CE⁵⁰ o CI⁵⁰ indica una mayor afinidad por una diana. Los valores de CE⁵⁰ y CI ⁵⁰ de un ligando para su diana pueden determinarse mediante métodos bien conocidos, por ejemplo, ELISA. Los ensayos adecuados para evaluar la CE⁵⁰ y la CI⁵⁰ de los polipéptidos se exponen en los Ejemplos.

Un anticuerpo biespecífico de la invención es preferentemente capaz de unirse a su diana con una afinidad que es al menos el doble, 10 veces, 50 veces, 100 veces o mayor que su afinidad por unirse a otra molécula no diana.

Dominios de unión a CD137

Los anticuerpos biespecíficos de la invención comprenden un dominio de unión (B1) que es capaz de unirse específicamente a CD137.

Ventajosamente, el dominio de unión B1 se une a CD137 humano con una Kd inferior a 10 x 10^-9 M, por ejemplo inferior a 4 x 10^-9 M o inferior a 1,2 x 10^-9 M.

El dominio de unión B1 comprende CDRL1 correspondiente al SEQ ID NO: 54, CDRL2 correspondiente al SEQ ID NO: 55, y CDRL3 correspondiente al SEQ ID NO: 83, y CDRH1 correspondiente al SEQ ID NO: 62 o una variante de CDRH1 que comprende solo una mutación de aminoácidos en relación con el SEQ ID NO: 62, CDRH2 correspondiente al SEQ iD NO: 69, y CDRH3 correspondiente al SEQ ID NO: 76.

De este modo, el dominio de unión B1 puede comprender la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 1618/1619 (SEQ ID NO: 35 y/o SEQ ID NO: 33.

Los expertos en la materia apreciarán que los polipéptidos biespecíficos de la invención pueden comprender alternativamente variantes de las regiones variables definidas anteriormente.

Una variante de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada o ligera citadas en el presente documento puede ser una variante de sustitución, deleción o adición de dicha secuencia. Una variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 20, hasta 30 o más sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de la dicha secuencia. Las variantes de "deleción" pueden comprender la deleción de aminoácidos individuales, deleción de pequeños grupos de aminoácidos tales como 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o deleción de regiones de aminoácidos más grandes, tal como la deleción de dominios de aminoácidos específicos u otros rasgos. Las variantes de "sustitución" implican preferentemente el reemplazo de uno o más aminoácidos con el mismo número de aminoácidos y la realización de sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, un aminoácido puede sustituirse con un aminoácido alternativo que tenga propiedades similares, por ejemplo, otro aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro aminoácido neutro, otro aminoácido cargado, otro aminoácido hidrófilo, otro aminoácido hidrófobo, otro aminoácido polar, otro aminoácido aromático u otro aminoácido alifático. Algunas propiedades de los 20 aminoácidos principales que se pueden usar para seleccionar sustituyentes adecuados son las siguientes:

En el presente documento, los aminoácidos pueden denominarse por su nombre completo, código de tres letras o código de una sola letra.

Los "derivados" o "variantes" preferidos incluyen aquellos en los que, en lugar del aminoácido de origen natural, el aminoácido que aparece en la secuencia es un análogo estructural de los mismos. Los aminoácidos usados en las secuencias también pueden derivatizarse o modificarse, p. ej., etiquetarse, siempre que la función del anticuerpo no se vea afectada de manera significativa.

Los derivados y variantes como se ha descrito anteriormente se pueden preparar durante la síntesis del anticuerpo o mediante modificación posterior a la producción, o cuando el anticuerpo está en forma recombinante usando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria o escisión enzimática y/o ligamiento de ácidos nucleicos.

Preferentemente, las variantes tienen una secuencia de aminoácidos que tiene más del 60 % o más del 70 %, p. ej., 75 u 80 %, preferentemente más del 85 %, p. ej., más del 90 o 95 % de identidad de aminoácidos con una secuencia como se muestra en las secuencias divulgadas en el presente documento (p. ej., las secuencias de la región VH o VL, o las secuencias de CDR en las mismas). Este nivel de identidad de aminoácidos puede verse en toda la longitud de la secuencia SEQ ID NO relevante o en una parte de la secuencia, tal como en 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 o más aminoácidos, dependiendo del tamaño del polipéptido de longitud completa.

Por ejemplo, las variantes de la secuencia de CDRH1 tienen solo una mutación de aminoácidos en relación con la secuencia de referencia (tal como una deleción, sustitución y/o inserción de un aminoácido).

En relación con las secuencias de aminoácidos, "identidad de secuencia" se refiere a secuencias que tienen el valor establecido cuando se evalúan usando ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(22):4673-80; cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en el presente documento) con los siguientes parámetros:

Parámetros de alineación por pares - Método: preciso, Matriz: PAM, Penalización por apertura de hueco: 10,00, Penalización por extensión de hueco: 0,10;

Múltiples parámetros de alineación - Matriz: PAM, Penalización por apertura de hueco: 10,00, % de identidad por retraso: 30, Penalizar huecos finales: activado, Distancia de separación de huecos: 0, Matriz negativa: no, Penalización por extensión de hueco: 0,20, Penalizaciones por hueco específico de resto: activado, Penalizaciones por hueco hidrófilo: activado, Restos hidrófilos: GPSNDQEKR. La identidad de secuencia en un resto particular tiene por objeto incluir restos idénticos que simplemente se han derivatizado.

De este modo, en una realización, el dominio de unión B1 puede comprender una o más variantes de las regiones variables de la cadena ligera definidas anteriormente y/o dichas regiones variables de la cadena pesada que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia en ellas.

En realizaciones preferidas, el dominio de unión B1 comprende la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 1618/1619.

De manera alternativa, el dominio de unión B1 comprende la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 1618/1619 (SEQ ID NO: 35 y/o SEQ ID NO: 33), o una variante que tiene más del 60 % o más del 70 %, p. ej., 75 u 80 %, preferentemente más del 85 %, p. ej., más del 90 o 95 % de identidad de aminoácido con SEQ ID n O: 35 y/o SEC ID NO: 33).

Dominios dirigidos a células tumorales

Los polipéptidos biespecíficos de la invención comprenden además un dominio de unión (B2) que es capaz de unirse específicamente a un antígeno asociado a células tumorales, en donde el antígeno asociado a células tumorales es 5T4.

Por "antígeno asociado a células tumorales", los presentes investigadores incluyen proteínas accesibles en la superficie extracelular de las células tumorales, de manera que sean accesibles a los polipéptidos biespecíficos de la invención tras la administración en el cuerpo. En una realización, el antígeno asociado a células tumorales es específico del tumor, es decir, se encuentra exclusivamente en células tumorales y no en células normales y sanas. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán que el antígeno asociado a células tumorales puede expresarse preferentemente en células tumorales, es decir, se expresa en células tumorales a un nivel más alto que en células sanas normales (por tanto, la expresión del antígeno en células tumorales puede ser al menos cinco veces más que en células sanas normales, por ejemplo, niveles de expresión en células tumorales de al menos diez veces más, veinte veces más, cincuenta veces más o superior).

El antígeno asociado a células tumorales es el antígeno oncofetal, 5T4 (por ejemplo, véase UniProt Q13641).

En una realización, la célula tumoral es una célula tumoral sólida.

Por ejemplo, el tumor sólido puede seleccionarse de los grupos que consisten en carcinoma de células renales, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de mama, melanomas, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro/del SNC, cáncer de cuello del útero, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza/cuello, cáncer de riñón, cáncer de hígado, linfomas, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y sarcomas.

Ventajosamente, el dominio de unión B2 se une al antígeno asociado a células tumorales con una Kd inferior a 10 x 10^-9 M, por ejemplo inferior a 4 x 10^-9 M o inferior a 1,2 x 10^-9 M.

El dominio de unión B2 comprende CDRL1 correspondiente al SEQ ID NO: 54 o una variante de CDRL1 que tiene solo una mutación de aminoácidos en relación con el SEQ ID NO: 54, CDRL2 correspondiente al SEQ ID NO: 55, y CDRL3 correspondiente al SEQ ID NO: 58; y CDRH1 correspondiente al SEQ ID NO: 46, CDRH2 correspondiente al SEQ ID NO: 48, y CDRH3 correspondiente al SEQ ID NO: 52.

De este modo, el dominio de unión B2 puede comprender la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 1210/1211 (SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 9).

Los expertos en la técnica apreciarán que el dominio de unión B2 puede comprender alternativamente variantes de dichas regiones variables de la cadena ligera y/o dichas regiones variables de la cadena pesada, por ejemplo, teniendo al menos un 90 % de identidad de secuencia en ellas.

Por ejemplo, las variantes de la secuencia de CDRL1 tienen solo una mutación de aminoácidos en relación con la secuencia de referencia (tal como una deleción, sustitución y/o inserción de un aminoácido).

En una realización, el dominio de unión B2 comprende la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 1210/1211.

De manera alternativa, el dominio de unión B2 comprende la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 1210/1211 (SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 9), o una variante que tiene más del 60 % o más del 70 %, p. ej., 75 u 80 %, preferentemente más del 85 %, p. ej., más del 90 o 95 % de identidad de aminoácido con el SEQ ID NO: 11 y/o Se Q ID NO: 9).

Anticuerpos biespecíficos CD137-5T4 ilustrativos

En una realización preferida de los polipéptidos biespecíficos de la invención, el dominio de unión B1 es una lgG y el dominio de unión B2 es un scFv. En cambio, el dominio de unión B1 ser un scFv y el dominio de unión B2 puede ser una lgG.

En una realización alternativa de los polipéptidos biespecíficos de la invención, el dominio de unión B1 es un scFv y el dominio de unión B2 es un scFv (p. ej., en un formato scFv²-Fc).

En los polipéptidos biespecíficos ilustrativos de la invención, B1 comprende las tres CDRs de la cadena ligera y/o las tres CDRs de la cadena pesada del anticuerpo 1618/1619 (SEQ ID NOs: 54, 55 y 83 y SEQ ID NOs: 62, 69 y 76) y B2 comprende las tres CDRs de la cadena ligera y las tres CDRs de la cadena pesada del anticuerpo 1210/1211 (SEQ ID NOs: 54, 55 y 58 y SEQ ID NOs: 46, 48 y 52).

En una realización preferida, B1 comprende la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 1210/1211 (SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 9) y B2 comprende la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 1618/1619 (s Eq ID NO: 35 y/o SEQ ID NO: 33), o variantes de dichas regiones variables de la cadena ligera y/o dichas regiones variables de la cadena pesada (por ejemplo, que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia con las mismas).

Normalmente, los polipéptidos de anticuerpos biespecíficos de la invención comprenderán secuencias de región constante, además de las secuencias de región variable definidas anteriormente.

Una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena pesada ilustrativa que puede combinarse con cualquier secuencia de región VH divulgada en el presente documento (para formar una cadena pesada completa) es la siguiente secuencia de región constante de cadena pesada de IgG1:

AS TKG P SVFP LA PSS K S TS G G TA A LG C LV K D Y FP E P V TV S W N S G A LTS G V H TFP A V LQ S

S G LY S LS S W T V P S S S LG T Q T Y IC N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E LLG

G P S V FLF P P K P K D T LM IS R T P E V T C V W D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K TK P R E E Q

Y N S T Y R W S V LT V LH Q D W LN G K E Y K C K V S N K A LP A P IE K T IS K A K G Q P R E P Q V Y T LP P S R

D E LTKN Q VS LTC LV KG FY PSD IA VE W ES N G Q PE N N Y KTTPP VLD S D G SFFLY SKLTVD KS

R W Q Q G N V FSC SV M H E ALH N H YTQ K SLSLSPG K

[SEQ ID NO:94]

o una de variante de la misma que comprende las mutaciones L234A y L235A ("LALA") (véase los restos de aminoácidos resaltados anteriormente).

De igual modo, una secuencia de aminoácidos de región constante de cadena ligera ilustrativa que puede combinarse con cualquier secuencia de región VL divulgada en el presente documento (para formar una cadena ligera completa) es la secuencia de región constante de cadena kappa reproducida en este caso:

R TV A A P S V FIFP P S D E Q LK S G T A S W C LLN N F Y P R E A K V Q W K V D N A LQ S G N S Q E S V T E Q

D S K D S TY S LSS TLTLS KA D Y EK H K VYA C EVTH Q G LSS PV TK SFN R G EC

[SEQ ID NO:95],

De este modo, el anticuerpo biespecífico de la invención puede comprender:

(a) un dominio de unión (B1) que comprende una región variable de la cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NOs: 33 y una región variable de la cadena ligera de cualquiera de las SEQ ID NOs: 35;

(b) una región constante de la cadena pesada que comprende una región Fc (por ejemplo, SEQ ID NO: 94 o 96); (c) un dominio de unión (B2) que comprende una región variable de la cadena pesada de cualquiera de las SEQ ID NOs: 9 y una región variable de la cadena ligera de cualquiera de las SEQ ID NOs: 11; y

(d) opcionalmente, una región constante de cadena ligera (por ejemplo SEQ ID NO:95).

En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico de la invención es un anticuerpo biespecífico lgG-scFv (por ejemplo, en donde B1 es una lgG intacta y B2 es un scFv unido al extremo C de una cadena pesada de la lgG, o viceversa).

Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico puede comprender los siguientes componentes:

(a) dos cadenas pesadas comprendiendo cada una, en orden del extremo N al extremo C:

[una secuencia VH] -[una región constante de cadena H] -[un conector] -[un scFv]

en donde el scFv puede comprender o consistir en orden del extremo N al extremo C:

[una secuencia VH] -[un enlazador] -[una secuencia VL], o viceversa

(b) dos cadenas ligeras comprendiendo cada una, en orden del extremo N al extremo C:

[una secuencia VL] -[una región constante de cadena L]

En dichos anticuerpos biespecíficos con "formato Morrison":

- las secuencias de VH pueden seleccionarse del clon 1618 (SEQ ID NO: 33), clon 1210 (SEQ ID NO: 9) o una variante de los mismos;

- la región constante de cadena pesada puede seleccionarse de cualquiera de las divulgadas en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO: 86 o 94;

- el conector puede seleccionarse de cualquiera de los divulgados en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NOs: 92 o 140 o 143;

- el enlazador en el scFv puede seleccionarse de cualquiera de los divulgados en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO:93, y

- la secuencia de VL en el scFv puede seleccionarse del clon 1619 (SEQ ID NO: 35), clon 1211 (SEQ ID NO: 11) o una variante de los mismos; y

- la región constante de cadena ligera puede seleccionarse de cualquiera de las divulgadas en el presente documento, por ejemplo, SEQ ID NO:95.

Como se ha analizado anteriormente, los métodos para la producción de polipéptidos de anticuerpo de la invención son bien conocidos en la técnica.

De manera práctica, el polipéptido de anticuerpo es o comprende un polipéptido recombinante. Los métodos adecuados para la producción de tales polipéptidos recombinantes son bien conocidos en la técnica, tales como la expresión en células hospedadoras procariotas o eucariotas (por ejemplo, véase Green y Sambrook, 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cuarta Edición, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Los polipéptidos de anticuerpos de la invención también pueden producirse usando un sistema de traducción in vitro disponible en el mercado, tal como lisado de reticulocitos de conejo o lisado de germen de trigo (disponible en Promega). Preferentemente, el sistema de traducción es lisado de reticulocitos de conejo. De manera práctica, el sistema de traducción se puede acoplar a un sistema de transcripción, tal como el sistema de traducción y transcripción TNT (Promega). Este sistema tiene la ventaja de producir un transcrito de ARNm adecuado a partir de un polinucleótido de ADN codificante en la misma reacción que la traducción.

Los expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos de anticuerpos de la invención pueden sintetizarse como alternativa de forma artificial, por ejemplo, usando técnicas bien conocidas de síntesis en fase líquida o en fase sólida (tales como la síntesis de péptidos en fase sólida t-Boc o Fmoc).

Polinucleótidos, vectores y células

Un segundo aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido biespecífico de uno cualquiera de los anticuerpos biespecíficos como se describe en las reivindicaciones.

Las expresiones "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento de gen, ARN mensajero (ARNm), ADNc, polinucleótidos recombinantes, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Puede proporcionarse un polinucleótido de la invención en forma aislada o sustancialmente aislada. Por sustancialmente aislado/a, se entiende que puede haber un aislamiento sustancial, pero no total, del polipéptido de cualquier medio circundante. Los polinucleótidos se pueden mezclar con vehículos o diluyentes que no interferirán con el uso previsto y aún se considerarán sustancialmente aislados.

Una secuencia de ácido nucleico que "codifica" un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan mediante un codón de inicio en el extremo (amino) terminal 5' y un codón de parada de traducción en el extremo (carboxi) terminal 3'. Para los fines de la invención, dichas secuencias de ácido nucleico pueden incluir, aunque no de forma limitativa, ADNc de ARNm viral, procariótico o eucariótico, secuencias genómicas de ADN o ARN viral o procariótico, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de terminación de la transcripción se puede ubicar 3' de la secuencia de codificación.

Una secuencia polinucleotídica adecuada puede ser alternativamente una variante. Por ejemplo, una variante puede ser una variante de sustitución, deleción o adición de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico anteriores. Un polinucleótido variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 75 o más sustituciones y/o deleciones de ácidos nucleicos de las secuencias dadas en el listado de secuencias.

Las variantes pueden ser al menos un 70 % homólogas con un polinucleótido de una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico divulgadas en el presente documento, preferentemente al menos un 80 o 90 % y más preferentemente al menos un 95 %, 97 % o 99 % homólogas con las mismas. Preferentemente, la homología y la identidad a estos niveles están presentes al menos con respecto a las regiones de codificación de los polinucleótidos. Los métodos para medir la homología son bien conocidos en la técnica y los expertos en la materia entenderán que en el presente contexto, la homología se calcula sobre la base de la identidad del ácido nucleico. Tal homología puede existir en una región de al menos 15, preferentemente al menos 30, por ejemplo al menos 40, 60, 100, 200 o más nucleótidos contiguos. Tal homología puede existir en toda la longitud de la secuencia de polinucleótidos no modificada.

Se conocen en la técnica métodos para medir la homología o identidad de los polinucleótidos. Por ejemplo, el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (p. ej., usado en sus ajustes por defecto) (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387-395).

Los algoritmos PILEUP y BLAST también pueden usarse para calcular la homología o secuencias de alineación (normalmente en sus ajustes por defecto), por ejemplo, como se describe en Altschul, 1993, J Mol Evol 36:290-300; Altschul et al, 1990, J Mol Biol 215:403-10).

El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero un par de secuencias de alta puntuación (HSP, por sus siglas en inglés) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que coinciden o satisfacen alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere al umbral de la puntuación de palabra vecina (Altschul et al, supra). Estos aciertos de palabra adyacente iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que los contengan. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineación acumulativa. Las extensiones de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos con valor negativo; o se alcanza el final de una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919), alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase, p. ej., Karlin y Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787. Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que sucedería una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de suma más pequeña en comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menos de aproximadamente 1, preferentemente menos de aproximadamente 0,1, más preferentemente menos de aproximadamente 0,01 y, lo más preferentemente, menos de aproximadamente 0,001.

El homólogo puede diferir de una secuencia en el polinucleótido relevante en menos de 3, 5, 10, 15, 20 o más mutaciones (cada una de las cuales puede ser una sustitución, deleción o inserción).

Estas mutaciones se pueden medir en una región de al menos 30, por ejemplo al menos 40, 60 o 100 o más nucleótidos contiguos del homólogo.

En una realización, una secuencia variante puede variar de las secuencias específicas dadas en el listado de secuencias en virtud de la redundancia en el código genético. El código de ADN tiene 4 restos de ácidos nucleicos primarios (A, T, C y G) y los usa para "deletrear" codones de tres letras que representan los aminoácidos que codifican las proteínas en los genes de un organismo. La secuencia lineal de codones a lo largo de la molécula de ADN se traduce en la secuencia lineal de aminoácidos en la(s) proteína(s) codificada(s) por esos genes. El código está muy degenerado, con 61 codones que codifican los 20 aminoácidos naturales y 3 codones que representan señales de "parada". De este modo, la mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un codón; de hecho, varios están codificados por cuatro o más codones diferentes. Por lo tanto, un polinucleótido variante de la invención puede codificar la misma secuencia polipeptídica al igual que otro polinucleótido de la invención, pero puede tener una secuencia de ácido nucleico diferente debido al uso de diferentes codones para codificar los mismos aminoácidos.

Por tanto, un anticuerpo biespecífico de la invención puede producirse o suministrarse en forma de un polinucleótido que lo codifica y es capaz de expresarlo.

Los polinucleótidos de la invención se pueden sintetizar de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, como se describe a modo de ejemplo en Green y Sambrook (2012, Molecular Cloning - a laboratory manual, 4a edición; Cold Spring Harbor Press).

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden proporcionar en forma de un casete de expresión que incluye secuencias de control unidas operativamente a la secuencia insertada, permitiendo así la expresión del polipéptido de la invención in vivo. Estos casetes de expresión, a su vez, se proporcionan normalmente dentro de vectores (p. ej., plásmidos o vectores virales recombinantes). Dicho casete de expresión puede administrarse directamente a un sujeto huésped. De manera alternativa, un vector que comprende un polinucleótido de la invención puede administrarse a un sujeto huésped. Preferentemente, el polinucleótido se prepara y/o administra usando un vector genético. Un vector adecuado puede ser cualquier vector que sea capaz de transportar una cantidad suficiente de información genética y permitir la expresión de un anticuerpo de la invención.

Por tanto, la presente invención incluye vectores de expresión que comprenden tales secuencias de polinucleótidos. Dichos vectores de expresión se construyen de forma rutinaria en la técnica de la biología molecular y pueden implicar, por ejemplo, el uso de ADN plasmídico e iniciadores, promotores, potenciadores y otros elementos apropiados, tales como por ejemplo señales de poliadenilación que pueden ser necesarias y que se colocan en la orientación correcta, con el fin de permitir la expresión de un péptido de la invención. Otros vectores adecuados resultarían evidentes para los expertos en la materia (véase Green y Sambrook, supra).

La invención también incluye células que se han modificado para expresar un anticuerpo biespecífico de la invención. Dichas células incluyen líneas celulares eucariotas superiores transitorias o preferentemente estables, tales como células de mamíferos o células de insectos, células eucariotas inferiores, tales como células de levadura o procariotas tales como células bacterianas. Los ejemplos particulares de células que pueden modificarse mediante la inserción de vectores o casetes de expresión que codifican un polipéptido de la invención incluyen células HEK293T, CHO, HeLa, NS0 y COS de mamífero. Preferentemente, la línea celular seleccionada será una que no solo sea estable, sino que también permita la glicosilación madura y la expresión en la superficie celular de un polipéptido.

Dichas líneas celulares de la invención pueden cultivarse usando métodos rutinarios para producir un anticuerpo biespecífico de la invención, o pueden usarse terapéutica o profilácticamente para suministrar anticuerpos de la invención a un sujeto. De manera alternativa, polinucleótidos, casetes de expresión o vectores de la invención se pueden administrar a una célula de un sujeto ex vivo y luego la célula regresa al cuerpo del sujeto.

En una realización, la molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada de anticuerpo o región variable de la misma.

En una realización, la molécula de ácido nucleico codifica una cadena ligera de anticuerpo o región variable de la misma.

Por "molécula de ácido nucleico" los presentes investigadores incluyen moléculas de ADN (p. ej., ADN genómico o ADN complementario) y de ARNm, que pueden ser monocatenarias o bicatenarias. Por "aislado/a" los presentes investigadores entiende que la molécula de ácido nucleico no está localizada o proporcionada de otra manera dentro de una célula.

En una realización, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADNc.

Los expertos en la materia apreciarán que la molécula de ácido nucleico puede ser optimizada por codones para la expresión del polipéptido de anticuerpo en una célula huésped particular, p. ej., para la expresión en células humanas (por ejemplo, véase Angov, 2011, Biotechnol. J. 6(6):650-659).

También se incluyen dentro del alcance de la invención lo siguiente:

(a) un tercer aspecto de la invención proporciona un vector (tal como un vector de expresión) que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención;

(b) un cuarto aspecto de la invención proporciona una célula hospedadora (tal como una célula de mamífero, p. ej., una célula humana o célula de ovario de hámster chino, p. ej., células CHOK1SV) que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención o un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención; y

(c) un quinto aspecto de la invención proporciona un método para fabricar un anticuerpo biespecífico de acuerdo con el primer aspecto de la invención que comprende cultivar una población de células hospedadoras de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención en condiciones en las que se expresa dicho polipéptido, y aislar el anticuerpo biespecífico del mismo.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de anticuerpo biespecífico de la invención. La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende además al menos un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los expertos en la materia apreciarán que también puedan incluirse compuestos adicionales en las composiciones farmacéuticas, incluyendo, agentes quelantes, tales como EDTA, citrato, EGTA o glutatión.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse de una manera conocida en la técnica que sea suficientemente estable en almacenamiento y adecuada para la administración a seres humanos y animales. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden liofilizarse, por ejemplo, mediante secado por congelación, secado por pulverización, enfriamiento por pulverización o mediante el uso de la formación de partículas a partir de la formación de partículas supercríticas.

Por "farmacéuticamente aceptable" los presentes investigadores quieren decir un material no tóxico que no disminuye la eficacia de la actividad de unión a CD137 y 5T4 del polipéptido de anticuerpo de la invención. Tales tampones, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (véase Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)).

El término "tampón" pretende significar una solución acuosa que contiene una mezcla ácido-base con la finalidad de estabilizar el pH. Ejemplos de tampones son Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazoláctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.

El término "diluyente" pretende significar una solución acuosa o no acuosa con la finalidad de diluir el polipéptido de anticuerpo en la preparación farmacéutica. El diluyente puede ser uno o más de solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tales como aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón o aceite de sésamo).

El término "adyuvante" pretende significar cualquier compuesto añadido a la formulación para aumentar el efecto biológico del polipéptido de anticuerpo de la invención. El adyuvante puede ser uno o más de sales de zinc, cobre o plata con diferentes aniones, por ejemplo, pero sin limitación, fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato y acetatos de diferente composición acílica. El adyuvante también puede ser polímeros catiónicos tales como éteres de celulosa catiónicos, ésteres de celulosa catiónicos, ácido hialurónico desacetilado, quitosano, dendrímeros catiónicos, polímeros sintéticos catiónicos tales como poli(vinil imidazol) y polipéptidos catiónicos tales como polihistidina, polilisina, poliarginina y péptidos que contienes esos aminoácidos.

El excipiente puede ser uno o más de carbohidratos, polímeros, lípidos y minerales. Ejemplos de carbohidratos incluyen lactosa, glucosa, sacarosa, manitol y ciclodextrinas, que se añaden a la composición, p. ej., para facilitar la liofilización. Ejemplos de polímeros son almidón, éteres de celulosa, carboximetilcelulosa de celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carragenina, ácido hialurónico y derivados de los mismos, ácido poliacrílico, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolímeros polietilenóxido/óxido de propileno, alcohol polivinílico/polivinilacetato de diferente grado de hidrólisis y polivinilpirrolidona, todos ellos de diferente peso molecular, que se añaden a la composición, p. ej., para el control de la viscosidad, para lograr bioadhesión o para proteger el lípido de la degradación química y proteolítica. Ejemplos de lípidos son ácidos grasos, fosfolípidos, mono-, di- y triglicéridos, ceramidas, esfingolípidos y glucolípidos, todos ellos de diferente longitud de cadena de acilo y saturación, lecitina de huevo, lecitina de soja, huevo hidrogenado y lecitina de soja, que se añaden a la composición por razones similares a las de los polímeros. Ejemplos de minerales son talco, óxido de magnesio, óxido de zinc y óxido de titanio, que se añaden a la composición para obtener beneficios tales como la reducción de la acumulación de líquido o las propiedades de pigmento ventajosas.

Los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden formularse en cualquier tipo de composición farmacéutica conocida en la técnica como adecuada para el suministro de los mismos.

En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en forma de un liposoma, en el que se combina el anticuerpo, además de otros vehículos farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos tales como lípidos, que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles y cristales líquidos. Los lípidos adecuados para la formulación liposomal incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y similares. Los lípidos adecuados también incluyen los lípidos modificados anteriormente por el poli(etilenglicol) en el grupo de la cabeza polar para prolongar el tiempo de circulación del torrente sanguíneo. La preparación de dichas formulaciones liposomales se puede encontrar por ejemplo en el documento US 4.235.871.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de microesferas biodegradables. Poliésteres alifáticos, tales como poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímeros de PLA y PGA (PLGA) o poli(carprolactona) (PCL) y polianhídridos se han usado ampliamente como polímeros biodegradables en la producción de microesferas. Las preparaciones de dichas microesferas se pueden encontrar en los documentos US 5.851.451 y EP 0213303.

En una realización adicional, las composiciones farmacéuticas de la invención se proporcionan en forma de geles poliméricos, en los que polímeros tales como almidón, éteres de celulosa, carboximetilcelulosa de celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carragenina, ácido hialurónico y derivados de los mismos, ácido poliacrílico, polivinil imidazol, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolímeros polietilenóxido/óxido de propileno, alcohol polivinílico/polivinilacetato de diferente grado de hidrólisis y polivinilpirrolidona se usan para espesar la solución que contiene el agente. Los polímeros también pueden comprender gelatina o colágeno.

De manera alternativa, el polipéptido de anticuerpo puede disolverse simplemente en solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tales como aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón o aceite de sésamo), goma de tragacanto y/o diversos tampones.

Se apreciará que las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir iones y un pH definido para la potenciación de la acción del polipéptido del anticuerpo activo. De manera adicional, las composiciones pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, tampones, cargas, etc.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden administrarse por cualquier vía adecuada conocida por los expertos en la técnica. De este modo, las posibles vías de administración incluyen parenteral (intravenosa, subcutánea e intramuscular), tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral, parenteral, vaginal y rectal. También es posible la administración desde implantes.

En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intracerebroventricular, intraarticular, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, intracraneal, intramuscular o subcutánea o pueden administrarse mediante técnicas de infusión. Se usan oportunamente en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa para hacer que la solución sea isotónica con la sangre. Las soluciones acuosas deben tamponarse adecuadamente (preferentemente a un pH de 3 a 9), si es necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas en condiciones estériles se realiza fácilmente mediante técnicas farmacéuticas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estéril acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hagan que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados y pueden almacenarse en un estado criodesecado (liofilizado) que requiera solo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Se pueden preparar soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

De este modo, las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente adecuadas para la administración parenteral, p. ej., intravenosa.

De manera alternativa, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía intranasal o por inhalación (por ejemplo, en forma de una presentación en rocío por aerosol de un recipiente presurizado, bomba, pulverizador o nebulizador con el uso de un propelente adecuado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse dotándolo de una válvula para suministrar una cantidad medida. El envase, bomba, pulverizador o nebulizador puede contener una solución o suspensión del polipéptido activo, p. ej., usando una mezcla de etanol y el propelente como disolvente, que puede contener adicionalmente un lubricante, p. ej., trioleato de sorbitán. Las cápsulas y los cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener una mezcla de polvo de un compuesto activo y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Las composiciones farmacéuticas se administrarán a un paciente en una dosis farmacéuticamente eficaz. Una "cantidad farmacéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" o "terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a esa cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una afección dada y régimen de administración. Esta es una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir un efecto terapéutico deseado en asociación con el aditivo y diluyente requeridos, es decir, un portador o vehículo de administración. Además, pretende significar una cantidad suficiente para reducir y evitar lo más preferentemente, un déficit clínicamente significativo en la actividad, función y respuesta del huésped. De manera alternativa, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para causar una mejora en una afección clínicamente significativa en un huésped. Como aprecian los expertos en la técnica, la cantidad de un compuesto puede variar dependiendo de su actividad específica. Las cantidades de dosificación adecuadas pueden contener una cantidad predeterminada de composición activa calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido. En los métodos y el uso para la fabricación de composiciones de la invención, se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz del componente activo. El personal médico experto o veterinario puede determinar una cantidad terapéuticamente eficaz basándose en las características del paciente, tales como edad, peso, sexo, afección, complicaciones, otras enfermedades, etc., como se conoce bien en la técnica. La administración de la dosis farmacéuticamente eficaz puede llevarse a cabo tanto por administración única en forma de una unidad de dosis individual como por varias otras unidades de dosis más pequeñas y también por múltiples administraciones de dosis subdivididas a intervalos específicos. De manera alternativa, las dosis pueden proporcionarse como una infusión continua durante un período prolongado.

Las composiciones particularmente preferidas están formuladas para administración sistémica.

La composición puede formularse preferentemente para liberación sostenida durante un período de tiempo. Por tanto, la composición puede proporcionarse en una matriz o como parte de la misma que facilita la liberación sostenida. Las matrices de liberación sostenida preferidas pueden comprender nanopartículas de montanida o de ácido ypoliglutámico (PGA).

Los anticuerpos pueden formularse en diversas concentraciones, dependiendo de la eficacia/toxicidad del polipéptido que se esté usando. Por ejemplo, la formulación puede comprender el anticuerpo activo en una concentración de entre 0,1 |jM y 1 mM, más preferentemente entre 1 j M y 500 j M, entre 500 j M y 1 mM, entre 300 j M y 700 j M, entre 1 j M y 100 j M, entre 100 j M y 200 j M, entre 200 j M y 300 j M, entre 300 j M y 400 j M, entre 400 j M y 500 j M, entre 500 j M y 600 j M, entre 600 j M y 700 j M, entre 800 j M y 900 j M o entre 900 j M y 1 mM. Normalmente, la formulación comprende el anticuerpo activo en una concentración de entre 300 pM y 700 pM.

Normalmente, la dosis terapéutica del anticuerpo (con o sin una fracción terapéutica) en un paciente humano estará en el intervalo de 100 pg a 700 mg por administración (basándose en un peso corporal de 70 kg). Por ejemplo, la dosis terapéutica máxima puede estar en el intervalo de 0,1 a 10 mg/kg por administración, por ejemplo, entre 0,1 y 5 mg/kg o entre 1 y 5 mg/kg o entre 0,1 y 2 mg/kg. Se apreciará que dicha dosis se puede administrar a diferentes intervalos, según lo determine el oncólogo/médico; por ejemplo, una dosis puede administrarse diariamente, dos veces a la semana, semanalmente, cada dos semanas o mensualmente.

Los expertos en la técnica apreciarán que las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse solas o en combinación con otros agentes terapéuticos usados en el tratamiento de cánceres, tales como antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas y otros antibióticos citotóxicos, alcaloides de la vinca, etopósido, compuestos de platino, taxanos, inhibidores de topoisomerasa I, otros fármacos citostáticos, inmunosupresores antiproliferativos, corticoesteroides, hormonas sexuales y antagonistas hormonales, y otros anticuerpos terapéuticos (tales como anticuerpos contra un antígeno asociado a tumores o un modulador de punto de regulación inmunitario).

Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse en combinación con un agente inmunoterapéutico que se une a una diana seleccionada del grupo que consiste en PD-1/PD-1L, CTLA-4, OX40, CD40, GITR, LAG3, TIM3, CD27 y KIR.

De este modo, la invención abarca terapias de combinación que comprenden un anticuerpo biespecífico de la invención junto con un agente inmunoterapéutico adicional, eficaz en el tratamiento del cáncer, que se une específicamente a una molécula de punto de regulación inmunitario. Se apreciará que el beneficio terapéutico del agente inmunoterapéutico adicional puede mediarse atenuando la función de una molécula de punto de regulación inmunitaria inhibitoria y/o activando la función de un punto de regulación inmunitaria estimuladora o molécula coestimuladora.

En una realización, el agente inmunoterapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en:

(a) el agente inmunoterapéutico que inhibe la función de PD-1 y/o PD-1L;

(b) un agente inmunoterapéutico que inhibe la función de CTLA-4;

(c) un agente inmunoterapéutico que activa la función de OX40; y

(d) un agente inmunoterapéutico que se une y activa la función de CD40.

De este modo, el agente inmunoterapéutico adicional puede ser un inhibidor de PD1, tal como un anticuerpo anti-PD1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo capaz de inhibir la función de PD1 (por ejemplo, Nivolumab, Pembrolizumab, Lambrolizumab, PDR-001, MEDI-0680 y AMP-224). De manera alternativa, el inhibidor de PD1 puede comprender o consistir en un anticuerpo anti-PD-L1, o fragmento de unión a antígeno del mismo capaz de inhibir la función de PD1 (por ejemplo, Durvalumab, Atezolizumab, Avelumab y MDX-1105).

En otra realización, el agente inmunoterapéutico adicional es un inhibidor de CTLA-4, tal como un anticuerpo anti-CTLA-4 o porción de unión a antígeno del mismo.

En una realización adicional, el agente inmunoterapéutico adicional activa OX40, tal como un anticuerpo anti-OX40 agonista o porción de unión a antígeno del mismo.

En una realización adicional, el agente inmunoterapéutico adicional activa CD40, tal como un anticuerpo anti-CD40 agonista o porción de unión a antígeno del mismo.

Los expertos en la materia apreciarán que la presencia de los dos agentes activos (como se ha detallado anteriormente) puede proporcionar un beneficio sinérgico en el tratamiento de un tumor en un sujeto. Por "sinérgico" los presentes investigadores incluyen que el efecto terapéutico de los dos agentes en combinación (p. ej., como se determina por la tasa de crecimiento o el tamaño del tumor) es superior al efecto terapéutico aditivo de los dos agentes administrados por sí mismos.

Dicho sinergismo puede identificarse analizando los agentes activos, solos y en combinación, en un modelo de línea celular relevante del tumor sólido.

Usos médicos y métodos

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden usarse en terapia o profilaxis. En aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos o composiciones se administran a un sujeto que ya padece un trastorno o afección, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la afección o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad o un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "cantidad terapéuticamente eficaz". En aplicaciones profilácticas, los anticuerpos o composiciones se administran a un sujeto que aún no presenta síntomas de un trastorno o afección, en una cantidad suficiente para prevenir o retrasar el desarrollo de los síntomas. Dicha cantidad se define como una "cantidad profilácticamente eficaz". El sujeto puede haber sido identificado como en riesgo de desarrollar la enfermedad o afección por cualquier medio adecuado.

De este modo, un séptimo aspecto de la invención proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con el primer aspecto de la invención para su uso en medicina.

Un octavo aspecto de la invención proporciona un anticuerpo biespecífico de acuerdo con el primer aspecto de la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno neoplásico en un sujeto.

Por "tratamiento" los presentes investigadores incluyen tanto el tratamiento terapéutico como el profiláctico del paciente. El término "profiláctico" se usa para abarcar el uso de un agente o una formulación del mismo, como se describe en el presente documento que evita o reduce la probabilidad de un trastorno neoplásico o la propagación, diseminación o metástasis de células cancerosas en un paciente o sujeto. El término "profiláctico" también abarca el uso de un agente o formulación del mismo, como se describe en el presente documento para evitar la reaparición de un trastorno neoplásico en un paciente que se ha tratado previamente por trastorno neoplásico.

En una realización, el trastorno neoplásico está asociado a la formación de tumores sólidos en el cuerpo del sujeto.

De este modo, el tumor sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, melanomas, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro/del SNC, cáncer de cuello del útero, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza/cuello, cáncer de riñón, cáncer de hígado, linfomas, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y sarcomas.

Por ejemplo, el tumor sólido puede seleccionarse de los grupos que consisten en carcinoma de células renales, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de próstata y cáncer de mama.

En una realización, el sujeto es un ser humano.

En una realización, el método comprende administrar sistémicamente el anticuerpo biespecífico.

En una realización, el método comprende además administrar al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales.

La enumeración o análisis de un documento aparentemente publicado previamente en la presente memoria descriptiva no debe considerarse necesariamente un reconocimiento de que el documento forma parte del estado de la técnica o es del conocimiento común general.

El uso de la palabra "un" o "uno/a", cuando se usa junto con la expresión "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva puede significar "uno/a", pero también está en consonancia con el significado de "uno/a o más", "al menos uno/a", y "uno/a o más de uno/a".

Estas y otras realizaciones de la invención se apreciarán y se entenderán mejor cuando se consideren junto con la descripción anterior y los dibujos adjuntos.

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una representación esquemática de la estructura de formatos ilustrativos para un anticuerpo biespecífico de la invención. En cada formato, las regiones constantes se muestran como un relleno de gris claro; regiones de la cadena pesada variables VH1 se muestran en blanco y negro a cuadros; regiones de la cadena ligera variables VL1 se muestran con un relleno de blanco; regiones de la cadena pesada variables VH2 se muestran como un relleno de negro; y las regiones de la cadena ligera variables VL2 se muestran en blanco con líneas diagonales. Los dominios de unión a CD137 (dominio de unión 1) se representan normalmente como un par de un dominio blanco y negro a cuadros con un dominio blanco relleno (VH1/VL1); los dominios de unión a antígeno asociados a tumores (dominio de unión 2) se representan normalmente como un par de un dominio negro relleno y un dominio blanco con líneas diagonales (VH2/VL2). Sin embargo, en todos los formatos mostrados, se apreciará que los dominios de unión 1 y 2 pueden cambiarse. Es decir, un dominio de unión a CD137 puede producirse en una posición mostrada en esta figura para un dominio de antígeno asociado a tumores, y viceversa.

La Figura 2 muestra un ejemplo de un experimento de dosis-respuesta de anticuerpos 5T4 que se unen a células B16 transfectadas con 5T4, analizadas por citometría de flujo.

La Figura 3 muestra los datos de citometría de flujo que muestran la intensidad de fluorescencia media (IFM) normalizada de la unión de mAb 5T4 a una concentración de 2,5 pg/ml a células B16 transfectadas con 5T4. La figura muestra la media ± DT de los datos agrupados de cuatro experimentos, con 1-4 puntos de datos para cada anticuerpo, tal como se indica en la Tabla 2. Los valores de IFM se normalizaron con respecto al anticuerpo de referencia 1628.

La Figura 4 muestra un análisis de dosis-respuesta de la unión del anticuerpo 5T4 a las células CHO transfectadas con 5T4 de cynomolgus.

La Figura 5 es una ilustración de las quimeras de 5T4 usadas para el mapeo de epítopos de los anticuerpos 5T4. A: Cada uno de los dominios indicados E1-E7 se reemplazó por la secuencia de 5T4 de ratón en quimeras de humano/ratón. B: aa 173-420 fueron reemplazados por la secuencia de 5T4 de ratón

La Figura 6 muestra la unión de anticuerpos anti-CD137 ilustrativa a CD137 de humano y cynomolgus. Se incluyen los datos de dos experimentos separados.

La Figura 7 muestra una descripción general de las quimeras de CD137 de humano/ratón. Negro: secuencia de ratón, blanco: secuencia de humano.

La Figura 8 muestra los valores del índice de estimulación normalizados a la referencia 1811/1812.

La Figura 9 muestra el resumen de dos experimentos de competencia de mAb CD137 con la unión de CD137L a células CHO-huCD137 (25 pg/ml).

La Figura 10 muestra la activación de CD137 en presencia de anticuerpo de reticulación.

La Figura 11 muestra la activación de CD137 en ausencia de anticuerpo de reticulación.

La Figura 12 muestra las curvas de dosis-respuesta en ELISA dual de anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137. Cada gráfico incluye datos basados en un aglutinante 5T4 (1206 [es decir, 1206/1207], 1208, 1210 o 1212) combinado con varios anticuerpos agonistas CD137 (1200 [es decir, 1200/1201], 1202, 1204, 1214, 1618, 1620 o 1626). La Figura 13 muestra la activación de células T dependientes de 5T4 mediante anticuerpos biespecíficos ilustrativos y de referencia (bsAb). Cada bsAb (1 pg/ml) se procesó en ensayos de células T CD8 basados en 2-4 donantes individuales. Los datos se presentan como cambio múltiplo promedio a la referencia (1200-1210) y las barras de error representan la DT. La parte izquierda del gráfico muestra anticuerpos biespecíficos donde el scFv de 5T4 se ha fusionado con IgG de CD137, es decir, 1200-1206 etc., mientras que la parte izquierda del gráfico muestra anticuerpos biespecíficos donde el scFv de CD137 se ha fusionado con IgG de 5T4, es decir, 1206-1200 etc.

La Figura 14 muestra la dosis-respuesta de los bsAbs 5T4-CD137 que muestran la activación de células T dependientes de 5T4. Los datos se analizan como cambio múltiplo a la referencia (1200-1210 a 1 pg/ml). Panel superior: agonista de CD137 como lgG y aglutinante 5T4 como scFv fusionado al extremo C de lgG. Panel inferior: aglutinante de 5T4 como lgG y agonista de CD137 como scFv fusionado al extremo C de lgG. La designación del clon sigue el mismo principio que se describe en la Figura 10.

La Figura 15 muestra la actividad funcional de los anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137 ilustrativos y de referencia en células T CD8+ humanas cultivadas con células tumorales que expresan 5T4. Todos los bsAbs generados se evaluaron a 1 pg/ml en el ensayo de células T basado completamente en células para verificar los resultados obtenidos en el ensayo realizado con 5T4-Fc recubierto. Los resultados se presentan como cambio múltiplo a la referencia (1200-1210) y las barras de error son la DT. La designación del clon sigue el mismo principio que se describe en la Figura 10.

La Figura 16 muestra las curvas de unión para los clones optimizados principales 5T4 a (A) células CHOh5T4 y (B) CHOcyno5T4.

La Figura 17 muestra las curvas de unión para los clones optimizados principales CD137 a (A) células CHOhCD137 y (B) CHOcynoCD137.

La Figura 18 muestra la respuesta normalizada de interferón gamma (IFNy) en células T CD8+ humanas cultivadas en placas recubiertas con 5T4-Fc, representada como un modelo de dosis-respuesta sigmoidal de tres parámetros para permitir la determinación de CE⁵⁰.

La Figura 19 muestra los resultados para el bsAb optimizado principal en un ensayo de células T CD8+ con 5T4-Fc reticulado, con niveles normalizados de IFNy para permitir la correlación de resultados entre las placas de ensayo.

La Figura 20 muestra los bsAbs generados con diferentes enlazadores en un ensayo de células T CD8+ con 5T4-Fc reticulado, con niveles normalizados de IFNy para permitir la correlación de resultados entre las placas de ensayo.

La Figura 21 muestra la respuesta normalizada de interferón gamma (IFNy) usando bsAb optimizado principal en células T CD8+ humanas cultivadas con células tumorales que expresan 5T4 y que no expresan 5T4, representada como un modelo de dosis-respuesta sigmoidal de tres parámetros para permitir la determinación de CE⁵⁰ La Figura 22 muestra la respuesta de interferón gamma (IFNy) de la activación mediada por CD137 de las PBMCs con y sin la presencia de 5T4-Fc.

La Figura 23 muestra la respuesta de interferón gamma (IFNy) del cocultivo de células T CD8+ y células L que expresan CD32.

La Figura 24 muestra los resultados de un ELISA dual que detecta CD137, para anticuerpos biespecíficos TAA-CD137.

La Figura 25 de referencia muestra la respuesta de interferón gamma (IFNy) usando anticuerpos biespecíficos TAA-CD137 en células T CD8+ cultivadas en placas recubiertas con CD3/t Aa donde TAA es (A) EpCAM, (B) EGFR y (C) Her2.

La Figura 26 muestra la localización dependiente de 5T4 de anticuerpo biespecífico para los tumores que expresan antígeno. Los tumores B16 y B16-5T4 se recogieron de ratones SCID-Beige tratados con vehículo, 1618-1210 (bsAb), 1618 (Mab anti-CD137) o 2112 (Mab anti-CD137 de referencia). La localización del anticuerpo en los tumores se detectó con lgG antihumana y se analizó por citometría de flujo. El gráfico muestra la frecuencia de las células lgG+ humanas entre las células vivas (n=5).

La Figura 27 muestra la localización dependiente de 5T4 de anticuerpo biespecífico para los tumores que expresan antígeno. Los tumores CT26 y CT26-5T4 se recogieron de ratones SCID-Beige tratados con vehículo, 1618-1210, 1618 o 2112. Se detectó la localización del anticuerpo en los tumores (A) con lgG antihumana o (B) mediante la unión de CD137 biotinilado y se analizó por citometría de flujo. Los gráficos muestran la frecuencia de células positivas entre células tumorales vivas únicas (n=5).

La Figura 28 muestra el porcentaje de células tumorales que son positivas para la unión de CD137 biotinilado y el antígeno tumoral 5T4. Los tumores SKOV-3 se recogieron de ratones SCID-Beige tratados con vehículo, 1618­ 1210, 1618 o 2112. La localización del anticuerpo en las células tumorales positivas a 5T4 se detectó con lgG antihumana y anticuerpo 5T4 antihumano. El gráfico muestra la frecuencia de células positivas dobles entre células tumorales vivas únicas (mCD45-CD45RA-(n=5/tratamiento).

TABLAS (SECUENCIAS)

Tabla A - Secuencias de aminoácidos (aa) y nucleótidos (nt) de VL y VH (incluyendo las secuencias reivindicadas y de referencia)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Tabla B - Secuencias de anticuerpo 5T4 - secuencias CDR (incluyendo secuencias reivindicadas y de referencia)

continuación

Tabla C - Anticuerpos CD137 - secuencias CDR (incluyendo secuencias reivindicadas y de referencia)

Tabla C 1 -VH

continuación

Tabla C2 - VL

continuación

Secuencias de anticuerpo de IgG1 mutada

Secuencia LALA de IgG1

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR

EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ

QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 86)

Secuencias enlazadoras

SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 87)

SGGGGSGGGGSAP (SEQ ID NO: 88)

NFSQP (SEQ ID NO: 89), KRTVA (SEQ ID NO: 90)

GGGSGGGG (SEQ ID NO: 91)

GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 92)

GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 93)

(SG)m, donde m = 1 a 7.

Secuencias de región constante de IgG

Secuencia de región constante de la cadena pesada de IgG1:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 94)

Secuencia de región constante de la cadena ligera de IgG1:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 95)

Tabla D - Secuencias de aminoácidos VH y VL optimizadas principales para CD137 y 5T4 Tabla D1 - Secuencias VH es ecíficas de 5T4 secuencias o timizadas de "1210" SEQ ID NO:9

Tabla D2 - Secuencias VH es ecíficas de CD137 secuencias o timizadas de "1618" SEQ ID NO:33)

continuación

Tabla D3 - Secuencias VL es ecíficas de 5T4 secuencias o timizadas de "1211" SEQ ID NO:11)

Tabla D4 - Secuencias VL es ecíficas de CD137 secuencias o timizadas de "1619" SEQ ID NO: 35)

continuación

Tabla D 5 - Secuencias conectoras

Cuadro D 6 - Alteraciones adicionales modificaciones

Tabla E - Ejemplo que describe cómo traducir el nombre del Anticuerpo en una secuencia de IgG completa para anticuerpos biespecíficos en formato de Morrison

Cadena pesada:

[A (subrayado); Secuencia Fc de la cadena pesada con modificación m2; conectorm6 (cursiva); C (negrita); enlazador; D (subrayado en negrita)]

EV Q LLESG G G LVQ PG G SLRLSCA A SG FTFSYG SM YW VR Q A PG K G LEW VSSISSG SG ST

YYA D SVK G R FTISR D N SK N TLYLQ M N SLR A ED TA VYYC A R SSYYG SYYSID YW G Q G TLV

TVS SA STK G PSVFPLA PSSK STSG G TA A LG CLVKD YFPEPVTVSW N SG A LTSG VH TFPA

VLQ SSG LY SLSS W TVP SS SLG TQ TYIC N VN H K PS N TK VD K K VEP K SC D K TH TC P PC PA P

E A A G G P S V FLFP P K PK D TLM ISR TPE VTC VW D V SH ED P EVK FN W Y VD G VE VH N A K TK P

R EEQ YN STYR W SVLTVLH Q D W LN G K EYK C K VSN K A LPA PIEK TISK A K G Q PR EPQ VYTL

PPSR D ELTK NQ VSLTC LVK G FYPSD IA VEW ESN G Q PEN NYKTTPPVLD SD G SFFLYSK LT

VD K SR W Q Q G N VFSC SVM H EA LH N H YTQ K SLSLSPG K G G G G SG G G G SEVQ LLESG G G

LVQPGGSLRLSCAASGFDFESYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKG

RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYGGYYSAWMDYWGQGTLVTVSSGG

GGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSALNWYQQKPGKAP

KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYGYLHTFGQGTK

LEIK

[SEQ ID NO:167] Cadena ligera:

[B (subrayado en negrita); Secuencia constante de cadena ligera]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVP

SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYDNLPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFP

PSD EQ LK SG TA SW C LLN N FYPR E A K V Q W K VD N A LQ SG N S Q ES VTEQ D S K D STY SLSS

TLTLSK AD YEK HK VYA CEVTH Q G LSSPVTKSFNR G EC

[SEQ ID NO:168] Ejemplos

Ejemplo 1 - Selección de anticuerpos 5T4 de la biblioteca Alligator-GOLD™

Las selecciones de expresión en fagos contra h5T4 se realizaron usando la biblioteca de scFv ALLIGATOR-GOLD™, una biblioteca de scFv completamente humana que contiene más de 1 x 1010 miembros únicos [Alligator Bioscience AB, Lund, Suecia). Se emplearon varias estrategias de selección diferentes, incluyendo selección en fase sólida, selección en solución usando 5T4-Fc biotinilado, selección con 5T4-Fc biotinilado acoplado a perlas de estreptavidina, así como una ronda de selección contra las células B16 que expresan 5T4 usando una reserva de fagos que previamente se había seleccionado contra el h5T4-Fc recombinante. Antes de la selección, las reservas de fagos fueron preseleccionadas contra estreptavidina, Beriglobina o SLIT2 con el fin de eliminar los posibles aglutinantes de estreptavidina, la parte Fc de la diana y los aglutinantes reaccionan de forma cruzada con otras proteínas de repetición ricas en leucina.

Para identificar los aglutinantes específicos de la selección de fagos, se identificaron de manera selectiva aproximadamente 1250 clones individuales en formato de fago usando ELISA recubierto con 5T4-Fc o proteína no diana (Biglycan u Orencia). Acto seguido, se realizó un análisis de secuencia, así como una identificación selectiva como scFv soluble en un ELISA de curva completa, ELISA realizado a 50 °C y análisis FACS de clones seleccionados. Basándose en esto, se eligieron 14 scFv candidatos únicos que se unieron a 5T4 recombinante y a células que expresan 5T4 sin mostrar una respuesta positiva a moléculas no diana o a células negativas a 5T4.

Los 14 clones scFv de 5T4 seleccionados se convirtieron en lgG1 completo para una caracterización adicional. Un anticuerpo anti-5T4 de referencia, designado como 1628 (seleccionado de una divulgación de la técnica anterior representativa), se usó en este estudio como control positivo.

Entre los 14 clones, se seleccionaron cuatro clones para una evaluación adicional en un formato de anticuerpo biespecífico. Estos cuatro clones se describen adicionalmente a continuación y se comparan con el clon de referencia 1628.

Ejemplo 2 - Unión a 5T4 humano medida por ELISA

Materiales y métodos

ELISA se realizó usando un protocolo convencional. Placas (n.° 655074, Greiner Bio-One GmbH, Alemania) se recubrieron previamente con 0,5 pg/ml de 5T4-Fc (obtenido de Peter L. Stern, Universidad de Manchester) durante la noche. Los anticuerpos 5T4 se diluyeron de 6 a 1,5 x 10-3 pg/ml en diluciones 1:4 y se añadieron en duplicados de 50 pl a cada pocillo. La unión se detectó con la cadena L kappa de conejo anti-h con HRP (P0129, Dako Denmark) y ELISA se desarrolló con el sustrato quimioluminiscente de ELISA PICO SuperSignal (Thermo Seientific Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) durante 2-10 minutos y se leyó en un lector multidetección basado en microplacas automatizado (FLUOstar OPTIMA, Países Bajos).

Resultados y conclusiones

Los resultados muestran que la mayoría de los mAbs 5T4 se unen con una potencia similar a 5T4 como 1628 (Tabla 1) con valores de CE⁵⁰ en el intervalo sub-nM. Sin embargo, el clon 1208 presenta un valor de CE⁵⁰ ligeramente más alto.

Tabla 1

Ejemplo 3 - Unión a 5T4 expresada en la superficie celular determinada por citometría de flujo

Materiales y métodos

El análisis de la unión de mAb 5T4 con citometría de flujo se realizó usando líneas celulares transfectadas con 5T4 y como control negativo, las células transfectadas de forma simulada. Tres líneas celulares transfectadas diferentes se usaron para este estudio; B16, A9 y CHO, se transfectaron con una construcción de 5T4 o con una construcción de control de vector vacío. Las células se tiñeron con anticuerpos 5T4 diluidos en tampón FACS (PBS, BSA al 0,5 % y 0,02% de NaN³). La unión se detectó con el anticuerpo secundario anti-lgG (Fc)-PE (109-115-098, Jackson ImmunoResearch Europe, R. U.) diluido 1:100. Las muestras se analizaron en un FACSCalibur o en un FACSverse (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) y se determinó la intensidad de fluorescencia media (IFM).

Resultados y conclusiones

En el análisis de citometría de flujo de la unión del anticuerpo 5T4 a las células B16 transfectadas con 5T4, la mayoría de los anticuerpos muestran una buena unión. Se observaron grandes variaciones en los valores de CE⁵⁰ entre los experimentos individuales. Por lo tanto, los resultados se resumen como CE⁵⁰ media en nM, así como CE⁵⁰ media normalizada con el control interno 1628 (Tabla 2). Un ejemplo de curvas de dosis-respuesta para la unión de mAb 5T4 a células B16 transfectadas con 5T4 se muestra en la Figura 2. En la Figura 3, se muestran los valores de IFM normalizados a una concentración fija de 2,5 pg/ml de anticuerpo. Considerados en conjunto, los datos indican que la mayoría de los anticuerpos se unen bien a las células B16 transfectadas con 5T4, con el clon 1208 que presenta una unión más débil.

Tabla 2

En un nuevo intento por calcular CE⁵⁰ con citometría de flujo, se realizó un experimento de dosis-respuesta de mAb 5T4 usando células CHO transfectadas de manera estable con 5T4 humano. Se realizó de una a cuatro series de titulación a partir de 2,5 nM. Los datos se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3

Por último, se evaluó la potencia de unión a células A9 transfectadas con 5T4 en dos experimentos individuales. Al igual que en los experimentos realizados con células B16-5T4, los valores de CE⁵⁰ absolutos determinados en experimentos individuales varían y, los datos se presentan por lo tanto como normalizados a 1628 de referencia (Tabla 4). Los resultados indican que los anticuerpos 5T4 se unen con una potencia comparable a 1628 de referencia.

Tabla 4

Para resumir, la potencia de unión de cuatro anticuerpos 5T4 se evaluó mediante citometría de flujo usando tres líneas celulares transfectadas con 5T4 diferentes (B16, CHO y A9). La conclusión de estos estudios es que todos los anticuerpos presentan una unión razonable, con el clon 1208 presentando en general una potencia más baja que los otros clones.

Ejemplo 4 - Unión a 5T4 de cynomolgus

Materiales y métodos

La potencia de los anticuerpos 5T4 en la unión a 5T4 de cynomolgus se determinó por citometría de flujo. Las células CHO se transfectaron de manera estable con 5T4 de Macaca mulatta (cynomolgus). Las células se tiñeron con anticuerpos 5T4 diluidos en tampón FACS (PBS, BSA al 0,5 % y 0,02 % de NaN³) usando titulación 1:4 a 2,5 nM. La unión se detectó con el anticuerpo secundario anti-lgG (Fc)-PE (109-115-098, Jackson ImmunoResearch Europe, R. U.) diluido 1:100. Las muestras se analizaron en un FACSCalibur o en un FACSverse (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) y se determinó la intensidad de fluorescencia media (IFM). Se realizaron tres experimentos con resultados comparables, aunque solo un experimento incluyó una curva de dosis-respuesta completa mientras que los otros dos experimentos incluyeron solo tres concentraciones de anticuerpos. Para comparar los valores de CE⁵⁰ entre 5T4 de humano y cynomolgus, se calculó la relación cy5T4/hu5T4 a partir del experimento con la dosis-respuesta completa.

Resultados y conclusiones

Los tres experimentos que se realizaron demostraron una buena unión a 5T4 de cynomolgus por los clones 1206, 1208 y 1210 y una unión débil por 1212 y 1628 de referencia (Figura 4, Tabla 5). El clon 1206 tuvo una potencia relativamente buena, aunque una baja eficacia. La comparación de los valores de CE⁵⁰ relativos entre 5T4 de cynomolgus y humano para clones seleccionados muestra que los clones 1206, 1208 y 1210 tienen una afinidad relativamente alta por 5T4 de cynomolgus mientras que 1212 no la tiene.

Tabla 5

Ejemplo 5 - Afinidad determinada mediante resonancia de plasmón superficial

Materiales y métodos

La cinética de unión de los mAbs específicos de 5T4 se ha estudiado usando dos plataformas basadas en SPA diferentes, la plataforma de Biacore 3000 (GE Healthcare) y MASS-1 (Sierra Sensors). Brevemente, 5T4 se capturó en la superficie del chip del sensor bien a través de un acoplamiento de amina directo (plataforma de Biacore) o usando un chip recubierto con estreptavidina y 5T4 biotinilado (plataforma de MASS-1). Los mAbs específicos de 5T4 diferentes se inyectaron después sobre el chip en concentraciones crecientes y las tasas de asociación y disociación se estudiaron en tiempo real. Se usó un modelo 1:1 de Langmuir para el ajuste de curvas.

Resultados y conclusiones

Un resumen de las constantes de tasa de unión y las afinidades obtenidas usando las dos plataformas se presentados en la Tabla 6. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la configuración del ensayo usada permite la unión bivalente de los mAbs al antígeno. Esto dará lugar a efectos de avidez que conducen a una subestimación significativa de las tasas de disociación (kd) y, por tanto, también al valor de afinidad (KD). Los anticuerpos 5T4 diferentes muestran diferentes características de unión, con 1208 y el 1628 de referencia mostrando tasas de disociación muy bajas mientras que las tasas de asociación varían menos entre los aglutinantes. Resulta obvio que existen variaciones significativas entre los dos ensayos, con una diferencia de más de 10 veces para 1206 y 1628. Para 1628, es probable que esto se deba a la dificultad de ajustar la curva con precisión cuando la tasa disociación es muy baja (casi sin disociación).

Tabla 6

continuación

Ejemplo 6 - Mapeo de dominio de anticuerpos 5T4

Materiales y métodos

El mapeo de epítopos se realizó mediante la investigación de la pérdida de unión por los anticuerpos usando un panel de construcciones de 5T4 quiméricos de humano/ratón por citometría de flujo. Esta estrategia fue posible ya que ninguno de los anticuerpos 5T4 reacciona de forma cruzada con 5T4 murino. Se usaron dos estrategias para el mapeo de epítopos como se ilustra en la Figura 5. En un enfoque, se construyeron siete quimeras de 5T4 de humano/ratón basadas en la división de 5T4 en siete dominios diferentes (Figura 5). Reemplazando, cada dominio con la secuencia de ratón correspondiente, se generaron siete quimeras de 5T4 de humano/ratón de 7 humanos/ratón. Las quimeras se generaron usando la secuencia de 5T4 de proteína humana NP_006661.1 (secuencia de ARNm de referencia NM_006670.4) y la secuencia de ratón correspondiente NP_035757.2 (secuencia de ARNm de referencia NM_011627.4). Las construcciones de ADN quimérico de humano/ratón, así como 5T4 de tipo silvestre de humano y ratón, se clonaron en vectores de expresión pcDNA3.1. Se generaron células CHO transfectadas de manera estable y células que expresaban 5T4 enriquecidas por clasificación MACS, dando como resultado un 60-80 % de células positivas. En el otro enfoque, se usaron células transfectadas con una quimera de 5T4 de humano/ratón (Woods et al., 2002, Biochem J 366(1):353-365), en la que la secuencia de ratón en el aminoácido 173-420 reemplazó la secuencia humana (Figura 5). Como controles se usaron células transfectadas con 5T4 de humano y 5T4 de ratón.

Para el análisis por citometría de flujo, las células se tiñeron con anticuerpos 5T4 diferentes diluidos en tampón FACS (PBS, BSA al 0,5%). La unión se detectó con el anticuerpo secundario anti-lgG (Fc)-PE (109-115-098, Jackson ImmunoResearch Europe, R. U.) diluido 1:100. Las muestras se analizaron mediante FACSverse (BD Biosciences, Heldelberg, Alemania) y se determinó el % de células positivas. Para compensar las variaciones en el % de células positivas a 5T4 en las diversas poblaciones transfectadas, los niveles de unión se normalizaron en cada quimera al dividir el % de células positivas para cada clon con el % de células positivas para los clones que dan lugar al porcentaje más alto de células positivas (% de células posclonx/% de células positivasmáx). Un valor normalizado de < 0,75 se definió como la unión de mAb dependiente de la región reemplazada, mientras que un valor normalizado < 0,25 se definió como dependencia completa.

Resultados y conclusión

Los cuatro anticuerpos 5T4 demostraron ser más o menos dependientes de al menos uno de los dominios E2, E3, E4, E6 o aa 173-420, mientras que no se observó una clara dependencia de E1, E5 o E7 (Tabla 7).

Los cuatro anticuerpos tenían un patrón de unión distinto:

1. Clon 1208; dependiente de E2 y E4

2. Clon 1210; dependiente de E2, E4 y aa173-420

3. Clon 1206; dependiente de E2, E3, E4 y aa173-420

4. Clon 1212 dependiente de E6 aa173-420

El anticuerpo de referencia 1628 difería de todos los anticuerpos ilustrativos de la invención, y era completamente dependiente de E4 y aa173-420.

Tabla 7

El experimento se repitió una vez para las quimeras E2, E3 y E6 y tres veces para la quimera E4 con alta reproducibilidad. Los mAbs con un valor de unión normalizado de < 0,75 se indican en negrita.

Ejemplo 7 - Selección de anticuerpos CD137 de la biblioteca Alligator-GOLD®

Las selecciones de expresión en fagos se realizaron usando una biblioteca de anticuerpos humanos (scFv), Alligator GOLD® (Alligator Bioscience, Lund, Suecia). Se realizaron selecciones hacia CD137 recombinante en forma soluble, recubiertas sobre la superficie de perlas o tubos, o expresadas en la superficie de células transfectadas con CD137. Se usaron CTLA4-Fc y una proteína marcada con His irrelevante como no dianas incluidas en exceso en las selecciones. Antes de cada ronda de selección, las reservas de fagos se preseleccionaron con beriglobina biotinilada, CTLA4-Fc, perlas o células negativas a CD137 para eliminar aglutinantes no específicos.

Para identificar los aglutinantes específicos de la selección de fagos, se identificaron de manera selectiva aproximadamente 4500 clones individuales en formato de fago usando ELISA recubierto bien con una proteína diana recombinante (CD137-Fc) o no diana (CTLA4-Fc), seguido de la confirmación como scFv soluble para algunos clones. Los clones que presentan una unión específica a CD137 se secuenciaron y se produjeron clones únicos como lgG para una caracterización adicional.

Ejemplo 8 - Unión a CD137 humano medida por ELISA

Material y métodos

La unión de los anticuerpos CD137 a CD137 humano recombinante se determinó mediante ELISA tipo sándwich. Brevemente, las placas ELISA (Greiner n.° 655074) recubiertas con CD137-Fc humano recombinante (R&D n.° 838-4B) se incubaron con diluciones en serie de los diversos anticuerpos CD137 a investigar. Los anticuerpos CD137 se detectaron usando una cadena ligera kappa de cabra antihumano conjugada con HRP (AbD Serotec n.° STAR127P) y se desarrollaron con un sustrato quimioluminiscente de ELISA Pico SuperSignal (Pierce n.° 37069). Los valores de CE⁵⁰ de los diversos anticuerpos se determinaron en 2-6 experimentos separados.

En este estudio se han usado dos anticuerpos anti-CD137 de referencia diferentes, como controles positivos (designados "1811/1812" y "1813/1814", que están ambos disponibles en la técnica).

Resultados y conclusión

La mayoría de los anticuerpos presentan valores de CE⁵⁰ en un intervalo similar a los de los anticuerpos de referencia, es decir, sub nM o bajo nM. Los resultados se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8

Ejemplo 9 - Determinación por citometría de flujo de la unión a CD137 de humano y cynomolgus

Material y métodos

La unión y la CE⁵⁰ se determinaron usando un análisis de citometría de flujo de células CHO transfectadas con C137 de humano, CD137 de cynomolgus o vector vacío. La parte extracelular de CD137 de humano o cynomolgus se fusiona con la parte transmembrana e intracelular de CD40 humano y se clonó en pcDNA3.1. El vector se transfectó posteriormente de forma estable en células CHO. La expresión de CD137 se confirmó por citometría de flujo usando el anticuerpo (CD137 (CD137-PE de humano, BD Biosciences n.° 555956) durante 30 min a 4 °C. Las células transfectadas con CD137 y las células transfectadas con vector vacío se incubaron con anticuerpos CD137 durante al menos 1 h a 4 °C para saturar la unión. Con el fin de minimizar la internalización del anticuerpo, se usó azida sódica al 0,05 % en el tampón de incubación y todo el trabajo se realizó en hielo. Los anticuerpos CD137 se detectaron usando anticuerpo anti-hlgG conjugado con PE (109-115-098, Jackson Immunoresearch laboratories), se incubaron durante 30 min a 4 °C. Directamente después de la tinción, las células se fijaron con una solución de paraformaldehído (10x concentrado BD CellFIX, BD biosciences n.° 340181). Las células se analizaron por citometría de flujo usando FACSVerse (BD Biosciences). La intensidad de fluorescencia media (IFM) se determinó para cada muestra y se analizaron los datos de dosis-respuesta usando Graph Pad Prism.

Los datos de IFM se normalizaron para cada anticuerpo, donde el 0 % se define como el valor más bajo y el 100 % es el valor más alto en la titulación de dosis para cada anticuerpo. CE⁵⁰ y el intervalo de confianza del 95 % se calcularon con Graph Pad Prism en función de los datos de los dos experimentos (regresión no lineal (ajuste de curva), restricciones establecidas en 0 y 100).

Resultados y conclusión

La unión a CHO-huCD137, CHO-cyCD137 y CHO-pcDNA se confirmó en dos experimentos separados (Figura 6). Todos los anticuerpos CD137 se unen relativamente bien a CD137 de humano con CE⁵⁰ comparable con los dos anticuerpos de referencia 1811/1812 y 1813/1814. La mayoría de los anticuerpos CD137 analizados se unen bien a CD137 de cynomolgus, excepto el anticuerpo de referencia 1811/1812 y 1200/1201 (datos no mostrados) que no se une en absoluto o muy débilmente, y el clon 1620/1621 que se une débilmente y no alcanza una completa saturación. Cabe destacar que la IFM máxima obtenida en las células de CD137 de cynomolgus fue 2-3 veces más bajo que en las células que expresan CD137 de humano, que indica diferencias en la densidad del receptor en las células.

La determinación de CE⁵⁰ se presenta como intervalos de confianza del 95 % para cada anticuerpo CD137 analizado con el fin de incluir las variaciones inter e intraensayo (Tabla 9).

Tabla 9

Ejemplo 10 - Afinidad de los anticuerpos CD137 medida por Biacore

Material y métodos

El CD137 de humano (R&D systems) se inmovilizó en el chip sensor de Biacore™, CM5, usando un acoplamiento de amina convencional. El anticuerpo analizado y el control (diluido en serie 1/210-0,63 nM) se analizaron para determinar su unión en HBS-P (GE, n.° BR-1003-68) a un caudal de 30 pl/ml. La asociación continuó durante 5 minutos y la disociación durante 15 minutos. La regeneración se realizó dos veces usando Glicina 10 nM pH 1,7 durante 30 segundos. Los parámetros cinéticos y las constantes de afinidad se calcularon usaron el modelo 1:1 de Langmuir.

Resultados y conclusión

Las afinidades de los anticuerpos estaban en el intervalo de nanomolar a subnanomolar (Tabla 10) medidas usando anticuerpos bivalentes que fluían sobre CD137 recubierto en la superficie del chip.

Tabla 10

Ejemplo 11 - Especificidad de la diana de los anticuerpos CD137 determinados por ELISA

Material y métodos

Se evaluó la unión a miembros de la superfamilia de TNFR para los que ya se habían establecido métodos de ELISA (CD40 y OX40) para detectar la posible propensión a la reacción cruzada con proteínas no diana. Adicionalmente, se realizó una búsqueda BLAST identificando TNFRSF21 como la secuencia más similar (34 % de identidad de secuencia). Puesto que la similitud de esta secuencia es bastante baja, se consideró suficiente la determinación de la unión no diana a OX40 y CD40.

Las placas de ELISA (Greiner n.° 655074) se recubrieron con 50 pl/pocillo de OX40 de humano recombinante (R&D n.° 1493-CD), CD40-Fc (Ancell n.° 504-820) o CD137 (R&D n.° 838-4b ) diluido a una concentración final de 0,5 pg/ml en PBS durante 1 h a 37 °C o durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron con PBS+0,05 % de TWEEN20 (PBST), seguido por un bloqueo con PBST+albúmina de suero de bovino al 1% (BSA). Las muestras de anticuerpos se prepararon como diluciones en serie 1/10 de 10-0,01 pg/ml en PBST+1 % de BSA y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de una detección usando un anticuerpo de cadena ligera kappa antihumano conjugado con peroxidasa de rábano picante (AbD Serotec n.° STAR127P) y desarrollado usando el sustrato quimioluminiscente de ELISA PicoSuperSignal (Pierce ThermoScientific n.° 37069).

Resultados y conclusión

Los resultados de los dos experimentos fueron similares. Un anticuerpo (1202/1203) presentó una unión débil a OX40 y CD40, mientras que ninguno de los anticuerpos restantes mostró una unión detectable a OX40 o CD40. Una descripción general de los anticuerpos analizados y los resultados de los dos experimentos se muestra en la Tabla 11. La CE⁵⁰ para la unión de 1202/1203 a CD137 en ELISA se determinó como 0,41 nM, correspondiente a aproximadamente 0,06 pg/ml. La señal de ELISA es muy baja incluso a 10 pg/ml, y la CE⁵⁰ para la unión a OX40 y CD40 es muy probablemente superior a 10 pg/ml ya que las curvas de dilución no han alcanzado una meseta.

Además, se analizó la unión a PBL primaria de múltiples donantes de sangre. La unión a PBL fue similar a los anticuerpos de Referencia. No se detectó una unión inespecífica relevante a proteínas no diana.

Tabla 11

continuación

Ejemplo 12 - Mapeo de dominio de anticuerpos que se unen a CD137

Material y métodos

La capacidad de cada anticuerpo para unirse a un panel de quimeras CD137 de humano/ratón expresadas en la superficie de las células transfectadas se analizó por citometría de flujo.

Las quimeras se diseñaron intercambiando dominios o módulos del CD137 de humano con el dominio de ratón correspondiente (Figura 7). Los genes de quimeras CD137 de humano/ratón se sintetizaron (GenScript) y se clonaron construcciones en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen) y se transfectaron transitoriamente en células FreeStyle 293-F (Invitrogen). Las células transfectadas se incubaron con anticuerpos CD137 y o anticuerpos de control, seguido de incubación con lgG-PE antihumana (Jackson Immnunoresearch) para su detección y se analizaron con FACS Verse (BD Biesciences). La unión a las diferentes construcciones quiméricas se calculó como IFM relativa en comparación con la unión del control de isotipo, seguido de normalización de la construcción de CD137 de humano de longitud completa para minimizar el efecto de las diferencias de afinidad entre los anticuerpos individuales.

Resultados y conclusión

Se pueden observar cuatro patrones de unión como se describe a continuación. Los datos se resumen en la Tabla 12. Patrón A:

Los anticuerpos 1811/1812 (anticuerpo de Referencia) y 1618/1619 dependen del dominio 1.

Patrón B:

Los anticuerpos 1200/1201, 1202/1203 y 1204/1205 dependen principalmente del dominio 2. Adicionalmente, también se observa cierta pérdida de unión para la construcción 1555, lo que también indica un impacto del dominio 1. Patrón C:

Los anticuerpos 1813/1814 (anticuerpo de Referencia) y 1620/1621 parecen depender principalmente de los dominios 3B-4A. Sin embargo, se observa una pérdida de unión en todas las construcciones, haciendo que este patrón sea bastante similar al patrón D.

Patrón D:

Para los anticuerpos 1214/1215 y 1626/1627, no se pudo demostrar una clara dependencia de dominios de CD137 particulares. En su lugar, estos anticuerpos presentaron una gran pérdida de unión para todas las quimeras. Sin embargo, para 1214/1215, los resultados difirieron entre los experimentos (véase la Tabla 12).

Ejemplo 13 - Eficacia in vitro de anticuerpos CD137

Material y métodos

La actividad agonista de los anticuerpos CD137 se evaluó en un ensayo de células T basado en células T CD8+ humanas primarias. Brevemente, Las células T CD8+ se separaron de las células mononucleares de sangre periférica humana mediante separación MACS (Miltenyi n.° 130-096-495) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se incubaron en placas de microtitulación de 96 pocillos (NuncThermo Scientific n.° 268200), se cubrieron previamente con el anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3, Affymetrix eBioscience n.° 16-0037) y se titularon las concentraciones del anticuerpo CD137 a analizar. Después de 72 o 96 horas de incubación, se cosechó el medio de cultivo y se determinaron los niveles de IFN-y por ELISA (BD n.° 555142).

Cada clon se analizó en al menos 6 donantes y se comparó con el anticuerpo CD137 de referencia 1811/1812 y el anticuerpo de control negativo.

Debido a las grandes variaciones intradonante, se determinó el índice de estimulación (SI, por sus siglas en inglés, inducción en veces por anticuerpo en comparación con el control negativo) para cada muestra y se normalizó al índice de estimulación para el anticuerpo de referencia 1811/1812.

Resultados y conclusión

Se identificaron varios clones con una eficacia comparable con 1811/1812 de referencia. Los datos se resumen en la Figura 8, que indica los niveles de IFN-y absolutos inducidos por la estimulación con CD137. Sin embargo, no se analizaron todos los anticuerpos mano a mano en todos los donantes, y el SI normalizado es más relevante para la comparación de la eficacia. Los anticuerpos se evaluaron en un formato de lgG1 y la eficacia se midió usando anticuerpos recubiertos en la superficie de los pocillos, lo que puede influir en la eficacia.

Ejemplo 14 - Unión competitiva de anticuerpos CD137 (bloqueo de ligando)

Objetivo y antecedentes

El objetivo era determinar si los anticuerpos CD137 ilustrativos bloquean la unión del ligando CD137.

En el experimento de mapeo de dominio anterior, los anticuerpos CD137 se dividieron en diferentes grupos en función de su unión a subdominios similares del antígeno CD137. Si los anticuerpos CD137 se unen a epítopos cerca de la región de unión al ligando, la unión al antígeno puede conllevar a un bloqueo parcial o total de la unión al ligando. La unión cerca del epítopo de unión al ligando CD137 también puede afectar a la unión del ligando debido a un impedimento estérico o cambios conformacionales del epítopo de unión al ligando CD137. Todos los anticuerpos CD137 se titularon frente a una concentración fija de CD137L para la evaluación de las propiedades de bloqueo del ligando.

Material y método

Se usaron células CHO transfectadas con CD137 de humano para la competencia de ligandos. La parte extracelular de CD137 de humano se fusionó con la parte transmembrana e intracelular de hCD40 y se clonó en pcDNA3.1. El vector se transfectó posteriormente de forma estable en células CHO. La expresión de CD137 se confirmó mediante la tinción con un anticuerpo comercial dirigido a CD137.

Los CHO-huCD137 se preincubaron con anticuerpos monoclonales CD137, al titular de 10:1 a una relación molar de 0,01:1 CD137 mAb (250 pg/ml) a CD137L (Ligando hCD137_CD8 ) (Ancell n.° 503-020), durante 1 h a 4 °C antes de la adición del ligando CD137 a una concentración a CE⁵⁰. Después de la coincubación durante otros 30 min a 4 °C, las células se lavaron y el ligando CD137 unido se detectó con aCD8a-PE (clon 53-6.7) (BD n.° 553033) y se fijó con paraformaldehído (10x concentrado BD CellFIX, BD biosciences). El análisis se realizó con FACSverse y la IFM (Intensidad de fluorescencia media) se calculó con el software FlowJo

Resultados y conclusión

El experimento de bloqueo de CD137L se realizó por duplicado. Se puede concluir que no todos los mAbs CD137 analizados bloqueaban la unión del ligando de CD137 (Tabla 13, Figura 9). Los mAbs CD137 que pertenecen al grupo B y C (1204 y 1620), que se unen al dominio 2B-4A, bloqueaban al CD137L. El anticuerpo ¹⁸¹⁴ también bloquea la unión a CD137L. 1618, perteneciente al grupo A que se unió al dominio 1, no bloqueó el ligando CD137.

Tabla 13

Ejemplo 15 - Unión competitiva de anticuerpos contra CD137 medida por ELISA

Objetivo y antecedentes

Al competir los anticuerpos CD137 ilustrativos entre sí, es posible determinar anticuerpos que se unen a epítopos similares en función de su patrón de bloqueo. Se realiza ELISA de competición mediante la coincubación de anticuerpos CD137 biotinilados con anticuerpos CD137 no biotinilados cuando se unen a CD137-Fc recubierto. La competencia se define como la pérdida de señal del anticuerpo CD137 biotinilado. Los bajos valores de competencia podrían deberse a que no hay competencia entre los anticuerpos o la cinética de unión de los anticuerpos. La unión de un anticuerpo también podría conducir a un impedimento estérico o cambios conformacionales cuando se une el antígeno que afecta la unión del otro anticuerpo CD137.

Material y métodos

Los anticuerpos CD137 fueron biotinilados (enlace EZ NHS-LC-Biotina, ThermoFisher) y las propiedades de unión intactas a CD137-Fc se verificaron con ELISA al comparar CE⁵⁰ entre mAbs anti-CD137 biotinilados y no biotinilados. El anti-CD137 no biotinilado (anti-CD137-bio) se preincubó con CD137-Fc en concentraciones 30 veces más altas que la CE⁵⁰ determinada durante 0,5 h. Sin lavado, se añadió anti-CD137-bio y se coincubó durante otra 1 h. La unión de anti-CD137-bio se detectó con estreptavidina-HRP (Pierce). La competencia se calculó como el número relativo dividiendo la unión medida con otros anticuerpos en relación con su competencia máxima (compitiendo con sí misma). Los valores relativos obtenidos se normalizaron frente a la capacidad máxima de bloqueo (Tabla 4).

Tabla 14

Resultado y conclusión

Cuando se normalizan los valores de competencia relativos para cada anticuerpo, se puede identificar un patrón de competencia (Tabla 14). Los anticuerpos 1812 y 1618 mostraron un patrón único en ELISA de competición (Patrón X). Los otros anticuerpos CD137 que se analizaron tenían un patrón de bloqueo similar (Patrón Y). Las diferencias en la cinética de unión entre esos anticuerpos, pueden explicar algunas de las variaciones menores en los patrones de unión entre estos anticuerpos, aunque no se puede excluir que las pequeñas variaciones dentro del grupo Y reflejen las diferencias reales en el epítopo de unión.

Ejemplo 16 - Dependencia de reticulación de mAbs CD137

Material y métodos

La dependencia de reticulación de los anticuerpos CD137 se evaluó en un ensayo de células T basado en células T CD8+ humanas primarias. Brevemente, las células se incubaron en placas de microtitulación de 96 pocillos (NuncThermo Scientific n.° 268200), se cubrieron previamente con el anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3, Affymetrix eBioscience n.° 16-0037). Se añadieron concentraciones tituladas de anticuerpos CD137 en presencia y ausencia de anticuerpo de reticulación, Fc F(ab')2 de cabra antihumano (Jackson Immuno n.° 109-006-098) a una relación molar de 1:3 a la placa. Tras 72, se cosechó el medio de cultivo y se determinaron los niveles de IFN-y por ELISA (BD n.° 555142).

Resultados y conclusión

Los resultados se resumen en la Figura 10 que muestra la activación de CD137 en presencia de anticuerpo de reticulación y la Figura 11 que muestra la activación en ausencia de anticuerpo de reticulación. A partir de los resultados obtenidos, se puede concluir que el clon de mAb CD137 1618 depende de la reticulación y la referencia, un anticuerpo de lgG4 específico de CD137 (Ab de REF), es independiente de la reticulación, cuando se trata de la activación mediada por CD137 de las células inmunitarias que expresan CD137.

Ejemplo 17- Producción de anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137

Materiales y métodos

Treinta bsAb 5T4-CD137, basados en cuatro 5T4 y ocho anticuerpos (CD137 se clonaron como bsAb con una de las fracciones de unión clonadas como scFv y fusionadas con el extremo C de la cadena pesada de la lgG (es decir, en el formato de Morrison). La mayoría de los bsAb eran clones con el aglutinante de 5T4 como scFv y el agonista CD137 como lgG, pero en algunas construcciones, un scFv de CD137 se fusionó con la cadena pesada de una lgG de 5T4 (Tabla 15). Adicionalmente, se incluyeron cuatro construcciones de control del isotipo, donde el 5T4 o el aglutinante CD137 se habían reemplazado con un anticuerpo de control de isotipo. Los bsAb se produjeron mediante transfección transitoria de células Freestyle293 (Thermo Fischer) y se purificaron mediante cromatografía de Proteína A.

La designación de bsAb fue la siguiente:

• El primer número indica el nombre del clon del anticuerpo

• El segundo número indica el nombre del clon scFv

De este modo, la designación "1200-1206" se refiere al aglutinante de 5T4 1206 (es decir, que comprende las secuencias de cadena pesada y ligera del dominio variable del anticuerpo 1206/1207) en formato scFv fusionado con el extremo C del Fc del anticuerpo agonista CD137 1200 (es decir, que comprende las secuencias de cadena pesada y ligera del dominio variable del anticuerpo 1200/1201).

Tabla 15

continuación

Ejemplo 18 - Unión a CD137 y 5T4 de humano por anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137 medida por ELISA

Materiales y métodos

La unión biespecífica a ambas dianas, CD137 y 5T4, se evaluó usando un protocolo de ELISA convencional. Placas (n.° 655074, Greiner Bio-One GmbH, Alemania) se recubrieron previamente con 0,5 pg/ml de 5T4-Fc (obtenido del profesor Peter Stern, Universidad de Manchester) durante la noche. Los bsAb CD137-5T4 se diluyeron de 8 a 2 x 10' 3 pg/ml en diluciones 1:4 y se añadieron en duplicados de 50 pl a cada pocillo. CD137-bio (Ancell n.° 502-030) se usó corno anticuerpo de detección a 0,5 pg/ml y la unión se detectó con Estreptavidina-HRP (Pierce n.° 21126). El ELISA se desarrolló con un sustrato quimioluminiscente de ELISA PICO SuperSignal (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) durante 2-10 minutos y se leyó en un lector multidetección basado en microplacas automatizado (FLUOstar OPTIMA, Países Bajos).

Resultados y conclusiones

La mayoría de los bsAb se unieron a ambas dianas en ELISA dual con valores de CE⁵⁰ en el intervalo sub-nM o bajo nM. Sin embargo, algunos bsAb presentaron valores de CE⁵⁰ considerablemente más altos, lo que indica una afinidad pobre para una o ambas dianas en esta combinación anticuerpo-scFv. Las curvas de dosis-respuesta se muestran en la Figura 12 y los valores de CE⁵⁰ se resumen en la Tabla 16.

Tabla 16

Ejemplo 19 - Afinidad de los anticuerpos biespecíficos CD137-5T4 medida mediante resonancia de plasmón superficial

Materiales y métodos

La cinética de unión de una selección de bsAbs CD137-5T4 se evaluó usando la plataforma MASS-1 basada en SPR (Sierra Sensors). Brevemente, se capturó CD137 o 5T4 en la superficie del chip del sensor usando un chip recubierto con estreptavidina y antígeno biotinilado. Los bsAbs CD137-5T4 diferentes se inyectaron después sobre el chip en concentraciones crecientes y las tasas de asociación y disociación se estudiaron en tiempo real.

Resultados y conclusiones

Un resumen de las constantes de tasa de unión obtenidas y las afinidades obtenidas se presenta en la Tabla 17. Debe tenerse en cuenta que la configuración del ensayo usada permite la unión bivalente de los bsAbs al antígeno. Esto dará lugar a efectos de avidez que conducen a una subestimación significativa de las tasas de disociación (kd) y, por tanto, también al valor de afinidad (KD). Esto hace que las comparaciones con otros compuestos sean problemáticas, pero los valores obtenidos son válidos para comparaciones dentro del conjunto de datos.

Los resultados del análisis cinético confirman la afinidad retenida de la parte de mAb específica de CD137 de la molécula biespecífica, mientras que la parte de scFv muestra una afinidad de 5T4 reducida en comparación con el mAb parental. Como se esperaba, los cambios conformacionales inducidos por un enlazador que reduce la flexibilidad en el formato de scFv tienen un efecto negativo en la afinidad de unión al antígeno. En el caso de 1210, este efecto es solo menor, mientras que la afinidad de 1208 se reduce aproximadamente 6 veces.

Tabla 17

Ejemplo 20 - Actividad funcional de anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137 en células T CD8+ humanas cultivadas en placas recubiertas con 5T4-Fc

Materiales y métodos

La actividad funcional del bsAb 5T4-CD137 se evaluó en un ensayo de células T CD8, donde las células se cultivaron en placas de microtitulación recubiertas con anticuerpo 5T4-Fc y CD3. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (MNC) mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque (p 1,077g/ml) (GE Healthcare n.° 17-1440-02) de concentrados de leucocitos obtenidos de donantes sanos (Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Labmedicin Region Skáne, Lund, Suecia). Las células T CD8+ se enriquecieron mediante selección negativa usando el kit de aislamiento de células T CD8+ (Miltenyi 130-096-495). Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 3 |jg/ml de aCD3, clon OKT3 (Affymetrix eBioscience n.° 16-0037-85), se lavaron y se recubrieron con 5 |jg/ml de 5T4-Fc durante 2 h a 37 °C. Después del recubrimiento de 5T4-Fc, las placas se lavaron y bloquearon durante un mínimo de 30 minutos con RPMI (Gibco n.° 61870010) que contenía FCS al 10 % (inactivado por calor, Gibco n.° 10270-106 lote 41Q9248K) y Hepes 10 mM (Gibco n.° 15630056).

Los bsAbs CD137-5T4 se diluyeron en RPMI que contenía FCS al 10 % y Hepes 10 mM y se añadieron a las placas 30 minutos antes de la adición de células T CD8+ (0,07 x 106células/pocillo). Las placas de ensayo se incubaron durante 68 o 92 h a 37 °C y se cosechó el sobrenadante del cultivo. Los niveles de IFN-y en los sobrenadantes se midieron por ELISA (BD OptiEIA n.° 555142). Los resultados se muestran como un cambio múltiplo en comparación con CE_1200-1210, que se usó como control interno en todos los experimentos.

Resultados y conclusiones

Los resultados del primer conjunto de bsAbs usados a una concentración fija de 1 jg/m l (Figura 13) muestran que la mayoría de los bsAbs en función de cualquiera de los aglutinantes de 5T4 1206, 1208 o 1210 eran funcionales en el ensayo de células T, mientras que los que se basaron en el anticuerpo 5T4 1212 no lo eran. Los datos también sugieren que el bsAb basado en el clon 1202 de CD137 puede tener una eficacia y/o potencia inferior en comparación con el bsAb basado en los clones 1204 y 1200 de CD137. El efecto agonista del bsAb 5T4-CD137 dependía de la reticulación por 5T4, ya que no se obtuvo activación alguna en ausencia de 5T4 o usando bsAb que comprendía una fracción de control de isotipo.

Basándose en estos resultados, se investigó un segundo conjunto de bsAbs basados en cinco nuevos clones CD137 como lgG y los clones 5T4 1208 y 1210 como scFv. Los aglutinantes de 5T4 1212 y 1206 se excluyeron debido a una actividad funcional pobre como bsAb y un valor de Tm bajo y, por tanto, una estabilidad pobre como scFv, respectivamente. La actividad funcional de todos los bsAb se resumen en la Figura 14.

Ejemplo 21 - Actividad funcional de anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137 en células T CD8+ humanas cultivadas con células tumorales que expresan 5T4

Materiales y métodos

Las células T CD8 se aislaron como se ha descrito anteriormente y se cultivaron en presencia de células que expresan 5T4, células B16. Se usaron células B16 transfectadas con un vector vacío como control negativo. La estimulación de CD3 se realizó con perlas recubiertas con aCD3 (OKT-3) (Dynal M-450 activado con tosilo n.° 14013) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Se añadieron células tumorales B16 irradiadas (6000 células/pocillo) a las placas de 96 pocillos y se dejaron unir durante 2 h. Se añadieron bsAbs CD137-5T4 y se incubaron durante 30 minutos antes de la adición de células T CD8+ (0,1 x 106 células/pocillo y perlas recubiertas con aCD3 (0,5 x 105 perlas/pocillo). Las placas se cultivaron durante 68 o 92 h y los niveles de IFN-y en los medios medidos por ELISA (b D OptiEIA n.° 555142).

Resultados y conclusiones

Los resultados del ensayo a base de células completas muestran que la mayoría de los bsAb son funcionales y que el efecto es específico de 5T4, sin activación inducida por células B16 negativas a 5T4 o bsAb de isotipo-CD137 (Figura 15).

Ejemplo 22 - Optimización de la afinidad y propiedades biofísicas de los anticuerpos biespecíficos: Optimización de dominios variables específicos de 5T4

Material y métodos

El objetivo de la optimización era generar versiones del anticuerpo 1210/1211 específico de 5T4 con respecto a las propiedades de afinidad y biofísicas. Se realizaron selecciones hacia 5T4 con la biblioteca optimizada principal 1210LOlib1. En total, se identificaron 170 clones únicos en la identificación selectiva primaria inicial con buena señal diana, así como la relación diana/no diana. Estos clones se investigaron además en una identificación selectiva primaria extendida con respecto a la estabilidad de la temperatura. La evaluación de la estabilidad de la temperatura mostró que la mayoría de los clones únicos identificados mostraron una mejor estabilidad en comparación con el clon scFv 1210/1211 de tipo silvestre. Los 96 clones principales se evaluaron además en un ELISA de dosis-respuesta y todos mostraron un comportamiento de unión similar y aceptable. El análisis de secuencia de la prueba de identificación selectiva y la identificación selectiva primaria mostraron tendencias similares.

Los 96 clones principales identificados de la identificación selectiva primaria y primaria extendida se volvieron a clonar como la parte scFv en el formato de Morrison, con 1618/1619 como la parte del anticuerpo monoclonal (mAb), y se evaluaron en función de la unión, afinidad y estabilidad.

Las mediciones cinéticas se realizaron usando la plataforma Octet RED96 equipada con puntas de sensor de 2a generación Fab-CH1 antihumano (ForteBio). Los anticuerpos biespecíficos se diluyeron a 1,5 pg/ml en 1x tampón cinético (ForteBio) y se acoplaron a los biosensores. El 5T4 de humano (producción propia) se diluyó en 1x Tampón cinético a 50 nM, 10 nM y 2 nM. La cinética de unión se estudió en 1x Tampón cinético donde se permitió la asociación durante 300 s seguido de disociación durante 600 s. Las puntas de sensor se regeneraron usando glicina 10 mM, pH 2,2. Se hizo referencia a los datos generados restando un blanco de tampón paralelo, el valor inicial se alineó con el eje y, se realizó una correlación interetapa mediante alineación contra la disociación y los datos se suavizaron mediante un filtro Savitzky-Golay en el software de análisis de datos (v.9.0.0.14). Los datos procesados se ajustaron usando un modelo de unión 1:1 de Langmuir con X2 como medición de la precisión de ajuste.

Resultados y conclusiones

Los datos se resumen en la Tabla 18. En términos generales, las variantes optimizadas principales se comportaron de manera muy similar en la evaluación de CE⁵⁰ en ELISA. La evaluación de afinidad mostró que la afinidad (KD) había mejorado entre 3 a más de 10 veces en comparación con el clon 1618-1210 de tipo silvestre. La evaluación de CE⁵⁰ en células también mostró un comportamiento similar de las variantes optimizadas diferentes y todas mostraron un rendimiento mejorado en comparación con el clon 1618-1210 de tipo silvestre. En cuanto a la estabilidad, los clones de rendimiento superior muestran una agregación inferior al 10 % después de la purificación de proteína A y tienen una Tm superior a la Tm de Fc (>70 °C) medida por HPLC y DSF, respectivamente.

Tabla 18

continuación

Ejemplo 23 - Optimización de la afinidad y propiedades biofísicas de los anticuerpos biespecíficos: Optimización de dominios variables específicos de CD137

Material y métodos

El objetivo de la optimización era generar versiones del anticuerpo 1618/1619 específico de CD137 con respecto a las propiedades de afinidad y biofísicas. Se realizaron selecciones hacia CD137 con la biblioteca optimizada principal 1618LOlib1. En total, se identificaron 153 clones únicos en la identificación selectiva primaria inicial con buena señal diana, así como la relación diana/no diana. Estos clones se investigaron además en una identificación selectiva primaria extendida con respecto a la estabilidad de la temperatura. La evaluación de la estabilidad de la temperatura permitió la identificación de los clones únicos de mejor rendimiento con respecto a la estabilidad de la temperatura en comparación con el clon de scFv 1618/1619 de tipo silvestre. Los 50 clones principales se evaluaron además en un ELISA de dosis-respuesta y todos mostraron un comportamiento de unión similar y aceptable. El análisis de secuencia de la prueba de identificación selectiva y la identificación selectiva primaria mostraron tendencias similares.

Los 50 clones principales identificados de la identificación selectiva primaria y primaria extendida se volvieron a clonar como la parte scFv en el formato de Morrison, con 1210/1211 como la parte del anticuerpo monoclonal (mAb), y se evaluaron en función de la unión, afinidad y estabilidad.

Las mediciones cinéticas se realizaron usando la plataforma Octet RED96 equipada con puntas de sensor de 2a generación Fab-CH1 antihumano (ForteBio). Los anticuerpos biespecíficos se diluyeron a 1,5 pg/ml en 1x tampón cinético (ForteBio) y se acoplaron a los biosensores. El CD137-Fc de humano (R&D Systems, N.° 838-4B) se diluyó en 1x Tampón cinético a 50 nM, 10 nM y 2 nM. La cinética de unión se estudió en 1x Tampón cinético donde se permitió la asociación durante 300 s seguido de disociación durante 600 s. Las puntas de sensor se regeneraron usando glicina 10 mM, pH 2,2. Se hizo referencia a los datos generados restando un blanco de tampón paralelo, el valor inicial se alineó con el eje y, se realizó una correlación interetapa mediante alineación contra la disociación y los datos se suavizaron mediante un filtro Savitzky-Golay en el software de análisis de datos (v.9.0.0.14). Los datos procesados se ajustaron usando un modelo de unión 1:1 de Langmuir con X2 como medición de la precisión de ajuste.

Resultados y conclusiones

Los datos se resumen en la Tabla 19. En términos generales, las variantes optimizadas principales se comportaron de manera muy similar en la evaluación de CE⁵⁰ en ELISA. La evaluación de afinidad mostró que la afinidad (KD) era comparable con el clon 1210-1618 de tipo silvestre. La evaluación de CE⁵⁰ en células también mostró un comportamiento similar de las diferentes variantes optimizadas. En cuanto a la estabilidad, los clones de rendimiento superior muestran una agregación inferior al 6 % después de la purificación de proteína A y tienen una Tm entre 54 °C-59 °C según lo medido por HPLC y DSF, respectivamente.

Ejemplo 24 - Optimización de la afinidad y propiedades biofísicas de los anticuerpos biespecíficos: Análisis ELISA dual de anticuerpos biespecíficos optimizados

Material y métodos

Los anticuerpos biespecíficos optimizados con propiedades biofísicas mejoradas se obtuvieron usando diferentes estrategias que incluyen la combinación de dominios de unión optimizados principales y el uso de mutaciones y conectores adicionales.

El anticuerpo biespecífico en este ejemplo es un anticuerpo biespecífico IgG-scFv. El dominio de unión a CD137 es una lgG intacta y el dominio de unión a 5T4 es un scFv unido al extremo C de una cadena pesada de la lgG. Los anticuerpos biespecíficos comprenden por ejemplo los siguientes componentes: (1) Dos cadenas pesadas comprendiendo cada una, en orden del extremo N al extremo C: [una secuencia VH; A en la Tabla 20] -[una región constante de la cadena H del subtipo de lgG1 sin mutaciones a menos que se indique mediante un sufijo mX en la Tabla 20] -[un conector m6, m15, m16 o m17] -[un scFv, en donde las cadenas variables (pesada o ligera) se ordenan del extremo N al extremo C, de manera que la cadena C en la Tabla 20 va seguida de un enlazador y seguida después de la Cadena D en la Tabla 20]; y(2) Dos cadenas ligeras comprendiendo cada una, en orden del extremo N al extremo C: [una secuencia VL; B en la Tabla 20] -[una región constante de cadena L].

El scFv para algunos de los anticuerpos biespecíficos en este ejemplo lleva sitios de N-glicosilación recombinantes colocados en el

Los genes de codificación de anticuerpos biespecíficos optimizados se diseñaron internamente y se sintetizaron en GeneArt (Thermo Fisher, Life Technologies o se generaron mediante métodos de clonación convencionales en vectores de expresión. Los anticuerpos biespecíficos se produjeron mediante transfección transitoria de Expi293™ (Thermo Fischer Scientific) y se purificaron mediante cromatografía de Proteína A. La unión biespecífica a ambas dianas, CD137 y 5T4, se evaluó usando un protocolo de ELISA convencional. Placas (n.° 655074, Greiner Bio-One GmbH, Alemania) se recubrieron previamente con 0,5 pg/ml de 5T4-Fc (obtenido del profesor Peter Stern, Universidad de Manchester) durante la noche. Los bsAb CD137-5T4 se diluyeron de 8 a 2 x 10'3 pg/ml en diluciones 1:4 y se añadieron en duplicados de 50 pl a cada pocillo. CD137-bio (Ancell n.° 502-030) se usó corno anticuerpo de detección a 0,5 pg/ml y la unión se detectó con Estreptavidina-HRP (Pierce n.° 21126). El ELISA se desarrolló con un sustrato quimioluminiscente de ELISA PICO SuperSignal (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) durante 2-10 minutos y se leyó en un lector multidetección basado en microplacas automatizado (FLUOstar OPTIMA, Países Bajos).

Resultados y conclusiones

Los datos se resumen en la Tabla 20. Los anticuerpos biespecíficos optimizados, que consisten en dominios de unión a CD137 optimizados principales y/o dominios de unión a 5T4 optimizados principales y/o anticuerpos biespecíficos estabilizados usando nuevos conectores y/o estrategias de estabilización adicionales que incluyen el orden invertido de cadena pesada y ligera o sitios de N-glicosilación, muestran una unión doble para ambas dianas, CD137 y 5T4. Los dominios de unión con unión mejorada, tales como, por ejemplo, 1210LO1 y 1210LO2 proporcionan una unión doble mejorada como se observa como valores de CE⁵⁰ más bajos en comparación con los anticuerpos biespecíficos que comprenden dominios de unión 1210 no optimizados.

Tabla 20

continuación

Ejemplo 25 - Unión de clones de 5T4 optimizados principales a células que expresan 5T4, medida por citometría de flujo

Materiales y métodos

El análisis de la unión de mAb 5T4 con citometría de flujo se realizó usando líneas celulares CHO-K transfectadas con 5T4 de humano y Macaca mulatta (cynomolgus) y como control negativo, las células transfectadas de forma simulada. Las células se tiñeron con clones optimizados principales de 5T4 (scFv en formato bsAb) diluidos en tampón FACS (PBS, BSA al 0,5 % y 0,02 % de NaN³). La unión se detectó con el anticuerpo secundario anti-lgG (Fc)-PE (109-115­ 098, Jackson ImmunoResearch Europe, R. U.) diluido 1:100. Las muestras se procesaron en un FACSverse (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) y se determinó la intensidad de fluorescencia media (IFM) usando el software FlowJo.

ELISA se realizó usando un protocolo convencional. Placas (n.° 655074, Greiner Bio-One GmbH, Alemania) se recubrieron previamente con 0,5 pg/ml de 5T4-Fc (producción propia) durante la noche. Los anticuerpos 5T4 se diluyeron en PBST+1 % de BSA y se añadieron 50 pl a cada pocillo. La unión se detectó con un anticuerpo de cadena ligera kappa antihumano (AbD Serotec n.° STAR127P) y ELISA se desarrolló con el sustrato quimioluminiscente de ELISA PICO SuperSignal (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) durante 2-10 minutos y se leyó en un lector multidetección basado en microplacas automatizado (FLUOstar OPTIMA, Países Bajos).

Resultados y conclusiones

Las curvas de unión para células CHOh5T4 y CHOcyno5T4 se pueden observar en la Figura 16 (A y B). Todas las variantes optimizadas principales tienen una potencia de unión similar tanto para las células que expresan 5T4 de humano como cyno, así como 5T4 humano medido con ELISA en comparación con el anticuerpo original. Las variantes optimizadas principales tienen una afinidad mejorada tanta para 5T4 de humano como cyno según lo medido con ELISA y FACS.

Ejemplo 26 - Unión de clones de CD137 optimizados principales a células que expresan CD137, medida por citometría de flujo

Material y métodos

El análisis de la unión de mAb CD137 con citometría de flujo se realizó usando líneas celulares CHO-K transfectadas con CD137 de humano y cyno y como control negativo, las células transfectadas de forma simulada. Las células se tiñeron con clones optimizados principales de CD137 (como scFv en formato bsAb) diluidos en tampón FACS (PBS, BSA al 0,5 % y 0,02 % de NaN³). La unión se detectó con el anticuerpo secundario anti-lgG (Fc)-Pe (109-115-098, Jackson ImmunoResearch Europe, R. U.) diluido 1:100. Las muestras se procesaron en un FACSverse (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) y se determinó la intensidad de fluorescencia media (IFM) usando el software FlowJo.

Las placas de ELISA (Greiner n.° 655074) se recubrieron con 50 pl/pocillo de CD137 recombinante (R&D n.° 838-4B) diluido a una concentración final de 0,5 pg/ml en PBS durante 1 h a 37 °C o durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron con PBS+0,05 % de TWEEN20 (PBST), seguido por un bloqueo con PBST+albúmina de suero de bovino al 1% (BSA). Las muestras de anticuerpos se diluyeron en PBST+1 % de BSA y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de una detección usando un anticuerpo de cadena ligera kappa antihumano conjugado con peroxidasa de rábano picante (AbD Serotec n.° STAR127P) y desarrollado usando el sustrato quimioluminiscente de ELISA Pico SuperSignal (Pierce ThermoScientific n.° 37069).

Resultados y conclusiones

Las curvas de unión de los anticuerpos biespecíficos a células CHOhCD137 y CHOcynoCD137 se pueden observar en la Figura 17 (A y B).

Los valores de CE⁵⁰ son comparables al clon 1210-1618 de tipo silvestre (1618 como scFv) para tanto CD137 de humano como de cyno.

Ejemplo 27 - Actividad in vitro de anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137 (1618-1210) optimizados principales en un ensayo de liberación de IFNy usando células T CD8+ humanas en placas recubiertas con 5T4

Material y métodos

La actividad funcional del bsAb 5T4-CD137 se evaluó en un ensayo de células T CD8+, donde las células se cultivaron en placas de microtitulación recubiertas con anticuerpo 5T4-Fc y CD3. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (MNC) mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque (p 1,077g/ml) (GE Healthcare n.° 17-1440-02) de concentrados de leucocitos obtenidos de donantes sanos (Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Labmedicin Region Skáne, Lund, Suecia). Las células T CD8+ se enriquecieron mediante selección negativa usando el kit de aislamiento de células T CD8+ (Miltenyi 130-096-495). Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 3 pg/ml de aCD3, clon OKT3 (Affymetrix eBioscience n.° 16-0037-85), se lavaron y se recubrieron con 5 pg/ml de 5T4-Fc durante 2 h a 37 °C. Después del recubrimiento de 5T4-Fc, las placas se lavaron y bloquearon durante un mínimo de 30 minutos con RPMI (Gibco n.° 61870010) que contenía FCS al 10 % (inactivado por calor, Gibco n.° 10270-106 lote 41Q9248K) y Hepes 10 mM (Gibco n.° 15630056). El bsAb 1618-1210 se diluyó en RPMI que contenía FCS al 10 % y Hepes 10 mM y se añadió a las placas 30 minutos antes de la adición de células T CD8+ (0,07 x 106células/pocillo). Las placas de ensayo se incubaron durante 68 h a 37 °C y se cosechó el sobrenadante del cultivo. Los niveles de IFN-y en los sobrenadantes se midieron por ELISA (BD OptiEIA n.° 555142).

Resultados y conclusiones

La potencia del bsAb 1618-1210 se determinó a CE⁵⁰ 0,6-0,9 nM usando células T CD8+ humanas cultivadas en placas recubiertas con 5T4-Fc y se basó en dos experimentos y un total de seis donantes. Los datos se normalizaron y la CE⁵⁰ se determinó usando un modelo sigmoidal de dosis-respuesta de tres parámetros (Figura 18).

Las variantes de anticuerpos biespecíficos con dominios variables optimizados de 1618-1619 y 1210-1211 se generaron como se indica en la Tabla D, Tabla E, Tabla 18, Tabla 19 y Tabla 20. Las variantes de bsAbs generadas con secuencias variables optimizadas fueron funcionales en el ensayo de células T CD8+ con 5T4-Fc reticulado como se observa en la Figura 19. Para correlacionar los resultados de las diferentes placas de ensayo, los niveles de IFNy calculados se normalizaron a una referencia de placa.

Los anticuerpos biespecíficos también se generaron con diferentes enlazadores como se indica en la Tabla D, Tabla E y Tabla 20, y se evaluaron en el ensayo de células T CD8. Como se muestra en la Figura 20, los bsAbs generados podrían inducir una activación de CD137 solo en presencia del antígeno tumoral. Al igual que en la Figura 19, los valores de IFNy obtenidos se normalizaron a un control positivo en la placa.

Ejemplo 28 - Actividad in vitro de anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137 (1618-1210) optimizados principales en un ensayo de liberación de IFNy usando células T CD8+ humanas cultivadas con células tumorales que expresan 5T4 (B16-5T4)

Material y métodos

Las células T CD8+ se aislaron como se ha descrito anteriormente y se cultivaron en presencia de células que expresan 5T4 del antígeno asociado a tumores (TAA), células B16. Se usaron células B16 transfectadas con un vector vacío como control negativo. La estimulación de CD3 se realizó con perlas recubiertas con aCD3 (OKT3) (Dynal M-450 activado con tosilo n.° 14013) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Se añadieron células tumorales B16 irradiadas (6000 células/pocillo) a las placas de 96 pocillos y se dejaron unir durante 2 horas. Se añadieron bsAbs CD137-5T4 y se incubaron durante 30 minutos antes de la adición de células CD8+ (0,1 x 106 células/pocillo) y perlas recubiertas con aCD3 (0,5 x 105 perlas/pocillo). Las placas se cultivaron durante 68 horas y los niveles de IFN-y en los medios se midieron por ELISA (BD OptiEIA n.° 555142).

Resultados y conclusiones

El anticuerpo biespecífico 1618-1210 indujo la producción de IFNy en células T CD8+ de manera dependiente de la dosis cuando se cultivó en células que expresaban 5T4 (TAA), pero no cuando se cultivó en células que no expresaban 5T4. Los resultados confirman además que los anticuerpos CD137-TAA estimulan las células T solo en presencia de antígenos tumorales. La potencia de bsAb 1618-1210 se determinó a CE⁵⁰0,2-0,7 nM en el ensayo de células T CD8+ realizado con células tumorales que expresan B16-5T4. La CE⁵⁰ se basó en los datos normalizados de dos donantes y se determinó usando un modelo sigmoidal de dosis-respuesta de tres parámetros (Figura 21).

Ejemplo 29 - Actividad in vitro de anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137 (1618-1210) optimizados principales en un ensayo de liberación de IFNy usando PBMCs humanas cultivadas en placas recubiertas con 5T4-Fc

Material y métodos

La actividad funcional del bsAb 5T4-CD137 se evaluó en un ensayo de PBMC, donde las células se cultivaron en placas de microtitulación recubiertas con anticuerpo 5T4-Fc. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque (p 1,077g/ml) (GE Healthcare n.° 17­ 1440-02) de concentrados de leucocitos obtenidos de donantes sanos (Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Labmedicin Region Skáne, Lund, Suecia). Las células T CD8+ se enriquecieron mediante selección negativa usando el kit de aislamiento de células T CD8+ (Miltenyi 130-096-495). Las placas se recubrieron con 5 pg/ml de 5T4-Fc durante 2 h a 37 °C. Después del recubrimiento de 5T4-Fc, las placas se lavaron y bloquearon durante un mínimo de 30 minutos con RPMI (Gibco n.° 61870010) que contenía FCS al 10 % (inactivado por calor, Gibco n.° 10270-106 lote 41Q9248K) y Hepes 10 mM (Gibco n.° 15630056).

Los bsAb 1618-1210 se diluyeron en RPMI que contenía FCS al 10 % y Hepes 10 mM y se añadieron a las placas 30 minutos antes de la adición de células T CD8+ (0,1 x 106células/pocillo). La estimulación de CD3 se realizó con 1 pg/ml de aCD3 soluble. Las placas de ensayo se incubaron durante 68 horas a 37 °C y se cosechó el sobrenadante del cultivo. Los niveles de IFN-y en los sobrenadantes se midieron por ELISA (BD OptiElA n.° 555142).

Resultados y conclusiones

Los resultados mostrados en la Figura 22 demuestran que el anticuerpo biespecífico 1618-1210.m2 indujo una activación mediada por CD137 dependiente de TAA (5T4) de PBMCs. No se detectó activación de PBMCs sin 5T4 presente en el ensayo.

Ejemplo 30 - Actividad in vitro de anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137 optimizados principales en un ensayo de liberación de IFNy usando células T c D8+ humanas cultivadas con células L que expresan CD32 (FcyRII)

Material y métodos

Las células T CD8 se aislaron como se ha descrito anteriormente y se cultivaron en presencia de células L que expresan CD32. La estimulación de CD3 se realizó con perlas recubiertas con aCD3 (OKT3) (Dynal M-450 activado con tosilo n.° 14013) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Se añadieron células L CD32 irradiadas (10.000 células/pocillo) a las placas de 96 pocillos y se dejaron unir durante 2 horas. Se añadió mAb CD137 (1618) y sin la mutación LALA y se incubó durante 30 minutos antes de la adición de células T CD8+ (0,1 x 106 células/pocillo) y perlas recubiertas con aCD3 (0,5 x 105 perlas/pocillo). Las placas se cultivaron durante 68 horas y los niveles de IFN-y en los medios se midieron por ELISA (BD OptiEIA n.° 555142).

Resultados y conclusiones

Los resultados del ensayo de cocultivo de células que expresan CD32 con células T CD8+, que se muestra en la Figura 23, demuestran que la activación de CD137 solo es inducida por 1618 que contiene la IgG1 ts y no por la IgG1 1618 silenciada por Fc que contiene la mutación LALA, respaldando aún más la conclusión de que la activación de las células T a través de CD137 con anticuerpos tales como 1618/1619 requiere reticulación.

Ejemplo 31 - Afinidad de los anticuerpos biespecíficos TAA-CD137 medida mediante ELISA dual-de unión

Material y métodos

Se generaron anticuerpos biespecíficos contra tres antígenos asociados a tumores (TAA), EpCAM, HER2 y EGFR. Se fusionó un scFv (1204/1205) que se unió a CD137 con el extremo C de tres anticuerpos de IgG diferentes con las secuencias correspondientes a los dominios de unión de Edrecolomab, Cetuximab y Herceptin. Los bsAbs se produjeron mediante transfección transitoria de Expi293™ (Thermo Fischer Scientific) y se purificaron mediante cromatografía de Proteína A.

La unión biespecífica a ambas dianas, CD137 y TAA, se evaluó usando un protocolo de ELISA convencional. Placas (n.° 655074, Greiner Bio-One GmbH, Alemania) se recubrieron previamente con 0,5 pg/ml de TAA (hEGFR-His, SinoBiological n.° 10001-H08H, hEpCAM-Fc, SinoBiological n.° 10694-H02H, HER2-His, SinoBiological n.° 10004-H08H y 5T4-Fc) durante la noche. Los TAA-bsAb se diluyeron a partir de 20 pg/ml en diluciones 1:4 y se añadieron en duplicados de 50 pl a cada pocillo. CD137-bio (Ancell n.° 502-030) se usó corno anticuerpo de detección a 0,5 pg/ml y la unión se detectó con Estreptavidina-HRP (Pierce n.° 21126). El ELISA se desarrolló con un sustrato quimioluminiscente de ELISA PICO SuperSignal (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) durante 2-10 minutos y se leyó en un lector multidetección basado en microplacas automatizado (FLUOstar OPTIMA, Países Bajos).

Resultados y conclusiones

Los bsAbs de TAA-CD137 generados se unieron a ambas dianas en el ELISA dual con valores de CE⁵⁰ en el intervalo bajo de nM (Tabla 21, Figura 24).

Tabla 21

Ejemplo de referencia 32 - Actividad in vitro de anticuerpos biespecíficos TAA-CD137 en un ensayo de liberación de IFNy usando células T CD8+ humanas en placas recubiertas con TAA

Material y métodos

La actividad funcional de los tres bsAbs TAA-CD137 que se unen a EpCAM, EGFA y Her2 se evaluó en un ensayo de células T CD8+, donde las células se cultivaron en placas de microtitulación recubiertas con anticuerpo CD3 y EGFR, EpCam o Her2. Como controles negativos, los pocillos paralelos se recubrieron solo con el anticuerpo CD3. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque (p 1,077 g/ml) (GE Healthcare n.° 17-1440-02) de concentrados de leucocitos obtenidos de donantes sanos (Clinical Immunology and Transfusion Medicine, Labmedicin Region Skáne, Lund, Suecia). Las células T CD8+ se enriquecieron mediante selección negativa usando el kit de aislamiento de células T CD8+ (Miltenyi 130-096-495). Las placas se recubrieron durante la noche a 4 °C con 3 pg/ml de aCD3, clon OKT3 (Affymetrix eBioscience n.° 16-0037­ 85), se lavaron y se recubrieron con 5 pg/ml de TAA durante 2 h a 37 °C. Después del recubrimiento de TAA, las placas se lavaron y bloquearon durante un mínimo de 30 minutos con RPMI (Gibco n.° 61870010) que contenía FCS al 10 % (inactivado por calor, Gibco n.° 10270-106 lote 41Q9248K) y Hepes 10 mM (Gibco n.° 15630056).

Los bsAbs TAA-CD137 se diluyeron en RPMI que contenía FCS al 10 % y Hepes 10 mM y se añadieron a las placas 30 minutos antes de la adición de células T CD8+ (0,07 x 106células/pocillo). Las placas de ensayo se incubaron durante 68 horas a 37 °C y se cosechó el sobrenadante del cultivo. Los niveles de IFN-y en los sobrenadantes se midieron por ELISA (BD OptiEIA n.° 555142).

Resultados y conclusiones

Se analizó la funcionalidad de los bsAbs EpCAM-1204 (Figura 25(A)), EGFR-1204 (Figura 25(B)) y Her2-CD137 (Figura 25(C)) y se concluyó que todos los bsAbs generados indujeron la activación de CD137 mediada por TAA en presencia de TAA y no en ausencia de TAA (pocillos recubiertos solo con anticuerpo CD3). Esto indica claramente que la activación de las células inmunitarias mediada por CD137 dependiente de TAA generada por los anticuerpos CD137-TAA es un fenómeno general aplicable a todos los tipos de TAA expresados en la superficie celular.

Ejemplo 33 - Efecto antitumoral in vivo del anticuerpo biespecífico 1618-1210 en un modelo de cáncer de colon CT26-5T4

Sumario

El efecto antitumoral de 1618-1210 (un anticuerpo ilustrativo que se dirige a CD137 y 5T4) se investigó usando ratones transgénicos para CD137 de humano y un modelo de tumor singénico subcutáneo de carcinoma de colon CT26 que expresa 5T4 humano.

El anticuerpo biespecífico 1618-1210 demostró una inhibición del volumen tumoral en comparación con el anticuerpo monoclonal 1618 que se dirige a CD137.

Material y métodos

El Prof. Lieping Chen desarrolló un modelo de ratón transgénico 4-1BB humano y en los experimentos se usaron hembras heterocigotas F1. Los heterocigotos se generaron criando homocigotos machos para CD137 humano en fondo C57 junto con hembras BalbC. Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del comité de ética de Malmo/Lund.

Se obtuvieron células de cáncer de colon CT26 de ATCC y se transfectaron con 5T4 humano. La línea celular CT26-5T4 que crecía en la fase logarítmica se inyectó subcutáneamente (0,5 x 106 células en 100 pl en el día 0 (D0)) en el trasero/flanco derecho. Los tratamientos intraperitoneales (1,33 nM) se realizaron los días 7, 10, y 13.

El tumor se midió en anchura, longitud y altura con un calibre, cuyo volumen tumoral se calculó (a/2 x l/2 x al/2 x pi x (4/3)). Los animales se sacrificaron antes de que el volumen del tumor alcanzara los 2 cm3, resultaran heridos, o afectara la salud de los ratones.

Los datos se analizaron para determinar la inhibición del volumen tumoral por el anticuerpo biespecífico en comparación con el anticuerpo monoclonal usando GraphPad Prism y Excel.

Resultados y conclusiones

La eficacia antitumoral se demostró mediante el tratamiento con el anticuerpo biespecífico 1618-1210 en comparación con el tratamiento con el anticuerpo monoclonal 1618 en los días 8-22 en forma de inhibición del crecimiento tumoral. El porcentaje de inhibición del volumen tumoral varió de 0-68 % cuando se trató con 1618-1210 (véase la Tabla 22). En conclusión, el efecto antitumoral de 1618-1210 se investigó usando ratones transgénicos para CD137 de humano y un modelo de tumor subcutáneo de carcinoma de colon CT26 que expresa 5T4 humano. El anticuerpo biespecífico 1618-1210 demostró una inhibición del volumen tumoral en comparación con el mAb monoclonal 1618 de CD137.

Tabla 22

Ejemplo 34 - Los anticuerpos biespecíficos 5T4-CD137 se localizan en el área del tomar

Material y métodos

Se usaron ratones hembra SCID-Beige (7-8 semanas) de Taconic (Dinamarca) en los experimentos. Todos los experimentos se realizaron con la aprobación del comité de ética de Malmo/Lund.

Estudios de tumores gemelos (tumores B16 y CT26)

El melanoma B16.F10 ts (B16) se obtuvo de ATCC y se cultivó de acuerdo con las recomendaciones de la ATCC. B16-5T4 se obtuvo del profesor Peter Stern y se cultivó en el mismo medio, suplementado con 1,2 mg/ml de G418. Las células CT26 y CT26-5T4 se cultivaron en RPMI, FCS al 10 %, NaPy y HEPES. El medio CT-5T4 se suplementó con 1,2 mg/ml de G418.

Para los tumores B16 y CT26, se realizaron estudios de tumores gemelos y cada ratón recibió un tumor negativo y un tumor positivo a 5T4 en cada lado del flanco. Las líneas celulares, que crecieron en la fase logarítmica, se inyectaron por vía subcutánea (1 x 105 células en 100 j l en el día 0). Las PBMCs humanas (10 x 106 en 100 jl), aisladas de concentrados de leucocitos, se inyectaron por vía intraperitoneal en el mismo día. Los concentrados de leucocitos se obtuvieron del Hospital Universitario de Lund.

Los tratamientos con anticuerpos intraperitoneales (100 jg ) se realizaron los días 6 y 13 para los tumores B16 y los días 6, 13 y 20 para los tumores CT26.

Estudios de tumores únicos (tumores SKOV-3)

Para tumores SKOV-3, cada ratón recibió un solo tumor en el flanco derecho. La línea celular, que creció en la fase logarítmica, se inyectó por vía subcutánea (10 x 106 células en 100 j l en el día 0). Las PBMCs humanas (10 x 106 en 100 jl), aisladas de concentrados de leucocitos, se inyectaron por vía intraperitoneal una vez que el volumen promedio del tumor alcanzó más de 100 mm3. Los tratamientos con anticuerpos intraperitoneales (100 jg ) se realizaron a partir de los 6 días después de la transferencia de PBMC, los días 55, 62 y 67.

Análisis FACS

Los ratones se sacrificaron 24 h después del tratamiento final y se recogieron los tumores. Los tumores se digirieron enzimáticamente usando Liberasa Tl (Roche n.° 05401020001) y DNasa I (Roche n.° 10104159001). El material tumoral digerido se pasó a través de un tamiz celular de 70 jm (Fisher Scientific n.° 22363548) y la suspensión de células individuales resultante se tiñó para el análisis FACS.

La unión del anticuerpo inespecífico se bloqueó usando lgG de ratón (Jackson ImmunoResearch n.° 015-000-003) y el bloque Fc (BD n.° 553141). Las células muertas se detectaron usando tinción de viabilidad fijable 450 (BD n.° 562247) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La unión del anticuerpo (lgG humana) a las células tumorales se detectó usando lgG-PE de cabra antihumano (Jackson ImmunoResearch n.° 109-115-098). Las muestras se procesaron en un FACSVerse (BD) y los datos se analizaron usando el software FlowJo.

Resultados

Localización de 1618-1210.m2.m5 en tumores B16 y CT26 positivos a 5T4 en ratones SCID-Beige

La unión de lgG humana fue claramente detectable en aproximadamente el 6 % de las células en tumores B16-5T4 de ratones tratados con 1618-1210.m2.m5, pero no en tumores B16.F10 ts de los mismos ratones. Los ratones tratados con 1618.m2 o 2112.s4.m3 tenían lgG humana unida a <1 % de las células independientemente del tipo de tumor (Figura 26).

Una observación similar se realizó en ratones portadores de tumores CT26. La localización del anticuerpo se observó de nuevo específicamente en los tumores que expresaban 5T4. Similar a los tumores B16, la lgG humana fue detectable en aproximadamente el 8 % de las células tumorales viables en ratones tratados con 1618-1210.m2.m5, pero no con 1618.m2 o 2112.s4.m3. De manera adicional, CD137 biotinilado también se unió específicamente a las células de tumores que expresan 5T4, de ratones tratados con 1618-1210.m2.m5 (Figura 27).

Localización de 1618-1210 m2.m5 en tumores SKOV-3

Similar a lo que se observó en los tumores CT26, se observó la unión de CD137 biotinilado en tumores SKOV-3 de ratones tratados con 1618-1210.m2.m5, pero no 1618.m2 o 2112.s4.m3. De manera adicional, las células que se habían unido a CD137 también expresaron 5T4, lo que sugiere que el anticuerpo biespecífico se dirige específicamente a las células que expresan 5T4 y permanece intacto dentro del tumor (Figura 28).

Conclusión

Estos datos muestran que el anticuerpo biespecífico 1618-1210.m2.iri5 se une selectivamente a los tumores que expresan 5T4 in vivo. Por el contrario, los anticuerpos monoespecíficos CD137 1618.m2 y 2112.s4.m3 no se localizan en los tumores.

Ejemplo 35 - Tm mejorada de aglutinantes de 5T4 y CD137 optimizados

Las mediciones de Tm se realizaron en scFv soluble o anticuerpos biespecíficos usando fluorescencia de proteínas con la plataforma UNcle (Unchained Labs). El inicio de la agregación se midió con dispersión de luz estática (SLS, por sus siglas en inglés) con la plataforma UNcle. Las mediciones se realizaron en el intervalo de temperatura 20 °C-95 °C con una velocidad de rampa de 0,4 °C por min en PBS y en un intervalo de concentración de proteínas de 0,12­ 1,32 mg/ml. El análisis de datos se realizó con la versión 2.0 del software UNcle Analysis usando la configuración predeterminada.

Tal como se puede observar en la Tabla 23, las secuencias optimizadas presentan Tm1 y Tagg mejoradas en comparación con las secuencias de tipo silvestre (1618 y 1210, respectivamente).

En la Tabla 24, se muestra Tm1 y Tagg para anticuerpos biespecíficos ilustrativos (en formato de Morrison). Los datos muestran que la termoestabilidad aumenta cuando las secuencias optimizadas se emplean en el formato biespecífico.

Tabla 23

Tabla 24

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Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio de unión, designado B1, que es capaz de unirse específicamente a CD137; y un segundo dominio de unión, designado B2, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno asociado a células tumorales, en donde el antígeno asociado a células tumorales es 5T4;

en donde el dominio de unión B1 comprende CDRL1 correspondiente al SEQ ID NO: 54, CDRL2 correspondiente al SEQ ID NO: 55, y CDRL3 correspondiente al SEQ ID NO: 83, y

en donde el dominio de unión B1 comprende CDRH1 correspondiente al SEQ ID NO: 62 o una variante de CDRH1 que tiene solo una mutación de aminoácidos en relación con el SEQ ID NO: 62, CDRH2 correspondiente al SEQ ID NO: 69, y CDRH3 correspondiente al SEQ ID NO: 76; y

en donde el dominio de unión B2 comprende CDRL1 correspondiente al SEQ ID NO: 54 o una variante de CDRL1 que tiene solo una mutación de aminoácidos en relación con el SEQ ID NO: 54, CDRL2 correspondiente al SEQ ID NO: 55, y CDRL3 correspondiente al SEQ ID NO: 58, y

en donde el dominio de unión B2 comprende CDRH1 correspondiente al SEQ ID NO: 46, CDRH2 correspondiente al SEQ ID NO: 48, y CDRH3 correspondiente al SEQ ID NO: 52.

2. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

(a) el dominio de unión B1 y/o el dominio de unión B2 es un anticuerpo de lgG intacta;

(b) el dominio de unión B1 y/o el dominio de unión B2 es un fragmento Fv; y/o

(c) el dominio de unión B1 y/o el dominio de unión B2 es un fragmento Fab;

y/o

en donde el anticuerpo biespecífico comprende una región Fc humana o una variante de una dicha región, donde la región es una región de lgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferentemente una región de IgG1 o IgG4; opcionalmente en donde la región Fc humana no presenta ninguna afinidad o una afinidad al menos 10 veces reducida para FcgRI, FcgRII y FcgRIII en comparación con la IgG1 humana de tipo silvestre según lo determinado por la concentración donde se alcanza la unión media máxima en el análisis citométrico de flujo de las células que expresan FcyR mediante ELISA FcyR; y/o

en donde la región Fc humana es una variante de una región Fc de lgG1 humana que comprende una mutación en una o más de las siguientes posiciones: L234, L235, P239, D265, N297 y/o P329; opcionalmente en donde la alanina está presente en la(s) posición(es) mutada(s), tales como las dobles mutaciones L234A y L235A.

3. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo biespecífico se selecciona de los grupos que consisten en:

(a) anticuerpos biespecíficos bivalentes, tales como anticuerpos biespecíficos IgG-scFv (por ejemplo, en donde B1 es una IgG intacta y B2 es un scFv unido a B1 en el extremo N de una cadena ligera y/o en el extremo C de una cadena ligera y/o en el extremo N de una cadena pesada y/o en el extremo C de una cadena pesada de la IgG, o en donde B2 es una IgG intacta y B1 es un scFv unido a B2 en el extremo N de una cadena ligera y/o en el extremo C de una cadena ligera y/o en el extremo N de una cadena pesada y/o en el extremo C de una cadena pesada de la IgG);

(b) anticuerpos biespecíficos monovalentes, tales como un anticuerpo biespecífico de "botón en ojal" (knob-in-hole) (por ejemplo, un scFv-KIH, scFv-KIHr, un BiTE-KIH o un BiTE-KIHr;

(c) anticuerpos biespecíficos scFv²-Fc;

(d) anticuerpos biespecíficos BiTE/scFv²;

(e) anticuerpos biespecíficos DVD-Ig u otros anticuerpos biespecíficos IgG-FAb, FAb-IgG;

(f) DART²-Fc o DART-Fc;

(g) anticuerpos biespecíficos DNL-Fab³; y

(h) anticuerpos biespecíficos scFv-HSA-scFv.

4. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio de unión B1 y el dominio de unión B2 están fusionados directamente entre sí; y/o

en donde el dominio de unión B1 y el dominio de unión B2 se unen a través de un enlazador polipeptídico; opcionalmente

en donde el enlazador se selecciona del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 87), SGGGGSGGGGSAP (SEQ ID NO: 88), NFSQP (SEQ ID NO: 89), KRTVA (SEQ ID NO: 90), GGGSGGGG (SEQ ID NO: 91), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 92), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 93), THTCPPCPEPKSSDK (SEQ ID NO: 140), GGGS (SEQ ID NO: 141), EAAKEAAKGGGGS (SEQ ID NO: 142), EAAKEAAK (SEQ ID NO: 143) o (SG)m, donde m = 1 a 7.

5. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo biespecífico es incapaz de inducir una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), una fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); y/o

en donde el anticuerpo biespecífico del mismo es capaz de inducir una inmunidad tumoral; y/o

en donde el anticuerpo biespecífico del mismo es capaz de inducir:

(a) una activación de células T citotóxicas, es decir, células T CD8+;

(b) una activación de células T auxiliares, es decir, células T CD4+;

(c) una activación de células dendríticas; y/o

(d) una activación de células citolíticas naturales; y/o

(e) una reprogramación de Tregs en células T efectoras.

6. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio de unión B1 se une a CD137 humano con una Kd inferior a 10 x 10-9 M, por ejemplo, inferior a 4 x 10-9M o inferior a 1,2 x 10-9 M y/o en donde el dominio de unión B2 se une al antígeno asociado a células tumorales con una Kd inferior a 10 x 10-9M, por ejemplo inferior 4 x 10-9M o inferior a 1,2 x 10-9 M;

en donde la Kd se mide mediante el análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR).

7. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio de unión B1 comprende la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 35 y la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33, o una variante que tiene más del 60 %, o más del 70 %, p. ej., el 75 o el 80 %, preferentemente más del 85 %, p. ej., más del 90 o 95 % de identidad de aminoácidos con el s Eq ID NO: 35 y/o el s Eq ID NO: 33.

8. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dominio de unión B2 comprende la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11 y la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 9, o una variante que tiene más del 60 %, o más del 70 %, p. ej., el 75 o el 80 %, preferentemente más del 85 %, p. ej., más del 90 o 95 % de identidad de aminoácidos con el SEQ ID NO: 11 y/o el s Eq ID NO: 9.

9. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

(a) B1 comprende la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 35 y/o la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 33 y B2 comprende la región variable de la cadena ligera SEQ ID NO: 11 y/o la región variable de la cadena pesada SEQ ID NO: 9; o

(b) B1 y/o B2 comprenden variantes de dichas regiones variables de la cadena ligera y/o dichas regiones variables de la cadena pesada que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia con las mismas.

10. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores; opcionalmente, en donde la molécula es una molécula de ADNc.

11. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10; opcionalmente en donde el vector es un vector de expresión.

12. Una célula hospedadora recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10 o un vector de acuerdo con la reivindicación 11; opcionalmente en donde la célula hospedadora es una célula bacteriana o una célula de mamífero o una célula humana.

13. Un método para producir un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo el método cultivar una célula hospedadora como se define en la reivindicación 12 en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo biespecífico.

14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 9 y un diluyente, un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptables; opcionalmente adaptado para administración parenteral o adaptado para administración intravenosa.

15. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en medicina.

16. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno neoplásico en un sujeto; opcionalmente en donde el trastorno neoplásico está asociado a la formación de tumores sólidos en el cuerpo del sujeto; opcionalmente

en donde el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, melanomas, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro/del SNC, cáncer de cuello del útero, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de cabeza/cuello, cáncer de riñón, cáncer de hígado, linfomas, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, sarcomas y carcinoma de células renales.