WO2024143643A1 - Cd137에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 이의 용도 - Google Patents

Cd137에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024143643A1
WO2024143643A1 PCT/KR2022/021735 KR2022021735W WO2024143643A1 WO 2024143643 A1 WO2024143643 A1 WO 2024143643A1 KR 2022021735 W KR2022021735 W KR 2022021735W WO 2024143643 A1 WO2024143643 A1 WO 2024143643A1
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seq
amino acid
acid sequence
cancer
affibody
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PCT/KR2022/021735
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이현종
안상호
이종호
이종서
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앱클론(주)
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes

Definitions

  • the present invention relates to affibodies that specifically bind to CD137 and their uses. More specifically, an affibody that specifically binds to CD137, a protein complex comprising an affibody that specifically binds to CD137 and an antibody that specifically binds to EGFR, HER2, or CD19, and prevention or treatment of cancer using the same. It's about use.
  • immunotherapy drugs have been receiving attention as promising cancer treatment options: ipilimumab, which targets CTLA-4, and pembrolizumab or nivolumab, which targets PD-1. ), and immune checkpoint inhibitors such as atezolizumab targeting PD-L1; Immunocytotherapy agents such as chimeric antigen receptor-T (CAR-T); therapeutic antibodies such as antibodies that bind to antigens in cancer cells and antibody drug conjugates (ADCs) that combine antibodies and drugs; Blinatumomab, which dual-specifically targets the CD3 antigen of T cells and the CD19 antigen of B-cell lymphoma, and the CD3 antigen of T cells and the epithelial cell adhesion molecule of cancer cells. T-cell engaging bispecific antibodies such as catumaxomab targeting; and anticancer vaccines that administer cancer cell-specific antigens or antigens to improve the body's immune response.
  • CAR-T chimeric antigen receptor-T
  • ADCs antibody
  • T-cell-engaging bispecific antibodies such as blinatumomab and catumaxomab are the most advanced next-generation immuno-oncology approaches to date, but blinatumomab is only used in hematological cancers and has safety issues. Since maxomab is only applied to the treatment of malignant ascites, its use in the treatment of various types of cancer is limited (Lakins MA, et al. Clin Cancer Res. 2020 Aug 1;26(15):4154-4167.).
  • T-cell engaging bispecific antibody that can be applied not only to blood cancer but also to solid tumors, it is expected to be useful in the treatment of various types of cancer.
  • the present inventors have made extensive research efforts to develop a T-cell engaging bispecific antibody that can be applied to both blood cancer and solid cancer.
  • an affibody that specifically binds to CD137, a co-stimulatory molecule whose expression increases on the surface of activated T cells, and used it to bind to CD137 on activated T cells.
  • a protein complex that specifically binds to antigens on the surface of cancer cells, such as EGFR, HER2, or CD19, a T-cell-involved bispecific antibody that can be applied to both blood cancer and solid cancer was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a protein complex comprising the above-described affibody and an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a protein on the surface of cancer cells.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the above-described affibody or protein complex and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137, comprising an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8.
  • the present inventors have made extensive research efforts to develop a T-cell engaging bispecific antibody that can be applied to both blood cancer and solid cancer.
  • an affibody that specifically binds to CD137, a co-stimulatory molecule whose expression increases on the surface of activated T cells, and used it to bind to CD137 on activated T cells.
  • a protein complex was developed that specifically binds to antigens on the surface of cancer cells, such as EGFR, HER2, or CD19. Therefore, the bispecific antibody comprising the affibody of the present invention and an antibody against an antigen on the surface of cancer cells, that is, a T-cell engaging bispecific antibody, can be usefully used in the prevention or treatment of hematological cancer and solid cancer.
  • CD137 refers to a member of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) family, also called tumor necrosis factor receptor superfamily number 9 (TNFRSF9), 4-1BB, and induced by lymphocyte activation (ILA). It refers to a co-stimulatory immune checkpoint molecule.
  • TNFR tumor necrosis factor receptor
  • 4-1BB tumor necrosis factor receptor superfamily number 9
  • IVA lymphocyte activation
  • the CD137 is CD137 from human or cynomolgus monkey.
  • Methods for transporting the vector of the present invention into a host cell include, when the host cell is a eukaryotic cell, microinjection (Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980)), calcium phosphate precipitation (Graham, F.L. et al. , Virology, 52:456 (1973)), electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841 (1982)), liposome-mediated transfection (Wong, T.K. et al., Gene , 10:87 (1980)), DEAE-dextran treatment (Gopal, Mol.
  • the recombinant vector injected into the host cell can express the above recombinant affibody within the host cell, and in this case, a large amount of affibody is obtained.
  • the expression vector contains a galactose-inducible promoter, gene expression can be induced by treating the host cell with IPTG.
  • the culture is usually carried out under aerobic conditions such as shaking culture or rotation by rotator.
  • the culture temperature is preferably in the range of 10°C to 40°C, and the culture time is generally 5 hours to 7 days.
  • the pH of the medium is preferably maintained in the range of 3.0 to 9.0 during culture.
  • the pH of the medium can be adjusted with inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • antibiotics such as ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, kanamycin, and tetracycline may be added for maintenance and expression of the recombinant vector.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising an affibody according to an embodiment and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the affibody since the above-described affibody specifically binds to cells expressing CD137, specifically activated CD8 + T cells, dendritic cells, NK cells, etc., the affibody acts as an agonist on CD137, Activates NK cells and exhibits ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) or T-cell mediated cytotoxicity (T-cell mediated cytotoxicity), so it can be usefully used in the prevention or treatment of cancer.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • T-cell mediated cytotoxicity T-cell mediated cytotoxicity
  • the pharmaceutical composition of the present invention uses the above-described affibody that specifically binds to CD137 of the present invention as an active ingredient, the description of common content between the two is omitted to avoid excessive complexity of the present specification. .
  • the cancer is hematological cancer or solid cancer.
  • Cancer sinonasal cancer, nasopharyngeal cancer, salivary gland cancer, hypopharyngeal cancer, thyroid cancer, oral cancer, thoracic tumor, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, thymic cancer, mediastinal tumor, esophageal cancer, breast cancer, male breast cancer, abdominal tumor, stomach cancer, liver cancer, Gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, small intestine cancer, colon cancer, rectal cancer, anal cancer, bladder cancer, kidney cancer, male genital cancer, penile cancer, prostate cancer, female genital cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, uterine sarcoma, One or more types selected from the group consisting of vaginal cancer, female external genital cancer, female urethral cancer, and skin cancer, but are not necessarily limited thereto.
  • the blood cancer includes acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, myelodysplastic syndrome, myeloproliferative tumor, polycythemia vera, essential thrombocythemia, myelofibrosis, monocytic leukemia, erythroleukemia, Megakaryoblastic leukemia, basophilic wallemia, eosinophilic leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma, lymphoma, B-cell lymphoma, marginal lymphoma, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, diffuse large B- Cellular lymphoma, extranodal marginal zone cell lymphoma, extranodal NK/T-cell lymphoma, peripheral T-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, progenitor cell tumor, mantle cell lympho
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in preparation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, Includes, but is limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. It doesn't work.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • lubricants wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, for example, by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intrasternal injection, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration. You can.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. Usually, a skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment or prevention. According to a preferred embodiment of the present invention, the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg/kg. As used herein, the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to prevent or treat the above-mentioned disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art. Alternatively, it can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, suppository, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
  • protein on the surface of cancer cells refers to a protein embedded in or spanning the cell membrane layer.
  • the proteins on the cancer cell surface include integral membrane proteins, transmembrane proteins, lipid-anchored membrane proteins, and superficial membrane proteins that exist/express on the cancer cell surface. It may be (peripheral membrane protein), antigen, proteoglycan, or mucin, but is not necessarily limited thereto.
  • the protein on the surface of the cancer cell may be a protein that is overexpressed compared to normal cells.
  • the protein on the surface of the cancer cell may be a mutated wild-type protein.
  • the protein on the surface of the cancer cell may be a cancer cell-specific protein or a tumor marker.
  • the tumor marker may be any protein present in or produced by cancer cells or other cells as a result of a response to cancer or a specific noncancerous benign condition.
  • the protein complex is in the form of a multimer in which monomers of the affibody according to one embodiment and monomers of each antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a protein on the surface of cancer cells are linked. .
  • the protein complex may be in the form of a multimer in which the affibody and each antibody or antigen-binding fragment thereof are covalently linked to each other.
  • the protein complex may be in the form of a multimer in which the affibody and each antibody or antigen-binding fragment thereof are linked to each other by an amino acid linker.
  • the protein complex may be implemented in the form of a fused protein or conjugate.
  • the affibodies and the antibodies or antigen-binding fragments thereof can be conjugated via chemical conjugation (known as organic chemistry methods) or other means (e.g., by expressing the complex as a fusion protein, directly or via a linker (e.g., an amino acid linker). ) can be indirectly connected through.
  • chemical conjugation known as organic chemistry methods
  • other means e.g., by expressing the complex as a fusion protein, directly or via a linker (e.g., an amino acid linker).
  • linker e.g., an amino acid linker
  • each monomer forming the protein complex is connected by at least one linker.
  • the linker may consist of an amino acid sequence represented by the general formula (GnSm)p or (SmGn)p:
  • n, m and p are independently,
  • n is an integer from 1 to 7;
  • n is an integer from 0 to 7;
  • n and m are integer less than or equal to 8.
  • p is an integer from 1 to 7.
  • the linker is (GGGGS) 3 .
  • the linker is GGGGS.
  • the linker is VDGS.
  • the linker is ASGS.
  • the protein complex may be a multiple antibody with two or more targets.
  • the protein complex is a monoclonal antibody, polyclonal antibody, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, minibody, diabody, triabody, tetrabody. It may be a body, double antibody, multispecific antibody, human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, chemobody, optobody, or antigen-binding fragment thereof.
  • the protein complex is a bispecific antibody. In another specific embodiment of the present invention, the protein complex is a tetravalent antibody.
  • the protein complex is a trispecific antibody.
  • the protein complex is a T-cell engaging bispecific antibody.
  • the protein complex is a monoclonal bispecific antibody.
  • the protein complex is a polyclonal bispecific antibody.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a protein on the surface of the cancer cell is a monoclonal antibody, polyclonal antibody, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2. , scFv-Fc, minibody, diabody, triabody, tetrabody, bispecific antibody, trispecific, multispecific antibody, bivalent antibody, tetravalent antibody, human antibody, humanized antibody, chimeric antibody or these It may be an antigen-binding fragment.
  • the affibody is fused to the heavy chain or light chain of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the affibody is fused to the C-terminus of the heavy chain or light chain of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the affibody is fused to the N-terminus of the heavy chain or light chain of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the affibody is fused to the C-terminus and N-terminus of the heavy chain or light chain of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the protein on the surface of the cancer cell is epidermal growth factor receptor (EGFR), human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), or cluster of differentiation 19 (CD19).
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • CD19 cluster of differentiation 19
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to EGFR includes:
  • cetuximab is a commercially available antibody that specifically binds to human EGFR, and any antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human EGFR known in the art can be used without limitation. Those skilled in the art will understand that there is.
  • the protein complex includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 according to one embodiment; and cetuximab.
  • the protein complex according to one embodiment of the present invention includes an affibody and cetuximab that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and includes an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8. Includes.
  • the protein complex includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137;
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, CDR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and CDR-H3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; And an antibody comprising a light chain variable region comprising CDR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, CDR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and CDR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, or Includes antigen-binding fragments thereof.
  • the protein complex according to one embodiment of the present invention includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and includes an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8; and
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, CDR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and CDR-H3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; And an antibody comprising a light chain variable region comprising CDR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, CDR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and CDR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, or Includes antigen-binding fragments thereof.
  • (b) is a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the protein complex includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 according to one embodiment
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; and an antibody or antigen-binding fragment thereof containing a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the protein complex according to one embodiment of the present invention includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and includes an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8; and
  • It includes an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 and a light chain variable region including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to HER2 includes:
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, CDR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, and CDR-H3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32; and a light chain variable region comprising CDR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, CDR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and CDR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35.
  • the trastuzumab is a commercially available antibody that specifically binds to human HER2, and any antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to human HER2 known in the art can be used without limitation. Those skilled in the art will understand that there is.
  • the protein complex includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137;
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; and an antibody or antigen-binding fragment thereof containing a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.
  • the protein complex according to one embodiment of the present invention includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and includes an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8; and
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; and an antibody or antigen-binding fragment thereof containing a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.
  • the protein complex includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137;
  • the protein complex according to one embodiment of the present invention includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and includes an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8; and
  • the protein complex includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137;
  • the protein complex according to one embodiment of the present invention includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and includes an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8; and
  • (e) is a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.
  • the protein complex according to one embodiment of the present invention includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and includes an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8; and
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; and an antibody or antigen-binding fragment thereof containing a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD19 includes:
  • the FMC63 is a commercially available antibody that specifically binds to human CD19, and those skilled in the art will understand that any antibody or antigen-binding fragment thereof known in the art that specifically binds to human CD19 can be used without limitation. will be.
  • the protein complex includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137;
  • the protein complex according to one embodiment of the present invention includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and includes an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8; and
  • the protein complex includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137;
  • the protein complex according to one embodiment of the present invention includes an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and includes an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8; and
  • the present invention provides a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding a protein complex according to an embodiment.
  • the nucleic acid molecule is a protein complex comprising an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a protein on the surface of cancer cells.
  • the nucleic acid molecule is a nucleotide sequence encoding a protein complex comprising an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to EGFR.
  • the nucleic acid molecule is a nucleotide encoding a protein complex comprising an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to HER2. Includes sequence.
  • the nucleic acid molecule encodes a protein complex comprising an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 and an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD19. Contains a nucleotide sequence.
  • nucleotide sequence encoding the protein complex of the present invention is sufficient to be the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence constituting the protein complex, and is not limited to any specific nucleotide sequence.
  • the present invention provides a recombinant vector containing a nucleic acid molecule encoding the above-described protein complex.
  • an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 according to one embodiment and an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a protein on the surface of cancer cells
  • the nucleic acid molecule encoding is operatively linked to the promoter.
  • an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 according to one embodiment and an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to EGFR, HER2 or CD19
  • a nucleic acid molecule encoding is operably linked to a promoter.
  • the nucleic acid molecule encoding the heavy chain variable region and the nucleic acid molecule encoding the light chain variable region of the antibody are operably linked to a promoter.
  • a nucleic acid molecule encoding an affibody and cetuximab that specifically binds to the extracellular domain of CD137 is operably linked to a promoter.
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, CDR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, and CDR-H3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; And a nucleic acid molecule encoding a light chain variable region comprising CDR-L1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, CDR-L2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and CDR-L3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22. is operably linked to the promoter.
  • an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 according to one embodiment in the vector of the present invention.
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23; And the nucleic acid molecule encoding the light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 is operably linked to the promoter.
  • an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 according to one embodiment
  • a nucleic acid molecule encoding a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to HER2 is operably linked to a promoter.
  • an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 according to one embodiment
  • a heavy chain variable region comprising CDR-H1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30, CDR-H2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, and CDR-H3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 32; And a nucleic acid molecule encoding a light chain variable region comprising CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34, and CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35. is operably linked to the promoter.
  • an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 according to one embodiment in the vector of the present invention.
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36; And the nucleic acid molecule encoding the light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37 is operably linked to the promoter.
  • an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 according to one embodiment
  • a nucleic acid molecule encoding a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD19 is operably linked to a promoter.
  • an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137 according to one embodiment
  • a nucleic acid molecule encoding FMC63 is operably linked to a promoter.
  • operatively linked refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence. , whereby the regulatory sequence regulates transcription and/or translation of the other nucleic acid sequences.
  • a nucleic acid expression control sequence e.g., a promoter, a signal sequence, or an array of transcriptional regulator binding sites
  • the recombinant vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) , this document is incorporated herein by reference.
  • the vector of the present invention can typically be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression. Additionally, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells e.g., metallothionein promoter, beta-actin promoter, human heroglobin promoter, and human muscle creatine promoter
  • promoters derived from mammalian viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter
  • the LTR promoter of HIV, the promoter of Moloney virus, the promoter of Epstein Barr virus (EBV), and the promoter of Roux Sarcoma virus (RSV) can be used and generally have a polyadenylation sequence as the transcription termination sequence.
  • the vector of the present invention may be fused with other sequences to facilitate purification of the antibody expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
  • the protein expressed by the vector of the present invention is an antibody
  • the expressed antibody can be easily purified through a protein A column, etc., without additional sequences for purification.
  • the expression vector of the present invention contains an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neo.
  • antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neo.
  • resistance genes for mycin and tetracycline are resistance genes for mycin and tetracycline.
  • the vector may additionally carry genes encoding reporter molecules (eg, luciferase and -glucuronidase).
  • reporter molecules eg, luciferase and -glucuronidase
  • the expression vector is a vector into which a nucleic acid molecule encoding an antibody against EGFR, HER2, or CD19 or an antigen-binding fragment thereof is inserted, and operably binds to the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule ( It is a recombinant vector for host cell expression that is operatively linked and contains a promoter that forms RNA molecules in the host cell and a poly A signal sequence that acts in the host cell to cause polyadenylation of the 3'-end of the RNA molecule.
  • the present invention provides an isolated host cell containing the above-described recombinant vector.
  • the isolated host cell is transformed with the recombinant vector of the present invention.
  • Host cells capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention are known in the art and any host cell can be used.
  • suitable eukaryotic host cells for the vector include yeast (Saccharomyce cerevisiae) and insect cells. , monkey kidney cells (COS7), NSO cells, SP2/0, Chinese hamster ovary (CHO) cells, W138, baby hamster kidney (BHK) cells, MDCK, myeloma cell line. , HuT 78 cells, and HEK-293 cells.
  • the host cells include cynomolgus monkey-derived fibroblasts (CYNOM-K1, Sigma-Aldrich) and rhesus monkey-derived kidney cells (ATCC, LLC-MK2 Original). CCL-7 TM or ATCC, FRhK-4, CRL-1688 TM ), or rhesus monkey-derived lymphoblasts (ATCC, LCL 8664, CRL-1805 TM ).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a protein complex according to an embodiment and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition of the present invention uses the above-mentioned protein complex as an active ingredient, the description of common content between the two is omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the cancer is hematological cancer or solid cancer.
  • the solid cancer is brain tumor, benign astrocytoma, malignant astrocytoma, pituitary adenoma, meningioma, brain lymphoma, oligodendroglioma, ependymoma, brainstem tumor, head and neck tumor, laryngeal cancer, oropharyngeal cancer, nasal cancer, paranasal sinus.
  • Cancer sinonasal cancer, nasopharyngeal cancer, salivary gland cancer, hypopharyngeal cancer, thyroid cancer, oral cancer, thoracic tumor, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, thymic cancer, mediastinal tumor, esophageal cancer, breast cancer, male breast cancer, abdominal tumor, stomach cancer, liver cancer, Gallbladder cancer, biliary tract cancer, pancreatic cancer, small intestine cancer, colon cancer, rectal cancer, anal cancer, bladder cancer, kidney cancer, male genital cancer, penile cancer, prostate cancer, female genital cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, uterine sarcoma, One or more types selected from the group consisting of vaginal cancer, female external genital cancer, female urethral cancer, and skin cancer, but are not necessarily limited thereto.
  • the blood cancer includes acute myeloid leukemia, chronic myeloid leukemia, myelodysplastic syndrome, myeloproliferative tumor, polycythemia vera, essential thrombocythemia, myelofibrosis, monocytic leukemia, erythroleukemia, Megakaryoblastic leukemia, basophilic wallemia, eosinophilic leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma, lymphoma, B-cell lymphoma, marginal lymphoma, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, diffuse large B- Cellular lymphoma, extranodal marginal zone cell lymphoma, extranodal NK/T-cell lymphoma, peripheral T-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, progenitor cell tumor, mantle cell lympho
  • the protein complex induces activation of T cells.
  • the protein complex of the present invention specifically binds to a protein on the surface of cancer cells and at the same time specifically binds to CD137 on T cells, so the protein complex acts as an agonist for T cells and induces activation of T cells.
  • the number of cancer cells can be reduced or the increase in the number of cancer cells can be suppressed, making it useful for the prevention or treatment of cancer. That is, the protein complex of the present invention induces T cell activation dependent on the protein on the surface of cancer cells.
  • the protein complex of the present invention specifically binds to EGFR on the surface of cancer cells and at the same time specifically binds to CD137 of T cells, so the protein complex acts as an agonist for T cells and activates T cells.
  • the protein complex of the present invention induces activation of T cells in an EGFR-dependent manner.
  • the cancer may be EGFR positive.
  • the cancer may be characterized by overexpressing EGFR.
  • the cancers include Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC), lung cancer, colorectal cancer, brain tumor, astrocytoma , esophageal cancer, and uterus. Cervical cancer, or Synovial Sarcoma, but is not necessarily limited thereto.
  • the cancer may be triple-negative breast cancer (TNBC).
  • TNBC is known to overexpress EGFR.
  • TNBC refers to breast cancer with less than 1% expression of Estrogen Receptor (ER), Progesterone Receptor (PR), and Human Epidermal Receptor 2 (Her2neu).
  • ER Estrogen Receptor
  • PR Progesterone Receptor
  • Her2neu Human Epidermal Receptor 2
  • the protein complex of the present invention specifically binds to HER2 on the surface of cancer cells and at the same time specifically binds to CD137 on T cells, so the protein complex acts as an agonist for T cells and activates T cells.
  • the number of cancer cells expressing HER2 can be reduced or the increase in the number of cancer cells expressing HER2 can be suppressed, and it can be usefully used in the prevention or treatment of cancer.
  • the bispecific antibody of the present invention induces T cell activation in a HER2-dependent manner.
  • the cancer may be HER2 positive.
  • the cancer may be characterized by overexpressing HER2.
  • the cancer may be invasive breast cancer or metastatic breast cancer.
  • the cancer may be breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, and stomach cancer, but is not necessarily limited thereto.
  • the protein complex of the present invention specifically binds to CD19 on the surface of cancer cells and at the same time specifically binds to CD137 on T cells, so the protein complex acts as an agonist for T cells and activates T cells.
  • the protein complex of the present invention induces T cell activation in a CD19-dependent manner.
  • the cancer may be CD19 positive.
  • the cancer may be characterized by overexpressing CD19.
  • the cancer may be lymphoma.
  • the lymphoma may be a B cell lymphoma.
  • the cancer may include marginal zone lymphoma, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, chronic lymphocytic leukemia (CLL), acute lymphoblastic leukemia (ALL), myeloid leukemia, or chemotherapy-resistant clastoma. It may be leukemia, but is not necessarily limited thereto.
  • interferon-gamma is increased by activation of the T cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention increases interferon gamma in a cancer cell surface protein-dependent manner.
  • the pharmaceutical composition of the present invention increases interferon gamma in an EGFR protein-dependent manner. That is, when the composition contacts cancer cells that are EGFR positive or overexpress EGFR, it activates T cells and increases the concentration of interferon gamma.
  • the pharmaceutical composition of the present invention increases interferon gamma in a HER2 protein-dependent manner. That is, when the composition contacts cancer cells that are HER2 positive or overexpress HER2, it activates T cells and increases the concentration of interferon gamma.
  • the pharmaceutical composition of the present invention increases interferon gamma in a CD19 protein-dependent manner. That is, when the composition contacts cancer cells that are CD19 positive or overexpress CD19, it activates T cells and increases the concentration of interferon gamma.
  • the pharmaceutical composition of the present invention induces T cell activation dependent on cancer cell surface proteins.
  • the pharmaceutical composition of the present invention induces activation of T cells in an EGFR protein-dependent manner. That is, when the composition comes into contact with cancer cells that are EGFR positive or overexpress EGFR, it induces activation of T cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention induces activation of T cells in a HER2 protein-dependent manner. That is, when the composition comes into contact with cancer cells that are HER2 positive or overexpress HER2, it induces activation of T cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention induces T cell activation in a protein-dependent manner on CD19. That is, when the composition contacts cancer cells that are CD19 positive or overexpress CD19, it induces activation of T cells.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are those commonly used in preparation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, Includes, but is limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. It doesn't work.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • lubricants wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, etc.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, for example, by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intrasternal injection, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration. You can.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity. Usually, a skilled physician can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment or prevention. According to a preferred embodiment of the present invention, the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg/kg. As used herein, the term “pharmaceutically effective amount” refers to an amount sufficient to prevent or treat the above-mentioned disease.
  • the term “prophylaxis” refers to the prevention or protective treatment of a disease or disease state.
  • treatment means reducing, suppressing, alleviating, or eradicating a disease state.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by a person skilled in the art. Alternatively, it can be manufactured by placing it in a multi-capacity container. At this time, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, suppository, powder, granule, tablet, or capsule, and may additionally contain a dispersant or stabilizer.
  • the present invention provides an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137.
  • the present invention provides an affibody that specifically binds to the extracellular domain of CD137; and an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to a protein on the surface of cancer cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the above-described affibody, or protein complex, and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a protein complex that binds specifically to T cells and at the same time specifically binds to antigens on the surface of various types of cancer cells can be developed to treat blood cancer and solid cancer. It can be useful for prevention or treatment.
  • Figure 1 shows the results of confirming the affibody binding to the CD137 protein in the form of a periplasmic extract.
  • Figure 2 shows the results of confirming the affibody binding to CD137 expressed on the cell using activated CEMT cells, which are CD137 positive cells, in the form of an antibody-affibody that binds to CD137.
  • Figures 3a to 3d show the results of producing a double antibody composed of a CD137 affibody based on two types of EGFR binding antibodies (CET or 15E3), and then confirming whether the double antibody binds to the CD137 protein and the EGFR protein.
  • Figure 3a is a diagram confirming that a double antibody composed of a CD137 affibody based on the Cetuximab (CET) antibody binds to the EGFR protein.
  • CCT Cetuximab
  • Figure 3b is a diagram confirming that a double antibody composed of a CD137 affibody based on the cetuximab (CET) antibody binds to the CD137 protein.
  • CCT cetuximab
  • Figure 3c is a diagram confirming that a double antibody composed of a CD137 affibody based on the 15E3 antibody binds to the EGFR protein.
  • Figure 3d is a diagram confirming that a double antibody composed of a CD137 affibody based on the 15E3 antibody binds to the CD137 protein.
  • Figure 4a is a diagram confirming that a double antibody composed of a CD137 affibody based on a cetuximab (CET) antibody binds to activated CEMT cells expressing CD137.
  • CCT cetuximab
  • Figure 4b is a diagram confirming that a double antibody composed of a CD137 affibody based on the 15E3 antibody binds to activated CEMT cells expressing CD137.
  • Figure 5a is a diagram confirming that a double antibody composed of a CD137 affibody based on a cetuximab (CET) antibody binds to HT29 cells expressing EGFR.
  • CCT cetuximab
  • Figure 5b is a diagram confirming that a double antibody composed of a CD137 affibody based on the 15E3 antibody binds to HT29 cells expressing EGFR.
  • Figure 6 is a diagram confirming EGFR dependent T cell activation through analysis of the amount of IFN-gamma secretion for selection of CD137 affibodies.
  • Figure 7 is a diagram confirming which extracellular domain (ECD) of CD137 the two selected CD137 affibodies bind to.
  • ECD extracellular domain
  • Figure 7a shows hCD137-ECD, hCD137-ECD- ⁇ D1, hCD137-ECD- ⁇ D12, hCD137-ECD- ⁇ D123p, hCD137-ECD- ⁇ D123, hCD137- consisting of a combination of signal peptides and different ECD domains 1 to 5.
  • a schematic diagram of ECD- ⁇ D3 and hCD137-ECD- ⁇ D5 is shown.
  • the amino acid sequence for human CD137 ECD consisting of domains 1 to 5 is shown in SEQ ID NO: 27.
  • Figure 7b is a diagram confirming that urelumab binds to domain 1 of CD137 ECD.
  • Figure 7c is a diagram confirming that utomilumab binds to domain 3 of CD137 ECD.
  • Figure 7d is a diagram confirming that cetuximab (Negative Ab) does not bind to any domain of CD137 ECD.
  • Figure 7e is a diagram confirming that affibody ZAAD01 binds to domain 3 of CD137 ECD.
  • Figure 7f is a diagram confirming that affibody ZAAD05 binds to domain 3 of CD137 ECD.
  • Figure 8 is a diagram confirming the cross reactivity between the two selected CD137 affibodies and other proteins belonging to the TNFR superfamily, CD27, CD30, CD134, CD270, CD357, and TNF- ⁇ .
  • Figure 8a is a diagram confirming that affibody ZAAD01 specifically binds only to CD137.
  • Figure 8b is a diagram confirming that affibody ZAA0D5 specifically binds only to CD137.
  • Figure 9 is a diagram confirming the interspecies cross-reactivity between the CD137 proteins of two selected CD137 affibodies and humans, mice, and cynomolgus monkeys.
  • Figure 9a is a diagram confirming that affibody ZAAD01 binds to the CD137 protein of humans and crab-eating monkeys.
  • Figure 9b is a diagram confirming that affibody ZAAD05 binds to the CD137 protein of humans and cynomolgus monkeys.
  • Figure 10 is a diagram confirming that four types of double antibodies in the form of antibody-affibody simultaneously bind to two targets, the CD137 antigen and the EGFR antigen, using the BLI (BioLayer Interferometry) method.
  • Figure 10a shows the BLI results of the CET-ZAAD01 double antibody
  • Figure 10b shows the CET-ZAAD05 double antibody
  • Figure 10c shows the 15E3-ZAAD01 double antibody
  • Figure 10d shows the BLI results of the 15E3-ZAAD05 double antibody.
  • Figure 11 is a diagram confirming the expression level of each cell of EGFR-expressing cells by flow cytometry, and confirming that the degree of T cell activation of the double antibody according to the level of EGFR expression is correlated with the level of EGFR expression.
  • Figure 11a is a diagram confirming EGFR expression in A431 cells, HT29 cells, and SW403 cells, which are EGFR positive cells, and MOLT4 cells, which are EGFR negative cells.
  • Figure 11b is a diagram confirming EGFR-dependent T cell activation of the 15E3-ZAAD01 double antibody according to the level of EGFR expression through analysis of the amount of IFN-gamma secretion.
  • Figure 12 is a diagram confirming that a double antibody produced using a CD137 affibody and a HER2 antibody or CD19 antibody binds to CD137 and HER2 or CD19, respectively.
  • Figure 12a is a diagram confirming that trastuzumab-ZAAD01 double antibody (anti-HER2 Ab1_ZAAD01) and hz1E11.10-ZAAD01 double antibody (anti-HER2 Ab2_ZAAD01) bind to CD137.
  • Figure 12b is a diagram confirming that the trastuzumab-ZAAD01 bispecific antibody and the hz1E11.10-ZAAD01 bispecific antibody bind to HER2.
  • Figure 12c is a diagram confirming that the FMC63-ZAAD01 double antibody (anti-CD19 Ab_ZAAD01) binds to CD137.
  • Figure 12d is a diagram confirming that the FMC63-ZAAD01 double antibody binds to CD19.
  • Figure 13 is a diagram confirming HER2- or CD19-dependent T cell activation by a double antibody produced using a CD137 affibody and a HER2 antibody or CD19 antibody through analysis of the amount of IFN-gamma secretion.
  • Figure 13a is a diagram confirming that trastuzumab-ZAAD01 bispecific antibody and hz1E11.10-ZAAD01 bispecific antibody activate T cells in a HER2-dependent manner compared to utomilumab through analysis of the amount of IFN-gamma secretion.
  • Figure 13b is a diagram confirming that the FMC63-ZAAD01 double antibody, compared to utomilumab, activates T cells in an EGFR-dependent manner through analysis of the amount of IFN-gamma secretion.
  • FIG 14a shows that DLD1-luc cells die due to immune cell activation by double antibodies (CET_ZAAD01 and CET_ZAAD05).
  • Figure 14b shows that the secretion of IFN-gamma is increased due to the activation of immune cells by double antibodies (CET_ZAAD01 and CET_ZAAD05).
  • Figure 15 shows the extension of survival period due to the anticancer effect of bispecific antibodies (CET_ZAAD01 and CET_ZAAD05) in the humanized CD137 model.
  • Figure 16a is a diagram showing the tumor size of the vehicle treatment group in the humanized CD137 model.
  • Figure 16b is a diagram showing the tumor size of the Cetuximab treatment group in the humanized CD137 model.
  • Figure 16c is a diagram showing the tumor size of the double antibody (CET_ZAAD01) treatment group in the humanized CD137 model.
  • Figure 16d is a diagram showing the tumor size of the double antibody (CET_ZAAD05) treatment group in the humanized CD137 model.
  • % used to indicate the concentration of a specific substance means (weight/weight) % for solid/solid, (weight/volume) % for solid/liquid, and Liquid/liquid is (volume/volume) %.
  • clones that specifically bind to CD137 were selected through panning in an affibody (Zb) library.
  • the selected clones were produced using animal cells in the form of a double antibody in the form of AffiMab (AffiMab, a double antibody composed of affibodies based on monoclonal antibodies), and clones that bind to CD137-expressing cells were selected.
  • the affibody library was rescued into phage form using VSCM13 helper phage and used for panning.
  • the number of library phages that initially bound to the antigen was more than 10 13 , and panning was performed four times. As the number of panning cycles increases, the amount of antigen (10 ⁇ g, 5 ⁇ g, 2 ⁇ g, and 1 ⁇ g) is gradually reduced, and the number of washes (3 times, 5 times, 7 times, and 10 times) is gradually increased.
  • a strategy was used to selectively select phages with high affinity.
  • the binder phage obtained from each round of panning was infected with E. coli ER2537 (New England Biolabs ® Inc.), and the resulting colonies were confirmed for binding to the antigen using ELISA.
  • Colonies obtained by infecting binder phage were inoculated into SB medium (MOPS 10 g/L, Bacto YEAST extract 20 g/L, and Trypton 30 g/L), and then when the OD 600 (optical density at 600 nm) value reached 0.8. After incubation, 1mM IPTG (Isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside, LPS Solution, Inc.) was added and shaking incubation was performed at 30°C to overexpress affibody (Zb). Periplasmic extraction (PE) of affibodies was performed using BBS buffer (200mM Boric acid, 150mM NaCl, and 1mM EDTA). Using this, the binder was screened using ELISA method.
  • SB medium MOPS 10 g/L, Bacto YEAST extract 20 g/L, and Trypton 30 g/L
  • OD 600 optical density at 600 nm
  • 1mM IPTG Isopropy
  • affibody periplasm extract was treated on a plate coated with hCD137-ECD-Fc (human CD137-extracellular domain-fragment crystallizable region) protein at a concentration of 2 ⁇ g/mL, and secondary antibody (anti- After treatment with HA-HRP, Roche, 12013819001, human influenza hemagglutinin (HA) protein), a color reaction is generated with TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, BioFX TM , TMBC-1000-01), and ELISA is performed.
  • the OD 450 value was measured using a reader (Victor X3, PerkinElmer, Inc.), and the results are shown in Figure 1.
  • plates coated with mouse CD137 ECD Fc protein mouse CD137
  • Negative protein is an extract of E. coli ER2537 without affibody plasmid.
  • the OD 450 value was barely measured in negative PE, and the OD 450 value was hardly measured in the mouse CD137 protein, so none of the 10 affibodies bound to it, while the high OD 450 value showed that human It was confirmed that all 10 affibodies bound to the CD137 protein.
  • CEMT cells (ATCC ® , CCL-119 TM , T lymphoblast, acute lymphoblastic leukemia) and add 50 ng of PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma-Aldrich ® , P1585). /mL and ionomycin (Sigma-Aldrich ® , I9657) at a concentration of 1 ⁇ g/mL, and then activated by incubation for 16 hours.
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate
  • ionomycin Sigma-Aldrich ® , I9657
  • PMA and ionomycin are known to activate T cells.
  • PMA activates protein kinase C
  • ionomycin is a calcium ionophore, and both compounds pass through the T cell membrane receptor complex, leading to the activation of several intracellular signaling pathways and activating T cells. By doing so, it causes the production of various cytokines (Ai, W., et al . (2013). Int J Environ Res Public Health. 2013; 10 (9):3834-3842. reference).
  • Ionomycin, together with PMA is known to stimulate intracellular production of cytokines, interferon, perolin, IL-2, and IL-4.
  • unstimulated naive T cells do not express CD137, whereas stimulated activated T cells transiently express CD137 at high levels.
  • Activated CEMT cells were prepared at 5 ⁇ 10 5 /tube, then centrifuged at 1,200 rpm for 3 minutes to collect the cells, washed with 5% FBS in PBS, and 5 ⁇ g/tube of the 10 types of Zb-Fc. mL treatment and incubated on ice for 1 hour. Cells were washed three times using 200 ⁇ L of 5% FBS in PBS and centrifuged at 1,200 rpm for 3 minutes. For control, inactivated CEMT cells were also prepared.
  • the cells were treated with 1 ⁇ g/mL of anti-human-Fc-FITC (Life Technologies ® , A11013) and incubated on ice for 45 minutes while blocking light.
  • the cells were washed three times using 200 ⁇ L of 5% FBS in PBS and centrifuged at 1,200 rpm for 3 minutes, and then sorted using a FACS (Fluorescence-activated cell sorting) device from Beckman Co ⁇ Lter, Inc. The intensity of fluorescence was measured, and the results are shown in Figure 2. As the peak moves to the right in the FACS result graph, it indicates stronger binding to cells.
  • FITC only is when only a buffer exists during Zb-Fc binding, and Negative Ab is when hIgG (human IgG) is used.
  • the above eight types of affibodies only showed a peak for FITC in non-activated CEMT cells, whereas in activated CEMT cells, they showed a peak that shifted to the right compared to the peak for FITC. This confirmed that the eight types of affibodies did not bind to unactivated CEMT cells, but did bind to activated CEMT cells.
  • affibodies ZAAD06 and ZAAD08 do not specifically bind to cells expressing CD137, i.e., activated CEMT cells, as there is no difference in peaks between hIgG-added control (negative Ab) and unactivated or activated CEMT cells. No, ZAAD06 and ZAAD08 were not selected.
  • Cetuximab which specifically binds to EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), and the self-developed 15E3 antibody (Korean Patent Publication No. 10-2017-0012754, reference)
  • eight types of CD137 affibodies selected in Example 1-2 were cloned into double antibody form, and a total of 16 types of double antibodies were produced using animal cells.
  • cetuximab CET
  • CET-ZAAD01, CET-ZAAD02, CET-ZAAD03, CET-ZAAD04, CET-ZAAD05, CET-ZAAD07, CET-ZAAD09 respectively.
  • CD137 affibodies that bind to both EGFR and CD137 proteins were selected through protein binding, expression cell binding, and T cell activation tests.
  • Figures 3a and 3b show the binding test results of a bispecific antibody composed of a CD137 affibody based on a cetuximab (CET) antibody (hereinafter referred to as CET-based CD137 affibody bispecific antibody, Cetuximab-Zb, or CET_ZAAD01 to CET_ZAAD10)
  • 3C and 3D are the binding test results of a diabody consisting of a CD137 affibody based on the 15E3 antibody (hereinafter referred to as 15E3-based CD137 affibody diabody, 15E3-Zb, or 15E3_ZAAD01 to 15E3_ZAAD10)
  • 3a and 3c are the results confirming the binding to the EGFR protein
  • Figures 3b and 3d are the results confirming the binding to the CD137 protein.
  • CEMT cells 1 ⁇ 10 7 /10 mL were prepared and treated with 50 ng/mL of PMA and 1 ⁇ g/mL of ionomycin. Afterwards, it was activated by incubation for 16 hours. Activated CEMT cells were prepared in 5 ⁇ 10 5 /tube, then collected by centrifugation at 1,200 rpm for 3 minutes, washed with 5% FBS in PBS, treated with 5 ⁇ g/mL double antibody, and stored on ice. Incubated for 1 hour. Cells were washed three times using 200 ⁇ L of 5% FBS in PBS and centrifuged at 1,200 rpm for 3 minutes.
  • Figure 4a is the FACS result of the CET-based CD137 affibody diabody, showing a peak that shifted to the right, like the peak of the positive control (Positive Ab), so all eight types of CET-based CD137 affibody diabodies were CD137. It was confirmed that it bound to activated CEMT expressing cells.
  • Figure 4b is the FACS result of the 15E3-based CD137 affibody diabody, showing a peak that shifted to the right, like the peak of the positive control, so all eight types of 15E3-based CD137 affibody diabodies were activated expressing CD137. It was confirmed that it bound to CEMT cells.
  • HT29 cells Kerean Cell Line Bank, KCLB, 30038, human colon cancer cell line
  • KCLB Human Cell Line Bank
  • Figure 5a is the FACS result of the CET-based CD137 affibody diabody, showing a peak that shifted to the right like the peak of the positive control (CET-IgG), so all eight types of CET-based CD137 affibody diabodies target EGFR. It was confirmed that it binds to expressing HT29 cells.
  • Figure 5b is the FACS result of the 15E3-based CD137 affibody bispecific antibody, showing a peak that shifted to the right like the peak of the positive control (15E3-IgG), so all eight types of 15E3-based CD137 affibody bispecific antibodies were EGFR It was confirmed that it binds to HT29 cells expressing.
  • Affibody selection was performed on a total of 16 types of bispecific antibodies produced through the EGFR dependent T cell activation test.
  • the R10 medium on the plate was completely removed, and 50 ⁇ L of 16 types of double antibodies (8 types of Cetuximab-Zb and 8 types of 15E3-Zb) at a concentration of 0.1 nM or 1 nM were treated for 30 minutes.
  • the blood provided from two donors was diluted by 1/2 with PBS and placed in a Leucosep tube (Greiner Bio-One Co., Ltd.) loaded with Ficoll ® (GE healthcare, 17-1440-12). Company, 227290) and then centrifuged at 1,000 g for 30 minutes. Only the layer of PBMC (peripheral blood mononuclear cell) located on top of Ficoll is picked. After repeating the washing operation using 2% PBMC in PBS and centrifugation at 300 g for 10 minutes, the number of PBMC was measured.
  • CD8 + T cells were prepared from PBMC following the protocol of the CD8 + T cell isolation kit (Miltenyi Biotec Inc., 130-096-495).
  • the number of CD8 + T cells was measured and released into R10 medium to reach 1.4 ⁇ 10 6 /mL, and then 50 ⁇ L each was applied to the plate treated with the 16 types of double antibodies. After 3 days of treatment, the plate was centrifuged at 2,000 rpm for 10 minutes to collect the supernatant, which was used to detect interferon-gamma (Interferon-gamma) following the protocol of the human interferon-gamma ELISA kit (IFN-gamma ELISA set, BD Biosciences, 555142). gamma, IFN-gamma, and IFN- ⁇ ) were measured, and the results are shown in Figure 6.
  • Interferon-gamma interferon-gamma
  • Cetuximab-Zb or 15E3-Zb binds to the hEGFR-ECD-Fc coated on the plate, and CD8 + T cells expressing CD3 are activated by the anti-CD3 antibody coated on the plate.
  • CD137 on the surface of CD8 + T cells bound to anti-CD3 antibody
  • CD8 + T cells are activated, and activated CD8 + It becomes possible to measure IFN- ⁇ secreted by T cells. It is known that T cells are activated through the agonism of CD137.
  • Affibodies ZAAD01 and ZAAD05 according to the present invention activated CD137 by binding to the CD137 ECD on the surface of CD8 + T cells and caused the CD8 + T cells to secrete IFN- ⁇ .
  • the present inventors confirmed that the double antibodies Cetuximab-ZAAD01, 15E3-ZAAD01, Cetuximab-ZAAD01, and 15E3-ZAAD01 activate T cells in an EGFR-dependent manner, and finally selected affibodies ZAAD01 and ZAAD05.
  • the 15E3-based ZAAD01 and ZAAD05 affibody bispecific antibodies are hereinafter referred to as 15E3ZAAD01 and 15E3ZAAD05, respectively.
  • the binding domains of Urelumab (BMS-663513) and Utomilumab (PF-05082566), monoclonal antibodies against CD137 were also investigated.
  • the cloned domain mutations include a signal peptide and ECD domains 1 to 5 in different combinations, specifically as follows: containing both the signal peptide and domains 1 to 5 hCD137-ECD; hCD137-ECD- ⁇ D1 with domain 1 deleted; hCD137-ECD- ⁇ D12 with domains 1 and 2 deleted; hCD137-ECD- ⁇ D123p with deletion of all of domains 1 and 2 and part of domain 3 (up to the 104th amino acid); hCD137-ECD- ⁇ D123 with domains 1 to 3 deleted; and hCD137-ECD- ⁇ D3 and hCD137-ECD- ⁇ D5 with domain 5 deleted.
  • Figure 7a shows a schematic diagram of hCD137ECD including a signal peptide and domains 1 to 5, and SEQ ID NO: 27 shows the amino acid sequences for domains 1 to 5, excluding the amino acid sequence for the signal peptide.
  • urelumab did not bind to hCD137ECD ⁇ D1, hCD137ECD ⁇ D12, hCD137ECD ⁇ D123P, and hCD137ECD ⁇ D123 among the domain mutations, confirming that urelumab binds to domain 1 of CD137 ECD.
  • utomilumab did not bind to hCD137ECD ⁇ D123P, hCD137ECD ⁇ D123, and hCD137ECD ⁇ D3 among the domain mutations, confirming that utomilumab bound to domain 3 of CD137 ECD.
  • Negative Ab did not bind to both the entire human CD137 ECD and its domain mutations, confirming that it did not bind to CD137 ECD.
  • 15E3ZAAD01 did not bind to hCD137ECD ⁇ D123P, hCD137ECD ⁇ D123, and hCD137ECD ⁇ D3 among the domain mutations, confirming that 15E3ZAAD01 binds to domain 3 of CD137 ECD.
  • 15E3ZAAD05 did not bind to hCD137ECD ⁇ D123P, hCD137ECD ⁇ D123, and hCD137ECD ⁇ D3 among the domain mutations, confirming that 15E3ZAAD05 binds to domain 3 of CD137 ECD.
  • the present inventors confirmed that the two selected affibodies, ZAAD01 and ZAAD05, bind to domain 3 of CD137 ECD.
  • TNFRSF TNF-alpha receptor super family
  • ZAAD01 specifically bound only to CD137
  • ZAAD05 also bound specifically to CD137.
  • the present inventors confirmed that the two selected affibodies, ZAAD01 and ZAAD05, did not cross-react with other proteins belonging to the TNFRSF (TNF-alpha receptor super family).
  • affibody ZAAD01 bound to the CD137 protein of humans and cynomolgus monkeys
  • affibody ZAAD05 also bound to the CD137 protein of humans and cynomolgus monkeys.
  • CET-ZAAD01 CET-ZAAD05
  • 15E3-ZAAD01 15E3-ZAAD05
  • 15E3-ZAAD05 consisting of cetuximab and 15E3
  • cetuximab which are antibodies that bind to EGFR
  • ZAAD01 and ZAAD05 which are affibodies that bind to CD137
  • the EGFR-ECD-Fc protein was immobilized on the AR2G sensor chip (Amine Reactive Second-Generation Biosensor, SATORIUS Co., Ltd., 18-5092) at a concentration of 5 ⁇ g/mL using the amine coupling method using EDC/NHS.
  • the above four types of double antibodies were bound to the sensor chip on which EGFR-ECD-Fc was immobilized at a concentration of 10 ⁇ g/mL each for 5 minutes and stabilized for 5 minutes.
  • CD137-ECD-his protein was added at a concentration of 30 ⁇ g/mL to the sensor chip where the double antibody was bound to the immobilized EGFR protein, allowed to bind for 5 minutes, and stabilized for 5 minutes.
  • the results are shown in Figures 10A to 10D. As a control, when treated with CET or 15E3, the results are shown as a red line, and when treated with the four types of double antibodies of the present invention, the results are shown as a blue line.
  • the CET-ZAAD05 double antibody ( Figure 10b), 15E3-ZAAD01 double antibody ( Figure 10c), and 15E3-ZAAD05 double antibody ( Figure 10d) also showed CD137-ECD-his protein on the sensor chip. When added, the binding signal increased, confirming that the double antibody also simultaneously bound to the EGFR protein and CD137 protein.
  • A431 ATCC, CRL-1555, epidermis, epidermoid carcinoma
  • HT29 KCLB, 30038, colon, adenocarcinoma
  • SW403 KCLB, 10230, colon, adenocarcinoma
  • MOLT4 KCLB, 21582, adult T acute lymphoblastic leukemia
  • cells were collected by centrifugation at 1,200 rpm for 3 minutes, washed with 5% FBS in PBS, and treated with 5 ⁇ g/mL of 15E3ZAAD01 double antibody. Incubate on ice for 1 hour. Cells were washed three times using 200 ⁇ L of 5% FBS in PBS and centrifuged at 1,200 rpm for 3 minutes. Next, the cells were treated with anti-human Fc FITC at 1 ⁇ g/mL and incubated on ice for 45 minutes while blocking light.
  • EGFR expression was confirmed in EGFR-positive cells, A431 cells, HT29 cells, and SW403 cells, and EGFR-negative cells, MOLT4 cells.
  • the cell lines A431, H29, SW403, and MOLT4 were 101.5, 23.9, 17.1, and 0.9 in that order.
  • MFI values for each it was confirmed that the expression of EGFR was high in the above order.
  • T cell assay was performed using cells with different expression levels of EGFR, as seen above.
  • a day before 50 ⁇ L of anti-CD3 antibody (Invitrogen TM , 16-0037-85) at a concentration of 3 ⁇ g/mL was coated on each 96-well round plate.
  • washing was performed three times using 100 ⁇ L of sterilized PBS. Washing was performed three times using 100 ⁇ L of R10 medium, and blocked for 1 hour at 37°C by treating with 100 ⁇ L of R10 medium.
  • 50 ⁇ L of four types of cell lines, A431, H29, SW403, and MOLT4, were added to each plate to make 2.4 ⁇ 10 5 /mL.
  • 50 ⁇ L of 15E3ZAAD01 double antibody at a concentration of 5 ⁇ g/mL was treated for 30 minutes.
  • the blood provided from two donors was diluted by 1/2 with PBS and placed in a Leucosep tube (Greiner Bio-One Co., Ltd.) loaded with Ficoll ® (GE healthcare, 17-1440-12). Company, 227290) and centrifuged at 1,000 g for 30 minutes.
  • a Leucosep tube (Greiner Bio-One Co., Ltd.) loaded with Ficoll ® (GE healthcare, 17-1440-12). Company, 227290) and centrifuged at 1,000 g for 30 minutes.
  • CD8 + T cells were prepared from PBMC according to the protocol of the CD8 + T cell isolation kit (Miltenyi Biotec Inc., 130-096-495).
  • the plate After measuring the number of CD8 + T cells and dissolving them into R10 medium to reach 1.4 ⁇ 10 6 /mL, the plate was treated with 15E3ZAAD01 double antibody in an amount of 50 ⁇ L. After 3 days of treatment, the plate was centrifuged at 2,000 rpm for 10 minutes to collect the supernatant, which was used to measure the concentration of IFN- ⁇ following the protocol of the IFN- ⁇ measurement kit (BD Biosciences, 555142). Whether the double antibody of the present invention activates T cells according to the level of EGFR expression was confirmed through the amount of IFN- ⁇ secreted by T cells, and the results are shown in Figure 11b.
  • the order in which the amount of IFN- ⁇ secretion was high was consistent with the order in which the amount of EGFR expression was high as seen above.
  • the fold values of the IFN- ⁇ concentration for cell lines A431, H29, SW403, and MOLT4 in that order were 5.9, 2.2, 1.9, and 1.0, respectively, confirming that the concentration of IFN- ⁇ was high in that order.
  • the present inventors confirmed the EGFR-dependent T cell activation of the 15E3-ZAAD01 bispecific antibody according to the level of EGFR expression, which indicates that the level of T cell activation of the bispecific antibody according to the level of EGFR expression is correlated with the level of EGFR expression. .
  • T cells expressing CD137 are located close to cancer cells and tissues showing excessive EGFR expression, bind to them, and can be activated, so EGFR overexpressing It can be useful in preventing or treating various types of cancer.
  • Example 5 Possibility of development of various antigen-targeting bispecific antibodies based on CD137 affibody - HER2 and CD19
  • T cells can be activated using an antibody-based CD137 affibody bispecific antibody against EGFR as a cancer-specific target protein as well as other cancer or tumor-specific target proteins. I wanted to do it.
  • anti-HER2 Ab1 is trastuzumab that specifically binds to human HER2, and in anti-HER2 Ab2-ZAAD01, anti-HER2 Ab2 binds specifically to human HER2. It is a self-developed hz1E11.10 antibody that binds (Korean Patent Publication No. 10-2017-0117330, reference).
  • the anti-HER2 Ab includes a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28; And it may be an antibody or antigen-binding fragment thereof containing a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29.
  • the anti-CD19 Ab is FMC63, which specifically binds to human CD19.
  • the anti-CD19 Ab includes a heavy chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38; And it may be an antibody or antigen-binding fragment thereof containing a light chain variable region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 39.
  • the above-described double antibody was produced using animal cells. Through protein binding and T cell activation tests in the form of purified double antibodies, we examined the possibility that the CD137 affibody of the present invention could be developed and practically used as a double antibody targeting various other antigens in a modular format. .
  • ELISA is performed by applying the above-mentioned double antibodies purified from 60 nM to 1/5 on a plate coated with hHer2-ECD-Fc protein and hCD19-ECD-Fc protein according to the CD137 protein and the target protein of each antibody at a concentration of 2 ⁇ g/mL. It was diluted to 7 points and treated with secondary antibody (anti-hIgG-Fab-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097) followed by TMB (BioFX TM , TMBC-1000-01). A color reaction was generated and the OD 450 value was measured using an ELISA reader (Victor X3, PerkinElmer, Inc.), and the results are shown in Figures 12a to 12d.
  • double antibodies produced using CD137 affibody and HER2 antibody or CD19 antibody bound to CD137 and HER2 or CD19, respectively.
  • both anti-HER2 Ab1-ZAAD01 and anti-HER2 Ab2-ZAAD01 double antibodies, composed of anti-HER2-antibody and ZAAD01 affibody, target proteins CD137 ( Figure 12a) and HER2 ( Figure 12b). ), respectively, increased in a concentration-dependent manner.
  • the binding of the anti-CD19 Ab-ZAAD01 double antibody, composed of anti-CD19-antibody and ZAAD01 affibody, to the target proteins CD137 (FIG. 12c) and CD19 (FIG. 12d) increased in a concentration-dependent manner, respectively.
  • the efficacy of the bispecific antibody was confirmed by performing a T cell activation test dependent on other expanded proteins, such as HER2 or CD19, using the produced bispecific antibody that was confirmed to bind to each target protein. .
  • the blood provided by two donors was diluted by 1/2 with PBS and placed in a Leucosep tube (Greiner Bio-One Co., Ltd.) loaded with Ficoll ® (GE healthcare, 17-1440-12). Company, 227290) and then centrifuged at 1,000 g for 30 minutes. Only the PBMC floor located above Picol was selected. After repeating the washing operation using 2% PBMC in PBS and centrifugation at 300 g for 10 minutes, the number of PBMC was measured.
  • CD8 + T cells were prepared from PBMC according to the protocol of the CD8 + T cell isolation kit (Miltenyi Biotec Inc., 130-096-495). The number of CD8 + T cells was measured and dissolved in R10 medium to reach 1.4 ⁇ 10 6 /mL, and then the plate treated with the double antibody was treated in an amount of 50 ⁇ L. Three days after treatment, the plate was centrifuged at 2,000 rpm for 10 minutes to collect the supernatant, which was used to measure the concentration of IFN- ⁇ following the protocol of the IFN- ⁇ measurement kit (BD Biosciences, 555142), and the results were is shown in Figures 13a and 13b. As a negative control, utomilumab, a monoclonal antibody against CD137, was used.
  • double antibodies (anti-HER2 Ab1-ZADD1, anti-HER2 Ab1-ZADD1, and anti-CD19 Ab-ZADD1) produced using CD137 affibody and HER2 antibody or CD19 antibody are HER2 or It was confirmed that T cells were activated in a dependent manner on the CD19 protein through an increase in the amount of IFN- ⁇ secretion.
  • the present inventors confirmed that the bispecific antibody consisting of an anti-HER2 antibody or an anti-CD19 antibody and a ZAAD01 affibody activated T cells in a dependent manner on each target antibody, HER2 or CD19. .
  • CD137 affibody of the present invention or a double antibody composed of a CD137 affibody and an antibody against a cancer cell-specific target protein, through various antigen-presenting cells (APC) expressing CD137,
  • APC antigen-presenting cells
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • NK natural killer cells
  • DC dendritic cells
  • the present inventors performed the following test to confirm the T cell activation and cell death effects of a dual antibody targeting EGFR and CD137 simultaneously.
  • the double antibodies (CET_ZAAD01 and CET-ZAAD05) used in this example are fusion proteins of Cetuximab targeting EGFR and affibody ZAAD01 or ZAAD05 targeting CD137 of the present invention.
  • Anti-CD3 antibody (Invitrogen, 16-0037-85) was coated in a 96-well round plate by dispensing 50 uL per well at a concentration of 5 ug/mL one day before double antibody treatment. The next day, 100 uL of R10 media was treated, and blocking was performed by incubation at 37°C for 1 hour. Add 50 uL of DLD-1-Luc cells to each plate at 1.0 Each was processed. Meanwhile, the blood provided by the donor was diluted 1/2 with PBS, placed in a Leucosep tube (greiner bio-one, 227290) loaded with Picoll (GE healthcare, 17-1440-12), and centrifuged at 1000 xg for 30 minutes. Separation was carried out.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • lysis buffer 75 mM Tris (pH8.0) 30% glycerol, 3% tritonX-100
  • 5'-fluoroluciferin Bio-GloTM Luciferase Assay System, promea / G7940
  • Example 7 Confirmation of anticancer efficacy of EGFR-CD137 target bispecific antibody using animal model
  • EGFR/MC38 cells were prepared in PBS to reach 5.0 When the size of the cancer reached approximately 100 mm 3 , the animals were randomly grouped into groups of 5 as designed. Cetuximab or EGFR-CD137 target bispecific antibodies (CET_ZAAD01 and CET-ZAAD05) were diluted with PBS to a concentration of 5 mpk and then administered by intraperitoneal injection twice a week for a total of 5 times. The size and weight of the cancer were measured three times a week, and the size of the cancer was measured using a digital vernier caliper. When the size of the cancer exceeded 2500 mm 3 , euthanasia was performed.
  • the two types of bispecific antibodies of the present invention (CET_ZAAD01 and CET-ZAAD05) showed the effect of prolonging the survival of mice.

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Abstract

본 발명은 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디, 상술한 어피바디 및 암 세포 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체, 및 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 이용하면, T 세포에 특이적으로 결합하는 동시에 다양한 종류의 암 세포 표면 상의 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 복합체를 개발하여, 혈액암 및 고형암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 이의 용도
본 발명은 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디, CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 EGFR, HER2 또는 CD19에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 단백질 복합체, 및 이들을 이용한 암의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
최근, 다음과 같은 면역항암제가 유망한 암 치료 방법으로 관심을 받고 있다: CTLA-4를 표적으로 하는 이필리무맙(ipilimumab), PD-1을 표적으로 하는 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 또는 니볼루맙(nivolumab), 및 PD-L1을 표적으로 하는 아테졸리맙(atezolizumab)과 같은 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor); 키메라 항원 수용체 T 세포(chimeric antigen receptor-T, CAR-T)와 같은 면역세포치료제; 암 세포의 항원에 결합하는 항체, 및 항체와 약물을 결합한 항체약물접합체(antibody drug conjugate, ADC)와 같은 치료용 항체; T 세포의 CD3 및 B 세포 림프종의 CD19 항원을 이중특이적으로 표적으로 하는 블리나투모맙(Blinatumomab) 및 T 세포의 CD3 항원 및 암 세포의 상피세포접착분자(epithelial cell adhesion molecule)를 이중특이적으로 표적으로 하는 카투막소맙(Catumaxomab)과 같은 T-세포 관여 이중특이적 항체(T-cell engaging bispecifc antibodies); 및 암세포 특이적 항원을 투여하거나 또는 체내 면역 반응 향상을 위한 항원을 투여하는 항암 백신.
이 중에서, 블리나투모맙 및 카투막소맙과 같은 T-세포 관여 이중특이적 항체는 현재까지 가장 진보된 차세대 면역항암 접근 방법이지만, 블리나투모맙은 혈액암에만 사용되고 있고 안전성 문제도 있으며, 카투막소맙은 악성 복수 치료에만 적용되므로, 다양한 종류의 암 치료에 사용하기에는 제한적이다(Lakins MA, et al. Clin Cancer Res. 2020 Aug 1;26(15):4154-4167.).
따라서, 혈액암뿐만 아니라 고형암(solid tumor)에도 적용할 수 있는 T-세포 관여 이중특이적 항체를 개발한다면, 다양한 종류의 암 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
[선행문헌]
국내 공개특허 제10-2017-0012754호 (공개일자 2017년 02월 03일)
국내 공개특허 제10-2017-0117330호 (공개일자 2017년 10월 23일)
본 발명자들은 혈액암 및 고형암에 모두 적용할 수 있는 T-세포 관여 이중특이적 항체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 활성화된 T 세포의 표면 상에서 발현이 증가하는 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)인 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 개발하고, 이를 이용하여 활성화된 T 세포의 CD137에 결합할 뿐만 아니라 EGFR, HER2 또는 CD19와 같은 암 세포 표면 상의 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 복합체를 개발함으로써, 혈액암 및 고형암 모두에 적용할 수 있는 T-세포 관여 이중특이적 항체를 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디(affibody)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 어피바디 및 암 세포 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 어피바디 또는 단백질 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디(affibody)를 제공한다.
본 발명자들은 혈액암 및 고형암에 모두 적용할 수 있는 T-세포 관여 이중특이적 항체를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 활성화된 T 세포의 표면 상에서 발현이 증가하는 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)인 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 개발하고, 이를 이용하여 활성화된 T 세포의 CD137에 결합할 뿐만 아니라 EGFR, HER2 또는 CD19와 같은 암 세포 표면 상의 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 복합체를 개발하였다. 따라서, 본 발명의 어피바디 및 암 세포 표면 상의 항원에 대한 항체를 포함하는 이중항체, 즉 T-세포 관여 이중특이적 항체는 혈액암 및 고형암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 “CD137”은 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor, TNFR) 패밀리 중 하나로, TNFRSF9(tumor necrosis factor receptor superfamily number 9), 4-1BB 및 ILA(induced by lymphocyte activation)이라고 불리기도 하는 공동-자극성 면역 체크포인트 분자(co-stimulatory immune checkpoint molecule)를 의미한다.
CD137 (4-1BB)은 활성화된 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg), NKT 세포(natural killer T cell), NK 세포(natural killer cell), 수지상세포(dentritic cell, DC), 중성구(neutrophil), 호산구(eosinophil), 비만 세포(mast cell) 및 혈관내피세포(endothelial cell) 상에 발현된다.
CD137은 이의 리간드인 4-1BBL과 결합하면 T 세포의 활성화, 생존 및 효과기 기능(effector function)을 유도한다. CD137의 리간드인 4-1BBL은 TNF 패밀리로, 성숙 DC, 활성화된 B 세포 및 대식세포(macrophage)와 같은 항원 제시 세포(antibody presenting cell, APC)에서 발현된다.
본 명세서에서, 용어 "어피바디(affibody)"는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)의 단백질 A (Protein A) 중 IgG(immunoglobulin G)에 친화성(affinity)이 있는 부위인 Z-도메인(Z domain)을 의미하며, "Z body" 또는 "Zb"로도 지칭된다.
어피바디는 58개의 아미노산 잔기로 이루어진 작은 단백질이다. 이러한 어피바디 분자의 단백질 서열에서 IgG와 결합면을 형성하는 13개의 아미노산은 아미노산 서열에 따라 다양한 타겟 항원에 대한 결합이 가능하며, 무작위적인 배열이 가능하여 라이브러리(library)를 구축할 수 있다. 어피바디 분자는 항체와 유사하게 라이브러리로부터 파지 디스플레이(phage display), 효모단백질 잡종법(yeast two hybrid, Y2H) 등의 스크리닝 방법을 통해서 다양한 타겟 항원에 대하여 결합할 수 있는 어피바디 분자들을 선별할 수 있다.
또한, 어피바디는 분자량이 6 kDa으로 매우 작아, 일반적으로 150 kDa의 분자량을 가진 IgG 형태의 항체와 비교하여 인체 투여시 전신적으로 확산되고, 신장 여과로 빠르게 제거되는 특징이 있다. 어피바디는 일반 IgG와 결합된 이중항체의 형태로도 개발되고 있다(Yu F et al., 2014, MAbs). 게다가, 어피바디는 열과 알칼리 조건에 대한 내성을 가지며, 박테리아를 이용해 대량 생산하기 때문에 제작 비용이 항체 대비 낮다.
제1 세대 Z 변이체(Z domain의 변이체)에 기반한 폴리펩타이드 스캐폴드에 관한 발명이 PCT 공개공보 WO95/19374에 개시된 바 있고, 제2 세대 Z 변이체에 기반한 폴리펩타이드 스캐폴드에 관한 발명이 PCT 공개공보 WO2009/080811에 개시된 바 있다.
상술하였듯이, 어피바디는 작은 단백질 도메인으로, 상이한 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있고, 포도상구균의 단백질 A로부터 유래된 58개-잔기 면역글로블린 Fc-결합 Z 도메인의 13개 표면 잔기를 무작위화(randomization)하여 설계된다.
상기 무작위화가 표적으로 하는 13개 표면 잔기는 첫 번째 나선(helix)에 위치한 Q9, Q11, N11, F13, Y14, L17 및 H18 잔기와, 두 번째 나선 표면에 위치한 E24, E25, R27, N28, Q32 및 K35 잔기이다. 야생형 Z 도메인의 인간 Fc (IgG)에 대한 친화도는 약 10 nM 내지 60 nM로 알려져 있고, 단백질 A는 면역글로불린 포획을 위한 친화성 리간드로 사용된다(Nord, K., Gunneriusson, E., Ringdahl, J. et al. Nat Biotechnol 15, 772-777, 1997. 참조).
본 명세서에서, 용어 “어피맵(AffiMab)”은 어떤 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합된 어피바디(affibody) 분자로 구성된 이중특이적 항체(bispecific antibody)를 의미한다. 어피맵은 모듈 형식이므로 상이한 표적에 용이하게 적용할 수 있다(Volk, AL., Mebrahtu, A., Ko, BK. et al. Drugs R D 21, 157-168, 2021. 참조). 본 발명에 따른 단백질 복합체, 융합 단백질 및 이중항체는 어피맵의 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CD137은 인간 또는 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey) 유래의 CD137이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 어피바디의 CD137 세포외 도메인에 대한 결합 부위는 서열번호 27의 아미노산 서열의 64번째 내지 95번째 아미노산 잔기 사이에 위치한다. 즉, 본 발명의 어피바디는 인간(Homo sapiens) 또는 게잡이 원숭이(Macaca fascicularis)의 CD137 세포외 도메인의 64번째 내지 95번째 아미노산 잔기 사이에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 어피바디는 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 동종이량체(homodimer)의 형태일 수 있다. 상기 동종이량체는 동일 단백질이 서로 상호작용하여 형성된 하나의 단백질 복합체를 의미한다. 상기 어피바디 동종이량체는 어피바디 단량체가 서로 연결된 다량체 형태일 수 있다. 상기 어피바디 동종이량체는 어피바디 단량체가 서로 아미노산 링커로 연결된 다량체 형태일 수 있다. 상기 어피바디 동종이량체는 융합 단백질 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있다. 상기 어피바디 동종이량체는 직접적으로, 예컨대 공지의 유기 화학적 방법으로, 또는 간접적으로 예컨대 아미노산 링커를 통해 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디는 금 나노입자와 연결된 복합체의 형태일 수 있다. 이러한 경우 나노입자-기반 면역분석법에 사용되어, CD137을 발현하는 항원제시세포(APC), 예컨대 활성화된 T-세포에 대한 높은 민감도와 특이도를 나타내는 ELISA, immuno-PCR 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디는 형광 단백질과 연결된 복합체의 형태일 수 있다. 본 발명의 어피바디가 형광 단백질과 연결된 복합체의 형태인 경우, CD137을 발현하는 항원제시세포에 대한 특이적 표적과 이미징이 가능하다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열의 64번째 내지 95번째 아미노산 잔기 사이에 특이적으로 결합하는 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 어피바디를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오타이드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 어피바디를 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성(예컨대 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성(예컨대 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성(예컨대 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성(예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성(예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 60% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이에 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.
서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 NCBI 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 NCBI 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 CD137에 대한 어피바디를 이루는 폴리펩타이드와 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 첨부된 서열목록에 수록되어 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상술한 핵산 분자를 포함하는 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디 발현을 위한 벡터이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상술한 핵산 분자를 포함하는 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 발현을 위한 벡터이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상술한 핵산 분자를 포함하는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 CD137 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 발현을 위한 벡터이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상술한 핵산 분자를 포함하는 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열의 64번째 내지 95번째 아미노산 잔기 사이에 특이적으로 결합하는 어피바디 발현을 위한 벡터이다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 파지미드 벡터; 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 어피바디를 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 어피바디의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 벡터는 인간 또는 게잡이 원숭이의 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 인코딩하는 핵산 분자가 삽입된 벡터로서, 상기 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 숙주세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터 및 숙주세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 숙주세포 발현용 재조합 벡터이다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 이스트(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분리된 숙주세포는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 것이다.
본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명에서 숙주세포 내로 주입된 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 재조합된 상기의 어피바디를 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 어피바디를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 갈락토오스 유도성 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
상기 배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10℃ 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5시간 내지 7일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터 또는 락토오스 유도성 프로모터를 함유하는 경우 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 여전히 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 어피바디 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상술한 어피바디는 CD137을 발현하는 세포, 구체적으로, 활성화된 CD8+ T 세포, 수지상세포, NK 세포 등에 특이적으로 결합하기 때문에, 상기 어피바디는 CD137에 작용제(agonist)로 작용하여, T 세포를 활성화하고, NK 세포의 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 T-세포 매개 세포 독성(T-cell mediated cytotoxicity)을 나타내므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 혈액암 또는 고형암이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 고형암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 부비동암, 비부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 직장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 혈액암은 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병, 골수이형성증후군, 골수증식성종양, 진성적혈구증가증, 본태성혈소판증가증, 골수섬유화증, 단핵구성백혈병, 적백혈병, 거대핵모구성백혈병, 호염기성벽혈병, 호산구성백혈병, 급성림프구성백혈병, 만성림프구성백혈병, 다발성골수종, 림프종, B세포림프종, 변연부비세포림프종, 호지킨림프종, 비호지킨림프종, 미만성큰B-세포림프종, 결절외변연부세포림프종, 결절외NK/T-세포림프종, 주변T-포림프종, 버킷림프종, 전구세포종양, 외투막세포림프종, 소포림프종, 면역결핍관련림프구증식성질환, 결절림프구우세호지킨병, 결절경화고전호지킨병, 림프구과다고전호지킨병, 혼합세포충실성고전호지킨병, 림프구고갈고전호지킨병 및 화학요법-저항성 모양세포백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 흉골내 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 단백질 복합체(protein complex)를 제공한다: 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및 암 세포 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
본 명세서에서 용어 "단백질 복합체(protein complex)"는 적어도 2개의 연관된 폴리펩타이드 사슬의 일 군을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "암 세포 표면 상의 단백질"은 세포막 층에 임베딩되거나 걸쳐있는 단백질을 의미한다. 상기 암 세포 표면 상의 단백질은 암 세포 표면에 존재하는/발현하는 내재성 막단백질(integral membrane protein), 막관통 단백질(transmemebrane protein), 지질-고정 막단백질(lipid-anchored membrane protein), 표재성 막단백질(peripheral membrane protein), 항원, 프로테오글리칸, 또는 뮤신일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암세포 표면 상의 단백질은 정상 세포 대비 과발현된 단백질일 수 있다. 상기 암세포 표면 상의 단백질은 야생형 단백질에서 돌연변이가 발생된 것일 수 있다. 상기 암세포 표면 상의 단백질은 암 세포-특이적 단백질 또는 종양 마커일 수 있다. 상기 종양 마커는 암 또는 특정 비암성 양성(noncancerous benign) 상태에 대한 반응의 결과로 암세포 또는 다른 세포에 존재하거나 이들로부터 생성되는 임의의 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 일 구현예에 따른어피바디의 단량체 및 암 세포 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하는 각각의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 단량체가 연결된 다량체 형태이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 상기 어피바디 및 각각의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서로 공유결합으로 연결된 다량체 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 상기 어피바디 및 각각의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 서로 아미노산 링커로 연결된 다량체 형태일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트(conjugate)의 형태로 구현될 수 있다.
따라서, 상기 어피바디 및 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 화학적 컨쥬게이션(유기 화학 방법으로 알려진) 또는 다른 수단(예를 들어, 복합체를 융합 단백질로서 발현하거나, 직접적으로 또는 링커(예컨대, 아미노산 링커))을 통하여 간접적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 단백질 복합체를 이루는 각 단량체는 적어도 하나의 링커로 연결된다. 이 경우 상기 링커는 일반식 (GnSm)p 또는 (SmGn)p로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다:
여기에서 상기 n, m 및 p는 독립적으로,
n은 1 내지 7의 정수이고;
m은 0 내지 7의 정수이며;
n과 m의 합은 8이하의 정수이고; 및
p는 1 내지 7의 정수이다.
본 발명의 다른 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 링커는 n = 1 내지 5이고, m = 0 내지 5이다. 보다 구체적인 일 구현예의 경우, n = 4이고, m = 1이다. 보다 더 구체적인 일 구현예의 경우, 상기 링커는 (GGGGS)3 이다. 또 다른 구현예의 경우, 상기 링커는 GGGGS이다. 또 다른 구체적인 일 구현예의 경우, 상기 링커는 VDGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 ASGS이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 타겟이 2 이상인, 다중 항체일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 단일클론항체, 다중클론항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중항체, 다중특이적 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 케모바디(chemobody), 옵토바디(optobody) 또는 이들의 항원 결합 단편일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 이중특이적 항체(bispecific antibody)이다. 본 발명의 구체적인 다른 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 4가항체(tetravalent antibody)이다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 삼중특이적 항체(trispecific antibody)이다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 T-세포 관여 이중특이적 항체(T-cell engaging bispecifc antibodies)이다.
본 발명의 구체적인 다른 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 단일클론 이중특이적 항체이다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 다중클론 이중특이적 항체이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 암 세포 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론 항체, 다중클론 항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중특이적 항체, 삼중특이적, 다중특이적 항체, 2가 항체, 4가 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 항원 결합 단편일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 어피바디는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄에 융합된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 어피바디는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에 융합된다.
본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 상기 어피바디는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 융합된다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 어피바디는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단 및 N-말단에 융합된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암 세포 표면 상의 단백질은 EGFR(epidermal growth factor receptor), HER2(human epidermal growth factor receptor 2), 또는 CD19(cluster of differentiation 19)이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 세툭시맙(cetuximab); 또는
(b) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역.
상기 세툭시맙(cetuximab)은 상업적으로 입수 가능한 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체이고, 당업계에 공지된 인간 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이라면, 비-제한적으로 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및 세툭시맙을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 세툭시맙을 포함한다.
본 발명의 구체적인 다른 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및
서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 (b)는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함한다.
본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및
서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(d) 트라스투주맙(trastuzumab); 또는
(e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역.
상기 트라스투주맙(trastuzumab)은 상업적으로 입수 가능한 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 항체이고, 당업계에 공지된 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이라면, 비-제한적으로 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
(c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및
(c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
(d) 트라스투주맙(trastuzumab)을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및
(d) 트라스투주맙(trastuzumab)을 포함한다.
본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
(e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및
(e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 (e)는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및
서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는
(g) FMC63.
상기 FMC63은 상업적으로 입수 가능한 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체이고, 당업계에 공지된 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이라면, 비-제한적으로 사용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및
(f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및
(f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명의 구체적인 일 구체예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및
(g) FMC63을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 구체예에 따른 단백질 복합체는 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하고; 및
(g) FMC63을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 핵산 분자는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 암 세포 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 핵산 분자는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 상기 핵산 분자는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 상기 핵산 분자는 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 단백질 복합체를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 단백질 복합체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 암 세포 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 EGFR, HER2 또는 CD19에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 항체의 중쇄가변영역을 인코딩하는 핵산 분자 및 경쇄가변영역을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.
본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 세툭시맙을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.
본 발명의 여전히 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
HER2에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
(c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
(d) 트라스투주맙(trastuzumab); 또는
(e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.
본 발명의 여전히 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.
본 발명의 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
CD19에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 일 구현예에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
(f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는
(g) FMC63을 인코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 벡터는 EGFR, HER2, 또는 CD19에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자가 삽입된 벡터로서, 상기 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 숙주세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터 및 숙주세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 숙주세포 발현용 재조합 벡터이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분리된 숙주세포는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 것이다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주 세포는 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey) 유래 섬유아세포(CYNOM-K1, Sigma-Aldrich), 붉은털원숭이(rhesus monkey) 유래 신장 세포(ATCC, LLC-MK2 Original CCL-7TM 또는 ATCC, FRhK-4, CRL-1688TM), 또는 붉은털원숭이 유래 림프모세포(ATCC, LCL 8664, CRL-1805 TM)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 일 구현예에 따른 단백질 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 단백질 복합체를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 혈액암 또는 고형암이다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 고형암은 뇌종양, 양성성상세포종, 악성성상세포종, 뇌하수체 선종, 뇌수막종, 뇌림프종, 핍지교종, 상의세포종, 뇌간종양, 두경부 종양, 후두암, 구인두암, 비강암, 부비동암, 비부비동암, 비인두암, 침샘암, 하인두암, 갑상선암, 구강암, 흉부종양, 소세포성 폐암, 비소세포성 폐암, 흉선암, 종격동 종양, 식도암, 유방암, 남성유방암, 복부종양, 위암, 간암, 담낭암, 담도암, 췌장암, 소장암, 대장암, 직장암, 항문암, 방광암, 신장암, 남성생식기종양, 음경암, 전립선암, 여성생식기종양, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 자궁육종, 질암, 여성외부생식기암, 여성요도암 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 혈액암은 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병, 골수이형성증후군, 골수증식성종양, 진성적혈구증가증, 본태성혈소판증가증, 골수섬유화증, 단핵구성백혈병, 적백혈병, 거대핵모구성백혈병, 호염기성벽혈병, 호산구성백혈병, 급성림프구성백혈병, 만성림프구성백혈병, 다발성골수종, 림프종, B세포림프종, 변연부비세포림프종, 호지킨림프종, 비호지킨림프종, 미만성큰B-세포림프종, 결절외변연부세포림프종, 결절외NK/T-세포림프종, 주변T-포림프종, 버킷림프종, 전구세포종양, 외투막세포림프종, 소포림프종, 면역결핍관련림프구증식성질환, 결절림프구우세호지킨병, 결절경화고전호지킨병, 림프구과다고전호지킨병, 혼합세포충실성고전호지킨병, 림프구고갈고전호지킨병 및 화학요법-저항성 모양세포백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질 복합체는 T 세포의 활성화를 유도한다.
구체적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 암 세포 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하고, 동시에 T 세포의 CD137에 특이적으로 결합하므로, 상기 단백질 복합체는 T 세포의 작용제로 작용하여 T 세포의 활성화를 유도함으로써, 암 세포의 수를 감소시키거나, 암 세포 수의 증가를 억제시킬 수 있어, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질 복합체는 암 세포 표면 상의 단백질에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 암 세포 표면 상의 EGFR에 특이적으로 결합하고, 동시에 T 세포의 CD137에 특이적으로 결합하므로, 상기 단백질 복합체는 T 세포의 작용제로 작용하여 T 세포의 활성화를 유도함으로써, EGFR을 발현하는 암 세포의 수를 감소시키거나, EGFR을 발현하는 암 세포 수의 증가를 억제시킬 수 있어, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질 복합체는 EGFR에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다.
상기 암은 EGFR 양성일 수 있다.
상기 암은 EGFR을 과발현하는 것을 특성으로 할 수 있다.
상기 암은 비소세포폐암(Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC), 폐암(lung cancer), 대장암(colorectal cancer), 뇌 종양(brain tumor), 성상세포종(astrocytoma), 식도암(esophageal cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 또는 활막육종(Synovial Sarcoma)이나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암은 삼중-음성 유방암(triple-negative breast cancer, TNBC)일 수 있다. TNBC는 EGFR을 과발현하는 것으로 공지되어 있다. TNBC는 에스트로겐 수용체(Estrogen Receptor, ER), 프로게스테론 수용체(Progesterone Receptor, PR) 및 인간 표피 수용체 2(Human Epidermal Receptor 2, Her2neu)의 발현이 1% 미만인 유방암을 의미한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 암 세포 표면 상의 HER2에 특이적으로 결합하고, 동시에 T 세포의 CD137에 특이적으로 결합하므로, 상기 단백질 복합체는 T 세포의 작용제로 작용하여 T 세포의 활성화를 유도함으로써, HER2를 발현하는 암 세포의 수를 감소시키거나, HER2를 발현하는 암 세포 수의 증가를 억제시킬 수 있어, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 이중항체는 HER2에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다.
상기 암은 HER2 양성일 수 있다.
상기 암은 HER2를 과발현하는 것을 특성으로 할 수 있다.
상기 암은 침윤성 유방암(invasive breast cancer) 또는 전이성 유방암(metastic breast cancer)일 수 있다. 상기 암은 유방암, 방광암, 췌장암, 난소암 및 위암일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 본 발명의 단백질 복합체는 암 세포 표면 상의 CD19에 특이적으로 결합하고, 동시에 T 세포의 CD137에 특이적으로 결합하므로, 상기 단백질 복합체는 T 세포의 작용제로 작용하여 T 세포의 활성화를 유도함으로써, CD19를 발현하는 암 세포의 수를 감소시키거나, CD19를 발현하는 암 세포 수의 증가를 억제시킬 수 있어, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질 복합체는 CD19에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다.
상기 암은 CD19 양성일 수 있다.
상기 암은 CD19를 과발현하는 것을 특성으로 할 수 있다.
상기 암은 림프종일 수 있다. 상기 림프종은 B 세포 림프종일 수 있다. 상기 암은 변연부림프종, 호지킨림프종, 비-호지킨 림프종, 만성림프구성백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 급성림프구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 골수성백혈병, 또는 화학요법-저항성 모양세포백혈병일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 T 세포의 활성화에 의해 인터페론-감마(IFN-γ)가 증가된다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 암 세포 표면 단백질에 의존적으로 인터페론 감마를 증가시킨다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 EGFR 단백질에 의존적으로 인터페론 감마를 증가시킨다. 즉, 상기 조성물이 EGFR 양성이거나 EGFR을 과발현하는 암 세포에 접촉한 경우 T 세포를 활성화여 인터페론 감마의 농도를 증가시킨다.
본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 HER2 단백질에 의존적으로 인터페론 감마를 증가시킨다. 즉, 상기 조성물이 HER2 양성이거나 HER2를 과발현하는 암 세포에 접촉한 경우 T 세포를 활성화여 인터페론 감마의 농도를 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 CD19 단백질에 의존적으로 인터페론 감마를 증가시킨다. 즉, 상기 조성물이 CD19 양성이거나 CD19를 과발현하는 암 세포에 접촉한 경우 T 세포를 활성화여 인터페론 감마의 농도를 증가시킨다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 암 세포 표면 단백질에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 EGFR 단백질에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다. 즉, 상기 조성물이 EGFR 양성이거나 EGFR를 과발현하는 암 세포에 접촉한 경우 T 세포의 활성화를 유도한다.
본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 HER2 단백질에 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다. 즉, 상기 조성물이 HER2 양성이거나 HER2를 과발현하는 암 세포에 접촉한 경우 T 세포의 활성화를 유도한다.
본 발명의 또 다른 일 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 CD19에 단백질 의존적으로 T 세포의 활성화를 유도한다. 즉, 상기 조성물이 CD19 양성이거나 CD19를 과발현하는 암 세포에 접촉한 경우 T 세포의 활성화를 유도한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 흉골내 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환 상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
본 발명은 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디를 제공한다.
본 발명은 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및 암 세포 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 단백질 복합체를 제공한다.
본 발명은 상술한 어피바디, 또는 단백질 복합체, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 CD137에 특이적으로 결합하는 어피바디를 이용하면, T 세포에 특이적으로 결합하는 동시에 다양한 종류의 암 세포 표면 상의 항원에 특이적으로 결합하는 단백질 복합체를 개발하여, 혈액암 및 고형암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 CD137 단백질에 결합하는 어피바디를 주변세포질의 추출물(periplasmic extract) 형태로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 CD137에 결합하는 항체-어피바디의 형태로, CD137 양성 세포인 활성화된 CEMT 세포(Activated CEMT cell)를 이용하여, 세포에 발현된 CD137에 결합하는 어피바디를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3d는 EGFR 결합 항체 2종(CET 또는 15E3)을 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체로 생산한 후, 상기 이중항체가 CD137 단백질과 EGFR 단백질에 결합하는지 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3a는 세툭시맙(Cetuximab, CET) 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 EGFR 단백질에 결합함을 확인한 도이다.
도 3b는 세툭시맙(CET) 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 CD137 단백질에 결합함을 확인한 도이다.
도3c는 15E3 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 EGFR 단백질에 결합함을 확인한 도이다.
도3d는 15E3 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 CD137 단백질에 결합함을 확인한 도이다.
도 4a는 세툭시맙(CET) 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 CD137을 발현하는 활성화된 CEMT 세포에 결합함을 확인한 도이다.
도 4b는 15E3항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 CD137을 발현하는 활성화된 CEMT 세포에 결합함을 확인한 도이다.
도5a는 세툭시맙(CET) 항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 EGFR을 발현하는 HT29 세포에 결합함을 확인한 도이다.
도5b는 15E3항체 기반으로 CD137 어피바디로 구성된 이중항체가 EGFR을 발현하는 HT29 세포에 결합함을 확인한 도이다.
도6은 CD137 어피바디의 선별을 위해, IFN-gamma 분비량 분석을 통해 EGFR 의존적인 T 세포 활성화(EGFR dependent T cell activation)를 확인한 도이다.
도7은 선별된 CD137 어피바디 2종이 CD137의 어떤 세포외 도메인(extracellular domain, ECD)에 결합하는지 확인한 도이다.
도 7a는 신호 펩타이드(signal peptide)와 상이한 ECD 도메인 1 내지 5의 조합으로 구성된 hCD137-ECD, hCD137-ECD-ΔD1, hCD137-ECD-ΔD12, hCD137-ECD-ΔD123p, hCD137-ECD-ΔD123, hCD137-ECD-ΔD3 및 hCD137-ECD-ΔD5의 모식도를 나타낸다. 도메인 1 내지 도메인 5로 구성된 인간 CD137 ECD에 대한 아미노산 서열은 서열번호 27에 나타내었다.
도 7b는 우렐루맙(urelumab)이 CD137 ECD의 도메인1에 결합함을 확인한 도이다.
도 7c는 유토밀루맙(utomilumab)이 CD137 ECD의 도메인3에 결합함을 확인한 도이다.
도 7d는 세툭시맙(Negative Ab)이 CD137 ECD의 어느 도메인에도 결합이 일어나지 않음을 확인한 도이다.
도 7e는 어피바디 ZAAD01이 CD137 ECD의 도메인3에 결합함을 확인한 도이다.
도 7f는 어피바디 ZAAD05가 CD137 ECD의 도메인3에 결합함을 확인한 도이다.
도8은 선별된 CD137 어피바디 2종과 TNFR 슈퍼패밀리(superfamily)에 속하는 다른 단백질, CD27, CD30, CD134, CD270, CD357, TNF-α과의 교차반응(cross reactivity)을 확인한 도이다.
도 8a는 어피바디 ZAAD01이 CD137에만 특이적으로 결합함을 확인한 도이다.
도 8b는 어피바디 ZAA0D5가 CD137에만 특이적으로 결합함을 확인한 도이다.
도9는 선별된 CD137 어피바디 2종의 CD137 단백질과의 인간(human), 마우스(mouse) 및 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey) 사이의 종간 교차반응을 확인한 도이다.
도9a는 어피바디 ZAAD01이 인간 및 게잡이 원숭이의 CD137 단백질과 결합함을 확인한 도이다.
도9b는 어피바디 ZAAD05가 인간 및 게잡이 원숭이의 CD137 단백질과 결합함을 확인한 도이다.
도10은 항체-어피바디 형태의 이중항체 4종이 CD137 항원과 EGFR 항원의 두 표적에 동시 결합함을 BLI(BioLayer Interferometry)법을 이용하여 확인한 도이다. 도 10a는 CET-ZAAD01 이중항체, 도 10b는 CET-ZAAD05 이중항체, 도 10c는 15E3-ZAAD01 이중항체, 도 10d는 15E3-ZAAD05 이중항체의 BLI 결과를 나타낸다.
도11은 EGFR 발현 세포의 세포별 발현 정도를 유세포 분석법(Flowcytometry)으로 확인하고, EGFR 발현 정도에 따른 이중항체의 T세포 활성화 정도가 EGFR 발현양과 상관관계가 있음을 확인한 도이다.
도 11a는 EGFR 양성 세포인 A431 세포, HT29 세포 및 SW403 세포와 EGFR 음성 세포인 MOLT4 세포에서 EGFR 발현을 확인한 도이다.
도 11b는 IFN-gamma 분비량 분석을 통해 EGFR 발현 정도에 따른 15E3-ZAAD01 이중항체의 EGFR 의존적 T 세포 활성화를 확인한 도이다.
도12는 CD137 어피바디와 HER2 항체 또는 CD19 항체를 이용하여 생산된 이중항체가 CD137과 HER2 또는 CD19에 각각 결합함을 확인한 도이다.
도 12a는 트라스투주맙-ZAAD01 이중항체(anti-HER2 Ab1_ZAAD01) 및 hz1E11.10-ZAAD01 이중항체(anti-HER2 Ab2_ZAAD01)가 CD137에 결합함을 확인한 도이다.
도 12b는 트라스투주맙-ZAAD01 이중항체 및 hz1E11.10-ZAAD01 이중항체가 HER2에 결합함을 확인한 도이다.
도 12c는 FMC63-ZAAD01 이중항체(anti-CD19 Ab_ZAAD01)가 CD137에 결합함을 확인한 도이다.
도 12d는 FMC63-ZAAD01 이중항체가 CD19에 결합함을 확인한 도이다.
도13은 CD137 어피바디와 HER2 항체 또는 CD19 항체를 이용하여 생산된 이중항체가 HER2 또는 CD19에 의존적인 T 세포 활성화를 IFN-gamma 분비량 분석을 통해 확인한 도이다.
도 13a는 IFN-감마 분비량 분석을 통해 유토밀루맙 대비 트라스투주맙-ZAAD01 이중항체 및 hz1E11.10-ZAAD01 이중항체가 HER2에 의존적으로 T 세포를 활성화함을 확인한 도이다.
도 13b는 IFN-감마 분비량 분석을 통해 유토밀루맙 대비 FMC63-ZAAD01 이중항체가 EGFR에 의존적으로 T 세포를 활성화함을 확인한 도이다.
도 14a는 이중항체(CET_ZAAD01 및 CET_ZAAD05)에 의한 면역세포의 활성으로 DLD1-luc 세포가 사멸함을 보여준다.
도 14b는 이중항체(CET_ZAAD01 및 CET_ZAAD05)에 의한 면역세포의 활성으로 IFN-gamma의 분비가 증가됨을 보여준다.
도 15는 인간화 CD137 모델에서 이중항체(CET_ZAAD01 및 CET_ZAAD05)에 대한 항암효과로 인한 생존기간 연장을 나타낸다.
도 16a는 인간화 CD137 모델에서 vehicle 처리군의 종양크기를 나타낸 도이다.
도 16b는 인간화 CD137 모델에서 Cetuximab 처리군의 종양크기를 나타낸 도이다.
도 16c는 인간화 CD137 모델에서 이중항체(CET_ZAAD01) 처리군의 종양크기를 나타낸 도이다.
도 16d는 인간화 CD137 모델에서 이중항체(CET_ZAAD05) 처리군의 종양크기를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1. CD137에 대한 어피바디 개발
1-1: 인간 CD137에 특이적으로 결합하는 10종의 어피바디 클론 스크리닝
CD137 단백질을 이용하여 어피바디(affibody, Zb) 라이브러리에서 패닝(panning)을 통해 CD137에 특이적으로 결합하는 클론(clone)을 선별하였다. 선별된 클론들을 어피맵(AffiMab, 단일클론 항체 기반의 어피바디로 구성된 이중항체) 형태의 이중항체로 동물세포를 이용하여 생산하고 CD137 발현 세포에 결합하는 클론을 선별하였다.
패닝 - 친화도 성숙
어피바디 라이브러리는 VSCM13 헬퍼 파지(VSCM13 helper phage)를 이용하여 파지 형태로 레스큐(rescue)해 패닝에 사용하였다. 처음 항원에 결합시키는 라이브러리 파지의 수는 1013개 이상이었고, 4회차의 패닝을 거쳐 진행하였다. 패닝 회차를 늘려감에 따라 항원의 양(10 μg, 5 μg, 2 μg 및 1 μg)은 점차 줄이고, 수세(wash) 횟수(3회, 5회, 7회 및 10회)는 점차 늘리는 방법을 적용하여, 친화성이 높은 파지를 선택적으로 선별하는 전략을 사용하였다. 패닝의 각 회차에서 얻은 바인더 파지(binder phage)를 대장균 ER2537(New England Biolabs® Inc.)에 감염시켜 얻은 콜로니를 ELISA 방법으로 항원에 대한 결합 여부를 확인하였다.
페리플라즘 추출 - 어피바디 분리
바인더 파지를 감염시켜 얻은 콜로니를 SB 배지(MOPS 10 g/L, Bacto YEAST extract 20 g/L 및 Trypton 30 g/L)에 접종한 다음 OD600 (optical density at 600 nm) 값이 0.8이 될 때까지 배앙한 후, 1 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, ㈜엘피에스 솔루션)를 넣고 30℃에서 진탕배양(shaking incubation)하여 어피바디(Zb)가 과발현되도록 하였다. BBS 버퍼(200 mM Boric acid, 150 mM NaCl 및 1 mM EDTA)를 이용하여 어피바디의 페리플라즘 추출(periplasmic extraction, PE)을 진행하였다. 이를 이용하여 ELISA 방법을 통해 바인더를 스크리닝하였다.
ELISA 방법 - 바인더 스크리닝
ELISA는 2 μg/mL의 농도로 hCD137-ECD-Fc (human CD137-extracellular domain-fragment crystallizable region) 단백질이 코팅(coating)된 플레이트에 어피바디 페리플라즘 추출물을 처리하였으며, 2차 항체(anti-HA-HRP, Roche, 12013819001, human influenza hemagglutinin (HA) protein)를 처리한 후 TMB(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, BioFXTM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3, PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD450 값을 측정하고, 그 결과는 도 1에 나타내었다. 대조를 위해, 마우스 CD137 ECD Fc 단백질을 코팅하거나(mouse CD137), 어떤 단백질도 코팅하지 않은 플레이트(Negative protein) 또한 사용하였다. Negative PE는 어피바디 플라스미드가 없는 대장균 ER2537의 추출물이다.
ELISA 결과 - 10종의 어피바디 클론 선별
도 1에 나타낸 바와 같이, negative PE에서는 OD450 값이 거의 측정되지 않았고, 마우스 CD137 단백질에서도 OD450 값이 거의 측정되지 않아 이에 대해 어피바디 10종 모두 결합하지 않은 반면, 높은 OD450 값을 통해 인간 CD137 단백질에 대해서는 어피바디 10종 모두 결합하였음을 확인하였다.
상기 ELISA 결과로부터, 인간 CD137 단백질에 결합하는 10종의 어피바디, ZAAD01 내지 ZAAD10을 선별하였다. 어피바디의 서열을 확인한 결과, 인간 CD137에 결합하는 10종의 고유한 클론(unique clone, 클로닝된 특정 세포주)을 확인하였다.
1-2: 8종의 어피바디 선별
상술한 고유한 클론 10종을 Zb-Fc의 형태로 클로닝하고 동물세포를 이용하여 생산하였다. 이후, CD137 발현 세포를 이용하여 세포 결합(융합)을 확인하였다. Fc는 단편 결정화 가능 영역(Fragment crystallizable region)을 의미한다.
T-세포 활성화
CEMT 세포(ATCC®, CCL-119TM, T lymphoblast, 급성 림프구성 백혈병)를 1×107/10 mL을 준비하여, PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma-Aldrich®, P1585) 50 ng/mL 와 이오노마이신(ionomycin, Sigma-Aldrich®, I9657) 1 μg/mL의 농도로 처리한 후, 16시간 인큐베이션(incubation)하여 활성화(activation)시켰다.
PMA 및 이오노마이신은 T 세포를 활성화하는 것으로 알려져 있다. PMA는 단백질 키나제 C(protein kinase C)를 활성화하고, 이오노마이신은 칼슘 운반체(calcium ionophore)이며, 두 화합물은 T 세포막 수용체 복합체를 통과해 여러 세포 내 신호 전달 경로의 활성화를 유도하고 T 세포 활성화함으로써, 다양한 사이토카인의 생성을 유발한다(Ai, W., et al. (2013). Int J Environ Res Public Health. 2013;10(9):3834-3842. 참조). 이오노마이신은 PMA와 함께 사이토카인, 인터페론, 퍼로린, IL-2 및 IL-4의 세포내 생산을 자극하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, 자극을 받지 않은 나이브(naive) T 세포는 CD137을 발현하지 않지만, 자극을 받은 활성화된 T 세포는 일시적으로 높은 수준으로 CD137을 발현하는 것으로 공지되어 있다.
활성화된 CEMT 세포를 5×105/튜브로 준비한 다음, 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고, PBS 중 5% FBS로 수세한 후, 상기 10종의 Zb-Fc를 5 μg/mL 처리하고 얼음에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세하였다. 대조를 위해, 활성화되지 않은 CEMT 세포(inactivated CEMT cell) 또한 준비하였다.
그 다음, 항-인간-Fc-FITC(anti-human-Fc-FITC, Life Technologies®, A11013)를 1 μg/mL로 세포에 처리하고 빛을 차단한 채로 얼음에서 45분간 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세한 후, 베크만 쿨터(Beckman CoμLter, Inc.)의 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 기기를 이용하여 형광의 세기를 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. FACS 결과 그래프에서 피크가 우측으로 이동할수록 세포에 대한 더 강한 결합을 나타낸다. FITC only는 Zb-Fc binding 시 버퍼(buffer)만 존재하는 경우이고, Negative Ab는 hIgG (human IgG)를 사용한 경우이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, FACS 측정 결과, CD137 발현 세포에 특이적으로 결합하는 8종의 어피바디, ZAAD01, ZAAD02, ZAAD03, ZAAD04, ZAAD05, ZAAD07, ZAAD09 및 ZAAD010을 선별하였다.
구체적으로, 상기 8종의 어피바디는 활성화되지 않은 CEMT 세포에서는 FITC에 대한 피크만 나타낸 반면, 활성화된 CEMT 세포에서는 FITC에 대한 피크보다 우측으로 이동한 피크를 나타내었다. 이는 상기 8종의 어피바디가 활성화되지 않은 CEMT 세포에는 결합하지 않고, 활성화된 CEMT 세포와는 결합함을 확인할 수 있었다.
그러나, 어피바디 ZAAD06 및 ZAAD08는 hIgG를 첨가한 대조군(negative Ab)과 활성화되지 않거나 활성화된 CEMT 세포 사이에서도 피크의 차이가 없어, CD137을 발현하는 세포, 즉 활성화된 CEMT 세포와 특이적으로 결합하지 않아, ZAAD06 및 ZAAD08은 선택하지 않았다.
실시예 2. CD137에 대한 어피바디 선별
2-1: 이중항체 16종의 생산
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)에 특이적으로 결합하는, 세툭시맙(Cetuximab, CET)과 자체적으로 개발한 15E3 항체(국내 공개특허공보 제10-2017-0012754호, 참조) 2종을 기반으로 하여, 상기 실시예 1-2에서 선별된 8종의 CD137 어피바디를 이중항체 형태로 클로닝하고, 동물세포를 이용하여 총 16종의 이중항체를 생산하였다. 상기 8종의 어피바디가 세툭시맙(CET)과 이중항체 형태로 클로닝된 경우에는 각각 CET-ZAAD01, CET-ZAAD02, CET-ZAAD03, CET-ZAAD04, CET-ZAAD05, CET-ZAAD07, CET-ZAAD09 및 CET-ZAAD010으로 지징하였으며, 15E3 항체와 이중항체 형태로 클로닝된 경우에는 각각 15E3-ZAAD01, 15E3-ZAAD02, 15E3-ZAAD03, 15E3-ZAAD04, 15E3-ZAAD05, 15E3-ZAAD07, 15E3-ZAAD09 및 15E3-ZAAD010으로 지징하였다.
상기 국내 공개특허공보 제10-2017-0012754호에 공지된 바와 같이, 본 발명자들은 세툭시맙과 15E3 항체 모두 EGFR 도메인3에 결합하지만, 두 항체가 상이한 에피톱(epitope)에 결합하는 것을 밝힌 바 있다.
2-2: CD137 및 EGFR 단백질 각각에 대한 이중항체의 결합 확인
정제된 이중항체의 형태를 이용하여, 단백질의 결합, 발현 세포의 결합 및 T 세포 활성화 테스트(T cell activation test)를 통해, EGFR 및 CD137 단백질에 모두 결합하는, CD137 어피바디의 선별을 진행하였다.
동물세포에서 생산된 상술한 이중항체 총 16종(8종의 Cetuximab-Zb 및 8종의 15E3-Zb)을 이용하여 각 CD137 과 EGFR의 단백질의 결합을 ELISA를 이용하여 확인하였다. ELISA는 2 μg/mL의 농도로 hCD137-ECD-his와 hEGFR-ECD-his 단백질이 각각 코팅된 플레이트에 정제된 이중항체 16종을 60 nM부터 1/5 희석(dilution)하여 7 포인트(point)로 처리하였으며, 2차 항체(Goat anti-human IgG-F(ab')2-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097)를 처리한 후, TMB(BioFXTM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3, PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD450 값을 측정하였다. 그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism)를 통해 EC50(half maximal effective concentration) 값을 구하고, 결과를 도 3a 내지 3d에 나타내었다.
도 3a 및 3b는 세툭시맙(CET) 항체를 기반으로 하는 CD137 어피바디로 구성된 이중항체(이하, CET-기반 CD137 어피바디 이중항체, Cetuximab-Zb, 또는 CET_ZAAD01 내지 CET_ZAAD10으로 지칭)의 결합 테스트 결과이고, 도 3c 및 3d는 15E3 항체를 기반으로 하는 CD137 어피바디로 구성된 이중항체(이하, 15E3-기반 CD137 어피바디 이중항체, 15E3-Zb, 또는 15E3_ZAAD01 내지 15E3_ZAAD10으로 지칭)의 결합 테스트 결과이며, 도 3a 및 3c는 EGFR 단백질에 대한 결합을 확인한 결과이며, 도 3b 및 3d는 CD137 단백질에 대한 결합을 확인한 결과이다.
상기 결과로부터, 본 발명의 이중항체 총 16종, CET-기반 CD137 어피바디 이중항체 및 15E3-기반 CD137 어피바디 이중항체가 EGFR 및 CD137 단백질 모두에 대해 결합하는 것을 확인하였다.
2-3: CD137 발현 세포에서 이중항체 형태의 결합 확인
CD137 발현 세포에서 상기 16종의 이중항체 형태의 결합을 확인하기 위해, CEMT 세포를 1×107/10 mL을 준비하여, 50 ng/mL의 PMA 및 1 μg/mL의 이오노마이신을 처리한 후, 16시간 동안 인큐베이션하여 활성화시켰다. 활성화된 CEMT 세포를 5×105/튜브로 준비한 다음 1,200 rpm으로 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고, PBS 중 5% FBS로 수세한 후, 이중항체를 5 μg/mL로 처리하고 얼음에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세하였다. 그 다음 anti-human-Fc-FITC(Life Technologies®, A11013)를 1 μg/mL로 세포에 처리하고 빛을 차단한 채로 얼음에서 45분간 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세한 후, 베크만 쿨터 FACS 기기를 이용하여 형광의 세기를 측정하고, 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다. 또한, 양성 대조군(Positive Ab)으로서 유토밀루맙(utomilumab)을 사용하였고, 음성 대조군으로 인간 IgG(hIgG)를 사용하였다.
도 4a는 CET-기반 CD137 어피바디 이중항체의 FACS 결과로, 양성 대조군(Positive Ab)의 피크와 같이, 우측으로 이동한 피크를 나타내었으므로, CET-기반 CD137 어피바디 이중항체 8종 모두 CD137을 발현하는 활성화된 CEMT 세포에 결합하였음을 확인할 수 있었다.
도 4b는 15E3-기반 CD137 어피바디 이중항체의 FACS 결과로, 양성 대조군의 피크와 같이, 우측으로 이동한 피크를 나타내었으므로, 15E3-기반 CD137 어피바디 이중항체 8종 모두 CD137을 발현하는 활성화된 CEMT 세포에 결합하였음을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 이중항체 총 16종이 모두 CD137을 발현하는 세포에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
2-4: EGFR 발현 세포에서 이중항체 형태의 결합 확인
마찬가지로, EGFR 발현 세포에서 상기 16종의 이중항체 형태의 결합을 확인하기 위해, 높은 EGFR 발현을 나타내는 것으로 공지된 HT29 세포(Korean Cell Line Bank, KCLB, 30038, 인간 대장암 세포주)를 5×105/튜브로 준비한 다음 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. PBS 중 5% FBS로 수세한 후, 상기 16종의 이중항체를 5 μg/mL로 처리하고 얼음에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세하였다. 그 다음 anti-human-Fc-FITC(Life Technologies®, A11013)를 1 μg/mL로 세포에 처리하고 빛을 차단한 채로 얼음에서 45분간 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세한 후, 베크만 쿨터 FACS 기기를 이용하여 형광의 세기를 측정하고, 결과를 도 5a 및 5b에 나타내었다. 또한, 양성 대조군(Positive Ab)으로 CET-기반 평가시에는 CET-IgG 형태를 사용하였고, 15E3-기반 평가시에는 15E3-IgG 형태를 사용하였고, 음성 대조군으로 hIgG를 사용하였다.
도5a는 CET-기반 CD137 어피바디 이중항체의 FACS 결과로, 양성 대조군(CET-IgG)의 피크와 같이 우측으로 이동한 피크를 나타내었으므로, CET-기반 CD137 어피바디 이중항체 8종 모두 EGFR을 발현하는 HT29 세포에 결합함을 확인하였다.
도5b는 15E3-기반 CD137 어피바디 이중항체의 FACS 결과로, 양성 대조군(15E3-IgG)의 피크와 같이 우측으로 이동한 피크를 나타내었으므로, 15E3-기반 CD137 어피바디의 이중항체 8종 모두 EGFR을 발현하는 HT29 세포에 결합함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 이중항체 총 16종이 모두 EGFR을 발현하는 세포에 특이적으로 결합함을 확인하였다.
2-5: EGFR 의존적 T 세포 활성화 테스트 - 어피바디 ZAAD01 및 ZAAD05 선정
생산된 총 16종의 이중항체에서 EGFR 의존적 T 세포 활성화 테스트(EGFR dependnet T cell activation test)를 통해 어피바디 선별 작업을 진행하였다.
테스트 방법
테스트 하루 전에 3 μg/mL의 농도로 항-CD3 항체(InvitrogenTM, 16-0037-85)를 96 웰 라운드 플레이트(96 well round plate)에 50 μL씩 코팅하였다. 다음 날, 멸균된 PBS 100 μL를 이용하여 세 번 수세하였다. 5 μg/mL 농도의 hEGFR-ECD-Fc를 다시 50 μL씩 코팅하였고, 대조군으로 단백질이 없는 웰에는 PBS만 처리하였으며, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. R10 배지(RPMI1640, 10% FBS 및 10 mM HEPES)를 100 μL 이용하여 세 번 수세하였고, R10 배지 100 μL를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 플레이트에 있는 R10 배지를 완전히 제거하고, 16종(8종의 Cetuximab-Zb 및 8종의 15E3-Zb)의 이중항체를 0.1 nM 또는 1 nM의 농도로 50 μL씩 30분간 처리하였다.
그 사이에, 두 명의 공여자로부터 제공받은 혈액을, PBS로 1/2 희석한 후에, 피콜(Ficoll®, GE healthcare, 17-1440-12)을 띄운 류코셉 튜브(Leucosep tube, Greiner Bio-One 유한회사, 227290)에 넣은 후, 1,000 g에서 30분간 원심분리를 진행하였다. 피콜 위에 자리한 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)의 층만을 따낸다. PBS 중 2% PBMC를 이용하여 300 g에서 10분간 원심분리를 하는 수세 작업을 2회 반복한 후에, PBMC의 수를 측정하였다. PBMC를 CD8+ T 세포 분리 키트(CD8+ T cell isolation kit, Miltenyi Biotec Inc., 130-096-495)의 프로토콜을 따라 CD8+ T 세포를 준비하였다.
CD8+ T 세포의 수를 측정하여 1.4 × 106/mL이 되도록 R10 배지로 풀어준 다음, 상기 16종의 이중항체를 처리한 플레이트에 50 μL씩 처리하였다. 처리 3일 후에 플레이트를 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하고, 이를 이용하여, 인간 인터페론-감마 ELISA 키트(IFN-gamma ELISA set, BD Biosciences, 555142)의 프로토콜을 따라 인터페론-감마(Interferon gamma, IFN-gamma, IFN-γ)를 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
테스트 결과
도 6에 나타낸 바와 같이, T 세포 활성화 분석을 통해 EGFR의 유무에 따른 T 세포 활성화의 정도를 IFN-γ의 측정을 통해 확인하였다. 그 결과, CET-기반 ZAAD01 어피바디 이중항체, CET-기반 ZAAD05 어피바디 이중항체, 15E3-기반 ZAAD01 어피바디 이중항체 및 15E3-기반 ZAAD05 어피바디 이중항체를 1 nM 농도로 처리한 경우 IFN-γ의 농도가 유의하게 증가함을 확인하였다. 따라서, 8종의 어피바디 중 IFN-γ 농도가 증가한 어피바디 ZAAD01및 ZAAD05를 선별하였다.
구체적으로, EGFR 의존적 T 세포 활성화 테스트에서는, 플레이트에 코팅된 hEGFR-ECD-Fc에 Cetuximab-Zb 또는 15E3-Zb가 결합하고, 플레이트에 코팅된 항-CD3 항체에 CD3을 발현하는 CD8+ T 세포가 결합한다. hEGFR-ECD-Fc에 결합해 있는 Cetuximab-Zb 또는 15E3-Zb의 어피바디가 항-CD3 항체에 결합해 있는 CD8+ T 세포 표면 상의 CD137과 결합함으로써, CD8+ T 세포가 활성화되고, 활성화된 CD8+ T 세포에 의해 분비된 IFN-γ를 측정할 수 있게 된다. CD137의 작용(agonism)을 통해 T 세포가 활성화되는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 어피바디 ZAAD01및 ZAAD05는 CD8+ T 세포 표면의 CD137 ECD에 결합함으로써 CD137을 활성화하였고, CD8+ T 세포가 IFN-γ를 분비하게 하였다.
이는, CD137에 대한 단일클론 항체인 우렐루맙(Urelumab, BMS-663513) 및 유토밀루맙(Utomilumab)이 CD137 (4-1BB)에 결합하여 T 세포를 활성화하는 작용제(agonist)로 공지된 선행문헌과 일치하는 결과이다(미국 특허 등록번호 제US7288638 B2호. 2007 Oct 30; 미국 특허 등록번호 제US7288638 B2호; 및 미국 특허 등록번호 제US8821867 B2호, 참조).
상기 결과로부터, 본 발명자들은 이중항체 Cetuximab-ZAAD01, 15E3- ZAAD01, Cetuximab-ZAAD01 및 15E3-ZAAD01이 EGFR에 의존적으로 T 세포 활성화하는 것을 확인하고, 어피바디 ZAAD01 및 ZAAD05를 최종 선별하였다.
실시예 3. 선별된 어피바디의 특성 분석
3-1: CD137 ECD 도메인 맵핑을 통한 어피바디의 결합 특성 확인
선별된 어피바디 두 종, ZAAD01 및 ZAAD05의 CD137 도메인 맵핑(domain mapping)을 통해 결합 특성을 확인하였다. 15E3-기반 ZAAD01 및 ZAAD05 어피바디 이중항체를 이하에서는 각각 15E3ZAAD01 및 15E3ZAAD05로 지칭하였다. 또한, CD137에 대한 단일클론 항체인 우렐루맙(Urelumab, BMS-663513) 및 유토밀루맙(Utomilumab, PF-05082566)의 결합 도메인도 함께 조사하였다.
선별된 CD137 어피바디 2종이 CD137의 세포외 도메인(extracellular domain, ECD)의 어느 부분에 결합하는지 확인하기 위해, CD137의 ECD를 5개의 도메인으로 구분한 후, 도메인 돌연변이(domain mutant)를 클로닝하였다. 도메인 돌연변이에 대한 모식도를 도 7a에 나타내었다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, 클로닝한 도메인 돌연변이는 신호 펩타이드(signal peptide) 및 상이한 조합의 ECD 도메인1 내지 도메인 5를 포함하며, 구체적으로는 다음과 같다: 신호 펩타이드 및 도메인 1내지 5를 모두 포함하는 hCD137-ECD; 도메인 1이 결실된 hCD137-ECD-ΔD1; 도메인 1 및 2가 결실된 hCD137-ECD-ΔD12; 도메인 1 및 2의 전부 및 도메인 3의 일부(104번째 아미노산까지 결실됨)가 결실된 hCD137-ECD-ΔD123p; 도메인 1 내지 3이 결실된 hCD137-ECD-ΔD123; 및 도메인 5가 결실된 hCD137-ECD-ΔD3 및 hCD137-ECD-ΔD5.
도 7a에서는 신호 펩타이드 및 도메인 1 내지 5를 포함하는 hCD137ECD에 대한 모식도를 나타내었고, 서열번호 27에는 신호 펩타이드에 대한 아미노산 서열은 제외하고, 도메인 1 내지 도메인 5에 대한 아미노산 서열을 나타내었다.
클로닝한 도메인 돌연변이를 동물세포를 이용하여 생산하였다. 2 μg/mL 농도의 생산된 도메인 돌연변이로 코팅된 플레이트에 정제된 우렐루맙(Urelumab), 유토밀루맙(Utomilumab), 15E3, 15E3ZAAD01 및 15E3ZAAD05를 10 μg/mL, 2 μg/mL 및 0.4 μg/mL씩 처리하였으며, 2차 항체(anti-hIgG-Fab-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097)를 처리한 후 TMB(BioFXTM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3, PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD450 값을 측정하고, 그 결과를 도 7b 내지 7f에 나타내었다.
도 7b에 나타낸 바와 같이, 우렐루맙은 도메인 돌연변이 중 hCD137ECD ΔD1, hCD137ECD ΔD12, hCD137ECD ΔD123P 및 hCD137ECD ΔD123에 결합하지 않았으므로, 우렐루맙은 CD137 ECD의 도메인1에 결합함을 확인하였다.
도 7c에 나타낸 바와 같이, 유토밀루맙은 도메인 돌연변이 중 hCD137ECD ΔD123P, hCD137ECD ΔD123 및 hCD137ECD ΔD3에 결합하지 않았으므로, 유토밀루맙은 CD137 ECD의 도메인3에 결합함을 확인하였다.
도 7d에 나타낸 바와 같이, Negative Ab (세툭시맙)은 인간 CD137 ECD 전체와 이의 도메인 돌연변이 모두와 결합하지 않았으므로, CD137 ECD에 결합하지 않음을 확인하였다.
도 7e에 나타낸 바와 같이, 15E3ZAAD01은 도메인 돌연변이 중 hCD137ECD ΔD123P, hCD137ECD ΔD123 및 hCD137ECD ΔD3에 결합하지 않았으므로, 15E3ZAAD01은 CD137 ECD의 도메인3에 결합함을 확인하였다.
도 7f에 나타낸 바와 같이, 15E3ZAAD05는 도메인 돌연변이 중 hCD137ECD ΔD123P, hCD137ECD ΔD123 및 hCD137ECD ΔD3에 결합하지 않았으므로, 15E3ZAAD05는 CD137 ECD의 도메인3에 결합함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명자들은 선별된 어피바디 두 종, ZAAD01 및 ZAAD05가 CD137 ECD의 도메인3에 결합하는 것을 확인하였다.
3-2: 선별된 어피바디의 TNFRSF 사이의 교차반응 확인
선별된 어피바디 두 종, ZAAD01 및 ZAAD05의 TNFRSF(TNF-alpha receptor super family)에 대한 교차반응(cross reactivity)을 ELISA를 이용하여 확인하였다.
TNFRSF에 속하는 CD137 (TNFRSF9), CD27 (TNFRSF7), CD30 (TNFRSF8), CD134 (TNFRSF4), CD270 (TNFRSF14), CD357 (TNFRSF18) 및 TNF-alpha 단백질을 2 μg/mL의 농도로 코팅된 플레이트에 15E3ZAAD01 및 15E3ZAAD05를 각각 1 μg/mL로 처리하였으며, 2차 항체(anti-hIgG-Fab-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097)를 처리한 후 TMB(BioFXTM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3 PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD450 값을 측정하고, 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다.
도 8a에 나타낸 바와 같이, ZAAD01은 CD137에만 특이적으로 결합하였고, 도 8b에 나타낸 바와 같이, ZAAD05 또한 CD137에만 특이적으로 결합하였다.
상기 결과로부터, 본 발명자들은 선별된 어피바디 두 종, ZAAD01 및 ZAAD05가 TNFRSF(TNF-alpha receptor super family)에 속하는 다른 단백질과 교차반응하지 않음을 확인하였다.
3-3: 선별된 어피바디의 종간 교차반응
선별된 어피바디 두 종, ZAAD01 및 ZAAD05의 CD137에 대한 종(species)간 교차반응을 ELISA를 이용하여 확인하였다.
인간(human) CD137, 마우스(mouse) CD137 및 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey) CD137 단백질이 각각 2 μg/mL의 농도로 코팅된 플레이트에 15E3ZAAD01 및 15E3ZAAD05를 5 μg/mL로 처리하였으며, 2차 항체(anti-hIgG-Fab-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097)를 처리한 후 TMB(BioFXTM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기(Victor X3, PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD450 값을 측정하고, 그 결과를 도 9a 및 9b에 나타내었다.
도 9a에 나타낸 바와 같이, 어피바디 ZAAD01은 인간 및 게잡이 원숭이의 CD137 단백질과 결합하였고, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 어피바디 ZAAD05 또한 인간 및 게잡이 원숭이의 CD137 단백질과 결합하였다.
상기 결과로부터, 선별된 CD137 어피바디 2종 모두 CD137 단백질에 대해 인간 및 게잡이 원숭이에서 종간 교차반응하였음을 확인하였다.
실시예 4. 이중항체의 타겟 단백질 결합 및 EGFR 의존적인 효능 확인
4.1: 이중항체가 두 표적에 동시에 결합하는지 여부 확인
EGFR에 결합하는 항체인 세툭시맙과 15E3, 및 CD137에 결합하는 어피바디인 ZAAD01과 ZAAD05로 구성된, 이중항체 4종인, CET-ZAAD01, CET-ZAAD05, 15E3-ZAAD01, 및 15E3-ZAAD05가 각 타겟 단백질에 동시에 결합하는지 여부를 BLI(BioLayer Interferometry) 법을 이용하여 확인하였다.
AR2G 센서칩(Amine Reactive Second-Generation Biosensor, SATORIUS 주식회사, 18-5092)에 EGFR-ECD-Fc 단백질을 5 μg/mL의 농도로 EDC/NHS를 이용한 아민 커플링 방법으로 고정시켰다. EGFR-ECD-Fc가 고정된 센서칩에 상기 4종의 이중항체를 각 10 μg/mL의 농도로 5분간 결합시키고 5분간 안정화시켰다. 고정된 EGFR 단백질에 이중항체가 결합하고 있는 센서칩에 CD137-ECD-his 단백질을 30 μg/mL의 농도로 첨가하고, 5분간 결합시키고 5분간 안정화시켰다. 결과는 도 10a 내지 10d에 나타내었다. 대조군으로서, CET 또는 15E3를 처리한 경우, 그 결과는 빨간색 선으로 나타내었으며, 본 발명의 4종의 이중항체를 처리한 경우, 그 결과는 파란색 선으로 나타내었다.
도 10a에 나타낸 바와 같이, 대조군으로서 CET를 처리한 후, 센서칩에 CD137-ECD-Fc 단백질을 첨가하였을 때 결합 신호에 변화가 없는 반면(빨간색 선), CET-ZAAD01 이중항체를 처리한 후, 센서칩에 CD137-ECD-Fc 단백질을 첨가하였을 때 결합 신호가 증가하였으며(파란색 선), 이는 CET-ZAAD01 이중항체가 센서칩에 미리 고정된 EGFR 단백질과 나중에 첨가한 CD137-ECD-Fc 단백질에 동시에 결합하는 것을 의미한다.
CET-ZAAD01 이중항체의 결과와 마찬가지로, CET-ZAAD05 이중항체(도 10b), 15E3-ZAAD01 이중항체(도 10c), 및 15E3-ZAAD05 이중항체(도 10d) 또한 센서칩에 CD137-ECD-his 단백질을 첨가하였을 때 결합 신호가 증가하여, 상기 이중항체 또한 EGFR 단백질 및 CD137 단백질에 동시에 결합하는 것을 확인하였다.
4.2: EGFR 발현 수준에 따른 이중항체의 T 세포 활성화
CD137에 대한 어피바디와 EGFR에 대한 항체를 이용한 이중항체가 세포주(cell line)의 EGFR 발현 정도에 따라 T 세포 활성화를 증가시키는지 여부를 조사하였다.
세포주의 EGFR 발현 수준
3종의 EGFR 발현 세포 A431(ATCC, CRL-1555, epidermis, epidermoid carcinoma), HT29(KCLB, 30038, colon, adenocarcinoma) 및 SW403(KCLB, 10230, colon, adenocarcinoma)과 EGFR 음성 세포인 MOLT4(KCLB, 21582, adult T acute lymphoblastic leukemia)를 5×105/튜브로 준비하였다.
그 다음, 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집하고, PBS 중 5% FBS로 수세한 후, 15E3ZAAD01 이중항체를 5 μg/mL 처리하였다. 얼음에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세하였다. 그 다음, anti-human Fc FITC를 1 μg/mL로 세포에 처리하고 빛을 차단한 채로 얼음에서 45분간 인큐베이션하였다. 200 μL의 PBS 중 5% FBS를 이용하여 1,200 rpm에서 3분 동안 원심분리하는 방법으로 세포를 3회 수세한 후, 베크만 쿨터의 FACS 기기를 이용하여 형광의 세기를 측정하고 MFI (Mean Fluorescent Intensity) 값을 얻어, 그 결과를 도 11a에 나타내었다. 세포가 15E3ZAAD01 이중항체와 결합을 많이 할수록 MFI 값은 증가하므로, 세포가 높은 EGFR 발현 수준을 가짐을 나타낸다.
도 11a에 나타낸 바와 같이, EGFR 양성 세포인 A431 세포, HT29 세포 및 SW403 세포와 EGFR 음성 세포인 MOLT4 세포에서 EGFR 발현을 확인한 결과, 세포주 A431, H29, SW403 및 MOLT4 순서대로 101.5, 23.9, 17.1 및 0.9의 MFI 값을 각각 나타내어, 상기 순서로 EGFR의 발현이 많았음을 확인하였다.
이중항체의 EGFR 의존적 T 세포 활성화
위에서 살펴본, EGFR의 발현 정도가 상이한 세포를 이용하여, T 세포 분석(T cell assay)을 진행하였다. 하루 전에 3 μg/mL의 농도로 항-CD3 항체(InvitrogenTM, 16-0037-85)를 96 웰 라운드 플레이트에 50 μL씩 코팅을 진행하였다. 다음 날, 멸균된 PBS를 100 μL 이용하여 수세를 3회 수행하였다. R10 배지를 100 μL 이용하여 수세를 3회 수행하고, R10 배지 100 μL를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 4종류의 세포주, A431, H29, SW403 및 MOLT4를 각 플레이트에 2.4×105/mL이 되도록 50 μL씩 첨가하였다. 15E3ZAAD01 이중항체를 5 μg/mL의 농도로 50 μL로 30분간 처리하였다.
그 사이에, 두 명의 공여자로부터 제공받은 혈액을, PBS로 1/2 희석한 후에, 피콜(Ficoll®, GE healthcare, 17-1440-12)을 띄운 류코셉 튜브(Leucosep tube, Greiner Bio-One 유한회사, 227290)에 넣고, 1,000 g에서 30분간 원심분리하였다.
피콜 위에 자리한 PBMC의 층만을 따내었다. PBS 중 2% PBMC를 이용하여 300 g에서 10분간 원심분리를 하는 수세 작업을 두 번 반복한 후에, PBMC의 수를 측정하였다. PBMC를 CD8+ T 세포 분리 키트(CD8+ T cell isolation kit, Miltenyi Biotec Inc., 130-096-495)의 프로토콜에 따라 CD8+ T 세포를 준비하였다.
CD8+ T 세포의 수를 측정하여 1.4×106/mL이 되도록 R10 배지로 풀어준 후에, 15E3ZAAD01 이중항체가 처리된 플레이트에 50 μL의 양으로 처리하였다. 처리 3일 후에 플레이트를 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하고, 이를 이용하여, IFN-γ 측정 키트(BD Biosciences, 555142)의 프로토콜을 따라 IFN-γ의 농도를 측정하였다. 본 발명의 이중항체가 EGFR 발현 수준에 따라 T 세포를 활성화하는지 여부를 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량을 통해 확인하였고, 그 결과는 도 11b에 나타내었다.
도 11b에 나타낸 바와 같이, T 세포 활성화 분석을 통해 EGFR의 발현이 증가함에 따라 IFN-γ의 농도가 증가하므로, EGFR 발현 증가에 따라 T 세포 활성이 증가함을 확인하였다.
구체적으로, IFN-γ 분비량이 많은 순서는 위에서 살펴본 EGFR 발현량이 많은 순서와 일치하였다. 구체적으로, 세포주 A431, H29, SW403 및 MOLT4 순서대로 5.9, 2.2, 1.9 및 1.0의 IFN-γ 농도 배수(fold) 값을 각각 나타내어, 상기 순서로 IFN-γ의 농도가 높았음을 확인하였다.
본 발명자들은 상기 결과로부터, EGFR 발현 정도에 따른 15E3-ZAAD01 이중항체의 EGFR 의존적 T 세포 활성화를 확인하였고, 이는 EGFR 발현 정도에 따른 이중항체의 T세포 활성화 정도가 EGFR 발현양과 상관관계가 있음을 나타낸다.
본 발명에 따른 EGFR 항체-기반 CD137 어피바디 이중항체를 이용하는 경우, 과도한 EGFR 발현량을 나타내는 암 세포 및 조직에 CD137을 발현하는 T 세포가 가까이 위치하여 결합하고, 활성화될 수 있으므로, EGFR을 과발현하는 다양한 암 유형에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 5. CD137 어피바디 기반 다양한 항원 표적 이중항체의 개발 가능성 - HER2 및 CD19
본 발명자들은 상기 결과로부터 암 특이적 표적 단백질로서 EGFR뿐만 아니라, 다른 암 또는 종양 특이적 표적 단백질에 대한 항체-기반 CD137 어피바디 이중항체를 이용하여, T 세포를 활성화할 수 있는지 여부를 아래와 같이 확인하고자 하였다.
5.1: 표적 단백질, HER2 또는 CD19에 대한 결합 확인
선별된 CD137에 대한 어피바디, ZAAD01을 기반으로, EGFR 이외의 다른 단백질인 HER2 및 CD19와 결합하는 항체를 각각 이용하여 이중항체 형태로 클로닝하였다. HER2 항체 및 CD137 어피바디로 구성된 이중항체는 anti-HER2 Ab1-ZAAD01 및 anti-HER2 Ab2-ZAAD01으로 표기하였고, CD19 항체 및 CD137 어피바디로 구성된 이중항체는 anti-CD19 Ab-ZAAD01으로 표기하였다.
구체적으로, anti-HER2 Ab1-ZAAD01에서, anti-HER2 Ab1은 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 트라스투주맙(trastuzumab)이고, anti-HER2 Ab2-ZAAD01에서 anti-HER2 Ab2은 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 자체적으로 개발한 hz1E11.10 항체(국내 공개특허 제10-2017-0117330호, 참조)이다.
상기 anti-HER2 Ab은 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
구체적으로, anti-CD19 Ab-ZAAD01에서 anti-CD19 Ab는 인간 CD19에 특이적으로 결합하는 FMC63이다.
상기 anti-CD19 Ab은 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.
동물세포를 이용하여 상술한 이중항체를 생산하였다. 정제된 이중항체의 형태로 단백질의 결합 및 T 세포 활성화 테스트를 통해, 본 발명의 CD137 어피바디가 모듈 형식으로 다양한 다른 항원을 표적으로 하는 이중항체로 개발되어 실질적으로 사용될 수 있는지의 가능성을 살펴보았다.
ELISA는 2 μg/mL의 농도로 CD137 단백질과 각 항체의 타겟 단백질에 맞게 hHer2-ECD-Fc 단백질과 hCD19-ECD-Fc 단백질이 코팅된 플레이트에 정제된 상술한 이중항체를 60 nM부터 1/5 희석하여 7 포인트로 처리하였으며, 2차 항체(anti-hIgG-Fab-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., JAC-109-035-097)를 처리한 후 TMB(BioFXTM, TMBC-1000-01)로 발색반응을 발생시켜 ELISA 리더기 (Victor X3, PerkinElmer, Inc.)를 이용하여 OD450 값을 측정하였고, 그 결과는 도 12a 내지 12d에 나타내었다.
도 12a 내지 12d에 나타낸 바와 같이, CD137 어피바디와 HER2 항체 또는 CD19 항체를 이용하여 생산된 이중항체가 CD137과 HER2 또는 CD19에 각각 결합하였다.
구체적으로, 음성 대조군(hIgG) 대비 항-HER2-항체 및 ZAAD01 어피바디로 구성된, anti-HER2 Ab1-ZAAD01 및 anti-HER2 Ab2-ZAAD01 이중항체 모두 표적 단백질인 CD137(도 12a) 및 HER2(도 12b)에 대한 결합이 농도 의존적으로 각각 증가하였다.
또한, 음성 대조군 대비 항-CD19-항체 및 ZAAD01 어피바디로 구성된, anti-CD19 Ab-ZAAD01 이중항체의 표적 단백질인 CD137(도 12c) 및 CD19(도 12d)에 대한 결합이 농도 의존적으로 각각 증가하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 이중항체 anti-HER2 Ab1-ZAAD01 및 anti-HER2 Ab2-ZAAD01은 CD137 및 HER2 단백질에 모두 결합하는 것을 확인하였고, 본 발명의 이중항체 anti-CD19 Ab-ZAAD01은 CD137 및 CD19 단백질에 모두 결합하는 것을 확인하였다.
5.2: 표적 단백질 의존적-T 세포 활성화 테스트
위에서 살펴보았듯이, 각 표적 단백질에 모두 결합하는 것을 확인한, 생산된 이중항체를 이용하여, 확장된 다른 단백질, 즉 HER2 또는 CD19에 의존적인 T 세포 활성화 테스트를 수행하여, 이중항체의 효능을 확인하였다.
테스트 방법
하루 전에 3 μg/mL의 농도로 항-CD3 항체(Invitrogen, 16-0037-85)를 96 웰 라운드 플레이트에 50 μL씩 코팅하였다. 다음 날, 멸균된 PBS를 100 μL 이용하여 수세를 3회 수행하였다. 5 μg/mL 농도의 HER2 또는 CD19를 다시 50 μL씩 코팅하고 대조군으로 단백질이 없는(HER2 또는 CD19 처리하지 않음) 웰에는 PBS만 처리한 다음, 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. R10 배지를 100 μL 이용하여 수세를 3회 수행하였고, R10 배지 100 μL를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 플레이트에 있는 R10 배지를 완전히 제거하고, 상기 이중항체를 5 μg/mL의 농도로 50 μL로 30분간 처리하였다.
그 사이에, 두 명의 공여자로부터 제공받은 혈액을, PBS로 1/2 희석한 후, 피콜(Ficoll®, GE healthcare, 17-1440-12)을 띄운 류코셉 튜브(Leucosep tube, Greiner Bio-One 유한회사, 227290)에 넣은 후, 1,000 g에서 30분간 원심분리하였다. 피콜 위에 자리한 PBMC의 층만을 따내었다. PBS 중 2% PBMC를 이용하여 300 g에서 10분간 원심분리를 하는 수세 작업을 2회 반복한 후에, PBMC의 수를 측정하였다.
PBMC를 CD8+ T 세포 분리 키트(CD8+ T cell isolation kit, Miltenyi Biotec Inc., 130-096-495)의 프로토콜에 따라 CD8+ T 세포를 준비하였다. CD8+ T 세포의 수를 측정하여 1.4×106/mL이 되도록 R10 배지로 풀어준 후, 상기 이중항체가 처리된 플레이트에 50 μL의 양으로 처리하였다. 처리하고 3일 후에 플레이트를 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하고, 이를 이용하여, IFN-γ 측정 키트(BD Biosciences, 555142)의 프로토콜을 따라 IFN-γ의 농도를 측정하고, 그 결과를 도 13a 및 13b에 나타내었다. 음성 대조군으로서, CD137에 대한 단일클론 항체인 유토밀루맙을 사용하였다.
테스트 결과
도 13a 및 13b에 나타낸 바와 같이, CD137 어피바디와 HER2 항체 또는 CD19 항체를 이용하여 생산된 이중항체(anti-HER2 Ab1-ZADD1, anti-HER2 Ab1-ZADD1 및 anti-CD19 Ab-ZADD1)가 HER2 또는 CD19 단백질에 의존적으로 T 세포를 활성화하였음을 IFN-γ 분비량이 증가하였음을 통해 확인하였다.
구체적으로, 도 13a에서 CD137에 대한 단일클론 항체인 유토밀루맙을 처리한 경우, HER2 유무에 상관없이 IFN-γ 가 CD8+ T 세포로부터 거의 분비되지 않았다. 이중항체 anti-HER2 Ab1-ZAAD01 (트라스투주맙-ZAAD01) 및 anti-HER2 Ab2-ZAAD01 (hz1E11.10-ZAAD01)를 처리한 경우, HER2를 처리하지 않았을 때(no HER2) 대비 HER2를 처리하였을 때(HER2) CD8+ T 세포는 유의하게 증가된 IFN-γ 분비량을 나타내었다.
또한, 도 13b에서 CD137에 대한 단일클론 항체인 유토밀루맙을 처리한 경우, CD19 유무에 따른 CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량에 유의한 차이가 없었다. 이중항체 anti-CD19 Ab-ZAAD01 (FMC63- ZAAD01)를 처리한 경우, CD19를 처리하지 않았을 때(no CD19) 대비 HER2를 처리하였을 때(CD19) CD8+ T 세포는 유의하게 증가된 IFN-γ 분비량을 나타내었다.
본 발명자들은, IFN-감마 분비량 분석을 통해, 항-HER2 항체 또는 항- CD19 항체 및 ZAAD01 어피바디로 구성된, 이중항체가 각각의 표적 항체, HER2 또는 CD19에 의존적으로 T 세포를 활성화하였음을 확인하였다.
특히, 이러한 결과는 확장된 다른 표적 단백질인 HER2 또는 CD19에 따른 T 세포 활성화의 유무를 IFN-γ의 측정을 통해 확인한 것으로, 본 발명에 따른 CD137 어피바디를 모듈 형식으로 이용하는 경우, 본 발명에 개시된 표적 단백질인 EGFR, HER2 및 CD19 뿐만 아니라, 상기 표적 단백질과 상이한, 다양한 표적 단백질에 적용 가능함을 제시하는 결과이다.
따라서, 본 발명의 개시사항으로부터 당업자라면, 특정 암 세포에 특이적으로 발현하는/존재하는 표적 단백질에 대한 항체와 본 발명의 CD137 어피바디로 구성된, 이중 항체를 구성함으로써, CD137의 면역조절적(immunomodulatory) 접근 방법을 통해, 다양한 유형의 암에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 이해할 것이다.
결국, 본 발명의 CD137 어피바디, 또는 CD137 어피바디 및 암 세포 특이적 표적 단백질에 대한 항체로 구성된 이중항체를 이용하면, CD137을 발현하는 다양한 항원제시세포(antigen-presenting cell, APC)를 통한, 예를 들어, NK(natural killer) 세포의 ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) 또는 DC(dendritic cell)의 T 세포 활성화 등을 통한, 다양한 유형의 암에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 6. EGFR-CD137 타겟 이중항체의 T 세포의 활성 및 세포 사멸확인
본 발명자들은 EGFR 및 CD137을 동시에 타겟하는 이중항체의 T 세포 활성 및 세포 사멸 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 시험을 수행하였다. 본 실시예에서 사용된 이중항체(CET_ZAAD01 및 CET-ZAAD05)는 EGFR을 타겟하는 Cetuximab 및 본 발명의 CD137을 타겟하는 어피바디 ZAAD01 또는 ZAAD05의 융합단백질이다.
anti-CD3 항체(Invitrogen,16-0037-85)를 이중항체 처리 하루 전에 5 ug/mL의 농도로 웰 당 50 uL씩 96 웰 라운드 플레이트에 분주하여 코팅하였다. 다음 날 R10 media 100 uL를 처리한 다음, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 블로킹을 진행하였다. DLD-1-Luc 세포들을 각 plate에 1.0 X 105/mL이 되게 50 uL씩 넣어준 다음 10 nM의 농도부터 1/10로 희석하여 준비한 이중항체(CET_ZAAD01 및 CET-ZAAD05)를 well 당 50 uL씩 처리하였다. 그 사이에 공여자로부터 제공받은 혈액을, PBS로 1/2 dilution한 후에, Picoll(GE healthcare, 17-1440-12)을 띄운 Leucosep tube(greiner bio-one,227290)에 넣고 1000 x g, 30분간 원심 분리를 진행하였다. Picoll 위에 자리한 PBMC 층만 분리한 다음 PBMC 10 mL을 2% FBS를 포함한 PBS 40mL과 섞고 300 x g, 10분간 원심 분리를 하는 washing 작업을 두 번 반복한 후에, PBMC의 수를 측정하였다. PBMC를 1.0 X 105/mL이 되게 R10 media로 풀어준 후에, 이중항체가 처리된 plate에 50 uL의 양으로 처리하였다. 처리하고 3일 후에 Plate를 2000RPM, 10 분간 원심 분리하여 상층액을 취하고, 이를 이용하여, IFN-gamma 측정 kit (BD, 555142)를 사용하여 IFN-gamma 양을 측정하였다. 남은 세포와 배지가 있는 well에 50 uL의 용해 버퍼(75 mM Tris(pH8.0) 30 % glycerol, 3% tritonX-100)를 넣고 잘 섞어준 후에 상온에 15 분 간 두었다. 세포와 용해 버퍼의 혼합물 50 uL를 96 well white plate로 옮긴 후, 동량의 5'-fluoroluciferin (Bio-Glo™ Luciferase Assay System, promea / G7940) 를 넣어주고 상온에 15 분 간 정치 후, ELISA 리더기를 통해 luminescence를 측정하였다.
결과는 도 14a 및 도 14b에 나타내었다.
도 14a 및 도 14b 에 나타낸 바와 같이 이중항체에 의한 면역세포의 활성으로 DLD1-Luc 세포의 사멸을 확인하였고, 동시에 IFN-gamma의 농도 증가를 확인하였다.
실시예 7: 동물모델을 이용한 EGFR-CD137 타겟 이중항체의 항암 효능 확인
인간화 CD137 마우스 모델을 이용하여 EGFR 및 CD137을 타겟하는 이중항체(CET_ZAAD01 및 CET-ZAAD05)의 효능을 확인하였다.
EGFR/MC38 세포를 5.0 X 105/mL 개체가 되도록 PBS로 준비해주고, 인간화 CD137 마우스의 옆구리에 피하주사를 진행하여 인공적으로 암형성을 유도하였다. 암의 크기가 약 100 mm3 이 되었을 시기에 디자인한대로 5마리씩 무작위로 그룹핑을 하였다. Cetuximab 또는 EGFR-CD137 타겟 이중항체(CET_ZAAD01 및 CET-ZAAD05)를 5mpk의 농도가 되도록 PBS로 희석한 다음 복강주사로 1주에 2번씩 총 5회 투여를 하였다. 암의 크기와 무게는 주 3회 측정하였고, 암의 크기는 디지털 버니어캘리퍼스를 통해 측정하였다. 암의 크기가 2500 mm3를 초과하였을 때는 안락사를 진행하였다.
결과는 도 15 및 도 16a 내지 도 16d에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 이중항체 2종(CET_ZAAD01 및 CET-ZAAD05)은 마우스의 생존연장 효과를 나타내었다.
또한, 도 16a 내지 도 16d에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 이중항체는 암의 크기를 감소시킴을 확인하였다.
반면, vehicle과 Cetuximab 처리군에서는 암의 크기가 계속 증가하는 추세를 확인하였고, 이중항체 2종(CET_ZAAD01 및 CET-ZAAD05)에서는 암의 크기가 억제되며, 사멸시키는 결과를 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

Claims (20)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 8 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디(affibody).
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD137은 인간 또는 게잡이 원숭이(cynomolgus monkey) 유래의 CD137인 것인, 어피바디.
  3. 제1항에 있어서, 상기 어피바디의 CD137 세포외 도메인에 대한 결합 부위는 서열번호 27의 아미노산 서열의 64번째 내지 95번째 아미노산 잔기 사이에 위치하는 것인, 어피바디.
  4. 제1항의 어피바디를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인, 핵산 분자.
  6. 제4항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제6항의 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포.
  8. 제1항의 어피바디 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암은 혈액암 또는 고형암인 것인, 약제학적 조성물
  10. 다음을 포함하는 단백질 복합체(protein complex):
    제1항에 따른 CD137의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 어피바디; 및
    암 세포 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 상기 암 세포 표면 상의 단백질은 EGFR(epidermal growth factor receptor), HER2(human epidermal growth factor receptor 2), 또는 CD19(cluster of differentiation 19)인 것인, 단백질 복합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 것인, 단백질 복합체:
    (a) 세툭시맙(cetuximab); 또는
    (b) 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역.
  13. 제12항에 있어서, 상기 (b)는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인, 단백질 복합체.
  14. 제11항에 있어서, 상기 HER2에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 것인, 단백질 복합체:
    (c) 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
    (d) 트라스투주맙(trastuzumab); 또는
    (e) 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3를 포함하는 경쇄가변영역.
  15. 제14항에 있어서, 상기 (e)는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는 것인, 단백질 복합체.
  16. 제11항에 있어서, 상기 CD19에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체 또는이의 항원 결합 단편은 다음을 포함하는 것인, 단백질 복합체:
    (f) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는
    (g) FMC63.
  17. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 복합체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  18. 제17항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  19. 제18항의 재조합 벡터를 포함하는, 분리된 숙주세포.
  20. 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 복합체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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