WO2022055299A1 - 인터루킨-4 수용체 알파 서브유닛과 인터루킨-5 수용체 알파 서브유닛에 동시에 결합하는 이중특이항체 및 이의 용도 - Google Patents

인터루킨-4 수용체 알파 서브유닛과 인터루킨-5 수용체 알파 서브유닛에 동시에 결합하는 이중특이항체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2022055299A1
WO2022055299A1 PCT/KR2021/012344 KR2021012344W WO2022055299A1 WO 2022055299 A1 WO2022055299 A1 WO 2022055299A1 KR 2021012344 W KR2021012344 W KR 2021012344W WO 2022055299 A1 WO2022055299 A1 WO 2022055299A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
antibody
light chain
heavy chain
antigen
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/012344
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김용성
박해심
김정은
정근옥
이동현
Original Assignee
아주대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아주대학교산학협력단 filed Critical 아주대학교산학협력단
Priority to EP21867164.2A priority Critical patent/EP4212550A1/en
Priority to US18/024,143 priority patent/US20230357415A1/en
Publication of WO2022055299A1 publication Critical patent/WO2022055299A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention provides an anti-IL-4R ⁇ /anti-IL-5R ⁇ bispecific antibody ( bispecific antibody), a multispecific antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the bispecific antibody, a nucleic acid encoding the same, a vector comprising the nucleic acid, a cell transformed with the vector, the bispecific antibody or its Methods for preparing antigen-binding fragments, and therapeutic uses thereof, for example, for the prevention of allergic diseases, inflammatory diseases and/or diseases caused by an increase in eosinophils associated with IL-4, IL-13 and/or IL-5; It relates to a composition for treatment, and a composition for diagnosing allergic diseases, inflammatory diseases and/or diseases caused by an increase in eosinophils.
  • T-cells In allergic diseases such as asthma and inflammatory diseases, various types of cytokines are activated by immune cells [T-cell, B-cell, mast cell, eosinophil, It has the characteristic of causing chronic inflammation by stimulating basophils, neutrophils, etc.].
  • T-cells are classified into naive T-cells that have not yet met antigens, mature effector T-cells (helper T-cells, cytotoxic T-cells, NK T-cells) that meet antigens, and memory T-cells.
  • Helper T-cell T h cell
  • T h cells are further classified into T h 1, T h 2, T h 17, T reg , and the like according to detailed functions. Among them, T h 2 cells typically secrete interleukin (IL)-4, IL-5, and IL-13.
  • IL interleukin
  • IL-4 is the only cytokine capable of inducing differentiation from T h 0 cells to T h 2 cells. Activated T h 2 cells produce additional IL-4 through autocrine (autocrine) action, so the body exhibits an inflammatory response due to Th2 overproduction. In addition, IL-4 causes B-cells to produce IgE and induces an inflammatory response by attaching IgE to the surface of mast cells and basophils.
  • IL-13 like IL-4, is a cytokine that plays an important role in IgE production and T h 2-mediated inflammatory response.
  • IL-13 and IL-4 share a receptor and have a function in common with IL-4.
  • IL-4 is involved in the inflammatory response through a signaling mechanism mediated by receptors composed of Type I (IL-4 R ⁇ , ⁇ c) and Type II (IL-4 R ⁇ , IL-13R ⁇ 1).
  • IL-13 is a receptor composed of Type II (IL-4 R ⁇ , IL-13R ⁇ 1, or IL-13R ⁇ 2). These receptors are expressed in most immune cells such as T cells, B cells, eosinophils, and mast cells.
  • IL-13's unique functions include goblet cell hyperplasia and smooth muscle contractility in the respiratory tract.
  • Dupilumab (Regeneron Pharmaceuticals Inc., U.S. Patent No. 7,605,237, Korean Patent No. 10-1474227) targets IL-4R ⁇ , which is commonly involved in IL-4 and IL-13 signal transduction, to produce two cytokines. can all be detrimental.
  • Dupilumab reduces the level of several inflammatory proteins, including blocking differentiation into T h 2 cells, inhibiting IgE production in B cells, and interfering with eosinophil migration by acting on vascular cells.
  • Dupilumab was effective in patients with atopic dermatitis, asthma, eczema, and eosinophilic esophagitis (Le Floc'h et al., 2020).
  • IL-5 is a cytokine that mainly acts on eosinophils and is involved in overall eosinophil functions such as differentiation, proliferation, and activity of eosinophils.
  • the receptor for IL-5 consists of IL-5R ⁇ and ⁇ c, and IL-5R ⁇ specifically binds to IL-5, and ⁇ c itself does not exhibit IL-5 binding ability and mediates signal transduction.
  • Cells expressing IL-5R ⁇ are limited to eosinophils, basophils, and mast cells. Eosinophils are implicated in various diseases, including allergic diseases, and are known to play an important role in the development of allergic diseases, including chronic bronchial asthma and atopic dermatitis.
  • the anti-IL-5 antibodies mepolizumab and resilizumab have the ability to indirectly reduce the number of eosinophils by inhibiting eosinophil proliferation/survival through IL-5 pathway blockade.
  • An anti-IL-5R ⁇ antibody that targets the IL-5R ⁇ receptor, benralizumab (benralizumab, MedImmune and AstraZeneca, U.S. Patent No. 6,018,032, Korean Patent No. 10-0259828) directly targets eosinophils in the IL-5 pathway In addition to inhibiting cell growth by blocking ., 2010).
  • eosinophils have been studied extensively as target cells for the treatment of allergic/inflammatory diseases, the incidence rate of eosinophils is different for each patient and often overlaps with symptoms caused by inflammatory reactions caused by other immune cells. Therefore, the combination of inhibiting the proliferation and activity of eosinophils through blocking the IL-5 pathway and inhibiting a broader range of Th2 inflammatory responses by blocking the IL-4/IL-13 pathway is more effective in a wide range of patient groups. It may show a high therapeutic effect. This is because several cytokines (typically IL-4, IL-13, IL-5) induce allergic/inflammatory responses in independent pathways.
  • cytokines typically IL-4, IL-13, IL-5
  • the combination of the method of inhibiting the activity of eosinophils by targeting IL-5R ⁇ and the method of inhibiting the activity of T-cells, B-cells, and mast cells by targeting IL-4R ⁇ is recommended for patients with allergic/inflammatory diseases with various symptoms. may be more effective in the treatment of
  • effector cells eg, eosinophils
  • IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ a monoclonal antibody specific for each antigen
  • a bispecific antibody that simultaneously binds to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ grows in effector cells by labeling more with both antigens expressed on the cell surface. It can be effectively eliminated by effectively inhibiting or inducing stronger ADCC.
  • the inventors of the present application developed a bispecific antibody that simultaneously binds to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ , and the therapeutic use thereof for allergic diseases associated with IL-4, IL-13 and/or IL-5 , by confirming the therapeutic or preventive effect of inflammatory diseases and/or diseases caused by an increase in eosinophils, thereby completing the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that simultaneously binds to the IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • Another object of the present invention is to provide a vector comprising the nucleic acid, a cell transformed with the vector, and a method for producing a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that simultaneously binds to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ using the same. .
  • Another object of the present invention is to prevent an allergic disease, an inflammatory disease, and/or a disease caused by an increase in eosinophils containing the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that simultaneously binds to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • a pharmaceutical composition for treatment To provide a pharmaceutical composition for treatment.
  • the present invention also relates to a composition for diagnosing an allergic disease, an inflammatory disease, and/or a disease caused by an increase in eosinophils, comprising the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that simultaneously binds to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ will be.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to interleukin (IL)-4 receptor ⁇ (IL-4R ⁇ , CD124) represented by SEQ ID NO: 65 and interleukin (IL) represented by SEQ ID NO: 66
  • IL interleukin
  • SEQ ID NO: 65 interleukin-4 receptor ⁇
  • IL interleukin
  • SEQ ID NO: 66 interleukin (IL) represented by SEQ ID NO: 66
  • a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to )-5 receptor ⁇ (IL-5R ⁇ , CD125).
  • the present invention also provides a multispecific antibody comprising the bispecific antibody.
  • the present invention also provides IL-4, IL-13, IL-4, IL-13, which have independent functions by acting on various effector cells (eosinophils, T-cells, B-cells, etc.) expressing IL-4R ⁇ or IL-5R ⁇
  • IL-4R ⁇ IL-4R ⁇
  • IL-5R ⁇ IL-5R ⁇
  • a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that simultaneously inhibits IL-5 activity.
  • the present invention also provides the activity of IL-4, IL-13, and IL-5 having overlapping functions by acting on effector cells (eosinophils, mast cells, etc.) expressing both IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • effector cells eosinophils, mast cells, etc.
  • a simultaneous inhibitory bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof is provided.
  • the present invention also binds IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ to target cells expressing both IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ at the same time and uses both antigens expressed on the cell surface to further label each antigen.
  • a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that exhibits a stronger avidity effect than a clonal antibody.
  • the present invention also binds IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ to target cells expressing both IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ at the same time and uses both antigens expressed on the cell surface to further label each antigen.
  • a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof having a stronger cell growth inhibitory effect than a monoclonal antibody.
  • the present invention also binds IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ to target cells expressing both IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ at the same time and uses both antigens expressed on the cell surface to further label each antigen.
  • a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that induces stronger antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) than a monoclonal antibody.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that simultaneously binds to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ , and an expression vector comprising the nucleic acid.
  • the present invention also relates to a cell transformed with the expression vector.
  • the present invention also relates to a method for producing a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that simultaneously binds to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ , comprising the steps of:
  • the present invention also provides for the prevention or treatment of allergic diseases, inflammatory diseases, and/or diseases caused by an increase in eosinophils comprising the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that simultaneously binds to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ It relates to a composition and a composition for diagnosis of these diseases.
  • 1 is a schematic diagram showing a strategy for constructing a library constructed based on 4R34.1.19 to improve the affinity of an anti-IL-4R ⁇ antibody.
  • the library was given to the CDR2 portion of the heavy chain variable region and the CDR3 portion of the light chain variable region.
  • 2A shows the results of indirect ELISA for confirming the specific binding of anti-IL-4R ⁇ antibodies to sIL-4R ⁇ (soluble IL-4R ⁇ ) antigen protein.
  • Figure 2B shows the binding isotherms analyzed for the affinity of the selected anti-IL-4Ra antibodies.
  • 3 is a result of evaluating the degree of SEAP activity by IL-4 dependent STAT6 phosphorylation using HEK-Blue-IL-4/IL-13 cells of affinity-improved anti-IL-4R ⁇ antibodies.
  • 4A shows the results of indirect ELISA for confirming the specific binding of humanized anti-IL-5R ⁇ antibodies to sIL-5R ⁇ (soluble IL-5R ⁇ ) antigen protein.
  • Figure 4B shows the binding isotherms analyzed for the affinity of anti-IL-5R ⁇ humanized antibodies.
  • 5A shows the results of evaluating the IL-5-dependent cell growth inhibition ability of humanized anti-IL-5R ⁇ antibodies in TF-1/IL-5R ⁇ cells compared to benralizumab analogues at various antibody concentrations.
  • Figure 5B is the result of evaluating the eosinophil proliferation inhibitory ability of the humanized anti-IL-5R ⁇ antibody using eosinophils purified from the peripheral blood of healthy donors and patients with severe asthma.
  • Figure 5C is the result of evaluating the ADCC of the humanized anti-IL-5R ⁇ antibody using eosinophils and NK cells purified from the peripheral blood of healthy donors and patients with severe asthma.
  • FIG. 6 shows representative views and characteristics of the three formats for constructing the IL-4 ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody, and the names of the clones constructed.
  • Figure 7A shows a schematic diagram of a bispecific antibody in scIgG format capable of simultaneous binding to IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • FIG. 7B shows a schematic diagram of a recombinant expression vector for expressing the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in scIgG format.
  • Pcmv is the promoter, and the rest indicated the domains of the heavy and light chains.
  • Figure 7C shows a schematic diagram of a bispecific antibody in BsIgG format capable of simultaneously binding to IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • FIG. 7D shows a schematic diagram of a recombinant expression vector for expressing the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in BsIgG format.
  • Pcmv is the promoter, and the rest indicated the domains of the heavy and light chains.
  • the antigen binding sites for IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ and heterodimeric Fc are shown in gray boxes.
  • 8A shows the results of SDS-PAGE analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in scIgG format.
  • FIG. 8B shows the results of Size Exclusion Chromatography (SEC) analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in scIgG format.
  • 8C shows the results of SDS-PAGE analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in BsIgG format.
  • 8D shows the results of SEC analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in BsIgG format.
  • FIG. 9A shows a schematic diagram of a bispecific antibody in the format of an IgG-scFv (specifically 4R-IgG-5R- HL scFv) capable of simultaneously binding to IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • IgG-scFv specifically 4R-IgG-5R- HL scFv
  • FIG. 9B shows a schematic diagram of a recombinant expression vector for expressing IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in 4R-IgG-5R- HL scFv format.
  • Pcmv is the promoter, and the rest indicated the domains of the heavy and light chains.
  • FIG. 9C shows a schematic diagram of a bispecific antibody in the format of an IgG-scFv (specifically 4R-IgG-5R- LH scFv) capable of simultaneously binding IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • IgG-scFv specifically 4R-IgG-5R- LH scFv
  • 9D shows a schematic diagram of a recombinant expression vector for expressing the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 4R-IgG-5R- LH scFv format.
  • Pcmv is the promoter, and the rest indicated the domains of the heavy and light chains.
  • the antigen binding sites for IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ and wild-type Fc are shown in gray boxes.
  • 10A shows the results of SDS-PAGE analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 4R-IgG-5R- HL scFv format.
  • 10B shows the results of SEC analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 4R-IgG-5R- HL scFv format.
  • 10C shows the results of SDS-PAGE analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 4R-IgG-5R- LH scFv format.
  • 10D shows the results of SEC analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 4R-IgG-5R- LH scFv format.
  • 11A shows a schematic diagram of a bispecific antibody in the format of an IgG-scFv (specifically 5R-IgG-4R- HL scFv) capable of simultaneously binding IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • IgG-scFv specifically 5R-IgG-4R- HL scFv
  • 11B shows a schematic diagram of a recombinant expression vector for expressing IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in 5R-IgG-4R- HL scFv format.
  • Pcmv is the promoter, and the rest indicated the domains of the heavy and light chains.
  • 11C shows a schematic diagram of a bispecific antibody in the format of an IgG-scFv (5R-IgG-4R- LH scFv) capable of simultaneously binding to IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • 11D shows a schematic diagram of a recombinant expression vector for expressing IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in 5R-IgG-4R- LH scFv format.
  • Pcmv is the promoter, and the rest indicated the domains of the heavy and light chains.
  • the antigen binding sites for IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ and wild-type Fc are shown in gray boxes.
  • 12A shows the results of SDS-PAGE analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 5R-IgG-4R- HL scFv format.
  • 12C shows the results of SDS-PAGE analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 5R-IgG-4R- LH scFv format.
  • 12D shows the results of SEC analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 5R-IgG-4R- LH scFv format.
  • FIG. 13 shows the results of SDS-PAGE analysis according to the antibody sequence of the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 5R-IgG-4R- LH scFv format.
  • 15A presents a schematic diagram of a 4R-LL-5R bispecific antibody format capable of simultaneous binding to IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • 15B shows a schematic diagram of a recombinant expression vector for expressing the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 4R-LL-5R format.
  • Pcmv is the promoter, and the rest indicated the domains of the heavy and light chains.
  • Figure 15C presents a schematic diagram of a bispecific antibody in the 4R-SL-5R format capable of simultaneously binding to IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ .
  • 15D shows a schematic diagram of a recombinant expression vector for expressing the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in 4R-SL-5R format.
  • Pcmv is the promoter, and the rest indicated the domains of the heavy and light chains.
  • the antigen binding sites for IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ and wild-type Fc are shown in gray boxes.
  • 16A shows the results of SEC analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 4R-LL-5R format.
  • 16B shows the results of SDS-PAGE analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 4R-SL-5R format.
  • 16C shows the results of SEC analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 4R-SL-5R format.
  • Figure 17A shows a schematic of a 5R-LL-4R bispecific antibody format capable of simultaneously binding IL-4 ⁇ and IL-5Ra.
  • 17B shows a schematic diagram of a recombinant expression vector for expressing IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in 5R-LL-4R format.
  • Pcmv is the promoter, and the rest indicated the domains of the heavy and light chains.
  • Figure 17C presents a schematic diagram of a bispecific antibody format in the 5R-SL-4R format capable of binding to IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ simultaneously.
  • 17D shows a schematic diagram of a recombinant expression vector for expressing the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 5R-SL-4R format.
  • Pcmv is the promoter, and the rest indicated the domains of the heavy and light chains.
  • the antigen binding sites for IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ and wild-type Fc are shown in gray boxes.
  • 18A shows the results of SEC analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in 5R-LL-4R format.
  • 18B shows the results of SEC analysis confirming the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 5R-SL-4R format.
  • 19 shows the results of SDS-PAGE analysis according to the antibody sequence of the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the 4R-SL-5R format.
  • Figure 21 shows the sIL-4 ⁇ and sIL- of the anti-IL-4 ⁇ antibody, the anti-IL-5R ⁇ antibody, and three types of bispecific antibodies in different formats (BsIgG, 5R-IgG-4R- LH scFv, 4R-SL-5R); It shows the evaluation of 5R ⁇ antigen-binding ability by indirect ELISA.
  • FIG. 22 shows the expression levels of IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ of eosinophils by analyzing a layer of granulocytes (neutrophils + eosinophils) isolated from peripheral blood of healthy donors using a flow cytometer. The analysis result is shown.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • a new anti-IL-5R ⁇ humanized antibody was developed by performing mouse immunization and humanization.
  • antibody-dependent cytotoxicity antibody- A novel bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that induces dependent cell cytotoxicity (ADCC) was identified.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to interleukin (IL)-4 receptor ⁇ (IL-4R ⁇ , CD124) represented by SEQ ID NO: 65 and interleukin (IL) represented by SEQ ID NO: 66 It relates to an IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to )-5 receptor ⁇ (IL-5R ⁇ , CD125).
  • IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in various formats capable of simultaneously binding to two or more antigenic proteins were constructed and expressed.
  • bispecific antibody refers to a protein capable of binding to two different types of antigens (target proteins). Specifically, it does not exist in nature, and it is preferable that it is a form manufactured by genetic engineering or any method.
  • the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof may bind to IL-4R ⁇ expressed in T-cells, B-cells, endothelial cells, etc. and IL-5R ⁇ expressed in eosinophils, basophils, and mast cells.
  • the "bispecific antibody” of the present invention may be used interchangeably with "dual-targeting antibody", “dual antibody” or “dual antibody protein”.
  • the bispecific antibody of the present invention can use IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ as antigens.
  • the form of the bispecific antibody of the present invention is not particularly limited thereto, but includes a form constructed based on the IgG form.
  • the bispecific antibody refers to a molecule in which an antigen-binding site is linked directly or through a linker or can form a heterodimer by electrostatic interaction.
  • Valid refers to the presence of a specified number of binding sites specific for an antigen in a molecule.
  • the terms “monovalent”, “bivalent”, “tetravalent”, and “hexavalent” refer to the presence of 1, 2, 4, and 6 binding sites, respectively, that are specific for an antigen in a molecule. do.
  • a “bispecific anti-IL-4 ⁇ /IL-5 ⁇ antibody” refers to a bispecific antibody having a domain that specifically binds IL-4 ⁇ and a domain that specifically binds IL-5 ⁇ .
  • the domains that specifically bind IL-4 ⁇ and IL-5 ⁇ are typically VH/VL pairs, and the bispecific anti-IL-4 ⁇ /IL-5 ⁇ antibody is a VH/VL pair that binds IL-4 ⁇ and IL-5 ⁇ . Depending on the type, it can be divided into one or two.
  • the present invention includes a multispecific antibody comprising the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • a multispecific antibody refers to an antibody having binding specificities for at least three different antigens.
  • a multi-specific antibody is a tri-specific antibody or more, for example, a tri-specific antibody, a tetra-specific antibody, or a target that targets more. may include antibodies.
  • antibody refers to a protein molecule serving as a receptor that specifically recognizes an antigen, including an immunoglobulin molecule having immunological reactivity with a specific antigen, multispecific antibody, monoclonal antibody, Includes both whole antibodies and antibody fragments.
  • the term also includes forms produced by genetic engineering such as chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and heterologous antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • a full-length antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the full-length antibody includes IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and IgG is a subtype, and may include IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4.
  • the antibody may include monovalent, bivalent, diabody, triabody, and tetrabody.
  • the antibody may be a multispecific antibody, a monoclonal antibody, including a murine, human, human-adapted, humanized and chimeric monoclonal antibody, an antibody fragment, a bispecific or multispecific antibody, a dimeric, tetrameric, or immunoglobulin molecules, including multimeric antibodies, and single chain antibodies.
  • the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof includes an antibody that specifically binds to IL-4R ⁇ in the form of immunoglobulin (Immunoglobulin G, IgG) and a full-length antibody that specifically binds to IL-5R ⁇ , Fab', F ( Proteins in the form of ab')2, Fab, Fv, rIgG or single chain Fv (scFv) may be linked by a linker, or may be an IgG-type antibody applied with heterodimeric Fc-based technology. ((Choi et al., 2013); Korean Patent Registration No. 10-1522954).
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region of the IL-4R ⁇ -binding antibody and the IL-5R ⁇ -binding antibody are heterogeneous.
  • It may include an IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody format or antigen-binding fragment thereof, which is a DVD (dual variable domain) IgG format including a format in which the heavy chain variable region and light chain of an antibody are juxtaposed.
  • a complete antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain connected to the heavy chain by a disulfide bond.
  • the term “heavy chain” refers to a full-length heavy chain comprising a variable region domain VH comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and three constant region domains CH1, CH2 and CH3. and fragments thereof.
  • the term “light chain” refers to a full-length light chain comprising a variable region domain VL and a constant region CL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen, and fragments thereof. all means
  • the whole antibody includes subtypes of IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, in particular, IgG includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ and epsilon ( ⁇ types) ) and alpha2 ( ⁇ 2)
  • the constant region of the light chain has kappa ( ⁇ and lambda ( ⁇ types).
  • Antigen-binding fragment or antibody fragment of an antibody refers to a fragment having an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab')2 and Fv.
  • Fab has a structure having variable regions of light and heavy chains, constant regions of light chain and first constant region (CH1) of heavy chain, and has one antigen-binding site.
  • Fab' differs from Fab in that it has a hinge-region comprising one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain.
  • F(ab')2 is formed when a cysteine residue in the hinge region of Fab' forms a disulfide bond.
  • Fv corresponds to the smallest antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • double-chain Fv two-chain Fv
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a non-covalent bond
  • single-chain Fv scFv
  • scFv single-chain Fv
  • antibody fragments can be prepared by using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the intact antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2), or by genetic recombination technology. can be produced using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the intact antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2), or by genetic recombination technology. can be produced using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the intact antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2), or by genetic recombination technology. can be produced using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the intact antibody with papain to obtain Fab, and by digestion with pepsin to obtain F(ab')2), or by genetic recombination technology. can be produced using proteolytic enzymes (for example, by restriction digestion of the intact antibody with papain to obtain
  • a “single chain Fv (scFv)” antibody fragment is a construct consisting of a single polypeptide chain comprising the VH and VL domains of an antibody. It may further comprise a polypeptide linker between the VH domain and the VL domain that enables the scFv to form the desired structure for antigen binding.
  • a “Fab” fragment comprises the variable and constant domains of a light chain and the variable and first constant domains (CH1) of a heavy chain.
  • F(ab')2 antibody fragments generally comprise a pair of Fab' fragments covalently linked by cysteines in the hinge region present at the C-terminus of the Fab' fragment.
  • the antibody of the present invention is a monoclonal antibody, multispecific antibody, human antibody, humanized antibody, chimeric antibody, scFv, Fab fragment, F(ab')2 fragment, disulfide-bonded Fvs (sdFv) and anti-idiotypic (anti-Id) antibodies, or epitope-binding fragments of such antibodies, and the like.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma ( ⁇ mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ or epsilon ( ⁇ ).
  • the constant region is gamma 1 (IgG1), gamma 2 (IgG2), gamma 3 (IgG3) or gamma 4 (IgG4)
  • the light chain constant region may be kappa or lambda type.
  • the monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, i.e., the individual antibodies occupying the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in trace amounts. Monoclonal antibodies are highly specific, being directed against a single antigenic site. In contrast to conventional (polyclonal) antibodies, which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen.
  • monoclonal antibodies useful in the present invention may be prepared by the hybridoma method, or may be prepared using recombinant DNA methods in bacterial, eukaryotic or plant cells.
  • monoclonal antibodies can be isolated from phage antibody libraries.
  • Epitope refers to a protein determinant to which an antibody can specifically bind. Epitopes are usually composed of a group of chemically active surface molecules, such as amino acids or sugar side chains, and generally have specific three-dimensional structural characteristics as well as specific charge properties. Conformational and non-steric epitopes are distinguished in that binding to the former is lost but not to the latter in the presence of a denaturing solvent.
  • IL-4R ⁇ has been reported to be expressed in several types of effector cells, such as T-cells, B-cells, mast cells, eosinophils, and endothelial cells.
  • IL-5R ⁇ is limitedly expressed only in eosinophils, basophils, and mast cells. Therefore, bispecific antibodies that bind to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ can not only bind to and act on various effector cells expressing IL-4R ⁇ or IL-5R ⁇ , but also act on both antigens (IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ ). These all show a stronger binding effect (avidity) to the expressed eosinophils, basophils, and mast cells, and can bind specifically.
  • T-cells, B-cells, eosinophils, basophils, mast cells, and other effector cells that exhibit inflammatory responses, such as differentiation, growth, migration, and secretion of toxic proteins are induced by cytokines.
  • cytokines have overlapping functions or have their own unique functions to induce an inflammatory response. Therefore, even if the action of one cytokine is inhibited, another cytokine can activate effector cells.
  • the bispecific antibody binding to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ simultaneously inhibits Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13), thereby simultaneously blocking multiple pathways causing an inflammatory response.
  • dupilumab an FDA-approved antibody, dupilumab
  • dupilumab an FDA-approved antibody, dupilumab
  • the number of eosinophils in the peripheral blood of patients receiving dupilumab increased. This is believed to be because dupilumab inhibited the migration of eosinophils by acting on endothelial cells.
  • the bispecific antibody binding to IL-5R ⁇ and IL-4R ⁇ inhibits the proliferation and activity of eosinophils by blocking the IL-5 pathway and by blocking the IL-4/IL-13 pathway, a broader range of Th2 inflammatory responses. Combining suppression may show a higher therapeutic effect in a wide range of patient groups.
  • bispecific antibodies binding to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ can induce stronger antibody-dependent cytotoxicity against eosinophils, basophils, and mast cells expressing both antigens (IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ ). .
  • the antibody binding to IL-4R ⁇ and the antibody binding to IL-5R ⁇ have the ability to bind IL-4R ⁇ of SEQ ID NO: 65 and IL-5R ⁇ of SEQ ID NO: 66.
  • affinity refers to the ability to specifically recognize and bind to a specific site of an antigen, and a high degree of affinity together with specificity for an antigen of an antibody is an important factor in an immune response.
  • the affinity constant (K D ) may be determined using surface plasmon resonance (SPR), for example, BIAcore, bio-layer interferometry. Surface plasmon resonance data yields a 1:1 Langmuir binding model (at the same time k on k off ) and an affinity constant (K D ) calculated from the ratio of the rate constant k off /k on .
  • the binding affinity of the bispecific antibody according to the present invention to each of IL-4 ⁇ and IL-5R ⁇ is in the range of 10 -5 M to 10 -12 M.
  • the binding affinity is 10 -6 M to 10 -12 M, 10 -7 M to 10 -12 M, 10 -8 M to 10 -12 M, 10 -9 M to 10 -12 M, 10 -5 M to 10 -11 M, 10 -6 M to 10 -11 M, 10 -7 M to 10 -11 M, 10 -8 M to 10 -11 M, 10 -9 M to 10 -11 M, 10 -10 M to 10 -11 M, 10 -5 M to 10 -10 M, 10 -6 M to 10 -10 M, 10 -7 M to 10 -10 M, 10 -8 M to 10 -10 M, 10 -9 M to 10 -10 M, 10 -5 M to 10 -9 M, 10 -6 M to 10 -9 M, 10 -7 M to 10 -9 M, 10 -8 M to 10 -9 M, 10 -5 M to 10 -8 M, 10 -6 M to 10
  • a library can be constructed to improve the affinity of the antibody CDR region that specifically binds to sIL-4 ⁇ or sIL-5R ⁇ , (1) the heavy chain variable region (VH) of the library template antibody and selecting an amino acid site with a high probability of binding to sIL-4 ⁇ or sIL-5R ⁇ among six complementary binding sites (CDRs) involved in antigen binding of the light chain variable region (VL); (2) designing a spiked oligonucleotide capable of encoding an amino acid desired to be included in the library and a degenerated codon primer at the selected amino acid site; and (3) expressing the designed heavy chain variable region and light chain variable region library in the form of scFab or Fab using a yeast surface expression system.
  • screening may be performed using a library for isolation and/or affinity improvement of antibody scFabs that specifically bind to sIL-4 ⁇ or sIL-5R ⁇ .
  • the method for screening an antibody that specifically binds to sIL-4 ⁇ or sIL-5R ⁇ according to the present invention is specifically,
  • the anti-IL-4 ⁇ antibody or anti-IL-5R ⁇ antibody according to the present invention is a human antibody Fab library expressed on yeast surface (Human Fab Antibody Library on Yeast Cell Surface) for sIL-4 ⁇ or sIL-5R ⁇ . It is an antibody that selectively binds to sIL-4 ⁇ or sIL-5R ⁇ with high affinity by screening the antibody, constructing an antibody scFab library on the yeast surface to further improve affinity, and selecting through kinetic screening.
  • the ability to identify and isolate high-affinity antibodies from libraries is important for isolating novel therapeutic antibodies. Isolation of high affinity antibodies from a library may depend on the size of the library, production efficiency in cells, and diversity of the library. The size of the library is reduced by improper folding of the antibody or antigen-binding protein and inefficient production due to the presence of stop codons. Expression in cells can be inhibited if the antibody or antigen binding domain does not fold properly. Expression can be improved by alternately mutating residues on the surface of the variable/constant interface or at selected CDR residues.
  • CDR3 regions have been found to often participate in antigen binding. Since the CDR3 regions on the heavy chain vary considerably in size, sequence and structural conformation, they can be used to prepare a variety of libraries.
  • diversity can be generated by randomizing the CDR regions of the variable heavy and light chains using all 20 amino acids at each position.
  • the use of all 20 amino acids can result in highly diverse variant antibody sequences and increase the chances of identifying novel antibodies.
  • substituted or substituted or mutating refers to altering, deleting, or inserting one or more amino acids or nucleotides within a polypeptide or polynucleotide sequence to create a variant of that sequence. refers to
  • non-human antibodies are chimeric antibodies that contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin.
  • humanized antibodies are of a non-human species (donor antibody) that retain the desired specificity, affinity and ability for residues from the hypervariable region of the recipient, eg, mouse, rat, rabbit or non-human primate. It is a human immunoglobulin (recipient antibody) replaced with residues from the hypervariable region of
  • human antibody is a molecule derived from human immunoglobulin, and means that the entire amino acid sequence constituting the antibody, including the complementarity determining region and structural region, is composed of human immunoglobulin.
  • a portion of the heavy and/or light chain is identical to or homologous to the corresponding sequence in an antibody from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, while the remaining chain(s) are derived from another species or are from another antibody class or subclass.
  • Included are "chimeric" antibodies (immunoglobulins) that are identical to or homologous to the corresponding sequence in antibodies belonging to the subclass, as well as fragments of such antibodies that exhibit the desired biological activity.
  • variable region of an antibody refers to the light and heavy chain portions of an antibody molecule comprising the amino acid sequences of complementarity determining regions (CDRs; ie, CDR1, CDR2, and CDR3) and framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • VH refers to the variable domain of a heavy chain
  • VL refers to the variable domain of the light chain.
  • CDR Complementary determining region
  • the IL-4R ⁇ -binding antibody or antigen-binding fragment thereof is a heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1; at least one heavy chain CDR2 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 7; heavy chain CDR3 of SEQ ID NO:8; and a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 13; light chain CDR2 of SEQ ID NO: 14; and a light chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 15 to 20.
  • the IL-4R ⁇ -binding antibody or antigen-binding fragment thereof is heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 2, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 8, and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 14 , the light chain CDR3 of SEQ ID NO: 15;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 3, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 8 and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 14, light chain CDR3 of SEQ ID NO: 16;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 4
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 8 heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13
  • light chain CDR2 of SEQ ID NO: 14 light chain CDR3 of SEQ ID NO: 17;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 5
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 8 heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13
  • light chain CDR2 of SEQ ID NO: 14 light chain CDR3 of SEQ ID NO: 16;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 6, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 8 and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 14, light chain CDR3 of SEQ ID NO: 17;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 7, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 8 and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 14, light chain CDR3 of SEQ ID NO: 16;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 5
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 8 heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13
  • light chain CDR2 of SEQ ID NO: 14 light chain CDR3 of SEQ ID NO: 18;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 3, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 8 and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 13, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 14, light chain CDR3 of SEQ ID NO: 19; or
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 1 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 5
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 8 heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 13
  • light chain CDR2 of SEQ ID NO: 14 light chain CDR3 of SEQ ID NO: 20.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds IL-4Ra may comprise the heavy chain and light chain CDR sequences shown in Table 1 and/or Table 3.
  • the IL-5R ⁇ -binding antibody or antigen-binding fragment thereof is one selected from the group consisting of amino acid residues 221 to 322 corresponding to domain 3 (domain 3, D3) in the sequence of IL-5R ⁇ shown in SEQ ID NO: 66
  • the above amino acid residues can be recognized as an epitope.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to IL-5Ra may include a heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 27; heavy chain CDR2 of SEQ ID NO:28; at least one heavy chain CDR3 selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 29-35; and a light chain CDR1 of SEQ ID NO: 43; light chain CDR2 of SEQ ID NO: 44; and a light chain CDR3 of SEQ ID NO: 45.
  • the IL-5R ⁇ -binding antibody or antigen-binding fragment thereof is heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 27, heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 28, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 29, and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 43, light chain of SEQ ID NO: 44 CDR2, light chain CDR3 of SEQ ID NO:45;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 27 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 28, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 30 and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 43, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 44, light chain CDR3 of SEQ ID NO: 45;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 27 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 28
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 31 and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 43, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 44, light chain CDR3 of SEQ ID NO: 45;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 27 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 28
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 32 heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 43, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 44, light chain CDR3 of SEQ ID NO: 45;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 27 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 28, heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 33 and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 43, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 44, light chain CDR3 of SEQ ID NO: 45;
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 27 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 28
  • heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 34 and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 43, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 44, light chain CDR3 of SEQ ID NO: 45; or
  • heavy chain CDR1 of SEQ ID NO: 27 heavy chain CDR2 of SEQ ID NO: 28 heavy chain CDR3 of SEQ ID NO: 35 and light chain CDR1 of SEQ ID NO: 43, light chain CDR2 of SEQ ID NO: 44, and light chain CDR3 of SEQ ID NO: 45.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that binds IL-5R ⁇ according to the present invention may comprise the heavy chain and light chain CDR sequences shown in Table 6 and/or Table 8.
  • a “Framework region (FR)” is a variable domain residue other than CDR residues. Each variable domain typically has four FRs: FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • the IL-4R ⁇ -binding antibody or antigen-binding fragment thereof is a heavy chain variable region comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 9 to 14 and/or selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 21 to 26 It may include a light chain variable region comprising a sequence.
  • the IL-4R ⁇ -binding antibody or antigen-binding fragment thereof may include:
  • the IL-4R ⁇ -binding antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may include the heavy chain and light chain variable region sequences shown in Table 2 and/or Table 4.
  • the IL-5R ⁇ -binding antibody or antigen-binding fragment thereof is a heavy chain variable region comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 36 to 42 and/or a light chain variable comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 46 It may contain areas.
  • the IL-5R ⁇ -binding antibody or antigen-binding fragment thereof may include:
  • the IL-4R ⁇ -binding antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may include the heavy chain and light chain variable region sequences shown in Table 7 and/or Table 9.
  • the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention includes an antibody or antigen-binding fragment thereof in which a part of the amino acid sequence is substituted through conservative substitution in the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention.
  • “conservative substitution” refers to a modification of a polypeptide comprising substituting one or more amino acids with amino acids having similar biochemical properties that do not result in loss of biological or biochemical functions of the polypeptide.
  • a “conservative amino acid substitution” is a substitution in which an amino acid residue is replaced by an amino acid residue having a similar side chain. Classes of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art and are well known.
  • amino acids with basic side chains eg lysine, arginine, histidine
  • amino acids with acidic side chains eg aspartic acid, glutamic acid
  • amino acids with uncharged polar side chains eg glycine
  • amino acids with non-polar side chains eg, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • beta-branched side chains amino acids with aromatic side chains eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine
  • amino acids with aromatic side chains eg, threonine, valine, isoleucine
  • the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may include not only the sequence of the antibody described herein, but also a biological equivalent thereof, within the scope of maintaining a desired function.
  • additional changes may be made to the amino acid sequence of an antibody to further improve its binding affinity and/or other biological properties.
  • Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody. That is, as described above, it is made based on the relative similarity of the amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine can be said to be biologically functional equivalents.
  • the antibody or nucleic acid molecule encoding the same of the present invention is interpreted to include a sequence showing substantial identity to the sequence set forth in SEQ ID NO:.
  • the substantial identity is at least 90% when the sequence of the present invention and any other sequences are aligned as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. refers to a sequence exhibiting homology, most preferably at least 95% homology, at least 96% homology, at least 97% homology, at least 98% homology, at least 99% homology.
  • Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • the NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) can be accessed from NBCI, etc.
  • BLAST can be accessed at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
  • a method for comparing sequence homology using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention has 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, or more homology.
  • homology can be determined by sequence comparison and/or alignment by methods known in the art. For example, a sequence comparison algorithm (ie, BLAST or BLAST 2.0), manual alignment, or visual inspection can be used to determine the percent sequence homology of a nucleic acid or protein of the invention.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof can be recombinantly produced by isolating a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • Nucleic acid has a meaning comprehensively encompassing DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules, and nucleotides, which are the basic building blocks of nucleic acids, include natural nucleotides as well as analogues in which sugar or base regions are modified. .
  • the sequences of the nucleic acids encoding the heavy and light chain variable regions of the present invention may be modified. Such modifications include additions, deletions, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • DNA encoding the bispecific antibody is easily isolated or It can be synthesized, and the nucleic acid is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of DNA) or further expression. Based on this, the present invention relates to a recombinant expression vector comprising the nucleic acid from another aspect.
  • the term "vector” is a means for expressing a target gene in a host cell, and a viral vector such as a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, an adenoviral vector, a retroviral vector, and an adeno-associated viral vector. etc.
  • Components of a vector generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more antibiotic resistance marker genes, an enhancer element, a promoter, a transcription termination sequence. Nucleic acids encoding antibodies are operatively linked, such as promoters and transcription termination sequences.
  • operably linked refers to a functional association between a nucleic acid expression control sequence (eg, a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, such that the control sequence is linked to the other nucleic acid sequence.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, a promoter, signal sequence, or array of transcriptional regulator binding sites
  • another nucleic acid sequence such that the control sequence is linked to the other nucleic acid sequence.
  • a strong promoter capable of propagating transcription eg, tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter
  • a promoter derived from the genome of a mammalian cell eg, metallotionine promoter, ⁇ -actin promoter, human hegglobin promoter, and human muscle creatine promoter
  • mammalian Promoters derived from viruses eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV, Moloney virus promoter Epstein Barr virus (EBV) promoter and Loose Sacoma virus (RSV) promoter
  • viruses eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV, Moloney virus promoter Epstein Barr virus (
  • the vector may be fused with other sequences to facilitate purification of the antibody expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Qiagen, USA).
  • the vector includes an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline. There is a resistance gene.
  • the present invention relates to a host cell transfected with the recombinant expression vector.
  • the host cell used to produce the bispecific antibody of the present invention may be, but is not limited to, a prokaryotic, yeast or higher eukaryotic cell.
  • Escherichia coli Bacillus subtilis (Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis), such as Bacillus genus strains, Streptomyces, Pseudomonas (Pseudomonas, for example, Pseudomonas putida) Prokaryotic host cells such as Pseudomonas putida), Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus) can be used.
  • animal cells are of greatest interest, and examples of useful host cell lines include COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0 , U20S, or may be HT1080, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of culturing the host cell to generate a bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof that simultaneously binds to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ (IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ ); And it relates to a method for producing an IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising the step of isolating and purifying the generated IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the method for producing an IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention comprises:
  • the host cells may be cultured in various media. Among commercially available media, it can be used as a culture medium without limitation. All other essential supplements known to those skilled in the art may be included in appropriate concentrations. Culture conditions, such as temperature, pH, etc., are already used with the host cells selected for expression and will be apparent to the skilled person.
  • impurities are removed by, for example, centrifugation or ultrafiltration, and the resultant can be purified using, for example, affinity chromatography.
  • affinity chromatography there is. Additional other purification techniques may be used, such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxylapatite chromatography, and the like.
  • the present invention provides a conjugate in which the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof and a bioactive molecule selected from the group consisting of peptides, proteins, small molecule drugs, nucleic acids, nanoparticles and liposomes are fused. is about
  • the protein is an antibody, antibody fragment, immunoglobulin, peptide, enzyme, growth factor, cytokine, transcription factor, toxin, antigenic peptide, hormone, carrier protein, motor function protein, receptor, signal (signaling) protein, storage protein, membrane protein, transmembrane protein, internal protein, external protein, secreted protein, viral protein, glycoprotein, truncated protein, protein complex, or chemically modified protein or the like.
  • the small molecule drug is used extensively herein to refer to an organic, inorganic or organometallic compound having a molecular weight of less than about 1000 Daltons and having activity as a therapeutic agent for a disease.
  • Small molecule drugs herein include oligopeptides and other biomolecules having a molecular weight of less than about 1000 Daltons.
  • the nanoparticles refer to particles made of materials having a diameter of 1 to 1000 nm, and the nanoparticles are metal/metal core-shell composites comprising metal nanoparticles, a metal nanoparticle core, and a metal shell surrounding the core; It may be a metal/non-metal core shell composed of a metal nanoparticle core and a non-metal shell surrounding the core, or a non-metal/metal core-shell composite composed of a non-metal nano particle core and a metal shell surrounding the core.
  • the metal may be selected from gold, silver, copper, aluminum, nickel, palladium, platinum, magnetic iron and oxides thereof, but is not limited thereto, and the non-metal includes silica, polystyrene, latex and acrylic. It may be selected from the material of the rate series, but is not limited thereto.
  • the liposomes are composed of one or more lipid bilayer membranes surrounding an aqueous inner compartment, capable of associating with themselves. Liposomes can be characterized by their membrane type and size. Small unilamellar vesicles (SUVs) have a single membrane and may have a diameter of 20 nm to 50 nm. Large unilamellar vesicles (LUVs) can have a diameter of 50 nm or more. Oligolamellar vesicles and multilamellar vesicles have multiple, usually concentric, membrane layers and can be greater than 100 nm in diameter. Liposomes with multiple non-concentric membranes, i.e., multiple small vesicles contained within a larger vesicle, are called multivesicular vesicles.
  • SUVs Small unilamellar vesicles
  • LUVs Large unilamellar vesicles
  • fusion refers to the integration of two molecules with different or the same function or structure, and any physical, chemical, or biological method capable of binding the tumor-penetrating peptide to the protein, small molecule drug, nanoparticles or liposome. It may be fusion by a method.
  • the fusion is preferably by a linker peptide, which can relay the fusion with the bioactive molecule at various positions of the antibody light chain variable region, antibody, or fragment thereof of the present invention.
  • effector function refers to the type of biological activity associated with the Fc region (a wild-type sequence of the Fc region or a variant of the amino acid sequence of the Fc region) of an antibody, and varies depending on the isotype of the antibody.
  • antibody effector functions include Clq binding, complement dependent cytotoxicity (CDC); Fc receptor binding, antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), phagocytosis, downregulation of cell surface receptors (eg B-cell receptor, BCR) and B-cell activation.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • effector cells eg T-cells, NK-cells
  • NK-cells effector cells
  • ADCC is also independent of the immune complement system, which lyses the target but does not require other cells.
  • ADCC typically requires effector cells known to be natural killer (NK) cells that interact with immunoglobulin G (IgG) antibodies.
  • NK natural killer
  • IgG immunoglobulin G
  • macrophages, neutrophils and eosinophils can mediate ADCC, for example eosinophils that kill certain parasitic worms known as parasites via IgE antibodies.
  • the bioactive molecule that can be conjugated to the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention is a small molecule drug, particularly an allergic disease, an inflammatory disease and/or a disease caused by an increase in eosinophils;
  • HES hypereosinophilic syndrome
  • hypereosinophilia asthma, such as eosinophilic asthma, eosinophilic bronchial asthma (ABA), and severe eosinophilic bronchial asthma (ABA); chronic obstructive pulmonary disease (COPD); Cherge-Strauss syndrome; eosinophilic esophagitis; eosinophilic gastroenteritis; eosinophilic gastrointestinal disease (EGID); atopic diseases such as atopic dermatitis; allergic diseases such as allergic rhinitis; immunoglobulin (IgE)-mediated food allergy; inflammatory bowel disease, allergic colitis; gastroesoph
  • indacaterol indacaterol
  • formoterol formoterol
  • vilanterol vilanterol
  • albuterol albuterol
  • levalbuterol levalbuterol
  • thio phylline beta agonists
  • beta agonists theophylline
  • Anti-cholinergic agents such as ipratropium, tiotropium, and glycopyrrolate
  • Leukotriene modifiers such as montelukast, zafirlukast, and zileuton may be exemplified, but are not limited thereto.
  • inhibiting the activity of IL-4, IL-5, IL-13 means simultaneously binding to and targeting IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ of the present invention (IL-4R ⁇ IL).
  • IL-4R ⁇ IL IL-4R ⁇ IL
  • the bispecific antibody inhibits the cellular activity induced by IL-4 or IL-5 by at least 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%.
  • the present invention provides an allergic disease, inflammatory disease and/or disease caused by an increase in eosinophils, particularly eosinophils, comprising the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient. It relates to a composition for preventing or treating diseases caused by hypertrophy.
  • diseases treatable using the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention include hypereosinophilic syndrome (HES); hypereosinophilia; asthma, such as eosinophilic asthma, eosinophilic bronchial asthma (ABA), and severe eosinophilic bronchial asthma (ABA); chronic obstructive pulmonary disease (COPD); Cherge-Strauss syndrome; eosinophilic esophagitis; eosinophilic gastroenteritis; eosinophilic gastrointestinal disease (EGID); atopic diseases such as atopic dermatitis; allergic diseases such as allergic rhinitis; food allergies, such as immunoglobulin (IgE)-mediated food allergies; inflammatory bowel disease, allergic colitis; gastroesophageal reflux; endocardial myocardial fibrosis; Loeffler endocarditis; Davis' disease; intermittent angioedema
  • the present invention provides (a) a pharmaceutically effective amount of the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention; And (b) to a pharmaceutical composition for preventing or treating allergic diseases, inflammatory diseases and / or diseases caused by an increase in eosinophils, including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to an allergic disease, an inflammatory disease, and/or an increase in eosinophils comprising administering the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention in an effective amount required to the patient. It relates to a method for preventing or treating diseases that occur.
  • the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody according to the present invention eliminates, inhibits or reduces IL-4, IL-5 and/or IL-13 activity, thereby reducing IL-4, IL-5 and/or IL-13 activity. It is useful for the prevention or treatment of mediated diseases.
  • the antibody according to the present invention binds to IL-4R ⁇ and/or IL-5R ⁇ and is used for the treatment of diseases associated with IL-4, IL-5 and/or IL-13 activity.
  • the bispecific antibody of the present invention may be administered to a patient in combination with other therapeutic agents using a multidrug regimen.
  • the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may be administered simultaneously, sequentially, or alternately with an immunosuppressant, or after resistance to other therapies has emerged.
  • the immunosuppressant may be administered in the same or lesser dose as used in the art. The choice of the preferred immunosuppressant will depend on many factors, including the type of disease being treated and the patient's medical history.
  • Prevention refers to any action that inhibits or delays the progression of an allergic disease, an inflammatory disease, and/or a disease caused by an increase in eosinophils by administration of the composition according to the present invention
  • treatment is an allergic disease , inflammatory diseases and / or allergic diseases, inflammatory diseases and / or inhibition of the development of diseases caused by an increase in eosinophils, allergic diseases, inflammatory diseases and / or alleviation of diseases caused by an increase in eosinophils, etc.
  • the antibodies of the present invention can be usefully used both in vitro and in vivo for applications involving IL-4R ⁇ and/or IL-5R ⁇ expressing cells.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises an IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention; Alternatively, it may contain the conjugate, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier for administration of the pharmaceutical composition of the present invention to the component.
  • a pharmaceutically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not stimulate the organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • the pharmaceutically acceptable carrier which is sterile and biocompatible, is saline, sterile water, buffered saline, albumin injection, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, and these components.
  • One or more components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostats may be added as needed.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to form an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in various oral or parenteral formulations.
  • formulation it is prepared using commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one excipient in one or more compounds, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose ( lactose), gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.
  • the treatment method using the conjugate may include the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention; or administering the conjugate in a pharmaceutically effective amount.
  • a suitable total daily amount can be determined by a treating physician within the scope of sound medical judgment.
  • it can be administered once or divided into several doses.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient will depend on the specific composition, age, weight, and general health of the patient, including the type and extent of the response to be achieved, and whether other agents are used, if desired. It is preferable to apply differently depending on various factors including , sex and diet, administration time, administration route and treatment period, drugs used together or concurrently with a specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field.
  • compositions of the present invention include, without limitation, mammals including humans.
  • administration of the present invention means introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a patient by any suitable method, and the administration route of the composition of the present invention is one or a variety of routes that can reach the target tissue. It can be administered through
  • the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention may be used alone or in combination with an existing therapeutic agent.
  • Drugs that can be used for combination therapy with the antibody according to the present invention include diseases caused by an increase in eosinophils, for example, hypereosinophilic syndrome (HES); hypereosinophilia; asthma, such as eosinophilic asthma, eosinophilic bronchial asthma (ABA), and severe eosinophilic bronchial asthma (ABA); chronic obstructive pulmonary disease (COPD); Cherge-Strauss syndrome; eosinophilic esophagitis; eosinophilic gastroenteritis; eosinophilic gastrointestinal disease (EGID); atopic diseases such as atopic dermatitis; allergic diseases such as allergic rhinitis; immunoglobulin (IgE)-mediated food allergy; inflammatory bowel disease, allergic colitis; gastroesophageal reflux; endocardial myocardial fibrosis; Loeffler endocarditis; Davis' disease; intermittent angioedema associated with
  • indacaterol indacaterol
  • formoterol formoterol
  • vilanterol vilanterol
  • albuterol albuterol
  • levalbuterol beta agonists
  • beta agonists beta agonists
  • Anti-cholinergic agents such as ipratropium, tiotropium, and glycopyrrolate
  • Leukotriene modifiers such as montelukast, zafirlukast, and zileuton
  • Inhaled corticosteroids anti-IgE antibodies such as malizumab and ligelizumab may be exemplified, but are not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for treating a disease comprising administering to a patient in need of treatment the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention.
  • the present invention provides a composition for diagnosing an allergic disease, an inflammatory disease, and/or a disease caused by an increase in eosinophils, comprising the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a kit for diagnosing allergic diseases, inflammatory diseases, and/or diseases caused by an increase in eosinophils, including the diagnostic composition.
  • Diagnosing as used herein means identifying the presence or characteristics of pathophysiology. Diagnosis in the present invention is to confirm the onset and progress of allergic diseases, inflammatory diseases and/or diseases caused by an increase in eosinophils.
  • the drug is used to detect the presence of IL-5R ⁇ antigen-expressing cells in vitro or in vivo. It may include a detectable label. Radioisotopes detectable in vivo, such as labels detectable using scintiography, magnetic resonance imaging, or ultrasound, may be used for clinical diagnostic applications. Useful scintiographic markers include positron emitters and ⁇ -emitters.
  • Representative contrast agents for magnetic source imaging include paramagnetic or superparamagnetic ions (eg, iron, copper, manganese, chromium, erbium, europium, dysprosium, holmium and gadolinium), iron oxide particles, and water-soluble contrast agents.
  • paramagnetic or superparamagnetic ions eg, iron, copper, manganese, chromium, erbium, europium, dysprosium, holmium and gadolinium
  • iron oxide particles e.g, iron oxide particles, and water-soluble contrast agents.
  • gases or liquids can be entrapped within porous inorganic particles that are released as microbubble contrast agents.
  • Detectable labels useful for in vitro detection include fluorophores, detectable epitopes or binding agents, and radioactive labels.
  • the kit for diagnosing allergic diseases, inflammatory diseases and/or diseases caused by an increase in eosinophils may further include a composition, solution or device having one or more other components suitable for the analysis method.
  • the kit may include a bottle, vial, bag, syringe or syringe.
  • the container may be formed from a variety of materials, such as glass, plastic, or metal.
  • a label included with the container may indicate instructions for use. It may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, such as other buffers, diluents, filters, needles, syringes, and the like.
  • Example 1 Construction of yeast cell surface expression library for increasing affinity based on 4R34.1.19
  • IL-4R ⁇ is a cell membrane glycoprotein
  • SEQ ID NO: 65 the expression “sIL-4R ⁇ ” is obtained by introducing the sequence of IL-4R ⁇ shown in SEQ ID NO: 65, which is an extracellular domain, into an animal cell expression vector.
  • scFab single chain Fab
  • 4R34.1.19 antibody was constructed in scFab form in pYDS-H vector treated with NheI/ApaI with restriction enzymes, and pYDS 4R34.1.19 scFab vector and one additional nucleotide were constructed.
  • ORF Open Reading Frame
  • the library introduced random mutations in the VH-CDR2 and VL-CDR3 regions based on the pYDS 4R34.1.19 scFab vector (FIG. 1).
  • a spiked oligonucleotide was used to prevent loss of binding to IL-4R ⁇ because mutations were introduced into many regions.
  • This is a mutation method that can be applied to all amino acids while preserving the existing wild-type 4R34.1.19 sequence with a 50% probability.
  • each of the wild-type nucleotides is maintained at 79% and the remaining nucleotide ratio is 7% by designing a primer. It is a technology that maintains 50% of wild-type amino acids during the PCR process.
  • Overlapping PCR was performed to prepare 12 ⁇ g of the library gene and 4 ⁇ g of the pYDS dummy vector with NheI/ApaI restriction enzymes. If a pYDS dummy vector that has not been treated with restriction enzymes remains and is transformed into a yeast strain, it is not expressed on the yeast surface by the stop codon. The two genes were mixed and transformed into the yeast AWT101 strain for yeast surface expression by electroporation and constructed through homologous recombination.
  • the library size was serially diluted and the selection medium SD-CAA+Trp (20 g/L Glucose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na 2 HPO 4 , The number of colonies grown on 8.6 g/L NaH 2 PO 4 , 5 g/L casamino acids, 0.4 mg/L tryptophan) was measured and confirmed, and a library of about 1 ⁇ 10 8 level was produced.
  • SD-CAA+Trp 20 g/L Glucose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na 2 HPO 4 .
  • the constructed library was first self-activated by binding scFab (5 ⁇ 10 9 scFab yeast) expressed in cells to 1 nM biotinylated sIL-4R ⁇ to select clones showing sIL-4R ⁇ binding ability.
  • Cell sorting Magnetic-activated cell sorting
  • kinetic screening was performed to select clones showing slow dissociation for IL-4R ⁇ .
  • FACS fluorescence activated cell sorting
  • the process of removing the dissociated biotinylated sIL-4R ⁇ and then resuspending in a buffer containing 50 nM of non-biotinylated sIL-4R ⁇ was repeated 4 times.
  • the anti-cMyc antibody 9E10 was diluted 1:100 and bound at room temperature for 15 minutes to confirm the expression level.
  • PE-conjugated streptavidin Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate (SA-PE), Thermo
  • Alexa 488-conjugated anti-IgG antibody goat Alexa 488-conjugated anti-Fc antibody, Thermo
  • Tables 1 and 2 are the heavy chain CDR sequences and heavy chain variable region sequences of 8 individual clones selected for binding to 4R34.1.19 and sIL-4R ⁇ , respectively, and Tables 3 and 4 are the light chain CDR sequences and light chain variable region sequences, respectively. am.
  • dupilumab drugbank accession number; DB12159
  • VH, VL variable regions of the selected antibody
  • pcDNA3.4 vector encoding the light chain (CH1, CH2, CH3) and heavy chain (CL) of IgG1.
  • dupilumab was named dupilumab analog.
  • the light and heavy chains of each antibody were co-transformed into HEK293F cells in a 1:1 ratio so that the light and heavy chains were expressed together in the cell.
  • HEK293F cells suspended in serum-free FreeStyle 293 expression medium were transfected with a mixture of plasmid and polyethylenimine (PEI). Upon 100 mL transfection in shake flasks, HEK293F cells were seeded in 90 mL of medium at a density of 1.0 ⁇ 10 6 cells/ml and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , 37 °C.
  • PKI polyethylenimine
  • the plasmid was diluted to 125 ⁇ g in 5 ml of FreeStyle 293 expression medium and filtered, mixed with 5 ml of medium diluted with 375 ⁇ g of PEI, and reacted at room temperature for 10 minutes. After that, the reacted mixed medium was put into the cells previously seeded with 90 ml and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 for 6 days. Proteins were purified from the cell incubation supernatant collected by referring to standard protocols. The antibody was applied to a Protein A Sepharose column and washed with PBS (pH 7.4). After eluting the antibody at pH 3.0 with 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl buffer, the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer.
  • the eluted protein was concentrated after exchanging the buffer with a storage buffer (PBS pH7.4) using a Vivaspin 10,000 MWCO (Satorius) centrifugal concentrator.
  • the purified protein was measured for absorbance at 562 nm wavelength using the solution in the BCA protein assay kit (Thermo), and the amount was quantified according to the drawn standard curve.
  • Multi-antigen ELISA was performed using four structurally different antigen double-stranded DNA (dsDNA), insulin, the macromolecule hemocyanin and the membrane component cardiolipin.
  • dsDNA antigen double-stranded DNA
  • sIL-4R ⁇ antigen protein 50ng/well, sinobio; 10402-H08H
  • sIL-5R ⁇ antigen protein 50ng/well, sinobio; 10392-H08H
  • dsDNA 25ng/well, D4522; Sigma
  • insulin 125ng/well, I9278; Sigma
  • hemocyanin 125ng/well, H8283
  • cardiolipin (1250ng/well, C0563; Sigma) proteins were placed in a 96-well plate, fixed at room temperature for 1 hour, and 2% powdered milk (Skim milk) containing 0.1% PBST PBST (0.1% Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl)
  • the antibody was diluted to 100 nM, added 25 ⁇ l per well to the blocked plate, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • 25 ⁇ l of anti-human Fc-HRP antibody (1:8000) per well was added as a secondary antibody and reacted at room temperature for 1 hour.
  • 25 ⁇ l of TMB solution was added per well, followed by a color reaction for ⁇ 2 minutes at room temperature, stopping the reaction with H 2 SO 4 (2N), and measuring the absorbance at 450 nm with an ELISA reader. measured.
  • 4R34.1.19 showed binding ability to sIL-5R ⁇ , but did not show binding ability to other antigens
  • selected anti-IL-4R ⁇ antibodies (4R.N1, 4R.N2, 4R.N3, 4R.N4, 4R.N5, 4R.N6, 4R.N7, 4R.N8) showed almost no binding ability to sIL-5R ⁇ , and showed no binding ability to four proteins, so they had binding specificity to sIL-4R ⁇ . confirmed that there is.
  • sIL-4R ⁇ sinobio; 10402-H08H
  • kinetic buffer PBS pH 7.4 + 0.02% (v/v) Tween 20
  • sIL-4R ⁇ sinobio; 10402-H08H
  • Table 5 shows the results of affinity analysis of anti-IL-4R ⁇ antibodies selected for sIL-4R ⁇ using Octet QK e . It was confirmed that the selected clones had a high affinity of 43.1-170 pM.
  • Example 6 Evaluation of SEAP activity inhibition by IL-4 dependent STAT6 phosphorylation of selected anti-IL-4R ⁇ antibodies
  • HEK-Blue-IL-4/IL-13 cells can compare biological activity by monitoring cell signaling activation by IL-4 or IL-13 by colorimetric analysis. These cells were created as a stable cell line by transfecting the human STAT6 gene to impart a fully activated STAT6 pathway to HEK293 cells that fully express IL-4 and IL-13 receptors. In addition, the cells are transfected with a STAT6-inducible SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatase) reporter gene. When IL-4 or IL-13 binds to the IL-4 or IL-13 receptor expressed on the HEK-Blue-IL-4/IL-13 cell surface, it activates Tyk2 and JAK1 and recruits STAT6, respectively.
  • SEAP secreted embryonic alkaline phosphatase
  • the active phosphorylated STAT6 forms a duplex, moves to the nucleus, binds to the promoter of responsive genes, and induces SEAP secretion.
  • Secreted SEAP causes the pink substrate, Quanti-Blue (Invivogen), to develop purple.
  • Quanti-Blue Invivogen
  • the degree of color development has a positive correlation with the amount of IL-4 and IL-13 present, and the content of IL-4 and IL-13 can be quantified using a standard. Therefore, these cells are easy to screen whether the IL-4 or IL-13 signaling pathway is blocked by the anti-IL-4/IL-4R ⁇ antibody or the anti-IL-13/IL-13R ⁇ 1 antibody.
  • 3 is a result confirming the IL-4 signal blocking effect of the constructed anti-IL-4R ⁇ antibodies compared to the dupilumab analogs by measuring SEAP secretion of HEK-Blue IL-4/13 cells.
  • the cells were cultured in a culture medium (4.5 g/L glucose (Gibco/Invitrogen), 10% heat inactivated FBS (Gibco/Invitrogen), 10 ⁇ g/mL Blasticidin S, active peptidyl nucleosomes).
  • Seed antibiotics (Invitrogen) and 100 ⁇ g/mL Zeocin (trade name), diluted to a density of 2.5 ⁇ 10 5 cells/mL in DMEM with Streptomyces) were dispensed in a 96-well plate by 100 ⁇ l.
  • 50 ⁇ l of 1000 pM human IL-4 (Sinobio; 11846-HNAE) and 50 ⁇ l of an anti-IL-4R ⁇ antibody solution previously diluted to 8, 40 nM or 2, 10 nM were added, followed by 96- The well plates were incubated at 37[deg.] C. and 5% CO2 for 20 hours.
  • IL-5R ⁇ is a cell membrane glycoprotein, the amino acid residue Asp1-Asn313) in the sequence of IL-5R ⁇ shown in SEQ ID NO: 66, which is an extracellular domain, was introduced into an animal cell expression vector. The expression is called “ ⁇ ”.
  • An anti-IL-5R ⁇ humanized antibody, hu2B7 was derived through mouse immunization and humanization using the sIL-5R ⁇ antigen.
  • a yeast cell surface expression library was constructed based on hu2B7 to derive 5R65 with increased affinity. Again, based on 5R65, screening was performed to improve affinity using a yeast cell surface expression library.
  • the selected clones may comprise the heavy and light chain CDR sequences shown in Tables 6 and 8 below.
  • the binding specificity of the humanized anti-IL-5Ra antibodies was investigated using indirect ELISA.
  • Multi-antigen ELISA was performed using four structurally different antigen double-stranded DNA (dsDNA), insulin, the macromolecule hemocyanin and the membrane component cardiolipin.
  • sIL-4R ⁇ antigen protein 50ng/well, sinobio; 10402-H08H
  • sIL-5R ⁇ antigen protein 50ng/well, sinobio; 10392-H08H
  • dsDNA 25ng/well, D4522; Sigma
  • insulin 125ng/well, I9278; Sigma
  • hemocyanin 125ng/well, H8283; Sigma
  • cardiolipin 1250ng/well, C0563; Sigma
  • the antibody was diluted to 100 nM, added 25 ⁇ l per well to the blocked plate, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • 25 ⁇ l of anti-human Fc-HRP antibody (1:8000) per well was added as a secondary antibody and reacted at room temperature for 1 hour.
  • 25 ⁇ l of TMB solution was added per well, followed by a color reaction for ⁇ 2 minutes at room temperature, stopping the reaction with H 2 SO 4 (2N), and measuring the absorbance at 450 nm with an ELISA reader. measured.
  • the anti-IL-5R ⁇ humanized antibodies (5R65, 5R65.7, 5R65.10, 5R65.14, 5R65.18, 5R65.39, 5R65.45) were sIL-4R ⁇ and 4 It was confirmed that it had binding specificity because it did not show binding ability to the protein of the species.
  • Octet QK to further quantitatively analyze the avidity of anti-IL-5R ⁇ humanized antibodies (5R65.7, 5R65.10, 5R65.14, 5R65.18, 5R65.39, 5R65.45) to sIL-5R ⁇ .
  • e (ForteBio, USA) was measured according to the protocol suggested by the manufacturer using the instrument. Specifically, 1x kinetic buffer is prepared by diluting 10x kinetic buffer (ForteBio, 18-1105) in PBS.
  • the antibody was prepared by diluting the antibody to a concentration of 1 ⁇ g/ml in 1x kinetic buffer, and purified sIL-5R ⁇ was sequentially diluted in 1x kinetic buffer to a concentration of 400, 200, 100, 12.5, 6.25 and 0 nM. 200 ⁇ l each was put into an opaque 96-well plate through which light does not pass.
  • AHC anti-human IgG Fc capture
  • sensor chip moves in the order of 1x kinetic buffer, antibody dilution solution, 1x kinetic buffer, antigen dilution solution, and 1x kinetic buffer, antigen is bound to the antibody and then released.
  • Antigen affinity (affinity) of the antibody was analyzed through the change in refractive index that occurs when Affinity was calculated with Octet Data Analysis software 11.0 as a 1:1 binding model. The results are shown in FIG. 4B.
  • Table 10 shows the results of affinity analysis of selected anti-IL-5R ⁇ humanized antibodies to sIL-5R ⁇ using Octet QK e .
  • Example 9 Comparison of IL-5-dependent proliferation inhibition ability of anti-IL-5R ⁇ humanized antibodies in TF-1/IL-5R ⁇ cell line
  • IL-5-dependent cell proliferation inhibition ability of anti-IL-5R ⁇ antibodies was evaluated using transformed TF-1 cells stably expressing IL-5R ⁇ (TF-1/IL-5R ⁇ cells).
  • benralizumab drugbank accession number; DB12023
  • variable regions (VH, VL) of the selected antibody were introduced into pcDNA3.4 vector encoding the light chain (CH1, CH2, CH3) and heavy chain (CL) of IgG1.
  • benralizumab was named as a benralizumab analog.
  • 2x10 4 TF-1/IL-5R ⁇ cells were aliquoted into 96-well plates by 100 ⁇ l.
  • 50 ⁇ l of 320 pM IL-5 and 50 ⁇ l of an anti-IL-5R ⁇ humanized antibody solution previously diluted two-fold at 128 nM were added, and then the 96-well plate was incubated at 37° C. and 5% CO 2 for 40 hours. incubated.
  • 100 ⁇ l of cell suspension was recovered from each well, 100 ⁇ l of CellTiter-Glo (CellTiter-Glo® Promega) sample was added, and the cell was reacted for 20 minutes at room temperature for CytationTM 3 cells.
  • Example 10 Evaluation of anti-proliferative ability of humanized anti-IL-5R ⁇ antibodies with enhanced affinity for human eosinophils derived from healthy donors and patients with severe asthma
  • Eosinophils are important inflammatory cells involved in allergic/inflammatory diseases, and are representative cells expressing IL-5R ⁇ . Since IL-5 is known to be involved in the proliferation of eosinophils, the ability of anti-IL-5R ⁇ antibodies to inhibit eosinophil proliferation was evaluated by isolating/purifying eosinophils from human peripheral blood.
  • Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03) was dispensed into a 50 ml polypropylene centrifuge tube, and 20 ml of heparinized patient blood was layered on each. This was centrifuged at 879 ⁇ g at room temperature for 25 minutes to separate and recover the lowermost layer.
  • the 2% dextran solution was dispensed to separate the red blood cells (lower layer) and the granulocyte layer (upper layer), and 27 ml of sterilized water and 3 ml of 10 ⁇ HBSS were used to collect the granulocyte layer and remove the red blood cells mixed therein. was busy.
  • eosinophils Concentrated granulocytes (eosinophils, neutrophils) from which red blood cells were removed were separated and recovered by centrifugation at 300 ⁇ g and 4°C for 10 minutes. Finally, only eosinophils were purified from granulocytes using a commercially available eosinophil Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec; 130-092-010) according to the manufacturer's protocol.
  • 5x10 4 cells/well of eosinophils were dispensed in a 96-well cell culture plate, and human IL-5 at a final concentration of 100 pM was added, and anti-IL-5R ⁇ antibodies at a final concentration of 5 nM, 20 nM, and 100 nM were added, respectively.
  • Each antibody was cultured in 2-3 wells, and the volume of each well was finally adjusted to 200 ⁇ l. Incubated for 2 days at 37°C in a CO 2 incubator, 100 ⁇ l of the cell suspension was recovered from each well after the incubation was completed, and 100 ⁇ l of CellTiter-Glo ® Promega sample was added and 20 at room temperature. Incubate for minutes. The proliferative capacity of eosinophils is analyzed by measuring luminescence with a microplate meter.
  • 5B, 5R65.7 showed the strongest eosinophil proliferation inhibitory ability, which was higher than that of the benralizumab analogue.
  • Example 11 Evaluation of Anti-IL-5R ⁇ Humanized Antibodies in Inducing Antibody-Dependent Cytotoxicity of Human Eosinophils from Healthy Donors and Patients with Severe Asthma
  • benralizumab has afucosylated Fc and thus has a higher affinity for Fc ⁇ RIIIa expressed on NK cells than IgG1 Fc, and thus can exhibit higher ADCC activity. Due to its high ADCC activity, benralizumab can effectively eliminate eosinophils in asthmatic patients. Comparison of activity of benralizumab analogs having an IgG1 Fc with anti-IL-5R ⁇ humanized antibodies (5R65, 5R65.7), which also have the same IgG1 Fc, because we do not have the equipment to produce afucosylated antibodies did
  • Example 12 Construction design of a diabody that simultaneously binds to IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ (IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ )
  • bispecific antibodies that simultaneously bind two or more antigens
  • affinity for each antigen, valency, geometry of antigen-binding sites, construction and construction of bispecific antibodies are important.
  • mutations or linkers are introduced to construct a bispecific antibody, there is a disadvantage in that the physical properties are inferior to that of a monoclonal antibody. Therefore, the present inventors prepared IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in various formats to determine how biochemical/biological efficacy changes, and to select IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies with the best efficacy. .
  • IgG-like format 2 IgG single chain Fv (IgG-scFv) 3) Dual variable domain IgG (DVD-IgG) It was constructed by combining linkers and the like. First, in the case of a format similar to IgG, it has monovalent binding to each antigen. To construct this format, two light chains (VL1, VL2) and two heavy chains (VH1, VH2) must form a complementary binding pair.
  • VL1, VL2 two light chains
  • VH1, VH2 two heavy chains
  • the antibody variable regions (VH, VL) were linked with a linker composed of Gly-Ser to form a single chain Fv (scFv), and an IgG-scFv format linked to the C-terminus of IgG was constructed.
  • the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in IgG-scFv format has bivalent binding to each antigen because it additionally connects variable regions.
  • the antibody variable region linked by a linker may have reduced antigen-binding ability.
  • the stability of scFv can be improved by introducing a disulfide bond at the contact surface of VL and VH connected by scFv.
  • the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in the IgG-scFv format has a geometry of antigen-binding sites that bind to each antigen in the opposite direction.
  • the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in DVD-IgG format is an IL- It is a format in which the heavy chain variable region and the light chain variable region of an antibody binding to 4R ⁇ or an antibody binding to IL-5R ⁇ are juxtaposed.
  • the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in DVD-IgG format also has bivalent binding to each antigen.
  • the antigen-binding ability of the second variable region pair may be reduced.
  • Example 13 Construction of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in scIgG and BsIgG format that simultaneously binds to IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • an IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody that monovalently binds to IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ was constructed.
  • the format in which the light chain and the heavy chain are linked by a linker was named scIgG (FIG. 7A), and a mutation causing an electrostatic interaction between the light chain constant region (CL) and the heavy chain constant region 1 (CH1)
  • the introduced format was named BsIgG (FIG. 7C).
  • an EW-RVT mutation (Kim et al., 2018) was introduced in the heavy chain constant region 3 (CH3) to form a heterodimeric heavy chain constant region (Heterodimeric Fc) pair.
  • CH3 heavy chain constant region 3
  • Heterodimeric Fc heterodimeric heavy chain constant region
  • IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies were introduced into pcDNA3.4 vector encoding the heavy chain (CH1, CH2, CH3) and light chain (CL) of IgG1.
  • scIgG linked the heavy and light chain variable regions of the anti-IL-4R ⁇ antibody with a linker consisting of 60 small amino acid residues, and then linked the heavy chain variable regions into which K360E and K409W (EU numbering) mutations were introduced to CH3 ( 7B).
  • the heavy and light chain variable regions of the anti-IL-5R ⁇ antibody were linked with a linker consisting of 60 amino acids, and then the heavy chain variable regions into which Q347R, D399V, F405T (EU numbering) mutations were introduced were linked to CH3 ( FIG. 7B ).
  • BsIgG introduced a V133E mutation in the CL of the light chain capable of encoding an anti-IL-4R ⁇ antibody and an S183K mutation in CH1 of the heavy chain for electrostatic interaction, and K360E and K409W mutations were introduced in CH3 of the heavy chain.
  • V133K mutation was introduced in the light chain constant region capable of encoding an anti-IL-5R ⁇ antibody
  • S183E mutation was introduced in the heavy chain constant region 1 (CH1) for electrostatic interaction (Dillon et al., 2017).
  • Q347R, D399V, F405T mutations were introduced in CH3 ( FIG. 7D ).
  • Table 11 and Table 12 show the amino acid sequences of the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in scIgG and BsIgG formats, respectively.
  • the anti-IL-4Ra antibody light chain variable region of SEQ ID NO: 21 includes SEQ ID NOs: 22-26.
  • the anti-IL-4Ra antibody heavy chain variable region of SEQ ID NO: 9 includes SEQ ID NOs: 10 to 14.
  • the anti-IL-5Ra antibody heavy chain variable region of SEQ ID NO: 36 includes SEQ ID NOs: 37-42.
  • Example 14 Expression and purification of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in scIgG and BsIgG formats that simultaneously bind IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • HEK293F Human HEK293F (Invitrogen) cells were transiently transfected. Upon 200 mL transfection in a shake flask (corning), HEK293F cells were seeded in 190ml of medium at a density of 2.0 X 10 6 cells/ml, and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , 37 °C.
  • Light and heavy chains were diluted in 5ml serum-free Freestyle 293 expression medium (Invitrogen) in a ratio of 1:1 or 1:1:1:1 in HEK293F cells and filtered to 5ml of 750 ⁇ g of polyethyleneimine (Polyethylenimine, PEI) diluted. After mixing with the medium, the reaction was carried out at room temperature for 10 minutes. Then, the reacted mixed medium was put into the cells seeded with 190ml previously, and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , and incubated for 6 days. Proteins were purified from the cell incubation supernatant collected by referring to standard protocols.
  • the antibody was applied to a Protein A Sepharose column and washed with PBS (pH 7.4). After eluting the antibody at pH 3.0 with 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl buffer, the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer. The eluted protein was concentrated after exchanging the buffer with a storage buffer (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM EDTA pH 7.2) using a Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) centrifugal concentrator. The purified protein was measured for absorbance at 562 nm wavelength using the solution in the BCA protein assay kit (Thermo), and the amount was quantified according to the drawn standard curve. As a result, 4.02 mg of scIgG and 3.66 mg of BsIgG were purified.
  • Example 15 SDS-PAGE and SEC analysis of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in scIgG and BsIgG formats that simultaneously bind IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • scIgG 3 ⁇ g of the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody purified in Example 14 in scIgG format was analyzed on SDS-PAGE under 12% non-reducing conditions ( FIG. 8A ).
  • scIgG is formed by forming a heterodimer of two light chain-linker-heavy chains. Each monomer has a molecular weight of about 78 kDa and scIgG about 156 kDa.
  • the portion indicated by the arrow in FIG. 6A is scIgG, and a band expected to be aggregates and a band expected to be a monomer of 78 kDa were observed in the upper portion.
  • scIgG was analyzed by size-exclusion chromatography (SEC). Specifically, 30 ⁇ g of protein was injected into the Superdex 200 Increase 10/300 GL column with high salt concentration PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4) as a running buffer. It was confirmed that the protein was eluted at a wavelength of 280 nm. To compare the molar mass of the protein, the elution times of ⁇ -Amylase (200 kDa, sigma; A8781) and Herceptin (150 kDa) were compared. Similar to the SDS-PAGE result, scIgG was observed between 200 kDa and 150 kDa, and peaks expected as aggregates and monomers were also observed ( FIG. 8B ).
  • SEC size-exclusion chromatography
  • BsIgG consists of two light chains and two heavy chains.
  • the light chain monomer has a molecular weight of about 25 kDa and the heavy chain monomer about 50 kD.
  • the portion indicated by the arrow in FIG. 6C is BsIgG, and a band expected to be aggregates was observed in the upper portion.
  • BsIgG was analyzed by size exclusion chromatography.
  • Example 16 Construction of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in 4R-IgG-5R- HL scFv and 4R-IgG-5R- LH scFv format that simultaneously binds to IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • an IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody that bivalently binds to the IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ antigens was constructed in an IgG-scFv format.
  • scFv is a component (building block) frequently used when constructing a bispecific antibody.
  • the scFv may have different antigen-binding ability or physical properties depending on the order in which the heavy chain (VH)-light chain (VL) or light chain (VL)-heavy chain (VH) variable regions are linked.
  • the stability of scFv can be improved by introducing a disulfide bond at the contact surface of VL and VH.
  • residue 44 of VH and residue 100 of VL are far from the CDRs, so the distance between the two residues is 5.36 ⁇ close without affecting antigen-binding ability.
  • mutations are introduced into Cys, aggregates are formed It has been reported that this decreases (Zhao et al., 2010).
  • the format in which the variable region of anti-IL-5R ⁇ is linked to the C-terminus of the anti-IL-4R ⁇ antibody in the VH-VL sequence is called 4R-IgG-5R- HL scFv (FIG. 9A).
  • 4R-IgG-5R- LH scFv (FIG. 9C).
  • the scFv was connected to the C-terminus of the anti-IL-4R ⁇ antibody by a LGGGGSGGGGSGGGGS (16 amino acid) linker, and GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (20 amino acids) linker was connected between VH-VL or VL-VH.
  • IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies were introduced into pcDNA3.4 vector encoding the heavy chain (CH1, CH2, CH3) and light chain (CL) of IgG1.
  • 9B is a schematic diagram of a vector encoding the light and heavy chains of a 4R-IgG-5R- HL scFv
  • FIG. 9D is a schematic diagram of a vector encoding the light and heavy chains of a 4R-IgG-5R- LH scFv.
  • Glycine residue 44 of VH was mutated to Cysteine and Serine residue 100 of VL was mutated to Cysteine.
  • Tables 13 and 14 show the amino acid sequences of 4R-IgG-5R- HL scFv and 4R-IgG-5R- LH scFv, respectively.
  • the anti-IL-4Ra antibody light chain variable region of SEQ ID NO: 21 includes SEQ ID NOs: 22-26.
  • the anti-IL-4Ra antibody heavy chain variable region of SEQ ID NO: 9 includes SEQ ID NOs: 10 to 14.
  • the anti-IL-5Ra antibody heavy chain variable region of SEQ ID NO: 58 includes a cysteine mutation introduced at residues 44 of SEQ ID NOs: 37 to 42.
  • Example 17 Expression and purification of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in 4R-IgG-5R- HL scFv and 4R-IgG-5R- LH scFv format that simultaneously binds IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • HEK293F Human HEK293F (Invitrogen) cells were transiently transfected. Upon 200 mL transfection in a shake flask (corning), HEK293F cells were seeded in 190 mL of medium at a density of 2.0 X 10 6 cells/ml, and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , 37 °C.
  • the light and heavy chains were diluted in 5ml serum-free Freestyle 293 expression medium (Invitrogen) with a total of 250 ⁇ g in a 1:1 ratio in HEK293F cells, filtered, and mixed with 5ml medium diluted with 750 ⁇ g of Polyethylenimine (PEI), followed by 10 at room temperature. reacted for a minute. Then, the reacted mixed medium was put into the cells seeded with 190ml previously, and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , and incubated for 6 days. Proteins were purified from the cell incubation supernatant collected by referring to standard protocols. The antibody was applied to a Protein A Sepharose column and washed with PBS (pH 7.4).
  • PBS pH 7.4
  • the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer.
  • the eluted protein was concentrated after exchanging the buffer with a storage buffer (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM EDTA pH 7.2) using a Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) centrifugal concentrator.
  • the purified protein was measured for absorbance at 562 nm wavelength using the solution in the BCA protein assay kit (Thermo), and the amount was quantified according to the drawn standard curve.
  • 90 ⁇ g of 4R-IgG-5R- HL scFv and 94 ⁇ g of 4R-IgG-5R- LH scFv were purified.
  • Example 18 SDS-PAGE and SEC of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in 4R-IgG-5R- HL scFv and 4R-IgG-5R- LH scFv format that simultaneously bind to IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ analyze
  • the 4R-IgG-5R- HL scFv is composed of two light chains of about 25 kDa and two heavy chains-linker-scFv of about 77 kDa, and has a molar mass of 204 kDa in total.
  • a portion indicated by an arrow in FIG. 8 is a 4R-IgG-5R- HL scFv, and a band expected as aggregates was observed on the upper portion.
  • 4R-IgG-5R- HL scFvs were analyzed by size-exclusion chromatography (SEC). Specifically, by injecting 10 ⁇ g of protein into the Superdex 200 Increase 10/300 GL column with high salt concentration PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4) as a running buffer. It was confirmed that the protein was eluted at a wavelength of 280 nm. To compare the molar mass of the protein, the elution times of ⁇ -Amylase (200 kDa, sigma; A8781) and Herceptin (150 kDa) were compared. The 4R-IgG-5R- HL scFv was observed around 150 kDa, and a peak expected as aggregates and a peak due to EDTA contained in the storage buffer were also observed ( FIG. 10B ).
  • SEC size-exclusion chromatography
  • the 4R-IgG-5R- LH scFv is composed of two light chains of about 25 kDa and two heavy chains-linker-scFv of about 77 kDa, and has a molar mass of 204 kDa in total.
  • a portion indicated by an arrow in FIG. 8C is 4R-IgG-5R- LH scFv, and a band expected as aggregates was observed at the upper portion.
  • 4R-IgG-5R- LH scFv was analyzed by size exclusion chromatography. Specifically, by injecting 10 ⁇ g of protein into the Superdex 200 Increase 10/300 GL column with high salt concentration PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4) as a running buffer. It was confirmed that the protein was eluted at a wavelength of 280 nm. To compare the molar mass of the protein, the elution times of ⁇ -Amylase (200 kDa, sigma; A8781) and Herceptin (150 kDa) were compared.
  • PBS 12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4
  • the 4R-IgG-5R- LH scFv was observed around 200 kDa, the peak expected as aggregates was observed although less than that of the 4R-IgG-5R- HL scFv, and the formation of the 4R-IgG-5R- LH scFv was well observed. A tailing peak was also confirmed. In addition, a peak due to EDTA contained in the storage buffer was also observed ( FIG. 10B ). Consequently, 4R-IgG-5R- HL scFv and 4R-IgG-5R- LH scFv were confirmed to have poor expression levels and poor physical properties.
  • Example 19 Construction of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody in 5R-IgG-4R- HL scFv and 5R-IgG-4R- LH scFv format that simultaneously binds IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • an IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody that bivalently binds to the IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ antigens was further constructed in an IgG-scFv format.
  • the variable region of the anti-IL-4Ra antibody was constructed as scFv, and the anti-IL-5Ra antibody was constructed in the form of IgG.
  • a cysteine mutation for disulfide bonding was introduced at residue 44 of VH and residue 100 of VL, according to the sequence of linking the heavy chain (VH)-light chain (VL) or light chain (VL)-heavy chain (VH) variable region comparison was made.
  • the format in which the variable region of anti-IL-4R ⁇ is linked to the C-terminus of the anti-IL-5R ⁇ antibody in VH-VL sequence is called 5R-IgG-4R- HL scFv (FIG. 11A). It was named, and the format linked in the VH-VL order was named 5R-IgG-4R- LH scFv (FIG. 11C).
  • the scFv was connected to the C-terminus of the anti-IL-5R ⁇ antibody with a LGGGGSGGGGSGGGGS (16 amino acid) linker, and GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (20 amino acids) linker was connected between VH-VL or VL-VH.
  • IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies were introduced into pcDNA3.4 vector encoding the heavy chain (CH1, CH2, CH3) and light chain (CL) of IgG1.
  • 11B is a schematic diagram of a vector encoding the light and heavy chains of a 5R-IgG-4R- HL scFv
  • FIG. 11D is a schematic diagram of a vector encoding the light and heavy chains of a 5R-IgG-4R- LH scFv.
  • Glycine residue 44 in VH was mutated to Cysteine
  • Glycine residue 100 in VL was mutated to Cysteine.
  • the anti-IL-5Ra antibody heavy chain variable region of SEQ ID NO: 36 includes SEQ ID NOs: 37 to 48.
  • the anti-IL-4Ra antibody heavy chain variable region of SEQ ID NO: 61 includes a cysteine mutation introduced at residues 100 of SEQ ID NOs: 10 to 14.
  • the anti-IL-4Ra antibody light chain variable region of SEQ ID NO: 62 includes a cysteine mutation introduced at residues 46 of SEQ ID NOs: 22 to 24.
  • Example 20 Expression and purification of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in 5R-IgG-4R-BscFv and 5R-IgG-4R- LH scFv format that simultaneously bind IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • HEK293F Human HEK293F (Invitrogen) cells were transiently transfected. Upon 200 mL transfection in a shake flask (corning), HEK293F cells were seeded in 190 mL of medium at a density of 2.0 ⁇ 10 6 cells/ml, and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , 37 °C.
  • the light and heavy chains were diluted in 5ml serum-free Freestyle 293 expression medium (Invitrogen) with a total of 250 ⁇ g in a 1:1 ratio in HEK293F cells, filtered, and mixed with 5ml medium diluted with 750 ⁇ g of Polyethylenimine (PEI), followed by 10 at room temperature. reacted for a minute. Then, the reacted mixed medium was put into the cells seeded with 190ml previously, and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , and incubated for 6 days. Proteins were purified from the cell incubation supernatant collected by referring to standard protocols. The antibody was applied to a Protein A Sepharose column and washed with PBS (pH 7.4).
  • PBS pH 7.4
  • the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer.
  • the eluted protein was concentrated after exchanging the buffer with a storage buffer (PBS pH 7.4) using a Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) centrifugal concentrator.
  • the purified protein was measured for absorbance at 562 nm wavelength using the solution in the BCA protein assay kit (Thermo), and the amount was quantified according to the drawn standard curve. As a result, 163 ⁇ g of 5R-IgG-4R- HL scFv and 1.22 mg of 5R-IgG-4R- LH scFv were purified.
  • Example 21 SDS-PAGE and SEC of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in 5R-IgG-4R- HL scFv and 5R-IgG-4R- LH scFv format that simultaneously bind IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ analyze
  • the 5R-IgG-4R- HL scFv is composed of two light chains of about 25 kDa and two heavy chains-linker-scFv of about 77 kDa, and has a molar mass of 204 kDa in total.
  • the portion indicated by the arrow in FIG. 12A is the 5R-IgG-4R- HL scFv, and almost no bands expected as aggregates were observed.
  • 5R-IgG-4R- HL scFvs were analyzed by size-exclusion chromatography (SEC). Specifically, by injecting 10 ⁇ g of protein into the Superdex 200 Increase 10/300 GL column with high salt concentration PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4) as a running buffer. It was confirmed that the protein was eluted at a wavelength of 280 nm. To compare the molar mass of the protein, the elution times of ⁇ -Amylase (200 kDa, sigma; A8781) and Herceptin (150 kDa) were compared. The 5R-IgG-4R- HL scFv was observed around 150 kDa, and a peak expected as aggregates was somewhat observed ( FIG. 12B ).
  • SEC size-exclusion chromatography
  • the 5R-IgG-4R- LH scFv is composed of two light chains of about 25 kDa and two heavy chains-linker-scFv of about 77 kDa, and has a molar mass of 204 kDa in total.
  • the portion indicated by the arrow in FIG. 10C is 5R-IgG-4R- LH scFv, and a band expected as aggregates was somewhat observed in the upper portion.
  • 5R-IgG-4R- LH scFv was analyzed by size exclusion chromatography. Specifically, by injecting 10 ⁇ g of protein into the Superdex 200 Increase 10/300 GL column with high salt concentration PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4) as a running buffer. It was confirmed that the protein was eluted at a wavelength of 280 nm (FIG. 12D). To compare the molar mass of the protein, the elution times of ⁇ -Amylase (200 kDa, sigma; A8781) and Herceptin (150 kDa) were compared.
  • PBS 12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4
  • 5R-IgG-4R- LH scFv was observed near 200 kDa, and a peak expected as aggregates was somewhat observed. As a result, it was confirmed that the 5R-IgG-4R- LH scFv had a high expression level and good physical properties ( FIG. 12D ).
  • Example 22 Comparison of differences in physical properties according to the sequence of the format of the 5R-IgG-4R- LH scFv bispecific antibody
  • the anti-IL-5R ⁇ antibody is the heavy chain variable region sequence of 5R65.7 (SEQ ID NO: 37) and the light chain variable region (SEQ ID NO: 62) in the scFv constructed with the variable region of anti-IL-4R ⁇ is SEQ ID NO: 22 , 23, 24, 25, 26 by mutating the glycine residue 44 to cysteine, and the heavy chain variable region (SEQ ID NO: 61) was constructed by mutating the glycine residue 100 in SEQ ID NOs: 10, 12, 13 to cysteine.
  • the constructed IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies are commonly 5R-IgG-4R- LH scFv can be grouped with, but depending on each constructed antibody sequence, 5R65-IgG-4R34.1.19- LH scFv, 5R65.7-IgG-4R.N3- LH scFv, 5R65.7-IgG-4R.N4- LH scFv, They were named 5R65.7 IgG-4R.N6- LH scFv, 5R65.7-IgG-4R.N7- LH scFv, and 5R65.7-IgG-4R.N8- LH scFv.
  • the constructed antibodies were expressed and purified in the same manner as in Example 20 above.
  • 5R65-IgG-4R34.1.19- LH scFv (2.6 mg), 5R65.7-IgG-4R.N- LH scFv (4.07 mg), 5R65.-IgG-4R.N4- LH scFv (3.67 mg), 5R65.7-IgG-4R.N6- LH scFv (4.98 mg), 5R65.7-IgG-4R.N7- LH scFv (3.91 mg), 5R65.7-IgG-4R.N8- LH scFv (4.48 mg) was purified.
  • the properties of the purified IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies were compared through SDS-PAGE (FIG. 13) and SEC (FIG. 14) analysis. As a result, 5R65.7-IgG-4R.N3- LH scFv and 5R65.7-IgG-4R.N8- LH scFv It was confirmed that the bispecific antibody exhibited improved physical properties and high expression level as few aggregates were observed.
  • Example 23 Construction of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ Bispecific Antibodies in 4R-LL-5R and 4R-SL-5R Formats Simultaneously Binding to IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • an IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody that bivalently binds to the IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ antigens was additionally constructed in the DVD-IgG (Dual variable domain-IgG) format.
  • DVD-IgG Different variable domain-IgG
  • IgG-scFv has the difference that the IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ antigen binding sites are constructed in opposite directions, whereas DVD-IgG has the same direction.
  • the first variable region and the second variable region are juxtapositioned through a linker. Since the inner second variable region is obscured by the first variable region, antigen binding capacity may be reduced. Therefore, linker combinations were compared.
  • the linker between VH1 and VH2 the long linker ASTKGPSVFPLAP (13 amino acids) and the short linker ASTKGP (6 amino acids) were used.
  • the linker between VL1 and VL2 the long linker TVAAPSVFIFPP (12 amino acids) and the short linker phosphorus TVAAP (5 amino acids) was used.
  • variable region of the anti-IL-4R ⁇ antibody is located in the first variable region and the variable region of the anti-IL-5R ⁇ is located in the second variable region.
  • the format in which long linkers were linked was named 4R-LL-5R (FIG. 15A), and the format in which short linkers were linked was named 4R-SL-5R (FIG. 15C).
  • IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies were introduced into pcDNA3.4 vector encoding the heavy chain (CH1, CH2, CH3) and light chain (CL) of IgG1.
  • Fig. 15B is a schematic diagram of a vector encoding the light and heavy chains of 4R-LL-5R
  • Fig. 15D is a schematic diagram of a vector encoding the light and heavy chains of 4R-SL-5R.
  • Table 17 and Table 18 show the amino acid sequences of 4R-LL-5R and 4R-SL-5R, respectively.
  • the anti-IL-4Ra antibody light chain variable region of SEQ ID NO: 21 includes SEQ ID NOs: 22-26.
  • the anti-IL-4Ra antibody heavy chain variable region of SEQ ID NO: 7 includes SEQ ID NOs: 10 to 14.
  • the anti-IL-5Ra antibody heavy chain variable region of SEQ ID NO: 36 includes SEQ ID NOs: 37-42.
  • Example 24 Expression and purification of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in 4R-LL-5R and 4R-SL-5R formats that simultaneously bind IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • HEK293F Human HEK293F (Invitrogen) cells were transiently transfected. Upon 200 mL transfection in a shake flask (corning), HEK293F cells were seeded in 190 mL of medium at a density of 2.0 X 10 6 cells/ml, and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , 37 °C.
  • the light and heavy chains were diluted in 5ml serum-free Freestyle 293 expression medium (Invitrogen) with a total of 250 ⁇ g in a 1:1 ratio in HEK293F cells, filtered, and mixed with 5ml medium diluted with 750 ⁇ g of Polyethylenimine (PEI), followed by 10 at room temperature. reacted for a minute. Then, the reacted mixed medium was put into the cells seeded with 190ml previously, and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , and incubated for 6 days. Proteins were purified from the cell incubation supernatant collected by referring to standard protocols. The antibody was applied to a Protein A Sepharose column and washed with PBS (pH 7.4).
  • PBS pH 7.4
  • the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer.
  • the eluted protein was concentrated after exchanging the buffer with a storage buffer (PBS pH 7.4) using a Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) centrifugal concentrator.
  • the purified protein was measured for absorbance at 562 nm wavelength using the solution in the BCA protein assay kit (Thermo), and the amount was quantified according to the drawn standard curve. As a result, 71 ⁇ g of 4R-LL-5R and 240 ⁇ g of 4R-SL-5R were purified.
  • Example 25 SDS-PAGE and SEC analysis of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in 4R-LL-5R and 4R-SL-5R formats that simultaneously bind IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • the 4R-LL-5R bispecific antibody purified in Example 24 was formed of two light chains of about 36 kDa and two heavy chains of about 64 kDa, and had a total molar mass of 200 kDa.
  • 4R-LL-5R was analyzed by Size-Exclusion Chromatography (SEC). Specifically, by injecting 10 ⁇ g of protein into the Superdex 200 Increase 10/300 GL column with high salt concentration PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4) as a running buffer. It was confirmed that the protein was eluted at a wavelength of 280 nm.
  • SEC Size-Exclusion Chromatography
  • 4R-SL-5R bispecific antibody purified in Example 24 was analyzed on SDS-PAGE under 12% non-reducing conditions ( FIG. 16B ).
  • the 4R-SL-5R bispecific antibody is composed of two light chains of about 35 kDa and two heavy chains of about 63 kDa, and has a molar mass of 196 kDa in total.
  • the portion indicated by the arrow in FIG. 16B is 4R-SL-5R, and a band expected as aggregates was somewhat observed in the upper portion.
  • 4R-SL-5R was analyzed by size exclusion chromatography.
  • Example 26 Construction of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ Bispecific Antibodies in 5R-LL-4R and 5R-SL-4R Formats that Simultaneously Bind to IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • DVD-IgG was compared whether physical properties were different depending on the location of the anti-IL-4R ⁇ antibody and the anti-IL-5R ⁇ antibody.
  • Linker combinations were also compared.
  • the linker between VH1 and VH2 the long linker ASTKGPSVFPLAP (13 amino acids) and the short linker ASTKGP (6 amino acids) were used.
  • the linker between VL1 and VL2 the long linker TVAAPSVFIFPP (12 amino acids) and the short linker phosphorus TVAAP (5 amino acids) was used.
  • variable region of the anti-IL-5R ⁇ antibody is located in the first variable region, and the variable region of the anti-IL-4R ⁇ is located in the second variable region.
  • the format in which long linkers were connected was named 5R-LL-4R (FIG. 17A), and the format in which short linkers were connected was named 5R-SL-4R (FIG. 17C).
  • IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies were introduced into pcDNA3.4 vector encoding the heavy chain (CH1, CH2, CH3) and light chain (CL) of IgG1.
  • Fig. 15B is a schematic diagram of a vector encoding the light and heavy chains of 5R-LL-4R
  • Fig. 17D is a schematic diagram of a vector encoding the light and heavy chains of 5R-SL-4R.
  • Table 19 and Table 20 show the amino acid sequences of 5R-LL-4R and 5R-SL-4R, respectively.
  • the anti-IL-4Ra antibody light chain variable region of SEQ ID NO: 21 includes SEQ ID NOs: 22-26.
  • the anti-IL-4Ra antibody heavy chain variable region of SEQ ID NO: 9 includes SEQ ID NOs: 10 to 14.
  • the anti-IL-5Ra antibody heavy chain variable region of SEQ ID NO: 36 includes SEQ ID NOs: 37 to 42.
  • Example 27 Expression and purification of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in 5R-LL-4R and 5R-SL-4R formats that simultaneously bind IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • HEK293F Human HEK293F (Invitrogen) cells were transiently transfected. Upon 200 mL transfection in a shake flask (corning), HEK293F cells were seeded in 190 mL of medium at a density of 2.0 X 10 6 cells/ml, and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , 37 °C.
  • the light and heavy chains were diluted in 5ml serum-free Freestyle 293 expression medium (Invitrogen) with a total of 250 ⁇ g in a 1:1 ratio in HEK293F cells, filtered, and mixed with 5ml medium diluted with 750 ⁇ g of Polyethylenimine (PEI), followed by 10 at room temperature. reacted for a minute. After that, the reacted mixed medium was put into the previously seeded cells in 190 ml and incubated at 120 rpm, 8% CO 2 , and then incubated for 6 days. Proteins were purified from the cell incubation supernatant collected by referring to standard protocols. The antibody was applied to a Protein A Sepharose column and washed with PBS (pH 7.4).
  • PBS pH 7.4
  • the sample was immediately neutralized with 1 M Tris buffer.
  • the eluted protein was concentrated after exchanging the buffer with a storage buffer (PBS pH 7.4) using a Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) centrifugal concentrator.
  • the purified protein was measured for absorbance at 562 nm wavelength using the solution in the BCA protein assay kit (Thermo), and the amount was quantified according to the drawn standard curve. As a result, 22 ⁇ g of 5R-LL-4R and 12.6 ⁇ g of 5R-SL-4R were purified.
  • Example 28 SEC analysis of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies in 5R-LL-4R and 5R-SL-4R formats that simultaneously bind IL-4R ⁇ IL-5R ⁇
  • the 5R-LL-4R bispecific antibody purified in Example 27 was formed of two light chains of about 36 kDa and two heavy chains of about 64 kDa, and had a molar mass of 200 kDa in total.
  • 5R-LL-4R was analyzed by size-exclusion chromatography (SEC). Specifically, by injecting 10 ⁇ g of protein into the Superdex 200 Increase 10/300 GL column with high salt concentration PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4) as a running buffer. It was confirmed that the protein was eluted at a wavelength of 280 nm.
  • Example 27 the 5R-SL-4R bispecific antibody purified in Example 27 was analyzed by size exclusion chromatography. Specifically, by injecting 10 ⁇ g of protein into the Superdex 200 Increase 10/300 GL column with high salt concentration PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4) as a running buffer. It was confirmed that the protein was eluted at a wavelength of 280 nm. To compare the molar mass of the protein, the elution times of ⁇ -Amylase (200 kDa, sigma; A8781) and Herceptin (150 kDa) were compared.
  • PBS 12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4
  • 5R-SL-4R was observed in the vicinity of 200 kDa, the peak was observed with the expected aggregate (aggregates), the rearward low peaks were observed (Fig. 18B).
  • Example 29 Comparison of differences in physical properties according to the sequence of the format of the 4R-LL-5R bispecific antibody
  • the anti-IL-5R ⁇ antibody is the heavy chain variable region sequence of 5R65.7 (SEQ ID NO: 37), and the light chain variable region of anti-IL-4R ⁇ is SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, heavy chain variable region Regions were constructed with SEQ ID NOs: 10, 12, 13.
  • the resulting IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies can be grouped in the 4R-LL-5R format, but according to each constructed antibody sequence, 4R34.1.19-SL-5R65, 4R.N3-SL-5R65.
  • the properties of the purified IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies were compared through SDS-PAGE (FIG. 19) and SEC (FIG. 20) analysis. As a result, it was confirmed that the 4R.N3-SL-5R65.7, 4R.N6-SL-5R65.7, and 4R.N8-SL-5R65.7 bispecific antibodies had improved physical properties and a high expression level.
  • Example 30 Confirmation of antigen binding ability according to the format of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody
  • BsIgG monovalent binding capacity, IgG form
  • IgG-scFv bivalent antigen binding sites in opposite directions
  • DVD-IgG bivalent antigen binding sites in juxtaposition
  • sIL-4R ⁇ antigen protein 50ng/well, sinobio; 10402-H08H
  • sIL-5R ⁇ antigen protein 50ng/well, sinobio; 10392-H08H
  • 0.1% PBST PBST containing 2% powdered milk (skim milk) 0.1% Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl
  • the antibody was diluted to 100 nM, 10 nM, and 1 nM, and 25 ⁇ l per well was added to the blocked plate, followed by reaction at room temperature for 1 hour.
  • 25 ⁇ l of anti-human Fc-HRP antibody (1:8000) per well was added as a secondary antibody and reacted at room temperature for 1 hour.
  • 25 ⁇ l of TMB solution was added per well, followed by a color reaction for ⁇ 2 minutes at room temperature, and then the reaction was stopped with H 2 SO 4 (2N), and absorbance was measured at 450 nm.
  • BsIgG has monovalent binding ability to sIL-4R ⁇ and sIL-5R ⁇ antigens. It can be seen that the monoclonal antibody of 4R34.1.19 has a decreased binding ability to sIL-4R ⁇ compared to the binding ability to sIL-4R ⁇ . The binding ability of BsIgG to sIL-5R ⁇ was hardly decreased compared to that of 5R65, which is thought to be due to the cross-binding ability of the 4R34.1.19 antibody to sIL-5R ⁇ ( FIG. 21 ).
  • 5R65-IgG-4R34.1.19- LH scFv In the case of the format, since the antigen-binding site for sIL-4R ⁇ was constructed with scFv, the binding ability to sIL-4R ⁇ was reduced and the binding ability to sIL-5R ⁇ was not significantly reduced ( FIG. 21 ). In the case of the 4R34.1.19-SL-5R65 format, 5R65 located in the second variable region is highly likely to have poor binding ability to sIL-5R ⁇ . As expected, it was confirmed that the high binding ability to sIL-4R ⁇ was maintained, and the binding ability to sIL-5R ⁇ was decreased ( FIG. 21 ).
  • a 2% dextran solution was dispensed to separate red blood cells (lower layer) and granulocytes (upper layer), and 27 ml of sterilized water and 3 ml of 10 ⁇ HBSS were dispensed for the purpose of recovering the granulocyte layer and removing red blood cells mixed therein. did A layer enriched with granulocytes (eosinophils, neutrophils) from which red blood cells were removed was separated and recovered by centrifugation at 300 ⁇ g and 4°C for 10 minutes.
  • Concentrated granulocytes can be classified into eosinophils and neutrophils according to the expression of Siglec 8 (sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin). Eosinophils express Siglec-8, but neutrophils do not.
  • Eosinophils have a relatively low rate of expression of IL-4R ⁇ and a high rate of expression of IL-5R ⁇ . However, it was confirmed that both IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ were expressed.
  • Example 32 Evaluation of the proliferation inhibitory ability of human eosinophils derived from healthy donors of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies
  • IL-5 contributes to the proliferation of eosinophils
  • the present inventors confirmed the proliferative capacity of eosinophils by each of IL-4 and IL-5, and confirmed whether the proliferative capacity of eosinophils was further increased when IL-4 and IL-5 were treated simultaneously than when treated alone.
  • the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody inhibits the proliferative ability of eosinophils by two cytokines.
  • Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03) was dispensed into a 50 ml polypropylene centrifuge tube, and 20 ml of heparinized patient blood was layered on each. This was centrifuged at 879 ⁇ g at room temperature for 25 minutes to separate and recover the lowermost layer.
  • the 2% dextran solution was dispensed to separate the red blood cells (lower layer) and the granulocyte layer (upper layer), and 27 ml of sterilized water and 3 ml of 10 ⁇ HBSS were used for the purpose of recovering the granulocyte layer and removing the red blood cells mixed therein. was busy.
  • eosinophils Concentrated granulocytes (eosinophils, neutrophils) from which red blood cells were removed were separated and recovered by centrifugation at 300 ⁇ g, 4°C for 10 minutes. Finally, only eosinophils were purified from granulocytes using a commercially available eosinophil Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec; 130-092-010) according to the manufacturer's protocol.
  • IL-4 can also induce the proliferation of eosinophils, and the simultaneous treatment of IL-4 and IL-5 showed higher eosinophil proliferation than the single treatment.
  • 4R34.1.19 had the ability to bind to IL-5R ⁇ , it showed a similar level of inhibitory activity to eosinophil proliferation as the IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies.
  • 4R34.1.19-SL-5R65 showed stronger eosinophil proliferation than BsIgG, because it has a bivalent antigen-binding site and thus has a higher binding ability to each antigen. It is believed (FIG. 23).
  • Example 33 Evaluation of antibody-dependent cytotoxicity inducing ability of human eosinophils from healthy donors of IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibodies
  • An increase in the number of eosinophils is closely related to allergic diseases. In order to reduce the number of eosinophils, it is important to inhibit the proliferation of eosinophils, but a more direct method of inducing antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) by effector cells such as NK cells is more effective. effective.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • Benralizumab is FDA-approved as an antibody against IL-5R ⁇ , and is known to inhibit the activity of IL-5 as well as to eliminate ADCC-induced eosinophils.
  • benralizumab has afucosylated Fc, it has a higher affinity for Fc ⁇ expressed on NK cells and the like than IgG1 Fc, thereby exhibiting higher ADCC activity (Kolbeck et al., 2010).
  • the present inventors prepared a benralizumab analog having the variable region of benralizumab (Accession Number: DB12023) and an IgG1 Fc, and prepared an anti-IL-5R ⁇ antibody (5R65) and IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ having the same IgG1 Fc.
  • bispecific antibodies Compared to the activity of bispecific antibodies (BsIgG, 4R34.1.19-SL-5R65), the bispecific antibody simultaneously binding IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ had higher ADCC induction than the monoclonal antibody targeting IL-5R ⁇ . performance was analyzed.
  • NK cells were purified using the NK Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec; 130-092-657) according to the manufacturer's protocol.
  • Eosinophils were purified using the eosinophil Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec; 130-092-010) according to the manufacturer's protocol. Purified NK cells and eosinophils were used as effector and target cells in a ratio of 10:1.
  • target cells, eosinophils are incubated with 10 ⁇ M CellTrace TM CFSE (Invitrogen) at a final concentration of 37° C., in a place protected from light for 30 minutes.
  • an anti-IL-5R ⁇ antibody (a benralizumab analog, 5R65) and an IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ bispecific antibody (BsIgG, 4R34.1.19-SL-5R65) were added, respectively.
  • Each antibody was cultured in 2 wells, and the volume of each well was finally adjusted to 200 ⁇ l. Incubate for 6 hours at 37° C. in a CO 2 incubator. After the completion of the culture, the cell suspension was recovered from each well, and the fluorescence of calcein-AM released was detected by a fluorescence plate meter.
  • the antibody-dependent cytotoxicity inducing ability was calculated using the following formula.
  • a bispecific antibody that simultaneously targets both IL-4R ⁇ and IL-5R ⁇ (IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ ) rather than a monoclonal antibody that targets IL-5R ⁇ against healthy donor eosinophils (benralizumab analog, 5R65) (BsIgG, 4R34.1.19-SL-5R65) showed a higher cytotoxicity-inducing ability.
  • 4R34.1.19-SL-5R65 showed the strongest induction ability. This can be confirmed with a quantified graph (FIG. 24).
  • a bispecific antibody that simultaneously neutralizes major cytokines that induce an inflammatory response can more comprehensively suppress inflammation and have a synergistic effect.
  • by simultaneously targeting two receptors expressed on a single cell stronger and more specific targeting, increased inhibition of cell growth and/or induction of ADCC, can eliminate inflammatory immune cells, and thus IL-4R ⁇ and IL
  • the bispecific antibody simultaneously binding and targeting -5R ⁇ (IL-4R ⁇ IL-5R ⁇ ) can be used for the treatment of strong allergic diseases, inflammatory diseases and/or diseases caused by an increase in eosinophils, but is limited thereto it is not
  • HES hypereosinophilic syndrome
  • asthma such as eosinophilic asthma, eosinophilic bronchial asthma (ABA), and severe eosinophilic bronchial asthma (ABA); chronic obstructive pulmonary disease (COPD); Cherge-Strauss syndrome; eosinophilic esophagitis; eosinophilic gastroenteritis; eosinophilic gastrointestinal disease (EGID); atopic diseases such as atopic dermatitis; allergic diseases such as allergic rhinitis; immunoglobulin (IgE)-mediated food allergy; inflammatory bowel disease, allergic colitis; gastroesophageal reflux; endocardial myocardial fibrosis; Loeffler endocarditis; Davis' disease; intermittent angioedema associated with eosinophilia; Eosinophilia-Myalgia Syndrome/Spanish Toxic Oil Syndrome;

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 인터루킨 (IL)-4 수용체 α (IL-4Rα, CD124) 및 IL-5 수용체 α (IL-5Rα, CD125)에 동시에 결합하는 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체, 상기 이중특이항체를 포함하는 다중특이항체, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 이중특이항체의 제조방법, 이의 치료적 용도, 예를 들어 IL-4, IL-13 및/또는 IL-5와 연관된 알러지성 질환, 염증성 질환, 호산구 증가증에 의한 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

인터루킨-4 수용체 알파 서브유닛과 인터루킨-5 수용체 알파 서브유닛에 동시에 결합하는 이중특이항체 및 이의 용도
본 발명은 인터루킨 (IL)-4 수용체 α (IL-4Rα, CD124) 및 IL-5 수용체 α (IL-5Rα, CD125)에 동시에 결합하는 항-IL-4Rα/항-IL-5Rα 이중특이항체(bispecific antibody), 상기 이중특이항체를 포함하는 다중특이항체(multispecific antibody) 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법, 이의 치료적 용도, 예를 들어 IL-4, IL-13 및/또는 IL-5와 연관된 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
천식이나 염증성 질환 같은 알레르기 질환들은 여러 종류의 사이토카인 (cytokine)들이 면역 세포 [T-세포 (T-cell), B-세포 (B-cell), 비만 세포 (mast cell), 호산구 (eosinophil), 호염기구 (basophil), 호중구 (neutrophil) 등]를 자극하여 만성적인 염증을 일으켜 발병하는 특징을 가지고 있다. T-세포는 아직 항원을 만나지 못한 naive T-cell과 항원을 만나 성숙한 Effector T-cell (helper T-cell, cytotoxic T-cell, NK T-cell), 그리고 memory T-cell로 분류된다. Helper T-cell (Th cell)는 효과 T세포 중 다른 백혈구들의 분화 및 활성화를 조절함으로써 체액성 면역을 촉진하는 세포를 말한다. Th cell은 세부 기능에 따라 다시 Th1, Th2, Th17, Treg 등으로 분류된다. 그 중 Th2 cell는 대표적으로 인터루킨(interleukin, IL)-4, IL-5, IL-13을 분비한다.
IL-4는 Th0 cell에서 Th2 세포로의 분화를 유도할 수 있는 유일한 사이토카인이다. 활성화된 Th2 세포들은 autocrine (자가분비) 작용으로 다시 추가적인 IL-4를 생산하므로 신체는 Th2 과잉생산으로 인한 염증반응이 나타나게 된다. 또한 IL-4는 B-cell이 IgE를 생성하게 하고, IgE가 비만세포(mast cell) 및 호염기구(basophil)의 표면에 부착됨으로써 염증성 반응을 유도한다.
IL-13은 IL-4와 마찬가지로 IgE 생성과 Th2 매개 염증반응에 중요한 역할을 하는 사이토카인이다. IL-13과 IL-4는 수용체를 공유하여 IL-4와 공통된 기능을 가진다. IL-4는 Type Ⅰ(IL-4 Rα, γc), Type Ⅱ(IL-4 Rα, IL-13Rα1)로 구성된 수용체들이 매개하는 신호전달기전을 통해 염증반응에 관여한다. 반면 IL-13은 Type Ⅱ(IL-4 Rα, IL-13Rα1 또는 IL-13Rα2)로 구성된 수용체로 신호전달을 한다. 이들 수용체는 T cell, B cell, 호산구, 비만 세포 등 대부분의 면역 세포에 발현되어 있다. 또한 IL-13 만의 독자적인 기능으로는 호흡기 기도에 있는 goblet cell 과형성 (hyperplasia)과 평활근 (smooth muscle) 수축 (contractility)이 있다.
두필루맙 (dupilumab, Regeneron Pharmaceuticals Inc., 미국특허 제 7,605,237호, 대한민국 특허 제 10-1474227호)은 IL-4와 IL-13의 신호 전달에 공통으로 관여하는 IL-4Rα를 표적하여 두 사이토카인을 모두 저해할 수 있다. 두필루맙은 Th2 cell로의 분화를 막고 B cell 에서의 IgE 생성을 저해하고 혈관 세포에 작용해 호산구의 이동을 방해하는 등 여러 염증성 단백질의 수준을 감소시킨다. 두필루맙은 아토피성 피부염 (atopic dermatitis), 천식, 습진, 호산구성 식도염 (Eosinophilic esophagitis) 환자에게서 효과를 보였다 (Le Floc'h et al., 2020).
IL-5는 주로 호산구에 작용하여 호산구의 분화, 증식, 활성 등 전반적인 호산구 기능에 관여하는 사이토카인이다. IL-5의 수용체는 IL-5Rα와 βc으로 이루어져 있으며, IL-5Rα가 특이적으로 IL-5와의 결합을 이루고, βc는 그 자체로는 IL-5에 대한 결합능을 나타내지 않고 신호전달을 매개한다고 알려져 있다. IL-5Rα를 발현하는 세포는 호산구, 호염기구, 비만 세포로 한정되어 있다. 호산구는 알레르기성 질병을 포함한 각종 질병들에 연루되어 있고, 알레르기성 질병, 예컨대 만성 기관지 천식 및 아토피성 피부염을 비롯한 알레르기성 질환을 발생시키는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 호산구는 이러한 질환을 가진 환자의 혈중에서 그 수가 높아져 있는 호산구 증가증 (eosinophilia)을 보인다. 호산구는 알레르기성/염증성 질환에 관여하는 중요한 염증 세포 중 하나이기 때문에 그 수를 줄이는 것이 중요한 치료 전략이다. 항-IL-5 항체인 메폴리주맙, 레실리주맙은 IL-5 경로 차단을 통해 호산구 증식/생존을 억제해 간접적으로 호산구 수의 감소 능력이 있다. IL-5Rα 수용체를 표적하는 항-IL-5Rα 항체인 벤랄리주맙 (benralizumab, MedImmune and AstraZeneca, 미국특허 제 6,018,032호, 대한민국 특허 제 10-0259828호) 은 직접적으로 호산구를 표적함으로써 IL-5의 경로를 차단하여 세포성장를 저해할 뿐 아니라, 자연살해세포 (natural killer cells) 및 대식세포 (macrophage)에 의한 항체 의존적 세포 독성 (antibody-dependent cell cytotoxicity)를 유도함으로써 직접적으로 호산구를 제거한다 (Kolbeck et al., 2010).
알레르기성/염증성 질환을 치료하기 위해 호산구가 표적 세포로 많이 연구되었지만 환자 개인마다 호산구에 의한 발병률이 다르고, 다른 면역 세포들에 의한 염증 반응으로 나타나는 증상들과 겹치는 경우가 많다. 따라서 IL-5 경로 차단을 통해 호산구의 증식 및 활성을 억제하는 방법과 IL-4/IL-13 경로를 차단하여 더 넓은 범위의 Th2 염증 반응을 억제하는 것을 병행하는 것이 넓은 범위의 환자 군에서 더 높은 치료 효과를 나타낼 수 있을 것이다. 이러한 이유는 여러 사이토카인들 (대표적으로 IL-4, IL-13, IL-5)이 독립적인 경로로 알레르기/염증성 반응을 유도하기 때문이다. 따라서 IL-5Rα를 표적하여 호산구의 활성을 저해하는 방법과 IL-4Rα를 표적하여 T-세포, B-세포, 비만 세포 등의 활성을 저해하는 방법을 병행하는 것이 증상이 다양한 알레르기/염증성 질환 환자의 치료에 더 효과적일 수 있다. 또한 IL-4Rα와 IL-5Rα를 동시에 발현하는 이펙터(effector) 세포 (예를 들어, 호산구)를 표적하여 세포 성장 저해 또는 제거하고자 하는 경우, 각 항원에 특이적인 단일클론항체(monoclonal antibody)보다, IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는(IL-4Rα×IL-5Rα) 이중특이항체(bispecific antibody)는 세포표면에 발현된 두 항원을 모두 이용하여 더 많이 표지함으로써 이펙터(effector) 세포에 성장을 효과적으로 저해하거나 더 강한 ADCC를 유도하여 효과적으로 제거할 수 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체를 개발하고, 이의 치료적 용도 IL-4, IL-13 및/또는 IL-5와 연관된 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 치료 또는 예방 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는(IL-4Rα×IL-5Rα) 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이항체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이를 이용한 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 또한, 상기 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 65로 표시되는 인터루킨 (IL)-4 수용체 α (IL-4Rα, CD124)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 서열번호 66으로 표시되는 인터루킨 (IL)-5 수용체 α (IL-5Rα, CD125)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중특이항체 (bispecific antibody) 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 이중특이항체를 포함하는 다중특이항체 (multispecific antibody)를 제공한다.
본 발명은 또한, IL-4Rα 또는 IL-5Rα를 발현하는 여러 이펙터(effector) 세포 (호산구, T-세포, B-세포 등)들에 작용하여 독립적인 기능을 가지는 IL-4, IL-13, IL-5의 활성을 동시에 저해하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, IL-4Rα와 IL-5Rα를 모두 발현하는 이펙터(effector) 세포 (호산구, 비만세포 등)에 작용하여 중복되는 기능을 가지는 IL-4, IL-13, IL-5의 활성을 동시에 저해하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, IL-4Rα와 IL-5Rα를 모두 발현하는 표적세포에 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하여 세포표면에 발현된 두 항원을 모두 이용하여 더 많이 표지함으로써 각 항원에 대한 단일클론항체보다 더 강한 결합 효과 (avidity effect)를 나타내는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, IL-4Rα와 IL-5Rα를 모두 발현하는 표적세포에 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하여 세포표면에 발현된 두 항원을 모두 이용하여 더 많이 표지함으로써, 각 항원에 대한 단일클론항체보다 더 강한 세포성장 저해 효과를 가지는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한, IL-4Rα와 IL-5Rα를 모두 발현하는 표적세포에 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하여 세포표면에 발현된 두 항원을 모두 이용하여 더 많이 표지함으로써, 각 항원에 대한 단일클론항체보다 단일클론항체더 강한 항체 의존적 세포 독성 (Antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC)를 유도하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 및 이러한 핵산을 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다:
(a) 상기 세포를 배양하여 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생산된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 이러한 질환에 대한 진단용 조성물에 관한 것이다.
도 1는 항-IL-4Rα 항체의 친화도 향상을 위해 4R34.1.19 기반으로 구축된 라이브러리의 구축 전략을 나타낸 모식도이다. 중쇄가변영역의 CDR2 부분과 경쇄가변영역의 CDR3 부분에 라이브러리를 주었다.
도 2A는 항-IL-4Rα 항체들의 sIL-4Rα (soluble IL-4Rα)항원 단백질에 대한 특이적 결합을 확인하기 위한 indirect ELISA 결과를 나타낸다.
도 2B는 선별된 항-IL-4Rα 항체들의 친화도를 분석한 binding isotherms를 나타낸 것이다.
도 3는 친화도가 개량된 항-IL-4Rα 항체들의 HEK-블루(Blue)-IL-4/IL-13 세포를 이용한 IL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 정도를 평가한 결과이다.
도 4A는 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 sIL-5Rα (soluble IL-5Rα)항원 단백질에 대한 특이적 결합을 확인하기 위한 indirect ELISA 결과를 나타낸다.
도 4B는 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 친화도를 분석한 binding isotherms를 나타낸 것이다.
도 5A는 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 TF-1/IL-5Rα 세포에서의 IL-5 의존적 세포 성장 억제능을 여러 항체 농도에서 벤랄리주맙 유사체와 비교하여 평가한 결과를 나타낸다.
도 5B는 건강한 기증자와 중증 천식 환자들의 말초혈액에서 정제한 호산구를 이용하여 항-IL-5Rα 인간화 항체의 호산구 증식 억제능을 평가한 결과이다.
도 5C는 건강한 기증자와 중증 천식 환자들의 말초혈액에서 정제한 호산구와 NK cell를 이용하여 항-IL-5Rα 인간화 항체의 ADCC를 평가한 결과이다.
도 6는 IL-4α×IL-5Rα 이중특이항체를 구축에 있어 3가지 포맷의 대표도와 특징, 구축한 클론명을 제시한다.
도 7A는 IL-4α와 IL-5Rα에 동시에 결합할 수 있는 scIgG 포맷의 이중특이항체 개략도를 제시한다.
도 7B는 scIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터이고 나머지는 중쇄와 경쇄의 도메인을 표시하였다.
도 7C는 IL-4α와 IL-5Rα에 동시에 결합할 수 있는 BsIgG 포맷의 이중특이항체 개략도를 제시한다.
도 7D는 BsIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터이고 나머지는 중쇄와 경쇄의 도메인을 표시하였다. 회색 박스에 IL-4α와 IL-5Rα에 대한 항원 결합부위와 이종이중체 Fc 도시되어 있다.
도 8A는 scIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 8B는 scIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 Size Exclusion Chromatography (SEC) 분석 결과를 나타낸다.
도 8C는 BsIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 8D는 BsIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 9A는 IL-4α와 IL-5Rα에 동시에 결합할 수 있는 IgG-scFv (구체적으로 4R-IgG-5R-HLscFv) 포맷의 이중특이항체 개략도를 제시한다.
도 9B는 4R-IgG-5R-HLscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터이고 나머지는 중쇄와 경쇄의 도메인을 표시하였다.
도 9C는 IL-4α와 IL-5Rα에 동시에 결합할 수 있는 IgG-scFv (구체적으로 4R-IgG-5R-LHscFv) 포맷의 이중특이항체 개략도를 제시한다.
도 9D는 4R-IgG-5R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터이고 나머지는 중쇄와 경쇄의 도메인을 표시하였다. 회색 박스에 IL-4α와 IL-5Rα에 대한 항원 결합부위와 야생형 Fc 도시되어 있다.
도 10A는 4R-IgG-5R-HLscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 10B는 4R-IgG-5R-HLscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 10C는 4R-IgG-5R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 10D는 4R-IgG-5R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 11A는 IL-4α와 IL-5Rα에 동시에 결합할 수 있는 IgG-scFv (구체적으로 5R-IgG-4R-HLscFv) 포맷의 이중특이항체 개략도를 제시한다.
도 11B는 5R-IgG-4R-HLscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터이고 나머지는 중쇄와 경쇄의 도메인을 표시하였다.
도 11C는 IL-4α와 IL-5Rα에 동시에 결합할 수 있는 IgG-scFv (5R-IgG-4R-LHscFv) 포맷의 이중특이항체 개략도를 제시한다.
도 11D는 5R-IgG-4R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터이고 나머지는 중쇄와 경쇄의 도메인을 표시하였다. 회색 박스에 IL-4α와 IL-5Rα에 대한 항원 결합부위와 야생형 Fc 도시되어 있다.
도 12A는 5R-IgG-4R-HLscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 12B는 5R-IgG-4R-HLscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 12C는 5R-IgG-4R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 12D는 5R-IgG-4R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 13는 5R-IgG-4R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 항체 서열에 따른 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 14는 5R-IgG-4R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 항체 서열에 따른 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 15A는 IL-4α와 IL-5Rα에 동시에 결합할 수 있는 4R-LL-5R 이중특이항체 포맷의 개략도를 제시한다.
도 15B는 4R-LL-5R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터이고 나머지는 중쇄와 경쇄의 도메인을 표시하였다.
도 15C는 IL-4α와 IL-5Rα에 동시에 결합할 수 있는 4R-SL-5R 포맷의 이중특이항체 개략도를 제시한다.
도 15D는 4R-SL-5R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터이고 나머지는 중쇄와 경쇄의 도메인을 표시하였다. 회색 박스에 IL-4α와 IL-5Rα에 대한 항원 결합부위와 야생형 Fc 도시되어 있다.
도 16A는 4R-LL-5R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 16B는 4R-SL-5R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 16C는 4R-SL-5R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 17A는 IL-4α와 IL-5Rα에 동시에 결합할 수 있는 5R-LL-4R 이중특이항체 포맷의 개략도를 제시한다.
도 17B는 5R-LL-4R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터이고 나머지는 중쇄와 경쇄의 도메인을 표시하였다.
도 17C는 IL-4α와 IL-5Rα에 동시에 결합할 수 있는 5R-SL-4R 포맷의 이중특이항체 포맷의 개략도를 제시한다.
도 17D는 5R-SL-4R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터이고 나머지는 중쇄와 경쇄의 도메인을 표시하였다. 회색 박스에 IL-4α와 IL-5Rα에 대한 항원 결합부위와 야생형 Fc 도시되어 있다.
도 18A는 5R-LL-4R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 18B는 5R-SL-4R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 확인하는 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 19는 4R-SL-5R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 항체 서열에 따른 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다.
도 20는 4R-SL-5R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 항체 서열에 따른 SEC 분석 결과를 나타낸다.
도 21는 항-IL-4α 항체와 항-IL-5Rα 항체, 포맷이 다른 이중특이항체 3종 (BsIgG, 5R-IgG-4R-LHscFv, 4R-SL-5R)의 sIL-4α와 sIL-5Rα 항원결합능을 indirect ELISA 로 평가한 것을 나타낸다.
도 22는 건강한 기증자 (Healthy controls)의 말초 혈액 (Peripheral blood)에서 분리한 과립구 (granulocytes)층 (호중구+호산구)을 유세포 분석기를 사용하여 분석하여 호산구의 IL-4α와 IL-5Rα의 발현량을 분석한 결과를 나타낸다.
도 23은 건강한 기증자의 말초 혈액에서 정제한 호산구를 이용하여 IL-4와 IL-5에 의한 호산구 증식을 단일클론항체 (4R34.1.19/5R65)와 이중특이항체 2종의 저해능을 평가한 것을 나타낸다.
도 24는 건강한 기증자의 말초 혈액에서 정제한 호산구와 NK-cell을 이용하여 단일클론항체 (벤랄리주맙 아날로그/5R65)와 이중특이항체 2종의 항체 의존적 세포 독성 (ADCC)을 평가한 것을 나타낸다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따르면 본 발명에서는 마우스 면역 (mouse immunization) 및 인간화를 수행하여 새로운 항-IL-5Rα 인간화 항체를 개발하였다.
본 발명의 실시예에서 단일클론항체 (항-IL-4Rα 항체 및 항-IL-5Rα 항체)보다 더 강하게 표적 세포 (IL-4Rα, IL-5Rα를 발현하는 세포)에 항체 의존적 세포 독성 (Antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC)을 유도하는 신규 이중특이항체 또는 이의 항원 결합단편을 확인하였다.
이를 바탕으로, 본 발명은 일 관점에서 서열번호 65로 표시되는 인터루킨 (IL)-4 수용체 α (IL-4Rα, CD124)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 서열번호 66으로 표시되는 인터루킨 (IL)-5 수용체 α (IL-5Rα, CD125)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체에 관한 것이다.
본 발명에서는 두 개 이상의 항원 단백질에 동시에 결합할 수 있는 다양한 포맷 (format)의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 구축 및 발현하였다.
본 발명에서 용어, "이중특이항체"이란 서로 다른 두 종류의 항원(표적 단백질)에 결합할 수 있는 단백질을 의미한다. 구체적으로는 자연적으로는 존재하지 않으며, 유전공학 또는 임의의 방법에 의해 제조된 형태임이 바람직하다.
상기 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편은 T-cells, B-cells, 내피 세포 (endothelial cells) 등에서 발현되는 IL-4Rα 및 호산구, 호염기구, 비만세포에서 발현되는 IL-5Rα과 결합할 수 있다. 본 발명의 "이중특이항체"는 "이중표적항체", "이중 항체" 또는 "이중 항체 단백질" 등과 혼용될 수 있다. 바람직하게 본 발명의 이중특이항체는 IL-4Rα 및 IL-5Rα를 항원으로 할 수 있다. 본 발명의 상기 이중특이항체의 형태는 특별히 이에 제한되지 않으나, IgG 형태를 기반으로 구축된 형태를 포함한다.
상기 이중특이항체는 직접적으로 또는 링커 (linker)를 통해 항원 결합 부위가 연결되거나 정전기적 상호작용에 의해 이종이중체 (heterodimer)를 이룰 수 있는 분자를 지칭한다.
"결합가 (valent)"는 분자 내의 항원에 특이적인 명시된 숫자의 결합 부위의 존재를 지칭한다. 그렇기 때문에, 용어 "1가", "2가", "4가", 및 "6가"는 분자 내의 항원에 특이적인 각각 1개, 2개, 4개, 및 6개의 결합 부위의 존재를 지칭한다.
"이중특이 항-IL-4α/IL-5α 항체"는 IL-4α에 특이적으로 결합하는 도메인 및 IL-5α에 특이적으로 결합하는 도메인을 갖는 이중특이성 항체를 지칭한다. IL-4α 및 IL-5α에 특이적으로 결합하는 도메인들은 전형적으로 VH/VL 쌍이며, 이중특이 항-IL-4α/IL-5α 항체는 IL-4α 및 IL-5α에 결합하는 VH/VL 쌍에 따라 1가 또는 2가로 구분할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 다중특이항체를 포함한다.
다중특이적 항체는 적어도 3 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 항체를 의미한다. 다중특이적(multi-specific) 항체는 삼중특이적(Tri-specific) 이상의 항체, 예를 들어 삼중특이적(Tri-specific) 항체, 사중특이적(Tetra-specific) 항체 또는 그 이상의 타겟을 표적하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다특이항체, 단일클론항체, 전장(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 전장 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전장 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체는 일가 (monovalent), 이가 (bivalent), 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody) 및 테트라바디 (tetrabody)를 포함할 수 있다.
상기 항체는 다중특이 항체, 뮤린, 인간, 인간-적응화 (human-adapted), 인간화 및 키메라 단일클론항체를 포함하는 단일클론항체, 항체 단편, 이중특이성 또는 다중특이성 항체, 이량체성, 사량체성, 또는 다량체성 항체, 및 단일쇄 항체를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다.
본 발명에서 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역글로불린(Immunoglobulin G, IgG) 형태의 IL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 및 IL-5Rα에 특이적으로 결합하는 전장 항체, Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG 또는 single chain Fv (scFv) 형태의 단백질이 링커로 연결된 형태일 수도 있으며, 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc) 기반 기술을 응용한 IgG 형태의 항체일 수도 있다 ((Choi et al., 2013); 대한민국 특허등록 제10-1522954호).
구체적으로, 본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 및 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)에 결합된 scIgG 또는 BsIgG 포맷(format)인 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체;
상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 IgG의 C-말단에 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 scFv가 연결된 IgG-scFv 포맷인 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체; 또는
상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 IgG의 N-말단에 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 이 병치되어 있는 포맷을 포함하는 DVD(dual variable domain) IgG 포멧인 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 포맷 또는이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 아형(subtype)을 포함하며, 특히 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변영역은 감마(γ뮤(μ), 알파(α), 델타(δ및 엡실론(ε타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ감마2(γ감마3(γ감마4(γ알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ및 람다(λ 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나 (예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.
"단일쇄 Fv (scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체는 단일클론항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 중쇄 불변영역은 감마(γ뮤(μ), 알파(α), 델타(δ또는 엡실론(ε중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1 (IgG1), 감마 2 (IgG2), 감마 3 (IgG3) 또는 감마 4 (IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
상기 단일클론항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체와는 대조적으로, 각각의 단일클론항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
예를 들어, 본 발명에서 유용한 단일클론항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 단일클론항체는 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
"에피토프(epitope)"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위(determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는 점에서 구별된다.
IL-4Rα는 T-cell, B-cell, 비만세포, 호산구, 내피 세포와 같은 여러 종류의 이펙터(effector) 세포 (effector cells)에 발현이 보고 되어있다. 반면에 IL-5Rα는 호산구, 호염기구, 비만세포에만 한정적으로 발현되어 있다고 보고된 바 있다. 따라서 IL-4Rα 및 IL-5Rα에 결합하는 이중특이항체는 IL-4Rα 또는 IL-5Rα를 발현하는 다양한 이펙터(effector) 세포에 결합하여 작용할 수 있을 뿐만 아니라 두 항원 (IL-4Rα 및 IL-5Rα)이 모두 발현되어 있는 호산구, 호염기구, 비만세포에 더 강한 결합 효과 (avidity)를 나타내며 특이적으로 결합할 수 있다.
T-cell, B-cell, 호산구, 호염기구, 비만 세포 등의 염증성 반응을 나타내는 이펙터(effector) 세포의 분화, 성장, 이동, 독성 단백질의 분비와 같은 활성 작용에는 사이토카인들에 의해서 유발된다. 이러한 사이토카인들은 중복되는 기능을 가지거나 자체의 고유한 기능을 가지고 염증 반응을 유도한다. 따라서 하나의 사이토카인의 작용을 저해한다 해도 또 다른 사이토카인이 이펙터(effector) 세포들을 활성화시킬 수 있다. IL-4Rα 및 IL-5Rα에 결합하는 이중특이항체는 Th2 사이토카인 (IL-4, IL-5, IL-13)들을 동시에 저해함으로써 염증성 반응을 일으키는 여러 경로를 동시에 차단할 수 있다.
예를 들어 FDA 승인받은 항체인, 두필루맙 (dupilumab)은 아토피, 천식과 같은 질환의 치료제로 사용되고 있다. 하지만 두필루맙을 투여받은 환자의 말초 혈액 내의 호산구 수가 증가하였다. 이는 두필루맙이 내피세포 (endothelial cell)에 작용하여 호산구의 이동을 저해하였기 때문이라 여겨진다. IL-5Rα 및 IL-4Rα에 결합하는 이중특이항체는 IL-5 경로 차단을 통해 호산구의 증식 및 활성을 억제하는 방법과 IL-4/IL-13 경로를 차단하여 더 넓은 범위의 Th2 염증 반응을 억제하는 것을 병행하는 것이 넓은 범위의 환자 군에서 더 높은 치료 효과를 나타낼 수 있을 것이다. 또한 IL-4Rα 및 IL-5Rα에 결합하는 이중특이항체는 두 항원 (IL-4Rα 및 IL-5Rα)이 모두 발현되어 있는 호산구, 호염기구, 비만세포에 더 강한 항체 의존적 세포 독성을 유도할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 항체 내의 아미노산 잔기의 넘버링은, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 바와 같이 Kabat 넘버링과 EU 인덱스에 따라 수행된다.
본 발명에 있어, IL-4Rα에 결합하는 항체 및 IL-5Rα에 결합하는 항체는 서열 번호 65의 IL-4Rα와 서열 번호 66의 IL-5Rα에 대해 결합능을 가진다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000001
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000002
용어 "친화도"는 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력으로, 항체의 항원에 대한 특이성과 함께 고도의 친화도는 면역 반응에서 중요한 요소이다. 상기 친화도 상수(KD)는 표면 플라스몬 공명(SPR), 예를 들어 BIAcore, bio-layer interferometry를 사용하여 결정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명 데이터를 통해 1:1 랑뮈어 결합 모델 (동시에 kon koff) 및 속도 상수 koff/kon의 비율에서 산출된 친화도 상수(KD)를 얻는다.
본 발명에 따른 이중특이항체의 IL-4α 및 IL-5Rα 각각에 대한 결합 친화성은 10-5M 내지 10-12　M 범위 내에 있다. 예를 들어, 결합 친화성은 10-6　M 내지 10-12　M, 10-7　M 내지 10-12　M, 10-8　M 내지 10-12　M, 10-9　M 내지 10-12　M, 10-5　M 내지 10-11　M, 10-6　M 내지 10-11　M, 10-7　M 내지 10-11　M, 10-8　M 내지 10-11　M, 10-9　M 내지 10-11　M, 10-10　M 내지 10-11　M, 10-5　M 내지 10-10　M, 10-6　M 내지 10-10　M, 10-7　M 내지 10-10　M, 10-8　M 내지 10-10　M, 10-9　M 내지 10-10　M, 10-5　M 내지 10-9　M, 10-6　M 내지 10-9　M, 10-7　M 내지 10-9　M, 10-8　M 내지 10-9　M, 10-5　M 내지 10-8　M, 10-6　M 내지 10-8　M, 10-7　M 내지 10-8　M, 10-5　M 내지 10-7　M, 10-6　M 내지 10-7　M 또는 10-5　M 내지 10-6　M이다.
본 발명의 실시예에서, sIL-4α 또는 sIL-5Rα에 특이적으로 결합하는 항체 CDR 영역의 친화도 개량을 위해 라이브러리를 구축할 수 있으며, (1) 라이브러리 주형 항체의 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)의 항원 결합에 관여하는 6 개의 상보성 결합 부위 (CDR) 중 sIL-4α 또는 sIL-5Rα에 결합할 가능성이 높은 아미노산 자리를 선정하는 단계; (2) 상기 선정한 아미노산 자리에, 라이브러리에 포함되길 원하는 아미노산을 코딩할 수 있는 스파이크 올리고머 (spiked oligonucleotide) 및 디제너레이트 코돈(degenerated codon primer)를 디자인하는 단계; 및 (3) 상기 디자인한 중쇄가변영역과 경쇄가변영역 라이브러리를 효모표면발현 시스템을 이용하여 scFab 또는 Fab 형태로 발현하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 sIL-4α 또는 sIL-5Rα에 특이적으로 결합하는 항체 scFab의 분리 및/또는 친화도 개량을 위해 라이브러리를 이용하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 sIL-4α 또는 sIL-5Rα에 특이적으로 결합하는 항체 스크리닝 방법은 구체적으로,
(1) sIL-4α 또는 sIL-5Rα에 결합할 수 있는 항체 scFab 라이브러리를 효모표면발현 시스템을 이용하여 발현하는 단계;
(2) Hit Tag이 융합된 형태의 sIL-4α 또는 sIL-5Rα 발현 벡터 구축 및 발현 단계;
(3) sIL-4α 또는 sIL-5Rα와 상기 라이브러리를 결합시키는 단계; 결합된 sIL-4α 또는 sIL-5Rα를 해리 시킬 수 있는 조건을 조성 후에도 sIL-4α 또는 sIL-5Rα와 결합하고 있는 효모를 선별하는 단계 (키네틱 스크리닝 (Kinetic screening)) 및
(4) 상기 sIL-4α 또는 sIL-5Rα 와 상기 라이브러리 결합의 친화도를 측정하는 단계; 를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 항-IL-4α 항체 또는 항-IL-5Rα 항체는 효모표면에 발현된 인간항체 Fab 라이브러리 (Human Fab Antibody Library on Yeast Cell Surface)에서 sIL-4α 또는 sIL-5Rα에 대한 항체를 선별하고, 추가적으로 친화도 향상을 위해 효모표면에 항체 scFab 라이브러리를 구축하고 키네틱 스크리닝 (Kinetic screening)을 통해 선별한, sIL-4α 또는 sIL-5Rα에 고친화도로 선택적으로 결합하는 항체이다.
라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
용어 "치환하는" 또는 "치환된" 또는 "돌연변이화하는" 또는 "돌연변이화된"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내에 그 서열의 변이체를 생성시키기 위해 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 변경, 결실, 또는 삽입하는 것을 지칭한다.
상기 "인간화 (humanization)" 형태의 비-인간(예: 마우스) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본 발명에서 사용된 항체의 "가변영역"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 의미한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 의미한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 의미한다.
"상보성 결정 영역(complement determining region, CDR)"은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 의미한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 발명에 있어, 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1; 서열번호 2 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR2; 서열번호 8의 중쇄 CDR3; 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1; 서열번호 14의 경쇄 CDR2; 서열번호 15 내지 20로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 15의 경쇄 CDR3;
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 3의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 4의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 17의 경쇄 CDR3;
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 17의 경쇄 CDR3;
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 7의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 18의 경쇄 CDR3;
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 3의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 20의 경쇄 CDR3를 포함할 수 있다.
구체적으로, IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 1 및/또는 표 3에 기재된 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 66으로 표시되는 IL-5Rα의 서열 중 도메인 3(domain 3, D3)에 해당하는 아미노산 잔기 221번 내지 322 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식할 수 있다.
상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 중쇄 CDR1; 서열번호 28의 중쇄 CDR2; 서열번호 29 내지 35로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR3; 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1; 서열번호 44의 경쇄 CDR2; 서열번호 45의 경쇄 CDR3를 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 29의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3;
서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 30의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3;
서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 31의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3;
서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 32의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3;
서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 33의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3;
서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 34의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3; 또는
서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 6 및/또는 표 8에 기재된 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
"골격 영역(Framework region, FR)"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 FR을 갖는다.
본 발명에 있어, 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 9 내지 14로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호 21 내지 26로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 9의 중쇄 가변영역 및 서열번호 21의 경쇄 가변영역;
서열번호 10의 중쇄 가변영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변영역;
서열번호 11의 중쇄 가변영역 및 서열번호 23의 경쇄 가변영역;
서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변영역;
서열번호 67의 중쇄 가변영역 및 서열번호 23의 경쇄 가변영역;
서열번호 68의 중쇄 가변영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변영역;
서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 24의 경쇄 가변영역;
서열번호 10의 중쇄 가변영역 및 서열번호 25의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 26의 경쇄 가변영역.
본 발명에 따른 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2 및/또는 표 4에 기재된 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 포함할 수 있다.
상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 36 내지 42로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및/또는 서열번호 46로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 36의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역;
서열번호 37의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역;
서열번호 38의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역;
서열번호 39의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역;
서열번호 40의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역;
서열번호 41의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 42의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역.
본 발명에 따른 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 7 및/또는 표 9에 기재된 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편에는 본 발명에 따른 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편에서, 보존적 치환을 통해 아미노산 서열의 일부가 치환된 항체 또는 이의 항원 결합 단편도 포함된다.
본 명세서에서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 변형을 의미한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체시키는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 본 발명의 항체가 보존적 아미노산 치환을 갖고 여전히 활성을 보유할 수 있음이 예상된다.
본 발명의 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편은 목적하는 기능을 유지하는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 즉, 앞서 본 바와 같이 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 이중특이항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 이중특이항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다.
"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 이중특이항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 분자생물학적 수법을 사용하여 (예를 들어, 항체와 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성할 수 있으며, 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나(DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Qiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 이중특이항체를 생성시키기 위해 사용된 숙주세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis 및 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas, 예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 숙주세포를 배양하여 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는(IL-4Rα×IL-5Rα) 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및 생성된 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로는 본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법은
(a) 본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하는 숙주 세포를 배양하여 본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생산된 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 숙주세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
상기 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자 및 리포좀으로 구성된 군으로부터 선택된 생체활성분자가 융합된 접합체에 관한 것이다.
상기 단백질은 항체, 항체의 단편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 또는 화학적으로 개질된 단백질 등일 수 있다.
상기 소분자 약물은 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니며 질병의 치료제로서 활성도를 지니는 유기 화합물, 무기 화합물 또는 유기금속 화합물을 나타내는 것으로 본원에서 광범위하게 사용된다. 본원에서 소분자 약물은 올리고펩티드 및 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니는 그 밖의 바이오분자(biomolecule)를 포함한다.
상기 나노입자는 직경 1 내지 1000 nm 크기를 갖는 물질들로 이루어진 입자를 의미하며, 상기 나노 입자는 금속 나노 입자, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 금속/금속 코어쉘 복합체, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 비금속 쉘로 구성되는 금속/비금속 코어쉘 또는 비금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 비금속/금속 코어쉘 복합체일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐, 백금, 자성철 및 그의 산화물로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 상기 비금속은 실리카, 폴리스티렌, 라텍스 및 아크릴레이트 계열의 물질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 리포좀은 자기 스스로 회합할 수 있는, 수성 내부 구획을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층 막으로 구성된다. 리포좀은 막 타입 및 그 크기에 의하여 특정 수 있다. 작은 유니라멜라 소포(SUV)는 단일막을 갖고 20nm 내지 50nm의 직경을 가질 수 있다. 큰 유니라멜라 소포(LUV)는 50nm이상의 직경을 가질 수 있다. 올리고라멜라 큰 소포 및 멀티라멜라 큰 소포는 다중, 일반적으로 동심원, 막 층을 가지고 직경이 100nm 이상일 수 있다. 여러 비동심원 막을 가진 리포좀, 즉 더 큰 소포 내에서 포함된 여러 작은 소포는 멀티소포성 소포(multivesicular vesicle)라고 한다.
본 명세서에서 “융합 (fusion)”은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀에 상기 종양 침투성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 연결자 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 연결자 펩타이드는 본 발명의 항체 경쇄 가변 영역, 항체, 또는 이의 절편의 다양한 위치에서 상기 생체 활성 분자와의 융합을 중계할 수 있다.
본 명세서에서 "이펙터 기능 (effector function)"은 항체의 Fc 영역 (Fc 영역의 야생형 서열 또는 Fc 영역의 아미노산 서열의 변이체)과 관련된 생물학적 활성의 유형을 말하며, 항체의 이소 타입에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q결합, 보체 의존적 세포 독성 (CDC); Fc 수용체 결합, 항체 의존적 세포-매개 세포 독성 (ADCC), 식균 작용 (phagocytosis), 세포 표면 수용체 (예를 들어, B- 세포 수용체, BCR)의 하향 조절 및 B- 세포 활성화가 있다.
"항체-의존적 세포 독성 (antibody-dependent cellular cytotoxicity)" 또는 "ADCC"는 특정 항체에 의해 표지된 표적 세포를 이펙터 세포가 (예를 들어 T-cell, NK-cell) 용해시키는 반응을 지칭한다. ADCC는 또한 표적을 용해시키지만 다른 세포를 필요로 하지 않는 면역 보체 시스템과는 독립적이다. ADCC는 전형적으로 면역 글로불린 G (IgG) 항체와 상호 작용하는 자연 살해 (NK) 세포인 것으로 알려진 이펙터 세포를 필요로 한다. 그러나 대식세포 (macrophages), 호중구 (neutrophils) 및 호산구 (eosinophils)는 ADCC를 매개할 수 있는데, 예를 들어 IgE 항체를 통해 기생충으로 알려진 특정 기생충 벌레를 죽이는 호산구와 같은 ADCC도 중재할 수 있다.
본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편에 접합될 수 있는 생체활성분자는 소분자 약물, 특히 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환, 예시적으로 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 및 류마티스성 관절염 등에 치료효과가 있는 약물이 바람직하며,
보다 바람직하게는 인다카테롤(indacaterol), 포르모테롤(formoterol), 비란테롤(vilanterol), 알부테롤(albuterol), 레바부테롤(levalbuterol), 티오필린(theophylline) 등의 베타 길항제(beta agonists); 이프라트로피움(ipratropium), 티오트로피움(tiotropium), 글리코피롤레이트(glycopyrrolate) 등의 항-콜린 제제(Anticholinergic agent); 몬테루카스트(montelukast), 자피루카스트(zafirlukast) 질루톤(zileuton) 등의 류코트리엔 조절자(Leukotriene modifiers) 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "IL-4, IL-5, IL-13의 활성을 저해한다"는 것은 본 발명의 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하여 표적하는(IL-4Rα×IL-5Rα) 이중특이항체가가 IL-4 또는 IL-5에 의해 유도되는 세포 활성을 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%로 억제하는 능력을 지칭한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합단편을 유효성분으로 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환, 특히 호산구 증가증에 의한 질환 등의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이용하여 치료가능한 질환의 예로는 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기 등의 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 류마티스성 관절염; 가와사키병 (Kawasaki disease); 겸상 적혈구증(sickle cell disease); 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome); 그레이브스병(Grave's disease); 전-자간증(pre-eclampsia); 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome); 자가면역 림프세포증식 증후군; 자가면역 용혈빈혈(autoimmune hemolytic anemia); 바레트 식도(Barrett's esophagus); 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis); 결핵; 신장증; 포진; 만성 특발성 두드러기; 피부경화증; 비대 흉터형성; 휘플병(Whipple's Disease) ; 양성 전립선 과다형성; 경증; 및 염증성 창자병 등의 염증 장애 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 (a) 본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 대한 것이다.
본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합단편을 투여하는 단계를 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체는 IL-4, IL-5 및/또는 IL-13 활성을 제거하거나 억제하거나 감소시킴으로써, IL-4, IL-5 및/또는 IL-13 매개 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 본 발명에 따른 항체는 IL-4Rα 및/또는 IL-5Rα에 결합하여 IL-4, IL-5 및/또는 IL-13 활성과 관련된 질환의 치료에 사용된다.
상기 자가 면역 질환 또는 관련자가 면역 상태를 치료하기 위해, 본 발명의 이중특이항체는 다약 요법을 사용하여 다른 치료제와 조합하여 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역 억제제와 동시에, 순차적으로 또는 교대로, 또는 다른 요법에 대한 내성이 나타난 후에 투여될 수 있다. 면역 억제제는 당업계에 사용된 것과 동일하거나 더 적은 용량으로 투여될 수 있다. 선호되는 면역 억제제의 선택은 치료해야 할 질병의 유형과 환자의 병력을 포함한 많은 요소에 따라 달라질 수 있다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환 발전의 억제, 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 경감 등을 의미한다. 본 발명의 항체는 IL-4Rα 및/또는 IL-5Rα 발현 세포와 관련된 적용의 경우에 시험관 내 및 생체 내 모두에서 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합단편; 또는 상기 접합체를 함유할 수 있으며, 상기 성분에 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 위하여 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 약학적으로 허용가능한 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 접합체를 이용한 치료 방법은 상기 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합단편; 또는 접합체를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 자명한 일이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 조성물을 투여하는 개체는 인간을 포함한 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경우 또는 비경우의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합단편은 단독 약물 또는 기존 치료제와의 병용치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체와 병용치료를 위해 사용될 수 있는 약물로는, 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환, 예시적으로 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 및 류마티스성 관절염 등의 치료를 위해 사용되는 약물이라면 제한없이 사용가능하며,
바람직하게는 인다카테롤(indacaterol), 포르모테롤(formoterol), 비란테롤(vilanterol), 알부테롤(albuterol), 레바부테롤(levalbuterol), 티오필린(theophylline) 등의 베타 길항제(beta agonists); 이프라트로피움(ipratropium), 티오트로피움(tiotropium), 글리코피롤레이트(glycopyrrolate) 등의 항-콜린 제제(Anticholinergic agent); 몬테루카스트(montelukast), 자피루카스트(zafirlukast) 질루톤(zileuton) 등의 류코트리엔 조절자(Leukotriene modifiers); 플루티카손 프로피오네이트(fluticasone propionate, 부데소나이드(budesonide), 서클소나이드(ciclesonide), 베틀로메타손(beclomethasone), 모메타손(mometasone), 플루티카손 퓨로에이트(fluticasone) 등의 흡입성 코르티코스테로이드(Inhaled corticosteroids); 말리주맵(Omalizumab) 및 리젤리주맵(Ligelizumab 등의 항-IgE 항체 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 치료를 요하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 질병의 치료방법에 대한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 발병 여부 및 경과를 확인하는 것이다.
본 발명에 따른 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 사용한 진단 방법을 위해, 약물은 시험관 내 또는 생체 내에서 IL-5Rα 항원-발현 세포의 존재를 검출하는데 사용되는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 섬광조영술, 자기 공명 영상 또는 초음파를 사용하여 검출할 수 있는 표지와 같이, 생체내에서 검출할 수 있는 방사성 동위원소를 임상 진단 적용을 위해 사용할 수 있다. 유용한 섬광조영술 표지에는 양전자 방출기 및 γ-방출기가 포함된다. 마그네틱 공급원 영상화용으로 대표적인 조영제로는 상자성 또는 초상자성 이온(예를 들면, 철, 구리, 망간, 크롬, 에르븀, 유로퓸, 디스프로슘, 홀뮴 및 가돌리늄), 산화철 입자 및 수용성 조영제가 있다. 초음파 검출을 위해, 가스 또는 액체를 마이크로버블(microbubble) 조영제로서 방출되는 다공성 무기 입자속 안에 포획시킬 수 있다. 시험관내 검출에 유용한 검출 가능한 표지에는 형광발색단, 검출가능한 에피토프 또는 결합제 및 방사성 표지가 포함된다.
상기 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
일 실시예에서 상기 키트는 병, 바이알, 백, 주사기 또는 시린지를 포함할 수 있다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 플라스틱, 또는 금속으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기에 포함된 라벨은 사용 지침을 나타낼 수 있다. 추가로 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예컨대 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 등을 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 4R34.1.19 기반 친화도 증가를 위한 효모 세포 표면 발현 라이브러리의 구축
앞선 4R34.1.19 항체 (Kim et al., 2019)의 생물학적 효능을 높이기 위해 IL-4Rα에 대한 친화도를 높이고자 하였다. IL-4Rα 항원에 대한 서열은 서열번호 65와 같다. IL-4Rα는 세포막 당단백질 (cell membrane glycoprotein)이기 때문에, 세포외 도메인(extracellular domain)인 서열번호 65로 표시되는 IL-4Rα의 서열을 동물세포 발현 벡터에 도입하여 발현한 것을 “sIL-4Rα”라 칭한다.
먼저 효모 표면에 single chain Fab (scFab) 형태로 발현시키기 위하여 NheI/ApaI으로 제한효소 처리한 pYDS-H 벡터에 4R34.1.19 항체를 scFab 형태로 구축하여 pYDS 4R34.1.19 scFab 벡터와 추가적인 한 개의 뉴클레오타이드를 도입하여 Open Reading Frame (ORF) 밀림 현상으로 스탑 코돈(stop codon)이 발생하는 pYDS-dummy 벡터를 클로닝하였다. pYDS-dummy 벡터를 사용함으로써 제한효소 처리가 안 된 벡터가 섞여 있다 하더라도 원하는 라이브러리 유전자가 들어간 벡터만이 효모 표면에 scFab을 발현할 수 있다. 라이브러리는 pYDS 4R34.1.19 scFab 벡터를 기반으로VH-CDR2, VL-CDR3 지역에 무작위적인 돌연변이를 도입하였다 (도 1). 동시에 많은 지역에 돌연변이를 도입하기 때문에 IL-4Rα에 대한 결합력을 잃지 않도록 하기 위하여 spiked 올리고머(spiked oligonucleotide)를 사용하였다. 이는 기존 야생형 4R34.1.19 서열을 50 % 확률로 보존하면서 모든 아미노산이 적용될 수 있는 돌연변이 방법으로서 아미노산을 코딩하는 3개 뉴클레오타이드에서 각각 야생형 뉴클레오타이드를 79 퍼센트 유지하고 나머지 뉴클레오타이드 비율을 7 퍼센트로 프라이머를 디자인함으로써 PCR 과정에서 야생형 아미노산이 50 퍼센트가 유지되도록 하는 기술이다.
Overlapping PCR을 수행해 라이브러리 유전자를 12 μg 과, pYDS dummy 벡터에도 NheI/ApaI 제한 효소를 하여 4 μg 준비하였다. 만약 제한 효소 처리가 되지 않은 pYDS dummy 벡터가 남아있어 효모 균주에 형질 전환되더라도 스탑 코돈에 의하여 효모 표면에 발현되지 않는다. 두 유전자는 혼합하여 효모표면 발현용 효모 AWT101 균주에 전기청공법으로 형질 전환하여 상동성 접합 (homologous recombination)을 통해 구축하였다. 이러한 과정을 12번 반복한 후 라이브러리 크기를 계단식 희석을 한 후 선택 배지 SD-CAA+Trp (20 g/L Glucose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4, 5 g/L casamino acids, 0.4 mg/L tryptophan)에 자란 콜로니의 수를 측정하여 확인하였으며, 약 1×108 수준의 라이브러리가 제작되었다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000003
실시예 2. 효모 scFab 라이브러리의 sIL-4Rα 항원 단백질에 대한 키네틱 스크리닝 (Kinetic screening)
구축된 라이브러리는 먼저 sIL-4Rα에 결합능을 보이는 클론을 선별하기 위하여 세포에 발현된 scFab (5×109 scFab효모)을 1nM의 바이오틴화된 IL-4Rα (biotinylated sIL-4Rα)에 결합시켜 자기 활성화 세포 분류 (Magnetic-activated cell sorting)로 선별하였다. 그 후에 IL-4Rα에 대해 느린 해리 속도 (slow dissociation)을 보이는 클론을 선별하기 위하여 카이네틱 스크리닝 (kinetic screening)을 수행하였다. 구체적으로 1차와 2차 FACS (fluorescence activated cell sorting)는 세포에 발현된 scFab (5×107 scFab효모)를 5nM의 바이오틴화된 sIL-4Rα 와 상온에서 30분간 결합시킨 후에 결합하지 않은 바이오틴화된 sIL-4Rα를 워싱하였다. 그 후에 효모에서 sIL-4Rα를 떨어뜨리기 위하여 1ml의 autoMACS®Running Buffer (phosphate buffered saline (PBS), bovine serum albumin (BSA), EDTA, and 0.09% azide, pH7.2, Miltenyi Biotec)에 다시 현탁한 후에 37°C에서 1시간 동안 shaking incubation 하였다. 3차와 4차 FACS는 재현탁시 50 nM의 비-바이오틴화된 sIL-4Rα를 추가하여 해리된 바이오틴화된 sIL-4Rα이 다시 결합하지 못하도록 경쟁시켰다. 5차 FACS는 해리된 바이오틴화된 sIL-4Rα를 제거시킨 후 다시 50 nM의 비-바이오틴화된 sIL-4Rα가 포함된 버퍼로 재현탁하는 과정을 4번 반복하였다. 매 차수에 해리 조건을 수행한 이후, anti-cMyc 항체인 9E10을 1:100으로 희석시켜 상온에서 15분간 결합시켜, 발현량을 확인할 수 있도록 하였다. 그 후에 PE가 접합된 streptavidin(Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate(SA-PE), Thermo)과 Alexa 488이 접합된 항-IgG 항 체(goat Alexa 488-conjugated anti-Fc antibody, Thermo)를 4°C에서 15분 동안 결합시킨 후 BD FACSAria™III 기기를 이용하여 scFab의 발현량이 높고, 바이오틴화된 sIL-4Rα와 결합을 유지하고 있는 상위 0.2~0.3%의 클론을 선별하였다.
위와 같은 선별을 통해 효모 세포 표면에 sIL-4Rα의 결합력이 높은 8개의 개별 클론 (4R.N1, 4R.N2, 4R.N3, 4R.N4, 4R.N5, 4R.N6, 4R.N7, 4R.N8)이 분리되었다.
표 1 및 2 각각은 4R34.1.19와 sIL-4Rα에 결합능을 보이는 선별된 8개의 개별클론의 중쇄 CDR 서열 및 중쇄가변영역의 서열이며, 표 3 및 4 각각은 경쇄 CDR 서열 및 경쇄가변영역의 서열이다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000004
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000005
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000006
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000007
실시예 3: 선별된 항-IL-4Rα 항체들의 IgG 전환 및 동정
scFab 형태의 선별된 8종의 항체는 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1의 형태로 변환시켰다. 대조군으로 두필루맙 (drugbank accession number; DB12159)과 선별된 항체의 가변영역(VH, VL)은 IgG1의 경쇄(CH1, CH2, CH3)와 중쇄(CL)를 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다. 이후 두필루맙은 두필루맙 유사체로 명명하였다. 각 항체들의 경쇄와 중쇄는 HEK293F 세포에 1:1 비율로 공통형질전환시켜 경쇄와 중쇄가 세포 안에서 함께 발현되도록 하였다.
상기 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지에서 부유 성장하는 HEK293F 세포를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크에 100 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 1.0 × 106 세포/ml의 밀도로 배지 90ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37°C에서 인큐베이션하였다. 플라스미드를 5 ml FreeStyle 293 발현 배지에 125 μg으로 희석 및 필터하여, PEI 375 μg을 희석한 5ml의 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10 분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 90 ml로 파종한 세포에 넣어 120 rpm, 8% CO2에서 6일동안 인큐베이션했다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 인큐베이션 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 상기 용출된 단백질은 Vivaspin 10,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 저장버퍼 (PBS pH7.4)로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다.
실시예 4: 선별된 항-IL-4Rα 항체들의 결합 특이성 분석
항체의 결합 특이성 (specificity)을 indirect ELISA를 이용하여 알아보았다. 4 개의 구조적으로 상이한 항원 이중 가닥 DNA (dsDNA), 인슐린, 거대 분자인 hemocyanin 및 막 구성 성분인 cardiolipin을 사용하여 다중 항원 ELISA를 수행하였다. 구체적으로, sIL-4Rα 항원 단백질 (50ng/웰, sinobio; 10402-H08H), sIL-5Rα 항원 단백질 (50ng/웰, sinobio; 10392-H08H), dsDNA (25ng/웰, D4522; Sigma), 인슐린 (125ng/웰, I9278; Sigma), hemocyanin (125ng/웰, H8283; Sigma), cardiolipin (1250ng/웰, C0563; Sigma) 단백질을 96-웰 플레이트에 넣고 상온에서 1시간 동안 고정시키고, 2% 분말 우유 (skim milk)를 포함하는 0.1% PBST PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl) 로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 100 nM이 되도록 항체를 희석하여 블로킹 된 플레이트에 웰당 25μl씩 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 2차 항체로 항 인간 Fc-HRP 항체 (1:8000)를 웰당 25μl씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 PBST 로 3 번 세척한 후, TMB 용액을 웰당 25μl씩 첨가하여 상온에서 ~2분 동안 발색 반응시킨 뒤, H2SO4 (2N)로 반응을 중지시키고, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 2A의 결과에서 확인할 수 있듯이, 4R34.1.19는 sIL-5Rα에는 결합능을 보이지만 나머지 항원에는 결합능을 보이지 않았고, 선별된 항-IL-4Rα 항체들(4R.N1, 4R.N2, 4R.N3, 4R.N4, 4R.N5, 4R.N6, 4R.N7, 4R.N8)은 sIL-5Rα 에도 결합능을 거의 보이지 않았고, 4종의 단백질에 대하여 결합능을 보이지 않아 sIL-4Rα에 대하여 결합 특이성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
실시예 5: 선별된 항-IL-4Rα 항체들의 결합능 분석
선별된 항-IL-4Rα 항체들(4R.N1, 4R.N2, 4R.N3, 4R.N4, 4R.N5, 4R.N6, 4R.N7, 4R.N8)에 대해서 sIL-4Rα에 대한 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 Octet QKe (ForteBio, USA) 기기를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 의하여 측정하였다. 구체적으로는, 카이네틱 버퍼 (PBS pH7.4 + 0.02% (v/v) Tween 20)에 항체를 1㎍/㎖의 농도로 희석하여 준비하고, sIL-4Rα (sinobio; 10402-H08H)은 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 및 0nM의 농도로 카이네틱 버퍼에 순차적으로 희석하여 각 200㎕씩 빛이 통과하지 않는 불투명한 96-웰 플레이트에 넣어주었다. AHC (anti-human IgG Fc capture) 센서칩이 카이네틱 버퍼, 항체 희석 용액, 카이네틱 버퍼, 항원 희석 용액, 카이네틱 버퍼의 순서로 옮겨가면서 항체에 항원이 결합했다가 떨어질 때 발생하는 굴절률의 변화를 통해 항체의 항원 친화도 (affinity)을 분석하였다. 친화도는 1:1 결합 모델로 Octet Data Analysis software 11.0으로 계산하였다. 그 결과를 도 2B에 나타내었다.
표 5는 Octet QKe를 이용하여 sIL-4Rα에 대한 선별된 항-IL-4Rα 항체들의 친화도 분석 결과를 나타낸다. 선별된 클론들은 43.1-170 pM 수준의 높은 친화도를 가지는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000008
실시예 6: 선별된 항-IL-4Rα 항체들의 IL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 저해능 평가
HEK-블루(Blue)-IL-4/IL-13 세포(Invivogen)는 IL-4 또는 IL-13에 의한 세포 신호 전달 활성화를 비색 분석법 (colorimetric analysis)로 모니터링하여 생물학적 활성을 비교할 수 있다. 이 세포는 IL-4 수용체와 IL-13 수용체를 충분히 발현하는 HEK293세포에 완전히 활성화된 STAT6 pathway를 부여하기 위해 human STAT6 유전자를 transfection하여 stable cell line으로 만든 것이다. 또한 이 세포는 STAT6-inducible SEAP(secreted embryonic alkaline phosphatase) reporter gene이 transfection 되어 있다. IL-4나 IL-13가 HEK-블루(Blue)-IL-4/IL-13 세포 표면에 발현된 IL-4 수용체나 IL-13 수용체에 결합하면 각각 Tyk2와 JAK1을 활성화시키고 STAT6를 모집하여 인산화시킨다. 활성형의 인산화된 STAT6는 이중체를 형성하고 핵으로 이동하여 responsive genes의 promoter에 결합하고 SEAP의 분비를 유도한다. 분비된 SEAP은 분홍색의 기질인 퀀티-블루(Quanti-Blue, Invivogen)를 보라색으로 발색시킨다. 발색의 정도는 IL-4와 IL-13의 존재 양과 양의 상관관계를 가지며, standard를 이용해 IL-4와 IL-13의 함량을 정량 할 수 있다. 때문에 이 세포는 항-IL-4/IL-4Rα 항체나 항-IL-13/IL-13Rα1 항체에 의한 IL-4나 IL-13 신호전달경로를 차단 여부를 스크리닝 하기에 용이하다.
도 3는 두필루맙 유사체와 비교하여 구축된 항-IL-4Rα 항체들의 IL-4 신호 차단효과를 HEK-Blue IL-4/13 세포의 SEAP 분비를 측정하여 확인한 결과이다. 구체적으로는, 세포를 배양 배지 (4.5 g/L 글루코스(Gibco/Invitrogen), 10％ 열 불활성화 FBS(Gibco/Invitrogen), 10 ㎍/mL 블라스티시딘(Blasticidin) S, 활성 펩티딜 뉴클레오시드 항생제(Invitrogen) 및 100 ㎍/mL 제오신(Zeocin)(상표명), 스트렙토마이세스가 있는 DMEM) 중에 2.5×105개/mL의 밀도로 희석하여 96-웰 플레이트에서 100 μl씩 분주하였다. 동일한 날에, 50 μl의 1000 pM 인간 IL-4 (Sinobio; 11846-HNAE)와 미리 8, 40 nM 또는 2, 10 nM로 희석한 항-IL-4Rα 항체 용액 50 μl를 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5％ CO2에서 20시간 배양시켰다. 분비된 SEAP을 측정하기 위하여, 20 μl의 각 세포 상청액을 투명 96-웰 플레이트에 넣고 180 μl의 퀀티-블루 용액과 혼합한 후, 96-웰 플레이트를 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켜 620 nm에서의 흡광도를 CytationTM 3 cell Imaging multi-mode reader로 분석하였다.
분석결과, 4R.N3, 4R.N4, 4R.N6, 4R.N7, 4R.N8은 두필루맙 유사체보다도 낮은 IL-4 신호차단효과를 보임을 확인하였다 (도 3).
실시예 7: 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 결합 특이성 분석
IL-5Rα는 세포막 당단백질 (cell membrane glycoprotein)이기 때문에, 세포외 도메인(extracellular domain)인 서열번호 66로 표시되는 IL-5Rα의 서열 중 아미노산 잔기 Asp1-Asn313) 부분을 동물세포 발현 벡터에 도입하여 발현한 것을 “α”라 칭한다. sIL-5Rα 항원을 이용해 쥐 면역 (mouse immunization) 및 인간화를 통해 항-IL-5Rα 인간화 항체인 hu2B7를 도출하였다. hu2B7을 기반으로 효모 세포 포면 발현 라이브러리를 구축하여 친화도가 증가된 5R65를 도출하였다. 다시 5R65를 기반으로 효모 세포 포면 발현 라이브러리를 이용해 친화도를 향상시키기 스크리닝을 진행하였다. 그 결과, 6종의 항-IL-5Rα 인간화 항체 (5R65.7, 5R65.10, 5R65.14, 5R65.18, 5R65.39, 5R65.45)를 도출하였다. 선별된 클론은 다음의 표 6 및 표 8에 기재된 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000009
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000010
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000011
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000012
항-IL-5Rα 인간화 항체들의 결합 특이성 (specificity)을 indirect ELISA를 이용하여 알아보았다. 4 개의 구조적으로 상이한 항원 이중 가닥 DNA (dsDNA), 인슐린, 거대 분자인 hemocyanin 및 막 구성 성분인 cardiolipin을 사용하여 다중 항원 ELISA를 수행하였다. 구체적으로, sIL-4Rα 항원 단백질 (50ng/웰, sinobio; 10402-H08H), sIL-5Rα 항원 단백질 (50ng/웰, sinobio; 10392-H08H), dsDNA (25ng/웰, D4522; Sigma), 인슐린 (125ng/웰, I9278; Sigma), hemocyanin (125ng/웰, H8283; Sigma), cardiolipin (1250ng/웰, C0563; Sigma) 단백질을 96-웰 플레이트에 넣고 상온에서 1시간 동안 고정시키고, 2% 분말 우유 (skim milk)를 포함하는 0.1% PBST PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl) 로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 100 nM이 되도록 항체를 희석하여 블로킹된 플레이트에 웰당 25μl씩 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 2차 항체로 항 인간 Fc-HRP 항체 (1:8000)를 웰당 25μl씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 PBST 로 3 번 세척한 후, TMB 용액을 웰당 25μl씩 첨가하여 상온에서 ~2분 동안 발색 반응시킨 뒤, H2SO4 (2N)로 반응을 중지시키고, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 4A의 결과에서 확인할 수 있듯이, 항-IL-5Rα 인간화 항체들(5R65, 5R65.7, 5R65.10, 5R65.14, 5R65.18, 5R65.39, 5R65.45)은 sIL-4Rα 및 4종의 단백질에 대하여 결합능을 보이지 않아 결합 특이성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
실시예 8: 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 결합능 분석
항-IL-5Rα 인간화 항체들 (5R65.7, 5R65.10, 5R65.14, 5R65.18, 5R65.39, 5R65.45)에 대해서 sIL-5Rα에 대한 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 Octet QKe (ForteBio, USA) 기기를 사용하여 제조사가 제안한 프로토콜에 의하여 측정하였다. 구체적으로는, 10x 카이네틱 버퍼 (ForteBio, 18-1105)를 PBS에 희석하여 1x 카이네틱 버퍼를 준비한다. 항체를 1x 카이네틱 버퍼에 1㎍/㎖의 농도로 희석하여 준비하고, 정제한 sIL-5Rα은 400, 200, 100, 12.5, 6.25 및 0nM의 농도로 1x 카이네틱 버퍼에 순차적으로 희석하여 각 200㎕씩 빛이 통과하지 않는 불투명한 96-웰 플레이트에 넣어주었다. AHC (anti-human IgG Fc capture) 센서 칩이 1x 카이네틱 버퍼, 항체 희석 용액, 1x 카이네틱 버퍼, 항원 희석 용액, 1x 카이네틱 버퍼의 순서로 옮겨가면서 항체에 항원이 결합했다가 떨어질 때 발생하는 굴절률의 변화를 통해 항체의 항원 친화도 (affinity)을 분석하였다. 친화도는 1:1 결합 모델로 Octet Data Analysis software 11.0으로 계산하였다. 그 결과를 도 4B에 나타내었다.
표 10는 Octet QKe를 이용하여 sIL-5Rα에 대한 선별된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 친화도 분석 결과를 나타낸다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000013
실시예 9: 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 TF-1/IL-5Rα 세포주에서의 IL-5 의존성 증식 억제능 비교
IL-5Rα을 안정적으로 발현하는 형질 전환된 TF-1 세포 (TF-1/IL-5Rα cell)를 이용하여 항-IL-5Rα항체들의 IL-5 의존적 세포 증식 억제능을 평가하였다. 대조군으로 벤랄리주맙 (drugbank accession number; DB12023)과 선별된 항체의 가변영역(VH, VL)은 IgG1의 경쇄(CH1, CH2, CH3)와 중쇄(CL)를 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다. 이후 벤랄리주맙은 벤랄리주맙 유사체로 명명하였다.
2x104 개의 TF-1/IL-5Rα cells를 96-웰 플레이트에 100μl씩 분주하였다. 동일한 날에 50μl의 320 pM의 IL-5과 미리 128nM에서 2배씩 희석한 항-IL-5Rα 인간화 항체 용액 50 μl의를 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5％ CO2에서 40시간 배양시켰다. 세포의 증식능을 측정하기 위하여, 각 웰로부터 100㎕의 세포현탁액을 회수한후 100㎕의 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo®프로메가사 제) 시료를 넣어주고 실온에서 20 분간 반응시켜 CytationTM 3 cell Imaging multi-mode reader로 분석하였다 (도 5A). 그 결과 벤랄리주맙 아날로그는 Absolute IC50 (Abs IC50) 값이 1.99 nM를 나타내며, 선별된 항-IL-5Rα 항체들 (5R65.7, 5R65.10, 5R65.14, 5R65.18, 5R65.39, 5R65.45)은 0.57 nM에서 1.34 nM의 범위에서 Abs IC50를 가져 벤랄리주맙 아날로그 보다 TF-1/IL-5Rα 세포주에서의 IL-5 의존성 증식 억제능이 향상됨을 알 수 있다. 특히 5R65.7이 가장 강한 증식 억제능을 나타내었다 (도 5A).
실시예 10: 친화도가 향상된 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 건강한 기증자 및 중증 천식 환자 유래 인체 호산구의 증식 억제능 평가
호산구는 알레르기성/염증성 질환에 관여하는 중요한 염증 세포이고, IL-5Rα가 발현된 대표적인 세포이다. IL-5는 호산구의 증식에 관여한다고 알려져 있기 때문에 인체유래 말초 혈액에서 호산구를 분리/정제하여 항-IL-5Rα 항체들의 호산구 증식 억제능을 평가하였다.
구체적으로, 50㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심관에 Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03)를 20㎖씩 분주하여 각각에 헤파린 처리를 한 환자 혈액 20㎖을 중층하였다. 이것을 879 × g, 실온에서 25 분간 원심분리하여 가장 아래층을 분리, 회수하였다. 2% 덱스트란 용액을 분주하여 적혈구(하층)과 과립구 층 (상층)을 분리하고 그 중 과립구 층을 회수하여 거기에 혼재하는 적혈구를 제거할 목적으로 27㎖ 멸균시킨 물과 3㎖ 10×HBSS를 분주하였다. 300×g, 4℃에서 10 분간 원심분리하여 적혈구를 제거한 농축된 과립구 (호산구, 호중구)를 분리, 회수하였다. 최종적으로 상업적으로 이용가능한 eosinophil Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec; 130-092-010)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 과립구에서 호산구만 정제하였다.
96 웰의 세포 배양용 플레이트에 5x104개/웰의 호산구를 분주하고, 최종농도 100pM의 인체 IL-5을 첨가하고 또한 최종농도 5nM, 20nM, 100nM의 항-IL-5Rα 항체들을 각각 첨가하였다. 각 항체에 대하여 2-3웰 배양하고 각 웰의 용량은 최종적으로 200㎕로 되도록 조제하였다. CO2인큐베이터 37℃에서 2 일간 배양하고, 배양 종료후 각 웰로부터 100㎕의 세포현탁액을 회수한후 100㎕의 셀타이터-글로 (CellTiter-Glo®) 프로메가사 제 시료를 넣어주고 실온에서 20 분간 인큐베이션한다. 마이크로플레이트 측정기로 발광을 측정하여 호산구의 증식능을 분석한다.
도 5B에서 5R65.7이 가장 강한 호산구 증식 억제능을 보였으며 이는 벤랄리주맙 유사체보다도 높았다.
실시예 11: 항-IL-5Rα 인간화 항체들의 건강한 기증자 및 중증 천식 환자 유래 인체 호산구의 항체-의존적 세포 독성 유도능 평가
FDA 승인된 벤랄리주맙은 afucosylated Fc를 가지고 있어 IgG1 Fc 보다 NK cell 등에 발현된 FcγRIIIa와의 친화력이 높아 더 높은 ADCC 활성을 나타낼 수 있다. 높은 ADCC 활성으로 인해 벤랄리주맙은 효과적으로 천식 환자 내의 호산구를 제거할 수 있다. 본 발명자들은 afucosylated 항체를 생산하기 위한 설비를 갖추고 있지 않기 때문에 IgG1 Fc를 가지는 벤랄리주맙 유사체를 역시 동일한 IgG1 Fc를 가지는 항-IL-5Rα 인간화 항체들 (5R65, 5R65.7)과의 활성의 비교하였다.
구체적으로 50㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심관에 Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03)를 20㎖씩 분주하여 각각에 헤파린 처리를 한 환자 혈액 20㎖을 중층하였다. 이것을 879 × g, 실온에서 25 분간 원심분리하여 NK 세포 단리를 위해 버피코트층을 분리, 회수하고 호산구 단리를 위해 가장 아래층을 분리, 회수하였다. 단리된 일차 NK 세포 및 호산구를 각기 5:1의 비로 이펙터 및 표적 세포로서 사용하였다. 96 웰의 세포 배양용 플레이트에 5 x 104개/웰의 호산구와 2.5 x 105개/웰의 일차 NK 세포를 분주하고 최종농도 100pM의 인체 IL-5을 첨가한다. 또한 최종농도 1μM의 각종 친화도를 향상시킨 항-IL-5Rα 항체를 각각 첨가하였다. 각 항체에 대하여 2웰 배양하고 각 웰의 용량은 최종적으로 200㎕로 되도록 조제하였다. CO2인큐베이터 37℃에서 20 시간 배양하고, 세포현탁액을 회수하기 2시간 전에 20㎕ 용해용액을 최대 Lactate DeHydrogenase (LDH) 유출시킬 샘플에 넣어준다. 배양 종료후 각 웰로부터 50㎕의 세포현탁액을 회수한후 50㎕의 사이토톡스96 (CytoTox96® Reagent) 프로메가사 제) 시료를 넣어주고 실온에서 30 분간 인큐베이션한다. 50㎕의 반응정지액을 넣어주고 마이크로플레이트 측정기로 흡광을 측정하여 항체-의존적 세포 독성 유도능을 분석한다. Y 및 X 축은 각기 % 최대 세포독성 및 항체 농도를 나타낸다.
세포 독성(%) = (A-B)/(C-B) × 100
A : 항체 처리시 방출값
B : 세포 자발적인 방출값
C : 세포 최대 방출값
분석결과, 이전 보고와 마찬가지로 IgG1 Fc를 가지는 벤랄리주맙은 항체 의존적 세포독성 유도능을 거의 유도하지 못했다 (Kolbeck et al., 2010). 건강한 기증자와 중증 천식 환자 유래 호산구에서 5R65, 5R65.7의 항체 의존적 세포독성 유도능은 벤랄리주맙 유사체보다 높았으며 특히 5R65.7이 가장 강한 유도능을 보였다. 이는 정량화한 그래프로 확인할 수 있다 (도 5C).
실시예 12: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는(IL-4Rα×IL-5Rα) 이중항체의 구축디자인
동시에 두 개 이상의 항원에 결합하는 이중특이항체의 개발에 있어서, 각 항원에 대한 친화도, 결합가 (valency), 항원 결합 부위의 기하학 (geometry of antigen-binding sites), 이중특이항체의 구성 및 구축 (format, architecture) 등의 결정이 중요하다. 또한 이중특이항체를 구축하기 위하여 돌연변이나 링커가 도입되기 때문에 단일클론항체에 비하여 물성이 떨어진다는 단점이 있다. 따라서 본 발명자들은 다양한 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 제조하여 생화학적/생물학적 효능이 어떻게 달라지는 지를 확인하고, 가장 효능이 좋은 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 선별하고자 하였다.
다양한 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 포맷 중에서 대표적으로 1) IgG와 유사한 포맷 2) IgG single chain Fv (IgG-scFv) 3) Dual variable domain IgG (DVD-IgG)에 대하여 타겟 항체의 위치, 링커 등을 조합하여 구축하였다. 먼저 IgG와 유사한 포맷의 경우, 각 항원에 대해 1가 결합가 (monovalent binding)를 가진다. 이 포맷을 구축하기 위해서는 2개의 경쇄 (VL1, VL2)와 2개의 중쇄 (VH1, VH2)가 상보적인 결합쌍을 이루어야 한다. 따라서 상보적인 경쇄와 중쇄를 링커로 연결한 single-chain (scIgG) 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체나 경쇄 불변부위 (CL)과 중쇄 불변부위 (CH1)에 정전기적 상호작용 결합을 도입한 bispecific IgG (BsIgG) 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체을 구축하였다. 이러한 IgG와 유사한 포맷을 구축하기 위해서는 이종이중체 Fc (heterodimer Fc)를 이루도록 CH3 도메인에 돌연변이가 도입된다 (도 6).
다음으로 단일클론항체에 항체 가변부위를 추가로 연결하여 이중특이항체를 구축하는 방법이 있다. 본 발명에서는 항체 가변부위 (VH, VL)를 Gly-Ser으로 구성된 링커로 연결하여 single chain Fv (scFv)로 만들어 IgG의 C-말단에 연결한 IgG-scFv 표맷을 구축하였다. IgG-scFv포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체는 가변부위를 추가로 연결하기 때문에 각 항원에 대하여 2가 결합가 (bivalent binding)를 가진다. 하지만 링커로 연결된 항체 가변부위는 항원에 대한 결합능이 감소할 수 있다. scFv로 연결된 VL과 VH의 접촉면에 이황화 결합 (disulfide bond)를 도입하여 scFv의 안정성을 높일 수 있다. 또한 도 6의 모식도에서 확인할 수 있듯이, IgG-scFv포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체는 각 항원에 대해서 반대 방향으로 결합하는 기하학 (geometry of antigen-binding sites)을 가진다.
항원 결합 부위의 기하학에 따른 이중특이항체의 효능을 비교해보기 위하여 병치 방향 (juxtaposition)으로 각 항원에 대해 결합능을 보이는 Dual variable domain IgG (DVD-Ig)를 추가 구축하였다. DVD-IgG포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체는 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 IgG의 N-말단에 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 병치되어 있는 포맷이다. DVD-IgG포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체는 역시 각 항원에 대하여 2가 결합가 (bivalent binding)를 가진다. 도 6의 모식도에서 확인할 수 있듯이, 첫 번째 가변부위쌍이 두 번째 가변부위쌍을 가리게 되는 구조이기 때문에 두 번째 가변부위쌍의 항원 결합능이 감소할 수 있다.
실시예 13: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 scIgG 및 BsIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 구축
먼저 IL-4Rα와 IL-5Rα에에 대해 1가 (monovalent) 결합하는 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 구축하였다. 도 7의 모식도에 나타냈듯이 경쇄와 중쇄를 링커로 연결한 포맷은 scIgG (도 7A)라 명명하였고, 경쇄 불변부위 (CL)과 중쇄 불변부위 1 (CH1)에 정전기적 상호작용을 유발하는 돌연변이를 도입한 포맷은 BsIgG (도 7C)라 명명하였다. scIgG와 BsIgG는 공통적으로 중쇄 불변부위 3 (CH3)에는 EW-RVT 돌연변이 (Kim et al., 2018)를 도입하여 이종이중체 중쇄불변부위 (Heterodimeric Fc)쌍을 이룰 수 있도록 하였다. Heterodimer Fc의 N-말단에 서로 다른 항원 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 융합하여 1가 결합하는 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 구축할 수 있게 한다.
구체적으로, IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들은 IgG1의 중쇄(CH1, CH2, CH3)와 경쇄(CL)를 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다. scIgG는 항-IL-4Rα 항체의 중쇄 및 경쇄 가변부위를 60개의 크기가 작은 아미노산 잔기로 이루어진 링커로 연결한 후, CH3에 K360E, K409W (EU 넘버링) 돌연변이가 도입된 중쇄 가변부위를 연결하였다 (도 7B). 마찬가지로 항-IL-5Rα 항체의 중쇄 및 경쇄 가변부위를 60개 아미노산으로 이루어진 링커로 연결한 후 CH3에 Q347R, D399V, F405T (EU 넘버링) 돌연변이가 도입된 중쇄 가변부위를 연결하였다 (도 7B). BsIgG는 항-IL-4Rα 항체를 코딩할 수 있는 경쇄의 CL 에는 V133E 돌연변이를, 중쇄의 CH1에는 S183K 돌연변이를 도입하여 정전기적 상호작용을 하도록 하였고 중쇄의 CH3에 K360E, K409W 돌연변이를 도입하였다. 또한 항-IL-5Rα 항체를 코딩할 수 있는 경쇄 불변부위에는 V133K 돌연변이를, 중쇄 불변부위 1 (CH1)에는 S183E 돌연변이를 도입하여 정전기적 상호작용을 하도록 하였고 (Dillon et al., 2017) 중쇄의 CH3에 Q347R, D399V, F405T 돌연변이를 도입하였다 (도 7D).
표 11 및 표 12은 각각은 scIgG와 BsIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 21의 항-IL-4Rα 항체 경쇄 가변영역은 서열번호 22 내지 26를 포함한다. 서열번호 9의 항-IL-4Rα 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 10 내지 14를 포함한다. 서열번호 36의 항-IL-5Rα 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 37 내지 42를 포함한다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000014
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000015
실시예 14: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 scIgG 및 BsIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 발현 및 정제
IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 발현 및 정제를 위하여 HEK293F (Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션(transient transfection) 하였다. 진탕 플라스크(corning)에 200 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 2.0 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 190ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37°C에서 인큐베이션 (incubation)하였다. 경쇄와 중쇄는 HEK293F 세포에 1:1 또는 1:1:1:1 비율로 총 250μg을 5ml 무혈청 Freestyle 293 발현 배지(Invitrogen)에 희석 및 필터하여 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) 750μg을 희석한 5ml 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후 반응시킨 혼합 배지를 앞서 190ml로 파종한 세포에 넣어 120 rpm, 8% CO2에서 인큐베이션 후, 6일 동안 인큐베이션하였다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 인큐베이션 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 상기 용출된 단백질은 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 저장버퍼 (25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM KCl, 1mM EDTA pH7.2)로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다. 그 결과 scIgG는 4.02 mg, BsIgG는 3.66mg이 정제되었다.
실시예 15: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 scIgG 및 BsIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 SDS-PAGE 및 SEC 분석
상기 실시예 14에서 정제된 scIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 3μg을 12% 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다 (도 8A). scIgG는 2개의 경쇄-링커-중쇄가 이종이중체를 이루어 형성된다. 각 단량체는 약 78 kDa, scIgG는 약 156 kDa의 분자량을 가진다. 도 6A에 화살표로 표시된 부분이 scIgG이며 윗 부분에 응집물 (aggregates)로 예상되는 밴드와 78 kDa의 단량체로 예상되는 밴드가 관찰되었다. 또한 scIgG를 크기 별 배제 크로마토그래피 (SEC; Size-Exclusion Chromatography)로 분석하였다. 구체적으로, Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼에 염농도가 높은 PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4)를 러닝 버퍼 (running buffer)로 하여 30μg의 단백질을 인젝션 (injection)하여 280nm 파장에서 단백질이 용출되는 양샹을 확인하였다. 단백질의 몰질량을 비교하기 위해 β-Amylase (200kDa, sigma; A8781)과 Herceptin (150 kDa)의 용출 시간을 비교하였다. SDS-PAGE 결과와 마찬가지로 scIgG는 200kDa과 150kDa 사이에 관찰되었고, 응집물 (aggregates)와 단량체로 예상되는 피크도 관찰되었다 (도 8B).
마찬가지로 상기 실시예 14에서 정제된 BsIgG 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 3μg을 12% 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다 (도 8C). BsIgG는 2개의 경쇄와 2개의 중쇄로 구성된다. 경쇄 단량체는 약 25 kDa, 중쇄 단량체는 약 50kD의 분자량을 가진다. 도 6C에 화살표로 표시된 부분이 BsIgG이며 윗 부분에 응집물 (aggregates)로 예상되는 밴드가 관찰되었다. 또한 BsIgG를 크기 별 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 구체적으로, Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼에 염농도가 높은 PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4)를 러닝 버퍼 (running buffer)로 하여 30μg의 단백질을 인젝션 (injection)하여 280nm 파장에서 단백질이 용출되는 양샹을 확인하였다. 단백질의 몰질량을 비교하기 위해 β-Amylase (200kDa, sigma; A8781)과 Herceptin (150 kDa)의 용출 시간을 비교하였다. BsIgG는 150kDa 부근에서 관찰되었고, 응집물 (aggregates)로 예상되는 피크가 다소 관찰되었다 (도 8D). 결과적으로, IL-4Rα×IL-5Rα에 대하여 각각 1가 결합능을 가지는 이중특이항체는 BsIgG 형태가 물성이 더 좋다는 것을 확인하였다.
실시예 16: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 4R-IgG-5R-HLscFv 및 4R-IgG-5R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 구축
이어 IL-4Rα 및 IL-5Rα 항원에 대해 2가 (bivalent) 결합하는 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 IgG-scFv 포맷으로 구축하였다. scFv는 이중특이항체를 구축시에 많이 이용되는 구성 요소 (building block)이다. scFv는 중쇄(VH)-경쇄(VL)또는 경쇄(VL)-중쇄(VH) 가변부위를 연결하는 순서에 따라 항원 결합능이나 물성이 달라질 수 있다. 또한 VL과 VH의 접촉면에 이황화 결합 (disulfide bond)를 도입하여 scFv의 안정성을 높일 수 있다. 특히 VH의 44번 잔기와 VL의 100번 잔기는 CDRs과의 거리가 멀어 항원 결합능에 영향을 주지 않으면서 두 잔기 사이의 거리가 5.36Å 정도로 가까워 Cys로 돌연변이를 도입하였을 때 응집물 (aggregates)의 형성이 감소된다는 보고가 있다 (Zhao et al., 2010).
도 9의 모식도에 나타냈듯이 항-IL-4Rα 항체의 C-말단에 항-IL-5Rα의 가변부위를 VH-VL순서로 연결한 포맷은 4R-IgG-5R-HLscFv (도 9A)라 명명하였고, VH-VL순서로 연결한 포맷은 4R-IgG-5R-LHscFv (도 9C)라 명명하였다. 항-IL-4Rα 항체의 C-말단에는 LGGGGSGGGGSGGGGS (16개의 아미노산) 링커로 scFv를 연결하였고, VH-VL 또는 VL-VH 사이에는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (20개의 아미노산) 링커로 연결하였다. IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들은 IgG1의 중쇄(CH1, CH2, CH3)와 경쇄(CL)를 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다. 도 9B는 4R-IgG-5R-HLscFv의 경쇄와 중쇄를 코딩하는 벡터의 모식도이고, 도 9D는 4R-IgG-5R-LHscFv의 경쇄와 중쇄를 코딩하는 벡터의 모식도이다. 항-IL-5Rα의 가변부위에서 VH의 44번 Glycine 잔기를 Cysteine으로, VL의 100번 Serine 잔기를 Cysteine으로 돌연변이 주었다.
표 13 및 표 14은 각각은 4R-IgG-5R-HLscFv 와 4R-IgG-5R-LHscFv의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 21의 항-IL-4Rα 항체 경쇄 가변영역은 서열번호 22 내지 26를 포함한다. 서열번호 9의 항-IL-4Rα 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 10 내지 14를 포함한다. 서열번호 58의 항-IL-5Rα 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 37 내지 42에 44번 잔기에 cysteine 돌연변이가 도입된 것을 포함한다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000016
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000017
실시예 17: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 4R-IgG-5R-HLscFv 및 4R-IgG-5R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 발현 및 정제
IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 발현 및 정제를 위하여 HEK293F (Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션(transient transfection) 하였다. 진탕 플라스크(corning)에 200 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 2.0 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 190ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37°C에서 인큐베이션하였다. 경쇄와 중쇄는 HEK293F 세포에 1:1 비율로 총 250μg을 5ml 무혈청 Freestyle 293 발현 배지(Invitrogen)에 희석 및 필터하여 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) 750μg을 희석한 5ml 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후 반응시킨 혼합 배지를 앞서 190ml로 파종한 세포에 넣어 120 rpm, 8% CO2에서 인큐베이션 후, 6일 동안 인큐베이션하였다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 인큐베이션 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 상기 용출된 단백질은 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 저장버퍼 (25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 2mM KCl, 1mM EDTA pH 7.2)로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다. 그 결과 4R-IgG-5R-HLscFv는 90μg, 4R-IgG-5R-LHscFv는 94μg이 정제되었다.
실시예 18: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 4R-IgG-5R-HLscFv 및 4R-IgG-5R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 SDS-PAGE 및 SEC 분석
상기 실시예 17에서 정제된 4R-IgG-5R-HLscFv 이중특이항체를 3μg을 12% 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다 (도 10A). 4R-IgG-5R-HLscFv는 약 25 kDa의 2개의 경쇄 와 약 77kDa 2개의 중쇄-링커-scFv로 형성되어 총 204 kDa의 몰질량을 가진다. 도 8에 화살표로 표시된 부분이 4R-IgG-5R-HLscFv이며 윗 부분에 응집물 (aggregates)로 예상되는 밴드가 관찰되었다. 또한 4R-IgG-5R-HLscFv를 크기 별 배제 크로마토그래피 (SEC; Size-Exclusion Chromatography)로 분석하였다. 구체적으로, Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼에 염농도가 높은 PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4)를 러닝 버퍼 (running buffer)로 하여 10μg의 단백질을 인젝션 (injection)하여 280nm 파장에서 단백질이 용출되는 양샹을 확인하였다. 단백질의 몰질량을 비교하기 위해 β-Amylase (200kDa, sigma; A8781)과 Herceptin (150 kDa)의 용출 시간을 비교하였다. 4R-IgG-5R-HLscFv는 150kDa 부근에서 관찰되었고, 응집물 (aggregates)로 예상되는 피크와 저장 버퍼에 포함된 EDTA로 인한 피크도 관찰되었다 (도 10B).
마찬가지로 상기 실시예 17에서 정제된 4R-IgG-5R-LHscFv 이중특이항체를 3μg을 12% 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다 (도 10C). 4R-IgG-5R-LHscFv는 약 25 kDa의 2개의 경쇄 와 약 77kDa 2개의 중쇄-링커-scFv로 형성되어 총 204 kDa의 몰질량을 가진다. 도 8C에 화살표로 표시된 부분이 4R-IgG-5R-LHscFv이며 윗 부분에 응집물 (aggregates)로 예상되는 밴드가 관찰되었다. 또한 4R-IgG-5R-LHscFv를 크기 별 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 구체적으로, Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼에 염농도가 높은 PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4)를 러닝 버퍼 (running buffer)로 하여 10μg의 단백질을 인젝션 (injection)하여 280nm 파장에서 단백질이 용출되는 양샹을 확인하였다. 단백질의 몰질량을 비교하기 위해 β-Amylase (200kDa, sigma; A8781)과 Herceptin (150 kDa)의 용출 시간을 비교하였다. 4R-IgG-5R-LHscFv는 200kDa 부근에서 관찰되었고, 응집물 (aggregates)로 예상되는 피크가 4R-IgG-5R-HLscFv 보다는 적지만 관찰되었으며, 4R-IgG-5R-LHscFv의 형성이 잘 되지 않아 테일링(tailing)되는 피크도 확인되었다. 또한 저장 버퍼에 포함된 EDTA로 인한 피크도 관찰되었다 (도 10B). 결과적으로, 4R-IgG-5R-HLscFv 및 4R-IgG-5R-LHscFv는 발현량과 물성이 모두 좋지 않다는 것을 확인하였다.
실시예 19: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는는 5R-IgG-4R-HLscFv 및 5R-IgG-4R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 구축
이어 IL-4Rα 및 IL-5Rα 항원에 대해 2가 (bivalent) 결합하는 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 IgG-scFv 포맷을 추가로 구축하였다. 앞선 실시예 16과는 반대로 항-IL-4Rα 항체의 가변부위를 scFv로, 항-IL-5Rα 항체를 IgG 형태로 구축하였다. 또한 VH의 44번 잔기와 VL의 100번 잔기에는 이황화 결합을 위한 cysteine 돌연변이를 도입하였으며, 중쇄(VH)-경쇄(VL)또는 경쇄(VL)-중쇄(VH) 가변부위를 연결하는 순서에 따른 비교를 하였다.
도 11의 모식도에 나타냈듯이 항-IL-5Rα 항체의 C-말단에 항-IL-4Rα의 가변부위를 VH-VL순서로 연결한 포맷은 5R-IgG-4R-HLscFv (도 11A)라 명명하였고, VH-VL순서로 연결한 포맷은 5R-IgG-4R-LHscFv (도 11C)라 명명하였다. 항-IL-5Rα 항체의 C-말단에는 LGGGGSGGGGSGGGGS (16개의 아미노산) 링커로 scFv를 연결하였고, VH-VL 또는 VL-VH 사이에는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (20개의 아미노산) 링커로 연결하였다. IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들은 IgG1의 중쇄(CH1, CH2, CH3)와 경쇄(CL)를 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다. 도 11B는 5R-IgG-4R-HLscFv의 경쇄와 중쇄를 코딩하는 벡터의 모식도이고, 도 11D는 5R-IgG-4R-LHscFv의 경쇄와 중쇄를 코딩하는 벡터의 모식도이다. 항-IL-4Rα의 가변부위에서 VH의 44번 Glycine 잔기를 Cysteine으로, VL의 100번 Glycine 잔기를 Cysteine으로 돌연변이 주었다.
표 15 및 표 16은 각각은 5R-IgG-4R-HLscFv 와 5R-IgG-4R-LHscFv의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 36의 항-IL-5Rα 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 37 내지 48 를 포함한다. 서열변호 61의 항-IL-4Rα 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 10 내지 14의 100번 잔기에 cysteine 돌연변이가 도입된 것을 포함한다. 서열번호 62의 항-IL-4Rα 항체 경쇄 가변영역은 서열번호 22 내지 24의 46번 잔기에 cysteine 돌연변이가 도입된 것을 포함한다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000018
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000019
실시예 20: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는는 5R-IgG-4R-BscFv 및 5R-IgG-4R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 발현 및 정제
IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 발현 및 정제를 위하여 HEK293F (Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션(transient transfection) 하였다. 진탕 플라스크(corning)에 200 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 2.0 × 106 세포/ml의 밀도로 배지 190ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37°C에서 인큐베이션하였다. 경쇄와 중쇄는 HEK293F 세포에 1:1 비율로 총 250μg을 5ml 무혈청 Freestyle 293 발현 배지(Invitrogen)에 희석 및 필터하여 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) 750μg을 희석한 5ml 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후 반응시킨 혼합 배지를 앞서 190ml로 파종한 세포에 넣어 120 rpm, 8% CO2에서 인큐베이션 후, 6일 동안 인큐베이션하였다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 인큐베이션 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 상기 용출된 단백질은 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 저장버퍼 (PBS pH 7.4)로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다. 그 결과 5R-IgG-4R-HLscFv는 163μg, 5R-IgG-4R-LHscFv는 1.22mg이 정제되었다.
실시예 21: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는는 5R-IgG-4R-HLscFv 및 5R-IgG-4R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 SDS-PAGE 및 SEC 분석
상기 실시예 20에서 정제된 5R-IgG-4R-HLscFv 이중특이항체를 3μg을 12% 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다 (도 12A). 5R-IgG-4R-HLscFv는 약 25 kDa의 2개의 경쇄 와 약 77kDa 2개의 중쇄-링커-scFv로 형성되어 총 204 kDa의 몰질량을 가진다. 도 12A에 화살표로 표시된 부분이 5R-IgG-4R-HLscFv이며 응집물 (aggregates)로 예상되는 밴드가 거의 관찰되지 않았다. 또한 5R-IgG-4R-HLscFv를 크기 별 배제 크로마토그래피 (SEC; Size-Exclusion Chromatography)로 분석하였다. 구체적으로, Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼에 염농도가 높은 PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4)를 러닝 버퍼 (running buffer)로 하여 10μg의 단백질을 인젝션 (injection)하여 280nm 파장에서 단백질이 용출되는 양샹을 확인하였다. 단백질의 몰질량을 비교하기 위해 β-Amylase (200kDa, sigma; A8781)과 Herceptin (150 kDa)의 용출 시간을 비교하였다. 5R-IgG-4R-HLscFv는 150kDa 부근에서 관찰되었고, 응집물 (aggregates)로 예상되는 피크가 다소 관찰되었다 (도 12B).
마찬가지로 상기 실시예 20에서 정제된 5R-IgG-4R-LHscFv 이중특이항체를 3μg을 12% 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다 (도 12C). 5R-IgG-4R-LHscFv는 약 25 kDa의 2개의 경쇄 와 약 77kDa 2개의 중쇄-링커-scFv로 형성되어 총 204 kDa의 몰질량을 가진다. 도 10C에 화살표로 표시된 부분이 5R-IgG-4R-LHscFv이며 윗 부분에 응집물 (aggregates)로 예상되는 밴드가 다소 관찰되었다. 또한 5R-IgG-4R-LHscFv를 크기 별 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 구체적으로, Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼에 염농도가 높은 PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4)를 러닝 버퍼 (running buffer)로 하여 10μg의 단백질을 인젝션 (injection)하여 280nm 파장에서 단백질이 용출되는 양샹을 확인하였다 (도 12D). 단백질의 몰질량을 비교하기 위해 β-Amylase (200kDa, sigma; A8781)과 Herceptin (150 kDa)의 용출 시간을 비교하였다. 5R-IgG-4R-LHscFv는 200kDa 부근에서 관찰되었고, 응집물 (aggregates)로 예상되는 피크가 다소 관찰되었다. 결과적으로, 5R-IgG-4R-LHscFv 이 발현량도 높으면서 물성이 좋다는 것을 확인하였다 (도 12D).
실시예 22: 5R-IgG-4R-LHscFv 이중특이항체의 포맷의 서열에 따른 물성 차이 비교
앞선 실시예 21에서 구축한 5R-IgG-4R-LHscFv 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 서열을 변경하여 추가적인 발현량 및 물성을 비교하였다. 구체적으로, 항-IL-5Rα 항체는 5R65.7 의 중쇄 가변 영역 서열 (서열 번호 37)로, 항-IL-4Rα 의 가변부위로 구축한 scFv에서 경쇄 가변 영역 (서열번호 62)은 서열번호 22, 23, 24, 25, 26 에 44번 glycine 잔기를 cysteine으로 돌연변이를 주고, 중쇄 가변 영역 (서열 번호 61)은 서열 번호 10, 12, 13에 100번 glycine 잔기를 cysteine으로 돌연변이 주어 구축하였다. 그 결과 구축된 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들은 공통적으로 5R-IgG-4R-LHscFv 로 그룹 지울 수 있지만 각각의 구성된 항체 서열에 따라, 5R65-IgG-4R34.1.19-LHscFv, 5R65.7-IgG-4R.N3-LHscFv, 5R65.7-IgG-4R.N4-LHscFv, 5R65.7 IgG-4R.N6-LHscFv, 5R65.7-IgG-4R.N7-LHscFv, 5R65.7-IgG-4R.N8-LHscFv로 명명하였다. 구축된 항체들은 앞선 실시예 20와 동일한 방법으로 발현 및 정제하였다. 그 결과 5R65-IgG-4R34.1.19-LHscFv (2.6mg), 5R65.7-IgG-4R.N-LHscFv (4.07mg), 5R65.-IgG-4R.N4-LHscFv (3.67mg), 5R65.7-IgG-4R.N6-LHscFv (4.98mg), 5R65.7-IgG-4R.N7-LHscFv (3.91mg), 5R65.7-IgG-4R.N8-LHscFv (4.48mg)이 정제되었다.
정제한 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 들은 SDS-PAGE (도 13)와 SEC (도 14) 분석을 통하여 물성을 비교하였다. 그 결과, 5R65.7-IgG-4R.N3-LHscFv과 5R65.7-IgG-4R.N8-LHscFv 이중특이항체가 응집물 (aggregates)이 거의 관찰되지 않아 물성이 향상되고 발현량도 높은 것을 확인하였다.
실시예 23: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 4R-LL-5R 및 4R-SL-5R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 구축
IgG-scFv 포맷에 이어 IL-4Rα 및 IL-5Rα 항원에 대해 2가 (bivalent) 결합하는 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체를 DVD-IgG (Dual variable domain-IgG) 포맷으로 추가로 구축하였다. IgG-scFv는 IL-4Rα 및 IL-5Rα 항원 결합 부위가 반대 방향으로 구축되지만, DVD-IgG는 같은 방향을 가지고 있다는 차이를 가지고 있다. DVD-IgG는 링커를 통해 첫 번째 가변부위와 두 번째 가변부위가 병치 (juxtaposition) 되어있다. 안 쪽에 있는 두 번째 가변 영역은 첫 번째 가변 영역에 의해 가려지기 때문에 항원 결합능이 떨어질 수 있다. 따라서 링커 조합을 비교하였다. VH1과 VH2 사이의 링커로는 긴 링커인 ASTKGPSVFPLAP (13개의 아미노산)과 짧은 링커인 ASTKGP (6개의 아미노산)을 사용하였으며 VL1과 VL2 사이의 링커로는 긴 링커인 TVAAPSVFIFPP (12개의 아미노산)과 짧은 링커인 TVAAP (5개의 아미노산)을 사용하였다.
도 15의 모식도에 나타냈듯이 항-IL-4Rα 항체의 가변 영역이 첫 번째 가변 영역에 위치하고 항-IL-5Rα의 가변 영역이 두 번째 가변 영역에 위치한다. 긴 링커끼리 연결한 포맷은 4R-LL-5R (도 15A)라 명명하였고, 짧은 링커끼리 연결한 포맷은 4R-SL-5R (도 15C)라 명명하였다. IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들은 IgG1의 중쇄(CH1, CH2, CH3)와 경쇄(CL)를 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다. 도 15B는 4R-LL-5R의 경쇄와 중쇄를 코딩하는 벡터의 모식도이고, 도 15D는 4R-SL-5R의 경쇄와 중쇄를 코딩하는 벡터의 모식도이다.
표 17 및 표 18은 각각은 4R-LL-5R와 4R-SL-5R의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 21의 항-IL-4Rα 항체 경쇄 가변영역은 서열번호 22 내지 26를 포함한다. 서열번호 7의 항-IL-4Rα 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 10 내지 14를 포함한다. 서열번호 36의 항-IL-5Rα 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 37 내지 42를 포함한다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000020
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000021
실시예 24: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 4R-LL-5R 및 4R-SL-5R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 발현 및 정제
IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 발현 및 정제를 위하여 HEK293F (Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션(transient transfection) 하였다. 진탕 플라스크(corning)에 200 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 2.0 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 190ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37°C에서 인큐베이션하였다. 경쇄와 중쇄는 HEK293F 세포에 1:1 비율로 총 250μg을 5ml 무혈청 Freestyle 293 발현 배지(Invitrogen)에 희석 및 필터하여 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) 750μg을 희석한 5ml 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후 반응시킨 혼합 배지를 앞서 190ml로 파종한 세포에 넣어 120 rpm, 8% CO2에서 인큐베이션 후, 6일 동안 인큐베이션하였다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 인큐베이션 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 상기 용출된 단백질은 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 저장버퍼 (PBS pH 7.4)로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다. 그 결과 4R-LL-5R는 71μg, 4R-SL-5R는 240μg이 정제되었다.
실시예 25: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 4R-LL-5R 및 4R-SL-5R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 SDS-PAGE 및 SEC 분석
상기 실시예 24에서 정제된 4R-LL-5R 이중특이항체는 약 36kDa의 2개의 경쇄 와 약 64kDa 2개의 중쇄로 형성되어 총 200 kDa의 몰질량을 가진다. 4R-LL-5R를 크기 별 배제 크로마토그래피 (SEC; Size-Exclusion Chromatography)로 분석하였다. 구체적으로, Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼에 염농도가 높은 PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4)를 러닝 버퍼 (running buffer)로 하여 10μg의 단백질을 인젝션 (injection)하여 280nm 파장에서 단백질이 용출되는 양샹을 확인하였다. 단백질의 몰질량을 비교하기 위해 β-Amylase (200kDa, sigma; A8781)과 Herceptin (150 kDa)의 용출 시간을 비교하였다. 4R-LL-5R는 200kDa 부근에서 관찰되었고, 이중특이항체 형성이 되지 않은 단량체로 예상되는 피크가 관찰되었다 (도 16A).
마찬가지로 상기 실시예 24에서 정제된 4R-SL-5R 이중특이항체를 3μg을 12% 비환원성 조건으로 SDS-PAGE 상에서 분석하였다 (도 16B). 4R-SL-5R 이중특이항체는 약 35kDa의 2개의 경쇄 와 약 63kDa 2개의 중쇄로 형성되어 총 196 kDa의 몰질량을 가진다. 도 16B에 화살표로 표시된 부분이 4R-SL-5R이며 윗 부분에 응집물 (aggregates)로 예상되는 밴드가 다소 관찰되었다. 또한 4R-SL-5R를 크기 별 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 구체적으로, Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼에 염농도가 높은 PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4)를 러닝 버퍼 (running buffer)로 하여 10μg의 단백질을 인젝션 (injection)하여 280nm 파장에서 단백질이 용출되는 양샹을 확인하였다. 단백질의 몰질량을 비교하기 위해 β-Amylase (200kDa, sigma; A8781)과 Herceptin (150 kDa)의 용출 시간을 비교하였다. 4R-SL-5R는 200kDa 부근에서 관찰되었고, 응집물 (aggregates)로 예상되는 피크가 다소 관찰되었다 (도 16C). 결과적으로, 4R-SL-5R이 발현량은 낮지만 긴 링커 보다는 물성이 좋다는 것을 확인하였다.
실시예 26: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 5R-LL-4R 및 5R-SL-4R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 구축
IgG-scFv 포맷과 마찬가지로 DVD-IgG도 항-IL-4Rα 항체와 항-IL-5Rα 항체의 위치에 따라 물성이 달라지는 지를 비교하였다. 링커 조합도 같이 비교하였다. VH1과 VH2 사이의 링커로는 긴 링커인 ASTKGPSVFPLAP (13개의 아미노산)과 짧은 링커인 ASTKGP (6개의 아미노산)을 사용하였으며 VL1과 VL2 사이의 링커로는 긴 링커인 TVAAPSVFIFPP (12개의 아미노산)과 짧은 링커인 TVAAP (5개의 아미노산)을 사용하였다.
도 17의 모식도에 나타냈듯이 항-IL-5Rα 항체의 가변 영역이 첫 번째 가변 영역에 위치하고 항-IL-4Rα의 가변 영역이 두 번째 가변 영역에 위치한다. 긴 링커끼리 연결한 포맷은 5R-LL-4R (도 17A)라 명명하였고, 짧은 링커끼리 연결한 포맷은 5R-SL-4R (도 17C)라 명명하였다. IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들은 IgG1의 중쇄(CH1, CH2, CH3)와 경쇄(CL)를 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다. 도 15B는 5R-LL-4R의 경쇄와 중쇄를 코딩하는 벡터의 모식도이고, 도 17D는 5R-SL-4R의 경쇄와 중쇄를 코딩하는 벡터의 모식도이다.
표 19 및 표 20은 각각은 5R-LL-4R와 5R-SL-4R의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호 21의 항-IL-4Rα 항체 경쇄 가변영역은 서열번호 22 내지 26를 포함한다. 서열번호 9의 항-IL-4Rα 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 10 내지 14를 포함한다. 서열번호 36의 항-IL-5Rα 항체 중쇄 가변영역은 서열번호 37 내지 42 포함한다.
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000022
Figure PCTKR2021012344-appb-img-000023
실시예 27: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 5R-LL-4R 및 5R-SL-4R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 발현 및 정제
IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 발현 및 정제를 위하여 HEK293F (Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션(transient transfection) 하였다. 진탕 플라스크(corning)에 200 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 2.0 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 190ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37°C에서 인큐베이션하였다. 경쇄와 중쇄는 HEK293F 세포에 1:1 비율로 총 250μg을 5ml 무혈청 Freestyle 293 발현 배지(Invitrogen)에 희석 및 필터하여 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) 750μg을 희석한 5ml 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후 반응시킨 혼합 배지를 앞서 190ml로 파종한 세포에 넣어 120 rpm, 8% CO2에서 인큐베이션 후, 6일 동안 인큐베이션하였다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 인큐베이션 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 상기 용출된 단백질은 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 이용하여 저장버퍼 (PBS pH 7.4)로 버퍼를 교환한 후 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다. 그 결과 5R-LL-4R는 22μg, 5R-SL-4R는 12.6μg이 정제되었다.
실시예 28: IL-4Rα×IL-5Rα에 동시에 결합하는 5R-LL-4R 및 5R-SL-4R 포맷의 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 SEC 분석
상기 실시예 27에서 정제된 5R-LL-4R 이중특이항체는 약 36kDa의 2개의 경쇄 와 약 64kDa 2개의 중쇄로 형성되어 총 200 kDa의 몰질량을 가진다. 5R-LL-4R를 크기 별 배제 크로마토그래피 (SEC; Size-Exclusion Chromatography)로 분석하였다. 구체적으로, Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼에 염농도가 높은 PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4)를 러닝 버퍼 (running buffer)로 하여 10μg의 단백질을 인젝션 (injection)하여 280nm 파장에서 단백질이 용출되는 양샹을 확인하였다. 단백질의 몰질량을 비교하기 위해 β-Amylase (200kDa, sigma; A8781)과 Herceptin (150 kDa)의 용출 시간을 비교하였다. 5R-LL-4R는 200kDa 부근에서 낮은 높이의 피크가 관찰되었고, 이는 이중특이항체 형성이 잘 되지 않은 것으로 보인다 (도 18A).
마찬가지로 상기 실시예 27에서 정제된 5R-SL-4R 이중특이항체를 크기 별 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 구체적으로, Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼에 염농도가 높은 PBS (12mM Phosphate, 0.5M NaCl, 2.7mM KCl, pH7.4)를 러닝 버퍼 (running buffer)로 하여 10μg의 단백질을 인젝션 (injection)하여 280nm 파장에서 단백질이 용출되는 양샹을 확인하였다. 단백질의 몰질량을 비교하기 위해 β-Amylase (200kDa, sigma; A8781)과 Herceptin (150 kDa)의 용출 시간을 비교하였다. 5R-SL-4R는 200kDa 부근에서 관찰되었고, 응집물 (aggregates)로 예상되는 피크와 관찰되었고 뒤 쪽으로 낮은 높이의 피크들이 관찰되었다 (도 18B). 결과적으로, 항-IL-5Rα항체의 가변 영역이 첫 번째 가변 영역에 위치한 5R-LL-4R 및 5R-SL-4R는 모두 물성이 좋지 않았다.
실시예 29: 4R-LL-5R 이중특이항체의 포맷의 서열에 따른 물성 차이 비교
앞선 실시예에서 구축한 4R-LL-5R 포맷의 항체 서열을 변경하여 추가적인 발현량 및 물성을 비교하였다. 구체적으로, 항-IL-5Rα 항체는 5R65.7 의 중쇄 가변 영역 서열 (서열 번호 37)로, 항-IL-4Rα의 경쇄 가변 영역은 서열번호 22, 23, 24, 25, 26로, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 10, 12, 13, 로 구축하였다. 그 결과 구축된 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들은 4R-LL-5R 포맷으로 그룹 지울 수 있지만 각각의 구성된 항체 서열에 따라, 4R34.1.19-SL-5R65, 4R.N3-SL-5R65.7, 4R.N4-SL-5R65.7, 4R.N6-SL-5R65.7, 4R.N7-SL-5R65.7, 4R.N8-SL-5R65.7로 명명하였다. 구축된 항체들은 앞선 실시예 24와 동일한 방법으로 발현 및 정제하였다. 그 결과 4R34.1.19-SL-5R65 (0.21mg), 4R.N3-SL-5R65.7 (3.26mg), 4R.N4-SL-5R65.7 (0.52mg), 4R.N6-SL-5R65.7 (1.8 mg), 4R.N7-SL-5R65.7 (0.7 mg), 4R.N8-SL-5R65.7 (1.52)이 정제되었다.
정제한 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 들은 SDS-PAGE (도 19)와 SEC (도 20) 분석을 통하여 물성을 비교하였다. 그 결과, 4R.N3-SL-5R65.7, 4R.N6-SL-5R65.7, 4R.N8-SL-5R65.7 이중특이항체가 물성이 향상되고 발현량도 높은 것을 확인하였다.
실시예 30: IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체의 포맷에 따른 항원 결합능 확인
이전 실시예에서 구축된 BsIgG (1가 결합능, IgG 형태), IgG-scFv (2가의 항원 결합 부위가 반대 방향 위치), DVD-IgG (2가의 항원 결합 부위가 병치)의 포맷에 따라 항원 결합능이 어떻게 달라지는지를 indirect ELISA를 이용해 비교하였다. IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들은 4R34.1.19와 5R65항체를 기반으로 구축하였다.
구체적으로, sIL-4Rα 항원 단백질 (50ng/웰, sinobio; 10402-H08H), sIL-5Rα 항원 단백질 (50ng/웰, sinobio; 10392-H08H)을 96-웰 플레이트에 넣고 상온에서 2시간 동안 고정시키고, 2% 분말 우유 (skim milk)를 포함하는 0.1% PBST PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl) 로 상온에서 2시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 100nM, 10nM, 1nM이 되도록 항체를 희석하여 블로킹 된 플레이트에 웰당 25μl씩 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 2차 항체로 항 인간 Fc-HRP 항체 (1:8000)를 웰당 25μl씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 PBST 로 3 번 세척한 후, TMB 용액을 웰당 25μl씩 첨가하여 상온에서 ~2분 동안 발색 반응시킨 뒤, H2SO4(2N)로 반응을 중지시키고, 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
BsIgG는 sIL-4Rα와 sIL-5Rα 항원에 대하여 1가 결합능을 가진다. 4R34.1.19의 단일클론항체가 sIL-4Rα에 대한 결합능에 비하여 sIL-4Rα에 대한 결합능이 감소한 경향을 확인할 수 있다. BsIgG는 sIL-5Rα에 대한 결합능은 5R65에 비하여 거의 감소하지 않았는데, 이는 4R34.1.19 항체가 sIL-5Rα에 대한 교차 결합능을 가진 것 때문인 여겨진다 (도 21). 5R65-IgG-4R34.1.19-LHscFv 포맷의 경우 sIL-4Rα에 대한 항원 결합부위가 scFv로 구축되어 있기 때문에 sIL-4Rα에 대한 결합능이 감소했고 sIL-5Rα에 대한 결합능은 크게 감소하지 않았다 (도 21). 4R34.1.19-SL-5R65 포맷의 경우 두 번째 가변 부위에 위치하는 5R65가 sIL-5Rα에 대한 결합능이 떨어질 가능성이 높다. 예상대로 sIL-4Rα에는 높은 결합능을 유지하였고, sIL-5Rα에 대해서는 결합능이 감소한 것을 확인하였다 (도 21).
실시예 31: 건강한 기증자 (Healthy controls)유래 인체 호산구에서의 IL-4Rα 및 IL-5Rα 발현 확인
호산구를 이용한 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들의 생물활적 활성을 평가하기에 앞서 건강한 기증자의 말초혈액에서 과립구 층에 있는 호산구의 IL-4Rα 및 IL-5Rα의 발현을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 50㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심관에 Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03)를 20㎖씩 분주하여 각각에 헤파린 처리를 한 건강한 기증자 혈액 20㎖을 중층하였다. 이것을 879×g, 실온에서 25 분간 원심분리하여 가장 아래층을 분리, 회수하였다. 2% 덱스트란 용액을 분주하여 적혈구(하층)과 과립구(상층)을 분리하고 그 중 과립구 층을 회수하여 거기에 혼재하는 적혈구를 제거할 목적으로 27㎖ 멸균시킨 물과 3㎖ 10× HBSS를 분주하였다. 300×g, 4℃에서 10 분간 원심 분리하여 적혈구를 제거한 과립구 (호산구, 호중구)가 농축된 층을 분리, 회수하였다.
농축된 과립구는 Siglec 8 (sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin)의 발현에 따라 호산구와 호중구로 구분할 수 있다. 호산구는 Siglec-8을 발현하고 있으며 호중구는 발현하지 않는다. 구체적으로, 각 기증자 샘플 당 1×106 개의 농축된 과립구 세포와 5μl의 APC anti-human Siglec-8 Ab (Biolegen; 347105)와 5μl의 PE anti-human IL-4Rα Ab (Biolegend; 355004) 또는 0.5μl의 PE anti-human IL-5Rα Ab (BD Pharmingen; 555902)을 혼합하여 4℃에서 30분간 반응시키고 PBSM (Miltenyli biotec; 130-091-221)으로 세척 후, 유세포 분석기기인 FACS Calibur (BD Bioscience)로 분석하였다. 분석 후, 각각의 샘플에 대한 점 그래프를 얻었다.
도 22는 건강한 기증자 유래 농축된 과립구 세포들에서 호산구를 siglec-8의 발현 유무에 따라 구분한 게이팅 전략과 IL-4Rα 및 IL-5Rα의 발현을 확인한 결과이다. 호산구는 상대적으로 IL-4Rα를 발현하는 비율이 낮고 IL-5Rα를 발현하는 비율이 높다. 하지만 IL-4Rα 및 IL-5Rα를 모두 발현하고 있는 것을 확인하였다.
실시예 32: IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들의 건강한 기증자 유래 인체 호산구의 증식 억제능 평가
IL-5가 호산구의 증식에 기여함은 잘 알려져 있지만, IL-4에 의한 호산구 증식은 거의 알려진 바가 없다. 본 발명자들은 IL-4와 IL-5 각각에 의한 호산구의 증식능을 확인하고, IL-4와 IL-5를 동시에 처리하였을 때 단독으로 처리시 보다 호산구의 증식능이 더 증가하는 지를 확인하였다. 또한 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체가 두 개의 사이토카인에 의한 호산구의 증식능을 억제하는지를 확인하였다.
구체적으로, 50㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심관에 Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03)를 20㎖씩 분주하여 각각에 헤파린 처리를 한 환자 혈액 20㎖을 중층하였다. 이것을 879×g, 실온에서 25 분간 원심분리하여 가장 아래층을 분리, 회수하였다. 2% 덱스트란 용액을 분주하여 적혈구(하층)과 과립구 층(상층)을 분리하고 그 중 과립구 층을 회수하여 거기에 혼재하는 적혈구를 제거할 목적으로 27㎖ 멸균시킨 물과 3㎖ 10× HBSS를 분주하였다. 300 × g, 4℃에서 10 분간 원심분리하여 적혈구를 제거한 농축된 과립구 (호산구, 호중구)를 분리, 회수하였다. 최종적으로 상업적으로 이용가능한 eosinophil Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec; 130-092-010)를 사용하여 제조사의 프로토콜대로 과립구에서 호산구만 정제하였다.
96 웰의 세포 배양용 플레이트에 5 x 104개/웰의 호산구를 분주하고, 최종농도 100pM의 인체 IL-5와 100nM의 인체 IL-4을 첨가하여 호산구의 증식을 유도하였다. 또한 최종농도 500 nM의 항-IL-4Rα 항체 (4R34.1.19), 항-IL-5Rα 항체 (5R65), 이중특이항체들 (BsIgG, 4R34.1.19-SL-5R65)을 각각 첨가하였다. 각 항체에 대하여 2-3웰 배양하고 각 웰의 용량은 최종적으로 200㎕로 되도록 조제하였다. CO2인큐베이터 37℃에서 2 일간 배양하고, 배양 종료후 각 웰로부터 100㎕의 세포현탁액을 회수한후 100㎕의 셀타이터-글로((CellTiter-Glo®) 프로메가사 제) 시료를 넣어주고 실온에서 20 분간 인큐베이션한다. 마이크로플레이트 측정기로 발광을 측정하여 호산구의 증식능을 분석한다.
분석 결과 IL-4도 호산구의 증식을 유도할 수 있고, IL-4와 IL-5를 동시에 처리시 단독 처리시 보다 높은 호산구의 증식능을 보였다. 4R34.1.19는 IL-5Rα에 대한 결합능을 가지고 있기 때문에 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들과 비슷한 수준의 호산구 증식 억제능을 보였다. IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 중에서는 BsIgG보다 4R34.1.19-SL-5R65가 더 강한 호산구 증식 억제능을 보였는데, 이는 2가 항원 결합 부위를 가지고 있어 각 항원에 대한 결합능이 더 높기 때문인 것이라 여겨진다 (도 23).
실시예 33: IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들의 건강한 기증자 유래 인체 호산구의 항체-의존적 세포 독성 유도능 평가
호산구 수의 증가는 알레르기성 질환과 밀접한 연관이 있다. 호산구의 수를 감소시키기 위해서는 호산구의 증식을 억제하는 것도 중요하지만 보다 더 직접적으로 NK cell과 같은 이펙터 (effector) 세포에 의한 항체-의존적 세포 독성 (Antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 유도하는 방법이 더 효과적이다. 벤랄리주맙은 IL-5Rα에 대한 항체로 FDA 승인을 받았으며, IL-5의 활성을 저해할 뿐만 아니라 ADCC로 인한 호산구를 제거한다고 알려져 있다. 또한 벤랄리주맙은 afucosylated Fc를 가지고 있어 IgG1 Fc 보다 NK cell 등에 발현된 Fcγ와의 친화력이 높아 더 높은 ADCC 활성을 나타낼 수 있다 (Kolbeck et al., 2010). 본 발명자들은 벤랄리주맙의 가변 영역 (Accession Number: DB12023)과 IgG1 Fc를 가지는 벤랄리주맙 유사체를 제조하여 역시 동일한 IgG1 Fc를 가지는 항-IL-5Rα 항체 (5R65)와 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체들 (BsIgG, 4R34.1.19-SL-5R65)과의 활성의 비교하여 IL-5Rα를 표적하는 단일클론항체보단 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체가 더 높은 ADCC 유도능을 보이는지를 분석하였다.
구체적으로 50㎖ 용량의 폴리프로필렌 원심관에 Ficoll-Paque solution (GE Healthcare, 17-5442-03)를 20㎖씩 분주하여 각각에 헤파린 처리를 한 환자 혈액 20㎖을 중층하였다. 이것을 879×g, 실온에서 25분간 원심분리하여 버피코트층을 분리, 회수하여 IL-2를 처리하여 10일간 인큐베이션 하여 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)를 expansion하였다. 10일 후에 NK Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec; 130-092-657)를 이용하여 제조사의 프로토콜대로 NK 세포를 정제하였다.
다시 동일한 건강한 기증자의 말초 혈액을 Ficoll-Paque로 중층 후, 호산구 단리를 위해 가장 아래층을 분리, 회수하였다. 호산구는 eosinophil Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec; 130-092-010)을 이용하여 제조사의 프로토콜대로 정제하였다. 정제된 NK 세포 및 호산구를 10:1의 비율로 이펙터 및 표적 세포로서 사용하였다. 먼저 표적 세포인 호산구는 최종 농도가 10 μM CellTraceTM CFSE (Invitrogen)와 37℃, 빛이 차단된 곳에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세포배양 배지를 첨가 후 5분 동안 상온에 배양하고 300xg, 실온에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 호산구를 세포배양 배지에 풀어준다. 96 웰의 U자형 세포 배양용 플레이트에 2x104개/웰의 호산구와 2x105개/웰의 NK 세포를 분주하고 최종농도 100pM의 인체 IL-5을 첨가한다. 또한 최종농도 250 nM의 항-IL-5Rα 항체 (벤랄리주맙 유사체, 5R65) 및 IL-4Rα×IL-5Rα 이중특이항체 (BsIgG, 4R34.1.19-SL-5R65)를 각각 첨가하였다. 각 항체에 대하여 2웰 배양하고 각 웰의 용량은 최종적으로 200㎕로 되도록 조제하였다. CO2인큐베이터 37℃에서 6 시간 배양한다. 배양 종료후 각 웰로부터 세포현탁액을 회수한후 형광 플레이트 측정기로 방출된 칼세인-AM의 형광을 감지하였다. 항체-의존적 세포 독성 유도능은 아래 공식을 이용하여 계산하였다.
세포 독성(%) = (A-B)/(C-B) × 100
A : 항체 처리시 방출값
B : 세포 자발적인 방출값
C : 세포 최대 방출값 (Triton X-100 처리군)
분석결과, 건강한 기증자 유래 호산구에 대해 IL-5Rα를 표적하는 단일클론항체 (벤랄리주맙 유사체, 5R65) 보다 IL-4Rα와 IL-5Rα를 동시에 표적하는 (IL-4Rα×IL-5Rα) 이중특이항체가 (BsIgG, 4R34.1.19-SL-5R65)이 더 높은 세포 독성 유도능을 보였다. 특히 4R34.1.19-SL-5R65이 가장 강한 유도능을 보였다. 이는 정량화한 그래프로 확인할 수 있다 (도 24).
현재 알레르기성/염증성 질환에 대한 단일클론항체의 임상 결과는 일부 환자에게만 효과가 있거나 효과가 거의 나타나지 않는 한계가 있다. 이러한 한계는 환자마다 phenotype이 다르다는 점에서 나타날 수 있다. 특히 알레르기질환은 여러 사이토카인과 면역세포가 복합적으로 일어나므로, 단일 사이토카인을 중화하기 보다는, 동시에 2개 또는 그 이상의 사이토카인을 동시에 중화하는 것이 훨씬 효율적인 전략이다.
따라서 염증 반응을 유발하는 주요 사이토카인들을 동시에 중화하는 이중특이항체가 보다 포괄적으로 염증을 억제하고 시너지 효과를 기대할 수 있다. 또한 하나의 세포에 발현된 두 개의 수용체를 동시에 표적함으로써 더 강하고 특이적으로 표적하여, 증가된 세포성장 저해 및/또는 ADCC를 유도하여 염증성 면역 세포를 제거할 수 있으며, 이에 따라 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하여 표적하는(IL-4Rα×IL-5Rα) 이중특이항체는 강력한 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 치료용도로 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
이러한 질환으로는 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 및 류마티스성 관절염 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (18)

  1. 서열번호 65로 표시되는 인터루킨 (IL)-4 수용체 α (IL-4Rα, CD124)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 서열번호 66으로 표시되는 인터루킨 (IL)-5 수용체 α (IL-5Rα, CD125)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1; 서열번호 2 내지 7로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR2; 서열번호 8의 중쇄 CDR3; 및
    서열번호 13의 경쇄 CDR1; 서열번호 14의 경쇄 CDR2; 서열번호 15 내지 20로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 66으로 표시되는 IL-5Rα의 서열 중 도메인 3(domain 3, D3)에 해당하는 아미노산 잔기 221번 내지 322 위치로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 중쇄 CDR1; 서열번호 28의 중쇄 CDR2; 서열번호 29 내지 35로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR3; 및
    서열번호 43의 경쇄 CDR1; 서열번호 44의 경쇄 CDR2; 서열번호 45의 경쇄 CDR3를 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 15의 경쇄 CDR3;
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 3의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 4의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 17의 경쇄 CDR3;
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 6의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 17의 경쇄 CDR3;
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 7의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 16의 경쇄 CDR3;
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 18의 경쇄 CDR3;
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 3의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 19의 경쇄 CDR3; 또는
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2, 서열번호 8의 중쇄 CDR3 및 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 14의 경쇄 CDR2, 서열번호 20의 경쇄 CDR3를 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 29의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3;
    서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 30의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3;
    서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 31의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3;
    서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 32의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3;
    서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 33의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3;
    서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 34의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3; 또는
    서열번호 27의 중쇄 CDR1, 서열번호 28의 중쇄 CDR2, 서열번호 35의 중쇄 CDR3 및 서열번호 43의 경쇄 CDR1, 서열번호 44의 경쇄 CDR2, 서열번호 45의 경쇄 CDR3을 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 9 내지 12, 67 및 68로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 21 내지 26으로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 가변영역을 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 36 내지 42로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 가변영역을 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항에 있어서, 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 46의 경쇄 가변영역을 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제1항에 있어서, 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 및 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 이종이중체 중쇄불변부위(heterodimeric Fc)에 결합된 scIgG 또는 BsIgG 포맷(format)인 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체;
    상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 IgG의 C-말단에 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 scFv가 연결된 IgG-scFv 포맷인 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체; 또는
    상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 IgG의 N-말단에 상기 IL-4Rα에 결합하는 항체 또는 상기 IL-5Rα에 결합하는 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역이 병치되어(tandem repeat) 있는 포맷을 포함하는 DVD(dual variable domain) IgG 포멧인 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체를 포함하는 다중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  14. 제13항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  15. 제14항의 발현벡터로 형질전환된 세포.
  16. 다음 단계를 포함하는 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제15항의 세포를 배양하여, IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 IL-4Rα와 IL-5Rα에 동시에 결합하는 이중특이항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 알러지성 질환, 염증성 질환 및/또는 호산구의 증가로 인해 발생되는 질환은 과호산구증후군(Hypereosinophilic syndrome, HES); 과호산구증가증(hypereosinophilia); 호산구성 천식 (eosinophilic asthma), 호산구성 기관지 천식 (eosinophilic bronchial asthma, ABA) 및 중증 호산 구성 기관지 천식 (severe eosinophilic bronchial asthma, ABA) 등의 천식; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) ; Cherge-Strauss 증후군; 호산구성 식도염 (eosinophilic esophagitis); 호산구성 위장염 (eosinophilic gastroenteritis); 호산구성 위장관병(EGID); 아토피 피부염(Atopic Dermatitis) 등의 아토피 질환(atopic disease); 알레르기성 비염(allergic rhinitis) 등의 알레르기 질환(allergic disease); 면역글로불린(IgE)-매개 식품 알레르기 등의 식품 알레르기; 염증성 장 질환, 알레르기성 대장염; 위식도 역류; 심내막심근 섬유증; 뢰플러 심장내막염; 데이비스병; 호산구증가증과 관련된 간헐 맥관부종; 호산구증 가증-근육통 증후군/스페인 독성 오일 증후군(Spanish Toxic Oil Syndrome); 간경변증; 피부염 농가진; 수포성 유천포창; 척-스트라우스 증후군; 급성 골수성 호산구성 백혈병; 급성 림프구성 호산구성 백혈병; 호산구증가증 동반의 전신성 비만세포병; 습진; 베그너 육이종증; 결절다발 동맥염; 호산구성 혈관염; 류마티스성 관절염; 가와사키병 (Kawasaki disease); 겸상 적혈구증(sickle cell disease); 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome); 그레이브스병(Grave's disease); 전-자간증(pre-eclampsia); 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome); 자가면역 림프세포증식 증후군; 자가면역 용혈빈혈(autoimmune hemolytic anemia); 바레트 식도(Barrett's esophagus); 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis); 결핵; 신장증; 포진; 만성 특발성 두드러기; 피부경화증; 비대 흉터형성; 휘플병(Whipple's Disease) ; 양성 전립선 과다형성; 경증; 및 염증성 창자병 등의 염증 장애;로 구성된 군에서 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
PCT/KR2021/012344 2020-09-14 2021-09-10 인터루킨-4 수용체 알파 서브유닛과 인터루킨-5 수용체 알파 서브유닛에 동시에 결합하는 이중특이항체 및 이의 용도 WO2022055299A1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21867164.2A EP4212550A1 (en) 2020-09-14 2021-09-10 Bispecific antibody simultaneously binding to interleukin-4 receptor alpha subunit and interleukin-5 receptor alpha subunit, and use thereof
US18/024,143 US20230357415A1 (en) 2020-09-14 2021-09-10 Bispecific antibody simultaneously binding to interleukin-4 receptor alpha subunit and interleukin-5 receptor alpha subunit, and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200117667A KR20220035655A (ko) 2020-09-14 2020-09-14 인터루킨-4 수용체 알파 서브유닛과 인터루킨-5 수용체 알파 서브유닛에 동시에 결합하는 이중특이항체 및 이의 용도
KR10-2020-0117667 2020-09-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022055299A1 true WO2022055299A1 (ko) 2022-03-17

Family

ID=80632040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/012344 WO2022055299A1 (ko) 2020-09-14 2021-09-10 인터루킨-4 수용체 알파 서브유닛과 인터루킨-5 수용체 알파 서브유닛에 동시에 결합하는 이중특이항체 및 이의 용도

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230357415A1 (ko)
EP (1) EP4212550A1 (ko)
KR (1) KR20220035655A (ko)
WO (1) WO2022055299A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023226617A1 (zh) * 2022-05-23 2023-11-30 南京融捷康生物科技有限公司 一种稳定的抗体制剂

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6018032A (en) 1995-09-11 2000-01-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody against human interleukin-5-receptor α chain
WO2009070642A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-04 Medimmune, Llc Protein formulation
US7605237B2 (en) 2006-10-02 2009-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
KR101522954B1 (ko) 2012-11-27 2015-05-27 아주대학교산학협력단 항체 중쇄불변부위의 이종이중체 고효율 형성을 유도하는 ch3 도메인 변이체 쌍, 이의 제조방법, 및 용도
KR20150139905A (ko) * 2013-04-05 2015-12-14 제넨테크, 인크. 항-il-4 항체 및 이중특이적 항체 및 그의 용도
WO2019158728A1 (en) * 2018-02-15 2019-08-22 Argenx Bvba Combined antagonists against il-5/il-5r and either il-4/il-4r or il-13/il-13r
KR20200054095A (ko) * 2018-11-09 2020-05-19 아주대학교산학협력단 인간 il-4 수용체 알파에 대한 고친화도 인간 항체 및 이의 용도

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6018032A (en) 1995-09-11 2000-01-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody against human interleukin-5-receptor α chain
KR100259828B1 (ko) 1995-09-11 2000-06-15 히라타 다다시 인체 인터루킨 5 수용체 알파-사슬에 대한 항체
US7605237B2 (en) 2006-10-02 2009-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
KR101474227B1 (ko) 2006-10-02 2014-12-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 사람 ｉｌ-4 수용체에 대한 고친화성 사람 항체
WO2009070642A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-04 Medimmune, Llc Protein formulation
KR101522954B1 (ko) 2012-11-27 2015-05-27 아주대학교산학협력단 항체 중쇄불변부위의 이종이중체 고효율 형성을 유도하는 ch3 도메인 변이체 쌍, 이의 제조방법, 및 용도
KR20150139905A (ko) * 2013-04-05 2015-12-14 제넨테크, 인크. 항-il-4 항체 및 이중특이적 항체 및 그의 용도
WO2019158728A1 (en) * 2018-02-15 2019-08-22 Argenx Bvba Combined antagonists against il-5/il-5r and either il-4/il-4r or il-13/il-13r
KR20200054095A (ko) * 2018-11-09 2020-05-19 아주대학교산학협력단 인간 il-4 수용체 알파에 대한 고친화도 인간 항체 및 이의 용도

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GODAR MARIE; DESWARTE KIM; VERGOTE KARL; SAUNDERS MICHAEL; DE HAARD HANS; HAMMAD HAMIDA; BLANCHETOT CHRISTOPHE; LAMBRECHT BART N.: "A bispecific antibody strategy to target multiple type 2 cytokines in asthma", JOURNAL OF ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 142, no. 4, 8 June 2018 (2018-06-08), AMSTERDAM, NL , pages 1185, XP085496777, ISSN: 0091-6749, DOI: 10.1016/j.jaci.2018.06.002 *
KABAT ET AL.: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1991, PUBLIC HEALTH SERVICE, NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH
KIM, J.-E.: "Engineering of Bispecific Antibodies Simultaneously Targeting Human Interleukin 4 Receptor Alpha (IL-4Rα) and Interleukin 5 Receptor Alpha (IL-5Rα) for Treatment of Severe Eosinophilic Asthma", THESIS, 1 February 2021 (2021-02-01), Korea, pages 1 - 137, XP009535485 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023226617A1 (zh) * 2022-05-23 2023-11-30 南京融捷康生物科技有限公司 一种稳定的抗体制剂

Also Published As

Publication number Publication date
US20230357415A1 (en) 2023-11-09
KR20220035655A (ko) 2022-03-22
EP4212550A1 (en) 2023-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020096381A1 (ko) 인간 il-4 수용체 알파에 대한 고친화도 인간 항체 및 이의 용도
AU2019229076B2 (en) Anti-TIGIT antibodies and uses thereof
WO2019225787A1 (ko) 항-b7-h3 항체 및 그 용도
WO2014204280A1 (en) Fcrn-specific human antibody and composition for treatment of autoimmune diseases
WO2014077648A1 (ko) 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2016137108A1 (en) Novel antibody binding to tfpi and composition comprising the same
WO2014090053A1 (zh) 拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2019050362A2 (ko) 인간 dlk1에 대한 항체 및 이의 용도
WO2017074074A1 (en) Novel anti-glypican 3 antibody and pharmaceutical composition containing the same
WO2019112347A2 (ko) 악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
WO2022039490A1 (en) Anti-b7-h4/anti-4-1bb bispecific antibodies and use thereof
WO2018174544A2 (ko) Muc1에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
WO2018026248A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질(pd-1)에 대한 신규 항체 및 이의 용도
WO2016200189A1 (ko) 광견병 바이러스 g 단백질의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 광견병 바이러스 중화 결합 분자
WO2021071319A1 (ko) 다중 특이적 융합 단백질 및 이의 용도
WO2022177394A1 (ko) Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 단일 도메인 항체 및 이의 용도
WO2022055299A1 (ko) 인터루킨-4 수용체 알파 서브유닛과 인터루킨-5 수용체 알파 서브유닛에 동시에 결합하는 이중특이항체 및 이의 용도
WO2019078699A2 (ko) 항-vista 항체 및 이의 용도
WO2022103245A1 (ko) Sars-cov-2에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도
WO2022085905A1 (ko) SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2019125070A1 (ko) 악성 b 세포를 특이적으로 인지하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 이를 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
WO2021101346A1 (en) Anti-ror1/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof
WO2020251316A1 (ko) α-SYN/IGF1R에 대한 이중 특이 항체 및 그 용도
WO2021060837A1 (en) Anti-mers-cov antibody and use thereof
WO2022149837A1 (ko) 항-fgfr3 항체 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21867164

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021867164

Country of ref document: EP

Effective date: 20230414