KR20200054095A - 인간 il-4 수용체 알파에 대한 고친화도 인간 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 IL-4의 수용체인 인간 IL-4 수용체 알파 체인에 pM 수준의 고친화도로 결합하며, 기존 항체와는 다른 에피토프를 가지며 항원해리속도가 다른 항체 또는 이의 항원 결합단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법, 이를 포함하는 접합체, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 염증성 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

인간 IL-4 수용체 알파에 대한 고친화도 인간 항체 및 이의 용도 {High Affinity Human Antibodies Against Human Interleukin-4 Receptor alpha and Uses Thereof}
본 발명은 인간 IL-4(hIL-4)의 수용체인 인간 IL-4 수용체 알파(hIL-4Rα)에 고친화도로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법, 이를 포함하는 접합체, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 염증성 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.
아토피 피부염, 알레르기성 비염, 천식 및 식품 알레르기와 같은 알레르기성 질환은 무해성 환경 항원 (알레르겐)에 대해 악화된 Th2 세포 반응과 관련된 것을 특징으로 한다.
알레르겐은 항원 제시 세포(antigen presenting cell)에 의해 포획되고, 림프절로 이동하여, 림프절 내의 전구체 T 세포(naive T-helper cell, Th0)에 작용하여, IL4에 의해 Th0 세포의 분화를 유도하게 된다. 알레르겐 특이성 Th 세포는 Th2 표현형에 속하고 인터루킨-4 (IL-4)에 의해 전구체 T 세포로부터 분화되어 Th2 세포로 발생한다. Th2 세포는 일단 활성화되면, IL-4 및 인터루킨-13 (IL-13)을 분비하고, 이들은 표면에 결합한 신호와 함께 B세포를 유도하여 IgE 생산 플라즈마 세포로 전환된다. IgE 분자는 비만 세포상의 고친화성 FcεR에 결합하고, 이후 알레르겐과 만난 후 비만 세포 활성화를 유도하고 알레르기 반응의 매개체의 방출을 유도한다. Th2 사이토카인은 또한 호산구의 생존을 촉진시키고, 탈과립화 후 IgE 생산, Th2 세포 분화 및 호산구 생존을 증강시킬수 있는 추가의 Th2 사이토카인을 방출시키는 비만 세포의 성장을 촉진시킨다.
따라서, Th2 세포는 알레르기 반응의 유도 및 발생에서 중추적인 역할을 하는 바, 그의 발생 및/또는 그의 이펙터(effector)의 작용을 길항시키기 위해 Th2 사이토카인(예를 들어 IL-4, IL-13)의 작용을 중화 및 억제시키는 것이 알레르기 반응을 중재시키는 효과적인 방법이 될 것이다.
IL-4 특이적인 약제인 Altrakincept(Immunex)와 Pascolizumab(GlaxoSmithKline)의 경우 부분적인 천식 증상에 효과를 보여 임상 초기에 실패하였고 비록 IL-13에 대한 약제가 IL-4에 대한 약제보다 치료효과가 더 좋아 보였지만, Anrukinzumab(Pfizer; Wyeth)는 임상 2상, Tralokinumab (AstraZeneca)은 임상 3상에서 실패하였고 Lebrikizumab (Roche, Dermira)는 임상 2상에 진행중이다. 아직까지 개발된 IL-4 또는 IL-13을 억제하는 단일 약제의 경우 두 사이토카인의 중복되는 역할 때문에 임상에서 큰 효과를 보지 못하였다.
이에, IL-4 또는 IL-13 단독으로 표적화하는 것보다 두 개의 사이토카인의 역할을 억제하는 것이 유익할 수 있다고 제시되어 왔다. 구체적으로 IL-4 와 IL-13은 세포 표면 수용체 및 수용체 컴플렉스는 상이한 친화성을 가지고 IL-4 및/또는 IL-13을 결합시킨다. IL-4의 경우 IL-4Rα에 고친화도(1nM)로 결합하여 IL-13Rα1와 헤테로다이머를 이루고 IL-13는 IL-13Rα1에 고친화도(30nM)로 결합하여 IL-4Rα와 헤테로다이머를 이루어 Stat6에 의한 세포 신호 전달을 보내기 때문에 이들의 수용체를 표적화하는 전략으로 연구가 진행되었다.
IL-4 뮤테인(Pitrakinra; Aerovance, Berkeley, CA)의 경우 IL13Rα와의 결합부위에 돌연변이를 도입하여 IL-4Rα에 결합하여도 수용체 콤플렉스를 이룰 수 없어 IL IL-4와 IL-13에 의한 신호 억제능으로 임상 2a에서 알레르겐이 유도된 후기 천식 반응을 감소시키고 천식 환자에서 폐의 안정기(resting) 염증 상태를 약독화 시키는 효능을 보여 IL-4Rα의 타겟화에 대한 견해를 더욱 공고히 하였다. 하지만 짧은 반감기로 인해 PK(Pharmacokinetics) 특성이 기대에 못 미쳤다.
또 다른 IL-4와 IL-13 저해제인 AMG317(Amgen)의 경우 IL-4Rα에 결합하여 IL4와 IL13의 활성을 저해한다. 하지만 플라시보와 중도 아토피성 천식환자를 대상으로 12주간 투여하였을 때 낮은 효과를 보여 임상 2상에서 실패하였다.
현재까지 항-hIL-4Rα 항체는 Regeneron Pharmaceuticals Inc.가 개발한 항체가 (미국특허 제 7,605,237호, 대한민국 특허 제 10-1474227호) 두필루맙(Dupilumab)이 2017년 FDA에 승인을 받아, 알러지 질환 (예, 아토피 습진 (eczema)) 질환에 치료용으로 쓰이고 있다. 두필루맙은 매우 높은 친화도 (pM 수준의 친화도 상수(KD))를 가지는 항hIL-4Rα 항체이다.
하지만 두필루맙 이 외의 치료용 항-hIL-4Rα 항체는 아직 승인된 바 없으며, 같은 치료제를 지속적이고 반복적으로 투여함에 따라 항-drug 항체(anti-drug antibody, ADA)가 생성되는 등 그 치료제에 대한 내성이 생기기도 한다 (Vaisman-Mentesh, A. et al., 2019). 이에 따라 강력한 치료효과를 가지는 항-hIL-4Rα 항체에 대한 기술 수요는 여전히 높은 상황이다.
또한 IL-4Rα는 세포 내재화(cellular internalization)가 빠른 특성을 가지고 있어 수용체에 결합한 물질의 endocytosis (receptor-mediated endocytosis)를 유발하여 분해할 수 있다. 이러한 특성은 생체 내 투여한 항체가 IL-4Rα에 결합되어 항체가 체내에서 빨리 제거 (antigen-mediated clearance)될 수 있는 기회를 제공한다 (Fujimoto et al., 2015). 이러한 경우는 항체의 친화도 (affinity)가 높은 경우, 특히 항원과의 해리속도 (off-rate, dissociation) 가 느려 수용체와 결합 후 떨어지지 않는 경우 촉진될 수 있다 (M Ritchie et al., 2013).
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 같은 항원에 대한 항체라도 에피토프와 친화도 (affinity)에 따라 효능이 달라질 수 있고 같은 치료제를 지속적이고 반복적으로 투여함에 따라 그 치료제에 대한 내성이 생기기도 하므로, IL-4와 IL-13의 신호를 둘 다 억제할 수 있는 신규 항- hIL-4Rα 항체를 개발하는 것이 필요함을 바탕으로, hIL-4Rα에 pM 수준의 친화도 상수(KD)를 가지고 높은 고친화도를 가지며, 기존 항체와 에피토프가 다른 항-hIL-4Rα 항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 hIL-4Rα에 대해 pM 수준의 친화도(K D)를 가지는 신규 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 hIL-4Rα에 대해 기 개발된 항체와 다른 에피토프를 가지는 신규 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 hIL-4Rα에 대해 항원 해리속도 (off-rate)가 빨라진 신규 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 접합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 염증성 질환의 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정시 인간 인터루킨-4 수용체 알파(hIL-4Rα)에 150 pM 미만의 친화도 상수(KD)를 가지며 기존 항체와 항원결합부위가 다른 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 98로 표시되는 인간 인터루킨-4 수용체 알파(hIL-4Rα)의 Leu67, Leu68, Asp92, Val93 및 Asp97의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하며, 인간 인터루킨-4 (hIL-4) 및 인간 인터루킨-13 (hIL-13)과 hIL-4Rα에 경쟁적으로 결합하는 특성을 갖는다.
본 발명에 따른 항체는 항원해리속도 (off-rate)가 기 개발된 항체보다 빨라져 생체 내 항원에 의해 항체가 제거되는 현상 (antigen-mediated clearance)의 감소가 예상되는, 인간 인터루킨-4 수용체 알파(hIL-4Rα)에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 및 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자 및 리포좀으로 구성된 군으로부터 선택된 생체활성분자가 융합된 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 또는 상기 접합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 염증성 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항-hIL-4Rα 항체 또는 이의 항원 결합단편은 항체는 hIL-4 활성을 중화시켜 환자 유래 T 세포의 세포 성장 억제와 Th2 세포 분화 저해 능력을 가짐으로써, 염증성 질환, 구체적으로는 아토피성 피부염, 천식, 알레르기성 비염이나 식품 알레르기 반응 등의 알레르기성 질환의 치료용 또는 예방용으로 사용될 수 있다. 이외에도, 관절염 (패혈성 관절염 포함), 포진, 만성 특발성 두드러기, 피부경화증, 비대 흉터형성, 휘플병(Whipple's Disease), 양성 전립선 과다형성, 경증, 중간 또는 중증 천식과 같은 폐 장애, 염증성 창자병과 같은 염증 장애, 가와사키병 (Kawasaki disease), 겸상 적혈구증(sickle cell disease), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 그레이브스병(Grave's disease), 전-자간증(pre-eclampsia), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 자가면역 림프세포증식 증후군, 자가면역 용혈빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 바레트 식도(Barrett's esophagus), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 결핵, 또는 신장증을 포함하는 질병도 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1a는 hIL-4Rα 항원 단백질을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터의 모식도를 나타낸다. Pcmv는 프로모터, H는 Poly 6X Histidine Tag이다.
도 1b는 HEK293F 세포에서 발현시킨 hIL-4Rα 항원 단백질을 확인하는 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 2는 항-hIL-4Rα 항체들의 hIL-4Rα 항원 단백질에 대한 결합 친화력과 특이적 결합을 확인하기 위한 indirect ELISA 결과를 나타낸다.
도 3a는 HEK-블루 세포의 hIL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 분비형 엠브리오닉 알칼라인(Secreted Embryonic Alkaline Phosphatase, SEAP)의 분비 매커니즘과 효소-기질 반응에 관한 모식도이다.
도 3b는 항-hIL-4Rα 항체들의 HEK-블루(Blue)-IL-4/IL-13 세포를 이용한 hIL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 정도를 평가한 결과이다.
도 4는 항-hIL-4Rα 항체의 친화도 향상을 위해 4R34 기반으로 구축된 라이브러리의 구축 전략을 나타낸 모식도이다. 중쇄가변영역의 CDR 2, 3 부분과 경쇄가변영역의 CDR 3 부분에 라이브러리를 주었다.
도 5는 항-hIL-4Rα 항체의 친화도 향상을 위해 4R34 기반으로 구축된 라이브러리의 선별 전략을 나타낸 모식도이다.
도 6는 4R34 기반으로 구축된 라이브러리에서 hIL-4Rα에 고친화도 클론을 얻기 위한 단계별 선별 과정을 유세포 분석기로 분석한 자료이다.
도 7a는 hIL-4-mFc 리간드 단백질을 발현하기 위한 동물 세포 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 7b는 HEK293F 세포에서 발현시킨 hIL-4-mFc 리간드 단백질을 확인하는 SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 8는 효모 표면 발현 scFab 클론들의 hIL-4Rα에 대하여 hIL-4-mFc와의 경쟁 조건에서의 결합능을 유세포 분석기로 분석한 자료이다. 효모 표면 발현 scFab 클론들이 hIL-4와 유사한 결합 부위에 결합함을 증명한다.
도 9는 친화도가 개량된 항-hIL-4Rα 항체들의 HEK-블루(Blue)-IL-4/IL-13 세포를 이용한 hIL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 정도를 평가한 결과이다.
도 10는 항-hIL-4Rα 항체의 친화도 향상을 위해 4R34.1 기반으로 구축된 라이브러리의 구축 전략을 나타낸 모식도이다. 중쇄가변영역의 CDR 1 부분과 경쇄가변영역의 CDR 1 부분에 라이브러리를 주었다.
도 11는 선별된 항-hIL-4Rα 항체들과 hIL-4-mFc 리간드가 hIL-4Rα에 대하여 결합 경쟁 ELISA를 수행한결과이다. 항체들의 농도에 따라 hIL-4-mFc와의 결합 경쟁을 확인하였고, 이는 항-hIL-4Rα 항체들이 hIL-4 결합부위와 중첩되는 부위에 결합함을 증명한다.
도 12는 항-hIL-4Rα 항체들의 HEK-블루(Blue)-IL-4/IL-13 세포를 이용한 hIL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 정도를 평가한 결과이다.
도 13는 항-hIL-4Rα 항체들의 HEK-블루(Blue)-IL-4/IL-13 세포를 이용한 hIL-13 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 정도를 평가한 결과이다.
도 14는 hIL-4Rα가 발현된 THP-1 세포주와 hIL-4Rα가 발현되지 않은 Molt-4 세포주에서의 항-hIL-4Rα 항체들의 hIL-4Rα 특이적 결합능을 항체 농도별로 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 15a는 hIL-4와 hIL-4Rα의 결합 구조 (PDB ID: 1IAR)와 결합에 중요하게 작용하는 잔기를 구체화한 것이다. Glu33, Arg112 잔기는 hIL-4Rα와 결합에 중요하게 작용하는 hIL-4의 잔기를 나타낸 것이다. Tyr38, Ser95, Asp97, Tyr208 잔기는 hIL-4와 결합에 중요하게 작용하는 hIL-4Rα의 잔기를 나타낸 것이며, Leu67, Leu68, Asp92, Val93 잔기는 hIL-4 와의 결합에 관여할 것이라 예상되며 또한 이 잔기들은 Medimmune Limited에서 개발한 항체의 에피토프 부위이다.
도 15b는 도10a에서 표시한 hIL-4Rα 잔기들을 각각 알라닌 돌연변이를 도입하여 구축 및 발현, 정제한 hIL-4Rα 변이체들을 비환원성 조건에서 12 % SDS-PAGE를 통해서 분석한 결과이다.
도 15c는 도 10a에서 정제된 hIL-4Rα 변이체들과 항-hIL-4Rα 항체들의 indirect ELISA를 통해 각 항체들의 에피토프 부위를 확인한 실험 결과이다. 두필루맙 유사체는 Val93 또는 Asp97 잔기에 단일 알라닌 돌연변이가 들어간 hIL-4Rα 변이체들에 대해서 결합력이 떨어졌고, 다른 항-hIL-4Rα 항체들은 hIL-4Rα 변이체들에 대해서 서로 다른 결합력을 보였다. 이는 친화도 성숙 과정을 거치면서 항체들의 에피토프 부위가 달라졌음을 보여준다.
도 16는 항-hIL-4Rα 항체들의 정상인 및 환자유래 PHA-activated PBMC에서 세포 성장 억제능을 보여준다.
도 17a는 항-hIL-4Rα 항체들의 정상인 및 환자유래 naive T 세포에서 Th2 세포로의 분화 저해능의 정량값을 보여준다.
도 17b는 항-hIL-4Rα 항체들의 정상인 및 환자유래 naive T 세포에서 Th2 세포로의 분화 저해능 실험의 대표 이미지를 보여준다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정시 150 pM 미만의 친화도 상수(KD)를 가지나 해리속도 (off-rate)가 기 개발된 항체보다 빨라져 생체 내 항원에 의해 항체가 제거되는 현상 (antigen-mediated clearance)의 감소가 예상되어 생체내 약물동력학 (Pharmakokinetics)가 향상될 수 있는, 인간 인터루킨-4 수용체 알파(hIL-4Rα)에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체는 항원 hIL-4Rα에 대하여 고친화도(affinity)로 결합하는 항체로, IL-4 활성을 중화시키는 능력을 가진다. 용어 "친화도"는 항원의 특정부위를 특이적으로 인식하고 결합하는 능력으로, 항체의 항원에 대한 특이성과 함께 고도의 친화도는 면역 반응에서 중요한 요소이다.
상기 친화도 상수(KD)는 표면 플라스몬 공명(SPR), 예를 들어 BIAcore를 사용하여 결정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명 데이터를 통해 1:1 랑뮈어 결합 모델(동시에 ka kd) 및 속도 상수 kd1/ka1의 비율에서 산출된 친화도 상수(KD)를 얻으며, 150 pM 미만, 100 pM 미만, 75 pM 또는 50 pM 미만일 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 98의 hIL-4Rα에서 Leu67, Leu68, Asp92, Val93 및 Asp97의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하며, 인간 인터루킨-4 (hIL-4) 및 인간 인터루킨-13 (hIL-13)과 hIL-4Rα에 경쟁적으로 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 hIL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항-hIL-4Rα 항체로, 본 발명의 범위에는 hIL-4Rα에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. "scFab"는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역, 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1) 및 링커로 이루어진 폴리펩티드이다. 경우에 따라서, 시스테인 잔기의 삽입에 의해 안정화될 수 있다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 항체는 단일클론항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단일클론항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
예를 들어, 본 발명에서 유용한 단일클론항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 박테리아, 진핵 동물 또는 식물 세포에서 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 단일클론항체는 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, hIL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체의 CDR영역의 친화도 개량을 위해 라이브러리를 구축할 수 있으며, (1) 라이브러리 주형인 4R34 및 4R34.1 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)의 항원 결합에 관여하는 6 개의 상보성 결합 부위 (CDR) 중 hIL-4Rα에 결합할 가능성이 높은 아미노산 자리를 선정하는 단계; (2) 상기 선정한 아미노산 자리에, 라이브러리에 포함되길 원하는 아미노산을 코딩할 수 있는 spiked 올리고머(spiked oligonucleotide) 및 디제너레이트 코돈(degenerated codon primer)를 디자인하는 단계; 및 (3) 상기 디자인한 중쇄가변영역 라이브러리를 효모표면발현 시스템을 이용하여 scFab 또는 Fab 형태로 발현하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 hIL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 scFab의 분리 및/또는 친화도 개량을 위해 라이브러리를 이용하여 스크리닝할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 hIL-4Rα에 특이적으로 결합하는 항체 스크리닝 방법은 구체적으로,
(1) hIL-4Rα에 결합할 수 있는 항체 scFab 라이브러리를 효모표면발현 시스템을 이용하여 발현하는 단계;
(2) Hit Tag이 융합된 형태의 IL-4Rα 벡터 구축 및 발현 단계;
(3) hIL-4Rα와 상기 라이브러리를 결합시키는 단계; 결합된 hIL-4Rα를 해리시킬 수 있는 조건을 조성 후에도 hIL-4Rα와 결합하고 있는 효모를 선별하는 단계(키네틱 스크리닝(Kinetic screening)) 및
(4) 상기 hIL-4Rα 와 상기 라이브러리 결합의 친화도를 측정하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 항-hIL-4Rα 항체는 효모표면에 발현된 인간항체 Fab 라이브러리 (Human Fab Antibody Library on Yeast Cell Surface)에서 hIL-4Rα에 대한 항체를 선별하고, 추가적으로 친화도 향상을 위해 효모표면에 항체 Fab 라이브러리를 구축하고 키네틱 스크리닝(Kinetic screening)을 통해 선별한, hIL-4Rα에 고친화도로 선택적으로 결합하는 항체이다.
라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
본 발명에 따른 실시예에서, 항체는 서열번호 98의 hIL-4Rα에서 Leu67, Leu68, Asp92, Val93 및 Asp97로 구성된 군에서 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 친화도 성숙에 따라 도출된 4R34, 4R34.1, 4R34.1.9 항체들의 경우 hIL-4Rα의 Leu67, Leu68, Asp92, Val93 및 Asp97를 중요한 에피토프로 인식하지만 각 에피토프의 기여도는 다르게 작용하고 있다. 특히 Asp92, Val93에 대한 결합능이 4R34 또는 4R34.1보다 높게 나타나는 경향이 보여 주변의 다른 잔기들에 의해 여전히 결합능을 유지하고 있는 것으로 보인다. 이는 친화도 성숙과정을 거치면서 항체들의 에피토프에 변화가 생겼음을 암시한다. 두필루맙 유사체는 상기 hIL-4Rα 아미노산 잔기 돌연변이체와의 결합능이 야생형 (wild type)과 차이가 크게 없지만, Val93 과 Asp97이 약한 결합으로 항체와의 결합에 관여하고 있는 것으로 보인다. 결국, 본 발명에 따른 항체들은 두필루맙 아놀로그를 비롯한 다른 항체들과 다른 에피토프를 가지는 것을 확인하였다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 발명에 있어, 상기 hIL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 11 내지 13 또는 84의 중쇄 CDR1; 서열번호 14 내지 22, 73 내지 76, 85로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2; 서열번호 23 내지 32로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3; 및
서열번호 43 내지 52, 92 내지 97로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR1; 서열번호 53 내지 60로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2; 서열번호 61 내지 68, 81, 82로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함할 수 있다.
구체적으로, 다음의 표 1 및 표 2에 기재된 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함할 수 있다.
[표 1]
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
[표 2]
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
상기 hIL-4Rα에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1 내지 10, 69 내지 72 및 83로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또한, 상기 hIL-4Rα의 세포외 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 33 내지 42, 77 내지 80, 86 내지 91로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
구체적으로, 다음의 표 3 및 표 4에 기재된 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열을 포함할 수 있다.
[표 3]
Figure pat00007
Figure pat00008
Figure pat00009
[표 4]
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합단편은 hIL-4Rα을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-hIL-4Rα 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 이의 항원 결합단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 이의 항원 결합단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자 및 리포좀으로 구성된 군으로부터 선택된 생체활성분자가 융합된 접합체에 관한 것이다.
상기 단백질은 항체, 항체의 단편, 면역 글로불린, 펩타이드, 효소, 성장인자 (growth factor), 사이토카인 (cytokine), 전사인자, 독소, 항원성 펩티드, 호르몬, 운반 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 단백질 복합체, 또는 화학적으로 개질된 단백질 등일 수 있다.
상기 소분자 약물은 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니며 질병의 치료제로서 활성도를 지니는 유기 화합물, 무기 화합물 또는 유기금속 화합물을 나타내는 것으로 본원에서 광범위하게 사용된다. 본원에서 소분자 약물은 올리고펩티드 및 약 1000 달톤 미만의 분자량을 지니는 그 밖의 바이오분자(biomolecule)를 포함한다.
상기 나노입자는 직경 1 내지 1000 nm 크기를 갖는 물질들로 이루어진 입자를 의미하며, 상기 나노 입자는 금속 나노 입자, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 금속/금속 코어쉘 복합체, 금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 비금속 쉘로 구성되는 금속/비금속 코어쉘 또는 비금속 나노 입자 코어 및 상기 코어를 둘러싸는 금속 쉘로 구성되는 비금속/금속 코어쉘 복합체일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐, 백금, 자성철 및 그의 산화물로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않으며, 상기 비금속은 실리카, 폴리스티렌, 라텍스 및 아크릴레이트 계열의 물질로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 리포좀은 자기 스스로 회합할 수 있는, 수성 내부 구획을 둘러싸는 하나 이상의 지질 이중층 막으로 구성된다. 리포좀은 막 타입 및 그 크기에 의하여 특정 수 있다. 작은 유니라멜라 소포(SUV)는 단일막을 갖고 20nm 내지 50nm의 직경을 가질 수 있다. 큰 유니라멜라 소포(LUV)는 50nm이상의 직경을 가질 수 있다. 올리고라멜라 큰 소포 및 멀티라멜라 큰 소포는 다중, 일반적으로 동심원, 막 층을 가지고 직경이 100nm 이상일 수 있다. 여러 비동심원 막을 가진 리포좀, 즉 더 큰 소포 내에서 포함된 여러 작은 소포는 멀티소포성 소포(multivesicular vesicle)라고 한다.
본 명세서에서 "융합"은 기능 또는 구조가 다르거나 같은 두 분자를 일체화하는 것으로, 상기 단백질, 소분자 약물, 나노입자 또는 리포좀에 상기 종양 침투성 펩타이드가 결합할 수 있는 모든 물리, 화학적 또는 생물학적 방법에 의한 융합일 수 있다. 상기 융합은 바람직하게는 연결자 펩타이드에 의할 수 있으며, 이 연결자 펩타이드는 본 발명의 항체 경쇄 가변 영역, 항체, 또는 이의 절편의 다양한 위치에서 상기 생체 활성 분자와의 융합을 중계할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편 또는 상기 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체를 이용하여 치료가능한 염증성 질환의 예로는 아토피성 피부염, 천식, 알레르기성 비염이나 식품 알레르기 반응 등의 알레르기성 질환 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 본 발명에 따른 항체를 이용하여 치료가능한 질환으로는 상기 예시된 아토피성 피부염, 천식, 알레르기성 비염이나 식품 알레르기 반응 등의 알레르기성 질환 이외에도, 관절염 (패혈성 관절염 포함), 포진, 만성 특발성 두드러기, 피부경화증, 비대 흉터형성, 휘플병(Whipple's Disease), 양성 전립선 과다형성, 경증, 중간 또는 중증 천식과 같은 폐 장애, 염증성 창자병과 같은 염증 장애, 가와사키병 (Kawasaki disease), 겸상 적혈구증(sickle cell disease), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 그레이브스병(Grave's disease), 전-자간증(pre-eclampsia), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 자가면역 림프세포증식 증후군, 자가면역 용혈빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 바레트 식도(Barrett's esophagus), 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis), 결핵, 또는 신장증을 포함하는 질병도 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 (a) 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 대한 것이다.
본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편을 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항체는 hIL-4 활성을 제거하거나 억제하거나 감소시킴으로써, hIL-4 매개 질환의 예방 또는 치료에 유용하다. 본 발명에 따른 항체는 hIL-4Rα에 결합하여 Th2 면역반응을 유도하는 hIL-4와 hIL-13의 신호를 억제하여 T 세포의 세포 성장 억제와 Th2 세포 분화를 저해할 수 있다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 염증성 질환 발전의 억제, 염증성 질환의 경감 등을 의미한다. 본 발명의 항체는 hIL-4Rα-발현 세포와 관련된 적용의 경우에 시험관 내 및 생체 내 모두에서 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편; 또는 상기 접합체를 함유할 수 있으며, 상기 성분에 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 위하여 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 약학적으로 허용가능한 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 완충식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합단편; 또는 접합체를 이용한 치료 방법은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편; 또는 접합체를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 또한, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 조성물을 투여하는 개체는 인간을 포함한 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경우 또는 비경우의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 단독 약물 또는 기존 치료제와의 병행치료를 통해 사용될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 염증성 질환의 진단용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는 염증성 질환의 진단용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 염증성 질환의 발병 여부 및 경과를 확인하는 것이다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 사용한 진단 방법을 위해, 약물은 시험관 내 또는 생체 내에서 hIL-4Rα 항원-발현 세포의 존재를 검출하는데 사용되는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 섬광조영술, 자기 공명 영상 또는 초음파를 사용하여 검출할 수 있는 표지와 같이, 생체내에서 검출할 수 있는 방사성 동위원소를 임상 진단 적용을 위해 사용할 수 있다. 유용한 섬광조영술 표지에는 양전자 방출기 및 γ-방출기가 포함된다. 마그네틱 공급원 영상화용으로 대표적인 조영제로는 상자성 또는 초상자성 이온(예를 들면, 철, 구리, 망간, 크롬, 에르븀, 유로퓸, 디스프로슘, 홀뮴 및 가돌리늄), 산화철 입자 및 수용성 조영제가 있다. 초음파 검출을 위해, 가스 또는 액체를 마이크로버블(microbubble) 조영제로서 방출되는 다공성 무기 입자속 안에 포획시킬 수 있다. 시험관내 검출에 유용한 검출 가능한 표지에는 형광발색단, 검출가능한 에피토프 또는 결합제 및 방사성 표지가 포함된다.
상기 염증성 질환의 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
일 실시예에서 상기 키트는 병, 바이알, 백, 주사기 또는 시린지를 포함할 수 있다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 플라스틱, 또는 금속으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기에 포함된 라벨은 사용 지침을 나타낼 수 있다. 추가로 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예컨대 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지 등을 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재조합 인간 인터루킨-4 리셉터α (hIL-4Rα)의 발현
인간 인터루킨-4 리셉터α (hIL-4Rα)에 특이적인 항체를 도출하기 위한 항원 단백질을 제조하였다. hIL-4Rα는 glycoprotein이기 때문에 동물세포 발현 시스템을 이용하였다. Full length의 cDNA (Met26-Ser232)는 동물발현 벡터(pSecTag2A)에 제한효소 NheI/BamHI을 사용하여 클로닝하여 C-말단에 6X히스티딘 표지단백질이 융합되도록 pSecTag2A-hIL-4Rα를 구축하였다 (도 1a). 항원 단백질을 발현 및 정제를 위하여 HEK293F(Invitrogen) 세포에 일시적 트랜스펙션(transient transfection) 하였다. 진탕 플라스크(corning)에 100 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 1.0 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 90ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37 도에서 인큐베이션하였다. 구축된 플라스미드 125μg을 5ml 무혈청 Freestyle 293 발현 배지(Invitrogen)에 희석 및 필터하여 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI) 375μg (7.5 μg/ml)을 희석한 5ml 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후 반응시킨 혼합 배지를 앞서 90ml로 파종한 세포에 넣어 120 rpm, 8% CO2에서 인큐베이션 후, 6일 동안 인큐베이션하였다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 인큐베이션 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 니켈 세파로오스 컬럼 (Ni Sepharose™ 6 Fast Flow, GE Healthcare)에 상등액을 적용하고 세척버퍼 (50mM phosphate, 300mM NaCl, 50mM imidazole pH 8.0)로 세척 후 용출버퍼 (50mM phosphate, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH8.0)을 이용하여 단백질을 용출하였다.
상기 용출된 단백질은 PD-10 Desalting column (GE Healthcare)을 이용하여 저장버퍼 (PBS pH7.4)로 버퍼를 교환한 후 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다.
hIL-4Rα의 탈당화(deglycosylation) 상태를 확인하기 위하여 상기 정제된 hIL-4Rα 단백질과 PNGaseF(NEB) 효소를 표준 프로토콜을 참조하여 반응시켰다.
구체적으로 10μg의 hIL-4Rα 단백질에 2 μl의 GlycoBuffer 2 (10X)를 넣고 최종 20μl가 되도록 3 차수로 부피를 맞춘다. 이 혼합물에 5 μl의 PNGaseF 효소를 추가하여 37 도에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 12.5 μl의 혼합물과 상기 정제된 5μg의 hIL-4Rα 단백질을 SDS-PAGE 분석을 통해 순도를 확인하였다 (도 1b). 정제된 단백질들은 예측한 분자량(26 kDa)보다 큰 사이즈에서 다소 끌리는 듯한 밴드가 관찰되었고 PNGaseF를 함께 처리했을 때 PNGaseF(36 kDa)와 함께 26k Da에서 사이즈가 관찰되었다. 따라서 끌리는 듯한 밴드는 서로 다른 글리코실화(glycosylation) 패턴에 의한 것임을 확인하였다.
실시예 2: 효모표면발현 라이브러리에서의 모노클로날 항체의 선별
인간 항체의 Fab를 발현하는 효모 Fab 라이브러리 (Baek, D. S. and Y. S. Kim (2014). J Microbiol Biotechnol 24(3): 408-420)를 스크리닝하여 <실시예 1>에서 제조한 hIL-4Rα 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 Fab를 발현하는 효모 클론을 스크리닝하였다.
효모 Fab 라이브러리에서 hIL-4Rα 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 클론을 선별한 방법은 다음과 같다. 먼저 hIL-4Rα 항원 단백질은 kit를 이용하여 바이오틴과 접합시켰다(EZ-LINKTMSulfo-NHS-LC-Biotinylationkit, Pierce Inc.). Fab을 발현하는 효모 라이브러리는 Alexa 488이 접합된 항-IgG 항체 (goat Alexa 488-conjugated anti-Fc antibody, Thermo)로 발현량을 확인할 수 있고 PE가 접합된 streptavidin(Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate(SA-PE), Thermo)을 이용하여 항원 결합력을 확인할 수 있다. 라이브러리를 바이오틴화된 hIL-4Rα에 대하여 농도를 낮춰가면서 Fab의 발현량이 높고 바이오틴화된 hIL-4Rα와 결합력이 높은 클론을 FACS 과정을 이용하여 선별하고, 도출된 pool을 분석하는 과정을 반복하였다. 이 같은 과정을 4회 반복하였다.
최종적으로 hIL-4Rα에 특이적으로 결합하는 각각의 개별 클론을 발현하는 효모 세포로부터 DNA를 수득하고 서열을 분석하여 독자적인 염기서열 및 아미노산 서열이 확인된 10종의 항체를 선별하였다.
표 5 및 7 각각은 선별된 hIL-4Rα에 결합능을 보이는 10개의 개별클론의 중쇄 CDR 서열 및 중쇄가변영역의 서열이며, 표 6 및 8 각각은 경쇄 CDR 서열 및 경쇄가변영역의 서열이다.
[표 5]
Figure pat00013
[표 6]
Figure pat00014
[표 7]
Figure pat00015
[표 8]
Figure pat00016
실시예 3: 선별된 항-hIL-4Rα 항체들의 IgG 전환 및 동정
Fab 형태의 선별된 10종의 항체와 두필루맙은 통상적으로 사용되는 항체인 IgG1의 형태로 변환시켰다. 선별된 항체 Fab과 두필루맙의 가변영역(VH, VL)은 IgG1의 경쇄(CH1, CH2, CH3)와 중쇄(CL)를 암호화하는 pcDNA3.4 벡터에 도입하였다. IgG1 불변영역(constant region)을 가지는 두필루맙을 두필루맙 유사체 (dupilumab analogue)로 명명하였다. 각 항체들의 경쇄와 중쇄는 HEK293F 세포에 1:1 비율로 공통형질전환시켜 경쇄와 중쇄가 세포 안에서 함께 발현되도록 하였다. 상기 일시적 트랜스펙션 방법에 따라 채취한 세포 인큐베이션 상등액을 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (12mM phosphate, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용출한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다.
상기 용출된 단백질은 PD-10 Desalting column (GE Healthcare)을 이용하여 저장버퍼 (PBS pH7.4)로 버퍼를 교환한 후 Vivaspin 30,000 MWCO (Satorius) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하였다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량하였다.
실시예 4: 선별된 항-hIL-4Rα 항체들의 결합력 검증
항체의 항원결합력(affinity)과 결합특이성(specificity)을 indirect ELISA를 이용하여 알아보았다. 앞선 <실시예 1>에서 제조한 hIL-4Rα 항원 단백질과 특이성 확인을 위해 GST(Glutathione S-transferase)단백질을 96-웰 플레이트에 각각 50ng/웰로 상온에서 1시간 동안 고정시키고, 4% 분말 우유를 포함하는 0.1% PBST PBST(0.1 % Tween20, pH 7.4, 137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl) 로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 50-500 nM의 범위에서 순차 희석하여 각 항체를 블로킹 된 플레이트에 웰당 25 μl씩 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 2차 항체로 항 인간 IgG-HRP 항체(1:8000)를 웰당 25μl씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 PBST 로 3 번 세척한 후, TMB 용액을 웰당 25μl씩 첨가하여 상온에서 ~1분 동안 발색 반응시킨 뒤, H2SO4(1M)로 반응을 중지시키고, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 2의 결과에서 확인할 수 있듯이, 10종의 항체들은 hIL-4Rα에 대하여 결합특이성을 가지며 다양한 범위의 친화력을 가지고 있는 것을 확인하였다.
실시예 5: 선별된 항-hIL-4Rα 항체들의 IL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 저해능 평가
HEK-블루(Blue)-IL-4/IL-13 세포(Invivogen)는 IL-4 또는 IL-13에 의한 세포 신호 전달 활성화를 비색 분석법 (colorimetric analysis)로 모니터링하여 생물학적 활성을 비교할 수 있다. 이 세포는 hIL-4 수용체와 hIL-13 수용체를 충분히 발현하는 HEK293세포에 완전히 활성화된 STAT6 pathway를 부여하기 위해 human STAT6 유전자를 transfection하여 stable cell line으로 만든 것이다. 또한 이 세포는 STAT6-inducible SEAP(secreted embryonic alkaline phosphatase) reporter gene이 transfection 되어 있다. hIL-4나 hIL-13가 HEK-블루(Blue)-IL-4/IL-13 세포 표면에 발현된 hIL-4 수용체나 hIL-13 수용체에 결합하면 각각 Tyk2와 JAK1을 활성화시키고 STAT6를 모집하여 인산화시킨다. 활성형의 인산화된 STAT6는 이중체를 형성하고 핵으로 이동하여 responsive genes의 promoter에 결합하고 SEAP의 분비를 유도한다. 분비된 SEAP은 분홍색의 기질인 퀀티-블루(Quanti-Blue, Invivogen)를 보라색으로 발색시킨다 (도 3a). 발색의 정도는 hIL-4와 hIL-13의 존재 양과 양의 상관관계를 가지며, standard를 이용해 hIL-4와 IL-13의 함량을 정량 할 수 있다. 때문에 이 세포는 항-IL-4/hIL-4Rα 항체나 항-IL-13/IL-13Rα1 항체에 의한 hIL-4나 hIL-13 신호전달경로를 차단 여부를 스크리닝 하기에 용이하다.
도 3b는 두필루맙 유사체와 비교하여 구축된 항-hIL-4Rα 항체들의 hIL-4 신호 차단효과를 HEK-Blue IL-4/13 세포의 SEAP 분비를 측정하여 확인한 결과이다.
구체적으로는, 세포를 배양 배지(4.5 g/L 글루코스(Gibco/Invitrogen), 10％ 열 불활성화 FBS(Gibco/Invitrogen), 10 ㎍/mL 블라스티시딘(Blasticidin) S, 활성펩티딜 뉴클레오시드 항생제(Invitrogen) 및 100 ㎍/mL 제오신(Zeocin)(상표명), 스트렙토마이세스가 있는 DMEM) 중에 2.5X105개/mL의 밀도로 희석하여 96-웰 플레이트에서 100 μl씩 분주하였다. 동일한 날에, 50 μl의 200 pM 인간 hIL-4(Sinobiological)와 미리 80-400 nM로 희석한 항-hIL-4Rα 항체 용액 50 μl를 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5％ CO2에서 24시간 배양시켰다. 분비된 SEAP을 측정하기 위하여, 20 μl의 각 세포 상청액을 투명 96-웰 플레이트에 넣고 180 μl의 퀀티-블루 용액과 혼합한 후, 96-웰 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 620 nm에서의 흡광도를 CytationTM 3 cell Imaging multi-mode reader로 분석하였다 (도 3b).
분석결과, 모든 항체들이 두필루맙 유사체보다는 낮은 hIL-4 신호차단효과를 보였고, 그 중 4R25 와 4R34가 높은 hIL-4 신호차단효과를 보임을 확인하였다 (도 3b).
실시예 6: 선별된 항-hIL-4Rα 항체들의 결합능 분석
4R25와 4R34에 대해서 hIL-4Rα에 대한 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 SPR(Surface Plasmon Resonance)을 Biacore2000 기기를 이용하여 수행하였다.
구체적으로는, hIL-4Rα(Sinobiological)를 10 mM NaAc 완충액(pH 4.0)에 50 μl/ml 농도로 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 약 500 response units(RU) 고정화 하였다. 이후 HBS-EP 완충액 (10 mM Hepes, 3 mM ethylenediaminetetraacetic acid, and 0.005% surfactant P20 (pH 7.4), GE Healthcare]을 30 μl/min 유속으로 분석하였으며, 4R25와 4R34항체에 대해서 1 nM에서 80 nM의 농도로 분석하였다. 결합, 해리 분석 후 CM5칩의 재생(regeneration)은 완충액(10mM Glycine, pH2.0)을 30μl/min 유속으로 90초간 흘려주어 시행되었다. 결합 90초, 해리 900초로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
표 9는 SPR (BIACORE 2000)를 이용하여 hIL-4Rα에 대한 항-hIL-4Rα 항체들의 친화도 분석 결과를 나타낸다. 4R25와 4R34는 각각 1.21 nM, 141 pM 수준의 높은 친화도를 보이나 이는 항원 고정화로 인해 친화도가 avidity효과 때문에 증가한 것으로 이러한 방식에서 친화도는 항원 고정화 수준에 따라 달라질 수 있다.
[표 9]
Figure pat00017
실시예 7: 4R34 기반 친화도 증가를 위한 효모 세포 표면 발현 라이브러리의 구축
앞선 <실시예 5>에서 4R34 항체가 hIL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 저해능 및 친화도가 4R25에 비하여 우수하였으므로 본 발명자는 항-hIL-4Rα 항체의 생물학적 효능을 높이기 위해 hIL-4Rα에 대한 친화도를 높이고자 하였다.
먼저 효모 표면에 single chain Fab(scFab) 형태로 발현시키기 위하여 NheI/ApaI으로 제한효소 처리한 pYDS-H 벡터(Baek and Kim 2014)에 4R34 항체를 scFab 형태로 구축하여 pYDS 4R34 scFab 벡터와 추가적인 한 개의 뉴클레오타이드를 도입하여 Open Reading Frame (ORF) 밀림 현상으로 스탑 코돈(stop codon)이 발생하는 pYDS-dummy 벡터를 클로닝하였다. pYDS-dummy 벡터를 사용함으로써 제한효소 처리가 안 된 벡터가 섞여 있다 하더라도 원하는 라이브러리 유전자가 들어간 벡터만이 효모 표면에 scFab을 발현할 수 있다.
라이브러리는 pYDS 4R34 scFab 벡터를 기반으로 6개의 CDR 중에서 항원 결합에 중요한 역할을 할 것이라 예측되는 VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR3 지역에 무작위적인 돌연변이를 도입하였다 (도 4).
구체적으로 10종의 항체 서열을 비교하였을 때 보존률이 낮은 VH-CDR2 (50,52-57), VH-CDR3 (95-98), VL-CDR3 (89,90,93,95A)에 돌연변이를 부여하였다. 동시에 많은 지역에 돌연변이를 도입하기 때문에 hIL-4Rα에 대한 결합력을 잃지 않도록 하기 위하여 spiked 올리고머(spiked oligonucleotide)를 사용하였다. 이는 기존 야생형 4R34 서열을 50 % 확률로 보존하면서 모든 아미노산이 적용될 수 있는 돌연변이 방법으로서 아미노산을 코딩하는 3개 뉴클레오타이드에서 각각 야생형 뉴클레오타이드를 79 퍼센트 유지하고 나머지 뉴클레오타이드 비율을 7 퍼센트로 프라이머를 디자인함으로써 PCR 과정에서 야생형 아미노산이 50 퍼센트가 유지되도록 하는 기술이다.
Overlapping PCR을 수행해 라이브러리 유전자를 12 μg 과, pYDS dummy 벡터에도 NheI/ApaI 제한 효소를 하여 4 μg 준비하였다. 만약 제한 효소 처리가 되지 않은 pYDS dummy 벡터가 남아있어 효모 균주에 형질 전환되더라도 스탑 코돈에 의하여 효모 표면에 발현되지 않는다. 두 유전자는 혼합하여 효모표면 발현용 효모 EBY100 (MATa, Trp-) 균주에 전기청공법으로 형질 전환하여 상동성 접합 (homologous recombination)을 통해 구축하였다. 이러한 과정을 10번 반복한 후 라이브러리 크기를 계단식 희석을 한 후 선택 배지 SD-CAA+Trp (20 g/L Glucose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO4, 8.6 g/L NaH2PO4, 5 g/L casamino acids, 0.4 mg/L tryptophan)에 자란 콜로니의 수를 측정하여 확인하였으며, 약 3X107 수준의 라이브러리가 제작되었다.
실시예 8: 효모 scFab 라이브러리의 hIL-4Rα 항원 단백질에 대한 키네틱 스크리닝(Kinetic screening)
보다 높은 친화도의 클론을 선별하기 위하여 바이오틴화된 hIL-4Rα(biotinylated hIL-4Rα) 와 경쟁 단백질로서 바이오틴과 접합하지 않은 hIL-4Rα를 20배 높은 농도로 경쟁시켜 hIL-4Rα에 결합하는 개별 클론들을 선별하였다. 도 5는 <실시예 7>에서 구축한 4R34 기반 효모 scFab 라이브러리에서의 hIL-4Rα에 대한 친화도가 높은 클론을 선별하기 위한 전략을 나타낸 모식도이다.
구체적으로 100 nM 농도의 바이오틴화된 hIL-4Rα 1 ml를 효모 세포에 발현된 scFab (1X108 scFab효모)와 상온에서 30분 동안 결합시킨 후, PE가 접합된 streptavidin(Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate(SA-PE), Thermo)과 Alexa 488이 접합된 항-IgG 항 체(goat Alexa 488-conjugated anti-Fc antibody, Thermo)를 4 도에서 15 분 동안 결합시킨 후 FACS(fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 scFab의 발현량이 높고, 바이오틴화된 hIL-4Rα와 결합력이 높은 클론을 선별하였다.
2차 FACS 수행 시에는 10 nM 농도의 바이오틴화된 hIL-4Rα 1 ml을 2X107 scFab효모와 상온에서 30분 동안 결합시킨 후 1ml autoMACS® Running Buffer (phosphate buffered saline (PBS), bovine serum albumin (BSA), EDTA, and 0.09% azide, pH7.2, Miltenyi Biotec)로 씻은 후 200 nM 농도의 바이오틴과 접합하지 않은 hIL-4Rα를 1 ml로 상온에서 4시간 동안 경쟁시켜 상위 0.1 %의 높은 결합력을 가진 클론을 선별하였다. 이후 3차 FACS 수행 시에는 1 nM 농도의 바이오틴화된 hIL-4Rα 1 ml을 1X107 scFab효모와 상온에서 30분 동안 결합시킨 후 상위 0.2 %의 pool을 선별하였으며 4차 FACS 수행시에는 바이오틴화된 1 nM 농도의 hIL-4Rα 1 ml을 1X107 scFab효모와 25 도에서 30분 동안 결합시킨 후 1 ml autoMACS® Running Buffer로 씻은 후 20 nM 농도의 바이오틴과 접합하지 않은 hIL-4Rα를 1 ml로 상온에서 4시간 동안 경쟁시켜 상위 0.1 %의 높은 결합력을 가진 클론을 선별하였다 (도 6).
위와 같은 선별을 통해 효모 세포 표면에 hIL-4Rα의 결합력이 높은 4개의 개별 클론 (4R34.1, 4R34.2, 4R34.19, 4R34.29)이 분리되었다.
추가적으로 효모 표면에서 항-hIL-4Rα scFab이 바이오틴화된 hIL-4Rα에 대하여 hIL-4와 경쟁적으로 결합하는 지를 평가하였다. 이를 위하여 쥐 중쇄불변영역(Hinge-CH2-CH3, mFc)를 포함하는 동물 발현 벡터인 pcDNA3.4 의 5' 말단에 hIL-4 분비 시그널펩타이드를 코딩하는 DNA가 융합된 full length의 hIL-4 cDNA (His25-Ser153)를 NotI/ApaI으로 클로닝하여 hIL-4-mFc 단백질을 발현하기 위한 벡터를 구축하였다 (도 7a).
상기 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)을 이용하여 단백질을 발현 및 정제하였다. 진탕 플라스크에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지에서 부유 성장하는 HEK293F 세포를 플라스미드 및 폴리에틸렌이민 (Polyethylenimine, PEI)의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 진탕 플라스크에 100 mL 트랜스펙션 시, HEK293F 세포를 1.0 X 106 세포/ml의 밀도로 배지 90ml에 파종하여, 120 rpm, 8 % CO2, 37 도에서 인큐베이션하였다. 플라스미드를 5 ml FreeStyle 293 발현 배지에 125 μg으로 희석 및 필터하여, PEI 375 μg (7.5 μg/ml)을 희석한 5ml의 배지와 혼합한 뒤 실온에서 10 분 동안 반응시켰다. 그 후, 반응시킨 혼합배지를 앞서 90 ml로 파종한 세포에 넣어 120 rpm, 8% CO2에서 6일동안 인큐베이션했다. 표준 프로토콜을 참조하여 채취한 세포 인큐베이션 상등액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column)에 항체를 적용하고 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 0.1 M Glycine, 0.5 M NaCl 완충액을 이용하여 pH 3.0에서 항체를 용리한 후 1M Tris 완충액을 이용하여 샘플을 즉시 중화하였다. 용리한 항체 분획은 투석방법을 통해 PBS (pH 6.5)로 완충액을 교환하며 농축을 진행했다. 정제된 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo)내 용액을 이용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그려진 표준 곡선에 따라 그 양을 정량 하였다. SDS-PAGE 분석을 통해 순도를 확인하였다 (도 7b).
구체적으로 바이오틴화된 hIL-4Rα 1nM 또는 바이오틴화된 hIL-4Rα와 hIL-4-mFc 융합 단백질 20nM을 함께 scFab효모에 상온에서 30분간 결합시킨다. 이후 SA-PE를 4 도에서 15분간 결합시킨 후 바이오틴화된 hIL-4Rα의 결합 정도를 유세포 분석기로 분석하였다 (도 8).
표 10 및 11은 선별된 hIL-4Rα에 높은 결합능을 보이는 4개의 개별클론의 중쇄가변영역의 서열 및 CDR서열이며, 표 12 및 13은 경쇄가변영역의 서열 및 CDR 서열이다.
[표 10]
Figure pat00018
[표 11]
Figure pat00019
[표 12]
Figure pat00020
[표 13]
Figure pat00021
실시예 9: 4R34 기반 친화도가 개량된 항체들의 결합능 분석 및 IL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 저해능 평가
선별된 클론들(4R34.1, 4R34.2, 4R34.19, 4R34.29)은 경쇄와 중쇄를 포함하는 상기 pcDNA3.4 벡터에 각각 삽입하였다. HEK293F 단백질 발현 세포세포에 두 벡터를 1:1 비율로 동시에 일시적 트랜스펙션(Transient transfection)하여 경쇄와 중쇄가 세포 안에서 함께 발현되도록 하였다.
hIL-4Rα에 대한 결합력을 정량적으로 비교하기 위하여 SPR(Surface Plasmon Resonance)을 Biacore2000 기기를 이용하여 수행하였다.
구체적으로는, hIL-4Rα(Sinobiological)를 10 mM NaAc 완충액(pH 4.0)에 10 μl/ml 농도로 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 약 80 response units(RU) 고정화 하였다. 이후 HBS-EP 완충액 (10 mM Hepes, 3 mM ethylenediaminetetraacetic acid, and 0.005% surfactant P20 (pH 7.4), GE Healthcare] 을 30 μl/min 유속으로 분석하였으며, 4R25, 4R34 항체에 대해서 1 nM에서 80 nM의 농도로 분석하였다. 결합, 해리 분석 후 CM5칩의 재생(regeneration)은 완충액(10mM Glycine, pH2.0)을 30μl/min 유속으로 90초간 흘려주어 시행되었다. 결합 90초, 해리 900초로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
표 14는 SPR (BIACORE 2000)를 이용하여 hIL-4Rα에 대한 항-hIL-4Rα 항체들(4R34.1, 4R34.2, 4R34.19, 4R34.29)의 친화도 분석 결과를 나타낸다. 4R34는 각각 3.8 nM 로 이전 보다 낮은 친화도를 보이나 이는 다른 hIL-4α 고정화 수준에 의한 차이에서 비롯된다. 선별된 클론 중에서는 4R34.1이 18.2 pM 로 가장 높은 친화도를 보였고 4R34.2, 4R34.19, 4R34.29 도 131 pM - 313 pM 수준으로 높은 친화도를 보였다.
[표 14]
Figure pat00022
친화도가 증가된 클론들(4R34.1, 4R34.2, 4R34.19, 4R34.29)과 라이브러리 주형으로 사용된 4R34을 대조군으로 사용하여 <실시예 5>와 동일한 방법으로 hIL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 저해능 평가하였다.
구체적으로는, 세포를 배양 배지(4.5 g/L 글루코스(Gibco/Invitrogen), 10 ％ 열 불활성화 FBS(Gibco/Invitrogen), 10 ㎍/mL 블라스티시딘(Blasticidin) S, 활성펩티딜 뉴클레오시드 항생제(Invitrogen) 및 100 ㎍/mL 제오신(Zeocin)(상표명), 스트렙토마이세스가 있는 DMEM) 중에 2.5X105개/mL의 밀도로 희석하여 96-웰 플레이트에서 100 μl씩 분주하였다. 동일한 날에, 50μL의 200 pM 인간 IL-4(Sinobiological)와 미리 40-200 nM로 희석한 항-hIL-4Rα 항체 용액 50 μl를 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5％ CO2에서 24시간 배양시켰다. 분비된 SEAP을 측정하기 위하여, 20 μl의 각 세포 상청액을 투명 96-웰 플레이트에 넣고 180 μl의 퀀티-블루 용액과 혼합한 후, 96-웰 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 620 nm에서의 흡광도를 CytationTM 3 cell Imaging multi-mode reader로 분석하였다.
분석결과, 친화도가 증가된 항-hIL-4Rα 항체들은 모두 주형으로 사용된 4R34 항체보다 hIL-4 신호차단효과가 높았으며, 그 중에서도 4R34.1 항체가 가장 높은 hIL-4 신호차단효과를 보임을 확인하였다 (도 9).
실시예 10: 4R34.1 항체 기반 추가 친화도 개량을 위한 고다양성 항체 라이브러리 구축 및 선별
친화도가 개량됨으로써 hIL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP활성 저해능이 높아진다는 것을 확인하였기 때문에 상기 실시예 7에서 사용되지 않은 VH-CDR1, VH-CDR1을 개량하여 친화도 및 hIL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP활성 저해능을 개량하고자 하였다.
구체적으로 상기 실시예 7과 유사하게 pYDS 4R34.1 벡터를 주형으로 VH-CDR1(31-35), VH-CDR1(27-32)에 20개의 모든 아미노산이 올 수 있는 디제너레이션 코돈(NNK)을 사용하여 돌연변이를 도입하였다 (도 10).
Overlapping PCR을 수행해 라이브러리 유전자를 12 μg 과, pYDS dummy 벡터에도 NheI/ApaI 제한 효소를 하여 4 μg 준비하였다. 두 유전자는 혼합하여 효모표면 발현용 효모 EBY100 (MATa, Trp-) 균주에 전기청공법으로 형질 전환하여 상동성 접합 (homologous recombination)을 통해 구축하였다. 이러한 과정을 10번 반복한 후 라이브러리 크기를 계단식 희석을 한 후 선택 배지 SD-CAA+Trp (20 g/L Glucose, 6.7 g/L Yeast nitrogen base without amino acids, 5.4 g/L Na2HPO24, 8.6 g/L NaH2PO2, 5 g/L casamino acids, 0.4 mg/L tryptophan)에 인큐베이션하였다.
1차 FACS 선별을 위해 1μM 농도의 상기 바이오틴화된 hIL-4Rα 1ml을 효모 표면에 발현된 1X108 scFab효모와 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 2차 FACS에서는 2nM 농도의 상기 바이오틴화된 hIL-4Rα 1ml을 1X108 scFab효모와 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 1ml의 autoMACS® Running Buffer으로 씻어낸 후 200 nM 농도의 바이오틴과 접합하지 않은 hIL-4Rα를 10ml로 상온에서 2시간 동안 경쟁시켰고 3차와 4차 FACS 수행 시에는 바이오틴화된 1 nM 농도의 hIL-4Rα 1 ml을 1X108 scFab효모와 상온에서 30분 동안 결합시킨 후 10ml autoMACS® Running Buffer로 씻은 후 100 nM 농도의 바이오틴과 접합하지 않은 hIL-4Rα를 1 ml로 상온에서 2시간 동안 경쟁시켜 높은 결합력을 가진 클론을 선별하였다.
최종 4차의 FACS후에 hIL-4Rα에 대한 결합력이 높은 개별 클론들을 PE 신호에 따라 분류하였으며, 4R34.1.11, 4R34.1.13, 4R34.1.17, 4R34.1.18, 4R34.1.19, 4R34.1.21으로 명칭한 클론들이 선별되었다.
6종의 클론들은 상기 실시예 3에서 IgG로 전환하여 동정하였다. 표 15, 16은 선별된 hIL-4Rα에 높은 결합능을 보이는 6개의 개별클론의 중쇄가변영역의 서열 및 CDR서열이며, 표 17, 18은 경쇄가변영역의 서열 및 CDR 서열이다.
[표 15]
Figure pat00023
[표 16]
Figure pat00024
[표 17]
Figure pat00025
[표 18]
Figure pat00026
실시예 11: 항체 선별을 위한 생화학적/생물학적 평가
<항체들과 사람 hIL-4가 hIL-4Rα에 대한 경쟁적으로 결합 평가>
생물학적 효능이 높은 항-hIL-4Rα 항체를 선별하기 위한 기준으로 hIL-4Rα의 hIL-4 결합부위에 hIL-4와의 경쟁적으로 결합하는지를 결합경쟁 ELISA를 수행하였다.
구체적으로 상기 실시예 1에서 정제한 hIL-4Rα 단백질을 96-웰 플레이트에 50ng/웰 농도로 1시간 동안 상온에서 고정시키고, 4% BSA(Bovain Serum Albumin)를 포함하는 0.1% PBST로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, hIL-4-mFc [27nM] 및 항-hIL-4Rα 항체 [20nM, 100nM, 500nM]를 농도별로 섞은 혼합물을 생성하여 블로킹 된 플레이트에 웰당 25 μl씩 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 2차 항체로 항 쥐 IgG-HRP 항체(1:4000)를 웰당 25μl씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 PBST 로 3번 세척한 후, TMB 용액을 웰당 25μl씩 첨가하여 상온에서 ~1분 30초 동안 발색 반응시킨 뒤, H2SO4(1M)로 반응을 중지시키고, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA 결과를 통해 모든 항-hIL-4Rα 항체들과 hIL-4-mFc가 hIL-4R에 대한 결합을 경쟁하는 것으로 확인하였고 항-hIL-4Rα 항체들 간의 경쟁능에 큰 차이는 없는 것을 확인하였다 (도 11).
<친화도 평가>
표 19는 SPR를 이용하여 항체들의 hIL-4Rα에 대한 친화도 분석 결과를 나타낸다.
[표 19]
Figure pat00027
구체적으로는, hIL-4Rα(Sinobiological)를 10 mM NaAc 완충액(pH 4.0)에 50 μl/ml 농도로 희석하여 CM5 센서칩(GE healthcare)에 약 200 response units(RU) 고정화 하였다. 이후 HBS-EP 완충액 (10 mM Hepes, 3 mM ethylenediaminetetraacetic acid, and 0.005% surfactant P20 (pH 7.4), GE Healthcare] 을 30 μl/min 유속으로 분석하였으며, 4R34.1, 4R34.1.11, 4R34.1.13, 4R34.1.17, 4R34.1.18, 4R34.1.19, 4R34.1.21, 두필루맙 유사체항체에 대해서 0.11 nM에서 9 nM의 농도 범위에서 분석하였다. 결합, 해리 분석 후 CM5칩의 재생(regeneration)은 완충액(10mM Glycine, pH2.0)을 30μl/min 유속으로 90초간 흘려주어 시행되었다. 결합 90초, 해리 360초로 얻어진 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(Blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(Subtraction)하여 친화도를 계산하였다.
새로 도출된 항체들의 친화도의 경우 4R34.1과 비교하였을 때 hIL-4Rα에 대한 친화도가 크게 달라지지 않았음을 확인하였다.
<hIL-4 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 저해능 평가>
4R34.1.11, 4R34.1.13, 4R34.1.17, 4R34.1.18, 4R34.1.19, 4R34.1.21 항체에 대해서 라이브러리 주형으로 사용된 4R34.1을 대조군으로 사용하여 실시예 5와 동일한 방법으로 항-hIL-4Rα항체들의 hIL-4 신호 차단효과를 HEK-Blue IL-4/13 세포의 SEAP 분비를 측정하여 확인하였다.
구체적으로는, 세포를 배양 배지(4.5 g/L 글루코스(Gibco/Invitrogen), 10％ 열 불활성화 FBS(Gibco/Invitrogen), 10 ㎍/mL 블라스티시딘(Blasticidin) S, 활성펩티딜 뉴클레오시드 항생제(Invitrogen) 및 100 ㎍/mL 제오신(Zeocin)(상표명), 스트렙토마이세스가 있는 DMEM) 중에 2.5X105개/mL의 밀도로 희석하여 96-웰 플레이트에서 100 μl씩 분주하였다. 동일한 날에, 50 μl의 200 pM 인간 IL-4(Sinobiological)와 미리 40-200 nM로 희석한 항-hIL-4Ra 항체 용액 50 μl를 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5％ CO2에서 24시간 배양시켰다. 분비된 SEAP을 측정하기 위하여, 20 μl의 각 세포 상청액을 투명 96-웰 플레이트에 넣고 180 μl 퀀티-블루 용액과 혼합한 후, 96-웰 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 620 nm에서의 흡광도를 CytationTM 3 cell Imaging multi-mode reader로 분석하였다.
분석결과, 친화도가 증가된 항-hIL-4Rα 항체들은 20-100 nM 농도에서 모두 주형으로 사용된 4R34.1 항체보다 IL-4 신호차단효과가 높았으며, 그 중에서도 4R34.1.17과 4R34.1.19 항체가 가장 높은 IL-4 신호차단효과를 보임을 확인하였다 (도 12).
<hIL-13 의존적 STAT6 인산화에 의한 SEAP 활성 저해능 평가>
hIL-4의 중화능이 높았던 4R34.1.17, 4R34.1.19 항체에 대해서 라이브러리 주형으로 사용된 4R34.1을 대조군으로 사용하여 항-hIL-4Rα항체들의 hIL-13 신호 차단효과를 HEK-Blue IL-4/13 세포의 SEAP 분비를 측정하여 확인하였다.
구체적으로는, 세포를 배양 배지(4.5 g/L 글루코스(Gibco/Invitrogen), 10％ 열 불활성화 FBS(Gibco/Invitrogen), 10 ㎍/mL 블라스티시딘(Blasticidin) S, 활성펩티딜 뉴클레오시드 항생제(Invitrogen) 및 100 ㎍/mL 제오신(Zeocin)(상표명), 스트렙토마이세스가 있는 DMEM) 중에 2.5X105개/mL의 밀도로 희석하여 96-웰 플레이트에서 100 μl씩 분주하였다. 동일한 날에, 50 μl의 2nM 인간 IL-13(Peprotech)와 미리 40-200 nM로 희석한 항-hIL-4Ra 항체 용액 50 μl를 첨가한 후, 96-웰 플레이트를 37℃ 및 5％ CO2에서 24시간 배양시켰다. 분비된 SEAP을 측정하기 위하여, 20 μl의 각 세포 상청액을 투명 96-웰 플레이트에 넣고 180 μl 퀀티-블루 용액과 혼합한 후, 96-웰 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 620 nm에서의 흡광도를 CytationTM 3 cell Imaging multi-mode reader로 분석하였다.
분석결과, 친화도가 증가된 항-hIL-4Rα 항체들은 1 nM 농도의 hIL-13에서 두필루맙 유사체와 동등한 수준의 hIL-13 신호차단효과를 보였다. (도 13).
천식 환자의 혈청 속에 있는 hIL-13의 양은 78.5 +/- 64.5 pg/ml 수준으로 매우 낮으므로 천식 환자에게 투여하였을 경우 두필루맙과 유사한 정도의 효과를 보일 수 있을 것이라 기대할 수 있다.
실시예 12: 최종 항체 선별을 위한 hIL-4Rα 특이적 결합력 검증
hIL-4Rα에 대한 특이성을 확인하기 위하여 hIL-4Rα를 발현하고 있는 THP-1 세포주(hIL-4Rα positive)와 hIL-4Rα가 발현되지 않은 Molt-4 세포주 (hIL-4Rα negative)를 이용하여 항-hIL-4Rα 항체의 hIL-4Rα 특이적 결합을 FACS로 확인하였다.
구체적으로는 각 샘플 당 2X105 개/90 μl의 THP-1, Molt-4 세포와 1 μg의 hIgG (10 mg/ml)을 혼합하여 4℃에서 20분간 반응시켜 Fcg 수용체를 차단하였다. 이러한 과정을 통해 항-hIL-4Rα 항체의 중쇄부분에 의한 비특이적 결합을 배제할 수 있다. 이후 40~1000 nM 농도의 항-hIL-4Rα 항체들을 10 μl씩 첨가하여 최종농도 4~100 nM로 만든 후, 4℃에서 30분간 반응시킨 다음, 차가운 PBS (pH 7.4)로 세척하였다. 인간 IgG를 인지하는 Alexa fluor 488이 결합된 anti-human IgG Fcγ specific F(ab')2 이차항체(Jackson ImmunoResearch)를 4℃에서 30분간 반응시키고 (pH 7.4)로 세척 후, 유세포 분석기기인 FACS Calibur (BD Bioscience)로 분석하였다. 분석 후, 각각의 샘플에 대한 히스토그램 그래프를 얻었다.
분석결과, 4R34.1.17과 4R34.1.19 항체는 THP-1에서 hIL-4Rα에 대한 결합능이 대조군인 4R34.1 항체보다 향상되었다(도 14). 그러나 4R34.1.17 항체는 hIL-4Rα가 발현되지 않은 Molt-4 세포주에도 결합하여 hIL-4Rα에 특이성이 없었다(도 14). 따라서 4R34.1.19항체가 hIL-4Rα 특이적 결합능이 4R34.1 보다 향상되어 IL-4에 의한 신호전달을 차단하는 것으로 확인되었다.
실시예 13: 4R34.1.19 항체의 에피토프 멥핑(Epitope Mapping)
[표 20]
Figure pat00028
hIL-4와 hIL-4Rα의 결합 구조는 PDB(Protein Database) ID: 1IAR에 나타나 있으며, 두 단백질의 결합에 중요한 잔기(residue)는 hIL-4의 Glu33과 Arg112과 hIL-4Rα의 Tyr38, Ser95, Asp97, Tyr208이 정전기적 상호 작용 (electrostatic interactions)을 하고 있다(LaPorte et al., 2008)(LaPorte et al., 2008)(Laporte et al., 2008)(LaPorte, Juo et al. 2008)(LaPorte et al. 2008)(LaPorte, Juo et al. 2008).
또한, Leu67, Leu68, Asp92, Val93 역시 hIL-4 와의 결합에 관여할 것이라 예상되며 이 잔기들은 다른 항-hIL-4Rα 항체(Medimmune Limited)가 Leu67, Leu68, Asp92, Val93를 에피토프로 인지하고 있다 (대한민국 등록특허 제1620539호). 도 15a는 hIL-4와 hIL-4Rα의 결합 구조에서 결합에 중요하게 작용하는 잔기와 상기 항체의 에피토프 부위를 구체화한 것이다.
에피토프 멥핑을 위해 위에 언급한 8개의 잔기(Tyr38, Ser95, Asp97, Tyr208, Leu67, Leu68, Asp92, Val93)에 각각 Ala로 단일 변이를 도입하여 8개의 hIL-4Rα 단백질을 <실시예 1>과 동일한 방법으로 정제하였고 12% SDS-PAGE를 이용하여 순도를 확인하였다 (도 15b).
상기 단백질을 96-웰 플레이트에 50ng/웰 농도로 1시간 동안 상온에서 고정시키고, 4% BSA(Bovain Serum Albumin)를 포함하는 0.1% PBST로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, hIL-4-mFc 5 nM과 항-hIL-4Rα 항체들(4R34 4R34.1, 4R34.1.9, 두필루맙 유사체)을 100 pM 또는 2.5 nM로 블로킹 된 플레이트에 웰당 25 μl씩 첨가하고, 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 0.1% PBST 로 3 번 세척한 후, 2차 항체로 항 인간 IgG-HRP 항체(1:8000)를 웰당 25μl씩 첨가하고 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 용액을 버리고 PBST 로 3번 세척한 후, TMB 용액을 웰당 25μl씩 첨가하여 상온에서 ~1분 동안 발색 반응시킨 뒤, H2SO4(1M)로 반응을 중지시키고, ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 15c에서 보는 바와 같이, 두필루맙 유사체의 경우 Val93 또는 Asp97에 Ala로 단일 변이가 들어간 단백질에 대한 결합력이 낮아지는 것을 확인하였다. 4R34, 4R34.1 및 4R34.1.19 항체는 hIL-4Rα의 Leu67, Leu68, Asp92, Val93 및 Asp97를 에피토프로 인식하였다. 4R34.1.19의 경우 hIL-4Rα의 Asp92, Val93 잔기를 에피토프로 인식하지만 친화도 성숙 전에 도출된 항체들 보다는 중요한 에피토프로 인식하지 않는다. 이는 주변의 다른 잔기들이 항체와 결합하는데 같이 기여해 여전히 결합능을 유지하고 있는 것으로 보인다. 두필루맙 유사체는 상기 hIL-4Rα의 Val93 과 Asp97이 Ala로 변이를 주었을 때 결합력이 야생형 IL-4Rα에 비하여 약해졌기 때문에 이 잔기들을 에피토프으로 가지고 있다고 여겨진다. 결론적으로 선별된 항체들은 두필루맙 유사체를 비롯한 다른 항체들과 다른 에피토프를 가지는 것을 확인하였다.
또한 hIL-4Rα의 Tyr38, Ser95, Asp97, Tyr208은 hIL-13의 Glu45, Arg98과 정전기적 상호 작용 (electrostatic interactions)을 하고 있다(LaPorte et al., 2008)(LaPorte et al., 2008)(Laporte et al., 2008)(LaPorte, Juo et al. 2008)(LaPorte et al. 2008)(LaPorte, Juo et al. 2008). 따라서 4R34, 4R34.1, 4R34.1.9는 hIL-13과도 경쟁적으로 결합하고 hIL-13에 의한 신호를 저해할 수 있었던 것이라 보인다.
실시예 14: 4R34.1.19 항체의 PHA-activated PBMC의 세포 증식 억제능 평가
인간 PBMC는 hIL-4Ra를 많이 발현하고 있지 않지만 PHA(phytohaemagglutinin P, Sigma-Aldrich)라는 mitogen을 이용하여 활성화시키면 면역세포가 분열하면서 B세포와 T세포에 IL-4Ra가 발현된다는 보고가 있다. 따라서 4R34.1.19 후보 항체가 실제 인체에서 hIL-4Ra를 발현하는 세포의 증식을 억제하는지를 PHA로 활성화된 PBMC를 이용하여 측정하였다.
구체적으로는, 인간의 말초혈액에서 면역세포 (PBMC)를 분리하기 위하여 15 ml 시험관에 Ficoll (GE Healthcare) 5 ml을 채워 넣었다. 채혈한 혈액은 PBS (pH 7.4)와 1:1로 섞은 후 흔들어 준 다음 10 ml 만큼 취해서 Ficoll이 담긴 시험관에 Ficoll과 섞이지 않게 넣고 750 g에서 20분간 no break 상태로 원심 분리하였다. 그 후 Ficoll 위에 형성된 buffy coat를 회수하여 PBS (pH 7.4)로 2번 세척한 후 T세포, B세포, NK 세포 및 단핵구를 포함하는 PBMC를 얻었다. 분리된 정상의 PBMC는 I IL-4Ra의 binding을 볼 수 있을 만큼 많은 양의 IL-4Ra를 발현하고 있지 않다. 때문에 PHA (Sigma-Aldrich) 라는 mitogen을 72 h 동안 처리하여 T세포와 B세포가 활성화할 수 있도록 자극을 주었다. PHA를 처리하게 되면 면역세포가 분열하면서 T세포와 B세포에 IL-4Ra 수용체가 발현된다는 보고가 있다. 10% FBS가 포함된 RPMI1640 배지에 1 x 106 cells/ml의 PBMC를 넣고 mitogen으로 PHA를 10μg/ml 농도로 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양 72 시간 동안 배양하였다. PHA로 활성화된 PBMC는 차가운 PBS(pH 7.4)로 세척하고 각 샘플당 2 x 104 개의 세포를 준비하였다. PHA로 활성화된 PBMC (2 x 104, 100 μL)를 96웰 플레이트(SPL, Korea)에 첨가하고 10 % FBS가 포함된 RPMI1640 배지로 희석된 2 mM의 IL-4를 50 μ씩 첨가한 다음, 80~ 2000 nM로 희석된 4R34.1.19, 4R34, 4R34.1 및 두필루맙 유사체 항체를 50 μl씩 첨가한 다음 48 시간 동안 5 % CO2, 37 ℃ 조건에서 배양 후, 세포증식시험을 위해 CTG(CellTiter-Glo, Promega) 시약을 70 μl씩 각 웰에 첨가한 후 실온에서 20시간 반응시키고 발광(luminescence)을 CytationTM 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader를 이용하여 측정하였다.
분석결과, 4R34.1.19 항체는 PHA-activated PBMC의 증식을 억제하는 효과가 주형인 4R34.1 항체보다는 현저히 향상되었으며, 대조군인 두필루맙 유사체와 유사한 정도로 PHA-activated PBMC의 증식을 억제하였다 (도 16).
실시예 15: 4R34.1.9 항체의 Th2 세포 분화 저해능 평가
4R34.1.9 항체가 IL-4에 의한 Th2 세포의 분화를 억제하는지를 IL-4 ELISpot assay를 이용하여 측정하였다.
구체적으로는, <실시예 14>에서와 같이 분리한 인간 PBMC에 CD4를 인지하는 PE-cy5가 결합된 항체(Thermo Fisher Scientific), 기억세포의 세포 표면 표지자인 CD45RO를 인지하는 FITC가 결합된 항체(Thermo Fisher Scientific)를 넣어 4℃에서 30 분간 반응시켰다. PBS로 세척 후, naive CD4+ T 세포(CD4+CD45-)를 FACS Aria III (BD biosciences, Korea)로 분리하였다. 분리된 naive CD4+ T 세포(5x104 cells/well)를 96 well flat bottom plate에 넣고 anti-CD3 Ab/anti-CD28 Ab 가 코팅된 sulfate latex bead (5x104 cells/well), 50 μl의 Th2 분화배지 (5 mg/ml anti-IFN-g Ab, 5 ng/ml IL-2 and 10 ng/ml IL-4) 및 20-500 nM로 희석된 4R34.1.9, 4R34, 4R34.1 및 두필루맙 유사체항체를 50 μl씩 첨가한 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양 7일간 배양하였다. 배양된 세포는 차가운 PBS(pH 7.4)로 세척하고 각 샘플당 2 x 104 개의 세포를 anti-IL-4 포획항체가 코팅된 ELISpot plate(Mabtech)에 넣고, anti-CD3 Ab/anti-CD28 Ab 가 코팅된 sulfate latex bead (2x104 cells/well)를 넣어 24시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. ELISpot plate 차가운 PBS(pH 7.4)로 세척한 후, biotin이 결합된 IL-4 검출 항체(Mabtech)를 실온에서 2시간 동안 결합시켰다. PBS(pH 7.4)으로 세척 후, avidin이 결합된 alkaline phosphatase (AP) (Mabtech)를 실온에서 1TLRKS 결합시킨 다음 PBS(pH 7.4)으로 세척 후, BCIP/NBT-plus 기질을 넣어 IL-4 spot을 발색시켰다. IL-4 spot forming cells의 수를 ELISpot 플레이트 리더를 이용하여 측정하였다.
분석결과, 4R34.1.19 항체는 정상인과 천식환자의 naive T세포가 Th2 세포로 분화되는 것을 억제하는 효과가 주형인 4R34.1 항체보다는 현저히 향상되었으며, 대조군인 두필루맙 유사체와 유사한 정도로 억제하였다. 이는 정량화한 값과 대표 이미지로 확인할 수 있다 (도 17a와 17b).
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> High Affinity Human Antibodies Against Human Interleukin-4 Receptor alpha and Uses Thereof <130> P19-B279 <150> KR18/137199 <151> 2018-11-09 <160> 98 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Gly Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Arg Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro Gln Arg Ser Ala Thr Ala Val Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Ser Pro Asn Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Pro Leu Ser Ala Ala Trp Ser His Ser Ser Tyr Tyr Asn 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 4 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser His Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro His Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 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Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Lys Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Phe Arg Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 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Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val His Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 73 Ala Ile Thr Ser Ser Gly Arg Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 74 Ala Ile Thr Ser Ser Gly Ala Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 75 Ala Ile Thr Ser Ser Gly Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 76 Ala Ile Thr Ala Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 77 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 77 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Phe Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 78 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 78 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Phe Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Arg Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 79 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 79 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Phe Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Tyr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 80 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 80 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Phe Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 81 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 81 Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Arg Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 82 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 82 Gly Tyr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 83 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 83 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His 20 25 30 Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Thr Ser Ser Gly Arg Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 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Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 92 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 92 Ser Gly Ser Ser Ala Asn Ser Arg Thr Asp Gly Phe Asn 1 5 10 <210> 93 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 93 Ser Gly Ser Ala Gln Phe Gly Ser Arg Asp Asn Phe Asn 1 5 10 <210> 94 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 94 Ser Gly Ser Thr Lys Gln Met His Asn Tyr Gln Phe Asn 1 5 10 <210> 95 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 95 Ser Gly Ser Leu Leu Arg Gly Glu Asn Leu Gln Phe Asn 1 5 10 <210> 96 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 96 Ser Gly Ser Pro Leu Phe Pro Asp Ser Gly Ser Phe Asn 1 5 10 <210> 97 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 97 Ser Gly Ser Ala Ala Leu Asp Leu Ser Pro Ser Phe Asn 1 5 10 <210> 98 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 98 Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val 1 5 10 15 Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro 20 25 30 Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met 35 40 45 Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu 50 55 60 Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly 65 70 75 80 Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala 85 90 95 Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys 100 105 110 Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn 115 120 125 Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser 130 135 140 Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala 145 150 155 160 Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn 165 170 175 Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys 180 185 190 Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr 195 200 205 Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser 210 215 220 Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His 225 230

Claims (15)

  1. 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정시 150 pM 미만의 친화도 상수(KD)를 가지는 인간 인터루킨-4 수용체 알파(hIL-4Rα)에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 98의 hIL-4Rα에서 Leu67, Leu68, Asp92, Val93 및 Asp97로 구성된 군에서 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프로 인식하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 98의 hIL-4Rα에서 Leu67, Leu68, Asp92, Val93 및 Asp97의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하며, 인간 인터루킨-4 (hIL-4) 및 인간 인터루킨-13 (hIL-13)과 hIL-4Rα에 경쟁적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 hIL-4Rα에 대한 다른 항체보다 항원해리속도 (off-rate)가 빨라져 생체 내 항원에 의해 항체가 제거되는 현상 (antigen-mediated clearance)의 감소되어, 생체내 반감기가 증가될 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 11 내지 13 또는 84의 중쇄 CDR1;
    서열번호 14 내지 22, 73 내지 76, 85로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR2;
    서열번호 23 내지 32로 구성된 군에서 선택되는 중쇄 CDR3; 및
    서열번호 43 내지 52, 92 내지 97로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR1;
    서열번호 53 내지 60로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR2;
    서열번호 61 내지 68, 81, 82로 구성된 군에서 선택되는 경쇄 CDR3를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호 1 내지 10, 69 내지 72 및 83로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호 33 내지 42, 77 내지 80, 86 내지 91로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  9. 제8항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  10. 제9항의 발현벡터로 형질전환된 세포.
  11. 다음 단계를 포함하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 측정시 150 pM 미만의 친화도 상수(KD)를 가지는, 인간 인터루킨-4 수용체 알파(hIL-4Rα)에 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법:
    (a) 제8항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합단편을 회수하는 단계.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편 및 펩타이드, 단백질, 소분자 약물, 핵산, 나노입자 및 리포좀으로 구성된 군으로부터 선택된 생체활성분자가 융합된 접합체.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편, 또는 제12항의 접합체를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피성 피부염, 천식, 알레르기성 비염이나 식품 알레르기 반응 등의 알레르기성 질환에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 염증성 질환의 진단용 조성물.
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