JP2024522340A - ＥｐＣＡＭを標的とするアゴニストＣＤ２８抗原結合分子 - Google Patents

ＥｐＣＡＭを標的とするアゴニストＣＤ２８抗原結合分子 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規のヒト化ＥｐＣＡＭ抗体を含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、それらを産生するための方法、これらの抗体を含有する医薬組成物、及びそれらを使用する方法に関する。【選択図】図１Ｂ

Description

本発明は、新規のヒト化ＥｐＣＡＭ抗体を含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、それらを産生するための方法、これらの分子を含有する医薬組成物、並びに疾患、特にがんの治療における免疫調節剤及び／又は共刺激剤としてのその使用に関する。
がん免疫療法は、黒色腫、非小細胞肺がん及び腎細胞癌腫等のがん型において劇的で持続的な応答をもたらすことができる、ますます有効な治療選択肢になりつつある。これは主に、抗ＰＤ－１（例えば、Ｍｅｒｃｋのキイトルーダ；ＢＭＳのオプジーボ）、抗ＣＴＬＡ－４（例えば、ＢＭＳのヤーボイ）及び抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、Ｒｏｃｈｅのテセントリク）を含むいくつかの免疫チェックポイント遮断の成功によって推進される。これらの薬剤は、多くのがん型の標準治療として、又は併用療法の骨格として役立つ可能性が高いが、患者のごく一部（＜２５％）がそのような治療法から利益を得るにすぎない。さらに、様々ながん（前立腺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、肉腫、非トリプルネガティブ乳がん等）は、これらの免疫調節剤に対する一次的な耐性を示す。いくつかの報告は、既存の抗腫瘍Ｔ細胞がないことが一部の患者の応答がないこと又は不十分であることに寄与することを示している。要約すると、既存の免疫療法の印象的な抗がん効果にもかかわらず、大きながん患者集団に対処すること、並びに新規な腫瘍特異的Ｔ細胞応答を誘導及び増強することを目的とする治療法を開発することに対する明確な医学的必要性が存在する。
ＣＤ２８は、重要なシグナル伝達モチーフを含む単一の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに結合したペア型Ｖセット免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ：ｐａｉｒｅｄ Ｖ－ｓｅｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）ドメインを特徴とする共刺激分子のサブファミリーの確立メンバーである（Ｃａｒｒｅｎｏ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，２００２）。サブファミリーの他のメンバーとしては、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤ１Ｈ、ＴＩＧＩＴ及びＢＴＬＡ（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｆｌｉｅｓ，２０１３）が挙げられる。ＣＤ２８発現はＴ細胞に限定され、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４を発現するものを含む、全てのナイーブ及び抗原経験サブセットの大部分で一般的である。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４は高度に相同であり、樹状細胞、Ｂ細胞、マクロファージ及び腫瘍細胞上に発現される同じＢ７分子ＣＤ８０及びＣＤ８６への結合について競合する（Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。リガンドのＢ７ファミリーに対するＣＴＬＡ－４のより高い親和性は、ＣＴＬＡ－４がリガンド結合についてＣＤ２８を打ち負かすこと、及びエフェクターＴ細胞応答を抑制することを可能にする（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００６）。対照的に、ＰＤ－１は、ＣＤ２８の細胞質ドメインを部分的に脱リン酸化することによってＣＤ２８シグナル伝達を阻害することが示された（Ｈｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。プロフェッショナル抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０又はＣＤ８６によるＣＤ２８のライゲーションは、ナイーブＴ細胞の機能的デノボプライミング、その後のクローン増殖、サイトカイン産生、標的細胞溶解、及び長期記憶の形成に厳密に必要とされる。ＣＤ２８リガンドの結合はまた、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、及び４－１ＢＢ等の誘導性共刺激受容体の発現を促進する（Ａｃｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，２００３で概説）。ＣＤ２８のライゲーション時に、ジスルフィド結合ホモ二量体、膜近位ＹＭＮＭモチーフ及び遠位ＰＹＡＰモチーフは、いくつかのキナーゼ及びアダプタータンパク質と複合体を形成することが示されている（Ｂｏｏｍｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２０１０）。これらのモチーフは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１及びＮＦκＢファミリー転写因子のＣＤ２８依存的活性化によって媒介されるＩＬ２転写の誘導に重要である（Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１）（Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。しかしながら、リン酸化及びユビキチン化のためのさらなる十分に特徴づけられていない部位が、ＣＤ２８の細胞質ドメイン内に見られる。（Ｅｓｅｎｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）によって概説されるように、ＣＤ２８によって開始される経路は、従来のＴ細胞の増殖及びエフェクター機能の促進において重要な役割を有する。ＣＤ２８ライゲーションはまた、制御性Ｔ細胞の抗炎症機能を促進する。ＣＤ２８は、Ｔ細胞受容体からのシグナルを部分的に増強することによってＴ細胞を共刺激するが、固有のシグナル伝達事象を媒介することも示された（Ａｃｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，２００３；Ｂｏｏｍｅｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，２０１０；Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。ＣＤ２８によって特異的に引き起こされるシグナルは、下流タンパク質のリン酸化及び他の翻訳後修飾（例えば、ＰＩ３Ｋ媒介性リン酸化）、転写変化（例えば、Ｂｃｌ－ｘＬ発現）、エピジェネティック変化（例えばＩＬ－２プロモーター）、細胞骨格リモデリング（例えば、微小管形成中心の配向）及び解糖速度の変化（例えば、解糖流量）を含む、Ｔ細胞機能の多くの重要な側面を制御する。ＣＤ２８欠損マウスは、感染性病原体、同種移植片抗原、移植片対宿主病、接触過敏症及び喘息に対する応答が低下している（Ａｃｕｔｏ ａｎｄ Ｍｉｃｈｅｌ，２００３）。ＣＤ２８媒介性共刺激の欠如は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞増殖の減少、胚中心形成及び免疫グロブリンアイソタイプクラスの切り替えの重度の阻害、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞分化の減少並びにＴｈ２型サイトカインの発現をもたらす。ＣＤ４依存性細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答も影響を受ける。重要なことに、ＣＤ２８欠損ナイーブＴ細胞は、特により低い抗原濃度で増殖応答の低下を示した。Ｔ細胞上でＣＤ２８を連結させることが抗腫瘍能を有するという考えが、文献により相次いで支持されている。最近の証拠は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害剤の抗がん効果がＣＤ２８に依存することを実証している（Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１遮断の治療効果を調査する臨床研究は、進行した黒色腫及び他のがんを有する患者において非常に有望な結果を示している。これに加え、細胞内ＴＣＲシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ｚ）及び細胞内共刺激ドメイン（ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢドメイン）に融合した細胞外抗原認識ドメインを含む人工キメラＴ細胞受容体を発現する遺伝子操作されたＴ細胞の注入は、Ｂ細胞がん及び他のがんにおける高い応答率及び応答の持続性を示した。
ＣＤ２８アゴニスト抗体を、（ｉ）ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体及び（ｉｉ）ＣＤ２８の従来のアゴニスト抗体の２つのカテゴリーに分けることができる。通常、ナイーブＴ細胞の活性化には、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ、シグナル１）の連結とＣＤ２８による共刺激シグナル伝達（シグナル２）の両方が必要である。ＣＤ２８スーパーアゴニスト（ＣＤ２８ＳＡ）は、明白なＴ細胞受容体関与なしにＴ細胞を自律的に活性化することができるＣＤ２８特異的モノクローナル抗体である（Ｈｕｎｉｇ，２０１２）。齧歯類では、ＣＤ２８ＳＡは、従来の制御性Ｔ細胞を活性化する。ＣＤ２８ＳＡ抗体は、自己免疫、炎症及び移植の複数のモデルにおいて治療有効である。しかしながら、ヒトＣＤ２８ＳＡ抗体ＴＧＮ１４１２の第Ｉ相研究は、２００６年に生命を脅かすサイトカインストームをもたらした。追跡調査は、ヒトＴ細胞及び前臨床動物モデルのＴ細胞のＣＤ２８応答性の違いによる投薬過誤によって毒性が引き起こされたことを示唆している。ＴＧＮ１４１２は現在、ＲＡ患者及び転移性又は切除不能な進行性固形悪性腫瘍を有する患者における非盲検多施設用量漸増試験で再評価されている。ＣＤ２８の従来のアゴニスト抗体、例えばクローン９．３は、ＣＤ２８天然リガンドを模倣し、Ｔ細胞受容体シグナルの存在下でのみＴ細胞活性化を増強することができる（シグナル１）。公開された見識は、抗体の結合エピトープが、アゴニスト抗体がスーパーアゴニストであるか従来のアゴニストであるかに大きな影響を及ぼすことを示している（Ｂｅｙｅｒｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，２００５）。スーパーアゴニストＴＧＮ１４１２はＣＤ２８の側方モチーフに結合するが、従来のアゴニスト分子９．３はリガンド結合エピトープの近くに結合する。異なる結合エピトープの結果として、スーパーアゴニスト抗体及び従来のアゴニスト抗体は、Ｔ細胞の表面上にＣＤ２８分子の線形複合体を形成する能力が異なる。正確には、ＴＧＮ１４１２はＣＤ２８の線形アレイを効率的に形成することができ、これはおそらくＴ細胞活性化の閾値を超えるのに十分な凝集したシグナル伝達成分をもたらす。一方、従来のアゴニスト９．３は、構造が直鎖状ではない複合体をもたらす。９．３クローンに基づく従来のアゴニスト結合因子を変換する試みは、メラノーマ関連プロテオグリカン及びＣＤ２８に対する組換え二重特異性単鎖抗体を使用して以前に発表されている（Ｏｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００９）。報告された二重特異性単鎖抗体は、多量体コンストラクトを形成する二重特異性単鎖抗体の固有の傾向に基づいて、従来のＣＤ２８アゴニスト結合因子９．３の使用にもかかわらず、「超アゴニスト」活性を発揮することが報告された。
腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）、１７－１Ａ及びＣＤ３２６としても知られる、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、上皮がんでは高度に発現し、正常な単純上皮では発現レベルが低い、Ｉ型約４０ｋＤａ膜貫通糖タンパク質である。ＥｐＣＡＭの構造及び機能については、例えば、Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ - Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ （２０１３）， １８２８（８）： １９８９－２００１； Ｔｒｚｐｉｓ ｅｔ ａｌ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． （２００７） １７１（２）： ３８６-３９５、及びＢａｅｕｅｒｌｅ ａｎｄ Ｇｉｒｅｓ， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， （２００７） ９６：４１７-４２３で概説されている。
ＥｐＣＡＭは基底膜に発現し、カルシウム非依存性の同種親和性細胞接着に関与している。成熟ＥｐＣＡＭ分子（２３アミノ酸シグナルペプチドを除去する処理後）は、上皮成長因子様反復領域、ヒトサイログロブリン（ＴＹ）反復領域及びシステイン欠乏領域を含むＮ末端２４２アミノ酸細胞外ドメインと、シングルパス２３アミノ酸膜貫通ドメインと、α－アクチニンに対する２つの結合部位とＮＰＸＹ内在化モチーフを含むＣ末端２６アミノ酸細胞質ドメインとを含む。ＥｐＣＡＭは上皮由来のがんで過剰発現することが多く、がん幹細胞でも発現するため、治療及び診断に重要な関心を持たれている分子である。ＥｐＣＡＭは、癌種及びその転移巣で頻繁に高発現することから、予後マーカー、治療標的、並びに転移がん細胞の主要な供給源と考えられている循環及び播種腫瘍細胞（ＣＴＣ／ＤＴＣ）のアンカー分子として機能している。細胞外ドメインＥｐＣＡＭを切断して、可溶性細胞外ドメイン分子ＥｐＥＸ及び細胞内分子ＥｐＩＣＤを得ることができる。ＥｐＩＣＤは、他のタンパク質と会合して、細胞増殖を促進する遺伝子の発現を上方制御する核複合体を形成することが示されている。ＥｐＣＡＭはまた、上皮から間葉細胞への移行（ＥＭＴ）に関与し得、大きな転移の形成に寄与し得る。
様々な癌腫の治療に抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用する臨床試験がいくつか実施されてきた。ＥｐＣＡＭ特異的抗体Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標）（エドレコロマブ；１７－１Ａ）は、１９９５年に大腸がんの治療用にドイツで初めて承認されたが、ＦＤＡの承認は得られなかった。さらに、ＥｐＣＡＭは、進行癌患者の原発腫瘍から血液及び骨髄に播種した転移細胞を濃縮し、同定し、特徴付けるのに役立った。既存の課題にもかかわらず、ＥｐＣＡＭは、予後的価値及び転移可能性を有する循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を分離するために、臨床で使用される表面抗原として選択されている。
限界量の抗ＣＤ３二重特異性抗体、すなわちＣＥＡ－ＴＣＢなどのＴ細胞二重特異性抗体（ＴＣＢ）を作動性抗ＣＤ２８分子と組み合わせると、より良好なＴ細胞活性化が達成されることが分かった。ＣＤ２８が様々な腫瘍適応症（Ｌａｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｔｉｒｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）においてＴ細胞上のベースラインで発現し、ＣＤ２８シグナル伝達の活性化がＴ細胞受容体シグナルを増強することを考えると、ＴＣＢ分子とＥｐＣＡＭ標的化ＣＤ２８分子との組み合わせは相乗的に作用して強力で長期持続性の抗腫瘍応答を誘導すると予想される。国際公開第２０２０／１２７６１８ Ａ１号には、腫瘍を標的としたアゴニストＣＤ２８抗原結合分子が記載されている。そこには様々な腫瘍標的が記載されている。
しかし、この分子の活性は、腫瘍を標的とする抗体の特性に厳密に依存することが判明している。したがって、当社は、本明細書において、ＴＣＢとの強力な相乗効果を示し、ＴＣＢシグナルの存在下での厳密な腫瘍標的依存性のためにＣＤ２８結合一価を必要とする新規なＥｐＣＡＭ標的化アゴニストＣＤ２８分子を記載する。
本発明は、多量体を形成することを必要とせずに腫瘍依存性Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅を達成する新たなＥｐＣＡＭ標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を記載する。本発明の二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子は、ＣＤ２８への一価結合と、それらの分子が上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）への特異的結合が可能である本明細書で定義されるような特定の抗原結合ドメインを含むこととを特徴とする。さらに、ＣＤ２８抗原結合分子は、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを持つ。それにより、Ｆｃ受容体媒介性架橋が抑止され、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインの結合による架橋によって腫瘍特異的活性化が達成される。
したがって、本発明は、
（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３０９のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３１０のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３１１のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号３１２又は配列番号３１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）；又は
（ｉｉ）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）；又は
（ｉｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。
一態様では、ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、以下に定義する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。一態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。
一態様では、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
（ｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
さらに、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、及び配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｇ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｈ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｊ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｋ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号５２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号５５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む。特定の一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の特定の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号５８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６０のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６３のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。さらなる特定の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号６４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６５のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６６のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６９のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、配列番号３０９のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３１０のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３１１のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号３１２又は配列番号３１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｉｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｉｖ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｖ）配列番号２５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ
を含む。
一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉｖ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｖ）配列番号２５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）
を含む。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲと、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲとを含む。特定の一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む。
別の態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲと、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲとを含む。特定の一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む。
さらなる態様では、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメイン及び／又はＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインがＦａｂ断片又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片である、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能なＦａｂ断片と、（ｂ）ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能なｃｒｏｓｓＦａｂ断片と、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能なｃｒｏｓｓＦａｂ断片と、（ｂ）ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能なＦａｂ断片と、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ断片である。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ断片である。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ分子である。
特定の一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であり、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられている、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ分子である。
特定の一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、
（ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｉｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｉｖ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｖ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、第１のサブユニット及び第２の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂ分子であり、Ｆｃドメインが、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成される、本明細書に開示される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供され、（ｉ）第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、第１の抗原結合ドメインはＦａｂ重鎖のＣ末端においてＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合される。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む。
本発明の別の態様によれば、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、本発明の１つ又は複数の単離ポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクター、特に、１つ又は複数の発現ベクター、及び本発明の１つ又は複数の単離ポリヌクレオチド又は１つ又は複数の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の産生方法が提供される。任意に、この方法はまた、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を回収することを含む。本発明は、本発明の方法により産生した二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子もまた包含する。
本発明はさらに、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容される添加物を含む医薬組成物を提供する。一態様では、医薬組成物は、疾患、特にがんの治療における使用のためのものである。
二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明の医薬組成物を使用する方法も本発明に包含される。一態様では、本発明は、医薬としての使用のための本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物を提供する。一態様では、（ａ）細胞活性化の増強又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能の増強における使用のための、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、疾患の治療における使用のための本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物が提供される。特定の態様では、疾患はがんである。別の態様では、本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物は、がんの治療における使用のためのものであり、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与するためのものである。さらなる態様では、がんの治療における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物が提供され、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与するためのものである。さらに別の態様では、がんの治療における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物が提供され、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与するためのものである。
疾患を治療するための医薬の製造における本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物の使用、並びに個体における疾患を治療する方法であって、当該個体に、治療有効量の本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物を投与することを含む、方法も提供される。特定の態様では、疾患はがんである。一態様では、個体における（ａ）細胞活性化を増強するか又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能を増強する方法であって、本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容可能な形態で含む組成物を当該個体に投与することを含む、方法が提供される。別の態様では、疾患を治療するための医薬の製造における本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の使用であって、治療が化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤との同時投与を含む、使用が提供される。さらなる態様では、個体において疾患を治療する方法であって、治療有効量の本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物を当該個体に投与することを含み、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と同時投与することを含む、方法が提供される。さらなる態様では、個体において疾患を治療する方法であって、治療有効量の本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物を当該個体に投与することを含み、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体を同時投与することを含む方法が提供される。別の態様では、個体において疾患を治療する方法であって、治療有効量の本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物を当該個体に投与することを含み、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体を同時投与することを含む方法が提供される。個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、当該個体に、有効量の、本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物を投与して、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む方法も提供される。上の態様のいずれかにおいて、個体は、好ましくは哺乳動物であり、特にヒトである。
本明細書に記載される例示的な分子の概略図を示す。図１Ａは、一価ｈｕ ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡアイソタイプとしてのＣＤ２８アゴニスト抗体バリアント（「Ｆｃサイレント」）の概略図を示す。図１Ｂは、１＋１フォーマットの二重特異性ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８抗原結合分子を示し、ＣＤ２８抗原結合ドメインを含むＦａｂ分子では、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに交換され（ＶＨ／ＶＬ ｃｒｏｓｓｆａｂ）、ＥｐＣＡＭ抗原結合ドメインを含むＦａｂ分子では、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの特定のアミノ酸が交換され（荷電バリアント）、軽鎖とのより良好な対合を可能とする。図１Ｃは、１＋１フォーマットの二重特異性ＥｐＣＡＭ８抗原結合分子を示し、ＥｐＣＡＭ抗原結合ドメインを含むＦａｂ分子では、ＶＨドメインとＶＬドメインが互いに交換され（ＶＨ／ＶＬ ｃｒｏｓｓｆａｂ）、ＣＤ２８抗原結合ドメインを含むＦａｂ分子では、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの特定のアミノ酸が交換され（荷電バリアント）、軽鎖とのより良好な対合を可能とする。 ＣＤ２８（ＳＡ）の可変ドメイン及びそのバリアントのアラインメントを示す。システイン５０を除去し、得られた抗ＣＤ２８結合因子の親和性を様々な程度に低下させるためのＣＤ２８（ＳＡ）ＶＨドメイン及びそのバリアントのアラインメントを図２Ａに示す。注目すべきことに、ＶＨバリアントｉ及びｊでは、ＣＤ２８（ＳＡ）のＣＤＲをＩＧＨＶ１－２フレームワークからＩＧＨＶ３－２３フレームワークにグラフトした（図２Ｂ）。図２Ｃには、得られた抗ＣＤ２８結合因子の親和性を異なる程度に低下させるためのＣＤ２８（ＳＡ）ＶＬドメイン及びそのバリアントのアラインメントを示す。バリアントｔでは、ＣＤＲをトラスツズマブ（ハーセプチン）ＶＬ配列のフレームワーク配列にグラフトした（図２Ｄ）。 細胞上のヒトＣＤ２８に対する上清からの単一特異性の一価ＩｇＧフォーマットにおける親和性低下ＣＤ２８アゴニスト抗体バリアントの結合を示す。陰性対照（抗ＤＰ４７）及び元のＣＤ２８抗体ＣＤ２８（ＳＡ）と比較した、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように修飾された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）への結合の蛍光強度中央値をフローサイトメトリーによって評価した。バリアント１～１０の結合曲線を図３Ａに示し、バリアント１１～２２の結合曲線を図３Ｂに示し、バリアント２３～３１の結合曲線を図３Ｃに示す。ＳＤでの技術的反復を示す。 ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子（ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）、ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９７４）、ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＥ９０５１）、及びＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５２９６））は、ＩＬ－２レポーターアッセイにおいて抗ＣＤ３刺激に対するＴ細胞応答を増強することを示す。最適以下の濃度の抗ＣＤ３ ＩｇＧ（１０ｎＭ）及び漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８の存在下でのＳＷ４０３、ＨＴ－２９、ＭＣＦ－７及びＫＡＴＯ－ＩＩＩ腫瘍細胞との６時間の共インキュベーション後の１秒あたりのカウント数（ＣＰＳ）での発光読み出しによって測定したＩＬ－２レポーター細胞活性化を示す。標準偏差（ＳＤ）での３反復を示す。白抜き記号の曲線は抗ＣＤ３刺激ＯＫＴ－３非存在下でのＩＬ－２レポーター細胞の活性化を示し、塗りつぶした記号の曲線は１０ｎＭのＯＫＴ－３存在下でのＩＬ－２レポーター細胞の活性化を示す。図４Ａ：ＥｐＣＡＭ発現標的細胞ＳＷ４０３の存在、図４Ｂ：ＥｐＣＡＭ発現標的細胞ＨＴ２９の存在、図４Ｃ：ＥｐＣＡＭ発現標的細胞ＭＣＦ７の存在、及び図４Ｄ：ＥｐＣＡＭ発現標的細胞ＫＡＴＯ－ＩＩＩの存在。 ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子（ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）、ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９７４）、ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＥ９０５１）、及びＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５２９６））は、ＩＬ－２レポーターアッセイにおいて異なる濃度の二重特異性抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３抗体（ＣＥＡ－ＴＣＢ）によって媒介される抗ＣＤ３刺激に対するＴ細胞応答を増強することを示す。異なる濃度のＣＥＡ－ＴＣＢ（１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、又はＣＥＡ－ＴＣＢなし）及び漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８の存在下でのＫＡＴＯ－ＩＩＩ細胞との６時間の共インキュベーション後の１秒あたりのカウント数（ＣＰＳ）での発光読み出しによって測定したＩＬ－２レポーター細胞活性化を示す。ＳＤでの３反復を示す。図５Ａ：１０ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢ、図５Ｂ：５ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢ、図５Ｃ：１ｎＭ ＣＥＡ－ＴＣＢ、図５Ｄ：ＣＥＡ－ＴＣＢなし。 ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子（ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）、ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９７４）、ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＥ９０５１）、及びＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５２９６））のＥｐＣＡＭ発現細胞及びＣＤ２８発現細胞への結合をそれぞれ示す。全てのＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子は、フローサイトメトリーで評価したところ、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ細胞上のヒトＥｐＣＡＭ（図６Ａ及び図６Ｂ）及びＣＨＯ－ｋ１－ｈｕＣＤ２８細胞上のヒトＣＤ２８（図６Ｃ）に濃度依存的に結合することができた。ＳＤでの３反復を示す。 新規ＥｐＣＡＭ抗体の試験のために本明細書で記載及び生成されたＥｐＣＡＭ抗原の概略図を示す。図７Ａは、２つのＥｐＣＡＭ ＥＣＤとノブ鎖のＣ末端ａｖｉ－ｈｉｓタグとを含むコンストラクトの概略図を示す。図７Ｂは、１つのＥｐＣＡＭ ＥＣＤとＣ末端ａｖｉ－ｈｉｓタグとを含むコンストラクトを示す。図７Ｃは、Ｃ末端ａｖｉ－ｈｉｓタグを含む可溶性組み換えＥｐＣＡＭ ＥＣＤを示す。 ４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ、その再ヒト化バリアント、及びヒト化に使用された生殖細胞系列配列の可変ドメインのアラインメントを示す。バリアントは、マウス由来のアミノ酸を除去し、それぞれの最も近いヒト生殖細胞系列との相同性を高めるために生成された。ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）ＶＨドメインとそのバリアントのアラインメントを図８Ａに示す。 ４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ、その再ヒト化バリアント、及びヒト化に使用された生殖細胞系列配列の可変ドメインのアラインメントを示す。バリアントは、マウス由来のアミノ酸を除去し、それぞれの最も近いヒト生殖細胞系列との相同性を高めるために生成された。図８Ｂに、ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）ＶＬドメインとそのバリアントのアライメントを示す。 本明細書に記載される例示的な分子の概略図を示す。図９Ａは、一価ｈｕ ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡアイソタイプとして抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体バリアント（「Ｆｃサイレント」）の概略図を示す。図９Ｂは、二価ＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡアイソタイプフォーマットにおける抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体バリアント（「Ｆｃサイレント」）の概略図を示す。 マウス抗体ＭＯＣ３１、公開されているヒト化バリアント４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ、及び新たに独立してヒト化されたＭＯＣ３１のバリアントの可変ドメインのアラインメントを示す。ＥｐＣＡＭ（ＭＯＣ３１）ＶＨドメインとそのバリアントのアラインメントを図１０Ａに示す。ＥｐＣＡＭ（ＭＯＣ３１）ＶＬドメインとそのバリアントのアラインメントを図１０Ｂに示す。ＫａｂａｔによるＣＤＲを示す。 両方のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子（ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８） （Ｐ１ＡＦ５９８０）及びＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＧ１６６３））は、ＩＬ－２レポーターアッセイにおいて抗ＣＤ３刺激に対するＴ細胞応答を増強することを示す。最適以下の濃度の抗ＣＤ３ ＩｇＧ（１０ｎＭ）及び漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８の存在下での、ＨＴ－２９細胞（図１１Ａ）、ＭＫＮ４５細胞（図１１Ｂ）、又はＮＣＩ－Ｈ１７５５細胞（図１１Ｃ）との６時間の共インキュベーション後の発光読み出しによって測定したＩＬ－２レポーター細胞活性化を示す。ＳＤでの３反復を示す。 最適量以下のＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢとｐＣＡＭ－ＣＤ２８（ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０））を組み合わせたときの強い相乗効果を示す。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ Ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ解析システムを用いた連続ライブセルイメージングによりモニタリングされたＳｃａＢＥＲ細胞の腫瘍細胞増殖を示す。異なる条件の正規化された赤血球読み出し値（＝標的細胞の増殖）を評価時間にわたってプロットした。ＳＤでの３反復を示す。 図１３Ａは、新たなＥｐＣＡＭ（ＭＯＣ３１）ヒト化バリアントを有する全ての二重特異性ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８抗原結合分子（Ｐ１ＡＨ２３２６、Ｐ１ＡＨ２３２７、Ｐ１ＡＨ２３２８、Ｐ１ＡＨ２３２９及びＰ１ＡＨ２３３０）は、ＩＬ－２レポーターアッセイにおいて抗ＣＤ３刺激に対するＴ細胞応答を増強することを示す。最適以下の濃度の抗ＣＤ３ ＩｇＧ（１０ｎＭ）及び漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８の存在下でのＨＴ－２９ ＥｐＣＡＭ発現細胞との６時間の共インキュベーション後の発光読み出しによって測定したＩＬ－２レポーター細胞活性化を示す。ＳＤでの３反復を示す。図１３Ｂは、抗ＣＤ３ ＩｇＧ（ＯＫＴ３）の非存在下では活性化が見られないことを示している。図１３Ｃ（抗ＣＤ３ ＩｇＧ存在下）又は図１３Ｄ（抗ＣＤ３ ＩｇＧ非存在下）に示すように、ＥｐＣＡＭ発現細胞が欠落している場合も活性化は見られない。 最適量以下のＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢを、新たなＥｐＣＡＭ（ＭＯＣ３１）ヒト化バリアントＰ１ＡＨ２３２６（図１４Ｂ）、Ｐ１ＡＨ２３２７（図１４Ｃ）、Ｐ１ＡＨ２３２８（図１４Ｄ）、Ｐ１ＡＨ２３２９（図１４Ｅ）及びＰ１ＡＨ２３３０（図１４Ｆ）を有する、又はＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）（図１４Ａ）を有する全ての二重特異性ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８抗原結合分子と組み合わせたときに、強い相乗効果を示す。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ Ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ解析システムを用いた連続ライブセルイメージングによりモニタリングされたＳｃａＢＥＲ細胞の腫瘍細胞増殖を示す。異なる条件の正規化された赤血球読み出し値（＝標的細胞の増殖）を評価時間にわたってプロットした。ＳＤでの３反復を示す。 ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ Ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ解析システムを用いた連続ライブセルイメージングによりモニタリングされたＳｃａＢＥＲ細胞の腫瘍細胞増殖を示す。異なる条件の正規化された赤血球読み出し値（＝標的細胞の増殖）を評価時間にわたってプロットした。ＳＤでの３反復を示す。ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢの非存在下では、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアントＰ１ＡＨ２３２６（図１５Ｂ）、Ｐ１ＡＨ２３２７（図１５Ｃ）、Ｐ１ＡＨ２３２８（図１５Ｄ）、Ｐ１ＡＨ２３２９（図１５Ｅ）、Ｐ１ＡＨ２３３０（図１５Ｆ）、又はＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）（図１５Ａ）は活性を示さないことから、ＥＰＣＡＭ－ＣＤ２８の共刺激効果はＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢの存在に強く依存することを証明した。 フローサイトメトリーで評価したところ、新たなＥｐＣＡＭ（ＭＯＣ３１）ヒト化バリアント（Ｐ１ＡＨ２３２６、Ｐ１ＡＨ２３２７、Ｐ１ＡＨ２３２８、Ｐ１ＡＨ２３２９及びＰ１ＡＨ２３３０）を有する全ての二重特異性ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８抗原結合分子が、ＨＴ－２９細胞上のヒトＥｐＣＡＭに濃度依存的に結合することを示している。ＳＤでの３反復を示す。 ヒト化ＮＳＧマウスのＢＣ００４ ＰＤＸモデルにおいて、二重特異性ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８抗体とＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢを組み合わせた有効性試験の試験計画を示す。計画及び種々の処置群を示す。 全処置群の腫瘍増殖動態（平均、＋ＳＥＭ）を示す（平均腫瘍体積）。 ｙ軸にプロットした５つの処置群の個々のマウスの腫瘍の成長を示す。図１９Ａは、ビヒクル群における個々のマウスの腫瘍増殖を示し、図１９Ｂは、０．５ｍｇ／ｋｇの量のＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ単独で処置したマウス、図１９Ｃは、０．０５ｍｇ／ｋｇの量のＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ単独で処置したマウス、図１９Ｄは、ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ（０．５ｍｇ／ｋｇ）及びＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８（１ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウス、図１９Ｅは、ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）及びＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８（１ｍｇ／ｋｇ）で処置したマウスの腫瘍増殖を示す。二重特異性ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８抗体の存在下でＴＣＢ媒介性腫瘍退縮が増加していることが分かる。
定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。
本明細書で使用する場合、「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質である。
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原に結合する抗原結合ドメイン」又は「腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な部分」という用語は、腫瘍関連抗原ＥｐＣＡＭに特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭを介したシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合ドメインは、それが付着している実体（例えば、ＣＤ２８抗体）をＥｐＣＡＭ発現細胞、例えば特定のタイプの腫瘍細胞に向けることができる。ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、本明細書でさらに定義される抗体及びその断片を含む。これに加え、腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、本明細書でさらに定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質又は設計された反復ドメインに基づく結合ドメイン（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照のこと）を含む。
抗原結合分子、すなわち抗体又はその断片に関して、「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、抗原の一部又は全部に相補的である領域を含む分子の一部を指す。特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、例えば１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。具体的には、特異的抗原結合が可能な抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。別の態様では、「腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な抗原結合ドメイン」は、Ｆａｂ断片又はｃｒｏｓｓＦａｂ断片であってもよい。本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインなどに関して「第１」、「第２」又は「第３」という語は、各タイプの部分が２つ以上ある場合に区別するのに便利なように使用される。これらの用語の使用は、明示的に述べられていない限り、部分の特定の順序又は向きを付与することを意図していない。
本明細書の「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体及び多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体製剤の産生中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体を除き、そのようなバリアントは、一般的に、少量存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
本明細書で使用される場合、「単一特異性」抗体という用語は、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は２つの抗原結合部位を含み、それらの各々が異なる抗原決定基に対して特異的である。しかしながら、二重特異性抗原結合分子は、さらなる抗原決定基に結合するさらなる抗原結合部位も含み得る。特定の態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの異なる細胞又は同じ細胞上に発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。したがって、本発明による「二重特異性」という用語は、三重特異性分子、例えばＣＤ２８抗体及び２つの異なる標的細胞抗原に向けられた２つの抗原結合ドメインを含む二重特異性分子も含み得る。
本願で用いられる「～価」という用語は、１つの抗原決定基に対して特異的である抗原結合分子内に、１つの抗原決定基に対して特異的な結合部位が特定数存在することを示す。したがって、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、抗原結合分子内に、それぞれ、特定の抗原決定基に対して特異的な２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを示す。本発明の特定の態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、特定の抗原決定基に対して一価であり得る（当該抗原決定基に対して１つのみの結合部位を有することを意味する）か、又は特定の抗原決定基に対して二価若しくは四価であり得る（当該抗原決定基に対してそれぞれ、２つの結合部位、若しくは４つの結合部位を有することを意味する）。
「全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに分けられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）等のサブタイプにさらに分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２タイプのうちの１つに割り当てられ得る。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｃｒｏｓｓＦａｂ断片；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ９， １２９－１３４ （２００３）を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９－３１５ （１９９４）を参照； また、国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えばＥＰ第４０４０９７号； 国際公開第１９９３／０１１６１号； Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ ９， １２９－１３４ （２００３）； 及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０， ６４４４－６４４８ （１９９３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもＨｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｄ ９， １２９－１３４ （２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。所定の実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である （Ｄｏｍａｎｔｉｓ， Ｉｎｃ．， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ； 例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による産生を含め、種々の技術によって作製され得る。
インタクト抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片を生じ、これは、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインと、さらに、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」又は「Ｆａｂ分子」という用語は、軽鎖（ＣＬ）の可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖の可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ又は複数のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。「従来のＦａｂ断片」は、ＶＬ－ＣＬ軽鎖及びＶＨ－ＣＨ１重鎖で構成される。
「ｃｒｏｓｓＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの可能な鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域は、置き換わっており、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインと重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。一方、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が置き換わっている場合、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）とで構成されるペプチド鎖と、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）とで構成されるペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、当該抗体ドメイン及び当該リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：（ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、（ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又は（ｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；かつ当該リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２～５０アミノ酸のポリペプチドである。当該単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化されている。これに加え、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるであろう。
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ－ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーから成るポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１及びｂ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有し；ＶＨとＶＬは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、かつ前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。これに加え、これらのｘ－ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによれば、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるであろう。
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０～約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とを、又はその逆で接続することができる。このたんぱく質は、定常領域の除去及びリンカーの誘導にかかわらず、元の抗体の特性を保持する。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ， Ｊ．Ｓ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３ （１９９１） ４６－９６に記載されている。これに加え、抗体断片は、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、又はＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）単鎖ポリペプチドを含み、それによって、完全長抗体の抗原結合特性を与える。
「足場抗原結合タンパク質」は、当該技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が、抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されている。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｓ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １３：２４５－２５５ （２００９） ａｎｄ Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｄａｒｐｉｎｓ： Ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １３： ６９５－７０１ （２００８）を参照されたい。本発明の一態様において、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４（エビボディ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来分子、例えば、プロテインＡのＺ－ドメイン（アフィボディ）、Ａ－ドメイン（アビマー／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体ベータ－ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγ－クリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えば、ノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様のＩｇ折りたたみを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与えるために、異種配列と置換されてもよい。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ－４分子も、エビボディとして知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７号Ｂ１）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。さらなる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８ （１－２）， ３１－４５ （２００１）を参照のこと。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の小さな疎水性分子を運ぶ細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、剛性ベータ－シート二次構造を有し、円錐構造の開放端に多くのループがあり、このループは、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。アンチカリンは、サイズが１６０から１８０の間のアミノ酸であり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４８２： ３３７－３５０ （２０００）、米国特許第７２５０２９７号、及び米国特許公開第２００７０２２４６３３号を参照のこと。アフィボディは、抗原に結合するように操作することが可能な、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来する足場である。ドメインは、約５８アミノ酸の３つの螺旋形の束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって作られている。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ． ２００４， １７， ４５５－４６２及びＥＰ１６４１８１８を参照のこと。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリーに由来する複数ドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、規定のジスルフィド結合した構造に適合する。多様性は、Ａ－ドメインのファミリーによって示される天然の変動のシャッフリングによって作られる。さらなる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）， １５５６ － １５６１ （２００５）及びＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）， ９０９－９１７ （Ｊｕｎｅ ２００７）を参照のこと。トランスフェリンは、モノマー血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容状態の表面ループへのペプチド配列の挿入によって異なる標的抗原に結合するように操作可能である。操作されたトランスフェリン足場の例としては、トランスボディが挙げられる。さらなる詳細については、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７４， ２４０６６－２４０７３ （１９９９）を参照のこと。設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格の内在性膜タンパク質の付着に介在するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのアルファらせんとベータ－ターンとからなる３３残基のモチーフである。単一のアンキリンリピートは、各反復の第１のアルファらせん及びベータ－ターンの中の残基をランダム化することによって異なる標的抗原に結合するように操作することができる。その結合界面は、モジュールの数を増やすことによって、増加させることができる（親和性成熟方法）。さらなる詳細については、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３２， ４８９－５０３ （２００３）， ＰＮＡＳ １００（４）， １７００－１７０５ （２００３）及びＪ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３６９， １０１５－１０２８ （２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照のこと。単一ドメイン抗体は、一本の単量体可変抗体ドメインから成る抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律的なヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来ＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列を有する骨格からなる。ベータ－サンドイッチの片方の端にある３つのループを、アドネクチンが対象となる治療標的を特異的に認識することができるように操作することができる。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ． １８， ４３５－ ４４４ （２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号を参照のこと。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には、活性部位に挿入される拘束された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細については、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． ５， ７８３－７９７ （２００５）を参照のこと。ミクロボディは、３～４個のシステイン架橋を含有する、長さ２５～５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質に由来する。ミクロタンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが含まれる。ミクロタンパク質は、ミクロタンパク質の全体的な折りたたみに影響を与えることなく、２５アミノ酸までを含むように操作することができるループを有する。操作されたノッチンドメインのさらなる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上遮断する。
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に特異的に結合しかつするとともに抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む、抗体結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分－抗原複合体を形成する、抗原結合部分が結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に認めることができる。別途指定されない限り、本明細書において抗原として有用なタンパク質は、哺乳動物、例えば、霊長類（例えばヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含め、任意の脊椎動物源由来の任意の天然形態のタンパク質であってもよい。特定の実施態様において、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、この用語は「全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。この用語はまた、天然に存在するタンパク質バリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントを包含する。
「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、望ましくない又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。特定の抗原への抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られているその他の技術（例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置での解析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７， ３２３－３２９ （２０００））及び古典的結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８， ２１７－２２９ （２００２））のいずれかにより測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍから１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍから１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
「親和性」又は「結合親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。別途指定されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対する親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と解離速度定数（それぞれｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比が同じである限り、同等の親和性が異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含め、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
本明細書で使用される「活性化Ｔ細胞抗原」は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指し、抗体との相互作用時にＴ細胞の活性化を誘導することができる。具体的には、抗体の活性化Ｔ細胞抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達のカスケードをトリガーすることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施態様では、活性化Ｔ細胞抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニット（ヒト配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０７７６６（バージョン１８９）、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号１６７；又は、カニクイザル）［Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についてはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９５ＬＩ５（バージョン４９）、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１、配列番号１６８を参照）である。
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の、１つ又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、当技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
「腫瘍関連抗原」又はＴＡＡは、本明細書で使用する場合、標的細胞、例えばがん細胞、腫瘍間質の細胞、悪性Ｂリンパ球又はメラノーマ細胞等の腫瘍内の細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。特定の一態様では、ＴＡＡはＥｐＣＡＭである。
癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られている、「癌胎児性抗原（ＣＥＡ）」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、並びに齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する、任意の天然ＣＥＡを意味する。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号１１０）に示されている。ＣＥＡは長らく、腫瘍関連抗原として識別されてきた（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．，１２１：４３９－４６２，１９６５；Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ Ｎ．Ｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．，２０：２１９７－２２０７，２００２）。元は、胎児組織のみで発現するタンパク質として分類されていたＣＥＡは現在、いくつかの健常な成人組織にて同定されている。これらの組織は、消化管、呼吸器、及び泌尿生殖器の細胞、並びに結腸、子宮頸部、汗腺、及び前立腺の細胞を含む、主に上皮由来である（Ｎａｐ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．， ９（２－３）：１４５－５３， １９８８； Ｎａｐ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５２（８）：２３２９－２３３３９， １９９２）。上皮由来の腫瘍、及びこれらの転移物は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含有する。ＣＥＡ自身が存在することは、がん性細胞への形質転換を意味するものではないものの、ＣＥＡが分布していることを示している。正常組織では、ＣＥＡは一般的に細胞の頂端表面で発現し（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ Ｓ．， Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． ９（２）：６７－８１ （１９９９））、血流中の抗体に到達できないようにする。正常組織とは対照的に、ＣＥＡは、がん性細胞の表面全体にわたって発現する傾向がある（Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ Ｓ．， Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． ９（２）：６７－８１ （１９９９））。発現パターンのこの変化により、ＣＥＡが、がん性細胞内で抗体結合をしやすくなる。さらに、ＣＥＡの発現は、がん性細胞にて増加する。さらに、ＣＥＡ発現の増加は、細胞間接着の増加を促進し、これは転移につながる可能性がある（Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｊ．， Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ３０（ａ Ｓｕｐｐｌ． ８）：３０－６， ２００３）。様々な腫瘍実体におけるＣＥＡ発現の有病率は、一般に非常に高い。公表されたデータと一致して、組織サンプル中で実施された独自の分析は、その高い有病率を確認し、結腸直腸癌（ＣＲＣ）ではおよそ９５％、膵臓がんでは９０％、胃がんでは８０％、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、ＨＥＲ３と共発現）では６０％、及び乳がんでは４０％であった。小細胞肺がん及び神経膠芽腫では低い発現率が確認された。
ＣＥＡは速やかに細胞表面から切断され、腫瘍から、直接又はリンパ系を介してのいずれかにより、血流に入る。この性質から、血清ＣＥＡのレベルは、がん診断のための臨床マーカー、及び、がん、特に結腸直腸がんの再発のためのスクリーニングとして使用されてきた（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ Ｄ Ｍ．， Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｒｓ， ７：１８３－１８８， １９９２； Ｃｈａｕ Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ２２：１４２０－１４２９， ２００４； Ｆｌａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ； １２（２３）：６９８５－６９８８， ２００６）。
別途指定されない限り、「上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源に由来する任意の天然ＥｐＣＡＭを指す。この用語は、「全長」のプロセシングされていないＥｐＣＡＭ、及び細胞におけるプロセシングから生じるＥｐＣＡＭの任意の形態を包含する。この用語は、ＥｐＣＡＭの天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント、又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス、及び／又はカニクイザルＥｐＣＡＭに特異的に結合可能である。ヒトＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ１６４２２（バージョン１６７、配列番号１１１）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００２３４５．２に示されている。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、成熟タンパク質のアミノ酸１から２４２を含む（配列番号１９６のアミノ酸配列）。マウスＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９９ＪＷ５（バージョン１１１、配列番号１１２）又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２５５８．２に示されている。腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）、１７－１Ａ及びＣＤ３２６としても知られる、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、上皮起源のがんにおいて及びがん幹細胞によって頻繁に過剰発現するＩ型約４０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質であり、したがって、治療及び診断のための重要な関心対象の分子である。細胞外ドメインＥｐＣＡＭを切断して、可溶性細胞外ドメイン分子ＥｐＥＸ及び細胞内分子ＥｐＩＣＤを得ることができる。ＥｐＩＣＤは、他のタンパク質と会合して、細胞増殖を促進する遺伝子の発現を上方制御する核複合体を形成することが示されている。ＥｐＣＡＭはまた、上皮から間葉細胞への移行（ＥＭＴ）に関与し得、大きな転移の形成に寄与し得る。
「ＣＤ２８」（分化クラスター２８、Ｔｐ４４）は、別途指定されない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のＣＤ２８タンパク質を指す。ＣＤ２８はＴ細胞上で発現され、Ｔ細胞の活性化及び生存に必要な共刺激シグナルを提供する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えてＣＤ２８によるＴ細胞刺激は、様々なインターロイキンの産生のための強力なシグナルを提供することができる。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）タンパク質の受容体であり、ナイーブＴ細胞上に構成的に発現される唯一のＢ７受容体である。ヒトＣＤ２８のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｐ１０７４７（配列番号１）に示される。
「アゴニスト抗体」とは、所与の受容体に対するアゴニスト機能を備える抗体を指す。一般に、アゴニストリガンド（因子）が受容体に結合すると、受容体タンパク質の三次構造が変化し、受容体が活性化される（受容体が膜タンパク質である場合、細胞増殖シグナル等が、通常、形質導入される（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｄ））。受容体が二量体形成型である場合、アゴニスト抗体は受容体を適切な距離及び角度で二量体化することができ、したがってリガンドと同様に作用する。適切な抗受容体抗体は、リガンドによって行われる受容体の二量体化を模倣することができ、したがって、アゴニスト抗体になり得る。
「ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子」又は「ＣＤ２８従来のアゴニスト抗原結合分子」は、Ｔ細胞受容体シグナル（「シグナル２」）の存在下でＴ細胞活性化を増強する役割においてＣＤ２８天然リガンド（ＣＤ８０又はＣＤ８６）を模倣する抗原結合分子である。Ｔ細胞は、完全に活性化されるために２つのシグナルを必要とする。生理学的条件下では、「シグナル１」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子と抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のペプチド／主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）複合体との相互作用から生じ、「シグナル２」は共刺激受容体、例えばＣＤ２８の連結によって提供される。ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子は、Ｔ細胞を共刺激することができる（シグナル２）。それはまた、ＴＣＲ複合体に対する特異性を有する分子と組み合わせてＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌を誘導することができるが、ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子は、ＴＣＲのさらなる刺激なしにＴ細胞を完全に活性化することができない。しかしながら、ＣＤ２８特異的抗原結合分子のサブクラス、いわゆるＣＤ２８スーパーアゴニスト抗原結合分子が存在する。「ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗原結合分子」は、ＴＣＲをさらに刺激することなくＴ細胞を完全に活性化することができるＣＤ２８抗原結合分子である。ＣＤ２８スーパーアゴニスト抗原結合分子は、事前のＴ細胞活性化なしにＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌を誘導することができる（シグナル１）。
「可変ドメイン」又は「可変領域」という用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照のこと。抗原結合特異性を付与するためには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分であり得る。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗原結合可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを指す。一般的に、抗原結合ドメインは、６個のＣＤＲを含み、ＶＨに３個（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、ＶＬに３個（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）含む。本明細書における例示的なＣＤＲには、以下が含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、及び９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７ （１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ （１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、及び９３～１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２： ７３２－７４５ （１９９６））。
別途指定されない限り、ＣＤＲは、上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の、科学的に受け入れられた命名法に従い決定することができることを理解するであろう。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．はまた、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のナンバリングシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔナンバリング」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， “Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ” （１９８３）により規定されたナンバリングシステムを指す。別途明記されない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングへの言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに準拠する。
本明細書で使用される場合、抗原結合分子（例えば、抗体）に関連して「親和性成熟」という用語は、参照抗原結合分子に由来し、例えば変異により、参照抗体と同じ抗原に、好ましくは同じエピトープに結合し、抗原に対して、参照抗原結合分子よりも高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は、一般に、抗原結合分子の１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸残基の修飾を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の配列：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４で現れる。
本明細書の目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよいし、アミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体（例えば非ヒト抗体）の「ヒト化型」とは、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を生み出すために定常領域が元の抗体の定常領域からさらに修飾又は変更されたものである。
「ヒト」抗体は、ヒト又はヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源から誘導される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。特に、「ヒト」抗体又は「ヒト化」抗体は、ヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むヒト起源の定常領域、特にＩｇＧアイソタイプの定常領域、より詳しくはＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を含む。
「ＣＬドメイン」という用語は、抗体軽鎖ポリペプチドの定常部分を示す。ヒト定常ドメインの例示的配列は、配列番号：１６５及び１６６（それぞれヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）に示される。
「ＣＨ１ドメイン」という用語は、おおよそＥＵ位置１１８からＥＵ位置２１５まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）。一態様では、ＣＨ１ドメインは、ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ ＮＴＫＶＤＫＫＶ（配列番号１１３）のアミノ酸配列を有する。通常、ＥＰＫＳＣ（配列番号１１６）のアミノ酸配列を有するセグメントは、続いてＣＨ１ドメインをヒンジ領域に連結する。
「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖においてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを結合する抗体重鎖ポリペプチドの一部（例えば、ＫａｂａｔのＥＵナンバーシステムにより、約２１６の位置から約２３０の位置まで、又は約２２６の位置から約２３０の位置まで）を表す。他のＩｇＧサブクラスのヒンジ領域は、ＩｇＧ１サブクラス配列のヒンジ領域システイン残基と整列させることによって決定することができる。ヒンジ領域は、通常、同一のアミノ酸配列を有する２つのポリペプチドからなる二量体分子である。ヒンジ領域は、一般に、２５個までのアミノ酸残基を含み、柔軟であり、関連する標的結合部位が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、上部、中央、及び下部ヒンジドメイン（例えば、Ｒｏｕｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１（１９９８）４０８３を参照されたい）の３つのドメインに細分することができる。
一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号１１７）を有し、ＸはＳ又はＰのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＨＴＣＰＸＣＰ（配列番号１１８）を有し、ＸはＳ又はＰのいずれかである。一態様では、ヒンジ領域はアミノ酸配列ＣＰＸＣＰ（配列番号１１９）を有し、ＸはＳ又はＰのいずれかである。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」との用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。Ｆａｂ断片（ＣＨ１ドメインを含む）によってすでに定義されている分子に関連して、「Ｆｃドメイン」という用語は、ＩｇＧ ＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインのみを指す場合がある。
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約ＥＵ位置２３１のアミノ酸残基から約ＥＵ位置３４０のアミノ酸残基（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）まで延在する。一態様では、ＣＨ２ドメインは、ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶ ＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ ＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰ ＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧ ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ ＲＥＥＱＥＳＴＹＲＷ ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ ＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥ ＫＴＩＳＫＡＫ（配列番号１１４）のアミノ酸配列を有する。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対になっていないという点で特有である。むしろ、インタクトネイティブＦｃ領域の２つのＣＨ２ドメインの間には、２つのＮ－ｌｉｎｋｅｄ分岐炭水化物鎖が介在している。炭水化物がドメイン－ドメイン対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインを安定させるのに役立ち得ることが推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２ （１９８５） １６１－２０６。ある実施態様では、ＣＨ２ドメインに炭水化物鎖が結合している。本明細書におけるＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメインでもバリアントＣＨ２ドメインでもよい。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインのＣ末端側の残基のストレッチを含み、およそＥＵ位置３４１からＥＵ位置４４６まで延びる抗体重鎖ポリペプチドの部分を表す（ＫａｂａｔによるＥＵナンバリングシステム）。一態様では、ＣＨ３ドメインは、ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫ ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧ ＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳＬＳＰＧ（配列番号１１５）のアミノ酸配列を有する。本明細書におけるＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメインでもバリアントＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖に「隆起」（「ノブ」）が導入され、そのもう一方の鎖に対応する「空洞」（「ホール」が導入されたＣＨ３ドメイン；本明細書において参照により明示的に援用される米国特許第５８２１３３３号を参照されたい）でもよい。そのようなバリアントＣＨ３ドメインを使用して、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。本明細書において別途明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， １９９１に記載のＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９， ６１７－６２１ （１９９６）及びＣａｒｔｅｒ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８， ７－１５ （２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある隆起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により変化させることによって作り出すことができる。具体的な実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これら２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、よってダイマーをさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８， ７－１５ （２００１））。
「免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子バリアント、並びに置換、付加、又は欠失を生成するが、免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害性）の媒介能を実質的に低下させない変更を有する変異体を含むことを意図している。例えば、１つ又は複数のアミノ酸を、生物学的機能を実質的に損なうことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。このようなバリアントは、活性に対する影響を最小化するために、当技術分野において既知の一般則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ， Ｊ． Ｕ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６－１０ （１９９０）参照）。
「野生型Ｆｃドメイン」という用語は、自然界で見出されるＦｃドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を意味する。野生型ヒトＦｃドメインとしては、天然ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）、天然ヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然ヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域及び天然ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域並びにその天然起源のバリアントが挙げられる。野生型Ｆｃ領域は、配列番号１２０（ＩｇＧ１、白人型アロタイプ）、配列番号１２１（ＩｇＧ１、アフロアメリカン型アロタイプ）、配列番号１２２（ＩｇＧ２）、配列番号１２３（ＩｇＧ３）、及び配列番号１２４（ＩｇＧ４）に示される。
「バリアント（ヒト）Ｆｃドメイン」という用語は、少なくとも１つの「アミノ酸変異」によって「野生型」（ヒト）Ｆｃドメインアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を示す。一態様では、バリアントＦｃ領域は、天然Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸変異、例えば約１～約１０個のアミノ酸変異、一態様では天然Ｆｃ領域中に約１～約５個のアミノ酸変異を有する。一態様では、（バリアント）Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と少なくとも約９５％の相同性を有する。本明細書で開示する特定のバリアントＦｃドメインは、配列番号３３７のアミノ酸配列を含む、変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性の機能を指す。抗体エフェクター機能の例には： Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）；サイトカイン分泌；抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞の活性化が含まれる。
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞上の専門化した細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用によりもたらされ得る。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介した、免疫複合体の食作用による抗体でコーティングされた病原体の除去と、対応する抗体でコーティングされた赤血球及び種々の他の細胞標的（例えば、腫瘍細胞）の溶解との両方を媒介することが示されている （例えば、Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｊ．Ｇ． ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｃ．Ｌ．， Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ４９ （１９９１） ５１１－５２４を参照のこと。）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性により定義される：ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ， Ｊ．Ｖ． ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ｊ．Ｐ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９ （１９９１） ４５７－４９２； Ｃａｐｅｌ， Ｐ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４ （１９９４） ２５－３４； ｄｅ Ｈａａｓ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １２６ （１９９５） ３３０－３４１；及びＧｅｓｓｎｅｒ， Ｊ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ７６ （１９９８） ２３１－２４８に記載されている。
ＩｇＧ抗体（ＦｃγＲ）のＦｃ領域に対する受容体の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害、及び炎症性メディエータの放出、並びに免疫複合体のクリアランス及び抗体産生の制御を含む、多種多様なエフェクター機能を誘発する。ヒトにおいて、ＦｃγＲの３クラスが以下のように特徴づけられている。
－ ＦｃγＲＩ （ＣＤ６４）は、高い親和性を有するモノマーＩｇＧを結合し、マクロファージ、単球、好中球及び好酸球上で発現すること。アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）の少なくとも１つにおけるＦｃ領域 ＩｇＧの修飾がＦｃγＲＩへの結合を低減させる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された２３３～２３６位のＩｇＧ２残基が、ＦｃγＲＩへの結合を１０3倍低下させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Ａｒｍｏｕｒ， Ｋ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９ （１９９９） ２６１３-２６２４）。
－ ＦｃγＲＩＩ （ＣＤ３２）は、中程度から低度の親和性で、複合ＩｇＧに結合し、広く発現している。この受容体は、二のサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）に見られ、殺傷プロセスを活性化することができるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びにマスト細胞及び好酸球に認められる。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、さらなる免疫グロブリンの産生及び例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチングを抑制するよう機能するようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介される食作用を阻害するように働く。好酸球及びマスト細胞上では、該Ｂ形態は、その別の受容体に結合しているＩｇＥを介して、これらの細胞の活性化を抑制するのに役立つ可能性がある。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の低減は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２及びＫ４１４ （ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）のうちの少なくとも１つにおいて変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に関して認められる。
－ ＦｃγＲＩＩＩ （ＣＤ１６）は、中程度から低い親和性でＩｇＧに結合し、二種類で存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球並びにいくつかの単球及びＴ細胞上で見られ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球で多く発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡへの減少した結合は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３－Ｇ２３６， Ｐ２３８， Ｄ２６５， Ｎ２９７， Ａ３２７， Ｐ３２９， Ｄ２７０， Ｑ２９５， Ａ３２７， Ｓ２３９， Ｅ２６９， Ｅ２９３， Ｙ２９６， Ｖ３０３， Ａ３２７， Ｋ３３８及びＤ３７６ （ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従いナンバリング。）の少なくとも一の変異を有するＩｇＧＦｃ領域を含む抗体で見られる。
Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上述の変異部位、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ， Ｒ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６ （２００１） ６５９１－６６０４に記載されている。
「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害性」という用語は、免疫エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞の溶解をもたらす免疫機構である。該標的細胞は、通常Ｆｃ領域に対するＮ末端であるタンパク質部分を介してＦｃ領域を含む抗体又はその誘導体が特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの低下」は、標的細胞を囲む媒質中の所定の抗体濃度において、上記に定義したＡＤＣＣの機構により所定の時間内に溶解する標的細胞の数、 及び／又は、ＡＤＣＣの機構により所定の時間内に所定の数の標的細胞を溶解させるために必要な、標的細胞を囲む媒質中の抗体濃度の上昇のいずれかと定義される。ＡＤＣＣの低減は、同じ標準的な生産、精製、製剤化及び保存方法（これらは当業者には既知である）を用いて、同じタイプの宿主細胞によって生産された同じ抗体であるが操作されていない抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較している。例えば、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換をそのＦｃドメインに含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、Ｆｃドメインにおいてこのアミノ酸置換を伴わない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣと比較される。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、当技術分野でよく知られている （例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は同第２０１２／１３０８３１号参照）。例えば、ＡＤＣＣを媒介する初期工程を誘発する抗体の能力は、ＦｃγＲＩ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡ又は（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）ＮＫ細胞を組み換えにより発現する細胞といった、Ｆｃγ受容体を発現する細胞への、抗体の結合を測定することにより調査される。特に、ＮＫ細胞上でのＦｃγＲへの結合が測定される。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による関与に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を引き起こすＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（配列番号１２５、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１）。
「エクトドメイン」は、細胞外空間 （即ち標的細胞外の空間）中に延びる膜タンパク質のドメインである。外部ドメインは、通常、シグナル伝達をもたらす表面との接触を開始するタンパク質の部分である。
用語「ペプチドリンカー」は、１つ又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０アミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当技術分野において既知のものであっても、本願明細書に記載されているものであってもよい。好適な、非免疫原性リンカーペプチドは例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ， （ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は一般に、１～５、典型的には２～４、特に２の数字であり、すなわち、ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１２８）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号：１２９）からなる群から選択されるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号１３０）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１３１）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１３２）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１３３）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号１３４）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号１３５）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号１３６）、ＧＧＳＧ（配列番号１３７）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号１３８）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号１３９）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号１４０）もまた含む。特に興味深いペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号１２６）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１２７）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号１３１）及び（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１３２）である。
「アミノ酸」という用語は、本明細書中で使用する場合、アラニン（三文字表記：ａｌａ、一文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα－アミノ酸の群を示す。
「融合した」又は「接続した」とは、構成要素（例えば、当該ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及び外部ドメイン）がペプチド結合によって直接又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介して連結されていることを意味する。
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要ならばギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした場合の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントであると定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、例えば、公的に入手可能なＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮなどのコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内にある様々な方法で達成され得る。ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が作成したものであり、ソースコードは、使用者用書類と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であるか、又はそのソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ－２プログラムによって設定されており、変わらない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、アミノ酸配列Ｂとの、又はアミノ酸配列Ｂとの対照での、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対し、アミノ酸配列Ｂと、又はアミノ酸配列Ｂとの対照で、特定のアミノ酸配列同一性％を有するか若しくは含む、所与のアミノ酸配列Ａとして記述することができる）は、以下のように計算される：１００×Ｘ／Ｙ；
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同マッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して、前段落で説明したように得られる。
特定の実施態様では、本明細書で提供する、ＣＤ２８抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントが想到される。例えば、ＣＤ２８抗原結合分子の結合親和性、及び／又は他の生物学的性質を改善するのが望ましい場合がある。ＣＤ２８抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントは、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせは、最終的なコンストラクトが、所望の特色（例えば、抗原結合）を有する限り、最終的なコンストラクトに到達するように行うことができる。置換変異誘発の対象となる部位には、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Ｂに与えられており、アミノ酸側鎖クラス（１）～（６）を参照しつつ、以下にさらに記載される。アミノ酸置換は目的の分子に導入することができ、その生成物を所望の活性、例えば、抗原結合性の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
Figure 2024522340000002
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る。
（１）疎水性： ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性： Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性： Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性： Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基： Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族： Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
「アミノ酸配列バリアント」という用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的なバリアントを含む。一般的に、さらなる試験のために選択され、得られたバリアント（複数可）は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）を有し、及び／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換バリアントは、親和性成熟抗体であり、これは、例えば、本明細書中に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟法を用いて簡便に作製され得る。簡潔には、１つ又は複数のＨＶＲ残基は、変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされたバリアント抗原結合分子である。特定の実施形態において、置換、挿入又は欠失は、そのような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中で行われてよい。変異誘発を標的とし得る抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１－１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、帯電した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。さらなる置換が、初期置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原－抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的化され得るか、又は排除され得る。バリアントは、所望の特性を含むかを判定するためにスクリーニングされ得る。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入の例としては、ＣＤ２８抗原結合分子の血清半減期を増加させる、Ｎ又はＣ末端の、ポリペプチドへの融合を伴うＣＤ２８抗原結合分子が挙げられる。
特定の実施態様では、本明細書で提供するＣＤ２８抗原結合分子が改変され、抗体がグリコシル化される程度が増加又は低下される。該分子のグリコシル化バリアントは、簡便には、１つ又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を変化させることにより得られる。アゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子がＦｃドメインを含む場合、Ｆｃドメインに付着した炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然の抗体は、通常、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に付着された分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照のこと。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに付着したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様では、アゴニストＩＣＯＳ結合分子中のオリゴ糖の修飾は、特定の改良された特性を有するバリアントを作製するために行われてもよい。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）接続するフコースを欠いた炭水化物構造を有するアゴニスト性ＩＣＯＳ結合分子のバリアントが提供される。そのようなフコシル化バリアントは、改良されたＡＤＣＣ機能を有していてもよく、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。本発明のＣＤ２８抗原結合分子のさらなるバリアントは、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に接続した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものを含む。このようなバリアントは、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば国際公開第２００３／０１１８７８号 （Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ ｅｔ ａｌ．）； 米国特許第６６０２６８４号 （Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）； 及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号 （Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）を参照のこと。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有するバリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号 （Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）； 国際公開第１９９８／５８９６４号 （Ｒａｊｕ， Ｓ．）； 及び国際公開第１９９９／２２７６４ （Ｒａｊｕ， Ｓ．）に記載されている。
一定の実施態様では、本発明のＣＤ２８抗原結合分子のシステイン操作バリアント、例えば、分子の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換された「チオＭＡｂ」を作製することが望ましい場合がある。特定の実施態様において、置換された残基は、分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、その反応性チオール基を用いて抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分にコンジュゲートさせて、イムノコンジュゲートを作製することができる。特定の実施態様において、以下の残基のうちのいずれか１つ又は複数がシステインで置換されていてもよい。軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作された抗原結合分子は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように作製されてもよい。
特定の態様では、本明細書中に提供されるＣＤ２８抗原結合分子は、当該分野で公知であり、容易に入手可能であるさらなる非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水の中でのその安定性に起因して、製造時に有利であり得る。そのポリマーは、任意の分子量であってもよく、分枝状であっても、分枝状でなくてもよい。抗体に付着するポリマーの数は変化し得て、１つを超えるポリマーが付着する場合、ポリマーは、同じ分子であってもよく、又は異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのか等を考慮しながら決定することができる。別の態様では、放射線への曝露により選択的に加熱され得る抗体と非タンパク質部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍ， Ｎ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２ （２００５） １１６００－１１６０５）。放射線は、任意の波長であってよく、限定されないが、通常の細胞に有害ではないが、非タンパク質性部分を、抗体－非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度まで加熱する波長を含む。別の態様では、本明細書で提供するＣＤ２８抗原結合分子のイムノコンジュゲートを得ることができる。「イムノコンジュゲート」は、限定されないが、細胞傷害性薬剤を含む、１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートされている抗体である。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は従来の結合以外の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）中に見出されるもの）を含んでいてもよい。「核酸分子」という用語は、任意の１つ又は複数の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。各ヌクレオチドは、塩基、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成されている。多くの場合、核酸分子は、塩基の配列によって記載され、それにより、前記塩基は、核酸分子の１次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、通常、５’から３’に向かって表される。本明細書中において、核酸分子という用語は、例えば、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線状でも環状でもよい。さらに、核酸分子という用語は、センス鎖とアンチセンス鎖との両方、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態を含む。さらに、本明細書中に記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。天然に存在しないヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学的に修飾された残基を有する修飾ヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及び／又は例えば宿主若しくは患者の、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）ベクター又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていても修飾されていなくてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を増強するために化学修飾することができ、その結果、ｍＲＮＡを対象に注射して、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成することができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１７） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３：８１５－８１７、又はＥＰ２１０１８２３号Ｂ１を参照されたい）。
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドが意図するのは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターにおいて含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの本発明のＲＮＡ転写物、及びポジティブ及びネガティブの鎖形態、二本鎖形態を含む。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸には、合成により生成されたそのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーター等の調節エレメントであってもよく、又は調節エレメントを含んでいてもよい。
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ること以外は、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが欠失しているか又は別のヌクレオチドで置換されていてもよく、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ以上の連続した群として散在してもよい。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ－２）を用いて、従来通りに決定することができる。
「発現カセット」という用語は、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列とプロモーターとを含む。特定の実施態様において、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造物としてのベクター、及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの多量の転写が可能となる。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構によって生成される。一実施態様において、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫も含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸の含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生産するのに使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、ほんの数例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織に含まれる細胞も挙げられる。
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞又は組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
薬剤、例えば医薬組成物の「治療有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な投薬量及び期間での有効な量を指す。治療有効量の薬剤は、例えば、疾患の副作用を除去し、低下させ、遅延させ、最小限にし、又は予防する。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。特に、個体又は対象は、ヒトである。
「医薬組成物」という用語は、中に含まれる有効成分の生物活性が有効になるような形態の調製物であり、かつ、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される添加物」は、医薬組成物中の有効成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される添加物としては、限定されないが、バッファー、安定剤又は防腐剤が挙げられる。
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」等、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の望ましい効果としては、疾患の発生又は再発を予防すること、症候の軽減、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行速度を遅らせること、疾患状態の回復又は緩和、及び緩解又は予後の改善が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、本発明の分子を使用し、疾患の発生を遅らせるか、又は疾患の進行を遅らせる。
本明細書で述べる「併用治療」又は「同時投与」という用語は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の製剤に含まれる場合）及び別個の投与を包含し、その場合、本明細書で報告する抗体の投与は、１つ又は複数の追加の治療剤、好ましくは１つ又は複数の抗体の投与の前、同時に及び／又は後に起こり得る。
「がん」という用語は、制御されていない細胞成長／増殖を典型的に特徴とする哺乳動物における生理学的症状を指すか、又は説明する。そのため、本明細書で使用される場合、がんという用語は、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病等の増殖性疾患を指す。特に、がんという用語は、リンパ球性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、肺細気管支肺胞がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部若しくは頸部のがん、皮膚若しくは眼内の黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰の癌腫、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、膀胱のがん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形膠芽細胞腫、星細胞種、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌腫、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫（上述のがんのいずれかの難治性態様を含む）、又は上述のがんの１つ又は複数の組み合わせを含む。一態様では、がんは固形腫瘍である。別の態様では、がんは血液がん、特に白血病、最も詳しくは急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）又は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
本発明は、産生可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率、減少した毒性、患者に与えることができる拡大した投与量範囲、及びそれによりおそらく増強した有効性等の、特に有利な特性を有する新規の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を提供する。新規の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能（Ｆｃサイレント）を低下させ、したがってＦｃ受容体を介した非特異的架橋が回避される、１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む。代わりに、それらは、腫瘍部位で架橋を引き起こす上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）への特異的結合が可能な特異的抗原結合ドメインを含む。驚くべきことに、本発明者らは、その結合特性に基づいて、本明細書に記載のＥｐＣＡＭ抗原結合ドメインが、二重特異性フォーマットにおいてより使用しやすくする有利な特性を有することを見出した。さらに、これらのＥｐＣＡＭ抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、特にＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体の存在下で、Ｔ細胞活性化を増加させる改善された機能性及び能力を有することが見出された。したがって、腫瘍特異的Ｔ細胞活性化の強化が達成される。
本発明では、
（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
（ｂ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
を含む、ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３０９のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３１０のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３１１のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号３１２又は配列番号３１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）；又は （ｉｉ）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）；又は
（ｉｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、本明細書において先に定義される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性を低下させる、及び／又はエフェクター機能を低下させる若しくは消失させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるナンバリング）を含む。一態様では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃドメインであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む。一態様では、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、第１のサブユニットが配列番号７０（ＦｃホールＰＧＬＡＬＡ）のアミノ酸配列を含み、第２へのサブユニットが配列番号７１（ＦｃノブＰＧＬＡＬＡ）のアミノ酸配列を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
（ｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ２及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
さらに、本明細書において前に定義したような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、及び配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｇ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｈ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｊ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
（ｋ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
特定の一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号５２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号５４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号５５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号５７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む。
別の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号５８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６０のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６３のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む。さらなる態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号６４のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号６５のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号６６のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号６７のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６８のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号６９のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む。
一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）を含む抗原結合ドメインと比較して、低い親和性でＣＤ２８に結合する、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。親和性は、ＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞への結合としてフローサイトメトリーによって測定される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む抗原結合ドメインと比較して、低下した親和性でＣＤ２８に結合し、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３とを含む。一態様では、配列番号２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む抗原結合ドメインと比較して、低下した親和性でＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む。
特定の一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の特定の態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
さらなる態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
ＥｐＣＡＭ標的化二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子
腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な抗原結合ドメインが上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）への特異的結合が可能な特異的抗原結合ドメインである、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が本明細書において提供される。
一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲと、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲとを含む。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む。
一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、及び配列番号２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、及び配列番号２２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｂ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｃ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｄ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｅ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｆ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｇ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｈ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｊ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｋ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｌ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｍ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、配列番号２５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）を有する、マウス抗体ＭＯＣ３１に由来する新たなヒト化抗体である、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、配列番号３０９のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３１０のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３１１のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号３１２又は配列番号３１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインは、配列番号３１６のアミノ酸配列を含む、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、（ｉｖ）配列番号３２５又は配列番号３２７又は配列番号３２８又は配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３３２又は配列番号３３４又は配列番号３３５又は配列番号３３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２１１、配列番号２６２、及び配列番号２６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、及び配列番号２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインを含む。特定の一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｉｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｉｖ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｖ） 配列番号２５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ
を含む。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、
（ｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉｖ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｖ） 配列番号２５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）
を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
別の態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲと、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲとを含む。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特に、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１６のアミノ酸含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む。
本明細書では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインが、（ｉ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、（ｉｖ）配列番号１４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｖ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子も開示される。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号１４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む。特に、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、配列番号１４７のアミノ酸含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む。
ＣＤ２８への結合については一価であり、ＥｐＣＡＭ３への結合については一価である二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（１＋１フォーマット）
一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメイン及び／又はＥｐＣＡＭ３への特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインがＦａｂ断片である、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインとＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインの両方がＦａｂ断片である。
一態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能なｃｒｏｓｓＦａｂ断片と、（ｂ）ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な従来のＦａｂ断片と、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な従来のＦａｂ断片と、（ｂ）ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能なｃｒｏｓｓＦａｂ断片と、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。
一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられたＦａｂ断片（ｃｒｏｓｓｆａｂ断片）である、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられたＦａｂ断片であり、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ断片である。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ断片である。
特定の一態様では、配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｆ）が提供される。
別の特定の態様では、配列番号９４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｋ）が提供される。
別の特定の態様では、配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｄ）が提供される。
さらに別の特定の態様では、配列番号９４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｄ）が提供される。
一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられたＦａｂ断片（ｃｒｏｓｓｆａｂ断片）である、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが互いに置き換えられているＦａｂ断片であり、ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ断片である。一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換され、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換され、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換され、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されるＦａｂ断片である。
特定の一態様では、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｇ）が提供される。
さらなる特定の態様では、配列番号８２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｊ）が提供される。
特定の一態様では、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（分子Ｇ）が提供される。
さらなる特定の態様では、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（Ｐ１ＡＨ２３２６）が本明細書で提供される。
特定の一態様では、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（Ｐ１ＡＨ２３２７）が提供される。
特定の一態様では、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（Ｐ１ＡＨ２３２８）が提供される。
さらに別の特定の態様では、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（Ｐ１ＡＨ２３２９）が提供される。
別の特定の態様では、配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子（Ｐ１ＡＨ２３３０）が提供される。
新たなＥｐＣＡＭ抗体
一態様では、抗体４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂのバリアントである、新たなヒト化抗体又は抗原結合ドメインが提供される。これらは、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、及び配列番号２１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、及び配列番号２２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、抗体又は抗体断片である。
特定の一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な抗体又は抗原結合ドメインであって、
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｂ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｃ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｄ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｅ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｆ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｇ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｈ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｊ）配列番号２１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｋ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｌ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｍ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）
を含む、抗体又は抗原結合ドメインが提供される。
別の特定の態様では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合し、マウス抗体ＭＯＣ３１に基づく、新たなヒト化抗体又は抗原結合ドメインが提供される。配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＥＰＣＡＭ細胞外ドメインに特異的に結合する新たな抗体又は抗体断片が提供される。
一態様では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体又は抗原結合ドメインであって、前記抗体又は抗原結合ドメインが、配列番号３１６のアミノ酸配列を含む、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１）、配列番号３１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、（ｉｖ）配列番号３２５又は配列番号３２７又は配列番号３２８又は配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３３２又は配列番号３３４又は配列番号３３５又は配列番号３３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、抗体又は抗原結合ドメインが提供される。
一態様では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する抗体又は抗原結合ドメインであって、前記抗体又は抗原結合ドメインが、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、及び配列番号２６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、及び配列番号２７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、抗体又は抗原結合ドメインが提供される。
一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｉｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｉｖ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
（ｖ） 配列番号２５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ
を含む。
特定の一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｉｖ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
（ｖ） 配列番号２５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）
を含む。
Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定した結合が可能である。Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に望ましい薬物動態特性を付与し、そのような薬物動態特性には、標的組織中への良好な蓄積に寄与する長い血清半減期及び望ましい組織－血液分配比が含まれる。一方では、好ましい抗原を含む細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞に対する本発明の二重特異性抗体の望ましくない標的化を引き起こす場合がある。
したがって、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示す。ある態様では、該Ｆｃは、Ｆｃ受容体に実質的に結合しないかつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一態様において、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。特定の態様において、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。ある態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下としては、限定されないが、以下のうちの１つ又は複数が挙げられる：補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の低下、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低下、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低下、サイトカイン分泌の低下、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低下、ＮＫ細胞への結合の低下、マクロファージへの結合の低下、単球への結合の低下、多形核細胞への結合の低下、アポトーシスを誘導する直接シグナル伝達の低下、樹状細胞の成熟の低下、又は減少したＴ細胞プライミング。
ある特定の態様において、１つ又は複数のアミノ酸の修飾は、本明細書中に提供される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域バリアントが作製され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
特定の一態様では、本発明は、Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体に対する、特にＦｃγ受容体への結合を減少させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、抗原結合分子を提供する。一態様では、本発明は、Ｆｃ領域が１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、かつ抗体によって誘導されるＡＤＣＣが、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む抗体によって誘導されるＡＤＣＣの０～２０％に減少する、抗体を提供する。
一態様では、本発明の抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を下げる１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのそれぞれに同じ１つ又は複数のアミノ酸変異が存在する。特に、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置（ＥＵナンバリング）にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４及び２３５ （ＥＵナンバリング）並びに／又は３２９の位置（ＥＵナンバリング） にアミノ酸置換を含む。より詳しくは、ＩｇＧ重鎖中にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、ＥＵナンバリング）を有するＦｃドメインを含む、本発明による抗原結合分子が提供される。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａは、所謂ＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させ、そのような変異体Ｆｃドメインを調製する方法及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定するための方法も記載している国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低下されたＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体（アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む）が挙げられる。
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する低下された結合親和性及び低下されたエフェクター機能を呈する。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔナンバリング）にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵナンバリング）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びそれらのＦｃγ受容体結合特性は、国際公開第２０１２／１３０８３１号にも記載されている。
変異体Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を使用して、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法には、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が含まれ得る。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって確認することができる。
Ｆｃ受容体への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって又は標準的な機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び例えば組換え発現により得られ得るＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。或いは、Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む細胞活性化抗体のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株（例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞）を用いて評価されてもよい。
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の抗原結合分子のエフェクター機能は、当該技術分野で既知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための好適なアッセイは、本明細書に記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号； Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３， ７０５９－７０６３ （１９８６） ａｎｄ Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２， １４９９－１５０２ （１９８５）； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８２１，３３７； Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６， １３５１－１３６１ （１９８７）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ （ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ （ＵＳＡ） ９５， ６５２－６５６ （１９９８）において開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価され得る。
いくつかの態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、具体的にはＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、Ｆｃドメインが低下したエフェクター機能を有するように設計されているいくつかの態様では、前述のエフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイは、本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、よってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために行われ得る。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３ （１９９６）； Ｃｒａｇｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２ （２００３）；及びＣｒａｇｇ， ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ， Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３ （２００４）を参照）。
特定の一態様では、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を示すＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。より詳しくは、それは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの片方又はもう一方に融合した異なる抗原結合部位を含み、そのため、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていてもよい。これらのポリペプチドの組換え共発現及びその後の二量体化により、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組換え産生における本発明の二重特異性抗原結合分子の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインに、所望なポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインとを含み、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進させる修飾を含む、ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のタンパク質間相互作用が最も広範囲に及ぶ部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインにある。したがって、一態様において、当該修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
具体的な態様において、上記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの１つに「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他の１つに「ホール」修飾と、を含む。したがって、本発明は、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な１つの抗原結合ドメインと、（ｂ）腫瘍関連抗原への特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含み、ノブからホールへの方法に従ってＦｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットがホールを含む、ＣＤ２８への一価結合を有する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。特定の態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９， ６１７－６２１ （１９９６）及びＣａｒｔｅｒ， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８， ７－１５ （２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある隆起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある対応する空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面からの小さなアミノ酸側鎖をそれより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じ又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
したがって、一態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内で位置換え可能な第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に隆起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖容積を有するアミノ酸残基と置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中で、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が位置換え可能である。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的変異誘発により、又はペプチド合成により変化させることによって作り出すことができる。具体的な態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のスレオニン残基がトリプトファン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基がバリン残基と置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、位置３６６のトレオニン残基が、セリン残基と置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基が、アラニン残基と置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）。
なおさらなる態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、さらに、位置３５４のセリン残基が、システイン残基と置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、さらに、位置３４９のチロシン残基が、システイン残基と置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、ダイマーをさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ （２００１）， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８， ７－１５ （２００１））。特定の態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖを含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。
別の態様において、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えばＰＣＴ公開である国際公開２００９／０８９００４に記載されているように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般に、この方法では、２つのＦｃドメインサブユニットの界面にある１つ又は複数のアミノ酸残基を帯電したアミノ酸残基で置き換えて、ホモ二量体形成が静電気的に不利になるが、ヘテロ二量体化が静電気的に有利になるようにする。
本明細書に報告される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうち１つ又は２つが除去された、短くされたＣ末端であり得る。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は短縮Ｃ末端末端Ｐである。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は短縮Ｃ末端末端ＰＧである。本明細書に報告される全ての態様のうちの一態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含むＣＤ２８抗原結合分子は、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。本明細書に報告される全ての態様のうちの一態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含むＣＤ２８抗原結合分子は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）。
Ｆａｂドメイン内の修飾
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、（ｂ）ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインがＦａｂ断片であり、Ｆａｂ断片において、可変ドメインＶＨ及びＶＬ、又は定常ドメインＣＨ１及びＣＬのいずれかがＣｒｏｓｓｍａｂ技術に従って交換される、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。
１つの結合アームにドメインの置き換え／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ－ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ－ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号、及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１９１に記載されている。これらの多重特異性抗体は、明確に、第１の抗原に対する軽鎖と、第２の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチにより生じる副産物を減らす（そのようなドメインの置き換えがない手法と比較した場合）。
一態様では、本発明は、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、（ｂ）ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＣＤ２８への特異的結合が可能なＦａｂ断片において、可変ドメインＶＬ及びＶＨが、ＶＨドメインが軽鎖の一部であるとともにＶＬドメインが重鎖の一部であるように、互いに置き換えられている、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。
別の態様では、正しい対合をさらに改善するために、（ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、（ｂ）ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、（ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインとを含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、種々の荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含有し得る。これらの修飾は、交差又は非交差ＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、ＣＬドメインの１つにおいて、位置１２３（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置換されており、位置１２４（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、ＣＨ１ドメインの１つにおいて、位置１４７（ＥＵナンバリング）、及び位置２１３（ＥＵナンバリング）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に関する。特定の一態様では、ＣＤ２８への特異的結合が可能なＦａｂ断片のＣＬドメインでは、１２３位のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がアルギニン（Ｒ）で置換されており、１２４位のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がリジン（Ｋ）で置換されており、ＣＤ２８への特異的結合が可能なＦａｂ断片のＣＨ１ドメインでは、１４７位のアミノ酸（ＥＵナンバリング）及び２１３位のアミノ酸（ＥＵナンバリング）がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている。
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載した二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする１つ又は複数の単離ポリヌクレオチドは、完全な抗原結合分子をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現してもよく、又は同時発現する複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現してもよい。一緒に発現するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗原結合分子を形成してもよい。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現すると、重鎖ポリペプチドは軽鎖ポリペプチドと会合して免疫グロブリンを形成する。いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子全体をコードする。他の態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明による二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
組み換え法
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、例えば、固体ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上記のような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために１つ又は複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定され得る。本発明のある態様において、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。このような方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）に記載の技術を参照。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片であり得る。発現ベクターは、抗体又はそのポリペプチド断片（即ちコード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター、及び／又は他の転写若しくは翻訳調節エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットを含む。ここで使用される「コード領域」は、アミノ酸中に翻訳されたコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸中に翻訳されないが、存在する場合はコード領域の一部であると考えられる。但し、あらゆる隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中（例えば単一のベクター上）に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中（例えば別々の（異なる）ベクター上）に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１つ又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の抗体、若しくはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合している、又は非融合であるいずれかの、異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域には、限定されないが、分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメイン等の特殊な要素又はモチーフが含まれる。作用可能な会合とは、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード領域が遺伝子産物の発現を調節配列の影響又は制御下に置くような方法で、１つ又は複数の調節配列と会合している。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに関連付けられたプロモーター等）は、プロモーター機能の誘導により、所望の遺伝子生成物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子生成物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか、又はＤＮＡテンプレートの転写能力を妨げない場合、「作用可能に会合」されている。したがって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができた場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と作用可能に会合していると思われる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルをポリヌクレオチドと作用可能に会合させて、細胞特異的転写を指示することができる。
適切なプロモーター及び他の転写制御領域がここに開示されている。様々な転写制御領域が当業者に知られている。これには、脊椎動物細胞で機能する、限定されないが、サイトメガロウイルス（例：イントロンＡと組み合わせた最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例：初期プロモーター）及びレトロウイルス（例：ラウス肉腫ウイルスなど）からのプロモーター及びエンハンサーセグメントなどの転写制御領域が含まれる。他の転写調節領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギa－グロビン、及び真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、並びに誘発性プロモーター（例：プロモーター誘発性テトラサイクリン）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる内部リボソーム侵入部位又はＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）等の染色体組み込み要素等の他の特徴を含み得る。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と関連し得る。例えば、抗体又はそのポリペプチド断片の分泌が所望される場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗い小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、通常、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有し、これが、翻訳されたポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態又は「成熟」形態を生成することを承知している。特定の実施態様では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又はそれと操作可能に結合するポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。代替的に、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換され得る。
後の精製（例えばヒスチジンタグ）を容易にするために、又は二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の標識化を補助するために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は末端に含まれ得る。
本発明のさらなる態様では、本発明の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。特定の実施態様では、本発明の１つ又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターには、ポリヌクレオチド及びベクターのそれぞれに関連してここに記載される特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の本発明の抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、これにより形質転換されている、又はこれがトランスフェクションされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製に適しかつ抗原結合分子の発現の補助に適した宿主細胞は、当技術分野でよく知られている。このような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターをトランスフェクトされるか又は形質導入されてもよく、大量のベクターを含む細胞は、増殖させて大規模発酵槽に播種し、臨床応用に十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞は、原核微生物、例えば大腸菌、又は種々の真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞等を含む。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でないとき、細菌中で生成され得る。発現後、ポリペプチドを細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離し、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的に又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２， １４０９－１４１４ （２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４， ２１０－２１５ （２００６）を参照。
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株が同定されており、これらは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用され得る。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、及び第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株が有用であり得る。他の有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６， ５９ （１９７７）に記載の２９３又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３， ２４３－２５１ （１９８０）に記載のＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３， ４４－６８ （１９８２）に記載）；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及び骨髄腫細胞株、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質生産に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２４８ （Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）， ｐ． ２５５－２６８ （２００３）を参照のこと。宿主細胞には、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれるが、数例を挙げると、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内に含まれる細胞も含まれる。ある実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。これら系で外来遺伝子を発現させるための標準的な技術は、当技術分野で既知である。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された産物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方も発現するように工学的に操作することができる。
一態様では、本発明の抗体又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下で、本明細書で提供される本発明の抗体又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明の抗体又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収すること、を含む、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を産生する方法が提供される。
特定の態様では、抗原結合分子の一部を形成するＥｐＣＡＭ（例えば、Ｆａｂ断片）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインは、少なくとも抗原への結合が可能な免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然に存在するか又は天然に存在しない抗体及びその断片の一部を形成することができ、かつそれらに由来し得る。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８を参照されたい）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え的に生産することも、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）。
任意の動物種の免疫グロブリンを本発明で使用することができる。本発明において有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトへの使用を意図したものである場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラ形態の免疫グロブリンを使用してもよい。免疫グロブリンのヒト化形態又は完全なヒト形態は、当該技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに対する米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）。ヒト化は、限定されないが、（ａ）重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要なもの）を保持しつつ、又は保持せずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用にとって重要な残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片でそれらを「クローキング」することを含め、種々の方法によって達成されてもよい。ヒト化抗体及びそれらの作製方法は、例えばＡｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ， Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３， １６１９－１６３３ （２００８）に総説され、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２， ３２３－３２９ （１９８８）； Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６， １００２９－１００３３ （１９８９）； 米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号； Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１， ５２２－５２５ （１９８６）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１， ６８５１－６８５５ （１９８４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ， Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４， ６５－９２ （１９８８）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， １５３４－１５３６ （１９８８）； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３）， １６９－２１７ （１９９４）； Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６， ２５－３４ （２００５） （ＳＤＲ （ａ－ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８， ４８９－４９８ （１９９１） （「リサーフェシング」を記述）； Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６， ４３－６０ （２００５） （「ＦＲシャッフリング」を記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６， ６１－６８ （２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３， ２５２－２６０ （２０００） （ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）でさらに記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の種々の技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は一般的にｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５， ３６８－７４ （２００１） 及びＬｏｎｂｅｒｇ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０， ４５０－４５９ （２００８）に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、かつ、そのような抗体から得ることができる（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ． ５１－６３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３， １１１７－１１２５ （２００５）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することにより生成され得る（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８， １－３７ （Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， ２００１）；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４８， ５５２－５５４； Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２， ６２４－６２８ （１９９１）を参照）。ファージは、一般的には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片として、抗体断片を提示する。
特定の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子に含まれる抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例を参照されたい）又は米国特許第２００４／０１３２０６６号に開示される方法に従って、結合親和性が増強されるように操作される。特定の抗原決定基に対する本発明の抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７， ３２３－３２９ （２０００））及び古典的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８， ２１７－２２９ （２００２））によって測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、そのような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば、線状エピトープ又は立体配座エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示の方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原を、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートする。第２の抗原結合分子は、ハイブリドーマ上清中に存在していてもよい。対照として、固定化された抗原を、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でのインキュベーション後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化抗原に関連付けられる標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、対照試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）を参照されたい。
本明細書に記載のとおりに調製される本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等の、当該技術分野にて周知の技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、正味の電荷、疎水性、親水性等といった要因に部分的に依存し、当業者には明らかであろう。親和性クロマトグラフィー精製のために、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗原結合分子を親和性クロマトグラフィー精製するために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続的なプロテインＡ又はＧ親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるように、抗原結合分子を単離するために使用され得る。ＣＤ２８抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む、多種多様の周知の分析技術のいずれかにより測定することができる。例えば、実施例にて記載のとおりに発現するＣＤ２８抗原結合分子は、還元型、及び非還元型ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより示されるように、インタクトであり、適切に集合したことが示された。
アッセイ
本明細書提供される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の物理的／化学的性質、及び／又は生物活性を、当該技術分野において公知の様々なアッセイにより識別、スクリーニング、又は特性決定することができる。
１．親和性アッセイ
対応する標的に対する本明細書で提供される抗原結合分子の親和性は、Ｐｒｏｔｅｏｎ機器（Ｂｉｏ－ｒａｄ）等の標準的な機器、及び組換え発現によって得られ得るもの等の受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施例に記載の方法に従って決定することができる。標的細胞抗原に対するＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子の親和性もまた、Ｐｒｏｔｅｏｎ機器（Ｂｉｏ－ｒａｄ）などの標準的な計装、及び、例えば組み換え発現により入手可能である、受容体又は標的タンパク質を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定することができる。一態様によれば、ＫＤは、Ｐｒｏｔｅｏｎ（登録商標）機（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用い、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される。
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の、対応する受容体を発現する細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように修飾された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）が結合アッセイに使用される。
さらなる態様では、ＥｐＣＡＭを発現するがん細胞株を使用して、この標的細胞抗原への二重特異性抗原結合分子の結合を実証した。
３．活性アッセイ
一態様では、生物活性を有するＣＤ２８抗原結合分子を特定するためのアッセイが提供される。生物学的活性としては、例えば、実施例２に記載の方法で測定したＴ細胞増殖及びサイトカイン分泌、又は腫瘍細胞死滅を挙げることができる。ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏでそのような生物活性を有する抗原結合分子も提供される。
医薬組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、以下の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書で提供される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかを含む医薬組成物を提供する。一実施態様では、医薬組成物は、本明細書で提供される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、及び少なくとも１つの薬学的に許容される添加物を含む。別の態様では、医薬組成物は、本明細書で提供される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかと、例えば後述する少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される添加物に溶解又は分散した、治療有効量の１つ又は複数の二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応又は他の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つの二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、及び任意に追加の有効成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に援用されているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０により例示されているように、本開示の見地から当業者に既知であろう。特に、組成物は、凍結乾燥された製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される添加物」としては、当業者には知られているだろうが、任意及び全ての溶媒、バッファー、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張性剤、塩類、安定化剤及びこれらの組合せが挙げられる。
非経口組成物には、注射による投与、例えば、皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、水溶液中で配合されてもよく、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えば、Ｈａｎｋｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ溶液又は生理食塩水バッファー中で配合されてもよい。溶液は、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの調合剤を含んでもよい。或いは、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は使用前に、好適なビヒクル、例えば発熱性物質除去水と共に構成するための、粉末形態であることができる。滅菌注射可能溶液は、必要な場合には以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の融合タンパク質を必要な量で、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁液又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、既に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の追加の所望な成分の粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要な場合には適切に緩衝されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全なレベルで、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満で最小限に維持されるべきであることが理解される。薬学的に許容される好適な添加物には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ－タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる化合物（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストラン等）を含んでいてもよい。任意に、懸濁液は、好適な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を高める薬剤も含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油注射懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。
活性成分は、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション法又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）に開示される。徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム又はマイクロカプセル等の成型物品の形態である。特定の実施態様において、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせ）の組成物での使用によってもたらされてもよい。本発明の例示的な薬学的に許容される添加物は、さらに、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。１つの態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせる。例示的な凍結乾燥した抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載される。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤には、ヒスチジン－酢酸バッファーが含まれる。上述した組成物に加えて、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をデポー調製物として製剤化することも可能である。そのような徐放性調製物は、移植（例えば、皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、適切なポリマー又は疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂を用いて、又はやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として配合されてもよい。
本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。医薬組成物は、１つ又は複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、添加物又はタンパク質を医薬として使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を用い、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態で、組成物に配合されることができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は塩酸又はリン酸等の無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸又はマンデル酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。また、遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩基に由来し得る。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。本発明の組成物は、治療される特定の徴候に必要な１種類より多い有効成分も含んでいてもよく、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含んでいてもよい。かかる有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般に、滅菌のものである。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。
治療方法及び組成物
本明細書において提供する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかを、単独で又は組み合わせて、治療方法にて使用することができる。
一態様では、医薬としての使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、がんの治療における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の態様では、治療の方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本明細書では、がんを有する個体を治療する方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、方法が、有効量のスーパーアゴニストＣＤ２８抗原結合分子を個体に投与することを含む、二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子が提供される。そのような一実施態様では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。
一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、ＥｐＣＡＭ発現がん細胞の増殖を阻害における使用のためのものである。したがって、特定の態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、ＥｐＣＡＭを発現するがんの治療における使用のためのものである。このようなＥｐＣＡＭを発現するがんには、例えば、乳がん、肺がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、結腸がん、食道がん、気管がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、子宮がん、直腸がん、若しくは小腸がん、膵臓がん、若しくはその他の上皮がん、又はそれらに伴う転移が含まれる。特定の一態様では、ＥｐＣＡＭを発現するがんは、上皮がん又は扁平上皮がんである。別の態様では、ＥｐＣＡＭを発現するがんは、乳がん、肺がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、結腸がん、食道がん、気管がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、子宮がん、直腸がん、膵臓がん、又は小腸がんから選択される。
特定の態様では、治療の方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の態様では、本明細書では、がんを有する個体を治療する方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、方法が、有効量のスーパーアゴニストＣＤ２８抗原結合分子を個体に投与することを含む、二重特異性ＣＤ２８抗原結合分子が提供される。別の態様では、、有効量の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を個体に投与することを含む、ＥｐＣＡＭ発現がん、特に上皮がん若しくは扁平上皮がん、又は乳がん、肺がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、結腸がん、食道がん、気管がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん、子宮がん、直腸がん、膵臓がん、若しくは小腸がんから選択されるがんを有する個体を治療する方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。そのような一実施態様では、本方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む。
さらなる態様では、本明細書において、医薬の製造又は調製における、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の使用のために提供される。一実施態様では、医薬は、がん、特にＥｐＣＡＭを発現するがんの治療のためのものである。さらなる態様では、医薬は、がんを治療する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、方法における使用のためのものである。そのような１つの態様において、その方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療薬、例えば、下記に記載されるようなものを個体に投与することをさらに含む。別の態様では、医薬は、ＥｐＣＡＭを発現するがんの治療のためのものである。さらなる態様では、医薬は、がん、特にＥｐＣＡＭを発現するがんを治療する方法であって、がんを有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、方法における使用のためのものである。さらなる態様では、がん、特にＥｐＣＡＭを発現するがんを治療するための方法が本明細書で提供される。一態様では、本方法は、がんを有する個体に有効量の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を投与する工程を含む。そのような１つの態様において、その方法は、下記に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療薬を個体に投与することをさらに含む。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。
さらなる態様では、例えば上記の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書に報告する二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかを含む医薬製剤が本明細書で提供される。一態様では、医薬製剤は、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、医薬製剤は、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子のいずれか、及び少なくとも１つの追加の治療剤を含む。
本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて治療に使用することができる。例えば、本明細書に記載されるような二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与され得る。したがって、がん免疫療法における使用のための本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。特定の実施態様では、がん免疫療法の方法における使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。上記の態様のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
上述のそのような併用療法は、併用投与（同じ又は別個の製剤中に２つ以上の治療剤が含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、本明細書に報告される抗体の投与は、追加の１つ又は複数の治療剤合の投与前、投与と同時に、及び／又は投与後に行われ得る。一態様では、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の投与、及び追加の治療剤の投与は互いに、約１ヶ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に生じる。
本明細書に報告される抗原結合分子（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療のために所望される場合、病変内投与を含む、任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期か又は長期かに部分的に依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射により行うことができる。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない種々の投薬スケジュールが企図される。
本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、良好な医療行為と一致した様式で、製剤化され、投薬され、投与され得る。これに関連して考慮すべき要因としては、治療特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、必ずしもではないが、任意に、問題の障害を予防又は治療するために同時に使用する１つ又は複数の薬剤と共に、製剤化される。有効量のそのような他の薬剤は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類、及び上述の他の要因に依存する。そのような他の薬剤は、一般的には本明細書に記載されているのと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載の用量の約１から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路で使用される。
疾患の予防又は治療のために、本明細書に記載される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の適切な投薬量は（単独で又は１つ又は複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用されるとき）、治療対象の疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療法、患者の病歴、抗体への反応、並びに主治医の裁量によって決定されることになる。二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、一度に、又は一連の治療にまたがり、患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じ、例えば、１回又は複数回の個別投与、又は連続点滴にかかわらず、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が、患者への投与への最初の候補投与量となり得る。上記の要因に応じて、典型的な１日あたりの投薬量は、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である可能性がある。数日間又はそれ以上にわたる反復投与の場合、治療は通常、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）のうちの１つ又は複数の用量が、患者に投与され得る。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。最初のより高い負荷用量、続いて１回以上のより低い用量を投与することができる。しかしながら、他の投与レジメンが有用であってもよい。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
他の薬剤及び治療
前述のように、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の抗原結合分子は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与されてもよい。「治療剤」という用語は、このような治療が必要な個体において、症状又は疾患を治療するために投与することが可能な任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した任意の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含み得る。特定の実施態様では、さらなる治療剤は、別の抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。特定の態様では、追加の治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞毒性剤若しくは細胞増殖抑制、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感度を高める薬剤である。
したがって、がんの治療おける使用のための本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又はそれらを含む医薬組成物が提供され、二重特異性抗原結合分子は、がん免疫療法における使用のための化学療法剤、放射線及び／又は他の薬剤と組み合わせて投与される。
そのような他の薬剤は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。有効量のそのような他の薬剤は、使用される融合タンパク質の量、障害又は治療の種類、上述の他の因子に依存する。本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体は通常、本明細書に記載される同一用量及び投与経路、若しくは本明細書で記載される１～９９％の用量、又は実験的／臨床的に適切と測定される任意の用量及び任意の経路で使用される。上記のこうした併用療法は、併用投与（同じ又は別々の組成物に２種以上の治療剤が含まれている）及び単独投与（これは、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時、及び／又は投与後に本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体の投与が起こり得る）を包含する。
さらなる態様では、がん、特にＥｐＣＡＭを発現するがんの治療における使用のための上述した本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、別の免疫調節薬と組み合わせて投与される二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子が提供される。「免疫調節剤」という用語は、免疫系に影響を与えるモノクローナル抗体を含む任意の物質を指す。本発明の分子は、免疫調節剤と見なすことができる。免疫調節剤は、がんの治療のための抗腫瘍剤として使用され得る。一態様では、免疫調節剤としては、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ又はペンブロリズマブ）、ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ又はデュルバルマブ）、ＯＸ－４０抗体、４－１ＢＢ抗体及びＧＩＴＲ抗体が挙げられる。上述のこのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療薬が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、二重特異性抗原結合分子の投与は、さらなる治療薬剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行われてもよい。
Ｔ細胞二重特異性抗体との組み合わせ
一態様では、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与され得る。Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、腫瘍関連抗原、例えば癌胎児抗原（ＣＥＡ）、又はヒト主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）の抗原、例えば、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）、又はＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４のようなＴ細胞エピトープに特異的である。
特定の態様では、併用における使用のための抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１４９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１５０のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号１５１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号１５２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１５３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１５４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。より詳しくは、抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号１５６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号１５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
別の態様では、併用における使用のための抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１７０のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１７１のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号１７２のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号１７３のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１７４のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１７５のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含むより詳しくは、抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１７６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号１７７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号１７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
別の態様では、併用における使用のための抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１７８のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１７９のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号１８０のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号１８１のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１８２のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１８３のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含むより詳しくは、抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号１８４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号１８５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号１８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
別の態様では、併用における使用のための抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２７７のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２７８のＣＤＲ－Ｈ２配列及び配列番号２７９のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、並びに／又は配列番号２８０のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号２８１のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号２８２のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含むより詳しくは、抗ＣＤ３二重特異性は、配列番号２８３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号２８４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む第１の抗原結合ドメインを含む。さらなる態様では、抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ３）、及び／又は配列番号２８４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ３）を含む。
一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた投与に適している。
特定の一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１５７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１５８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１５９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号１６０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。さらに特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号１５７のポリペプチド配列、配列番号１５８のポリペプチド配列、配列番号１５９のポリペプチド配列及び配列番号１６０のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡ ＣＤ３ ＴＣＢ）。
別の一態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１６１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１６２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号１６３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、及び配列番号１６４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。さらに特定の実施態様では、二重特異性抗体は、配列番号１６１のポリペプチド配列、配列番号１６２のポリペプチド配列、配列番号１６３のポリペプチド配列及び配列番号１６４のポリペプチド配列を含む（ＣＥＡＣＡＭ５ ＣＤ３ ＴＣＢ）。
特定の二重特異性抗体は、ＰＣＴ出願国際公開第２０１４／１３１７１２号Ａ１にさらに記載されている。さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体はまた、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））を含み得る。さらなる態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、国際公開第２００７／０７１４２６号又は国際公開第２０１４／１３１７１２号に記載される二重特異性抗体である。
一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体はヒト主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）の抗原に特異的であり、例えば抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた投与に適している。
一態様では、抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＨＬＡ－Ｇ）、及び／又は配列番号２９２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＨＬＡ－Ｇ）を含む。特定の一態様では、抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２９３の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号２９４の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号２９５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の２つのポリペプチド、及び配列番号２９６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。さらなる特定の態様では、二重特異性抗体は、配列番号２９３のポリペプチド配列、配列番号２９４のポリペプチド配列、配列番号２９５の２つのポリペプチド配列及び配列番号２９６のポリペプチド配列を含む（ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ）。
一態様では、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４などのＴ細胞エピトープに特異的であり、例えば抗ＭＡＧＥ－Ａ４／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。一態様では、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、抗ＭＡＧＥ－Ａ４／抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせた投与に適している。
一態様では、抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号３０３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＭＡＧＥ－Ａ４）、及び／又は配列番号３０４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＭＡＧＥ－Ａ４）を含む。特定の一態様では、抗ＭＡＧＥ－Ａ４／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号３０５の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号３０６の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチド、配列番号３０７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の２つのポリペプチド、及び配列番号３０８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のポリペプチドを含む。さらなる特定の態様では、二重特異性抗体は、配列番号３０５のポリペプチド配列、配列番号３０６のポリペプチド配列、配列番号３０７の２つのポリペプチド配列及び配列番号３０８のポリペプチド配列を含む（ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢ）。
一態様において、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は全長抗体である。一態様において、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、ヒトＩｇＧクラスの抗体、特にヒトＩｇＧ１クラスの抗体である。一態様において、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、抗体断片、特にＦａｂ分子又はｓｃＦｖ分子、より詳しくはＦａｂ分子である。特定の態様において、ＣＤ３に特異的に結合する抗体は、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換されている（すなわち、互いに置き換えられる）クロスオーバーＦａｂ分子である。一態様において、ＣＤ３に特異的に結合する抗体はヒト化抗体である。
別の態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子と、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と、を含む組み合わせ製品が提供される。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。一態様では、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗ＭＡＧＥ－Ａ４／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。
ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤との組み合わせ
一態様では、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤、例えばＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ－１結合アンタゴニスト、特に抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与され得る。
一態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。ＣＤ２７４又はＢ７－Ｈ１としても知られている「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源に由来する任意の天然ＰＤ－Ｌ１（特に、「ヒトＰＤ－Ｌ１」）を指す。完全ヒトＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ９ＮＺＱ７（配列番号１８６）に示されている。「ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－Ｌ１とその結合パートナーのうちのいずれか１つ又は複数、例えば、ＰＤ－１、Ｂ７－１との相互作用に起因するシグナル伝達を低減する、遮断する、阻害する、消失させる、又は妨害する分子を指す。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様は、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１及び／又はＢ７－１への結合を阻害する。いくつかの態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、並びにＰＤ－Ｌ１と、ＰＤ－１、Ｂ７－１等のその結合パートナーの１つ又は複数との相互作用に起因するシグナル伝達を低減、遮断、阻害、抑止、又は妨害する他の分子を含む。一態様では、ＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニストは、機能不全のＴ細胞を機能不全にしないようにする（例えば、抗原認識に対するエフェクター応答を増強する）ように、ＰＤ－Ｌ１を介するシグナル伝達を介してＴリンパ球上で発現される細胞表面タンパク質によって又はそれを介して媒介される負の共刺激性シグナルを低減する。特に、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗体」、又は「ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体」、又は「アゴニスト抗ＰＤ－Ｌ１」という用語は、１．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では、１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性で、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）等の標準的な結合アッセイを用いて測定される。特定の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）及びＭＤＸ－１１０５からなる群より選択される。具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、本明細書に記載のＭＤＸ－１１０５である。さらに別の具体的な態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）である。なおさらなる態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）である。より詳しくは、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤はアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１８７の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ－１）及び配列番号１８８の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ－１）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１８９の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤＬ－１）及び配列番号１９０の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤＬ－１）を含む抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。
ＣＤ２７９、ＰＤ１又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる「ＰＤ－１」という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意の天然ＰＤ－Ｌ１、特にＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ１５１１６（配列番号１９１）に示されるアミノ酸配列を有するヒトタンパク質ＰＤ－１を指す。「ＰＤ－１結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ－１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子を指す。いくつかの実施態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ２への結合を阻害する。いくつかの実施態様では、ＰＤ－１結合アンタゴニストは、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方への結合を阻害する。特に、ＰＤ－Ｌ１結合拮抗剤は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。用語「抗ＰＤ－１抗体」又は「ヒトＰＤ－１に結合する抗体」又は「ヒトＰＤ－１に特異的に結合する抗体」又は「アンタゴニスト抗ＰＤ－１」は、１．０×１０－８ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値、一態様では１．０×１０－９ｍｏｌ／ｌ以下のＫＤ値の結合親和性でヒトＰＤ１抗原に特異的に結合する抗体を指す。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標），ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）等の標準的な結合アッセイを用いて測定される。一態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、抗ＰＤ－１抗体である。具体的な態様では、抗ＰＤ－１抗体は、ＭＤＸ１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ－３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ－０１１（ピディリズマブ）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、及びＢＧＢ－１０８からなる群より、特にペンブロリズマブ及びニボルマブから選択される。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１９２の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ－１）及び配列番号１９３の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ－１）を含む抗ＰＤ－１抗体である。別の態様では、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤は、配列番号１９４の重鎖可変ドメインＶＨ（ＰＤ－１）及び配列番号１９５の軽鎖可変ドメインＶＬ（ＰＤ－１）を含む抗ＰＤ－１抗体である。
別の態様では、本明細書に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子と、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用を遮断する薬剤、例えばＰＤ－Ｌ１結合アンタゴニスト又はＰＤ－１結合アンタゴニスト、特に抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と、を含む組み合わせ製品が提供される。
上述のそのような併用療法は、併用投与（同じ又は別個の製剤中に２つ以上の治療剤が含まれる）及び別個の投与を包含し、別個の投与の場合、治療剤の投与は、追加の１つ又は複数の薬剤の投与前、投与と同時に、及び／又は投与後に行うことができる。一実施態様において、治療剤の投与及び追加の治療剤の投与は、互いの約１ヶ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行われる。
製造品
本発明の別の態様において、上述の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に挿入されるか、又は容器に付随するラベル又はパッケージ添付文書とを備えている。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、症状の治療、予防、及び／又は診断に有効な、単独の又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針により穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）製造品中に含有され、本発明の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を含む組成物を含む第１の容器、及び、（ｂ）製造品中に含有され、さらなる細胞傷害性の又は別の治療剤を含む組成物を含む第２の容器を含んでよい。本発明のこの実施態様における製造品は、特定の症状を治療するために上記組成物が使用可能であることを示す添付文書をさらに備えてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器をさらに備えていてもよい。本製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに備えてもよい。
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ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は：Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ （１９９１）に記載される。抗体鎖のアミノ酸は、上に定義したようなＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））によるナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、参照される。
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる： Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２．
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子合成
必要な場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用してＰＣＲにより生成したか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（ドイツ国レーゲンスブルク）又はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（米国ニュージャージー州）で合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって測定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を使用して設計された。
細胞培養技術
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２０００）， Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ， Ｊ．Ｓ．， Ｄａｓｓｏ， Ｍ．， Ｈａｒｆｏｒｄ， Ｊ．Ｂ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｊ． ａｎｄ Ｙａｍａｄａ， Ｋ．Ｍ． （ｅｄｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．に記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
タンパク質精製
標準的なプロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔に述べると、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出はｐＨ２．８で達成され、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、ＰＢＳ中、又は２０ｍＭ ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中、単量体抗体から分離させた。モノマー抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ （３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し（必要な場合）、－２０℃又は－８０℃で冷凍し、保存した。試料の一部が、その後のタンパク質分析、及び例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー （ＳＥＣ）又は質量分析による分析的特徴付けのために提供された。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造業者の説明書に従って、使用した。特に、１０％若しくは４～１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ－ＴＲＩＳ Ｐｒｅ－Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル） ランニングバッファーを使用した。
分析サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムの３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）におけるＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ－Ｓｙｓｔｅｍの２×ＰＢＳにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸光度及びピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１-１９０１が標準として機能した。
質量分析法
このセクションでは、正確な組み立てに重点を置いて、ＶＨ／ＶＬ交換を含む多重特異性抗体（ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂ）の特性評価について記載する。脱グリコシル化されたインタクトＣｒｏｓｓＭａｂ及び脱グリコシル化／プラスミン消化ＣｒｏｓｓＭａｂ或いは脱グリコシル化／ＬｙｓＣ限定消化ＣｒｏｓｓＭａｂのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）により、予想される一次構造の解析を行った。
ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂを、Ｎ－グリコシダーゼＦを用い、リン酸又はＴｒｉｓバッファー中、３７℃で最大１７時間、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌで脱グリコシル化した。プラスミン消化又はＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）限定消化を、１００μｇの脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂを用い、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）中で、それぞれ、室温で１２０時間、３７℃で４０分間行った。質量分析の前に、試料を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＨＰＬＣによって脱塩した。合計質量を、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ ｓｏｕｒｃｅ（Ａｄｖｉｏｎ）が取り付けられたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ－ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）でのＥＳＩ－ＭＳによって決定した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用い、それぞれの抗原に対する多重特異性抗体の結合及び結合親和性の決定。
それぞれの抗原に対する、生成した抗体の結合は、ＢＩＡＣＯＲＥ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を用い、表面プラズモン共鳴によって観察された。簡潔には、親和性測定のために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ １０９－００５－０９８抗体を、それぞれの抗原に対する抗体の提示のためにアミンカップリングを介してＣＭ５チップ上に固定化する。結合を、ＨＢＳバッファー（ＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐｈ７．４）、２５℃（又は代替的に３７℃）中で測定する。抗原（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ又は社内精製）を溶液中に様々な濃度で添加した。８０秒～３分の抗原注入により会合を測定し、チップ表面をＨＢＳバッファーで３～１０分間洗浄して解離を測定し、１：１ラングミュア結合モデルを用いてＫＤ値を推定した。システム固有のベースラインドリフトの補正及びノイズシグナル低減のために、試料曲線から陰性対照データ（例えば、緩衝曲線）を差し引く。それぞれのＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを、センサーグラムの分析及び親和性データの計算に使用する。
実施例１
ＣＤ２８及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的とする二重特異性抗原結合分子の生成及び産生
１．１ ＣＤ２８及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
ヒトＣＤ２８抗原のクローニング：
ヒトＣＤ２８Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１０７４７）の細胞外ドメイン（成熟タンパク質のアミノ酸１～１３４）をコードするＤＮＡ断片を、溶解性及び精製タグとして機能するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片をコードする断片の上流で、２つの異なる哺乳動物レシピエントベクターにインフレームで挿入した。発現ベクターの１つはＦｃ領域に「ホール」変異を含み、もう１つは「ノブ」変異を含み、また、Ｃ末端ａｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号８８）はＢｉｒ Ａビオチンリガーゼとの同時発現中に特異的ビオチン化を可能にした。また、両Ｆｃ断片はＰＧ－ＬＡＬＡ変異を含んでいた。Ｆｃノブ鎖のＣ末端に一価ビオチン化ａｖｉタグを有する二量体ＣＤ２８－Ｆｃコンストラクトを得るために、両方のベクターを、ＢｉｒＡビオチンリガーゼをコードするプラスミドと組み合わせて同時トランスフェクトした。
ホットスポットを欠き、親和性が低下したＣＤ２８（ＳＡ）バリアントの作製及び特性評価
配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＬを有するＣＤ２８スーパーアゴニスト抗体（ＳＡ）は、国際公開第２００６／０５０９４９号に記載されている。
不対システイン残基、トリプトファン残基、脱アミド部位の除去及び親和性低下ＣＤ２８（ＳＡ）バリアントの生成
本発明者らの詳細な結合因子の特性評価の一部として、ＣＤ２８（ＳＡ）可変ドメイン配列の計算分析を行った。この分析により、ＶＨのＣＤＲ２領域の不対システイン（５０位、Ｋａｂａｔナンバリング）、ＶＨのＣＤＲ３のトリプトファン残基（１００ａ位、Ｋａｂａｔナンバリング）及びＶＬのＣＤＲ１（３２位、Ｋａｂａｔナンバリング）、並びにＶＨのＣＤＲ２の潜在的なアスパラギン脱アミド部位（５６位、Ｋａｂａｔナンバリング）が明らかになった。トリプトファンの酸化はかなり遅いプロセスであり、還元化合物を添加することによって防止することができるが、抗体可変ドメイン中の不対システインの存在は重要となり得る。遊離システインは反応性であり、他のタンパク質又は細胞若しくは培地の成分の他の不対システインと安定な結合を形成することができる。結果として、これは、潜在的に免疫原性であり、したがって患者にリスクをもたらし得る未知の修飾を有する不均一で不安定な生成物をもたらす可能性がある。これに加え、アスパラギンの脱アミド化並びに結果として生じるイソアスパラギン酸及びスクシンイミドの形成は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性及びｉｎ ｖｉｖｏ生物学的機能の両方に影響を及ぼし得る。親マウス結合因子５．１１Ａの結晶構造分析により、Ｃ５０はヒトＣＤ２８への結合に関与せず、したがってＣＤ２８に対する親和性に影響を与えることなくセリン等の類似のアミノ酸で置換できることが明らかになった。しかしながら、５０位のトリプトファン残基及びアスパラギンの両方は、結合界面に近いか又はそれに関与し、したがって、類似のアミノ酸による置換は、結合親和性の低下をもたらし得る。この実施例では、本発明者らは、以下の理由のために、ヒトＣＤ２８に対するＣＤ２８（ＳＡ）の親和性を低下させることを特に目的とした：ＣＤ２８（ＳＡ）の親和性は１～２ｎＭの範囲内であり、結合半減期は約３２分である。この強い親和性は、患者に静脈内注射した場合、血液及びリンパ組織等の大量のＣＤ２８発現細胞を含有する組織においてシンク効果（ｓｉｎｋ ｅｆｆｅｃｔ）をもたらし得る。結果として、標的化成分を介した化合物の部位特異的標的化が低下し得、コンストラクトの有効性が低下し得る。そのような効果を最小限に抑えるために、いくつかのＶＨ及びＶＬバリアントを生成して、親和性を異なる程度に低下させた（図２Ａ及び図２Ｃ）。潜在的な安定性ホットスポットを表す前述の位置に加えて、ヒトＣＤ２８への結合に直接的又は間接的に関与するさらなる残基は、元のマウス生殖系列アミノ酸又は類似のアミノ酸のいずれかによって置き換えられた。さらに、ＣＤ２８（ＳＡ）ＶＬ及びＶＨの両方のＣＤＲも、トラスツズマブのそれぞれのフレームワーク配列にグラフトした（図２Ｂ及び２Ｄ）。次いで、ＶＨ及びＶＬバリアントのいくつかの組み合わせを一価の１アーム抗ＣＤ２８ ＩｇＧ様コンストラクトとして発現させ、結合をＳＰＲによって特性評価した。
ＳＰＲによる還元型１アーム抗ＣＤ２８バリアントの解離速度定数（ｋ ｏｆｆ ）の分析
第１の工程で抗ＣＤ２８結合バリアントを特性評価するため、全ての結合因子を一価の１アームＩｇＧ様コンストラクトとして発現させた（図１Ａ）。このフォーマットを、１：１モデルにおいてＣＤ２８への結合を特性評価するために選択した。ＨＥＫ細胞へのトランスフェクションの５日後、上清を回収し、発現したコンストラクトの力価を決定した。
抗ＣＤ２８結合因子バリアントの解離速度を、ニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定化されたビオチン化ｈｕＣＤ２８－Ｆｃ抗原を用いて２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。組換え抗原（リガンド）の固定化のため、ｈｕＣＤ２８－ＦｃをＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム ｐＨ ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０からなるＴｗｅｅｎ ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で１００～５００ｎＭの範囲の濃度に希釈し、次いで、様々な接触時間で２５μｌ／分で注入した。これにより、垂直配向で１０００～３０００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルが得られた。
ワンショット反応速度測定では、注入方向を水平配向に変更した。産生された上清の力価に基づいて、一価の１アームＩｇＧをＰＢＳＴで希釈して、１００ｎＭ～６．２５ｎＭの範囲の２倍希釈系列を得た。注入は、１２０秒の会合時間及び３００秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って５０μｌ／分で同時に行った。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿ってバッファー（ＰＢＳＴ）を注入した。結合相互作用は、精製及び生化学的特性評価をせずに上清からの一価の１アームＩｇＧを用いて測定したため、タンパク質：タンパク質相互作用のオフレートのみをさらなる結論に使用した。解離センサーグラムを適合させることによって、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１対１ラングミュア結合モデルを使用して、解離速度を計算した。全てのクローンの解離速度定数（ｋｏｆｆ）値を表１に要約する。産生されたバリアントの比較により、ｋｏｆｆ値が親配列と比較して最大３０倍減少することが明らかになった。
Figure 2024522340000053
Figure 2024522340000054
ヒトＣＤ２８への結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように修飾された親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－６１）を用いて試験した。結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳバッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）に２．５×１０５／ｍｌで再懸濁した。５×１０４個の細胞を、漸増濃度のＣＤ２８結合因子（１ｐＭ～１００ｎＭ）と共に４℃で２時間、丸底９６ウェルプレートにおいてインキュベーションした。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、ＰＥコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ、カタログ番号１０９－１１６－０９８）と共に４℃でさらに６０分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、遠心分離し、１００ｕｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。構築物と細胞との間の非特異的結合相互作用をモニターするために、抗ＤＰ４７ ＩｇＧを陰性対照として含めた。結合を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ、ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ ６を用いて結合曲線を得た。図３Ａ～３Ｃからわかるように、一価の１アームＩｇＧ様ＣＤ２８バリアントコンストラクトは、結合の違いを示した。
ＣＤ２８及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃドメインにおいて、国際特許出願国際公開第２０１２／１３０８３１に記載の方法に従い、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異（ＰＧ－ＬＡＬＡ）を、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。二重特異性抗体の作製のために、Ｆｃ断片は、重鎖の誤対合を回避するための「ノブ」変異（Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異、ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）又は「ホール」変異（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによるＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異）のいずれかを含有した。二重特異性抗原結合分子における軽鎖の誤対合を回避するために、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／Ｃカッパドメインの交換を１つの結合部分に導入した（ＣｒｏｓｓＦａｂ技術）。国際特許出願の国際公開第２０１５／１５０４４７号に記載されるように、別の結合部分において、電荷をＣＨ１ドメイン及びＣカッパドメインに導入した。
抗ＥｐＣＡＭ抗体ＭＴ２０１（アデカツムマブ）の作製及び調製は、米国特許第７，６３２，９２５号Ｂ２に記載されている。抗ＥｐＣＡＭ抗体３－１７ｌの作製については、例えば交際公開第２０１０１４２９９０ Ａ１号に記載されている。ｓｃＦｖ及びＩｇＧ１フォーマットの３－１７ｌのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列（並びにそのＶＨ配列及びＶＬ配列）は、例えば国際公開第２０１０１４２９９０ Ａ１号の表１及び図１に開示されている。抗ＥｐＣａｍ ｓｃＦｖ断片４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ並びにそのＶＨ配列及びＶＬ配列の作製は、Ｗｉｌｌｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９９， ５９（２２）， ５７５８－５７６７に記載されている。抗マウスＥｐＣＡＭ抗体（抗ｍｕ ＥｐＣＡＭ）を含む二重特異性抗原結合分子も調製した。抗ＣＤ２８抗体ｍａｂ １４２２６Ｐ２の作製及び調製は、国際公開第２０２０／１３２０６６ Ａ１号に記載されている。
以下の分子をクローニングし、その概略図を図１Ｂ又は１Ｃに示す：
分子Ａ：ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）１＋１フォーマット、配列番号９３及び９６の重鎖アミノ酸配列と、配列番号９４及び９７の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＥ９０５１）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換、及びＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｂ）。
分子Ｂ：ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１フォーマット、配列番号９１及び９６の重鎖アミノ酸配列と、配列番号９２及び９７の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＦ５２９６）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換、及びＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｂ）。
分子Ｃ：ＥＰＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号７４及び９８の重鎖アミノ酸配列と、配列番号８３及び９９の軽鎖アミノ酸配列とを含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）における荷電修飾、及びＥＰＣＡＭ Ｆａｂ断片（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｃ）。
分子Ｄ：ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号９１及び１００の重鎖アミノ酸配列と、配列番号９２及び１０１の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＦ５９７４）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換、及びＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｂ）。
分子Ｅ：ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号７４及び１０２の重鎖アミノ酸配列と、配列番号８３及び１０３の軽鎖アミノ酸配列とを含む、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）における荷電修飾、及びＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）Ｆａｂ断片（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｃ）。
分子Ｆ：ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号９１及び１０４の重鎖アミノ酸配列と、配列番号９２及び１０５の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＦ５９８０）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換、及びＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｂ）。
分子Ｇ：ＥＰＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号７４及び１０６の重鎖アミノ酸配列と、配列番号８３及び１０７の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＧ１８１０）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）における荷電修飾、及びＥＰＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ） Ｆａｂ断片（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｃ）。
分子Ｈ（比較用）：ＣＤ１９（８Ｂ８－２Ｂ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）における荷電修飾、及びＣＤ１９（２Ｂ１１）Ｆａｂ断片（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｃ）。この分子は、配列番号７４及び１０８の重鎖アミノ酸配列と、配列番号８３及び１０９の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＦ０１７５）。
分子Ｉ：ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）１＋１フォーマット、配列番号９３及び１００の重鎖アミノ酸配列と、配列番号９４及び１０１の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＧ１６６２）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換、及びＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｂ）。
分子Ｊ：ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）１＋１、配列番号７６及び１０６の重鎖アミノ酸配列と、配列番号８２及び１０７の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＧ１８１１）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）Ｆａｂ断片（ノブ）における荷電修飾、及びＥＰＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ） Ｆａｂ断片（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｃ）。
分子Ｋ：ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）１＋１、配列番号９３及び１０４の重鎖アミノ酸配列と、配列番号９４及び１０５の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＧ１６６３）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換、及びＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｂ）。
分子Ｌ： ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ｍａｂ １４２２６Ｐ２）１＋１、配列番号１０６及び２０１の重鎖アミノ酸配列と、配列番号１０７及び２０２の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＧ１８１２）、ＣＤ２８（ｍａｂ １４２２６Ｐ２）Ｆａｂ断片（ノブ）における荷電修飾、及びＥＰＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ） Ｆａｂ断片（ホール）におけるＶＨ／ＶＬ交換を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｃ）。
分子Ｍ： ＥｐＣＡＭ（抗ｍｕ ＥｐＣＡＭ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１、配列番号９１及び２０３の重鎖アミノ酸配列と、配列番号９２及び２０４の軽鎖アミノ酸配列とを含む（Ｐ１ＡＦ５９８３）、ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）Ｆａｂ断片（ノブ）におけるＶＨ／ＶＬ交換、及びＥｐＣＡＭ（ａ）Ｆａｂ断片（ホール）における荷電修飾を有する、二重特異性ｈｕＩｇＧ１ ＰＧ－ＬＡＬＡ ＣｒｏｓｓＦａｂ分子（図１Ｂ）。
１．２ ＣＤ２８及びＥｐＣＡＭを標的とする二重特異性抗原結合分子の産生
上記の分子の発現は、キメラＭＰＳＶプロモーター又はＣＭＶプロモーターのいずれかによって引き起こされる。ポリアデニル化は、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列によって引き起こされる。これに加え、各ベクターは、常染色体複製のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
抗体及び二重特異性抗体を、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞への一過性トランスフェクションにより作製した。細胞を遠心分離し、培地を、予熱したＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製、カタログ番号１０７４３０２９）に交換した。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号２３９６６－１）を添加し、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２Ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合し、フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気の振とうインキュベーター内で、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、補充物を含むＥｘｃｅｌｌ培地（総容積の８０％）を添加した（Ｗ． Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ． Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ， Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ， ＤＯＩ： １０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９； ２０１４）。トランスフェクションの１日後、補充物（Ｆｅｅｄ、総容積の１２％） を添加した。７日後に、遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
代替的には、本明細書に記載の抗体及び二重特異性抗体は、Ｅｖｉｔｒｉａ社により、独自のベクター系と従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を使用し、懸濁適応ＣＨＯ Ｋ１細胞（もともとＡＴＣＣから譲り受け、Ｅｖｉｔｒｉａ社で懸濁培養液中での無血清培養に適応させたもの）を用いて調製された。産生にあたっては、Ｅｖｉｔｒｉａ社は、独自の動物成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）と独自のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離及びその後の濾過（０．２μｍフィルタ）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
１．３ ＣＤ２８及びＥｐＣＡＭを標的とする二重特異性抗原結合分子の精製
標準的なプロトコルを参照して、フィルタにかけた細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡単に説明すると、Ｆｃ含有タンパク質を、プロテインＡ－アフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した（平衡化バッファー：２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファー：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ ３．０）。溶出はｐＨ ３．０ で達成され、続いて直ちに試料のｐＨが中和された。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５（Ａｒｔ．Ｎｒ．： ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
１．４ ＣＤ２８及びＥｐＣＡＭを標的とする二重特異性抗体の分析データ
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３に従ったアミノ酸配列に基づき計算した質量減衰係数を用いて、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を測定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（パーキンエルマー）（パーキンエルマー）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下にて、ＣＥ－ＳＤＳにより、タンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集体含量の測定は、ランニングバッファー（それぞれ、２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ ６．２、０．０２％ ＮａＮ３又は２５ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｌ－アルギニンモノヒドロクロリド、ｐＨ ６．７、又は２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ ６．２）中で平衡化した分析サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００）を使用して、２５℃でのＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。全ての分子の精製パラメータの概要を表２に示す。
Figure 2024522340000055
実施例２
ＥｐＣＡＭを標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的特性評価
初代ヒトＰＢＭＣを用いていくつかの細胞ベースのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体によって提供されるＴＣＲシグナルの存在下及び非存在下におけるＣＤ２８（ＳＡ）及び二重特異性ＥｐＣＡＭ標的化ＣＤ２８抗原結合分子の活性を評価した。フローサイトメトリー、サイトカインＥＬＩＳＡ及び生細胞イメージングによって決定されるＴ細胞増殖、サイトカイン分泌及び腫瘍細胞死滅を読み出し値として得た。
ＰＢＭＣの単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、バフィーコート（Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅ Ｚｕｒｉｃｈ）から得たヘパリン処理した血液の濃縮リンパ球調製物から密度勾配遠心分離によって調製した。２５ｍｌの血液（ＰＢＳで１：２に希釈）を１５ｍｌのｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７８５１）の上に積層し、室温で２５分間、８４５×ｇでブレーキなしで遠心分離した。ＰＢＭＣ含有界面を、１０ｍｌピペットを用いて５０ｍｌチューブに回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、６１１×ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを５０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３０４×ｇで５分間遠心分離した。洗浄工程を繰り返し、１７１×ｇで遠心分離した。細胞をＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ（５％ヒト血清、ピルビン酸ナトリウム、ＮＥＡＡ、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有）に再懸濁し、それぞれのアッセイプロトコルに従ってさらなる機能分析のために処理した。
２．１ ＩＬ－２レポーターアッセイに基づくＥｐＣＡＭを標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的特性評価－ＣＤ３－ＩｇＧによる刺激
ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８が抗ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化をサポートする能力を評価するために、異なるＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子を試験した：ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）、ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９７４）、ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＥ９０５１）、ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５２９６）。ＩＬ－２レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１６５１）はエフェクター細胞（ＩＬ－２プロモーターによって引き起こされるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）としての役割を果たし、ＳＷ４０３、ＨＴ－２９、ＭＣＦ－７及びＫＡＴＯ－ＩＩＩ細胞は腫瘍標的としての役割を果たした。５０００個の腫瘍標的細胞を、１０ｎＭの抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１６－００３７－８５）単独の存在下、又は漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗体（１２．８ｐＭ～２００ｎＭ）と組み合わせた存在下、２５０００個のＩＬ－２レポーター細胞（Ｅ：Ｔ ５：１）と共に、３７℃で６時間、透明な底の３８４ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｉｌｕｘ）内でインキュベートした。測定の前に、プレートを室温で１５分間インキュベートし、次いで、２０μｌの基質（ＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１２０）を細胞に添加した。暗所での室温での１０分間のインキュベーション後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを用いて発光（カウント／秒）を測定した。
一定の最適以下の抗ＣＤ３刺激と組み合わせたＴ細胞活性化を評価した。この目的のために、ＩＬ－２レポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗体（Ｐ１ＡＦ５９８０、Ｐ１ＡＦ５９７４、Ｐ１ＡＥ９０５１及びＰ１ＡＦ５２９６）及び固定された限界濃度の抗ＣＤ３ ＩｇＧクローンＯＫＴ３（１０ｎＭ）の存在下において、ＥｐＣＡＭ発現標的細胞（ＳＷ４０３、ＨＴ２９、ＭＣＦ７及びＫＡＴＯ－３）と６時間共培養した。ＣＤ１９標的化ＣＤ２８二重特異性抗体ＣＤ１９（２Ｂ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ０１７５）を非結合対照として含めた。
図４Ａから４Ｄに示されるように、４つすべてのＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子は、濃度依存的に最適以下のＣＤ３刺激に曝露されたＴ細胞におけるＩＬ－２産生の増加によって判断されるように、Ｔ細胞活性化を増強することがきた。ＩＬ２産生の観点から見た４つの分子の順位は以下の通りである：ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）＞ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９７４）＞ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＥ９０５１）＞ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５２９６）。抗ＣＤ３刺激のＯＫＴ－３の非存在下では、Ｔ細胞の活性化は観察されなかった。
別の実験では、異なるＣＤ２８抗体を含む２つの異なるＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８分子（ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）及びＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＧ１６６３））を試験した。ＩＬ－２レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１６５１）はエフェクター細胞（ＩＬ－２プロモーターによって引き起こされるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）としての役割を果たし、ＨＴ－２９、ＭＫＮ４５及びＮＣＩ－Ｈ１７５５細胞は腫瘍標的としての役割を果たした。６００００個の腫瘍標的細胞を、透明な底の３８４ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｉｌｕｘ）中で、１０ｎＭのＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１６－００３７－８５）の存在下又は非存在下で、６００００個のＩＬ－２レポーター細胞（Ｅ：Ｔ １：１）と３７℃で６時間インキュベートした。ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗体を、１２．８ｐＭから２００ｎＭまでの範囲の濃度で添加し、プレートを加湿インキュベーター内３７℃で６時間インキュベートした。測定の前に、室温で１５分間インキュベートし、それから、２０μｌの基質（ＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１２０）を細胞に添加した。暗所での室温での１０分間のインキュベーション後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを用いて発光（カウント／秒）を測定した。
図１１Ａから１１Ｃに示されるように、どちらのＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８分子も、濃度依存的に最適以下のＣＤ３刺激に曝露されたＴ細胞におけるＩＬ－２産生の増加によって判断されるように、Ｔ細胞活性化を増強することができた。ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）及びＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＧ１６６３）は、ＥＰＣＡＭ高発現細胞細胞（ＨＴ２９）及びＥｐＣＡＭ中発現細胞（ＭＫＮ４５）に対して同等の活性を示した。ＥｐＣＡＭ低発現細胞（ＮＣＩ－Ｈ１７５５）に対しては、より親和性の高いＣＤ２８結合因子を含むＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＧ１６６３）がより優れた効果を示した。抗ＣＤ３刺激のＯＫＴ－３の非存在下では、Ｔ細胞の活性化は観察されなかった。
ＩＬ２レポーター細胞アッセイによる対応するＥＣ５０値は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６によって用量反応曲線から計算され、表２Ａに示されている。
Figure 2024522340000056
２．２ ＩＬ－２レポーターアッセイに基づくＥｐＣＡＭを標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的特性評価－Ｔ細胞二重特異性抗体（ＣＥＡ ＴＣＢ）による刺激
ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８が抗ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化をサポートする能力を評価するために、異なるＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子を試験した：ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）、ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９７４）、ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＥ９０５１、及びＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５２９６）。ＩＬ－２レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１６５１）はエフェクター細胞（ＩＬ－２プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）としての役割を果たし、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ細胞は腫瘍標的としての役割を果たした。５０００個の腫瘍標的細胞を、漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗体（４．３ｐＭ～２００ｎＭ））と組み合わせた、１０ｎＭ、５ｎＭ若しくは１ｎＭのＣＥＡ／ＣＤ３二重特異性抗体（ＣＥＡ ＴＣＢ）又はＣＥＡ／ＣＤ３なしの存在下、２５０００個のＩＬ－２レポーター細胞（Ｅ：Ｔ ５：１）と共に、３７℃で６時間、透明な底の３８４ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｉｌｕｘ）内でインキュベートした。測定の前に、プレートを室温で１５分間インキュベートし、次いで、２０μｌの基質（ＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１２０）を細胞に添加した。暗所での室温での１０分間のインキュベーション後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを用いて発光（カウント／秒）を測定した。
抗ＣＤ３刺激としての異なる濃度のＣＥＡ ＴＣＢと組み合わせたＴ細胞活性化を評価した。この目的のために、ＩＬ－２レポーターＪｕｒｋａｔ細胞を、漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗体（Ｐ１ＡＦ５９８０、Ｐ１ＡＦ５９７４、Ｐ１ＡＥ９０５１及びＰ１ＡＦ５２９６）及び異なる濃度のＣＥＡ ＴＣＢ（１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ及びＣＥＡ－ＴＣＢなし）の存在下において、ＥｐＣＡＭ／ＣＥＡ発現標的細胞（ＫＡＴＯ－ＩＩＩ）と６時間共培養した。ＣＤ１９標的化ＣＤ２８二重特異性抗体ＣＤ１９（２Ｂ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ０１７５）を非結合対照として含めた。
図５Ａから５Ｄに示されるように、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子は、濃度依存的に最適以下のＣＤ３刺激に曝露されたＴ細胞におけるＩＬ－２産生の増加によって判断されるように、Ｔ細胞活性化を増強することがきた。ＩＬ２産生の観点から見た４つの分子の順位は以下の通りであった：ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）＞ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９７４）＞ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＥ９０５１）＞ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５２９６）。Ｔ細胞二重特異性抗体ＣＥＡ－ＴＣＢを介したＣＤ３刺激の非存在下では、Ｔ細胞におけるＩＬ－２産生は観察されなかった。
２．３ ＥｐＣＡＭ発現細胞及びＣＤ２８発現細胞へのＥｐＣＡＭを標的とする異なる二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子の結合
異なるＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子（ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）、ＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９７４）、ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＥ９０５１）、及びＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５２９６））のＥｐＣＡＭに対する結合をＫＡＴＯ－ＩＩＩ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１０３ＴＭ）を用いて試験し、ヒトＣＤ２８に対する結合を、ヒトＣＤ２８を発現するＣＨＯ細胞（親細胞株ＣＨＯ－ｋ１ ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ－６１、ヒトＣＤ２８を安定的に過剰発現するように修飾）を用いて試験した。
結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）に０．５ Ｍｉｏ細胞／ｍｌで再懸濁した。５×１０４細胞を、漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８コンストラクト（０．２３～５００ｎＭ）と共に４℃で４５分間、丸底９６ウェルプレート中でインキュベーションした。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＥコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ、カタログ番号＃１０９－１１６－１７０）と共に４℃でさらに３５分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、遠心分離し、２００ｕｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。コンストラクトと細胞間の非特異的結合相互作用をモニタリングするために、ＣＤ１９標的化ＣＤ２８二重特異性抗体ＣＤ１９（２Ｂ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ０１７５）を陰性対照としてＥｐＣＡＭ発現ＫＡＴＯ－ＩＩＩ細胞に含めた。結合を、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ、ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。結合曲線はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７を使用して得た。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞結合アッセイでは、試験したＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性アゴニスト抗体の４つはすべて、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ細胞上のヒトＥｐＣＡＭに（図６Ａ及び図６Ｂ）また、ＣＨＯ－ｋ１－ｈｕＣＤ２８細胞上のヒトＣＤ２８（図６Ｃ）に、濃度依存的に結合することが確認された。ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）及びＥｐＣＡＭ（３－１７Ｉ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９７４）の顕著に優れた結合がＥｐＣＡＭ＋ Ｋａｔｏ ＩＩＩ細胞上で観察され、これはＩＬ２レポーター細胞アッセイで観察されたこれら２つの分子の優れた有効性と一致している（２．１及び２．２参照）。ＣＤ２８のバリアント１５結合因子を含有するＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント１５）（Ｐ１ＡＥ９０５１）は、ＣＨＯ－ｋ１－ｈｕＣＤ２８細胞上で発現したヒトＣＤ２８に対する優れた結合を示した。予想通り、ＫＡＴＯ－ＩＩＩ細胞上ではＣＤ１９標的化ＣＤ２８二重特異性抗体ＣＤ１９（２Ｂ１１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ０１７５）との結合は検出されなかった。これは、結合の検出がそれぞれの標的部位による特異的なＥｐＣＡＭ結合によるものであることを示している。
２．４ 連続ライブセルイメージング（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ）によるＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢと組み合わせたＥｐＣＡＭを標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子の共刺激効果の評価
ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８が抗ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び腫瘍増殖阻害それぞれの溶解をサポートする能力を数日間にわたり動態的にモニタリングするために、ＥｐＣＡＭ及びＭＡＧＥ－Ａ４＋ ＨＬＡ－Ａ＊０２発現ＳｃａＢｅｒ細胞を、国際公開第２０２１／１２２８７５号に記載されているような最適以下の濃度の抗ＨＬＡ－Ａ／ＭＡＧＥ－Ａ４×抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢ、Ｐ１ＡＥ３７５６、配列番号３０５、配列番号３０６、２×配列番号３０７及び配列番号３０８）を有するヒトＰＢＭＣと、ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）（Ｐ１ＡＦ５９８０）の存在下又は非存在下で共培養した。腫瘍細胞増殖それぞれの溶解を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ Ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ解析システムを用いた連続ライブセルイメージングによりモニタリングした。
アッセイのために、５０００個のＳｃａＢＥＲ細胞を９６ウェル平底組織培養プレート（ＴＰＰ）に播種した。ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢは、対照としてＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８（２００ｎＭ）又はアッセイ培地の存在下、最終濃度５ｎＭで添加した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ Ｄｙｅ ｆｏｒ ＡｐｏｐｔｏｓｉｓをＰＢＭＣ懸濁液に１／５００希釈（最終濃度／ウェル＝１／２０００）で添加し、ＰＢＭＣをＥ：Ｔが５：１（２５０００ＰＢＭＣ／ウェル）になるように最終容量２５０ｕｌ／ウェルで添加した。
プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｔｄ．）のインキュベーターに入れ、３７℃、５％ＣＯ２で９６時間培養した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｚｏｏｍに配置してから１時間後にスキャンを開始した（＝タイムポイント０時間）。１ウェルあたり４枚の写真を撮影してプレートを３時間ごとに９６時間スキャンした（位相差、赤色チャンネル（標的細胞）、及び緑色チャンネル（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ Ｄｙｅ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ））。読み取ったシグナルの平均を、各条件の３反復からタイムポイント０時間について計算した。この値は、後のタイムポイントの同じ条件の各値から差し引かれた（＝正規化された値）。
図１２は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｚｏｏｍを用いた連続ライブセルイメージングによりモニタリングされた腫瘍細胞の増殖を示している。異なる条件の正規化された赤血球読み出し値（＝標的細胞の増殖）を評価時間にわたってプロットした。この結果は、最適用量以下のＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢ（単剤では活性を示さない）をＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８と組み合わせたときに、強い相乗効果があることを示している。
ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢの非存在下では、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８は活性を示さないことから、ＥＰＣＡＭ－ＣＤ２８の共刺激効果はシグナル１（最適濃度以下のＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢを介して提供される）の存在に強く依存していることが証明された。
実施例３
ＣＤ２８及びＥｐＣＡＭを標的とする追加の二重特異性抗原結合分子の作製及び産生
３．１ ＣＤ２８及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的とする二重特異性抗原結合分子のクローニング
ＥｐＣＡＭ抗原発現ベクターのクローニング及び産生：
様々なＥｐＣＡＭ抗体とそのバリアントの特性評価のために、ヒトＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（成熟タンパク質のアミノ酸１～２４２、配列番号１９６のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ断片（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ１６４２２、配列番号１１１）を３つの異なる抗原の作製に使用した：
１）ＥｐＣＡＭ ＥＣＤを、溶解性タグ及び精製タグとして機能するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片をコードするＤＮＡ断片の上流の２つの異なる哺乳動物のレシピエントベクターにインフレームで挿入した。発現ベクターの１つはＦｃ領域に「ホール」変異を含み、もう１つは「ノブ」変異を含み、また、Ｃ末端ａｖｉタグ及びａｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、配列番号８８）はＢｉｒ Ａビオチンリガーゼとの同時発現中に特異的ビオチン化を可能にした。（図７Ａ）（配列番号１９７及び１９８）
２）一価のＥｐＣＡＭ－Ｆｃコンストラクトを作製するために、ＥｐＣＡＭ ＥＣＤ Ｆｃ（ｋｎｏｂ）ａｖｉ－ｈｉｓ融合体をコードする発現ベクターをＦｃ（ホール）断片と組み合わせた。（図７Ａ）（配列番号１９８及び１９９）。
３）可溶性組換えＥｐＣＡＭを作製するために、ＥＣＤをＮ末端リーダー配列を含む哺乳動物レシピエントベクターにインフレームでクローニングした。さらに、コンストラクトには、Ｂｉｒ Ａビオチンリガーゼとの共発現中に特異的ビオチン化を可能にするＣ末端ａｖｉタグと、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる精製に使用されるＨｉｓタグとが含まれている（配列番号３及び２００）。
ＥｐＣＡＭ抗原は、実施例１．２に記載したように、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクショにより発現及び作製した。組み換え可溶性ＥｐＣＡＭ ＥＣＤを、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）とその後のゲルろ過を使用した標準プロトコルを参照して、ろ過された細胞培養上清から精製した。モノマータンパク質画分をプールし、濃縮し（必要な場合）、冷凍し、－８０℃で保存した。サンプルの一部が、その後のタンパク質分析、及び、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析による分析的特性評価のために、提供された。
３．２ ＥｐＣＡＭ抗体４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂの再ヒト化
ＥｐＣＡＭ抗体４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂを含む二重特異性抗原結合分子は、機能的アッセイにおいて優れた特性を示したため、この抗体をより詳細に研究した。Ｗｉｌｌｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９； ５９， ５７５８－５７６７によって発表されたその配列の解析から、ネズミの生殖細胞系列由来のアミノ酸が多く含まれていることが明らかになった。抗体のヒト特性を高め、ヒト生殖細胞系列由来の配列と可能な限り高い相同性を有する配列バリアントを作製するために、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインのいくつかのバリアントを設計し、マウス生殖細胞系列由来のアミノ酸を置き換えた。ヒト由来の生殖細胞系列に近い相同性は、ヒト個体に１回又は数回注射した後の抗薬物抗体の作製を減少させることが期待される。合計で１１配列の新しいＶＨバリアントの設計には、生殖細胞系列の配列ＩＧＨＶ３－２３－０４をテンプレートとして用いた（図８Ａ）。最初の６つのバリアント（ＭＯＣＨ１～ＭＯＣＨ５（７７／８２））が配列中の単一のアミノ酸又はセクションの適合を含有するのに対し、バリアント６～１０（ＭＯＣＨ６～ＭＯＣＨ１０）はいくつかのヒト化アミノ酸又は配列セクションの組み合わせを含む。７つのＶＬバリアントについては、生殖細胞系列の配列ＩＧＫＶ１－３９－０１がテンプレートとして機能した。バリアントＭＯＣＬ７は、いくつかの再ヒト化変異の組み合わせを含有している（図８Ｂ）。すべてのバリアントの配列を以下の表３に列挙する。
Figure 2024522340000057
図９Ａに概略的に示すように、再ヒト化ＥｐＣＡＭバリアントをクローニングし、１アーム（一価）ＩｇＧフォーマットで産生した。新しい抗体バリアントを評価するために、すべてのＶＨ配列バリアントをすべてのＶＬバリアントと組み合わせ、本明細書で前述したように発現させた。
選別のため、表面プラズモン共鳴法により、産生された１アームＥｐＣＡＭ ＩｇＧ（ＰＧ ＬＡＬＡ修飾を有する）の解離定数を決定した。．再ヒト化ＥｐＣＡＭバリアントの結合特性を評価し、親抗体と比較するために、Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６装置を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による１アームＥｐＣＡＭ ＩｇＧのオフレート分析を実施した。組換え抗原（リガンド）の固定化のために、一価ＥｐｃＡＭ－ＦｃをＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１００～５００ｎＭの範囲の濃度に希釈し、次いで、様々な接触時間で２５μｌ／分でストレプトアビジンでコーティングしたＮＬＣチップに注射した。これにより、垂直配向で３００～３０００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルが得られた。
上清中の発現したＥｐＣＡＭバリアントの解離速度（ｋｏｆｆ）を測定するために、注入方向を水平配向に変更した。測定した力価に基づき、培地中の上清を希釈して５０ｎＭの溶液を作製し、別々のチャネル１～５に沿って、会合時間２１０秒、解離時間６００秒で、５０μｌ／分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って培地を注入した。再生を、５０μｌ／分（水平配向）で６０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ ２．１で行った。解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアで、センサーグラムの解離曲線をフィッティングすることにより算出した。親の４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂクローンと同程度の解離速度を有するクローンを、さらなる特性評価のために選択した。選択したＥｐＣＡＭ抗体バリアントの解離速度を以下の表４に列挙する。これらの抗体バリアントの対応する配列を表５にまとめた。
解離速度が遅いことから事前に選択した一価のＥｐＣＡＭ ＩｇＧの親和性（ＫＤ）を、Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６装置を用いた表面プラズモン共鳴によるＳＰＲで測定した。組換え抗原（リガンド）を固定化するために、ビオチン化した一価のＥｐＣＡＭ－Ｆｃを前述のようにストレプトアビジンチップに注入した。これにより、垂直配向で３００～３０００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルが得られた。上清中の発現したＥｐＣＡＭバリアントの親和性（ＫＤ）を測定するために、注入方向を水平配向に変更した。５０と３．１２５ｎＭの間の様々な濃度範囲の２倍希釈系列を、２１０秒の会合時間及び６００秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って５０μｌ／分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って培地を注入した。再生を、５０ｕｌ／分（水平配向）で６０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ ２．１で行った。結合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ を使用して、結合と解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。親抗体４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ（Ｐ１ＡＧ３９８９）を有するコンストラクトは、選択されたバリアントの参照として機能し、すべての速度論的及び熱力学的データを表４に列挙する。
Figure 2024522340000058
Figure 2024522340000059
Figure 2024522340000060
一価のＩｇＧフォーマットで最も高い親和性を示した再ヒト化ＥｐＣＡＭバリアントを、より良い特性評価のためにヒトＩｇＧ（ＰＧ－ＬＡＬＡ）フォーマットに変換した。したがって、図９Ｂに概略的に示すように、対応するＶＨ及びＶＬバリアントをクローニングし、二価のＩｇＧフォーマットで産生した。対照として、また比較のために、親４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ抗体を同じフォーマットに変換した。表６にすべてのＩｇＧバリアント及びそれぞれの対照の配列の組み合わせを列挙する。すべてのクローニング工程、産生工程、及び精製工程は上記のように行った。表７では、選択した抗体の産生パラメータ及び精製パラメータを要約している。
Figure 2024522340000061
Figure 2024522340000062
３．３ マウスＥｐＣＡＭ抗体ＭＯＣ３１の新たなヒト化
以前に行われたヒト化ＥｐＣＡＭ抗体４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂの再ヒト化作業により、ヒト生殖細胞系列ＩＧＨＶ３－２３－０４及びＩＧＫＶ１－３９－０１との配列相同性は著しく改善された。しかし、これらのバリアントを含むそれぞれのＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ ＩｇＧ １＋１二重特異性抗原結合分子の生産収率は低く、質量分析によってＥｐＣＡＭを標的とする抗体部分は低量しか発現していないことが明らかになった。
これらの知見に基づき、代替的なヒトフレームワーク配列を使用して、親マウス抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体ＭＯＣ３１の新たなヒト化が行われた。ＭＯＣ３１は、Ｗｉｌｌｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９， ５９， ５７５８－５７６７に記載されており、その構造は、ＰＤＢ ＩＤ： ６Ｉ０７としてＰｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄａｔａｂａｓｅ ＰＤＢ （ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）に掲載されている。適切なヒトアクセプターフレームワークを同定するために、高い配列相同性及び保存されたＶＨ－ＶＬ配向を有するアクセプターフレームワーク（国際公開第２０１６／０６２７３４、ＶＨ－ＶＬ－Ｉｎｔｅｒｄｏｍａｉｎ ａｎｇｌｅ ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎを参照）を検索し、このフレームワーク上にＣＤＲをグラフトし、どのような復帰突然変異が想定され得るかを評価するという古典的なアプローチがとられた。より明示的には、親抗体に対する同定されたフレームワークの各アミノ酸の違いは、結合因子の構造的完全性への影響について判断され、適切な場合には常に親配列に対する復帰突然変異が導入された（国際公開第２０１９／０２５２９９号－Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄを参照）。構造評価は、親抗体と、Ｂｉｏｖｉａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，バージョン４．５を使用して実装した、社内で開発した抗体構造相同性モデリングツールであるＭｏＦｖＡｂ（Ａ． Ｂｕｊｏｔｚｅｋ ｅｔ ａｌ．， ＭｏＦｖＡｂ： ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｖ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ＭＡｂｓ ７ （５）， ８３８－８５２ ）より作製したそのヒト化バージョンとの両方のＦｖ領域相同性モデルに基いた。
合計で７配列の新たなＶＨバリアントの設計には、４つのヒトアクセプターフレームワークを使用した（図１０Ａ）。新たなＶＬバリアントの作製には、４つのヒトアクセプターフレームワークがテンプレートとして機能した（図１０Ｂ）。ＶＬのＣＤＲ１領域は抗原結合に関与しないことから、３つのバリアントの元のマウスＬＣＤＲ１配列をヒトＣＤＲ１の長さに適合させた（図１０Ｂ）。すべてのバリアントの配列を以下の表８に列挙する。
Figure 2024522340000063
新たにヒト化した一価のＥｐＣＡＭ ＩｇＧ及び二価のＥｐＣＡＭ ＩｇＧ並びにＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性１＋１コンストラクトのクローニングのために、特に、発現プラスミドの作製のために、それぞれの可変ドメインの配列を使用し、それぞれのレシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入されたそれぞれの定常領域とインフレームでサブクローニングした。示されるように、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ、及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異（ＰＧ－ＬＡＬＡ）を、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域に導入して、Ｆｃγ受容体への結合をなくした。１アーム型ＥｐＣＡＭ特異的抗体を作製するために、ＥｐＣＡＭ結合側を有するＦｃ断片は「ホール」変異を含有し、「ノブ」変異はヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインからなる「空の」Ｆｃ断片に導入された。さらに、ＥｐＣＡＭ結合部分にＶＨ／ＶＬドメインの交換が導入された（ＣｒｏｓｓＦａｂ技術）。
二重特異性抗体の作製のために、Ｆｃ断片は、重鎖の誤対合を回避するために「ノブ」又は「ホール」変異のいずれかを含有した。軽鎖の誤対合を回避するために、ＶＨ／ＶＬ又はＣＨ１／Ｃカッパドメインの交換を１つの結合部分に導入した。他の結合部分において、電荷をＣＨ１ドメイン及びＣカッパドメインに導入した。
新しいヒト化抗体バリアントを評価するために、図９Ａに概略的に示すように、すべてのＶＨ配列バリアントをすべてのＶＬバリアントと組み合わせ、本明細書で前述したように１アーム（一価）ＩｇＧフォーマットで発現させた。
ヒト化ＥｐＣＡＭバリアントの結合特性を評価し、親抗体と比較するために、Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６装置を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるコンストラクトのオフレート分析を実施した。組換え抗原（リガンド）の固定化のために、一価ＥｐＣＡＭ－ＦｃをＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１００～５００ｎＭの範囲の濃度に希釈し、次いで、様々な接触時間で２５μｌ／分でストレプトアビジンでコーティングしたＮＬＣチップに注射した。これにより、垂直配向で３００～３０００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルが得られた。上清中の発現したＥｐＣＡＭバリアントの解離速度（ｋｏｆｆ）を測定するために、注入方向を水平配向に変更した。測定した力価に基づき、培地中の上清を希釈して５０ｎＭの溶液を作製し、別々のチャネル１～５に沿って、会合時間１８０秒、解離時間６００秒で、５０μｌ／分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って培地を注入した。再生を、５０μｌ／分（水平配向）で６０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ ２．１で行った。
解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアで、センサーグラムの解離曲線をフィッティングすることにより算出した。すべてのＥｐＣＡＭ結合因子バリアントの解離速度を以下の表９に列挙する。解離速度が最善であるクローン（表９の下線部）を選択し、さらなる特性評価を行った。比較のため、親抗体ＭＯＣ３１は、２．４０Ｅ－０４のオフレート（１／ｓ）を示した。
Figure 2024522340000064
表１０は、選択された抗体とその一価フォーマットの配列の概要を提供する。
Figure 2024522340000065
解離速度のために事前に選択した一価のＥｐＣＡＭ ＩｇＧの親和性（ＫＤ）を、Ｐｒｏｔｅｏｎ ＸＰＲ３６装置を用いた表面プラズモン共鳴によるＳＰＲで測定した。組換え抗原（リガンド）を固定化するために、ビオチン化した一価のＥｐＣＡＭ－Ｆｃを前述のようにストレプトアビジンチップに注入した。これにより、垂直配向で３００～３０００応答単位（ＲＵ）の固定化レベルが得られた。上清中の発現したＥｐＣＡＭバリアントの親和性（ＫＤ）を測定するために、注入方向を水平配向に変更した。５０と３．１２５ｎＭの間の様々な濃度範囲の２倍希釈系列を、２１０秒の会合時間及び６００秒の解離時間で、別々のチャネル１～５に沿って５０μｌ／分で同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って培地を注入した。再生を、５０μｌ／分（水平配向）で６０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ ２．１で行った。結合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して、結合と解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。ＥｐＣＡＭ抗体４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ（Ｐ１ＡＧ７８１６）を有するコンストラクトは、選択されたバリアントの参照として機能し、すべての速度論的及び熱力学的データを表１１に列挙する。
Figure 2024522340000066
３．４ 新たなヒト化ＥｐＣＡＭ（ＭＯＣ３１）バリアントを含むＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ ＩｇＧ１ １＋１二重特異性抗体の作製及び産生
一価のＩｇＧフォーマットで最も高い親和性を示した選択した新たにヒト化したＥｐＣＡＭバリアントを、より良い特性評価のためにヒトＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ ＩｇＧ １＋１二重特異性フォーマットフォーマットに変換した。フォーマットを図１Ｃに示す。対照として、また比較のために、ヒト化ＥｐＣＡＭ抗体４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂを使用した。表１２に、新たにヒト化したバリアントの組み合わせを列挙する。すべてのクローニング工程、産生工程、及び精製工程は前述のように行った。表１３では、新たなコンストラクトのすべての産生パラメータ及び精製パラメータを要約している。
Figure 2024522340000067
Figure 2024522340000068
新たにヒト化されたＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ ＩｇＧ１ １＋１二重特異性抗体の親和性（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を用いてＳＰＲで測定した。組換え抗原（リガンド）の固定化には、標準的なＳＡカップリングキット（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて、ビオチン化一価ＥｐＣＡＭ－Ｆｃを約５５ＲＵの直接固定化によりＳＡセンサチップ上に固定化した。
精製したＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ ＩｇＧ１ １＋１二重特異性抗体の親和性（ＫＤ）を決定するために、２００と０．３９１ｎＭの間の様々な濃度範囲の２倍希釈系列を、３０μｌ／分で、３６０秒の会合時間及び８００秒の解離時間で注入した。ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００３Ｍ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を希釈及び参照用に使用した。再生を、５０μｌ／分で８０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１で行った。会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時にフィッティングすることにより単純な１：１ラングミュア結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数（ＫＤ）を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。親結合因子４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂを有するコンストラクトは、選択されたバリアントの参照として機能した。全ての動力学的及び熱力学的データを表１４に列挙する。
Figure 2024522340000069
実施例４
新たにヒト化したＥｐＣＡＭ抗体を含む二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的特性評価
４．１ ＩＬ－２レポーターアッセイに基づくＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏ機能的特性評価－ＣＤ３－ＩｇＧによる刺激
ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアントが抗ＣＤ３媒介Ｔ細胞活性化をサポートする能力を評価するために、５つの異なるＥｐＣＡＭヒト化バリアント分子（Ｐ１ＡＨ２３２６、Ｐ１ＡＨ２３２７、Ｐ１ＡＨ２３２８、Ｐ１ＡＨ２３２９及びＰ１ＡＨ２３３０、全てＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）を含む）を試験し、ＥｐＣＡＭ （４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８＿交差）１＋１（Ｐ１ＡＦ５９８０）、ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ 交差）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１（Ｐ１ＡＧ１８１０）、及びＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８＿交差）１＋１（Ｐ１ＡＦ５２９６）と比較した。
ＩＬ－２レポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１６５１）はエフェクター細胞（ＩＬ－２プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞株）としての役割を果たし、ＨＴ－２９細胞は腫瘍標的としての役割を果たした。６００００個の腫瘍標的細胞を、透明な底の３８４ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）Ｏｐｔｉｌｕｘ）中で、１０ｎＭのＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１６－００３７－８５）の存在下又は非存在下で、６００００個のＩＬ－２レポーター細胞（Ｅ：Ｔ １：１）と３７℃で６時間インキュベートした。ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８コンストラクトを、６．４ｐＭから１００ｎＭまでの範囲の濃度で添加し、プレートを加湿インキュベーター内３７℃で６時間インキュベートした。測定の前に、室温で１５分間インキュベートし、それから、２０μｌの基質（ＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１２０）を細胞に添加した。暗所での室温での１０分間のインキュベーション後、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍを用いて発光（カウント／秒）を測定した。
図１３Ａから図１３Ｄに示されるように全てのＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８分子（ＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８、交差）１＋１（Ｐ１ＡＦ５２９６）を除く）は、濃度依存的に最適以下のＣＤ３刺激に曝露されたＴ細胞におけるＩＬ－２産生の増加によって判断されるように、同等のＴ細胞活性化を増強することができた。抗ＣＤ３刺激ＯＫＴ－３の非存在下では、Ｔ細胞の活性化は観察されなかった。
ＩＬ２レポーター細胞アッセイによる対応するＥＣ５０値は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６によって用量反応曲線から計算され、表１５に示されている。
Figure 2024522340000070
４．２ 連続ライブセルイメージング（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ）によるＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢと組み合わせたＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアント分子の共刺激効果の評価
ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアントが抗ＣＤ３媒介性Ｔ細胞活性化及び腫瘍増殖抑制それぞれの溶解を支持する能力を数日間にわたり動態的にモニタリングするために、ＥｐＣＡＭ及びＭＡＧＥ－Ａ４＋ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１発現ＳｃａＢｅｒ細胞を、最適以下の濃度のＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢ（Ｐ１ＡＥ３７５６、実施例２．４参照）を添加したヒトＰＢＭＣと、二重特異性ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアント分子（Ｐ１ＡＨ２３２６、Ｐ１ＡＨ２３２７、Ｐ１ＡＨ２３２８、Ｐ１ＡＨ２３２９及びＰ１ＡＨ２３３０）又はＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８＿交差）１＋１（Ｐ１ＡＦ５９８０）の存在下又は非存在下で培養した。腫瘍細胞増殖それぞれの溶解を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ Ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ解析システムを用いた連続ライブセルイメージングによりモニタリングした。
アッセイのために、５０００個のＳｃａＢＥＲ細胞を９６ウェル平底組織培養プレート（ＴＰＰ）に播種した。ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢは、それぞれ対照としてＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８（２００ｎＭ）又はアッセイ培地の存在下、最終濃度５ｎＭで添加した。ＰＢＭＣを、Ｅ：Ｔが５：１（２５０００ ＰＢＭＣ／ウェル）になるように最終容量２５０μｌ／ウェルで添加した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｔｄ．）のインキュベーターに入れ、３７℃、５％ＣＯ２で１２０時間培養した。プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅに入れてから１時間後にスキャンを開始した（＝タイムポイント０ｈ）。プレートを、１ウェルあたり４枚の写真を撮影して、３時間ごとに１２０時間スキャンした（位相差及び赤色チャンネル（標的細胞））。読み取ったシグナルの平均を、各条件の３反復からタイムポイント０時間について計算した。この値は、後のタイムポイントの同じ条件の各値から差し引かれた（＝正規化された値）。
図１４Ａから１４Ｆは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭを用いた連続ライブセルイメージングによりモニタリングされた腫瘍細胞の増殖を示す。異なる条件の正規化された赤血球読み出し値（＝標的細胞の増殖）を評価時間にわたってプロットした。最適用量以下のＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢをＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアントのそれぞれと組み合わせると、強い相乗効果が観察される。ＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢの非存在下（図１５Ａから１５Ｆ）では、ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアントは活性を示さないことから、ＥＰＣＡＭ－ＣＤ２８の共刺激効果はシグナル１（最適濃度以下のＭＡＧＥ－Ａ４ ＴＣＢを介して提供される）の存在に強く依存していることが証明された。
４．３ ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアント分子のＥｐＣＡＭ発現ＨＴ－２９細胞への結合
５つの異なるＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアント分子（Ｐ１ＡＨ２３２６、Ｐ１ＡＨ２３２７、Ｐ１ＡＨ２３２８、Ｐ１ＡＨ２３２９及びＰ１ＡＨ２３３０）のＥｐＣＡＭへの結合を、ＥｐＣＡＭ発現ＨＴ－２９細胞でのフローサイトメトリーで試験し、ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８＿交差）１＋１（Ｐ１ＡＦ５９８０）、ＥｐＣＡＭ（４Ｄ５ＭＯＣ－Ｂ）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８）１＋１（Ｐ１ＡＧ１８１０）、及びＥｐＣＡＭ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２（ＳＡ＿バリアント８＿交差）１＋１（Ｐ１ＡＦ５２９６）のＥｐＣＡＭへの結合と比較した。
結合を評価するために、細胞を回収し、計数し、生存率についてチェックし、ＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００－４２２２－２６）に０．５ Ｍｉｏ細胞／ｍｌで再懸濁した。４００００細胞を、漸増濃度のＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８コンストラクト（２．６ｐＭ～２００ｎＭ）と共に４℃で３０分間、丸底９６ウェルプレート中でインキュベーションした。次いで、細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、ＰＥコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ、カタログ番号＃１０９－１１６－１７０）と共に４℃でさらに３０分間インキュベートし、冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、遠心分離し、２００ｕｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。結合を、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ、ソフトウェアＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いたフローサイトメトリーによって評価した。結合曲線はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７を使用して得た。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞結合アッセイでは、試験した５つの二重特異性ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアント分子はすべて、ＨＴ－２９細胞上のヒトＥｐＣＡＭ（図１６）に濃度依存的に結合することが確認された。Ｅｐｃａｍ（ＭＴ２０１）－ＣＤ２８（ＳＡ＿バリアント８、交差）１＋１（Ｐ１ＡＦ５２９６）よりも明らかに優れた結合が、試験した５つの二重特異性ＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８ヒト化バリアント分子すべてで観察された。対応するＥＣ５０値を、以下の表１６に示す。
Figure 2024522340000071
実施例５
ＥｐＣＡＭを標的とする二重特異性ＣＤ２８アゴニスト抗原結合分子のｉｎ ｖｉｖｏ機能的特性評価
ここに記載した有効性試験は、ＢＣ００４腫瘍を有するヒト化ＮＳＧマウスにおける腫瘍退縮の観点から、抗ＨＬＡ－Ｇ／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ）と組み合わせたＥｐＣＡＭ－ＣＤ２８二重特異性抗原結合分子の効力を理解することを目的とした。ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢ（Ｐ１ＡＦ７９７７）は、配列番号２９３及び配列番号２９４のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号２９５のアミノ酸配列を有する２つの軽鎖と、配列番号２９６のアミノ酸配列を有する１つの軽鎖とを含む。
腫瘍細胞：ヒト乳がん患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルＢＣ００４をＯｎｃｏＴｅｓｔ（ドイツ、フライブルク）から購入した。腫瘍断片をＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｄ及びＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、単一細胞懸濁液を調製した。細胞数及び生存率をＶｉＣｅｌｌで決定した。
マウスモデル：雌性３週齢のＮＳＧ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ）マウスに放射線照射（１４０ｃＧｙ）を行い、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓでマウス１匹あたり９×１０４個のＣＤ３４＋臍帯血細胞を静脈内注射して生着させた。血液中のヒト免疫浸潤率（ｈＣＤ４５）が２５％超に達した後、マウスをＲｏｃｈｅに輸送し、新しい環境に慣れるために５日間維持した。関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ； Ｆｅｌａｓａ； ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、マウスを毎日、１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体がない条件下で保持した。継続的な健康モニタリングが毎日実施された。実験研究プロトコルは、地方政府によってまとめられ、承認された（ＲＯＢ－５５．２－２５３２．Ｖｅｔ＿０３－１６－１０）。
腫瘍の注射及び治療：ヒト化マウスに、２×１０６のＢＣ００４細胞を総量２０μＬのＰＢＳで乳腺脂肪パッドに注射した。キャリパーを用いて腫瘍増殖を少なくとも週２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：腫瘍体積＝（Ｗ２／２）×Ｌ（Ｗ： 幅、Ｌ： 長さ）。腫瘍が平均体積約２００ｍｍ３に達した時点で、マウスを腫瘍体積及び体重に基づいて異なる治療群に無作為に割り当てた。全てのマウスに、適切な溶液をｉ．ｖ．注射した。適切な化合物量を得るため、原液（表１７）は必要に応じてヒスチジンバッファーで希釈した。第１のグループのマウスには対照としてヒスチジンバッファー（ビヒクル）が与えられた。すべての抗体は注射前に新鮮な状態で調製し、図１７に示す試験レイアウトに示された用量及びスケジュールで静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。
Figure 2024522340000072
試験は初回投与日から３４日目に終了した。図１８は、各群の腫瘍増殖動態（平均、＋ＳＥＭ）を示す。図１９Ａから１９Ｅは、群及びマウスごとの個別の腫瘍増殖動態を示す。ここに記述したように、ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢによる治療は、ＢＣ００４腫瘍を有する動物において用量に関連した抗腫瘍効果をもたらした。ＥＰＣＡＭ－ＣＤ２８との併用療法後、腫瘍増殖抑制は増加した。結論として、今回報告されたｉｎ ｖｉｖｏの結果は、ＨＬＡ－Ｇ ＴＣＢとＥＰＣＡＭ－ＣＤ２８の組み合わせを支持するものである。
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Ｆｒａｓｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｉｒｖｉｎｇ， Ｂ．Ａ．， Ｃｒａｂｔｒｅｅ， Ｇ．Ｒ．， ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ， Ａ． （１９９１）． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＣＤ２８． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１， ３１３－３１６．
Ｇａｏ Ｙ．， Ｗａｎｇ Ｘ．， Ｙａｎ Ｈ．， Ｚｅｎｇ Ｊ．， Ｍａ Ｓ．， Ｎｉｕ Ｙ．， Ｚｈｏｕ Ｇ．， Ｊｉａｎｇ Ｙ．， Ｃｈｅｎ Ｙ． （２０１６）． Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｆｅｔａｌ Ｓｋｉｎ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｋｅｙ Ｇｅｎｅｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｈａｉｒ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｃａｓｈｍｅｒｅ Ｇｏａｔｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（３）， ｅ０１５１１１８．
Ｈｕｉ， Ｅ．， Ｃｈｅｕｎｇ， Ｊ．， Ｚｈｕ， Ｊ．， Ｓｕ， Ｘ．， Ｔａｙｌｏｒ， Ｍ．Ｊ．， Ｗａｌｌｗｅｂｅｒ， Ｈ．Ａ．， Ｓａｓｍａｌ， Ｄ．Ｋ．， Ｈｕａｎｇ， Ｊ．， Ｋｉｍ， Ｊ．Ｍ．， Ｍｅｌｌｍａｎ， Ｉ．， ａｎｄ Ｖａｌｅ， Ｒ．Ｄ． （２０１７）． Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ２８ ｉｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ＰＤ－１－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５， １４２８－１４３３．
Ｈｕｎｉｇ， Ｔ． （２０１２）． Ｔｈｅ ｓｔｏｒｍ ｈａｓ ｃｌｅａｒｅｄ： ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＣＤ２８ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ＴＧＮ１４１２ ｔｒｉａｌ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２， ３１７－３１８．
Ｊｕｎｅ， Ｃ．Ｈ．， Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ， Ｊ．Ａ．， Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ， Ｍ．Ｍ．， Ｌｉｎｄｓｔｅｎ， Ｔ．， ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｃ．Ｂ． （１９８７）． Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ２８ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７， ４４７２－４４８１．
Ｋａｍｐｈｏｒｓｔ， Ａ．Ｏ．， Ｗｉｅｌａｎｄ， Ａ．， Ｎａｓｔｉ， Ｔ．， Ｙａｎｇ， Ｓ．， Ｚｈａｎｇ， Ｒ．， Ｂａｒｂｅｒ， Ｄ．Ｌ．， Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ， Ｂ．Ｔ．， Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ， Ｃ．Ｚ．， Ｋｏｅｎｉｇ， Ｌ．， Ｙｕ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＰＤ－１－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｓ ＣＤ２８－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５５， １４２３－１４２７．
Ｌａｖｉｎ， Ｙ．， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｓ．， Ｌｅａｄｅｒ， Ａ．， Ａｍｉｒ， Ｅ．Ｄ．， Ｅｌｅｆａｎｔ， Ｎ．， Ｂｉｇｅｎｗａｌｄ， Ｃ．， Ｒｅｍａｒｋ， Ｒ．， Ｓｗｅｅｎｅｙ， Ｒ．， Ｂｅｃｋｅｒ， Ｃ．Ｄ．， Ｌｅｖｉｎｅ， Ｊ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｉｎ Ｅａｒｌｙ Ｌｕｎｇ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ Ｐａｉｒｅｄ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ． Ｃｅｌｌ １６９， ７５０－７６５ ｅ７１７．
Ｌｉｎｓｌｅｙ， Ｐ．Ｓ．， Ｃｌａｒｋ， Ｅ．Ａ．， ａｎｄ Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ， Ｊ．Ａ． （１９９０）． Ｔ－ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ＣＤ２８ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ Ｂ７／ＢＢ－１． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８７， ５０３１－５０３５．
Ｍｕｒｒａｙ Ｍ．Ｅ．， Ｇａｖｉｌｅ Ｃ．Ｍ．， Ｎａｉｒ Ｊ．Ｒ．， Ｋｏｏｒｅｌｌａ Ｃ．， Ｃａｒｌｓｏｎ Ｌ．Ｍ．， Ｂｕａｃ Ｄ．， Ｕｔｌｅｙ Ａ．， Ｃｈｅｓｉ Ｍ．， Ｂｅｒｇｓａｇｅｌ Ｐ．Ｌ．， Ｂｏｉｓｅ Ｌ．Ｈ．， Ｌｅｅ Ｋ．Ｐ． （２０１４）． ＣＤ２８－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏ－ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ． Ｂｌｏｏｄ １２３ （２４）， ３７７０ - ３７７９．
Ｒoｍｅｒ， Ｐ．Ｓ．， Ｂｅｒｒ， Ｓ．， Ａｖｏｔａ， Ｅ．， Ｎａ， Ｓ．Ｙ．， Ｂａｔｔａｇｌｉａ， Ｍ．， ｔｅｎ Ｂｅｒｇｅ， Ｉ．， Ｅｉｎｓｅｌｅ， Ｈ．， ａｎｄ Ｈｕｎｉｇ， Ｔ． （２０１１）． Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ＰＢＭＣｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ， ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ＣＤ２８ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ＴＧＮ１４１２． Ｂｌｏｏｄ １１８， ６７７２－６７８２．
Ｔａｉ， Ｘ．， Ｖａｎ Ｌａｅｔｈｅｍ， Ｆ．， Ｓｈａｒｐｅ， Ａ．Ｈ．， ａｎｄ Ｓｉｎｇｅｒ， Ａ． （２００７）． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ＣＴＬＡ－４－／－ ｍｉｃｅ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ２８ ｍｏｔｉｆ ｔｈａｔ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４， １３７５６－１３７６１．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｃ．Ｂ．， Ｌｉｎｄｓｔｅｎ， Ｔ．， Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ， Ｊ．Ａ．， Ｋｕｎｋｅｌ， Ｓ．Ｌ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｈ．Ａ．， Ｅｍｅｒｓｏｎ， Ｓ．Ｇ．， Ｌｅｉｄｅｎ， Ｊ．Ｍ．， ａｎｄ Ｊｕｎｅ， Ｃ．Ｈ． （１９８９）． ＣＤ２８ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ／ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８６， １３３３－１３３７．
Ｔｉｒｏｓｈ， Ｉ．， Ｉｚａｒ， Ｂ．， Ｐｒａｋａｄａｎ， Ｓ．Ｍ．， Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ， Ｍ．Ｈ．， ２ｎｄ， Ｔｒｅａｃｙ， Ｄ．， Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ， Ｊ．Ｊ．， Ｒｏｔｅｍ， Ａ．， Ｒｏｄｍａｎ， Ｃ．， Ｌｉａｎ， Ｃ．， Ｍｕｒｐｈｙ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ． （２０１６）． Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２， １８９－１９６．
Ｚｈｅｎｇ， Ｃ．， Ｚｈｅｎｇ， Ｌ．， Ｙｏｏ， Ｊ．Ｋ．， Ｇｕｏ， Ｈ．， Ｚｈａｎｇ， Ｙ．， Ｇｕｏ， Ｘ．， Ｋａｎｇ， Ｂ．， Ｈｕ， Ｒ．， Ｈｕａｎｇ， Ｊ．Ｙ．， Ｚｈａｎｇ， Ｑ．， ｅｔ ａｌ． （２０１７）． Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｃｅｌｌ １６９， １３４２－１３５６ ｅ１３１６．

Claims (39)

  1. （ａ）ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインと、
    （ｂ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）への特異的結合が可能な抗原結合ドメインへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインと、
    （ｃ）Ｆｃ受容体に対する抗原結合分子の結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインと
    を含む、ＣＤ２８への一価結合を特徴とする二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子であって、ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な前記第２の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号３０９のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３１０のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号３１１のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号３１２又は配列番号３１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）；又は
    （ｉｉ）配列番号２のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号４のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号５のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号７のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）；又は
    （ｉｉｉ）配列番号１０のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１１のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号１３のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号１４のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）
    を含む、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  2. ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１サブクラスのものであり、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む、請求項１に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  3. ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号２６のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｈ３の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２９のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号３０のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号３１のＣＤＲ－Ｌ３の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）；又は
    （ｉｉ）配列番号１８のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２１のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
    を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  4. ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  5. ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、
    （ａ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｂ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号５１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｄ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｅ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｆ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｇ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｈ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｊ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）、又は
    （ｋ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）
    を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  6. ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）のＣＤＲと、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）のＣＤＲとを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  7. ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＣＤ２８）と、配列番号４４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＣＤ２８）とを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  8. ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
    （ｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
    （ｉｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
    （ｉｖ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ、又は
    （ｖ）配列番号２５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲ
    を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  9. ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
    （ｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
    （ｉｉｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
    （ｉｖ）配列番号２５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）、又は
    （ｖ）配列番号２５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）及び配列番号２６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）
    を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  10. ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲと、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲとを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  11. ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、請求項１から７又は１０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  12. ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）のＣＤＲと、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）のＣＤＲとを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  13. ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨＥｐＣＡＭ）と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬＥｐＣＡＭ）とを含む、請求項１から７又は１２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  14. ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメイン及び／又はＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ分子である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  15. ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及び可変ドメインＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及び可変ドメインＶＨが互いに置き換えられている、請求項１から１４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  16. ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であって、定常ドメインＣＬにおいて位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換されており、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されており、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  17. （ｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
    （ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号９１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１００のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
    を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  18. ＥｐＣＡＭへの特異的結合が可能な第２の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であって、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及び可変ドメインＶＨ、又は定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及び可変ドメインＶＨが互いに置き換えられている、請求項１から１４のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  19. ＣＤ２８への特異的結合が可能な第１の抗原結合ドメインがＦａｂ分子であって、定常ドメインＣＬにおいて位置１２３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）から選択されるアミノ酸によって置換されており、かつ、位置１２４（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって独立して置換されており、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換されており、かつ、位置２１３（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）によって独立して置換されている、請求項１から１４又は１８のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  20. （ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
    （ｉｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
    （ｉｉｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
    （ｉｖ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
    （ｖ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号７４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号２７６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
    を含む、請求項１から１４又は１８又は１９のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  21. 第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインが、それぞれＦａｂ分子であり、Ｆｃドメインが、安定な会合が可能な第１のサブユニット及び第２のサブユニットで構成され、（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、かつ第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されるか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合され、かつ第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合される、請求項１から２０のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  22. Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  23. Ｆｃドメインの第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  24. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子をコードする、１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチド。
  25. 請求項２４に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む、１つ又は複数のベクター、特に発現ベクター。
  26. 請求項２４に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチド又は請求項２５に記載の１つ又は複数のベクターを含む、宿主細胞。
  27. 二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を産生する方法であって、ａ）請求項２６に記載の宿主細胞を、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及びｂ）任意に、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子を回収する工程を含む、方法。
  28. 請求項２７に記載の方法によって産生される、二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子。
  29. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される添加物とを含む、医薬組成物。
  30. 医薬としての使用のための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. （ａ）Ｔ細胞活性化又は（ｂ）Ｔ細胞エフェクター機能の増強における使用のための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  32. 疾患の治療における使用のための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  33. 疾患ががんである、請求項３２に記載の使用のための二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は医薬組成物。
  34. 使用が、化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤と組み合わせて投与するためのものである、がんの治療における使用のための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  35. 使用が、Ｔ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体と組み合わせて投与するためのものである、がんの治療における使用のための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  36. 使用が、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与するためのものである、がんの治療における使用のための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  37. 疾患の治療、特にがんの治療のための医薬の製造における、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子、又は請求項２９に記載の医薬組成物の使用。
  38. 個体における疾患、特にがんを治療する方法であって、有効量の請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性アゴニストＣＤ２８抗原結合分子又は請求項２９に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む、方法。
  39. 化学療法剤、放射線療法及び／又はがん免疫療法における使用のための他の薬剤、特にＴ細胞活性化抗ＣＤ３二重特異性抗体、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体若しくは抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
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