KR102618718B1 - 항-4-1bb 항체 및 pd-1 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

항-4-1bb 항체 및 pd-1 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-4-1BB 작용제(agonist) 항체 및 PD-L1에 고친화도로 결합하는 PD-1 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 제공한다. 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 PD-L1을 발현하는 종양 세포와 함께, 4-1BB 상향조절된 T 세포, 특히 이펙터 CD8 + T 세포와 결합하는, 4-1BB 및 PD-L1에 동시에 독립적으로 결합한다. 이러한 상호작용은 마우스 모델에서 PD-1/PD-L1-매개된 억제 신호전달을 차단하고 4-1BB-매개된 동시자극 신호전달을 활성화함으로써 항-종양 이펙터 CD8+ T 세포의 세포독성 활성의 강력한 활성화를 유도한다. 이러한 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 각각의 성분 단독에 비해 훨씬 더 강력한 종양용해(oncolytic) 효과를 갖는다.

Description

항-4-1BB 항체 및 PD-1 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 및 이의 용도
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 1월 11일에 출원된 미국 임시 출원 제63/135,812호의 우선권을 주장하며 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
37 CFR §1.52(e)(5)에 따라, 본 명세서는 "540469WO_ST25.txt"라는 명칭의 .txt 파일로 전자적으로 제출된 서열 목록을 참조한다. .txt 파일은 2022년 1월 10일에 생성되었으며 크기가 120,095 바이트이다. 서열 목록의 전체 내용이 본원에 인용되어 포함되며 본 출원의 개시내용의 필수적인 부분을 형성한다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 항-4-1BB 작용제(agonist) 항체 및 PD-L1에 고친화도로 결합하는 PD-1 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 제공한다. 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 PD-L1을 발현하는 종양 세포와 함께, 4-1BB 상향조절된 T 세포, 특히 이펙터 CD8 + T 세포와 결합하는, 4-1BB 및 PD-L1에 동시에 독립적으로 결합한다. 이러한 상호작용은 마우스 모델에서 PD-1/PD-L1-매개된 억제 신호전달을 차단하고 4-1BB-매개된 동시자극 신호전달을 활성화함으로써 항-종양 이펙터 CD8+ T 세포의 세포독성 활성의 강력한 활성화를 유도한다. 이러한 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 각각의 성분 단독에 비해 훨씬 더 강력한 종양용해(oncolytic) 효과를 갖는다.
암은 여전히 세계 주요 사망 원인 중 하나이다. 최근 통계에 따르면 세계 인구의 13%가 암으로 사망한다. 국제 암 연구 기관(IARC: International Agency for Research on Cancer)의 추정에 따르면, 2020년에 전 세계적으로 1,930만 건의 새로운 암 사례가 발생하고 1,000만 명이 암으로 사망하였다. 2030년까지, 전 세계적으로 인구 증가와 고령화 및 흡연, 건강에 해로운 식단 및 신체 활동 부족과 같은 위험 요소에 대한 노출로 인해 새로운 암 사례가 2,170만 건이고 암으로 인한 사망이 1,300만 명으로 늘어날 것으로 예상된다. 또한, 암 치료에 따른 통증과 의료비로 인해 암 환자와 그 가족 모두의 삶의 질을 떨어뜨리고 있다. 따라서, 계속 증가하는 암 위기에 대처하기 위해 의료 전문가가 사용할 수 있는 무기고를 확장해야 할 중요한 필요성이 남아 있다.
4-1BB는 면역반응에서 T 세포와 항원 제시 세포의 표면에 발현되는 동시자극 분자의 일종으로 세포막 단백질인 종양 괴사 인자(TNF: tumor necrosis factor) 수용체군의 일종으로 알려져 있다. 4-1BB의 발현은 항원- 또는 미토젠-유도 활성화 후 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 표면에서 빠르게 유도된다. 4-1BB는 55 kDa의 동종이량체이며, 마우스의 T 세포주, 흉선세포, 성숙한 T 세포와 같은 다양한 부위에서 발현되고, ConA, 피토헤마글루티닌(PHA: phytohemagglutinin), 이노마이신, 항-CD3 항체 또는 분자 등에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있다. 또한, 4-1BB 일부는 세포 내부에 존재하여 단백질 키나제의 일종인 p561과 결합하며, 따라서 이는 4-1BB를 통해 세포 외 신호가 세포 내로 전달되는 것으로 추론될 수 있다.
예정된 세포 사멸 단백질 1(PD-1: Programmed cell death protein 1)은 다양한 암 예컨대 악성 흑색종, 비-소세포 폐암, 및 신세포암종의 치료에서 암 면역요법에 대한 우수한 표적 단백질인 면역 체크포인트 수용체이다. PD-1은 T 세포의 표면 상에 존재하는 수용체이며 면역글로불린 수퍼패밀리에 속한다. PD-1이 예정된 사멸 리간드 1(PD-L1: programmed death ligand 1) 또는 예정된 사멸 리간드 2(PD-L2)에 결합하는 경우, PD-1과 관련된 신호 전달이 활성화되고, T 세포 증식, 인터페론 감마 및 인터류킨 2 생성, 및 T 세포 수용체 신호 전달이 억제되어, T 세포 활성화가 억제된다. 다양한 종류의 암세포가 PD-L1을 발현하여 T 세포의 기능을 상실시키는 것으로 알려져 있으며, 이는 암세포가 면역계의 공격을 회피하는 기전으로 작용한다.
4-1BB/4-1BBL(4-1BB 리간드)은 자극 신호를 제공하는 반면, PD-1/PD-L1은 T 림프구에 억제 신호를 제공한다. 4-1BB에 대한 다양한 형태의 작용제 또는 PD-L1에 대한 차단제는 주로 CD8 + T 세포를 조절하는 데 강력한 항-종양 활성을 나타낸다. 따라서, 4-1BB의 작용제와 PD-L1 차단제를 결합하여 시너지 또는 부가적인 항-종양 효과가 달성될 수 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 출원의 발명자들은 치료 후보 물질의 전체 크기를 고려하고, 항체와 단백질의 다양한 조합을 시험하고, 최상의 항-종양 활성을 나타내는 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 선택함으로써 본 발명을 개발하였다.
4-1BB/4-1BBL은 자극 신호를 제공하는 반면, PD-1/PD-L1은 T 림프구에 억제 신호를 제공한다. 4-1BB에 대한 다양한 형태의 작용제 또는 PD-L1에 대한 차단제는 주로 CD8 + T 세포를 조절하는 데 강력한 항-종양 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 4-1BB의 작용제와 PD-L1 차단제를 결합하여 시너지 또는 부가적인 항-종양 효과가 달성될 수 있다고 추측한다.
이러한 점을 감안하여, 본 출원의 발명자들은 치료 후보 물질의 전체 크기를 고려하고, 항체와 단백질의 다양한 조합을 시험하고, 최상의 항-종양 활성을 나타내는 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 선택함으로써 본 발명을 개발하였다.
본 발명의 목적은 우수한 항-종양 활성을 나타내는 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (VH), (VL), (X), (VH)n, (VL)n, (X)n, (VH)n-Y, (VL)n-Y, (VH-VL)n-Y, (VL-VH)n-Y, (X)n-Y, Y-(VH)m, Y-(VL)m, Y-(VH-VL)m, Y-(VL-VH)m, 및/또는 Y-(X)m의 조합을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 제공한다. 본 발명에서, 도메인은 단일 폴리펩티드에 있을 수 있거나 "중쇄" 및 "경쇄"는 별개의 폴리펩티드에 있을 수 있다.
상기에서, VH, VL, 및/또는 X는 직접적으로 또는 N-말단 측면 또는 C-말단 측면의 힌지 및/또는 링커를 통해 Y에 연결된다.
상기에서, VH 및 VL은 4-1BB에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역을 각각 지칭한다.
상기에서, X는 변형된 또는 조작된, 친화도 성숙된, 및/또는 돌연변이된 PD-1 단백질 또는 이의 단편을 포함하여, PD-L1에 결합하는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이다.
상기에서, Y는 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역의 단편을 지칭한다. 중쇄 불변 영역의 단편은 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3, 및 이의 단편 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역의 단편은 불변 영역 도메인 CL 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, Y는 CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 단편이다. 본 발명의 실시형태에서, Y는 CH1을 포함하는 단편이다. 본 발명의 실시형태에서, Y는 CL 도메인을 포함하는 단편이다.
상기에서, n 및 m은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5의 모든 정수를 포함하는, 1 내지 5의 정수이다.
본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 N-말단 신호 펩티드를 함유할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 신호 펩티드는 일반적으로 길이가 12 내지 40, 15 내지 35, 또는 16 내지 30 아미노산이며 세포가 단백질을, 일반적으로 세포막으로 전위하도록 촉진하는 기능을 한다. 본 발명에서 사용하기 위한 신호 펩티드의 구체적인 서열은 특별히 제한되지 않으며 예컨대, 임의의 공지된 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 적합한 N-말단 신호 펩티드의 비-제한적인 예는 다음의 서열을 갖는다: MEWSWVFLVTLLNGIQC(SEQ ID NO: 29). 덜 바람직하지만, 신호 펩티드가 C-말단에 위치할 수 있는 것도 또한 가능하다.
본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질의 예는 SEQ ID NO: 1 내지 10 및 14(S01-S10)이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 SEQ ID NO: 3(S03)의 서열을 갖는다.
이들 확인된 예시적인 이중특이적 에피토프 결합 단백질과 관련하여, 이중특이적 결합이 보존되는 한 서열의 변이가 허용되는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명의 서열은 적어도 약 30 내지 40%의 전체 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 4-1BB 및 PD-L1에 대한 이중특이적 결합 친화도를 보유한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 인간화된 항체이다.
일부 실시형태에서 본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 함유하는 세포이다.
다음을 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다: 이중특이적 에피토프 결합 단백질, 본원에 기술된 핵산 분자 중 임의의 하나, 본원에 기술된 재조합 벡터 중 임의의 하나, 또는 본원에 기술된 세포 중 임의의 하나; 및 약학적으로 허용되는 담체.
본원에 기술된 약학 조성물 중 임의의 하나를 포함하는 키트가 본원에 제공된다.
이중특이적 에피토프 결합 단백질의 생산 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 생성하기에 충분한 조건 하에서 배양 배지에서 본원에 기술된 세포 중 임의의 하나를 배양하는 단계; 및 세포 및/또는 배양 배지로부터 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 회수하는 단계.
이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법이 본원에서 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: 본원에 기술된 이중특이적 에피토프 결합 단백질 중 임의의 하나, 본원에 기술된 핵산 분자 중 임의의 하나, 본원에 기술된 재조합 벡터 중 임의의 하나, 또는 본원에 기술된 세포 중 임의의 하나를 포함하거나 전달하는 조성물을 대상체에 투여하여, 질환 또는 상태를 치료하는 단계. 일부 실시형태에서, 대상체는 암에 걸렸거나 암이 발병할 위험에 있다. 일부 실시형태에서, 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 자궁관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포암종, 교모세포종, 전립선암, 및 이들의 조합을 포함한다.
상기 목적은 본 발명의 특정 양태를 강조한다. 본 발명의 추가적인 목적, 양태 및 실시형태는 본 발명의 다음의 상세한 설명에서 확인된다.
이하의 상세한 설명과 함께 이하의 도면을 참조하면 본 발명과 그에 수반되는 많은 이점은 그것이 더 잘 이해됨에 따라 쉽게 얻을 수 있을 것이다.
도 1은 T 세포 인게이저 및 체크포인트 억제제의 이중 기능에 대한 이중특이적 에피토프 결합 단백질의 작용 방식을 도시한다.
도 2는 실시예 1에 기술된 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S01 내지 S11에 대한 설계를 도시한다.
도 3은 비-환원 및 환원 조건 하에서 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S01 내지 S11에 대한 SDS-PAGE 분석(실시예 2 참조)의 결과를 도시한다.
도 4는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S01 내지 S11에 대한 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)(실시예 3 참조)의 결과를 도시한다.
도 5a는 PD-L1에 대한 인간 PD1-Fc 결합에 대한 표면 플라즈몬 공명 분석의 결과를 도시한다. 도 5b는 PD-L1에 대한 SO3 결합에 대한 표면 플라즈몬 공명 분석의 결과를 도시한다.(실시예 4 참조)
도 6a는 실시예 5에서 단일 항원 결합 ELISA에 대한 분석 방법을 도시한다. 도 6b는 4-1BB에 결합하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S01 내지 S11의 결과를 도시한다. 도 6c는 PD-L1에 결합하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S01 내지 S11의 결과를 도시한다. 도 6d는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S03 및 null 변이체 S12(4-1BB null) 및 S13(PD-L1 null)의 이중특이적 항체 설계를 도시한다. 도 6e는 4-1BB에 결합하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S03, 및 null 변이체 S12 및 S13의 결과를 도시한다. 도 6f는 PD-L1에 결합하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S03, 및 null 변이체 S12 및 S13의 결과를 도시한다.
도 7a는 실시예 6의 이중 항원 결합 ELISA에 대한 분석 방법을 도시한다. 도 7b는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S01 내지 S11에 대한 이중 항원 결합 ELISA의 결과를 도시한다. 도 7c는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S03, null 변이체 S12(4-1BB null) 및 S13(PD-L1 null)에 대한 이중 항원 결합 ELISA의 결과를 도시한다.
도 8은 실시예 7의 세포 결합 분석 결과를 도시한다. 구체적으로, 도 8은 분석에 사용되는 다양한 세포주에서 4-1BB 및 PD-L1의 발현 수준을 도시한다.
도 9a(MDA-MB-231-Luc) 및 도 9b(FaDu)는 PD-L1 양성 세포주를 갖는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체에 대한 FACS 분석 결과를 도시한다. 도 9c는 4-1BB 양성 세포주를 갖는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체에 대한 FACS 분석 결과를 도시한다. 도 9d(MCF-7)는 PD-L1 및 4-1BB 음성 세포주를 갖는 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체에 대한 FACS 분석 결과를 도시한다.(실시예 7 참조)
도 10은 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S01 내지 S11에 대하여 실시예 8에서의 4-1BB 생물분석 결과를 도시한다.
도 11a는 실시예 9에 기술된 4-1BB/PD-1 조합 생물분석을 도시한다. 도 11b는 항-4-1BB 항체(94kvt-조작된 IgG1, SEQ ID NO: 14 및 21), 항-PD-1 항체(펨브롤리주맙, MSD), 항-PD-L1 항체(아테졸리주맙, Roche), 및 euPD-1 Fc(SEQ ID NO: 22), 및 항-4-1BB 항체와 euPD-1 Fc의 특정 조합과 비교하여 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S03에 대한 4-1BB/PD-1 조합 생물분석의 결과를 도시한다.
도 12a는 PD-L1 및 PD-L2에 대한 인간 PD1-Fc의 결합을 시험하는 ELISA 분석 결과를 도시한다. 도 12b는 PD-L1에 대한 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S03, 항-PD-L1 항체, 및 항-PD-L2 항체의 결합을 시험하는 ELISA 분석 결과를 도시한다. 도 12c는 PD-L2에 대한 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S03, 항-PD-L1 항체, 및 항-PD-L2 항체의 결합을 시험하는 ELISA 분석 결과를 도시한다.(실시예 10 참조)
도 13은 실시예 11의 세포독성 분석 결과를 도시한다.
도 14는 실시예 12의 IFN-γ 분석 결과를 도시한다.
도 15a는 4-1BB 양성 세포주에 대한 실시예 13의 항체-의존적 세포 세포독성 분석 결과를 도시한다. 도 15b는 PD-L1 양성 세포주에 대한 실시예 13의 항체-의존적 세포 세포독성 분석 결과를 도시한다.
도 16은 실시예 14의 보체-의존적 세포독성 분석 결과를 도시한다.
도 17a는 실시예 15에 기술된 바와 같이 h4-1BB 녹-인(knock-in) 마우스를 사용한 S03, S05 및 S07의 생체 내 효능에 대한 분석을 나타낸다. 도 17b는 종양 크기와 관련하여 h4-1BB 녹-인 마우스를 사용한 S03, S05 및 S07의 생체 내 효능 연구 결과를 도시한다.
도 18a는 실시예 16에 기술된 바와 같이 종양 크기와 관련하여 h4-1BB 녹-인 마우스를 사용한 S03의 생체 내 효능 연구 결과를 도시한다. 도 18b는 혈액 내 T 세포 집단에 대한 h4-1BB 녹-인 마우스를 사용한 S03의 생체 내 효능 연구 결과를 도시한다.
도 19는 실시예 17에 기술된 바와 같이 종양 크기에 대해 h4-1BB 및 hPD-1 이중 녹-인 마우스를 사용한 S03의 생체 내 효능 연구 결과를 도시한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야(예컨대 효소학, 생화학, 세포 생물학, 분자 생물학 및 의료 과학 분야)의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용된다.
본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 모든 방법 및 재료는 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으며, 적합한 방법 및 재료는 본원에 기술되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체 내용이 인용되어 포함된다. 충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법, 및 예는 예시일 뿐이며 달리 명시되지 않는 한 제한하려는 의도가 아니다.
본 발명은 (VH), (VL), (X), (VH)n, (VL)n, (X)n, (VH)n-Y, (VL)n-Y, (VH-VL)n-Y, (VL-VH)n-Y, (X)n-Y, Y-(VH)m, Y-(VL)m, Y-(VH-VL)m, Y-(VL-VH)m, 및/또는 Y-(X)m의 조합을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 제공한다. 본 발명에서, 도메인은 단일 폴리펩티드에 있을 수 있거나 "중쇄" 및 "경쇄"는 별개의 폴리펩티드에 있을 수 있다.
상기에서, VH, VL, 및/또는 X는 직접적으로 또는 N-말단 측면 또는 C-말단 측면의 힌지 및/또는 링커를 통해 Y에 연결된다. 예를 들어, VH, VL, 및/또는 X는 직접적으로 또는 힌지 또는 링커를 통해 CH2에 연결되고, 독립적으로, CH3은 직접적으로 또는 힌지 또는 링커를 통해 VH, VL, 및/또는 X에 연결된다.
상기에서, VH 및 VL은 4-1BB에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 각각을 지칭한다.
상기에서, X는 변형된 또는 조작된, 친화도 성숙된, 및/또는 돌연변이된 PD-1 단백질 또는 이의 단편을 포함하여, PD-L1에 결합하는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이다.
상기에서, Y는 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역의 단편을 지칭한다. 중쇄 불변 영역의 단편은 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3, 및 이의 단편 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역의 단편은 불변 영역 도메인 CL을 포함할 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, Y는 CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 단편이다. 본 발명의 실시형태에서, Y는 CH1을 포함하는 단편이다. 본 발명의 실시형태에서, Y는 CL 도메인을 포함하는 단편이다.
본 발명의 실시형태에서, Y는 인간 IgG 항체로부터 유도된다.
3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3, 및 이의 단편과 관련하여, CH1, CH2, 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1(SEQ ID NO: 32), IgG2(SEQ ID NO: 34), IgG3(SEQ ID NO: 35), 및 IgG4(SEQ ID NO: 36) 각각에 대한 중쇄 불변 영역은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에서, 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3, 및 이의 단편 중 하나 이상이 사용될 수 있다. 이를 위해, Y(하나 이상의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3, 및 이의 단편 포함)는 임의의 SEQ ID NO: 32, 34, 35, 또는 36 또는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 유도될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, Y(하나 이상의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3, 및 이의 단편 포함)는 SEQ ID NO: 32의 서열 또는 SEQ ID NO: 32와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성인 서열을 갖는 IgG1 중쇄 불변 영역으로부터 유도되며 여기서 상기 변이체는 부가, 결실, 및/또는 치환을 포함한다. 변형된 중쇄 불변 영역의 예는 본 발명에서 사용하기 위한 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3, 및 이의 단편 중 하나 이상이 유도될 수 있는 SEQ ID NO: 33이다.
불변 영역 CL, 및 이의 단편과 관련하여, 면역글로불린 카파(SEQ ID NO: 37), 면역글로불린 람다 1(SEQ ID NO: 38), 및 면역글로불린 람다 2(SEQ ID NO: 39)에 대한 경쇄 불변 영역이 당업계에 잘 알려져 있다. 이를 위해, Y는 임의의 SEQ ID NO: 37 내지 39 또는 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열로부터 유도될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, Y는 SEQ ID NO: 37의 서열 또는 SEQ ID NO: 37과 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성인 서열을 갖는 면역글로불린 카파 경쇄 불변 영역으로부터 유도되며 여기서 상기 변이체는 부가, 결실, 및/또는 치환을 포함한다.
상기에서, n 및 m은 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5의 모든 정수를 포함하는, 1 내지 5의 정수이다.
(VH), (VL), (VH)n-Y, (VL)n-Y, (VH-VL)n-Y, (VL-VH)n-Y, (X)n-Y, Y-(VH)m, Y-(VL)m, Y-(VH-VL)m, Y-(VL-VH)m, 및/또는 Y-(X)m의 영역은, 존재하는 경우, N-말단 에서 C-말단의 임의의 순서로 나타날 수 있다. 또한, (VH), (VL), (VH)n-Y, (VL)n-Y, (VH-VL)n-Y, (VL-VH)n-Y, (X)n-Y, Y-(VH)m, Y-(VL)m, Y-(VH-VL)m, Y-(VL-VH)m, 및/또는 Y-(X)m의 다수의 복사본이 존재하는 경우, 이들은 다른 영역에 대해 임의의 순서로 존재할 수 있으며 유사한 종류의 영역에 직접 인접할 필요는 없다.
본 발명의 실시형태에서, 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 An-A'n'-B-Cm-C'm'의 구조를 가지며,
여기서:
A, A', C, C': VH, VL, VH-VL, VL-VH 또는 X
B: Y
VH, VL, X, Y, n, 및 m은 상기 정의된 바와 같으며 각각의 VH, VL, X, Y는 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지로 연결된다. 값 'n' 및 m'은 독립적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5의 모든 정수를 포함하는 1 내지 5의 정수이다.
본 발명의 실시형태에서, 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 An-B-Cm의 구조를 가지며,
여기서:
A 또는 C: VH-VL, VL-VH 또는 X
B: Y
VH, VL, X, Y, n, 및 m은 상기 정의된 바와 같으며 각각의 VH, VL, X, Y는 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지로 연결된다.
본 발명의 실시형태에서, CH1 도메인은 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지로 (VH-VL)n, (VL-VH)n, 또는 (X)n에 C-말단으로 연결되며 CH2/CH3 도메인은 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지로 (VH-VL)m, (VL-VH)m, (X)m에 N-말단으로 연결된다. 또한, 이러한 실시형태에서 CH1 도메인은 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지로 CH2/CH3 도메인에 연결된다. 상기에서, VH, VL, X, n, 및 m은 상기 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 별개의 폴리펩티드 상에 각각 중쇄 및 경쇄를 갖는 실시형태를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 중쇄는 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지를 통해 CH2에 연결된 VH-VL, VL-VH, X, 및/또는 VH-CH1을 포함하고, 독립적으로, CH3은 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지를 통해 VH-VL, VL-VH 또는 X에 연결된다. 이러한 실시형태에서, 경쇄는 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지로 CL에 연결된 VL을 포함한다. VH, VL, 및 X는 상기 정의된 바와 같고 각각의 VH, VL, X, CH1, CH2, CH3, 및 CL은 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지를 통해 연결된다. 이러한 실시형태의 예로서, S09 및 S10(도 2 참조)이 참조되며 여기서 상기 S09는 SEQ ID NO: 9의 중쇄 및 SEQ ID NO: 14의 경쇄를 갖고 S10은 SEQ ID NO: 10의 중쇄 및 SEQ ID NO: 14의 경쇄를 갖는다.
이중특이적 에피토프 결합 단백질이 scFv 형태인 것이 바람직하다.
본 발명의 예시적인 실시형태에서, (VH 및 VL, 어느 순서로든)n-Y 및/또는 Y-(X)m을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 제공되며,
여기서:
Y는 독립적으로 CH2 또는 CH3 도메인이고;
VH, 및 VL, 및 CH2 및/또는 CH3, 또는 CH2 및/또는 CH3 및 X는 직접적으로 또는 힌지 및/또는 링커로 연결되고;
VH 및 VL은 4-1BB에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 각각을 지칭하고;
X는 변형된 또는 조작된, 친화도 성숙된, 및/또는 돌연변이된 PD-1 단백질 또는 이의 단편을 포함하여, PD-L1에 결합하는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이고;
n 및 m은 각각 1, 2, 3, 4, 또는 5의 모든 정수를 포함하는, 1 내지 5의 정수이다.
이러한 실시형태의 특정 예는 N-말단에서 C-말단으로 기재된 (VL-VH)n-CH2-CH3-(X)m으로 배열된 scFv이다. VL, VH, X, n, 및 m은 상기 정의된 바와 같다. 이러한 예의 실시형태에서 VL 및 VH는 링커에 의해 연결되고, VH 및 CH2는 링커에 의해 연결되고, CH3 및 (X)m은 링커에 의해 연결되고/되거나, CH2 및 CH3은 링커에 의해 연결된다. 이러한 실시형태에서, 링커 중 하나 이상은 힌지가 뒤따를 수 있거나 뒤따른다. 대안적으로, 전술된 연결 중 하나 이상은 직접 연결되거나 힌지에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 또 다른 예시적인 실시형태는 (X)m-Y 및/또는 Y-(VH 및 VL, 어느 순서로든)n을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질이고,
여기서:
Y는 독립적으로 CH2 또는 CH3 도메인이고;
VH, 및 VL, 및 CH2 및/또는 CH3, 또는 CH2 및/또는 CH3 및 X는 직접적으로 또는 힌지 및/또는 링커를 통해 연결되고;
VH 및 VL은 4-1BB에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 각각을 지칭하고;
X는 변형된 또는 조작된, 친화도 성숙된, 및/또는 돌연변이된 PD-1 단백질 또는 이의 단편을 포함하여, PD-L1에 결합하는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이고;
n 및 m은 각각 1, 2, 3, 4, 또는 5의 모든 정수를 포함하는 1 내지 5의 정수이다.
본 실시형태의 특정 예는 N-말단에서 C-말단으로 기재된 (X)m-CH2-CH3-(VH-VL)n으로 배열된 scFv이다. VL, VH, X, n, 및 m은 상기 정의된 바와 같다. 이러한 예의 실시형태에서 (X)m 및 CH2는 링커에 의해 연결되고, CH3 및 VH는 링커에 의해 연결되고, VH 및 VL은 링커에 의해 연결되고/되거나 CH2 및 CH3은 링커에 의해 연결된다. 이러한 실시형태에서, 링커 중 하나 이상은 힌지가 뒤따를 수 있거나 힌지가 뒤따른다. 대안적으로, 전술된 연결 중 하나 이상은 직접적일 수 있거나 힌지에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 실시형태에서 n 및 m 각각은 개별적으로 정수 1, 2, 3, 4, 또는 5로부터 선택되어 이러한 정수 값을 갖는 n 및 m의 임의의 조합이 존재할 수 있다. 다수의 VH, VL, 및/또는 X가 존재하는 경우(즉, n 및/또는 m은 1보다 큰 값임), 이는 직접적으로 연결될 수 있거나 복사본이 힌지 및/또는 링커 서열에 의해 분리될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 다중 복사본은 링커 서열에 의해 분리된다.
본 발명에 따른 (VH 및 VL, 어느 순서로든)n-Y 및/또는 Y-(X)m을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 이중 특이적 치료제의 제1 암(arm)이고, 제2 암으로서 동일한 (VH 및 VL, 어느 순서로든)n-Y 및/또는 Y-(X)m을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 가져서 쌍을 형성한다. 쌍의 제1 암이 (X)m-Y 및/또는 Y-(VH 및 VL, 어느 순서로든)n인 경우, 이중특이적 에피토프 결합 단백질의 제2 암이 동일한 (X)m-Y 및/또는 Y-(VH 및 VL, 어느 순서로든)n을 포함하는 경우도 마찬가지이다. 즉, 본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 구성하는 생성된 항체는 쌍의 다른 암과 한 팔에서 동일한 배열을 가져야 한다.
VH, 및 VL 및 CH2 및/또는 CH3, 또는 CH2 및/또는 CH3 및 X는 직접적으로 또는 힌지 및/또는 링커를 통해 연결될 수 있다. 시스테인 잔기는 힌지 및/또는 링커를 통한 연결을 위해 연결 부위에 포함될 수 있다. 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하는 동안, VH 및 VL 및 CH2 및/또는 CH3, 또는 CH2 및/또는 CH3 및 X는 직접적으로 또는 힌지 및/또는 링커를 통해 연결될 수 있다.
치료 후보 물질의 전체 크기와 항체와 단백질의 다양한 조합을 고려할 때, 항 4-1BB 항체 단편과 PD-1에 고친화도로 결합하는 가용성 PD-1의 조합을 통해 최고의 항-종양 활성이 나타났다.
본 발명의 실시형태에서, VH 영역은 SEQ ID NO: 23을 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, VL 영역은 SEQ ID NO: 25를 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, 항-4-1BB는 항체 단편은 SEQ ID NO: 23을 포함하는 VH 영역 및 SEQ ID NO: 25를 포함하는 VL 영역을 갖는다.
본 발명의 실시형태에서, 항-4-1BB 항체 단편은 scFv 형태이다.
본 발명의 실시형태에서, SEQ ID NO: 23을 코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 24의 서열이다. 본 발명의 실시형태에서, SEQ ID NO: 25를 코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 26의 서열이다.
SEQ ID NO: 23:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQGLEWIGEINPGNGHTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFKTARAFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 24:
caggtccagctggtgcagagcggcgccgaagtgaaaaaacctggggcaagtgtcaagctgtcctgtaaggccagcggttataccttctcctcatattggatgcactgggtgaggcaagcccctggacaagggctggaatggatcggtgaaattaatcccggaaatggccatacaaactacaatgaaaaattcaaaagtcgagtgaccatgacacgggacacatccacttccactgcatacatggagctttcgagtctgcgctccgaggatacagctgtctattactgcgcacgcagttttaaaactgccagagcctttgcctactggggtcagggaaccctggtcaccgttagcagc
SEQ ID NO: 25:
DIVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASQTISDYLHWYQQKPDQAPKLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCQDGHSWPPTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 26:
gacattgtgatgacacagtcccctgctttcctgagcgttacacccggcgaaaaggtgactatcacatgcagggctagtcagaccatctcagactaccttcattggtatcaacagaagccagaccaggctcctaagttgctgataaagtacgcctcccaatccatttccggcattccttcccgtttttccggctccggctccggcaccgactttacgttcaccatctcttctttggaggctgaagacgcagctacctattactgtcaggatggtcacagctggccaccaactttcgggcaaggcaccaagctggagatcaaa
PD-1 단백질 또는 단편은 PD-L1에 결합하는 한 친화도 성숙과 함께/없이 사용될 수 있다. 따라서, PD-1 단백질 또는 이의 단편은 천연 PD-1 또는 이의 단편일 수 있다. 대안적으로, PD-1 단백질 또는 이의 단편은 변형되거나 조작될 수 있고, 친화도 성숙되고/되거나 돌연변이될 수 있다. 분자적으로 진화된 PD-1을 얻기 위해, 먼저 PD-1과 PD-L1 사이의 3D 복합체가 사용되고, 주요 기여 PD-1 아미노산이 선택되었고, 선택된 아미노산으로 무작위 돌연변이가 구성되었고, 스크리닝을 위해 효모 표면 디스플레이가 사용되었다. 친화도 성숙된 PD-1을 euPD-1로 지칭하였다. 적어도 약 30 내지 40% 전체 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는, PD-1 단백질 또는 이의 단편의 돌연변이와 관련하여, PD-1 단백질 또는 이의 단편은 PD-L1에 대한 특이적 결합 친화도를 보유한다.
본 발명의 실시형태에서, euPD-1은 SEQ ID NO: 27의 서열을 포함할 수 있다. 전술한 설명과 일관되게, PD-1 단백질 또는 이의 단편은 SEQ ID NO: 27에 대해 적어도 약 30 내지 40% 전체 서열 동일성을 가질 수 있고, 바람직하게는 SEQ ID NO: 27에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 85% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있고, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO: 27에 대해 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가질 수 있고, 여기서 상기 PD-1 단백질 또는 이의 단편은 PD-L1에 대한 특이적 결합 친화도를 보유한다.
본 발명의 실시형태에서, SEQ ID NO: 27을 코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 28의 서열이다.
SEQ ID NO: 27:
FLESPDRPWNAPTFSPALLLVAEGDNATFTCSFSNASESFHVVWHRESPSGQTDTLAAFPEDRSQPGQDHRFRVTRLPNGRDFHMSVVRAQRNDSGTYVCGVISLAPKIQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVG
SEQ ID NO: 28:
tttctcgaatcaccggacagaccctggaatgcgcccacattctcaccagcacttttgctggtagcagagggcgataatgctacattcacgtgttccttcagtaatgcaagcgagtcatttcatgtggtttggcatcgagagtcacctagtgggcagactgatacacttgccgcattcccggaagatcgctcccagccaggtcaggatcaccggttcagggtaacccgactgccgaatgggcgcgatttccatatgagcgttgtccgggcgcaacggaacgatagtggaacatacgtgtgtggcgtaatatccctcgctcccaaaatacaaataaaggagtctctgagagcagagctgagagtgacagaacgacgggcggaagttcccacggctcatccgtcaccaagtccgcgccccgcaggccaatttcaaacgctcgtcgtaggc
본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 신호 펩티드, 예컨대 N-말단 신호 펩티드를 함유할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 신호 펩티드는 일반적으로 길이가 12 내지 40, 15 내지 35, 또는 16 내지 30 아미노산이고 세포로 하여금 단백질을, 일반적으로 세포막으로 전위하도록 촉진하는 기능을 한다. 본 발명에서 우리를 위한 신호 펩티드의 구체적인 서열은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 임의의 알려진 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 적합한 N-말단 신호 펩티드의 비-제한적인 예는 다음의 서열을 갖는다: MEWSWVFLVTLLNGIQC(SEQ ID NO: 29). 덜 바람직하지만, 신호 펩티드가 C-말단에 위치할 수 있는 것도 또한 가능하다.
본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질의 예는 SEQ ID NO: 1 내지 10 및 14(S01 내지 S10)이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 SEQ ID NO: 3의 서열(S03)을 갖는다.
이러한 확인된 예시적인 이중특이적 에피토프 결합 단백질과 관련하여, 이중특이적 결합이 보존되는 한 서열의 변이가 허용되는 것으로 이해된다. 따라서, 4-1BB와 PD-L1에 대한 이중특이적 결합 친화도를 보유하는 본 발명의 서열은 적어도 약 30 내지 40%의 전체 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는다.
세포 결합 및 이중 항원 분석을 통해, S03(SEQ ID NO: 3)이 두 표적에 동시에 독립적으로 결합함을 확인하였다.
4-1BB 생물분석의 결과, 생물학적으로 관련된 MOA-기반 분석은 S03에 의한 강력한 PD-L1-의존성 T 세포 활성화를 나타냈다.
4-1BB 녹-인 마우스 모델에서 인간 PD-L1-발현 종양 세포에 대해 시험했을 때, S03은 각 성분 단독 및 S05 또는 S07과 같은 다른 후보에 비해 훨씬 더 강력한 종양용해 효과를 나타냈다.
또한, S03이 주입되는 경우, 말초혈액에서 T 세포, 특히 이펙터 CD8 + T 세포가 증가하여, 그 결과, 종양의 크기가 감소하였다. S03은 CD8+ T 세포 침윤을 촉진하고 2개의 상이한 표적인 4-1BB 및 PD-L1에 동시에 결합함으로써 종양 부위에서 제자리에서 T 세포를 활성화하는 유망한 항-종양제이다.
그 결과, S03은 항-4-1BB 항체 및 euPD-1을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질이며, 다음의 특성을 나타낸다:
1. Fc 조작을 통한 감소된 ADCC 및 CDC 활성;
2. 천연 PD-1보다 강력한 결합 친화도;
3. 시험관 내 전임상 연구에서 PD-L1-양성 종양-지시적 T-세포 반응을 선택적으로 활성화하고 강화함.
4. 대조군 항체에 비해 종양 제거에 더 나은 효과.
"이중특이적(Bispecific)" 또는 "이중 특이적(dual specific)"은 표적에 특이적으로 결합하여 두 개의 상이한 표적의 활성을 조절할 수 있는 결합 단백질의 특성이며, 제조는 항체 또는 각 표적에 특이적으로 결합하는 단백질에 의해 수행되거나, 또는 이의 단편, 및 이에 결합하는 각 항원에 대해 1가인 2개의 별개의 항원-결합 암(암: 2개의 표적에 대한 특이성)을 보유한다. 특히, 본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 4-1BB 및 PD-L1의 특이적 결합 또는 4-1BB 및 PD-L1에 대한 특이적 친화도를 갖는 것에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항-4-1BB 항체를 지칭한다. 본 발명의 범주는 4-1BB에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 항원-결합 단편도 또한 포함한다.
용어 "PD-1 단백질"은 PD-1 단백질 또는 PD-L1에 결합하는 단편을 포함한다. 본 발명의 범주는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 완전한 재조합 단백질 형태뿐만 아니라, 재조합 단백질 분자의 PD-1-결합 단편도 또한 포함한다. 또한, 상기 언급한 바와 같이, PD-1 단백질 또는 단편은 이것이 PD-L1에 결합하는 한 친화도 성숙과 함께/친화도 성숙 없이 사용될 수 있다. 따라서, PD-1 단백질 또는 이의 단편은 천연 PD-1 또는 이의 단편일 수 있다. 대안적으로, PD-1 단백질 또는 이의 단편은 상기 설명과 일치하게 변형된 또는 조작된, 친화도 성숙된, 및/또는 돌연변이될 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전장 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가진 구조를 가지며, 각각의 경쇄는 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하는 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH, 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전장 중쇄, 및 이의 단편을 지칭한다. 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하는 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL, 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄, 및 이의 단편을 지칭한다.
전체(whole) 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG의 하위유형 또는 변이체를 포함하고, 특히, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 유형 및 하위부류 감마 1(γ1), 감마 2(γ2), 감마 3(γ3), 감마 4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 갖는다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 유형을 포함한다.
항체의 항원-결합 단편 또는 항체 단편은 항원-결합 기능을 가진 단편을 지칭하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중에서, Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역, 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제1 불변 영역(CH1)을 갖는 구조를 가지며, 하나의 항원-결합 부위를 갖는다. Fab'은 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지-영역을 갖는다는 점에서 Fab와 상이하다. F(ab')2 단편은 Fab'의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성할 때 형성된다.
Fv는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 갖는 최소 항체 단편에 해당한다. 이중-쇄 Fv(2-쇄 Fv)에서는, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 비-공유결합으로 연결되어 있고, 단일-쇄 Fv(scFv)에서는, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 펩티드 링커를 통해 공유결합으로 연결되거나 C-말단에서 직접적으로 연결되어 이중쇄 Fv와 같은 이량체와 같은 구조를 형성한다. 이러한 항체 단편은 단백질 분해 효소에 의해 제조될 수 있거나(예컨대 파파인으로 온전한 항체를 제한 분해하여 Fab을 생성하고, 펩신으로 분해하면 F(ab')2를 생성함), 유전자 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 포함하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인이 연결된 이량체이다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인 및 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab' 단편의 C-말단에 존재하는 힌지 영역에서 시스테인에 의해 공유 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.
"단일 사슬 Fv(scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된 작제물이다. scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성하도록 하는 폴리펩티드 링커는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에서 "힌지"는 특별히 제한되지 않으며 당업계에 잘 알려져 있다. 힌지는 이황화 결합에 의해 이들 2개의 사슬을 연결하는, IgG 및 IgA 면역글로불린 클래스의 중쇄 중앙 부분에 있는 유연한 아미노산 스트레치를 지칭한다. 이는 시스테인과 프롤린 아미노산이 풍부하고, 아미노산 서열이 매우 다양하며, 임의의 다른 면역 글로불린 영역과 유사하지 않다. 힌지 영역은 길이가 다양할 수 있고 일반적으로 10 내지 50개의 아미노산 잔기 범위이다. 문헌[Adlersberg JB, Ric Clin Lab. Jul-Sep 1976; 6(3):191-205]의 리뷰를 참조한다. 예로서, EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 30) 및 DKTHTCPPCP(SEQ ID NO: 31)의 힌지 서열에 대한 언급이 이루어진다.
힌지가 링커 서열을 뒤따르도록 하는 것이 본 발명에서 특히 유리하다. 링커 서열 앞에 힌지가 올 수도 있다.
본 발명의 항체는 모노클로날 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, scFvs, Fab 단편s, F(ab')2 단편, 이황화-연결된 Fv(sdFv) 및 항-이디오타입(idiotypic)(항-Id) 항체, 또는 항체의 에피토프-결합 단편, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중 임의의 하나의 이소형으로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 불변 영역은 감마 1(IgG1), 감마 2(IgG2), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 유형일 수 있다.
모노클로날 항체는 항체의 실질적으루 균질한 집단으로부터 수득된 항체를 지칭한다. 즉, 이는 항체 중 소량으로 존재할 수 있는 자연적인 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 의미한다. 모노클로날 항체는 특이성이 높기 때문에, 단일 항원 부위에 대해 유도된다. 일반적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 기존의 (폴리클로날) 항체와 달리, 각 모노클로날 항체는 항원의 단일 결정기에 대해 지시된다.
용어 "에피토프"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 지칭한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 화학적 활성 표면 분자 군으로 구성되며, 일반적으로 특정 3차원 구조적 특성과 특정 전하 특성을 가지고 있다.
"인간화된" 형태의 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 유지하는 마우스, 랫트, 토끼, 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종의 초가변 영역(공여자 항체)의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다.
용어 "인간 항체"는 상보성 결정 영역 및 구조적 영역을 포함하여 항체를 구성하는 전체 아미노산 서열이 인간 면역글로불린으로 구성된, 인간 면역글로불린으로부터 유래된 분자를 지칭한다.
키메라 항체(면역글로불린) 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 항체의 단편인, 화학 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 갖는 반면, 나머지 사슬은 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 갖는다.
본원에서 사용된 항체의 "가변 영역"은 상보성 결정 영역(CDR; 즉, CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 프레임워크 영역(FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
용어 "상보성 결정 영역(CDR)"은 항원 결합에 필요한 실재물인 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
"프레임워크 영역(FR)"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 일반적으로 4개의 FR을 갖는다: FR1, FR2, FR3 및 FR4.
scFv는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어진 작제물인 항체 단편이다. 이는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있도록 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 단일 폴리펩티드이다.
링커는 펩티드 링커일 수 있으며 인용된 것처럼 각각의 정수 값을 포함하여 약 10 내지 25 aa, 약 10 내지 20 aa, 또는 약 12 내지 19 aa의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 링커는, 예를 들어 (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m(n 및 m은 각가 1 내지 10임, 즉, n 및 m은 독립적으로 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있음)을 포함할 수 있지만, 링커는, 예를 들어 (GnS)m(n 및 m은 각가 1 내지 10임, 즉, n 및 m은 독립적으로 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있음)일 수 있다. 특정 참조가 (G4S)3(SEQ ID NO: 15) 또는 (G4S)2(SEQ ID NO: 16) 링커에 대해 주어진다. 링커는 또한 218 링커(SEQ ID NO: 17) 또는 218S 링커(SEQ ID NO: 18)의 하나 이상의 복사본일 수 있다. 물론, 본 발명에서 또한 전술한 링커의 조합이 고려된다.
실시형태에서, 본 발명은 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 핵산을 단리하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 즉, 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 코딩하는 핵산, 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터, 및 핵산 및/또는 벡터를 함유하는 세포가 본 발명에 포함된다.
"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 것으로 해석되며, 핵산의 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 천연 뉴클레오티드 뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체도 포함하는 것으로 해석된다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 이러한 변형은 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 비-보존적 또는 보존적 치환을 포함한다.
DNA는 기존의 분자 생물학적 기술을 사용하여 쉽게 단리되거나 합성될 수 있으며, 핵산은 단리되어 복제가능한 벡터에 삽입되어 추가 클로닝(DNA 증폭) 또는 추가 발현이 가능하다. 이에 기초하여, 본 발명은 다른 양태의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 표적 유전자를 발현시키는 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 등을 포함한다. 벡터의 성분은 일반적으로 비제한적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다. 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 코딩하는 핵산은 프로모터, 전사 종결 서열 등과 작동 가능하게 연결된다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터, 신호 서열 또는 전사 조절자 결합 부위의 어레이)과 또 다른 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하며, 이로써 조절 서열은 또 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절한다.
원핵 세포가 숙주인 경우, 이는 일반적으로 전사를 전파할 수 있는 강력한 프로모터(예컨대 tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터, 등), 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위, 및 전사/번역 종결 서열을 포함한다. 또한, 예컨대, 진핵 세포가 숙주로서 사용되는 경우, 포유류 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예컨대 메탈로티오네인 프로모터, β-액틴 프로모터, 인간 헤모글로빈 프로모터 및 인간 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 유래된 프로모터(예컨대, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 거대세포바이러스(CMV: cytomegalovirus) 프로모터, HSV tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV: mouse mammary tumor virus) 프로모터, HIV LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터, 엡스타인-바 바이러스(EBV: Epstein-Barr virus)의 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV: rous sarcoma virus)의 프로모터)가 사용될 수 있으며, 일반적으로 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열이 포함된다.
상황에 따라, 벡터는 이로부터 발현된 이중특이적 에피토프 결합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해 다른 서열과 융합될 수 있다. 융합될 서열은 예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, 미국 소재), 말토스 결합 단백질(NEB, 미국 소재), FLAG(IBI, 미국 소재), 6x His(헥사히스티딘; Qiagen, 미국 소재) 등을 포함한다.
벡터는 선택 마커로서 당업계에서 일반적으로 사용되는 항생제 내성 유전자를 함유한다. 예를 들어, 이들은 암피실린, 겐타마이신, 카르베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 내성이 있는 유전자이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 재조합 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포는 비제한적으로 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵 세포일 수 있다.
대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilus) 및 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)를 포함하는 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예컨대 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코커스(Staphylococcus)(예컨대 스타필로커스 카르노서스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포가 사용될 수 있다.
그러나, 동물 세포가 가장 관심있으며, 유용한 숙주 세포주의 예는 MDA-MB-231, MCF-7, FaDu, Jurkat, MC38, COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다: 숙주 세포를 배양하여 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 생성하는 단계; 및 생성된 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 단리 및 정제하는 단계.
숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지로서 시판되는 배지가 제한 없이 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 모든 필수 보충제는 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 이미 사용되며 당업자에게 자명할 것이다.
이중특이적 에피토프 결합 단백질의 회수를 위해, 원심분리 또는 한외여과를 통해 불순물이 제거될 수 있으며, 결과물은 친화성 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하여 정제될 수 있다. 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 등과 같은 다른 추가적인 정제 기술이 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 포함하는, 종양 또는 암의 예방 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것이다.
용어 "예방"은 획기적인 사례의 절대적인 제거를 요구하지 않는다. 따라서, 용어 "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 질병의 임상 증상을 억제하거나 진행을 지연시키는 임의의 작용을 지칭하고, 용어 "치료"는 질병의 임상 증상의 발달을 억제하거나, 임상 증상의 완화 또는 제거를 지칭한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제형에서 통상적으로 사용되며, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 광유, 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 상기 성분 외에, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구로 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 내 주입, 복강 내 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비강 내 투여, 폐 내 투여 및 직장 투여를 통해 투여될 수 있다.
단백질 또는 펩티드는 경구 투여시 소화되기 때문에, 경구 조성물은 활성제를 코팅하거나 위에서 분해로부터 보호하도록 제형화되어야 한다. 또한, 약학 조성물은 활성 물질을 표적 세포로 수송할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적절한 투여량은 제형화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 의학적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설율 및 반응 민감도와 같은 인자에 따라 달라진다. 숙련된 의사는 원하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약학 조성물의 일일 투여량은 0.0001 내지 100 mg/kg이며 여기서 상기 "kg"은 대상체의 체중을 지칭한다. 일일 투여량의 하한은 0.0001, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 22.5, 25, 27.5, 30, 32.5, 35, 37.5, 및 40 mg/kg일 수 있다. 일일 투여량의 상한은 100, 97.5, 95, 92.5, 90, 87.5, 85, 82.5, 80, 77.5, 75, 72.5, 70, 67.5, 65, 62.5, 60, 57.5, 55, 52.5, 50, 47.5, 45, 42.5, 및 40 mg/kg일 수 있다. 또한 전술된 것으로부터 선택되는 하한 및 상한에 의해 한정된 임의의 범위, 및 하한으로서 언급된 값이 상한으로 작용할 수 있는 범위(예컨대, 0.01 내지 10 mg/kg의 범위가 본 발명에 의해 포함됨) 및 상한으로서 언급된 값이 하한으로서 작용할 수 있는 범위(예컨대, 45 내지 75 mg/kg의 범위가 본 발명에 의해 포함됨)가 본 발명에 의해 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 유효한 용량"은 암을 예방 또는 치료하기에 충분한 용량을 지칭한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 사용하여 제형화하여 단위 용량으로 제조될 수 있거나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 다회-용량 용기에 내재화하여 제조될 수 있다. 이 경우, 제형은 오일 또는 수성 매질, 현탁액 또는 에멀젼 중의 용액의 형태일 수 있거나, 추출물, 분말, 좌제, 과립, 정제 또는 캡슐제의 형태일 수 있다. 분산제 또는 안정화제가 추가로 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이적 에피토프 결합 단백질, 단일-사슬 키메라 폴리펩티드, 또는 본원에 기술된 핵산 작제물이 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 이중특이적 에피토프 결합 단백질, 단일-사슬 키메라 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물은 질환 또는 병태로 진단된 대상체에 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 암이 있거나 암이 발병할 위험이 있다.
일부 실시형태에서, 약학 조성물은 이온화 방사선, 화학요법제, 치료 항체 및 체크포인트 억제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가의 항-종양 요법과 함께 투여될 수 있다.
암은 신체의 비정상적인 세포가 통제되지 않는 성장을 특징으로 하는 광범위한 질환 군을 지칭할 수 있다. 조절되지 않은 세포 분열과 성장은 주변 조직을 침범하는 악성 종양의 형성을 초래하고 림프계나 혈류를 통해 신체의 먼 부분으로 전이될 수도 있다. 암 또는 암 조직은 종양을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법에 의한 치료에 적합한 암은 비제한적으로 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 자궁관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 및 전립선암을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 의한 치료를 위한 암은 비제한적으로 암종, 림프종(예컨대, 호지킨 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 편평 세포 암종, 소 세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암종, 폐의 편평 세포 암종, 복막암, 간세포 암종, 위암, 췌장암, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포 암종, 유방암, 대장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 기타 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 이중특이적 에피토프 결합 단백질, 단일-사슬 키메라 폴리펩티드, 임의의 세포, 또는 임의의 핵산 중 적어도 하나를 포함하는 조성물(예컨대, 약학 조성물)이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본원에 기술된 임의의 이중특이적 에피토프 결합 단백질 단일-사슬 키메라 폴리펩티드 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 임의의 면역 세포(예컨대, 본원에 기술된 임의의 면역 세포, 예컨대, 본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여 생산된 임의의 면역 세포)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 약학 조성물은 상이한 투여 경로(예컨대, 정맥 내, 피하) 용으로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체(예컨대, 인산염 완충된 염수)를 포함할 수 있다.
약학 조성물의 단일 또는 다중 투여는 예를 들어 대상에 의해 요구되고 허용되는 투여량 및 빈도에 따라 이를 필요로 하는 대상체에 제공될 수 있다. 제형은 상태, 질환, 또는 증상을 효과적으로 치료, 예방, 또는 개선하기에 충분한 양의 활성제를 제공해야 한다.
본원에 기술된 임의의 이중특이적 에피토프 결합 단백질, 단일-사슬 키메라 폴리펩티드, 조성물, 핵산, 또는 세포(예컨대, 면역 세포)를 포함하는 키트가 또한 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 임의의 본원에 기술된 약학 조성물의 적어도 하나의 용량을 포함할 수 있다.
정의:
약: 용어 "약"은 본원에서 값과 관련하여 사용될 때, 언급된 값과 관련하여 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 문맥에 친숙한 당업자는 그 문맥에서 "약"에 의해 포함되는 적절한 정도의 변동의 정도를 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 언급된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하 이내인 값의 범위를 포함할 수 있다.
투여 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여"는 전형적으로 조성물이거나 조성물에 포함된 제제의 전달을 달성하기 위해 대상체 또는 시스템에 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 당업자는 적절한 상황에서 대상체, 예를 들어 인간에게 투여하기 위해 사용될 수 있는 다양한 경로를 알고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 투여는 안구, 경구, 비경구, 국소 등일 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 투여는 기관지(예를 들어, 기관지 점적에 의한), 협측, 피부(예를 들어, 진피, 피내(intradermal), 피간(interdermal), 경피 등의 하나 이상의 국소부위일 수 있거나 이를 포함할 수 있음), 장내, 동맥내, 피내, 위내, 골수 내, 근육 내, 비강 내, 복강 내, 척추강 내, 정맥 내, 뇌실 내, 특정 장기 내(예컨대 간 내), 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(예를 들어, 기관내 점적에 의해), 질, 유리체 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 단일 용량만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 고정된 수의 용량의 적용을 수반할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 간헐적(예를 들어, 시간 상 분리된 복수의 용량) 및/또는 주기적(예를 들어, 공통 기간으로 분리된 개별 용량) 투여인 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투여(예를 들어, 관류)를 포함할 수 있다.
친화도 : 당업계에 알려진 바와 같이 "친화도"는 특정 리간드가 이의 파트너에 결합하는 강도의 척도이다. 친화도는 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화도는 정량적 분석법에 의해 측정된다. 이러한 일부 실시형태에서, 결합 파트너 농도는 생리학적 조건을 모방하기 위해 리간드 농도를 초과하도록 고정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 결합 파트너 농도 및/또는 리간드 농도가 변할 수 있다. 이러한 일부 실시형태에서, 친화도는 비교가능한 조건(예컨대 농도)에서 기준과 비교될 수 있다.
항체 제제 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 제제"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린 구조 요소를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 예시적인 항체 제제는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 및 이의 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 당업계에 공지된 바와 같이 인간화, 영장류화, 키메라 등의 하나 이상의 서열 요소를 포함할 수 있다. 많은 실시형태에서, 용어 "항체 제제"는 대안적인 제시에서 항체의 구조적 및 기능적 특징을 이용하기 위한 당업계에 공지되거나 개발된 작제물 또는 형식 중 하나 이상을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 실시형태에서, 본 발명에 따라 사용되는 항체 제제는 비제한적으로 온전한 IgA, IgG, IgE, 또는 IgM 항체; 이중- 또는 다중- 특이적 항체(예컨대, Zybodies®, 등); 항체 단편 예컨대 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 CDR 또는 이의 세트, 단일 사슬 Fv; 폴리펩티드-Fc 융합; 단일 도메인 항체(예컨대, 상어 단일 도메인 항체 예컨대 IgNAR 또는 이의 단편); 카멜로이드 항체; 차폐 항체(예컨대, Probodies®); 소형 모듈형 면역약제("SMIPsTM": Small Modular ImmunoPharmaceuticals); 단일 사슬 또는 탠덤 디아바디(TandAb®); VHH; Anticalins®; Nanobodies® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®; Avimers®; DART; TCR-유사 항체;, Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; 마이크로단백질; Fynomers®, Centyrins®; 및 KALBITOR®로부터 선택되는 형식이다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 자연적으로 생성되는 경우 가질 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드[예를 들어, 검출 가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등], 또는 기타 펜던트기[예를 들어, 폴리-에틸렌 글리콜 등]를 함유할 수 있다. 많은 실시형태에서, 항체 제제는 아미노산 서열이 상보성 결정 영역(CDR)으로서 당업자에 의해 인식되는 하나 이상의 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다; 일부 실시형태에서 항체 제제는 아미노산 서열이 참조 항체에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR(예를 들어, 적어도 하나의 중쇄 CDR 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDR)을 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 비교하여 서열이 동일하거나 1 내지 5개 아미노산 치환을 함유한다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84% 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 비교하여 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환되었지만 포함된 CDR이 참조 CDR과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 참조 CDR과 비교하여 포함된 CDR의 1 내지 5개 아미노산이 결실, 부가, 또는 치환되었지만 포함된 CDR이 참조 CDR과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 치환되었지만 포함된 CDR이 참조 CDR과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 1 내지 5개 아미노산이 참조 CDR과 비교하여 결실, 부가, 또는 치환되었지만 포함된 CDR이 참조 CDR과 달리 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 도메인으로서 당업자에 의해 인식되는 구조적 요소를 포함하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 면역글로불린-결합 도메인과 상동성 또는 대체로 상동성인 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항체 제제는 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor)의 적어도 일부이거나 이를 포함한다.
항원 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항체 제제에 결합하는 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 항원은 항체 제제에 결합하고 유기체에서 특정 생리학적 반응을 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 일반적으로, 항원은 예를 들어 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 탄수화물, 지질, 중합체(생물학적 중합체[예를 들어, 핵산 및/또는 아미노산 중합체] 및 생물학적 중합체 이외의 중합체[예를 들어, 핵산 또는 아미노산 중합체 이외의 중합체]) 등과 같은 임의의 화학적 실재물일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 글리칸이거나 이를 포함한다. 당업자는 일반적으로 항원이 단리된 또는 순수한 형태로 제공될 수 있거나, 대안적으로 미정제 형태로 제공될 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어, 다른 물질과 함께, 예를 들어 세포 추출물과 같은 추출물로 또는 항원-함유 공급원의 다른 상대적으로 미정제 제조에서). 일부 특정 실시형태에서, 항원은 세포 맥락에 존재한다(예를 들어, 항원은 세포의 표면 상에서 발현되거나 세포에서 발현된다). 일부 실시형태에서, 항원은 재조합 항원이다.
항원 결합 도메인 : 본원에 사용된 바와 같이, 표적 모이어티 또는 실재물에 특이적으로 결합하는 항체 제제 또는 이의 일부를 지칭한다. 전형적으로, 항원 결합 도메인과 이의 표적 사이의 상호작용은 비-공유적이다. 일부 실시형태에서, 표적 모이어티 또는 실재물은 예를 들어 탄수화물, 지질, 핵산, 금속, 폴리펩티드 또는 소분자를 포함하는 임의의 화학적 부류일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 폴리펩티드(또는 이의 복합체)이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 융합 폴리펩티드의 일부이다.
~와 관련된: 두 이벤트 또는 실재물은 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 하나의 존재, 수준 및/또는 형태와 상관되는 경우, 그 용어가 본원에서 사용된 것처럼 서로 "관련"된다. 예를 들어, 특정 실재물(예컨대 폴리펩티드, 유전적 특징, 대사산물, 미생물 등)은 그 존재, 수준 및/또는 형태가 질환, 장애, 또는 병태의 발병률 및/또는 그에 대한 감수성과 상관되는 경우(예컨대 관련 인구집단 전체에 걸쳐), 특정 질환, 장애, 또는 병태와 관련된다고 간주된다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 실재물은 서로 물리적으로 근접해 있고/있거나 유지되도록 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 경우 서로 물리적으로 "관련"되어 있다. 일부 실시형태에서, 서로 물리적으로 관련된 둘 이상의 실재물은 서로 공유적으로 연결되어 있다; 일부 실시형태에서, 서로 물리적으로 관련된 둘 이상의 실재물은 서로 공유적으로 연결되어 있지 않지만, 예를 들어 수소 결합, 반 데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자성, 및 이들의 조합에 의해 비-공유적으로 관련되어 있다.
결합 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합"은 일반적으로 둘 이상의 실재물 사이 또는 이들 사이의 비-공유 결합을 지칭하는 것으로 이해될 것이다. "직접" 결합은 실재물 또는 모이어티 간의 물리적 접촉을 포함한다; 간접 결합은 하나 이상의 중간 실재물과의 물리적 접촉을 통한 물리적 상호 작용을 포함한다. 둘 이상의 실재물 간의 결합은 일반적으로 상호작용하는 실재물 또는 모이어티가 개별적으로 연구되는 경우 또는 더 복잡한 시스템의 맥락(예컨대, 담체 실재물 및/또는 생물학적 시스템 또는 세포와 공유적으로 또는 달리 결합되어 있는 동안)을 포함하여, 임의의 다양한 맥락에서 평가될 수 있다.
암 : 용어 "암", "악성", "신생물", "종양" 및 "암종"은 본원에서 상대적으로 비정상적이고, 조절되지 않고/않거나 자율적으로 성장을 나타내어, 세포 증식 제어의 현저한 상실을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타내는 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 종양은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성 및/또는 비-전이성인 세포일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 본 개시내용은 이의 교시가 특히 관련될 수 있는 특정 암을 구체적으로 식별한다. 일부 실시형태에서, 관련 암은 고형 종양을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관련 암은 혈액 종양을 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 다양한 유형의 암의 예는 예를 들어 백혈병, 림프종(호지킨 및 비-호지킨), 골수종 및 골수증식성 장애를 포함하는 혈액암; 육종, 흑색종, 선종, 고형 조직의 암종, 구강, 인후, 후두, 및 폐의 편평 세포 암종, 간암, 비뇨생식기암 예컨대 전립선암, 자궁경부암, 방광암, 자궁암, 및 자궁내막암 및 신세포암종, 골암, 췌장암, 피부암, 피부 또는 안내 흑색종, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 두경부암, 유방암, 위장관암 및 신경계 암, 양성 병변 예컨대 유두종, 등을 포함한다.
화학요법제 : 본원에서 사용된 용어 "화학요법제"는 하나 이상의 세포자멸사 촉진제, 세포증식억제제 및/또는 세포독성제를 지칭하는 당업계에서 이해되는 의미를 가지며, 예를 들어 바람직하지 않은 세포 증식과 관련된 하나 이상의 질병, 장애 또는 병태를 치료하는 데 사용 및/또는 권장되는 제제를 구체적으로 포함한다. 많은 실시형태에서, 화학요법제는 암 치료에 유용하다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 하나 이상의 알킬화제(예컨대, 이기능성 알킬화제 예컨대 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 메클로레타민(Mechlorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 및 멜팔란(Melphalan) 및 일기능성 알킬화제 예컨대 다카바진(Dacarbazine), 니트로소우레아스(Nitrosoureas), 테모졸라미드(Temozolomide)), 하나 이상의 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 이다루비신(Idarubicin), 및 미토잔트론(Mitoxantrone)), 발루비시논(valrubicinone) 또는 그 이상의 세포골격 파괴제(예컨대 미세소관 표적화제 예컨대 탁산(taxane), 메이탄신(maytansine) 및 이들의 유사체, 구체적인 예는 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 아라박산(Arabaxane), 및 탁소테레(Taxotere)를 포함함), 하나 이상의 에포틸론(epothilone), 하나 이상의 히스톤 디아세틸라제 억제제(HDAC), 하나 이상의 토포이소머라제 억제제(예컨대, 토포이소머라제 I 및/또는 토포이소머라제 II의 억제제), 하나 이상의 키나제 억제제, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 전구체 유사체, 하나 이상의 펩티드 항생제, 하나 이상의 백금-기반 제제, 하나 이상의 레티노이드, 하나 이상의 빈카 알칼로이드, 및/또는 하나 이상의 다음 중 하나 이상의 유사체(즉, 관련 항-증식 활성을 공유함)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 화학요법제는 하나 이상의 액티노마이신(Actinomycin), 올-트랜스 레티논산(All-trans retinoic acid), 아우리스타틴(Auiristatin), 아자시티딘(Azacitidine), 아자티오프린(Azathioprine), 블레오마이신(Bleomycin), 보르테조밉(Bortezomib), 카보플라틴(Carboplatin), 카페시타빈(Capecitabine), 시스플라틴(Cisplatin), 클로람부실(Chlorambucil), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 커큐민(Curcumin), 시타라빈(Cytarabine), 다우노루비신(Daunorubicin), 도세탁셀(Docetaxel), 독시플루리딘(Doxifluridine), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 에포틸론(Epothilone), 에토포시드(Etoposide), 플루오로우라실(Fluorouracil), 겜시타빈(Gemcitabine), 히드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이마티닙(Imatinib), 이리노테칸(Irinotecan), 메이탄신(Maytansine) 및/또는 이들의 유사체(예컨대 DM1) 메클로레타민(Mechlorethamine), 머캅토퓨린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), 메이탄시노이드(Maytansinoid), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 페메트렉세드(Pemetrexed), 테니포시드(Teniposide), 티오구아닌(Tioguanine), 토포테칸(Topotecan), 발루비신(Valrubicin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 비노렐빈(Vinorelbine), 및 이들의 조합일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 항체-약물 접합체의 맥락에서 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학요법제는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체로 발견되는 것이다: hLL1-독소루비신(doxorubicin), hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN-38, hLL1-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro-2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLL1-Pro-2-P-Dox, P4/D10-독소루비신(doxorubicin), 겜투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 트라스트주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine), 이노투주맙 오조가미신(inotuzumab ozogamicin), 글렘바투모맙 베도틴(glembatumomab vedotin), SAR3419, SAR566658, BIIB015, BT062, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, 항-PSMA ADC, RG-7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, 보르세투주맙 마포도틴(vorsetuzumab mafodotin), 및 로보투주맙 메르탄신(lorvotuzumab mertansine).
조작된: 일반적으로, 용어 "조작된"은 사람의 손에 의해 조작된 양태를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리펩티드 서열이 사람의 손에 의해 조작될 때 "조작된" 것으로 간주된다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 사람의 손에 의해 참조 폴리펩티드 서열로 도입된 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 폴리펩티드는 사람의 손에 의해 하나 이상의 추가 폴리펩티드에 융합(즉, 공유 결합)되어 생체 내에서 자연적으로 발생하지 않는 융합 폴리펩티드를 형성한 폴리펩티드를 포함한다. 유사하게, 세포나 유기체는 유전 정보가 변경되도록 조작된 경우 "조작된" 것으로 간주된다(예컨대, 이전에 존재하지 않은 새로운 유전 물질이 예를 들어 형질전환, 교배, 체세포 혼성화, 형질감염, 형질도입, 또는 기타 기전에 의해 도입됨, 또는 이전에 존재하는 유전 물질이 예를 들어 치환 또는 결실 돌연변이, 또는 짝짓기 프로토콜에 의해 변경되거나 제거됨). 일반적인 관행이고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 폴리펩티드 또는 세포의 유도체 및/또는 자손은 비록 실제 조작이 이전 개체에서 수행되었음에도 불구하고 일반적으로 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.
약학 조성물 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학 조성물"은 활성제가 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화되는 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 인간 또는 동물 대상체에 투여하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 활성제는 관련 집단에 투여될 때 미리 결정된 치료 효과를 달성할 통계적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 요법으로 투여하기에 적절한 단위 투여량으로 존재한다.
약학적으로 허용되는 담체 : 상기 주어진 예에 추가하여, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 일반적으로 약학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 담체, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 안정화제, 분산제, 현탁제, 희석제, 부형제, 증점제, 용매 또는 캡슐화 물질, 의도된 기능을 수행할 수 있도록 환자 내에세 또는 환자에게 본 발명 내에서 유용한 화합물을 운반하거나 수송하는데 관여하는 당업계에서 인정하는 의미를 갖는다. 전형적으로, 이러한 작제물은 한 기관 또는 신체의 일부로부터 다른 기관 또는 신체의 일부로 운반되거나 수송된다. 각 담체는 본 발명 내에서 유용한 화합물을 포함하는, 제형의 다른 성분과 양립할 수 있고 환자에게 해를 끼치지 않는다는 의미에서 "허용"되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용되는 담체"는 또한 본 발명 내에서 유용한 화합물의 활성과 양립가능하고 환자에게 생리학적으로 허용되는 임의의 및 모든 코팅, 항균제 및 항진균제, 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 본 발명 내에서 유용한 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 실시에 사용되는 약학 조성물에 포함될 수 있는 다른 추가 성분은 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, Pa.)]에 기술되어 있으며, 이는 본원에 인용되어 포함된다. "약학적으로 허용되는 담체"는 일반적으로 조성물의 다른 성분과 상용성이고 수용자에게 해롭지 않고 생물학적으로나 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 약학 조성물의 제조에 유용하다. "약학적으로 허용되는 담체"는 하나 이상의 담체를 포함한다. 실시형태는 국소, 안구, 비경구, 정맥 내, 복강 내 근육 내, 설하, 비강 또는 경구 투여를 위한 담체를 포함한다. "약학적으로 허용되는 담체"는 또한 수성 분산액 및 주사 또는 분산액을 위한 멸균 분말 제조용 제제를 포함한다.
약학적으로 허용되는 염 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는 염"은 일반적으로 당업계에서 인정하는 의미를 가지며 모 화합물이 존재하는 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환시킴으로써 변형된 본원에 제공된 화합물의 유도체를 지칭한다. 약학적으로 허용되는 염의 예는 비제한적으로 아민과 같은 염기 잔기의 미네랄 또는 유기산 염; 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염; 등을 포함한다. 본원에 제공된 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어 무독성 무기산 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 무독성 염을 포함한다. 본원에 제공된 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 둘의 혼합물에서 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 조합함으로써 제조될 수 있으며; 일반적으로 에터, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 사용될 수 있다. 적합한 염의 목록은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th　ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418] 및 문헌[Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)]에서 확인되며, 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
부형제 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 일반적으로 당업계에서 인정하는 의미를 가지며 약학 조성물의 제조에서 유용한 생리학적으로 양립가능한 첨가제를 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제의 예는, 예컨대, 문헌[Remington Pharmaceutical Science, 16th　Ed]에서 확인할 수 있다.
폴리펩티드 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 일반적으로 적어도 3개의 아미노산의 중합체의 당업계에서 인정하는 의미를 갖는다. 당업자는 용어 "폴리펩티드"가 본원에 인용된 완전한 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함할뿐만 아니라 그러한 완전한 폴리펩티드의 기능적 단편(즉, 하나 이상의 활성을 유지하는 단편)을 나타내는 폴리펩티드를 포함하도록 충분히 일반적으로 의도된다는 것을 이해할 것이다. 더욱이, 당업자는 단백질 서열이 일반적으로 활성을 파괴하지 않으면서 일부 치환을 허용한다는 것을 이해한다. 따라서, 활성을 유지하고 적어도 약 30 내지 40% 전체 서열 동일성, 종종 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 85% 이상을 공유하며 추가로 일반적으로 하나 이상의 고도로 보존된 영역에서 훨씬 더 높은 동일성의 적어도 하나의 영역, 종종 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상을 포함하며, 일반적으로 적어도 3 내지 4개 및 종종 최대 20개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드는, 동일한 부류의 또 다른 폴리펩티드와 함께, 본원에서 사용되는 관련 용어 "폴리펩티드"에 포함된다. 폴리펩티드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 다를 함유할 수 있고 당업계에 공지된 임의의 다양한 아미노산 변형 또는 유사체를 함유할 수 있다. 유용한 변형은 예를 들어 말단 아세틸화, 아미드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 합성 아미노산, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "펩티드"는 일반적으로 약 100개 미만의 아미노산, 약 50개 미만의 아미노산, 20개 미만의 아미노산, 또는 10개 미만의 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 지칭하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 단백질은 항체 제제, 항체 단편, 이의 생물학적 활성 부분, 및/또는 이의 특징 부분이다.
재조합 : 본원에서 사용된 바와 같이, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드와 같은 재조합 수단에 의해 설계, 조작, 제조, 발현, 생성, 제조 및/또는 단리된 폴리펩티드; 재조합, 조합 인간 폴리펩티드 라이브러리로부터 단리된 폴리펩티드; 형질전환되었거나 달리 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 성분, 부분, 요소, 또는 도메인을 코딩하고/하거나 발현을 지시하는 유전자 또는 유전자들 또는 유전자 성분을 발현하도록 조작된 동물(예컨대 마우스, 토끼, 양, 어류 등)로부터 단리된 폴리펩티드; 및/또는 선택된 핵산 서열 요소를 서로 스플라이싱 또는 결찰하고, 선택된 서열 요소를 화학적으로 합성하고/하거나 폴리펩티드 또는 이의 하나 이상의 성분, 부분, 요소, 또는 도메인을 코딩하고/하거나 발현을 지시하는 핵산을 달리 생성하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 폴리펩티드를 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 자연에서 발견된다. 일부 실시형태에서, 이러한 선택된 서열 요소 중 하나 이상은 인 실리코(in silico)로 설계된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 이러한 선택된 서열 요소는, 예를 들어, 관심 공급원 유기체(예컨대 인간, 마우스 등의 것)의 생식계열에서와 같은 천연 또는 합성 공급원으로부터 공지된 서열 요소의 돌연변이유발(예를 들어, 생체 내 또는 시험관 내)로부터 발생한다.
특이적 결합 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 결합이 일어나는 환경에서 가능한 결합 파트너를 구별하는 능력을 지칭한다. 다른 잠재적인 표적이 존재할 때 하나의 특정 표적과 상호작용하는 결합제는 그것이 상호작용하는 표적에 "특이적으로 결합"한다고 한다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 결합제와 그의 파트너 사이의 연관 정도를 검출하거나 측정함으로써 평가되고; 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 결합제-파트너 복합체의 해리 정도를 검출하거나 측정함으로써 평가되고; 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 이의 파트너와 다른 실재물 사이의 대안적인 상호작용을 경쟁하는 결합제의 능력을 검출하거나 측정함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 농도 범위에 걸쳐 이러한 검출 또는 측정을 수행함으로써 평가된다.
대상체 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 유기체, 전형적으로 포유류(예를 들어, 인간, 일부 실시형태에서는 태아기 인간 형태를 포함함)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 관련 질병, 장애 또는 병태를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질병, 장애 또는 병태에 취약하다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질병, 장애 또는 병태의 어떠한 증상 또는 특징도 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질병, 장애 또는 병태에 대한 감수성 또는 위험의 특징인 하나 이상의 특징을 갖는 사람이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여된 개체이다.
치료제 :　본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "치료제"는 일반적으로 유기체에 투여될 때 원하는 약리학적 효과를 유도하는 임의의 제제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 제제가 적절한 집단에 걸쳐 통계적으로 유의한 효과를 나타내는 경우 제제는 치료제로 간주된다. 일부 실시형태에서, 적절한 집단은 모델 유기체의 집단일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적절한 집단은 특정 연령군, 성별, 유전적 배경, 기존 임상 상태 등과 같은 다양한 기준에 의해 정의될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료제는 질병, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 완화, 개선, 경감, 억제, 예방, 발병 지연, 중증도 감소, 및/또는 발병률 감소에 사용될 수 있는 물질이다. 일부 실시형태에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 판매될 수 있기 전에 정부 기관에 의해 승인되었거나 승인을 받아야 하는 제제이다. 일부 실시형태에서, "치료제"는 인간에게 투여하기 위해 의학적 처방이 필요한 제제이다.
치료 유효량 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료 유효량"은 질병, 장애 및/또는 병태를 치료하기 위해, 치료적 투여 요법에 따라 질병, 장애 및/또는 병태를 앓거나 이에 민감한 집단에게 투여될 때 충분한 양을 의미한다. 일부 실시형태에서, 치료 유효량은 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상의 발병률 및/또는 중증도를 감소시키고, 그의 하나 이상의 특징을 안정화시키고/시키거나 발병을 지연시키는 양이다. 당업자는 "치료 유효량"이라는 용어가 실제로 특정 개인에서 달성된 성공적인 치료를 필요로 하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 오히려, 치료 유효량은 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 상당한 수의 대상체에서 특정한 원하는 약리학적 반응을 제공하는 양일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "치료 유효량"은 본 발명의 요법의 맥락에서 이를 필요로 하는 개체에게 투여될 때 상기 개체에서 발생하는 암-지지 과정을 차단, 안정화, 약화 또는 역전시키는 양을 지칭하거나, 상기 개체에서 암-억제 과정을 향상 또는 증가시키는 양을 지칭한다. 암 치료의 맥락에서, "치료 유효량"은 암으로 진단된 개체에게 투여될 때 개체에서 암의 추가 발달을 예방, 안정화, 억제 또는 감소시키는 양이다. 본원에 기술된 조성물의 특히 바람직한 "치료 유효량"은 (치료적 치료에서) 췌장 암종과 같은 악성 종양의 발병을 역전시키거나 악성 종양의 관해를 달성하거나 연장하는 것을 돕는다. 개체에게 암을 치료하기 위해 투여되는 치료 유효량은 관해를 촉진하거나 전이를 억제하기 위해 투여되는 치료학적 유효량과 동일하거나 상이할 수 있다. 대부분의 암 치료법과 마찬가지로, 본원에 기술된 치료 방법은 암에 대한 "치료"로 해석되거나, 이에 제한되거나, 달리 제한되어서는 안 된다; 오히려 치료 방법은 암을 "치료"하기 위한, 즉 암에 걸린 개체의 건강에 바람직하거나 유익한 변화를 일으키기 위한 기술된 조성물의 사용에 관한 것이다. 이러한 이점은 종양학 분야의 숙련된 의료 제공자에 의해 인정되며 비제한적으로 환자 상태의 안정화, 종양 크기의 감소(종양 퇴행), 생명 기능의 개선(예컨대 암성 조직 또는 기관의 기능 개선), 추가 전이의 감소 또는 억제, 기회 감염의 감소, 생존율 증가, 통증 감소, 운동 기능 개선, 인지 기능 개선, 에너지 느낌 개선(활력, 권태감 감소), 웰빙 느낌 개선, 정상적인 식욕의 회복, 건강한 체중 증가의 회복 및 이들의 조합을 포함한다. 추가로, 개체의 특정 종양의 퇴행(예를 들어, 본원에 기술된 치료의 결과로서)은 또한 췌장 선암종과 같은 종양의 부위로부터 암세포의 샘플을 채취함으로써 평가될 수 있고(예를 들어, 치료 과정 상에서) 대사 및 신호전달 마커의 수준에 대해 암세포를 시험하여 암세포의 상태를 모니터링하여 분자 수준에서 암세포가 덜 악성 표현형으로 퇴행하는지 확인한다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 유도된 종양 퇴행은 상기 논의된 혈관신생 촉진 마커 중 임의의 것의 감소, 본원에 기술된 항-혈관신생 마커의 증가, 대사 경로, 세포간 신호전달 경로, 또는 암으로 진단을 받은 개체에서 비정상적인 활성을 나타내는 세포 내 신호전달 경로의 정상화(즉, 암을 앓지 않는 정상 개체에서 발견되는 상태로의 변경)의 발견에 의해 표시된다. 당업자는 일부 실시형태에서 치료 유효량이 단일 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 치료 유효량은, 예를 들어, 투여 요법의 일부로서 다수의 용량으로 제형화 및/또는 투여될 수 있다.
변이체 : 분자, 예를 들어 핵산, 단백질 또는 소분자의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 참조 분자와 상당한 구조적 동일성을 나타내지만 예를 들어, 참조 실재물과 비교하여 하나 이상의 화학적 모이어티의 존재 또는 부재 또는 수준에서 참조 분자와 구조적으로 상이한 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변이체는 또한 이의 참조 분자와 기능적으로 상이하다. 일반적으로 특정 분자가 참조 분자의 "변이체"로 적절하게 간주되는지 여부는 참조 분자와의 구조적 동일성 정도를 기반으로 한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 분자는 특정 특징적인 구조 요소를 갖는다. 정의에 따르면 변이체는 하나 이상의 이러한 특징적인 구조 요소를 공유하지만 참조 분자와 적어도 한 측면에서 상이한 별개의 분자이다. 몇 가지 예를 들자면, 폴리펩티드는 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖고/갖거나 특정 구조적 모티프 및/또는 생물학적 기능에 기여하는 복수의 아미노산으로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다; 핵산은 선형 또는 3차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기로 구성된 특징적인 서열 요소를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 차이의 결과로서 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 99%인 참조 폴리펩티드 또는 핵산과의 전체 서열 동일성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산과 적어도 하나의 특징적인 서열 요소를 공유하지 않는다. 일부 실시형태에서, 참조 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 생물학적 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변이체 폴리펩티드 또는 핵산은 참조 폴리펩티드 또는 핵산의 생물학적 활성 중 하나 이상을 공유한다.
벡터 : 본원에서 사용된 바와 같이, 그리고 추가로 상기 개시내용에 사용된 바와 같이, 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 추가 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 나타내는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환(예컨대 전기천공, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 전술한 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있고, 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 예컨대, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))]을 참조하며, 이는 임의의 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
본 명세서의 맥락에서, 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 달리 표시되지 않는 한, 완전히 설명된 것처럼 모든 목적을 위해 그 전체가 내용이 본원에 인용되어 명시적으로 포함되며, 그 전체가 본 개시내용의 일부로서 간주되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 충돌하는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다.
본 발명에 대한 상기 기재된 설명은 당업자가 이를 제조 및 사용할 수 있도록 제조 및 사용하는 방식 및 과정을 제공하며, 이러한 가능하게 함은 특히 원래 설명의 일부를 구성하는 첨부된 청구범위의 주제에 대해 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "~로 이루어진 군으로부터 선택되는", "~로부터 선택되는" 등은 특정 물질의 혼합물을 포함한다.
수치적 한계 또는 범위가 본원에 명시된 경우 종점이 포함된다. 또한, 수치 한계 또는 범위 내의 모든 값 및 하위 범위는 명시적으로 작성된 것처럼 구체적으로 포함된다.
위의 설명은 당업자가 본 발명을 만들고 사용할 수 있도록 하기 위해 제공되며 특정 적용 및 그 요구 사항의 맥락에서 제공된다. 바람직한 실시형태에 대한 다양한 수정은 당업자에게 용이하게 명백할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다른 실시형태 및 적용에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 제시된 실시형태로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 본원에 개시된 원리 및 특징과 일치하는 가장 넓은 범위가 부여되어야 한다.
하기 특정 실시형태에 구속되지 않고, 본 발명은 하기에 의해 예시된다:
(1) (VH), (VL), (X), (VH)n, (VL)n, (X)n, (VH)n-Y, (VL)n-Y, (VH-VL)n-Y, (VL-VH)n-Y, (X)n-Y, Y-(VH)m, Y-(VL)m, Y-(VH-VL)m, Y-(VL-VH)m, 및/또는 Y-(X)m의 조합을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질,
여기서 상기 VH 및 VL은 4-1BB에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 각각을 지칭하고,
X는 PD-L1에 결합하는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이고,
Y는 CL, CH1, CH2, 및 CH3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역의 단편을 지칭하고,
n 및 m은 각각 1 내지 5의 정수이다.
(2) (1)에 있어서, (VH), (VL), (VH)n-Y, (VL)n-Y, (VH-VL)n-Y, (VL-VH)n-Y, (X)n-Y, Y-(VH)m, Y-(VL)m, Y-(VH-VL)m, Y-(VL-VH)m, 및/또는 Y-(X)m은, 존재하는 경우, N-말단에서 C-말단으로 임의의 순서로 나타날 수 있는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, (VH), (VL), (VH)n-Y, (VL)n-Y, (VH-VL)n-Y, (VL-VH)n-Y, (X)n-Y, Y-(VH)m, Y-(VL)m, Y-(VH-VL)m, Y-(VL-VH)m, 및/또는 Y-(X)m의 다중 복사본이 존재하는 경우, 이들은 다른 영역에 대해 임의의 순서로 존재할 수 있으며 유사한 종류의 영역에 직접 인접할 필요가 없는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 scFv 형태인, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 An-A'n'-B-Cm-C'm'의 구조를 갖는 이중특이적 에피토프 결합 단백질로서,
여기서:
A, A', C, C': VH, VL, VH-VL, VL-VH 또는 X
B: Y
VH, VL, X, Y, n, 및 m은 상기 정의된 바와 같고 각각의 VH, VL, X, Y는 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지에 의해 연결되고,
n' 및 m'는 독립적으로 1 내지 5의 정수인, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(6) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 상기 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 An-B-Cm의 구조를 갖는 이중특이적 에피토프 결합 단백질로서,
여기서:
A 또는 C: VH-VL, VL-VH 또는 X
B: Y
VH, VL, X, Y, n, 및 m은 상기 정의된 바와 같고 각각의 VH, VL, X, Y는 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지에 의해 연결되는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(7) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, CH1 도메인이 (VH-VL)n, (VL-VH)n, 또는 (X)n에 직접적으로 또는 힌지 및/또는 링커에 의해 C-말단으로 연결되고 CH2/CH3 도메인이 (VH-VL)m, (VL-VH)m, (X)m에 직접적으로 또는 힌지 및/또는 링커에 의해 N-말단으로 연결되고, 상기 VH, VL, X, n, 및 m이 상기 정의된 바와 같은, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(8) (7)에 있어서, CH1 도메인이 CH2/CH3 도메인에 직접적으로 또는 힌지 및/또는 링커에 의해 연결되는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(9) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 상기 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 다음을 포함하는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질
- CH2에 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지를 통해 연결된 VH-VL, VL-VH, X, 및/또는 VH-CH1을 포함하고, 독립적으로, CH3은 VH-VL, VL-VH 또는 X에 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지를 통해 연결된, 중쇄 및
- 링커 및/또는 힌지를 통해 CL에 연결된 VL을 포함하는 경쇄
여기서 상기 VH, VL, 및 X는 상기 정의된 바와 같고 각각의 VH, VL, X, CH1, CH2, CH3, 및 CL은 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지에 의해 연결된다.
(10) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, (VH 및 VL, 어느 순서로든)n-Y 및/또는 Y-(X)m을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질로서,
여기서 상기 Y는 독립적으로 CH2 또는 CH3 도메인이고, VH, 및 VL 및 CH2 및/또는 CH3, 또는 CH2 및/또는 CH3 및 X는 직접적으로 또는 힌지 및/또는 링커를 통해 연결되고;
VH, VL, X, n, 및 m은 상기 정의된 바와 같은 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(11) (1) 내지 (4) 및 (10) 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 N-말단에서 C-말단으로 기재된 (VL-VH)n-CH2-CH3-(X)m와 같이 배열된 scFv인, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(12) (11)에 있어서, VL 및 VH, VH 및 CH2, CH3 및 (X)m, 및/또는 CH2 및 CH3이 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지에 의해 연결된, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(13) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, (X)m-Y 및/또는 Y-(VH 및 VL, 어느 순서로든)n을 포함하는 이중특이적 에피토프 결합 단백질로서,
여기서 상기 Y는 독립적으로 CH2 또는 CH3 도메인이고, VH, 및 VL 및 CH2 및/또는 CH3, 또는 CH2 및/또는 CH3 및 X는 직접적으로 또는 힌지 및/또는 링커를 통해 연결되고;
VH, VL, X, n, 및 m은 상기 정의된 바와 같은, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(14) (13)에 있어서, 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 N-말단에서 C-말단으로 기재된 (X)m-CH2-CH3-(VH-VL)n과 같이 배열된 scFv인, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(15) (14)에 있어서, (X)m 및 CH2, CH3 및 VH, 및 VH 및 VL, 및/또는 CH2 및 CH3이 직접적으로 또는 링커 및/또는 힌지에 의해 연결된, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(16) (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 각각의 n 및 m이 개별적으로 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수로부터 선택되어 이러한 정수 값을 갖는 n 및 m의 임의의 조합이 존재할 수 있는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(17) (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서, 다중 VH, VL, 및/또는 X가 존재하는 경우(즉, n 및/또는 m이 1 초과의 값인 경우) 복사본이 직접적으로 연결되거나 힌지 및/또는 링커 서열에 의해 분리되는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(18) (17)에 있어서, 복사본이 링커 서열에 의해 분리되는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(19) (5) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 링커가 약 10 내지 25개 아미노산 잔기, 10 내지 20개 아미노산 잔기, 또는 12 내지 19개 아미노산 잔기를 포함하는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(20) (5) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, 링커가 (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n 또는 (GnS)m(n 및 m은 각각 1 내지 10임)), 218 링커, 또는 218S 링커로부터 선택되는 적어도 하나인, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(21) (5) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 링커가 (G4S)3 링커, (G4S)2 링커, 218 링커, 또는 218S 링커인, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(22) (1) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 4-1BB-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 23의 VH를 포함하는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(23) (1) 내지 (22) 중 어느 하나에 있어서, 4-1BB-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 25의 VL을 포함하는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(24) (1) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 4-1BB-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 23의 VH 및 SEQ ID NO: 25의 VL을 포함하는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(25) (1) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, PD-1 단백질 또는 이의 단편이 SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(25) (1) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 4-1BB-결합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 SEQ ID NO: 23의 VH 및 SEQ ID NO: 25의 VL을 포함하고 PD-1 단백질 또는 이의 단편이 SEQ ID NO: 27의 서열을 포함하는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(27) (1) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 상기 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 SEQ ID NO: 1 내지 10 및 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖거나 상기 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 SEQ ID NO: 1 내지 10 및 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 이중특이적 에피토프 결합 단백질과 적어도 80% 서열 동일성을 갖고 4-1BB 및 PD-L1에 대한 이중특이적 결합 친화도를 갖는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(28) (1) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 상기 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 SEQ ID NO: 1 내지 10 및 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(29) (1) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 상기 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 SEQ ID NO: 1 내지 10 및 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 이중특이적 에피토프 결합 단백질과 적어도 80% 서열 동일성을 갖고 4-1BB 및 PD-L1에 대한 이중특이적 결합 친화도를 갖는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(30) (1) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 상기 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 SEQ ID NO: 3의 서열을 갖는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(31) (1) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 상기 이중특이적 에피토프 결합 단백질이 SEQ ID NO: 3의 서열을 갖는 이중특이적 에피토프 결합 단백질과 적어도 80% 서열 동일성을 갖고 4-1BB 및 PD-L1에 대한 이중특이적 결합 친화도를 갖는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(32) (1) 내지 (31) 중 어느 하나에 있어서, 신호 펩티드를 추가로 포함하는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(33) (32)에 있어서, 상기 신호 펩티드가 12 내지 40개 아미노산을 포함하는 N-말단 신호 펩티드인, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(34) (5) 내지 (33) 중 어느 하나에 있어서, 힌지가 SEQ ID NO: 30 또는 SEQ ID NO: 31의 서열을 갖는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(35) (5) 내지 (34) 중 어느 하나에 있어서, 힌지가 SEQ ID NO: 31의 서열을 갖는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(36) (1) 내지 (35) 중 어느 하나에 있어서, PD-1 단백질 또는 이의 단편이 친화도 성숙된, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
(37) (1) 내지 (36) 중 어느 하나의 이중특이적 에피토프 결합 단백질 쌍으로서, 쌍의 두 구성원 모두가 동일한, 이중특이적 에피토프 결합 단백질 쌍.
(38) (1) 내지 (36) 중 어느 하나의 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
(39) (38)의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
(40) (38)의 핵산 분자 또는 (28)의 재조합 벡터를 포함하는 세포.
(41) 이중특이적 에피토프 결합 단백질의 생산 방법으로서, 상기 방법은 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양 배지에서 (40)의 세포를 배양하는 단계; 및 세포 및/또는 배양 배지로부터 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 방법,
(42) (1) 내지 (36) 중 어느 하나의 이중특이적 에피토프 결합 단백질, (38)의 핵산, (39)의 재조합 벡터, 또는 (40)의 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학 조성물.
(43) (42)의 약학 조성물을 포함하는 키트.
(44) 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
(1) 내지 (36)의 이중특이적 에피토프 결합 단백질, (37)의 핵산, (38)의 재조합 벡터, 또는 (40)의 세포의 유효량을 포함하거나 전달하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
(45) (44)에 있어서, 대상체가 암에 걸린, 방법.
(46) (44)에 있어서, 대상체가 암이 발병할 위험이 있는, 방법.
(47) (44) 내지 (46) 중 어느 하나에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 자궁관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포암종, 교모세포종, 전립선암, 및 이들의 조합을 포함하는, 방법.
(48) 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 예방하는 방법으로서, 상기 방법은
(1) 내지 (36)의 이중특이적 에피토프 결합 단백질, (38)의 핵산, (39)의 재조합 벡터, 또는 (40)의 세포의 유효량을 포함하거나 전달하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
(49) (48)에 있어서, 대상체가 암에 걸린, 방법.
(50) (48)에 있어서, 대상체가 암이 발병할 위험이 있는, 방법.
(51) (48) 내지 (50) 중 어느 하나에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 자궁관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포암종, 교모세포종, 전립선암, 및 이들의 조합을 포함하는, 방법.
(52) (48) 내지 (51) 중 어느 하나에 있어서, 예방이 암의 임상적 증상의 발병을 억제하는, 방법.
(53) (48) 내지 (51) 중 어느 하나에 있어서, 예방이 암과 관련된 임상적 증상의 완화인, 방법.
(54) (47) 내지 (50) 중 어느 하나에 있어서, 예방이 암과 관련된 임상적 증상의 제거인, 방법.
본 발명을 일반적으로 설명했지만, 특정 구체적인 실시예를 참조하여 추가 이해를 얻을 수 있으며, 이는 단지 예시의 목적으로 본원에 제공되며 달리 명시되지 않는 한 제한하려는 의도가 아니다.
실시예
본 개시내용은 청구범위에 기술된 개시내용의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예 1: 이중특이적 항체( BsAB ) 설계 및 생산
항-4-1BB 항체의 경우, 94kvt 클론을 사용하였고(국제 공개 WO2018-127787호에 기술된 EU101, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨), 항-PD-L1 단백질의 경우, 친화도 성숙된 PD-1 단백질(euPD-1, 미국특허 제17/469,549호에 기술된 EU131, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함됨)을 사용하였다. 배열을 변경하여 총 10개의(S01 내지 S10) 항-4-1BB 항체 × euPD-1 변이체(본원에서 "이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체"로 지칭됨)를 설계(SEQ ID NO: 1 내지 10, 14; 각각 이중특이적 에피토프 결합 단백질 S01-S10 및 94kvt 경쇄)하고, (G4S)3, (G4S)2, 및 218 또는 218S(SEQ ID NO:15 내지 18)를 각 부분을 연결하기 위한 링커로서 사용하였다. 94kvt의 경우, scFv 형태를 사용하였다. 조작된 IgG1의 힌지 및 Fc 부분을 euPD-1와 연결하기 위해 사용하였다. Fc의 경우, 점 돌연변이(L234A, L235A, K322A, D356E, L358M)를 도입하여 ADCC 및 CDC를 감소시켰다.(도 2)
또한, S11(SEQ ID NO: 11) 항체를 항체의 C-말단에 scFv 형태로 시판 허가된 항-PD-L1 항체(아테졸리주맙, Genentech)를 부착하여 대조군으로 사용하도록 개발하였다.(도 2)
생성된 이중특이적 항체의 발현을 Expi293F 발현 시스템(Invitrogen) 또는 ExpiCHO 발현 시스템(ThermoFisher scientific)을 사용하여 수행하였다. AktaPure(cytiva) 기기, 단백질 A 컬럼(Hitrap MabSelectSure, cytiva, Cat. no. 11003495) 및 탈염 컬럼(Hiprep 26/10 Desalting, Cytiva Cat. no. 17508702)을 사용하여 정제를 수행하였다.
실시예 2: 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체의 SDS-PAGE 분석
SDS-PAGE 분석을 환원 및 비-환원 조건 하에 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체를 분석하기 위해 수행하였다. 환원 조건은 샘플 환원제(Thermo, Cat. No. NP0009)와 함께 LDS 샘플 완충액(Invitrogen, Cat. No. NP0007)에 1 μg의 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체를 첨가하는 것이다. 이어서 95℃에서 3분 동안 끓이기를 수행하였다. 비-환원 조건의 경우, 오직 LDS 샘플 완충액만 첨가하여 사용하였다. TGX 스테인-프리 겔(Mini-PROTEAN TGX stain-free gel)상에 생성된 샘플을 겔에 로딩한 후, 1x Tris/글리신/SDS 완충액(Bio-rad, Cat. No. 1610732) 중에서 125 V에서 30분 동안 러닝시켰다. Chemidoc(Bio-rad)을 사용하여 결과를 분석하여 도 3에 도시하였다.
실시예 3: 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체의 크기-배제 크로마토그래피 분석
HPLC 기기(Agilent Technologies, 1260 인피니티 II LC 시스템) 및 크기 배제 컬럼(Tosoh, TSKgel G3000 SWXL, 7.8 × 300 mm, Part No. 0008541, 컬럼 No. 004E04320E)을 사용하여 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체를 또한 SEC 분석에 적용하였다. 겔 여과 표준(Bio-rad, Cat no. 1511901)을 대조군으로서 사용하였다. 결과를 도 4에 도시하였다.
실시예 4: 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체의 친화도 분석
이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체의 친화도를 분석하기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하였다.
4- 1BB에 대한 친화도
4-1BB 친화도 결정을 위하여 5 μg/ml으로 희석된 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체를 human capture(Cytiva, Cat. No. BR-1008-39)를 이용하여 CM5 칩(Cytiva, BR-1005-30)에 고정시켰다. 4-1BB 항원(abclon)을 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 및 3.125 nM의 농도로 주입하였고, 결합 시간을 150초로 설정하였고 해리 시간을 240초로 설정하였다. Biacore T200(cytiva)을 분석 장비로서 사용하였다. 표 1은 4-1BB 친화도 평가의 결과이다:
No. Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM)
S01 1.61E+05 5.37E-04 3.34
S02 1.79E+05 6.58E-04 3.67
S03 2.08E+05 6.34E-04 3.05
S04 2.31E+05 6.62E-04 2.87
S05 1.27E+05 4.66E-04 3.66
S06 2.45E+05 9.14E-04 3.72
S07 6.43E+03 6.76E-04 105.2
S08 1.12E+05 7.64E-04 6.83
S09 2.61E+05 5.68E-04 2.17
S10 2.62E+05 6.01E-04 2.3
S11 2.06E+05 4.42E-04 2.14
4- 1BB에 대한 친화도
PD- L1에 대한 친화도
PD-L1 친화도 결정을 위하여 10 μg/ml으로 희석된 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체를 human capture를 이용하여 CM5 칩에 고정시켰다. PD-L1 항원(SinoBiologics, Cat. No. 10084-H08H)을 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 및 3.125 nM의 농도로 주입하였고, 후속 절차는 4-1BB 친화도 분석 절차와 동일하였다. 표 2는 PD-L1 친화도 평가의 결과이다:
No. Ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM)
S01 2.30E+05 1.32E-03 5.73
S02 3.24E+05 1.32E-03 4.06
S03 2.27E+05 1.15E-03 5.07
S04 5.96E+05 1.40E-03 2.34
S05 1.46E+06 1.69E-03 1.16
S06 8.37E+05 1.86E-03 2.22
S07 1.00E+06 1.58E-03 1.58
S08 8.37E+05 1.86E-03 2.22
S09 2.09E+05 1.31E-03 6.26
S10 3.77E+05 1.41E-03 3.73
S11 7.11E+04 5.53E-05 0.78
PD- L1에 대한 친화도
천연 PD-1과 S03 사이의 PD-L1에 대한 결합 차이, 및 마우스 PD-1 및 인간 PD-L1의 결합을 비교하기 위해, 인간 PD-1-Fc(SinoBiologics) 및 마우스 PD-1 Fc(SinoBiologics, Cat No. 50124-M02H)를 15 μg/ml로 희석하고 human capture와 함께 CM5 칩에 고정하였다. PD-L1 항원을 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 및 3.125 nM의 농도로 주입하였고, 후속 절차는 4-1BB 친화도 분석 절차와 동일하였다. 결과를 인간 천연 PD1-Fc의 경우 도 5a에 도시하였고 S03의 경우 도 5b에 도시하였다. S03은 천연 PD-1보다 약 93배 더 강력하게 PD-L1에 결합하는 것으로 확인되었다. 또한, 인간 PD-L1에 대한 마우스 PD-1의 친화도는 확인되지 않았다(표 3 참조).
ka (1/Ms) Kd (1/s) KD (nM)
마우스
PD1-Fc 		검출되지 않음
인간
PD1-Fc 		3.13E+05 1.48E-01 471.40
S03 2.27E+05 1.15E-03 5.07
PD- L1에 대한 친화도
실시예 5: 단일 항원 결합 ELISA
이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체가 각 표적 항원에 결합하는지 확인하기 위해 단일 항원 결합 ELISA를 수행하였다. 분석 방법을 도 6a에 도시된 바와 같이 수행하였다.
4-1BB 결합을 확인하기 위해, 96-웰 면역 플레이트를 4℃에서 1 μg/ml의 4-1BB 항원(abclon)으로 밤새 코팅하고 150 μl의 1x 분석 완충액(BioLegend)을 1시간 동안 처리하여 비-특이적 결합을 차단하였다. 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체를 3 nM에서 4배씩 4개의 지점에 대해 희석한 후, 웰 당 100 μl를 2시간 동안 처리하였다. 다음으로, HRP-접합된 항-인간 IgG, Fcγ 항체(Jackson Immunoresearch, Cat. No. 10-035-008)를 2000배 희석하고 각 웰에 100 μl씩 첨가하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. TMB로 발색 시킨 후, 황산을 사용하여 반응을 정지시켰다. TMB 처리 후 공정을 제외한 전 공정에서 세척 완충액을 사용하여 3회 세척하였으며, 코팅 공정을 제외한 모든 공정을 실온에서 진행하였다.(도 6b)
PD-L1 결합을 확인하기 위해, 96-웰 면역 플레이트를 4℃에서 1 μg/ml의 PD-L1 항원(SinoBiologics)으로 밤새 코팅하고, 150 μl의 1x 분석 완충액(BioLegend)을 1시간 동안 첨가하여 비-특이적 결합을 차단하였다. 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체를 300 nM에서 10배씩 4개의 지점에 대해 희석한 후, 웰 당 100 μl를 2시간 동안 처리하였다. 이후의 다른 절차는 4-1BB 결합 ELISA의 것과 동일하였다.(도 6c).
또한, 각 항원 결합 부위에 의한 특이적 결합 여부를 확인하기 위하여, i) 4-1BB에 대한 결합을 방지하기 위해 S03의 항-4-1BB 항체를 인간 생식계열 항체(DP47)로 치환하여 S12(SEQ ID NO: 12)를 제작하였고, ii) PD-L1에 대한 결합을 방지하기 위해 S03의 euPD-1을 점 돌연변이시키고 이를 euPD-1n으로 치환하여 S13(SEQ ID NO: 13)을 제작하고 4-1BB 및 PD-L1에 대한 단일 항원 결합 ELISA를 수행하였다.(도 6d)
4-1BB 결합의 경우, S03, S12, S13을 0.5 μg/ml에서 2배씩 희석하여 총 11 지점을 확인하였다. 항-4-1BB 항체가 없는 S12는 4-1BB에 결합하지 못하였고, S03과 S13은 4-1BB에 용량 의존적으로 결합하는 것을 확인하였다. (도 6e)
PD-L1 결합의 경우, S03, S12 및 S13을 100 μg/ml에서 4배씩 희석하여 총 11 지점을 확인하였다. PD-L1에 결합할 수 없도록 점 돌연변이된 S13은 PD-L1에 결합하지 않은 반면, S03 및 S12는 PD-L1에 용량 의존적으로 결합함을 주목하였다. (도 6f)
실시예 6: 이중 항원 결합 ELISA
이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체가 항원 4-1BB 및 PD-L1 둘 다에 결합한다는 것을 확인하기 위해 이중 결합 분석을 수행하였다.
분석 방법은 도 7a에 도시된 바와 같이 수행하였다. 요약하면, 96-웰 면역 플레이트에 1 μg/ml의 PD-L1 항원(SinoBiologics)을 4℃에서 밤새 코팅하고, 150 μl의 1x 분석 완충액(BioLegend)을 1시간 동안 처리하여 비-특이적 결합을 차단하였다. 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체를 10 nM로부터 5배씩 4개 지점에 대해 희석하여 수행하였으며, 웰 당 100 μl를 2시간 동안 처리하였으며, 0.1 μg/ml 농도의 100 μl의 비오틴화된 4-1BB 항원(SinoBiologics, Cat. No. 10041-H08H-B)을 각 웰에 첨가하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 아비딘-HRP(BioLegend, Cat No. 79004)를 1/1000으로 희석하여, 각 웰에 100 μl씩 첨가하여 30분간 처리한 후, TMB로 발색 시킨 후, 황산을 사용하여 반응을 정지시켰다. TMB 첨가 후 공정을 제외한 모든 공정에서 세척 완충액을 사용하여 3회 세척하였으며, 코팅 공정을 제외한 모든 공정은 실온에서 진행하였다. (도 7b)
S03, S12 및 S13에 대한 이중 항원 ELISA도 또한 각 항원 결합 부분에 의한 특이적 결합을 확인하기 위해 100 μg/ml에서 5배씩 12개 지점에 대해 희석하여 수행하였다. 항-4-1BB 항체가 없는 S12와 PD-L1에 대한 결합을 하지 못하는 점 돌연변이된 S13은 이중항원 결합을 보이지 않았고, S03이 용량 의존적으로 결합함을 알 수 있다.(도 7c)
실시예 7: 세포 결합 분석
PD-L1 양성 세포주인 MDA-MB-231-Luc(인간 유방암 세포, JCRB, JCRB1559), FaDu(인간 편평 세포 암종 세포, ATCC, HTB-43), 4-1BB 양성 세포주인 4-1BB Jurkat(자체 제작), 및 PD-L1 및 4-1BB 음성 세포주인 MCF-7(인간 유방암 세포)을 분석을 위해 사용하였다. 도 8은 각각의 세포주에서 4-1BB 및 PD-L1의 발현 수준을 나타낸다. 이는 2차 항체에 의해 배경 신호가 거의 없는 것으로 결정되었다.
각 세포주로부터 2 × 105개 세포에 50, 5, 0.5, 및 0.05 nM의 최종 농도로 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체를 처리하였고, 이어서 4℃에서 20분 동안 인큐베이션 하였다. 다음으로, FACS 세척 완충액을 사용하여 1회 세척을 수행하고 1 μl/튜브의 항-hFC-488 2차 항체(Jackson ImmunoResearch)를 20분 동안 처리하였다. 2회 세척한 후, FACS(FACSCelesta, BD)를 사용하여 분석을 수행하였다.
FACS 분석 결과, 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체는 PD-L1(도 9a 내지 b) 및 4-1BB 양성 세포주(도 9c)에 용량 의존적으로 결합함이 밝혀졌다. 또한, 4-1BB와 PD-L1을 모두 발현하지 않는 세포에는 결합하지 않았다(도 9d).
실시예 8: 4 - 1BB 생물분석
4-1BB 활성 효과를 검증하기 위해, 4-1BB 이펙터 세포가 활성화되면 루시페라아제가 발현된다는 원리에 따라 4-1BB 생물분석(Promega, J2332)을 수행하였다.
생물검정 및 루시페라아제 분석을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. PD-L1을 발현하는 MDA-MB-231 세포를 96-웰 백색 플레이트(Costar)에 분주하였다. 37℃ CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한 후, 이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체 및 4-1BB 이펙터 세포를 처리하였다. 항체 100 ng/ml으로부터 2배씩 희석하여 4개 지점에 대해 수행하였다. 4-1BB 이펙터 세포로 처리한 후, 37℃ CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하고, 루미노미터(Floroskan Ascent FL, Thermo)를 사용하여 발광 강도를 측정하였다. 결과는 도 10에 나와있다.
실시예 9: 4 - 1BB /PD-1 조합 생물분석
PD-1 및 PD-L1에 대한 이펙터 세포의 결합이 차단되고 4-1BB가 활성화될 때 루시페라아제가 발현된다는 원리에 따라 PD-1과 PD-L1의 결합 억제 효과와 4-1BB 활성의 효과를 검증하기 위해 4-1BB/PD-1 조합 생물분석(Promega, CS1978I10)을 수행하였다.(도 11a)
생물분석 및 루시페라아제 분석을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. PD-L1을 발현하는 PD-L1 aAPC/CHO-K1 세포를 96-웰 백색 플레이트에 분주하였다. 이를 37℃ CO2 인큐베이터에서 밤새 배양하고 항체 및 이펙터 세포를 처리하였다. S03, 항-4-1BB 항체(94kvt-조작된 IgG1, SEQ ID NO: 14 및 21), 항-PD-1 항체(펨브롤리주맙, MSD), 항-PD-L1 항체(아테졸리주맙, Roche), 및 euPD-1 Fc(SEQ ID NO: 22)를 사용하였다. 147 nM에서 3배씩 7개 지점으로 희석하여 수행하였다. 처리를 위해 4-1BB 이펙터 세포를 첨가하고, 37℃ CO2 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하고, 루미노미터(Floroskan Ascent FL, Thermo)를 사용하여 발광 강도를 측정하였다.
실험 결과(도 11b), PD-L1 발현 세포 및 이펙터 세포에 결합할 수 있는 S03에 의해 발광이 강하게 검출됨을 확인하였다.
실시예 10: PD-L1 또는 PD- L2에 대한 친화도
PD-1은 PD-L1과 PD-L2 모두에 결합하는 것으로 알려져 있다. S03은 PD-1의 친화도 성숙된 형태인 euPD-1을 함유한다. PD-L1 및 PD-L2에 대한 S03의 결합을 ELISA로 확인하였다.
96-웰 면역 플레이트를 2 μg/ml의 인간 PD-1-Fc(SinoBiologics, Cat. No. 10377-H02H)으로 웰 당 100 μl를 4℃에서 밤새 코팅하고 150 μl의 1x 분석 완충액(BioLegend)을 1시간 동안 처리하여 비-특이적 결합을 차단하였다. 비오틴화된 PD-L1(SinoBiologics, Cat. No. 10084-H08H-B) 및 비오틴화된 PD-L2(SinoBiologics, Cat. No. 10292-H08H-B)을 1 μg/ml로부터 3배씩 5개 지점 희석하여 웰 당 100 μl를 1시간 동안 처리하였다. 이후, 아비딘-HRP(BioLegend, Cat No. 79004)를 1/1000으로 희석하여, 웰 당 100 ul씩 30분 동안 첨가한 후 TMB로 발색시킨 후, 황산으로 반응을 정지시켰다. TMB 처리 후 공정을 제외한 모든 공정에서 세척 완충액을 사용하여 3회 세척하였으며, 항체 코팅 공정을 제외한 모든 공정은 실온에서 진행하였다.
또한, S03, 항PD-L1 항체(Roche), 및 항PD-L2 항체(SinoBiologics, Cat. No. 10292-R018)을 0.1 μg/ml에서 4배씩 4개 지점 희석하여, 96-웰 면역 플레이트에 웰 당 100 μl를 첨가한 후 4
Figure 112022123108799-pct00001
에서 밤새 코팅하였다.. 다음으로, 비-특이적 결합을 차단하기 위해 1시간 동안 처리를 위해 150 μl의 1x 분석 완충액을 처리하였다. 비오틴화된 PD-L1 및 비오틴화된 PD-L2 100 μl를 각 웰에 0.1 μl/ml의 농도로 1시간 동안 처리하였다. 이후의 다른 절차는 인간 PD-1-Fc ELISA와 동일하였다.
실험 결과, 인간 PD-1-Fc는 PD-L1과 PD-L2 모두에 결합하지만(도 12a), 대조군으로 사용한 항-PD-L1 항체는 PD-L1에만 결합하는 것으로 나타났으며, 항-PD-L2 항체는 PD-L2에만 결합하는 것으로 나타났다. 시험 물질 S03은 PD-L1에만 결합되었다.(도 12b 내지 c)
실시예 11: 세포독성 분석
S03의 표적 세포에 대한 T 세포 매개 세포독성 효과를 확인하기 위해 세포독성 분석을 수행하였다. 인간 말초 혈액 단핵세포으로부터 판(pan) T 음성 선택(Miltenyi Biotec, Cat. No. 130-096-535)에 의해 분리된 T 세포를 4일 동안 항-CD3 항체(OKT3, Bio X Cell)로 코팅된 플레이트에서 활성화시켰다. T 세포 및 항체 처리 하루 전에, PD-L1 양성 세포주 MDA-MB-231-GFP(자체 제작)를 4 × 104 세포/웰에 분주하였다. 항-4-1BB 항체(94kvt-조작된 IgG1), 항-PD-1 항체(펨브롤리주맙, MSD) 및 S03을 1.667 nM에서 3배씩 4개 지점 희석하여 수행하였다. 활성화된 T 세포를 수확한 다음 종양 세포와 1:1 비율로 처리하였다. GFP 신호는 살아있는 세포 분석 시스템(Incucyte, Sartorius)을 사용하여 117시간 동안 1시간 간격으로 측정하였다.
실험 결과는 1.667 nM에 대한 데이터로서, 대조군으로 사용한 항-4-1BB 항체 및 항-PD-L1 항체에 비해 S03에 의한 T 세포-매개된 세포독성 효과가 우수한 것으로 확인되었다.(도 13)
실시예 12: IFN -γ 분석
T 세포에서 생성되는 IFN-γ의 수준을 세포독성 분석(실시예 11)에서 얻은 상등액을 사용하여 측정하였다. IFN-γ ELISA 키트(BioLegend, Cat. No. 430101)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였으며, 요약하면, 포획 항체로 밤새 코팅된 플레이트에 1x 분석 완충액(BioLegend) 150 μl를 1시간 처리하였다. 표준품의 경우, 500 pg/ml부터 2배씩 7개 지점 희석하여 사용하였으며, 상등액은 50배 희석하여 각 웰에 100 μl씩 2시간 동안 처리하였다. 검출항체 100 μl를 1시간 동안 처리한 후, 아비딘-HRP(BioLegend, Cat No. 79004)를 1/1000으로 희석하고 각 웰에 100 μl씩 30분 동안 처리하였다. TMB로 발색 시킨 후, 황산을 사용하여 반응을 정지시켰다. TMB 처리 후 공정을 제외한 모든 공정에서 세척 완충액을 사용하여 3회 세척하였으며, 항체 코팅 공정을 제외한 모든 공정은 실온에서 진행하였다.
실험 결과, 항체 처리 농도에 따라 T 세포에 의한 IFN-γ 생산이 증가함을 관찰할 수 있다.(도 14)
실시예 13: 항체-의존적 세포 세포독성 분석
이중특이적 에피토프 결합 단백질 변이체에 대해 IgG1-Fc 조작을 사용하여 항체-의존적 세포독성(ADCC) 및 보체-의존적 세포독성(CDC)을 감소시켰다. ADCC 감소 여부를 확인하기 위해 S03을 사용하여 ADCC 생물분석(Promega, Cat. No. G701A)을 수행하였다.
S03의 항-4-1BB 항체 결합에 의한 ADCC를 확인하기 위하여 백색 96-웰 플레이트(Costar)에 4-1BB 양성 세포주(4-1BB NF-kB HEK293)를 분주하고 밤새 배양하였다. . 다음날, 항-4-1BB 항체인, S03(조작된 IgG1, L234A, L235A, K322A, D356E, L358M), 94kvt-IgG1(SEQ ID NO: 14 및 20), 및 94kvt-조작된 IgG1(L234A, L235A, K322A)를 294 nM에서부터 3배씩 8개 지점 희석하여 수행하였다. ADCC 이펙터 세포를 첨가하고 37℃의 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, Bio-Glo 루시페라아제 기질을 첨가하고 루미노미터(Glo-max, Promega)를 사용하여 발광 강도를 측정하였다. 양성대조군으로 사용된 94kvt-IgG1은 ADCC를 유도하는 반면, 음성대조군인 94kvt-조작된 IgG1과 S03은 ADCC를 유도하지 않는 것을 관찰할 수 있다.(도 15a)
S03의 euPD-1에 의한 ADCC를 확인하기 위해, PD-L1 양성 세포주(MDA-MB-231)를 백색 96-웰 플레이트(Costar)에 분주하고 밤새 배양하였다. 다음 날, 항-PD-L1 항체인, S03과 아벨루맙(Avelumab)(Pfizer, IgG1)과 아테졸리주맙(Atezolizumab)(Roche, 조작된 IgG1, N297A)을 5.88 nM부터 6개 지점에 대해 4배씩 희석하였다. ADCC 이펙터 세포를 첨가하고 37℃의 인큐베이터에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 Bio-Glo 루시페라아제 기질을 첨가하고 루미노미터(Glo-max, Promega)를 사용하여 발광 강도를 측정하였다. 양성대조군으로 사용된 아벨루맙(Avelumab)은 ADCC를 유도하는 것으로 볼 수 있으나, 음성대조군인 아테졸리주맙(Atezolizumab)과 S03은 ADCC를 유도하지 않는 것을 관찰할 수 있다. (도 15b)
실시예 14: 보체 -의존적 세포독성 분석
C1q ELISA를 수행하여 CDC가 S03에 사용된 조작된 IgG1에 의해 감소되었음을 확인하였다.
96-웰 면역 플레이트(NUNC)를 75 nM의 S03, 아벨루맙(Avelumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab)을 1x 코팅 완충액(BioLegend)을 사용하여 4℃에서 밤새 코팅한 후, 1× 분석 완충액(BioLegend) 150 μl를 1시간 동안 첨가하여 비-특이적 결합을 차단하였다. 비오틴화 키트(Abcam, Cat. No. Ab201795)를 사용하여 비오틴화된 C1q(comp Tech, Cat. No. A099) 단백질을 2 μg/ml로부터 2배씩 7개 지점 희석하여, 웰 당 100 μl로 2시간 동안 처리하였다. 다음으로, 아비딘-HRP(BioLegend, Cat No. 79004)를 1/1000으로 희석하여, 각 웰에 100 μl씩 첨가하여 1시간 동안 처리한 후, TMB로 발색시킨 후 황산을 사용하여 반응을 정지시켰다. TMB 처리 후 공정을 제외한 모든 공정에서 세척 완충액을 사용하여 3회 세척하였으며, 항체 코팅 공정을 제외한 모든 공정은 실온에서 진행하였다. 양성 대조군으로 사용한 아벨루맙(Avelumab)은 C1q에 결합하지만, S03과 음성대조군인 아테졸리주맙(Atezolizumab)은 C1q에 결합하지 않는 것을 관찰할 수 있다.(도 16)
실시예 15: 생체 내 효능 연구 1 - 4- 1BB KI
S03의 효능을 검증하기 위해, h4-1BB 녹-인 마우스(배경: C57BL/6, Biocytogen)를 사용하여 생체 내 연구를 수행하였다.
PD-L1을 발현하는 MC38 세포를 도 17a에 도시된 바와 같이 종양 세포로서 사용하였고, 개체 당 5 × 105 종양 세포를 피하로 투여하였다. 투여 1주일 후, 종양의 크기를 측정하여 유사한 평균(100 mm3 이내)과 표준 편차를 기준으로 투여군을 나누었다. 각 군에 대해 5마리의 마우스를 사용하였다.
S03, S05 및 S07을 정맥 내로 주입하였다. 부형제 DPBS(Gibco)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 항체 용량을 2 mg/kg 및 5 mg/kg으로 설정하였다. 투여는 100 μl로 수행하였으며 3일 간격으로 5회 투여하였다. 또한 종양 크기도 3일 간격으로 측정하였으며, 마지막 투여 후 2일까지 종양 크기를 측정하였다.
종양 크기 관찰 결과, 도 17b에 도시된 바와 같이, 음성대조군에 비해 S03, S05, S07 모두 종양 성장을 억제함을 확인하였으며, 그 중 S03의 종양 감소 효과가 가장 우수함을 알 수 있다. 또한, 시험된 항체에 대해 용량-의존적 반응이 관찰되었다.
실시예 16: 생체 내 효능 연구 2 - 4- 1BB KI
S03의 효능을 검증하기 위해, h4-1BB 녹-인 마우스(배경: C57BL/6, Biocytogen)를 사용하여 생체 내 연구를 수행하였다. 시험 방법은 도 17a와 동일하다.
S03, 항-4-1BB 항체(94kvt-조작된 IgG1), 및 항-PD-L1 항체(아테졸리주맙)를 정맥 내로 주입하였다. 부형제 DPBS(Gibco)를 음성 대조군으로서 사용하였다. 항체 용량을 S03을 기준으로 5 mg/kg(5.88 μM)으로 설정하였으며, 5.88 μM의 항-4-1BB 항체 및 항-PD-L1 항체를 또한 투여하였다. 투여는 100 μl로 수행하였으며 3일 간격으로 5회 투여하였다. 또한, 종양 크기도 3일 간격으로 측정하였으며, 마지막 투여 후 2일까지 종양 크기를 측정하였다. 또한 실험 종료 당일 혈액을 채취하여 혈액 내 ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase)), AST(아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase)), BUN(혈액 우레아 니트로겐(blood urea nitrogen))의 농도를 생화학적 분석기를 사용하여 확인하여 독성을 확인하였다.
종양 크기 관찰 결과, 도 18a에 도시된 바와 같이, 음성 대조군에 비해 S03, 항-4-1BB 항체, 및 항-PD-L1 항체 모두 종양 성장을 억제함을 확인하였으며, 그 중, S03의 종양-감소 효과(약 98% 감소)가 가장 우수함을 알 수 있다.
도 18b에 나타난 바와 같이, 혈액 내 T 세포 집단을 분석한 결과, 혈액 내 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 S03에 의해 증가하였고, CD8+ T 세포에서 이펙터 T 세포의 증가가 관찰되었다.
표 4에 나타난 바와 같이, 간 독성 지수 분석 결과, 투여군의 4가지 지표 모두 정상 범위(ALT: 17 내지 77 U/L, AST: 54 내지 298 U/L, BUN: 8 내지 33 mg/dL) 이내였으며, 실험 조건에서는 간에 간독성이 없는 것으로 확인되었다.
ALT (U/L) AST (U/L) BUN (mg/ dL )
정상 범위 17 - 77 54 - 298 8 - 33
NT 26.27 ± 1.67 97.40 ± 31.32 24.61 ± 1.60
S03 40.67 ± 8.00 59.00 ± 6.63 23.21 ± 1.70
항-4- 1BB 항체 34.67 ± 6.93 69.50 ± 13.40 28.72 ± 2.51
항-PD-L1 항체 28.37 ± 9.24 69.50 ± 19.42 31.27 ± 8.56
혈청 중 간 간세포독성
실시예 17: 생체 내 효능 연구 3 - h4- 1BB / hPD -1 DKI
S03의 효능을 검증하기 위해, h4-1BB 및 hPD-1 이중 녹-인 마우스(배경: C57BL/6, Biocytogen)를 사용하여 생체 내 연구를 수행하였다.
PD-L1을 발현하는 MC38 세포를 도 17a에 나타낸 바와 같이 종양 세포로 사용하고, 개체 당 5 × 105 종양 세포를 피하로 투여하였다. 투여 1주일 후, 종양의 크기를 측정하고 유사한 평균(약 100 mm3)과 표준 편차를 기준으로 투여군을 나누었다. 각 군에서 6마리의 마우스를 사용하였다.
항체 S03, 항-4-1BB 항체(94kvt-조작된 IgG1), 및 항-PD-L1 항체(아테졸리주맙)를 정맥 내로 주입하였다. 부형제 DPBS(Gibco)를 음성 대조군으로 사용하였다. 항체 용량은 S03 기준으로 5 mg/kg(5.88 μM)으로 설정하였고, 5.88 μM의 항-4-1BB 항체 및 항-PD-L1 항체도 투여하였다. 투여는 100 μl로 수행하였으며, 3일 간격으로 5회 투여하였다. 종양 크기도 3일 간격으로 측정하였으며, 마지막 투여 후 2일까지 종양 크기를 측정하였다.
종양 크기를 관찰한 결과, 도 19에 도시한 바와 같이, 음성 대조군의 투여에 비해 S03, 항-4-1BB 항체, 항-PD-L1 항체 모두에서 종양 성장이 억제됨을 확인하였다(약 73% 감소).
모든 데이터는 평균 SEM, 일원 ANOVA 통계 검정으로 그래프로 표시된다. 모든 통계는 동물 당 또는 샘플 당 평균 데이터를 사용하여 계산하였다. * p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001.
이상, 본 발명의 내용의 구체적인 부분에 대하여 설명하였다. 이러한 구체적인 설명은 당업자에게 있어서 바람직한 실시형태에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아님은 자명할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구범위 및 그 균등물에 의해 정의되는 것으로 의도된다.
<110> EUTILEX CO. 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350 Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 355 360 365 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 370 375 380 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 385 390 395 400 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 405 410 415 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 420 425 430 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 435 440 445 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 450 455 460 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 465 470 475 480 Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe Leu Glu Ser 485 490 495 Pro Asp Arg Pro Trp Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Leu 500 505 510 Val Ala Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Ala 515 520 525 Ser Glu Ser Phe His Val Val Trp His Arg Glu Ser Pro Ser Gly Gln 530 535 540 Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln 545 550 555 560 Asp His Arg Phe Arg Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His 565 570 575 Met Ser Val Val Arg Ala Gln Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Val Cys 580 585 590 Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg 595 600 605 Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His 610 615 620 Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val 625 630 635 640 Gly <210> 2 <211> 805 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bispecific epitope binding protein S02 <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Phe Lys Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro 115 120 125 Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 145 150 155 160 Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile 180 185 190 Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Asp Gly His Ser Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Ile Lys Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 260 265 270 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 275 280 285 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 290 295 300 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 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Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln 115 120 125 Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140 Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile 165 170 175 Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg 180 185 190 Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 195 200 205 Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 210 215 220 Phe Lys Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 260 265 270 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 275 280 285 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 290 295 300 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 305 310 315 320 His Asn Ala Lys 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Asn 260 265 270 Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 275 280 285 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 290 295 300 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 305 310 315 320 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 325 330 335 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 340 345 350 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 355 360 365 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 370 375 380 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 <210> 23 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH peptide sequence <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Phe Lys Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH nucleic acid sequence <400> 24 caggtccagc tggtgcagag cggcgccgaa gtgaaaaaac ctggggcaag tgtcaagctg 60 tcctgtaagg ccagcggtta taccttctcc tcatattgga tgcactgggt gaggcaagcc 120 cctggacaag ggctggaatg gatcggtgaa attaatcccg gaaatggcca tacaaactac 180 aatgaaaaat tcaaaagtcg agtgaccatg acacgggaca catccacttc cactgcatac 240 atggagcttt cgagtctgcg ctccgaggat acagctgtct attactgcgc acgcagtttt 300 aaaactgcca gagcctttgc ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt tagcagc 357 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL peptide sequence <400> 25 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr 20 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gccgaatggg 240 cgcgatttcc atatgagcgt tgtccgggcg caacggaacg atagtggaac atacgtgtgt 300 ggcgtaatat ccctcgctcc caaaatacaa ataaaggagt ctctgagagc agagctgaga 360 gtgacagaac gacgggcgga agttcccacg gctcatccgt caccaagtcc gcgccccgca 420 ggccaatttc aaacgctcgt cgtaggc 447 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 29 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly Ile Gln 1 5 10 15 Cys <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge peptide <400> 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge peptide <400> 31 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 32 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH domain (IgG1) <400> 32 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 33 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified CH domain <400> 33 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 <210> 34 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH domain (IgG2) <400> 34 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 35 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH domain (IgG3) <400> 35 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro 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Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL domain (Immunoglobulin kappa) <400> 37 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 38 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL domain (Immunoglobulin lambda 1) <400> 38 Gly Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 39 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CL domain (immunoglobulin lambda 2) <400> 39 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

Claims (28)

  1. (VH-VL) 또는 (VL-VH)를 포함하고; N 말단 또는 C 말단에 (X)n을 포함하며;
    상기 (X)n은 VH 또는 VL에 Y로 연결되는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질로서,
    상기 VH 및 VL은 4-1BB에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역 각각을 지칭하고, 상기 VH는 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 서열로 이루어지고, 상기 VL은 SEQ ID NO: 25로 표시되는 서열로 이루어지며,
    상기 X는 PD-L1에 결합하는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이고, 상기 PD-1 단백질은 SEQ ID NO: 27로 표시되는 서열로 이루어지며,
    상기 Y는 L234A, L235A, K322A, D356E 및 L358M 돌연변이를 포함하는 IgG1 의 Fc 를 포함하는 펩티드이며, 상기 IgG1은 ADCC 및 CDC를 감소시킨 것이고,
    상기 n은 각각 1 내지 5의 정수인, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    N 말단에서 C 말단의 방향으로 상기 VH, VL, Y, 및 (X)n이 순서대로 연결된, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    N 말단에서 C 말단의 방향으로 상기 VL, VH, Y, 및 (X)n이 순서대로 연결된, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    N 말단에서 C 말단의 방향으로 상기 (X)n, Y, VH, 및 VL이 순서대로 연결된, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    N 말단에서 C 말단의 방향으로 상기 (X)n, Y, VL, 및 VH가 순서대로 연결된, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 VH 및 VL은 직접적으로 또는 힌지 및/또는 링커에 의해 연결되고, (X)n은 힌지 및/또는 링커에 의해 연결되는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
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  9. VH 및 (X)n을 포함하며, 상기 (X)n은 VH에 Y로 연결되는, 중쇄; 및
    SEQ ID NO: 14로 표시되는 서열의 경쇄;를 포함하는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질로서,
    상기 VH는 4-1BB에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 중쇄 영역을 지칭하고, 상기 VH는 SEQ ID NO: 23으로 표시되는 서열로 이루어지며,
    상기 X는 PD-L1에 결합하는 PD-1 단백질 또는 이의 단편이고, 상기 PD-1 단백질은 SEQ ID NO: 27로 표시되는 서열로 이루어지고, 상기 n은 각각 1 내지 5의 정수이며,
    상기 Y는 L234A, L235A, K322A, D356E 및 L358M 돌연변이를 포함하는 IgG1 의 Fc 를 포함하는 펩티드이며, 상기 IgG1은 ADCC 및 CDC를 감소시킨 것인, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
  10. 제1항 내지 6항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이중특이적 에피토프 결합 단백질은 4-1BB 및 PD-L1에 대한 이중특이적 결합 친화도를 갖는, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 6항, 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    N 말단 또는 C 말단에 신호 펩티드가 추가 결합된, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 신호 펩티드는 12 내지 40개 아미노산을 포함하는 N-말단 신호 펩티드인, 이중특이적 에피토프 결합 단백질.
  13. 제1항 내지 6항, 및 제9항 중 어느 한 항의 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 코딩하는, 핵산 분자.
  14. 제13항의 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터.
  15. 제13항의 핵산 분자를 포함하는, 세포.
  16. 이중특이적 에피토프 결합 단백질의 생산 방법으로서,
    상기 방법은 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 하의 배양 배지에서 제15항의 세포를 배양하는 단계; 및 세포 및/또는 배양 배지로부터 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 6항, 및 제9항 중 어느 한 항의 이중특이적 에피토프 결합 단백질을 포함하는, PD-L1 양성 암 예방 또는 치료용 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 PD-L1 양성 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 대장암, 자궁내막암, 식도암, 자궁관암, 담낭암, 위장관암, 두경부암, 혈액암, 후두암, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 중피종, 난소암, 원발 복막암, 침샘암, 육종, 위암, 갑상선암, 췌장암, 신세포암종, 교모세포종, 전립선암, 또는 이들의 조합인, 조성물.
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