CN116615442A

CN116615442A - 程序性细胞死亡1多肽变体

Info

Publication number: CN116615442A
Application number: CN202180061743.8A
Authority: CN
Inventors: 权炳世; 任相中; 韩承熙; 李汉娜; 朴真星; 崔镇敬; 李承眩; 孙贤台
Original assignee: Eutilex Co Ltd
Current assignee: Eutilex Co Ltd
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-08-18
Also published as: JP2023541853A; KR20230060527A; WO2022053864A1; US20220073586A1; EP4211148A1

Abstract

本公开提供了程序性细胞死亡1(PD‑1)多肽变体，包含与程序性细胞死亡1配体(PD‑L1)特异性结合的细胞外结构域以及跨膜结构域或其片段。本公开还提供了PD‑1Fc融合蛋白，其包含免疫球蛋白Fc区以及PD‑1多肽变体。

Description

程序性细胞死亡1多肽变体

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2020年9月8日递交的第63/075,641号美国专利申请的优先权，所述专利申请通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。

技术领域

本发明涉及程序性细胞死亡1(PD-1)多肽变体。

背景技术

癌症仍然是全球首要的死亡原因之一。最新统计数据显示，全球13％的人口死于癌症。据国际癌症研究机构(IARC)估计，2012年全球新增1410万癌症病例，癌症死亡人数达820万。由于人口增长、老龄化以及暴露于吸烟、不健康饮食和缺乏锻炼等风险因素，预计到2030年，全球新增癌症病例将增至2170万，癌症死亡人数将增至1300万。此外，癌症治疗的疼痛和医疗费用降低了癌症患者及其家人的生活质量。

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种免疫检查点受体，具有通过下调免疫系统来调节免疫系统反应，并通过抑制T细胞的炎症活动来促进自我耐受的作用。由于PD-1在癌症中过度表达，使T细胞耗竭增加，抗肿瘤反应减弱，因此通过阻断PD-1/PD-L1抑制通路来增强T细胞活化在治疗癌症等疾病方面潜力巨大。

发明内容

本发明提供了程序性细胞死亡1(PD-1)多肽变体，包含与SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:8具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列，其中，所述PD-1多肽变体包含：与程序性细胞死亡1配体(PD-L1)特异性结合的细胞外结构域；以及跨膜结构域或其片段。在一些实施方式中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有97％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有98％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述PD-1多肽变体包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述PD-1多肽变体包含SEQ ID NO:4。在一些实施方式中，所述PD-1多肽变体包含SEQ ID NO:6。在一些实施方式中，所述PD-1多肽变体包含SEQ ID NO:8。

本发明中使用的跨膜结构域可以是与SEQ ID NO:11的氨基酸残基171-191对应的PD-1野生型跨膜结构域或其片段。在一些实施方式中，所述跨膜结构域是一个跨膜结构域的片段，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个氨基酸残基(包括由这些值结合的所有范围和子范围)。例如，所述跨膜结构域片段可包含至少2个氨基酸残基、至少5个氨基酸残基或至少10个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述跨膜结构域具有与SEQ ID NO:11的氨基酸残基171-172对应的两个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述跨膜结构域具有与SEQ ID NO:11的氨基酸残基171-173对应的三个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述跨膜结构域具有与SEQ ID NO:11的氨基酸残基171-174对应的四个氨基酸残基。在一些实施方式中，所述跨膜结构域具有与SEQ ID NO:11的氨基酸残基171-175对应的五个氨基酸残基。

所述跨膜结构域或其片段的定义中包括与SEQ ID NO:11的氨基酸残基171-191对应的PD-1野生型跨膜结构域变体，所述PD-1野生型跨膜结构域通过添加、删除、取代一至五个氨基酸(包括一、二、三、四和五个氨基酸的整数值)进行修饰，所述氨基酸可相对于与SEQID NO:11的氨基酸残基171-191对应的PD-1野生型跨膜结构域进行修饰、添加或取代。

本发明提供了程序性细胞死亡1(PD-1)多肽变体，包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的残基处的突变。

在一些实施方式中，与野生型PD-1多肽相比，所述多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力增强。在一些实施方式中，所述多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1×10^-8～1×10^-10M。在一些实施方式中，所述多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1.10×10^-9M、1.037×10^-9M或7.14×10^-10M。

本发明还提供了PD-1Fc融合蛋白，包含：免疫球蛋白Fc区；以及PD-1多肽变体(通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端)，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的序列。

本发明还提供了PD-1Fc融合蛋白，包含：免疫球蛋白Fc区；以及PD-1多肽变体(通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端)，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的残基处的突变。

本发明还提供了Fc融合BsAb(双特异性抗体)，包含：免疫球蛋白Fc区；以及PD-1多肽变体(通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的N末端)，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列；以及抗4-1BB抗体的scFv(通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的C末端)，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含与包含通过肽键或者肽连接子序列连接的SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列。

本发明还提供了Fc融合BsAb(双特异性抗体)，包含：免疫球蛋白Fc区；以个PD-1多肽变体，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的N末端，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的残基处的突变；以及抗4-1BB抗体的scFv，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的C末端，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含与包含通过肽键或者肽连接子序列连接的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的序列。在一些实施方式中，所述抗4-1BB抗体的scFv是与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23至少70％相同的氨基酸序列。

本发明的BsAb抗体具有降低的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应，或不具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应。

本发明的BsAb抗体证明肝毒性降低或无肝毒性。

在一些实施方式中，与野生型PD-1多肽相比，所述融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力增强。在一些实施方式中，所述融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1×10^-8～1×10^-10M。在一些实施方式中，所述融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1.10×10^-9M、1.037×10^-9M或7.14×10^-10M。

本发明中还提供了核酸，包含：编码PD-1多肽变体的序列，其中，所述多肽变体包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7具有95％或更高序列一致性的序列。在一些实施方式中，所述核酸进一步包含：编码免疫球蛋白Fc区的序列，其中，所述编码免疫球蛋白Fc区的序列包含SEQ ID NO:9。

本发明中还提供了表达载体，包含本发明中提供的任何一种核酸。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体。

本发明中还提供了药物组合物，包含：本发明中提供的任何一种PD-1多肽变体或本发明中提供的任何一种PD-1融合蛋白；以及药学上可接受载体。

本发明中还提供了治疗对象的方法，所述方法包括：为有需要对象施用本发明中提供的任何一种药物组合物，从而治疗疾病或病症。在一些实施方式中，所述对象患有癌症。在一些实施方式中，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈部癌、血液学癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰脏癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。

附图说明

图1示出人PD-1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。

图2示出野生型PD-1(SEQ ID NO:2)、PD-l.m7(SEQ ID NO:4)、PD-1.m8(SEQ IDNO:6)和euPD-1(SEQ ID NO:8)的序列比对。

图3示出PD-1变体Fc融合蛋白的示例性重组表达载体结构。

图4示出PD-1变体Fc融合蛋白、PD-1Fc融合蛋白(1)、PD-l.m7Fc融合蛋白(2)、PD-1.m8 Fc融合蛋白(3)和euPD-1Fc融合蛋白(4)的SDS-PAGE结果。

图5A-图5E示出凝胶过滤标层析准品(图5A)、野生型PD-1Fc融合蛋白(图5B)、PD-l.m7 Fc融合蛋白(图5C)、PD-l.m8 Fc融合蛋白(图5D)和euPD-1Fc融合蛋白(图5E)的尺寸排阻色谱图。

图6示出PD-L1在PD-L1高表达细胞系MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)和PD-L1低表达细胞系MCF-7(人乳腺癌细胞)细胞中的表达水平。

图7A示出PD-L1阳性细胞中PD-1Fc细胞结合的FACS分析。

图7B示出PD-L1阴性细胞中PD-1Fc细胞结合的FACS分析。

图8A和图8C示出实施例7的测定方法学。

图8B示出euPD-1Fc融合蛋白、野生型PD-1Fc融合蛋白和Tecentriq与抗原PD-L1的结合情况。

图8D示出euPD-1Fc融合蛋白、野生型PD-1Fc融合蛋白和Tecentriq与抗原PD-L2的结合情况。

图9示出实施例8中PD-1/PD-L1阻断生物测定的结果。

图10示出实施例9的体内疗效研究对照。

图11A、图11B、图11C和图11D示出实施例9中euPD-1Fc和tecentriq的肿瘤大小观察结果。

图12示出实施例9中的肝毒性指数分析(ALT：17～77U/L(图12A和图12E)、AST：54～298U/L(图12B和图12F)、BUN：8～33mg/dL(图12C和图12G)、T-BIL：8～33mg/dL(图12D和图12H))。

图13示出实施例10中使用euPD-1和抗4-1BB抗体的Fc融合BsAB。

图14示出实施例10中使用euPD-1和抗4-1BB抗体的Fc融合BsAB的SDS-PAGE结果。

图15示出实施例10中使用euPD-1和抗4-1BB抗体的Fc融合BsAB的凝胶过滤标层析准品尺寸排阻色谱图。

图16示出实施例10中euPD-1BsAB构建体的SPR结果。

图17A示出实施例11中使用的抗原结合测定方法。

图17B示出实施例11中的抗原结合结果。

图18示出实施例12中4-1BB/PD-1组合生物测定的结果。

具体实施方式

本公开描述了PD-1多肽的变体，其中，所述PD-1多肽变体包含野生型PD-1蛋白中的突变，增强了对PD-L1分子的亲和力。

定义：

约(About)：在本发明中用于引用某个值时，“约”系指上下文中与引用值类似的值。熟悉背景的本领域技术人员通常将理解上下文中“约”所包含的相关差异度。例如，在一些实施方式中，“约”可包含引用值25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的一系列值。

施用(Administration)：本发明中使用的术语“施用”泛指向对象或系统施用组合物，以实现药剂(即该组合物)或该组合物中所含药剂的递送。本领域普通技术人员将意识到，在适当的情况下，可以利用多种通路向对象(例如人)施用。例如，在一些实施方式中，施用可以是眼部、口服、肠胃外、局部施用等。在一些特定的实施方式中，施用位置可以是支气管(例如，通过支气管滴注)、颊给药、皮肤(可以是或包括真皮局部给药、皮内给药、皮肤间给药、透皮给药等中的一种或多种)、肠内、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌肉内、鼻内、腹腔内、鞘内、静脉内、脑室内、特定器官内(例如肝内)、粘膜、鼻腔、口腔、直肠、皮下、舌下、局部、气管(例如通过气管内滴注)、阴道、玻璃体等。在一些实施方式中，施用可以仅涉及单次剂量。在一些实施方式中，施用可以涉及应用固定数量的剂量。在一些实施方式中，施用可以涉及间歇加药(例如以时间分隔的多个剂量)和/或定时加药(例如以共同时间段分隔的个体剂量)。在一些实施方式中，施用可以涉及至少一段选定时间内的连续加药(例如灌注)。

亲和力(Affinity)：本领域已知的“亲和力”系指特定的配体与其配偶体结合的紧密度量度。可以以不同方式测量亲和力。在一些实施方式中，通过定量测定测量亲和力。在此类实施方式中，可以将结合配偶体浓度固定为超过配体浓度，以模拟生理条件。可替代地或另外，在一些实施方式中，结合配偶体浓度和/或配体浓度可以发生变化。在此类实施方式中，亲和力可以在可比较的条件(例如浓度)下与对照进行比较。

抗体药剂(Antibody agent)：本发明中使用的术语“抗体药剂”系指与特定抗原特异性结合的药剂。在一些实施方式中，此术语包括任何多肽或多肽复合物，其中包括足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件。示例性抗体药剂包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体及其片段。在一些实施方式中，抗体药剂可以包含一种或多种序列元件，如本领域已知，这些序列元件是人源化元件、引物化元件、嵌合元件等。在很多实施方式中，术语“抗体药剂”用于指代一种或多种技术已知或已开发的构建体或格式，用于在替代性陈述中利用抗体的结构性和功能性特征。例如，在实施方式中，根据本发明使用的抗体药剂的格式选自但不限于完整的IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如等)；抗体片段，如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd'片段、Fd片段和分离的CDR或其集合；单链Fv；多肽Fc融合；单域抗体(例如鲨鱼单域抗体，如IgNAR或其片段)；骆驼类抗体；掩蔽抗体(例如/>)；小型模块化免疫药物(“SMIPs^TM)；单链或串联双抗体/>VHH；微型抗体；/>锚蛋白重复蛋白或/> DARTs；TCR样抗体；，/> 微量蛋白；/> 在一些实施方式中，抗体药剂可能缺少其将会拥有(如果是天然产生的)的共价修饰(例如聚糖的附着)。在一些实施方式中，抗体药剂可以包含共价修饰(例如聚糖的附着、有效载荷[例如可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其他侧基[例如聚乙二醇等])。在很多实施方式中，抗体药剂系指或包含多肽，所述多肽的氨基酸序列包含一种或多种经本领域技术人员识别为互补决定区(CDR)的结构元件；在一些实施方式中，抗体药剂系指或包含多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与对照抗体中发现的CDR基本相同的至少一个CDR(例如至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)。在一些实施方式中，所包含的CDR与对照CDR基本相同，原因是与对照CDR相比，其序列与对照CDR相同或包含1-5个氨基酸取代。在一些实施方式中，所包含的CDR与对照CDR基本相同，原因是它显示出与对照CDR至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。在一些实施方式中，所包含的CDR与对照CDR基本相同，原因是它显示出与对照CDR至少96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。在一些实施方式中，所包含的CDR与对照CDR基本相同，原因是与对照CDR相比，所包含的CDR内删除、添加或取代了至少一个氨基酸，但所包含的CDR具有在其他方面与对照CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所包含的CDR与对照CDR基本相同，原因是与对照CDR相比，所包含的CDR内删除、添加或取代了1-5个氨基酸，但所包含的CDR具有在其他方面与对照CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所包含的CDR与对照CDR基本相同，原因是与对照CDR相比，所包含的CDR内取代了至少一个氨基酸，但所包含的CDR具有在其他方面与对照CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所包含的CDR与对照CDR基本相同，原因是与对照CDR相比，所包含的CDR内删除、添加或取代了1-5个氨基酸，但所包含的CDR具有在其他方面与对照CDR相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体药剂系指或包含多肽，所述多肽的氨基酸序列包含经本领域技术人员识别为免疫球蛋白可变结构域的结构元件。在一些实施方式中，抗体药剂系指具有与免疫球蛋白结合域同源或很大程度上同源的结合结构域的多肽蛋白。在一些实施方案中，抗体药剂系指或包含嵌合抗原受体(CAR)的至少一部分。

抗原(Antigen)：本发明中使用的术语“抗原”系指与抗体药剂结合的药剂。在一些实施方式中，抗原与抗体药剂结合，并且可以或可以不在有机体中诱导特定的生理反应。通常，抗原可以是或包含任何化学实体，例如小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚合物(包括生物聚合物[例如核酸和/或氨基酸聚合物]以及生物聚合物以外的聚合物[例如除核酸或氨基酸聚合物以外的聚合物])等。在一些实施方式中，抗原系指或包含多肽。在一些实施方式中，抗原系指或包含聚糖。本领域普通技术人员将理解，抗原通常可以以分离或纯粹的形式提供，或者可替代地可以粗糙的形式提供(例如与其他材料一起提供，例如在提取物中，例如细胞提取物，或含抗原源的其他相对粗糙的制剂)。在一些特定的实施方式中，抗原存在于细胞环境中(例如，抗原在细胞表面或细胞中表达)。在一些实施方式中，抗原系指重组抗原。

抗原结合域(Antigen binding domain)：本发明中使用的术语“抗原结合域”系指特异性结合靶标部分或实体的抗体药剂或其一部分。通常，抗原结合域与其靶标之间存在非共价相互作用。在一些实施方式中，可以采用任何化学类别的靶标部分或实体，包括碳水化合物、脂质、核酸、金属、多肽或小分子。在一些实施方式中，抗原结合域可以是多肽或包含多肽(或其复合物)。在一些实施方式中，抗原结合域是融合多肽的一部分。在一些实施方式中，抗原结合域是嵌合抗原受体(CAR)的一部分。

与...关联(Associated with)：如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一事件或实体的存在、级别和/或形式关联，则本发明中使用的两个事件或实体彼此“关联”。例如，如果特定实体(例如多肽、遗传标志、代谢产物、微生物等)的存在、水平和/或形式与疾病、紊乱或病症的发病率和/或易感性关联(例如在相关人群中)，则认为该特定实体与特定疾病、紊乱或病症相关。在一些实施方式中，如果两个或多个实体直接或间接相互作用，则它们在物理上彼此“关联”，使得它们彼此在物理上接近和/或保持物理上接近。在一些实施方式中，物理上彼此关联的两个或多个实体彼此共价连接；在一些实施方式中，物理上彼此关联的两个或多个实体彼此并非共价连接，而是通过氢键、范德瓦耳斯相互作用、疏水性相互作用、磁性及其组合进行非共价关联。

结合(Binding)：可以理解，本发明中使用的术语“结合”通常指两个或多个实体之间的非共价关联。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触；间接结合涉及通过与一种或多种中间实体物理接触进行的物理相互作用。通常，可以在各种环境中的任何环境中对两个或多个实体之间的结合进行评估——包括孤立地或在更复杂系统的环境中研究相互作用的实体或部分(例如，当与载体实体共价关联或以其他方式关联时和/或在生物系统或细胞中)。

癌症(Cancer)：在本发明中，术语“癌症”、“恶性”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”用于指表现出相对异常、不受控制和/或自主生长的细胞，使其表现出异常生长表型，而异常生长表型的特点是细胞增殖严重失控。在一些实施方式中，肿瘤可以是或包括癌前(例如良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性细胞。本公开具体识别了某些癌症，其教导可能与这些癌症特别相关。在一些实施方式中，相关癌症可以以实体肿瘤为特征。在一些实施方式中，相关癌症可以以血液肿瘤为特征。本领域已知的不同类型癌症的示例一般包括造血癌症，其中包括白血病、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤和骨髓增生性疾病；肉瘤、黑色素瘤、腺瘤、实体组织癌、口腔、喉咙、喉部和肺部鳞状细胞癌、肝癌、泌尿生殖器癌症(如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌和子宫内膜癌)、肾细胞癌、骨癌、胰脏癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑素瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、头颈癌、乳癌、胃肠道癌和神经系统癌、良性病变(如乳头状瘤)等。

化学治疗剂(Chemotherapeutic Agent)：本发明中使用的术语“化学治疗剂”在本领域中的理解系指一种或多种促凋亡、细胞抑制和/或细胞毒性剂，例如具体包括用于和/或推荐用于治疗与不良细胞增殖关联的一种或多种疾病、紊乱或病症的药剂。在很多实施方式中，化疗剂可有效用于癌症治疗。在一些实施方式中，化疗剂可以是或包含一种或多种烷化剂、一种或多种蒽环类药物、一种或多种细胞骨架破坏剂(例如微管靶向剂，如紫杉烷类、美登素及其类似物)、一种或多种埃博霉素、一种或多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC)、一种或多种拓扑异构酶抑制剂(例如拓扑异酶I和/或拓扑异构酶II的抑制剂)、一种或多种激酶抑制剂、一种或多种核苷酸类似物或核苷酸前体类似物、一种或多种肽抗生素、一种或多种基于铂基药物、一种或多种维甲酸、一种或多种长春花生物碱和/或一种或多种下列物质的一种或多种类似物(即具有相关的抗增殖活性)。在一些特定的实施方式中，化疗剂可以是或包含以下各项中的一种或多种：放线菌素、全反式维甲酸、奥瑞斯他汀、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博莱霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、姜黄素、阿糖胞苷、道诺霉素、多烯紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、表阿霉素、埃博霉素、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、依达比星、伊马替尼、伊立替康、美登素和/或其类似物(例如DM1)氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、美登醇、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、拓扑替康、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨及其组合。在一些实施方式中，可以在抗体-药物偶联物的背景下使用化疗剂。在一些实施方式中，在抗体-药物偶联物中发现了化疗剂，所述抗体-药物偶联物选自由以下各项的一组中选择：hLLl-多柔比星、hRS7-SN-38、hMN-14-SN-38、hLL2-SN-38、hA20-SN-38、hPAM4-SN-38、hLLl-SN-38、hRS7-Pro-2-P-Dox、hMN-14-Pro-2-P-Dox、hLL2-Pro-2-P-Dox、hA20-Pro-2-P-Dox、hPAM4-Pro-2-P-Dox、hLLl-Pro-2-P-Dox、P4/D10-多柔比星、吉妥单抗、维布妥昔单抗、恩美曲妥珠单抗、奥英妥珠单抗、格巴妥木单抗奥瑞他汀、SAR3419、SAR566658、BIIB015、BT062、SGN-75、SGN-CD19A、AMG-172、AMG-595、BAY-94-9343、ASG-5ME、ASG-22ME、ASG-16M8F、MDX-1203、MLN-0264、抗PSMA ADC、RG-7450、RG-7458、RG-7593、RG-7596、RG-7598、RG-7599、RG-7600、RG-7636、ABT-414、IMGN-853、IMGN-529、玛汀-沃瑟妥珠单抗以及莫星-洛沃妥珠单抗。

工程改造(Engineered)：“工程改造”泛指已经由人手操纵的方面。例如，当多肽序列由人手操纵时，所述多肽可视为“工程改造”多肽。例如，在本发明的一些实施方式中，工程改造多肽包含一个序列，所述序列包含一种或多种已由人手引入对照多肽序列中的氨基酸突变、删除和/或插入。在一些实施方式中，工程改造多肽包含已由人手与一种或多种其它多肽融合(即共价连接)的多肽，形成不会在体内自然出现的融合多肽。同样，如果一个细胞或生物体已经被操纵，使其遗传信息发生改变，则将该细胞或生物体视为“工程改造”(例如，已经引入先前不存在的新遗传物质，例如通过转化、配对、体细胞杂交、转染、转导或其他机制，或先前存在的遗传物质发生改变或移除，例如通过取代或缺失突变，或通过配对方案)。按照惯例，本领域技术人员应理解，即使对先前实体进行了实际操纵，通常工程改造多肽或细胞的衍生物和/或后代也仍然称为“工程改造”衍生物和/或后代。

药物组合物(Pharmaceutical composition)：本发明中使用的术语“药物组合物”系指一种组合物，其中的活性剂与一种或多种药学上可接受载体一起配制。在一些实施方式中，所述组合物适用于向人类或动物对象施用。在一些实施方式中，活性剂以适合于在治疗方案中施用的单位剂量存在，所述治疗方案在所述活性剂向相关人群施用时表现出达到预定治疗作用的统计学显著概率。

药学上可接受载体(Pharmaceutically acceptable carrier)：本发明中使用的术语“药学上可接受载体”一般具有本领域公认的药学上可接受材料、组合物或载体含义，例如液体或固体填料、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或封装材料，它们参与在患者体内携带或向患者输送本发明中的有用化合物，使其起到预期的作用。通常，这种构建体会从身体的一个器官或一部分携带或运送到身体的另一器官或部分。从与制剂的其他成分(包括本发明中的有用化合物)相容且不伤害患者的意义上，每个载体必须是“可接受”载体。本发明中使用的术语“药学上可接受载体”还包含任何及所有涂层、抗菌剂和抗真菌剂和吸收延迟剂，以及与化合物的活性相容并且对于患者而言生理学上可接受的类似载体。“药学上可接受载体”可进一步包含本发明中有用化合物的药学上可接受的盐。《雷氏药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(Genaro(编辑)，马克出版公司，1985，宾夕法尼亚州伊斯顿)中介绍了可包含在本发明做法中使用的药物组合物中的其他附加成分，所述出版物通过本发明的引用，成为本发明的一部分。“药学上可接受载体”可用于制备药物组合物，所述药物组合物通常与所述组合物的其他成分相容，对受体无害，并非生物学上或以其他方式不可取的组分。“药学上可接受载体”包括一种或多种载体。实施方式包括用于局部、眼、肠外、静脉内、腹膜内、肌肉内、舌下含服、鼻内或口服给药的载体。“药学上可接受载体”还包括用于制备水性分散液和注射用无菌粉末或分散液的药剂。

药学上可接受的盐(Pharmaceutically acceptable salt)：本发明中使用的术语“药学上可接受的盐”一般具有本领域公认的含义，系指本发明中提供的化合物的衍生物，其中，通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式，修饰母体化合物。药学上可接受的盐的示例包括但不限于碱性残基(如胺)的无机或有机酸盐；酸性残基(如羧酸)的碱性或有机盐；等等。本发明中提供的化合物的药学上可接受的盐包括由无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本发明中提供的化合物的药学上可接受的盐可由含有碱性或酸性部分的母体化合物经常规化学法合成。一般而言，这些盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中组合来制备；一般而言，可以使用非水性介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。关于合适的盐的列表，可以参阅《雷氏药学大全》，第17版，马克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，1985，第1418页和《药物科学杂志(Journal of Pharmaceutical Science)》，66，2(1977)，所述出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。

赋形剂(Excipient)：本发明中使用的术语“赋形剂”一般具有本领域公认的含义，系指可用于制备药物组合物的生理上相容的添加剂。关于药学上可接受载体和赋形剂的示例，可以参阅《雷氏药学大全》，第16版。

多肽(Polypeptide)：本发明中使用的术语“多肽”一般具有本领域公认的含义，即至少三个氨基酸的聚合物。本领域普通技术人员将认识到，“多肽”一词旨在以充分概括的方式给出说明，其不仅包括具有本发明所述完整序列的多肽，而且包括表示这种完整多肽的功能性片段(即保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域普通技术人员理解，蛋白序列通常容忍一些取代而不破坏活性。因而，保留活性并与母体多肽共有至少约30-40％的全部序列一致性(通常约大于50％、60％、70％或80％)，通常进一步包括至少一个一致性高得多(在一种或多种高度保守区中，所述一致性通常大于90％，甚至大于95％、96％、97％、98％或99％)的区域，并且通常包含至少3-4个且通常最多20个或更多个氨基酸的任何多肽与另一同类多肽一起包含在本发明中使用的相关术语“多肽”中。多肽可以包含L-氨基酸、D-氨基酸或两者兼而有之，并且可以包含本领域已知的各种氨基酸修饰或类似物中的任何一种。有用的修饰包括末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包括天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施方式中，蛋白质是抗体药剂、抗体片段、其生物活性部分和/或其特征部分。

重组(Recombinant)：本发明中使用的术语“重组”一词意指通过重组手段设计、工程改造、制备、表达、产生、制造和/或分离的多肽，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽；从重组的组合人多肽文库中分离的多肽；从动物(例如小鼠、兔子、绵羊、鱼等)中分离的多肽，所述动物为转基因或已经以其他方式受到操纵，以表达编码和/或指导多肽或其一种或多种成分、部分、元件或结构域的表达的基因或基因成分；和/或通过任何其他手段制备、表达、产生或分离的多肽，所述手段涉及将选定的核酸序列元件彼此剪接或连接，化学合成选定的序列元件，和/或以其他方式产生编码和/或指导多肽或其一种或多种成分、部分、元件或结构域的表达的核酸。在一些实施方式中，一种或多种所述选定序列元件是天然的。在一些实施方式中，一种或多种所述选定序列元件采用计算机模拟设计。在一些实施方式中，一种或多种所述选定序列元件来自已知序列元件的突变(如体内或体外)，例如来自天然或合成来源，如在目标源生物种系(如人、小鼠等)中。

特异性结合(Specific binding)：本发明中使用的术语“特异性结合”系指能够在结合发生的环境中在可能的结合配偶体之间进行区分的能力。结合剂在存在有其他潜在靶标时与一种特定靶标相互作用时则称为“特异性结合”其与之相互作用的靶标。在一些实施方式中，特异性结合通过检测或确定结合剂与其配偶体之间的关联程度来评定；在一些实施方式中，特异性结合通过检测或确定结合剂-配偶体复合物的解离程度来评定；在一些实施方式中，特异性结合通过检测或确定结合剂与其配偶体和另一实体之间选择性相互作用的竞争能力来评定。在一些实施方式中，特异性结合通过在一系列浓度上进行上述检测或测定来评定。

对象(Subject)：本发明中使用的术语“对象”系指生物体，通常是哺乳动物(例如人，在一些实施方式中包括人的产前形式)。在一些实施方式中，对象患有相关疾病、紊乱或病症。在一些实施方式中，对象易患疾病、紊乱或病症。在一些实施方式中，对象表现出疾病、紊乱或病症的一种或多种症状或特征。在一些实施方式中，对象未表现出疾病、紊乱或病症的任何症状或特征。在一些实施方式中，对象具有疾病、紊乱或病症的一种或多种易感特征或风险特征。在一些实施方式中，对象是患者。在一些实施方式中，对象是确诊和/或接受治疗的个体或是已经确诊过和/或接受过治疗的个体。

治疗剂(Therapeutic agent)：本发明中使用的短语“治疗剂”泛指向生物体施用后激发所需药理学效应的任何药剂。在一些实施方式中，如果某药剂在适当的群体中表现出统计学上显著的作用，则认为该药剂是治疗剂。在一些实施方式中，适当的群体可以是模式生物群体。在一些实施方式中，适当的群体可以用各种标准来界定，例如特定年龄组、性别、遗传背景、原有临床病症等。在一些实施方式中，治疗剂是一种可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟疾病、紊乱和/或病症一种或多种症状或特征的发作、降低其严重性和/或降低其发生率的物质。在一些实施方式中，“治疗剂”是曾经或目前须经政府机构批准才能上市进行人体施用的药剂。在一些实施方式中，“治疗剂”是需要开具处方才能进行人体施用的药剂。

治疗有效量(Therapeutically Effective Amount)：本发明中使用的术语“治疗有效量”系指按照治疗剂量给药方案向患有或易患疾病、紊乱和/或病症的群体施用时足以治疗所述疾病、紊乱和/或病症的量。在一些实施方式中，治疗有效量是降低疾病、紊乱和/或病症一种或多种症状的发病率和/或严重性、稳定所述症状的一种或多种特征和/或延迟所述症状发生的量。本领域普通技术人员将理解，“治疗有效量”实际上不需要在特定个体中实现成功治疗。相反，治疗有效量可以是向需要这种治疗的患者施用时在显著数量的对象中提供特定的所需药理学反应的量。例如，在一些实施方式中，术语“治疗有效量”系指这样的量，即在创新疗法的背景下向有需要的个体施用时，能阻断、稳定、减轻或逆转所述个体内发生的癌症支持性进程，或将增强或增加所述个体内的癌症抑制性进程的量。就癌症治疗而言，“治疗有效量”是当向癌症确诊个体施用时能预防、稳定、抑制或减少个体内癌症进一步发展的量。本发明所述组合物的特别优选的“治疗有效量”逆转了(在治疗性处置中)恶性肿瘤(如胰腺癌)的发展，或帮助实现或延长了恶性肿瘤的缓解。向个体施用以治疗该个体癌症的治疗有效量可以与用于促进缓解或抑制转移的治疗有效量相同或不同。就大多数癌症疗法而言，本发明所述的治疗方法不应解释为限于或以其他方式限于癌症的“治愈”；相反，治疗方法指使用所述组合物来“治疗”癌症，即对患癌个体的健康产生期望的或有益的改变。肿瘤学领域有经验的医疗保健提供者认识到了这些益处，包括但不限于患者病情稳定、肿瘤减小(肿瘤消退)、重要机能改善(例如患癌组织或器官功能改善)、减少或抑制进一步转移、减少机会性感染、生存能力的提高、疼痛的减轻、运动机能改善、认知功能改善、精力改善(活力，不适减少)、健康感改善、恢复正常食欲、恢复健康的体重增加及其组合。此外，个体内特定肿瘤的消退(例如作为本文所述治疗的结果)还可以通过以下方式进行评定：从肿瘤(如胰腺癌)部位抽取癌细胞样本(例如在治疗过程中)并对癌细胞进行代谢标志物和信号传导标志物水平检测，从而监测癌细胞的状态，在分子水平上验证癌细胞消退至低恶性表型。例如，采用本发明的方法诱导的肿瘤消退将通过以下方式进行指示：发现前文所述任何一种促血管生成标志物减少，本文所述抗血管生成标志物增加，代谢路径或细胞间信号传导路径或细胞内信号传导路径(在癌症确诊个体内表现出异常活性)正常化(即朝着非患癌正常个体的状态方向改变)。本领域普通技术人员将理解，在一些实施方式中，治疗有效量可以配制成单剂量和/或按单剂量给药。在一些实施方式中，治疗有效量可以配制成多剂量和/或按多剂量给药，例如作为给药方案的一部分。

变体(Variant)：就分子(如核酸、蛋白质或小分子)而言，本发明中使用的术语“变体”系指与对照分子显示出显著的结构一致性但结构上不同于对照分子的分子，例如，与对照实体相比，在一个或多个化学部分的存在或不存在或水平方面存在差别。在一些实施方式中，变体在功能上也不同于其对照分子。一般而言，将特定分子视为对照分子的“变体”是否恰当是基于其与对照分子的结构一致性程度。本领域技术人员将理解，任何生物或化学对照分子都具有某些特征性结构元件。根据定义，变体是共有一种或多种此类特征性结构元件但在至少一个方面不同于对照分子的不同分子。这里仅举几个例子，多肽可具有由多个氨基酸组成的特征性序列元件，这些氨基酸在线性或三维空间中具有彼此相对的指定位置和/或参与构成特定的结构基序和/或生物学功能；核酸可具有多个核苷酸残基组成的特征性序列元件，这些核苷酸残基在线性或三维空间中具有彼此相对的指定位置。在一些实施方式中，变体多肽或核酸可能因氨基酸或核苷酸序列中的一处或多处差异而有别于对照多肽或核酸。在一些实施方式中，变体多肽或核酸与对照多肽或核酸的总体序列一致性至少为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％。在一些实施方式中，变体多肽或核酸与对照多肽或核酸不共有至少一种特征序列元件。在一些实施方式中，对照多肽或核酸具有一种或多种生物活性。在一些实施方式中，变体多肽或核酸与对照多肽或核酸共有一种或多种生物学活性。

载体(Vector)：本发明中使用的术语“载体”系指能够运输与之相连的另一核酸的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，指可在其中连接其他DNA片段的环状双链DNA环。另一种载体类型是病毒载体，其中，其他DNA片段可连入病毒基因组。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和其他游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能够引导与其操作性连接的基因的表达。在本发明中，此类载体称为“表达载体”。可以利用标准技术(例如电穿孔、脂质转染)进行重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养与转化。可以按照制造商的说明书或按照本领域常规操作或按照本发明所述进行酶促反应和纯化技术。上述技术和程序一般可以按照如本领域所知、如本说明书所引用和论述的各种综合性和专论性文献所述进行。参见Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》第2版，美国冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(1989)，该书通过本发明的引用，成为本发明的一部分，并用于任何目的。

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种抑制性受体，主要由活化的T细胞表达。除了常规的T细胞外，PD-1还可由调节性T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和一些髓样细胞群表达。PD-1在各种生理反应中调节T细胞效应子功能，包括急慢性感染、癌症、自身免疫性和处于免疫稳态。此外，PD-1在抗原接触期间经常表现出较高的持续表达水平，这种情况可能发生在慢性感染或癌症的环境中，并且会限制保护性免疫力。

在肿瘤微环境中，PD-1及其配体(程序性死亡配体1(PD-L1))通过使肿瘤逃避免疫监视在肿瘤的进展和存活中发挥重要作用。通过阻断PD-1和PD-L1抑制通路来增强T细胞活化的做法已表现出有益的抗肿瘤反应，使各类癌症患者的病情得到长期缓解。因此，使用阻断PD-1和PD-L1相互作用的抑制剂能帮助预防PD-1刺激(例如在T细胞上)，从而增加T细胞功能信号和免疫细胞反应。

在一些实施方式中，引入野生型PD-1的特异性突变，以产生PD-1多肽变体，其中，特异性突变诱导了与PD-L1的优先结合。在一些实施方式中，PD-1多肽变体是可溶性PD-1蛋白。在一些实施方式中，PD-1多肽变体包含细胞外结构域和跨膜结构域或其片段。跨膜结构域或其片段如上所述。

在一些实施方式中，PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:8具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列，其中，PD-1多肽变体包含与PD-L1特异性结合的细胞外结构域、跨膜结构域或其片段。在一些实施方式中，PD-1多肽变体包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:8的氨基酸序列。

在一些实施方式中，与野生型PD-1多肽相比，PD-1多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力增强。在一些实施方式中，多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1×10^-8～1×10^-10M，优选约1×10^-9～1×10^-10M。在一些实施方式中，多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1.10×10^-9M、1.037×10^-9M或7.14×10^-10M。

本发明中使用的“核酸”用于包括任何包含多核苷酸的化合物和/或物质。示例性核酸或多核苷酸可以包括但不限于核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)。

在一些实施方式中，核酸包括编码PD-1多肽变体的序列，其中，所述PD-1多肽变体包含至少一个与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7具有95％或更高(96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

SEQ ID NO:1-人PD-1野生型(核苷酸序列)

TTTTTGGATTCTCCAGACCGGCCTTGGAACCCGCCCACGTTTAGCCCTGCTCTTTTGGTAGTTACAGAGGGGGACAACGCCACATTCACCTGCAGCTTCTCTAATACGTCCGAGAGCTTTGTACTGAATTGGTATAGAATGAGTCCATCTAATCAGACAGATAAATTGGCTGCCTTCCCTGAAGACAGGAGTCAGCCGGGTCAGGACTGCAGATTCCGCGTTACGCAACTCCCAAATGGTCGAGACTTTCATATGTCAGTTGTTCGGGCGAGGAGAAATGATAGCGGTACTTACCTGTGCGGCGCGATATCTCTCGCACCAAAAGCACAGATTAAAGAGTCTCTCCGGGCTGAACTCCGCGTGACAGAAAGGCGAGCCGAGGTACCAACGGCGCACCCATCACCGAGTCCTAGACCTGCGGGCCAATTCCAGACTTTGGTTGTCGGA

SEQ ID NO:2-人PD-1野生型(氨基酸)

FLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVG

SEQ ID NO:3-PD-1多肽变体PD-l.m7(核苷酸序列)

TTTCTGGAGTCACCCGACCGCCCTTGGAACGCACCTACCTTTTCCCCGGCCCTCTTGCTGGTCGCAGAAGGAGATAACGCCACTTTCACATGCAGCTTTAGTAACGCCTCCGAATCTTTTCATGTAGTTTGGCACAGAGAAAGCCCCTCCGGACAAACCGACACCTTGGCTGCGTTTCCCGAAGACCGAAGTCAACCAGGGCAGGACTGCCGGTTCCGCGTAACACGGCTGCCAAACGGTAGGGACTTCCACATGTCAGTGGTTCGAGCACGCCGGAACGACAGCGGGACGTATGTCTGCGGAGTCATTAGCCTTGCCCCGAAGATACAGATTAAAGAAAGTCTTGGGGCAGAACTTCGAGTCACCGAGCGCAGGGCCGAGGTCCCAACGGCACATCCCAGTCCTAGTCCACGGCCCGCCGGTCAATTTCAGACCCTTGTAGTGGGC

SEQ ID NO:4-PD-1多肽变体PD-l.m7(氨基酸)

FLESPDRPWNAPTFSPALLLVAEGDNATFTCSFSNASESFHVVWHRESPSGQTDTLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYVCGVISLAPKIQIKESLGAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVG

SEQ ID NO:5-PD-1多肽变体PD-l.m8(核苷酸序列)

TTTTTGGAAAGTCCCGATCGGCCTTGGAACGCTCCCACATTTAGCCCGGCCCTGCTTTTGGTTGCTGAAGGCGATAACGCCACTTTTACATGCAGTTTCAGCAACGCCTCTGAAAGTTTCCATGTAGTGTGGCACCGCGAGTCTCCAAGTGGGCAAACAGATACCCTTGCAGCTTTCCCGGAAGATAGGAGTCAGCCAGGGCAGGATCACCGGTTTAGAGTCACTCGCCTCCCCAATGGTAGAGATTTTCACATGAGCGTCGTTCGAGCTCAGAGAAACGATAGTGGCACATACGTTTGTGGCGTAATATCTCTCGCCCCGAAGATCCAGATTAAAGAGTCCCTTGGCGCGGAGCTGAGAGTCACCGAGAGGCGAGCTGAGGTGCCTACAGCTCATCCTAGCCCGAGCCCAAGGCCAGCTGGACAGTTCCAAACTTTGGTTGTAGGC

SEQ ID NO:6-PD-1多肽变体PD-l.m8(氨基酸)

FLESPDRPWNAPTFSPALLLVAEGDNATFTCSFSNASESFHVVWHRESPSGQTDTLAAFPEDRSQPGQDHRFRVTRLPNGRDFHMSVVRAQRNDSGTYVCGVISLAPKIQIKESLGAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVG

SEQ ID NO:7-PD-1多肽变体euPD-1(核苷酸序列)

TTTCTCGAATCACCGGACAGACCCTGGAATGCGCCCACATTCTCACCAGCACTTTTGCTGGTAGCAGAGGGCGATAATGCTACATTCACGTGTTCCTTCAGTAATGCAAGCGAGTCATTTCATGTGGTTTGGCATCGAGAGTCACCTAGTGGGCAGACTGATACACTTGCCGCATTCCCGGAAGATCGCTCCCAGCCAGGTCAGGATCACCGGTTCAGGGTAACCCGACTGCCGAATGGGCGCGATTTCCATATGAGCGTTGTCCGGGCGCAACGGAACGATAGTGGAACATACGTGTGTGGCGTAATATCCCTCGCTCCCAAAATACAAATAAAGGAGTCTCTGAGAGCAGAGCTGAGAGTGACAGAACGACGGGCGGAAGTTCCCACGGCTCATCCGTCACCAAGTCCGCGCCCCGCAGGCCAATTTCAAACGCTCGTCGTAGGC

SEQ ID NO:8-PD-1多肽变体euPD-1(氨基酸)

FLESPDRPWNAPTFSPALLLVAEGDNATFTCSFSNASESFHVVWHRESPSGQTDTLAAFPEDRSQPGQDHRFRVTRLPNGRDFHMSVVRAQRNDSGTYVCGVISLAPKIQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVG

在本发明所述的所有实施方式中，PD-1变体可在C末端包含由于选择克隆用限制性内切酶而产生的额外残基。优选地，由于克隆选择而产生的额外残基限于一个、两个、三个或四个残基，优先考虑二肽添加，优选丙氨酸-丝氨酸二肽。例如，当作为PD-1多肽变体单独使用或作为融合构建体的一部分时，对于euPD-1，本发明中包含SEQ ID NO:8的序列加上C末端AS二肽。本发明的PD-1多肽变体的氨基酸序列一致性的定义水平设想并包含了这样一种序列。

在一些实施方式中，本发明的PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的残基处的突变。本发明中包括一种编码本实施方式PD-1多肽变体的核酸、一种包含所述核酸的载体、一种包含本实施方式PD-1多肽变体的药物组合物以及一种通过施用所述药物组合物治疗有需要对象的疾病或病症(例如癌症)的方法。

在本实施方式的变体中，本发明的PD-1多肽变体包含一种PD-1变体，所述PD-1变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸，其中，所述变体具有位于D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、Q99、L122、A125、A132和R139处的突变。本发明中包括一种编码本实施方式PD-1多肽变体的核酸、一种包含所述核酸的载体、一种包含本实施方式PD-1多肽变体的药物组合物以及一种通过施用所述药物组合物治疗有需要对象的疾病或病症(例如癌症)的方法。

在一些实施方式中，本发明的PD-1多肽变体包含一种PD-1变体，所述PD-1变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有位于D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139处的突变。本发明中包括一种编码本实施方式PD-1多肽变体的核酸、一种包含所述核酸的载体、一种包含本实施方式PD-1多肽变体的药物组合物以及一种通过施用所述药物组合物治疗有需要对象的疾病或病症(例如癌症)的方法。

优选突变包括：D26E、P34A、V43L、T45A、T59A、V64H、L65V、N66V、Y68H、M70E、N74G、K78T、C93H、Q99R、R114Q、L122Y、A125V、A132I、R139G。

Fc融合蛋白和编码核苷酸序列

本发明中使用的“Fc融合蛋白”系指由与目标多肽或蛋白连接的IgG的Fc结构域组成的工程改造蛋白。Fc融合多肽或蛋白的示例包括但不限于单肽、细胞表面受体结合后激活的配体、信号传导分子(例如细胞因子)、二聚后激活的受体的细胞外结构域以及用于识别蛋白质微阵列中的结合配偶体的诱饵蛋白。在一些实施方式中，Fc融合蛋白充当通过抗原结合域特异性结合特定抗原的抗体物质。在一些实施方式中，Fc融合蛋白包含一种多肽或多肽复合物，其中包括足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件。

Fc是从IgG1或其变体、IgG2或其变体、IgG4或其变体以及人源化IgGl/2或其变体中选择的恒定域。Fc在二聚化中扮演多重角色，实现了Ig Y形结构形成和结构维持以及Fc介导的效应器功能，延长了血清半衰期。在一些实施方式中，单体Fc中存在两个结构域，即第二恒定域(CH2)和第三恒定域(CH3)。在一些实施方式中，所述融合蛋白包含将Fc结构域和特定肽或蛋白融合在一起的连接子。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc区通过肽键与特定的肽或蛋白连接。在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc区通过肽连接子序列与特定的肽或蛋白连接。在一些实施方式中，所述连接子序列包含(G₄S)₂连接子(SEQ ID NO:19)、(G₄S)₃连接子(SEQ ID NO:20)或218连接子(SEQ ID NO:21)。

在一些实施方式中，所述特异性肽或蛋白与免疫球蛋白Fc区的羧基末端连接。在一些实施方式中，所述Fc区包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16或与SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:16具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的序列。

在一些实施方式中，PD-1多肽变体用于产生PD-1融合蛋白。在一些实施方式中，PD-1融合蛋白可以包含PD-1多肽变体和免疫球蛋白Fc区。在一些实施方式中，PD-1Fc融合蛋白包含免疫球蛋白Fc区以及PD-1多肽变体(通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端)，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:8具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc区包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，与野生型PD-1多肽相比，PD-1Fc融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力增强。在一些实施方式中，PD-1Fc融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1×10^-8～1×10^-10M，优选约1×10^-9至1×10^-10M。在一些实施方式中，PD-1Fc融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1.10×10^-9M、1.037×10^-9M或7.14×10^-10M。

在一些实施方式中，核酸构建体包括编码免疫球蛋白Fc区和PD-1多肽变体的区域。在一些实施方式中，编码Fc结构域的序列包含与SEQ ID NO:9具有95％或更高(例如95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的核苷酸序列。

SEQ ID NO:9-Fc(207-230 IMGT等位基因IGHG1*03，231-457 IMGT等位基因IGHG2*01)

AGCAACACTAAAGTCGACAAGCGAGTAGAACCGAAATCATGCGACAAAACACATACGTGCCCTCCCTGCCCAGCACCACCTGTCGCGGGCCCCTCTGTTTTCCTGTTTCCACCCAAGCCAAAGGACACATTGATGATTTCCCGGACTCCTGAAGTCACCTGCGTGGTAGTAGATGTATCACATGAAGATCCAGAAGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTAGAGGTACATAATGCCAAGACCAAACCACGGGAAGAGCAGTTCAACAGTACTTTCCGGGTAGTTAGCGTTTTGACTGTCGTACACCAAGACTGGCTTAATGGAAAAGAATACAAGTGTAAGGTAAGCAACAAGGGCCTGCCGGCTCCGATAGAGAAAACCATTAGCAAGACAAAGGGCCAACCACGCGAACCCCAGGTATATACCCTCCCACCGTCCCGCGAGGAGATGACTAAGAATCAAGTTTCTCTCACGTGCTTGGTAAAGGGCTTCTATCCGAGCGATATAGCCGTGGAGTGGGAGTCTAATGGTCAGCCCGAAAACAATTACAAAACTACGCCTCCTATGCTGGACAGTGATGGGAGCTTCTTTCTTTACAGTAAGCTTACCGTGGACAAGTCTCGGTGGCAACAAGGAAATGTTTTTAGTTGTTCTGTAATGCATGAAGCACTTCATAACCATTACACCCAGAAAAGTCTGAGCTTGTCCCCGGGAAAA

SEQ ID NO:10-Fc(207-230 IMGT等位基因IGHG1*03，231-457 IMGT等位基因IGHG2*01)(氨基酸)

SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF

RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREP

QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK

如上所述，在本发明所述的所有实施方式中，PD-1变体可在C末端包含由于选择克隆用限制性内切酶而产生的额外残基。优选地，由于克隆选择而产生的额外残基限于一个、两个、三个或四个残基，优先考虑二肽添加，优选丙氨酸-丝氨酸二肽。例如，当作为PD-1多肽变体单独使用或作为融合构建体的一部分时，对于euPD-1，本发明中包含SEQ ID NO:8的序列加上C末端AS二肽。本发明的PD-1多肽变体的氨基酸序列一致性的定义水平设想并包含了这样一种序列。因此，在本实施方式的融合构建体中，由克隆产生的残基可以位于连接子之前。

本发明还包含一种PD-1Fc融合蛋白，其中存在PD-1多肽变体的多个拷贝，每个拷贝通过连接子分开。术语“PD-1多肽变体的多个拷贝”指可能存在两个、三个或四个PD-1多肽变体，其中存在的变体可能相同或不同。此外，将各个PD-1多肽变体分开的连接子可以相同或不同。此外，PD-1多肽变体之间的连接子可能与PD-1多肽变体和目标多肽或蛋白之间的连接子不同。

在一些实施方式中，PD-1Fc融合蛋白的PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的突变。本发明中包括一种编码本实施方式PD-1多肽变体的核酸、一种包含所述核酸的载体、一种包含本实施方式PD-1多肽变体的药物组合物以及一种通过施用所述药物组合物治疗有需要对象的疾病或病症(例如癌症)的方法。

在本实施方式的变体中，PD-1Fc融合蛋白的PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有位于D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、Q99、L122、A125、A132和R139处的突变。本发明中包括一种编码本实施方式PD-1多肽变体的核酸、一种包含所述核酸的载体、一种包含本实施方式PD-1多肽变体的药物组合物以及一种通过施用所述药物组合物治疗有需要对象的疾病或病症(例如癌症)的方法。

在一些实施方式中，PD-1Fc融合蛋白的PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有位于D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139处的突变。本发明中包括一种编码本实施方式PD-1多肽变体的核酸、一种包含所述核酸的载体、一种包含本实施方式PD-1多肽变体的药物组合物以及一种通过施用所述药物组合物治疗有需要对象的疾病或病症(例如癌症)的方法。

如上所述，在一些实施方式中，免疫球蛋白Fc区包含与SEQ ID NO:10或SEQ IDNO:16具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

4-1BB

4-1BB(也称为CD137、TNFRSF9)是一种属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的受体。4-1BB是一种共刺激分子，一般在活化的T淋巴细胞中表达，并参与免疫和自身免疫疾病(Kwon等人PNAS 84：2896，1987；Kwon等人PNAS 86：1963，1989；Son人等《免疫法杂志(Journal of Immunological Methods)》286(1-2)：187-201，2004，所述各出版物通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分)。人4-1BB是一种由255个氨基酸组成的蛋白，在细胞表面以单体(30kDa)和二聚体(55kDa)的形式表达，并有可能与4-1BB配体三聚体化进行信号传导。

此外，4-1BB在许多细胞上进行组成性表达，尽管表达水平较低，包括Foxp3⁺Tregs和树突状细胞(DC)。采用多种激动剂(如细胞因子(例如IL-2、IL-4)、多克隆激活剂(例如Con A和PHA)、细胞表面分子(例如抗CD3、抗CD28)和Ca²⁺诱导和PKC活性启动子(例如离子霉素、肉豆蔻酸佛波酯))进行激活，进一步增强了4-1BB的表达。

对小鼠和人T细胞的大量研究表明，4-1BB促进了细胞增殖、存活和细胞因子产生。研究表明，一些4-1BB激动剂单克隆抗体可以增加协同刺激分子表达，显著增强溶细胞T淋巴细胞反应，从而在预防和治疗环境中产生抗肿瘤药效。此外，4-1BB单药和联合治疗肿瘤模型建立了持久的抗肿瘤保护性T细胞记忆应答。研究还表明，4-1BB激动剂在各种本领域公认的自身免疫模型中抑制了自身免疫反应。4-1BB的这种双活性具有提供抗肿瘤活性的潜力，同时抑制了与免疫疗法关联的自身免疫副作用。

在本发明中的一些实施方式中，所述融合蛋白可包含作为免疫球蛋白Fc区的抗4-1BB抗体结构域。具体而言，利用具有作为单链Fv(scFv)的抗4-1BB抗体结构域(94kvt)的94kvt克隆(WO2018-127787，通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分)，可以产生抗4-1BB抗体结构域。用于抗4-1BB抗体的合适scFv的示例包括VH-218连接子-VL(HLC 218)和VL-218连接子-VH(LHC 218)。94kvt VH序列如SEQ ID NO:17所示，而94kvt VL序列如SEQID NO:18所示，218连接子如SEQ ID NO:21所示。此外，scFv变体94kvt HLC 218如SEQ IDNO:22所示，scFv变体94kvt LHC 218如SEQ ID NO:23所示。

在一些实施方式中，作为单链Fv(scFv)的抗4-1BB抗体结构域(94kvt)包含与SEQID NO:22或SEQ ID NO:33至少70％相同(例如至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同、或100％相同)的序列。

因此，在本发明的一个实施方式中，Fc融合BsAb(双特异性抗体)包括：免疫球蛋白Fc区；PD-1多肽变体(通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的N末端)，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高)序列一致性的氨基酸序列；以及抗4-1BB抗体的scFv(通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的C末端)，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含与包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列(通过肽键或者肽连接子序列连接)具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

本发明还提供了一种Fc融合BsAb(双特异性抗体)，包括：免疫球蛋白Fc区；PD-1多肽变体(通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的N末端)，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高)序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的残基处的突变；以及抗4-1BB抗体的scFv(通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的C末端)，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含与包含通过肽键或者肽连接子序列连接的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

在一些实施方式中，抗4-1BB抗体的scFv是与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23至少70％相同(例如至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同、或100％相同)的氨基酸序列。

所述连接子序列的示例包括(G₄S)₂(SEQ ID NO:19)、(G₄S)₃连接子(SEQ ID NO:20)或218连接子(SEQ ID NO:21)。

与野生型PD-1多肽相比，本发明所述的双特异性抗体对PD-L1分子的结合亲和力增强，对4-1BB的结合亲和力具有特异性。

本发明的BsAb抗体证明肝毒性降低或无肝毒性。

载体

在一些实施方式中，可以通过本领域已知的方法将上述核酸构建体插入到表达载体或病毒载体中，核酸分子可以按人工操作方式连接至表达控制序列。表达载体的非限制性示例包括质粒载体、转座子载体、柯斯质粒载体和病毒衍生载体(例如任何腺病毒衍生载体(AV)、巨细胞病毒衍生(CMV)载体、猴病毒衍生(SV40)载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体)。在一些实施方式中，所述表达载体是病毒载体。

这类克隆和/或表达序列中可以添加额外序列，以优化这些序列在克隆和/或者表达中的功能，辅助分离多核苷酸，或改进细胞中的多核苷酸引入。克隆载体、表达载体、适配子和连接子的使用在本领域众所周知。

在一些实施方式中，将核酸分子插入载体中，当引入到适当的细胞中时，所述载体能够表达本公开的PD-1多肽变体或PD-1Fc融合蛋白。

治疗应用

在一些实施方式中，本发明所述的PD-1多肽变体、PD-1Fc融合蛋白或核酸构建体可用于治疗有需要的对象。在一些实施方式中，所述对象经诊断患有PD-L1相关疾病。在一些实施方式中，所述对象经诊断患有PD-L1相关癌症。在一些实施方式中，可对经诊断患有PD-L1相关疾病的对象施用包含PD-1多肽变体或PD-1Fc融合蛋白和药学上可接受载体的药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物可与一种或多种额外抗癌疗法一起施用，所述抗癌疗法包括但不限于电离辐射、化疗剂、治疗性抗体和检查点抑制剂。

PD-1/PD-L1通路代表了肿瘤细胞响应内源性免疫抗肿瘤活性时采用的适应性免疫抵抗机制。肿瘤细胞上表达的PD-L1与活化T细胞上的PD-1受体结合，抑制了细胞毒性T细胞。在一些实施方式中，PD-1多肽变体作为治疗癌症(包括但不限于非小细胞肺癌、肺腺癌、胃癌和乳腺癌)的PD-L1抑制剂。

癌症可指以体内不正常细胞不受控制的生长为特征的一大类疾病。不受调控的细胞分裂和生长导致形成了恶性肿瘤，肿瘤侵入邻近组织，并且还可以通过淋巴系统或血流转移到身体的远侧部分。癌症或癌组织可包括肿瘤。

适合采用本公开的方法治疗的癌症可以包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈部癌、血液学癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰脏癌和前列腺癌。在一些实施方式中，采用本公开的方法治疗的癌症可以包括但不限于癌、淋巴瘤(例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。在一些实施方式中，癌症可包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胰脏癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血病等淋巴增生性疾病，以及各种头颈部癌。

在一些实施方式中，癌症可以是胚胎性肿瘤(肾母细胞瘤、肝母细胞瘤、横纹肌样瘤、成神经细胞瘤)、生殖细胞瘤(卵黄囊瘤、未成熟畸胎瘤和胚胎性癌)、癌(肝细胞癌和肺鳞癌)、肉瘤(恶性横纹肌样瘤和RMS)或恶性黑色素瘤。

本发明的融合蛋白和双特异性抗体的优势有所增加，即它们具有降低的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应，或不具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应。此外，本发明的融合蛋白和双特异性抗体具有降低的肝毒性，或不具有肝毒性。

在本说明书的上下文中，如未另行说明，本发明中提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献出于所有目的通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分，如同充分阐述一样，其全部内容应视为本公开的一部分。

除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。若有冲突，以本说明书(包括定义)为准。

本发明的上述书面说明提供了一种制作和使用本发明的方式和过程，使本领域技术人员能够制作和使用本发明，特别是针对构成原说明书一部分的所附权利要求的主题。

本发明中使用的短语“选自由……组成的组中”、“从……中选择”等包括指定材料的混合物。

若本发明中规定了数值的极限或范围，则包括端点。此外，本发明须具体包括并写明数值极限或范围内的所有值和子范围。

上述说明旨在使本领域技术人员能够制作和使用本发明，并且上述说明是在特定应用及其要求的情况下提供。本领域技术人员将清楚地知道优选实施方式的各种修改，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本发明中定义的一般原理可用于其他实施方式和应用。因此，本发明并不限于所示的实施例，而是在最大范围内符合本发明公开的原理和特征。

在不受以下具体实施方式限制的情况下，对本发明举例说明如下：

(1)一种程序性细胞死亡1(PD-1)多肽变体，包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列，

其中，所述所述PD-1多肽变体包含：

与程序性细胞死亡1配体(PD-L1)特异性结合的细胞外结构域；以及

跨膜结构域或其片段。

(2)根据(1)所述的PD-1多肽变体，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有97％或更高序列一致性的氨基酸序列。

(3)根据(1)或(2)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有98％或更高序列一致性的氨基酸序列。

(4)根据(1)-(3)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述PD-1多肽变体包含SEQID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

(5)根据(1)所述的PD-1多肽变体，其中，所述PD-1多肽变体包含SEQ ID NO:4。

(6)根据(1)所述的PD-1多肽变体，其中，所述PD-1多肽变体包含SEQ ID NO:6。

(7)根据(1)所述的PD-1多肽变体，其中，所述PD-1多肽变体包含SEQ ID NO:8。

(8)根据(1)-(7)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述跨膜结构域包含至少2个氨基酸残基。

(9)根据(1)-(8)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述跨膜结构域包含至少5个氨基酸残基。

(10)根据(1)-(9)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述跨膜结构域包含至少10个氨基酸残基。

(11)根据(1)-(10)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，与野生型PD-1多肽相比，所述多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力增强。

(12)根据(1)-(11)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1×10^-8～1×10^-10M。

(13)根据(1)-(12)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1.10×10^-9M、1.037×10^-9M或7.14×10^-10M。

(14)一种PD-1Fc融合蛋白，包含：

免疫球蛋白Fc区；以及

PD-1多肽变体，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

(15)根据(14)所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，免疫球蛋白Fc区包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

(16)根据(14)-(15)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，与野生型PD-1多肽相比，所述融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力增强。

(17)根据(14)-(16)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，所述融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1×10^-8～1×10^-10M。

(18)根据(14)-(17)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，所述融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1.10×10^-9M、1.037×10^-9M或7.14×10^-10M。

(19)根据(14)-(18)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，所述PD-1多肽变体通过肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端。

(20)根据(14)-(19)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，所述肽连接子序列选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21组成的组中。

(21)根据(14)-(20)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，存在PD-1多肽变体的一个以上拷贝，其中，所述拷贝可以相同或不同，并通过肽连接子序列连接。

(22)根据(21)所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，存在PD-1多肽变体的两个拷贝。

(23)根据(21)或(22)所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，所述肽连接子序列选自由SEQID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21组成的组中。

(24)根据(14)-(23)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，所述PD-1Fc融合蛋白选自由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15组成的组中。

(25)一种核酸，包含：

编码PD-1多肽变体的序列，其中，所述多肽变体包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的序列。

(26)根据(25)所述的核酸，进一步包含：

编码免疫球蛋白Fc区的序列，其中，所述编码免疫球蛋白Fc区的序列包含SEQ IDNO:9。

(27)一种表达载体，包含(25)或(26)所述的核酸。

(28)根据(27)所述的载体，其中，所述载体是病毒载体。

(29)一种药物组合物，包含：

(1)-(13)中任一项所述的PD-1多肽变体或(14)-(24)中任一项所述的PD-1融合蛋白；以及

药学上可接受载体。

(30)一种治疗有需要对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：

向对象(29)施用所述的药物组合物，从而治疗疾病或病症。

(31)根据(30)所述的方法，其中，所述对象患有癌症。

(32)根据(31)所述的方法，其中，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈部癌、血液学癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰脏癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。

(33)根据(30)-(32)中任一项所述的方法，其中，当所述药物组合物包含(14)-(24)中任一项所述的PD-1融合蛋白时，观察到抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应降低，或未观察到抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应。

(34)根据(30)-(33)中任一项所述的方法，其中，当所述药物组合物包含(14)-(24)中任一项所述的PD-1融合蛋白时，观察到肝毒性下降，或未观察到肝毒性。

(35)一种程序性细胞死亡1(PD-1)多肽变体，包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的残基处的突变。

(36)根据(35)所述的PD-1多肽变体，其中，所述变体包含D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、Q99、L122、A125、A132和R139处的突变。

(37)根据(35)所述的PD-1多肽变体，其中，所述变体包含D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139处的突变。

(38)根据(35)-(37)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述突变为D26E、P34A、V43L、T45A、T59A、V64H、L65V、N66V、Y68H、M70E、N74G、K78T、C93H、Q99R、R114Q、L122Y、A125V、A132I或R139G。

(39)根据(35)-(38)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:11具有97％或更高序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的残基处的突变。

(40)根据(35)-(39)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有98％或更高序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的残基处的突变。

(41)根据(35)-(40)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，与野生型PD-1多肽相比，所述多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力增强。

(42)根据(35)-(41)中任一项所述的PD-1多肽变体，其中，所述多肽变体对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1×10^-8～1×10^-10M。

(43)一种PD-1Fc融合蛋白，包含：

免疫球蛋白Fc区；以及

(35)-(42)中任一项所述的PD-1多肽变体，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端。

(44)根据(43)所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，免疫球蛋白Fc区包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

(45)根据(43)或(44)所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，与野生型PD-1多肽相比，所述融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力增强。

(46)根据(43)-(45)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，所述融合蛋白对PD-L1分子的结合亲和力(K_D)约为1×10^-8～1×10^-10M。

(47)根据(43)-(46)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，所述PD-1多肽变体通过肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端。

(48)根据(43)-(47)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，所述肽连接子序列选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21组成的组中。

(49)根据(43)-(48)中任一项所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，存在PD-1多肽变体的一个以上拷贝，其中，所述拷贝可以相同或不同，并通过肽连接子序列连接。

(50)根据(49)所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，存在PD-1多肽变体的两个拷贝。

(51)根据(49)或(50)所述的PD-1Fc融合蛋白，其中，所述肽连接子序列选自由SEQID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的一组中选择。

(52)一种核酸，包含：

编码(35)-(51)中任一项所述的PD-1多肽变体的序列。

(53)根据(52)所述的核酸，进一步包含：

编码免疫球蛋白Fc区的序列。

(54)一种表达载体，其包含(52)或(53)所述的核酸。

(55)根据(54)所述的载体，其中，所述载体是病毒载体。

(56)一种药物组合物，包含：

(35)-(42)中任一项所述的PD-1多肽变体或(43)-(51)中任一项所述的PD-1融合蛋白；以及

药学上可接受载体。

(57)一种治疗有需要对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：

向对象(56)施用所述的药物组合物，从而治疗疾病或病症。

(58)根据(57)所述的方法，其中，所述对象患有癌症。

(59)根据(58)所述的方法，其中，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈部癌、血液学癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰脏癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。

(60)根据(57)-(59)中任一项所述的方法，其中，当所述药物组合物包含(43)-(51)中任一项所述的PD-1融合蛋白时，观察到抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应降低，或未观察到抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应。

(61)根据(57)-(60)中任一项所述的方法，其中，当所述药物组合物包含(43)-(51)中任一项所述的PD-1融合蛋白时，观察到肝毒性下降，或未观察到肝毒性。

(62)一种双特异性抗体，包含：

免疫球蛋白Fc区；

一PD-1多肽变体，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的N末端，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列；以及

抗4-1BB抗体的scFv，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的C末端，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含与包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列(通过肽键或者肽连接子序列连接)具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

(63)根据(62)所述的双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白Fc区包含与SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:16具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

(64)根据(62)或(63)所述的双特异性抗体，其中，所述PD-1多肽变体通过肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的N末端。

(65)根据(62)-(64)中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述抗4-1BB的scFv通过肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的C末端。

(66)根据(62)-(65)中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述肽连接子序列选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21组成的组中。

(67)根据(62)-(66)中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23至少70％相同(例如至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。

(68)根据(62)-(67)中任一项所述的双特异性抗体，其中，与野生型PD-1多肽相比，所述双特异性抗体对PD-L1分子的结合亲和力增强，对4-1BB的结合亲和力具有特异性。

(69)一种药物组合物，包含：

(62)-(68)中任一项所述的双特异性抗体；以及

药学上可接受载体。

(70)一种治疗有需要对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：

向对象(69)施用所述的药物组合物，从而治疗疾病或病症。

(71)根据(70)所述的方法，其中，所述对象患有癌症。

(72)根据(71)所述的方法，其中，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈部癌、血液学癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰脏癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。

(73)根据(70)-(72)中任一项所述的方法，其中，观察到抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应降低，或未观察到抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应。

(74)根据(70)-(73)中任一项所述的方法，其中，观察到肝毒性下降，或未观察到肝毒性。

(75)一种双特异性抗体，包含：

免疫球蛋白Fc区；

PD-1多肽变体，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的N末端，其中，所述PD-1多肽变体包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高)序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的残基处的突变；以及

抗4-1BB抗体的scFv(通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的C末端)，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含与包含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列(通过肽键或者肽连接子序列连接)具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

(76)根据(75)所述的双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白Fc区包含与SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:16具有95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)序列一致性的氨基酸序列。

(77)根据(75)或(76)所述的双特异性抗体，其中，所述PD-1多肽变体通过肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的N末端。

(78)根据(75)-(77)中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述抗4-1BB的scFv通过肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的C末端。

(79)根据(75)-(78)中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述肽连接子序列选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21组成的组中。

(80)根据(75)-(79)中任一项所述的双特异性抗体，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23或与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23至少70％相同(例如至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。

(81)根据(75)-(80)中任一项所述的双特异性抗体，其中，与野生型PD-1多肽相比，所述双特异性抗体对PD-L1分子的结合亲和力增强，对4-1BB的结合亲和力具有特异性。

(82)一种药物组合物，包含：

(75)-(81)中任一项所述的双特异性抗体；以及

药学上可接受载体。

(83)一种治疗有需要对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：

向对象(82)施用所述的药物组合物，从而治疗疾病或病症。

(84)根据(83)所述的方法，其中，所述对象患有癌症。

(85)根据(84)所述的方法，其中，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈部癌、血液学癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰脏癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。

(86)根据(83)-(85)中任一项所述的方法，其中，观察到抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应降低，或未观察到抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)效应。

(87)根据(83)-(86)中任一项所述的方法，其中，观察到肝毒性下降，或未观察到肝毒性。

实施例

本公开将在以下实施例中进一步说明，但不会限制权利要求书中所述的本公开范围。

实施例1-PD-1的变体

使用PD1-G₄S连接子-Fc_pcDNA3.3质粒，生产包含PD-1多肽变体的PD-1Fc融合蛋白。人PD-1蛋白的拓扑结构如表1所示。人PD-1和PD-1多肽变体的序列如图1和图2所示。此外，表2中列出了每个PD-1多肽变体的突变，其中，氨基酸残基数与图1(SEQ ID NO:11)所示的全长人PD-1野生型序列相关。PD-1多肽变体的设计旨在包括图1(SEQ ID NO:11)所示的全长人PD-1野生型序列的胞外结构域(24-170)和部分跨膜结构域(171-172)。具体而言，使用动物细胞表达载体pcDNA3.3生产PD-1Fc融合蛋白，其中，限制酶EcoRI和BamHI在限制酶位点处插入。信号肽采用人PD-1信号肽(seq ID：Q15116，1-23)，Fc区采用207aa-230aaIMGT等位基因IGHG1*03，231aa-457aa IMGT等位基因IGHG2*01。编码PD-1Fc融合蛋白的DNA构建体如图3所示。

表1.

特征键	位置	描述
			拓扑结构域	24-170	细胞外
跨膜	171-191	螺旋
			拓扑结构域	192-288	细胞质

表2.

实施例2-分析和表征PD-1多肽变体

PD-1多肽变体插入到质粒中，并用于使用Expi293表达系统(Invitrogen)生产PD-1Fc融合蛋白。然后，使用AktaPure(GE healthcare)和FibroPrismA柱(GE healthcare，产品目录号17-0618-01)进行多肽变体的纯化处理。将纯化的多肽变体通过脱盐柱(GEhealthcare，产品目录号17-1408-01)，并使用Multiskan GO(Thermo)测定了蛋白浓度。

结果如表3所示。

表3.

实施例3-采用SDS-PAGE分析PD-1多肽变体

将PD-1多肽变体加到LDS样品缓冲液(Invitrogen，产品目录号B0007)中，其中，将样品还原剂(Invitrogen，产品目录号B0004)加到还原态组中，并在70℃下孵育10分钟。将SDS运行缓冲液(Bio-rad，产品目录号1610732)加到制备的样品中，并使用Mini-PROTEINTGX Stain-Free Gel(Bio-rad，产品目录号456-8096)运行样品30分钟。使用Chemidoc(Bio-rad)进行结果分析(图4)。

实施例4-分析对PD-L1分子的亲和力

利用表面等离子体共振(SPR)，分析PD-1多肽变体对PD-L1分子的亲和力。将PD-1多肽变体稀释至浓度2μg/mL后固定在CM5芯片(GE Healthcare，产品目录号BR-1005-30)上。以100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM的浓度注射PD-L1分子(Sino，产品目录号10084-H08H)，缔合时间为150秒，解离时间为240秒。使用Biacore T200(GE healthcare)测量和分析每个PD-1多肽变体的亲和力。结果表明，PD-1多肽变体euPD-1对PD-L1具有最高的结合亲和力(表4)。

表4.对PD-L1的亲和力

PD-1种类	ka(1/Ms)	kd(1/s)	K_D(M)
				PD-1	2.373E+5	0.01018	4289E-8
PD-1.m7	1.964E+6	0.002161	1.100E-9
				PD-1.m8	1.757E+6	0.001822	1.037E-9
euPD-1	1.822E+6	0.001301	7.140E-10

实施例5-尺寸排阻色谱法

利用HPLC(美国安捷伦科技公司，1260infinity II液相色谱系统)和尺寸排阻色谱柱(Tosoh，TSKgel G3000 SWXL，7.8×300mm，件号0008541，色谱柱号004E04320E)进行PD-1多肽变体分析。对照组采用凝胶过滤标层析准品(BIO-RAD，产品目录号151-1901)(图5A-图5E)。

实施例6-PD-1融合蛋白细胞结合测定

使用PD-L1高表达细胞系MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)和PD-L1低表达细胞系MCF-7(人乳腺癌细胞)细胞。图6示出每个细胞系中的PD-L1表达水平。根据图6可以确认，PD-L1在MDA-MB-231中高表达，在MCF7中则不表达。

1.5×10⁵个细胞在4℃下通过抗体处理孵育20分钟。将euPD-1Fc、PD-1Fc和Tecentriq(Genetech，阿替利珠单抗，抗PD-L1抗体)的处理浓度从877.19nM连续稀释2倍，共产生12点。用FACS洗涤缓冲液(DPBS中0.5％ FBS+0.1％ NaN₃)洗涤一次后，将抗hFC-AF488第二抗体(Jackson ImmunoResearch)以1μl/孔处理20分钟。在洗涤两次后，进行FACS分析。

根据FACS分析结果确认，第二抗体几乎没有提供本底信号。在图7A中，在实验浓度范围内，PD-1Fc未与PD-L1阳性细胞结合，而euPD-1Fc和Tecentriq与PD-L1阳性细胞以剂量依赖的方式结合。作为FACS分析的结果，在图7B中，三种抗体均未与PD-L1阴性细胞结合。

实施例7-PD-1融合蛋白抗原结合测定

进行抗原结合测定，以确认euPD-1Fc是否与抗原PD-L1或PD-L2结合。

如图8A和图8C所示，实施所述测定方法。简言之，在4℃下将PD-L1抗原或PD-L2抗原以1μg/ml的浓度包被在96孔免疫板中放置过夜后，用150μl l×测定缓冲液(Biolegend)处理1小时，以阻断非特异性结合。用100μL缓冲液分别处理euPD-1Fc、PD-1Fc和Tecentriq，并孵育2小时。将抗原PD-L1包被板上的处理浓度从30μg/mL连续稀释3倍，共产生15个点。将抗原PD-L2包被板上的处理浓度从100μg/mL连续稀释3倍，共产生12个点。用浓度为0.4μg/mL的100μl缓冲液处理抗hFc-HRP(Biolegend)。孵育1小时后，用TMB显色，3分钟后，用硫酸停止反应。除TMB处理后过程以外，在所有过程中使用洗涤缓冲液进行3次洗涤。除抗原包被过程以外，所有过程均在室温下进行。作为实验的结果，如图8B所示，确认euPD-1Fc和Tecentriq与抗原PD-L1结合，且呈剂量依赖性。在图8D中，仅PD-1Fc与抗原PD-L2结合，且呈剂量依赖性，而euPD-1Fc和Tecentriq未结合。

实施例8-PD-1融合蛋白阻断生物测定

进行阻断生物测定，以验证PD-1和PD-L1(Bicytogen)的结合抑制效应。

在PD-1和PD-L1的结合受到抑制的条件下，所使用的生物测定产品(Promega，J1250)表达荧光素酶。生物测定和荧光素酶检测遵循Promega公司的方案。靶细胞以4×10⁴个细胞/100μL/孔接种在96孔白色板中。在37℃二氧化碳培养箱中过夜孵育后，处理抗体和效应细胞。抗体采用euPD-1Fc、PD-1Fc、Tecentriq和Keytruda(Merck，帕博利珠单抗，抗PD-1抗体)。将处理浓度从217.39nM连续稀释2.5倍，共产生10个点。在37℃二氧化碳培养箱中孵育6小时后处理荧光素，并进行荧光素酶检测。作为荧光素酶检测的结果，如图9A所示，euPD-1Fc、Tecentriq和Keytruda均表现出抑制作用，且呈剂量依赖性，如图9B所示，euPD-1Fc表现出的抑制作用比PD-1Fc高2.4至4.9倍。

实施例9-PD-1融合蛋白体内疗效研究

为了验证euPD-1Fc的疗效，进行了肿瘤生长抑制体内研究。使用hPD-1敲入的雌性C57BL/6小鼠进行实验。

如图10所示，以表达人PD-L1的MC38细胞为肿瘤细胞，对每个个体皮下给予8×10⁶个肿瘤细胞。给予一周后，测量肿瘤大小并分配给药组，使平均值与标准差相似(即约100mm³)。静脉注射euPD-1Fc、PD-1Fc和Tecentriq三种抗体。阴性对照采用赋形剂DPBS(Gibco)。基于euPD-1Fc，将抗体剂量设定在5mg/kg和2mg/kg，同时，考虑到分子量，PD-1Fc和tecentriq 5mg/kg采用8.77μM浓度。给药剂量为100μl，每隔3天给药5次。每隔3天或4天测量一次肿瘤大小，直至最后一次给药后2天测量肿瘤大小。此外，在实验结束当天采血以确认毒性，并使用生化分析仪检验ALT(丙氨酸转氨酶)、AST(天冬氨酸转氨酶)、BUN(血尿素氮)和T-BIL(总胆红素)的浓度。

作为肿瘤大小观察的结果，如图11A和图11B所示，与阴性对照的给药相比，euPD-1Fc(8.77μM)和tecentriq(8.77μM)均抑制了肿瘤生长；PD-1Fc(8.77μM)表现出与阴性对照相似的生长。此外，如图11C和图11D所示，与低浓度(2mg/kg)给药组的阴性对照给药相比，euPD-1Fc使肿瘤缩小了33.9％，在高浓度(5mg/kg)给药组中观察到，肿瘤缩小了66.1％，表现出剂量依赖性抑制效应。

此外，还进行了肝毒性指数分析，如图12所示。如图12的肝毒性指数分析所示，在euPD-1Fc给药组中，四个指标均在正常范围内(ALT：17-77U/L(图12A和图12E)、AST：54-298U/L(图12B和图12F)、BUN：8-33mg/dL(图12C和图12G)、T-BIL：8-33mg/dL(图12D和图12H))，在实验条件下未确认任何肝毒性。

因此，研究证实，包含euPD-1和IgG1变体的本发明的融合蛋白和双特异性抗体未表现出肝毒性。此外，本发明的抗体缺少ADCC和CDC效应。

实施例10-PD-1融合蛋白euPD-1BsAb的设计、生产和表征

如图13所示，使用euPD-1和抗4-1BB抗体，设计Fc融合BsAb。使用(G₄S)₂连接子连接euPD-1和Fc，用于BsAb的Fc区采用经IgG1修饰的Fc区(L234A，L235A，K322A，D356E，L358M)。

还设计了以连接两个euPD-l的形式存在的BsAb；使用(G₄S)₃连接子连接两个euPD-l，并将所述(G₄S)₃连接子命名为euPD-1.2。

在C末端侧，抗4-1BB抗体以scFv的形式结合Fc；此时，抗4-1BB抗体与(G₄S)₂连接子连接，并且抗4-1BB抗体采用两种类型的scFv，即VH-218连接子-VL(HLC 218)和VL-218连接子-VH(LHC 218)。

产生表5或图13中的构建体。同时还提供了上述序列。

表5：

/>

瞬时转染到Expi293F细胞中，以产生euPD-1BsAb(双特异性抗体)；通过蛋白A柱进行纯化处理。

作为SDS-PAGE分析的结果，在非还原条件下，观察到具有一个euPD-1的euPD-1x94kvt HLC 218和euPD-1x 94kvt LHC 218约为160kDa；在还原条件下，观察到euPD-1x94kvt LHC 218约为80kDa。观察到euPD-1双重形式euPD-1.2x 94kvt HLC 218和euPD-1.2x94kvt LHC 218约为250kDa；在还原条件下，观察到euPD-1双重形式euPD-1.2x 94kvt HLC218和euPD-1.2x 94kvt LHC 218约为125kDa。作为尺寸排阻色谱分析的结果，观察到纯度为90％或更高的单峰(见图15)。

进行与实施例4中所述分析类似的表面等离子体共振(SPR)分析。具体而言，将25μg/ml抗人Fc抗体固定在CM5芯片上。将25μg/ml抗人Fc抗体固定在CM5芯片上。然后，使4种类型的euPD-1BsAb以10μg/ml和10μl/min的流速流动60秒后捕获，并使用100nM、50nM、25nM、12.5nM、3.25nM、3.125nM、0nM的PD-L1抗原进行KD分析。图16示出euPD-1BsAb构建体的SPR结果。

实施例11-用euPD-1BsAb构建体进行抗原结合测定

为了检验euPD-1BsAbs是否与抗原PD-L1结合，进行抗原结合测定。

如图17A所示，实施所述测定方法。简言之，在4℃下将PD-L1抗原以1μg/ml的浓度包被在96孔免疫板中放置过夜后，用150μl l×测定缓冲液(Biolegend)处理1小时，以阻断非特异性结合。euPD-1BsAb用100μL缓冲液处理后孵育2小时。将处理浓度从10μg/mL连续稀释10倍，共产生3个点。将浓度1μg/ml的100μl生物素化4-1BB处理1小时。使用方案中所示浓度的100μl缓冲液，处理亲和素-HRP(Bioglend)30分钟。用TMB显色后，3分钟后用硫酸停止反应。除TMB处理后的过程以外，所有过程均使用洗涤缓冲液进行3次洗涤；除PD-L1包被过程以外，所有过程均在室温下进行。

作为实验的结果，如图17B所示，确认euPD-1BsAb与抗原PD-L1结合，且呈剂量依赖性。

实施例12-4-1BB/PD-1组合生物测定

为了验证抑制PD-1和PD-L1结合的作用以及4-1BB活性的作用，进行4-1BB/PD-1组合生物测定。

在本次实验中，生物测定产品(Promega，CS1978I10)采用了一种测定系统，当4-1BB由4-1BB抗体刺激激活时，同时当PD-1/PD-L1相互作用抑制时，所述测定系统可以表达荧光素酶。生物测定和荧光素酶检测遵循Promega公司的方案。表达PD-L1的MDA-MB-231细胞以4×10⁴个细胞/100μL/孔接种在96孔白色板中。在37℃二氧化碳培养箱中过夜孵育后，处理抗体和PD1+4-1BB效应细胞。抗体采用euPD-1x 94kvt HLC 218和euPD-1x 94kvt LHC218。将处理浓度从60ng/ml连续稀释4倍，共产生4个点。在37℃二氧化碳培养箱中孵育6小时后处理荧光素，并进行荧光素酶检测。

作为荧光素酶检测的结果，如图18所示，euPD-1x 94kvt HLC 218和euPD-1x94kvt LHC 218激活4-1BB，同时抑制PD-1/PD-L1，且呈剂量依赖性。

序列表

<110> 优特力克斯有限公司

<120> 程序性细胞死亡1多肽变体

<130> 538173WO

<150> 63/075,641

<151> 2020-09-08

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 447

<212> DNA

<213> 人类

<400> 1

tttttggatt ctccagaccg gccttggaac ccgcccacgt ttagccctgc tcttttggta 60

gttacagagg gggacaacgc cacattcacc tgcagcttct ctaatacgtc cgagagcttt 120

gtactgaatt ggtatagaat gagtccatct aatcagacag ataaattggc tgccttccct 180

gaagacagga gtcagccggg tcaggactgc agattccgcg ttacgcaact cccaaatggt 240

cgagactttc atatgtcagt tgttcgggcg aggagaaatg atagcggtac ttacctgtgc 300

ggcgcgatat ctctcgcacc aaaagcacag attaaagagt ctctccgggc tgaactccgc 360

gtgacagaaa ggcgagccga ggtaccaacg gcgcacccat caccgagtcc tagacctgcg 420

ggccaattcc agactttggt tgtcgga 447

<210> 2

<211> 149

<212> PRT

<213> 人类

<400> 2

Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser

35 40 45

Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys

100 105 110

Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

115 120 125

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Val Val Gly

145

<210> 3

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 polypeptide variant PD-1.m7

<400> 3

tttctggagt cacccgaccg cccttggaac gcacctacct tttccccggc cctcttgctg 60

gtcgcagaag gagataacgc cactttcaca tgcagcttta gtaacgcctc cgaatctttt 120

catgtagttt ggcacagaga aagcccctcc ggacaaaccg acaccttggc tgcgtttccc 180

gaagaccgaa gtcaaccagg gcaggactgc cggttccgcg taacacggct gccaaacggt 240

agggacttcc acatgtcagt ggttcgagca cgccggaacg acagcgggac gtatgtctgc 300

ggagtcatta gccttgcccc gaagatacag attaaagaaa gtcttggggc agaacttcga 360

gtcaccgagc gcagggccga ggtcccaacg gcacatccca gtcctagtcc acggcccgcc 420

ggtcaatttc agacccttgt agtgggc 447

<210> 4

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 polypeptide variant PD-1.m7

<400> 4

Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Val Ala Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe His Val Val Trp His Arg Glu Ser

35 40 45

Pro Ser Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ile Gln Ile Lys

100 105 110

Glu Ser Leu Gly Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

115 120 125

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Val Val Gly

145

<210> 5

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 polypeptide variant PD-1.m8

<400> 5

tttttggaaa gtcccgatcg gccttggaac gctcccacat ttagcccggc cctgcttttg 60

gttgctgaag gcgataacgc cacttttaca tgcagtttca gcaacgcctc tgaaagtttc 120

catgtagtgt ggcaccgcga gtctccaagt gggcaaacag atacccttgc agctttcccg 180

gaagatagga gtcagccagg gcaggatcac cggtttagag tcactcgcct ccccaatggt 240

agagattttc acatgagcgt cgttcgagct cagagaaacg atagtggcac atacgtttgt 300

ggcgtaatat ctctcgcccc gaagatccag attaaagagt cccttggcgc ggagctgaga 360

gtcaccgaga ggcgagctga ggtgcctaca gctcatccta gcccgagccc aaggccagct 420

ggacagttcc aaactttggt tgtaggc 447

<210> 6

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 polypeptide variant PD-1.m8

<400> 6

Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Val Ala Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe His Val Val Trp His Arg Glu Ser

35 40 45

Pro Ser Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp His Arg Phe Arg Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Gln Arg Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ile Gln Ile Lys

100 105 110

Glu Ser Leu Gly Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

115 120 125

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Val Val Gly

145

<210> 7

<211> 447

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 polypeptide variant euPD-1

<400> 7

tttctcgaat caccggacag accctggaat gcgcccacat tctcaccagc acttttgctg 60

gtagcagagg gcgataatgc tacattcacg tgttccttca gtaatgcaag cgagtcattt 120

catgtggttt ggcatcgaga gtcacctagt gggcagactg atacacttgc cgcattcccg 180

gaagatcgct cccagccagg tcaggatcac cggttcaggg taacccgact gccgaatggg 240

cgcgatttcc atatgagcgt tgtccgggcg caacggaacg atagtggaac atacgtgtgt 300

ggcgtaatat ccctcgctcc caaaatacaa ataaaggagt ctctgagagc agagctgaga 360

gtgacagaac gacgggcgga agttcccacg gctcatccgt caccaagtcc gcgccccgca 420

ggccaatttc aaacgctcgt cgtaggc 447

<210> 8

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 polypeptide variant euPD-1

<400> 8

Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Val Ala Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe His Val Val Trp His Arg Glu Ser

35 40 45

Pro Ser Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp His Arg Phe Arg Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Gln Arg Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ile Gln Ile Lys

100 105 110

Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

115 120 125

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Val Val Gly

145

<210> 9

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc (207-230 IMGT allele IGHG1*03, 231- 457 IMGT allele IGHG2*01)

<400> 9

agcaacacta aagtcgacaa gcgagtagaa ccgaaatcat gcgacaaaac acatacgtgc 60

cctccctgcc cagcaccacc tgtcgcgggc ccctctgttt tcctgtttcc acccaagcca 120

aaggacacat tgatgatttc ccggactcct gaagtcacct gcgtggtagt agatgtatca 180

catgaagatc cagaagtcca gttcaactgg tatgtggacg gagtagaggt acataatgcc 240

aagaccaaac cacgggaaga gcagttcaac agtactttcc gggtagttag cgttttgact 300

gtcgtacacc aagactggct taatggaaaa gaatacaagt gtaaggtaag caacaagggc 360

ctgccggctc cgatagagaa aaccattagc aagacaaagg gccaaccacg cgaaccccag 420

gtatataccc tcccaccgtc ccgcgaggag atgactaaga atcaagtttc tctcacgtgc 480

ttggtaaagg gcttctatcc gagcgatata gccgtggagt gggagtctaa tggtcagccc 540

gaaaacaatt acaaaactac gcctcctatg ctggacagtg atgggagctt ctttctttac 600

agtaagctta ccgtggacaa gtctcggtgg caacaaggaa atgtttttag ttgttctgta 660

atgcatgaag cacttcataa ccattacacc cagaaaagtc tgagcttgtc cccgggaaaa 720

<210> 10

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc (207-230 IMGT allele IGHG1*03, 231- 457 IMGT allele IGHG2*01)

<400> 10

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

1 5 10 15

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

20 25 30

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

35 40 45

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

50 55 60

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

65 70 75 80

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val

85 90 95

Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

100 105 110

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

115 120 125

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

130 135 140

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

145 150 155 160

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

165 170 175

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp

180 185 190

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

195 200 205

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

210 215 220

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230 235 240

<210> 11

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro

225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 12

<211> 641

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> euPD-1 x 94kvt HLC 218

<400> 12

Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Val Ala Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe His Val Val Trp His Arg Glu Ser

35 40 45

Pro Ser Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp His Arg Phe Arg Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Gln Arg Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Thr Tyr Val Cys Gly Val Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ile Gln Ile Lys

100 105 110

Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

115 120 125

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

165 170 175

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

180 185 190

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

195 200 205

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

210 215 220

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

225 230 235 240

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

245 250 255

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

260 265 270

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

275 280 285

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

290 295 300

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

305 310 315 320

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

325 330 335

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

340 345 350

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

355 360 365

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

370 375 380

Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln

385 390 395 400

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

405 410 415

Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His

420 425 430

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile

435 440 445

Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg

450 455 460

Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

465 470 475 480

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser

485 490 495

Phe Lys Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

500 505 510

Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly

515 520 525

Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe

530 535 540

Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

545 550 555 560

Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln

565 570 575

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile

580 585 590

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr

595 600 605

Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asp

610 615 620

Gly His Ser Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile

625 630 635 640

Lys

<210> 13

<211> 805

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> euPD-1.2 x 94kvt HLC 218

<400> 13

Phe Leu Glu Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Ala Pro Thr Phe Ser Pro

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Val Ala Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

20 25 30

Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe His Val Val Trp His Arg Glu Ser

35 40 45

Pro Ser Gly Gln Thr Asp Thr Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

50 55 60

Gln Pro Gly Gln Asp His Arg Phe Arg Val Thr Arg Leu Pro Asn Gly

65 70 75 80

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705 710 715 720

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805

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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165 170 175

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

180 185 190

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<213> 人工序列

<220>

<223> Fc

<400> 16

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 94kvt VH

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100 105 110

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<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 94kvt VL

<400> 18

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<400> 19

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> (G4S)3

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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<210> 21

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 218

<400> 21

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

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<210> 22

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 94kvt HLC 218

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

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20 25 30

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Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys

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225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys

<210> 23

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 94kvt LHC 218

<400> 23

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asp Gly His Ser Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln

115 120 125

Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys

130 135 140

Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile

165 170 175

Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Arg

180 185 190

Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu

195 200 205

Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser

210 215 220

Phe Lys Thr Ala Arg Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

Claims

1.一种程序性细胞死亡1多肽变体，包含与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列，其中，所述程序性细胞死亡1多肽变体包含：

与程序性细胞死亡1配体特异性结合的细胞外结构域；以及

跨膜结构域或其片段。

2.根据权利要求1所述的程序性细胞死亡1多肽变体，其中，所述程序性细胞死亡1多肽变体包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的程序性细胞死亡1多肽变体，其中，所述跨膜结构域包含至少两个氨基酸残基。

4.根据权利要求1所述的程序性细胞死亡1多肽变体，其中，与野生型程序性细胞死亡1多肽相比，所述多肽变体对程序性细胞死亡1配体分子的结合亲和力增强。

5.根据权利要求4所述的程序性细胞死亡1多肽变体，其中，所述多肽变体对程序性细胞死亡1配体分子的结合亲和力(K_D)约为1×10^-8～1×10^-10M。

6.一种程序性细胞死亡1多肽变体，包含与SEQ ID NO:11的残基24-172具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列，其中，所述变体具有至少位于一个选自由D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139组成的组中的残基处的突变。

7.根据权利要求6所述的程序性细胞死亡1多肽变体，其中，所述变体包含位于D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、Q99、L122、A125、A132和R139处的突变。

8.根据权利要求6所述的程序性细胞死亡1多肽变体，其中，所述变体包含位于D26、P34、V43、T45、T59、V64、L65、N66、Y68、M70、N74、K78、C93、Q99、R114、L122、A125、A132和R139处的突变。

9.根据权利要求6所述的程序性细胞死亡1多肽变体，其中，所述突变为D26E、P34A、V43L、T45A、T59A、V64H、L65V、N66V、Y68H、M70E、N74G、K78T、C93H、Q99R、R114Q、L122Y、A125V、A132I或R139G。

10.一种程序性细胞死亡1Fc融合蛋白，包含：

免疫球蛋白Fc区；以及

权利要求1所述的程序性细胞死亡1多肽变体，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端。

11.根据权利要求10所述的程序性细胞死亡1Fc融合蛋白，其中，所述免疫球蛋白Fc区包含与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列。

12.根据权利要求10所述的程序性细胞死亡1Fc融合蛋白，其中，存在程序性细胞死亡1多肽变体的两个拷贝，两个拷贝可以相同或不同，并通过肽连接子序列连接。

13.根据权利要求10所述的程序性细胞死亡1Fc融合蛋白，其中，与野生型程序性细胞死亡1多肽相比，所述融合蛋白对程序性细胞死亡1配体分子的结合亲和力增强。

14.根据权利要求13所述的程序性细胞死亡1Fc融合蛋白，其中，所述融合蛋白对程序性细胞死亡1配体分子的结合亲和力(K_D)约为1×10^-8～1×10^-10M。

15.一种程序性细胞死亡1Fc融合蛋白，包含：

免疫球蛋白Fc区；以及

权利要求6所述的程序性细胞死亡1多肽变体，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端。

16.根据权利要求15所述的程序性细胞死亡1Fc融合蛋白，其中，存在程序性细胞死亡1多肽变体的两个拷贝，两个拷贝可以相同或不同，并通过肽连接子序列连接。

17.一种核酸，包含：

编码程序性细胞死亡1多肽变体的序列，其中，所述多肽变体包含与SEQ ID NO:3、SEQID NO:5或SEQ ID NO:7具有95％或更高序列一致性的序列。

18.根据权利要求17所述的核酸，进一步包含：

编码免疫球蛋白Fc区的序列，其中，所述编码免疫球蛋白Fc区的序列包含SEQ ID NO:9。

19.一种表达载体，包含权利要求17所述的核酸。

20.根据权利要求19所述的载体，其中，所述载体是病毒载体。

21.一种药物组合物，包含：

权利要求1所述的程序性细胞死亡1多肽变体，或一种融合蛋白，所述融合蛋白包含免疫球蛋白Fc区和所述程序性细胞死亡1多肽变体，所述程序性细胞死亡1多肽变体通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端；以及

药学上可接受载体。

22.一种治疗有需要对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：

向对象施用权利要求21所述的药物组合物，从而治疗疾病或病症。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述对象患有癌症。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈部癌、血液学癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰脏癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。

25.根据权利要求22所述的方法，其中，当所述药物组合物包含所述融合蛋白时，观察到抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性效应降低，或未观察到抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性效应。

26.根据权利要求22所述的方法，其中，当所述药物组合物包含所述融合蛋白时，观察到肝毒性下降，或未观察到肝毒性。

27.一种药物组合物，包含：

权利要求6所述的程序性细胞死亡1多肽变体，或一种融合蛋白，所述融合蛋白包含免疫球蛋白Fc区和所述程序性细胞死亡1多肽变体，所述程序性细胞死亡1多肽变体通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的羧基末端；以及

药学上可接受载体。

28.一种治疗有需要对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：

向对象施用权利要求27所述的药物组合物，从而治疗疾病或病症。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述对象患有癌症。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈部癌、血液学癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰脏癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。

31.根据权利要求28所述的方法，其中，当所述药物组合物包含所述融合蛋白时，观察到抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性效应降低，或未观察到抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性效应。

32.根据权利要求28所述的方法，其中，当所述药物组合物包含所述融合蛋白时，观察到肝毒性下降，或未观察到肝毒性。

33.一种双特异性抗体，包含：

免疫球蛋白Fc区；

权利要求1所述的程序性细胞死亡1多肽变体，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的N末端；以及

抗4-1BB抗体的scFv，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的C末端，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含与包含通过肽键或者肽连接子序列连接的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列。

34.根据权利要求33所述的双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白Fc区包含与SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:16具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列。

35.根据权利要求33所述的双特异性抗体，其中，所述程序性细胞死亡1多肽或所述scFv或两者均通过选自由SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:21组成的组中的肽连接子连接至免疫球蛋白Fc区。

36.根据权利要求33所述的双特异性抗体，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含与SEQID NO:22或SEQ ID NO:23至少90％相同的序列。

37.根据权利要求33所述的双特异性抗体，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:23。

38.根据权利要求33所述的双特异性抗体，其中，与野生型程序性细胞死亡1多肽相比，所述双特异性抗体对程序性细胞死亡1配体分子的结合亲和力增强，对4-1BB的结合亲和力具有特异性。

39.一种药物组合物，包含：

权利要求33所述的双特异性抗体；以及

药学上可接受载体。

40.一种治疗有需要对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：

向对象施用权利要求39所述的药物组合物，从而治疗疾病或病症。

41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述对象患有癌症。

42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈部癌、血液学癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰脏癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。

43.根据权利要求40所述的方法，其中，当所述药物组合物包含所述融合蛋白时，观察到抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性效应降低，或未观察到抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性效应。

44.根据权利要求40所述的方法，其中，当所述药物组合物包含所述融合蛋白时，观察到肝毒性下降，或未观察到肝毒性。

45.一种双特异性抗体，包含：

免疫球蛋白Fc区；

权利要求6所述的程序性细胞死亡1多肽变体，通过肽键或肽连接子序列连接至免疫球蛋白Fc区的N末端；以及

46.根据权利要求45所述的双特异性抗体，其中，所述免疫球蛋白Fc区包含与SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:16具有95％或更高序列一致性的氨基酸序列。

47.根据权利要求45所述的双特异性抗体，其中，所述程序性细胞死亡1多肽或所述scFv或两者均通过选自由SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:21组成的组中的肽连接子连接至免疫球蛋白Fc区。

48.根据权利要求45所述的双特异性抗体，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含与SEQID NO:22或SEQ ID NO:23至少90％相同的序列。

49.根据权利要求45所述的双特异性抗体，其中，所述抗4-1BB抗体的scFv包含SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:23。

50.根据权利要求45所述的双特异性抗体，其中，与野生型程序性细胞死亡1多肽相比，所述双特异性抗体对程序性细胞死亡1配体分子的结合亲和力增强，对4-1BB的结合亲和力具有特异性。

51.一种药物组合物，包含：

权利要求45所述的双特异性抗体；以及

药学上可接受载体。

52.一种治疗有需要对象的疾病或病症的方法，所述方法包括：

向对象施用权利要求51所述的药物组合物，从而治疗疾病或病症。

53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述对象患有癌症。

54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述癌症选自膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、输卵管癌、胆囊癌、胃肠道癌、头颈部癌、血液学癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、原发性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、胰脏癌、肾细胞癌、胶质母细胞瘤和前列腺癌。

55.根据权利要求54所述的方法，其中，当所述药物组合物包含所述融合蛋白时，观察到抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性效应降低，或未观察到抗体依赖性细胞毒性和/或补体依赖性细胞毒性效应。

56.根据权利要求54所述的方法，其中，当所述药物组合物包含所述融合蛋白时，观察到肝毒性下降，或未观察到肝毒性。