KR20210030925A

KR20210030925A - 메소텔린 및 cd137 결합 분자

Info

Publication number: KR20210030925A
Application number: KR1020217000265A
Authority: KR
Inventors: 호세 무노즈-올라야; 미흐리반 투나; 레미 페르틴; 클레어 리더; 프란시스카 울러톤; 닐 브레위스
Original assignee: 에프-스타 델타 리미티드
Priority date: 2018-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2021-03-18
Also published as: JP2023178323A; GB201811450D0; BR112021000396A2; AR115769A1; JP2021524269A; CN112437776A; MX2021000397A; WO2020011976A1; SG11202011960XA; AU2019303081A1; EP3820894A1; CA3103173A1; JP7360441B2; TW202012448A; US20210309753A1; IL280007A

Abstract

본 발명은 메소텔린(MSLN) 및 CD137 모두에 결합하는 항체 분자에 관한 것이다. 항체 분자는 MSLN에 대한 CDR 기반 결합 부위, 및 항체 분자의 불변 도메인에 위치된 CD137 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 분자는, 예를 들어, 암의 치료에적용된다.

Description

메소텔린 및 CD137 결합 분자

본 발명은 메소텔린(MSLN) 및 CD137 모두에 결합하는 항체 분자에 관한 것이다. 항체 분자는 MSLN에 대한 CDR 기반 결합 부위, 및 항체 분자의 불변 도메인(domain)에 위치된 CD137 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 분자는, 예를 들어, 암 치료에 적용된다.

세포 신호 전달은 모든 유기체의 생명의 본질적인 부분이며, 일반적으로 가용성 또는 표면 발현 리간드와 상호 작용하는 세포 표면 수용체를 포함한다. 이 상호 작용은 수용체, 리간드 또는 둘 모두를 변화시킨다. 예를 들어, 리간드 결합은 수용체의 형태적 변화를 유도하여 그들이 함께 이량체 또는 올리고머로 클러스터링(clustering)되도록 할 수 있다. 이어서, 이 클러스터링 효과는 세포내 신호 전달 경로의 활성화를 초래한다. CD137과 같은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF)의 구성원을 포함하여 이러한 방식으로 활성화되는 수많은 수용체가 있다.

CD137(4-1BB; TNFRSF9)은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF)의 공 자극 분자이다. CD137은 활성화 후 CD8⁺ T 세포 상에서 상향 조절되는 것으로 널리 공지되어 있으며, 또한 활성화된 CD4⁺ 헬퍼 T 세포, B 세포, 조절 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포 및 수지상 세포(DC) 상에서 발현될 수 있다(Bartkowiak & Curran, 2015). T 세포 세포 독성을 향상시키는 데 있어서 CD137의 주요 기능적 역할은 1997년에 처음 기재되었으며(Shuford et al., 1997), 그 후 곧 항-CD137 mAb가 항암 치료제로서 제안되었다.

CD137은 CRD1-4로서 지칭되는 4개의 세포외 시스테인 풍부 도메인과 CD137 신호 전달을 담당하는 세포질 영역을 갖는 막 관통 단백질이다. CD137의 리간드는 CD137L이다. CD137/CD137L 복합체에 대한 결정 구조는 존재하지 않지만, CD137은 CD137L과 삼량체/삼량체 복합체를 형성할 것으로 예상된다(Won et al., 2010). CD137L의 참여는 수용체 삼량체 형성 및 다중 수용체 삼량체의 후속적 클러스터링을 초래하고, CD137 신호 전달 캐스케이드의 활성화로 이어진다. 이 신호 전달 캐스케이드는 활성화 유도 세포사에 대해 T 세포에 생존 신호를 제공하여(Hurtado et al., 1997) 효과적인 T 세포 면역 반응을 유지하고 면역학적 기억을 생성하는 데 중요한 역할을 한다(Bartkowiak & Curran, 2015).

백혈구 생물학에서 CD137의 역할은 일반적으로 종양 면역학에서 CD137의 역할 배후의 명확한 생물학적 근거로 충분히 이해된다. CD137은 활성화된 T 세포에 의해 발현되며 항원 특이적 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포를 동정하기 위한 마커로 사용되었다. 전형적으로, CD137의 발현은 CD4⁺ T 세포보다 CD8⁺ T 세포에서 더 높다(Wen et al., 2002). CD8⁺ T 세포의 경우, 인터페론 감마 및 인터류킨 2의 생산을 통한 증식, 생존 및 세포 독성 이펙터 기능은 CD137 가교결합에 기인한다. CD137 가교결합은 또한 기억 CD8⁺ T 세포의 분화 및 유지에 기여한다. CD4⁺ T 세포의 일부 서브세트에서, CD137 가교결합은 유사하게 증식 및 활성화를 유도하고 인터류킨 2와 같은 사이토카인의 방출을 초래한다(Makkouk et al., 2016).

종양 표적화 mAb를 통한 자연 살해(NK) 매개 항체 의존성 세포 세포 독성(ADCC)은 시험관내 및 생체내에서 작용성 항-CD137 모노클로날 항체를 통한 CD137 자극의 결과로 강화되는 것으로 입증되었다(Bartkowiak & Curran, 2015). NK 세포는 그들의 Fc 수용체를 통해 항체에 결합하며, 항체 아이소타입에 따라, 이는 NK 세포 활성화를 유도하여 세포 독성 과립 방출 및 표적 세포의 용해를 유도할 수 있다(Kohrt et al., 2012). 코르트(Kohrt) 및 동료들은 항-CD137 작용성 항체가 함께 투여될 때 ADCC를 향상시킴으로써 치료 항체 리툭시맙, 트라스투주맙 및 세툭시맙의 항종양 활성을 향상시켰음을 입증했다(Kohrt et al., 2014; Kohrt et al., 2011). 또한, 인간 NK 세포는 FcγR을 통해 세포 결합 항체를 만난 후 CD137의 발현을 상향 조절한다. 항-CD137 항체에 의한 이러한 NK 세포의 후속적 자극은 종양 세포에 대한 그들의 ADCC를 향상시키는 것으로 나타났다(Chester et al., 2015; Chester et al., 2016 ).

B 림프구는 또한 활성화시 CD137을 발현한다. CD137 리간드의 CD137에의 결합은 B 세포 증식, 생존 및 사이토카인 생산을 향상시킨다. CD137 발현은 또한 CD40이 그의 리간드 CD154(CD40 리간드)에 결합한 후 정상 및 악성 인간 B 세포에서 유도되어, CD137이 후속적으로 활성화되면 B 세포 생존율을 향상시킨다.

CD137은 또한 종양 침윤성 림프구(TIL)의 종양 반응성 서브세트에서 발현되는 것으로 입증되었다. CD137 단일 요법은 MC38, CT26 및 B 세포 림프종과 같은 여러 전임상 면역원성 종양 모델에서 효과적인 것으로 나타났다. CD137 참여와 화학 요법, 사이토카인 및 기타 체크포인트 조절제와 같은 다른 항암제와의 조합은 확립된 종양의 성장 감소를 향상시키는 것으로 입증되었다. 구체적으로, 항-CD137 항체와 항-CD20, 항-EGFR 및 항-HER-2 항체의 조합은 다양한 전임상 이종 이식 모델에서 종양 성장 감소에 시너지 효과를 초래하는 것으로 나타났다(Kohrt et al., 2014; Kohrt et al., 2012; Kohrt et al., 2011).

종양 표적화 모노클로날 항체 요법과 항-CD137 작용제 항체에 의한 치료를 결합하면 림프종(Kohrt et al., 2011), 두경부암, 결장직장암(Kohrt et al., 2014) 및 유방암(Kohrt et al., 2012)에 대한 전임상 모델에서 유망한 결과가 나타났다. 그러나, CD137 작용제 항체 치료와 관련된 용량 제한적인 고급 간 염증으로 인해 임상 개발이 느려졌다. 비-리간드 차단 인간 IgG4 아이소타입 항체(Chester et al., 2018)인 우렐루맙(BMS-663513)은 임상 시험에 진입한 최초 항-CD137 항체 였지만, 이들은 표적에서 상당한 용량 의존성 간 독성이 관찰된 후에 중단되었다(Chester et al., 2018). 보다 최근에는 우렐루맙 치료가 방사선 요법(NCT03431948) 또는 리툭시맙(NCT01775631), 세툭시맙(NCT02110082), 항-PD-1 항체 니볼루맙(NCT02253992, NCT02534506, NCT02845323), 및 니볼루맙과 항-LAG-3 항체 BMS986016(NCT02658981)의 조합과 같은 다른 치료 항체와 병용되는 우렐루맙의 임상 시험이 고형암 치료에서 재개되었다. 그러나, 우렐루맙 치료와 관련된 간 독성을 줄이기 위해, 이러한 시험에서 우렐루맙의 투여는 제한해야 했고, 효능 결과는 실망스러웠다(Chester et al., 2018).

진행성 암의 1상 임상 시험에서 0.03mg/kg에서 최대 10mg/kg까지 용량 범위에서 인간 IgG2 아이소타입 항체인 화이자(Pfizer)의 항-CD137 항체 유토밀루맙(PF-05082566)에 의한 용량 제한 독성(DLT)은 관찰되지 않았다(Chester et al. 2016; Segal et al., 2018). 그러나, 이 항체에의 전반적인 객관적 반응률은 고형 종양 환자에서 3.8%에 불과했으며, 이는 잠재적으로 유토밀루맙이 우렐루맙보다 약한 효력(potency)과 임상적 효능(efficacy)을 가지면서 더 유리한 안전성 프로파일을 갖고 있음을 나타낸다(Chester et al., 2018; Segal et al., 2018). 유토밀루맙은 방사선 요법(NCT03217747) 또는 화학 요법과 함께 테스트될 뿐만 아니라 항-PD-L1 항체 아벨루맙(NCT02554812) 및 항-PD-1 항체 펨브롤리주맙(NCT02179918)을 포함한 다른 항체 요법과 함께 테스트되어 상이한 치료 조합의 안전성, 내약성, 용량 제한 독성(DLT), 최대 허용 용량(MTD) 및 효능을 평가했다. 이러한 시험은 최대 5mg/kg 용량에 대해 DLT가 없고 유토밀루맙과 펨브롤리주맙의 조합에 대해 26% 환자 반응률을 나타내는 초기 결과로 진행 중이다. 유토밀루맙과 아벨루맙 및 기타 면역 종양학 요법의 삼중 조합도 테스트 중이다(NCT02554812, NCT03217747).

MSLN은 건강한 개체(individual)의 흉막, 복막 및 심낭(Hassan et al., 2005)을 둘러싸고있는 중피 세포에서 비교적 낮은 수준으로 발현되지만, 중피종, 편평 세포 암종, 췌장암, 폐암, 위암, 유방암, 자궁 내막암 및 난소암를 포함한 여러 다른 암에서 고도로 발현된다. 메소텔린의 정상적인 생물학적 기능은 공지되어 있지 않다. 암의 맥락에서, MSLN의 높은 발현 수준은 난소암, 담관암종, 폐 선암종 및 삼중 음성 유방암의 불량한 예후와 관련된다. 정상 세포에서의 MSLN의 제한된 발현 대 종양 세포에서의 높은 발현은 모노클로날 항체를 사용하는 매력적인 치료 표적이 된다(Hassan et al., 2016).

MSLN은 69-kDa 전구체 단백질(628 아미노산)로서 발현된다. 이어서, 전구체 단백질은 엔도프로테아제 푸린에 의해 절단되어 거핵구 강화 인자(MPF)라고 칭명되는 분비된 N-말단 영역을 방출하는 반면, 40-kDa 단백질 성숙 MSLN은 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 링커를 통해 세포막에 부착된 상태로 유지된다. 인간 MSLN은 MSLN의 뮤린 및 시노몰구스 오솔로그와 각각 60% 및 87% 아미노산 동일성을 공유한다.

막 결합된 성숙 MSLN은 막 앵커 서열이 없는 변이체를 생성하거나 종양 괴사 인자 α-전환 효소(TACE)에 의한 프로테아제 절단을 통해 대안적인 스플라이싱의 결과로 세포로부터 박리된다(Sapede et al., 2008; Zhang et al., 2011). 가용성 박리된 MSLN은 환자의 혈청과 악성 중피종, 난소암 또는 고도로 전이된 암을 포함한 종양의 간질에서 발견된다. 중피종 환자의 혈액 및 삼출액에서 가용성 MSLN 수준을 측정하는 것은 치료 및 진행에 대한 환자 반응을 모니터링하기 위해 미국 FDA의 승인을 받았다(Hollevoet et al., 2012, Creany et al., 2015).

MSLN을 표적으로 하는 여러 항체 기반 요법이 주로 중피종, 췌장 및 비-소세포 폐암에서 임상 시험에서 개발되고 테스트되었다(Hassan et al., 2016). 사용된 전략에는 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC) 활성을 갖는 항-MSLN 항체, 예를 들어, 아마툭시맙의 사용뿐만 아니라 독소에 접합된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 SS1P-PE38 및 아네투맙-라브탄신과 같은 항채 약물 접합체(ADC)의 사용을 통한 직접적인 종양 세포 사멸이 포함된다.

MSLN을 표적으로 하는 비접합된 항체는 유리한 안전성 프로필을 나타냈지만 그들의 치료 효능은 제한된 반면, ADC는 항종양 활성에서 더 강력하게 나타났지만 용량 제한 독성과 관련되었다. MSLN뿐만 아니라 공동 자극 단백질 CD40, MSLN-CD3 이중특이적 T 세포 참여자(BITE) 및 MSLN-CD47 이중특이적 분자를 표적으로 하는 ABBV-428을 포함하여 면역계에 관여하도록 의도된 여러 이중특이적 분자도 개발 중에 있다.

발명의 진술

상기 배경 섹션에서 설명된 바와 같이, CD137 작용제 분자의 임상 개발은 용량 제한 고급 간 염증(우렐루맙) 또는 낮은 임상 효능(유토밀루맙)과 관련된 치료로 인해 보류되었다.

본 발명자들은 높은 활성을 나타내지만 용량 제한 간 염증과 관련되지 않는 CD137 작용제 분자가 당업계에 필요하다는 것을 인식했다. 이러한 분자는 효력 및 따라서 분자의 효능을 최적화하는 용량으로 개체에게 투여될 수 있으며, 예를 들어, 면역 치료제로서 암 치료에 사용될 수 있다.

이론에 결부시키고자 하지 않고, 간에 존재하는 T 세포는 항-CD137 작용제 분자에 의해 활성화되어 간 염증을 유발할 수 있는 가능성을 가질 수 있다고 생각된다. CD8⁺ T 세포는 패혈증/바이러스 감염 후 간 염증과 세포 사멸을 촉진하는 것으로 나타났다(Wesche-Soldato et al., 2007). 그러나, 이 효과는 CD137 특이적이지 않다. 마우스에서 항-CD137 작용제 항체 요법은 간으로 CD137-의존 T 세포 침윤을 초래하는 것으로 나타났다(Dubrot J et al., 2010). 함께 취하면, 이러한 연구 결과는 우렐루맙과 같은 높은 활성을 갖는 항-CD137 작용제 항체가 간으로 활성화된 CD8⁺ T 세포의 침윤을 유발하여 간 염증을 일으킬 수 있음을 나타낸다.

CD137 리간드의 CD137에 대한 초기 결찰은 수용체 삼량체화를 유도하는 일련의 사건을 개시하고, 수용체 클러스터링, 활성화 및 강력한 항종양 면역 세포 활성의 후속적 개시가 이어지는 것으로 생각된다. 치료제가 CD137의 활성화를 효율적으로 달성하기 위해서, 따라서 여러 수용체 단량체가 삼량체성 리간드에 의한 가교를 모방하는 방식으로 함께 가교될 필요가 있을 것으로 예상된다.

본 발명자들은 MSLN에 대한 상보성 결정 영역(CDR) 기반 항원 결합 부위와 항체 분자의 불변 도메인에 위치된 CD137 항원 결합 부위를 포함하는 단리된 항체 분자를 갖는다. 본 발명자들은 이러한 항체 분자가 시험관내에서 CD137 및 MSLN 둘 다에 결합될 때 CD137의 클러스터링 및 신호 전달을 유도할 수 있음을 보여 주었다.

이론에 결부시키고자 하지 않고, 항체 분자는 CDR 기반 항원 결합 부위를 통해 MSLN에 결합하여 종양 세포 표면에서 여러 항체 분자의 가교결합에 이어, 종양 침윤성 림프구(TIL)와 같은 면역 세포의 표면 상의 CD137에 대한 항체 분자의 CD137 항원 결합 부위의 결합을 초래하여 CD137의 클러스터링 및 활성화를 유도하여 면역 활성화를 유도한다고 생각된다. 이어서, 활성화된 면역 세포는 종양에 작용하여 종양 면역 요법을 유발할 수 있다.

종양 세포 표면에 존재하는 MSLN의 농도는 CD137 효능 작용의 수준에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 구체적으로, 높은 농도의 MSLN은 세포 표면을 교차하여 항체 분자의 결함 및 가교결합을 증가시키고 결과적으로 CD137 효능 작용을 증가시키는 것으로 생각된다.

본 발명의 항체 분자의 CD137 작용제 활성은 항체 분자의 MSLN에의 동시 결합에 의존한다. 따라서, 항체 분자에 의한 CD137의 활성화는 종양 미세 환경으로 제한될 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 항체 분자는 또한 본원에서 "조건부 작용제"로서 지칭된다. 이러한 맥락에서, 항체 분자의 조건부 작용제 활성은 불변 도메인에 CD137 항원 결합 부위를 포함하는 항체의 본질적인 특징이 아니라는 점에 유의해야 한다. 오히려, 본 발명자들에 의해 수행된 스크리닝 프로그램 동안 단리된 많은 분자는 CD137에 결합되었지만 CD137 클러스터링 및 활성화를 위해 가교결합을 필요로 하지 않았거나 가교결합의 부재하에 제한된 CD137 클러스터링 및 활성화를 유도했다. 종양 미세 환경에 국한된 본 발명의 항체 분자의 조건부 작용제 활성으로 인해, 이들 분자는 간 염증을 유발할 것으로 예상되지 않는다.

CD137과 같은 TNF 수용체에 특이적인 통상적인 항체는 전형적으로 본질적인 작용제 활성을 갖지 않거나 단지 매우 중간 정도이고, 단백질 A 또는 G 또는 2차 항체와 같은 외부 가교결합제를 사용하여 항체-TNFRSF 구성원 복합체의 2차 가교결합 또는 더 높은 수준의 TNF 수용체 구성원 클러스터링 및 활성화를 유도하기 위해 원형질막 국한된 Fcγ 수용체에의 항체의 결합을 필요로 한다(Wajant, 2015). 가교결합 부재하에 TNF 수용체 특이적 항체의 작용제 활성의 낮은 수준 또는 결여는 정상적인 2가 항체가 TNF 수용체 활성화에 불충분한 2개의 단량체성 TNF 수용체를 최대로 가교결합할 수 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 따라서, 생체내 효능을 위해, 단일특이적 항체 표적화 CD137은 CD137-특이적 항체의 가교결합 및 CD137 수용체의 후속적 클러스터링 및 활성화를 달성하기 위해 CD137 발현 T 세포에 인접하여 Fcγ 수용체 발현 세포의 존재를 필요로 한다. 그러나, FCγ 수용체 매개 가교결합은 비효율적인 것으로 생각된다. 또한, Fcγ 수용체를 발현하는 세포는 신체 전반에 걸쳐 존재하고, 따라서 항체 가교결합 및 CD137을 발현하는 면역 세포의 활성화는, 예를 들어, 종양 미세 환경과 같은 특정 부위에 제한되지 않는다. 또한, 이러한 CD137 항체의 아이소타입이 가교결합을 위한 Fcγ 수용체에 대한 효과적인 결합을 매개하기 위해 선택되어야 한다. 그러나, 이는 Fcγ 수용체, 예를 들어, ADCC에 의해 매개된 이펙터 기능을 유도하는 항체를 초래하여 항체에 의해 활성화되도록 의도된 면역 세포를 제거할 수 있다.

대조적으로, 본 발명의 항체 분자는, 예를 들어, 종래의 항체 분자에 의해 필요한 Fcγ 수용체 가교결합의 필요 없이 MSLN의 존재하에 조건부로 CD137을 활성화할 수 있다. 또한, MSLN에 대한 결합을 통한 본 발명의 항체 분자의 가교결합이 Fcγ 수용체 매개된 가교결합보다 더 효율적일 것으로 예상된다. Fcγ 수용체 결합을 폐지하기 위한 돌연변이가 당업계에 공지되어 있으며, 바람직하게는 본 발명의 항체 분자에 포함된다. 따라서, MSLN의 부재하에, 본 발명의 항체 분자는 CD137 작용제 활성을 나타내지 않으며, 따라서, 간 염증을 유도할 것으로 예상되지 않는다.

본 발명자들은 하나 이상의 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키거나 폐지 하도록 변형된 상기 상세화된 MSLN 및 CD137 항원 결합 부위를 포함하는 항체 분자 가 생체내 마우스 종양 모델에서 종양 성장을 억제할 수 있었음을 추가로 보여 주었다. 이들 항체 분자는 ADCC 활성을 폐지하거나 감소시켰기 때문에, 항체 분자는 CD137을 발현하는 T 세포를 활성화시켜 종양 성장을 억제했다고 예상된다.

항체 분자는 단량체성 CD137보다 더 높은 친화도로 이량체성 CD137에 결합하는 것으로 나타났다.

본원에 언급된 바와 같은 '친화도'는 K_D로 측정된 항체 분자와 이의 동족체 항원의 결합 상호 작용의 강도를 지칭할 수 있다. 당업자에게 용이하게 명백한 바와 같이, 항체 분자가 항원과 다수의 결합 상호 작용을 형성할 수 있는 경우(예: 항체 분자가 2가로 항원에 결합할 수 있고, 임의로 항원이 이량체인 경우), K_D로 측정된 친화도는 또한 결합력에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이에 의해 결합력은 항체-항원 복합체의 전반적인 강도를 지칭한다.

T 세포에 의한 CD137의 발현은 활성화시 상향 조절된다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 활성화된 T 세포에서 CD137의 높은 발현으로 인해 CD137은 이러한 세포의 표면에서 이량체, 삼량체 및 고차 다량체 형태로 존재할 것으로 생각된다. 대조적으로, 나이브(naive) T 세포와 같은 나이브 면역 세포는 세포 표면에서 낮거나 무시할 수 있는 수준의 CD137을 발현하고, 따라서 존재하는 임의의 CD137은 단량체 형태일 가능성이 높다. 따라서, 높은 친화도로 CD137에 결합하지만, 높은 친화도로 단량체성 CD137에 결합하지 않는 항체 분자는, 예를 들어, 간에 존재하는 나이브 면역 세포와 대조적으로 활성화된 T 세포와 같은 활성화된 면역 세포에 우선적으로 결합할 것으로 예상된다.

또한, 본 발명의 항체 분자는 용액 내 MSLN보다 고정된(immobilised) MSLN에 더 높은 친화도로 결합하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 본 발명의 항체 분자는 높은 결합력으로 MSLN에 결합하고, 따라서, 항체가 2개의 MSLN 분자에 결합할 수 있는 경우 MSLN에 더 강하게 결합하는 것으로 생각되며, 이는 용액 내 MSLN의 경우 예상되는 바와 같이 MSLN이 단량체 형태인 경우보다 항원의 다중 카피가 표면에 고정된 경우이다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 따라서, 본 발명의 항체 분자는 단량체성 MSLN에 대한 항체의 낮은 친화도로 인해 생체내에서 용액 내 박리된 MSLN에 결합된 채로 잔류하지 않을 것이며, 따라서 종양 부위로부터 신속하게 제거되지 않을 것이고, 따라서, 종양 세포 표면에 MSLN을 결합함으로써 치료 효과를 발휘하는 데 더 오래 걸릴 것으로 생각된다.

본 발명의 항체 분자는 MSLN 상의 상이한 에피토프/영역에 결합한다. 이는 항체 분자 중 일부가 리간드 MUC16의 MSLN에의 결합을 차단할 수 있는 반면, 다른 분자는 그렇지 않다는 사실로부터 명백하다.

본 발명의 항체 분자 중 일부는 CD137에 대해서보다 MSLN에 대해 유사하거나 더 높은 친화도를 갖는 것으로 나타났다. 이는 항체 분자를 MSLN을 발현하는 종양에 국한시키는 데 유익한 것으로 생각된다. MSLN에 대한 항체 분자의 결합은 항체 가교결합, 면역 세포의 표면에서 발현된 CD137에의 결합, 이어서 CD137 클러스터링 및 활성화를 초래하여 궁극적으로 면역 세포의 활성화를 초래할 것으로 예상된다.

본 발명의 항체 분자는 또한 인간 및 시노몰구스 MSLN 및 인간 및 시노몰구스 CD137 모두에 대해 높은 친화도로 결합할 수 있는 것으로 나타났다. 항체 분자의 투여 및 안전성 테스트가 전임상 개발 동안 시노몰구스 원숭이에서 수행되도록 허용하기 때문에, 이러한 교차 반응성이 유리하다.

마우스 동계 종양 모델에서 생체내 연구는 CH3 도메인에 인간 MSLN을 위한 Fab 결합 부위 및 마우스 CD137 결합 부위를 함유하는 항체 분자가 아이소타입 대조군 항체 또는 단일 요법 또는 병용 요법으로 전달된 이중특이적 항체 분자의 구성 요서 부분과 비교하여 더 큰 항종양 효능을 갖는다는 것을 나타냈다(참조: 실시예 13). 항체 분자는 종양 성장의 현저한 감소 및 생존 이점을 입증함으로써 유리한 특징을 보였으며, 상이한 수준의 MSLN을 발현하는 종양에서 항종양 반응을 자극할 수 있었다. 용량 의존 항종양 반응도 또한 이들 분자를 사용한 치료 후에 관찰되었다. 전반적으로, 항체는 종양 성장을 감소시키고 동물의 생존을 증가시키는 데 있어서 대조군 분자와 비교하여 생체내에서 유리한 특징을 보였다.

또한, 항체 분자를 사용하는 치료 후에 간 간독성은 관찰되지 않았다. 이 것은 다른 항-CD137 작용제 항체를 사용한 치료가 간 독성을 유발하는 것으로 문헌에서 밝혀 졌기 때문에 유리하다. 기계론적 연구는 항체 분자가 종양 미세 환경에서 T 세포의 활성화를 자극한 반면, 대조군 CD137 작용제는 종양 미세 환경 외부에서 더 큰 T 세포 활성화를 자극하여 이 유리한 특징을 추가로 뒷받침한다는 것을 보여주었다.

본 발명자들에 의해 동정된 항체 분자의 추가의 유리한 특징은 MSLN 및 CD137에 대한 항원 결합 부위가 모두 항체 구조 자체 내에 함유된다는 점이다. 특히, 항체 분자는 두 표적 모두에 2가 결합할 수 있는 분자를 유도하기 위해 링커 또는 다른 수단을 통해 항체 분자에 융합되는 다른 단백질을 필요로 하지 않는다. 이는 다수의 이점을 갖는다. 구체적으로, 본 발명자들에 의해 동정된 항체 분자는 그들이 임의의 추가 융합 부분을 포함하지 않기 때문에 표준 항체의 생산에 사용되는 것들과 유사한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 구조는 또한 링커가 경시적으로 분해되어 항체 분자의 이종성 집단을 유도할 수 있기 때문에 항체 안정성을 개선시킬 것으로 예상된다. 융합된 하나의 단백질만을 갖는 집단의 항체는 CD137과 MSLN 모두에 결합함으로써 가교결합의 결과로 CD137을 통해 세포 결합된 MSLN 또는 클러스터 및 신호에 우선적으로 결합하지 못할 수 있다. 링커의 절단/분해는 개체에게 치료제를 투여하기 전 또는 투여한 후에(예를 들어, 효소적 절단 또는 개체의 생체내 pH를 통해) 발생하여 개체에서 순환하는 동안 이의 유효성을 감소시킬 있다. 본 발명자들에 의해 동정된 항체 분자에는 링커가 없기 때문에, 항체 분자는 투여 전 및 후 모두 동일한 수의 결합 부위를 유지할 것으로 예상된다. 더욱이, 본 발명자들에 의해 동정된 항체 분자의 구조는, 융합 단백질 또는 링커 또는 둘 다의 도입이 분자가 개체에게 투여될 때 면역원성을 유도하여 치료제의 감소된 유효성을 유도할 수 있기 때문에, 분자의 면역원성의 관점에서도 바람직하다.

따라서, 본 발명은 다음을 제공한다:

[1] (a) 메소텔린(MSLN)에 대한 상보성 결정 영역(CDR)-기반 항원 결합 부위 및

(b) 항체 분자의 CH3 도메인에 위치된 CD137 항원 결합 부위를 포함하는, MSLN 및 CD137에 결합하는 항체 분자로서,

CDR-기반 항원-결합 부위가 다음에 제시된 CDR 1-6을 포함하고:

(i) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22 및 80[FS28-256-271];

(ⅱ) 각각 서열번호 14, 16, 27, 20, 22 및 24[FS28-024-052];

(iii) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22 및 40[FS28-256-021];

(iv) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22 및 37[FS28-256-012];

(v) 각각 서열번호 50, 33, 52, 20, 22 및 40[FS28-256-023];

(vi) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22 및 41[FS28-256-024];

(ⅶ) 각각 서열번호 50, 33, 52, 20, 22 및 41[FS28-256-026];

(viii) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22, 및 80[FS28-256-027];

(ix) 각각 서열번호 38, 33, 35, 20, 22, 및 40[FS28-256-001];

(x) 각각 서열번호 38, 33, 35, 20, 22, 및 41[FS28-256-005];

(xi) 각각 서열번호 46, 33, 48, 20, 22 및 37[FS28-256-014];

(xii) 각각 서열번호 50, 33, 52, 20, 22 및 37[FS28-256-018];

(xiii) 각각 서열번호 31, 33, 35, 20, 22 및 37[FS28-256];

(xiv) 각각 서열번호 14, 16, 25, 20, 22 및 24[FS28-024-051];

(xv) 각각 서열번호 14, 16, 29, 20, 22 및 24[FS28-024-053]; 또는

(xvi) 각각 서열번호 14, 16, 18, 20, 22 및 24[FS28-024];

상기 CDR 서열이 ImMunoGeneTics(IMGT) 넘버링(numbering) 방식에 따라 정의되고;

상기 CD137 항원 결합 부위가 각각 CH3 도메인의 AB 및 EF 구조 루프에 위치된 제1 서열 및 제2 서열을 포함하고, 상기 제1 및 상기 제2 서열이 각각 서열번호 10 및 11[FS22-172-003]에 제시된 서열을 갖는, 항체 분자.

[2] (a) 메소텔린(MSLN)에 대한 상보성 결정 영역(CDR)-기반 항원 결합 부위 및

상기 CDR-기반 항원-결합 부위가 다음에 제시된 CDR 1-6을 포함하고:

(i) 각각 서열번호 43, 5, 45, 21, 23 및 80[FS28-256-271];

(ⅱ) 각각 서열번호 15, 17, 28, 21, 23 및 24[FS28-024-052];

(iii) 각각 서열번호 43, 34, 45, 21, 23 및 40[FS28-256-021];

(iv) 각각 서열번호 43, 34, 45, 21, 23 및 37[FS28-256-012];

(v) 각각 서열번호 51, 34, 53, 21, 23 및 40[FS28-256-023];

(vi) 각각 서열번호 43, 34, 45, 21, 23 및 41[FS28-256-024];

(vii) 각각 서열번호 51, 34, 53, 21, 23 및 41[FS28-256-026];

(viii) 각각 서열번호 43, 34, 45, 21, 23 및 80[FS28-256-027];

(ix) 각각 서열번호 39, 34, 36, 21, 23 및 40[FS28-256-001];

(x) 각각 서열번호 39, 34, 36, 21, 23 및 41[FS28-256-005];

(xi) 각각 서열번호 47, 34, 49, 21, 23 및 37[FS28-256-014];

(xii) 각각 서열번호 51, 34, 53, 21, 23 및 37[FS28-256-018];

(xiii) 각각 서열번호 32, 34, 36, 21, 23 및 37[FS28-256];

(xiv) 각각 서열번호 15, 17, 26, 21, 23 및 24[FS28-024-051];

(xv) 각각 서열번호 15, 17, 30, 21, 23 및 24[FS28-024-053]; 또는

(xvi) 각각 서열번호 15, 17, 19, 21, 23 및 24[FS28-024];

상기 CDR 서열이 카바트(Kabat)에 따라 정의되고;

상기 CD137 항원 결합 부위가 각각 CH3 도메인의 AB 및 EF 구조 루프에 위치된 제1 서열 및 제2 서열을 포함하고, 상기 제1 및 상기 제2 서열이 서열번호 10 및 11[FS22-172-003]에 제시된 서열을 갖는, 항체 분자.

[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 항체 분자가 [1] 또는 [2]의 (i)에 제시된 CDR 1-6을 포함하는, 항체 분자.

[4] [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 항체 분자가 [1] 또는 [2]의 (ii)에 제시된 CDR 1-6을 포함하는, 항체 분자.

[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 중쇄 가변(VH) 도메인 및/또는 경쇄 가변(VL) 도메인, 바람직하게는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는, 항체 분자.

[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 면역글로불린 중쇄 및/또는 면역글로불린 경쇄, 바람직하게는 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하는, 항체 분자.

[7] [5] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 하기에 제시된 VH 도메인 및/또는 VL 도메인, 바람직하게는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는, 항체 분자:

(ⅰ) 각각 서열번호 70 및 76[FS28-256-271];

(ⅱ) 각각 서열번호 58 및 54[FS28-024-052];

(iii) 각각 서열번호 70 및 68[FS28-256-021];

(iv) 각각 서열번호 70 및 64[FS28-256-012];

(v) 각각 서열번호 74 및 68[FS28-256-023];

(vi) 각각 서열번호 70 및 78[FS28-256-024];

(ⅶ) 각각 서열번호 74 및 78[FS28-256-026];

(viii) 각각 서열번호 70 및 76[FS28-256-027];

(ix) 각각 서열번호 66 및 68[FS28-256-001];

(x) 각각 서열번호 66 및 78[FS28-256-005];

(xi) 각각 서열번호 72 및 64[FS28-256-014];

(xii) 각각 서열번호 74 및 64[FS28-256-018];

(xiii) 각각 서열번호 62 및 64[FS28-256];

(xiv) 각각 서열번호 56 및 54[FS28-024-051];

(xv) 각각 서열번호 60 및 54[FS28-024-053]; 또는

(xvi) 각각 서열번호 12 및 54[FS28-024].

[8] [7]에 있어서, 상기 항체 분자가 각각 서열번호 70 및 76[FS28-256-271]에 제시된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는, 항체 분자.

[9] [7]에 있어서, 상기 항체 분자가 각각 서열번호 58 및 54[FS28-024-052]에 제시된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는, 항체 분자.

[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 서열이 항체 분자의 CH3 도메인의 위치 14와 17 사이에 위치되고, 상기 아미노산 잔기 넘버링이 IMGT 넘버링 방식에 따르는, 항체 분자.

[11] [10]에 있어서, 상기 제1 서열이 항체 분자의 CH3 도메인의 위치 15, 16, 16.5, 16.4, 16.3, 16.2 및 16.1에 위치되고, 상기 아미노산 잔기 넘버링이 IMGT 넘버링 방식에 따르는, 항체 분자.

[12] [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 서열이 항체 분자의 CH3 도메인의 위치 92 내지 98에 위치되고, 상기 아미노산 잔기 넘버링이 IMGT 넘버링 방식에 따르는, 항체 분자.

[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 CH3 도메인의 CD 구조 루프에 위치된 제3 서열을 추가로 포함하는, 항체 분자.

[14] [13]에 있어서, 상기 제3 서열이 항체 분자의 CH3 도메인의 위치 43 내지 78에 위치되고, 상기 아미노산 잔기 넘버링이 IMGT 넘버링 방식에 따르는, 항체 분자.

[15] [13] 내지 [14] 중 어느 하나에 있어서, 상기 제3 서열이 서열번호 157에 제시된 서열을 갖는, 항체 분자.

[16] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 서열번호 8[FS22-172-003]에 제시된 CH3 도메인 서열을 포함하는, 항체 분자.

[17] [1] 내지 [16] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 인간 IgG1 분자인, 항체 분자.

[18] [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 다음 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 항체 분자:

(i) 각각 서열번호 3 및 84에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-271;

(ii) 각각 서열번호 102 및 85에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-052;

(iii) 각각 서열번호 125 및 82에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-021;

(ⅳ) 각각 서열번호 125 및 116에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-012;

(v) 각각 서열번호 133 및 82에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-023;

(vi) 각각 서열번호 125 및 83에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-024;

(vii) 각각 서열번호 133 및 83에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-026;

(viii) 각각 서열번호 125 및 84에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-027;

(ix) 각각 서열번호 120 및 82에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-001;

(x) 각각 서열번호 120 및 83에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-005;

(xi) 각각 서열번호 129 및 116에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-014;

(xii) 각각 서열번호 133 및 116에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-018;

(xiii) 각각 서열번호 114 및 116에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256;

(xiv) 각각 서열번호 98 및 85에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-051;

(xv) 각각 서열번호 106 및 85에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-053; 또는

(xvi) 각각 서열번호 94 및 85에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024.

[19] [18]에 있어서, 상기 항체 분자가 각각 서열번호 84 및 3에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-271의 경쇄 및 중쇄를 포함하는, 항체 분자.

[20] [18]에 있어서, 각각 서열번호 85 및 102에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-052의 경쇄 및 중쇄를 포함하는, 항체 분자.

[21] [18] 내지 [20] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 CH2 도메인의 위치 114의 프롤린(P)이 알라닌(A)으로 치환되고, 상기 아미노산 잔기 넘버링이 IMGT 넘버링 방식에 따르는, 항체 분자.

[22] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 상기 MSLN이 세포 표면 결합된 MSLN인, 항체 분자.

[23] [22]에 있어서, 상기 항체 분자가 가용성 MSLN에 대한 것 보다 높은 친화도로 고정된 MSLN에 결합하는, 항체 분자.

[24] [23]에 있어서,

(i) 상기 항체 분자가 8nM의 kD 또는 더 높은 친화도로 고정된 MSLN에 결합하고/하거나;

(ii) 상기 항체 분자가 15nM의 kD 또는 더 낮은 친화도로 가용성 MSLN에 결합하는, 항체 분자.

[25] [1] 내지 [24] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 인간 MSLN 및 인간 CD137에 결합하는, 항체 분자.

[26] [25]에 있어서, 상기 MSLN이 서열번호 375에 제시된 서열로 구성되거나이를 포함하는, 항체 분자.

[27] [25] 또는 [26]에 있어서, 상기 인간 CD137이 서열번호 373에 제시된 서열로 구성되거나 이를 포함하는, 항체 분자.

[28] [1] 내지 [27] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 [1] 또는 [2]의 (ii) 또는 (xiv) 내지 (xvi) 중 어느 하나에 제시된 CDR 1-6을 포함하고, 상기 항체가 MUC16의 MSLN에의 결합을 차단하는, 항체 분자.

[29] [1] 내지 [27] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 [1] 또는 [2]의 (i) 또는 (iii) 내지 (xiii) 중 어느 하나에 제시된 CDR 1-6을 포함하고, 상기 항체가 MUC16의 MSLN에의 결합을 차단하지 않는, 항체 분자.

[30] [28] 또는 [29]에 있어서, 상기 MUC16이 인간 MUC16인, 항체 분자.

[31] [1] 내지 [30] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 종양 세포 표면 결합된 MSLN의 존재하에 면역 세포 상에서 CD137을 활성화할 수 있는, 항체 분자.

[32] [1] 내지 [31] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자의 면역 세포 상의 CD137 및 종양 세포 표면 결합된 MSLN에의 결합이 면역 세포 상에서 CD137의 클러스터링을 유발하는, 항체 분자.

[33] [31] 또는 [32]에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포 또는 수지상 세포(DC)인, 항체 분자.

[34] [33]에 있어서, 상기 면역 세포가 T 세포인, 항체 분자.

[35] [1] 내지 [34] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 상기 항체 분자의 CH2 도메인 또는 항체 분자의 하나 이상의 Fcγ 수용체에의 결합을 감소시키거나 폐지하도록 변형된, 항체 분자.

[36] [1] 내지 [35] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 분자가 Fcγ 수용체에 결합하지 않는, 항체 분자.

[37] [35] 또는 [36]에 있어서, 상기 Fcγ 수용체가 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIII으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체 분자.

[38] [1] 내지 [37] 중 어느 하나에 따르는 항체 분자 및 생리활성 분자를 포함하는 접합체.

[39] [1] 내지 [37] 중 어느 하나에 따르는 항체 분자 및 검출 가능한 표지를 포함하는 접합체.

[40] [1] 내지 [37] 중 어느 하나에 따르는 항체 분자를 인코딩(encoding)하는 핵산 분자 또는 분자들.

[41] [1] 내지 [37] 중 어느 하나에 따르는 항체 분자를 인코딩하는 핵산 분자 또는 분자들로서, 상기 핵산 분자(들)가 다음의 중쇄 핵산 서열 및/또는 경쇄 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자 또는 분자들:

(I) 각각 서열번호 4 및 91에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-271;

(ii) 각각 서열번호 103 및 86에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-052;

(iii) 각각 서열번호 126 및 122에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-021;

(iv) 각각 서열번호 126 및 117에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-012;

(v) 각각 서열번호 134 및 122에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-023;

(vi) 각각 서열번호 126 및 90에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-024;

(vii) 각각 서열번호 134 및 90에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-026;

(viii) 각각 서열번호 126 및 91에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-027;

(ix) 각각 서열번호 121 및 122에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-001;

(x) 각각 서열번호 121 및 90에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-005;

(xi) 각각 서열번호 130 및 117에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-014;

(xii) 각각 서열번호 134 및 117에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-018;

(xiii) 각각 서열번호 115 및 117에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256;

(xiv) 각각 서열번호 99 및 86에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-051;

(xv) 각각 서열번호 107 및 86에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-053; 또는

(xvi) 각각 서열번호 95 및 86에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024.

[42] [40] 또는 [41] 중 어느 하나에 따르는 핵산 분자 또는 분자들을 포함하는 벡터 또는 벡터들.

[43] [40] 내지 [41] 중 어느 하나에 따르는 핵산 분자(들) 또는 [42]에 따르는 벡터(들)를 포함하는 재조합 숙주 세포.

[44] [43]의 재조합 숙주 세포를 항체 분자의 생산 조건하에서 배양하는 단계를 포함하는, [1] 내지 [37] 중 어느 하나에 따르는 항체 분자의 생산 방법.

[45] [44]에 있어서, 항체 분자를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

[46] [1] 내지 [39] 중 어느 하나에 따르는 항체 분자 또는 접합체 및 약학 적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.

[47] [1] 내지 [39] 중 어느 하나에 있어서, 개체에서 암의 치료 방법에 사용하기 위한, 항체 분자 또는 접합체.

[48] [1] 내지 [39] 중 어느 하나에 따르는 항체 분자 또는 접합체의 치료적 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 암 치료 방법.

[49] 암 치료용 의약을 제조하는 데 있어서 [1] 내지 [39] 중 어느 하나에 따르는 항체 분자 또는 접합체의 용도.

[50] [47] 내지 [49] 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 난소암, 췌장암, 폐암, 또는 중피종인, 항체 분자 또는 접합체, 방법 또는 용도.

[51] [47]에 있어서, 상기 치료가 항체 분자 또는 접합체를 제2 치료제와 함께 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항체 분자 또는 접합체.

[52] [48]에 있어서, 상기 방법이 치료적 유효량의 제2 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

도 1은 인간 MSLN의 다른 영역에 결합하는 Fab를 포함하는 mAb²가 mAb²가 MSLN 양성 NCI-H226 세포에 의해 가교결합될 때 CD8⁺ T 세포의 CD137-매개 활성화를 유도하여 인간 IL-2의 방출을 유도하는 T 세포 활성화 검정 결과를 도시한다. 이러한 결과는 FS28-185 계통(B)의 Fab를 포함하는 mAb²가 이 검정에서 기능적 활성을 갖지 않음을 보여준다. 계통 FS28-024(A) 및 FS28-256(C)의 Fab를 포함하는 mAb²는 모두 mAb²의 서브나노몰(subnanomolar) 내지 1.5nM 농도의 존재하에 hIL-2 방출의 증가를 나타낸다.
도 2는 가용성 MSLN(sMSLN)의 상이한 농도(sMSLN 없음, 2nM 및 20nM sMSLN)의 존재하에 T 세포 활성화 검정의 결과를 도시한다. 막 결합 MSLN에 대한 우선적인 결합을 나타낸 mAb²(FS28-024-051, FS28-024-052, FS28-024-053, FS28-256-021 및 FS28-256-023을 포함하는 mAb²)는 EC₅₀의 상당한 변화가 sMSLN이 존재하지 않았을 경우와 비교하여 20nM의 sMSLN의 존재하에 관찰된 FS22-172-003-AA/FS28-256-027(F)보다 가용성 MSLN(A-E)의 존재에 의해 덜 영향받았다.
도 3A 및 B는 mAb²가 OVCAR-3 세포에 의해 가교결합될 때 mAb²가 CD8⁺ T 세포의 CD137-매개 활성화를 유도하는 T 세포 활성화 검정 결과를 도시한다. 이러한 결과는 mAb²가 세포막에서 더 낮은 MSLN 밀도를 발현하는 세포의 맥락에서 CD137 매개 효능 작용을 유도할 수 있음을 보여준다. 모의 mAb²포맷(FS22-172-003/HelD1.3)의 항-CD137 Fcab FS22-172-003이 또한 이 검정에서 테스트되었고, IL-2 방출의 결여는 항-인간 CD137 Fcab이 분자의 Fab 암을 통해 가교결합될 때만 기능적임을 나타냈다.
도 4는 서열 최적화된 mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256-271(A), FS22-172-003-AA/FS28-256-272(B) 및 FS22-172-003-AA/FS28-256-273(C)이 최대 20nM의 sMSLN의 부재 또는 존재하에 인간 MSLN을 발현하는 NCI-H226 세포와 가교결합된 CD8⁺ T 세포 활성화 검정 결과를 도시한다. mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256-271의 경우, 최대 20nM의 sMSLN 농도는 관찰된 EC₅₀ 측면에서 T 세포 활성화 활성의 최소 감소를 초래한다. mAb²FS22-172-003-AA/FS28-256-272 및 FS22-172-003-AA/FS28-256-273은 EC₅₀에서 6.6배 감소를 나타낸 부모 클론 FS22-172-003-AA/FS28-256-027(D)에서와 같이, 관찰된 EC₅₀에서 4배보다 높은 감소로 20nM의 sMSLN의 존재하에 T 세포 활성화 활성의 보다 현저한 감소를 나타냈다.
도 5는 mAb² FS22m-063-AA/FS28m-228-010 및 FS22m-063-AA/FS28m-228이 2nM 가용성 마우스 MSLN의 존재 또는 부재하(A 내지 D)에 CT26.G10, CT26.B2 또는 Panc02 세포와 가교결합되었을 때 T 세포 활성화 검정에서 IFNγ 방출을 도시한다. mAb² FS22m-063-AA/FS28m-228에 대한 실험에는 다음 음성 대조군이 포함되었다: 임의의 CD137-표적화 Fcab가 결여된 IgG1 포맷의 항-MSLN 대조군 항체, 및 모의 mAb² FS22m-063/HelD1.3(즉, MSLN 표적화 없는 CD137 Fcab). 결과는, 심지어 비교적 높은 농도의 가용성 MSLN에서 이 검정에서 mAb²의 효력에 무시할 만한 영향을 미쳤다는 것을 보여주었다. 이 데이터는 또한 테스트된 모든 MSLN-발현 세포주를 교차하여 서브나노몰 효능(EC₅₀)을 나타냈다.
도 6은 G1/4420(인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체)(A) 또는 FS22m-063-AA/FS28m-228(항-마우스 CD137/MSLN mAb²)(B)로 처리된 마우스에 대한 CT26.B2 동계 마우스 종양 모델에서 개별적 종양 용적 측정을 도시한다. FS22m-063-AA/FS28m-228에 의한 치료는 아이소타입 대조군과 비교하여 감소된 종양 성장을 유도했다.
도 7은 G1/4420(인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체) 또는 FS22m-063-AA/FS28m-228(항-마우스 CD137/MSLN mAb²)로 처리된 CT26.B2 동계 마우스 종양 모델에서 마우스의 카플란 마이어(Kaplan Meier) 생존 플롯을 도시한다. FS22m-063-AA/FS28m-228에 의한 치료는 인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체로의 치료와 비교하여 생존율의 상당한 개선을 나타냈다. (로그-순위 분석, **p <0.01)
도 8은 G1/4420(인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체)(A) 또는 FS22m-063-AA/FS28m-228(항-마우스 CD137/MSLN mAb²)(B)로 처리된 마우스에 대한 CT26.G10 동계 마우스 종양 모델에서 개별적 종양 용적 측정을 도시한다. FS22m-063-AA/FS28m-228로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군과 비교하여 감소된 종양 성장을 나타냈고, 연구 종료시 아이소타입 대조군 처리된 그룹에서와 비교하여(1/20, 5%) 4/20(25%) 마우스에서 만져지는 종양이 존재하지 않는다.
도 9는 G1/4420(인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체) 또는 FS22m-063-AA/FS28m-228(항-마우스 CD137/MSLN mAb²)로 처리된 CT26.G10 동계 마우스 종양 모델에서 마우스의 카플란 마이어 생존 플롯을 도시한다. FS22m-063-AA/FS28m-228에 의한 치료는 인간 IgG1 아이소타입 대조군 항체에 의한 치료와 비교하여 생존율의 상당한 개선을 나타냈다. (로그-순위 분석, **p <0.01)
도 10은 G1-AA/4420(IgG 대조군; 20μg, 20g 마우스에서 1㎎/kg과 등가임), G1/Lob12.3(야생형 인간 IgG1 항-CD137 양성 대조군; 20㎍, 20g 마우스에서 1mg/kg과 등가임) 및 FS22m-063-AA/FS28m-228-010(항-마우스 CD137/MSLN mAb²)으로 처리된 마우스에 대한 CT26.G10 동계 마우스 종양 모델에서 개별적 종양 용적 측정을 도시한다. FS22m-063-AA/FS28m-228-010에 의한 치료는 인간 IgG1 아이소타입 대조군 처리 마우스와 비교하여 종양 성장에서 용량 의존 감소를 나타냈다.
도 11은 G1-AA/4420(인간 IgG1 대조군; 20μg, 20g 마우스에서 1㎎/kg과 등가임), G1/Lob12.3(야생형 인간 IgG1 항-CD137 양성 대조군; 20μg, 20g 마우스에서 1mg/kg과 등가임) 및 FS22m-063-AA/FS28m-228-010(항-마우스 CD137/MSLN mAb²)로 처리된 CT26.G10 동계 마우스 종양 모델에서 마우스의 카플란 마이어 생존 플롯을 도시한다. 테스트된 모든 용량 수준의 FS22m-063-AA/FS28m-228-010에 의한 치료는 IgG 대조군과 비교하여 생존율의 상당한 개선을 유도했고, 생존율의 개선은 용량 의존적이었다. (치료 그룹을 G1-AA/4420 아이소타입 대조군과 비교하는 로그-순위 쌍별 분석, p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001)
도 12는 (A) G1-AA/HelD1.3(인간 IgG1 대조군), (B) FS22m-063-AA/HelD1.3('모의' mAb² 포맷의 항-마우스 CD137 Fcab), (C) FS22m-AA-063/4420(mAb² 포맷의 항-마우스 CD137 Fcab), (D) G1-AA/FS28m-228-010(항-마우스 MSLN 항체), (E) FS22m-063-AA/HelD1.3 + G1-AA/FS28m-228-010의 조합('모의' mAb² 포맷의 항-마우스 CD137 Fcab + 항-마우스 MSLN Fab) 및 (F) FS22m-063-AA/FS28m-228-010(항-마우스 CD137/MSLN mAb²)으로 처리된 마우스에 대한 CT26.G10 동계 마우스 종양 모델에서 개별적 종양 용적 측정을 도시한다. 결과는, FS22m-063-AA/FS28m-228-010으로 처리된 마우스 7/20(35%)은 연구 종료시 G1-AA/FS28m-228-010(1/20, 5%)을 제외하고 만져지는 종양을 갖지 않았고, 다른 치료로 투여된 모든 마우스는 연구 종료시 ≥ 62.5mm³의 종양을 가졌다.
도 13은 G1-AA/HelD1.3(IgG 대조군), FS22m-063-AA/HelD1.3(비-결합제 Fab, 항-HelD1.3을 갖는 '모의' mAb² 포맷의 항-마우스 CD137 Fcab), FS22m-063-AA/4420(비-결합제 Fab, 항-4420을 갖는 '모의' mAb² 포맷의 항-마우스 CD137 Fcab), G1-AA/FS28m-228-010(항-마우스 MSLN 항체), FS22m-063-AA/HelD1.3 + G1-AA/FS28m-228-010의 조합(항-마우스 CD137 Fcab + 항-마우스 MSLN 항체) 및 FS22m-063-AA/FS28m-228-010(항-마우스 CD137/MSLN mAb²)으로 처리된 CT26.G10 동계 마우스 종양 모델에서 카플란 마이어 생존 플롯을 도시한다. 결과는, '모의' mAb² 포맷의 2개의 항-마우스 CD137 Fcab 중 하나, 또는 항-마우스 MSLN 항체로 처리된 마우스 뿐만 아니라 조합 치료 그룹의 마우스는 아이소타입 대조군 처리 마우스와 비교하여 생존율의 임의의 개선을 나타내지 않은 반면, FS22m-063-AA/FS28m-228-010으로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군 처리 마우스와 비교하여 개선된 생존율을 나타냈다. (치료 그룹을 G1-AAHelD1.3 아이소타입 대조군과 비교하는 로그-순위 쌍별 분석, ***p <0.0001).
도 14는 비종양 보유 C57BL/6 마우스 모델에서 항-인간 CD137/MSLN mAb² 및 항-마우스CD137/MSLN mAb²의 약동학적 프로파일을 도시한다. A: 단일 정맥내 용량(그룹당 n=3) 후, 10mg/kg 인간 IgG1 아이소타입 대조군(G1/4420)과 비교하여 10mg/kg에서 항-마우스 CD137/MSLN mAb²(FS22m-063-AA/FS28m-228-010)를 도시한다. 인간 IgG1 아이소타입 대조군 및 FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²는 모두 투여 후 144시간에 각각 70.30 및 18.11μg/ml에서 높은 수준의 노출을 유지했다. 정량화의 하한치(LLOQ)는 5.48ng/mL에서 제시된다. B: 단일 정맥내 용량이 비-종양 보유 C57BL/6 마우스에 투여된 후 6.7mg/kg 인간 IgG1 아이소타입 대조군(G1/4420)과 비교하여 6.7mg/kg의 정맥내 용량 후 항-인간 CD137/MSLN mAb²(FS22-172-003-AA/FS28-256-271)의 수준을 도시한다. 인간 IgG1 아이소타입 대조군 및 항-인간 CD137/MSLN mAb²는 모두 투여 후 144시간에 각각 28.36 및 60.26㎍/㎖에서 높은 수준의 노출을 유지했다. 정량화의 하한치(LLOQ)는 1.82ng/mL에서 제시된다.

본 발명은 MSLN 및 CD137 모두에 결합하는 항체 분자에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 항체 분자는 MSLN에 대한 CDR 기반 항원 결합 부위 및 항체 분자의 불변 도메인에 위치된 CD137 항원 결합 부위를 포함한다.

항체 분자는 바람직하게는 MSLN 및 CD137에 특이적으로 결합한다. 용어 "특이적"은 항체 분자가 그의 특정 결합 파트너(들), 여기서 MSLN 및 CD137 이외의 분자에 대해 임의의 유의한 결합을 나타내지 않을 상황을 지칭할 수 있다. 용어 "특이적"은 또한 항체 분자가 다수의 항원에 의해 운반되는 MSLN 및 CD137 상의 에피토프와 같은 특정 에피토프에 특이적인 경우에 적용될 수 있으며, 이 경우 항체 분자는 에피토프를 운반하는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 분자는 OX40, GITR, CD40, CEACAM-5, E-카드헤린, 트롬보모듈린 또는 EpCAM에 결합하지 않거나 이들에 대한 임의의 유의한 결합을 나타내지 않는다.

용어 "항체 분자"는 천연이거나 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 생성된 면역글로불린을 기재한다. 항체 분자는 인간 또는 인간화될 수 있고, 바람직하게는 인간일 수 있다. 항체 분자는 바람직하게는 모노클로날 항체 분자이다. 항체의 예는 면역글로불린 G와 같은 면역글로불린 아이소타입, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은 아이소타입 서브클래스뿐만 아니라 이들의 단편이다. 항체 분자는 다른 폴리펩티드 및/또는 혈청 성분에 결합할 수 있는 항체와 같은 오염 물질이 없다는 의미에서 단리될 수 있다 .

따라서, 본원에서 사용된 용어 "항체 분자"는 항체 단편을 포함하며, 단, 상기 단편은 MSLN에 대한 CDR 기반 항원 결합 부위 및 불변 도메인에 위치된 CD137 항원 결합 부위를 포함한다.

항체 분자는 천연이거나 부분적으로 또는 전체적으로 합성적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 재조합 항체 분자일 수 있다.

항체 분자는 MSLN에 대한 하나 이상의 CDR 기반 항원 결합 부위 및 항체 분자의 하나 이상의 불변 도메인, 바람직하게는 하나 이상의 CH3 도메인에 CD137에 대한 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.

항체 분자는 면역글로불린 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 IgG, IgA, IgE 또는 IgM 분자, 바람직하게는 IgG 분자, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자, 더욱 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 분자, 가장 바람직하게는 IgG1 분자, 또는 이의 단편일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체 분자는 완전 면역글로불린 분자이다.

다른 구현예에서, 항체 분자는 MSLN에 대한 CDR 기반 항원 결합 부위 및 불변 도메인에 위치된 CD137에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 항원 결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 scFv가 MSLN에 결합하고 Fc가 OX40 또는 미니바디에 결합하는 scFv-Fc 융합일 수 있고, 이는 CH3 도메인에 결합된 scFv를 포함한다(Hu et al.(1996), Cancer Res., 56(13): 3055-61).

항체 및 이의 구성 및 사용 방법은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌(참조: Holliger and Hudson, 2005)에 기재되어 있다. 모노클로날 및 기타 항체를 취하고 재조합 DNA 기술을 사용하여 원래 항체의 특이성을 유지하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생성하는 것이 가능하다. 이러한 기술은 하나의 항체 분자의 CDR 또는 가변 영역을 상이한 항체 분자에 도입하는 것을 포함할 수 있다(EP-A-184187, GB 2188638A 및 EP-A-239400).

바람직한 구현예에서, 항체 분자는 mAb²(TM) 이중특이적 항체이다. 본원에서 언급되는 바와 같이, mAb² 이중특이적 항체는 이의 가변 영역 각각에 CDR 기반 항원 결합 부위 및 항체 분자의 불변 도메인에 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 면역글로불린이다.

바람직한 구현예에서, 항체는 MSLN 및 CD137에 결합하는 항체 분자이며, 상기 항체 분자는

(i) 각각 면역글로불린 VH 도메인 및 면역글로불린 VL 도메인에 의해 형성된 MSLN에 대한 2개의 CDR 기반 항원 결합 부위; 및

(ii) 항체 분자의 2개의 CH3 도메인에 위치된 CD137에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다.

더욱 바람직한 구현예에서, 항체는 MSLN 및 CD137에 결합하는 완전 면역글로불린 분자, 예를 들어, 완전 IgG1 분자이며, 상기 항체는

(ii) 항체 분자의 2개의 CH3 도메인에 위치된 CD137에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함하고,

상기 면역글로불린 분자는 CH1, CH2 및 CL 도메인을 추가로 포함한다.

CDR 기반 항원 결합 부위는 항체 가변 영역 중 항원 결합 부위이다. CDR 기반 항원 결합 부위는 3개의 경쇄 가변 도메인(VL) CDR 또는 3개의 중쇄 가변 도메인(VH) CDR과 같은 3개의 CDR에 의해 형성될 수 있다. 바람직하게는, CDR 기반 항원 결합 부위는 6개의 CDR, 3개의 VL CDR 및 3개의 VH CDR에 의해 형성된다. 항원의 결합에 대한 상이한 CDR의 기여는 상이한 항원 결합 부위에서 다양할 수 있다.

항원 결합 부위의 3개의 VH 도메인 CDR은 면역글로불린 VH 도메인 내에 위치될 수 있고, 3개의 VL 도메인 CDR은 면역글로불린 VL 도메인 내에 위치될 수 있다. 예를 들어, CDR 기반 항원 결합 부위는 항체 가변 영역에 위치될 수 있다.

항체 분자는 MSLN에 대한 하나 또는 바람직하게는 하나 이상, 예를 들어, 2개의 CDR 기반 항원 결합 부위를 갖는다. 따라서, 항체 분자는 하나의 VH 및 하나의 VL 도메인을 포함할 수 있지만, 바람직하게는, 예를 들어, 자연 발생 IgG 분자의 경우와 같이 2개의 VH 및 2개의 VL 도메인, 즉 2개의 VH/VL 도메인 쌍을 포함한다.

CDR 기반 항원 결합 부위는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-024-052, FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-012, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-024, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027, FS22-172-003-AA/FS28-256-001, FS22-172-003-AA/FS28-256-005, FS22-172-003-AA/FS28-256-014, FS22-172-003-AA/FS28-256-018, FS22-172-003-AA/FS28-256, FS22-172-003-AA/FS28-024-051, FS22-172-003-AA/FS28-024-053 또는 FS22-172-003-AA/FS28-024, 바람직하게 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271 또는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052, 가장 바람직하게 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271의 3개의 VH CDR 또는 3개의 VL CDR, 바람직하게는 3개의 VH CDR 및 3개의 VL CDR을 포함할 수 있다.

CDR의 서열은 통상적인 기술을 사용하여 항체 분자의 VH 및 VL 도메인 서열로부터 쉽게 결정될 수 있다. 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-024-052, FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-012, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-024, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027, FS22-172-003-AA/FS28-256-001, FS22-172-003-AA/FS28-256-005, FS22-172-003-AA/FS28-256-014, FS22-172-003-AA/FS28-256-018, FS22-172-003-AA/FS28-256, FS22-172-003-AA/FS28-024-051, FS22-172-003-AA/FS28-024-053 및 FS22-172-003-AA/FS28-024의 VH 및 VL 도메인 서열이 본원에 기재되어 있으며, 따라서, 상기 항체의 3개의 VH 및 3개의 VL 도메인 CDR은 상기 서열로부터 결정될 수 있다. CDR 서열은, 예를 들어, 문헌[참조: Kabat et al., 1991 또는 the international ImMunoGeneTics information system(IMGT)(Lefranc et al., 2015)]에 따라 결정될 수 있다.

CH2 도메인에 LALA 돌연변이를 함유하는 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인의 서열은 LALA 돌연변이를 함유하지 않는 항체와 동일하다. 예를 들어, 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271의 VH 및 VL 서열은 항체 FS22-172-003/FS28-256-271의 VH 및 VL 서열과 동일하다. 마찬가지로, CH2 도메인에 LALA 돌연변이를 함유하는 항체의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3은 LALA 돌연변이를 포함하지 않는 항체와 동일하다. 예를 들어, 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 항체 FS22-172-003/FS28-256-271의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열과 동일하다.

IMGT 넘버링에 따르는 항체 분자의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 항체 분자의 VH 도메인의 위치 27-38, 56-65 및 105-117에 위치된 서열일 수 있다.

카바트 넘버링에 따르는 항체 분자의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 VH 도메인의 31-35, 50-65 및 95-102 위치에 위치된 서열일 수 있다.

IMGT 넘버링에 따르는 항체 분자의 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 VL 도메인의 위치 27-38, 56-65 및 105-117에 위치된 서열일 수 있다.

카바트 넘버링에 따르는 항체 분자의 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 각각 VL 도메인의 위치 24-34, 50-56 및 89-97에 위치된 서열일 수 있다.

예를 들어, 다음의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열:

(i) 각각 서열번호 42, 33 및 44에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-271;

(ii) 각각 서열번호 14, 16 및 27에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052;

(iii) 각각 서열번호 42, 33 및 44에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-021;

(iv) 각각 서열번호 42, 33 및 44에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-012;

(v) 각각 서열번호 50, 33 및 52에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-023;

(vi) 각각 서열번호 42, 33 및 44에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-024;

(vii) 각각 서열번호 50, 33 및 52에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-026;

(viii) 각각 서열번호 42, 33 및 44에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-027;

(ix) 각각 서열번호 38, 33 및 35에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-001;

(x) 각각 서열번호 38, 33 및 35에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-005;

(xi) 각각 서열번호 46, 33 및 48에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-014;

(xii) 각각 서열번호 50, 33 및 52에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-018;

(xiii) 각각 서열번호 31, 33 및 35에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256;

(xiv) 각각 서열번호 14, 16 및 25에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-051;

(xv) 각각 서열번호 14, 16 및 29에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-053; 및

(xvi) 각각 서열번호 14, 16 및 18에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024;

여기서, 상기 CDR 서열은 IMGT 넘버링 방식에 따라 정의된다.

다음의 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열:

(i) 각각 서열번호 20, 22 및 80에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-271;

(ii) 각각 서열번호 20, 22 및 24에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052;

(iii) 각각 서열번호 20, 22 및 40에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-021;

(iv) 각각 서열번호 20, 22 및 37에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-012;

(v) 각각 서열번호 20, 22 및 40에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-023;

(vi) 각각 서열번호 20, 22 및 41에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-024;

(vii) 각각 서열번호 20, 22 및 41에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-026;

(viii) 각각 서열번호 20, 22 및 80에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-027;

(ix) 각각 서열번호 20, 22 및 40에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-001;

(x) 각각 서열번호 20, 22 및 41에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-005;

(xi) 각각 서열번호 20, 22 및 37에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-014;

(xii) 각각 서열번호 20, 22 및 37에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-018;

(xiii) 각각 서열번호 20, 22 및 37에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256;

(xiv) 각각 서열번호 20, 22 및 24에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-051;

(xv) 각각 서열번호 20, 22 및 24에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-053; 및

(xvi) 각각 서열번호 20, 22 및 24에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024;

여기서, 상기 CDR 서열은 IMGT 넘버링 방식에 따라 정의된다.

예를 들어, 다음의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열:

(i) 각각 서열번호 43, 5 및 45에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-271;

(ii) 각각 서열번호 15, 17 및 28에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052;

(iii) 각각 서열번호 43, 34 및 45에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-021;

(iv) 각각 서열번호 43, 34 및 45에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-012;

(v) 각각 서열번호 51, 34 및 53에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-023;

(vi) 각각 서열번호 43, 34 및 45에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-024;

(vii) 각각 서열번호 51, 34 및 53에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-026;

(viii) 각각 서열번호 43, 34 및 45에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-027;

(ix) 각각 서열번호 39, 34 및 36에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-001;

(x) 각각 서열번호 39, 34 및 36에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-005;

(xi) 각각 서열번호 47, 34 및 49에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-014;

(xii) 각각 서열번호 51, 34 및 53에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-018;

(xiii) 각각 서열번호 32, 34 및 36에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256;

(xiv) 각각 서열번호 15, 17 및 26에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-051;

(xv) 각각 서열번호 15, 17 및 30에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-053; 및

(xvi) 각각 서열번호 15, 17 및 19에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024;

여기서, 상기 CDR 서열은 카바트 넘버링 방식에 따라 정의된다.

다음의 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열:

(i) 각각 서열번호 21, 23 및 80에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-271;

(ii) 각각 서열번호 21, 23 및 24에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052;

(iii) 각각 서열번호 21, 23 및 40에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-021;

(iv) 각각 서열번호 21, 23 및 37에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-012;

(v) 각각 서열번호 21, 23 및 40에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-023;

(vi) 각각 서열번호 21, 23 및 41에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-024;

(vii) 각각 서열번호 21, 23 및 41에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-026;

(viii) 각각 서열번호 21, 23 및 80에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-027;

(ix) 각각 서열번호 21, 23 및 40에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-001;

(x) 각각 서열번호 21, 23 및 41에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-005;

(xi) 각각 서열번호 21, 23 및 37에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-014;

(xii) 각각 서열번호 21, 23 및 37에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256-018;

(xiii) 각각 서열번호 21, 23 및 37에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-256;

(xiv) 각각 서열번호 21, 23 및 24에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-051;

(xv) 각각 서열번호 21, 23 및 24에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024-053; 및

(xvi) 각각 서열번호 21, 23 및 24에 제시된 바와 같을 수 있는 FS22-172-003-AA/FS28-024;

CDR 기반 항원 결합 부위는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-024-052, FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-012, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-024, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027, FS22-172-003-AA/FS28-256-001, FS22-172-003-AA/FS28-256-005, FS22-172-003-AA/FS28-256-014, FS22-172-003-AA/FS28-256-018, FS22-172-003-AA/FS28-256, FS22-1각2-003-AA/FS28-024-051, FS22-172-003-AA/FS28-024-053 또는 FS22-172-003-AA/FS28-024, 바람직하게는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271 또는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052, 가장 바람직하게는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271의 VH 또는 VL 도메인, 바람직하게는 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있다.

항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-024-052, FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-012, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-024, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027, FS22-172-003-AA/FS28-256-001, FS22-172-003-AA/FS28-256-005, FS22-172-003-AA/FS28-256-014, FS22-172-003-AA/FS28-256-018, FS22-172-003-AA/FS28-256, FS22-172-003-AA/FS28-024-051, FS22-172-003-AA/FS28-024-053, 및 FS22-172-003-AA/FS28-024의 VH 도메인은 각각 서열번호 3, 58, 70, 70, 74, 70, 74, 70, 66, 66, 72, 74, 62, 56, 60, 및 12에 제시된 서열을 가질 수 있다.

항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-024-052, FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-012, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-024, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027, FS22-172-003-AA/FS28-256-001, FS22-172-003-AA/FS28-256-005, FS22-172-003-AA/FS28-256-014, FS22-172-003-AA/FS28-256-018, FS22-172-003-AA/FS28-256, FS22-172-003-AA/FS28-024-051, FS22-172-003-AA/FS28-024-053 및 FS22-172-003-AA/FS28-024의 VL 도메인은 각각 서열번호 76, 54, 68, 64, 68, 78, 78, 76, 68, 78, 64, 64, 64, 54, 54 및 54에 제시된 서열을 가질 수 있다.

항체 분자는 바람직하게는 인간 MSLN, 더욱 바람직하게는 인간 및 시노몰구스 MSLN에 결합한다. 본 발명의 항체 분자는 바람직하게는 세포의 표면에서 발현된 MSLN에 결합할 수 있다. 세포는 바람직하게는 종양 세포이다.

상기 배경 섹션에서 설명된 바와 같이, 성숙한 MSLN은 종양 세포로부터 박리되고, 종양 부위에서 제거된다. 이 박리된 MSLN은 박리된 MSLN에 결합한 후 종양 부위에서 또한 제거되는 항-MSLN 결합 분자에 대한 싱크로서 작용할 수 있다. 종양 세포의 표면에 존재하는 MSLN에 우선적으로 결합하는 분자를 선택하기 위해, 본 발명자들은 MSLN에 대한 결합력이 높은 항체 분자를 선택했다. 구체적으로, 본 발명자들은 용액 내 MSLN에 대한 것 보다 높은 친화도로 고정된 MSLN에 결합된 항체 분자를 선택하였다. 높은 결합력으로 MSLN에 결합하는 항체 분자는, 단량체 형태로 존재할 것으로 예상되는 종양 세포로부터 박리된 MSLN과 대조적으로, MSLN의 다수의 카피가 존재하고 항체 분자에 의한 2가 결합에 이용 가능할 것으로 예상되는 종양 세포에 존재하는 MSLN에 우선적으로 결합하는 것으로 생각된다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 본 발명의 항체 분자는 따라서, 종양 부위에서 덜 빨리 제거될 것으로 예상되며, 따라서, 그들의 치료 효과를 발휘하는 더 긴 시간 창을 가질 것으로 예상된다.

항체 분자는 바람직하게는 용액 내 MSLN에 대한 것 보다 높은 친화도로 고정된 MSLN에 결합한다. 고정된 MSLN은 표면 플라즈몬 공명에 사용하기 위한 칩과 같은 표면에 고정된 MSLN일 수 있다. 용액 내 MSLN은 본원에서 가용성 MSLN이라고 지칭되기도 하며 고정되지 않는다. 가용성 MSLN은 바람직하게는 단량체 형태, 즉 단량체성 메소텔린이다.

동족체 항원에 대한 항체의 친화도는 항체가 상기 항원과 상호 작용하는 평형 해리 상수(K_D)로 표현될 수 있다. K_D 값이 높을수록 항원에 대한 항체 분자의 친화도는 낮아진다.

항체 분자는 바람직하게는 9nM, 8nM, 7nM 또는 6nM의 친화도(K_D) 또는 더 높은 친화도로 고정된 MSLN에 결합한다. 바람직하게는, 항체 분자는 7nM, 또는 6nM의 K_D 또는 더 낮은 K_D 값으로 고정된 MSLN에 결합한다.

항체 분자는 바람직하게는 15nM의 친화도(K_D)로, 또는 더 낮은 친화도로 용액 내 MSLN에 결합한다. 보다 바람직하게는, 항체 분자는 16nM, 17nM 또는 18nM의 친화도(K_D) 또는 더 낮은 친화도로 고정된 MSLN에 결합한다.

바람직한 구현예에서, 항체 분자는 6nM의 친화도(K_D) 또는 더 높은 친화도로 고정된 MSLN에 결합하고, 18nM의 친화도(K_D) 또는 더 낮은 친화도로 용액 내 MSLN에 결합한다.

표면 결합된 MSLN을 포함하는 세포에 대한 항체 분자의 결합 친화도는 세포에 대한 항체 분자의 절반-최대 결합(EC₅₀)을 달성하는 데 필요한 항체 분자의 농도를 결정함으로써 측정될 수 있다. 세포에 대한 항체 분자의 절반-최대 결합을 달성하는 데 필요한 항체 분자의 농도를 결정하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 실시예에 개시되어 있다(예를 들어, 실시예 7 참조). 상기 설명된 바와 같이, 표면 결합된 MSLN을 포함하는 종양 세포에 대한 결합이 가용성 MSLN의 존재에 의해 영향을 받지 않거나 덜 영향을 받는 항체 분자가 종양 환경에서 박리된 MSLN의 존재의 관점에서 바람직하다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 20nM 가용성 MSLN의 존재하에 표면 결합된 MSLN을 포함하는 세포(예: 종양 세포)에 대한 항체의 절반-최대 결합(EC₅₀)을 달성하는 데 필요한 항체 분자의 농도는 가용성 MSLN의 부재하에 세포에 대한 항체의 절반-최대 결합(EC₅₀)을 달성하는 데 필요한 항체 분자의 농도보다 20배 미만, 15배 미만, 10배 미만, 9배 미만, 8배 미만, 7배 미만, 6배 미만, 5배 미만, 4배 미만 또는 3배 미만 더 높다.

MSLN에 대한 MUC16의 결합을 차단하지 않는 항체 분자의 세포 결합된 MSLN을 포함하는 세포에 대한 결합은 가용성 MSLN의 존재에 의해 영향을 덜 받는 것으로 나타났다. 따라서, MSLN에 대한 MUC16의 결합을 차단할 수 없거나 차단하지 않는 항체 분자가 바람직할 수 있다.

고정된 MSLN은 서열번호 142에 제시된 서열을 가질 수 있다. 용액 내 MSLN은 서열번호 142에 제시된 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 항체 분자는 또한 시노몰구스 MSLN에 결합하는 것으로 나타났다. 이것은 인간에서 항체 분자의 효능 및 독성을 예측할 수 있는 시노몰구스 원숭이에서 항체 분자에 의한 효능 및 독성 연구를 수행하는 데 유익한 것으로 생각된다.

항체 분자는 유사한 친화도로 고정된 인간 MSLN 및 고정된 시노몰구스 MSLN에 결합할 수 있다. 또한, 항체 분자는 유사한 친화도로 용액 내 인간 MSLN 및 용액 내 시노몰구스 MSLN에 결합할 수 있다. 이것은 시노몰구스 원숭이에서 항체 분자로 수행된 효능 및 독성 연구가 인간에서 항체 분자의 효능 및 독성을 예측하는지를 보장하는 데 유익한 것으로 생각된다.

따라서, 바람직한 구현예에서, 항체 분자는 항체 분자가 고정된 인간 MSLN에 결합하는 친화도의 10배 이하, 바람직하게는 5배 이하, 더욱 바람직하게는 3배 이하 더 낮은 또는 더 높은 친화도로 고정된 시노몰구스 MSLN에 결합한다. 또한, 항체 분자는 바람직하게는 항체 분자가 용액 내 인간 MSLN에 결합하는 친화도의 10배 이하, 바람직하게는 5배 이하, 더욱 바람직하게는 2배 이하 더 낮은 또는 더 높은 친화도로 용액 내 시노몰구스 MSLN에 결합한다.

항체 분자는 리간드 결합에 대해 다양한 활성을 갖는 것으로 나타났다. 예를 들어, 항체 분자는 MSLN에 대한 MUC16의 결합을 차단할 수 있거나 차단할 수 없을 수 있다.

항체 분자는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-024-051, FS22-172-003-AA/FS28-024-052, FS22-172-003-AA/FS28-024-053, 또는 FS22-172-003-AA/FS28-024 또는 이의 변이체의 CDR 1-6, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 항체 분자는 MSLN에 대한 MUC16의 결합을 차단한다.

대안적으로, 항체 분자는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-012, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-024, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027, FS22-172-003-AA/FS28-256-001, FS22-172-003-AA/FS28-256-005, FS22-172-003-AA/FS28-256-014, FS22-172-003-AA/FS28-256-018, 또는 FS22-172-003-AA/FS28-256 또는 이의 변이체의 CDR 1-6, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 항체 분자는 MSLN에 대한 MUC16의 결합을 차단하지 않는다.

MSLN에 대한 MUC16의 결합을 차단하는 항체 분자의 능력을 결정하는 데 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, ELISA 및 세포 기반 검정, 예를 들어, 항체가 MSLN을 발현하는 세포, 예를 들어, NCI-H226 세포에 대한 결합을 위해 MUC16과의 결합에 대해 경쟁하는 검정을 포함한다.

본 발명의 항체 분자는 CD137 항원 결합 부위를 포함한다. CD137 항원 결합 부위는 항체 분자의 불변 도메인, 바람직하게는 CH3 도메인에 위치된다. CD137 항원 결합 부위는 항체 분자의 불변 도메인에 하나 이상의 변형된 구조 루프를 포함한다. 표적 항원에 대한 항원 결합 부위를 생성하기 위한 항체 불변 도메인 구조 루프를 조작하는 것은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌(참조: Wozniak-Knopp G et al.(2010) Protein Eng Des. 23(4): 289-297; WO2006/072620 및 WO2009/132876)에 기재되어 있다. 본 발명의 항체 분자에 포함된 CD137 불변 도메인 항원 결합 부위는 광범위한 선택 및 친화도 성숙 프로그램에 따라 동정되었으며, 단량체성 인간 CD137보다는 이량체성 인간 CD137에 우선적으로 결합한다.

항체 분자의 CD137 항원 결합 부위는 제1 및 제2 서열을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 서열은 각각 항체 분자의 불변 도메인, 바람직하게는 CH3 도메인의 AB 및 EF 구조 루프에 위치된다. 제1 서열 및 제2 서열은 바람직하게 각각 서열번호 10 및 11에 제시된 FS22-172-003의 제1 및 제2 서열이다. 제1 및 제2 서열은 바람직하게는 각각 항체 분자의 CH3 도메인의 위치 14와 17, 및 위치 91와 99 사이에 위치되며, 여기서 잔기 넘버링은 IMGT 넘버링에 따른다.

항체 분자의 CD 루프 서열은 바람직하게는 변형되지 않는다, 즉 야생형이다. 따라서, CD 루프 서열은 바람직하게는 서열번호 157에 제시된 서열을 갖는다. CD 루프 서열은 바람직하게는 항체 분자의 CH3 도메인의 위치 43 내지 78에 위치되며, 여기서 잔기 넘버링은 IMGT 넘버링에 따른다.

바람직한 구현예에서, 항체 분자는 서열번호 8에 제시된 FS22-172-003의 CH3 도메인 서열을 포함하거나, 갖거나 이로 구성되는 CH3 도메인을 포함한다.

항체 분자의 CH3 도메인은 CH3 도메인 서열의 가까운 C-말단에 추가의 리신 잔기(K)를 임의로 포함할 수 있다.

모노클로날 및 기타 항체를 취하고 재조합 DNA 기술의 기술을 사용하여 원래 항체의 특이성을 유지하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산할 수 있다. 이러한 기술은 CDR 또는 가변 영역을 상이한 면역글로불린으로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 하나의 면역글로불린의 CDR의 다른 면역글로불린으로의 도입은, 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 및 EP-A-239400에 기재되어 있다. 유사한 기술을 사용 하여 본 발명에 따르는 항체 분자의 CD137 항원 결합 부위를 구성하는 불변 도메인 서열을 또 다른 항체 분자의 불변 도메인, 예를 들어, CH3 도메인에 도입함으로써, 불변 도메인에 CD137 항원 결합 부위를 포함하는 항체 분자를 유도할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자의 전체 불변 도메인 서열은 본 발명에 따르는 항체 분자의 불변 도메인 서열로 대체되어 불변 도메인에 CD137 항원 결합 부위를 포함하는 항체 분자를 제조할 수 있다. 유사하게, 항체 분자의 불변 도메인 서열의 단편은 CD137 항원 결합 부위를 포함하는 본 발명에 따르는 항체 분자의 불변 도메인 서열의 상응하는 단편으로 대체될 수 있다.

항체 분자는 바람직하게는 인간 CD137, 더 바람직하게는 인간 및 시노몰구스 CD137, 더욱 더 바람직하게는 이량체성 인간 및 시노몰구스 CD137에 결합한다. 항체 분자에 의해 결합된 CD137 부분은 바람직하게는 CD137 세포외 도메인이다. 인간 및 시노몰구스 CD137의 세포외 도메인은 각각 서열번호 149 및 153에 제시된 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 항체 분자는 바람직하게는 세포 표면에서 발현된 CD137에 결합할 수 있다. 세포는 바람직하게는 면역 세포, 예를 들어, CD8⁺ 또는 CD4⁺ T 세포 또는 조절 T(Treg) 세포, 바람직하게는 CD8⁺ T 세포, 또는 B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해 T(NKT) 세포, 수지상 세포(DC) 또는 종양 침윤성 림프구(TIL)이다.

상기 배경 섹션에서 설명된 바와 같이, 항-CD137 항체 우렐루맙에 의한 환자의 치료는 용량 제한 고급 간 염증과 관련되었다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 우렐루맙 치료로 나타나는 간 염증은 간에 존재하는 T 세포의 활성화 또는 환자의 간에서 활성화된 T 세포의 침윤 및 축적으로 인한 것일 수 있다고 생각된다. 간 염증이 감소되거나 없는 분자를 선택하기 위해, 본 발명자들은 CD137에 대한 높은 결합력을 갖는 Fcab를 선택했다. 구체적으로, 본 발명자들은 단량체성 CD137보다 더 높은 친화도로 이량체성 CD137에 결합된 Fcab를 선택했다. T 세포에 의한 CD137의 발현은 프라이밍 및 활성화시 상향 조절된다. 활성화된 T 세포에서 CD137의 더 높은 발현으로 인해 CD137은 이러한 세포 표면에서 이량체, 삼량체 및 고차 다량체의 형태로 존재할 것으로 생각된다. 대조적으로, 비활성 T 세포에 의한 CD137 발현은 낮거나 심지어 검출 불가능하게 발현된다. 따라서, CD137은 이러한 T 세포의 표면에서 전혀 발현되지 않는 한 단량체 형태일 가능성이 높다고 생각된다. 따라서, 높은 결합력으로 CD137에 결합하는 CD137/MSLN mAb²는 간에 존재하는 비활성 T 세포와 같은 비활성 T 세포와 대조적으로 활성화된 T 세포에 우선적으로 결합하는 것으로 생각되고, 따라서 간 염증이 감소되거나 전혀 나타나지 않는다. 이러한 기대는 항-마우스 CD137/MSLN mAb²로 처리된 마우스의 간 약리학을 결정함으로써 확인되었으며, 이는 치료가 간독성을 초래하지 않았음을 보여 주었다(실시예 13).

항체 분자는 바람직하게는 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10nM, 5nM, 4nM, 3nM, 또는 2nM의 친화도(K_D), 또는 더 큰 친화도로 이량체성 인간 CD137에 결합한다.

바람직한 구현예에서, 항체 분자는 단량체성 CD137보다 높은 친화도로 이량체성 CD137에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 항체 분자는 단량체성 CD137에 대한 항체 분자의 친화도보다 적어도 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 110배, 120배, 130배, 140배, 150배, 160배, 170배 또는 200배 더 높은 친화도로 이량체성 CD137에 결합한다.

단량체성 인간 CD137은, 예를 들어, 서열번호 149에 제시된 서열을 가질 수 있다.

FS22-172 계통의 항체 분자는 또한 이량체성 시노몰구스 CD137에 결합하는 것으로 나타났다. 인간 CD137뿐만 아니라 시노몰구스 CD137에 대한 결합은 인간에게 투여하기 전에 효능 및 독성에 대해 시노몰구스 원숭이에서 항체 분자의 테스트를 허용하기 때문에 유익하다.

바람직한 구현예에서, 항체 분자는 250nM, 200nM, 150nM, 140nM, 120nM, 100nM, 90nM, 80nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10nM, 5nM, 4nM, 3nM 또는 2nM의 친화도(K_D) 또는 더 큰 친화도로 이량체성 시노몰구스 CD137에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항체 분자는 2nM의 친화도(K_D) 또는 더 큰 친화도로 시노몰구스 CD137에 결합한다.

항체 분자는 유사한 친화도로 이량체성 인간 CD137 및 이량체성 시노몰구스 CD137에 결합할 수 있다. 이것은 시노몰구스 원숭이에서 항체 분자로 수행된 효능 및 독성 연구가 인간에서 항체 분자의 효능 및 독성을 예측함을 보장하는 데 유익한 것으로 생각된다.

따라서, 바람직한 구현예에서, 항체 분자는 항체 분자가 이량체성 인간 CD137에 결합하는 친화도의 10배 이하, 바람직하게는 5배 이하 더 낮거나 더 높은 친화도로 이량체성 시노몰구스 CD137에 결합한다.

인간 또는 시노몰구스 CD137과 같은 동족체 항원에 대한 항체 분자의 결합 친화도는, 예를 들어, Biacore와 같은 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정될 수 있다.

항체 분자는 CD137와 이의 리간드, CD137L, 바람직하게는 인간 CD137과 인간 CD137L 사이의 상호 작용을 차단할 수 있다. CD137에 대한 CD137L의 결합을 차단하는 항체 분자의 능력은 ELISA를 사용하여 결정될 수 있다.

또한, 항체 분자는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자의 CH2 도메인과 같은 면역글로불린 G 분자의 CH2 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체 분자는 IgG1 분자의 CH2 도메인을 포함한다. CH2 도메인은 서열번호 154에 제시된 서열을 가질 수 있다. CH2 도메인은 Fcγ 수용체 및 보체에 결합하는 것으로 공지되어 있다. Fcγ 수용체에 대한 CH2 도메인의 결합은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)이 필요한 반면, 보체에 대한 결합은 보체 의존성 세포 독성(CDC)이 필요하다.

항체 분자의 CH2 도메인은 바람직하게는 하나 이상의 Fcγ 수용체, 예를 들어, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII, 및/또는 보체에 대한 CH2 도메인의 결합을 감소시키거나 폐지하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 본 발명자들은 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키거나 제거하는 것이 항체 분자에 의해 매개되는 ADCC를 감소시키거나 제거할 것이라고 가정한다. 유사하게, 보체에 대한 결합을 감소 또는 폐지하는 것은 항체 분자에 의해 매개되는 CDC를 감소 또는 제거할 것으로 예상된다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 이는 항체 분자가 환자에게 투여될 때 간 염증을 감소시키거나 회피할 것으로 기대된다. 하나 이상의 Fcγ 수용체 및/또는 보체에 대한 CH2 도메인의 결합을 감소시키거나 폐지하는 돌연변이는 당업계에 공지되어 있다(Wang et al., 2018). 이러한 돌연변이에는 CH2 도메인의 위치 1.3 및 1.2에서 류신 잔기의 알라닌으로의 치환(L1.3A 및 L1.2A)을 포함하는, 문헌[참조: Bruhns et al., 2009 및 Hezareh et al., 2001]에 기재되어 있는 "LALA 돌연변이"가 포함된다. 대안적으로, CH2 도메인의 위치 84.4에서 아파라긴(N)을 알라닌, 글리신 또는 글루타민으로 돌연변이시킴으로써(N84.4A, N84.4G 또는 N84.4Q) 보존된 N-연결된 글리코실화 부위의 돌연변이를 통한 a-글리코실 항체의 생성은 또한 IgG1 이펙터 기능을 감소시키는 것으로 공지되어 있다(Wang et al., 2018). 추가의 대안으로서, 보체 활성화(C1q 결합) 및 ADCC는 CH2 도메인의 위치 114에서 프롤린의 알라닌 또는 글리신으로의 돌연변이(P114A 또는 P114G)를 통해 감소되는 것으로 공지되어 있다(Idusogie et al., 2000; Klein et al., 2016). 이들 돌연변이는 또한 ADCC 또는 CDC 활성이 추가로 감소되거나 없는 항체 분자를 생성하기 위해 조합될 수 있다.

따라서, 항체 분자는 CH2 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 CH2 도메인은

(i) 위치 1.3 및 1.2에 알라닌 잔기; 및/또는

(ii) 위치 114에 알라닌 또는 글리신; 및/또는

(iii) 위치 84.4에 알라닌, 글루타민 또는 글리신을 포함하고;

여기서, 아미노산 잔기 넘버링은 IMGT 넘버링 방식에 따른다.

바람직한 구현예에서, 항체 분자는 CH2 도메인을 포함하고, 여기서 CH2 도메인은

(i) 위치 1.3에 알라닌 잔기; 및

(ii) 위치 1.2에 알라닌 잔기를 포함하고;

여기서, 아미노산 잔기 넘버링은 IMGT 넘버링 방식에 따른다.

예를 들어, CH2 도메인은 서열번호 155에 제시된 서열을 가질 수 있다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 항체 분자는 CH2 도메인을 포함하고, 여기서 CH2 도메인은

(i) 위치 1.3에 알라닌 잔기;

(ii) 위치 1.2에 알라닌 잔기; 및

(iii) 위치 114에 알라닌을 포함하고;

여기서, 아미노산 잔기 넘버링은 IMGT 넘버링 방식에 따른다.

예를 들어, CH2 도메인은 서열번호 156에 제시된 서열을 가질 수 있다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 항체 분자는 다음 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 바람직하게는 중쇄 및 경쇄를 포함한다:

(x) 각각 서열번호 120 및 78에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-005;

(xiv) 각각 서열번호 98 및 85에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-051; (xv) 각각 서열번호 106 및 85에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-053;

또는

보다 바람직한 구현예에서, 항체 분자는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271 또는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052, 가장 바람직하게는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-의 중쇄 및/또는 경쇄, 바람직하게는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 이들 항체의 중쇄 및 경쇄 서열은 상기 제시된 바와 같다.

본 발명의 항체 분자는 또한 제1, 제2 또는 제3 서열, AB, CD 또는 EF 구조 루프 서열, CH3 도메인, CH2 도메인, CDR, VH 도메인, VL 도메인, 본원에 개시된 경쇄 및/또는 중쇄 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 적합한 변이체는 서열 변경 또는 돌연변이 및 스크리닝 방법을 통해 수득될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 변이체 서열을 포함하는 항체 분자는 MSLN 및 CD137에 대한 결합 특이성 및/또는 결합 친화도와 같은 부모 항체 분자의 기능적 특징 중 하나 이상을 보유한다. 예를 들어, 하나 이상의 변이체 서열을 포함하는 항체 분자는 바람직하게 는 (부모) 항체 분자와 동일한 친화도로 또는 더 높은 친화도로 MSLN 및/또는 CD137에 결합한다. 부모 항체 분자는 변이체 항체 분자에 도입된 아미노산 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들)을 포함하지 않는 항체 분자이다.

항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-012, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-024, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027, FS22-172-003-AA/FS28-256-001, FS22-172-003-AA/FS28-256-005, FS22-172-003-AA/FS28-256-014, FS22- 172-003-AA/FS28-256-018 또는 FS22-172-003-AA/FS28-256의 CDR 1-6, VH 도메인 및/또는 중쇄를 포함하는 항체 분자는 VH 도메인의 위치 55 또는 57에서 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 여기서 아미노산 잔기 넘버링은 IMGT 넘버링 방식에 따른다.

예를 들어, 항체 분자는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-027의 CDR 1-6의 VH 도메인 및/또는 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 상기 항체 분자는 VH 도메인의 위치 55에 아미노산 치환을 포함하고, 아미노산 잔기 넘버링은 IMGT 넘버링 방식에 따른다. 예를 들어, 본 발명의 항체 분자는 본원에 개시된 구조 루프, CH3 도메인, CH2 도메인, CDR, VH 도메인, VL 도메인, 경쇄 또는 중쇄 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 제1, 제2 또는 제3 서열, AB, CD 또는 EF 구조 루프 서열, CH3 도메인, CH2 도메인, CDR, VH 도메인, VL 도메인, 경쇄 및/또는 중쇄 서열을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 분자는 본원에 개시된 바와 같은 CH3 도메인에 대해 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 CH3 도메인 서열을 포함한다.

추가의 바람직한 구현예에서, 항체 분자는 본원에 개시된 바와 같은 CH2 도메인에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.1%, 적어도 99.2%, 적어도 99.3%, 적어도 99.4%, 적어도 99.5%, 적어도 99.6%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8%, 또는 적어도 99.9% 서열 동일성을 갖는 CH2 도메인 서열을 갖거나 포함한다.

서열 동일성은 일반적으로 알고리즘 GAP(Wisconsin GCG 패키지, Accelerys Inc, San Diego USA)를 참조하여 정의된다. GAP는 니들만 및 부니쉬 알고리즘(Needleman and Wunsch algorithm)을 사용하여 두개의 완전 서열을 정렬하여 일치 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화한다. 일반적으로, 디폴트 매개 변수가 사용되며, 갭 생성 페널티는 12이고 갭 확장 페널티는 4와 같다. GAP 사용이 바람직할 수 있지만, 다른 알고리즘, 예를 들어, 일반적으로 디폴트 매개변수를 사용하는 BLAST(문헌(Altschul et al., 1990)의 방법을 사용), FASTA(문헌(Pearson and Lipman, 1988)의 방법을 사용) 또는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘(Smith and Waterman, 1981) 또는 문헌(Altschul et al., 1990 상기)의 TBLASTN 프로그램이 사용될 수 있다. 특히 psi-Blast 알고리즘(Altschul et al., 1997)이 사용될 수 있다.

본 발명의 항체 분자는 또한 본원에 개시된 제1, 제2 또는 제3 서열, AB, CD 또는 EF 구조 루프 서열, CH3 도메인, CH2 도메인, Fcab, CDR, VH 도메인, VL 도메인, 경쇄 또는 중쇄 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 서열 변경(아미노산 잔기의 추가, 결실, 치환 및/또는 삽입), 바람직하게는 20개 이하의 변경, 15개 이하의 변경, 10개 이하의 변경, 5개 이하의 변경, 4개 이하의 변경, 3개 이하의 변경, 2개 이하의 변경 또는 1개의 변경을 갖는 제1, 제2 또는 제3 서열, AB, CD 또는 EF 구조 루프 서열, CH3 도메인, CH2 도메인, VH 도메인, VL 도메인, 경쇄 및/또는 중쇄를 포함할 수 있다. 특히, 변경은 VH 및 VL 도메인 서열 외부의 항체 분자의 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 CH3 도메인의 하나 이상의 프레임워크 영역에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 변경은 제1, 제2 및 제3 서열로서, 또는 AB, CD 또는 EF 구조 루프 서열로서 본원에 기재된 서열 외부의 CH3 도메인에 있을 수 있다.

항체 분자는 본원에 개시된 바와 같은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및/또는 VL CDR3과 비교하여 하나 이상의 아미노산 서열 변경(아미노산 잔기의 추가, 결실, 치환 및/또는 삽입), 바람직하게는 3개 이하의 변경, 2개 이하의 변경 또는 1개의 변경을 갖는 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및/또는 VL CDR3을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 분자는 본원에 개시된 CH3 도메인과 비교하여 하나 이상의 아미노산 서열 변경(아미노산 잔기의 추가, 결실, 치환 및/또는 삽입), 바람직하게는 20개 이하의 변경, 15개 이하의 변경, 10개 이하의 변경, 5개 이하의 변경, 4개 이하의 변경, 3개 이하의 변경, 2개 이하의 변경 또는 1개의 변경을 갖는 CH3 도메인 서열을 포함할 수 있다.

하나 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 바람직한 구현예에서, 치환은, 예를 들어, 하기 표에 따라 보존적 치환일 수 있다. 일부 구현예에서, 중간 컬럼에서 동일한 카테고리의 아미노산이 서로 치환된다, 즉, 비극성 아미노산은, 예를 들어, 다른 비극성 아미노산으로 치환된다. 일부 구현예에서, 가장 오른쪽 컬럼에서 동일한 라인에 있는 아미노산이 서로 치환된다.

일부 구현예에서, 치환(들)은 기능적으로 보존적일 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 치환은 등가의 비치환된 항체 분자와 비교하여 치환을 포함하는 항체 분자의 하나 이상의 기능적 특성(예: 결합 친화도)에 영향을 미치지 않을 수 있다(또는 실질적으로 영향을 미치지 않을 수 있다).

본 발명의 항체 분자는 바람직하게는 항체 분자가 가교결합되지 않은 경우보다 항체 분자가, 예를 들어, MSLN에 대한 결합을 통해 가교결합될 때 증가된 T 세포 활성화를 유도한다.

T 세포를 활성화하는 항체 분자의 능력은 T 세포 활성화 검정을 사용하여 측정될 수 있다. T 세포는 활성화시 IL-2를 방출한다. 따라서, T 세포 활성화 검정은 항체 분자 또는 항체 분자에 의해 유도된 T 세포 활성화의 수준을 결정하기 위해 IL-2 방출을 측정할 수 있다.

예를 들어, T 세포를 활성화하는 항체 분자의 능력은 항체 분자가 가교결합될 때 T 세포 활성화 검정에서 T 세포에 의한 IL-2의 절반-최대 방출을 달성하는 데 필요한 항체 분자의 농도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 이는 아래 항체 분자의 EC₅₀으로서 언급된다. 더 낮은 EC₅₀은 항체 분자의 더 낮은 농도가 T 세포 활성화 검정에서 T 세포에 의한 IL-2의 절반-최대 방출을 달성하는데 필요하고, 따라서 항체 분자가 더 높은 T 세포 활성화 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 항체 분자는, 예를 들어, 항-CH2 항체를 사용하여 가교결합될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 항체 분자는 T 세포 활성화 검정에서 동일 검정에서의 FS22-172-003-AA/FS28-256-271 또는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052의 EC₅₀의 10배, 5배, 4배, 3배 또는 2배 이내인 EC₅₀을 갖는다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 항체 분자는 T 세포 활성화 검정에서 동일 검정에서의 FS22-172-003-AA/FS28-256-271 또는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052의 EC₅₀의 10배, 5배, 4배, 3배 또는 2배 이내인 EC₅₀을 갖는다.

예를 들어, 항체 분자는 T 세포 활성화 검정에서 5nM 이하, 4nM 이하, 3nM 이하, 2nM 이하, 1nM 이하 또는 0.5nM 이하의 EC₅₀을 가질 수 있다.

추가로, 또는 대안적으로, T 세포를 활성화하는 항체 분자의 능력은 항체 분자의 존재하에 T 세포 활성화 검정에서 T 세포에 의해 방출되는 IL-2의 최대 농도를 측정함으로써 결정될 수 있으며, 여기서 항체 분자는 가교결합된다.

바람직한 구현예에서, 가교결합의 존재하의 항체 분자의 존재하에 T 세포 활성화 검정에서 T 세포에 의해 방출되는 IL-2의 최대 농도는 동일한 검정에서 FS22-172-003-AA/FS28-256-271 또는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052의 존재하에 T 세포에 의해 방출된 IL-2의 최대 농도의 3배, 2배 또는 1.5배 이내이다.

T 세포 활성화 검정은 본 실시예에 기재된 바와 같이, CD8⁺ T 세포 검정과 같은 본원에 기재된 바와 같은 T 세포 검정일 수 있다(예를 들어, 실시예 8 참조).

예를 들어, T 세포 활성화 검정은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 단리된 CD8⁺ T 세포에 기반한 IL-2 방출 검정일 수 있다. 예를 들어, T 세포 활성화 검정은 백혈구 결실 추체로부터 인간 PBMC를 단리시킴을 포함할 수 있다. PBMC를 단리시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 실시예에 기재되어 있다. 이어서, CD8⁺ T 세포는 PBMC로부터 단리될 수 있다. PBMC로부터 CD8⁺ T 세포를 단리하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 실시예에 기재되어 있다.

이어서, CD8⁺ T 세포를 항-인간 CD3 항체로 코팅된 다중 벽 플레이트에 첨가할 수 있다. 각 시험 항체 분자의 적절한 희석액을 제조하여 웰에 첨가할 수 있다. 이어서, T 세포는 테스트 항체와 함께 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 배양될 수 있다. 상청액에서 IL-2의 농도를 결정하기 위해 상청액이 수집되고 검정될 수 있다. 용액에서 IL-2의 농도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 본 실시예에 기재되어 있다. 인간 IL-2의 농도는 항체 분자의 로그 농도에 대해 플롯팅될 수 있다. 생성되는 곡선은 로그 (작용제) 대 반응 방정식을 사용하여 적합화될 수 있다.

항체 분자는 생리활성 분자 또는 검출 가능한 표지에 접합될 수 있다. 이 경우, 항체 분자는 접합체로서 지칭될 수 있다. 이러한 접합체는 본원에 기재된 질환의 치료 및/또는 진단에 적용된다.

예를 들어, 생리활성 분자는 사이토카인, 바람직하게는 인간 사이토카인과 같은 면역계 조절제일 수 있다. 예를 들어, 사이토카인은 T 세포 활성화 및/또는 증식을 자극하는 사이토카인일 수 있다. 항체 분자에 접합하기 위한 사이토카인의 예에는 IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, GM-CSF 및 IFN-감마가 포함된다.

대안적으로, 생리활성 분자는 리간드 트랩, 예를 들어, 사이토카인, 예를 들어, TGF-베타 또는 IL-6의 리간드 트랩일 수 있다.

추가의 대안으로서, 생리활성 분자는 CD137L, OX40L, TRAIL, CD40L, CD27L 또는 GITRL과 같은 리간드일 수 있다.

추가의 대안으로서, 생리활성 분자는 튜불린 중합 억제제(예: 오리스타틴), 튜불린 탈중합제(예: 메이탄신), DNA 가닥 절단 유도제(예: 칼리케아마이신), DNA 알킬화제(예: 듀오카르마이신) 또는 RNA 폴리머라제 억제제(예: 알파-아마니틴)와 같은 약물일 수 있다.

항체 분자에 접합될 수 있는 적합한 검출 가능한 표지는 당업계에 공지되어 있으며, 방사성 동위 원소, 예를 들어, 요오드-125, 요오드-131, 이트륨-90, 인듐-111 및 테크네튬-99; 형광 색소, 예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린, 텍사스 레드 및 시아닌 염료 유도체, 예를 들어, Cy7 및 Alexa750; 발색성 염료, 예를 들어, 디아미노벤지딘; 라텍스 비드; 효소 표지, 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제; 스펙트럼으로 단리된 흡수 또는 방출 특성을 갖는 인광체 또는 레이저 염료; 및 특정 동족체 검출 가능한 잔기, 예를 들어, 표지된 아비딘에 대한 결합을 통해 검출될 수 있는 화학적 잔기, 예를 들어, 비오틴을 포함한다.

항체 분자는 이황화물 또는 펩티드 결합과 같은 임의의 적합한 공유 또는 비공유 결합에 의해 생리활성 분자 또는 검출 가능한 표지에 접합될 수 있다. 생리활성 분자가 사이토카인인 경우, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 항체 분자에 연결될 수 있다. 적합한 펩티드 링커는 당업계에 공지되어 있으며, 5 내지 25개, 5 내지 20개, 5 내지 15개, 10 내지 25개, 10 내지 20개, 또는 10 내지 15개의 아미노산 길이일 수 있다.

일부 구현예에서, 생리활성 분자는 절단 가능한 링커에 의해 항체 분자에 접합될 수 있다. 링커는 치료 부위에서 항체 분자로부터 생리활성 분자의 방출을 허용할 수 있다. 링커는 아미드 결합(예: 펩티드 링커), 이황화 결합 또는 하이드라존을 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커는 부위 특이적 프로테아제에 의해 절단될 수 있고, 이황화 결합은 세포질의 환원 환경에 의해 절단될 수 있으며, 하이드라존은 산 매개 가수분해에 의해 절단될 수 있다.

접합체는 항체 분자 및 생리활성 분자를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 이 경우, 생리활성 분자는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합에 의해 항체 분자에 접합될 수 있다. 항체 분자가 다중 쇄 분자인 경우, 예를 들어, 항체 분자가 Fcab이거나 이를 포함하거나 mAb²인 경우, 생리활성 분자는 항체 분자의 하나 이상의 쇄에 접합될 수 있다. 예를 들어, 생리활성 분자는 mAb² 분자의 중쇄 중 하나 또는 둘 모두에 접합될 수 있다. 융합 단백질은 생산 및 정제하기가 더 용이하여 임상 등급 물질의 생산을 촉진시키는 이점을 갖는다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체 분자를 인코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 분자들을 제공한다. 당업자는 당업계에 익히 공지된 방법을 사용하여 이러한 핵산 분자를 제조하는 데 어려움이 없을 것이다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 핵산 분자(들)는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-024-052, FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-012, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-024, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027, FS22-172-003-AA/FS28-256-001, FS22-172-003-AA/FS28-256-005, FS22-172-003-AA/FS28-256-014, FS22-172-003-AA/FS28-256-018, FS22-172-003-AA/FS28-256, FS22-172-003-AA/FS28-024-051, FS22-172-003-AA/FS28-024-053 또는 FS22-172 -003-AA/FS28-024, 바람직하게는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271 또는 FS22-172-003-AA/FS28-024-052, 가장 바람직하게는 항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271의 중쇄 및/또는 경쇄, 바람직하게는 중쇄 및 경쇄를 인코딩한다.

항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-024-052, FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-012, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-024, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027, FS22-172-003-AA/FS28-256-001, FS22-172-003-AA/FS28-256-005, FS22-172-003-AA/FS28-256-014, FS22-172-003-AA/FS28-256-018, FS22-172-003-AA/FS28-256, FS22-172-003-AA/FS28-024-051, FS22-172-003-AA/FS28-024-053 및 FS22-172-003-AA/FS28-024의 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자는 각각 서열번호 4, 103, 126, 126, 134, 126, 134, 126, 121, 121, 130, 134, 115, 99, 107 및 95에 제시된다.

항체 FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-024-052, FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-012, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-024, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027, FS22-172-003-AA/FS28-256-001, FS22-172-003-AA/FS28-256-005, FS22-172-003-AA/FS28-256-014, FS22-172-003-AA/FS28-256-018, FS22-172-003-AA/FS28-256, FS22-172-003-AA/FS28-024-051, FS22-172-003-AA/FS28-024-053 및 FS22-172-003-AA/FS28-024의 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자는 각각 서열번호 91, 86, 122, 117, 122, 90, 90, 91, 122, 90, 117, 117, 117, 86, 86 및 86에 제시된다.

핵산이 본 발명의 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 경우, 2개의 도메인 또는 쇄는 2개의 개별적 핵산 분자에서 인코딩될 수 있다.

단리된 핵산 분자는 본 발명의 항체 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 핵산은 일반적으로 발현을 위한 재조합 벡터의 형태로 제공될 것이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 프로모터 서열, 종결자 단편, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 기타 적절한 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현을 유도하는 적절한 조절 서열을 함유한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 예를 들어, 적절한 경우 파지 또는 파지미드일 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 또는 벡터는 숙주 세포에 도입될 수 있다. 숙주 세포로 핵산 또는 벡터를 도입하는 기술은 당업계에서 잘 확립되어 있으며, 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다. 재조합 항체 분자의 생산에 적합한 다양한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있으며, 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 숙주 세포를 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 CHO, NS0 또는 HEK 세포, 예를 들어, HEK293 세포와 같은 포유류 세포이다.

본 발명의 또 다른 측면은 숙주 세포에서 항체 분자를 인코딩하는 핵산을 발현하고, 임의로 이렇게 생성된 항체 분자를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 분자를 생산하는 방법을 제공한다. 숙주 세포를 배양하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 상기 방법은 항체 분자를 단리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 재조합 항체 분자의 정제 기술은 당업계에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 L을 사용하는 HPLC, FPLC 또는 친화도 크로마토그래피를 포함한다. 일부 구현예에서, 정제는 항체 분자에서 친화도 태그를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 또한 항체 분자를 임의로 하기 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 다른 물질과 함께 약제학적 조성물로 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 설명된 바와 같이, MSLN은 종양 세포의 표면에서 발현되며, 가용성 MSLN의 높은 발현 수준은 여러 암에서 불량한 예후와 상관 관계가 있다. 항-MSLN 항체는 항암 치료제로서 조사되었다. 이러한 항-MSLN 항체는 ADCC 활성을 통해 직접 세포 사멸을 유도하거나 ADC 형태로 사용된다.

따라서, 본원에 기재된 항체 분자는 암의 치료에 적용될 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 관련 측면은 다음을 제공한다:

(i) 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 항체 분자,

(ii) 개체에서 암의 치료에 사용하기 위한 의약을 제조하는 데 있어서 본원에 기재된 항체 분자의 용도; 및

(iv) 개체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 본원에 기재된 바와 같은 치료적 유효량의 항체 분자를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료 방법.

개체는 환자, 바람직하게는 인간 환자일 수 있다.

본 발명의 항체 분자는 가용성 MSLN과 비교하여 암 세포 표면에 존재하는 MSLN에 우선적으로 결합하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 항체 분자를 사용하여 치료될 암은 바람직하게는 MSLN을 발현하거나 발현하는 것으로 결정되었다. 보다 바람직하게는, 치료될 암 세포는 세포 표면에 MSLN을 포함하거나 포함하는 것으로, 즉 세포 표면 결합된 MSLN을 포함하는 것으로 결정되었다.

암은 바람직하게는 CD137을 발현하는 종양 침윤성 림프구(TIL)를 포함하거나 이를 포함하는 것으로 결정되었다. 구체적으로, TIL은 바람직하게는 세포 표면에 CD137을 포함하거나 포함하는 것으로 결정되었다.

세포 표면에서 항원의 존재를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 유세포 분석을 포함한다.

암은 원발성 또는 2차 암일 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 분자는 개체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것일 수 있으며, 여기서 암은 원발성 종양 및/또는 종양 전이이다.

본 발명의 항체 분자를 사용하여 치료될 암은 고형 암일 수 있다.

암은 중피종(mesothelioma), 췌장암(pancreatic cancer), 난소암(ovarian cancer), 폐암(lung cancer)(예: 소세포 폐암(small-cell lung cancer) 및 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)), 식도암(oesophageal cancer), 유방암(breast cancer), 위암(gastric cancer), 담관암종(cholangiocarcinoma), 결장암(colon cancer), 흉선 암종(thymic carcinoma), 자궁 내막암(endometrial cancer), 두경부암(head and neck cancer), 육종(sarcoma)(예: 2상 활액 육종(biphasic synovial sarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 골 형성 육종(osteogenic sarcoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 또는 연조직 육종(soft-tissue sarcoma)), 탈형성 작은 원형 세포 종양(desmoplastic small round cell tumours), 백혈병(leukaemia)(예: 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukaemia), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia), 급성 과립구성 백혈병(acute granulocytic leukaemia), 만성 과립구성 백혈병(chronic granulocytic leukaemia), 모발 세포 백혈병(hairy cell leukaemia), 또는 골수성 백혈병(myeloid leukaemia)), 부신 피질암(adrenal cortex cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌암(brain cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁경부 과형성(cervical hyperplasia), 고환 융모막 암종(testicular choriocarcinoma), 본태성 혈소판증가증(essential thrombocytosis), 비뇨 생식기 암종(genitourinary carcinoma), 신경교종(glioma), 교아세포종(glioblastoma), 림프종(lymphoma)(예: 호지킨병(Hodgkin's disease) 또는 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)), 악성 카르시노이드 암종(malignant carcinoid carcinoma), 악성 고칼슘혈증(malignant hypercalcemia), 흑색종(melanoma)(악성 흑색종(malignant melanoma)으로서 지칭되기도 함), 악성 췌장 인슐린종(malignant pancreatic insulinoma), 수질 갑상선 암종(medullary thyroid carcinoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 균상식육종(mycosis fungoides), 신경모세포종(neuroblastoma), 진성 다혈구증(polycythemia vera), 원발성 뇌 암종(primary brain carcinoma), 원발성 거대글로불린혈증(primary macroglobulinemia), 전립선암(prostate cancer), 신장 세포암(renal cell cancer), 피부암(skin cancer), 편평 세포암(squamous cell cancer), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 및 윌름즈 종양(Wilms' tumor)으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

바람직하게는, 암은 중피종, 췌장암, 난소암, 폐암, 식도암, 유방암, 위암, 담관암종, 결장암, 흉선 암종, 자궁 내막암, 두경부암, 2상 활액 육종, 및 탈형성 작은 원형 세포 종양으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

보다 바람직하게는, 암은 중피종, 췌장암, 난소암 및 폐암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

암은 악성 암 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 한다. 유방암과 같은 특정 유형의 암이 언급되는 경우, 이는 유방 조직과 같은 관련 조직의 악성 세포의 비정상적 증식을 지칭한다. 유방에 위치되지만 난소 조직과 같은 다른 조직의 악성 세포의 비정상적 증식 결과인 2차 암은 본원에서 언급된 바와 같은 유방암이 아니라 난소암이다.

암의 맥락에서, 치료는 완전한 암 관해를 포함한 암 성장의 억제 및/또는 암 전이의 억제뿐만 아니라 암 재발의 억제를 포함할 수 있다. 암 성장은 일반적으로 암 내에서 더 발달된 형태로의 변화를 나타내는 여러 지표 중 어느 하나를 지칭한다. 따라서, 암 성장의 억제를 측정하기 위한 지표에는 암 세포 생존율의 감소, 종양 용적 또는 형태의 감소(예: 컴퓨터 단층 촬영(CT), 초음파 검사 또는 기타 영상 방법을 사용하여 결정됨), 종양 성장 지연, 종양 혈관 구조의 파괴, 지연된 과민성 피부 테스트의 성능 향상, 항암 면역 세포 또는 기타 항암 면역 반응의 활성 증가, 및 종양 특이적 항원 수준의 감소가 포함된다. 개체에서 암성 종양에 대한 면역 반응을 활성화하거나 향상시키는 것은 개체의 암 성장, 특히 대상체에 이미 존재하는 암의 성장에 저항하는 능력을 향상시키고/시키거나 개체에서 암 성장 성향을 감소시킬 수 있다.

항체 분자는 단독으로 투여될 수 있지만, 항체 분자는 일반적으로 항체 분자 이외에 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 항체 분자를 약제학적 조성물로 제형 화하는 단계를 포함하는 방법도 또한 제공된다.

약제학적 조성물은 항체 분자 이외에 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충액, 안정화제 또는 당업자에게 익히 공지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는"은 정상적인 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 대상체(예: 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한, 합리적인 이익/위험 비율에 비례하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태에 관한 것이다. 각 담체, 부형제 등은 제형의 다른 성분과 양립할 수 있다는 의미에서 또한 "허용가능"해야 한다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 특성은 투여 경로에 따라 달라질 것이며, 이는 주입, 주사 또는 이하 논의되는 바와 같은 임의의 다른 적합한 경로일 수 있다.

예를 들어, 주사에 의한 비경구, 예를 들어, 피하 또는 정맥내 투여의 경우, 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트화 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 충분히 제조할 수 있다. 완충액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 산화방지제, 예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제(예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3'-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 복합체(예: Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하여 필요로 따라 방부제, 안정화제, 완충액, 산화방지제 및/또는 다른 첨가제가 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 항체 분자는 투여 전에 재구성을 위해 동결 건조된 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 동결 건조된 항체 분자는 멸균수에서 재구성되고, 개체에게 투여하기 전에 식염수와 혼합될 수 있다.

투여는 "치료적 유효량"일 수 있고, 이는 개체에게 이익을 보여주기에 충분하다. 실제 투여량, 투여 속도 및 시간 과정은 치료 대상의 특성과 중증도, 치료될 특정 개체, 개체의 임상 상태, 장애의 원인, 조성물의 전달 부위, 항체 분자의 유형, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 공지된 기타 요인에 따라 달라질 것이다. 치료 처방, 예를 들어, 투여량 결정 등은 일반의 및 다른 의사의 책임 내에 있으며, 증상의 중증도 및/또는 치료되는 질환의 진행에 따라 달라질 수 있다. 항체 분자의 적절한 용량은 당업계에 익히 공지되어 있다(Ledermann et al., 1991; Bagshawe et al., 1991). 투여되는 항체 분자에 적절한 것으로 본원에 또는 문헌[참조: Physician's Desk Reference(2003)]에 지시된 특정 투여량이 사용될 수 있다. 항체 분자의 치료적 유효량 또는 적합한 용량은 동물 모델에서 시험관내 활성과 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 인간에 대한 마우스 및 기타 테스트 동물의 유효 투여량을 외삽하는 방법은 공지되어 있다. 정확한 용량은 치료될 면적의 크기와 위치 및 항체 분자의 정확한 특성을 포함한 여러 요인에 따라 달라질 것이다.

전형적인 항체 용량은 전신 적용의 경우 100㎍ 내지 1g, 국소 적용의 경우 1㎍ 내지 1mg 범위내이다. 초기 더 높은 로딩 용량에 이어 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 이것은 성인 개체의 단일 치료를 위한 용량으로, 이는 어린이와 유아에 대해 비례적으로 조정될 수 있으며 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷에 대해서도 조정될 수 있다.

치료는 의사의 재량에 따라 매일, 주당 두 번, 매주 또는 매월 간격으로 반복될 수 있다. 개체에 대한 치료 일정은 항체 조성물의 약동학적 및 약력학적 특성, 투여 경로 및 치료될 상태의 특성에 따라 달라질 수 있다.

치료는 주기적일 수 있으며, 투여 사이의 기간은 약 2주 이상, 예를 들어, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 한 달에 약 1회 이상, 약 5주 이상 또는 약 6주 이상일 수 있다. 예를 들어, 치료는 2-4주 마다 또는 4-8주 마다 이루어질 수 있다. 적합한 제형 및 투여 경로는 상기 기재되어 있다.

암 치료의 맥락에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 분자는 다른 항암 요법 또는 치료제, 예를 들어, 문제의 암의 치료용으로 적합한 것으로 나타나거나 적합할 것으로 예상되는 항암 요법 또는 치료제와 조합하여 개체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자는 화학 요법제, 방사선 요법, 면역 요법제, 항종양 백신, 종양 용해성 바이러스, 입양 세포 전달(ACT) 요법(예: 입양 NK 세포 요법) 또는 키메라 항원 수용체(CAR) T-세포, 자가 종양 침윤성 림프구(TIL), 또는 감마/델타 T 세포를 사용한 요법, 또는 호르몬 요법용 제제와 조합하여 개체에게 투여될 수 있다.

이론에 결부시키고자 하지 않고, 항체 분자가 TNFRSF 수용체와 같은 면역 세포 항원에 대한 제2 항원 결합 부위를 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 항체 분자는 항암 요법에서 보조제로서 작용할 수 있다고 생각된다. 구체적으로, 항체 분자를 화학 요법 및/또는 방사선 요법과 조합하여 또는, 예를 들어, 항종양 백신과 조합하여 개체에게 투여하면 화학 요법 및/또는 방사선 요법으로 또는 항종양 백신 단독으로 달성되는 것보다 암에 대해 더 큰 면역 반응을 유발할 것으로 생각된다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 분자와 조합하여 투여하기 위한 하나 이상의 화학 요법제는 탁산, 세포 독성 항생제, 티로신 키나제 억제제, PARP 억제제, B-Raf 효소 억제제, MEK 억제제, c-MET 억제제, VEGFR 억제제, PDGFR 억제제, 알킬화제, 백금 유사체, 뉴클레오시드 유사체, 항엽산, 탈리도마이드 유도체, 항종양성 화학 요법제 및 기타로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 탁산은 도세탁셀, 파클리탁셀 및 nab-파클리탁셀을 포함하고; 세포 독성 항생제는 액티노마이신, 블레오마이신 및 안트라사이클린, 예를 들어, 독소루비신, 미톡산트론 및 발루비신을 포함하고; 티로신 키나제 억제제는 에를로티닙, 게피티닙, 악시티닙, PLX3397, 이마티닙, 코베미티닙 및 트라메티닙을 포함하고; PARP 억제제는 피라파립을 포함하고; B-Raf 효소 억제제는 베무라페닙 및 다브라페닙을 포함하고; 알킬화제는 다카르바진, 사이클로포스파미드 및 테모졸로미드를 포함하고; 백금 유사체는 카보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴을 포함하고; 뉴클레오시드 유사체는 아자시티딘, 카페시타빈, 플루다라빈, 플루오로우라실 및 젬시타빈을 포함하고; 항엽산은 메토트렉세이트 및 페메트렉세드를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 화학 요법제는 데팍티닙, 엔티노스타트, 에리불린, 이리노테칸 및 빈블라스틴을 포함한다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 분자와 함께 투여하기 위한 바람직한 치료제는 펜토스타틴, 사이클로포스파미드, 시스-플라틴, 페메트렉세드, 파클리탁셀, 카보플라틴, 젬시타빈, 독소루비신, 비노렐빈, 도세탁셀 또는 에토포사이드이다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 분자와 조합하여 투여하기 위한 방사선 요법은 외부 빔 방사선 요법(예: 강도 조절된 방사선 요법(IMRT), 정위 신체 방사선 요법(SBRT), 이미지 유도 방사선 요법(IGRT), 수술 중 방사선 요법(IORT), 전자 요법 또는 전자빔 요법(EBT), 피상적 방사선 요법(SRT)) 또는 내부 방사선 요법(예: 근접 요법, 방사성 동위 원소 또는 방사성 핵종 요법, SIRT)일 수 있다. 바람직하게는, 방사선 요법은 통상적인 외부 빔 방사선 요법, 외부 빔 방사선 요법(EBRT), 정위 방사선 요법 또는 근접 요법이다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 분자와 조합하여 투여하기 위한 면역 요법제는 치료적 항체 분자, 핵산, 사이토카인 또는 사이토카인 기반 요법일 수 있다. 예를 들어, 치료적 항체 분자는 면역 조절 분자, 예를 들어, 억제성 체크포인트 분자 또는 면역 공동 자극 분자, 선천성 면역계의 수용체, 또는 종양 항원, 예를 들어, 세포 표면 종양 항원 또는 가용성 종양 항원에 결합할 수 있다. 치료적 항체 분자가 결합할 수 있는 면역 조절 분자의 예는 억제성 체크포인트 분자, 예를 들어, CTLA-4, LAG-3, TIGIT, TIM-3, VISTA, PD-L1, PD-1 또는 KIR, 면역 공동 자극 분자, 예를 들어, OX40, CD40, GITR, CD27 또는 ICOS, 다른 면역 조절 분자, 예를 들어, CD47, CD73, CSF-1R, HVEM, TGFB 또는 CSF-1을 포함한다. 치료적 항체 분자가 결합할 수 있는 선천성 면역계의 수용체의 예는 TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR9, RIG-I- 유사 수용체(예: RIG-I 및 MDA-5) 및 STING을 포함한다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 분자와 조합하여 투여하기 위한 핵산은 siRNA일 수 있다.

사이토카인 또는 사이토카인 기반 요법은 IL-2, 접합된 IL-2의 프로드럭, GM-CSF, IL-7, IL-12, IL-9, IL-15, IL-18, IL-21 및 I형 인터페론으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

암 치료를 위한 항종양 백신은 클리닉에서 시행되었으며, 과학 문헌(예: Rosenberg, S. 2000) 내에서 상세히 논의된다. 이것은 주로 면역계가 과립구-대 식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)의 존재 및 부재하 모두 이들 세포를 백신 접종 방법으로 사용하여 자가 또는 동종 암 세포에 의해 발현되는 다양한 세포 마커에 반응하도록 유도하는 전략을 포함한다. GM-CSF는 항원 제시에서 강한 반응을 일으키며, 상기 전략과 함께 사용될 때 특히 잘 작동한다.

화학 요법제, 방사선 요법, 면역 요법제, 항종양 백신, 종양 용해성 바이러스, ACT 요법 또는 호르몬 요법용 제제는 바람직하게는 화학 요법제, 방사선 요법, 면역 요법제, 항종양 백신, 종양 용해성 바이러스, ACT 요법 또는 문제의 암에 대한 호르몬 요법용 제제, 즉 화학 요법제, 방사선 요법, 면역 요법제, 항종양 백신, 종양 용해성 바이러스, ACT 요법 또는 문제의 암 치료에 효과적인 것으로 나타난 호르몬 요법용 제제이다. 적절한 화학 요법제, 방사선 요법, 면역 요법제, 항종양 백신, 종양 용해성 바이러스, ACT 요법 또는 문제의 암에 효과적인 것으로 나타난 호르몬 요법용 제제의 선택은 숙련된 의사의 능력 내에 있다.

본 발명의 추가의 측면 및 구현예는 하기 실험적 예시를 포함하는 본 개시 내용을 감안하여 당업자에게 명백할 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 문서는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

본원에 사용되는 "및/또는"은 서로를 포함하거나 포함하지 않는 2개의 특정된 특징 또는 성분 각각의 특정 개시내용으로 간주되어야 한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 본원에서 개별적으로 제시된 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각의 특정 개시내용으로 간주되어야 한다.

문맥이 달리 지시하지 않는 한, 위에 제시된 특징의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 측면 또는 구현예로 제한되지 않으며, 기재된 모든 측면 및 구현예에 동일하게 적용된다.

본 발명의 다른 측면 및 구현예는 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 용어 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는"으로 대체된 용어 "포함하는"으로 상기 기재된 측면 및 구현예를 제공한다.

본 발명의 특정 측면 및 구현예는 이하 예로서 상기 기재된 도면을 참조하여 예시될 것이다.

실시예

실시예 1: 항원 선택 및 특성화

MSLN 및 CD137에 결합할 수 있고 CD137 효능 작용을 유발할 수 있는 mAb²를 동정하는 데 사용되는 선택 및 스크리닝 방법은 다양한 MSLN 및 CD137 항원의 사용이 필요했다. 이러한 항원의 생산은 아래에 더 상세히 기재되어 있다.

1.1 재조합 CD137 항원

CD137과 같은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리(TNFRSF) 구성원은 동족체 리간드에 결합될 때 함께 클러스터링되는 다량체를 형성하는 경향으로 공지되어 있다(Croft, M. 2003). 작용성에 대해 응집하려는 이러한 성향은 파지 및 효모 디스플레이와 같은 시험관내 선택에의 사용 및 선택된 단백질의 특성화를 위한 용액에서 응집되지 않는 가용성 재조합 단백질을 생산하는 것을 어렵게 만든다.

시판되는 항원의 대부분이 적합하지 않은 것으로 간주되었으므로, 다음과 같은 재조합 이량체성 및 단량체성 CD137 항원(표 1 참조)이 선택에 사용하기 위해 사내에서(in-house) 생산되었다.

단량체성 항원은 Avi 태그 서열 및 6개의 C-말단 히스티딘 잔기와 함께 인간(서열번호 149에 나타낸 바와 같음) 또는 마우스 CD137(서열번호 150에 나타낸 바와 같음)의 세포외 도메인을 인코딩하는 DNa를 EcoRI-HF 및 BamHI-HF 제한 효소를 사용하여 변형된 pFUSE 벡터(InvivoGen, pfuse-mIgG2A-Fc2)로 클로닝함으로써 생성되었다. 벡터를 HEK293-6E 세포(캐나다 국립 연구위원회)로 형질 감염시키고, 발현된 CD137을 HisTrap™ 엑셀 니켈 컬럼(GE Healthcare Life Sciences 29048586) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 정제하여 항원이 단일 종이고 응집체를 함유하지 않았음을 보장했다.

이량체성 항원을 생산하기 위해, Avi 태그 서열과 함께 mIgG2a Fc 도메인과 융합된 인간, 마우스 또는 시노몰구스 CD137의 세포외 도메인을 인코딩하는 DNA 작제물을 변형된 pFUSE 벡터로 클로닝하고, HEK293-6E 세포로 형질 감염시켰다. 재조합 CD137은 MabSelect SuRe™ 단백질 A 컬럼(GE Healthcare Life Sciences, 11003494 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 정제하여 항원이 단일 종이며 응집체를 함유하지 않았음을 보장했다.

이량체성 및 단량체성 항원 각각은 BirA 비오틴-단백질 리가제 반응 키트(Avidity LLC, BirA500)를 사용하여 비오티닐화하여 단일 비오틴 분자로 표지된 단량체성 CD137 항원 및 2개의 단량체 각각당 하나인 2개의 비오틴 분자로 표지된 이량체성 CD137 항원을 생산했다. 3mg의 항원을 1:50의 효소 대 기질의 몰 비로7.8μl BirA 효소 혼합물과 혼합했다. 이어서, 첨가제를 제조업체의 권고(142μl Biomix A, 142μl Biomix B, 142μl 비오틴)에 따라 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양했다. 비오티닐화된 단백질의 완전성을 유지하기 위해, 반응 혼합물은 즉시 완충액를 Amicon 30μm 필터(Merck, UFC503096)를 사용하여 DPBS(ThermoFisher Scientific 14190-169)로 교환했다.

단백질을 추가로 SEC에 의해 정제하여 BirA 효소의 제거 및 고분자량 응집체를 갖지 않는 최종 고품질의 단일 분산 단백질 제제의 생산을 보장했다. 물질은 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC), SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 다중 각도 광 산란을 사용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS)에 의해 안정성 및 순도를 분석했다. 단백질의 완전한 비오티닐화는 스트렙타비딘-이동 SDS-PAGE 겔에서 확인되었다. 재조합 인간 및 마우스 항원은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 시험관내에서 항-CD137 양성 대조군 항체(각각 20H4.9(미국 특허 제7288638호)) 및 Lob12.3(사우샘프턴 대학교))에, 유세포 분석에 의해 인간 및 마우스 CD137 리간드를 발현하는 DO11.10 세포에 결합하는 것으로 확인되었다. 세포를 CD137 항원과 함께 1시간 동안 배양한 다음, 형광 표지된 항 마우스 Fc 단편 항체를 사용하여 세포 결합을 검출했다. 선택 프로토콜에 사용된 물질에 대해 가능한 한 높은 순도를 보장하기 위해, 항원의 철저한 단백질 특성화를 수행하여 단백질 응집체의 존재가 2%를 초과하지 않았음을 보장했다.

1.2 세포 발현된 CD137 항원

각각 'DO11.10.mCD137' 및 'DO11.10.hCD137'로 지정된 전장 마우스(서열번호 374) 또는 인간 CD137(서열번호 373)을 발현하는 DO11.10 세포(National Jewish Health)는 표 2에 열거된 바와 같이 선택된 Fcab의 선택 및 추가의 특성화를 위해 천연 형태와 가장 유사한 막 결합된 형태로 항원을 제시하기 위해 생성되었다.

렌티바이러스 형질 도입은 Lenti-X HTX 패키징 시스템(Clontech, 카탈로그 번호 631249)을 사용하여 인간 또는 마우스 CD137 수용체를 과발현하는 이러한 DO11.10 세포를 생성하기 위해 사용되었다. 인간 CD137 cDNA 또는 마우스 CD137 cDNA를 함유하는 Lenti-X 발현 벡터(pLVX)(Clontech, 카탈로그 번호 631253)를 Lenti-X HTX 패키징 혼합물을 사용하여 Lenti-X 293T 세포주(Clontech, 카탈로그 번호 632180)로 공동 형질감염시켜 바이러스를 생성했다. 이어서, DO11.10 세포주는 이들 렌티바이러스 벡터로 형질 도입하였다.

이들 세포에서 인간 CD137 또는 마우스 CD137의 발현은 각각 20H4.9 및 Lob12.3 항-CD137 양성 대조군 항체가 세포에 결합함으로써 유세포 분석에 의해 확인되었다. 세포를 인간 또는 마우스 양성 대조군 항체와 함께 1시간 동안 배양한 다음, 형광 표지된 항-인간 Fc 검출 항체(Stratech Scientific Ltd, 카탈로그 번호 109-546-098-JIR)를 사용하여 세포 결합을 검출했다.

1.3 인간, 시노 및 마우스 메소텔린 항원

'hMSLN-His Acro'로 명명된 재조합 비오티닐화된 인간 MSLN-His 항원은 C-말단 18개 아미노산이 결여된 Acrobiosystems(cat 번호 MSN-H8223)로부터 획득했다. 전장 단량체성 인간 MSLN 항원을 생성하고 파지 선택을 위해 사내에서 비오티닐화했다. 시노몰구스 및 마우스 MSLN은 각각 인간 및 시노 MSLN에 결합할 수 있는 결합제의 단리, 및 또한 뮤린 MSLN 결합제의 단리를 가능하게 하기 위해 생성되었다.

요약하면, MSLN 항원은 전장 인간(서열번호 142)(hMSLN-His-Avi), 시노몰구스(서열번호 143)(cMSLN-His-Avi) 또는 마우스(서열번호 144)(mMSLN-His-Avi) MSLN을 인코딩하는 DNA를 6개의 C-말단 히스티딘 잔기 및 Avi 태그 서열과 함께 EcoRI-HF 및 BamHI-HF 제한 효소를 사용하여 변형된 pFUSE 벡터(InvivoGen, pfuse-mIgG2A-Fc2)로 클로닝함으로써 생성되었다. 벡터를 HEK293-6E 세포(캐나다 국립 연구위원회)로 형질 감염시키고, 발현된 MSLN을 HisTrap™ 엑셀 니켈 컬럼(GE Healthcare Life Sciences 29048586)을 사용하여 정제했다. 각각의 항원은 단일 비오틴 분자로 표지된 단량체성 MSLN 항원을 생산하기 위해 BirA 비오틴-단백질 리가제 반응 키트(Avidity LLC, BirA500)를 사용하여 비오티닐화되었다.

재조합 인간, 시노 또는 마우스 MSLN은 후속적으로 HisTrap™ 엑셀 니켈 컬럼을 사용하여 정제하여 과량의 유리 비오틴을 제거했다.

이들 항원의 SEC-HPLC는 10% 미만의 응집을 보였고, PAGE는 항원이 단량체였음을 확인했다. ELISA 및 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 비오티닐화된 MSLN 항원이 SS1 scFv(US 7,081,518 B1; Hassan et al. 2002) 및 MOR6626(특허 공개 번호 WO 2009/068204 A1)와 동일한 CDR을 함유하는 MSLN 특이적 양성 대조군 항체 SS1(VH 서열번호 140; VL 서열번호 141)에 의해 결합될 수 있음을 확인했다. 이 데이터를 기반으로, 모든 항원은 나이브 선택에 적합한 것으로 간주되었다.

실시예 2: 항-인간 CD137 Fcab의 선택 및 특성화

2.1 항-인간 CD137 Fcab의 나이브 선택

인간 CD137에 결합하는 Fcab을 선택하기 위해, 동정된 Fcab의 다양성을 최대화하기 위해 효모 및 파지 디스플레이 선택 캠페인이 사용되었다. 세포 표면 모두 인간 CD137 및 재조합 이량체성 인간 CD137을 나타냈으며, 이량체성 또는 다량체성 CD137 단백질에 대해 결합력 구동 선택 압력을 발휘하기 위해 다양한 항원 제시를 제공하는 데 사용되었다. 단량체성 CD137에 대한 높은 친화도보다 CD137 복합체에 열광적으로 결합된 Fcab을 수득하는 것은 이러한 Fcab가 우선적으로 활성화되고 프라이밍된 T 세포만을 표적화할 것이기 때문에 유익한 것으로 간주되었으며, 여기서 CD137의 상향 조절은 T 세포 자극 후에 발생한다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, CD137 막 발현 수준이 매우 낮거나 무시할 수 있는 T 세포는 대부분의 단백질이 이량체, 삼량체 또는 고급 다량체 상태로 존재하는 매우 상향조절된 CD137을 갖는 활성화된 T 세포와 달리 단량체 상태로 CD137을 가질 가능성이 더 높을 것이라는 가설이 세워졌다. 결합력-구동 선택의 결과로서, Fcab는 활성화된 T 세포에 우선적으로 결합하고 CD137의 낮은 발현을 나타내는 나이브 T 세포 또는 다른 세포에는 충분히 결합하지 않을 것이다. 열렬한 CD137 Fcab를 선택함으로써, 잠재적인 비표적화 T 세포 활성화가 감소되고, 관련된 독성이 감소될 것이다.

인간 IgG1의 CH1 내지 CH3 도메인을 나타내는 나이브 효모 라이브러리는 효모 디스플레이에 의한 선택에 사용되었다. 모든 라이브러리는 CH3 도메인에 무작위화 AB 루프(IMGT 넘버링에 따라 위치 14 내지 18에 잔기를 포함함) 및 무작위화 EF 루프(IMGT 넘버링에 따라 위치 92 내지 101에 잔기를 포함함)를 함유했다. 라이브러리 중 2개는 CH3 도메인의 AB 루프의 위치 16에 5개의 아미노산 잔기(IMGT 넘버링에 따라 위치 16.5 내지 16.1에 잔기)의 삽입을 추가로 함유했다.

라이브러리 선택으로부터 동정된 효모 단일 클론은 재조합 hCD137 항원의 Fc 부분에 결합하는 효모 클론에 대해 구별하기 위해 세포를 비오티닐화된 재조합 이량체성 인간 항원 또는 마우스 Fc 단편과 함께 배양함을 포함하는 유세포 분석 항원 결합 검정을 사용하여 항원 결합에 대해 스크리닝했다. 선택은 유도 온도의 증가, 선택 엄격도의 감소 또는 적중 수를 증가시키기 위해 라운드 수의 감소와 같은 다양한 항원 농도 및 조건으로 반복되었다. 고유한 서열을 갖는 9개의 Fcab 클론이 동정되었다.

2.2 "모의" mAb ² 포맷의 항-인간 CD137 Fcab의 제조

85개의 항-인간 CD137 Fcab 클론을 포함하는 IgG1 분자로 구성되는 "모의" mAb² 항체는 mAb² 포맷의 Fcab의 특성화를 허용하기 위해 생산되었다. 모의 mAb²는 AB, CD 및 EF 루프를 포함하는 CH3 도메인 Fcab의 일부를 항-암탉 계란 리소자임 항체 HelD1.3의 CH3 도메인의 상응하는 영역으로 치환함으로써 제조되었다. HelD1.3 항체의 생성은 문헌(참조: Tello et al. 1993)에 기재되어 있다. 항체 HelD1.3의 중쇄 및 경쇄 서열은 각각 서열번호 138 및 139에 제시되어 있다. 모의 mAb² 분자는 HEK293-6E 세포에서 일시적인 발현에 의해 생산하고, mAb SelectSure 컬럼을 사용하여 단백질 A 친화도 크로마토그래피로 정제했다. 이어서, 이러한 mAb²는 생물층 간섭계(BLI)에 의해 인간 재조합 항원(비오티닐화 hCD137-mFc-Avi)에 대한 결합에 대해 테스트했다.

2.3 인간 NF-κB 리포터 검정에서 선택된 항-CD137 모의 mAb ² 의 활성

TNFR 신호 전달에는 다량체화 및 클러스터링이 필요하다(참조: Bitra et al., 2017). CD137은 동족체 리간드인 CD137L과 상호 작용할 때 NF-κB 신호 전달 경로를 클러스터링하고 활성화한다. 작용제 분자는 CD137의 클러스터링 및 활성화를 유도하는 데 있어서 리간드를 모방하여 NF-κB 신호 전달 경로를 활성화한다. 일부 작용제 항체는, 예를 들어, 우렐루맙과 결합시 본질적으로 CD137 클러스터링을 유발할 수 있는 반면, 다른 항체는 유토밀루맙과 같은 CD137 클러스터링을 유도하기 위해 항체 자체의 추가의 가교결합이 필요하다는 것이 공지되어 있다(참조: Fisher et al., 2012). 이펙터 세포 상의 Fc 감마 수용체는 생체내에서 이러한 가교결합을 유도하는 것으로 공지되어 있지만, 이것은 비효율적이며 치료적 관심의 부위로부터 떨어져 발생할 수 있다. 용량 제한 독성은 유톨리무맙이 아니라 우렐루맙과 관련되기 때문에, 본질적으로 작용하는 능력을 갖지 않는 항-CD137 결합 Fcab을 선택하고, CD137 클러스터링을 유도하기 위해 추가의 가교결합이 필요한 것들만 선택하기로 결정했다. 따라서, 가교결합된 항체에 의해 세포 표면에서 발현된 CD137의 클러스터링시 세포에서 NF-κB 신호 전달 경로의 활성화를 검출할 수 있지만 항체가 가교결합되지 않았을 때 거의 활성을 나타내지 않은 검정이 개발되었다. 이어서, 이 검정은 Fcab이 BLI에 의해 재조합 항원에 결합하는 것으로 밝혀졌는지의 여부와 관계 없이 항-CD137 Fcab 클론 mAb² 포맷의 작용제 기능적 활성을 테스트하는 데 사용되었다. 단백질 L은 검정에서 Fab 부분을 통해 모의 mAb²의 가교결합을 유도하기 위한 가교결합제로서 사용되었고, NF-κB 활성화가 측정되었다.

HEK.FRT.luc.hCD137 세포는 EcoRI-HF 및 XhoI 제한 효소를 사용하여 인간 CD137 서열(서열번호 149)을 인코딩하는 cDNA 서열을 pMSCV-네오마이신 벡터(Takara Clontech, Cat. 634401)로 서브클로닝하여 생산되었다. RetroPack PT67 세포주(Clontech, Cat. 631510)는 제조업체의 프로토콜에 따라 레트로바이러스 입자를 생산하는 데 사용되었다. 이 레트로 바이러스는 후속적으로 Flp-In T-REx 293 HEK 세포주(Life Technologies, R780-07)를 루시퍼라제의 발현을 조절하는 NF-κB-민감성 프로모터를 함유하는 Qiagen Cignal Lenti NFkB 리포터(luc)(Qiagen, cat no 336851) 렌티바이러스로 형질 도입함으로써 이전에 생성된 HEK.FRT.luc 세포를 형질 도입하는 데 사용되었다. 이러한 HEK.FRT.luc.hCD137 세포를 사용하여 선택에서 동정된 CD137 결합제를 함유하는 모의 mAb²를 스크리닝하였다.

각 모의 mAb²의 2μM 희석액을 DPBS(Life Technologies, 14190169)에서 제조하고, 리포터 세포 배지(DMEM(Gibco, Cat. 61965-026); 10% FCS(Gibco, Cat. 10270-106); 1x PennStrep(Gibco, Cat. 15140-122); 블라스티시딘 15μg/ml(Melford Laboratories Ltd. Cat. B1105); 퓨로마이신 5μg/ml(Life technologies, Cat. A11113803); 제오신 100μg/ml(InvivoGen, Cat. 11006-33-0); 제네티신 500μg/ml(Life Technologies, Cat. 10131-027)에서 1:3으로 추가로 희석했다. 단백질 L(Life Technologies, 21189)은 인공 가교결합제로서 사용되었으며, mAb² 분자와 1:4 몰 비로 혼합되었다. 24시간 배양 후, 세포를 제조업체의 지침에 따라서 100μl Promega Bio-Glo™ 루시퍼라제 검정 시약(Promega cat no G7941)으로 처리하고, 발광은 Gen5 소프트웨어, BioTek를 갖는 플레이트 판독기에서 0.5초의 통합 시간으로 측정했다. 발광 값은 가교결합된 Fcab에 의해 유도된 CD137의 클러스터링에 의한 NF-κB 신호 전달 경로의 활성화에 대한 반응으로 생성된 루시퍼라제의 척도이다. 발광 값은 Fcab의 로그 농도에 대해 플롯팅되었으며, 생성되는 곡선은 GraphPad Prism에서 로그(작용제) 대 반응 방정식을 사용하여 적합화되었다.

적중(Hit)은 이러한 클론이 CD137 클러스터링 및 다운스트림 신호 전달 경로의 후속 활성화를 유도할 수 있는 것으로 결정되었기 때문에 가교결합되지 않은 경우와 비교하여 단백질 L과 가교결합될 때 루시퍼라제 신호가 적어도 10배 증가함으로써 동정되었다. 테스트된 모든 클론 중 2개는 FS22-172를 포함하여 가교결합시 루시퍼라제의 이러한 10배 증가를 유도할 수 있었지만, EC50은 둘 중 하나에 대해 결정될 수 없었다. 둘 다는 DO11.10 T 세포 활성화 검정에서 추가의 특성화를 위해 선택되었다. 놀랍게도, BLI에 의한 CD137 표적에의 결합에도 불구하고 가교결합된 조건에서 잔류하는 클론에 대한 활성이 관찰되지 않았는데, 이는 아마도 그들이 CD137 상의 무관한 에피토프에서 결합했음을 나타내거나, 이러한 클론의 친화도가 NF-κB 신호 전달 캐스케이드를 개시하기에 충분히 강하게 CD137에 결합하기에 충분하지 않았음을 나타낸다. 전반적으로, 2개의 Fcab(FS22-172 포함)는 가교될 때 NF-κB 리포터 검정에서 목적하는 기능을 나타내고 가교결합되지 않을 때 거의 활성을 나타내지 않는 나이브 선택으로부터 동정되었다.

실시예 3: 항-인간 CD137 Fcab의 친화도 성숙 및 후속적 특성화

3.1 FS22-172의 친화도 성숙

FS22-172 Fcab 클론으로부터 4개의 효모 제시된 라이브러리가 작제되었다. 7개의 잔기(IMGT에 따라 위치 15-16.1에서)를 각 클론의 CH3 도메인의 AB 루프에서 ELLA 프라이머를 사용하여 무작위화하여 라이브러리 FS22-172 AB를 제조했다. 5개의 잔기(IMGT에 따라 위치 92-94 및 97-98에서)를 CH3 도메인의 EF 루프에서 ELLA 프라이머를 사용하여 무작위화하여 라이브러리 FS22-172 EF를 생성했다.

라이브러리 FS22-172 AB 및 FS22-172 EF의 경우, 이량체성 hCD137-mFc-Avi 항원 또는 단량체성 hCD137-Avi-His 항원을 사용하여 친화도 성숙 클론을 선택하기 위해 효모 라이브러리에서 3회 또는 4회 선택 라운드를 수행했다. 클론이 항원에 대한 친화도를 유지하고 결합력을 통해서만 결합하지 않음을 보장하기 위해 단량체성 항원을 이량체성 항원과 교호시켰다. 단량체성 또는 이량체성 항원의 사용 및 사용된 농도는 이전 라운드에서 단량체성 또는 이량체성 항원에 대한 농축이 관찰되었는지 여부로 결정된 유세포 분석에 의해 각 라운드 동안 경험적으로 결정되었다. 가능할 때마다, 부모 분자와 비교하여 친화도 성숙 클론을 단리시키기 위해 부모 위의 분류 게이트를 사용했다. 선택 압력은 최대 1nM의 이량체성 항원까지 증가되었다. 각 선택 라운드 동안, 개별적 클론을 한천 플레이트에서 스팟팅하여 선택의 진행을 평가했다. 각 클론을 개별적으로 성장시키고 유도한 다음, 이의 결합 및 구조 매개 변수는 앞서 기재된 바와 같이 비오티닐화된 이량체성 항원 및 항-CH2 구조 마커를 사용하여 유세포 분석에 의해 결정되었다. 선택 출력으로부터 클론 샘플을 기반으로 선택 성공의 결정을 가능하게 하고 후속적으로 가용성 단백질로서 생산될 수 있는 개별적 클론의 조기 스크리닝을 허용하는 이러한 스크리닝 캐스케이드가 이어졌다.

효모 단일 클론은 앞서 기재된 바와 같이 항원 결합 유세포 분석에서 비오티닐화된 재조합 항원에 대한 결합에 대해 스크리닝되었다. 30개의 고유한 루프 서열이 FS22-172 AB 라이브러리로부터 단리되었다. FS22-172 EF 라이브러리는 부모 클론에 대해 임의의 결합 개선을 나타낸 임의의 클론을 함유하지 않았다.

3.2 "모의" mAb ² 포맷의 항-인간 CD137 Fcab의 작제

HelD1.3에서 항-인간 CD137 Fcab를 포함하는 "모의" mAb² 항체는 mAb² 포맷의 친화도 성숙된 Fcab의 추가 특성화를 위해 제조되었다. 이들 mAb²는 실시예 2.2에 기재된 바와 같이 제조되었다. CD137/HelD1.3 "모의" mAb²는 HEK293-6E 세포에서 일시적인 발현에 의해 생산되고, mAb Select SuRe 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제되었다.

3.3 인간 NF-κB 리포터 세포 검정에서 모의 mAb ² 포맷의 인간 Fcab의 활성

나열된 모의 mAb²(HelD1.3) 포맷의 친화도 성숙된 항-인간 CD137 Fcab의 기능적 활성은 실시예 2.3에 기재된 동일한 NF-κB 루시퍼라제 검정으로 테스트되었다. 발광은 Gen5 소프트웨어, BioTek이 있는 플레이트 판독기에서 0.5초의 통합 시간으로 측정되었다. 예상된 바와 같이, Fcab 중 어느 것도 단백질 L 가교결합(-XL) 없이 활성을 나타내지 않았다. 모든 친화도 성숙된 CD137 Fcab은 부모 CD137 Fcab에 비해 엄청난 개선을 보였으며, 이 검정에서는 양성이지만 EC₅₀ 값의 계산은 불가능했다(실시예 2.3 참조). FS22-172-003은 단백질 L과 가교결합될 때(+XL) 최저 EC₅₀(32.64nM)으로 각 패밀리에서 최고의 활성을 나타냈다.

3.4 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 항-인간 CD137 Fcab의 특이성 결정

다른 관련 TNFSFR 패밀리 구성원과 비교하여 인간 CD137에 대한 항-인간 CD137 Fcab의 특이성을 테스트했다. Fcab 중 8개를 모의 mAb²(HelD1.3) 포맷으로 테스트하고, 다른 인간 TNFRSF 수용체인 CD40, OX40 및 GITR에 대한 결합에 대해 테스트하여 Biacore T200(GE Healthcare)에서 SPR로 측정했다. 아민 커플링(아민 커플링 키트, GE Healthcare, BR-1000-50)을 사용하여 인간 CD40, GITR 및 OX40을 Biacore CM5 칩(GE Healthcare, 카탈로그 번호 29149603)에서 약 1000RU로 코팅시켰다. 1μM에서 시작하는 모의 mAb² 포맷(FS22-172-003/HelD1.3)의 항-인간 CD137 Fcab의 희석액을 HBS-EP + 완충액(BR100669)에서 제조하고, 30μl/분으로 3분 동안 주입한 다음, 4분 동안 완충액에서 해리시켰다. 칩은 30μl/분으로 12초 동안 10mM 글리신 pH 2.5를 주입하여 재생시켰다. 상이한 TNFRSF 구성원에 특이적인 항체를 양성 대조군으로 사용하여 Biacore 칩 코팅을 확인했다. 데이터는 이중 참조 감산되었고, BIAevaluation 3.2 소프트웨어를 사용하여 분석했다. Fcab는 테스트된 임의의 TNFRSF 수용체에 결합하지 않았으며, CD137에 대한 특이성을 입증했다. 결과적으로, Fcab, 또는 이들 Fcab로부터의 항원 결합 부위를 포함하는 mAb²가 CD137 이외의 것에 대한 결합을 유도할 것으로 예상되지 않는다.

3.5 SPR에 의한 인간, 시노몰구스 및 마우스 CD137에 대한 모의 mAb ² 포맷의 항-인간 CD137 Fcab의 결합 친화도

인간, 시노몰구스(시노) 및 마우스 CD137에 대한 모의 mAb² 포맷(실시예 3.2 참조)의 항-인간 CD137 Fcab의 친화도는 SPR로 측정하여 Fcab이 동물 연구에서 테스트에 유용할 수 있는지 여부를 결정했다. 항-인간 Fab 포획 항체는 CM5 시리즈 S 칩(GE Healthcare # BR-1005-30)의 4개의 유동 세포 모두에 제조업체의 권고(GE Healthcare, 인간 Fab 포획 키트, #28958325)에 따라 6000RU의 평균 표면 밀도로 고정시켰다. 25℃ 및 10μl/분 유속에서 고정화하는 평균 최종 반응 6000RU를 달성했다. 각 mAb²는 HBS-EP + 완충액(GE Healthcare # BR1006-69)에서 희석된 mAb²의 3μg/ml 용액을 30μl/분으로 60초 동안 주입하여 약 150RU로 포획되었다. 이어서, HBS-EP + 완충액에서 인간, 시노 또는 마우스 CD137 항원(비오티닐화되지 않은 인간, 시노 또는 마우스 CD137-mFc-Avi 또는 인간 CD137-Avi-His)의 상이한 농도를 칩 위에 60μl/분으로 3분 동안 유동시킨 다음, 10분 동안 해리시켰다. 각 항원 농도 후, 칩은 30초 동안 30μl/분의 유속으로 10mM 글리신 pH 2.1를주입하여 재생시켰다. 완충액 HBS-EP+는 참조 감산을 위해 항원의 최고 농도 이전 및 항원의 최저 농도 이후에 주입하였고, 농도 중 하나는 무작위로 두 번 반복되었다. 결합 동역학은 1:1 Langmuir 모델로 적합화하여 각 샘플에 대한 평형 결합 상수(K_D)를 생성했다. 데이터 분석은 BiaEvaluation 소프트웨어 버전 3.2로 수행되었다. 결과는 표 3에 제시된다.

결과의 분석은 각각의 부모 분자와 비교하여 모든 친화도 성숙된 클론에 의한 인간 및 시노몰구스 CD137 모두에 대한 개선된 결합을 나타냈다. 단량체성 인간 CD137 항원에 대한 결합 친화도는 이량체성 인간 및 시노 Fc-융합 항원에 대한 것보다 약했다(적어도 100배). 실시예 2.1에서 논의된 바와 같이, CD137의 단량체 형태보다 이량체에 우선적으로 결합하도록 Fcab이 선택되었고, 이 데이터는 선택 전략이 성공적이었음을 확인한다. 이러한 동적 거동은 자극되지 않은 T 세포에서 최소 수준으로 발현된 단량체성 CD137에 결합할 가능성을 줄여 일부 항-CD137 모노클로날 항체 요법과 관련된 간 또는 전신 독성의 위험을 감소시킨다.

데이터는 또한 항-인간 CD137 Fcab가 인간 이량체성 CD137에 필적하는 친화도로 시노몰구스 이량체성 CD137에 결합되었음을 보여준다.

마우스 이량체성 CD137에 결합하는 Fcab의 능력도 테스트되었다. 클론 중 어느 것도 마우스 항원에 대한 강한 결합을 나타내지 않았다(N/A가 K_D가 계산될 수 없었음을 나타내는 표 3에 제시된 바와 같음).

3.6 항-인간 CD137 Fcab의 친화도 성숙 및 특성화의 요약

요약하면, 친화도 성숙된 항-CD137 Fcab가 생성되고 mAb² 포맷으로 제조된 다음 특성화되었다. CH3 도메인에 이러한 CD137 항원 결합 도메인을 함유하는 mAb²는 인간 NF-κB 리포터 세포 검정에서 높은 수준의 활성을 보였고, 이 활성은 가교결합 의존성인 것으로 나타났다.

항-인간 CD137 항원 결합 도메인을 함유하는 mAb²는 또한 CD137에 특이적인 것으로 나타났으며, 다른 TNFRSF 수용체에 결합하지 않았다. mAb²는 인간 단량체성 CD137 항원에 비해 인간 이량체성 CD137 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 나타났다. 마지막으로, 이들 mAb²는 인간 이량체성 CD137에 필적하는 친화도로 시노몰구스 이량체성 CD137에 결합하는 것으로 나타났다.

항-인간 CD137 항원 결합 도메인을 함유하는 mAb²가 CD137을 클러스터링하고 활성화하기 위해 가교결합이 필요하다는 것을 입증한 후, 다음 목표는 CD137 이외에 인간 MSLN에 결합하는 mAb²를 제조하는 것이었다. Fab 암을 통한 인간 MSLN 에의 mAb²의 결합은 항체 분자의 가교결합을 야기하고, 이는 또한 CD137의 클러스터링 및 활성화를 초래하고, 이 활성화는 인간 MSLN 발현의 존재에 의존할 것이라는 가설이 세워졌다.

CD137 이외에 인간 MSLN에 결합하는 mAb²를 제조하기 위해, 먼저 MSLN에 결합할 수 있는 mAb를 생성하는 것이 필요했다. 이러한 mAb의 생성은 아래에 기재되어 있다.

실시예 4: 항-인간 MSLN 항체의 단리: 항원, 선택 및 스크리닝

메소텔린은 69kDa 전구체로 합성되고 30kDa NH2 말단 분비 형태(거핵구 강화 인자 또는 MPF로서 지칭됨) 및 40kDa 막 결합된 메소텔린(MSLN)으로 단백질 가수분해적으로 처리되는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-연결된 당단백질이다. 종양 세포 표면으로부터 박리되고 막 결합된 MSLN의 대안적인 스플라이싱 또는 종양 괴사 인자-a 전환 효소(TACE)에 의해 생성되는 MSLN의 가용성 형태가 환자 혈청에서 발견된다. 이 종양-박리 항원은 항체가 종양의 MSLN에 결합할 수 있도록 극복해야 하는 치료용 항체의 미끼 역할을 할 수 있는 '싱크'를 생성하는 것으로 공지되어 있다(Lee et al., 2018). 이러한 싱크 효과를 피하기 위해, 가용성 MSLN과 비교하여 고정된 MSLN에 우선적으로 결합된 새로운 항-메소텔린 항체가 이것이 싱크에서 가용성 MSLN보다 막 결합된 MSLN에 대한 우선적 결합으로 번역될 것이라는 의도로 수득되었다. 이를 위해, 상이한 형태의 MSLN 항원이 파지 선택 및 후속적 스크리닝 캠페인에 사용되었다. 다양한 친화도로 막 결합된 인간 및 시노 MSLN에 결합되고 MSLN의 상이한 영역을 표적화할 수 있었던 항체 패널이 동정되었다. ELISA, Biacore 차단 검정 및 세포 결합을 포함하는 일련의 스크리닝 검정 및 과 MSLN에 대한 결합 영역이 비교된 검정을 수행했다.

4.1 파지미드 라이브러리 선택

CDR1, CDR2 및 CDR3(MSM Technologies)에서 무작위화와 함께 인간 IgG1 생식 계열의 Fab 도메인을 나타내는 합성 나이브 파지미드 라이브러리를 실시예 1.3에 기재된 MSLN 항원으로 선택하기 위해 사용하였다.

Fab 라이브러리는 스트렙타비딘 다이나비드(Thermo Fisher, 11205D), 다이나비드에 결합된 뉴트라비딘 결합 단백질(Thermo Fisher, 31000) 또는 항-His 다이나비드(Thermo Fisher, 10103D)를 사용하여 3 또는 4라운드에서 각각 여러 캠페인에서 초기에 선택되어 비오티닐화 인간, 시노 또는 마우스 MSLN-His-Avi 또는 hMSLN-His Acro에 결합된 파지를 단리시켰다. 선택 캠페인은 또한 인간 MSLN 선택 라운드가 인간 및 시노 교차 반응성 클론을 단리할 목적으로 시노 MSLN 항원과 교호되는 사내에서 생성된 전장 MSLN 항원을 사용하여 수행되었다. 마우스 MSLN(R & D mMSLN-His 8604-MS)에 대한 결합제의 선택도 수행되었다. 표준 파지 선택 및 파지 회수 절차가 사용되었다.

MSLN 항원의 상이한 영역에 결합하는 클론을 수득하기 위한 노력에서, 상기 기재된 초기 선택 캠페인으로부터의 항-MSLN 항체를 사용하여 에피토프 마스킹 전략이 채택되었다. 간단히, 나이브 Fab 라이브러리의 선택의 제1 라운드는 500nM에서 비오티닐화된 인간 MSLN-His-Avi를 사용하여 수행하였다. 라운드 2 및 3에서 500nM(라운드 2) 또는 100nM(라운드 3)에서 비오티닐화된 시노 MSLN-His-Avi의 파지 결합은 초기 선택 캠페인으로부터 단리된 나이브 항-메소텔린 mAb 단백질의 혼합물의 존재하에 테스트되었다. 이러한 에피토프 마스킹 선택은 감소된 출력 역가를 유도했고, 선택 전략이 적은 결합제가 동정된 바와 같이 작동되어 초기 선택 캠페인으로부터의 클론과 비교하여 MSLN의 추가의 영역을 표적화하는 3개의 클론의 동정을 유도했음을 나타낸다.

4.2 항-MSLN 항체를 동정하기 위한 스크리닝

모든 선택의 라운드 3 및 4 출력으로부터 약 2000개의 클론은 선택 라운드에서 사용된 항원과 일치하는 25nM 고정된 비오티닐화된 hMSLN-His Acro, 전장 비오티닐화된 인간 또는 시노 MSLN-His-Avi에 대한 결합에 대해 파지 ELISA로 스크리닝했다. 무관한 비오티닐화된 His 태그된 항원으로 고정된 스트렙타비딘 플레이트 또는 플레이트들을 음성 대조군으로 포함시켰다. 음성 대조군에 대한 신호보다 적어도 4배 더 높은 MSLN 결합 신호를 갖는 클론을 선택하고, 이들의 가변 영역을 서열분석하여 156개의 고유한 VH/VL 서열 조합을 동정하였으며, 이는 후속적으로 가용성 발현을 위해 선택되었다. 클론은 에피토프 마스킹 선택을 포함한 모든 선택 캠페인에서 선택되었다. 각 클론에 대해, VH 및 VL을 CH1, CH2(CH2 도메인(Bruhns et al., 2009; Hezareh et al., 2001)에서 LALA 돌연변이 포함) 및 CH3 도메인, 또는 CL 도메인을 각각 함유하는 pTT5 발현 벡터(캐나다 국립 연구위원회)로 개별적으로 클로닝했다. LALA 돌연변이(AA) 및 pTT5-FS28 VL 벡터를 갖는 생성되는 pTT5-FS28 VH를 HEK293-6E 세포로 일시적으로 공동 형질 감염시키고, 클론을 완전 IgG1 분자로서 생산하였다. 동일한 방법을 사용하여, SS1 및 항-암탉 계란 백색 리소자임 항체 HelD1.3의 VH 및 VL 영역을 클로닝하고 IgG1 LALA 포맷으로 발현하여 각각 양성 및 음성 대조군으로서 작용하는 G1-AA/SS1(서열번호 140(중쇄) 및 141(경쇄)) 및 G1-AA/HelD1.3(서열번호 138(중쇄) 및 139(경쇄))을 산출했다.

4.3 재조합 MSLN에 대한 결합의 스크리닝

4.3.1 결합 ELISA

가용성 항-MSLN 결합 클론 또는 정제된 클론을 함유하는 HEK293 상청액을 인간 MSLN-His Acro, hMSLN-His-Avi 및 일부 캠페인의 경우 cMSLN-His-Avi에 대한 결합에 대해 ELISA에 의해 스크리닝했다. 간단히 말해서, hMSLN-His Acro, hMSLN-His-Avi, cMSLN-His-Avi 또는 무관한 His 태그된 항원을 4℃에서 밤새 25nM에서 maxisorp 플레이트 상에 코팅했다. 다음날, 플레이트를 0.05% Tween20 및 2% Marvel 우유(Marvel 분유)를 함유하는 300μl PBS로 차단했다. 상청액 또는 정제된 단백질을 함유하는 항-MSLN mAb를 실온에서 1시간 동안 배양하고, 그들의 결합은 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 접합된 마우스 항 인간 Fc-IgG 항체로 검출했다. 무관한 항원에 대한 결합을 나타내거나 인간 및 시노몰구스 항원 모두에 교차 반응성이 아닌 클론은 폐기시켰다. 또한, 절단된 MSLN 항원인 hMSLN-His Acro에 결합하지만 전장 MSLN 항원인 MSLN-His-Avi에는 결합하지 않은 클론은 전장 항원이 MSLN-발현 세포의 세포 표면에서 항원 형태를 더 잘 나타낼 것으로 예상되었기 때문에 먼저 진행되지 않았다.

항체가 MSLN에 대한 결합 특이성을 가졌음을 보장하기 위해, 항-MSLN 결합 클론은 또한 글리코실화 및 탈글리코실화 MSLN에 대한 차등 결합에 대해 테스트되었다. 비오티닐화된 hMSLN-His-Avi를 PNGase F 효소(NEB, P0704L)를 사용하여 37℃에서 24시간 동안 탈글리코실화되고, Amicon 울트라 원심분리 필터(Millipore, UFC901024)를 사용하여 정제하고, 25nM에서 maxisorp 플레이트에 코팅했다. MSLN에 대한 고유의 항-메소텔린 mAb의 ELISA 결합은 마우스 항-인간 Fc-IgG-HRP(Sigma, A0170)를 사용하여 검출되었다. 글리코실화된 MSLN 항원과 비교하여 탈글리코실화된 MSLN 항원에 대한 결합 신호의 2배 이상 감소를 나타낸 클론은 나이브 항-MSLN 결합 mAb 패널로부터 제외되었다.

4.3.2 BIAcore 스크리닝

인간 MSLN-His-Avi는 아민 커플링 키트(GE Healthcare, BR10050)를 사용하여 CM5 시리즈 S BIAcore 센서 칩(GE Healthcare, BR100530)의 유동 세포 2에 약 200 반응 단위(RU)로 고정시켰다. 유동 세포 1은 감산을 위해 블랭크로 남겨두었다. HEK293 상청액 또는 정제된 단백질은 HBS-EP+(GE Healthcare)를 사용하여 샘플당 약 50nM 항-MSLN mAb로 조정했다. 샘플을 유동 세포 1 및 2에 2.5분 동안 30μl/분으로 주입한 다음, HBS-EP 완충액에서 2.5분 동안 해리되도록 허용했다. 재생은 10mM 글리신 pH 1.5(GE Healthcare, BR100354)를 30초 동안 30μl/분의 속도로 주입하여 달성했다. 감산된 데이터(유동 세포 2 - 유동 세포 1)는 BIAevaluation 3.2 소프트웨어(GE Healthcare)를 사용하여 분석되었다. 결합 ELISA로부터 이 검정에서 테스트된 86개의 클론 중 39개의 클론이 50nM에서 10RU보다 큰 결합 반응을 나타냈으며, 따라서 재발현, 정제 및 추가 스크리닝을 위해 선택되었다.

4.3.3 결합된 MSLN 영역에 기반한 항체의 비닝

ELISA 및 Biacore 스크리닝 데이터를 기반으로 하여, 클론은 이어서 인간 MSLN에 대한 mAb의 결합이 다른 mAb의 존재하에 Octet(ForteBio)에서 생물층 간섭계(BLI)(Bio-Layer Interferometry)에 의해 테스트되는 비닝 검정에서 테스트되었다.

간단히 말해, 비오티닐화된 hMSLN-His-Avi(5㎍/ml)를 스트렙타비딘 팁(ForteBIO, 18-5020)에 5분 동안 결합시켰다. G1-AA/SS1을 1x 동적 완충액(ForteBIO, 18-1092)에서 200nM로 희석시키고, hMSLN-His-Avi에 5분 동안 결합하도록 허용했다. 다음으로, 200nM의 테스트 mAb 및 200nM의 G1-AA/SS1을 함유하는 혼합물의 결합을 5분 동안 평가하였다. 이것은 결합된 G1-AA/SS1의 부재하에 hMSLN-His-Avi에 대한 테스트 mAb의 결합과 비교하여 SS1의 부재하(즉, 결합에 대한 경쟁이 없는 경우)에서 가능한 결합의 최대 정도를 결정하였다. 두 항체가 MSLN의 동일한 영역에 대한 결합을 경쟁하는 경우, 테스트 항체는 결합할 수 없다.

G1-AA/SS1을 사용한 이러한 비닝 실험은 테스트된 FS28 결합제의 대부분(23개 중 19개)이 G1-AA/SS1의 존재하에 MSLN에 결합할 수 없었고, 따라서 G1-AA/SS1과 유사한 영역에 결합하는 것으로 간주될 수 있다. Fab 포맷의 SS1 항체에 대한 MSLN 결합 부위가 보고되었으며(Ma et al., 2012), MUC16 결합에도 관여하는 아미노산 7 내지 64로 구성되는 N-말단 영역으로 정의된다. SS1과의 결합에 대한 부분적 경쟁을 나타내거나 경쟁이 없는 추가의 클론, FS28-185 및 FS28-256이 동정되었다. 서로에 대한 이들 클론의 비닝은 이들 클론이 2개의 추가 독립적인 빈을 나타내며, 즉 MSLN의 추가의 2개의 상이한 영역에 결합할 수 있었음을 나타냈다. FS28-185는 하나의 빈('빈 2')에 할당된 반면, FS28-256은 별도의 빈('빈 3')에 할당되었다. 이러한 결과는 섹션 1.2의 에피토프 마스킹 선택이 MSLN의 여러 영역에 결합된 항체가 동정됨에 따라 성공적이었음을 보여주었다.

4.3.4 친화도

실시예 4.3.3에 기재된 각 빈에 대해, 결합 동역학은 인간 또는 시노 MSLN-His-Avi가 50 또는 100RU에서 고정된 것을 제외하고는 실시예 4.3.2에 기재된 바와 동일한 방법을 사용하여 결정되었다. 클론은 81nM 내지 0.33nM의 농도 범위에서 3배 희석으로 테스트되었다. 결합제의 순위를 매기고, 각 빈에서 최고가 선택되었다: 빈 1에서 FS28-024; 빈 2에서 FS28-185, 및 빈 3의 경우 FS28-256. 이들 클론은 모두 시노 교차 반응성이었지만(데이터는 제시되지 않음), 친화도는 이러한 시험 조건하에 계산되지 않았다. 표 4에 제시된 바와 같이, 50RU의 고정된 MSLN에서 수득된 친화도는 더 높은 수준의 MSLN에서 증가된 결합을 보여주는 100RU의 고정된 MSLN 항원에서 수득된 것보다 낮았다.

4.4 MUC16-MSLN 차단 검정

FS28-024, FS28-185 및 FS28-256은 차단 검정에서 메소텔린에 대한 MUC16의 결합을 차단하는 능력에 대해 테스트되었다. SS1은 MSLN에 대한 MUC16 결합을 차단하는 것으로 문헌으로부터 공지되어 있다(참조: Ma et al., 2012). SS1과 동일한 CDR을 포함하고 MUC16 결합을 차단할 것으로 예상되는 G1-AA/SS1 및 대조군 IgG1 항체(G1AA/HelD1.3)가 각각 양성 및 음성 대조군으로 포함되었다.

간단히 말해서, 재조합 인간 MUC16(R & D Systems, 5809-MU-050)을 maxisorp 플레이트에 1x PBS에서 0.65μg/ml로 4℃에서 밤새 코팅했다. 플레이트를 1xPBS로 3회 세척하고, 2% Tween 20 및 2% Marvel 우유를 함유하는 300μl PBS로 차단했다. 항-MSLN mAb의 농도(0.23nM 내지 500nM, 3배 희석)를 실온에서 1시간 동안 100μl의 용적으로 비오티닐화된 hMSLN-His-Avi 항원(최종 농도 2μg/ml)과 사전 혼합했다. 차단 용액을 제거한 후, mAb/MSLN 혼합물을 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양했다. 플레이트를 PBST(1x PBS 및 0.05% Tween20)로 3회 세척하고, 스트렙타비딘-HRP(Thermo Scientific, 21126, 1xPBS에서 1:1000 희석)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했다. 마지막으로, 플레이트를 PBST로 3회, PBS로 3회 세척했다. MUC16에 결합된 MSLN은 100μl TMB를 15분 동안 첨가한 다음, 100μl 1M 황산 용액을 첨가하여 가시화했다. 흡광도는 450 내지 630nM에서 판독되었다(Gen5 소프트웨어, BioTek).

빈 1 클론 FS28-024는 G1-AA/SS1의 것과 유사한 MUC16-MSLN 상호 작용의 용량 의존적 차단을 나타냈다. FS28-256은 음성 대조군 G1-AA/HelD1.3과 유사한 임의의 차단 활성을 나타내지 않았다. 반면에, FS28-185는 MSLN에 대한 MUC16의 결합을 촉진시켰다. 이들 결과는 MSLN의 3개의 상이한 영역에 결합된 클론이 리간드 차단 검정에서 3개의 상이한 거동을 나타냈다는 점에서 실시예 4.3.3의 비닝 데이터와 일치하였다.

결론적으로, 결과는 MSLN의 3개의 다른 영역(빈)에 결합하는 클론 패널이 선택되었고; MSLN의 한 영역에 결합하는 항체는 MSLN에 대한 MUC16의 결합을 차단하는 반면, 다른 두 영역에 결합하는 항체는 그렇지 않음을 보여준다.

4.5 특이성

항체 패널에 의해 결합된 MSLN의 다른 영역에 비추어, MSLN에 대한 결합에 대한 특이성을 테스트했다. FS28-024, FS28-185 및 FS28-256의 특이성은 MSLN에 대한 결합을 CEACAM-5, E-카드헤린, 트롬보모듈린 및 EpCAM과 같은 세포 접착에 관련된 다른 분자에 대한 결합과 비교하여 ELISA에 의해 테스트되었다.

maxisorp 플레이트가 1㎍/ml의 재조합 인간 MSLN-His-Avi, 인간 CEACAM-5-His-Fc(Sino Biological, 1077-H03H), 인간 E-카드헤린(R & D 시스템, 8505-EC), 인간 트롬보모듈린(Peprotech, 100-58) 또는 인간 EpCAM-hFc(사내 생산)으로 코팅된 실시예 4.3.1에 기재된 바와 같이 유사한 프로토콜이 사용되었다. 0.02 내지 1000nM의 농도 범위(3배 희석)에서 테스트된 항-MSLN mAb의 결합은 항-인간 Fab-HRP(Sigma, A0293)를 사용하여 검출했다. FS28-024, 및 FS28-185 및 FS28-256은 인간 MSLN-His-Avi에 결합되었지만(EC₅₀ 약 0.5nM 및 최대 결합 신호 3), 최대 1000nM까지 테스트된 임의의 세포 접착 분자에 대한 어떠한 결합도 관찰되지 않았다. 예상된 바와 같이, 양성 대조군 항체는 그들 각각의 표적에 결합되었다. 따라서, 항-MSLN 항체는 높은 수준의 특이성을 나타냈다.

4.6 세포 결합

선택된 항-메소텔린 mAb의 패널(FS28-024, FS28-185 및 FS28-256)은 인간 폐암 세포주 NCI-H226에서 내인성 세포 표면 MSLN에 대한 결합에 대해 분석했다.

간단히 말하면, NCI-H226 세포(ATCC CRL-5826)는 아큐타제(Gibco, A11105-01)를 사용하여 T175 세포 배양 플라스크에서 수거했다. 세포를 1200rpm에서 3분 동안 원심분리하고, DPBS(Life Technologies, 14190169) 및 1% BSA(Sigma-Aldrich, A7906)로 구성된 빙냉 FACS 완충액에 2x10⁶ 세포/ml로 재현탁시키고, 웰당 50μl를 96-웰 V-바닥 플레이트(Costar, 3894)에 시딩했다. 테스트된 모든 mAb는 0.01 내지 200nM(4배 희석)의 농도 범위에서 120μl로 FACS 완충액에서 희석되었다. 이어서, NCI-H226 세포를 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 각 mAb 희석액 100μl에 재현탁시키고, 4℃에서 45분 동안 배양했다. 세포를 150μl FACS 완충액으로 원심분리하여 2회 세척하고, FACS 완충액에서 1:1000 희석된 염소 항-인간 IgG(γ-쇄 특이적) F(ab')2 단편-R-피코에리트린 항체(Sigma, P8047)를 함유하는 100μl에 재현탁시키고, 4℃에서 45분 동안 배양했다. 세포를 150μl FACS 완충액으로 1회, 이어서 150μl DPBS로 세척하고, DAPI(Biotium, 40043)를 함유하는 150μl DPBS에 1:10.000으로 재현탁시키고, BDCantoII 또는 iQue(Intellicyt)에서 판독했다. 데이터는 FlowJo v10을 사용하여 분석하여 각 웰의 살아있는 세포에 대한 PE에 대한 신호 기하학적 평균을 결정했다.

mAb² FS28-024는 양성 대조군 G1-AA/SS1과 마찬가지로 NCI-H226 세포 상의 세포-표면 MSLN에 결합되었다. 이에 비해, FS28-185 및 FS28-256은 세포-표면 MSLN에 대해 더 약한 결합을 입증했다.

나이브 스크리닝 절차의 요약

나이브 파지 라이브러리의 초기 스크리닝에 의해 동정된 156 mAb로부터, 전장 탈글리코실화된 재조합 MSLN에 대한 결합 뿐만 아니라 시노 MSLN에 결합하는 능력을 최초 확인한 스크리닝 검정 세트를 기반으로 하여 3개의 항-인간 MSLN mAb 클론(FS28-024, FS28-185 및 FS28-256)이 선택되었다. 둘째, 클론은 그들이 결합된 MSLN 영역(빈) 및 MUC16 차단 활성의 다양성을 기반으로 하여 그룹화되었으며, 이러한 그룹 내에서 최고 친화도 결합제가 선택되었다. 생성되는 mAb 클론 FS28-024, FS28-185 및 FS28-256의 패널은 MSLN의 3개의 상이한 영역에 결합되었고, 이중 하나(빈 1, FS28-024)는 시험관내에서 MSLN에 대한 MUC16의 결합을 차단했다. 5개의 항-MSLN 항체의 패널은 MSLN에 대한 특이적 결합, 재조합 및 세포 표면 MSLN에 대한 상이한 친화도를 나타냈으며, 하기 실시예 5에 기재된 바와 같이 추가의 특성화 및/또는 최적화를 위해 선택되었다.

실시예 5: 나이브 항-MSLN mAb의 친화도 성숙 및 서열 최적화

5.1 NNK 보행 전략을 사용한 클론 FS28-024의 친화도 성숙

FS28-024는 서브나노몰 친화도로 인간 MSLN에 결합된 반면, 시노 MSLN에 대한 이의 친화도는 약 5배 더 낮았다. 시노 MSLN에 대한 결합을 개선시키기 위해, VH CDR3 영역의 5개 잔기에 NNK 보행 전략이 사용되었다.

FS28-024 VH 및 VL의 서열이 최적화되었다. 간결한 돌연변이 유발 라이브러리를 VH CDR3의 RATLF 잔기(카바트 넘버링 95-99)에서 한 번에 하나의 아미노산 잔기를 다양화함으로써 생성되어 총 5개의 개별 라이브러리를 유도했다. 라이브러리는 관심 위치에서 가능한 아미노산을 모두 나타내기 위해 낮은 중복 NNK 코돈으로 제조되었다. 정방향 및 역방향 프라이머는 라이브러리를 생성하는 데 사용된 Quickchange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent, 200518)의 지침에 따라 설계되었다. 각 돌연변이체는 HEK293 세포에서 소규모로 발현되었고, 상청액은 BIAcore에 의해 인간 및 시노 MSLN-His-Avi에 대한 결합 유지 또는 개선에 대해 스크리닝되었다. 스크리닝된 84개의 클론에서, 거의 결합이 유지되지 않았으며, 대부분은 T98 잔기의 대체물이었다. 4개의 클론, FS28-024-051, FS28-024-052, FS28-024-053 및 FS28-024-060을 재발현시키고, 정제하고 인간 및 시노 MSLN에 대한 친화도를 결정하였다. 단 하나의 클론 FS28-024-053은 단일 T98V 돌연변이(카바트 넘버링)에 의해 달성된 시노 교차 반응성의 개선을 보여주었다. 4개의 클론은 모두 대체 서열과 특성을 제공할 수 있으므로 먼저 진행되었다.

5.2 FS28-185 및 FS28-256의 친화도 성숙

FS28-024와 비교하여, 클론 FS28-185 및 FS28-256은 재조합 및 세포 표면 MSLN 둘 다에 대해 약한 친화도을 가졌고, 따라서 친화도 성숙에 적용되었다.

VH 및 VL CDR3 영역은 NNK 프라이머를 사용하여 5개 내지 6개 아미노산의 중첩 카세트를 무작위화함으로써 scFv 포맷으로 병렬로 친화도 성숙되었다. FS28-185에 대해 무작위화된 영역은 VH G95-M100F 및 VL S91-A95였고, FS28-256의 경우 그들은 VH Y95-L100B 및 VL S91-I96(카바트 넘버링)이었다. 라이브러리 생성 전에, 간결한 돌연변이유발이 CDR1 및 CDR3 영역(FS28-256 VL CDR3 라이브러리 제외)의 잠재적인 메티오닌 산화 및 탈 아미드화 부위에서 수행되었다. 2 라운드의 선택은 나이브 캠페인에 대해 기재된 바와 같이, 라운드 1에서 20nM 비오티닐화된 인간 MSLN-His-Avi 및 라운드 2에서 20 또는 2nM 시노 MSLN-His-Avi를 사용하여 수행되었다. 이어서, 가용성 scFv(단일 포인트 농도)는 난소암 세포주에 OVCAR-3(ATCC® HTB-161™)에 대한 결합에 대해 테스트되었다. OVCAR-3 세포는 StemPro 아큐타제(Gibco, A11105-01)를 사용하여 수거하고, 1200rpm에서 3분 동안 원심분리하고, FACS 완충액(2% BSA를 함유하는 DPS)에 2x10⁶ 세포/ml로 재현탁시켰다. 100μl의 OVCAR-3 세포를 96-웰 V-바닥 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 1200rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 완충제를 폐기했다. 150μl의 scFv를 세포에 첨가하고, 1시간 동안 4℃에서 배양했다. 부모 클론 FS28-185 및 256의 ScFv가 대조군으로 포함되었다. 세척 후, 세포를 100μl의 Penta His Alexa-Fluor 647(Qiagen, 109-546-098)에 재현탁시키고, Sytox Green Nucleic Acid Stain(Invitrogen S7020, 1:10000 희석)을 함유하는 100μl DPBS에 재현탁시키기 전에 세척했다. 샘플은 iQue(Intellicyt Corporation, IQue Plus)에서 실행되었으며, APC에 대한 기하학적 평균이 기록되었다.

FS28-185 및 FS28-256 모두에 대해, OVCAR-3 세포에 대한 결합이 개선된 친화도 성숙 클론이 동정되었다. 세포 결합(850보다 큰 MFI) 및 서열 다양성을 기준으로, FS28-256 VH CDR3으로부터 10개의 클론이 선택고고, VL CDR3 선택으로부터 9개가 선택되었다. 이 검정에서 테스트된 38개의 FS28-185 친화도 성숙된 클론 중에서, 14개는 VH CDR3 선택으로부터 선택되고, 하나는 VL CDR3 선택으로부터 선택되었다. 선택된 클론은 mAb² 이중특이적 항체 포맷으로 추가로 특성화되었다.

5.3 FS28-185 및 FS28-256 기반 mAb ² 의 생성

항-MSLN 결합제의 추가 특성화를 위해, FS28-024, FS28-185 또는 256의 친화도 성숙된 VH 또는 VL 영역 및 부모 클론은 mAb² 포맷으로 생성되었다. 생성되는 mAb²는 FS28-024, FS28-185 또는 FS28-256 클론의 CDR 또는 이들로부터 유래된 친화도 성숙된 변이체를 포함하는 IgG1 항체이며, CH2 도메인에 LALA 돌연변이를, CH3 도메인에 인간 CD137 수용체 결합 부위를 포함한다. 생성되는 mAb² 분자의 중쇄 및 경쇄 서열은 다음 서열번호에 제시되어 있다:

FS22-172-003-AA/FS28-024 mAb²: 서열번호 94 및 85

FS22-172-003-AA/FS28-024-051 mAb²: 서열번호 98 및 85

FS22-172-003-AA/FS28-024-052 mAb²: 서열번호 102 및 85

FS22-172-003-AA/FS28-024-053 mAb²: 서열번호 106 및 85

FS22-172-003-AA/FS28-024-060 mAb²: 서열번호 108 및 85

FS22-172-003-AA/FS28-026 mAb²: 270 서열번호 109 및 87

FS22-172-003-AA/FS28-091 mmAb²: 서열번호 110 및 88

FS22-172-003-AA/FS28-185 mmAb²: 서열번호 111 및 89

FS22-172-003-AA/FS28-256 mAb²: 서열번호 114 및 116

FS22-172-003-AA/FS28-256-001 mAb²: 서열번호 120 및 82

FS22-172-003-AA/FS28-256-005 mAb²: 서열번호 120 및 83

FS22-172-003-AA/FS28-256-012 mAb²: 서열번호 125 및 116

FS22-172-003-AA/FS28-256-014 mAb²: 서열번호 129 및 116

FS22-172-003-AA/FS28-256-018 mAb²: 서열번호 133 및 116

FS22-172-003-AA/FS28-256-021 mAb²: 서열번호 125 및 82

FS22-172-003-AA/FS28-256-023 mAb²: 서열번호 133 및 82

FS22-172-003-AA/FS28-256-024 mAb²: 서열번호 125 및 83

FS22-172-003-AA/FS28-256-026 mAb²: 서열번호 133 및 83

FS22-172-003-AA/FS28-256-027 mAb²: 서열번호 125 및 84

FS22-172-003-AA/FS28-256-271 mAb²: 3 및 84

FS22-172-003-AA/FS28-256-272 mAb²: 158 및 84

FS22-172-003-AA/FS28-256-273 mAb²: 163 및 84

이들 mAb²는 HEK293-6E 세포에서 일시적인 발현에 의해 생산되었으며, 지시된 경우, mAb Select SuRe 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제되었다.

5.4 FS28-256 친화도 성숙된 클론의 서열 최적화

모든 FS28-256 계통 클론은 VH CDR2에 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위(IMGT 넘버링 N55-X-S57, 여기서 X는 임의의 잔기이다)를 함유했다. 클론 FS28-256-027의 4개의 변이체는 VH CDR2의 N55를 알라닌, 히스티딘, 세린 및 트레오닌으로 치환함으로써 수득되었다. 이들 클론은 각각 FS28-256-271, FS28-256-272, FS28-256-273 및 FS28-256-274로 명명되었다. 클론은 고정된 및 용액 내 MSLN에 대한 결합에 대해 SPR에 의해 특성화되었다. 표 5는 SPR 결과를 보여준다. FS28-256-274는 다른 클론보다 고정된 MSLN에 대해 훨씬 더 약한 친화도를 가졌고, 따라서 진행되지 않았다. FS28-256-272 및 FS28-256-273은 고정된 MSLN에 대해 수행되었던 것보다 더 강하게 또는 유사한 강도로 가용성 MSLN에 결합되었다. 결과적으로, 세포 표면 발현된 MSLN에 대한 이들 클론 모두의 결합은 가용성 MSLN의 존재에 의해 영향을 받을 가능성이 있다. 대조적으로, FS28-256-271은 고정된 MSLN에 대해 가장 강한 결합을, 가용성 MSLN에 대해 더 약한 결합을 가져서 용액 내 MSLN보다 고정된 MSLN을 우선적으로 표적화한다.

Fcab 및 mAb 선택 및 스크리닝의 요약

이전 실시예에서 동정된 항-CD137 Fcab는 단백질 L과 같은 외부 가교결합제(실시예 2) 중 하나에 의해 가교결합될 때 NF-κB 리포터 검정에서 작용제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 동정된 항-인간 CD137 Fcab의 패널 중, FS22-172-003은, 이 클론이 가장 유리한 기능적 및 생물물리학적 특성을 나타냈기 때문에, MSLN-표적화 Fab와의 페어링을 위해 선택되었다.

이 CD137 구동 작용제 활성을 종양 미세환경에 국한시키기 위해, mAb² 포맷의 Fcab을 종양 관련 항원인 메소텔린(MSLN)을 특이적으로 표적화하는 Fab와 쌍을 이루기로 결정했다. 이것은 종양 세포에서 MSLN의 발현이 mAb²의 가교결합을 초래할 것으로 예상되기 때문에 유익할 수 있어서, Fcab은 CD137에 결합될 때 작용제 활성을 유도할 수 있을 것이다.

이전 실시예에서 동정된 바와 같이, MSLN의 상이한 영역에 결합하고 가용성 메소텔린보다 고정된 MSLN에 우선적으로 결합하는 MSLN 결합 Fab의 패널이 선택되었다.

실시예 6: CD137 및 메소텔린(MSLN)을 표적으로 하는 mAb ² 의 생산

항-CD137 Fcab FS22-172-003을 포함하는 IgG1 분자, 및 항-MSLN Fab의 패널(표 6에 나열됨)로 이루어진 CD137/MSLN mAb²를 생산하여 mAb² 포맷의 페어링의 특성화를 허용했다. 그들은 AB, CD 및 EF 루프를 포함하는 CH3 도메인 Fcab의 일부를 MSLN 결합 항체의 CH3 도메인의 상응하는 영역으로 치환하여 제조되었다. 이러한 CD137/MSLN mAb²는 CH2 도메인(AA)에 LALA 돌연변이를 포함했다. mAb²의 아이소타입은 인간 IgG1이며, 이는 그것이 결합하는 세포에 대해 ADCC를 유도할 수 있다. CD137/MSLN mAb²는 CD137을 발현하는 면역 세포에 결합할 것이기 때문에, LALA 돌연변이를 포함함으로써 면역 세포에 대한 ADCC를 유도하는 mAb²의 가능성을 감소시키기로 결정했다. 또한, 이펙터 세포 상의 Fc 감마 수용체는 생체내에서 항체의 가교결합을 유도하는 것으로 공지되어 있지만, 이것은 비효율적이며 치료적 관심 부위에서 멀리 떨어져 발생할 수 있다. 클리닉의 CD137 항체는 용량 제한 독성과 관련되었기 때문에, LALA 돌연변이를 포함하여 CD137/MSLN mAb²가 MSLN에의 결합에 의한 가교결합을 통해서 작용제 활성만을 발휘하도록 결정했다. 모든 mAb² 및 대조군 항체는 HEK293-6E 세포에서 일시적인 발현에 의해 생산되었으며, mAb Select Sure Protein A 컬럼을 사용하여 정제되었다. 이어서, mAb²는 SEC-HPLC에 의해 순도를 평가하여 분자의 단량체 백분율이 98%를 초과했음을 보장했다.

실시예 7: CD137/MSLN mAb ² 의 특성화

CD137 및 MSLN에 대한 CD137/MSLN mAb²의 결합 강도는 BIAcore 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 테스트되었을 뿐만 아니라 MSLN을 내생적으로 발현하는 관련 세포주에서 유세포 분석에 의해 세포 표면 발현된 MSLN에 대한 결합도 테스트되었다. 막-결합된 MSLN의 대안적인 스플라이싱 또는 종양 괴사 인자-a 전환 효소(TACE)에 의해 생성된 MSLN의 가용성 형태가 MSLN 양성 암 환자의 혈청에서 발견되기 때문에, 이는 치료 항체의 미끼로서 작용할 수 있음이 가정된다(Lee et al., 2018). 본 발명자들은 mAb²의 결합 특성과 결합력, 특히 가용성 및 고정된 MSLN에 대한 결합 친화도의 차이를 조사했다. 이것은 두 가지 방식으로 설정된 BIAcore 결합 실험으로 측정되었다: 첫째, 세포 표면에 존재하는 항원에 결합하는 mAb²의 동적 프로파일을 재현하기 위해, 재조합 항원을 SPR 칩에 적당한 밀도로 고정시킨 다음, mAb²를 다양한 농도로 주사했다(참조: 실시예 7.1). 둘째, 세포 표면 결합된 MSLN에 결합하는 mAb²에 가용성 MSLN을 순환시킴으로써 유도된 잠재적인 싱크 효과를 시뮬레이션하기 위해, mAb²를 칩에서 포획한 후, 재조합 항원을 다양한 농도로 유동시켰다(참조: 실시예 7.2). 또한, MSLN 양성 환자 혈청(Onda et al., 2006, 10.1158/1078-0432.CCR-05-1477)에서 전형적으로 발견되는 수준을 나타내는 수준으로 첨가된 가용성 재조합 MSLN의 효과도 세포 표면 발현된 MSLN에 대한 결합 연구 및 CD8⁺ T 세포 검정에서 철저히 조사되었다.

7.1 열렬한 조건하에서 인간 MSLN에 대한 CD137/MSLN mAb ² 의 결합 - 항원 포획 방법

BIAcore 칩에 고정된 MSLN에 대한 모든 mAb²의 결합은 열렬한 조건하에 인간 MSLN에 대한 결합 친화도를 결정하기 위해 테스트되었고, 여기서 고정된 항원의 높은 농도는 항체가 열광적으로 결합하게 하는 데 이용 가능하다. CM5 칩(GE Healthcare BR-1005-30)을 제조업체의 지침에 따라 약 100RU에서 hMSLN-His-Avi로 코팅했다. 표 6에 기재된 CD137/MSLN mAb²의 패널 및 대조군 항체 G1-AA/HelD1.3 및 G1-AA/SS1(Hassan et al. 2002)을 70μl/분의 유속으로 300nM에서 시작하는 3배 희석 시리즈의 농도 범위로 주입했다. 회합 시간은 5분이었고, 해리 시간은 10분이었다. 작동 완충액은 HBS-EP(GE Healthcare BR100188)였다. 30초 동안 30μl/분의 유속으로 글리신-HCl pH1.5를 주입하여 유동 세포를 재생시켰다. 의도적으로 블랭크로 남겨진(항원 코팅 없음) 유동 세포에 대해 이중 참조하여 데이터를 분석했다. 결합 동역학은 결합 회합(k_a) 및 해리(k_d) 속도를 생성하기 위해 1:1 Langmuir 모델로 적합화되었다. 평형 결합 상수(K_D)는 해리 속도를 각 샘플의 회합 속도로 나눔으로써 계산되었다. 데이터 분석은 BiaEvaluation 소프트웨어 버전 3.2로 수행되었다. 결과는 표 7에 제시된다.

FS28-185 및 FS28-256 부모 MSLN Fab 암을 포함하는 FS22-172-003-AA/FS28-185 및 FS22-172-003-AA/FS28-256 mAb²는 36 내지 50nM의 결합 친화도을 나타냈다.그렇지 않으면, FS28-256의 친화도 성숙된 자손을 포함한 모든 mAb²는 10nM 미만의 MSLN 결합 친화도(K_D)를 나타냈다. 실제로, 계통 FS28-024로부터의 MSLN Fab 암을 함유하는 mAb²에 대해 서브나노몰 K_D가 결정되었다.

mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256-271의 경우, 시노 교차-반응성은 정상 상태 동역학 분석을 사용하여 SPR에 의해 결정되었다. CM5 칩(GE Healthcare BR-1005-30)을 제조업체의 지침에 따라 약 50RU에서 hMSLN-His-Avi 또는 cMSLN-His-Avi로 코팅했다. mAb²는 10μl/분의 유속으로 243nM에서 시작하는 3배 희석 시리즈의 농도 범위로 주입하였다. 회합 시간은 정상 상태까지 1000초였고, 해리 시간은 30초였다. 작동 완충액은 HBS-EP(GE Healthcare BR100188)였다. 유동 세포는 30초 동안 30μl/분의 유속으로 글리신-HCl pH1.5를 주입하여 재생시켰다. 의도적으로 블랭크로 남겨진(항원 코팅 없음) 유동 세포에 대해 이중 참조하여 데이터를 분석했다. 정상 상태 친화도 모델은 BIAEvaluation 소프트웨어 버전 3.2를 사용하여 동적 데이터를 분석하는데 사용했다. cMSLN-Avi-His에 대한 결합은 hMSLN-Avi-His에 대한 결합의 3배 이내였다.

7.2 가용성 인간 MSLN에 대한 CD137/MSLN mAb ² 의 결합 - 항체 포획 방법

표 7에 기재된 CD137/MSLN mAb² 뿐만 아니라 대조군 항체 G1-AA/HelD1.3 및 G1-AA/SS1도 인간 MSLN 및 시노몰구스 MSLN에 대한 결합에 대해 SPR에 의해 테스트되었으며, 여기서 항체는 용액 내 MSLN에 대한 결합을 평가하기 위해 포획되었다(용액 내 K_D). 단백질 G(GE Healthcare 29179315)를 사용하여 약 100RU에서 mAb 또는 mAb² 샘플을 포획한 후 hMSLN-His-Avi 또는 cMSLN-His-Avi가 70μl/분의 유속으로 1000nM에서 시작하는 3배 희석 시리즈의 농도 범위로 주입되었다. 회합 시간은 5 분이었고, 해리 시간은 5분이었다. 작동 완충액은 HBS-EP(GE Healthcare BR100188)였다. 유동 세포는 15초 동안 30μl/분의 유속으로 글리신-HCl pH2.1을 주입하여 재생시켰다. 데이터는 실시예 7.1에 기재된 바와 같이 분석되었다. 결과는 표 7에 제시된다. 항체 포획 방법으로부터, 대부분의 mAb²는 결합 친화도를 현저히 감소시켰으며, 고정된 MSLN 대 가용성 MSLN에 대한 차등 결합을 갖는 열성적 항-MSLN 항체를 생성하기 위해 구현된 스크리닝 전략을 뒷받침한다. 가용성 MSLN에 대한 결합의 K_D 값은 최상의 mAb² FS22-172-003-AA/FS28-024-060의 경우 4.27nM과 최저 친화도를 갖는 mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256의 경우 1.2μM 사이였다.

모든 테스트된 mAb²는 인간 MSLN과 비교하여 54배 덜 교차 반응성인 mAb² FS22-172-003-AA/FS28-024-060을 제외하고 인간 MSLN에 대한 친화도의 10배 이내로 시노 교차-반응성이었고, 따라서 더 이상 추구되지 않았다.

모든 mAb²의 MSLN 결합 Fab 암의 친화도(K_D에 의해 측정됨)는 항원 포획(고정된 MSLN) 및 항체 포획(용액 내 MSLN) 방법 둘 다에 의해 확인되었다. 용액 내 대 고정된 K_D 값은 각 항체에 대해 다양했다. 비율은 각각의 mAb²에 대해 이의 결합이 가용성 MSLN(표 7)의 존재하에 변경되었는지의 관점에서 이의 거동의 조짐을 제공하는 이러한 K_D 값으로부터 계산되었다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 본 발명자들은 mAb²가 효율적으로 가교결합될 수 있도록 극복해야 하는 결합 친화도의 임계 값이 있지만 고정된 MSLN 대 용액 내 MSLN에 대한 결합 친화도의 차이가 또한 이 작용성이 박리된 MSLN-구동 싱크 효과에 의해 어떻게 영향을 받을 수 있는지의 관점에서 중요한 역할을 한다고 가설을 세운다.

7.3 CD137에 대한 Biacore 결합: mAb ² 포맷으로 유지된 결합 친화도

MSLN에 대한 결합 강도 이외에, 인간 CD137에 대한 CD137 Fcab의 K_D는 또한 새로운 Fab와 쌍을 이룰 때 Fcab의 결합 특성이 유지됨을 입증하기 위해 테스트되었다. Biacore CM5 칩은 제조업체의 조건에 따라 인간 Fab 포획 키트(GE Healthcare 28958325)를 사용하여 약 9000RU의 표면 밀도로 항-인간 Fab로 코팅시켰다. FS22-172-003-AA/FS28-024-052 및 FS22-172-003-AA/FS28-256-271의 샘플은 약 100RU로 포획한 후, 인간 CD137 항원(hCD137-MFC-Avi)을 70μl/분의 유속으로 81nM에서 시작하는 3배 희석 시리즈의 농도 범위로 유동시켰다. 회합 시간은 5분이고, 해리 시간은 5분이었다. 작동 완충액은 HBS-EP였다. 유동 세포는 30초 동안 30μl/분의 유속으로 pH 2.1에서 10mM 글리신-HCl의 두 번 반복 주입액을 주입하여 재생시켰다. 데이터 분석은 초기 실시예(참조: 실시예 7.1)에서 기재된 바와 같이 수행되었다. 표 8의 결과는 동일한 Fcab을 함유하지만 상이한 Fab를 함유하는 mAb² 사이에서 CD137에 대한 일관된 친화도를 보여준다. 항-CD137 Fcab는 그들이 열렬한 결합 상호 작용을 통해 단량체성 CD137에 비해 이량체성 또는 다량체성 CD137에 우선적으로 결합되도록 선택되었다. 이러한 결합력 작용 방식은 활성화된 T 세포와 같은 상향 조절된 CD137 발현을 갖는 세포를 훨씬 더 낮은 수준에서 CD137을 발현하는 다른 세포보다 우선적으로 표적화하는 데 유익하다는 가설이 세워졌다. 이는 독성과 같은 원치 않는 영향을 유발할 수 있는 오프-종양(off-tumour) T 세포 활성화를 최소화하는 데 유익할 수 있다. 또한, Fcab는 단순히 CD137에 결합하여 효능 작용을 유도할 수 없도록 가교결합된 경우에만 활성을 갖도록 설계되었다. 이들 CD137/MSLN mAb²의 맥락에서, 분자의 두 특이성의 동적 작용 방식이 mAb²가 종양 세포에서 높은 수준으로 발현된 상향 조절된 MSLN에 우선적으로 결합한 다음, 상향 조절된 CD137 발현을 갖는 활성화된 T 세포에 결합하는 결과를 초래할 수 있다고 생각된다. 분자의 Fcab 도메인의 결합 역학으로 인해, mAb² 분자가 먼저 T 세포에서 CD137에 결합하는 경우, MSLN 매개된 가교결합의 결여는 T 세포 효능 작용이 유발되지 않음을 보장한다.

7.4 세포 표면 발현된 MSLN에 대한 결합 및 가용성 MSLN에 의한 간섭

세포 표면 MSLN에 대한 결합을 확인하기 위해, 표 9에 나열된 mAb²는 인간 폐암 세포주 NCI-H226에서 내인성 세포 표면 MSLN에 대한 결합에 대해 분석되었다. 또한, MSLN은 혈액에서 박리된 가용성 형태로 발견될 수 있기 때문에, 이 순환성 MSLN이 본 mAb²의 노출 및 궁극적으로 효력에 영향을 미칠 위험이 있다. 가용성 MSLN의 존재가 최소한의 영향을 미치는지 확인하기 위해, NCI-H226 세포에 대한 추가 결합 실험은 악성 중피종 및 폐암 환자를 MSLN 양성(Cui et al., 2014)으로 정의하기 위한 진단적 가치가 있는 것으로 밝혀진 가용성 MSLN 수준의 10-20배인 20nM 가용성 MSLN의 존재하에 수행되었다. 간단히 말하면, NCI-H226 세포(ATCC CRL-5826)는 아큐타제(Gibco, A11105-01)를 사용하여 T175 세포 배양 플라스크에서 수거되었다. 항체 제제 프로토콜은 가용성 MSLN으로 보충될 때 약간 변경되었다: 항체를 FACS 완충액에서 희석하여 96-웰 V-바닥 플레이트에서 2배의 최종 농도를 제공한 다음, 각 웰로부터 60μl를 FACS 완충액 단독에 또는 60μl의 40nM 재조합 hMSLN-His(R & D systems, 3265-MS-050)(20nM hMSLN의 최종 농도를 수득하기 위해)를 함유하는 FACS 완충액에 첨가하고, 100μl를 세포에 첨가하기 전에 실온에서 1시간 동안 예비배양했다.

두 경우에, 세포를 1200rpm에서 3분 동안 원심분리하고, DPBS(Life Technologies, 14190169) 및 1% BSA(Sigma-Aldrich, A7906)로 구성된 빙냉 FACS 완충액에 2x10⁶ 세포/ml로 재현탁시키고, 웰당 50μl를 96-웰 V-바닥 플레이트(Costar, 3894)에 시딩했다. 테스트된 모든 항체는 0.01-200nM(4배 희석)의 농도 범위에서 120μl 중 FACS 완충액에서 희석시켰다. 이어서, NCI-H226 세포를 원심분리하고, 상청액을 제거하고 세포를 각 mAb 희석액 100μl에 재현탁시키고 4℃에서 45분 동안 배양했다. 세포를 150μl FACS 완충액으로 원심분리하여 2회 세척하고, FACS 완충액에서 1:1000 희석된 염소 항-인간 IgG(γ-쇄 특이적) F(ab')2 단편-R-피코에리트린 항체(Sigma, P8047)를 함유하는 100μl에 재현탁시키고, 4℃에서 45분 동안 배양했다. 세포를 150㎕의 FACS 완충액으로 한번 세척한 다음, 150μl의 DPBS로 세척하고, DAPI(Biotium, 40,043)를 함유하는 150μl의 DPBS에 1:10,000으로 재현탁시키고, BDCantoII 또는 iQue(Intellicyt)에서 판독했다. 데이터는 FlowJo v10을 사용하여 분석하여 각 웰의 살아있는 세포에 대한 PE의 신호 기하학적 평균을 결정했다.

표 9의 세포 결합 결과에 따르면, 내생적으로 발현하는 세포주 NCI-H226 상의 세포 표면 MSLN에 대한 결합은 0.3 내지 47nM 초과 범위의 EC₅₀ 값을 갖는 모든 mAb²에 대해 확인되었다. 세포 결합 친화도에 대한 가용성 재조합 MSLN의 존재의 영향은 일반적으로 대부분의 클론에 대해 관찰된 EC50의 최소(3배 미만) 증가와 함께 낮았다.

FS22-172-003-AA/FS28-256은 가용성 MSLN의 존재 및 부재하에 테스트된 대부분의 다른 클론보다 더 높은 EC₅₀을 가져서 부모 FS28-256 항체가 더 약한 결합을 가졌음을 나타낸다. 그러나, 이 부모 항체의 친화도 성숙된 변이체는 더 강한 결합을 나타냈다. 특히, FS28-256-001, FS28-256-005, FS28-256-012, FS28-256-014, FS28-256-018, FS28-256-023, FS28-256-024 및 FS28-256-026과 같은 FS28-256 유래된 클론을 함유하는 mAb²의 세포 결합 친화도는 부모보다 훨씬 더 우수했으며, 가용성 MSLN의 존재에 의해 영향을 받지 않았다. 이는 과량의 가용성 MSLN의 존재하에서도 대부분의 mAb²가 MSLN의 막 결합 형태에 우선적으로 결합됨을 입증한다. FS28-024-060 및 FS28-256-027을 함유하는 mAb²는 가용성 MSLN의 존재하에 세포에 결합할 때 가장 큰 영향을 받았으며, 이는 용액 내 MSLN에 대한 높은 친화도 결합제가 박리된 MSLN의 존재에 의해 영향을 받을 가능성이 더 높다는 것을 나타낸다. 부모 FS28-185 클론(즉, FS22-172-003-AA/FS28-185)을 함유하는 mAb²는 또한 더 높은 EC₅₀ 값을 가졌고, 따라서, 가용성 재조합 MSLN의 존재 및 부재하에 더 약한 결합을 나타냈다. 부모 클론의 친화도 성숙된 변이체도 또한 테스트되었다. 가용성 MSLN의 부재하에 결합의 개선이 mAb²에서 이러한 친화도 성숙된 클론에 대해 관찰되었다.

7.5 mAb ² 는 광범위한 범위의 내인성 메소텔린 발현 수준으로 세포주에 결합한다

다양한 MSLN 세포 밀도를 발현하는 세포에 결합하는 항-MSLN Fab 클론 FS28-256-271의 능력을 입증하기 위해, mAb²를 다음 인간 암종 세포가 이용된 실시예 7.3 에 기재된 것과 유사한 세포 결합 유세포 분석 검정에서 테스트되었다: NCI-H226 [H226](ATCC® CRL-5826), OVCAR-3 [OVCAR3](ATCC® HTB-161) 및 AsPC-1 [AsPC-1](ATCC® CRL-1682™). 실시예 2에 기재된 MSLN 음성 세포주 HEK.FRT도 또한 음성 대조군으로 사용되었다. 각 세포주에서 MSLN의 상대적 발현을 결정하기 위해, 제조업체에 의해 권장된 프로토콜(Quantum™ Simply Cellular® #816 Bangs Labs)에 따라 항체 결합 용량(ABC)을 사용했다. 세포주는 MSLN 발현 수준 순으로 순위를 매겼는데, H226이 테스트된 것들 중 최고 MSLN(ABC 315,478)을 갖고, OVCAR3은 중간 수준(ABC 103,444)을 갖고, AsPC-1은 낮은 수준(ABC 20,999)을 갖는다.

세포 결합 검정 결과는 표 10에 제시되어 있다. 발현 수준의 측면에서, FS28-256-271은 테스트된 세포주의 최고 MSLN 발현을 갖는 H226에 더 강하게 결합한다. mAb²는 OVCAR-3 및 AsPC-1 세포와 필적하는 결합을 갖는다. 예상된 바와 같이, FS28-256-271은 MSLN을 발현하는 세포에 선택적으로 결합하지만 음성 HEK.FRT 세포주에는 결합하지 않는다. 결과적으로, CD137/MSLN mAb²는 다양한 수준의 막 MSLN 발현을 발현하는 세포에서 작동할 가능성이 있다.

실시예 8: CD137/MSLN mAb2의 기능적 활성

내인성 수준의 MSLN을 갖는 세포주가 CD137/MSLN mAb²를 가교결합시켜 CD137 효능 작용 및 후속적 T 세포 활성화를 유발할 수 있음을 입증하기 위해, IL-2 또는 TNFγ 사이토카인 방출이 검정 종점으로 사용된 세포독성 CD8⁺ T 세포 검정이 개발되었다. 실시예 7에 기재된 NCI-H226, OVCAR-3, AsPC-1 및 HEK.FRT를 사용하여 이 T 세포 검정에서 CD137/MSLN mAb²를 테스트하였다.

T 세포를 단리시키기 위해, 혈소판 공여 부산물인 백혈구 고갈 추체로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리시켰다. 간단히 말해서, 백혈구 추체 내용물을 PBS로 플러슁하고, Ficoll(Sigma-Aldrich, 1440-02) 구배 위에 중첩시켰다. PBMC를 원심분리에 의해 단리시키고 Ficoll 구배를 교차하지 않은 세포를 회수했다. PBMC를 PBS로 추가로 세척하고, 잔류하는 적혈구를 제조업체의 지침에 따라 10ml 1X 적혈구 용해 완충액(eBioscience, 00-4300-54)을 첨가하여 용해시켰다. CD8⁺ T 세포는 제조업체의 지침에 따라 CD8⁺ T 세포 단리 키트 II(Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-495)를 사용하여 용리액에 존재하는 PBMC로부터 단리시켰다.

항-CD3 항체와의 배양은 T 세포의 초기 활성화를 유도하기 위한 제1 신호로 사용되었다. 96-웰 평저 조직 배양 플레이트를 PBS에서 밤새 4℃에서 8㎍/ml 항-CD3 항체(Clone UCHT1, R & D Systems, MAB100-SP)로 코팅했다. 이어서, 플레이트를 200㎕ PBS로 3회 세척했다.

8.1 MSLN 가교결합을 위해 NCI-H226을 사용하는 CD8 ⁺ T 세포 검정

이어서, 세포독성 CD8⁺ T 세포를 상기 기재된 바와 같이 PBMC로부터 단리시켰다. NCI-H226 세포를 100㎕ T 세포 배양 배지(10% FBS(Life Technologies), 1X 페니실린 스트렙토마이신(Life Technologies, 15140122), 1mM 나트륨 피루베이트(Gibco, 11360-070), 10mM Hepes(Sigma-Aldrich, H0887), 2mM L-글루타민(Sigma-Aldrich, G7513) 및 50μM 2-머캅토에탄올(Gibco, M6250)을 갖는 RPMI 배지(Life Technologies, 61870-044))에서 항-CD3 항체 코팅된(8μg/㎖) 96 웰 평저 플레이트 위에 웰당 2 x 10⁴ 세포로 플레이팅했다. 4시간 배양 후 세포가 부착되면, 모든 T 세포 배양 배지를 제거하고, 4.0 x 10⁵ 세포/ml의 농도로 T 세포를 함유하는 50μL T 세포 배양 배지로 대체하여 2.0 x 10⁴ 세포/웰을 생성했다. mAb²는 60nM에서 시작하여 2x 최종 농도로 T 세포 배지에서 희석시키고, 1:3 또는 1:7 연속 희석이 수행되었다. 총 검정 용적이 200μl이고 항체 농도가 1배인 경우 50μl의 mAb² 적정을 세포에 첨가했다. 이 검정에서 테스트된 분자의 세부 사항은 표 11에 제공되며, G1-AA/20H4.9는 각 검정에서 양성 대조군으로 사용되었다(데이터는 제시되지 않음).

상기 검정은 37℃, 5% CO₂에서 72시간 동안 배양했다. 상청액을 수집하고 제조업체의 지침에 따라 Meso Scale Discovery(K151QQD-4)의 V-PLEX IL-2 키트로 검정했다. 인간 IL-2(hIL-2)의 농도를 항체의 로그 농도에 대해 플롯팅하고, 생성되는 곡선을 GraphPad Prism에서 로그(작용제) 대 반응 방정식을 사용하여 적합화했다.

표 11은 검정의 상이한 반복에 걸쳐 T 세포 활성화 검정에서 관찰된 IL-2 방출의 EC₅₀ 값 및 최대 반응을 나타낸다. 수행된 검정 횟수로 인해 여러 공여자의 T 세포가 사용되었다. 각각의 경우에, 양성 및 음성 대조군이 각 검정에서 사용되어 검정 및 공여자를 교차하는 일관된 데이터 세트를 보장했다. 양성 대조군 항-인간 CD137 항체인 20H4.9는 0.5nM의 EC50으로 hIL-2 방출의 증가를 보여준다. 오프-표적화 CD137-매개 T 세포 효능 작용의 결여는 상기 기재된 것과 유사하지만 MSLN 양성 NCI-H226 대신 MSLN 세포를 발현하도록 형질 도입되지 않은 HEK-FRT를 사용한 CD8⁺ T 세포 검정에서 확인되었다. 클리닉의 일부 다른 CD137 분자에서 관찰된 용량 제한 독성의 사례로 인해 CD137 항체에서 특히 오프-표적화 활성화의 회피가 매우 바람직하며, 따라서 이 인자는 어느 mAb² 조합이 선택되었는지를 결정하는 데 사용되었다. 다음 mAb²는 IL-2 방출의 증가를 보여주었고, 각각 서브나노몰 EC50을 갖는다: FS22-172-003-AA/FS28-024-051, FS22-172-003-AA/FS28-024-052, FS22-172-003-AA/FS28-024-053, FS22-172-003-AA/FS28-024-060, FS22-172-003-AA/FS28-256-021, FS22-172-003-AA/FS28-256-023, FS22-172-003-AA/FS28-256-026, FS22-172-003-AA/FS28-256-027. 도 1은 T 세포 활성화 검정에 대한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 도시한다. 이러한 결과는 FS28-185 계통(도 1B)의 Fab를 포함하는 mAb²가 이러한 특별한 검정에서 기능적 활성을 나타내지 않음을 시사한다. 놀랍게도, FS28-185 계통의 Fab와 쌍을 이룬 모든 mAb²는 IL-2 방출이 매우 제한적이고 감소되거나 전혀 나타내지 않는다. 이는, 그 계통의 Fab가 MSLN에 결합할 수 있지만, MSLN의 이 특정 영역에 대한 결합은 이 검정에서 MSLN 가교결합시 효력을 증가시키는 방식으로 CD137/MSLN mAb²를 가교결합할 수 없는 것으로 나타난다는 것을 시사한다. 계통 FS28-024(도 1A)의 Fab 및 계통 FS28-256(도 1C)으로부터의 FS28-256-021, FS28-256-023, FS28-256-023, FS28-256-026 및 FS28-256-027을 포함하는 모든 mAb²는 서브나노몰 EC₅₀과 함께 hIL-2 방출의 증가를 보여준다.

가용성 MSLN의 존재하에 NCI-H226을 사용하는 CD8⁺ T 세포 검정

상기 기재된 CD8⁺ T 세포 기능 검정은 악성 중피종 및 폐암 환자를 MSLN 양성으로 정의하기 위한 진단 가치가 있는 것으로 밝혀진 가용성 MSLN 수준의 10 내지 20배인 20mM 농도에서 hMSLN-His의 존재하에 반복했다(Cui et al., 2014).

도 2는 가용성 MSLN의 존재 또는 부재하에서 mAb²의 서브세트의 활성을 도시한다. 예상된 바와 같이, 가용성 MSLN은 고정된 MSLN 대 가용성 MSLN에 우선적으로 결합하는 Fab와 쌍을 이룬 mAb²의 효력을 변경하지 않는다. 구체적으로, MSLN Fab FS28-024-051, FS28-024-052, FS28-024-053, FS28-256-021 및 FS28-256-023을 포함하는 mAb²는 최대 20nM 가용성 MSLN의 존재에 의해 영향을 받지 않았고, 이는 실시예 7.1 및 7.2에 기재된 친화도 및 세포 결합 데이터와 일치한다.

흥미롭게도, mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256-027은 20nM의 가용성 MSLN과 함께 배양되었을 때 가장 큰 효력 손실을 나타내어 EC₅₀의 상당한 변화를 초래했다. 이는 실시예 7.1 및 7.2의 친화도 결과와 일치하며, 여기서 FS28-256-027은 고정된 MSLN과 가용성 MSLN 둘 다에 대해 높은 친화도를 나타내어 가용성 MSLN에 대한 높은 친화도가 바람직하지 않다는 이론을 뒷받침한다. 결과는 막 MSLN에 우선적으로 결합하는 클론이 가용성 MSLN의 존재에 의해 덜 간섭받는다는 조기 기재된 가설과 일치한다. 이러한 맥락에서, 클론 FS28-256-027은 고정된 MSLN 및 용액 내 MSLN 모두에 대한 높은 친화도 결합을 나타내고, mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256-027을 사용한 기능적 데이터는 20nM sMSLN으로 처리될 때 EC₅₀의 상당한 변화를 나타낸다. MSLN Fab FS28-024-051, FS28-024-052, FS28-024-053, FS28-256-021 및 FS28-256-023을 포함하는 잔류하는 mAb²는 최대 20nM의 존재하에 영향을 받지 않았고, 이는 상기 기재된 친화도 및 세포 결합 데이터와 일치한다.

8.2 가교결합을 위해 OVCAR-3을 사용한 CD8 ⁺ T 세포 검정

메소텔린 양성 암은 광범위한 발현 수준을 가지며, 따라서, 세포 표면에서 더 낮은 MSLN 밀도를 갖는 세포를 사용하여 실시예 8.1에서 서브나노몰 효력을 갖는 것으로 동정된 mAb² 중 일부의 작용성을 평가하는 것이 바람직했다. 이를 달성하기 위해, T 세포 활성화 검정은 상기 실시예 8.1에 기재된 바와 같이 수행되었지만, 이번에는 OVCAR-3 세포주(ATCC® HTB-161)를 사용했다. 이들은 NCI-H226 세포보다 더 낮은 수준의 MSLN을 내생적으로 발현하는 MSLN 양성 난소 암종 세포이다. 실시예 8.1에 기재된 동일한 프로토콜이 다음과 같은 변화와 함께 이어졌다: 세포 크기 및 형태의 차이로 인해, OVCAR-3 세포를 100μl T 세포 배양 배지에서 항-CD3 항체 코팅된(8μg/ml) 96 웰 평저 플레이트에 웰당 1 x 10⁴ 세포로 플레이팅했다. 4시간 배양 후 세포가 부착되면, 모든 T 세포 배양 배지를 제거하고, T 세포를 8.0 × 10⁵ 세포/ml의 농도로 함유하는 50μl T 세포 배양 배지로 대체하여 4.0 x 10⁴ 세포/웰을 초래했다. 결과는 OVCAR-3 세포와 가교결합될 때 IL-2 방출을 유도하는 모든 테스트된 mAb²의 능력을 확인한다(참조: 도 3). 이러한 데이터는 이러한 mAb²가 상이한 종양 세포주에 걸쳐 광범위한 MSLN 밀도에 걸쳐 작동할 가능성이 있음을 시사한다. HelD 1.3 모의 mAb² 포맷의 Fcab FS22-172-003(FS22-172-003/HelD1.3)은 MSLN에 결합하지 않았기 때문에 이 검정에서 또한 테스트되었고, IL-2 방출의 결여는 항-인간 CD137 Fcab가 Fab 암(이 경우에 MSLN)을 통해 가교결합되었을 때만 기능적임을 나타냈다.

8.3 서열 최적화된 FS28-256 친화도 성숙된 클론의 기능적 스크리닝

실시예 8.2에 기재된 FS28-256 계통의 항-MSLN Fab를 함유하는 모든 mAb²는 실시예 5.4에 기재된 바와 같이 제조된 VH CDR2에 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위를 함유한다. 다음 치환을 갖는 3개의 mAb² 변이체가 생성되었다: IMGT 명명법에 따라, 각각 N55A, N55H 또는 H55S의 아미노산 치환을 함유한 FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-256-272 및 FS22-172-003-AA/FS28-256-273. 이러한 서열 최적화된 mAb²의 효력을 입증하기 위해, CD8⁺ T 세포 활성화 검정을 실시예 8.1에 기재된 바와 같은 MSLN + NCI-H226 세포와의 공-배양으로 수행되었다. mAb²는 또한 가용성 MSLN의 존재하에 테스트되었다.

도 4 및 표 12는 이러한 mAb²의 효력 및 분자의 전반적인 효력에 대한 가용성 MSLN의 효과를 나타낸다. mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256-271은 테스트된 3개의 mAb² 효력의 최소 감소를 나타냈다. 실시예 8.1 및 7.2에 기재된 데이터와 일치하여, 용액 내 MSLN과 비교하여 고정된 MSLN에 높은 친화도로 결합하는 MSLN Fab는 가용성 MSLN의 존재에 의해 영향을 덜 받았다; mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256-271은 가용성 MSLN의 부재하와 비교하여 가용성 MSLN의 존재하에 EC₅₀의 최소 변화를 나타냈고, EC₅₀의 3배 감소가 관찰되었다. 실시예 7.1에 보고된 친화도 측정과 일치하여, 이 mAb²는 용액 내 MSLN과 비교하여 고정된 MSLN에 대해 더 강한 친화도를 나타냈다. 또한 실시예 7.1과 일치하여, mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256-272 및 FS22-172-003-AA/FS28-256-273은 더 강한 친화도로 용액 내 MSLN에 결합되었고, 이는 도 4에 도시된 바와 같이, 가용성 MSLN이 존재하지 않을 때와 비교하여 가용성 MSLN의 존재하에 이 검정에서 이러한 클론의 EC₅₀에 대한 큰 영향으로 번역되었다. 따라서, mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256-271이 추가 특성화용으로 선택되었다.

8.4 광범위한 MSLN 수준을 발현하는 내인성 세포주 및 다수의 PBMC 공여자에 걸쳐 발현 의존성 CD137/MSLN mAb ² 효력

실시예 8.1 및 8.2에서 언급된 바와 같이, 암 환자는 불균일한 수준의 MSLN을 발현한다. 따라서, 다양한 수준의 MSLN을 발현하는 다양한 세포에 걸쳐 FS22-172-003-AA/FS28-256-271 mAb²의 효력을 결정하는 것이 바람직하였다. CD8⁺ T 세포 검정은 실시예 8.1 및 8.2에 기재된 바와 같이 수행되었다. 72시간 후 IL-2 측정 이외에, IFNγ 생산은 또한 제조업체의 지침에 따라 V-PLEX 인간 IFNγ MSD 키트(Meso Scale Discovery, K151QOD-4)를 사용하여 96시간 후에 측정되었다.

표 13에 보고된 모든 검정에서, mAb² FS22-172-003-AA/FS28-256-271은 IL-2(72h) 및 IFNγ(96h)의 생산을 위한 서브나노몰에 의해 입증된 바와 같이 상이한 수준의 MSLN을 발현하는 세포에 의해 가교결합될 때 강력한 T 세포 활성화를 유도할 수 있었다(참조: 표 13). 흥미롭게도, IL-2 및 IFNγ 생산은 가교결합 세포에 존재하는 MSLN의 양에 따라, 예를 들어, 낮은 수준의 MSLN(AsPC-1)을 발현하는 세포와 가교결합되었을 때 감소되었다. 이 감소는 IL-2 생산과 비교하여 IFNγ를 측정할 때 덜 현저했지만, 모든 경우에 mAb²는 서브나노몰 효력을 나타내었다. 또한, mAb²가 MSLN 음성 HEK.FRT 세포와의 공-배양으로 테스트되었을 때, mAb²는 사이토카인 생산 부족으로 입증된 바와 같이 임의의 작용제 활성도 유도하지 않았다. 전반적으로, 이러한 결과는 mAb²가 MSLN의 낮은 수준으로도 T 세포 활성화를 유도할 수 있고, mAb²에 의해 유도된 T 세포 활성화의 수준이 mAb²를 가교결합시키기 위해 존재하는 MSLN의 수준에 의존한다는 것을 시사하고, 따라서 mAb²의 효력이 세포의 MSLN 발현 밀도와 관련된다는 것을 입증한다.

실시예 9: 항-마우스 CD137 Fcab의 생산

생체내에서 마우스 및 인간 CD137 서열 사이의 낮은 서열 상동성으로 인해, 마우스 CD137에 특이적으로 결합된 Fcab가 생성되었고, 불변 도메인에 CD137 항원 결합 영역을 함유하는 mAb²의 활성이 생체내 마우스 모델에서 테스트될 수 있도록 특성화되었다.

9.1 항-마우스 CD137 Fcab의 나이브 선택

인간 CD137에 결합하는 Fcab를 선택하기 위해, 인간 CD137에 결합하는 Fcab의 선택에 대해 이전에 기재된 바와 유사한 효모 디스플레이 선택 캠페인이 사용되었다(참조: 실시예 2.1). 재조합 마우스 이량체가 항원으로 사용되었다(참조: 실시예 1).

인간 CD137에 결합하는 Fcab의 선택에 이전에 사용된 인간 IgG1의 CH1 내지 CH3 도메인을 나타내는 4개의 나이브 효모 라이브러리가 마우스 CD137에 결합하는 Fcab의 선택에 사용되었다. 항-마우스 CD137 결합제를 동정하기 위해 총 53회의 개별 라운드 선택이 수행되었다. 사내 생산된 재조합 이량체성 비오티닐화된 마우스 CD137(mCD137-mFc-Avi) 항원을 사용하여 효모 나이브 라이브러리에서 결합제를 선택했다.

9.2 나이브 선택으로부터 항-마우스 CD137 Fcab의 특성화

마우스 CD137에 대한 항-마우스 CD137 Fcab의 특이성이 HelD1.3 "모의" mAb² 포맷으로 테스트되었고, 다른 마우스 TNFRSF 수용체(CD40, OX40, GITR)에 대한 Fcab의 결합에 대해 테스트하여 Octet QKe 시스템으로 BLI에 의해 측정되었다. 10ng/μl 마우스 CD40, GITR, OX40 수용체를 코팅하기 위한 스트렙타비딘 바이오센서(PALL ForteBio 18-5021)(모두 R & D Systems에서 입수되고, Thermoscientific #21328의 EZ-Link Sulfo-NHS-SS-비오틴 키트를 사용하여 비오티닐화됨). 모의 mAb² 포맷의 항-마우스 CD137 Fcab을 동적 완충액(PALL 18-1092)에서 적어도 1μM의 최종 농도로 1:1 희석했다. 항원 코팅된 센서를 mAb² 용액에 180초 동안 침지시킨 후 1x 동적 완충액에 180초 동안 침지시켰다. TNFRSF 수용체 각각에 대한 항체를 양성 대조군으로 사용했다. Fcab 클론 FS22m-055, FS22m-063, FS22m-066, FS22m-075, FS22m-135, FS22m-055, FS22m-063, FS22m-066은 테스트된 임의의 TNFRSF 수용체에 결합하지 않았고, 따라서 마우스 CD137에 대한 이들의 특이성을 입증한다.

마우스 CD137 서열(서열번호 150)을 발현하는 HEK.FRT.luc 세포는 실시예 2.3에서 이전에 기재된 바와 동일한 방법론에 따라 생산되었다. 이전에 선택된 항-마우스 CD137 Fcab를 함유하는 mAb²는 실시예 2.3에 기재된 방법에 따라 이 세포주 HEK.FRT.luc.mCD137를 사용하여 스크리닝되었다. 56개의 mAb²가 테스트되었고, 이중 29개는 NF-κB 활성에 대해 양성이었다. LALA 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 Fc를 함유하는 Lob12.3(G1AA/Lob12.3)은 양성 대조군 항-마우스 CD137 mAb로서 사용되었고, 발광을 증가시켜 검정의 유효성을 확인했다. 또한 LALA 돌연변이가 있는 인간 IgG1 Fc를 함유하는 HelD1.3은 음성 대조군 인간 IgG 아이소타입으로 사용되어 이 검정에서 인간 IgG 모의 Fab으로부터의 간섭을 배제했다. EC₅₀은 가능한 경우 계산되었고, 활성의 안정기에 도달하지 않은 mAb²는 고전적인 S자형 활성 동역학을 나타내는 mAb²를 선호하여 대해 무시되었다. mAb²는 EC50의 순 및 단백질 L 가교결합시 활성의 배수 변화로 순위를 매겼다. FS22m-063은 가교결합시 최고의 EC50(1.44nM)과 가교결합시 활성의 최고 배수 변화(27배)를 갖는 것을 기준으로 선택되었다.

실시예 10: 항-마우스 MSLN 항체의 선택 및 특성화

10.1 항-마우스 MSLN mAb의 나이브 선택

마우스와 인간 MSLN 사이의 아미노산 동일성은 낮다(60%). 마우스에서 생체내 개념 증명(PoC) 연구를 가능하게 하기 위해, 본 발명자들은 실시예 4 및 5에 기재된 항-인간 MSLN mAb와 유사한 특성을 갖는 항-마우스 MSLN mAb를 단리시키기 시작했다.

CDR1, CDR2 및 CDR3(MSM Technologies)에서 무작위화와 함께 인간 IgG1 생식 계열의 Fab 도메인을 나타내는 합성 나이브 파지미드 라이브러리를 사용한 파지 선택은 섹션 1.2에 기재된 바와 같이 비오티닐화된 마우스 MSLN-His-Avi(서열번호 143, 섹션 1.1 참조)를 사용한 선택에 사용되었다. 감소하는 농도의 비오티닐화된 mMSLN-His-Avi로 항-인간 MSLN 선택과 유사하게 4라운드의 선택이 수행되었고, 에피토프 마스킹 전략이 후속 캠페인에서 수행되었다. 또한, 재조합 항원을 사용하는 제1 라운드 후, HEK293-mMSLN 세포가 생성되었고, 2, 3, 4라운드에 사용되었다.

간단히 말해서, 마우스 MSLN(서열번호 145 서열을 인코딩하는 cDNA를 pcDNA5/FRT/TO 벡터(Life Technologies, V652020)로 서브클로닝한 다음, Flp 재조합 효소 발현 플라스미드 pOG44(Life Technologies, V600520)를 사용하여 Flp-In TREx 293 세포주(Life Technologies, R78007)로 공동-형질감염시켰다. 세포를 10% FBS, 100μg/ml 하이그로마이신 B(Melford Laboratories Ltd, Z2475) 및 15μg/ml 블라스티시딘(Melford Laboratories Ltd, B1105)을 함유하는 DMEM에서 안정적으로 형질전환된 세포의 콜로니가 형성될 때까지 3 내지 4주 동안 성장시켰다. 이러한 콜로니를 1μg/ml 독시사이클린(Sigma Aldrich, D9891)의 존재하에서 증폭시키고, 항-마우스 MSLN(LS Bio, LS-C179484)을 사용하여 MSLN의 발현에 대해 테스트했다.

농축된 집단으로부터 총 47개의 개별적 mAb를 항원 결합을 위해 스크리닝하고, 45개의 고유한 양성 결합제를 서브클로닝하고, 실시예 1.3에서 이전에 기재된 바와 같이 IgG1 LALA 포맷의 가용성 mAb로 발현시켰다. mAb는 ELISA에 의해 고정된 mMSLN-His-Avi에 대한 특이적 결합에 대해 특성화되었고, Biacore 분석을 사용하는 동적 실험에서 약 50 또는 200RU의 고정된 mMSLN-His-Avi에 대한 친화도를 기준으로 순위를 매겼다. 이것은 1 내지 25nM 범위의 친화도를 갖는 FS28m-228을 포함하는 mAb의 패널을 동정했다. 또한, MSLN의 상이한 영역에 대한 결합은 섹션 2.1.3에 기재된 바와 같이 테스트되었다. MOR6626 클론(특허 공보 제WO 2009/068204 A1호)의 VH 및 VL을 클로닝하여 생성된 마우스 교차 반응성 mAb G1-AA/MOR6626을 양성 대조군으로 사용했다. FS28m-228이었던 대부분의 클론은 이미 MOR6626에 결합된 MSLN에 결합하지 못한 반면, FS28-194 또는 FS28-261과 같은 다른 클론은 각각 부분적 또는 전체 결합을 나타냈다. 따라서, 상이한 영역(빈)에 결합하는 클론은 단리시켰다.

요약: 항-마우스 Fcab 및 mAb 선택 및 스크리닝

이전 실시예에서 동정된 항-마우스 CD137 Fcab는 단백질 L과 같은 외부 가교결합제(실시예 9) 중 하나와 가교결합될 때 NF-κB 리포터 검정에서 작용제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 동정된 항-인간 CD137 Fcab의 패널 중에서, FS22m-066이 마우스 MSLN-표적화 Fab와의 페어링을 위해 선택되었는데, 이는 이 클론이 가장 유리한 기능적 및 생물 물리적 특성을 나타냈기 때문이다.

파지 선택 및 항체 스크리닝 전략은 다양한 친화도를 가지며 mMSLN의 상이한 영역에 결합하는 항-마우스 메소텔린 결합 클론의 패널의 동정을 유도했다. 항-인간 MSLN 결합제와 마찬가지로, 클론은 가용성 mMSLN보다 고정된 mMSLN에 대한 결합을 선호하는 결합 특성을 나타내어 그들을 뮤린 생체내 PoC 연구에서 연구에 적합한 분자이도록 했다.

실시예 11: 항-마우스 CD137/MSLN mAb ² 의 생산

실시예 10에 기재된 바와 같이, 나이브 항-마우스 MSLN 항체 패널이 발견되고, 유익한 결합 및 표적화 특성에 대해 스크리닝되었다. 항-마우스 CD137 Fcab이 실시예 9에 기재된 바와 같이 선택되었다. 항-마우스 CD137 Fcab(FS22m-063) 및 항-마우스 MSLN Fab(FS28m-228 및 FS28m-228-010)를 사용하여 동계 마우스 종양 모델에서 MSLN-표적화된 CD137 효능 작용의 완전한 시험관내 특성화 및 생체내 개념 증명을 위한 마우스 mAb²를 생성하였다. Fab는 결합 친화도, 결합력 및 기능적 활성 사이의 관계를 조사하기 위해 선택되었다. mAb²는 중쇄의 CH2 도메인에 LALA 돌연변이를 갖고, Fc-감마 수용체 구동된 가교결합 및 이펙터 기능의 기여를 최소화할 목적으로, 실시예 6에 기재된 바와 같이 작제되었고, 각각 동정자 FS22m-063-AA/FS28m-228(서열번호 136(경쇄), 137(중쇄)) 및 FS22m-063-AA/FS28m-228-010(서열번호 136(경쇄) 및 166(중쇄))이 제공되었다. mAb²는 HEK293-6E 세포에서 일시적인 발현에 의해 생산되었고, mAb Select Sure 단백질 A 컬럼을 이용하여 정제되었다.

11.1 결합 동역학

항-인간 MSLN 결합제와 마찬가지로 고정된 MSLN 및 가용성 MSLN에 대한 결합 에 대한 mAb²의 친화도는 Biacore 기기를 사용하여 SPR에 의해 테스트되었다.

고정된 MSLN에 결합하는 절차는 50RU에서 고정된 mMSLN-His-Avi를 사용하여 실시예 7.1 및 7.2에 기재된 방법과 유사했다. 가용성 MSLN에 대한 친화도를 결정하기 위해, 항-인간 Fc를 통해 mAb²를 포획했다. 요약하면, 25μg/ml 항-인간 IgG(Fc) 항체(GE Healthcare, Human Antibody Capture Kit, BR100839)를 Biacore 센서 칩 CM5(GE Healthcare, BR100530)에 고정시켜 약 750RU의 최종 반응을 달성했다. 50nM의 HBS-EP 완충액(GE Healthcare, BR100188)에서 희석된 mAb² 분자를 30μl/분으로 개별적으로 주입하여 약 100RU의 반응을 달성했다. HBS-EP 완충액에서 희석된 재조합 mMSLN-His-Avi 항원을 70μl/분으로 5분 동안 3배 희석으로 243nM 내지 0.11nM의 농도 범위로 주입한 후 5분 동안 완충액에서 해리시켰다. 재생은 3M 염화마그네슘(GE Healthcare, 인간 항체 포획 키트, BR100839)을 30초 동안 30μl/분의 속도로 주입하여 달성했다.

동적 데이터는 표 14에 제시된다. FS22m-063-AA/FS28m-228-010은 가용성 박리된 MSLN보다 막 결합된 MSLN에 더 강한 결합을 보였는데, 이는 아마도 강화된 열렬한 결합 상호 작용 때문일 것이다. 친화도 성숙된 mAb² FS22m-063-AA/FS28m-228-010은 고정된 MSLN 용액 및 용액 내 MSLN 모두에 대한 결합의 개선을 나타냈다. FS28m-228-010은 혈액에서 MSLN을 순환시켜 싱크 효과를 피하는 데 유익한 것으로 간주된 고정된 MSLN에 우선적으로 결합하기 때문에 선택되었다. 이 클론은, 인간 Fab FS28-256-271과 마찬가지로, 한 자릿수 나노몰 범위로 고정된 MSLN에 결합되어 용액 내 MSLN에 비해 고정된 MSLN을 우선적으로 표적화한다.

11.2 마우스 MSLN 양성 세포를 사용한 마우스 CD137/MSLN mAb ² 의 기능적 활성

활성화된 세포 독성 CD8⁺ T 세포는 암 세포를 직접 사멸하는 역할을 하고, 세포 표면에서 CD137을 발현한다(Ye et al., 2014). CD137의 클러스터링은 다운 스트림 신호 전달 및 추가의 CD8⁺ T 세포 활성화를 유도하는 데 필수적인 것으로 공지되어 있다. 따라서, CD8⁺ T 세포 활성화 검정을 사용하여 mAb²가 CD137의 클러스터링 및 후속적 다운스트림 신호전달을 유도하는 능력을 평가했다. CD8⁺ T 세포 활성화는 난백 알부민 펩티드 257-264에 특이적인 T 세포 수용체를 갖는 C57 BL/6-Tg(Tcra Tcrb) 1100Mjb/Crl OT-I 마우스(Jackson Laboratory, Cat 번호 003,831)로부터 단리된 유전자 변형된 OT-1 T 세포의 항원 자극에 의해 달성되었고, IFNγ의 방출에 의해 결정되었다.

T 세포를 단리시키기 위해, 비장 세포를 신선한 OT-1 마우스 비장으로부터 단리시켰다. 간단히 말해서, C57Bl/6 OT-1 마우스의 각 비장을 수집하고 PBS에 저장 한 후 6-웰 조직 배양 플레이트의 웰로 옮기고 2개의 바늘로 기계적으로 파괴했다. 파괴된 비장은 70μm 세포 스트레이너를 통해 통과시키고 스트레이너를 PBS로 세정했다. 이어서, 세포 현탁액을 원심분리로 펠릿화하고, 상청액을 제거하고, 제조업체의 지침에 따라 10ml 1X 적혈구 용해 완충액(eBioscience, 00-4300-54)을 첨가하여 적혈구를 용해시켰다. 비장 세포를 웰당 10x10⁶개 세포로 6-웰 플레이트에 10nM SIINFEKL 펩티드를 함유하는 배지(IMDM, 5% FCS, 50μM 2-머캅토 에탄올, 1X Penstrep)에서 웰당 2x10⁶개 세포로 T 세포 활성화를 위해 플레이팅했다. 플레이트를 5% CO2와 함께 37℃에서 48시간 동안 배양했다. 48시간 후, CD8 T 세포는 제조업체의 지침에 따라 CD8⁺ T 세포 단리 키트(Milentyi Biotec, 130-104-075)를 사용하여 단리시켰다. 단리되고 활성화된 CD8 T 세포를 30U/ml IL-2(Peprotech, AF-200-02)가 보충된 배지(IMDM, 5% FCS, 50μM 2-머캅토 에탄올, 1X Penstrep)에 플레이팅하고, 추가의 3일 동안 각각 매일 분할할 때마다 ml당 1x10⁶ 미만으로 유지시켰다. 확장 3일 후, 세포를 다음 검정 사용하였다.

이 실시예에 사용된 CD8⁺ T 세포는 두 개의 별도의 동물로부터 유래되었고, 비장 세포 확장은 18개월 간격으로 수행되었고, 따라서 시험편 A 및 B 사이의 T 세포 활성화의 변화가 예상된다.

전장 마우스 메소텔린(서열번호 145)을 발현하는 CT26 결장 암종 세포(ATCC, CRL-2638)를 생산하여 막 결합된 형태로 항원을 제시하였다. 리포펙션(리포펙타민 3000, Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 L3000008)은 pcDNA3.1 벡터(+)(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 V79020)을 사용하여 이러한 세포를 생성하는데 사용했다. 제조업체의 프로토콜에 따라서, CT26 세포를 마우스 MSLN cDNA를 함유하는 pcDNA3.1 벡터로 형질감염시켰다. 이어서, 안정한 형질감염은 완전 배지(RPMI, 10% FBS) 중 선택 항생제(600μg/ml에서)로서 제네티신을 사용하여 달성되었다.

CT26 세포 상의 마우스 MSLN의 발현은 양성 대조군 항체 MOR6626을 사용하여 유세포 분석으로 확인되었다. 세포를 양성 대조군 항체와 함께 1시간 동안 배양한 다음, 형광 표지된 항-인간 IgG 검출 항체(Stratech Scientific Ltd, 카탈로그 번호 109-546-098-JIR)를 사용하여 세포 결합을 검출했다. 클론 집단을 확장하고, 후속적으로 동일한 유세포 분석 절차를 사용하여 상대적 발현 수준을 결정하기 위해 분석한 후, 상이한 수준으로 마우스 MSLN을 발현하는 두 클론을 항-마우스 MSLN Fab: CT26.B2(높은 MSLN 발현) 및 CT26.G10(중간/낮은 MSLN 발현)를 연구하기 위한 도구로서 진행시켰다. 다양한 MSLN 발현을 갖는 세포를 제공하기 위해, MSLN을 내성적으로 발현하는 Panc02 세포 NIC/NIH(Maryland, USA)도 또한 사용되었다. 이들 세포는 시험관내 및 생체외에서 낮은 수준의 MSLN을 발현하였으며, IHC에 의해 결정된 바와 같이 세포질 발현을 나타냈다(데이터는 제시되지 않음). 메소텔린 발현은 또한 후속적으로 IHC에 의해 생체외에서 확인되었다(데이터는 제시되지 않음).

CT26.B2, CT26.G10 및 Panc02 세포를 SIINFEKL 펩티드(500nM)와 함께 배양 하고, 웰당 2 x 10⁴개의 OT-1 세포를 50μl 배지 중 MSLN⁺ 세포에 첨가했다. 테스트 항체는 60nM(4 × 최종 농도)에서 시작하는 1:4 적정으로 제조하였고, 따라서 각 웰에 50μl의 항체 혼합물을 첨가하여 최종 검정 용적 200μl를 유도했다. 검정은 5% CO2와 함께 37℃에서 3일 동안 배양되었다. 3일 후, 상청액을 수거하고 mIFNγ(eBioscience, cat no. 88-7314-88)에 대한 ELISA를 제조업체의 지침에 따라 수행했다.

마우스 CD137/MSLN mAb²는 가용성 마우스 MSLN의 부재하 및 존재하에 이러한 T 세포 검정으로 스크리닝하였다. 시판되는 마우스 mMSLN-His Biolegend(# 594008),. CT26.G10 종양을 동반하는 마우스의 혈액 혈청 분석으로 혈액 중 MSLN의 평균 농도가 100pM인 것으로 결정되었다(데이터는 제시되지 않음). 따라서, 가용성 MSLN에 의한 간섭을 연구하기 위해, 최대 2nM이 기능적 검정에 사용되었다.

표 15 및 도 5에 제시된 바와 같이, mAb² FS22m-063-AA/FS28m-228-010은 CT26.G10 세포주에 의해 가교결합될 때 부모 FS22m-063-AA를/FS28m-228보다 더 큰 효력을 가졌다. 다음 음성 대조군은 또한 하나의 검정에서 테스트되었는데, 이는 예상된 바와 같이, 임의의 사이토카인 판독치를 유도하지 않았다: 모의 mAb² 포맷의 FS22m-063 Fcab(HelD1.3) 및 MSLN-표적화 양성 대조군(G1/MOR6626). 도 5에 도시된 바와 같이, 2nM의 가용성 MSLN의 존재는 조작된 MSLN⁺ CT26 세포보다 막 MSLN을 덜 발현하는 Panc02 세포를 제외하고 낮은 피코몰 범위의 모든 EC50 값으로 IFNγ 방출에 최소한의 영향을 미쳤다. 인간 mAb2와 유사하게, mAb2에 의해 유도된 T 세포 활성화 수준은 가교결합 세포에 존재하는 MSLN 수준에 따라 달라진다.

실시예 12: 생체내 개념의 증명

mAb²가 T 세포 검정에서 기능을 가짐을 보여주었으므로, 동계 면역 적격 종양 모델에서 생체내에서 mAb² FS22m-063-AA/FS28m-228의 기능을 테스트하는 것이 바람직했다.

12.1 CT26.B2 동계 종양 모델에서 생체내 FS22m-063-AA/FS28m-228의 효능

높은 MSLN 발현 종양 모델에서 FS22m-063-AA/FS28m-228의 항종양 효능을 결정하기 위해, 9 내지 10주령 Balb/C 암컷 마우스(Charles River)를 연구 개시 전에 1주일 동안 순응시켰다. 모든 동물은 마이크로-칩을 심고, 고유의 동정자가 제공되었다. 각 코호트는 15마리 또는 20마리의 마우스를 가졌다. CT26.B2 세포를 확장시키고, 세포 은행을 생성한 다음, IMPACT I 프로토콜을 사용하여 병원체에 대해 IDEXX Bioresearch에 의해 사전 스크리닝하였고, 병원균이 없는 것으로 나타났다. 각 동물은 100μl 무혈청 배지에서 왼쪽 옆구리에 피하 주사된 1 x 10⁵ 세포를 받았다. 종양 세포 접종 17일 후, 종양을 갖지 않은 마우스는 연구에서 제거되었다.

FS22m-063-AA/FS28-228 mAb²(서열번호 360 및 361) 또는 인간 IgG1 아이소타입 대조군(G1-AA/4420)은 DPBS + 1mM 아르기닌 + 0.05% Tween 80에서 용량당 200μg의 고정 농도(20g 마우스에서 약 10mg/kg)로 항체 200μl를 주입했다. 접종 후 17일, 19일 및 21일째에 mAb² 분자를 복강내 주사로 마우스에게 투여한 반면, 마우스는 접종 후 7, 9 및 11일째에 대조군 인간 IgG1 항체를 투여했다. 종양 용적 측정은 종양의 최장 축과 최단 축의 최장 축과 최단 축을 결정하기 위해 캘리퍼스로 주당 3회 착수했다. 다음 식을 사용하여 종양 용적을 계산했다:

L X (S²)/2

상기 식에서,

L = 최장 축이고; S = 최단 축이다.

연구 종점은 종양 용적 및 상태를 기반으로 한 인도적 종점에 의해 결정되었다.

도 6에 도시된 바와 같이, FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb²에 의한 치료는 아이소타입 대조군(G1/4420)으로 처리된 마우스와 비교하여 종양 성장의 시각적 지연을 나타냈다.

시간-대-종점(생존) 분석은 GraphPad Prism 8.0 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 도 7 및 표 15에 제시된 데이터는 로그-순위(Mantel-Cox) 테스트를 사용하여 분석되었다. 데이터는 FS22m-AA-063/228-FS28m mAb²가 로그-순위 분석에 의해 아이소타입 대조군(G1/4420)과 비교하여 상당한 생존 이점을 유도했음을 나타냈다. IgG1 대조군의 평균 생존율은 33.5일인 반면, FS22m-063-AA/FS28m-228의 평균 생존율은 도달되지 않았다.

[표 15]

12.2 CT26.G10 동계 종양 모델에서 생체내 FS22m-063-AA/FS28m-228의 효능

FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb²의 효능은 CT26.G10 동계 종양 모델에서 또한 테스트되었다. CT26.G10 세포는 CT26.B2 세포와 비교하여 더 낮은 수준의 MSLN을 발현한다. CT26.G10 세포주를 사용하여 마우스를 접종한 것 이외에는 실시예 12.1에 기재된 바와 동일한 절차를 따랐다. 마우스에게 접종 후 12, 14 및 16일째에 FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb²의 200μl 복강내 주사로 투여하고/하거나 접종 후 7, 9 및 11일째에 G1/4420 대조군 항체를 투여했다. 마우스는 200㎍/마우스의 고정 용량(20g 마우스에서 약 10㎎/kg과 등가)으로 투여되었다.

도 8에 도시된 바와 같이, FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb² 처리된 마우스는 아이소타입 대조군으로 처리된 마우스와 비교하여 감소된 종양 성장을 보였으며, G1/4420 처리된 그룹과 비교하여 FS22m-063-AA/FS28m-228-처리된 마우스에서 종양 용적 증가의 현저한 지연이 관찰되었다. 또한, 마우스의 1/20(5%)은 G1/4420으로 치료 후 종양을 함유하지 않은 반면, 마우스의 4/20(20%)이 연구 종료시 FS22m-063-AA/FS28m-228로 치료후 종양을 함유하지 않았다. 또한, 도 9 및 표 16에 제시된 바와 같이, 이는 쌍별 로그-순위 분석을 사용하여 평가된 바와 같이, 종양 비함유 생존에서 유의한 개선으로 번역된다. 구체적으로, 평균 생존율은 25일(G1/4420)에서 FS22m-063-AA/FS28m-228에 의해 29일로 증가했다.

mAb² 및 아이소타입 대조군은 LALA 돌연변이를 함유했고, 따라서 관찰된 종양 성장 억제는 LALA 돌연변이가 항체가 Fcγ 수용체에 결합하는 능력을 현저히 감소시켰기 때문에 ADCC 활성의 결과일 수 없다. 따라서, LALA 돌연변이-함유 항-MSLN mAb 단독으로 처리된 마우스에서 항-종양 활성이 나타나지 않을 것으로 추정된다. 그러나, LALA 돌연변이를 함유하는 mAb²는 LALA 돌연변이가 존재하는 경우에도 상당한 종양 성장 억제를 할 수 있었는데, 이는 세포 표면에서 MSLN에 결합하는 Fab 암에 의한 mAb²의 가교결합이 면역 세포에서 CD137의 클러스터링 및 활성화를 유도하여 mAb²의 항종양 활성을 초래함으로 인한 것으로 생각된다.

실시예 13: 친화도 성숙된 항-마우스 CD137/MSLN(FS22m-063-AA/FS28m-228-010) mAb ² 의 생체내 특성화

13.1 CT26.G10 동계 마우스 종양 모델에서 친화도 성숙된 CD137/MSLN mAb ² 의 용량-반응 활성

높은 수준의 마우스 MSLN(CT26.B2)을 발현하는 동계 종양 모델뿐만 아니라 FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb²(실시예 12)로 처리될 때 낮은 수준의 마우스 MSLN(CT26.G10)을 발현하는 종양에서 상당한 항종양 효능 및 생존율 개선이 관찰되었다. 따라서, 다양한 용량(6, 20, 60 및 200㎍/마우스, 20g 마우스에서 약 0.3, 1, 3 및 10mg/kg과 등가)에서 생체내에서 친화도 성숙된 FS22m-063-AA/FS28m-228-010의 항종양 효능을 조사하는 것이 바람직했다.

체중 17.0 내지 25.2g의 9 내지 11주령 BALB/c 암컷 마우스(Charles River)를 각각 연구 개시 전 1주일 동안 순응시켰다. 모든 동물은 마이크로-칩을 심고, 고유의 동정을 받았다. 각 코호트는 20마리의 마우스를 가졌다. 실시예 11.2에 기재된 CT26.G10 결장 암종 세포주를 확장시키고, 세포 은행을 생성시켰다. 각 동물은 100μl 무혈청 배지에서 왼쪽 옆구리에 피하 주사된 1 x 10⁵ 세포를 받았다. 종양 세포 접종 12일 후, 종양을 갖지 않은 마우스는 연구에서 제거되었다.

FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²를 제조하고, 상기 기재된 용량 범위에 따라 고정된 최종 농도로 마우스에 복강내(IP) 주입했다. 모두 인간 IgG1 백본에 있고, LALA를 함유하는 인간 IgG1 아이소타입 대조군(G1-AA/4420) 및 항-CD137 양성 대조군 항체 Lob12.3(G1/Lob12.3)은 20μg의 용량(20g 마우스에서 약 1mg/kg)으로 포함되었다. 모든 항체는 DPBS + 1mM 아르기닌 + 0.05% Tween 80에서 제조되었다.각 마우스는 종양 접종 후 12, 14 및 16일째에 200μl IP 주사로 mAb² 분자 또는 대조군 항체를 받았다. 종양 용적 측정은 실시예 12.1에 기재된 바와 같이 캘리퍼스를 사용하여 주당 3회 착수했고, 마우스를 면밀히 모니터링했다. 연구 종점은 종양 용적 및 상태를 기반으로 하는 인도적 종점에 의해 결정되었다.

STATA/IC 15.1 소프트웨어를 사용하여 종양 성장률 분석을 위한 혼합 모델을 구현했다. 통계적 유의성은 모든 그룹을 비교하는 혼합 모델 분석을 사용하여 전체 연구 기간 동안 성장률에 대해 쌍별로 제시되었다. 별도의 모델이 관심있는 각 치료 쌍에 적합화되었다. 모델은 다음과 같다:

log10(용적) = A + B ×(일 - 개시 일) + εA 및 B는 각각 절편과 기울기이고; 그들은 각 마우스에 대해 상이하고, 그룹에 대한 고정 효과와 동물에 대한 무작위 효과를 포함한다:

A = A0 + A1T + εA

B = B0 + B1T + εB

T는 한 그룹에서 값이 0이고 다른 그룹에서 1인 치료 그룹을 나타내는 더미 변수이다. 무작위 효과는 정규 분포로 분포된다.

εA ~(0,σA), εB ~ N(0,σB)

여기서, σA 및 σB는 각각 절편 및 기울기에서 동물간 변동성의 표준 편차이다. 동물간 변동성은 또한 표준 편차 σ로 정규 분포된다: ε~(0,σ)

각 치료 쌍에 대해, 상기 모델을 데이터에 적합화했다. A1 및 B1의 경우, 0으로부터의 차이에 대한 (양면) p-값이 계산되었다: 0.05 미만의 p-값은 치료 그룹 간의 차이에 대한 통계적으로 유의한 증거이다.

도 10에 도시된 바와 같이, FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²는 아이소타입 대조군으로 처리된 마우스와 비교하여 모든 용량 수준에서 종양 성장을 감소시켰다. 연구 종료시 62.5mm³ 이하로 측정되는 종양을 보유하는 모든 동물을 완전 반응 동물로서 계수했다(참조: 표 17). 각각 10, 3, 1 및 0.3mg/kg의 FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²로 처리된 동물의 30%, 20%, 20% 및 10%는 항-CD137 항체, G1/Lob12.3(15%) 및 G1-AA/4420 아이소타입 대조군 처리된 동물(0%)과 비교하여 종양이 없는 것으로 간주되었다.

또한, 표 17은 모든 그룹을 IgG1 아이소타입 대조군 치료 그룹과 비교하여 혼합 모델 분석을 사용하여 연구 전체 과정에 걸쳐 성장률의 쌍별 비교를 나타낸다. 어떤 마우스도 명백한 독성이나 부작용의 징후를 나타내지 않았으며, 모든 치료는 마우스에 충분히 허용되었다.

생존율 분석(도 11 및 표 18)은 모든 용량 수준에서 FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²가 아이소타입 대조군(G1-AA/4420)-처리된 마우스와 비교하여 유의한 항-종양 반응을 유도했고, 이 반응은 용량 의존적인 것으로 나타났다. 또한, 표 18은 각 그룹의 평균 생존 일수의 요약을 나타내고, 여기서 10mg/kg, 3mg/kg, 1mg/kg 및 0.3mg/kg의 마우스 CD137/MSLN mAb²에 의한 치료는 평균 생존율을 29.5일(G1-AA/4420)에서 각각 36.5, 37.5, 35 및 31일로 증가시켰다.

CD137/MSLN mAb² 포맷의 FS28m-228 MSLN Fab과 유사하게, CD137/MSLN mAb² 포맷의 FS28m-228-010 Fab는 또한 아이소타입 대조군과 비교하여 종양 성장의 상당한 감소를 유도했다. 더욱이, mAb²를 사용한 생존의 용량 의존적 유의한 개선은 Fab 암에 의한 MSLN 표적에 대한 mAb²의 가교결합이 CD137의 효능 작용을 유도하고, 따라서 항종양 효능이 생체내에서 관찰된다는 것을 시사한다.

13.2 CT26.G10 동계 종양 모델에서 구성 요소 부분과 비교한 FS22m-063-AA/FS28m-228-010의 항종양 효능

FS22m-063-AA/FS28m-228-010이 종양 보유 마우스에서 유의한 항종양 효능 및 개선된 생존을 가졌음을 나타냈으므로, mAb²가 이의 개별 구성 요소 부분과 비교하여 생체내에서 우수한 항종양 활성을 입증하였는지를 결정하는 것이 바람직했다. 마우스 MSLN 항체(G1-AA/FS28m-228-010), "모의" mAb² 포맷의 CD137 Fcab(FS22m-063-AA/HelD1.3 및 FS22m-063-AA/4420), 마우스 MSLN 항체와 "모의" mAb² 포맷의 CD137 Fcab의 조합(즉, G1-AA/FS28m-228-010 + FS22m-063-AA/HelD1.3), 및 FS22m-063-AA/FS28m-228- 010 mAb²에 의한 치료를 인간 아이소타입 대조군 항체(G1-AA/HelD1.3)에 의한 치료와 비교했다.

마우스는 실시예 13.1에 따라 준비하였고, CT26.G10 결장 암종 세포주로 접종했다. 모든 코호트는, 10마리의 마우스를 갖는 FS22m-063-AA/4420를 제외하고, 20마리의 마우스를 가졌다.

FS22m-063-AA/FS28-228-010 mAb², G1-AA/FS28m-228-010, FS22m-063-AA/HelD1.3, FS22m-063-AA/4420 및 G1-AA/HelD1.3 항체는 모두 용량당 200μg(20g 마우스에서 약 10㎎/kg)으로 제조되었고, 마우스에 고정된 용량으로 복강내(IP) 주입되었다. 또한, CD137 모의 mAb² 및 MSLN 항체는 모두 조합 그룹을 위해 용량당 200μg(20g 마우스에서 약 10㎎/kg)으로 제조되었다. 모든 항체는 DPBS + 1mM 아르기닌 + 0.05% Tween 80에서 제조되었다. 실시예 13.1의 투여 섭생과 유사하게, 각각의 마우스는 종양 접종 후 12, 14 및 16일째(q2dx3)에 200㎕ 복강내 주사로 항체를 받았다. 종양 용적 측정은 실시예 12.1에 기재된 바와 같이 캘리퍼스를 사용하여 주당 3회 수행되었고, 마우스는 면밀히 모니터링했다. 연구 종점은 종양 용적 및 상태를 기반으로 하는 인도적 종점에 의해 결정되었다.

도 12에 도시된 바와 같이, FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²에 의한 치료는 G1-AA/HelD1.3 아이소타입 대조군으로 처리된 마우스와 비교하여 상당히 감소된 종양 성장을 초래했다. 연구 종료시 62.5mm³ 이하로 측정되는 종양을 보유하는 모든 동물은 완전 반응성 동물로서 계수되었다(참조: 표 19). 7/20(35%)의 FS22m-063-AA/FS28-228-010 mAb²-처리된 동물은 1/20(5%)의 G1-AA/FS28m 228-010-처리된 마우스 및 0/20(0%)의 G1-AA/HelD1.3 아이소타입 대조군, FS22m-063-AA/HelD1.3, FS22m-AA-063/4420, 및 FS22m-063-AA/HelD1.3 + G1-AA/FS28m 228-010의 조합-처리된 마우스와 비교하여 연구 종료시 치료에 대한 완전한 반응자인 것으로 간주되었다.

또한, 표 19는 모든 그룹을 G1-AA/HelD1.3 아이소타입 대조군과 비교하는 혼합 모델 분석을 사용하여 연구 전체 과정에 걸쳐 성장률의 쌍별 비교를 보여준다.

생존율 분석(도 13 및 표 20)은 FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²가 G1-AA/HelD1.3 항체와 비교하여 상당한 생존 이점을 유도한 반면, 성분이 생존 이점을 유도하지 않았음을 나타냈다. 또한, FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²에 의한 치료는 G1-AA/HelD1.3(29일), FS22m-063-AA/HelD1.3(30일), FS22m-063-AA/4420(29일), G1-AA/FS28m-228-010(30일) 및 FS22m-063-AA/HelD1.3과 G1-AA/FS28m-228-010의 조합(29일)과 비교하여 42.5일의 개선된 평균 생존을 초래했다.

이러한 데이터는 CD137 및 MSLN을 모두 표적화하는 이중특이적 분자가 생체내 활성을 필요로 하는데, 이는 mAb2의 개별적 구성 요소가 단독으로 또는 조합하여 투여되는 경우 관찰되지 않은 수준에서 종양 성장 억제를 유도했기 때문임을 입증한다.

13.3 CT26.G10 동계 마우스 종양 보유 모델에서 항-마우스 CD137/MSLN mAb ² 의 간 약리학

연구 임상 시험에서 우렐루맙을 사용한 고형 종양 환자의 항-CD137 mAb 치료는 투여된 우렐루맙의 용량과 관련되는 것으로 밝혀진 심각한 치료 관련 면역 이벤트를 초래했다. 이러한 면역 이벤트의 효과는 간에서 심각한 간독성으로 나타났다(Segal, NH, et al., 2017).

동물이 CD137 작용제 도구 항체를 사용하여 투여되는 마우스에서 수행된 전임상 메커니즘 작업은 유사한 간독성을 나타냈다. 이러한 연구는 생성되는 간독성에서 T 세포 및 CD137에 대한 요구 사항을 보여주었다(Niu, L., et al. 2007 및 Dubrot J, et al. 2010). 잘 이해되지는 않았지만, 골수와 T 세포 구획 사이의 상호 작용은 또한 간 손상과 간독성으로 이어지는 염증성 캐스케이드를 개시하는 데 중요한 것으로 나타났다(Bartkowiak, T et al., 2018). 따라서, 이러한 동물 모델은 CD137/MSLN mAb²와 같은 다른 CD137 작용제의 투여 후 인간 환자에서 간독성의 위험을 예측하는 데 있어서 클리닉에 대한 번역 관련성을 갖는다.

실시예 13.1 및 13.2에 기재된 CT26.G10 동계 종양 연구의 마우스는 FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²를 반복 투여한 후 명백한 독성 징후를 나타내지 않았다.이들 동물에서 간독성 마우스와 상관 관계가 있는 면역 활성화가 실시예 13.1 및 13.2에 나타낸 바와 유사한 투여 섭생에 따라 투여되었는지를 결정하기 위해, 투여 후 4개의 시점에서 마우스를 도태시키고, 조직학적 평가를 위해 부검에서 간 샘플을 채취했다.

마우스는 실시예 13.1에 기재된 바와 같이 준비하였고, 마우스는 CT26.G10 결장 암종 세포주를 접종했다. 각 코호트는 24마리의 마우스로 구성되었다. FS22m-063-AA/FS28-228-010 mAb²(CD137/MSLN) 및 G1-AA/4420(인간 IgG1 아이소타입 대조군) 항체를 DPBS + 1mM의 아르기닌 + 0.05% Tween 80에서 용량당 200μg(20g 마우스에서 약 10mg/kg)으로 제조하고, 고정된 용량으로 마우스에 복강내(IP) 주입했다. 각 마우스는 종양 접종 후 12일, 14일 및 16일째에 200μl의 복강내 주사로 항체를 받았다. 종양 용적 측정은 실시예 12.1에 기재된 바와 같이 캘리퍼스를 사용하여 주당 3회 수행되었고, 마우스를 면밀히 모니터링하였다. 마지막 용량 투여 후 2, 5, 8 및 11일에 그룹당 6마리의 마우스를 부검하고, 간 샘플은 고정되어 형성되었고, 파라핀을 매립시켰다. 이어서, 간 절편을 절단하고 헤마톡실린 및 에오신 염색 및 독립적이고 인증된 수의학 병리학자에 의한 간 염증 및 손상의 점수 매기기를 통해 조직병리학적 평가를 받았다.

점수 매기기 시스템은 헤마톡실린 및 에오신 염색 섹션에서 간 병리를 평가하는 데 사용되었다. 간은 다초점 혼합 염증 세포, 다초점 퇴행성 간세포, 간세포 유사 분열 증가 및 문맥 혼합 염증 세포 침윤에 상응하는 병리학에 대해 점수를 매겼다. 각 그룹 내에서 최소, 경미 및 중등도 효과를 나타내는 마우스의 빈도는 표 21에 제시된다.

FS22m-063-AA/FS28-228-010 mAb² 처리된 동물은 최소한의 간 병리, 특히 다음을 나타냈다:

· 실질 전반에 걸쳐 위치된 최소 다초점 혼합 염증 세포(주로 과립구)

· 실질 전반에 걸쳐 산란된 최소 퇴행성 간세포

· 최소 퇴행성 간세포

· 문맥 관의 최소 혼합 염증 세포

이러한 발견은 항-CD137 작용제 항체의 다른 예로 관찰된 바와 같이, 간독성을 나타내지 않는다. 또한, mAb²가 MSLN 결합을 통해 매개된 가교결합을 통해 CD137을 괴롭히고, MSLN이 종양 세포의 세포 표면에서 주로 과발현되지만 간에서는 그렇지 않음(Ordonez 2003, 14576474)을 감안하여, CD137 효능 작용은 종양 미세환경으로 제한될 것으로 예상된다.

13.4 CT26.G10 동계 마우스 종양 모델에서 항-마우스 CD137/MSLN mAb ² 의 작용 메커니즘

CD137/MSLN mAb²(실시예 13.3)를 반복 투여한 후 관찰된 제한된 간 약리학으로, FS22m-063-AA/FS28m-228-010으로 관찰된 항종양 반응의 약리학을 추가로 이해하기 위해, MSLN-양성 동계 종양 모델에서 CD137/MSLN mAb²의 작용 메커니즘이 조사되었다.

마우스는 실시예 13.1에 기재된 바와 같이 준비하였고, CT26.G10 결장 암종 세포주를 접종했다. 각 코호트는 20마리의 마우스로 구성되었다. FS22m-063-AA/FS28-228-010(CD137/MSLN) mAb², 인간 IgG1 아이소타입 대조군(G1-AA/4420) 및 항-CD137 작용제 항체(클론 3H3; G1/3H3)도 비교용으로 포함되었다. 3개 항체는 모두 DPBS + 1mM 아르기닌 + 0.05% Tween 80에서 용량당 134μg(20g 마우스에서 약 6.7mg/kg)으로 제조되었고, 마우스에 복강내(IP) 주입되었다. 각 마우스는 종양 접종 후 20일째에 134μg의 고정 용량으로 하나의 200㎕ 복강내 주사로 항체를 받았다. 종양 용적 측정은 실시예 12.1에 기재된 바와 같이 캘리퍼스를 사용하여 주당 3회 수행되었고, 마우스는 면밀히 모니터링했다.

그룹당 6마리 마우스를 종양 접종 후 20일째에 투여 후 24, 72, 144 및 192시간에 부검했다. 비장, 혈액 및 종양 조직은 분석을 위해 FS22m-063-AA/FS28-228-010, G1-AA/4420 또는 G1/3H3으로 처리된 CT26.G10 종양 보유 마우스로부터 채취했다. 모든 샘플은 T 세포 활성화 및 증식 마커가 CD137 효능 작용의 다운스트림 효과인 것으로 공지되어 있기 때문에 유세포 분석에 의해 T 세포 풍부도 및 증식에 대해 조사되었다(Fisher et al., 2012). 또한, 가용성 MSLN 발현의 검출 및 정량화를 위해 혈액에서 혈청을 수집했다. 비장 및 종양 조직은 표준 기계적 및 효소적 방법으로 단일 세포 현탁액으로 분해되고, 적혈구를 적혈구 용해 완충액(Miltenyi Biotec Ltd., 130-094-183)에서 1회 용해시켰다. 혈액은 말기 심장 출혈로 수집하고, 절반은 유세포 분석에 의한 단일 세포 분석을 위해 EDTA 함유 튜브에 수집하고, 혈액의 절반은 가용성 MSLN의 분석을 위해 응고 활성화제/혈청 튜브에 수집했다. EDTA 함유 튜브에 수집된 전혈을 제조업체의 지침에 따라 적혈구 용해 완충액(Miltenyi Biotec Ltd., 130-094-183)에서 3회 용해시켰다. 혈청 튜브에 수집된 혈액은 원심분리에 의해 분획화하고, 가용성 MSLN의 분석을 위해 혈청을 제거했다.

이어서, 비장, 종양 및 혈액의 단일 세포를 동일하게 처리하고, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 샘플을 고정 가능한 생존성 염료(eBioscience, 65-0865-14)로 염색했다. 후속적으로, 세포를 Fc 블록(eBioscience, 16-0161-85, 1:25)의 존재하에 표 22에 제시된 항체 염색 패널(거의 세포내 마커, Ki67 및 FoxP3)로 세포 표면 마커에 대해 45분 동안 4℃에서 염색했다. 이어서, 세포를 고정시키고, 제조업체의 지침에 따라 eBioscience FoxP3 염색 키트(eBioscience, 00-5523-00)로 투과시켰다. 세포를 세포내 마커 Ki67 및 FoxP3 항체와 함께 100μl 투과 완충액에 재현 탁시키고, 어둠 속에서 4℃에서 밤새 배양하였다. BD Fortessa 유세포 분석기로 획득하기 전에, 세포를 투과 완충액으로 1회 세척하고 0.5% BSA를 함유하는 120㎕ PBS에 재현탁시켰다. BD FACS Diva 소프트웨어를 사용하여 데이터를 획득하고, FlowJo(V10) 및 Microsoft Excel로 분석했다. 데이터는 부모 집단의 백분율로서, 투여 후 144시간에 CD8⁺ T 세포의 풍부도 및 증식을 보여준다.

표 23에 제시된 바와 같이, 종양에서 CD8⁺ T 세포 백분율의 증가가 대조군 치료 그룹(G1-AA/4420)과 비교하여 G1/3H3 및 FS22m-063-AA/FS28-228-010 mAb² 투여 후 144시간에 관찰되었다. 종양에서 CD8⁺ T 세포의 평균 백분율은 투여 후 144시간에 32.1%(G1-AA/4420)에서 G1/3H3에 의해 56.1%로, FS22m-063-AA/FS28m-228-010에 의해 58.4%로 증가되었다.

또한, CD8⁺ T 세포의 풍부도의 증가가 또한 IgG1 대조군과 비교하여 G1/3H3에 의해서만 혈액 및 비장에서 관찰되었다. 투여 후 144시간에 혈액에서, CD8⁺ T 세포의 평균 백분율은 22.6%(G1-AA/4420)에서 57.0%(G1/3H3)로 증가되었지만, 이 증가는 FS22m-063-AA/FS28m-228-010(25.8%)으로는 관찰되지 않았다. 유사하게, 비장에서, CD8⁺ T 세포의 평균 백분율은 28.8%(G1-AA/4420)에서 G1/3H3에 의해 38.0%로 증가되었지만, 이 증가는 FS22m-063-AA/FS28m-228-010(29%)으로는 관찰되지 관찰되지 않았다.

이것은 FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²가 종양에서 구체적으로 CD8⁺ T 세포를 증가시키고, 여기서 MSLN이 발현되는 반면, CD137-표적화 항체인 G1/3H3은 또한 CD8⁺ T 세포에서 말초(혈액 및 비장) 증가를 입증한다는 것을 시사한다.

투여 후 CD8⁺ T 세포의 증식에서 임의의 차이가 존재하였는지를 동정하게 위해, 증식 마커인 Ki67은 종양, 혈액 및 비장의 CD8⁺ 세포에서 분석되었다. 표 24에 제시된 바와 같이, 대조군에서 CD8⁺ T 세포 발현된 Ki67⁺의 높은 비율(평균 발현 75.1%)은 CT26.G10 모델의 종양에서 높은 수준의 증식성 CD8⁺ T 세포를 시사한다. 이것은 종양에서 용량 그룹 사이의 CD8⁺ T 세포에서 Ki67 발현의 불분명한 차이에 기여할 수 있다.

이에 비해, IgG1 대조군과 비교하여 G1/3H3 투여 후 144시간에 혈액 및 비장의 CD8⁺ T 세포에서 Ki67⁺ 발현의 명확한 증가가 관찰되었다. 혈액에서, 아이소타입 대조군 처리 마우스는 CD8⁺ T 세포에서 10.4%의 평균 Ki67⁺ 발현을 나타낸 반면, G1/3H3 투여 후 CD8⁺ T 세포에서 Ki67의 평균 발현은 투여 후 144시간에 86.3%인 것으로 나타난다. 이에 비해, 이 증가는 FS22m-063-AA/FS28m-228-010으로는 관찰되지 않았고, 여기서 CD8⁺ T 세포에서 평균 Ki67⁺ 발현은 혈액에서 mAb² 투여 후 13.1%에서 관찰되었다. 유사하게, 비장에서, 평균 Ki67⁺ 발현은 아이소타입 대조군 투여 후 관찰된 8.1% 및 FS22m-063-AA/FS28m-228-010으로 관찰된 11.4%와 비교하여 G1/3H3 투여 후 CD8⁺ T 세포의 36.1%에서 관찰되었다.

FS22m-063-AA/FS28-228-010, G1-AA/4420 또는 G1/3H3이 투여된 그룹당 6마리 마우스로부터 수집된 혈청을 혈청에 대한 제조업체의 지침에 따라서 메소텔린 마우스 SimpleStep ELISA 키트(Abcam, ab204528)를 사용하여 가용성 MSLN의 수준에 대해 분석했다. 데이터는 경시적으로 제시된 프리즘 및 혈청 MSLN 수준의 농도로 플롯팅했다. 표 25에 제시된 바와 같이, 투여 후 144시간에 아이소타입 대조군 G1-AA/4420과 비교하여 G1/3H3 및 FS22m-063-AA/FS28m-228-010에 의한 MSLN의 혈청 수준의 증가가 존재했다. 이러한 유사한 증가가 G1/3H3 및 FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb² 모두에서 관찰되고 MSLN이 CT26.G10 동계 마우스 모델의 종양 세포에서 주로 발현되기 때문에, 이것은 종양에서 CD137-효능 작용이 혈청에서 검출되는 가용성 MSLN을 증가시킬 수 있음을 시사한다.

종합적으로, 이들 데이터는 FS22m-063-AA/FS28m-228-010이 종양에서 세포독성 CD8⁺ T 세포의 종양 특이적 증가를 매개했음을 나타낸다. 이것은 또한 FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb²와 달리, G1/3H3로 관찰되었지만, G1/3H3은 또한 혈액 및 비장에서 CD8⁺ T 세포의 말초 증가를 촉진시켰다. 또한, 이들 CD8⁺ T 세포는 또한 G1/3H3 투여 후 증식 증가를 나타냈다. CD8⁺ T 세포(세포독성 림프구라고 지칭되기도 함)의 주요 역할은 세 가지 주요 메커니즘을 통해 감염된 세포 또는 악성 세포를 사멸시키는 것이다: 1) 사이토카인, 예를 들어, TNFα 및 IFNγ의 방출, 2) 세포독성 과립의 생산 및 방출 및 3) FasL의 발현. 따라서, 치료 후 종양에서 CD8⁺ T 세포의 증가는 종양에 대한 이러한 메카니즘을 통해 세포독성 활성을 초래할 수 있고, 이는 결과적으로 이 샘플에서 관찰된 바와 같이 종양 세포 사멸의 결과로서 메소텔린의 방출 증가로 이어질 수 있다. 종양이 CD137을 발현하지 않기 때문에, 메소텔린의 방출이 T 세포-매개된 세포독성에 의해 야기되는 간접적 PD 반응이라는 가설이 세워진다.

실시예 14: 마우스에서 항-마우스 CD137/MSLN mAb ² 및 항-인간 CD137/MSLN mAb ² 의 약동학

14.1 비-종양 보유 마우스에서 항-마우스 CD137/MSLN mAb ² (FS22m-063-AA/FS28-228-010)의 약동학

마우스에서 항-마우스 CD137/MSLN mAb²의 약동학을 결정하기 위해, 비-종양 보유 C57BL/6 암컷 마우스는 10㎎/kg의 항-마우스 CD137/MSLN mAb²(FS22m-063 -AA/FS28m-228-010) 또는 인간 IgG1 대조군 항체(G1/4420)를 정맥내로 1회 투여하고, 최대 144시간 동안 모니터링되었다.

약 20㎕의 전혈의 마이크로샘플링을 0.5, 1, 6, 24, 48, 96, 144시간에 수행하였고, 분석을 위한 약 5㎕의 혈청을 단리시키기 위해 처리했다. 각 시점에 존재하는 항체의 양은 Gyros Protein Technologies의 Gyrolab xPlore 시스템(시스템 명칭 XPS1055)을 사용하여 결정되었다. 비오티닐화된 염소 항-인간 IgG-(중쇄 및 경쇄) 원숭이 흡착 항체(Cambridge Biosciences, A80-319B)를 포획 항체로서, 염소 항-인간 IgG-AlexaFluor® 647(Cambridge Biosciences, 2040-31)을 검출 항체로서 사용하는 Gyrolab Bioaffy 200 CD(Gyros Protein Technologies, P0004180)를 사용하여 샌드위치 검정을 수행했다. 각 화합물의 4000ng/mL 내지 0.0677ng/mL 범위로 생성된 표준 곡선을 Rexxip AN 완충액(Gyros Protein Technologies, P0004994) 중 0.1% 마우스 혈청(Sigma-Aldrich M5905)에서 제조하여 샘플 농도를 결정하고, 샘플은 Rexxip AN(Gyros Protein Technologies, P0004994)에서 1:1000 희석을 경험한다. 시점당 개별 마우스(시점당 3마리 마우스)의 평균 샘플 농도를 플롯팅했다.

도 14A는 항-마우스 CD137/MSLN mAb²의 약동학을 도시하고, mAb²가 투여 기간에 걸쳐 비-MSLN 결합 인간 IgG1 항체보다 약간 더 낮은 전신 노출을 가졌음을 입증한다. 이것은 표적-매개된 클리어런스 메카니즘에 의해 설명될 수 있다.

14.2 비-종양 보유 마우스에서 항-인간 CD137/MSLN mAb ² 의 약동학

비교를 위해, 비-종양 보유 C57BL/6 암컷 마우스에서 항-인간 CD137/MSLN mAb²의 약동학적 프로파일이 결정되었다. 마우스는 6.7mg/kg의 항-인간 CD137/MSLN(FS22-172-003-AA/FS28-256-271) mAb² 또는 인간 IgG1 대조군 항체(G1-AA/4420)를 정맥내 투여하고, 최대 144시간 동안 모니터링했다. 약 20㎕의 전혈의 마이크로샘플링은 0.5, 1, 6, 24, 48, 96, 144시간에 수행되었고, 분석을 위한 약 5㎕의 혈청을 단리시키기 위해 처리했다. 분석은 실시예 14.1에 기재된 바와 같이 수행되었다.

도 14B는 항-인간 CD137/MSLN mAb²의 약동학을 도시하고, mAb²가 MSLN에 결합하지 않는 표준 인간 IgG1 항체에 대해 혈액 중 필적할만한 노출을 가졌음을 입증한다(Bergman et al., 1998).

서열 목록

중쇄 주석

i. mAb²의 중쇄의 아미노산 서열에서, 가변 도메인은 이탤릭체로 제시되고, IMGT에 따르는 CDR은 굵은 이탤릭체로 제시되고, 카바트에 따르는 CDR은 이탤릭체및 밑줄로 제시되고(따라서, 임의의 중첩성 IMGT 및 카바트 CDR 서열은 굵은 이탤릭체 및 밑줄로 제시된다), CH1 도메인은 밑줄치고, 힌지 영역은 이중으로 밑줄치고, CH2 도메인은 굵게 제시되고(그리고, 적용 가능한 경우, LALA 돌연변이의 위치는 굵고 밑줄로 제시된다), CH3 도메인은 일반 글꼴로 제시되고, CH3 구조 루프의 변형된 영역은 밑줄친다(루프가 변화되지 않은 경우 밑줄 없음).

ii. 가변 도메인의 아미노산 서열에서, IMGT에 따르는 CDR은 굵은 이탤릭체로 제시되고, 카바트에 따르는 CDR은 이탤릭체 및 밑줄로 제시된다(따라서, 임의의 중첩성 IMGT 및 카바트 CDR 서열은 굵은 이탤릭체 및 밑줄로 제시된다).

iii. IMGT 및 카바트 둘 다에 따르는 CDR 아미노산 서열이 제공된다.

경쇄 주석

i. mAb²의 경쇄의 아미노산 서열에서, 가변 도메인은 이탤릭체로 제시되고, IMGT에 따르는 CDR은 굵은 이탤릭체로 제시되고, 카바트에 따르는 CDR은 이탤릭체 및 밑줄로 제시된다(따라서, 임의의 중첩성 IMGT 및 카바트 CDR 서열은 굵은 이탤릭체 및 밑줄로 제시된다).

CH3 도메인의 아미노산 및 cDNA 서열 및 모든 FS22-172-003 Fcab 함유 mAb ² 클론 및 FS22-172-003 Fcab의 CH3 AB 및 EF 구조 루프의 변형된 영역의 아미노산 서열

CH3 서열번호 8 AA

GQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

CH3 서열번호 9 DNA

GGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 10 루프 AB(AA) PYIIPPY

서열번호 11 루프 EF(AA) GADRWLE

FS22-172-003-AA/FS28-024 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 92 중쇄 AA (LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALTFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 93 중쇄 DNA(LALA 없음)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCTTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 94 중쇄 AA(LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALTFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 95 중쇄 DNA(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCTTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 12 VH 도메인 AA

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALTFDY WGQGTLVTVSS

서열번호 13 VH 도메인 DNA

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGACGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCTTGGTCACCGTCTCGAGT

서열번호 14 HCDR1(AA)(IMGT) GFTLSYSS

서열번호 15 HCDR1(AA)(카바트) YSSMS

서열번호 16 HCDR2(AA)(IMGT) ITPSTGYT

서열번호 17 HCDR2(AA)(카바트) FITPSTGYTHYADSVKG

서열번호 18 HCDR3(AA)(IMGT) ARRALTFDY

서열번호 19 HCDR3(AA)(카바트) RALTFDY

FS22-172-003-AA/FS28-024 mAb ² 의 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 85 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQASSYPLT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 86 경쇄 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAAGCTTCTTCTTATCCTCTCACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACTGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATTTTTCCGCCATCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTCTGCCTGCTCAACAACTTCTACCCTCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAATGCCCTGCAGTCCGGAAACTCGCAGGAAAGCGTGACTGAACAGGACTCCAAGGACTCCACCTATTCACTGTCCTCGACTCTGACCCTGAGCAAGGCGGATTACGAAAAGCACAAAGTGTACGCATGCGAAGTGACCCACCAGGGTCTTTCGTCCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGAGAGTGT

서열번호 54 VL 도메인 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQASSYPLT FGQGTKVEIK

서열번호 55 VL 도메인 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAAGCTTCTTCTTATCCTCTCACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

서열번호 20 LCDR1(AA)(IMGT) QSVSSSY

서열번호 21 LCDR1(AA)(카바트) RASQSVSSSYLA

서열번호 22 LCDR2(AA)(IMGT) GAS

서열번호 23 LCDR2(AA)(카바트) GASSRAT

서열번호 24 LCDR3(AA)(IMGT) QQASSYPLT

서열번호 24 LCDR3(AA)(카바트) QQASSYPLT

FS22-172-003-AA/FS28-024-051 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 96 중쇄 AA(LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALIFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 97 중쇄 DNA(LALA 없음)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGATTTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 98 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALIFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 99 중쇄 DNA(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGATTTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 56 VH 도메인 AA

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALIFDY WGQGTLVTVSS

서열번호 57 VH 도메인 DNA

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGATTTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT

서열번호 14 HCDR1(AA)(IMGT) GFTLSYSS

서열번호 15 HCDR1(AA)(카바트) YSSMS

서열번호 16 HCDR2(AA)(IMGT) ITPSTGYT

서열번호 17 HCDR2(AA)(카바트) FITPSTGYTHYADSVKG

서열번호 25 HCDR3(AA)(IMGT) ARRALIFDY

서열번호 26 HCDR3(AA)(카바트) RALIFDY

FS22-172-003-AA/FS28-024-051 mAb ² 의 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 85 경쇄 AA

서열번호 86 경쇄 DNA

서열번호 54 VL 도메인 AA

서열번호 55 VL 도메인 DNA

서열번호 20 LCDR1(AA)(IMGT) QSVSSSY

서열번호 21 LCDR1(AA)(카바트) RASQSVSSSYLA

서열번호 22 LCDR2(AA)(IMGT) GAS

서열번호 23 LCDR2(AA)(카바트) GASSRAT

서열번호 24 LCDR3(AA)(IMGT) QQASSYPLT

서열번호 24 LCDR3(AA)(카바트) QQASSYPLT

FS22-172-003-AA/FS28-024-052 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 100 중쇄 AA(LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTI

SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALLFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 101 중쇄 DNA(LALA 없음)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGCTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGTCGGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 102 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALLFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 103 중쇄 DNA(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGCTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGTCGGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 58 VH 도메인 AA

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALLFDY WGQGTLVTVSS

서열번호 59 VH 도메인 DNA

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGCTTTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGTCG

서열번호 14 HCDR1(AA)(IMGT) GFTLSYSS

서열번호 15 HCDR1(AA)(카바트) YSSMS

서열번호 16 HCDR2(AA)(IMGT) ITPSTGYT

서열번호 17 HCDR2(AA) 카바트) FITPSTGYTHYADSVKG

서열번호 27 HCDR3(AA)(IMGT) ARRALLFDY

서열번호 28 HCDR3(AA)(카바트) RALLFDY

FS22-172-003-AA/FS28-024-052 mAb ² 의 경쇄 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 85 경쇄 AA

서열번호 86 경쇄 DNA

서열번호 54 VL 도메인 AA

서열번호 55 VL DNA

서열번호 20 LCDR1(AA)(IMGT) QSVSSSY

서열번호 21 LCDR1(AA)(카바트) RASQSVSSSYLA

서열번호 22 LCDR2(AA)(IMGT) GAS

서열번호 23 LCDR2(AA)(카바트) GASSRAT

서열번호 24 LCDR3(AA)(IMGT) QQASSYPLT

서열번호 24 LCDR3(AA)(카바트) QQASSYPLT

FS22-172-003-AA/FS28-024-053 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 104 중쇄 AA(LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALVFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 105 중쇄 DNA

(LALA 없음)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGGTGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGTCGGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 106 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALVFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 107 중쇄 DNA

(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGGTGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGTCGGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGTf

서열번호 60 VH 도메인 AA

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALVFDY WGQGTLVTVSS

서열번호 61 VH 도메인 DNA

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCCTCAGTTATTCTTCTATGTCATGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTTTATTACTCCGTCTACTGGCTATACCCACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGCGCTGGTGTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGTCG

서열번호 14 HCDR1(AA)(IMGT) GFTLSYSS

서열번호 15 HCDR1(AA)(카바트) YSSMS

서열번호 16 HCDR2(AA)(IMGT) ITPSTGYT

서열번호 17 HCDR2(AA) 카바트) FITPSTGYTHYADSVKG

서열번호 29 HCDR3(AA)(IMGT) ARRALVFDY

서열번호 30 HCDR3(AA)(카바트) RALVFDY

FS22-172-003-AA/FS28-024-053 mAb ² 의 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 85 경쇄 AA

서열번호 86 경쇄 DNA

서열번호 54 VL 도메인 AA

서열번호 55 VL 도메인 DNA

서열번호 20 LCDR1(AA)(IMGT) QSVSSSY

서열번호 21 LCDR1(AA)(카바트) RASQSVSSSYLA

서열번호 22 LCDR2(AA)(IMGT) GAS

서열번호 23 LCDR2(AA)(카바트) GASSRAT

서열번호 24 LCDR3(AA)(IMGT) QQASSYPLT

서열번호 24 LCDR3(AA)(카바트) QQASSYPLT

FS22-172-003-AA/FS28-024-060 mAb ² 의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열

서열번호 108 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTLS YSS MS WVRQAPGKGLEWVS F ITPSTGYT HYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR RALWFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 85 경쇄 AA

FS22-172-003-AA/FS28-026 mAb ² 의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열

서열번호 109 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFS NYA MT WVRQAPGKGLEWVS S ITPYYSKT DYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR NWYRFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 87 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQYSSYPIT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

FS22-172-003-AA/FS28-091 mAb ² 의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열

서열번호 110 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT NYA MS WVRQAPGKGLEWVS S IKPYDGNT YYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR NRWVFDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 88 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQYSSSPFT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

FS22-172-003-AA/FS28-185 mAb ² 의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열

서열번호 111 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT TSA MS WVRQAPGKGLEWVS R INPYEGET NYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR GWSIATYYKSAMDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 89 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQSSYSAPVT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

FS22-172-003-AA/FS28-256 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 112 중쇄 AA(LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT NTY MS WVRQAPGKGLEWVS N ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNSYQGGLDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 113 중쇄 DNA(lala 없음)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTAACACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAATATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACTCTTACCAGGGTGGCTTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCTTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 114 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT NTY MS WVRQAPGKGLEWVS N ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNSYQGGLDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 115 중쇄 DNA(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTAACACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAATATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACTCTTACCAGGGTGGCTTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCTTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 62 VH 도메인 AA

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT NTY MS WVRQAPGKGLEWVS N ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNSYQGGLDY WGQGTLVTVSS

서열번호 63 VH 도메인 DNA

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTAACACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAATATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACTCTTACCAGGGTGGCTTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCTTGGTCACCGTCTCGAGT

서열번호 31 HCDR1(AA)(IMGT) GFTFTNTY

서열번호 32 HCDR1(AA)(카바트) NTYMS

서열번호 33 HCDR2(AA)(IMGT) ISPTYSTT

서열번호 34 HCDR2(AA) 카바트) NISPTYSTTNYADSVKG

서열번호 35 HCDR3(AA)(IMGT) ARYNSYQGGLDY

서열번호 36 HCDR3(AA)(카바트) YNSYQGGLDY

FS22-172-003-AA/FS28-256 mAb ² 의 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 116 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQSYYYPIT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 117 경쇄 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAATCTTATTATTATCCTATCACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACTGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATTTTTCCGCCATCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTCTGCCTGCTCAACAACTTCTACCCTCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAATGCCCTGCAGTCCGGAAACTCGCAGGAAAGCGTGACTGAACAGGACTCCAAGGACTCCACCTATTCACTGTCCTCGACTCTGACCCTGAGCAAGGCGGATTACGAAAAGCACAAAGTGTACGCATGCGAAGTGACCCACCAGGGTCTTTCGTCCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGAGAGTGT

서열번호 64 VL 도메인 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQSYYYPIT FGQGTKVEIK

서열번호 65 VL 도메인 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAATCTTATTATTATCCTATCACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

서열번호 20 LCDR1(AA)(IMGT) QSVSSSY

서열번호 21 LCDR1(AA)(카바트) RASQSVSSSYLA

서열번호 22 LCDR2(AA)(IMGT) GAS

서열번호 23 LCDR2(AA)(카바트) GASSRAT

서열번호 37 LCDR3(AA)(IMGT) QQSYYYPIT

서열번호 37 LCDR3(AA)(카바트) QQSYYYPIT

FS22-172-003-AA/FS28-256-001 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 118 중쇄 AA(LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT ETY MS WVRQAPGKGLEWVS N ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNSYQGGLDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 119 중쇄 DNA(LALA 없음)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTGAGACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAATATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACTCTTACCAGGGTGGCTTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCTTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 120 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT ETY MS WVRQAPGKGLEWVS N ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNSYQGGLDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 121 중쇄 DNA(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTGAGACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAATATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACTCTTACCAGGGTGGCTTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCTTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 66 VH 도메인 AA

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT ETY MS WVRQAPGKGLEWVS N ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNSYQGGLDY WGQGTLVTVSS

서열번호 67 VH 도메인 DNA

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTGAGACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAATATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACTCTTACCAGGGTGGCTTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCTTGGTCACCGTCTCGAGT

서열번호 38 HCDR1(AA)(IMGT) GFTFTETY

서열번호 39 HCDR1(AA)(카바트) ETYMS

서열번호 33 HCDR2(AA)(IMGT) ISPTYSTT

서열번호 34 HCDR2(AA) 카바트) NISPTYSTTNYADSVKG

서열번호 35 HCDR3(AA)(IMGT) ARYNSYQGGLDY

서열번호 36 HCDR3(AA)(카바트) YNSYQGGLDY

FS22-172-003-AA/FS28-256-001 mAb ² 의 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 82 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQHNQYPNT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 122 경쇄 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAACATAATCAGTATCCGAATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACTGTAGCAGCTCCTTCCGTGTTCATCTTTCCGCCCAGTGATGAGCAGCTGAAGTCAGGTACTGCTTCCGTGGTTTGCCTGCTCAACAACTTTTACCCCAGAGAAGCCAAAGTCCAGTGGAAAGTGGACAATGCGTTGCAAAGCGGGAACTCTCAGGAATCCGTCACAGAGCAGGACTCTAAGGACTCCACCTATAGCCTCTCTAGTACGCTGACACTGAGCAAAGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGTGAGGTTACCCATCAAGGCCTTAGCTCACCAGTGACCAAGAGCTTCAATAGGGGAGAATGC

서열번호 68 VL 도메인 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQHNQYPNT FGQGTKVEIK

서열번호 69 VL 도메인 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAACATAATCAGTATCCGAATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

서열번호 20 LCDR1(AA)(IMGT) QSVSSSY

서열번호 21 LCDR1(AA)(카바트) RASQSVSSSYLA

서열번호 22 LCDR2(AA)(IMGT) GAS

서열번호 23 LCDR2(AA)(카바트) GASSRAT

서열번호 40 LCDR3(AA)(IMGT) QQHNQYPNT

서열번호 40 LCDR3(AA)(카바트) QQHNQYPNT

FS22-172-003-AA/FS28-256-005 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 118 중쇄 AA(LALA 없음)

서열번호 119 중쇄 DNA(LALA 없음)

서열번호 120 중쇄 AA(LALA 포함)

서열번호 121 중쇄 DNA(LALA 포함)

서열번호 66 VH 도메인 AA

서열번호 67 VH 도메인 DNA

서열번호 38 HCDR1(AA)(IMGT) GFTFTETY

서열번호 39 HCDR1(AA)(카바트) ETYMS

서열번호 33 HCDR2(AA)(IMGT) ISPTYSTT

서열번호 34 HCDR2(AA) 카바트) NISPTYSTTNYADSVKG

서열번호 35 HCDR3(AA)(IMGT) ARYNSYQGGLDY

서열번호 36 HCDR3(AA)(카바트) YNSYQGGLDY

FS22-172-003-AA/FS28-256-005 mAb ² 의 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 83 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQALGYPHT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 90 경쇄 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAAGCTTTGGGTTATCCTCATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACTGTAGCAGCTCCTTCCGTGTTCATCTTTCCGCCCAGTGATGAGCAGCTGAAGTCAGGTACTGCTTCCGTGGTTTGCCTGCTCAACAACTTTTACCCCAGAGAAGCCAAAGTCCAGTGGAAAGTGGACAATGCGTTGCAAAGCGGGAACTCTCAGGAATCCGTCACAGAGCAGGACTCTAAGGACTCCACCTATAGCCTCTCTAGTACGCTGACACTGAGCAAAGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCCTGTGAGGTTACCCATCAAGGCCTTAGCTCACCAGTGACCAAGAGCTTCAATAGGGGAGAATGC

서열번호 78 VL 도메인 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQALGYPHT FGQGTKVEIK

서열번호 79 VL 도메인 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAAGCTTTGGGTTATCCTCATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

서열번호 20 LCDR1(AA)(IMGT) QSVSSSY

서열번호 21 LCDR1(AA)(카바트) RASQSVSSSYLA

서열번호 22 LCDR2(AA)(IMGT) GAS

서열번호 23 LCDR2(AA)(카바트) GASSRAT

서열번호 41 LCDR3(AA)(IMGT) QQALGYPHT

서열번호 41 LCDR3(AA)(카바트) QQALGYPHT

FS22-172-003-AA/FS28-256-012 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 123 중쇄 AA(LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT HTY MS WVRQAPGKGLEWVS N ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNNKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNAYHAALDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 124 중쇄 DNA(LALA 없음)

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서열번호 125 중쇄 AA(LALA 포함)

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FS22-172-003-AA/FS28-256-026 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 131 중쇄 AA (LALA 없음)

서열번호 132 중쇄 DNA(LALA 없음)

서열번호 133 중쇄 AA(LALA 포함)

서열번호 134 중쇄 DNA(LALA 포함)

서열번호 74 VH 도메인 AA

서열번호 75 VH 도메인 DNA

서열번호 50 HCDR1(AA)(IMGT) GFTFTQTY

서열번호 51 HCDR1(AA)(카바트) QTYMS

서열번호 33 HCDR2(AA)(IMGT) ISPTYSTT

서열번호 34 HCDR2(AA) 카바트) NISPTYSTTNYADSVKG

서열번호 52 HCDR3(AA)(IMGT) ARYNAYQIGLDY

서열번호 53 HCDR3(AA)(카바트) YNAYQIGLDY

FS22-172-003-AA/FS28-256-026 mAb ² 의 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 83 경쇄 AA

서열번호 90 경쇄 DNA

서열번호 78 VL 도메인 AA

서열번호 79 VL 도메인 DNA

서열번호 20 LCDR1(AA)(IMGT) QSVSSSY

서열번호 21 LCDR1(AA)(카바트) RASQSVSSSYLA

서열번호 22 LCDR2(AA)(IMGT) GAS

서열번호 23 LCDR2(AA)(카바트) GASSRAT

서열번호 41 LCDR3(AA)(IMGT) QQALGYPHT

서열번호 41 LCDR3(AA)(카바트) QQALGYPHT

FS22-172-003-AA/FS28-256-027 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 123 중쇄 AA(LALA 없음)

서열번호 124 중쇄 DNA(LALA 없음)

서열번호 125 중쇄 AA(LALA 포함)

서열번호 126 중쇄 DNA(LALA 포함)

서열번호 70 VH 도메인 AA

서열번호 71 VH 도메인 DNA

서열번호 42 HCDR1(AA)(IMGT) GFTFTHTY

서열번호 43 HCDR1(AA)(카바트) HTYMS

서열번호 33 HCDR2(AA)(IMGT) ISPTYSTT

서열번호 34 HCDR2(AA) 카바트) NISPTYSTTNYADSVKG

서열번호 44 HCDR3(AA)(IMGT) ARYNAYHAALDY

서열번호 45 HCDR3(AA)(카바트) YNAYHAALDY

FS22-172-003-AA/FS28-256-027 mAb ² 의 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 84 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQTVPYPYT FGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

서열번호 91 경쇄 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAAACTGTGCCGTATCCGTATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACTGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATTTTTCCGCCATCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTCTGCCTGCTCAACAACTTCTACCCTCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAATGCCCTGCAGTCCGGAAACTCGCAGGAAAGCGTGACTGAACAGGACTCCAAGGACTCCACCTATTCACTGTCCTCGACTCTGACCCTGAGCAAGGCGGATTACGAAAAGCACAAAGTGTACGCATGCGAAGTGACCCACCAGGGTCTTTCGTCCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGAGAGTGT

서열번호 76 VL 도메인 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RAS QSVSSSY LA WYQQKPGQAPRLLIY GAS SRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQTVPYPYT FGQGTKVEIK

서열번호 77 VL 도메인 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAAACTGTGCCGTATCCGTATACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA

서열번호 20 LCDR1(AA)(IMGT) QSVSSSY

서열번호 21 LCDR1(AA)(카바트) RASQSVSSSYLA

서열번호 22 LCDR2(AA)(IMGT) GAS

서열번호 23 LCDR2(AA)(카바트) GASSRAT

서열번호 80 LCDR3(AA)(IMGT) QQTVPYPYT

서열번호 80 LCDR3(AA)(카바트) QQTVPYPYT

마우스 mAb 및 mAb ²

FS28m-228 mAb의 중쇄의 아미노산 서열

서열번호 135 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYFMVWVRQAPGKGLEWVSMISPKSSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWFTPARFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

FS28m-228 mAb의 경쇄의 아미노산 서열

서열번호 136 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQPFPFSFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 서열

서열번호 137 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYFMVWVRQAPGKGLEWVSMISPKSSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWFTPARFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEPYWSYVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVMNYRWELGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

FS22m-063-AA/FS28m-228 mAb ² 의 경쇄의 아미노산 서열

서열번호: 136 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQPFPFSFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

G1AA/HelD1.3 mAb의 중쇄의 아미노산 서열

서열번호 138 중쇄 AA(LALA 포함)

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

G1AA/HelD1.3 mAb의 경쇄의 아미노산 서열

서열번호 139 경쇄 AA

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

G1AA/SS1 mAb

서열번호 140 중쇄(LALA 포함)

QVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKSLEWIGLITPYNGASSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMDLLSLTSEDSAVYFCARGGYDGRGFDYWGSGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 141 경쇄

DIELTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSKHPLTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

MSLN-His-Avi

메소텔린(MPF 및 C 말단 없음)(제시됨); His 및 Avi 태그(제시되지 않음)

서열번호 142 인간

EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALS

서열번호 143 시노

DVERTTCPPEKEVHEIDESLIFYKKRELEACVDAALLAAQMDRVDAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIRHLGHLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLKVSKGHEMSAQVATLIDRVVVGRGQLDKDTADTLTAFCPGCLCSLSPERLSSVPPSIIGAVRPQDLDTCGPRQLDVLYPKARLAFQNMSGSEYFVKIRPFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRREAVLPLSVAEVQKLLGPHVEGLKVEEQHSPVRDWILKQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLILDLSVREALS

서열번호 144 마우스

DAEQKACPPGKEPYKVDEDLIFYQNWELEACVDGTMLARQMDLVNEIPFTYEQLSIFKHKLDKTYPQGYPESLIQQLGHFFRYVSPEDIHQWNVTSPDTVKTLLKVSKGQKMNAQAIALVACYLRGGGQLDEDMVKALGDIPLSYLCDFSPQDLHSVPSSVMWLVGPQDLDKCSQRHLGLLYQKACSAFQNVSGLEYFEKIKTFLGGASVKDLRALSQHNVSMDIATFKRLQVDSLVGLSVAEVQKLLGPNIVDLKTEEDKSPVRDWLFRQHQKDLDRLGLGLQGGIPNGYLVLDFNVREAFS

CD137-mFc-Avi 및 CD137-Avi-His

(세포외 도메인 CD137(제시됨); mFc, Avi 태그, His 태그(제시되지 않음))

서열번호 146 인간

SLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQ

서열번호 147 시노

SLQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQ

서열번호 148 마우스

AVQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICRVCAGYFRFKKFCSSTHNAECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCSLDGRSVLKTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGHSLQVL

세포 발현 항원(CD137)

(세포외 도메인(이탤릭체); 막 관통 및 세포내 도메인(굵게))

서열번호 149 인간

LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQ IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

서열번호 150 마우스

VQNSCDNCQPGTFCRKYNPVCKSCPPSTFSSIGGQPNCNICRVCAGYFRFKKFCSSTHNAECECIEGFHCLGPQCTRCEKDCRPGQELTKQGCKTCSLGTFNDQNGTGVCRPWTNCSLDGRSVLKTGTTEKDVVCGPPVVSFSPSTTISVTPEGGPGGHSLQVL TLFLALTSALLLALIFITLLFSVLKWIRKKFPHIFKQPFKKTTGAAQEEDACSCRCPQEEEGGGGGYEL

서열번호 153 시노 LQDLCSNCPAGTFCDNNRSQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFKTRKECSSTSNAECDCISGYHCLGAECSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSATPPAPAREPGHSPQ IIFFLALTSTVVLFLLFFLVLRFSVVKRSRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

과발현 세포주 - 메소텔린의 막-결합된 성숙 형태(굵은 이탤릭체로 제시됨)

[N.B. MPF 및 프로펩티드는 메소텔린 서열 전후에 일반 글꼴로 제시된다. 어느 것도 메소텔린의 막-결합된 성숙 형태로 존재하지 않는다.]

인간 MPF + MSLN

서열번호: 151

MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISSLSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVRELAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTWSVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRFRR EVEKTACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALLATQMDRVNAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATLIDRFVKGRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKARLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQKLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALS GTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA

마우스 MPF + MSLN

서열번호 145

MALPTARPLLGSCGSPICSRSFLLLLLSLGWIPRLQTQTTKTSQEATLLHAVNGAADFASLPTGLFLGLTCEEVSDLSMEQAKGLAMAVRQKNITLRGHQLRCLARRLPRHLTDEELNALPLDLLLFLNPAMFPGQQACAHFFSLISKANVDVLPRRSLERQRLLMEALKCQGVYGFQVSEADVRALGGLACDLPGKFVARSSEVLLPWLAGCQGPLDQSQEKAVREVLRSGRTQYGPPSKWSVSTLDALQSLVAVLDESIVQSIPKDVKAEWLQHISRDPSRLGSKLTVIHPRFRR DAEQKACPPGKEPYKVDEDLIFYQNWELEACVDGTMLARQMDLVNEIPFTYEQLSIFKHKLDKTYPQGYPESLIQQLGHFFRYVSPEDIHQWNVTSPDTVKTLLKVSKGQKMNAQAIALVACYLRGGGQLDEDMVKALGDIPLSYLCDFSPQDLHSVPSSVMWLVGPQDLDKCSQRHLGLLYQKACSAFQNVSGLEYFEKIKTFLGGASVKDLRALSQHNVSMDIATFKRLQVDSLVGLSVAEVQKLLGPNIVDLKTEEDKSPVRDWLFRQHQKDLDRLGLGLQGGIPNGYLVLDFNVREAFS SRASLLGPGFVLIWIPALLPALRLS

시노 MPF + MSLN

서열번호 152

MALPMARPLSGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRVLAGETRQEAAPLDGILTNAPDIASLSPRQLLGFTCVEVSGLSTELVQELAVALGQKNVKLSAEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPLDLLLFLNPDAFSGPQACTHFFSRVAKANVDLLPRGAPERQRLLPAALTCWGVRGSLLSEADVRALGGLACDLPGRFVAESAEVVLPRLVRCLGPLDQDQQEAARAALQRGGPPYGPPSTWSISTLDDLQSLLPVLGQPVIHSIPQGILAAWRQRSSRDPSWQQPEQTVLRPRFRR DVERTTCPPEKEVHEIDESLIFYKKRELEACVDAALLAAQMDRVDAIPFTYEQLDVLKHKLDELYPQGYPESVIRHLGHLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLKVSKGHEMSAQVATLIDRVVVGRGQLDKDTADTLTAFCPGCLCSLSPERLSSVPPSIIGAVRPQDLDTCGPRQLDVLYPKARLAFQNMSGSEYFVKIRPFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRREAVLPLSVAEVQKLLGPHVEGLKVEEQHSPVRDWILKQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLILDLSVREALS GTPCLLGPGPVLTVLALLLASTLA

야생형 CH2 도메인의 아미노산 서열

서열번호 154 CH2(WT)

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

LALA 돌연변이를 함유하는 CH2 도메인의 아미노산 서열(LALA 돌연변이는 굵게 그리고 밑줄친다)

서열번호 155 CH2(LALA)

APE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

LALA-PA 돌연변이를 함유하는 CH2 도메인의 아미노산 서열(LALA-PA 돌연변이는 굵게 그리고 밑줄친다)

서열번호 156 CH2(LALA-PA)

APE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL A APIEKTISKAK

FS22-172-003-AA/FS28-256-271, FS22-172-003-AA/FS28-256-272 및 FS22-172-003-AA/FS28-256-273 mAb2의 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 84 경쇄 AA

서열번호 91 경쇄 DNA

서열번호 76 VL 도메인 AA

서열번호 77 VL 도메인 DNA

서열번호 20 LCDR1(AA)(IMGT) QSVSSSY

서열번호 21 LCDR1(AA)(카바트) RASQSVSSSYLA

서열번호 22 LCDR2(AA)(IMGT) GAS

서열번호 23 LCDR2(AA)(카바트) GASSRAT

서열번호 80 LCDR3(AA)(IMGT) QQTVPYPYT

서열번호 80 LCDR3(AA)(카바트) QQTVPYPYT

FS22-172-003-AA/FS28-256-271 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 1 중쇄 AA(LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT HTY MS WVRQAPGKGLEWVS A ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNNKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNAYHAALDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 2 중쇄 DNA(LALA 없음)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTCATACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGCGATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAACAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACGCGTATCATGCTGCTCTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 3 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT HTY MS WVRQAPGKGLEWVS A ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNNKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNAYHAALDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 4 중쇄 DNA(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTCATACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCGCGATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAACAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACGCGTATCATGCTGCTCTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 70 VH 도메인 AA

서열번호 71 VH 도메인 DNA

서열번호 42 HCDR1(AA)(IMGT) GFTFTHTY

서열번호 43 HCDR1(AA)(카바트) HTYMS

서열번호 33 HCDR2(AA)(IMGT) ISPTYSTT

서열번호 5 HCDR2(AA) 카바트) AISPTYSTTNYADSVKG

서열번호 44 HCDR3(AA)(IMGT) ARYNAYHAALDY

서열번호 45 HCDR3(AA)(카바트) YNAYHAALDY

FS22-172-003-AA/FS28-256-272 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 6 중쇄 AA(LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT HTY MS WVRQAPGKGLEWVS H ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNNKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNAYHAALDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 7 중쇄 DNA(LALA 없음)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTCATACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCCATATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAACAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACGCGTATCATGCTGCTCTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 158 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT HTY MS WVRQAPGKGLEWVS H ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNNKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNAYHAALDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 159 중쇄 DNA(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTCATACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCCATATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAACAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACGCGTATCATGCTGCTCTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 70 VH 도메인 AA

서열번호 71 VH 도메인 DNA

서열번호 42 HCDR1(AA)(IMGT) GFTFTHTY

서열번호 43 HCDR1(AA)(카바트) HTYMS

서열번호 33 HCDR2(AA)(IMGT) ISPTYSTT

서열번호 160 HCDR2(AA) 카바트) HISPTYSTTNYADSVKG

서열번호 44 HCDR3(AA)(IMGT) ARYNAYHAALDY

서열번호 45 HCDR3(AA)(카바트) YNAYHAALDY

FS22-172-003-AA/FS28-256-273 mAb ² 의 중쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 161 중쇄 AA(LALA 없음)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT HTY MS WVRQAPGKGLEWVS S ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNNKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNAYHAALDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 162 중쇄 DNA(LALA 없음)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTCATACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTCGATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAACAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACGCGTATCATGCTGCTCTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAACTGCTGGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 163 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT HTY MS WVRQAPGKGLEWVS S ISPTYSTT NYADSVKG RFTISRDNNKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR YNAYHAALDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 164 중쇄 DNA(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTCATACTTATATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCTCGATTTCTCCGACTTATAGCACTACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAACAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGATACAACGCGTATCATGCTGCTCTGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 70 VH 도메인 AA

서열번호 71 VH 도메인 DNA

서열번호 42 HCDR1(AA)(IMGT) GFTFTHTY

서열번호 43 HCDR1(AA)(카바트) HTYMS

서열번호 33 HCDR2(AA)(IMGT) ISPTYSTT

서열번호 165 HCDR2(AA) 카바트) SISPTYSTTNYADSVKG

서열번호 44 HCDR3(AA)(IMGT) ARYNAYHAALDY

서열번호 45 HCDR3(AA)(카바트) YNAYHAALDY

FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2의 중쇄의 아미노산 서열

서열번호 166 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYFMVWVRQAPGKGLEWVSMISPKSSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYHISPRFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEPYWSYVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVMNYRWELGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

FS22m-063-AA/FS28m-228-010 mAb2의 경쇄의 아미노산 서열

서열번호 136 경쇄 AA

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQPFPFSFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

FS22m-063-AA/HelD1.3 mAb2의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열

서열번호 167 중쇄 AA(LALA 포함)

QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGSTFSGYGVNWVRQPPGRGLEWIGMIWGDGNTDYNSALKSRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARERDYRLDYWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEPYWSYVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVMNYRWELGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 168 경쇄 AA

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

FS22-172-003-AA/FS28-185-002 mAb ² 의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 169 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT TSA MS WVRQAPGKGLEWVS R INPYEGET NYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR GWSSDTWFKSATDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 170 중쇄 DNA(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGCTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTACATCTGCTATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGGATTAATCCGTATGAGGGCGAGACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGTTGGTCTAGTGATACGTGGTTTAAATCTGCCACGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 171 경쇄 AA

서열번호 172 경쇄 DNA

GAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCGGGCACGTTATCTCTGAGCCCTGGTGAGCGCGCCACTCTGTCATGCCGGGCTTCTCAAAGTGTTAGCAGTAGCTACCTGGCGTGGTATCAGCAAAAACCGGGCCAGGCCCCGCGTCTGCTGATTTACGGTGCATCCAGCCGTGCCACCGGCATTCCAGATCGTTTTTCCGGTAGTGGTTCTGGGACGGACTTCACTCTGACAATCTCACGCCTGGAACCGGAGGATTTTGCGGTGTATTACTGCCAGCAATCTTCTTATTCTGCTCCTGTCACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACTGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATTTTTCCGCCATCCGACGAGCAGCTCAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTCTGCCTGCTCAACAACTTCTACCCTCGCGAAGCTAAGGTCCAGTGGAAGGTCGACAATGCCCTGCAGTCCGGAAACTCGCAGGAAAGCGTGACTGAACAGGACTCCAAGGACTCCACCTATTCACTGTCCTCGACTCTGACCCTGAGCAAGGCGGATTACGAAAAGCACAAAGTGTACGCATGCGAAGTGACCCACCAGGGTCTTTCGTCCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGAGAGTGT

FS22-172-003-AA/FS28-185-003 mAb ² 의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 및 cDNA 서열

서열번호 173 중쇄 AA(LALA 포함)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFT TSA MS WVRQAPGKGLEWVS R INPYEGET NYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AR GWSATSYFKSATDY WGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE AA GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELPYIIPPYNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVGADRWLEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

서열번호 174 중쇄 DNA(LALA 포함)

GAAGTGCAACTGTTGGAGTCCGGTGGTGGTCTGGTACAGCCGGGTGGTTCTCTGCGTCTGAGTTGCGCGGCCAGTGGCTTTACCTTCACTACATCTGCTATGAGCTGGGTGCGTCAGGCTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGGTTAGCAGGATTAATCCGTATGAGGGCGAGACCAACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCTCGCGACAACAGCAAGAACACGCTGTACCTGCAGATGAACTCACTGCGTGCCGAAGATACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGTTGGTCTGCGACGAGTTATTTTAAATCTGCCACTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGCTAGCACTAAGGGCCCGTCGGTGTTCCCGCTGGCCCCATCGTCCAAGAGCACATCAGGGGGTACCGCCGCCCTGGGCTGCCTTGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTCACAGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCTCCGGAGTGCATACTTTCCCGGCTGTGCTTCAGTCCTCTGGCCTGTACTCATTGTCCTCCGTGGTCACCGTCCCTTCGTCCTCCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGTAATGTCAACCATAAGCCCTCGAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTCGAGCCGAAGTCGTGCGACAAGACTCACACTTGCCCGCCTTGCCCAGCCCCGGAAGCTGCCGGTGGTCCTTCGGTGTTCCTCTTCCCGCCCAAGCCGAAGGATACCCTGATGATCTCACGGACCCCCGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCGGAAGTGAAATTCAATTGGTACGTGGATGGAGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCACGGGAAGAACAGTACAACTCTACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTCACTGTGCTGCACCAAGACTGGCTGAACGGGAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCGCTGCCTGCCCCAATTGAGAAAACTATCTCGAAAGCCAAGGGACAGCCTCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGCCATACATCATCCCACCATACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGGCGCAGATAGGTGGCTGGAAGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCGCTGCACAACCACTACACTCAGAAGAGCTTGTCCCTGTCGCCCGGT

서열번호 175 경쇄 AA

서열번호 176 경쇄 DNA

WT Fcab CH3 도메인의 아미노산 서열(서열번호 81)

AB, CD 및 EF 루프는 밑줄친다

GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

WT CD 루프 서열

서열번호 157

WT Fcab CD 루프 - SNGQPENNY

참고 문헌

Claims

(a) 메소텔린(MSLN)에 대한 상보성 결정 영역(CDR)-기반 항원 결합 부위; 및
(b) 항체 분자의 CH3 도메인에 위치된 CD137 항원 결합 부위를 포함하는, 메소텔린(MSLN) 및 CD137에 결합하는 항체 분자로서,
CDR-기반 항원-결합 부위가 다음에 제시된 CDR 1-6을 포함하고:
(i) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22 및 80[FS28-256-271];
(ⅱ) 각각 서열번호 14, 16, 27, 20, 22 및 24[FS28-024-052];
(iii) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22 및 40[FS28-256-021];
(iv) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22 및 37[FS28-256-012];
(v) 각각 서열번호 50, 33, 52, 20, 22 및 40[FS28-256-023];
(vi) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22 및 41[FS28-256-024];
(ⅶ) 각각 서열번호 50, 33, 52, 20, 22 및 41[FS28-256-026];
(viii) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22, 및 80[FS28-256-027];
(ix) 각각 서열번호 38, 33, 35, 20, 22, 및 40[FS28-256-001];
(x) 각각 서열번호 38, 33, 35, 20, 22, 및 41[FS28-256-005];
(xi) 각각 서열번호 46, 33, 48, 20, 22 및 37[FS28-256-014];
(xii) 각각 서열번호 50, 33, 52, 20, 22 및 37[FS28-256-018];
(xiii) 각각 서열번호 31, 33, 35, 20, 22 및 37[FS28-256];
(xiv) 각각 서열번호 14, 16, 25, 20, 22 및 24[FS28-024-051];
(xv) 각각 서열번호 14, 16, 29, 20, 22 및 24[FS28-024-053]; 또는
(xvi) 각각 서열번호 14, 16, 18, 20, 22 및 24[FS28-024];
CD137 항원 결합 부위가 각각 CH3 도메인(domain)의 AB 및 EF 구조 루프(structural loop)에 위치된 제1 서열 및 제2 서열을 포함하고, 제1 및 상기 제2 서열이 각각 서열번호 10 및 11[FS22-172-003]에 제시된 서열을 갖는, 항체 분자.
제1항에 있어서, 항체 분자가 하기에 제시된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는, 항체 분자:
(ⅰ) 각각 서열번호 70 및 76[FS28-256-271];
(ⅱ) 각각 서열번호 58 및 54[FS28-024-052];
(iii) 각각 서열번호 70 및 68[FS28-256-021];
(iv) 각각 서열번호 70 및 64[FS28-256-012];
(v) 각각 서열번호 74 및 68[FS28-256-023];
(vi) 각각 서열번호 70 및 78[FS28-256-024];
(ⅶ) 각각 서열번호 74 및 78[FS28-256-026];
(viii) 각각 서열번호 70 및 76[FS28-256-027];
(ix) 각각 서열번호 66 및 68[FS28-256-001];
(x) 각각 서열번호 66 및 78[FS28-256-005];
(xi) 각각 서열번호 72 및 64[FS28-256-014];
(xii) 각각 서열번호 74 및 64[FS28-256-018];
(xiii) 각각 서열번호 62 및 64[FS28-256];
(xiv) 각각 서열번호 56 및 54[FS28-024-051];
(xv) 각각 서열번호 60 및 54[FS28-024-053]; 또는
(xvi) 각각 서열번호 12 및 54[FS28-024].
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자가
(i) 각각 서열번호 42, 33, 44, 20, 22, 및 80[FS28-256-271]에 제시된 CDR 1-6; 및/또는
(ii) 각각 서열번호 70 및 76[[FS28-256-271]에 제시된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는, 항체 분자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 분자가
(i) 각각 서열번호 14, 16, 27, 20, 22, 및 24[FS28-024-052]에 제시된 CDR 1-6; 및/또는
(ii) 각각 서열번호 58 및 54[FS28-024-052]에 제시된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는, 항체 분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 제1 서열이 항체 분자의 CH3 도메인의 위치 14와 위치 17 사이에 위치되고/되거나,
(ii) 제2 서열이 항체 분자의 CH3 도메인의 91과 99 사이에 위치되고,
아미노산 잔기 넘버링(numbering)이 IMGT 넘버링 방식에 따르는, 항체 분자.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 서열번호 8[FS22-172-003]에 제시된 CH3 도메인 서열을 포함하는, 항체 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 다음 항체의 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 항체 분자:
(i) 각각 서열번호 3 및 84에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-271;
(ii) 각각 서열번호 102 및 85에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-052;
(iii) 각각 서열번호 125 및 82에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-021;
(ⅳ) 각각 서열번호 125 및 116에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-012;
(v) 각각 서열번호 113 및 82에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-023;
(vi) 각각 서열번호 125 및 83에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-024;
(vii) 각각 서열번호 133 및 83에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-026;
(viii) 각각 서열번호 125 및 84에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-027;
(ix) 각각 서열번호 120 및 82에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-001;
(x) 각각 서열번호 120 및 83에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-005;
(xi) 각각 서열번호 129 및 116에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-014;
(xii) 각각 서열번호 133 및 116에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256-018;
(xiii) 각각 서열번호 114 및 116에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-256;
(xiv) 각각 서열번호 98 및 85에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-051;
(xv) 각각 서열번호 106 및 85에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024-053; 또는
(xvi) 각각 서열번호 94 및 85에 제시된 FS22-172-003-AA/FS28-024.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 각각 서열번호 3 및 84[FS22-172-003-AA/FS28-256-271]에 제시된 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 항체 분자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 각각 서열번호 85 및 102[FS22-172-003-AA/FS28-024-052]에 제시된 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 항체 분자.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 Fcγ 수용체에 결합하지 않는, 항체 분자.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 가용성 MSLN에 대한 것보다 높은 친화도로 고정된(immobilised) MSLN에 결합하는, 항체 분자.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 종양 세포 표면 결합된 MSLN의 존재하에 면역 세포 상에서 CD137을 활성화할 수 있는, 항체 분자.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자의 면역 세포 상의 CD137 및 종양 세포 표면 결합된 MSLN에 대한 결합이 면역 세포 상에서 CD137의 클러스터링(clustering)을 유발하는, 항체 분자.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 항체 분자를 인코딩(encoding)하는 핵산 분자 또는 분자들.
제14항에 따르는 핵산 분자 또는 분자들을 포함하는 벡터 또는 벡터들.
제14항에 따르는 핵산 분자(들) 또는 제15항에 따르는 벡터(들)를 포함하는 재조합 숙주 세포.
제16항의 재조합 숙주 세포를 항체 분자를 생산하기 위한 조건하에 배양하는 단게를 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 항체 분자의 생산 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따르는 항체 분자 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 개체(individual)에서 암의 치료 방법에 사용하기 위한, 항체 분자.
제19항에 있어서, 치료가 항체 분자 또는 접합체를 제2 치료제와 함께 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항체 분자 또는 접합체.