CN107523546A - 一种高效稳定表达抗体的nk细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高效稳定表达抗体的NK细胞及其用途。具体而言，本发明提供一种转基因NK细胞，所述NK细胞的基因组中稳定整合了包含人Fc段的抗体的编码序列的表达框，且表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列。本发明的转基因NK细胞在保持细胞杀伤毒性作用的同时又能够高水平、稳定表达包含人Fc段的抗体。此外，为了防止稳定表达抗体的免疫细胞在体内不断增殖，导致抗体过量表达，进而造成系统性毒性和自身免疫病，本发明还引入分子刹车系统。应用上市单抗药物可快速清除整合有抗体表达框的杀伤性细胞，有效提高了其治疗的安全性。

Description

一种高效稳定表达抗体的NK细胞及其用途
技术领域
本发明属于细胞生物学和肿瘤学领域，涉及一种高效稳定表达抗体的NK细胞及其用途。
背景技术
癌症现在已成为人类健康的头号杀手，快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。目前传统治疗手段疗效已到瓶颈，亟需探索一个更加有效的治疗方法，来提高癌症患者的生存率和生存质量。针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得令人瞩目的临床疗效。2011年，Nature及临床肿瘤最顶级杂志JCO分别发表相同题目“肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章(Nature.2011；480(7378):480；J Clin Oncol.2011；29(36):4828)，肿瘤免疫细胞治疗迎来新一轮的研究高潮，未来有可能在肿瘤治疗中占据相当重要的地位。
“免疫作用”可分为细胞免疫及体液免疫，两者具有截然不同杀灭肿瘤或病毒的方式。细胞免疫是以细胞直接发挥效应来清除异物，它是机体免疫应答的参与者，也是免疫功能的执行者。目前用于临床治疗的效应免疫细胞主要包括细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine activated killer cells，CIK)、自然杀伤细胞(Natural killer，NK)、淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell，LAK)、树突状细胞刺激的细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、γδT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)等。
NK细胞是重要的免疫效应细胞，主要参与免疫监视，消除异常细胞(包括恶性转化的细胞，病毒感染的细胞，抗体约束的细胞)以及受胁迫的细胞，而不破坏健康和正常的“自身”细胞。MHC-I分子几乎在每一个细胞上表达，当作是体内的“自我”标志，这些细胞不会受到NK细胞活性影响。许多异常肿瘤或病毒感染的细胞会减少细胞表面MHC-I分子的表达，以逃避细胞毒性T淋巴细胞(CTL)作用，但这些异常细胞会因耐受MHC-I配体的不存在而易受NK细胞介导的杀伤作用。
NK细胞是定义为表型为CD3-CD56+的淋巴细胞，属于固有免疫应答细胞，其杀伤活性不受细胞MHC限制，能快速溶解靶细胞。与CD8+的毒性T淋巴细胞不同，NK细胞的抗肿瘤毒性不需要事先致敏，并且还可以消除MHC-I阴性的细胞。NK细胞是一个非常安全的效应细胞，因为他们可以避免细胞因子风暴、肿瘤溶解综合症。NK细胞作为肿瘤免疫治疗，目的是使用不同方法(如使用异体NK细胞或者细胞系、基因修饰NK细胞或者细胞系)来克服NK细胞麻痹，特别是采用嵌合抗原受体修饰的NK细胞，可有效的提高NK细胞的抗肿瘤效应。NK细胞因为不需要进行HLA配型，因此也被认为是肿瘤免疫治疗中和T细胞有同样应用价值的细胞类型。临床试验显示，异体NK细胞在患者体内能存活数周甚至数月。
NK细胞来源有：外周血(PB)、无刺激的白细胞单采产品(PBSC)、脐带血(UCB)、骨髓(BM)、人胚胎干细胞(hESCs)以及诱导性多能干细胞(iPCSs)。目前认为NK细胞主要通过以下途径发挥杀伤作用：1、NK细胞直接通过胞吐作用释放穿孔素和颗粒酶等细胞毒性颗粒，活化caspase途径诱导靶细胞凋亡；2、活化NK细胞表达Fas(CD95)配体和TRAIL(TNFrelated apoptosis inducing ligand)分子，诱导CD95+靶细胞和TRAIL受体阳性的靶细胞通过内源酶的级联反应发生凋亡；3、细胞因子介导的杀伤作用，NK细胞能合成和分泌多种细胞因子，如IFNγ、TNFα、IL1、IL5、IL8、IL10和GCSF；4、ADCC作用。
体液免疫是由抗体所介导产生作用，人体内的抗体是由B淋巴细胞产生。1997年，第一个用于临床癌症治疗的单抗——抗人CD20(rituximab)获得FDA批准。随着抗体技术的发展，至今全球已报道的抗体有10多万种，其中基因工程抗体有1000多种，人源化抗体200多种。截止2016年3月，FDA至今已批准50个抗体上市，其中26个用于肿瘤治疗，这些抗体既有作用于肿瘤细胞本身直接发挥作用，也有作用于免疫细胞间接发挥作用。
然而，NK细胞虽然具有一定的抗肿瘤作用，但其临床治疗效果有限；而大分子抗体对实体瘤的穿透力不足，且全身用药有可能引起系统性不良反应。例如，HER2单抗具有心脏毒性，而PD1抗体打破机体免疫平衡，可引起自身免疫疾病。而且，由于抗体药物涉及复杂的体外生产与制备工艺，纯度要求高且用量大，导致用药费用高昂。因而，如果在NK细胞保持细胞杀伤毒性的前提下，能由其高效表达具有抗肿瘤活性的抗体，将同时克服细胞免疫治疗作用不足与大分子抗体难以进入实体瘤内部的困难，同时可以降低治疗成本。这些既具有细胞杀伤毒性、又能高水平表达抗体的细胞，在趋化因子作用下，经过细胞变形主动进入肿瘤组织内部，从而在肿瘤组织局部高水平表达抗体，可以避免全身性用药带来的副作用。同时，作用于免疫细胞自身的抗体(如HER2抗体Herceptin)，由于抗体与细胞杀伤毒性免疫细胞双重存在，可产生强烈的ADCC效应及CDC效应，高效杀灭肿瘤细胞；而作用于T细胞的抗体(如PD1抗体Keytruda)，可以重新激活肿瘤微环境中被抑制的肿瘤特异性T细胞的活性，使其持续发挥治疗作用。
尽管已经有将外源基因转导入NK细胞的报导，但目前常用基因转染载体系统对NK细胞转染率低，或者难以使外源基因在其细胞内高水平地表达。利用腺病毒载体(非整合型)可以介导外源基因在NK细胞内较高效的短时表达，但活化的NK细胞增殖速度非常快，携带的外源基因表达框在细胞传代中将快速丢失，表达难以持久；利用逆转录病毒或慢病毒可以介导外源基因在NK细胞基因组中的整合，理论上可实现稳定表达，但抗体包含轻链与重链，编码序列长、分子量大，导致携带全长抗体表达框的逆转录病毒或慢病毒包装与制备存在较大困难、难以高效表达抗体，只能用于表达结构简单的单链抗体(缺乏Fc段片段，功能不全且半衰期短)。因而在此之前，尚无具有细胞杀伤毒性并且能稳定、高水平地表达含有人Fc段的抗体的转基因NK细胞的报道。
发明内容
本发明第一方面提供一种转基因NK细胞，所述NK细胞的基因组中稳定整合了包含人Fc段的抗体的编码序列的表达框，且表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列。
在一个或多个实施方案中，每百万个所述NK细胞在48小时内表达的抗体量高于2μg。
在一个或多个实施方案中，所述转座子选自：piggybac、sleeping beauty、frogprince、Tn5和Ty；优选地，所述转座子为piggybac。
在一个或多个实施方案中，所述NK细胞选自：原代NK细胞、NK细胞株和NKT细胞；优选地，所述NK细胞为原代NK细胞。
在一个或多个实施方案中，所述人抗体的Fc段为人鼠嵌合抗体或人源化抗体Fc段。
在一个或多个实施方案中，所述NK细胞还包含刹车分子，该刹车分子为可被已上市抗体药物识别的膜抗原；优选地，所述膜抗原选自CD11a、CD15、CD19、CD20、CD25、CD44、CD47、CD52、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、MSLN、GPIIb/IIIa、α4整合素和α4β7整合素；优选地，所述膜抗原为CD20。
在一个或多个实施方案中，所述NK细胞的基因组中还稳定整合了包含刹车分子的编码序列的表达框，且表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列。
在一个或多个实施方案中，所述抗体为抗肿瘤或抗病毒的抗体，优选选自：免疫检查点抗体、T细胞共刺激信号抗体、抗新生血管生成的抗体、抗肿瘤细胞生长因子受体的抗体、抗肿瘤细胞膜抗原的抗体和抗病毒抗体。
在一个或多个实施方案中，所述抗体针对如下抗原中的一种或多种：EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、MUC1(粘蛋白1，细胞表面相关的)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转换酶1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、CA125(又称MUC16，粘蛋白16，细胞表面相关)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、β2-MG(β-2-微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)、GD2(又称B4GALNT1，β1,4-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、gp100(PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称melan-A)、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(α-胎蛋白)、CEA、PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD28、CD137、CD40、CD40L、CD47、乙肝病毒和艾滋病毒。
在一个或多个实施方案中，所述抗体为HER2抗体。
在一个或多个实施方案中，所述转基因NK细胞转入了以下核酸构建物A和B：
核酸构建物A：含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、包含人Fc段的抗体的编码序列及控制该核酸序列表达的启动子、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)；
核酸构建物B：含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、编码刹车分子的核酸序列及控制该核酸序列表达的启动子、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列和任选的控制转座酶编码序列表达的启动子。
在一个或多个实施方案中，采用病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转中的一种或多种方法将所述核酸构建物转入所述细胞中，优选地采用电转。
本发明第二方面提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的转基因NK细胞和药学上可接受的辅料。
本发明第三方面提供本文所述的转基因NK细胞药物组合物的用途，其特征在于，所述用途选自：
制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物、制备用于抑制病毒生长的药物、制备用于治疗肿瘤的药物、制备用于治疗病毒感染性疾病的药物、制备用于治疗细菌感染性疾病的药物和制备用于治疗自身免疫疾病的药物。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤选自：肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。
本发明第四方面提供一种转染NK细胞的方法，所述方法包括使用两种重组表达载体共转染所述NK细胞；其中，一种重组表达载体含有感兴趣核酸序列的表达框，在该表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列，且该重组表达载体不含有转座酶的编码序列；另一种重组表达载体含有任选的刹车分子的表达框，在在该表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列，且该重组表达载体含有转座酶的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述两种重组表达载体分别为本文所述的重组表达载体A和B。
附图说明
图1：抗体的表达框模式图。ITR为转座子末端重复序列，HyPB是piggybac转座酶。
图2A和2B：不同供体来源的PIK-NK细胞表达HER2抗体水平的ELISA检测图。对照为非转基因的同一来源NK细胞。
图3：PIK-NK细胞表达HER2抗体的Western blotting检测图。
图4：HER2抗体表达框在PIK-NK细胞基因组中的检测。
图5：PIK-NK细胞表面表达抗体分子的流式检测。
图6A、6B、6C和6D：PIK-NK细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤活性检测。
图7：PIK-NK细胞对移植瘤的体内抑制作用检测。
图8：PIK-NK细胞分子刹车系统的功能检测。
具体实施方式
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列和PolyA加尾信号序列。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“抗原结合片段”(antigen-binding fragment,Fab)是指位于抗体分子"Y"结构的两臂末端，由高变区氨基酸序列组成，决定抗体结合抗原的特异性的肽段。
术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable,Fc)，是指位于抗体分子"Y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段,是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。
术语“抗原表位”，又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。一般情况下，一个多肽表位含5～6个氨基酸残基抗原表位，可被特定的抗体所识别。抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。而根据抗原表位的氨基酸连续性的不同，可以分为线性表位与空间表位，线性表位是一段序列相邻的氨基酸组成的表位，而空间表位是数个不相邻，但在空间结构上相邻的氨基酸组成的表位。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。
术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences，Gennaro AR编，第19版，Pennsylvania:Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
本文提供一类核酸构建物(本文也称为“核酸构建物A”)，该类核酸构建物含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、感兴趣的核酸序列及任选的控制该感兴趣的核酸序列表达的启动子、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)。
本文还提供另一类核酸构建物(本文也称为“核酸构建物B”)，该类核酸构建物含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、任选的编码刹车分子的核酸序列及任选的控制该核酸序列表达的启动子、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列和任选的控制转座酶编码序列表达的启动子。
本文中，“感兴趣的核酸序列”可以是编码本领域周知的各种功能蛋白的核酸序列。这类功能蛋白包括各类抗体，尤其是抗体的恒定区段和/或可变区，包括但不限于重链恒定区段、轻链恒定区段、重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，所述感兴趣的核酸序列编码抗体的Fc段的全长序列或其功能性片段。在某些实施方案中，所述感兴趣的核酸序列编码抗体的重链恒定区段(如Fc)和轻链。在某些实施方案中，所述感兴趣的核酸序列编码抗体的重链全长序列和轻链全长序列。在某些实施方案中，编码重链区段和轻链区段的核酸序列可通过本领域常用的接头序列(如Furin 2A的编码序列)连接。“区段”在本文中指抗体的基础结构单元，例如抗体的CH1、CH2、CH3、CL、VL、VH等部分。
感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。感兴趣的抗体可选自：免疫检查点抗体、T细胞共刺激信号抗体、抗新生血管生成的抗体、抗肿瘤细胞生长因子受体的抗体以及抗肿瘤细胞膜抗原的抗体。
在某些实施方案中，感兴趣的抗体可以是针对如下抗原中的一种或多种的抗体：EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、MUC1(粘蛋白1，细胞表面相关的)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转换酶1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、CA125(又称MUC16，粘蛋白16，细胞表面相关)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、β2-MG(β-2-微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)、GD2(又称B4GALNT1，β1,4-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、gp100(PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称melan-A)、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(α-胎蛋白)、CEA、PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD28、CD137、CD40、CD40L、CD47、乙肝病毒和艾滋病毒。
在某些实施方案中，抗体为作用于肿瘤细胞的抗体，在NK细胞表达抗体后，通过抗体的引导作用，协同发挥ADCC效应。在某些实施方案中，抗体为分泌型抗体。在其它实施方案中，抗体为膜锚定型抗体。在一个或多个实施方案中，所述抗体为HER2抗体。
“ERBB2”是指细胞生长因子受体2，又称HER2，它在NCBI GeneBank的官方名称为ERBB2，ID号为2064，它有5个异构体，cDNA序列/蛋白序列为NM_004448.3/NP_004439.2，NM_001005862.2/NP_001005862.1，NM_001289936.1/NP_001276865.1，NM_001289937.1/NP_001276866.1，NM_001289938.1/NP_001276867.1。
“CD20”是指人白细胞分化抗原20，它在NCBI GeneBank的官方名称为MS4A1，ID号为931，有2个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，分别为NM_021950.3/NP_068769.2,NM_152866.2/NP_690605.1。当提及CD20的氨基酸序列时，其包括CD20蛋白的全长或者具有CD20功能的CD20的片段；还包括所述全长或片段的融合蛋白。并且，本领域技术人员理解，在CD20的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。并且，当描述CD20的蛋白序列片段时，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
可根据所选的感兴趣核酸序列选择相应的启动子序列。这类启动子的例子包括但不限于EF1α启动子。如CN201510021408.1所述(本文将其全部内容以引用的方式纳入本文)，启动子上游还可包括增强子，如mCMV增强子、hCMV增强子和CD3e增强子中的一个、任意两个或全部三个。
因此，在某些实施方案中，本文使用CN201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请SEQ ID NO:1所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的CCEF启动子；SEQ ID NO:2所示的含CD3e增强子和EF1α启动子的TEF启动子；SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的TCEF启动子；SEQ ID NO:4所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子；SEQ ID NO:5所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及SEQ ID NO:5所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的TCEFI启动子。
本文中，转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，本发明核酸构建物中的5’ITR和3’ITR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。
在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac的转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。
转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7SEQ ID NO:6所示。
可使用本领域周知的polyA加尾信号序列。在某些实施方案中，所述polyA来自SV40。在某些实施方式中，可使用CN 201510638974.7SEQ ID NO:3所示的序列。
本文所用“刹车分子”或“分子刹车”可互换使用，指可被已上市抗体药物识别的膜抗原。通过加入识别该“刹车分子”的抗体药物，携带该“刹车分子”的细胞能被快速清除，从而提高治疗安全性。合适的刹车分子(膜抗原)可选自：CD11a、CD15、CD19、CD20、CD25、CD44、CD47、CD52、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、MSLN(间皮素)、GPIIb/IIIa、α4整合素和α4β7整合素。在某些实施方案中，膜抗原为CD20。在某些实施方案中，可使用所述膜抗原的线性表位或空间表位。
可针对所选膜抗原选择合适的启动子，用以控制膜抗原的表达。在某些实施方案中，启动子是EF1α启动子。在某些实施方案中，EF1α启动子的序列如CN 201510638974.7SEQID NO:8所示。
在某些实施方案中，本文的核酸构建物A含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制感兴趣的核酸序列表达的启动子、感兴趣的核酸序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)。
在某些实施方案中，本文的核酸构建物B含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制编码刹车分子的核酸序列表达的启动子、编码刹车分子的核酸序列、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列以及控制该转座酶编码序列表达的启动子。
在某些实施方案中，所述核酸构建物A含有SEQ ID NO:3所示的核酸序列。在某些实施方案中，所述核酸构建物B含有SEQ ID NO:4所示的核酸序列。
本文的核酸构建物A和B各自可以是种重组表达载体(重组表达载体A和B)，用于表达感兴趣的核酸序列和所述任选的编码刹车分子的核酸序列。优选的是，表达载体是转座子载体。在某些实施方案中，载体为选自如下转座子载体中的一种或多种：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty。除核酸构建物A、B和C所含的核酸序列外，表达载体中通常还含有载体通常所含的其它元件，例如多克隆位点、抗性基因、复制起始位点等。应理解，通常，本发明的核酸构建物A/重组表达载体A不含有转座酶的编码序列。
在某些实施方案中，所述重组表达载体采用pUC18、pUC19、pMD18-T、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、pMAX或pDC315系列载体作为骨架。在其它实施方案中，所述重组表达载体采用pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX载体或pDC315系列载体作为骨架。在某些实施方案中，本发明使用CN201510638974.7构建的pSN载体，其载体结构如该申请图1所示。
可将本发明的核酸构建物A/重组表达载体A和核酸构建物B/重组表达载体B转入感兴趣的细胞中。转入的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述核酸构建物或重组表达载体。
感兴趣的细胞可以是本领域周知的各种NK细胞。示例性的NK细胞包括但不限于原代NK细胞、NK细胞株(如NK92)和NKT细胞。在某些实施方案中，所述NK细胞为原代NK细胞。另外，可使用各种来源的NK细胞，包括但不限于来自或衍生自外周血(PB)、无刺激的白细胞单采产品(PBSC)、脐带血(UCB)、骨髓(BM)、人胚胎干细胞(hESCs)以及诱导性多能干细胞(iPCSs)的NK细胞。
由于核酸构建物A/重组表达载体A含有转座所需的ITR元件但不含有转座酶，而核酸构建物B/重组表达载体B含有外源基因整合所需的转座酶，因此，只有同时转染了核酸构建物A/重组表达载体A和核酸构建物B/重组表达载体B的细胞中才能实现含感兴趣核酸序列的表达框整合。更进一步地，核酸构建物A或重组表达载体A中转座子5’反向末端重复序列和转座子3’反向末端重复序列之间的核酸序列，包括5’和3’反向末端重复序列本身，都整合到细胞的基因组中。当核酸构建物B/重组表达载体B含有编码刹车分子的核酸序列时，细胞将进一步表达刹车分子。同样地，核酸构建物B或重组表达载体B中转座子5’反向末端重复序列和转座子3’反向末端重复序列之间的核酸序列，包括5’和3’反向末端重复序列本身，也都整合到细胞的基因组中。
因此，本文还提供一类转基因NK细胞，所述转基因NK细胞的基因组中稳定整合了包含所述感兴趣的核酸序列的表达框。更进一步地，所述NK细胞的基因组中稳定整合了依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制感兴趣的核酸序列表达的启动子、感兴趣的核酸序列、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)。在优选的实施方案中，所述转基因NK细胞的基因组中还进一步整合有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、控制编码刹车分子的核酸序列表达的启动子、编码刹车分子的核酸序列、polyA加尾信号序列、以及转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)。
在某些实施方案中，本文的转基因NK细胞稳定表达抗体Fc段的全长序列或其功能性片段。在某些实施方案中，本文的转基因NK细胞稳定表达抗体的重链恒定区段(如Fc)和轻链。在某些实施方案中，本文的转基因NK细胞稳定表达抗体的重链和轻链。在某些实施方案中，本文的转基因NK细胞转入了本文所述的核酸构建物A/重组表达载体A和核酸构建物B/重组表达载体B。在其它实施方案中，每百万个本文的转基因NK细胞在48小时的时间内表达的抗体量高于2μg。
根据所表达的抗体的生物学功能，本文的转基因NK细胞可具有不同的生物学活性，包括但不限于抑制肿瘤、抑制病毒、抑制细菌等。因此，本文的转基因NK细胞可用于抑制肿瘤细胞的生长、抑制病毒的生长、治疗肿瘤、治疗病毒感染性疾病、治疗细菌感染性疾病、以及治疗自身免疫疾病。本文中，肿瘤包括但不限于：肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。
因此，本文也提供一种药物组合物，该药物组合物含有本文转基因NK细胞和药学上可接受的载体或赋形剂。本文还提供本文所述的转基因NK细胞在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物、制备用于抑制病毒生长的药物、制备用于治疗肿瘤的药物、制备用于治疗病毒感染性疾病的药物、制备用于治疗细菌感染性疾病的药物、或制备用于治疗自身免疫疾病的药物中的用途。
本发明还提供一种转染NK细胞的方法，所述方法包括使用两种重组表达载体共转染所述NK细胞；其中，一种重组表达载体含有感兴趣核酸序列的表达框，在该表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列，且该重组表达载体不含有转座酶的编码序列；另一种重组表达载体含有任选的刹车分子的表达框，在在该表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列，且该重组表达载体含有转座酶的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述两种重组表达载体分别为本文所述的重组表达载体A和B。转染的方法为本文周知的方法，包括但不限于病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转中的一种或多种。转染时，两种重组表达载体的用量可根据实际情况调整，通常不含转座酶编码序列的重组表达载体与含转座酶编码序列的表达载体的用量配比可在1～5：1的范围之内。
因此，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有两种重组表达载体：一种重组表达载体含有感兴趣核酸序列的表达框，在该表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列，且该重组表达载体不含有转座酶的编码序列；另一种重组表达载体含有任选的刹车分子的表达框，在在该表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列，且该重组表达载体含有转座酶的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述两种重组表达载体分别为本文所述的重组表达载体A和B。试剂盒还可含有适用于将所述重组表达载体转染入细胞中的各种试剂，以及任选的指导本领域技术人员将所述重组表达载体转染入细胞的说明书。试剂盒中，两种重组表达载体可独立包装，也可以混合物的形式包装在同一容器中。
因此，在某些实施方案中，本发明也涉及一种重组表达载体的组合物，该组合物至少含有两种重组表达载体：一种重组表达载体含有感兴趣核酸序列的表达框，在该表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列，且该重组表达载体不含有转座酶的编码序列；另一种重组表达载体含有任选的刹车分子的表达框，在在该表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列，且该重组表达载体含有转座酶的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述两种重组表达载体分别为本文所述的重组表达载体A和B。组合物中还可含有相应的溶剂或载体。
本发明克服了目前常用基因转染载体系统对NK细胞转染率低、介导抗体表达水平低的缺陷，使NK细胞高水平稳定地表达来自人Fc段全长的抗体，克服了细胞免疫治疗作用不足与大分子抗体难以进入实体瘤内部的困难。本发明制得的转基因NK细胞在保持细胞杀伤毒性作用的同时又能够高水平、稳定表达包含人Fc段的全长抗体，具有细胞免疫与体液免疫双重功能，其一方面能发挥抗肿瘤细胞免疫(主要由NK细胞介导)，另一方面则发挥体液免疫(主要由抗体介导)，能够有效地抑制肿瘤及病毒的增殖。
此外，为了防止稳定表达抗体的NK细胞在体内不断增殖，导致抗体过量表达，进而造成系统性毒性和自身免疫病，可通过引入分子刹车系统(如CD20-美罗华分子刹车系统(CD20BR))。应用相应的上市单抗药物(如美罗华)，可通过其介导的ADCC效应与CDC效应，能快速清除整合有全长抗体表达框的NK细胞，有效提高了其治疗的安全性。而且，根据所表达的抗体，本发明制得的转基因NK细胞能够用于如前文所述的多种恶性肿瘤与病毒的治疗。
下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：重组质粒pS838-AntiHER2与pNB328-CD20BR的构建
委托上海杰瑞生物公司合成两段DNA序列，序列如下：
Seq1：CGATAGGACGCTGATCTTAAT(SEQ ID NO:1)；
Seq2:TACCTGCGACTAGAAT(SEQ ID NO:2)。
98℃变性5分钟，随后自然降温，形成上下游分别具有ClaI与PacI粘性末端的双链DNA接头。
pNB载体经CalI与PacI双酶切(构建过程参考CN201510638974.7)，装入上述双链DNA，获得pS载体。
按CN201510021408.1所公布的CCEF启动子序列，委托上海杰瑞生物公司合成，并在上下游分别引入XbaI与EcoRI酶切位点，装入经XbaI与EcoRI双酶切的pS载体。获得pS838载体。
按SEQ ID NO:3所示HER2抗体编码序列，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点,装入pS838载体，命名为pS838-AntiHER2。
antiHER2编码序列：
GCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAACGTAAAAGGCGAGCTCCTGTTAAACAGACTTTGAA TTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAA(SEQ IDNO:3)，其中双下划线表示酶切位点，单下划线表示Furin 2A的编码序列。
按SEQ ID NO:4所示CD20BR的编码序列，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点,装入pNB328载体(构建过程参考CN201510638974.7)，命名为pNB328-CD20BR。
CD20BR编码序列：
GCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTAACATATACAACTGTGAACCAGCTAATCCCTCTGAGAAAAACTCCCCATCTACCCAATACTGTTACAGCATACAATCTCTGGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACCGTAAAAGGCGAGCTCCTGTTAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAAGAACACCGGCCTGCAGGAGATCATGAGCTTCAAGGTGAACCTGGAGGGCGTGGTGAACAACCACGTGTTCACCATGGAGGGCTGCGGCAAGGGCAACATCCTGTTCGGCAACCAGCTGGTGCAGATCCGCGTGACCAAGGGCGCCCCCCTGCCCTTCGCCTTCGACATCCTGAGCCCCGCCTTCCAGTACGGCAACCGCACCTTCACCAAGTACCCCGAGGACATCAGCGACTTCTTCATCCAGAGCTTCCCCGCCGGCTTCGTGTACGAGCGCACCCTGCGCTACGAGGACGGCGGCCTGGTGGAGATCCGCAGCGACATCAACCTGATCGAGGAGATGTTCGTGTACCGCGTGGAGTACAAGGGCCGCAACTTCCCCAACGACGGCCCCGTGATGAAGAAGACCATCACCGGCCTGCAGCCCAGCTTCGAGGTGGTGTACATGAACGACGGCGTGCTGGTGGGCCAGGTGATCCTGGTGTACCGCCTGAACAGCGGCAAGTTCTACAGCTGCCACATGCGCACCCTGATGAAGAGCAAGGGCGTGGTGAAGGACTTCCCCGAGTACCACTTCATCCAGCACCGCCTGGAGAAGACCTACGTGGAGGACGGCGGCTTCGTGGAGCAGCACGAGACCGCCATCGCCCAGCTGACCAGCCTGGGCAAGCCCCTGGGCAGCCTGCACGAGTGGGTGTGA SEQ ID NO:4)，其中双下划线表示酶切位点，单划线表示美罗华抗体识别的CD20表位。
pNB328-CD20BR与pS838-antiHER2载体模式图见图1。
实施例2：外周血来源NK细胞的遗传修饰
新鲜分离获得外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，置于含30ng/mL抗CD16抗体，500IU/mL IL-21(购自Novoprotein公司)，3ml NK培养基的培养板中(购自STEMCELL Technologies公司)，37℃、5％CO2孵箱培养。收集5×106NK细胞，通过Lonza 2b-Nucleofector仪器，按1:2的比例将pNB328-CD20BR与pS838-antiHER2共转染到细胞核中。待细胞健康生长后，即获得表达HER2抗体的多能NK细胞，简称PIK-NK。由于只有pNB328载体中含有外源基因整合所需的转座酶，pS838载体中只含转座所需的ITR元件，只有同时转染了pNB328-CD20BR与pS838-antiHER2载体的细胞中才能实现HER2抗体表达框的整合，保证了PIK-NK细胞中均包含CD20分子刹车。
实施例3：PIK-NK细胞中HER2抗体表达量的定量检测
将实施例2制备得到的PIK-NK和对照NK细胞按1:3的稀释比例传代培养，按1.0×106细胞/孔铺在加有NK培液(购自STEMCELL Technologies公司)的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养24小时、48小时、72小时、96小时后收集800μl细胞上清，-20℃保存备用。应用人源的HER2重组蛋白包被酶标板(购自SinoBiological公司)，带HRP标记的鼠抗人IgG mAb(购自Abcam公司)检测，以商品化的HER2抗体(Herceptin，购自Roche公司)作为标准品，用双夹心ELISA方法检测HER2抗体的表达量。
结果发现，2个不同供体来源的PIK-NK细胞均能够高水平稳定的表达HER2抗体，具体如图2所示。
实施例4：PIK-NK细胞中HER2抗体表达量的定性检测
将实施例2制备得到的PIK-NK按1.0×106细胞/孔铺在加有4ml NK培液(购自STEMCELL Technologies公司)的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养48h后收集细胞上清，取120μl的细胞上清，加入30μl的5X SDS-PAGE Loading缓冲液100℃煮沸10min，将样品-20℃保存备用。Western blotting(使用羊抗人IgG(H+L)作为一抗，HRP-兔抗羊为二抗，一抗和二抗都购买于Jackson ImmunoResearch公司)实验检测抗HER2抗体的表达。结果发现，PIK-NK细胞表达的抗HER2抗体包含正确的重链(50kD)和轻链(25kD)，具体如图3所示。
实施例5：PIK-NK细胞基因组中HER2抗体表达框的检测
提取实施例2制备得到的PIK-NK细胞和对照NK细胞的基因组DNA，实验步骤参照试剂盒内附带的说明书，测定PIK-NK细胞和对照NK细胞DNA的浓度，采用荧光实时定量PCR检测抗PD1抗体基因组的表达水平(引物如SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6所示)，反应程序为:95℃，15s→95℃，5s→60℃，15s，40个循环。结果发现，HER2抗体表达框被整合到NK细胞基因组中，具体如图4所示。
F:GGCTGTCCTACAGTCCTCAG(SEQ ID NO:5)；
R:TTGTCCACCTTGGTGTTGCT(SEQ ID NO:6)。
实施例6：PIK-NK细胞表面抗体分子的流式检测
收集悬浮的实施例2制备得到的PIK-NK细胞和对照NK细胞，计数后以1×106个细胞/管分别加入2个1.5ml的EP管中，PBS清洗两遍，1200rpm离心5min,弃上清；分别加入2μl抗人IgG Fab2’抗体(购自Jackson ImmunoResearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀，室温避光孵育30min，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水将细胞转移至流式管中，上机检测。实验结果发现，相对于对照细胞，PIK-NK细胞表面具有HER2抗体分子，具体如图5所示。
实施例7：PIK-NK细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤实验
选取HER2阳性的肿瘤细胞株SK-OV3、BGC27、MCF7以及HER2阴性的肿瘤细胞株A549(均购自美国典型物保藏中心，ATCC)，应用LDH乳酸脱氢酶-细胞毒性检测分析试剂盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit，Biovision)检测不转基因前后的NK细胞对不同类型肿瘤细胞的体外杀伤能力。效靶比分别设置为8:1、4:1、2:1，以未转染质粒的NK细胞作为对照(效靶比8:1)，观察细胞增殖曲线。结果发现，相对于对照细胞，表达HER2抗体的实施例2制备得到的PIK-NK细胞对HER2阳性的肿瘤细胞杀伤作用显著增强，而对HER2阴性的肿瘤细胞的杀伤作用无明显差异。具体如图6所示。
实施例8:PIK-NK细胞用于治疗移植瘤的体内实验。
在NOD-SCID小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)中皮下注射5×106的SK-OV3恶性卵巢癌细胞，10天后经尾静脉分别注射PIK-NK来细胞(实施例2制备)、对照NK细胞(注射剂量1×107)或PBS缓冲液，测定移植瘤的生长状况。结果表明，相对于对照组，PIK-NK细胞对肺癌的抑制作用具有显著差异(图7)。
实施例9：PIK-NK细胞的体外清除试验(分子刹车功能的验证)
将实施例2制备得到的PIK-NK及NK细胞按1.0×105细胞/孔铺在加有4ml NK培液(购自STEMCELL Technologies公司)的12孔板中，分别加入50μg/ml的美罗华抗体或人IgG抗体，应用LDH乳酸脱氢酶-细胞毒性检测分析试剂盒(LDH-Cytotoxicity Assay Kit，Biovi sion)检测加入抗体后，PIK-NK细胞的裂解率。结果发现，相对于对照人IgG抗体，加入美罗华抗体后，PIK-NK细胞能被快速裂解；而NK细胞对美罗华抗体与对照人IgG抗体均无明显反应。结果表明，因NK细胞能高效介导ADCC效应，加入美罗华抗体后，能结合到PIK-NK细胞表面的CD20表位上，启动细胞间的相互杀伤，导致PIK-NK细胞被清除，说明CD20-美罗华分子刹车系统能有效清除PIK-NK细胞，具有良好的安全性。具体如图8所示。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (11)

1.一种转基因NK细胞，其特征在于，所述NK细胞的基因组中稳定整合了包含人Fc段的抗体的编码序列的表达框，且表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列。
2.如权利要求1所述的转基因NK细胞，其特征在于，每百万个所述NK细胞在48小时内表达的抗体量高于2μg。
3.如权利要求1所述的转基因NK细胞，其特征在于，所述转座子选自：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty；优选地，所述转座子为piggybac。
4.如权利要求1所述的转基因NK细胞，其特征在于，所述NK细胞选自：原代NK细胞、NK细胞株和NKT细胞；优选地，所述NK细胞为原代NK细胞。
5.如权利要求1所述的转基因NK细胞，其特征在于，所述NK细胞还包含刹车分子，该刹车分子为可被已上市抗体药物识别的膜抗原；优选地，所述膜抗原选自CD11a、CD15、CD19、CD20、CD25、CD44、CD47、CD52、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、MSLN、GPIIb/IIIa、α4整合素和α4β7整合素；优选地，所述膜抗原为CD20。
6.如权利要求1所述转基因NK细胞，其特征在于，所述抗体为抗肿瘤或抗病毒的抗体，优选自：免疫检查点抗体、T细胞共刺激信号抗体、抗新生血管生成的抗体、抗肿瘤细胞生长因子受体的抗体、抗肿瘤细胞膜抗原的抗体和抗病毒抗体。
7.如权利要求1所述的转基因NK细胞，其特征在于，所述抗体针对如下抗原中的一种或多种：EGFR、EGFRvIII、ERBB2、ERBB3、ERBB4、MUC1(粘蛋白1，细胞表面相关的)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转换酶1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、CA125(又称MUC16，粘蛋白16，细胞表面相关)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、β2-MG(β-2-微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)、GD2(又称B4GALNT1，β1,4-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、gp100(PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称melan-A)、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(α-胎蛋白)、CEA、PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD28、CD137、CD40、CD40L、CD47、乙肝病毒和艾滋病毒；优选地，所述抗体为HER2抗体。
8.如权利要求1-8中任一项所述的转基因NK细胞，其特征在于，所述转基因NK细胞转入了以下核酸构建物A和B：
核酸构建物A：含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、包含人Fc段的抗体的编码序列及控制该核酸序列表达的启动子、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)；
核酸构建物B：含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、编码刹车分子的核酸序列及控制该核酸序列表达的启动子、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列和任选的控制转座酶编码序列表达的启动子；
任选地，采用病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转中的一种或多种方法将所述核酸构建物转入所述细胞中，优选地采用电转。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1-8中任一项所述的转基因NK细胞和药学上可接受的辅料。
10.权利要求1-8中任一项所述的转基因NK细胞或权利要求9所述的药物组合物的用途，其特征在于，所述用途选自：
制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物、制备用于抑制病毒生长的药物、制备用于治疗肿瘤的药物、制备用于治疗病毒感染性疾病的药物、制备用于治疗细菌感染性疾病的药物和制备用于治疗自身免疫疾病的药物；
优选地，所述肿瘤选自：肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。
11.选自以下的核酸构建物或其混合物：
核酸构建物A：含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、包含人Fc段的抗体的编码序列及控制该核酸序列表达的启动子、polyA加尾信号序列和转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)；和
核酸构建物B：含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、编码刹车分子的核酸序列及控制该核酸序列表达的启动子、polyA加尾信号序列、转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)、转座酶编码序列和任选的控制转座酶编码序列表达的启动子。
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