CN107523547A - 一种高效稳定表达抑制性抗体的car‑t细胞及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高效稳定表达抑制性抗体的CAR‑T细胞及其用途。具体而言，本发明提供一种转基因T细胞，所述T细胞基因组中稳定整合了含编码嵌合抗原受体与免疫检查点抑制性抗体核酸序列的表达框，且表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列。本发明的多能CAR‑T细胞基因组中通过转座子系统稳定整合了抑制抗体的表达框，从而在保持其原有T细胞杀伤活性的前提下具备稳定高效表达抑制性抗体的活性，使回输的CAR‑T细胞避免被肿瘤微环境抑制，且能原位激活残留的肿瘤特异性T细胞。同时，为保证该多能CAR‑T细胞治疗的安全性，本发明引入分子刹车系统，必要情况下可将回输的多能CAR‑T细胞及时清除。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学和肿瘤学领域，涉及一种能高水平稳定表达抑制性抗体的CAR-T(Chimeric antigen receptor，CAR)细胞。
背景技术
针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得令人瞩目的临床疗效。其中，免疫检查点(如CTLA4、PD1/PDL1)单抗治疗，通过原位激活患者残留的肿瘤特异性T细胞发挥作用，对多种恶性肿瘤的总体有效率达到30％，且许多患者一旦起效能长期存活；转基因CAR-T/TCR-T细胞治疗，是通过离体基因修饰的手段快速获得肿瘤特异性T细胞后，过继回输进行治疗发挥作用，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)一般由一个scFv(single-chain variable Fragment)单链抗体(抗体轻重链可变区经Linker连接构成，负责结合膜抗原)，通过铰链结构(负责形成正确构象，形成二聚体)与跨膜区、胞内信号结构(负责传递T细胞活化信号)连接构成。经CAR基因修饰的T细胞(CAR-T)被赋予识别肿瘤细胞膜抗原肽分子，启动杀伤或增殖的能力。由于CAR-T细胞识别的是表达在细胞膜上的抗原，而非与MHC分子结合后被递呈到细胞表面的抗原，因而可以绕过T细胞MHC限制性，避免由于肿瘤细胞下调或缺失MHC分子引起的免疫逃逸。
CAR的设计最早由以色列学者Eshhar和其同事于1989年提出，按其发展阶段到目前为止可分为三代。第一代CAR受体包含了胞外特异识别肿瘤抗原的svFC片段，胞内激活信号由CD3ζ或FcεRIγ的ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少等缺点。第二代CAR受体增加了共刺激信号分子的胞内结构域，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specific protein tyrosinekinase(LCK)，inducible T-cell co-stimulator(ICOS)以及DNAX-activation protein10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(activation induced celldeath,AICD)。第三代CAR受体则是在第二代CAR的基础上再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，从而产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。近年来，有部分学者提出第四代CAR受体概念，他们在第三代CAR的基础上增加了IL12、IL15等具有正向调节T细胞功能的细胞因子，进一步提高T细胞的增殖、杀伤、体内存活能力。
目前，已有多个靶标的CAR-T细胞正在开展实体瘤治疗的临床试验，包括GD2、FR-α、L1-CAM、HER2、EGFR、EGFRvIII、VEGFR-2、IL-13Rα2、FAP、Mesothelin、c-MET、PSMA、CEA、GPC3、EphA2、MUC1、CAIX(carbonic anhydrase IX)等。其中，部分临床试验取得相对良好的结果，例如，针对GD2的CAR-T细胞治疗高风险性神经母细胞瘤的临床试验(19例患者)，8例患者回输后肿瘤完全消退，3例未消退的患者在回输后第6周的观察时间点显示完全应答，1名完全应答患者192周仍能检测到CAR-T细胞；针对HER2的CAR-T细胞治疗HER2阳性实体瘤临床试验(共19例，其中骨肉瘤16例)，4例维持无疾病进展状态12周至14月，其中3例肿瘤消退，1例消退90％以上。然而总体而言，实体瘤的CAR-T治疗相对于血液肿瘤，疗效仍存在较大差距，究其原因，主要包括：
1、抑制免疫的微环境
实体瘤组织存在免疫抑制的微环境，包括Treg细胞、肿瘤相关成纤维细胞、骨髓来源未成熟DC细胞、M2型巨噬细胞等及其它们分泌的细胞因子，如IL-6、IL-10、IDO、VEGF、TGFβ等，这些细胞及其它们分泌的细胞因子可以通过直接或间接的方式抑制T细胞的功能。通过放化疗破坏肿瘤微环境，免疫检查点抗体(如PD1/PDL1)或免疫负调节因子(如IDO小分子抑制剂)特异阻断相关信号通路，表观遗传修饰相关酶类的抑制剂整体调整免疫微环境，过表达免疫正调节因子(如IL-12)，直接靶向清除肿瘤基质细胞(如靶向FAP阳性肿瘤相关成纤维细胞的CAR-T)等策略，均可以作用于实体瘤免疫抑制的微环境，提高浸润的CAR-T细胞的存活能力与杀伤效果。
2、缺乏合适的CAR-T治疗靶点
实体瘤具有高度的异质性，不同患者、同一患者不同病灶、同一病灶不同肿瘤细胞之间均存在高度的差异。这种高度的异质性致使肿瘤靶向治疗陷入缺乏理想的通用、广谱靶点的不利境地，限制了CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效。因而，为扩大CAR-T细胞的杀伤范围，有学者提出TanCAR的设计理念，将两种结合不同肿瘤相关抗原的scFv串联在一起，构成一个新的能同时识别并结合两个靶点的CAR，有效提高了CAR-T细胞的疗效。
因而，如能在CAR-T，尤其是能广谱识别肿瘤膜抗原的CAR-T基础上，表达具有打破肿瘤微环境抑制作用的抗体，则能有效克服实体瘤CAR-T治疗的难题，大幅提高疗效。
尽管已经有将外源基因转导入例如T细胞的报导，但目前常用基因转染载体系统对具有细胞杀伤毒性的效应免疫细胞转染率低，或者难以使外源基因在其细胞内高水平地表达。利用腺病毒载体(非整合型)可以介导外源基因在T细胞内较高效的短时表达，但活化的T细胞增殖速度非常快，携带的外源基因表达框在细胞传代中将快速丢失，表达难以持久；利用逆转录病毒或慢病毒可以介导外源基因在T细胞基因组中的整合，理论上可实现稳定表达，但抗体包含轻链与重链，编码序列长、分子量大，导致携带全长抗体表达框的逆转录病毒或慢病毒包装与制备存在较大困难、难以高效表达抗体(例如，利用CAR-T细胞表达抗体，浓度仅200ng/ml，Oncotarget.2016Apr 29.doi:10.18632/oncotarget.9114)，一般用于表达结构简单的单链抗体(缺乏恒定区片段，功能不全且半衰期短)。因而在此之前，尚无具有细胞杀伤毒性并且能稳定、高水平地表达含有人恒定区的抗体的转基因细胞的报道。
发明内容
本发明第一方面提供一种转基因T细胞，所述T细胞基因组中稳定整合了含编码嵌合抗原受体与抑制性抗体的核酸序列的表达框，且表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列。
在一个或多个实施方案中，所述抑制性抗体是免疫检查点抑制性抗体。
在一个或多个实施方案中，所述抑制性抗体选自：抗体全长序列或其功能性片段。
在一个或多个实施方案中，所述抑制性抗体选自：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv和scFv-Fc。
在一个或多个实施方案中，每百万个所述T细胞在48小时内表达的抑制性抗体量高于2μg。
在一个或多个实施方案中，所述转座子选自：piggybac、sleeping beauty、frogprince、Tn5和Ty；优选地，所述转座子为piggybac。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体针对如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1，β1,4-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称粘蛋白-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(α-胎蛋白)、MUC1(mucin 1，细胞表面相关)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转换酶1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16，mucin 16，细胞表面相关)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、β2-MG(β-2-微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)；优选地，所述嵌合抗原受体为针对EGFR家族的嵌合抗原受体。
在一个或多个实施方案中，所述转基因T细胞还包含刹车分子。
在一个或多个实施方案中，所述刹车分子为可被已上市抗体药物识别的膜抗原；优选地，所述膜抗原选自CD11a、CD15、CD19、CD20、CD25、CD44、CD47、CD52、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、MSLN、GPIIb/IIIa、α4整合素和α4β7整合素；优选地，所述膜抗原为CD20。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抑制性抗体针对如下抗原中的一种或多种：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-H1、B7-1、VSIR和CD244；优选地，所述抗体为抗PD-1抗体的scFv。
在一个或多个实施方案中，所述转基因杀伤性细胞转入了以下核酸构建物C：
核酸构建物C：含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)，编码任选的刹车分子、嵌合抗原受体(CAR)和抑制性抗体的核酸序列及控制该核酸序列表达的启动子，polyA加尾信号序列，转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)，转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子；
任选地，采用病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转中的一种或多种方法将所述核酸构建物转入所述细胞中，优选地采用电转。
本发明第二方面提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的转基因T细胞和药学上可接受的辅料。
本发明第三方面提供本文所述的转基因T细胞或药物组合物的用途，所述用途选自：
制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物、制备用于抑制病毒生长的药物、制备用于治疗肿瘤的药物、制备用于治疗病毒感染性疾病的药物、制备用于治疗细菌感染性疾病的药物和制备用于治疗自身免疫疾病的药物。
在一个或多个实施方案中，所述肿瘤选自：肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。
本发明第四方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)，编码任选的刹车分子、嵌合抗原受体(CAR)和免疫检查点抑制性抗体的核酸序列及控制该核酸序列表达的启动子，polyA加尾信号序列，转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)，转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子。
在一个或多个实施方案中，所述抑制性抗体选自：抗体全长序列或其功能性片段。
在一个或多个实施方案中，所述抑制性抗体选自：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv和scFv-Fc。
在一个或多个实施方案中，所述转座酶为来自piggybac转座系统的转座酶，所述5’反向末端重复序列(5’ITR)和3’反向末端重复序列是piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。
在一个或多个实施方案中，所述刹车分子是CD20。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合受体抗原是针对EGFR家族的嵌合抗原受体。
在一个或多个实施方案中，所述免疫检查点抑制性抗体针对如下抗原中的一种或多种：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-H1、B7-1、VSIR和CD244；优选地，所述抗体为抗PD-1抗体的scFv-Fc。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物含有SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
附图说明
图1：抗体的表达框模式图。ITR为转座子末端重复序列，HyPB是piggybac转座酶。
图2：herinCAR-PD1细胞表达PD1抗体水平的ELISA检测图。对照为同一来源herinCAR细胞。
图3：herinCAR-PD1细胞表达PD1抗体的蛋白质印迹检测图。
图4：herinCAR-PD1细胞的体外增殖检测。
图5A-5C：herinCAR-PD1细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤活性检测。
图6：herinCAR-PD1细胞对移植瘤的体内抑制作用检测。Control，PBS治疗组；Mock-T，未转基因的T细胞。
图7：herinCAR-PD1细胞在移植瘤内的增殖检测。Mock-T为未转基因的T细胞。
图8：herinCAR-PD1细胞分子刹车系统的功能检测。
具体实施方式
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列、PolyA加尾信号序列。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如刹车分子，CAR，单链抗体，IgG4铰链和IgG4Fc)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“抑制性抗体”指存在时可抑制某一特定免疫反应的抗体。所述抑制性抗体选自：抗体全长序列或其功能性片段。在一个或多个实施方案中，所述抑制性抗体选自：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv和scFv-Fc。在某些实施方案中，本文所述的抑制性抗体是scFv-Fc。
术语“抗原结合片段”(antigen-binding fragment,Fab)是指位于抗体分子"Y"结构两臂末端，由高变区氨基酸序列组成，决定抗体结合抗原的特异性的肽段。
术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable,Fc)，是指位于抗体分子"Y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段，是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。
术语“抗原表位”，又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。一般情况下，一个多肽表位含5～6个氨基酸残基抗原表位，可被特定的抗体所识别。抗原表位的性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。而根据抗原表位的氨基酸连续性的不同，可以分为线性表位与空间表位，线性表位是一段序列相邻的氨基酸组成的表位，而空间表位是数个不相邻，但在空间结构上相邻的氨基酸组成的表位。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及例如Furin 2A肽。
术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
本文提供一类核酸构建物(本文也称为“核酸构建物C”)，该类核酸构建物含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)，编码任选的刹车分子、嵌合抗原受体(CAR)和抑制性抗体(如感兴趣的单链抗体)的核酸序列及控制该核酸序列表达的启动子，polyA加尾信号序列，转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)，转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子。
“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。
适用于本文的嵌合抗原受体可以是本领域周知的各种CAR。通常，CAR依次包含信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽、铰链区、跨膜区和胞内信号区。可采用本领域周知的用于构建CAR的信号肽、铰链区、跨膜区和胞内信号区来构建本发明的CAR。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达膜抗原，该多肽通常插入有抗原表位，插入的位置选自如下3个位置中的任意1个、2个或3个：信号肽与结合肿瘤细胞膜抗原的多肽之间，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽内部，以及结合肿瘤细胞膜抗原的多肽和铰链区之间。所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽为天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体针对如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1，β1,4-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称粘蛋白-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(α-胎蛋白)、MUC1(mucin 1，细胞表面相关)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转换酶1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16，mucin 16，细胞表面相关)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、β2-MG(β-2-微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)。优选地，所述CAR为针对EGFR家族的嵌合抗原受体。
在某些实施方案中，本文使用来自CN 201510812654.9的herinCAR(本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文)。
在某些实施方案中，所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽为天然多肽，是人类Her2基因第8个内含子Herin编码的氨基酸序列HERIN；优选地，其氨基酸序列如CN201510812654.9的SEQ ID NO:5所示。
在某些实施方案中，本发明CAR信号肽的氨基酸序列如CN 201510812654.9的SEQID NO:3所示。
在某些实施方案中，本发明CAR的铰链区选自CD8的胞外铰链区、CD28的胞外铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种；优选地为CD8的胞外铰链区。在某些实施方案中，所述CD8的胞外铰链区如CN 201510812654.9的SEQ ID NO:7所示。
在某些实施方案中，本发明CAR的跨膜区选自CD8的跨膜区、CD28的跨膜区和CD4的跨膜区的任意一种或多种；优选地，为CD8跨膜区；优选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如CN 201510812654.9的SEQ ID NO:8所示。
在某些实施方案中，本发明CAR的胞内信号区可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、LCK、ICOS、DAP10、CD3ζ和FcεRIγ中的任意一种或多种的胞内信号区，优选为4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区，或者CD28胞内信号区和CD3ζ胞内信号区；优选地，所述4-1BB胞内信号区和CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如CN 201510812654.9的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；优选地，所述CD28胞内信号区和CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列分别如CN 201510812654.9的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:10所示。
在某些实施方案中，所述抗原表位与结合肿瘤细胞膜抗原的多肽直接相连或者通过蛋白接头相连。通常，所述接头为至少2个甘氨酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个甘氨酸。
在某些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体由信号肽、CD20抗原表位、人类Her2基因第8个内含子Herin编码的氨基酸序列HERIN、CD20抗原表位、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激肽段依次构成。优选地，其氨基酸序列如CN 201510812654.9的SEQ ID NO:1所示。
本文中，感兴趣的“单链抗体”(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。应理解的是，本文的核酸构建物可编码两种单链抗体，一种单链抗体存在于所示的CAR之中，另一种单链抗体为与CAR相连的单链抗体。这两种单链抗体可相同，也可不同，优选的是，两种单链抗体执行不同的抗体功能。
感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。感兴趣的抗体可选自：免疫检查点抗体、T细胞共刺激信号抗体、抗新生血管生成的抗体、抗肿瘤细胞生长因子受体的抗体以及抗肿瘤细胞膜抗原的抗体。在某些实施方案中，感兴趣的抗体可以是针对如下抗原中的一种或多种的抗体：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD28、CD137、CD40、CD40L、CD47、CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1，β1,4-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、gp100(PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称melan-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(α-胎蛋白)、MUC1(mucin 1，细胞表面相关)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转换酶1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16，mucin 16，细胞表面相关)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、β2-MG(β-2-微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)、乙肝病毒和爱滋病毒。
在某些实施方案中，抗体为分泌型抗体。在其它实施方案中，抗体为膜锚定型抗体。
在某些实施方案中，所述抗体为免疫检查点抑制抗体。在某些实施方案中，所述抗体针对如下抗原中的一种或多种：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-H1、B7-1、VSIR和CD244。在一个或多个实施方案中，所述抗体为抗PD-1抗体的scFv-Fc。
本文中，“PD1”是指程序性死亡受体1，它在NCBI GeneBank的官方名称为PDCD1，ID号为5133，其cDNA序列/蛋白序列为NM_005018.2/NP_005009.2。
单链抗体可含有各感兴趣抗体各自的重链可变区和轻链可变区，或由重链可变区和轻链可变区以及任选的接头组成。重链可变区和轻链可变区之间可通过熟知的接头连接，例如含G和/或S的接头。接头长度通常为15～20个氨基酸。在某些实施方案中，接头为(GGGS)n，n为1－5的整数。
在某些实施方案中，本发明核酸构建物C中，编码抑制性抗体(如感兴趣单链抗体)的核酸序列之后还可包括来自免疫球蛋白的铰链区和Fc区的编码序列。可使用本领域周知的各种类型的免疫球蛋白，但在某些优选实施方案中，该免疫球蛋白是人IgG4。在某些实施方案中，所述抗体是衍生自抗PD-1抗体的scFv-Fc。
本文所用“刹车分子”和“分子刹车”可互换使用，指可被已上市抗体药物识别的膜抗原。通过加入识别该“刹车分子”的抗体药物，携带该“刹车分子”的细胞能被快速清除，从而提高治疗安全性。合适的刹车分子(膜抗原)可选自：CD11a、CD15、CD19、CD20、CD25、CD44、CD47、CD52、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、MSLN(间皮素)、GPIIb/IIIa、α4整合素和α4β7整合素。在某些实施方案中，膜抗原为CD20。在某些实施方案中，可使用所述膜抗原的线性表位或空间表位。
当存在刹车分子时，刹车分子可通过本领域常用的接头序列(如前文所述的含G和S的接头序列)与CAR连接，或者可直接与CAR连接。CAR与抑制性抗体(如单链抗体)可直接相连，也可通过接头序列(例如Furin 2A肽)进行连接。
“CD20”是指人白细胞分化抗原20，它在NCBI GeneBank的官方名称为MS4A1，ID号为931，有2个异构体(cDNA序列/蛋白序列)，分别为NM_021950.3/NP_068769.2,NM_152866.2/NP_690605.1。当提及CD20的氨基酸序列时，其包括，CD20蛋白的全长或者具有CD20功能的CD20的片段；还包括所述全长或片段的融合蛋白。并且，本领域技术人员理解，在CD20的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。并且，当描述CD20的蛋白序列片段时，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
可根据所选的CAR的编码序列选择相应的启动子序列。这类启动子的例子包括但不限于EF1α启动子。如CN201510021408.1所述(本文将其全部内容以引用的方式纳入本文)，启动子上游还可包括增强子，如mCMV增强子、hCMV增强子和CD3e增强子中的一个、任意两个或全部三个。
因此，在某些实施方案中，本文使用CN201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请SEQ ID NO:1所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的CCEF启动子；SEQ ID NO:2所示的含CD3e增强子和EF1α启动子的TEF启动子；SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的TCEF启动子；SEQ ID NO:4所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子；SEQ ID NO:5所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及SEQ ID NO:5所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的TCEFI启动子。
本文中，转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，本发明核酸构建物中的5’ITR和3’ITR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。
在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。
转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7SEQ ID NO:6所示。
可使用本领域周知的polyA加尾信号序列。在某些实施方案中，所述polyA来自SV40。在某些实施方式中，可使用CN 201510638974.7SEQ ID NO:3所示的序列。
可针对所选膜抗原选择合适的启动子，用以控制膜抗原的表达。在某些实施方案中，启动子是EF1α启动子。在某些实施方案中，EF1α启动子的序列如CN 201510638974.7SEQID NO:8所示。
在某些实施方案中，本文的核酸构建物C含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)，控制编码刹车分子、嵌合抗原受体(CAR)和抑制性抗体(如感兴趣单链抗体)的核酸序列表达的启动子，编码刹车分子、嵌合抗原受体(CAR)和抑制性抗体(如感兴趣单链抗体)的核酸序列，polyA加尾信号序列，转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)，转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子。
在某些实施方案中，本文的核酸构建物C含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)，EF1α启动子，刹车分子(CD20)的编码序列，CAR的编码序列，抗PD1单链抗体的编码序列，免疫球蛋白铰链区和Fc的编码序列，polyA加尾信号序列，转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)，转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子(CMV)。
在某些实施方案中，本文的核酸构建物C含有依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)，EF1α启动子，刹车分子(CD20)的编码序列，CAR的编码序列，抗PD1单链抗体的编码序列，IgG4铰链区的编码序列，IgG4Fc的编码序列，polyA加尾信号序列，转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)，转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子(CMV)。
在某些实施方案中，所述核酸构建物C含有SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
本文的核酸构建物C可以是种重组表达载体(重组表达载体C)，用于表达所述CAR、scFV和所述任选的刹车分子。优选的是，表达载体是转座子载体。在某些实施方案中，载体为选自如下转座子载体中的一种或多种：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty。除核酸构建物C所含的核酸序列外，表达载体中通常还含有载体通常所含的其它元件，例如多克隆位点、抗性基因、复制起始位点等。
在某些实施方案中，所述重组表达载体采用pUC18、pUC19、pMD18-T、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、pMAX或pDC315系列载体作为骨架。在其它实施方案中，所述重组表达载体采用pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX载体或pDC315系列载体作为骨架。在某些实施方案中，本发明使用CN201510638974.7构建的pSN载体，其载体结构如该申请图1所示。
可将本发明的核酸构建物C/重组表达载体C转入感兴趣的细胞中。转入的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述核酸构建物或重组表达载体。
感兴趣的细胞可以是本领域周知的各种T细胞，包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。在某些实施方案中，所述T细胞为外周血T淋巴细胞与源自TIL的T细胞。
当将核酸构建物C/重组表达载体C转染感兴趣的T细胞时，由于其含有转座所需的ITR元件和转座酶，因此该核酸构建物或重组表达载体所含的转座子5’反向末端重复序列和转座子3’反向末端重复序列之间的核酸序列(包括5’和3’反向末端重复序列本身)被整合到感兴趣细胞的基因组中。当核酸构建物C/重组表达载体C含有编码刹车分子的核酸序列时，细胞将进一步表达刹车分子。
因此，本文还提供一类转基因T细胞，所述T细胞的基因组中稳定整合了包含编码CAR及抑制性抗体(如感兴趣单链抗体)的核酸序列的表达框。更进一步地，所述T细胞的基因组中稳定整合了依次连接的转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)，控制编码刹车分子、嵌合抗原受体(CAR)和抑制性抗体(如感兴趣单链抗体)的核酸序列表达的启动子，编码刹车分子、嵌合抗原受体(CAR)和抑制性抗体(如感兴趣单链抗体)的核酸序列，polyA加尾信号序列，以及转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)。
在某些实施方案中，本文所述T细胞表达抑制性抗体。所述抗体可以为分泌型抗体或膜锚定型，优选为分泌型抗体。该抗体可以是作用于T细胞自身的免疫检查点抑制抗体。该抗体在T细胞中表达后，保护该细胞自身不受肿瘤微环境的抑制，且能激活残留的肿瘤特异性T细胞。
在某些实施方案中，本文的T细胞稳定表达感兴趣的CAR及感兴趣的抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中，本文的T细胞转入了本文所述的核酸构建物C/重组表达载体C。在其它实施方案中，本文的T细胞细胞表达抗体(如本文所述的抑制性抗体)的浓度大于1μg/ml(1百万细胞)。
根据所表达的抗体的生物学功能，本文的转基因T细胞可具有不同的生物学活性，包括但不限于抑制肿瘤、抑制病毒、抑制细菌等。因此，本文的CAR-T细胞可用于抑制肿瘤细胞的生长、抑制病毒的生长、治疗肿瘤、治疗病毒感染性疾病、治疗细菌感染性疾病、以及治疗自身免疫疾病。肿瘤包括但不限于肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、头颈部肿瘤。
因此，本文也提供一种药物组合物，该药物组合物含有本文所述的转基因T细胞和药学上可接受的载体或赋形剂。本文还提供本文所述的转基因T细胞在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物、制备用于抑制病毒生长的药物、制备用于治疗肿瘤的药物、制备用于治疗病毒感染性疾病的药物、制备用于治疗细菌感染性疾病的药物、或制备用于治疗自身免疫疾病的药物中的用途。
在本文的一个或多个实施方案中，所述转基因T细胞是CAR-T细胞。
因此，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的重组表达载体。试剂盒还可含有适用于将所述重组表达载体转染入细胞中的各种试剂，以及任选的指导本领域技术人员将所述重组表达载体转染入细胞的说明书。
因此，在某些实施方案中，本发明也涉及一种重组表达载体的组合物，该组合物本文所述的重组表达载体。组合物中还可含有相应的溶剂或载体。
本发明的CAR-T细胞基因组中通过转座子系统稳定整合了抑制抗体(尤其是免疫检查点抑制抗体)表达框，从而在保持其原有CAR-T细胞杀伤活性的前提下，具备稳定高效表达抑制性抗体的活性，使回输的CAR-T细胞避免被肿瘤微环境抑制，且能原位激活残留的肿瘤特异性T细胞。同时，为保证该多能CAR-T细胞治疗的安全性，可引入分子刹车系统，必要情况下可将回输的多能CAR-T细胞及时清除。
下面将结合实施案例对本发明所涉及的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施案例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施案例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：重组质粒pNB328-herinCAR-PD1的构建
按SEQ ID NO:1所示含CD20-美罗华分子刹车的herinCAR编码序列(靶向EGFR家族的CAR，参见CN 201510812654.9)与SEQ ID NO:2所示herinCAR-PD1编码序列(靶向EGFR家族且包含CD20-美罗华分子刹车的CAR与PD1单链-Fc抗体，中间用2A相连)，委托上海杰瑞生物公司合成，并在其上下游分别引入EcoRI与SalI酶切位点,装入pNB328载体，分别命名为pNB328-herinCAR、pNB328-herinCAR-PD1。
含CD20-美罗华分子刹车的herinCAR编码序列：
GCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAGTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:1)其中双下划线表示酶切位点，波浪下划线的为美罗华抗体识别的CD20表位编码序列。
herinCAR-PD1编码序列：
GCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT GGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGAGGTGGTACCCACTCACTGCCCCCGAGGCCAGCTGCAGTTCCTGTCCCTCTGCGCATGCAGCCTGGCCCAGCCCACCCTGTCCTATCCTTCCTCAGACCCTCTTGGGACCTAGTCTCTGCCTTCTACTCTCTACCCCTGGCCCCCCTCAGCCCTACAAGTGTCCCTATATCCCCTGTCAGTGTGGGGAGGGGCCCGGACCCTGATGCTCATGTGGCTGTTGACCTGTCCCGGTATGAAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAGTTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCCGTAAAAGGCGAGCTCCTGTTAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGG GAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGTGGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCCTCCGTCAAGGTGTCCTGTAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCAACTACTACATGTACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGGCATCAACCCTTCCAACGGCGGCACCAACTTCAACGAGAAGTTCAAGAACCGGGTGACCCTGACCACCGACTCCTCCACCACAACCGCCTACATGGAACTGAAGTCCCTGCAGTTCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGCGGGACTACCGGTTCGACATGGGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGGTCGGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGCAAAGGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATTTGCACTGGTATCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATCTTGCATCCTACCTAGAATCTGGCGTCCCAGCCAGGTTCAGTGGTAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCACAGCAGGGACCTTCCGCTCACGTTCGGCGGAGGGACCAAAGTGGAGATCAAA TGATAA(SEQ ID NO:2)，其中双下划线表示酶切位点，单下划线表示Furin 2A的编码序列，波浪下划线的为美罗华抗体识别的CD20表位编码序列，虚线下划线的IgG4铰链(hinge)的编码序列，双波浪下划线的IgG4Fc的编码序列。
pNB328-herinCAR-PD1载体的模式图见图1。
实施例2：herinCAR-PD1细胞的构建
准备1×107新鲜分离获得的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcell,PBMC)，通过Lonza 2b-Nucleofector仪器，将6μg的pNB328-herinCAR-PD1质粒转染到细胞核中，置37℃、5％CO2孵箱培养；6小时后转移到含30ng/mL抗CD3抗体、3000IU/mL IL-2(购自Novoprotein公司)的6孔板中，置37℃、5％CO2孵箱培养。待细胞长满后，按1:5的比例传代培养。即得同时表达靶向EGFR家族的且含CD20-美罗华分子刹车CAR、PD1单链-Fc抗体的基因修饰T细胞，简称herinCAR-PD1细胞。同时，相同来源PBMC转染pNB328-herinCAR质粒，获得herinCAR-T细胞。
实施例3：herinCAR-PD1细胞中PD1抗体表达量的定量检测
将实施例2制备得到的herinCAR-PD1和herinCAR细胞按1:3的稀释比例传代培养，两周后，按1.0×106细胞/孔铺在加有4ml AIM-V培液(购自Gibco公司)的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养24小时、48小时、72小时、96小时后收集800μl细胞上清，-20℃保存备用。应用人源的PD1重组蛋白包被酶标板(购自SinoBiological公司)，带HRP标记的鼠抗人IgG mAb(购自Abcam公司)检测，以商品化的抗PD1抗体(购自Merck公司)作为标准品，用双夹心ELISA方法检测PD1抗体的表达量。
结果发现，herinCAR-PD1细胞均能够高水平稳定的表达PD1抗体，具体如图2所示。
实施例4：herinCAR-PD1细胞中PD1抗体表达量的定性检测
将实施例2制备得到的herinCAR-PD1按1.0×106细胞/孔铺在加有4ml AIM-V培液的6孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱培养，并于培养48h、72h、96h后收集细胞上清，每个时间点各取120ul的细胞上清，加入30ul的5X SDS-PAGE Loading buffer 100℃煮沸10min,将样品-20℃保存备用。蛋白质印迹(使用羊抗人IgG(H+L)作为一抗，HRP-兔抗羊为二抗，一抗和二抗都购买于Jackson ImmunoResearch公司)实验检测抗PD1抗体的表达。结果发现，herinCAR-PD1细胞表达的抗PD1抗体包含正确的scFv-Fc抗体(52kD)，具体如图3所示。
实施例5：herinCAR-PD1细胞的增殖检测
将实施例2制备得到的herinCAR-PD1细胞和herinCAR细胞按4×104/孔铺在96孔板中，每种细胞铺3个复孔，总体积为200μl，置于37℃，5％CO2培养箱培养，分别在培养24h，48h，72h，96h后加入20μl的CCK8试剂，37℃避光孵育6h，酶标仪上450nm测OD值。结果发现，herinCAR-PD1细胞的增殖速度明显高于对照herinCAR细胞，说明herinCAR-PD1细胞分泌的抗体能够促进T细胞的增殖，具体如图4所示。
实施例6：herinCAR-PD1细胞的体外杀伤活性检测
在RTCA细胞增殖板(购自美国ACEA Biosciences公司)上按10000个/孔的比例铺肺癌细胞株NCI-H23、H446、H460(购自美国标准生物品收藏中心，ATCC)，置于xCELLigenceRTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪上，实时记录细胞的生长情况(以测得的细胞指数来反映，数值越高表明细胞状态越佳)。24小时后，分别按4:1、2:1效靶比(E:T)，加入实施例2制备得到的herinCAR细胞与herinCAR-PD1细胞，重新置于xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪上进行细胞生长情况检测。结果显示，相对于不表达PD1抗体的herinCAR-T细胞，表达PD1抗体的herinCAR-T细胞，即herinCAR-PD1细胞对肺癌细胞的杀伤活性显著提高(图5A-C)。以上结果表明，共表达PD1抗体后，能增强CAR-T细胞对肺癌细胞的杀伤活性。
实施例7：herinCAR-PD1细胞的体内杀伤活性鉴定
在NOD-SCID小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)中皮下注射5×106的Huh7恶性肝癌细胞，10天后经尾静脉分别注射实施例2制备得到的herinCAR细胞、herinCAR-PD1细胞、未转基因的同一供体来源T细胞、(注射剂量2×105)或PBS缓冲液，测定移植瘤的生长状况。结果表明，相对于对照组，herinCAR-PD1细胞对肝癌的抑制作用具有显著差异(图6)。表明，共表达PD1抗体的herinCAR-T细胞在体内具有良好的抗肿瘤作用。
实施例8：herinCAR-PD1细胞在移植瘤内的增殖检测
治疗后的第35天，处死荷瘤小鼠，取移植瘤组织，提取基因组DNA(按Sigma-Aldrich公司的组织DNA抽提试剂盒进行操作)。利用RT-PCR(检测herinCAR基因在移植瘤组织中的相对拷贝数(引物如SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4所示，反应体系与程序按天根生物的RealMaster Mix(SYBR Green)检测试剂盒操作)。结果表明，相对于herinCAR-T细胞，herinCAR-PD1细胞在移植瘤内的拷贝数显著提高(图7)，表明表达PD1抗体可增强CAR-T细胞在移植瘤内的存活时间。
F：CAGTGAGATTGGGATGAAAGG(SEQ ID NO:3)；
R：GAAGGGCGTCGTAGGTGTC(SEQ ID NO:4)。
实施例9：herinCAR-PD1细胞的体内清除试验(分子刹车功能的验证)
在BABL/c裸鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)尾静脉注射实施例2制备得到的herinCAR-PD1细胞(注射剂量5×106)，3天后静脉注射100μg的美罗华抗体或人IgG对照抗体。12个小时后，采集血液及骨髓样品，用流式细胞仪检测PIK-T细胞的比例(CD20与CD3双阳性细胞)。
结果表明，相对于注射人IgG抗体的对照组，在注射美罗华抗体后，输注的herinCAR-PD1细胞在血液与骨髓中的比例显著降低(图8)。可见，CD20分子刹车在体内能有效发挥作用，可以通过ADCC及CDC效应将含有CD20表位的PIK-T细胞清除。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (11)
1.一种转基因T细胞，其特征在于，所述T细胞基因组中稳定整合了含编码嵌合抗原受体与免疫检查点抑制性抗体的核酸序列的表达框，且表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列。
2.如权利要求1所述的转基因T细胞，其特征在于，每百万个所述T细胞在48小时的时间内表达的抗体量高于2μg。
3.如权利要求1所述的转基因T细胞，其特征在于，所述转座子选自：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty；优选地，所述转座子为piggybac。
4.如权利要求1所述的转基因T细胞，其特征在于，所述激活型抗体选自：抗体全长序列或其功能性片段；优选地，选自：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv和scFv-Fc；进一步优选地，所述抗体为scFv-Fc。
5.如权利要求1所述的转基因T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体针对如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1，β1,4-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称粘蛋白-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(α-胎蛋白)、MUC1(mucin 1，细胞表面相关)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转换酶1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16，mucin 16，细胞表面相关)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、β2-MG(β-2-微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)；优选地，所述嵌合抗原受体为针对EGFR家族的嵌合抗原受体。
6.如权利要求1所述的转基因T细胞，其特征在于，所述转基因T细胞还包含刹车分子，该刹车分子为可被已上市抗体药物识别的膜抗原；优选地，所述膜抗原选自CD11a、CD15、CD19、CD20、CD25、CD44、CD47、CD52、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、VEGFR1、VEGFR2、EpCAM、MSLN、GPIIb/IIIa、α4整合素和α4β7整合素；优选地，所述膜抗原为CD20。
7.如权利要求1所述的转基因T细胞，其特征在于，所述免疫检查点抑制性抗体针对如下抗原中的一种或多种：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-H1、B7-1、VSIR和CD244；优选地，所述抗体为抗PD-1抗体。
8.如权利要求1-7中任一项所述的转基因T细胞，其特征在于，所述转基因杀伤性细胞转入了以下核酸构建物C：
核酸构建物C：含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)，编码任选的刹车分子、嵌合抗原受体(CAR)和抑制性抗体的核酸序列及控制该核酸序列表达的启动子，polyA加尾信号序列，转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)，转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子；
任选地，采用病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转中的一种或多种方法将所述核酸构建物转入所述细胞中，优选地采用电转。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1-8中任一项所述的转基因T细胞和药学上可接受的辅料。
10.权利要求1-8中任一项所述的转基因T细胞或权利要求9所述的药物组合物的用途，其特征在于，所述用途选自：
制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物、制备用于抑制病毒生长的药物、制备用于治疗肿瘤的药物、制备用于治疗病毒感染性疾病的药物、制备用于治疗细菌感染性疾病的药物和制备用于治疗自身免疫疾病的药物；
其中，所述肿瘤选自：肝癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、淋巴瘤、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤。
11.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)，编码任选的刹车分子、嵌合抗原受体(CAR)和免疫检查点抑制性抗体的核酸序列及控制该核酸序列表达的启动子，polyA加尾信号序列，转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)，转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子；
优选地，所述转座酶为来自piggybac转座系统的转座酶，所述5’反向末端重复序列(5’ITR)和3’反向末端重复序列是piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列；
优选地，所述刹车分子是CD20；
优选地，所述嵌合受体抗原是针对EGFR家族的嵌合抗原受体；
优选地，所述免疫检查点抑制抗体针对如下抗原中的一种或多种：PD-1、CTLA4、PDL1、PDL2、PDL3、TIM3、LAG3、CD47、BTLA、TIGIT、CD160、LAIR1、B7-H1、B7-1、VSIR和CD244；优选地，所述抗体为抗PD-1抗体的scFv-Fc；
优选地，所述核酸构建物含有SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
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