CN112079924A - Pd-l1靶向结合剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种PD‑L1靶向结合剂及其用途。其中，所述PD‑L1靶向结合剂与PD‑L1特异性结合并抑制PD‑L1的生物活性，可用于抑制PD‑L1介导的肿瘤细胞存活和抑制PD‑L1介导的肿瘤反应性T细胞的抑制，从而降低肿瘤细胞增殖、运动性、侵入、转移和肿瘤生长。

Description

PD-L1靶向结合剂及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及针对PD-L1的靶向结合剂、编码它们的核酸及其用途。在一些实施方案中，本发明涉及针对PD-L1的单克隆抗体、编码它们的核酸和这些抗体的用途。本发明也涉及表达所述靶向结合剂或抗体的细胞系。此外，本发明还涉及所述的靶向结合剂用于诊断和用于治疗与PD-L1的活性和/或表达相关的疾病。
背景技术
适应性免疫应答涉及T细胞和B细胞的两种主要类别的淋巴细胞的激活、选择和克隆增殖。遇到抗原之后，T细胞增殖并分化为抗原特异性效应细胞，而B细胞增殖并分化为抗体分泌细胞。T细胞激活是多步骤过程，需要T细胞和抗原呈递细胞(APC)之间的一些信号转导事件。对于要发生的T细胞激活，必须向静止T细胞递送两种类型的信号。第一种类型是通过抗原特异性T细胞受体(TCR)来介导，并赋予对免疫应答的特异性。第二种共刺激类型调节应答的大小并通过T细胞上的辅助受体来递送。
主要的共刺激信号通过结合APC上的配体B7-1或B7-2激活T细胞上的CD28受体来递送。相比之下，同样的B7-1或B7-2配体与抑制性CTLA-4受体的结合导致T细胞应答的弱化。因此，CTLA-4信号对抗由CD28介导的共刺激。在高抗原浓度时，CD28共刺激超越了CTLA-4抑制作用。CD28和CTLA-4表达的暂时调节维持了激活信号和抑制信号之间的平衡并确保了有效的免疫应答的形成，同时防范自身免疫的形成。
PD-L1，又称作B7-H1，是大小约53kD的I型跨膜蛋白。在人中，PD-L1在多种免疫细胞类型上表达，包括在活化的T细胞、无反应性的/衰竭的T细胞、天然B细胞和活化B细胞上表达，以及在髓系树突细胞(DC)、单核细胞和肥大细胞上表达。其还在非免疫细胞，包括胰岛、肝脏库普弗细胞(Kupffer Cell)、血管内皮细胞和上皮细胞，例如，气管上皮细胞和肾小管上皮细胞上表达，其中在炎性发作过程中其表达是增强的。此外，研究还发现PD-L1在多种肿瘤中表达水平上调，所述多种肿瘤包括但不限于乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、胃癌、膀胱癌、肝癌和胰腺癌，以及黑素瘤。
PD-L1是B7家族蛋白的成员，其含有两个胞外免疫球蛋白(Ig)结构域，一个N末端V型结构域，之后是C型结构域。30个氨基酸长度的胞内结构域不含明显的信号转导基序，但含有蛋白激酶C磷酸化的可能位点。小鼠PD-L1与人PD-L1具有69％氨基酸同源性，并且共有保守结构。
已知PD-L1与两个可替代性配体结合，其中之一的PD-1为50-55kD的I型跨膜受体，其最初鉴定于经历激活诱导的凋亡的T细胞中。PD-1表达于活化T细胞、B细胞和单核细胞以及免疫系统的其它细胞中，并与PD-L1和PD-L2结合。第二是B7家族成员B7-1，其表达于活化T细胞、B细胞、单核细胞和抗原呈递细胞。
PD-1是免疫球蛋白超家族的成员，其在其胞外区中含有单一的Ig V样结构域。PD-1胞浆域含有两个酪氨酸，最接近膜的酪氨酸位于免疫受体酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibitory Motif，ITIM)中。ITIM的存在表明该分子以通过募集胞浆磷酸酶来抑制抗原受体信号转导来发挥作用。人和鼠PD-1蛋白共有约60％的氨基酸同源性，其中保守的是4个N-糖基化位点，和限定Ig-V结构域的氨基酸残基。胞浆区中的ITIM和围绕PD-L1羧基末端的酪氨酸的ITIM样基序(人和小鼠中的TEYATI)在人和鼠之间也是保守的。
研究认为经由PD-L1轴线的信号转导通过负向调控T细胞应答在免疫系统中起关键作用。该调控参与了T细胞发育、慢性炎症应答和外周耐受。这些功能的关键性质表现在自身免疫表型的PD-1缺陷的小鼠中示出。C57BL/6小鼠中的PD-1缺陷导致了慢性进行性狼疮样肾小球肾炎和关节炎。在BAL b/c小鼠中，PD-1缺陷导致由于心脏组织特异性自身反应性抗体的存在引起的严重的心肌病。经由PD-L1/B7-1的信号转导的功能尚不清楚，但认为其也参与向T细胞和抗原呈递细胞递送负调控信号。
研究认为表达于肿瘤细胞的PD-L1有助于肿瘤逃逸免疫系统的检测和清除。PD-L1经由一些可选择的机制在该方面起作用，所述机制包括驱使浸润T淋巴细胞的肿瘤的衰竭和无反应性、刺激免疫抑制性细胞因子分泌到肿瘤微环境中、刺激抑制性调控T细胞起作用并防止表达PD-L1的肿瘤细胞被肿瘤细胞特异性细胞毒性T细胞裂解。
总之，存在提供用于与免疫反应的抑制有关的疾患的安全且有效的治疗方法的需要，所述疾患例如癌症和慢性病毒感染。这些疾患中涉及的免疫应答的调节可通过对PD-1/PD-L1通路进行操作来实现。
发明内容
本发明涉及与PD-L1特异性结合并抑制PD-L1的生物活性的靶向结合剂。在本发明的一个实施方案中，本发明涉及与PD-L1特异性结合并从而抑制PD-L1活性的靶向结合剂。在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及与PD-L1特异性结合并从而抑制PD-L1与PD-1的结合的靶向结合剂。在本发明的又一个实施方案中，本发明涉及阻断PD-L1诱导的T细胞抑制并从而增强抗肿瘤免疫力的靶向结合剂。在本发明又一个另外的实施方案中，本发明还涉及可进一步刺激以下活性中的一种或多种的靶向结合剂，所述活性包括混合淋巴细胞反应中的T细胞增殖、IFN-γ或IL-2分泌。
本发明的实施方案涉及与PD-L1特异性结合并抑制PD-L1的生物活性的靶向结合剂。在一个实施方案中，与不存在所述靶向结合剂时相比，靶向结合剂抑制了PD-L1生物活性的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
本发明的实施方案涉及与PD-L1特异性结合并从而抑制PD-L1活性的靶向结合剂。在一个实施方案中，与不存在所述靶向结合剂时相比，靶向结合剂抑制了PD-L1活性的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
本发明的实施方案涉及与PD-L1特异性结合并从而抑制与PD-1的结合的靶向结合剂。在一个实施方案中，与不存在靶向结合剂时相比，靶向结合剂抑制了PD-L1/PD-1受体配体结合的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
本发明的另外的实施方案涉及与B7-H1特异性结合并从而增强抗肿瘤免疫力的靶向结合剂。在一个实施方案中，与不存在靶向结合剂时将发生的相比，靶向结合剂增强了抗肿瘤免疫力的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
本发明的另外的实施方案涉及与B7-H1特异性结合并从而抑制细胞增殖的靶向结合剂。在一个实施方案中，与不存在靶向结合剂时将发生的相比，靶向结合剂抑制了细胞增殖的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
本发明的另外的实施方案涉及与PD-L1特异性结合并提高针对表达B7-H1的肿瘤细胞的特异性溶细胞(CTL)活性的靶向结合剂。在一个实施方案中，本发明的抗体具有小于或等于100nM、50nM或1nM的EC50。而且，在另一个实施方案中，本发明的抗体具有约100nM直至约1nM的EC50；或约50nM直至约1nM的EC50；或约20nM直至约1nM的EC50；或约100nM直至约50nM的EC50；或约100nM直至约70nM的EC50。
本发明的另外的实施方案涉及与PD-L1特异性结合并以小于或等于100nM的EC50抑制PD-L1介导的T细胞增殖的抑制的靶向结合剂。在一个实施方案中，本发明的抗体具有小于或等于100nM，例如，90、80、70、60、50、40、30、20或10nM的EC50。而且，在另一个实施方案中，本发明的抗体具有约100nM直至约10nM的EC50；或约50nM直至约10nM的EC50；或约20nM直至约10nM的EC50；或约100nM直至约50nM的EC50；或约100nM直至约70nM的EC50；或约100nM直至约80nM的EC50。
靶向结合剂还抑制肿瘤细胞黏附、运动性、侵入和细胞转移，并且靶向结合剂对于降低肿瘤生长是有用的。可实现如此的机制可包括但不限于，抑制PD-L1活性。
在本发明的一个实施方案中，靶向结合剂是抗体。在本发明的一个实施方案中，靶向结合剂是单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，靶向结合剂是人源化抗体或其片段。所述单克隆抗体在本文中可指抗PD-L1抗体或本发明的抗体。
抗体、单克隆抗体和人单克隆抗体包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同种型抗体。在本发明的一个实施方案中，靶向结合剂是IgG1同种型的人源化单克隆抗体。IgG1同种型提高了抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，IgG1同种型具有较高的稳定性。
在本发明的一个实施方案中，靶向结合剂具有选自以下中的一个或多个的需要的治疗性质：对PD-L1的高亲和性、在体外或在体内抑制PD-L1活性的能力、抑制PD-L1介导的肿瘤细胞存活的能力和抑制PD-L1介导的肿瘤反应性T细胞的抑制的能力，其可进而降低肿瘤细胞增殖、运动性、侵入、转移和肿瘤生长。
在一个实施方案中，本发明包括以非常高的亲和力与PD-L1特异性结合的抗体。在本发明的一些实施方案中，靶向结合剂以小于5nM的结合亲和力(Kd)结合PD-L1。在其它实施方案中，靶向结合剂以小于4nM、3nM、2nM或1nM的Kd结合。而且，在一些其它实施方案中，本发明的抗体以约5nM至约1nM；或约5nM至约2nM；或约5nM至约3nM；或约5nM至约4nM；或约3nM至约1nM；或约2nM至约1nM的Kd结合PD-L1。在本发明的一些实施方案中，靶向结合剂以小于950pM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM或100pM的Kd结合PD-L1。而且，在一些其它实施方案中，本发明的抗体以约900pM至约100pM；或约900pM至约200pM；或约900pM至约300pM；或约900pM至约400pM；或约900pM至约500pM；或约900pM至约600pM；或约900pM至约700pM；或约200pM至约100pM；或约300pM至约200pM；或约400pM至约300pM的Kd结合PD-L1。在一些其它实施方案中，靶向结合剂以小于90pM、80pM、70pM、60pM、55pM或50pM的Kd结合PD-L1。在一些其它实施方案中，靶向结合剂以小于60pM的Kd结合PD-L1。在一些其它实施方案中，靶向结合剂以小于55pM的Kd结合PD-L1。而且，在一些其它实施方案中，本发明的抗体以约100pM至约50pM；或约100pM至约70pM；或约100pM至约80pM；或约100pM至约90pM；或约70pM至约50pM；或约60pM至约50pM；或约55pM至约50pM的Kd结合PD-L1。利用本文所描述的或本领域中普通技术人员熟知的方法(例如BIAcore法)(BiacoreInternational AB,Uppsala,Sweden)可评估Kd。
在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含抗体1C2、1D4、1G11、2F7、3D7或6A3的重链序列中的任何一个。轻链混杂在本领域中非常确定，因而，包含含有抗体1C2、1D4、1G11、2F7、3D7或6A3、本文所公开的另一抗体的重链序列中的任何一个的序列的靶向结合剂或抗体还可包含示于表2中的1C2、1D4、1G11、2F7、3D7或6A3、本文所公开的其它抗体的轻链序列(VL)中的任何一个。在另一个实施方案中靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含抗体1C2、1D4、1G11、2F7、3D7或6A3的重链序列中的任何一个且还包含抗体1C2、1D4、1G11、2F7、3D7或6A3的对应的轻链序列。在一些实施方案中，抗体是完全人单克隆抗体。
在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含示于表2中的轻链序列中的任何一个。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含抗体1C2、1D4、1G11、2F7、3D7或6A3的轻链序列中的任何一个。
另一个实施方案是与PD-L1特异性结合的靶向结合剂或抗体，且包含这样的序列，该序列包含示于表2中的CDR2序列的其中之一和CDR3序列的其中之一。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体还包含这样的序列，该序列包含示于表1中的CDR3序列。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体还包含这样的序列，该序列包含如表1和/或表2中所示的CDR2序列和CDR3序列。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体还包含这样的序列，该序列包含：如表1和/或表2中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可包含这样的序列，该序列包含如表1中所示的单克隆抗体1C2、1D4、1G11、2F7、3D7或6A3中的任何一个的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一个。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可包含这样的序列，该序列包含如表2中所示的单克隆抗体1C2、1D4、1G11、2F7、3D7或6A3的任何一个的CDR1、CDR2或CDR3中的任何一个。在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可包含这样的序列，该序列包含如表1中所示的单克隆抗体1C2、1D4、1G11、2F7、3D7或6A3中的任何一个的CDR1、CDR2和CDR3。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体可包含这样的序列，该序列包含如表2中所示的单克隆抗体1C2、1D4、1G11、2F7、3D7或6A3的任何一个的CDR1、CDR2和CDR3。
在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含如表1中所示的单克隆抗体1C2重链的CDR1、CDR2和CDR3序列和如表2中所示的单克隆抗体1C2轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含如表1中所示的单克隆抗体1D4重链的CDR1、CDR2和CDR3序列和如表2中所示的单克隆抗体1D4轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含如表1中所示的单克隆抗体1G11重链的CDR1、CDR2和CDR3序列和如表2中所示的单克隆抗体1G11轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含如表1中所示的单克隆抗体2F7重链的CDR1、CDR2和CDR3序列和如表2中所示的单克隆抗体2F7轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含如表1中所示的单克隆抗体3D7重链的CDR1、CDR2和CDR3序列和如表2中所示的单克隆抗体3D7轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列包含如表1中所示的单克隆抗体6A3重链的CDR1、CDR2和CDR3序列和如表2中所示的单克隆抗体6A3轻链的CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。
值得注意地是，本领域中的普通技术人员可容易地完成CDR的测定。参见例如，Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目的蛋白序列),第5版,NIH出版91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷。Kabat提供了来自大量物种抗体同种型的免疫球蛋白链的多个序列比对。根据单一编号系统，Kabat编号系统对所比对的序列进行编号。Kabat序列已自1991年更新且作为电子序列数据库是可获得的(目前可从Kabat数据库网站获得；另见Nucleic Acids Research,2000,28(1),214-218)。通过与Kabat参考序列进行比对，根据Kabat可对任何免疫球蛋白序列进行编号。因此，Kabat编号系统提供了用于对免疫球蛋白链进行编号的统一系统。
在另一个实施方案中，本发明的靶向结合剂或抗体包含如表1或表2中所示的CDR3序列；或如表1或表2中所示的CDR1、CDR2或CDR3序列中的任何一个；或如表1中所示的重链可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3序列；或如表2中所显示的轻链可变区序列的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。
在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体，或其抗原结合部分，包含与SEQ ID NO:1的氨基酸具有至少90％同源性的重链可变区，且包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％同源性的轻链可变区。
在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体，或其抗原结合部分，包含与SEQ ID NO:3的氨基酸具有至少90％同源性的重链可变区，且包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90％同源性的轻链可变区。
在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体，或其抗原结合部分，包含与SEQ ID NO:5的氨基酸具有至少90％同源性的重链可变区，且包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90％同源性的轻链可变区。
在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体，或其抗原结合部分，包含与SEQ ID NO:7的氨基酸具有至少90％同源性的重链可变区，且包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％同源性的轻链可变区。
在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体，或其抗原结合部分，包含与SEQ ID NO:9的氨基酸具有至少90％同源性的重链可变区，且包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％同源性的轻链可变区。
在另一个实施方案中，靶向结合剂或抗体，或其抗原结合部分，包含与SEQ ID NO:11的氨基酸具有至少90％同源性的重链可变区，且包含与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少90％同源性的轻链可变区。
在一个实施方案中，靶向结合剂或抗体包含本文所公开的CDR的变体或衍生物，跨越本文所公开的轻链序列或重链序列的框架区和CDR或本文所公开的抗体的框架区和CDR(尤其从FR1至FR4或CDR1至CDR3)的连续序列。变体包括靶向结合剂或抗体，所述靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列具有如表1或表2中所示的CDR1、CDR2或CDR3的连续序列、本文所公开的轻链序列或重链序列、或本文所公开的单克隆抗体的任何中的多达20个、16个、10个、9个或更少，例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸增加、置换、缺失和/或插入。变体包括靶向结合剂或抗体，所述靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列具有如表1或表2中所示的CDR1、CDR2或CDR3的连续序列、本文所公开的轻链序列或重链序列、或本文所公开的单克隆抗体的任何中的1个、2个、3个氨基酸增加、置换、缺失和/或插入。变体包括靶向结合剂或抗体，所述靶向结合剂或抗体包含这样的序列，该序列与如表1或表2中所示的CDR1、CDR2或CDR3的连续序列、本文所公开的轻链序列或重链序列、或本文所公开的单克隆抗体中的任何一者具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或约99％氨基酸同源性。两个氨基酸序列的同源性百分比可通过本领域中的技术人员已知的任何方法来确定，所述方法包括但不限于，成对蛋白质比对。在一个实施方案中，变体包括本文所公开的CDR序列或轻链序列或重链序列中的改变，所述改变是天然存在的或通过利用重组DNA技术或突变技术对天然序列进行体外工程化来引入。天然存在的变体包括在针对外源抗原的抗体的生成过程中对应种系核苷酸序列中体内生成的那些。
在一个实施方案中，靶向结合剂包含：
具有SEQ ID NO:13、16、19、22、25或28所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:14、17、20、23、26或29所示氨基酸序列的CDR2，或具有SEQ ID NO:15、18、21、24、27或30所示氨基酸序列的CDR3，或它们的变体中的一个或多个；和/或
具有SEQ ID NO:31、34、37、40、43或46所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:32、35、38、41、44或47所示氨基酸序列的CDR2，或具有SEQ ID NO:33、36、39、42、45或48所示氨基酸序列的CDR3，或它们的变体中的一个或多个；
优选地，所述变体的序列为包括多达20个、16个、10个、9个或更少，例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸的增加、置换、缺失和/或插入的任一所述序列，或所述变体的序列与任一所述序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性。
在一个实施方案中，靶向结合剂为包含重链可变区和轻链可变区的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中：
(i)所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(a)CDR1具有与SEQ ID NO:13、16、19、22、25或28相同的氨基酸序列或相对于SEQID NO:13、16、19、22、25或28包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列；
(b)CDR2具有与SEQ ID NO:14、17、20、23、26或29相同的氨基酸序列或相对于SEQID NO:14、17、20、23、26或29包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列；
(c)CDR3具有与SEQ ID NO:15、18、21、24、27或30相同的氨基酸序列或相对于SEQID NO:15、18、21、24、27或30包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列；
(ii)所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(d)CDR1具有与SEQ ID NO:31、34、37、40、43或46相同的氨基酸序列或相对于SEQID NO:31、34、37、40、43或46包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列；
(e)CDR2具有与SEQ ID NO:32、35、38、41、44或47相同的氨基酸序列或相对于SEQID NO:32、35、38、41、44或47包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列；
(f)CDR3具有与SEQ ID NO:33、36、39、42、45或48相同的氨基酸序列或相对于SEQID NO:33、36、39、42、45或48包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列。
在一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:1包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:2包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列。
在一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:3包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:4包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列。
在一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:5相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:5包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:6相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:6包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列。
在一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:7相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:7包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:8相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:8包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列。
在一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:9相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:9包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:10相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:10包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列。
在一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:11相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:11包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:12相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列。
在另一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:13相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:13包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:14相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:14包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:15相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:15包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:31相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:31包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:32相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:32包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:33相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:33包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
在另一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:16相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:16包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:17相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:17包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:18相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:18包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:34相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:34包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:35相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:35包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:36相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:36包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
在另一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:19相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:19包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:20相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:20包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:21相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:21包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:37相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:38相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:38包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:39相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:39包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
在另一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:22相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:22包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:23相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:23包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:24相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:24包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:40相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:40包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:41相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:41包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:42相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:42包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
在另一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:25相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:25包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:26相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:26包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:27相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:27包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:43相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:43包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:44相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:44包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:45相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:45包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
在另一个实施方案中，变体包括靶向结合剂或抗体，其包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:28相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:28包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:29相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:29包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:30相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:30包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:46相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:46包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:47相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:47包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:48相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:48包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链CDR3、SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的轻链CDR3。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的重链CDR3、SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链CDR3。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链CDR3、SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的轻链CDR3。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链CDR3、SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链CDR3。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:27所氨基酸序列示的重链CDR3、SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的轻链CDR3。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的重链CDR3、SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链CDR3。
在一个实施方案中，衍生物可以是异种抗体，即其中两个或多个抗体连接在一起的抗体。衍生物包括已经过化学修饰的抗体。实例包括一种或多种聚合物的共价结合，比如水可溶性聚合物、N-连接的或O-连接的碳水化合物、糖、磷酸盐、和/或其它这样的分子。衍生物以所结合的分子的类型或位置不同于天然存在的抗体或起始抗体的方式来修饰。衍生物还包括抗体中天然存在的一种或多种化学基团的缺失。
在本发明的一些实施方案中，提供编码所述靶向结合剂的分离的核酸、包含此类核酸的载体和宿主细胞和用于产生所述靶向结合剂的重组技术。
优选地，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:71所示；优选地，SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:72所示；优选地，SEQ IDNO:3所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:73所示；优选地，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:74所示；优选地，SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:75所示；优选地，SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:76所示；优选地，SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:77所示；优选地，SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:78所示；优选地，SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:79所示；优选地，SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:80所示；优选地，SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:81所示；优选地，SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:82所示。
在本发明的一些实施方案中，提供一种载体，该载体适合用于表达编码前述任何一种抗-PD-L1抗体的核酸。在又一个具体方面中，所述载体还包含适合用于表达该核酸的宿主细胞。在又一个具体方面中，所述宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在又一个具体方面中，所述真核细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)。
在本发明的一些实施方案中，提供制备抗-PD-L1抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合用于产生此类抗体或片段的条件下，培养含有适合于表达的形式的核酸的宿主细胞，该核酸编码前述任何一种抗-PD-L1抗体或抗原结合片段，并且回收所述抗体或片段。
为了重组产生抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规流程容易的分离编码单克隆抗体的DNA并测序(如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)起源的。
在本发明的一些实施方案中，提供了一种PD-L1抗体的嵌合抗原受体，其包含PD-L1抗体可变区序列。优选地，所述的PD-L1抗体的嵌合抗原受体，其还包含一个或多个选自由以下组成的组的元件：信号肽、接头序列、跨膜结构域、内部结构域和共刺激结构域。更优选地，所述的PD-L1抗体的嵌合抗原受体包含CD8抗原信号肽、PD-L1抗体的轻链可变区、PD-L1抗体的重链可变区、CD28元件、4-1BBL元件以及CD3ζ元件。优选地，CD8抗原信号肽的编码核酸序列如SEQ ID NO:51所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示。优选地，所述CD28元件的编码核酸序列如SEQ ID NO:53所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示。优选地，所述4-1BBL元件的编码核酸序列如SEQ ID NO:55所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示。优选地，所述CD3ζ元件的编码核酸序列如SEQ ID NO:57所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示。更优选地，所述嵌合抗原受体的编码核酸序列选自59、61、63、65、67或69所示的序列，其相应的氨基酸序列选自60、62、64、66、68或70所示的序列。
在本发明的一些实施方案中，提供了编码PD-L1抗体的嵌合抗原受体的核酸。
在本发明的一些实施方案中，提供了含有所述核酸的重组载体、表达盒、重组病毒或重组细胞。
在本发明的一些实施方案中，提供了一种CAR构建体，其包含编码嵌合抗原受体的核酸。
在本发明的一些实施方案中，提供了一种T细胞，其用所述的CAR构建体转导。
在本发明的一些实施方案中，还提供了一种PD-L1 CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)构建含有可识别人PD-L1的CAR元件(即本文中的PD-L1抗体可变区序列)的载体，所述载体可以是真核表达载体或慢病毒载体，优选慢病毒载体，优选地，所述载体是慢病毒载体pHAGE-EF1α-MCS-ZsGreen；
(b)用步骤(a)构建的载体转染或感染宿主T细胞，产生带有带有可识别人PD-L1的CAR元件的CAR-T细胞。
在本发明的一些实施方案中，还提供了一种PD-L1 CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)构建含有可识别人PD-L1的CAR元件(即本文中的PD-L1抗体可变区序列)的载体，所述载体可以是真核表达载体或慢病毒载体，优选慢病毒载体；优选地，所述载体是慢病毒载体pHAGE-EF1α-MCS-ZsGreen；
(b)将步骤(a)构建的载体转染至包装细胞系中，产生带有可识别人PD-L1的CAR元件的慢病毒颗粒；
(c)将所述载体或慢病毒颗粒转染或感染宿主T细胞，产生带有带有可识别人PD-L1的CAR元件的CAR-T细胞。
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:1包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:2包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:3包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:4包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:5相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:5包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:6相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:6包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:7相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:7包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:8相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:8包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:9相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:9包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:10相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:10包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:11相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:11包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:12相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:13相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:13包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:14相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:14包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:15相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:15包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:31相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:31包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:32相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:32包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:33相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:33包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:16相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:16包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:17相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:17包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:18相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:18包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:34相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:34包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:35相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:35包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:36相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:36包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:19相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:19包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:20相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:20包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:21相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:21包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:37相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:38相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:38包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:39相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:39包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:22相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:22包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:23相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:23包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:24相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:24包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:40相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:40包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:41相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:41包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:42相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:42包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:25相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:25包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:26相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:26包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:27相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:27包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:43相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:43包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:44相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:44包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:45相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:45包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
在一个实施方案中，CAR元件包含以下序列：
(a)具有与SEQ ID NO:28相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:28包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:29相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:29包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:30相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:30包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:46相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:46包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:47相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:47包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:48相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:48包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
术语“CDR区”或“CDR”意在表示赋予抗体抗原结合特异性的抗体的重链和轻链的高变区。CDR可根据Kabat系统(Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington)和更近的版本来定义。抗体通常含有3个重链CDR和3个轻链CDR。本文使用术语CDR来表示，根据情况，这些区域之一或这些区域的一些或甚至全部，这些区域含有负责通过抗体对其识别的抗原或表位的亲和力进行结合的氨基酸残基的大部分。
重链的第三CDR(HCDR3)具有较大尺寸的可变性(较大多样性基本上由于使其产生的基因的排列机制)。虽然已知最长的尺寸为26，其可短至2个氨基酸。CDR长度还可根据特定的基本框架可适应的长度来变化。功能上，HCDR3在决定抗体的特异性中起重要作用(Segal等,PNAS,71:4298-4302,1974,Amit,Science,233:747-753,1986,Chothia,J.Mol.Biol.,196:901-917,1987,Chothia等,Nature,342:877-883,1989,Caton,J.Immunol.,144:1965-1968,1990,Sharon,PNAS,87:4814-4817,1990,Sharon等,J.Immunol.,144:4863-4869,1990,Kabat等,J.Immunol.,147:1709-1719,1991)。
本文所提到的术语“CDR组”包括CDR1、CDR2和CDR3。因此，HCDR组指HCDR1、HCDR2和HCDR3，和LCDR组指LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本发明的VH和VL区和CDR的变体，包括其氨基酸序列在本文列出且其可应用于PD-L1的靶向结合剂和抗体的那些，可通过序列改变或突变方法和筛选具有需要的特性的抗原靶向来获得。需要的特性的实例包括但不限于：相对于对抗原特异的已知抗体，对抗原增高的结合亲和力；相对于对抗原特异性的已知抗体，增高的抗原活性的中和(如果活性是已知的)；在特定的摩尔比率时与已知抗体或配体对抗原的特定的竞争能力；免疫沉淀配体-受体复合物的能力；与特定的表位结合的能力；线性表位，例如，利用肽结合扫描鉴定的肽序列，例如，利用线性和/或限定构象中筛选的肽；构象表位，由非连续残基所形成；调节B7-H1或下游分子的新型生物活性的能力；结合和/或中和B7-H1和/或任何其它需要的性质的能力。在CDR、抗体VH或VL区和抗原结合位点的氨基酸序列中进行置换所需的技术是本领域中可获得的。可产生本文所公开的抗体分子的变体并用于本发明。继计算机化学在将多变量数据分析技术应用于结构/性质活性关系中的先导之后(Wold等,Multivariate dataanalysis in chemistry.Chemometrics–Mathematics and Statistics in Chemistry(编:B.Kowalski),D.Reidel PublishingCompany,Dordrecht,Holland,1984)，利用熟知的数学技术可推导定量的抗体活性-性质关系，所述数学技术诸如统计回归、模式识别和分类(Norman等,Applied RegressionAnalysis.Wiley-Interscience；第3版(April 1998)；Kandel,Abraham&Backer,Eric.Computer-Assisted Reasoning in ClusterAnalysis.Prentice Hall PTR,(5月11日,1995)；Krzanowski,Wojtek.Principles ofMultivariate Analysis:A User’s Perspective(Oxford Statistical Science Series,No22(Paper)).Oxford University Press；(December2000)；Witten,Ian H.&Frank,Eibe.Data Mining:Practical Machine Learning To olsand Techniques with JavaImplementations.Morgan Kaufmann；(October11,1999)；Denison David G.T.(Editor),Christopher C.Holmes,Bani K.Mallick,Adrian F.M.Smith.Bayesian Methods forNonlinear Classification and Regression(Wiley Series in Probability andStatistics).John Wiley&Sons；(July 2002)；Ghose,Arup K.&Viswanadhan,VellarkadN.Combinatorial Library Design and Evaluation Principles,Software,Tools,andApplications in Drug Discovery)。在一些情况中，抗体的性质可来源于抗体序列、功能结构和三维结构的经验和理论模型(例如，可能接触残基或计算的物理化学性质的分析，且可单独地和组合地考虑这些性质。由VH域和VL域组成的抗体抗原结合位点通常由6个多肽的环形成：来自轻链可变域(VL)的3个和来自重链可变域(VH)的三个。对已知原子结构的抗体的分析已阐明了抗体结合位点的序列和三维结构之间的关系。这些关系暗示，除VH结构域中的第3区(环)，结合位点环具有少量的主链构象之一：典型结构。已显示在特定的环中形成的典型结构通过其大小和在环和框架区二者中的关键位点处某些残基的存在来确定。
该序列-结构关系的研究可用于预测已知序列(除未知的三维结构之外)的抗体中的那些残基，其在维持其CDR环的三维结构且从而维持结合特异性中是重要的。这些预测可通过将预测与来自先导最优实验的输出信息相比较来支持。在一个结构方法中，可利用任何免费提供的或商业上的软件包(诸如WAM)来创建抗体分子的模型。然后可使用蛋白质可视和分析软件包(诸如Insight II(Accelrys,Inc.)或Deep View)来评估CDR中的每个位置处可能的置换。然后可利用该信息来进行可能对活性具有极小影响或有利的影响或赋予其它需要的性质的置换。
本文所用的术语“多肽片段”指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但其中其余的氨基酸序列与所推断的天然存在的序列中的对应的位置相同，例如来自全长cDNA序列。片段长度通常为至少5个、6个、8个或10个氨基酸，优选长度为至少14个氨基酸，更优选长度为至少20个氨基酸，通常长度为至少50个氨基酸，和甚至更优选长度为至少70个氨基酸。如本文所用的术语“类似物”指由与所推断的氨基酸序列的部分具有充分同一性的至少25个氨基酸的片段组成的多肽，且其具有以下性质中的至少一个：(1)在适宜的结合条件下，与PD-L1的特异性结合，(2)阻断适当的PD-L1蛋白结合的能力，或(3)抑制PD-L1活性的能力。通常，多肽类似物包含关于天然存在的序列的保守氨基酸置换(或增加或缺失)。类似物长度通常为至少20个氨基酸，优选长度为至少50个氨基酸或更长，且可通常与全长天然存在的多肽一样长。
肽类似物常作为具有与模板肽类似的性质的非肽药物而用于药物工业中。这些类型的非肽化合物被称作“肽模拟物”或“类肽物”。Fauchere,J.Adv.Drug Res.15:29(1986)；Veber和Freidinger TINS第392页(1985)；和Evans等J.Med.Chem.30:1229(1987)，其通过引用并入本文。常借助于计算机的分子建模来开发这样的化合物。与治疗上有用的肽在结构上相似的肽模拟物可用于产生等效治疗或预防作用。一般，类肽物在结构上与范例肽(paradigm polypeptide)(即，具有生化性质或药理活性的多肽)相似，诸如人抗体，但其具有通过本领域中熟知的方法用选自由--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--组成的组的链接任选地替换的一个或多个肽链接。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸的系统置换(例如，D-赖氨酸替代L-赖氨酸)可用来产生更稳定的肽。并且，可通过了本领域中已知的方法来产生包含共有序列或基本上相同的共有序列变异的限定肽(Rizo和GieraschAnn.Rev.Biochem.61:387(1992)，通过引用并入本文)；例如，通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫键的内部半胱氨酸残基。
本文所用的“抗体”可以是单独的或与已知技术所提供的其它氨基酸序列组合的单链抗体、寡克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、驼化的抗体(camelised antibody)、嵌合抗体、CDR移植抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化抗体、嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体、抗独特型抗体和可以溶解的形式或结合的形式来标记的抗体以及其片段、变体或衍生物。抗体可来源于任何物种。抗体包含多肽或多肽的组，其由至少一个结合结构域组成，所述结合结构域从具有三维结合空间的多肽链的折叠形成，其中内表面形状和电荷分布与抗原的抗原决定簇的特征互补。抗体通常具有四聚形式，包含两个相同的多肽链的对，每对具有一条“轻”链和一条“重”链。每条轻/重链的可变区形成抗体结合位点。天然抗体通常是分子量约150Kd的异源四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键的数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变区(VH)，其后为恒定区。每条轻链在一端具有可变区(VL)且在另一端具有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，且轻链的可变区与重链的可变区相对。基于轻链恒定区的氨基酸序列将轻链分类为λ链或κ链。κ轻链的可变区在本文中还可表示为VK。
术语“可变区”还可用来描述重链或轻链的可变区。特定的氨基酸残基在轻链可变区和重链可变区之间形成分界。每条轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。所述抗体可来源于任何哺乳动物，包括但不限于，人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等。
术语“抗体”包括本发明的抗体的结合片段，示例性的片段包括单链Fv(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体、Fv片段、Fab片段、F(ab)′片段、F(ab′)2片段，表现出需要的生物活性的抗体片段、二硫键稳定的可变区(dsFv)、二聚可变区(双链抗体)、抗独特型抗体、胞内抗体、线性抗体、单链抗体分子和从抗体片段形成的多特异性抗体和以上中任何的表位结合片段。尤其是，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型的(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，任何种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的。
用酶(木瓜蛋白酶)消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，也称作“Fab”片段，和“Fc”片段，其不具有抗原结合活性但具有结晶的能力。用酶(胃蛋白酶)消化抗体产生F(ab′)2片段，其中抗体分子的两个臂保持相连且包含两个抗原结合位点。F(ab′)2片段具有交联抗原的能力。
当在本文使用时，“Fv”指保持抗原识别位点和抗原结合位点二者的抗体的最小片段。该区域由紧密的非共价结合或共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。在这种构型中：每个可变区的3个CDR相互作用以限定VH-VL二聚体的表面的抗原结合位点。总之，6个CDR赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使在低于完整的结合位点的亲和力时，单一可变区(或仅包含对抗原特异的3个CDR的一半)还具有识别和结合抗原的能力。
当在本文中使用时，“Fab”指抗体的片段，除了包含重链可变区和轻链可变区之外，其还包含轻链恒定域和重链的CH1区。
当在本文中使用时，“dAb”指作为人抗体的最小功能结合单位的抗体的片段。“dAb”是单一结构域抗体且包含抗体重链的VH或抗体轻链的VL。每个dAb含有6个天然存在的CDR中的3个(Ward等,Binding activitiesof a repertoire of singleimmunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli.Nature341,544-546(1989)；Holt等,Domain antibodies:protein for therapy,Trends Biotechnol.21,484-49(2003))。其分子量范围从11kDa到15kDa，它们比抗原结合片段(Fab)2小4倍且是单链Fv(scFv)分子大小的一半。
当在本文中使用时，“驼源”指由重链二聚物组成的抗体分子，其缺少轻链，但却具有大量的抗原结合组成组分(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R(1993)Naturally occurringantibodies devoid of light chains.Nature363:446-448)。
术语“双链抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其片段包括在同一多肽链中与轻链可变区相连的重链可变区。通过利用足够短的连接物来使同一链上的两个结构域之间配对，促使结构域与另一链的互补域配对并构建两个抗原结合位点。双链抗体更充分地描述于，例如，EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
已显示完整抗体的片段可执行结合抗原的功能。结合片段的实例是(Ward,E.S.等,(1989)Nature341,544-546)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(McCafferty等,(1990)Nature,348,552-554)由VH和CH1结构域组成的Fd片段)；(Holt等,(2003)Trends inBiotechnology 21,484-490)由单一抗体的VL和VH域组成的Fv片段；dAb片段(Ward,E.S.等,Nature 341,544-546(1989),McCafferty等,(1990)Nature,348,552-554,Holt等,(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490)，其由VH或VL域组成；分离的CDR区；F(ab')2片段，包含两个相连的Fab片段的二价片段；单链Fv分子(scFv)，其中VH域与VL域由肽连接物相连，其使两个结构域结合以形成抗原结合位点(Bird等,(1988)Science,242,423-426,Huston等,(1988)PNAS USA,85,5879-5883)；双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和“双链抗体”，通过基因融合构建的多价片段或多特异性片段(WO94/13804；Holliger,P.(1993)等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448)。Fv、scFv或双链抗体分子可通过连接VH和VL域的二硫桥的掺入来稳定(Reiter,Y.等,Nature Biotech,14,1239-1245,1996)。还可产生包含与CH3域结合的scFv的微抗体(Hu,S.等,(1996)Cancer Res.,56,3055-3061)。结合片段的其它实例是Fab′，其由于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基而不同于Fab片段，所述残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸，和Fab′-SH，其是Fab′片段，其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离的硫醇基。
术语“可变的”指以下事实：抗体可变区的某些部分在抗体之间在序列中具有很大不同，且负责每个特定的抗体与其特定的抗原的结合特异性。然而，可变性并不在抗体的可变域中均匀分布。其集中于轻链可变域和重链可变域二者中称作互补决定区(CDR)的片段中。可变区的高度保守的部分称作框架区(FR)。天然抗体重链和轻链的可变区均包含4个FR区，很大程度地采用了β-折叠构型，由3个CDR连接，所述3个CDR形成连接β-折叠结构且在一些情况中形成β-折叠结构的部分的环。每条链中的CDR通过FR区与来自其它链的CDR紧密结合在一起，有助于形成抗体的抗原结合位点(参见，Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。恒定区一般不直接参与抗原结合，但可影响抗原结合亲和力并可表现出多种效应功能，比如ADCC、CDC和/或细胞凋亡中抗体的参与。
术语“高变区”指与其与抗原的结合有关的抗体的氨基酸残基。高变区包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变区的第24-34位残基(L1)、第50-56位残基(L2)和第89-97位残基(L3)和重链可变区的第31-35位残基(H1)、第50-65位残基(H2)和第95-102位残基(H3)(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变域中的第26-32位残基(L1)、第50-52位残基(L2)和第91-96位残基(L3)和重链可变域中的第26-32位残基(H1)、第53-55位残基(H2)和第96-101位残基(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))。“框架”或“FR”残基是在CDR两侧的那些可变域残基。FR残基存在于嵌合抗体、人源化的抗体、人抗体、结构域抗体、双链抗体、疫苗体、线性抗体和双特异性抗体中。
“靶向结合剂”、“靶向结合蛋白”、“特异性结合蛋白”和相似的术语指优先与靶位点结合的药剂，例如抗体或其结合片段。在一个实施方案中，靶向结合剂仅对一个靶位点是特异的。在其它实施方案中，靶向结合剂对多于一个的靶位点是特异的。在一个实施方案中，靶向结合剂可以是单克隆抗体且靶位点可以是表位。靶向结合剂可包含抗体的至少一个抗原结合结构域(例如，CDR)，其中所述结构域融合于或含于异源蛋白支架中，例如，非抗体蛋白支架。
抗体的“结合片段”通过重组DNA技术来产生，或通过完整抗体的酶促裂解或化学裂解来产生。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb和单链抗体。不同于“双特异性”或“双功能”抗体的抗体被理解为其每个结合位点是相同的。当过量的抗体降低了与反受体结合的受体的量的至少约20％、40％、60％或80％，且更通常高于约85％时(如在体外竞争结合测定中所测量的)，抗体基本上抑制受体与反受体的结合。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由具有化学活性的分子的表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成，且可(但不总是)具有特定的三维结构特性，以及特定的电荷特性。当解离常数≤1μM，优选地≤100μM和最优选地≤10μM时，称抗体与抗原特异性结合。
术语“药剂”代表化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。
关于PD-L1多肽的“活性的”或“活性”指PD-L1多肽的具有天然PD-L1多肽的生物活性或免疫活性的部分。当在本文中使用时“生物的”指由天然PD-L1多肽的活性引起的生物学功能。优选的PD-L1生物活性包括，例如，PD-L1诱导的细胞增殖、细胞黏附和侵入。
当在本文中使用时，“哺乳动物”指被认为是哺乳动物的任何动物。优选地，哺乳动物是人。
当在本文中使用时，“动物”包括被认为是哺乳动物的动物。优选地，动物是人。
术语“患者”包括人和受试动物。
术语“mAb”指单克隆抗体。
当在本文中使用时，“脂质体”指可用于将可包含本发明的PD-L1多肽或对于这种PD-L1多肽的抗体的药物递送至哺乳动物的小囊泡。
如本文所用的“标记”或“标记的”指将可检测的部分添加到多肽，所述可检测部分例如放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记的或生物素基。放射性同位素或放射性核素可包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I，荧光标记可包括罗丹明、稀土荧光粉或FITC，且酶标记可包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶。
另外的标记包括，以示例的方式且不限于：酶，比如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶和过氧化物酶；染料；另外的荧光标记或荧光剂包括，比如荧光素和其衍生物、荧色物、GFP(绿色荧光蛋白)、丹酰、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺；荧光团诸如穴状稀土化合物和螯合物，例如铕等(Perkin Elmer和Cisbio测定)；化学发光标记或化学发光物，比如异鲁米诺、鲁米诺和二氧烷；敏化剂；辅酶；酶底物；颗粒，比如胶乳颗粒或碳颗粒；金属溶胶；微晶；脂质体；细胞等，其可进一步被染料、催化剂或其它可检测基团所标记；分子诸如生物素、地高辛或5-溴脱氧尿苷；毒素部分，比如例如选自由假单胞菌外毒素(PE或其细胞毒性片段或突变体)、白喉毒素或其细胞毒性片段或突变体、肉毒杆菌毒素A、B、C、D、E或F、蓖麻毒素或其细胞毒性片段例如蓖麻毒素A、相思豆毒素或其细胞毒性片段、皂草素或其细胞毒性片段、美洲商陆抗病毒毒素或其细胞毒性片段和bryodin1或其细胞毒性片段组成的组的毒素部分。
如本文所用的术语“药物剂或药物”指当合适地施用于患者时能够诱导需要的治疗作用的化学化合物或组合物。本文所用的其它化学术语根据本领域中的常规用法使用，如The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms所例证(Parker,S.,编,McGraw-Hill,San Francisco(1985))。
如本文所用的，“基本上纯的”意为主题物质是所存在的主要物质(即其在组合物中的摩尔数占比任何其它单独的物质更丰富)，且优选地基本上纯的组分是其中主题物质占存在的所有大分子物质的至少50％摩尔比的组合物。一般，基本上纯的组合物将占存在于组合物中的所有大分子物质的大于约80％，更优选地大于约85％、90％、95％和99％。最优选地，主题物质是纯化至基本均质的(通过常规检测方法在组合物中不可检测污染物物质)，其中组合物基本上由单一的大分子物质组成。
“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”指某种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并随之导致靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞有NK细胞，仅表达FcγRIII，然而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概括于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页的表9中。为评估目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，比如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中所描述的。用于这样的测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和NK细胞。可选地，或另外地，目标分子的ADCC活性可在体内进行评估，例如，在动物模型中，比如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1988)中所公开的。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指抗体进行其细胞杀伤功能的机制。其通过补体的第一组分的成分C1q与在Igs、IgG或IgM的Fc结构域的结合来起始。C1q是以70μg/mL的浓度存在于人血清中的大的、～410kD的结构复杂的糖蛋白(Cooper,N.R.1985.Adv.Immunol.37:151)。C1r和C1s、C1q与两个丝氨酸蛋白酶共同形成补体的第一组分—复合物C1。C1q的N末端球形头部中的至少两个必须与Igs的Fc结合以进行C1激活，从而起始补体级联反应(Cooper,N.R.1985.Adv.Immunol.37:151)。
本文所用的术语“抗体半衰期”意为抗体的药代动力学性质，其为施用后抗体分子的平均存活时间的量度。抗体半衰期可表示为从患者体中或其特定的区室中或其它组织中消除已知的免疫球蛋白的量的50％所需的时间，例如，如血清或血浆中所测量的，即循环半衰期。半衰期可根据免疫球蛋白或免疫球蛋白的类别而不同。一般地，抗体半衰期的增加导致施用的抗体的循环中的平均停留时间(MRT)的增加。
术语“同种型”指抗体重链恒定区或轻链恒定区的分类。抗体的恒定区不参与结合抗原，但表现出多种效应功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，可将给定的人抗体或免疫球蛋白分配到5种主要免疫球蛋白种类的其中之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些种类中的一些可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)和IgG4(γ4)，和IgA1和IgA2。对应于不同种类的免疫球蛋白的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的结构和三维构型是熟知的。在多种人免疫球蛋白种类中，仅已知人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM激活补体。已知人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4结合Fcγ受体，其介导包括ADCC的多种效应功能。轻链恒定区可被分类为两个主要的种类，κ和λ。
如果需要的话，可转换抗体的同种型。例如，一些情况下，治疗性抗体需要补体依赖性细胞毒性。存在许多具有补体依赖性细胞毒性的抗体同种型，包括但不限于以下：鼠IgM、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgM、人IgA、人IgG1和人IgG3。在其它实施方案中，治疗性抗体需要结合效应细胞上的Fc受体并参与抗体依赖性细胞毒性。存在许多具有抗体依赖性细胞毒性抗体的抗体同种型，包括但不限于以下：鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgG1和人IgG3。最初所产生的抗体不必具有所述同种型，可利用本领域中熟知的常规技术对抗体进行同种型转换。所述技术其中包括直接重组技术(参见美国专利第4,816,397号)，细胞-细胞融合技术(参见美国专利第5,916,771号和第6,207,418号)的使用。
“全血测定”利用未分级分离的血液作为天然效应器的来源。血液在血浆中含有补体，以及FcR表达细胞效应器，比如多形核白细胞(PMN)和单核细胞(MNC)。这样，全血测定允许在体外同时评估ADCC和CDC二者效应器机制的协同作用。
本文所用的“治疗有效的”量是向受治疗者提供某些改善或益处的量。换言之，“治疗有效的”量是提供至少一种临床症状的一定的缓和、缓解和/或减少的量。可通过本发明的方法治疗的与疾患有关的临床症状是本领域中的技术人员熟知的。而且，本领域中的技术人员将理解，治疗作用不必是彻底的或治愈的，只要向受治疗者提供了一定的益处。
示例性癌症包括膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌(例如神经胶质瘤)、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统的癌症；子宫内膜癌、食道癌；眼癌、头颈癌、胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞肺癌)；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌、成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌、肾癌、呼吸系统的癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌、泌尿系统的癌症，以及其它癌和肉瘤。
示例性慢性感染包括HIV感染、乙肝病毒(HBV)感染和丙肝病毒(HCV)感染。
本文所用的术语“和/或”视作两个特定的特征或组分的每一项与另一项一起或不与另一项一起的特定的公开。例如“A和/或B”视作(i)A，(ii)B和(iii)A和B的每一项的特定的公开，如同每个单独在本文中列出。
抗体结构
已知基本抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的氨基末端部分包括约100至110或更多的氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应功能的恒定区。轻链分类为κ轻链和λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并分别定义抗体的同种型为IgM、IgD、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区域连接，其中重链还包含约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见，Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,编,第2版.Raven Press,N.Y.(1989))。每条轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。
这样，完整的抗体具有两个结合位点。除在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点是相同的。
链均表现出同样的一般结构：由3个高变区(也称CDR)连接的相对保守的框架区(FR)。来自每对的两条链的CDR通过框架区对齐，使能够与特定表位结合。从N末端到C末端，轻链和重链二者均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。根据Kabat的定义将氨基酸分配至每个结构域Sequences of Proteins ofImmunological Interest(NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991)),或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等,Nature 342:878-883(1989)。
双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接的多种方法来产生。参见Songsivilai&Lachmann Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990),Kostelny等J.Immunol.148:1547-1553(1992)。双特异性抗体不以具有单一结合位点的片段的形式(例如，Fab、Fab′和Fv)存在。
通常，VH与VL配对以提供抗体抗原结合位点，虽然单独的VH或VL可用来结合抗原。
人抗体和抗体的人源化
人抗体避免了与具有小鼠或大鼠可变区和/或恒定区的抗体有关的某些问题。小鼠或大鼠来源的抗体可导致抗体的快速清除或可导致由患者针对抗体产生免疫应答。为避免利用小鼠或大鼠来源的抗体，完全人抗体可通过将功能性的人抗体基因座导入到啮齿动物、其它哺乳动物或动物中而使啮齿动物、其它哺乳动物或动物产生完全人抗体来生成。
抗体的制备
将回收的淋巴细胞与骨髓型细胞系融合以制备永久杂交瘤细胞系。筛选这些杂交瘤细胞系并进行选择以鉴定产生对目标抗原特异的抗体的杂交瘤细胞系。本文所提供的是用于产生对PD-L1特异的多种杂交瘤细胞系的产生的方法。而且，本文所提供的是由所述细胞系产生的抗体的表征，包括所述抗体的重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列分析。
可选地，代替与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，可直接对B细胞进行测定。例如，可从超免疫小鼠中分离CD19+B细胞并允许其增殖并分化为抗体分泌的血浆细胞。然后通过ELISA筛选来自细胞上清液的抗体针对PD-L1免疫原的反应性。还可筛选上清液的针对PD-L1的片段的免疫反应性以进一步标出与B7-H1上目标功能结构域结合的不同抗体。还可筛选抗体其它相关人蛋白并针对大鼠、小鼠和非人灵长类，比如食蟹猕猴，B7-H1的直系同源物，最终来确定物种交叉反应性。可通过多种方法使来自含有目标抗体的孔的B细胞永生化，所述方法包括融合以从单独的孔或从合并的孔中生成杂交瘤，或通过用EBV感染或通过已知的永生化基因转染且然后接种于适宜的培养基中。可选地，然后利用B7-H1特异性的溶血性空斑测定来分离分泌具有期望特性的抗体的单独的血浆细胞(参见，例如Babcook等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-48(1996))。靶向裂解的细胞优选地为用B7-H1抗原覆盖的绵羊红细胞(SRBC)。
如将所理解地，可在不同于杂交瘤细胞系的细胞系中表达如本文所描述的抗体。编码特定抗体的序列可用于转化适宜的哺乳动物宿主细胞。转化可通过用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的任何已知的方法来进行，包括例如，将多核苷酸包装在病毒中(或包装到病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞，或通过本领域中已知的转染程序，如美国专利第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号和第4,959,455号中所示出的(所述专利通过引用并入本文)。所用的转化方法取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法是本领域中熟知的，且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体中的多核苷酸的封装和直接将DNA微注射到核中。
在细胞-细胞融合技术中，制备拥有具有任何需要的同种型的重链的骨髓瘤、CHO细胞或其它细胞系，制备具有轻链的骨髓瘤、CHO细胞或其它细胞系。之后可将所述细胞融合并可分离表达完整的抗体的细胞系。
因此，生成了抗体候选物，其符合如上所述的需要的“结构”属性，通过同种型转换它们一般可具有至少某些需要的“功能”属性。
在细胞-细胞融合技术中，制备了拥有具有需要的同种型的重链的骨髓瘤、CHO细胞或其它细胞系和制备了具有轻链的的骨髓瘤、CHO细胞或其它细胞系。之后可将所述细胞融合并可分离表达完整的抗体的细胞系。
因此，生成了抗体候选物，其符合如上所述的需要的“结构”属性，通过同种型转换它们一般可具有至少某些需要的“功能”属性。
抗体序列
本发明的实施方案包括以下所列的抗体。下划线表示CDR区。各个抗体重链的CDR序列及其编号如表1所示，抗体轻链的CDR序列及其编号如表2所示。
1C2 VH氨基酸序列(SEQ ID NO:1)119aa
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSSYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGGGSPNYNEKFKGKATITADTSSNTVNMQLSSLTSEDSAVYYCVREDYSSRVFAYWGQGTLVTVSA
1C2 VH核酸序列(SEQ ID NO:71)357bp
caggttcagctgcagcagtctggagctgagctgatgaagcctggggcctcagtgaagatatcctgcaaggctactggctacacattcagtagttactggatagagtgggtaaagcagaggcctggacatggccttgaatggattggagagattttacctggaggtggtagtcctaactacaatgagaagttcaagggcaaggccacaatcactgcagatacatcctccaacacagttaacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgtaagagaggactacagtagtagggtgtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
1C2 VL氨基酸序列(SEQ ID NO:2)107aa
DIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASENVYSYLAWYQHKQGKSPQVLVYNAKTLAEGVLSRFSGSGSGTQFSLKINRLQPEDFGSYYCQHHYVIPWTFGGGTKLEIK
1C2 VL核酸序列(SEQ ID NO:72)321bp
gatattgtgctaactcagtctccagcctccctatctgcctctgtgggagaaactgtcaccatcacatgtcgagcaagtgagaatgtttacagttatctagcatggtatcagcacaaacagggaaaatctcctcaggtcctagtctataatgcaaaaaccttagcagagggtgtgctatcaaggttcagtggcagtggatcaggcacacagttttctctgaagatcaatcgcctgcagcctgaagattttgggagttattactgtcaacatcattatgttattccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa
1D4 VH氨基酸序列(SEQ ID NO:3)121aa
QAFLQQSGAELVRSGASVKMSCKASDYTFASYNMHWVKQTPGQGLEWIGFIYPGNGGTNYNPKFKGKATLTADTSSSTAYMQISNLTSEDSAVYFCARKEGDYHGSWFAYWGQGTLVTVSA
1D4 VH核酸序列(SEQ ID NO:73)363bp
caggcttttcttcagcagtctggggctgagctggtgaggtctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctgactacacatttgccagttacaatatgcactgggtaaagcagacacctggacagggcctggaatggattggatttatttatcctggaaatggcggtactaactacaatccgaagttcaagggcaaggccacattgactgcagacacatcctccagcacagcctacatgcagatcagcaacctgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagaaaggagggggattaccacggttcctggtttgcgtactggggccaagggactctggtcactgtctctgca
1D4 VL氨基酸序列(SEQ ID NO:4)107aa
NIVLTQSPASLPVTPGDSVSLSCRASQGVNNNLHWYQQKSHGSPRLLISYASQSISGTPSRFSGSGSGTDFTLTINSVETEDFGMYFCQQSNNWPPTFGSGTKLEIK
1D4 VL核酸序列(SEQ ID NO:74)321bp
aatattgttctaactcagtctccagcctccctgcctgtgactccaggagatagcgtcagtctctcctgcagggccagccaaggtgttaacaacaacctacactggtatcaacaaaaatcacatgggtctccaaggcttctcatcagctatgcttcccagtccatctctgggaccccctccaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcactctcactatcaacagtgtggagactgaagattttggaatgtatttctgtcaacagagtaacaactggcctcccacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa
1G11 VH氨基酸序列(SEQ ID NO:5)122aa
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1G11 VH核酸序列(SEQ ID NO:75)366bp
gaagagatgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagactctggattcactttcagtagctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagagactggagtgggtcgcagccattaatagtggtggtacttacacctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatatccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtatttctgtgcaagacatgaggggggatattatacggctagccggtttgcttattggggccaagggactctggtcactgtctctgca
1G11 VL氨基酸序列(SEQ ID NO:6)108aa
EIVLTQSPALMAASPGEKVTITCSVSSNISSSNLHWYQQKSESSPKPWIYGTSTLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSIYPLTFGAGTKLELK
1G11 VL核酸序列(SEQ ID NO:76)324bp
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2F7 VH氨基酸序列(SEQ ID NO:7)117aa
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2F7 VH核酸序列(SEQ ID NO:77)351bp
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2F7 VL氨基酸序列(SEQ ID NO:8)111aa
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2F7 VL核酸序列(SEQ ID NO:78)333bp
gacattgtgctcacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagagccaccatctcctgcagagccagtgaaagtgttgaatattatggcccaagtttaatgcagtggttccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaacgtagaatctggggtccctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacatacttcagcctcaacatccatcctgtggaggaggatgatattgcaatgtatttctgtcaccaaagtaggaaggttccttacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa
3D7 VH氨基酸序列(SEQ ID NO:9)122aa
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3D7 VH核酸序列(SEQ ID NO:79)366bp
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3D7 VL氨基酸序列(SEQ ID NO:10)107aa
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3D7 VL核酸序列(SEQ ID NO:80)321bp
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6A3 VH氨基酸序列(SEQ ID NO:11)121aa
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6A3 VH核酸序列(SEQ ID NO:81)363bp
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6A3 VL氨基酸序列(SEQ ID NO:12)107aa
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6A3 VL核酸序列(SEQ ID NO:82)321bp
gatattgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagcgtcagtctttcctgcagggccagccaatatattagccacaaccttcactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaagacttgtcatcaagtatgcttcccagtccatcgctgggatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcactctcactttcaacagtgtggagactgaagattttggagtgtatttctgtcaacagagtgacagctggcctcacacgttcggctcggggacaaagttggaaatgaaa
表1抗PD-L1抗体重链CDR氨基酸序列及其编号
Figure BDA0002091509230000341
表2抗PD-L1抗体轻链CDR氨基酸序列及其编号
Figure BDA0002091509230000342
治疗施用和制剂
本发明的实施方案包括用于治疗疾病的PD-L1靶向结合剂的药物制剂；优选地，所述PD-L1靶向结合剂是抗PD-L1抗体。所述制剂将抑制PD-L1与其一个或多个其同源配体的结合，从而治疗病理病症。本发明的抗体优选地具有足够的亲和力以有效地抑制PD-L1活性，或抑制PD-L1与其一个或多个同源配体的结合，和优选地具有足够的作用持续时间以允许在人中不频繁给药。延长的作用持续时间将允许通过交替的胃肠外途径(诸如皮下或肌内注射)的较不频繁的和更方便的给药方案。
可生成无菌制剂，例如，在抗体的冷冻干燥和重构之前或之后通过经过无菌滤膜进行过滤。抗体一般以冻干的形式或在溶液中贮存。治疗性抗体组合物一般置于具有无菌存取口的容器中，例如，具有允许取回制剂的接头的静脉内溶液包或药瓶，所述接头比如由皮下注射针头可刺穿的塞子。
所述PD-L1靶向结合剂可用于治疗癌症。其包括向患者施用有效量的PD-L1靶向结合剂或包含其的组合物。所述癌症选自由以下组成的组：膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌(例如神经胶质瘤)、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统的癌症；子宫内膜癌、食道癌；眼癌、头颈癌、胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞肺癌)；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌、成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌、肾癌、呼吸系统的癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌、泌尿系统的癌症，以及其它癌和肉瘤。
所述PD-L1靶向结合剂可以与化疗剂联合使用。
所述PD-L1靶向结合剂可用于治疗感染，可以与抗生素联合使用。优选地，所述抗生素是抗病毒剂；还优选地，所述抗病毒剂是逆转录酶抑制剂；更优选地，所述逆转录酶抑制剂是聚合酶抑制剂。所述感染是慢性感染，例如HIV、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染。所述感染是由选自由细菌，病毒，真菌和原生动物组成的组的病原体导致的。
所述PD-L1靶向结合剂还可与至少一种疫苗联合使用。
附图说明
图1为PD-L1纯化结果图。
图2为抗PD-L1抗体的亲和力测定结果图。
图3为抗PD-L1抗体免疫荧光染色图。
图4为抗PD-L1抗体的免疫荧光效价EC50测定结果图。
图5为人源化抗PD-L1抗体的亲和力测定结果图。
图6为人源化抗PD-L1抗体的免疫荧光效价EC50测定结果图。
图7为K562-PD-L1膜表面结合试验结果图。
图8为Raji-PD-L1膜表面PD-L1结合试验结果图。
图9为膜表面PD-L1结合试验结果图。
图10为PD-L1 CAR元件结构示意图。
图11为PD-L1嵌合抗原受体(PD-L1 CAR)活性图。
具体实施方式
以下的实施例，包括所提供的进行的实验和获得的结果仅用于阐释的目的而不应理解为对本文的教导的限制。
实施例1：重组人PD-L1-his蛋白的表达与纯化
从NCBI数据库上获取人PD-L1胞外区蛋白序列(NP_054862.1)，经哺乳动物密码子优化后，加上6个组氨酸标签编码序列，送金唯智公司合成，得到PD-L1-his的编码核酸序列(SEQ ID NO:49)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。通过本领域熟知的分子生物学方法将片段构建至真核表达载体pVKD1.0中(参见PCT/CN2017/104401，其公开号为WO2019061297A1)，构建成表达人PD-L1胞外区肽段的真核表达载体pVKD1.0-hPD-L1-his。
将pVKD1.0-hPD-L1-his载体用PEI介导转染至293T细胞中，收集上清，并用镍柱层析，然后通过超滤得到纯化的人PD-L1-his重组蛋白，具体方法参看试剂盒说明书(GEHealthcare，货号：17-5247-01)。其纯化结果如图1。
实施例2：小鼠免疫、杂交瘤的融合和克隆筛查
从苏州大学动物实验中心购买5只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心SPF级动物房中。将实施例1中的人PD-L1-his重组蛋白与完全弗氏佐剂完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)充分乳化后，背部皮下注射，10μg/只。每间隔一个月免疫一次，连续免疫BALB/c小鼠3到4次。
融合前一周，复苏SP 2/0骨髓瘤细胞，饲养于含10％FBS的DMEM培养基中，融合前三天，用50μg人PD-L1-His重组蛋白通过腹腔注射冲击免疫小鼠。通过颈脱位法处死免疫小鼠，并获取小鼠脾细胞。用无血清的DMEM培养基洗涤小鼠脾细胞和SP 2/0骨髓瘤细胞三遍，然后500g离心5分钟，分别重悬于10mL无血清DMEM培养基中，细胞计数。取脾细胞：SP 2/0骨髓瘤细胞＝5:1的比例混合，500g离心5分钟，去上清后用1mL 50％PEG进行细胞融合。融合完成后500g离心5分钟，去上清，用含20％FBS的DMEM培养基重悬，以2×105细胞/孔加入96孔板中，37℃过夜孵育。第二天，加入含HAT的杂交瘤选择培养基(Sigma，目录号A9666)，100μL/孔。以后每隔3天，去除一半的培养基，并用杂交瘤选择培养基补充。在第14天，每孔取100μL上清，用ELISA法筛查杂交瘤上清中的抗体活性。
ELISA方法为本领域熟知，简述如下。96孔酶标板购自江海玻璃仪器总厂。重组人PD-L1-his蛋白由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。用NaHCO3缓冲液(pH 9.6)包被蛋白，4℃过夜，包被浓度为1μg/mL。用含0.1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)37℃封闭30分钟，再用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗5遍后拍干，加入待测杂交瘤上清，100μL/孔，室温孵育1小时，PBST洗5遍后，1:5000孵育羊抗鼠HRP二抗(美国Santacruz公司，货号：sc-2005)，37℃孵育30分钟，PBST洗5遍后拍干，用3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetraamthyl benzidine,TMB)底物显色，37℃孵育15分钟，用2M稀硫酸终止后用酶标仪(美国Thermo公司)在450nm波长下读取吸光度(A)值。
将OD值>1.0的孔定义为阳性克隆，从96孔细胞培养板中挑出阳性细胞克隆，然后转移至24孔培养，两天后再次运用上述的ELSIA法复测上清抗体活性。复测阳性的克隆转移至6孔板培养，然后收集细胞，进行后续实验。复测后滴定的结果如表3所示。选取复测后滴度>1000的克隆进行进一步研究。
表3复测后杂交瘤上清OD450值
Figure BDA0002091509230000371
Figure BDA0002091509230000381
Figure BDA0002091509230000391
实施例3：抗PD-L1抗体的序列获取并分析
用Trizol试剂(Thermo，货号15596026)裂解处理杂交瘤细胞，然后提取杂交瘤细胞RNA，具体方法本领域熟知，可参看Trizol试剂说明书。
用cDNA合成(逆转录)试剂盒(宝生物，货号2641Q)扩增cDNA第一链，具体方法参看试剂盒说明书。然后PCR分别扩增抗体重链VH区和轻链的VL区，具体方法参考SherieL.Morrison“Cloning,Expression,and Modification of Antibody V Regions”in“Current Protocols in Immunology”，Volume 47,Issue 1。
扩增后的产物连接至pMD19T载体(宝生物，货号6013)，送测序，每个VH和VL各送至少10个克隆测序，得到抗体VH和VL核酸序列。并分析得到各个抗体的CDR区序列，各个抗体的CDR区序列见表1和表2。
实施例4：抗体纯化和亲和力测定
将实施例2中获得的杂交瘤细胞用含10％FBS的DMEM培养基扩增，收集杂交瘤上清，用蛋白A柱(GE Healthcare，货号：28985254)纯化，具体方法参考试剂盒说明书，得到各个纯化后的小鼠单克隆抗体，并用ELISA方法测定抗体的EC50效价。ELISA的方法为本领域人员熟知，简述如下。96孔酶标板购自江海玻璃仪器总厂。实施例1制备的重组人PD-L1-his蛋白。用NaHCO3缓冲液(pH 9.6)包被蛋白，4℃过夜，包被浓度为1μg/mL。用含0.1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)37℃封闭30分钟，再用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗5遍后拍干，加入待测抗PD-L1抗体，100μL/孔，抗体起始浓度为100ng/mL，3倍或4倍梯度稀释，室温孵育1小时，PBST洗5遍后，1:5000孵育羊抗鼠HRP二抗(美国Santacruz公司，货号：sc-2005)，37℃孵育30分钟，PBST洗5遍后拍干，用3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetraamthyl benzidine,TMB)底物显色，37℃孵育15分钟，用2M稀硫酸终止后用酶标仪(美国Thermo公司)在450nm波长下读取吸光度(A)值。最后用GraphPad软件拟合曲线，计算EC50。
抗PD-L1抗体的EC50效价见表4。
表4 PD-L1抗体EC50效价
克隆 EC50
1C2 0.467nM
1D4 0.813nM
1G11 0.333nM
2F7 0.707nM
3D7 0.133nM
6A3 0.901nM
然后用Friguet法(J Immunol Methods.1985；77:305-19)测定各抗体的平衡解离常数Kd，即抗体的亲和力。主要步骤简述如下。96孔酶标板购自江海玻璃仪器总厂。重组人PD-L1-his蛋白由实施例1制备。用NaHCO3缓冲液(pH 9.6)包被蛋白，4℃过夜，包被浓度为5μg/mL。用含5％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS)37℃封闭30分钟。用含5％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS)(抗体稀释液)稀释PD-L1-his抗原蛋白，得到12个不同梯度的稀释液(0、0.349nM、0.697nM、1.395nM、2.79nM、5.58nM、11.2nM、22.3nM、44.6nM、89.3nM、178.4nM、357nM)后，然后加入恒定浓度的待测抗PD-L1抗体，100μL/孔，37℃孵育1小时。然后将共孵育复合物加入酶标板，室温2小时。PBST洗5遍后，1:5000孵育羊抗鼠HRP二抗(美国Santacruz公司，货号：sc-2005)，37℃孵育30分钟，PBST洗5遍后拍干，用3,3,5,5四甲基联苯胺(3，3，5，5-tetraamthyl benzidine,TMB)底物显色，37℃孵育15分钟，用2M稀硫酸终止后用酶标仪(美国Thermo公司)在450nm波长下读取吸光度(A)值。然后计算Kd值。图2为各抗体亲和力测定的结果，其最后结果汇总于表5。
表5抗PD-L1抗体亲和力
Figure BDA0002091509230000401
Figure BDA0002091509230000411
最后，用免疫荧光法检测各PD-L1抗体与天然PD-L1蛋白的结合能力。用表达全长人PD-L1的质粒pVKD1.0-PD-L1-Full(苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)转染至Hela细胞，48小时后先用含5％FBS的PBS室温封闭30分钟，然后加入各个梯度的抗PD-L1抗体孵育，室温1小时，然后用PBS洗涤3遍后，加入1:1000稀释的羊抗鼠-PE二抗(Santa Cruz，货号：sc-3752)，室温孵育30分钟后，用荧光显微镜观察(美国BioTek，Cytation 3)成像拍照。结果如图3所示，各个抗PD-L1抗体均能有效结果细胞膜表面表达的PD-L1蛋白。根据所得荧光强度，经计算分析，得到免疫荧光法染色的EC50效价，结果见图4，其最后结果汇总于表6。
表6抗PD-L1抗体EC50效价(免疫荧光法)
克隆 EC50
1C2 0.093nM
1D4 8.593nM
1G11 97.733nM
2F7 5.007nM
3D7 3.860nM
6A3 1.540nM
实施例5：抗体人源化改造和表达
将实施例3中获得的各个抗体基因VH区通过本领域熟知的分子生物学技术克隆至带有人IgG1 CH1结构区及其Fc结构区的载体Abvec-hIgG1(GenBank:FJ475055.1)上。将实施例3中获得的各个抗体基因VL区通过本领域熟知的分子生物学技术克隆至带有人κ轻链恒定区的载体AbVec-hIgKappa(GenBank:FJ475056.1)上。然后将分别表达人源化重链和人源化轻链的质粒共同转染至293T细胞中，收集上清，获取抗PD-L1人源化抗体。
实施例6：人源化抗体纯化
将实施例5中获得的含有人源化抗体的细胞转染上清通过蛋白A柱(GEHealthcare，货号：17-0402-01)纯化，具体方法参考试剂盒说明书。得到各个纯化后的人源化抗体，结果见表7。
表7人源化抗体纯化结果
Figure BDA0002091509230000412
Figure BDA0002091509230000421
实施例7：人源化抗体EC50效价确定
ELISA法确定抗PD-L1抗体的EC50活性。ELISA的方法为本领域人员熟知，简述如下。96孔酶标板购自江海玻璃仪器总厂。实施例1制备的重组人PD-L1-his蛋白用NaHCO3缓冲液(pH 9.6)包被蛋白，4℃过夜，包被浓度为1μg/mL。用含0.1％牛血清白蛋白(bovineserum albumin,BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)37℃封闭30分钟，再用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗5遍后拍干，加入待测抗PD-L1抗体，100μL/孔，抗体起始浓度为100ng/mL，3倍或4倍梯度稀释，室温孵育1小时，PBST洗5遍后，1:5000孵育羊抗鼠HRP二抗(美国Santacruz公司，货号：sc-2005)，37℃孵育30分钟，PBST洗5遍后拍干，用3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetraamthyl benzidine,TMB)底物显色，37℃孵育15分钟，用2M稀硫酸终止后用酶标仪(美国Thermo公司)在450nm波长下读取吸光度(A)值。最后用GraphPad软件拟合曲线，计算EC50。各抗PD-L1抗体EC50效价结果见表8。
表8人源化抗体EC50效价
克隆 IgG类型 EC50
人源化1C2 人IgG1 0.47nM
人源化1D4 人IgG1 0.64nM
人源化1G11 人IgG1 1.33nM
人源化2F7 人IgG1 0.96nM
人源化3D7 人IgG1 0.21nM
实施例8：人源化抗PD-L1抗体的亲和力测定
用实施例4中的Friguet法测定人源化抗体的Kd值，结果如图5，其结果汇总于表9。
表9人源化抗体亲和力
Figure BDA0002091509230000422
Figure BDA0002091509230000431
实施例9：人源化抗PD-L1抗体的亲和力(免疫荧光法)
用实施例4中的免疫荧光法测定人源化抗体结合天然PD-L1亲和力，结果如图6，其结果汇总于表10。
表10人源化抗体亲和力(免疫荧光法)
克隆 IgG类型 EC50
人源化1C2 人IgG1 105nM
人源化1D4 人IgG1 14.9nM
人源化1G11 人IgG1 1650nM
人源化2F7 人IgG1 31.8nM
人源化3D7 人IgG1 229nM
实施例10：抗PD-L1抗体结合肿瘤细胞细胞膜表面PD-L1抗原的能力
用流式细胞术检测抗PD-L1抗体结合肿瘤细胞细胞膜表面PD-L1抗原的能力。分别取106稳定表达人PD-L1的K562-PD-L1细胞(参见WO2018103734A1)和稳定表达人PD-L1的Raji-PD-L1细胞(购自Invivogen)于EP管(1.5mL)中，然后加入相应的抗PD-L1抗体，进行一抗孵育。染色体系总体积为50μL的含2％FBS的PBS缓冲液(染色缓冲液)，一抗为实施例2中得到的抗PD-L1抗体，抗体终浓度均调整为2μg/mL，于4℃孵育30min。结束后，每管加入500μL的染色缓冲液洗脱两次，800g离心，每次3分钟。一抗染色结束后，配制二抗染色混合物，以1:1000加入二抗驴抗小鼠-IgG(H+L)(AF647 Conjugate,Abcam)，染色体系总体积亦为50μL的染色缓冲液，于4℃染色30分钟，每管加入500μL的染色缓冲液洗脱两次，800g离心，每次3分钟。最后用300μL的染色缓冲液重悬细胞后进行流式检测。结果如图7和图8所示，所有抗PD-L1抗体均能有效结合细胞膜表面的PD-L1蛋白。总体结合效率见图9所示，其中1C2、6A3、2F7、1D4抗体对膜表面表达的PD-L1蛋白结合能力最高。
实施例11：抗PD-L1抗体的嵌合抗原受体(CAR)活性
将PD-L1抗体VL区和VH区拼接进行基因合成，合成后的PD-L1嵌合抗原受体基因，均转载至慢病毒载体pHAGE-EF1α-MCS-ZsGreen(购自哈佛大学医学院，货号：EvNO00061636)，从而获得基于6个PD-L1单抗的可识别人PD-L1的CAR：1C2 CAR、1D4 CAR、1G11 CAR、2F7 CAR、3D7 CAR和6A3 CAR(PD-L1 CAR元件结构示意图见图10)。其中，CD8 SP代表源于人CD8抗原信号肽(CD8 SP)的序列，PD-L1 VL代表抗PD-L1抗体的VL序列，PD-L1VH代表抗PD-L1抗体的VH序列，CD28、4-1BBL以及CD3ζ代表各自相应的元件，均为常用的CAR构建所需元件。具体地，CD8 SP的编码核酸序列如SEQ ID NO:51所示，氨基酸序列如SEQ IDNO:52所示；CD28元件的编码核酸序列如SEQ ID NO:53所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示；4-1BBL元件的编码核酸序列如SEQ ID NO:55所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示；CD3ζ元件的编码核酸序列如SEQ ID NO:57所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示。1C2 CAR的编码核酸序列如SEQ ID NO:59所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示；1D4 CAR的编码核酸序列如SEQ ID NO:61所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示；1G11 CAR的编码核酸序列如SEQ ID NO:63所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:64所示；2F7 CAR的编码核酸序列如SEQ IDNO:64所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示；3D7 CAR的编码核酸序列如SEQ ID NO:67所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:68所示；6A3 CAR的编码核酸序列如SEQ ID NO:69所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。
将慢病毒包装质粒转染进293T细胞中，转染48h后收集病毒上清，3000rpm，4℃离心10分钟去除细胞碎片，再经0.45μm滤器过滤，以体积比1:5加入慢病毒浓缩液PEG8000(5×)，浓缩过夜，4000g，4℃离心20分钟获得慢病毒沉淀，用RPMI1640培养基重悬慢病毒，-80℃保存。取一支浓缩的病毒感染Jurkat E6-1(ATCC目录号：TIB-152TM，简称JE6-1)，感染时细胞数控制在2×105，加入终浓度为10μg/mL的促感染试剂硫酸鱼精蛋白。采用离心感染法，1000g，于32℃离心感染1小时。离心感染结束后6-8小时换成新鲜的培养基RPMI1640，继续培养扩增感染后的JE6-1。待细胞扩增到一定数量，采用流式细胞仪分选PD-L1 CAR阳性细胞。分别取105的PD-L1 CAR-T细胞与靶细胞(K562和K562-PD-L1)，以1:1混合，400g，离心1分钟促进细胞接触，置于37℃孵箱，孵育24小时后收集上清于-20℃冻存备用。采用HumanIL-2 ELISA kit(BD Biosciences)进行上清IL-2的检测，确定PD-L1 CAR活性。结果如图11所示，基于1C2，1D4，2F7，3D7和6A3的PD-L1 CAR均可识别肿瘤细胞膜表面PD-L1抗原而激活，分泌细胞因子IL-2。其中，1D4鼠源单抗的活化效果与阳性对照抗体(Avelumab，参看WO2016137985A1)相当。
序列表
<110> 苏州工业园区唯可达生物科技有限公司
<120> PD-L1靶向结合剂及其用途
<130> DIC18110071
<160> 82
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Asn
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Val Arg Glu Asp Tyr Ser Ser Arg Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Val Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Val Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Leu Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Arg Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Val Ile Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Ala Phe Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Ile Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Glu Gly Asp Tyr His Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Asn Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Glu Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Thr Ala Ser Arg Phe Ala Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Asn Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Ser Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Ser Ser Tyr Asp Asp Gly Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Gly Gly Ser Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Pro Ser Leu Met Gln Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys His Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Ser Ile Arg Asn Lys Val Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ser
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Asp Val Arg Asp Pro Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Lys Tyr Ser Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Leu His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ala Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Lys Glu Arg Asp Tyr His Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser His Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Val Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ala Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Phe Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
100 105
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ile Leu Pro Gly Gly Gly Ser Pro
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Val Arg Glu Asp Tyr Ser Ser Arg Val Phe Ala Tyr
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<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr Asn
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ala Arg Lys Glu Gly Asp Tyr His Gly Ser Trp Phe Ala Tyr
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<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ile Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Thr
1 5
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Thr Ala Ser Arg Phe Ala Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr Ala
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ile Ser Ser Ser Tyr Asp Asp Gly
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Arg Gly Gly Ser Ser Ser Phe Asp Tyr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ile Arg Asn Lys Val Asn Gly Tyr Thr Thr
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Ala Arg Asp Val Arg Asp Pro Lys Phe Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Asn
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Thr Arg Lys Glu Arg Asp Tyr His Gly Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Asn Val Tyr Ser Tyr
1 5
<210> 32
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Asn Ala Lys
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln His His Tyr Val Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Gln Gly Val Asn Asn Asn
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Tyr Ala Ser
1
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gln Gln Ser Asn Asn Trp Pro Pro Thr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Ser Asn Ile Ser Ser Ser Asn
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Gly Thr Ser
1
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gln Gln Trp Ser Ile Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Pro Ser Leu
1 5 10
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Ala Ala Ser
1
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
His Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Gln Asn Val Arg Thr Ala
1 5
<210> 44
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Leu Ala Ser
1
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Leu Gln His Trp Lys Tyr Ser Phe Thr
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Gln Tyr Ile Ser His Asn
1 5
<210> 47
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Tyr Ala Ser
1
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro His Thr
1 5
<210> 49
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
atgcgcattt tcgctgtgtt cattttcatg acatactggc acctcctgaa cgctttcaca 60
gtgacagtgc ctaaggactt gtatgtggtg gagtacgggt ctaacatgac aattgagtgc 120
aagttccccg tggagaagca gctcgacctg gccgccctga tcgtgtactg ggagatggag 180
gacaagaaca ttattcagtt cgtgcacggc gaagaggatc tcaaggtgca gcactcttcc 240
taccggcagc gggctagact gctcaaggac cagctcagcc tcggaaacgc cgctctccag 300
attaccgacg tgaagctcca ggacgccggc gtgtacagat gcatgatctc ttacggcggg 360
gccgactaca agagaatcac agtgaaggtg aacgccccat acaacaagat taaccagcgg 420
attctggtgg tggaccctgt gacatctgag cacgagctta catgccaggc cgagggatac 480
cctaaggctg aagtcatttg gacatctagc gaccaccagg tgctgtccgg aaagacaacc 540
acaaccaact ctaagcgcga agagaagctg ttcaacgtga catctacact gcgcattaac 600
accacaacaa acgaaatttt ctactgcacc ttccgcagac tcgaccccga ggaaaaccac 660
accgctgagc ttgtgatccc agagctgcct ctggcccacc ctccaaacga gcgccaccac 720
caccaccacc ac 732
<210> 50
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg His His
225 230 235 240
His His His His
<210> 51
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
atggccctgc ctgtgaccgc cctcctcctg cctctcgccc tgctcctcca cgccgctaga 60
ccc 63
<210> 52
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 53
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
atcgaggtga tgtaccctcc cccttacctg gacaacgaga agagcaacgg caccatcatc 60
cacgtgaagg gcaagcacct gtgccctagc cccctgttcc ccggacctag caagcccttt 120
tgggtgctgg tggtggtggg cggcgtgctg gcctgttact ccctgctggt gaccgtggcc 180
ttcattatct tctgggtgag gagcaagagg agcaggctgc tgcacagcga ctacatgaac 240
atgacaccca ggagacctgg ccccaccaga aagcactacc agccctatgc cccccccaga 300
gactttgccg cctacagaag c 321
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105
<210> 55
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aggttcagcg tggtgaagag gggcaggaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcccttc 60
atgaggcccg tgcagaccac ccaggaggag gacggctgca gctgcaggtt ccccgaggag 120
gaggaaggcg gatgcgagct g 141
<210> 56
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40 45
<210> 57
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
agagtgaagt tctccagaag cgctgacgcc cctgcctacc agcagggaca gaaccagctg 60
tataacgagc tgaacctggg caggagagag gagtacgatg tcctggacaa gaggagagga 120
cgtgatcctg agatgggcgg caagccccaa aggagaaaga acccccagga gggactgtac 180
aatgagctgc agaaggacaa gatggccgag gcctactccg aaatcggcat gaaaggcgag 240
aggagaaggg gcaaaggcca cgatggcctg taccagggcc tgagcacagc caccaaagac 300
acatacgacg ccctgcacat gcaggccctg ccccctagg 339
<210> 58
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 59
<211> 1617
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
atggccctgc ctgtgaccgc cctcctcctg cctctcgccc tgctcctcca cgccgctaga 60
cccgatattg tgctaactca gtctccagcc tccctatctg cctctgtggg agaaactgtc 120
accatcacat gtcgagcaag tgagaatgtt tacagttatc tagcatggta tcagcacaaa 180
cagggaaaat ctcctcaggt cctagtctat aatgcaaaaa ccttagcaga gggtgtgcta 240
tcaaggttca gtggcagtgg atcaggcaca cagttttctc tgaagatcaa tcgcctgcag 300
cctgaagatt ttgggagtta ttactgtcaa catcattatg ttattccgtg gacgttcggt 360
ggaggcacca agctggaaat caaaggcgga ggcggcagtg gcgggggcgg gtccggcgga 420
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gtgaagatat cctgcaaggc tactggctac acattcagta gttactggat agagtgggta 540
aagcagaggc ctggacatgg ccttgaatgg attggagaga ttttacctgg aggtggtagt 600
cctaactaca atgagaagtt caagggcaag gccacaatca ctgcagatac atcctccaac 660
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agagaggact acagtagtag ggtgtttgct tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 780
tctgcagatt acaaggatga tgatgataaa gctagcatcg aggtgatgta ccctccccct 840
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cctagccccc tgttccccgg acctagcaag cccttttggg tgctggtggt ggtgggcggc 960
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ttcagcgtgg tgaagagggg caggaagaag ctgctgtaca tcttcaagca gcccttcatg 1200
aggcccgtgc agaccaccca ggaggaggac ggctgcagct gcaggttccc cgaggaggag 1260
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ccccaggagg gactgtacaa tgagctgcag aaggacaaga tggccgaggc ctactccgaa 1500
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agcacagcca ccaaagacac atacgacgcc ctgcacatgc aggccctgcc ccctagg 1617
<210> 60
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu
35 40 45
Asn Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Gln Gly Lys Ser
50 55 60
Pro Gln Val Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Leu
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile
85 90 95
Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His
100 105 110
Tyr Val Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp
165 170 175
Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Ser Pro Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
195 200 205
Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Asn Met
210 215 220
Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val
225 230 235 240
Arg Glu Asp Tyr Ser Ser Arg Val Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ser
260 265 270
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
275 280 285
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
290 295 300
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
305 310 315 320
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
325 330 335
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
340 345 350
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
355 360 365
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val
370 375 380
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
385 390 395 400
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
405 410 415
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
420 425 430
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
435 440 445
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
450 455 460
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn
465 470 475 480
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
485 490 495
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
500 505 510
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
515 520 525
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535
<210> 61
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
atggccctgc ctgtgaccgc cctcctcctg cctctcgccc tgctcctcca cgccgctaga 60
cccaatattg ttctaactca gtctccagcc tccctgcctg tgactccagg agatagcgtc 120
agtctctcct gcagggccag ccaaggtgtt aacaacaacc tacactggta tcaacaaaaa 180
tcacatgggt ctccaaggct tctcatcagc tatgcttccc agtccatctc tgggaccccc 240
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tcggggacaa agttggaaat aaaaggcgga ggcggcagtg gcgggggcgg gtccggcgga 420
ggcgggagcc aggcttttct tcagcagtct ggggctgagc tggtgaggtc tggggcctca 480
gtgaagatgt cctgcaaggc ttctgactac acatttgcca gttacaatat gcactgggta 540
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actaactaca atccgaagtt caagggcaag gccacattga ctgcagacac atcctccagc 660
acagcctaca tgcagatcag caacctgaca tctgaagact ctgcggtcta tttctgtgca 720
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actgtctctg cagattacaa ggatgatgat gataaagcta gcatcgaggt gatgtaccct 840
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aggagcaaga ggagcaggct gctgcacagc gactacatga acatgacacc caggagacct 1080
ggccccacca gaaagcacta ccagccctat gcccccccca gagactttgc cgcctacaga 1140
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taccagcagg gacagaacca gctgtataac gagctgaacc tgggcaggag agaggagtac 1380
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agg 1623
<210> 62
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
20 25 30
Pro Val Thr Pro Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Gly Val Asn Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Gly Ser
50 55 60
Pro Arg Leu Leu Ile Ser Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Thr Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Asn Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser
100 105 110
Asn Asn Trp Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Ala Phe Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala Ser
145 150 155 160
Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr Asn
165 170 175
Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Phe Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Lys Phe Lys
195 200 205
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
210 215 220
Gln Ile Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
225 230 235 240
Arg Lys Glu Gly Asp Tyr His Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
260 265 270
Ala Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys
275 280 285
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
290 295 300
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
305 310 315 320
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
325 330 335
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
340 345 350
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
355 360 365
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser
370 375 380
Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
385 390 395 400
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
405 410 415
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
420 425 430
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
435 440 445
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
450 455 460
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg
465 470 475 480
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
485 490 495
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
500 505 510
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
515 520 525
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535 540
<210> 63
<211> 1629
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
atggccctgc ctgtgaccgc cctcctcctg cctctcgccc tgctcctcca cgccgctaga 60
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<210> 64
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met
20 25 30
Ala Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser
35 40 45
Asn Ile Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Ser
50 55 60
Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val
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Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Trp Ser Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
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Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Glu Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
145 150 155 160
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
165 170 175
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
180 185 190
Ala Ala Ile Asn Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
195 200 205
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
210 215 220
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
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Ala Arg His Glu Gly Gly Tyr Tyr Thr Ala Ser Arg Phe Ala Tyr Trp
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
260 265 270
Asp Lys Ala Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn
275 280 285
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
290 295 300
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
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Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
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Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
340 345 350
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Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
370 375 380
Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
385 390 395 400
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
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420 425 430
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435 440 445
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
450 455 460
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Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
atggccctgc ctgtgaccgc cctcctcctg cctctcgccc tgctcctcca cgccgctaga 60
cccgacattg tgctcaccca atctccagct tctttggctg tgtctctagg gcagagagcc 120
accatctcct gcagagccag tgaaagtgtt gaatattatg gcccaagttt aatgcagtgg 180
ttccaacaga aaccaggaca gccacccaaa ctcctcatct atgctgcatc caacgtagaa 240
tctggggtcc ctgccaggtt tagtggcagt gggtctggga catacttcag cctcaacatc 300
catcctgtgg aggaggatga tattgcaatg tatttctgtc accaaagtag gaaggttcct 360
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaaggcg gaggcggcag tggcgggggc 420
gggtccggcg gaggcgggag ccaggtccag ctgcagcagt ctggggctga actggtgagg 480
cctggggtct cagtgaagat ttcctgcaag ggttctggct acatattcac tgattatgct 540
atacactggg tgaagcagag tcatgcaaag aatctagagt ggattggagt tattagttct 600
tcctatgatg atggtaacta caaccagaag ttcaggggca aggccacaat gactgcagac 660
aaatcctcca gcacagccta catggaactt gccagactga catctgagga ttccgccatc 720
tattactgtt caaggggcgg tagtagttcc tttgactact ggggccaagg caccactctc 780
acagtctcct cagattacaa ggatgatgat gataaagcta gcatcgaggt gatgtaccct 840
cccccttacc tggacaacga gaagagcaac ggcaccatca tccacgtgaa gggcaagcac 900
ctgtgcccta gccccctgtt ccccggacct agcaagccct tttgggtgct ggtggtggtg 960
ggcggcgtgc tggcctgtta ctccctgctg gtgaccgtgg ccttcattat cttctgggtg 1020
aggagcaaga ggagcaggct gctgcacagc gactacatga acatgacacc caggagacct 1080
ggccccacca gaaagcacta ccagccctat gcccccccca gagactttgc cgcctacaga 1140
agcaggttca gcgtggtgaa gaggggcagg aagaagctgc tgtacatctt caagcagccc 1200
ttcatgaggc ccgtgcagac cacccaggag gaggacggct gcagctgcag gttccccgag 1260
gaggaggaag gcggatgcga gctgagagtg aagttctcca gaagcgctga cgcccctgcc 1320
taccagcagg gacagaacca gctgtataac gagctgaacc tgggcaggag agaggagtac 1380
gatgtcctgg acaagaggag aggacgtgat cctgagatgg gcggcaagcc ccaaaggaga 1440
aagaaccccc aggagggact gtacaatgag ctgcagaagg acaagatggc cgaggcctac 1500
tccgaaatcg gcatgaaagg cgagaggaga aggggcaaag gccacgatgg cctgtaccag 1560
ggcctgagca cagccaccaa agacacatac gacgccctgc acatgcaggc cctgccccct 1620
agg 1623
<210> 66
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu
35 40 45
Ser Val Glu Tyr Tyr Gly Pro Ser Leu Met Gln Trp Phe Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe
85 90 95
Ser Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe
100 105 110
Cys His Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
145 150 155 160
Pro Gly Val Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ile Phe
165 170 175
Thr Asp Tyr Ala Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Asn Leu
180 185 190
Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Ser Ser Tyr Asp Asp Gly Asn Tyr Asn
195 200 205
Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
210 215 220
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Ser Arg Gly Gly Ser Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
260 265 270
Ala Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys
275 280 285
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
290 295 300
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
305 310 315 320
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
325 330 335
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
340 345 350
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
355 360 365
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser
370 375 380
Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
385 390 395 400
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
405 410 415
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
420 425 430
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
435 440 445
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
450 455 460
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg
465 470 475 480
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
485 490 495
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
500 505 510
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
515 520 525
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535 540
<210> 67
<211> 1626
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
atggccctgc ctgtgaccgc cctcctcctg cctctcgccc tgctcctcca cgccgctaga 60
cccgacgttg tgatgaccca gtctcaaaaa ttcatgtcca catcaatagg agacagggtc 120
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gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccattag caatgtgcaa 300
tctgaagacc tggcagatta tttctgtctg caacattgga aatattcatt cacgttcggc 360
tcggggacaa aattggaaat aaaaggcgga ggcggcagtg gcgggggcgg gtccggcgga 420
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tacacaacag agtacagttc atctgtgaag ggtcggttga ccatctccag agataattcc 660
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gtgaggagca agaggagcag gctgctgcac agcgactaca tgaacatgac acccaggaga 1080
cctggcccca ccagaaagca ctaccagccc tatgcccccc ccagagactt tgccgcctac 1140
agaagcaggt tcagcgtggt gaagaggggc aggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag 1200
cccttcatga ggcccgtgca gaccacccag gaggaggacg gctgcagctg caggttcccc 1260
gaggaggagg aaggcggatg cgagctgaga gtgaagttct ccagaagcgc tgacgcccct 1320
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tacgatgtcc tggacaagag gagaggacgt gatcctgaga tgggcggcaa gccccaaagg 1440
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tactccgaaa tcggcatgaa aggcgagagg agaaggggca aaggccacga tggcctgtac 1560
cagggcctga gcacagccac caaagacaca tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc 1620
cctagg 1626
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<211> 542
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met
20 25 30
Ser Thr Ser Ile Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln
35 40 45
Asn Val Arg Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
50 55 60
Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His
100 105 110
Trp Lys Tyr Ser Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
145 150 155 160
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr
165 170 175
Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Ser Ile Arg Asn Lys Val Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ser Ser
195 200 205
Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile Leu
210 215 220
Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr
225 230 235 240
Cys Ala Arg Asp Val Arg Asp Pro Lys Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
260 265 270
Lys Ala Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu
275 280 285
Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro
290 295 300
Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val
305 310 315 320
Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe
325 330 335
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
340 345 350
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
355 360 365
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe
370 375 380
Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
385 390 395 400
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
405 410 415
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
420 425 430
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
435 440 445
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
450 455 460
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg
465 470 475 480
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
485 490 495
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
500 505 510
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
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<210> 69
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
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ggccccacca gaaagcacta ccagccctat gcccccccca gagactttgc cgcctacaga 1140
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agg 1623
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<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu
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Ser Val Thr Pro Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
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50 55 60
Pro Arg Leu Val Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ala Gly Ile Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Phe
85 90 95
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100 105 110
Asp Ser Trp Pro His Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Ala Tyr Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Ser Gly Ala Ser
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Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Asn
165 170 175
Leu His Trp Val Lys Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
180 185 190
Phe Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
195 200 205
Ala Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Leu
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Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Thr
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Arg Lys Glu Arg Asp Tyr His Gly Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
260 265 270
Ala Ser Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys
275 280 285
Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser
290 295 300
Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
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Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
325 330 335
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
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Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
355 360 365
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser
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Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
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Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
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Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
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Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
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Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
450 455 460
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg
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Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
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<210> 73
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
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<212> DNA
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<400> 76
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<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
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<210> 79
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gaggtgaaac tggtggaatc tggaggaggc ttggtacagc ctgggggttc tctgagactc 60
tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcact gattactaca tgagctgggt ccgccagcct 120
ccaggaaagg cacttgagtg gttgggttct attagaaaca aagttaatgg ttacacaaca 180
gagtacagtt catctgtgaa gggtcggttg accatctcca gagataattc ccaaagcatc 240
ctctatcttc aaatgaacac cctgagagct gaggacagtg ccacttatta ctgtgcaaga 300
gatgtccggg atcccaagtt tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 80
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gacgttgtga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat caataggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca gaatgttcgt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
gggcagtctc ctaaagcact gatttacttg gcttccaacc ggcacactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccattagcaa tgtgcaatct 240
gaagacctgg cagattattt ctgtctgcaa cattggaaat attcattcac gttcggctcg 300
gggacaaaat tggaaataaa a 321
<210> 81
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
caggcttatc tacagcagtc tggggctgaa ctggtgaagt ctggggcctc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggcta cacattttcc agttacaatc tgcactgggt aaagcagaca 120
cctagacagg gcctggaatg gattggattt atttatcctg gaaatggtgg tactgactac 180
agtcagaagt tcaaggccaa ggtcacattg actgcagaca catcctccag cacagcctac 240
ttgcagatca gcagcctgac atctgaagac tctgcggtct atttttgtac aagaaaggag 300
cgggattacc acggctcctg gttcgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360
gca 363
<210> 82
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gatattgtgc taactcagtc tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagcgtcagt 60
ctttcctgca gggccagcca atatattagc cacaaccttc actggtatca acaaaaatca 120
catgagtctc caagacttgt catcaagtat gcttcccagt ccatcgctgg gatcccctcc 180
aggttcagtg gcagtggatc agggacagat ttcactctca ctttcaacag tgtggagact 240
gaagattttg gagtgtattt ctgtcaacag agtgacagct ggcctcacac gttcggctcg 300
gggacaaagt tggaaatgaa a 321

Claims (21)

1.一种PD-L1靶向结合剂，其与PD-L1特异性结合并抑制PD-L1的生物活性，其中所述靶向结合剂包含：
具有SEQ ID NO:13、16、19、22、25或28所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:14、17、20、23、26或29所示氨基酸序列的CDR2，或具有SEQ ID NO:15、18、21、24、27或30所示氨基酸序列的CDR3，或它们的变体中的一个或多个；和/或
具有SEQ ID NO:31、34、37、40、43或46所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:32、35、38、41、44或47所示氨基酸序列的CDR2，或具有SEQ ID NO:33、36、39、42、45或48所示氨基酸序列的CDR3，或它们的变体中的一个或多个；
优选地，所述变体的序列为包括多达20个、16个、10个、9个或更少，例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸的增加、置换、缺失和/或插入的任一所述序列，或所述变体的序列与任一所述序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性。
2.根据权利要求1所述的PD-L1靶向结合剂，其为包含重链可变区和轻链可变区的PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中：
(i)所述重链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(a)CDR1具有与SEQ ID NO:13、16、19、22、25或28相同的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:13、16、19、22、25或28包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列；
(b)CDR2具有与SEQ ID NO:14、17、20、23、26或29相同的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:14、17、20、23、26或29包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列；
(c)CDR3具有与SEQ ID NO:15、18、21、24、27或30相同的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:15、18、21、24、27或30包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列；
(ii)所述轻链可变区包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(d)CDR1具有与SEQ ID NO:31、34、37、40、43或46相同的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:31、34、37、40、43或46包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列；
(e)CDR2具有与SEQ ID NO:32、35、38、41、44或47相同的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:32、35、38、41、44或47包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列；
(f)CDR3具有与SEQ ID NO:33、36、39、42、45或48相同的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:33、36、39、42、45或48包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的PD-L1靶向结合剂，所述抗体或其抗原结合片段选自(i)-(vi)，其中：
(i)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:13相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:13包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:14相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:14包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:15相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:15包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:31相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:31包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:32相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:32包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:33相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:33包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3；
(ii)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:16相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:16包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:17相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:17包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:18相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:18包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:34相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:34包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:35相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:35包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:36相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:36包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3；
(iii)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:19相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:19包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:20相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:20包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:21相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:21包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:37相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:37包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:38相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:38包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:39相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:39包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3；
(iv)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:22相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:22包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:23相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:23包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:24相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:24包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:40相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:40包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:41相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:41包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:42相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:42包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3；
(v)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:25相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:25包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:26相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:26包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:27相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:27包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:43相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:43包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:44相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:44包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:45相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:45包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3；
(vi)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:28相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:28包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR1；
(b)具有与SEQ ID NO:29相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:29包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR2；
(c)具有与SEQ ID NO:30相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:30包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH CDR3；
(d)具有与SEQ ID NO:46相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:46包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR1；
(e)具有与SEQ ID NO:47相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:47包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR2；
(f)具有与SEQ ID NO:48相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:48包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL CDR3。
4.根据权利要求3所述的PD-L1靶向结合剂，所述抗体或其抗原结合片段选自(vii)-(xii)，其中：
(vii)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:1包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:2包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
(viii)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:3相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:3包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:4相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:4包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
(ix)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:5相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:5包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:6相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:6包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
(x)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:7相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:7包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:8相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:8包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
(xi)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:9相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:9包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:10相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:10包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
(xii)包含以下：
(a)具有与SEQ ID NO:11相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:11包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VH序列；
(b)具有与SEQ ID NO:12相同的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:12包含1个、2个或3个氨基酸残基置换的氨基酸序列的VL序列；
优选地，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链CDR3、SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的轻链CDR3；
SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:18所示氨基酸序列的重链CDR3、SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的轻链CDR3；
SEQ ID NO:19所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的重链CDR3、SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的轻链CDR3；
SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的重链CDR3、SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的轻链CDR3；
SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:27所氨基酸序列示的重链CDR3、SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的轻链CDR3；或
SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的重链CDR1、SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的重链CDR2、SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的重链CDR3、SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的轻链CDR1、SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的轻链CDR2、和SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的轻链CDR3。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的PD-L1靶向结合剂，其中所述靶向结合剂包含：
(a)SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链可变区或与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的重链可变区，和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的轻链可变区或与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的轻链可变区；
(b)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的重链可变区或与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的重链可变区，和SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的轻链可变区或与SEQ ID NO:4所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的轻链可变区；
(c)SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的重链可变区或与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的重链可变区，和SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的轻链可变区或与SEQ ID NO:6所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的轻链可变区；
(d)SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的重链可变区或与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的重链可变区，和SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的轻链可变区或与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的轻链可变区；
(e)SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的重链可变区或与SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的重链可变区，和SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的轻链可变区或与SEQ ID NO:10所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的轻链可变区；或
(f)SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的重链可变区或与SEQ ID NO:11所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的重链可变区，和SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的轻链可变区或与SEQ ID NO:12所示氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的轻链可变区。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的PD-L1靶向结合剂，其还包含人恒定区；优选地，所述恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区；更优选地，所述恒定区是人IgG1的恒定区。
7.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至6中任一项所述的PD-L1靶向结合剂；优选地，SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:71所示；优选地，SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:72所示；优选地，SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:73所示；优选地，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:74所示；优选地，SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:75所示；优选地，SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:76所示；优选地，SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:77所示；优选地，SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:78所示；优选地，SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:79所示；优选地，SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:80所示；优选地，SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:81所示；优选地，SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的编码核酸序列如SEQ ID NO:82所示。
8.一种表达载体，其包含根据权利要求7所述的核酸。
9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8所述的表达载体；优选地，所述宿主细胞是真核细胞；更优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
10.一种PD-L1抗体的嵌合抗原受体，其中，所述PD-L1抗体包含：
具有SEQ ID NO:13、16、19、22、25或28所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:14、17、20、23、26或29所示氨基酸序列的CDR2，或具有SEQ ID NO:15、18、21、24、27或30所示氨基酸序列的CDR3，或它们的变体中的一个或多个；和/或
具有SEQ ID NO:31、34、37、40、43或46所示氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:32、35、38、41、44或47所示氨基酸序列的CDR2，或具有SEQ ID NO:33、36、39、42、45或48所示氨基酸序列的CDR3，或它们的变体中的一个或多个；
优选地，所述变体的序列为包括多达20个、16个、10个、9个或更少，例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸的增加、置换、缺失和/或插入的任一所述序列，或所述变体的序列与任一所述序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性。
11.根据权利要求10所述的PD-L1抗体的嵌合抗原受体，其还包含一个或多个选自以下的元件：信号肽、接头序列、跨膜结构域、内部结构域和共刺激结构域。
12.根据权利要求11或12所述的PD-L1抗体的嵌合抗原受体，其包含CD8抗原信号肽、PD-L1抗体的轻链可变区、PD-L1抗体的重链可变区、CD28元件、4-1BBL元件以及CD3ζ元件；优选地，所述CD8抗原信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示；优选地，所述CD28元件的氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示；优选地，所述4-1BBL元件的氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示；优选地，所述CD3ζ元件的氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示；更优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自60、62、64、66、68或70所示的序列。
13.编码根据权利要求10至12中任一项所述的PD-L1抗体的嵌合抗原受体的核酸，优选地，所述CD8抗原信号肽的编码核酸序列如SEQ ID NO:51所示；优选地，所述CD28元件的编码核酸序列如SEQ ID NO:53所示；优选地，所述4-1BBL元件的编码核酸序列如SEQ ID NO:55所示；优选地，所述CD3ζ元件的编码核酸序列如SEQ ID NO:57所示；更优选地，所述嵌合抗原受体的编码核酸序列选自59、61、63、65、67或69所示的序列。
14.含有根据权利要求13所述核酸的重组载体、表达盒、重组病毒或重组细胞。
15.一种CAR构建体，其包含编码根据权利要求10-12中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸。
16.一种T细胞，其用根据权利要求15所述的CAR构建体转导。
17.一种用于预防和/或治疗疾病的药物组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的PD-L1靶向结合剂、根据权利要求7所述的核酸、根据权利要求8所述的表达载体、根据权利要求9所述的宿主细胞、根据权利要求10至12任一项所述的嵌合抗原受体、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14所述的重组载体、表达盒、重组病毒或重组细胞、根据权利要求15所述的CAR构建体或根据权利要求16所述的T细胞；以及任选的一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂；
优选地，所述药物组合物还包含其它抗癌药物和/或抗病毒药物；
优选地，所述疾病是癌症或感染；
优选地，所述癌症选自：膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌(例如神经胶质瘤)、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统的癌症；子宫内膜癌、食道癌；眼癌、头颈癌、胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞肺癌)；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌、成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌、肾癌、呼吸系统的癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌、泌尿系统的癌症，以及其它癌和肉瘤；
优选地，所述感染是慢性感染；更优选地，所述慢性感染选自：HIV感染、乙肝病毒(HBV)感染和丙肝病毒(HCV)感染。
18.一种根据权利要求1至6中任一项所述的PD-L1靶向结合剂的制备方法，其包括在适合根据权利要求8所述的载体表达的条件下培养权利要求9所述的宿主细胞，并且收获所述PD-L1靶向结合剂。
19.一种PD-L1 CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)构建含有可识别人PD-L1的CAR元件的载体，所述载体可以是真核表达载体或慢病毒载体，优选慢病毒载体，所述CAR元件包含根据权利要求13所述的核酸；优选地，所述载体是慢病毒载体pHAGE-EF1α-MCS-ZsGreen；
(b)用步骤(a)构建的载体转染或感染宿主T细胞，产生带有带有可识别人PD-L1的CAR元件的CAR-T细胞。
20.一种PD-L1 CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)构建含有可识别人PD-L1的CAR元件的载体，所述载体可以是真核表达载体或慢病毒载体，优选慢病毒载体，所述CAR元件包含根据权利要求13所述的核酸；优选地，所述载体是慢病毒载体pHAGE-EF1α-MCS-ZsGreen；
(b)将步骤(a)构建的载体转染至包装细胞系中，产生带有可识别人PD-L1的CAR元件的慢病毒颗粒；
(c)将慢病毒颗粒转染或感染宿主T细胞，产生带有带有可识别人PD-L1的CAR元件的CAR-T细胞。
21.根据权利要求1至6中任一项所述的PD-L1靶向结合剂、根据权利要求7所述的核酸、根据权利要求8所述的表达载体、根据权利要求9所述的宿主细胞、根据权利要求10至12任一项所述的嵌合抗原受体、根据权利要求13所述的核酸、根据权利要求14所述的重组载体、表达盒、重组病毒或重组细胞、根据权利要求15所述的CAR构建体、根据权利要求16所述的T细胞或根据权利要求17所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途；
优选地，所述疾病是癌症或感染；
优选地，所述癌症选自：膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌(例如神经胶质瘤)、子宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌、消化系统的癌症；子宫内膜癌、食道癌；眼癌、头颈癌、胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小细胞和非小细胞肺癌)；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤；黑素瘤；骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌(例如，唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌、成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌、肾癌、呼吸系统的癌症；肉瘤；皮肤癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌、泌尿系统的癌症，以及其它癌和肉瘤；
优选地，所述感染是慢性感染；更优选地，所述慢性感染选自：HIV感染、乙肝病毒(HBV)感染和丙肝病毒(HCV)感染。
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